KR20220031995A - 항체 표적화된 식균작용을 통해 질환 유발 인자를 고갈시키는 방법 - Google Patents
항체 표적화된 식균작용을 통해 질환 유발 인자를 고갈시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 개시내용은 표적화된 식균작용을 유발하고, 특이적 식균성 수용체, 예컨대 Dectin-1에 결합하는 결합 도메인, 및 특이적 질환-유발 인자에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 분자의 투여 시 인간 대상체에서 숙주 세포, 또는 숙주 세포 생성물, 미생물 또는 그들의 생성물을 비롯한 질환-유발 인자를 고갈시키거나 또는 그의 수를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 표적화된 식균작용에 의해 조직, 혈액 또는 골수에서 질환-유발 인자를 고갈시키거나 또는 그의 수를 감소시킨다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 4월 5일에 출원한 미국 가출원 번호 62/830,139를 우선권으로 주장하며, 그의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 표적화된 식균작용에 의해 인간에서 질환-유발 인자를 고갈시키거나 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.
전문적인 식균세포는 비정상적이거나 또는 질환을 유발하는 숙주 또는 외래 물질을 특이적으로 인식하고 포식하는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 호중구, 호산구 및 파골세포를 일반적으로 지칭하는 백혈구의 하위집합이다 (Rabinovitch, 1995, Trends in Cell Biol; Arandejelovic, et al., 2015, Nat Immunol; Rosales, et al., 2017 BioMed Research International). 식균작용은 병원체 및 세포 파편을 제거하기 위해 사용되는 주요 메카니즘이다. 원형질-막 외피 내에서 미립자 (>0.5 mm)의 세포 흡수로 정의되는 식균작용은 유체상 거대음세포 작용성 및 수용체 경로에 의한 가용성 리간드의 엔도시토시스와 밀접하게 관련이 있고 부분적으로 중복된다 (Rosales, et al., 2017 BioMed Research International; Gordon, 2016, Immunity; Tse, et al., 2003, J Biol Chem). 이어서, 포식된 물질은 파고솜에서 소화된다. 박테리아, 죽은 조직 세포, 및 작은 미네랄 입자는 식균될 수 있는 객체의 모든 예이다. 몇몇 용어는 에페로시토시스로도 공지된 아폽토시스 세포의 흡수, 및 감염 및 염증으로 인해 발생하는 괴사성 세포의 흡수 (네크롭토시스 및 피롭토시스)와 연관된 메카니즘에 적용되었다 (Henson and Bratton, 2009). 포식된 물질은 엔도-리소좀 경로를 통한 식균작용 과정에서 파괴된다. 수지상 세포 및 대식세포는 식균작용에 의해 병원체를 섭취하고, 그들을 파괴하여, 적응성 면역계의 세포에 항원을 제시한다.
식균작용을 매개하는 식균세포의 원형질막 상의 수용체는 비-옵소닌 및 옵소닌 유형으로 나뉠 수 있다. 비-옵소닌 수용체에는 렉틴-유형 수용체, Dectin 수용체, 또는 스캐빈저 수용체가 포함된다 (Freeman and Grinstein, Immunological Reviews, 2014). 일부 식균성 경로는 병원체-연관된 분자 패턴 (PAMPS)으로의 부착에 의해 활성화된 패턴 인식 수용체 (PRR)로부터의 두번째 신호를 필요로 하며, 이는 NF-κB 활성화를 유도한다 (Patin, et al., 2018, Semin Cell Dev Biol; Brandt, et al., 2013, PLoS One). 전문적인 식균세포에 의해 다양하게 발현되는 비-옵소닌 수용체에는 렉틴-유사 인식 분자, 예컨대 CD169, CD33, 및 시알릴화 잔기에 대한 관련 수용체가 포함된다. 또한, 식균세포는 Dectin-1 (잘 정의된 신호전달 능력을 갖는 진균 베타-글루칸에 대한 수용체), 관련 C-유형 렉틴 (예를 들어, MICL, Dectin-2, Mincle, 및 DNGR-1), 및 스캐빈저 수용체의 그룹을 또한 발현한다 (Asano, et al., 2018, J Biochem, Lock, et al., 2004, Immunobiol). SR-A, MARCO 및 CD36은 도메인 구조가 다양하고, 아폽토시스 및 미생물 리간드의 중복 인식에도 불구하고 구별된다 (Freeman and Grinstein, Immunological Reviews, 2014). 이들 무차별적인 수용체는 다중음이온성 리간드에 결합하고, 제대로 정의되지 않은 세포내 신호전달 능력을 가지며, 이는 아마도 다중-리간드 및 수용체 상호작용이 흡수를 위한 요건임을 나타낸다. 주목할만 하게는, 톨-유사 수용체 (TLR)가 종종 다른 비-옵소닌 수용체와 협력하여 흡수 및 신호전달을 촉진시킴에도 불구하고, 이들은 감지기이고, 식균성 진입 수용체가 아니다 (Gordon 2016).
원형질막 수용체는 주로 IgG 항체의 보존된 도메인에 대한 옵소닌성 FcR (활성화 또는 억제성), 및 보체 활성화의 전형적인 (IgM 또는 IgG) 또는 대안적인 렉틴 경로에 의해 침착된 iC3b에 대한 보체 수용체, 예컨대 CR3으로 분류될 수 있다. CR3은 아마도 대식세포-유래된 보체를 침착시킴으로써 옵소닌의 부재 하에 인식을 또한 매개할 수 있다. 원형질- 또는 세포-유래된 옵소닌에는 피브로넥틴, 만노스-결합 렉틴, 유지방 글로불린 (MFG-E8)이 포함된다. 가장 일반적인 식균성 수용체의 목록은 표 A에 제시되어 있다 (Rosales 2017).
지금까지 4가지 β-글루칸 수용체, 즉, 보체 수용체 3 (CR3; CD11b/CD18), 락토실세라미드, 선택된 스캐빈저 수용체, 및 dectin-1 (βGR)이 항진균성 식균 활성을 매개하는 후보로서 확인되었다. Dectin-1은 단일 C-유형, 렉틴-유사, 탄수화물 인식 도메인, 짧은 줄기, 및 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 갖는 세포질 꼬리로 이루어진다. 수용체는 β-글루칸-의존성 방식으로 지모산, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 및 열-사멸된 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 같은 입자를 인식한다 (Taylor 2002). Dectin-1은 명백히 식균작용을 활성화시키는데 충분한 것으로 제시된 바 있다. 이는 골수성 수지상 세포, 단핵구, 대식세포 및 B 세포 상에서 발현된다.
전반적인 식균작용을 증가시키지 않고 축적된 질환-유발 인자의 표적화된 제거 및 분해를 개발하는 것이 유익할 것이다. 본 개시내용은 문제에 대한 해결을 제공하고, 다른 이점을 기재한다.
특허 출원, 특허 공보 및 과학 문헌을 비롯하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 참고문헌이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함된다고 나타낸 것과 같이 그들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용은 질환-유발 인자에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 대식세포 상에서 발현되는 식균성 수용체인 Dectin-1에 결합하고 식균작용을 유도하는 제2 결합 도메인, 및 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 포함하는 분자의 투여 시 인간 대상체에서 숙주 세포, 또는 숙주 세포 생성물, 미생물 또는 그들의 생성물을 비롯한 질환-유발 인자의 수를 제거하고 분해하는 방법에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 표적화된 식균작용에 의해 조직, 혈액 및/또는 골수에서 질환-유발 인자를 고갈시키거나 또는 그의 수를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 질환-유발 인자에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 및 대식세포, 단핵구 및/또는 과립구 상에서 발현되는 식균성 수용체에 결합하고 대식세포, 단핵구 및/또는 과립구의 식균작용 활성을 유도하는 제2 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 표적화된 식균작용에 의해 질환-유발 인자의 수를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 식균성 수용체는 Dectin-1, 예를 들어 인간 Dectin-1이다. 일부 실시양태에서, 질환-유발 인자에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인 및 Dectin-1에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 결합 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환-유발 인자의 수를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 항체 (예를 들어, 다중특이적 또는 이중특이적 항체)이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 질환-유발 인자에 의해 발현되는 표적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 질환-유발 인자에 의해 발현되는 표적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이며, 이중특이적 항체는 도 1a에 제시되고/거나 그를 참조하여 기재된 포맷을 갖는다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질의 투여는 상기 인자의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질의 투여는 상기 인자의 수를 검출 한계 미만으로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질의 투여는 결합 단백질의 투여 후 적어도 약 1 주 동안 상기 인자의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질의 투여는 투여 후 12 시간 내에, 24 시간 내에, 36 시간 내에 또는 48 시간 내에 상기 인자의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 질환-유발 인자의 감소는 예를 들어 결합 단백질의 투여가 중단된 후에 가역적이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질의 투여는 대상체에서 하나 이상의 증상의 중증도 및/또는 발병률을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 질환-연관된 단백질 또는 단백질 응집물을 제거하고/거나 그의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비정상적인 단백질 축적을 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 질환, 예를 들어 신경변성 질환, 섬유증, 또는 아밀로이드증의 하나 이상의 증상의 진행을 완화시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 표적 단백질 또는 단백질 응집물에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 암, 종양 또는 림프종 세포를 제거하고/거나 그의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 암의 하나 이상의 증상을 완화시키고/거나 암의 진행을 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 암 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 암 세포의 표면 상에서 발현되는 종양 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 미생물 (예를 들어, 박테리아 세포, 진균 세포, 원생동물 세포, 또는 바이러스)을 제거하고/거나 그의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 미생물 (예를 들어, 박테리아 세포, 진균 세포, 원생동물 세포, 또는 바이러스)에 의해 유발된 질환 또는 감염의 하나 이상의 증상의 진행을 완화시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 박테리아 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 박테리아 세포의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 진균 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 진균 세포의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 원생동물 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 원생동물 세포의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 바이러스에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 바이러스의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 노쇠 세포 및/또는 그들의 생성물(들)을 제거하고/거나 그의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들어 하나 이상의 연령-관련 증상 또는 상태에서 노화의 진행을 완화시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 노쇠 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 노쇠 세포의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 LDL 및 심혈관 질환, 예를 들어 동맥경화증 또는 가족성 고콜레스테롤혈증을 유도하는 다른 인자를 제거하고/거나 그의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 심혈관 질환, 예를 들어 동맥경화증 또는 가족성 고콜레스테롤혈증의 하나 이상의 증상의 진행을 완화시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 지단백질 입자 (예를 들어, LDL)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 비만 세포를 제거하고/거나 그의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 비만 세포-관련 질환, 예를 들어 알러지, 섬유증, COPD, 천식, 또는 다른 면역증식성의 비만 세포-관련 질환의 하나 이상의 증상의 진행을 완화시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 비만 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 비만 세포의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 호산구를 제거하고/거나 그의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 호산구-관련 질환, 예를 들어 알러지, 섬유증, COPD, 천식, 또는 다른 면역증식성의 호산구-관련 질환의 하나 이상의 증상의 진행을 완화시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 호산구에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 호산구의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 ILC2 세포를 제거하고/거나 그의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 ILC2-관련 질환, 예를 들어 알러지, 섬유증, COPD, 천식, 또는 다른 면역증식성의 ILC2-관련 질환의 하나 이상의 증상의 진행을 완화시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 ILC2 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, ILC2 세포의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들어 근육, GI 관, 폐, 심장, 관절 및 뇌로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 조직에서 염증성 면역 세포를 제거하고/거나 그의 수준을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 근육염, IBD, RA, 알러지, 섬유증, COPD, 천식, 또는 다른 면역증식성 염증성 면역 세포-관련 질환의 하나 이상의 증상의 진행을 완화시키거나 또는 예방한다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질은 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 염증성 면역 세포에 의해 발현되는 표적 항원 (예를 들어, 염증성 면역 세포의 표면 상에서 발현되는 항원)에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, 결합 단백질은 항체; 공유 결합된 2개의 항체 또는 IgG; IgG-scFv; 인트라바디; 펩티바디; 나노바디; 단일 도메인 항체; SMTP; 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 탠덤 디-scFV, 탠덤 트리-scFv, ADAPTIR); Fab, Fab', F(ab')2, 또는 Fv 단편; Fab'-SH 또는 F(ab')2 디아바디; 선형 항체; scFv 항체; VH 항체; 또는 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질의 하나 이상의 결합 도메인(들)은 비-인간, 키메라, 인간화, 또는 인간이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질의 하나 이상의 결합 도메인(들)은 인간화 또는 인간이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질의 결합 도메인 둘 다가 비-인간, 키메라, 인간화, 또는 인간이다. 일부 실시양태에서, 결합 단백질의 결합 도메인 둘 다가 인간화 또는 인간이다.
본원에 기재된 다양한 실시양태의 하나, 일부 또는 모든 성질이 조합되어 본 개시내용의 다른 실시양태를 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 본 개시내용의 이들 및 다른 측면은 관련 기술분야의 기술자에게 명백해질 것이다. 본 개시내용의 이들 및 다른 실시양태는 하기 상세한 설명에 의해 추가로 기재된다.
도 1a는 일부 실시양태에 따라 표적화된 식균작용에 대한 항체 분자의 개략적인 도해를 제공한다. Dectin-1 (d) 및 질환-유발 인자 (a)에 결합하는 이중특이적 항체는 도 1a의 패널 A에 제시된다. IgG-scFv 분자의 예는 도 1a의 패널 B 및 C에 제시된다. 공유 결합된 2개의 IgG 분자 (IgG2)는 도 1a의 패널 D에 제시된다. 질환-유발 인자에 대해 특이적인 IgG는 탄수화물, 예컨대 커들란 (c)를 함유하는 β-1,6-연결된 글루칸에 공유 부착되었다.
도 1b는 단핵구/대식세포에 의한 식균작용을 통해 질환-유발 인자의 제거 및 분해에 대한 작용 메카니즘의 개략적인 개요를 제공한다. 본 개시내용은 한 아암 상에서 식균성 수용체 Dectin-1에 결합하고, 다른 아암 상에서 질환-유발 인자 (예를 들어 종양 세포, 박테리아, 바이러스, LDL, 단백질 응집물 등)에 결합하는 분자, 예컨대 이중특이적 항체의 개발을 기재한다. 결속 시, 질환-유발 인자는 식균세포에 의해 포식되고, 엔도-리소좀 경로를 통해 제거된다. 이는 조직 및 혈액에서 질환-유발 인자의 유의한 감소를 유도할 수 있다.
도 2는 2가지 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플에서 Dectin-1의 유동 세포측정 분석을 제시한다. 형광단-접합된 계통- 및 세포 유형-특이적 항체를 사용하여 단일의 살아있는 단핵구 및 림프구 집단을 게이팅하여, 각각의 면역 세포 집단을 확인하였다. Dectin-1 발현은 Dectin-1 항체로부터의 형광 신호 (클론 15e2; 표지됨)를 형광 마이너스 원 (FMO: fluorescence minus one) 및 이소타입 대조군 (IgG2a; 표지됨)과 비교함으로써 결정되었다. Dectin-1 수용체 수 및 Dectin-1 양성 세포의 퍼센트 (괄호 안)는 검출되는 경우 히스토그램에 표시된다. Dectin-1 발현은 단핵구에서 검출되었지만, 림프구 집단에서는 검출되지 않았다.
도 3은 3가지 건강한 공여자 말초 혈액 백혈구 (PBL) 샘플에서 Dectin-1의 유동 세포측정 분석을 제시한다. 단일의 살아있는 단핵구 및 과립구 집단을 전방 및 측면 스캐터를 이용하여 게이팅하였다. Dectin-1 발현은 Dectin-1 항체로부터의 형광 신호 (클론 15e2; 표지됨)를 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소타입 대조군 (IgG2a; 표지됨)과 비교함으로써 결정되었다. Dectin-1 수용체 수 및 Dectin-1 양성 세포의 퍼센트 (괄호 안)는 히스토그램에 표시된다. Dectin-1은 단핵구와 비교할 때 또 다른 부류의 식균성 세포인 과립구에서 낮은 수준으로 발현되었다.
도 4는 건강한 공여자로부터의 단핵구-유래된 배양된 대식세포에서 Dectin-1의 유동 세포측정 분석을 제시한다. 단핵구를 MCSF (20 ng/ml) 중에서 7 일 동안 배양시켜, 이들이 대식세포로 분화되도록 하였다. 이어서, 단일의 살아있는 세포를 CD11b로 염색하여 대식세포 분화를 확인하였다. Dectin-1 발현은 Dectin-1 항체로부터의 형광 신호 (클론 15e2; 히스토그램에서 우측 피크)를 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소타입 대조군 (IgG2a; 히스토그램에서 좌측 피크)과 비교함으로써 결정되었다. Dectin-1 발현은 단핵구-유래된 대식세포에서 유지되는 것으로 확인되었다.
도 5는 건강한 공여자로부터의 폐 면역 세포에서 Dectin-1의 유동 세포측정 분석을 제시한다. 건강한 공여자로부터의 조직 폐 샘플을 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec) 조직 해리 키트를 사용하여 해리시켰다. CD45를 사용하여 조혈 세포를 게이팅하였다. CD3+ (T 세포), CD3-CD19+ (B 세포) 및 CD3-CD56+ (NK 세포) 게이트를 사용함으로써 CD45+ 세포 상에서 림프구 집단을 확인하였다. CD45+ 세포 상에서 T, B 및 NK 세포를 배제시킨 후에 CD163 및 CD11b를 사용하여 대식세포를 게이팅하였다. Dectin-1 발현은 Dectin-1 항체로부터의 형광 신호 (클론 15e2; 히스토그램에서 우측 피크)를 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소타입 대조군 (IgG2a; 히스토그램에서 좌측 피크)과 비교함으로써 결정되었다. Dectin-1 수용체 수 및 Dectin-1 양성 세포의 퍼센트 (괄호 안)는 히스토그램에 표시된다. Dectin-1은 대식세포 상에서 선택적으로 발현되는 것으로 확인되었지만, 건강한 인간 폐 조직의 림프구 또는 비-조혈 세포에서는 검출되지 않았다.
도 6은 대조군 HEK293 세포 (HEK-블루 Null1 세포), 인간 Dectin-1 이소형 A (HEK-블루 hDectin-1a 세포) 또는 이소형 B (HEK-블루 hDectin-1b 세포)를 과발현하도록 조작된 HEK293 세포, 및 인간 Dectin-1A를 발현하는 구축물에 의해 일시적으로 형질감염된 (293F hDectin-1a FL) 프리스타일293(Freestyle293) 세포에서 Dectin-1 발현의 유동 세포측정 분석을 제시한다. Dectin-1은 Dectin-1 항체 (클론 15e2; 히스토그램에서 우측 피크)에 의해 검출되고, 이소타입 대조군 (IgG2a; 히스토그램에서 좌측 피크)과 비교되었다. Dectin-1 항체 (클론 15e2)는 Dectin-1을 과발현하는 HEK293 세포에서 Dectin-1의 A 및 B 이소형 둘 다를 인식한다. Dectin-1의 발현은 다중 Dectin-1 항체 클론 (259931, GE2 및 BD6, 이들은 A 이소형만을 인식함)에 의해 확인되었다.
도 7은 유동 세포측정에 의해 PBMC로부터 유래된 시노몰구스 원숭이 단핵구에서 Dectin-1 항체 클론 15e2 및 259931의 결합 분석을 제시한다. 단일의 살아있는 및 CD14+ 세포를 게이팅하여 단핵구를 확인하였다. 세포를 Dectin-1 일차 항체 (클론 15e2 및 259931) 및 그들 각각의 이소타입 대조군, IgG2a 및 IgG2b와 함께, 이어서 형광 항-마우스 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 일차 항체 15e2 및 259921은 100, 33.3, 11.1, 3.7, 1.23 및 0.41 nM의 연속 용량 적정에서 및 이소타입 대조군은 166, 55.3, 18.4 및 6.150 nM의 연속 용량 적정에서 사용되었다. 인간 Dectin1 항체 (클론 15e2 및 259931)는 단핵구 상에서 발현된 시노몰구스 Dectin-1과 교차-반응성을 나타내었다.
도 8은 HEK-블루 hDectin-1a 세포에서 Dectin-1의 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 리포터 검정을 제시한다. Dectin-1/NF-kB/SEAP 신호전달 경로에서 유전자를 발현하고, Dectin-1 리간드에 대한 반응으로 SEAP 반응을 갖도록 HEK-블루 hDectin-1a 세포를 조작하였다. Dectin-1 또는 이소타입 항체와 함께 인큐베이션된 세포에서 SEAP 생성을 모니터링하였다. 이소타입 대조군 항체가 아니라 Dectin-1 항체에 의한 자극에 의해 알칼리성 포스파타제 분비의 유도가 도 8의 상부 패널에 제시된다. Dectin-1 항체에 의해 자극된 세포에서 활성은 Dectin-1의 천연 리간드인 지모산에 의해 HEK-블루 hDectin-1a 세포를 자극하는 것과 비슷하였다. 도 8의 하부 패널은 알칼리성 포스파타제 분비에 대한 Dectin-1 항체의 용량-의존성 효과를 제시한다. 세포를 0.1 - 10 μg / 웰 범위의 양으로 Dectin-1 또는 이소타입 항체와 함께 인큐베이션하여 용량-반응 곡선을 생성하였다.
도 9a & 9b는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pH-민감성 형광 염료 (pHrodo 레드)로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군과 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 HEK-블루 hDectin-1a 세포 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. HEK-블루 hDectin-1a 세포를 세포-침투성 염료 칼세인(Calcein) AM으로 표지하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트(IncuCyte) 라이브 세포 영상화 또는 유동 세포측정에 의해 모니터링하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-표지된 객체의 중첩으로서 표현하였다. 도 9a의 상부 패널은 3 시간에 걸쳐 비드의 식균작용의 측정을 제시하는 반면에, 도 9a의 하부 패널은 식균작용 2.5 시간 시점에서 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다. 비드에 커플링된 Dectin-1 항체는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에서 식균작용을 촉진시킨다. 도 9b에서는, 식균작용의 유동 세포측정이 제시된다. Dectin-1 항체 클론 (클론 15e2 및 259931) 또는 이소타입 항체에 커플링된 비드에 의한 식균작용을 시험하였다. 포식된 비드는 히스토그램에서 우측 피크에 의해 표시된다. Dectin-1 항체에 커플링된 비드는 이소타입 항체에 커플링된 비드에 비해 유의하게 더 높은 수준 (2.1-4.5배)의 식균작용을 유도하였다 (p<0.0001; 홀름-사이닥(Holm-Sidak) 다중 비교에 의한 2-원 anova).
도 10은 HEK-블루 hDectin-1a 세포에서 Dectin-1에 대한 식균작용의 특이성을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm, 400,000개 / 웰)를 pHrodo로 표지하였고, 20 ng 내지 400 ng 범위의 증가된 양의 Dectin-1 항체 (클론 15e2) 또는 이소타입 대조군 (IgG2a)과 혼합하였다. 비드의 항체 결합 능력으로 인해, 20 ng보다 많은 양의 15e2 항체는 비결합 15e2 항체를 과량으로 생성하였다. 비결합 Dectin-1 항체를 제거하지 않고 HEK-블루 hDectin-1a 세포 (50,000개 / 웰)를 Dectin-1-접합된 비드와 혼합하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 10은 4 시간에 걸쳐 비드의 식균작용의 측정을 제시한다 (상부 패널). 4 시간 시점에서 20 ng 또는 40 ng vs 100 ng 및 100 ng vs 200 ng 또는 400 ng의 Dectin-1 항체 양 사이에서 식균작용에서의 유의한 차이가 관찰되었다 (****p<0.0001; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1-특이적 항체에 커플링된 비드에 의해 유도된 식균작용은 과량의 유리 Dectin-1 항체의 존재 하에 감소되었다. 도 10은 또한 식균작용 2 시간 시점에서 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다 (하부 패널).
도 11a & 11b는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 상이한 크기의 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (0.85, 3.4 및 8 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 HEK-블루 hDectin-1a 세포 (50,000개 / 웰)와 함께 1:12의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 11a는 5 시간 과정에 걸친 비드의 식균작용을 제시한다. Dectin-1 항체에 접합된 비드의 식균작용은 시험한 모든 비드 크기에 대해 이소타입 항체에 접합된 비드에 비해 유의하게 더 높았다 (****p<0.0001; *p<0.05; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). 도 11b는 5 시간 시점에서 제시된 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다. 영상에서, 화살표는 비드를 표시하는 반면에, 원은 pHrodo 양성 세포를 표시한다.
도 12a & 12b는 HEK-블루 hDectin-1a 및 HEK-블루 hDectin-1b 세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 (클론 15e2 또는 259931) 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 HEK-블루 hDectin-1a (도 12a) 또는 HEK-블루 hDectin-1b 세포 (도 12b) (50,000개 / 웰)와 함께 1:10의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 세포를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. 비드의 식균작용을 3 시간에 걸쳐 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였고, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. Dectin-1 항체에 접합된 비드의 식균작용은 HEK-블루 hDectin-1a 및 HEK-블루 hDectin-1b 세포 둘 다에서 이소타입 항체에 접합된 비드에 비해 유의하게 더 높았다 (****,^^^^p<0.0001; ***,^^^p<0.001; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1 항체 클론 둘 다는 Dectin-1 이소형 A를 발현하는 세포에서 비슷한 수준으로 식균작용을 촉진시켰다 (도 12a). 259931 항체 클론은 15e2 클론에 비해 Dectin-1 이소형 B를 발현하는 세포에서 더 높은 수준의 식균작용을 촉진시켰다 (도 12b).
도 13a-13c는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 다양한 크기, 0.85 (도 13a), 3.4 (도 13b) 및 8 μm (도 13c)의 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드를 pHrodo로 표지하였고, Dectin-1 항체 (클론 15e2 또는 259931) 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 HEK-블루 hDectin-1a 세포 (50,000개 / 웰)와 함께 1:12의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 비드의 식균작용을 5 시간에 걸쳐 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였고, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. Dectin-1 항체 클론 둘 다는 이소타입 대조군에 비해 모든 크기의 비드의 유의하게 더 높은 수준의 식균작용을 유도하였다 (****,^^^^ p<0.0001; ^^p<0.01; *,^p,0.05; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). 259931 클론은 15e2와 비교하여 중간 크기의 입자의 유사한 수준의 식균작용을 촉진시켰지만, 매우 작은 및 매우 큰 입자의 더욱 유효한 식균작용을 촉진시켰다.
도 14a-14c는 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 인간 단핵구 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 14a는 3 시간에 걸친 비드의 식균작용의 측정을 제시하는 반면에, 도 14b는 식균작용 2 시간째에 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다. Dectin-1 항체 (클론 15e2)는 이소타입 대조군에 비해 단핵구에 의해 유의하게 더 높은 수준의 식균작용을 유도하였다 (**** p<0.0001; ***p<0.001; ** p<0.01; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1은 인간 단핵구에 의한 비드의 식균작용을 촉진시켰다. 도 14c는 식균작용의 유동 세포측정 평가를 제시한다. 포식된 비드는 히스토그램에서 우측 피크에 의해 표시된다. Dectin-1 항체에 커플링된 비드는 이소타입 항체에 커플링된 비드에 비해 인간 단핵구에 의해 유의하게 더 높은 수준 (1.6배)의 식균작용을 유도하였다.
도 15는 FcgR 차단 항체의 존재 하에 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, FcgR 매개된 식균작용을 배제하기 위해 FcgR 차단 항체의 존재 하에 비드를 배양된 인간 단핵구 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. pHrodo-양성 세포의 영상을 식균작용 3 시간째에 취하였다. FcgR 차단 항체의 첨가는 Dectin-1 항체-유도된 식균작용을 방지하지 않았으며 (상부 우측 및 하부 우측 참조), 이는 Dectin-1이 Fcy 수용체와는 독립적으로 식균작용을 유도함을 나타낸다.
도 16은 시토칼라신 D로 처리된 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo 표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 5 μM 시토칼라신 D (CytoD)의 존재 또는 부재 하에 배양된 인간 단핵구 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 16은 3 시간에 걸친 비드의 식균작용의 측정 (상부 플롯), 뿐만 아니라 식균작용 3 시간째에 pHrodo-양성 세포의 대표적인 영상 (하부 영상)을 제시한다. Dectin-1 항체는 이소타입 대조군에 비해 유의하게 더 높은 수준에서 식균작용을 유도하였다 (**** p<0.0001; ***p<0.001; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1 항체-의존성 식균작용은 CytoD의 첨가에 의해 억제되었고, 이는 액틴 중합이 인간 단핵구에서 Dectin-1-유도된 식균작용을 위해 필요함을 입증한다.
도 17은 인간 대식세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 단핵구-유래된 대식세포 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 대식세포를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. 비드 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 17은 3 시간에 걸친 비드의 식균작용의 측정 (상부 플롯), 뿐만 아니라 식균작용 3 시간째에 pHrodo-양성 세포의 대표적인 영상 (하부 영상)을 제시한다. Dectin-1 항체는 이소타입 대조군에 비해 유의하게 더 높은 수준으로 대식세포에 의한 식균작용을 유도하였다 (**** p<0.0001; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1 항체는 배양된 인간 대식세포에서 비드의 유도된 식균작용을 촉진시킨다.
도 18a-18c는 Dectin-1 이중특이적 항체에 의해 매개된 바이러스의 포식을 제시한다. 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)을 H3N2 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질에 결합하는 항-H3N2 항체인 pHrodo-표지된 스트렙타비딘-12CA5 항체 (12CA5-SA-pHr)에 접합시켰다. HEK-블루 hDectin-1a 세포를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였고, 96-웰 플레이트 (50,000개 / 웰)에 시딩하였다. 15e2-B 또는 이소타입 대조군을 12CA5-SA-pHr과 혼합하였고, 30 분 동안 이중특이적 항체가 형성되게 하였다. 가용성의 이중특이적 항체를 40 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 pHrodo 활성화를 평가함으로써 모니터링하였다. 도 18a는 이중특이적 Dectin-1/12CA5 항체와 세포의 접합을 제시한다. 이 포맷을 이용하여 세포를 H3N2 바이러스에 연결시킬 수 있다. 도 18b는 실험 18 시간째에 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다 (포식된 12CA5 pHrodo 표지된 항체는 파고솜에서 밝은 적색 형광을 냄). 도 18c는 24 시간에 걸친 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 제시한다. 포식을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 적색 객체 카운트 (pHrodo)의 중첩으로 표현하였다. **** p<0.0001 vs 이소타입. 홀름-사이닥 다중 비교 시험에 의한 2-원 anova.
도 19a & 19b는 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 이중특이적 항체의 포식을 제시한다. 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)을 H3N2 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질에 결합하는 항-H3N2 항체인 pHrodo 표지된 스트렙타비딘-12CA5 (12CA5-SA-pHr)에 접합시켰다. 인간 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였고, 96-웰 플레이트 (50,000개 / 웰)에 시딩하였다. 15e2-B 또는 이소타입 대조군 항체를 12CA5-SA-pHr과 혼합하였고, 30 분 동안 이중특이적 항체가 형성되게 하였다. 가용성의 이중특이적 항체를 40 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 pHrodo 활성화를 평가함으로써 모니터링하였다. 도 19a는 21 시간에 걸친 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 제시하며, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 적색 객체 카운트 (pHrodo)의 중첩으로 표현하였다. ** p<0.01; **** p<0.0001 vs 이소타입. 홀름-사이닥 다중 비교 시험에 의한 2-원 anova. 도 19b는 실험 6 시간째의 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다 (포식된 12CA5 pHrodo 표지된 항체는 파고솜에서 밝은 적색 형광을 냄).
도 20a & 20b는 인간 단핵구에 의한 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)에 접합된 스트렙타비딘 FITC-표지된 폴리스티렌 비드 (40 nm)의 포식을 제시한다. 폴리스티렌 FITC 비드를 30 분 동안 비오틴화 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군으로 포화시켰다. 이어서, 항체/비드 복합체를 배양된 인간 단핵구와 함께 1:6 (세포:비드)의 비로 인큐베이션하였다. 단핵구의 FITC 염색을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 도 20a는 21 시간에 걸친 단핵구에 의한 SA-FITC 비드의 포식을 제시하며, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 녹색 (FITC 양성) 객체 카운트로 표현하였다. 도 20b는 실험 15 시간째에 FITC 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다.
도 1b는 단핵구/대식세포에 의한 식균작용을 통해 질환-유발 인자의 제거 및 분해에 대한 작용 메카니즘의 개략적인 개요를 제공한다. 본 개시내용은 한 아암 상에서 식균성 수용체 Dectin-1에 결합하고, 다른 아암 상에서 질환-유발 인자 (예를 들어 종양 세포, 박테리아, 바이러스, LDL, 단백질 응집물 등)에 결합하는 분자, 예컨대 이중특이적 항체의 개발을 기재한다. 결속 시, 질환-유발 인자는 식균세포에 의해 포식되고, 엔도-리소좀 경로를 통해 제거된다. 이는 조직 및 혈액에서 질환-유발 인자의 유의한 감소를 유도할 수 있다.
도 2는 2가지 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플에서 Dectin-1의 유동 세포측정 분석을 제시한다. 형광단-접합된 계통- 및 세포 유형-특이적 항체를 사용하여 단일의 살아있는 단핵구 및 림프구 집단을 게이팅하여, 각각의 면역 세포 집단을 확인하였다. Dectin-1 발현은 Dectin-1 항체로부터의 형광 신호 (클론 15e2; 표지됨)를 형광 마이너스 원 (FMO: fluorescence minus one) 및 이소타입 대조군 (IgG2a; 표지됨)과 비교함으로써 결정되었다. Dectin-1 수용체 수 및 Dectin-1 양성 세포의 퍼센트 (괄호 안)는 검출되는 경우 히스토그램에 표시된다. Dectin-1 발현은 단핵구에서 검출되었지만, 림프구 집단에서는 검출되지 않았다.
도 3은 3가지 건강한 공여자 말초 혈액 백혈구 (PBL) 샘플에서 Dectin-1의 유동 세포측정 분석을 제시한다. 단일의 살아있는 단핵구 및 과립구 집단을 전방 및 측면 스캐터를 이용하여 게이팅하였다. Dectin-1 발현은 Dectin-1 항체로부터의 형광 신호 (클론 15e2; 표지됨)를 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소타입 대조군 (IgG2a; 표지됨)과 비교함으로써 결정되었다. Dectin-1 수용체 수 및 Dectin-1 양성 세포의 퍼센트 (괄호 안)는 히스토그램에 표시된다. Dectin-1은 단핵구와 비교할 때 또 다른 부류의 식균성 세포인 과립구에서 낮은 수준으로 발현되었다.
도 4는 건강한 공여자로부터의 단핵구-유래된 배양된 대식세포에서 Dectin-1의 유동 세포측정 분석을 제시한다. 단핵구를 MCSF (20 ng/ml) 중에서 7 일 동안 배양시켜, 이들이 대식세포로 분화되도록 하였다. 이어서, 단일의 살아있는 세포를 CD11b로 염색하여 대식세포 분화를 확인하였다. Dectin-1 발현은 Dectin-1 항체로부터의 형광 신호 (클론 15e2; 히스토그램에서 우측 피크)를 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소타입 대조군 (IgG2a; 히스토그램에서 좌측 피크)과 비교함으로써 결정되었다. Dectin-1 발현은 단핵구-유래된 대식세포에서 유지되는 것으로 확인되었다.
도 5는 건강한 공여자로부터의 폐 면역 세포에서 Dectin-1의 유동 세포측정 분석을 제시한다. 건강한 공여자로부터의 조직 폐 샘플을 밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec) 조직 해리 키트를 사용하여 해리시켰다. CD45를 사용하여 조혈 세포를 게이팅하였다. CD3+ (T 세포), CD3-CD19+ (B 세포) 및 CD3-CD56+ (NK 세포) 게이트를 사용함으로써 CD45+ 세포 상에서 림프구 집단을 확인하였다. CD45+ 세포 상에서 T, B 및 NK 세포를 배제시킨 후에 CD163 및 CD11b를 사용하여 대식세포를 게이팅하였다. Dectin-1 발현은 Dectin-1 항체로부터의 형광 신호 (클론 15e2; 히스토그램에서 우측 피크)를 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소타입 대조군 (IgG2a; 히스토그램에서 좌측 피크)과 비교함으로써 결정되었다. Dectin-1 수용체 수 및 Dectin-1 양성 세포의 퍼센트 (괄호 안)는 히스토그램에 표시된다. Dectin-1은 대식세포 상에서 선택적으로 발현되는 것으로 확인되었지만, 건강한 인간 폐 조직의 림프구 또는 비-조혈 세포에서는 검출되지 않았다.
도 6은 대조군 HEK293 세포 (HEK-블루 Null1 세포), 인간 Dectin-1 이소형 A (HEK-블루 hDectin-1a 세포) 또는 이소형 B (HEK-블루 hDectin-1b 세포)를 과발현하도록 조작된 HEK293 세포, 및 인간 Dectin-1A를 발현하는 구축물에 의해 일시적으로 형질감염된 (293F hDectin-1a FL) 프리스타일293(Freestyle293) 세포에서 Dectin-1 발현의 유동 세포측정 분석을 제시한다. Dectin-1은 Dectin-1 항체 (클론 15e2; 히스토그램에서 우측 피크)에 의해 검출되고, 이소타입 대조군 (IgG2a; 히스토그램에서 좌측 피크)과 비교되었다. Dectin-1 항체 (클론 15e2)는 Dectin-1을 과발현하는 HEK293 세포에서 Dectin-1의 A 및 B 이소형 둘 다를 인식한다. Dectin-1의 발현은 다중 Dectin-1 항체 클론 (259931, GE2 및 BD6, 이들은 A 이소형만을 인식함)에 의해 확인되었다.
도 7은 유동 세포측정에 의해 PBMC로부터 유래된 시노몰구스 원숭이 단핵구에서 Dectin-1 항체 클론 15e2 및 259931의 결합 분석을 제시한다. 단일의 살아있는 및 CD14+ 세포를 게이팅하여 단핵구를 확인하였다. 세포를 Dectin-1 일차 항체 (클론 15e2 및 259931) 및 그들 각각의 이소타입 대조군, IgG2a 및 IgG2b와 함께, 이어서 형광 항-마우스 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 일차 항체 15e2 및 259921은 100, 33.3, 11.1, 3.7, 1.23 및 0.41 nM의 연속 용량 적정에서 및 이소타입 대조군은 166, 55.3, 18.4 및 6.150 nM의 연속 용량 적정에서 사용되었다. 인간 Dectin1 항체 (클론 15e2 및 259931)는 단핵구 상에서 발현된 시노몰구스 Dectin-1과 교차-반응성을 나타내었다.
도 8은 HEK-블루 hDectin-1a 세포에서 Dectin-1의 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP) 리포터 검정을 제시한다. Dectin-1/NF-kB/SEAP 신호전달 경로에서 유전자를 발현하고, Dectin-1 리간드에 대한 반응으로 SEAP 반응을 갖도록 HEK-블루 hDectin-1a 세포를 조작하였다. Dectin-1 또는 이소타입 항체와 함께 인큐베이션된 세포에서 SEAP 생성을 모니터링하였다. 이소타입 대조군 항체가 아니라 Dectin-1 항체에 의한 자극에 의해 알칼리성 포스파타제 분비의 유도가 도 8의 상부 패널에 제시된다. Dectin-1 항체에 의해 자극된 세포에서 활성은 Dectin-1의 천연 리간드인 지모산에 의해 HEK-블루 hDectin-1a 세포를 자극하는 것과 비슷하였다. 도 8의 하부 패널은 알칼리성 포스파타제 분비에 대한 Dectin-1 항체의 용량-의존성 효과를 제시한다. 세포를 0.1 - 10 μg / 웰 범위의 양으로 Dectin-1 또는 이소타입 항체와 함께 인큐베이션하여 용량-반응 곡선을 생성하였다.
도 9a & 9b는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pH-민감성 형광 염료 (pHrodo 레드)로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군과 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 HEK-블루 hDectin-1a 세포 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. HEK-블루 hDectin-1a 세포를 세포-침투성 염료 칼세인(Calcein) AM으로 표지하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트(IncuCyte) 라이브 세포 영상화 또는 유동 세포측정에 의해 모니터링하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-표지된 객체의 중첩으로서 표현하였다. 도 9a의 상부 패널은 3 시간에 걸쳐 비드의 식균작용의 측정을 제시하는 반면에, 도 9a의 하부 패널은 식균작용 2.5 시간 시점에서 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다. 비드에 커플링된 Dectin-1 항체는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에서 식균작용을 촉진시킨다. 도 9b에서는, 식균작용의 유동 세포측정이 제시된다. Dectin-1 항체 클론 (클론 15e2 및 259931) 또는 이소타입 항체에 커플링된 비드에 의한 식균작용을 시험하였다. 포식된 비드는 히스토그램에서 우측 피크에 의해 표시된다. Dectin-1 항체에 커플링된 비드는 이소타입 항체에 커플링된 비드에 비해 유의하게 더 높은 수준 (2.1-4.5배)의 식균작용을 유도하였다 (p<0.0001; 홀름-사이닥(Holm-Sidak) 다중 비교에 의한 2-원 anova).
도 10은 HEK-블루 hDectin-1a 세포에서 Dectin-1에 대한 식균작용의 특이성을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm, 400,000개 / 웰)를 pHrodo로 표지하였고, 20 ng 내지 400 ng 범위의 증가된 양의 Dectin-1 항체 (클론 15e2) 또는 이소타입 대조군 (IgG2a)과 혼합하였다. 비드의 항체 결합 능력으로 인해, 20 ng보다 많은 양의 15e2 항체는 비결합 15e2 항체를 과량으로 생성하였다. 비결합 Dectin-1 항체를 제거하지 않고 HEK-블루 hDectin-1a 세포 (50,000개 / 웰)를 Dectin-1-접합된 비드와 혼합하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 10은 4 시간에 걸쳐 비드의 식균작용의 측정을 제시한다 (상부 패널). 4 시간 시점에서 20 ng 또는 40 ng vs 100 ng 및 100 ng vs 200 ng 또는 400 ng의 Dectin-1 항체 양 사이에서 식균작용에서의 유의한 차이가 관찰되었다 (****p<0.0001; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1-특이적 항체에 커플링된 비드에 의해 유도된 식균작용은 과량의 유리 Dectin-1 항체의 존재 하에 감소되었다. 도 10은 또한 식균작용 2 시간 시점에서 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다 (하부 패널).
도 11a & 11b는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 상이한 크기의 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (0.85, 3.4 및 8 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 HEK-블루 hDectin-1a 세포 (50,000개 / 웰)와 함께 1:12의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 11a는 5 시간 과정에 걸친 비드의 식균작용을 제시한다. Dectin-1 항체에 접합된 비드의 식균작용은 시험한 모든 비드 크기에 대해 이소타입 항체에 접합된 비드에 비해 유의하게 더 높았다 (****p<0.0001; *p<0.05; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). 도 11b는 5 시간 시점에서 제시된 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다. 영상에서, 화살표는 비드를 표시하는 반면에, 원은 pHrodo 양성 세포를 표시한다.
도 12a & 12b는 HEK-블루 hDectin-1a 및 HEK-블루 hDectin-1b 세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 (클론 15e2 또는 259931) 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 HEK-블루 hDectin-1a (도 12a) 또는 HEK-블루 hDectin-1b 세포 (도 12b) (50,000개 / 웰)와 함께 1:10의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 세포를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. 비드의 식균작용을 3 시간에 걸쳐 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였고, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. Dectin-1 항체에 접합된 비드의 식균작용은 HEK-블루 hDectin-1a 및 HEK-블루 hDectin-1b 세포 둘 다에서 이소타입 항체에 접합된 비드에 비해 유의하게 더 높았다 (****,^^^^p<0.0001; ***,^^^p<0.001; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1 항체 클론 둘 다는 Dectin-1 이소형 A를 발현하는 세포에서 비슷한 수준으로 식균작용을 촉진시켰다 (도 12a). 259931 항체 클론은 15e2 클론에 비해 Dectin-1 이소형 B를 발현하는 세포에서 더 높은 수준의 식균작용을 촉진시켰다 (도 12b).
도 13a-13c는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 다양한 크기, 0.85 (도 13a), 3.4 (도 13b) 및 8 μm (도 13c)의 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드를 pHrodo로 표지하였고, Dectin-1 항체 (클론 15e2 또는 259931) 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 HEK-블루 hDectin-1a 세포 (50,000개 / 웰)와 함께 1:12의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 비드의 식균작용을 5 시간에 걸쳐 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였고, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. Dectin-1 항체 클론 둘 다는 이소타입 대조군에 비해 모든 크기의 비드의 유의하게 더 높은 수준의 식균작용을 유도하였다 (****,^^^^ p<0.0001; ^^p<0.01; *,^p,0.05; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). 259931 클론은 15e2와 비교하여 중간 크기의 입자의 유사한 수준의 식균작용을 촉진시켰지만, 매우 작은 및 매우 큰 입자의 더욱 유효한 식균작용을 촉진시켰다.
도 14a-14c는 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 인간 단핵구 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 14a는 3 시간에 걸친 비드의 식균작용의 측정을 제시하는 반면에, 도 14b는 식균작용 2 시간째에 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다. Dectin-1 항체 (클론 15e2)는 이소타입 대조군에 비해 단핵구에 의해 유의하게 더 높은 수준의 식균작용을 유도하였다 (**** p<0.0001; ***p<0.001; ** p<0.01; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1은 인간 단핵구에 의한 비드의 식균작용을 촉진시켰다. 도 14c는 식균작용의 유동 세포측정 평가를 제시한다. 포식된 비드는 히스토그램에서 우측 피크에 의해 표시된다. Dectin-1 항체에 커플링된 비드는 이소타입 항체에 커플링된 비드에 비해 인간 단핵구에 의해 유의하게 더 높은 수준 (1.6배)의 식균작용을 유도하였다.
도 15는 FcgR 차단 항체의 존재 하에 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, FcgR 매개된 식균작용을 배제하기 위해 FcgR 차단 항체의 존재 하에 비드를 배양된 인간 단핵구 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. pHrodo-양성 세포의 영상을 식균작용 3 시간째에 취하였다. FcgR 차단 항체의 첨가는 Dectin-1 항체-유도된 식균작용을 방지하지 않았으며 (상부 우측 및 하부 우측 참조), 이는 Dectin-1이 Fcy 수용체와는 독립적으로 식균작용을 유도함을 나타낸다.
도 16은 시토칼라신 D로 처리된 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo 표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 5 μM 시토칼라신 D (CytoD)의 존재 또는 부재 하에 배양된 인간 단핵구 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. 비드의 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 16은 3 시간에 걸친 비드의 식균작용의 측정 (상부 플롯), 뿐만 아니라 식균작용 3 시간째에 pHrodo-양성 세포의 대표적인 영상 (하부 영상)을 제시한다. Dectin-1 항체는 이소타입 대조군에 비해 유의하게 더 높은 수준에서 식균작용을 유도하였다 (**** p<0.0001; ***p<0.001; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1 항체-의존성 식균작용은 CytoD의 첨가에 의해 억제되었고, 이는 액틴 중합이 인간 단핵구에서 Dectin-1-유도된 식균작용을 위해 필요함을 입증한다.
도 17은 인간 대식세포에 의한 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드의 식균작용을 제시한다. 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)를 pHrodo 레드로 표지하였고, Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합시켰다. 이어서, 비드를 배양된 단핵구-유래된 대식세포 (50,000개 / 웰)와 함께 1:3의 세포:비드 비로 인큐베이션하였다. 대식세포를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였다. 비드 식균작용을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 식균작용을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 pHrodo-양성 객체의 중첩으로 표현하였다. 도 17은 3 시간에 걸친 비드의 식균작용의 측정 (상부 플롯), 뿐만 아니라 식균작용 3 시간째에 pHrodo-양성 세포의 대표적인 영상 (하부 영상)을 제시한다. Dectin-1 항체는 이소타입 대조군에 비해 유의하게 더 높은 수준으로 대식세포에 의한 식균작용을 유도하였다 (**** p<0.0001; 홀름-사이닥 다중 비교에 의한 2-원 anova). Dectin-1 항체는 배양된 인간 대식세포에서 비드의 유도된 식균작용을 촉진시킨다.
도 18a-18c는 Dectin-1 이중특이적 항체에 의해 매개된 바이러스의 포식을 제시한다. 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)을 H3N2 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질에 결합하는 항-H3N2 항체인 pHrodo-표지된 스트렙타비딘-12CA5 항체 (12CA5-SA-pHr)에 접합시켰다. HEK-블루 hDectin-1a 세포를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였고, 96-웰 플레이트 (50,000개 / 웰)에 시딩하였다. 15e2-B 또는 이소타입 대조군을 12CA5-SA-pHr과 혼합하였고, 30 분 동안 이중특이적 항체가 형성되게 하였다. 가용성의 이중특이적 항체를 40 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 pHrodo 활성화를 평가함으로써 모니터링하였다. 도 18a는 이중특이적 Dectin-1/12CA5 항체와 세포의 접합을 제시한다. 이 포맷을 이용하여 세포를 H3N2 바이러스에 연결시킬 수 있다. 도 18b는 실험 18 시간째에 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다 (포식된 12CA5 pHrodo 표지된 항체는 파고솜에서 밝은 적색 형광을 냄). 도 18c는 24 시간에 걸친 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 제시한다. 포식을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 적색 객체 카운트 (pHrodo)의 중첩으로 표현하였다. **** p<0.0001 vs 이소타입. 홀름-사이닥 다중 비교 시험에 의한 2-원 anova.
도 19a & 19b는 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 이중특이적 항체의 포식을 제시한다. 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)을 H3N2 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질에 결합하는 항-H3N2 항체인 pHrodo 표지된 스트렙타비딘-12CA5 (12CA5-SA-pHr)에 접합시켰다. 인간 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하였고, 96-웰 플레이트 (50,000개 / 웰)에 시딩하였다. 15e2-B 또는 이소타입 대조군 항체를 12CA5-SA-pHr과 혼합하였고, 30 분 동안 이중특이적 항체가 형성되게 하였다. 가용성의 이중특이적 항체를 40 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 pHrodo 활성화를 평가함으로써 모니터링하였다. 도 19a는 21 시간에 걸친 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 제시하며, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 적색 객체 카운트 (pHrodo)의 중첩으로 표현하였다. ** p<0.01; **** p<0.0001 vs 이소타입. 홀름-사이닥 다중 비교 시험에 의한 2-원 anova. 도 19b는 실험 6 시간째의 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다 (포식된 12CA5 pHrodo 표지된 항체는 파고솜에서 밝은 적색 형광을 냄).
도 20a & 20b는 인간 단핵구에 의한 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)에 접합된 스트렙타비딘 FITC-표지된 폴리스티렌 비드 (40 nm)의 포식을 제시한다. 폴리스티렌 FITC 비드를 30 분 동안 비오틴화 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군으로 포화시켰다. 이어서, 항체/비드 복합체를 배양된 인간 단핵구와 함께 1:6 (세포:비드)의 비로 인큐베이션하였다. 단핵구의 FITC 염색을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 도 20a는 21 시간에 걸친 단핵구에 의한 SA-FITC 비드의 포식을 제시하며, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 녹색 (FITC 양성) 객체 카운트로 표현하였다. 도 20b는 실험 15 시간째에 FITC 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다.
설명을 위해 예시적인 적용을 참조하여 몇몇 측면을 하기에 기재한다. 수많은 구체적인 세부사항, 관계 및 방법이 본원에 기재된 특징의 충분한 이해를 제공하도록 제시됨을 이해해야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 특징이 하나 이상의 구체적인 세부사항이 없이 또는 다른 방법에 의해 실시될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 일부 작동이 상이한 순서로 및/또는 다른 작동 또는 사건과 동시에 발생할 수 있기 때문에, 본원에 기재된 특징은 설명된 작동 또는 사건의 순서로 제한되지 않는다. 추가로, 본원에 기재된 특징에 따라 방법을 실시하기 위해 설명된 모든 작동 또는 사건이 필요하지는 않다.
본원에서 사용된 바와 같이, 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는다면 단수 형태는 복수 형태 또한 포함하는 것으로 의도된다. 추가로, 용어 "비롯한", "포함한다", "갖는, "갖는다", "함께" 또는 이들의 변형어가 상세한 설명 및/또는 청구항에서 사용되는 한, 이러한 용어들은 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 "비롯한" 또는 "함유하는"과 동의어이며, 포괄적이거나 개방적인 것이다.
본원에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 명시되지 않는다면 "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 숫자와 관련하여 용어 "약"은 해당 숫자 + 또는 - 해당 숫자의 10%를 지칭한다. 범위와 관련하여 용어 "약"은 해당 범위 - 그의 가장 낮은 값의 10% 및 + 그의 가장 높은 값의 10%를 지칭한다.
질환과 연관된 축적되고 제거되지 않은 다양한 비정상적인 숙주 세포, 예컨대 종양, 림프종, 죽은, 괴사성, 아폽토시스, 죽어가는, 감염된, 손상된 세포가 있다. 또한, 다양한 세포 생성물, 예컨대 응집된 단백질 (β-아밀로이드 플라크 또는 Tau 응집물), 지단백질 입자는 축적이 증가함에 따라 질환을 유발할 수 있다. 질환-유발 세포는 질환, 장애 또는 다른 바람직하지 않은 상태와 연관된 비정상적인 세포에서 전형적인 당단백질, 표면 단백질, 또는 당지질을 가질 수 있다. 숙주 생성된 물질 외에도, 다양한 외래 병원체, 예컨대 감염성 미생물 (예를 들어 바이러스, 진균 및 박테리아) 및 미생물 생성된 생성물 및 파편 (예를 들어, 바이러스 입자 외피, 내독소)은 환자에서 잘 제거되지 않을 수 있다. 상기 나열된 이상은 암, 알츠하이머 질환, 섬유증, 파킨슨 질환, 헌팅턴 질환, HIV, A형, B형 또는 C형 간염, 패혈증 등과 같은 질병을 유발할 수 있다. 이들 여러 장애 또는 질환은 인간 대상체의 상이한 장기에서 질환-유발 인자의 축적을 특징으로 한다.
생물학적 제제를 사용함으로써 숙주 식균세포의 포식 활성, 선택성 또는 표현형을 변경시키고 개선시키는 방법이 본원에 제공된다.
본 개시내용은 한 아암으로 질환-유발 인자에 특이적으로 결합하고, 다른 아암으로 식균성 수용체 Dectin-1 수용체에 결합하는 분자의 사용을 기재한다 (예를 들어, 도 1b 참조). 표적화된 식균작용을 달성하기 위해, Dectin-1에 결합 시 효능작용성 활성을 갖는 모노클로날 항체를 생성하는 것이 필요하다. 본 개시내용은 효능작용성 항체가 수용체를 활성화시키고, 식균작용을 유도함을 제안한다. 식균성 수용체 Dectin-1 및 질환-유발 인자, 예컨대 β-아밀로이드 응집물 플라크에 결합하는 이중특이적 항체는 상기 인자의 식균작용 및 그의 분해를 유도할 수 있다 (도 1a). 전형적인 이중특이적 항체 외에도 또는 대안적으로, 한 IgG가 식균작용 수용체에 결합하고 다른 것이 질환 유발 인자에 결합하는 공유 결합된 2개의 IgG (IgG2)가 사용될 수 있다 (도 1a). 또 다른 옵션은 IgG가 식균작용 수용체에 결합하고 scFv 부분이 질환-유발 인자에 결합하는 IgG-scFv 포맷을 사용하는 것이다 (도 1a).
식균작용을 통한 질환-유발 인자의 표적화된 제거를 가능하게 하기 위해, 본 개시내용의 항원-결합 도메인은 IgG, 인트라바디, 펩티바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, SMTP, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 탠덤 디-scFV, 탠덤 트리-scFv, ADAPTIR)로부터 선택될 수 있다.
다중특이적 항체는 일반적으로 상이한 항원으로부터의 적어도 2가지 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 F(ab')2 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이중특이적 항체의 제조에 대해 널리 확립된 한가지 접근법은 "구멍-내-손잡이(knobs-into-holes)" 또는 "공동-내-융기부(protuberance-into-cavity)" 접근법이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168을 참조한다. 2가지 이뮤노글로불린 폴리펩티드 (예를 들어, 중쇄 폴리펩티드) 각각은 계면을 포함하고; 한 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 계면은 다른 이뮤노글로불린 폴리펩티드 상의 상응하는 계면과 상호작용하여, 2가지 이뮤노글로불린 폴리펩티드가 회합되게 한다. 일부 실시양태에서, 계면은 한 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 계면에 위치한 "손잡이" 또는 "융기부"가 다른 이뮤노글로불린 폴리펩티드의 계면에 위치한 "구멍" 또는 "공동"에 상응하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 손잡이는 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄로 대체함으로써 구축될 수 있다. 일부 실시양태에서, 구멍은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄로 대체함으로써 구축될 수 있다. 손잡이 또는 구멍은 원래의 계면에 존재할 수 있거나, 또는 이들은 합성에 의해 도입될 수 있다. 하나 이상의 상응하는 손잡이- 또는 구멍-형성 돌연변이를 갖는 변형된 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 표준 재조합 기술 및 세포 시스템을 이용하여 발현되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168; 5,807,706; 5,821,333; 7,642,228; 7,695,936; 8,216,805; 미국 공개 번호 2013/0089553; 및 [Spiess et al., Nature Biotechnology 31: 753-758, 2013]을 참조한다. 변형된 이뮤노글로불린 폴리펩티드는 원핵생물 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 또는 진핵생물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포를 사용하여 생성될 수 있다. 상응하는 손잡이- 및 구멍-보유 이뮤노글로불린 폴리펩티드는 이종다량체로서 공동 배양물로 숙주 세포에서 함께 발현되고 정제될 수 있거나, 또는 이들은 단일 배양물로 발현되고, 별도로 정제되고, 시험관내에서 조립될 수 있다.
상이한 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다.
본 개시내용의 결합 단백질 (예를 들어, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분)은 비-인간, 키메라, 인간화, 또는 인간일 수 있다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv 항체, VH, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
"Fab" (단편 항원 결합)는 항원에 결합하는 항체의 일부분이며, 쇄간 디술피드 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역 및 CHI를 포함한다. 항체는 IgG 및 그의 하위 부류 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 비롯한 임의의 부류 또는 하위 부류일 수 있다.
항-질환-유발 인자 항체는 식균작용 수용체 리간드, 예컨대 β-1,6-연결된 글루칸 (예를 들어 커들란 및 덱스트란)에 공유 부착할 수 있고, 상기 인자의 식균작용을 유도한다 (도 1a).
식균작용을 통해 질환-유발 인자의 표적화된 제거를 매개하는 분자의 결합은 결합력이 있을 수 있고 없을 수 있고, 즉, 식균작용 수용체, 예컨대 Dectin-1 또는 상기 인자 상에 존재하는 표적 항원의 이량체를 유도할 수 있고 유도하지 않을 수 있다.
식균작용을 통한 질환-유발 인자의 유익한 제거 외에도, 분자는 염증성 매개인자의 생성을 유도하여, 예컨대 종양, 암 및 림프종에서 질환 미세환경을 변경시킬 수 있다.
표적화된 식균작용을 유발하는 분자의 이뮤노글로불린 Fc 부분은 Fc 수용체를 결속시키고 추가의 식균작용을 유도함으로써 상기 과정에서 중요한 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자는 야생형 인간 IgG1과 비교하여 감소된 ADCC 활성을 갖는 변형된 Fc 도메인을 갖는다.
이론에 구애되기를 바라지 않지만, 식균작용을 유도하기 위해 더 높은 효능작용성 활성을 갖는 항체 후보가 약물 개발에 가장 매력적일 수 있다고 생각된다. 낮은 내재화를 유도하는 항체 후보는 세포 표면 상에서 더 높은 수용체 점유율 및 더 높은 수준의 수용체-항체 복합체로 인해 가장 현저한 식균작용을 입증할 수 있다.
Dectin-1에 대한 모노클로날 항체 (mAb)를 생성하기 위해, 재조합 표적은 마우스의 면역화를 위해 사용될 것이다. 생성된 mAb는 ELISA 및 유동 세포측정에 의해 Dectin-1과의 선택적인 결합에 대해 분석될 것이다. 선택된 mAb는 Dectin-1 유도된 활성화 (식균작용) 및 내재화 능력에 대해 시험관내에서 시험될 것이다. mAb 후보는 시노몰구스 및 마우스 Dectin-1과의 결합에 대해 추가로 시험될 것이다. 양성 후보는 시험관내에서 및 생체내에서 식균작용을 위해 사용될 것이다. 선택된 mAb의 활성은 상업적으로 입수가능한 mAb와 비교될 것이다. 예를 들어, 항-Dectin-1 mAb는 하기 항-Dectin-1 mAb와 함께 시험될 것이다: 259931 (알앤디 시스템즈(R&D Systems); 카탈로그 #: MAB1859), 15E2 (인비트로겐(Invitrogen) 카탈로그 #: 50-9856-42; 바이오레전드(BioLegend) 카탈로그 #: 355402), BD6 (바이오-라드(Bio-Rad) 카탈로그 #: MCA4662), GE2 (압캠(Abcam) 카탈로그 #: Ab82888); REA515 (밀테니이 바이오텍 카탈로그 #: 130-107-725).
질환-유발 인자, 예컨대 β-아밀로이드 응집물에 대한 모노클로날 항체 (mAb)를 생성하기 위해, 상기 인자는 마우스의 면역화를 위해 사용될 것이다. 생성된 mAb는 적용가능한 경우 ELISA 또는 유동 세포측정에 의해 적절한 표적과의 선택적인 결합에 대해 분석될 것이다. 가장 높은 친화도를 갖는 mAb 후보는 적용가능한 경우 시노몰구스 표적과의 결합에 대해 추가로 시험될 것이다. 항-Dectin-1 mAb 후보의 식균성 활성은 상업적으로 입수가능한 항-Dectin-1 mAb와 비교될 것이다. 양성 후보는 Dectin-1 및 질환-유발 인자, 예컨대 β-아밀로이드 응집물에 결합하는 아암으로 구성되는 이중특이적 항체를 생성하기 위해 사용될 것이다.
항체는 재조합 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체를 코딩하는 핵산은 추가의 클로닝 또는 발현을 위해 단리되고, 복제가능한 벡터에 삽입될 수 있다. 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 통해) 용이하게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 여러 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있으며; 벡터 성분에는 일반적으로 하기 중 하나 이상이 포함되나 이로 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열. 본원에서 벡터에서 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 더 고등의 진핵생물 세포이다. 재조합 기술을 이용할 때, 항체는 세포내에서, 원형질막 주위 공간에서 생성될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접적으로 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생성되는 경우, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 여과기를 이용하여 먼저 농축된다.
최종 후보는 시험관내에서 및 생체내에서 식균작용을 위해 사용될 것이다. 선택된 후보의 활성은 보고된 바와 같은 리간드 유도된 식균작용과 비교될 것이다 (Herre 2004).
질환-유발 인자의 고갈에 대한 최종 후보의 시험관내 식균성 활성을 입증하기 위해, 인간에서의 활성을 재현하는 시험관내 모델이 이용된다. 정상적인 혈액 공여자로부터 단리된 말초 혈액 림프구 (PBL)는 고갈을 연구하기 위해 최종 후보와 함께 인큐베이션될 것이다. 상기 인자의 수준은 ELISA 또는 유동 세포측정에 의해 측정될 것이다. 항체의 식균성 활성은 이전에 기재된 바와 같이 정제된 일차 단핵구에 의해 시험될 것이다 (Ackerman 2011). 대식세포에 대한 후보의 식균성 활성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 일차 단핵구로부터 그들을 생성할 것이다. 추가로, 단일 세포 조직 균질액 뿐만 아니라 골수 또는 활액으로부터의 대식세포 및 DC로 구성되는 일차 조직 세포에 대한 Ab 활성이 연구된다.
질환-유발 인자, 예컨대 LDL 또는 이. 콜라이의 고갈 또는 수준 감소에 대해 선택된 항체 후보의 생체내 활성을 나타내기 위해, 마우스 또는 시노몰구스 원숭이가 사용될 것이다. 시노몰구스 원숭이의 코호트를 단일 용량 항체 처리 하루 전에 채혈하여 ELISA에 의해 LDL의 투여전 수준을 확인할 것이다. 항체로 처리 시, 원숭이는 하기 시점에서 채혈될 것이다: 1 시간, 1, 7, 14 및 30 일. 혈액 및 다른 생체 시편, 예컨대 활액, 골수 및 비장에서 질환-유발 인자, 예컨대 LDL의 수준은 ELISA에 의해 결정될 것이다.
최종 mAb 후보는 인간 또는 인간화일 것이고, 인간 및 시노몰구스 식균성 수용체 Dectin-1, 및 질환-유발 인자, 예컨대 LDL과의 결합, 식균작용 능력, 및 생체내 활성에 대해 특징분석될 것이다. 추가로, 최종 후보는 10mg/mL보다 높은 농도에서 가용성이어야 하고, 낮은 수준의 가용성 응집물 (<5%)을 갖고, 2-8℃에서 3 개월 인큐베이션할 때 SDS PAGE에 의해 측정 시 분해 생성물이 없이 ELISA에 의해 측정 시 표적에 대한 그의 결합을 유지한다 (>90% 효능).
최종 인간화 후보의 독성 분석은 인간 대상체에서 사용될 것으로 예상되는 용량보다 5배 넘게 더 높은 용량에서 시노몰구스 원숭이에서 수행될 것이다.
이론에 구애되기를 바라지 않지만, 표적화된 식균작용을 수행하는 분자가 환자, 예컨대 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 암, 감염성 질환 (바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 감염), 염증성, 또는 면역 질환 (예를 들어, 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 다발성 경화증), 퇴행성 질환 (예를 들어, 관절 및 연골) 류마티스성 관절염, 펠티(Felty) 증후군, 공격성 NK 백혈병, IBM, IBD 등에 대한 명백한 이익을 입증할 수 있는 것으로 생각된다. 추가로, 표적화된 식균작용 항체 처리는 NK 세포에 의존하는 ADCC에 비해 조직에서 세포 고갈에 대해 더 양호한 활성을 가질 수 있다. 상기 처리는 일반적으로 골수성 세포를 표적화하고 식균작용을 개선시키는 요법에 비해 특정한 질환-유발 인자의 제거에 대해 선택적인 활성을 가질 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 무엇보다도 식균성 수용체 및 질환-유발 인자와의 결합에 의해 표적화된 식균작용을 유도하고, 이뮤노글로불린 Fc 영역을 갖는 분자의 투여 시 인간 대상체에서 질환-유발 인자의 수를 감소시키거나 또는 이를 고갈시키는 방법을 제공한다.
하기 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 다양한 실시양태를 제조하고 사용할 수 있도록 제시된다. 구체적인 기기, 기술 및 적용의 설명은 예시로서만 제공된다. 본원에 기재된 예시에 대한 다양한 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 실시양태의 개념 및 범위를 벗어나지 않고 다른 예시 및 응용에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태는 본원에 기재되고 제시된 예시로 제한되지 않는 것으로 의도되고, 청구항과 일치하는 범위에 따라야 한다.
실시예
실시예 1: Dectin-1 발현의 분석
이 실시예는 다양한 세포 유형에 의해 Dectin-1의 발현을 특징분석하기 위한 실험 결과를 기재한다.
재료 및 방법
건강한 공여자 샘플
신선한 건강한 공여자 버피 코트를 스탠포드(Stanford) 혈액 센터로부터 입수하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-파크(ficoll-paque) (지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 일리노이주 시카고) 분리를 통해 단리하고, 밤뱅커(Bambanker) 세포 냉동 배지 (불독-바이오(Bulldog-Bio), 뉴햄프셔주 포츠마우스)에서 동결보존시켰다. 간략히, 버피 코트를 인산염 완충된 식염수 (PBS)에서 1:1 비로 희석한 후, 희석된 버피 코트를 피콜에서 계층화하고, 760g에서 원심분리하였다. PBMC 층을 단리하고, 하류 분석 전에 PBS로 세척하였다. 말초 혈액 백혈구 (PBL)를 적혈구 용해를 통해 단리하였다. 조직 샘플은 국립 암 센터(National Cancer Institute)에 의해 자금 지원된 협력 인간 조직 네트워크(Cooperative Human Tissue Network)에 의해 제공되었다. 조직 해리는 밀테니이 바이오텍 종양 해리 키트 (밀테니이 바이오텍 인크., 캘리포니아주 오번)의 제조자 지침에 따라 수행하였다. 동결보존된 시노몰구스 원숭이 PBMC를 인간 세포로부터 입수하였다.
일차 세포 및 세포 배양
인간 단핵구는 범-단핵구 단리 키트 (밀테니이 바이오텍 인크., 캘리포니아주 오번)의 제조자 지침에 따라 건강한 공여자 PBMC로부터 단리되었다. 대식세포 분화를 위해, PBMC로부터의 단핵구를 3 시간 동안 세포 배양 플레이트에 부착되게 두었다. 부유 세포를 세척해 내고, 부착된 단핵구를 20 ng/ml MCSF (페프로테크(Peprotech), 뉴저지주 록키 힐) 중에서 7 일 동안 배양하여 대식세포로 완전히 분화시켰다. HEK-블루 Null1 세포 (인비트로겐(Invivogen), 캘리포니아주 샌디에고)는 노르모신 및 제오신으로 보충된 DMEM/10% FBS 중에서 유지시켰다. HEK-블루 hDectin-1a 세포 및 HEK-블루 hDectin-1b 세포 (인비트로겐, 캘리포니아주 샌디에고)는 노르모신 및 퓨로마이신으로 보충된 DMEM/10% FBS 중에서 유지시켰다.
프리스타일 293-F 세포를 제조자의 제안에 따라 (써모 피셔(Thermo Fisher), 메사추세츠주 월텀) 일시적으로 형질감염시켰다. 간략히, 생존 세포 밀도 및 퍼센트 생존율을 결정하였다. 세포를 프리스타일 293 발현 배지에 의해 1 x 10*6 생존 세포/mL의 최종 밀도로 희석시켰다. 프리스타일 맥스 시약을 옵티프로(OptiPro) SFM 배지로 희석하고, 혼합하고, 실온에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 프리스타일 맥스 시약을 옵티프로 SFM 배지로 희석된 플라스미드 DNA에 첨가하고, 혼합하였다. 프리스타일 맥스 시약/플라스미드 DNA 복합체를 실온에서 10-20 분 동안 인큐베이션하였다. 복합체를 세포로 천천히 옮기고, 첨가하는 동안 배양 플라스크를 부드럽게 휘저은 다음, 세포를 궤도 진탕기 상에서 ≥80% 상대 습도 및 8% CO2 하에 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.
유동 세포측정 분석
대략 1 x 105 - 5 x 105 세포를 비-조직 배양 처리된 96-웰 V 바닥 플레이트에서 플레이팅하고, 인간 FcgR 차단 항체 (바이오레전드, 캘리포니아주 샌디에고)에서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 얼음 상에서 30 분 동안 1:1000 희석으로 이플루오르(eFluor) 506 생존성 염료 (써모피셔, 메사추세츠주 월텀)로 염색한 후, FACS 완충제 (2% 태아 소 혈청을 갖는 PBS)로 세척 단계를 수행하였다. 항체 칵테일을 세포에 첨가한 다음, 얼음 상에서 30 분 동안 인큐베이션한 후, FACS 완충제 중에서 또 다른 세척 단계를 수행하였다. 울트라콤프(Ultracomp) 비드 (써모피셔, 메사추세츠주 월텀)를 항체 보상을 위해 사용하였다. 이 연구에서 사용된 항체는 표 1에 제공된다. 모든 데이터 획득 및 형광 보상은 사이토플렉스(CytoFlex) 유동 세포측정기 (베크만 코울터(Beckman Coulter), 조지아주 애틀란타)를 사용하여 수행하였다. 데이터 분석은 플로우조(FlowJo) 유동 세포측정 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 단핵구, 림프구 및 과립구에서 Dectin-1 발현을 결정하기 위해 이용된 전략은 전방 및 측면 스캐터 상에서 개별적으로 게이팅하는 것이었다. 전방 스캐터 면적 및 전방 스캐터 높이를 이용하여 단일 세포를 게이팅한 후, 이플루오르 506 및 전방 스캐터 면적을 이용하여 살아있는 세포를 게이팅하였다. 각각 CD14, CD3+/CD4+/8+, CD3-CD19+, CD3-CD56+ 및 CD15+ 마커를 사용하여 단핵구, T 세포, B 세포, NK 세포 및 과립구를 게이팅하였다. 배양된 대식세포는 CD11b 염색에 의해 확인하였다. 폐 조직에서, CD45를 사용하여 조혈 세포를 게이팅하였다. 각각 CD3+, CD3-CD19+, CD3-CD56+ 전략을 이용하여 CD45+ 세포 상에서 T 세포, B 세포 및 NK 세포를 게이팅하였다. CD45+ 세포 상에서 T, B 및 NK 세포를 배제시킨 후에, CD163 및 CD11b를 사용하여 대식세포를 게이팅하였다. 결합 검정을 위해, 일차 Dectin-1 항체는 100, 33.3, 11.1, 3.7, 1.23 및 0.41 nM의 적정에서 사용하였고, 이소타입 대조군은 166, 55.3, 18.4 및 6.150 nM의 적정에서 사용한 후에, 형광-표지된 항-마우스 Fc-특이적 이차 항체를 사용하였다.
수용체 정량화
건강한 공여자 PBMC를 APC-접합된 표적 항체로 염색함으로써 Dectin-1 수용체 수를 정량화하고, 상기 기재된 적절한 면역 세포 유형을 기반으로 하여 게이팅하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 등가의 가용성 형광색소 (MESF) 보정 표준 비드 (뱅스 래버러토리즈, 인크.(Bangs Laboratories, Inc.), 인디애나주 피셔스)의 양자 APC 분자를 획득하고, 동시에 분석하여, 중간 형광 강도 측정치를 MESF 단위로 변환시켰다. FMO (형광 마이너스 원) 및 이소타입 대조군 MESF 값을 차감함으로써 백그라운드 형광을 제거하였다. 후속적으로, MESF 값을 형광단 대 단백질 비 (제조자에 의해 제공됨)로 나누어, 항체 결합 능력 또는 수용체 수로 변환시켰다.
항체
표 1은 실시예에 기재된 실험에서 사용된 항체를 제공한다.
표 1. 형광-표지된 항체.
결과
다양한 세포 유형에서 CLEC7A로도 공지된 Dectin-1의 발현을 Dectin-1-특이적 항체 및 유동 세포측정 분석을 이용하여 평가하였다. 각각의 면역 세포 집단을 확인하기 위해 형광단-접합된 계통- 및 세포 유형-특이적 항체를 사용하여, 공여자 샘플 또는 배양된 세포 샘플로부터의 단일의 살아있는 단핵구 및 림프구 집단을 유동 세포측정에 의해 분석하였다. Dectin-1은 Dectin-1-특이적 항체를 사용하여 검출하였다. Dectin-1 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소타입 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. 일부 실험에서, Dectin-1 수용체 수 및 Dectin-1 양성 세포의 퍼센트를 계산하였다. Dectin-1 검출 및 유동 세포측정에서 사용된 모든 항체는 표 1에 나열된다.
면역 세포 집단에서 Dectin-1의 발현을 결정하기 위해, 2가지 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플을 수집하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 높은 수준의 Dectin-1 발현은 건강한 PBMC 샘플의 단핵구 (CD14+ 세포) 상에서 발견되었다 (도 2). 단핵구는 전문적인 식균성 세포이다. 단핵구에서 Dectin-1의 발현은 시험한 22 명의 공여자 중 21 명에서 양성이었고, Dectin-1 양성 단핵구의 백분율은 90%가 넘었으며, 수용체 수는 세포당 32,000 내지 59,000개였다. Dectin-1은 CD4+ T-세포 (CD3+CD4+ 세포), CD8 T-세포 (CD3+CD8+ 세포), B 세포 (CD3-CD19+ 세포), 또는 NK 세포 (CD3-CD56+ 세포) 상에서 검출되지 않았다. 따라서, Dectin-1은 건강한 공여자 PBMC 샘플에서 T 세포, B 세포 또는 NK 세포 상에서가 아니라 단핵구 상에서 선택적으로 발현된다.
Dectin-1이 단핵구 상에서 많이 발현되므로, 과립구에서 Dectin-1의 발현 또한 실험하였다. 과립구는 또 다른 유형의 식균성 면역 세포이다. 3가지 건강한 공여자 말초 혈액 백혈구 (PBL) 샘플을 수집하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, Dectin-1은 3가지 건강한 공여자 PBL 샘플에서 단핵구 상에서 많이 발현되고, 과립구에서는 적당히 발현되었다. Dectin-1은 단핵구과 비교하여 과립구에서 낮은 수준으로 발현되었으며, 수용체 수는 세포당 4,000 내지 5,000개였다.
단핵구는 조직-특이적 식균성 세포인 대식세포로 분화할 수 있다. 대식세포 상에서 Dectin-1의 발현을 결정하기 위해, 공여자 샘플을 7 일 동안 MCSF (20 ng/ml) 중에서 배양하여, 이들이 대식세포로 분화되게 하였다. 이어서, 단일의 살아있는 세포를 CD11b로 염색하여 대식세포 분화를 확인한 다음, 유동 세포측정에 의해 분석하여, Dectin-1 발현을 결정하였다. 도 4에 제시된 바와 같이, Dectin-1은 단핵구-유래된 배양된 대식세포 상에서 발현된다. Dectin-1 발현이 배양된 단핵구-유래된 대식세포에서 유지된다는 확인은 표적화된 식균작용이 조직에서 가능하다는 원리 증명으로서 작용하였다.
대식세포는 조직-특이적 식균성 세포이다. 조직 내의 대식세포에서 Dectin-1의 발현을 시험하기 위해, 건강한 공여자로부터의 폐 조직 샘플을 수집하고, 해리하고, 유동 세포측정에 의해 분석하였다. CD45를 사용하여 조혈 세포를 게이팅하여, 이들을 조직에서 비-조혈 세포로부터 분리하였다. 각각 CD3+, CD3-CD19+, CD3-CD56+ 게이트를 사용하여 CD45+ 세포 상에서 T 세포, B 세포 및 NK 세포를 확인하였다. CD45+ 세포 상에서 T, B 및 NK 세포를 배제시킨 후, CD163 및 CD11b를 사용하여 대식세포를 게이팅하였다. Dectin-1 발현을 모든 단리된 세포 집단에 대해 결정하였다. 도 5는 이 실험의 결과를 제시한다. Dectin-1은 폐 조직 샘플에서 대식세포에서 많이 발현되었고, 수용체 수는 세포당 19,000개였다. Dectin-1 발현은 T 세포, B 세포 또는 NK 세포에서는 검출되지 않았으며, 이는 Dectin-1이 건강한 인간 폐 조직에서 대식세포에서 선택적으로 발현됨을 나타낸다. Dectin-1은 비-조혈 세포에서는 검출되지 않았다. 이 결과는 적절한 세포 유형 및 표적 둘 다가 존재하기 때문에 조직에서 Dectin-1-매개된 표적화된 식균작용이 가능함을 입증한다.
Dectin-1 수용체는 2가지 상이한 이소형인 이소형 A 및 이소형 B로 발현될 수 있다. Dectin-1 항체가 A 또는 B 이소형을 인식하는지 여부를 실험하기 위해, 인간 Dectin-1 이소형 A 또는 B를 과발현하도록 HEK293 세포를 조작하고 (각각 HEK-블루 hDectin-1a 세포 및 HEK-블루 hDectin-1b 세포), 유동 세포측정에 의해 분석하여, Dectin-1 발현을 평가하였다. 15e2 Dectin-1 항체 클론을 사용하여, Dectin-1 발현을 확인하였다. 대조군 HEK293 세포 (HEK-블루 Null1 세포), 및 인간 Dectin-1A를 발현하는 구축물로 일시적으로 형질감염된 프리스타일293 세포 (293F hDectin-1a FL)를 분석하여, Dectin-1 검출의 특이성을 시험하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 클로닝된 15e2 Dectin-1 항체는 Dectin-1을 과발현하는 HEK293 세포에서 Dectin-1의 A 및 B 이소형 둘 다를 인식하였다. Dectin-1이 형질전환되지 않은 대조군 세포에서 검출되지 않았기 때문에, 항체는 Dectin-1에 대해 특이적이다. 조작된 HEK293 세포는 일반적으로 비-식균성 세포주에서 Dectin-1을 수반하는 식균작용 및 신호전달 사건의 기능 평가에 유용한 도구이다.
다중 Dectin-1 항체 클론 (259931, GE2 및 BD6)의 특이성을 Dectin-1을 과발현하는 HEK293 세포에서 및 건강한 공여자로부터의 단핵구에서 또한 평가하였다. 이들 실험의 결과는 표 2에 요악된다. 클론 259931은 시험한 모든 세포에서 Dectin-1에 대해 가장 높은 친화도를 가졌다. 259931 클론 또한 Dectin-1의 이소형 A 및 B 둘 다에 대해 높은 친화도를 갖는 반면에, 다른 항체는 B 이소형에 결합하지 않거나 또는 그에 대해 감소된 결합 친화도를 갖는다. 수용체 이소형에 대한 그들의 상이한 친화도에 의해 입증되는 바와 같이, 상이한 Dectin-1 항체 클론에 대해 관찰된 상이한 친화도는 상이한 에피토프에 대한 결합에서 기인할 수 있다.
표 2. Dectin-1 과발현 세포주에서 Dectin-1 항체 클론의 친화도
최종적으로, 인간 Dectin-1 항체 클론 15e2 및 259931과 시노몰구스 원숭이 Dectin-1의 교차-반응성을 실험하기 위해 결합 검정을 수행하였다. 단핵구는 유동 세포측정에 의해 원숭이 PBMC 샘플로부터 유래되었다. 단리된 세포를 15e2 및 259931 Dectin-1 항체 클론, 및 그들 각각의 이소타입 대조군 항체, IgG2a 및 IgG2b와 함께, 이어서 형광 항-마우스 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 결합 곡선을 생성하기 위해, Dectin-1 항체는 100, 33.3, 11.1, 3.7, 1.23 및 0.41 nM의 연속 용량 적정에서 사용된 반면에, 이소타입 대조군은 166, 55.3, 18.4 및 6.150 nM의 연속 용량 적정에서 사용되었다. 도 7에 제시된 바와 같이, 인간 Dectin-1 항체 클론 둘 다는 단핵구 상에서 발현된 원숭이 Dectin-1과 교차 반응하였다. 그러나, 클론은 원숭이 Dectin-1에 대해 각각의 클론의 상이한 결합 특징을 나타내었고, 이는 상이한 항체가 상이한 에피토프에 결합함을 입증한다. 시노몰구스 원숭이가 일반적으로 독성 연구를 위한 전임상 모델로서 사용되고, 이들 Dectin-1 항체가 시노몰구스 원숭이 단핵구에 결합하기 때문에, 따라서 이들은 독성 연구를 위해 용이하게 사용될 수 있다.
이 실시예에서 제시된 바와 같이, Dectin-1은 전문화된 식균성 세포인 단핵구 및 대식세포에서 많이 발현되지만, 다른 면역 세포에서는 발현되지 않는다. Dectin-1 발현은 또한 건강한 인간 폐 조직 내의 대식세포에 대해 특이적이다. 이 실시예에서 특징분석된 Dectin-1 항체는 세포에서 Dectin-1을 특이적으로 인식하고, Dectin-1의 이소형 둘 다를 인식할 수 있으며, 원숭이 Dectin-1과 교차 반응한다. 이 실시예에 기재된 항체는 Dectin-1-매개된 표적화된 식균작용을 위해 사용될 수 있다.
실시예 2: 식균작용 및 신호전달에 대한 Dectin-1 항체의 효과
이 실시예는 식균작용 및 신호전달에 대한 Dectin-1 항체의 효과를 시험하기 위한 실험 결과를 기재한다.
재료 및 방법
이 실험에서 사용된 재료 및 방법이 하기에 상세하기 기재된다. 달리 나타내지 않는다면, 공여자 샘플 및 일차 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 달리 나타내지 않는다면, 세포 배양, 유동 세포측정, 및 수용체 정량화는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 이 실시예에서 사용된 항체는 표 1에 기재된다.
공기 건조에 의해 고정화된 Dectin-1 항체를 사용하여 HEK 세포에서 SEAP 리포터 검정
Dectin-1 모노클로날 항체 15e2, 259931, GE2, BD6 및 대조군 이소타입을 비처리 96-웰, U-바닥 폴리프로필렌 미세역가 플레이트의 웰의 표면 상에 코팅함으로써 고정화시켰다. 코팅하기 위해, 50 μl 멸균 PBS 중에서 희석된 10 μg의 항체를 각각의 웰에 첨가하였다. 용액이 증발할 수 있도록 뚜껑을 제거하여 플레이트를 밤새 클래스 II 층류 캐비넷에 두었다. 코팅된 플레이트를 200 μl 멸균 PBS로 2회 세척하여 염 결정 및 비결합 항체를 제거하였다. 이어서, HEK-블루 hDectin-1a 세포를 플레이트 상에서 22 시간 동안 배양하고, 제조자의 지침에 따라 알칼리성 포스파타제 수준을 상청액 중에서 OD 630 nm에서 콴티-블루(QUANTI-Blue) 용액 (인비트로겐, 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 평가하였다.
pHrodo에 의한 폴리스티렌 비드의 표지화 및 항체와의 접합
염소 항-마우스 IgG (Fc) (스페로테크(Spherotech), 일리노이주 레이크 포레스트)로 코팅된 폴리스티렌 비드를 사용하여 pHrodo 표지화를 수행하였다. 스핀-엑스(Spin-X) 원심분리 튜브 여과기 (코닝, 뉴욕주 코닝)를 사용하여 인산염 완충된 식염수 pH 7.2 (PBS) (코닝(Corning), 뉴욕주 코닝)로 비드를 세척하였다. 중탄산염 완충제를 첨가하여 pH를 조정하였다. pHrodo 레드, 숙신이미딜 에스테르 (pHrodo 레드, SE) (써모피셔, 메사추세츠주 월텀)를 비드에 첨가하고, 실온에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 스핀-엑스 원심분리 튜브 여과기를 사용하여 비드를 PBS로 세척하여, 과량의 pHrodo 레드를 제거하였다. pHrodo 표지화 후에, 제조자의 지침에 따라 항체를 비드에 접합시켜다. 간략히, 항체에 대한 비드의 결합 능력을 기반으로 하여, 과량의 항체를 PBS 중에서 비드에 첨가하고, 진탕시키면서 실온에서 60 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 스핀-엑스 원심분리 튜브 여과기를 사용하여 비드를 PBS로 세척하여, 비결합 항체를 제거하였다.
항체-의존성 세포 식균작용
식균작용 실험을 위해, Dectin-1을 과발현하는 HEK 세포, 또는 단핵구를 96-웰 플레이트에 시딩하고, 1 시간 동안 부착되게 하였다. Dectin-1 항체 또는 이소타입에 접합된 pHrodo 비드를 원하는 비로 첨가하였다. 분화된 대식세포를 아큐타제(Accutase) (써모 피셔, 메사추세츠주 월텀)를 사용하여 탈착시키고, 96-웰 플레이트에 원하는 밀도로 다시 시딩하고, 비드를 첨가하기 전에 2 시간 동안 부착되게 하였다. 세포 추적기 칼세인 AM (써모 피셔, 메사추세츠주 월텀)을 첨가하여, 살아있는 세포를 확인하였다.
세포 및 pHrodo-접합된 비드를 함유하는 플레이트를 인큐사이트 S3 라이브 영상화 시스템 (사르토리우스(Sartorius), 독일)에 두었다. 원하는 시점에 영상을 찍어서 식균작용을 모니터링하고, 인큐사이트 S3 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 밝은 적색 형광 (포식된 비드)과 칼세인 AM-양성 세포의 중첩을 식균작용의 척도로 취하였다.
일부 실험에서 pHrodo-표지된 비드를 96-웰 플레이트에서 Dectin-1 항체와 1 시간 동안 혼합하였다. 비드를 회전시키고, 상청액을 흡인하여, 비결합 항체를 제거하였다. 이어서, 세포를 원하는 비로 비드와 혼합하였고, 간략히 회전시키고, 식균작용에 대해 모니터링하였다. 대안적으로, 비드와 함께 30 분 또는 1 시간 동안 인큐베이션한 세포를 수집하고, 사이토플렉스 유동 세포측정기 (베크만 코울터, 조지아주 애틀란타)를 사용하여 유동 세포측정에 의해 식균작용을 평가하였다.
이중특이적 항체 제조를 위해, 단일 항체를 비오틴 또는 스트렙타비딘 (압캠, 메사추세츠주 캠브릿지) 및 pHrodo 표지 (표시된 경우)에 접합시켰다. 항체를 2:1 (비오틴 항체: 스트렙타비딘 항체)의 비로 혼합하고, 실온에서 30 분 동안 결합시켰다. 이중특이적 항체를 세포에 첨가하여, 인큐사이트 라이브 영상화에 의해 포식을 조사하였다. 한 실험에서 비오틴화 항체를 40 nm 크기의 스트렙타비딘-FITC 비드 (써모 피셔, 메사추세츠주 월텀)와 혼합하였다.
결과
실시예 1에 기재된 Dectin-1-특이적 항체를 다양한 세포 유형에서 알칼리성 포스파타제의 분비 및 식균작용을 활성화시키는 그들의 능력에 대해 검정하였다. 달리 나타내지 않는다면, 식균작용은 pH-민감성 형광 염료 (pHrodo 레드)로 표지되고 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합된 폴리스티렌 항-마우스 Fc IgG 비드 (~ 3.4 μm)에 의해 이루어졌다. 리간드에 의한 Dectin-1의 자극은 세포에서 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP)를 생성한다. Dectin-1-특이적 항체는 수용체의 리간드로서 작용할 수 있고, 세포에서 SEAP 신호전달 경로를 자극할 수 있다.
Dectin-1을 자극하는데 있어서 Dectin-1 항체의 능력을 HEK-블루 hDectin-1a 세포를 사용하여 SEAP 리포터 검정에 의해 시험하였다. HEK-블루 hDectin-1a 세포는 Dectin-1A 이소형 및 Dectin-1/NF-κB/SEAP 신호전달 경로에 수반되는 유전자를 발현하고, 따라서 Dectin-1 리간드에 의한 자극에 대한 반응으로 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP)를 발현하도록 조작되었다. 양성 대조군으로서 세포를 DECTIN의 천연 리간드인 지모산 (10 ug/ml)과 함께 인큐베이션하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, 15e2 Dectin-1 항체 클론은 아마도 세포의 표면 상에서 Dectin-1과 결속함으로써 SEAP 분비를 촉진시키고, 이는 효능작용성 활성을 나타낸다. Dectin-1 항체에 의한 자극으로 인한 활성은 지모산과 비슷하다. 도 8에 제시된 바와 같이, Dectin-1 항체의 효과는 또한 용량-의존성이다. 따라서, Dectin-1-특이적 항체는 HEK-블루 hDectin-1a에서 알칼리성 포스파타제 분비를 유도한다. 이들 세포는 Dectin-1 항체를 기능적으로 스크리닝하는데 유용한 도구를 제공한다.
Dectin-1의 자극은 식균작용의 활성화를 유도할 수 있다. Dectin-1-특이적 식균작용을 조사하기 위해, 배양된 HEK-블루 hDectin-1a 세포를 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 항체에 접합된 pHrodo-표지된 비드로 처리하였다. pHrodo에 의해 생성된 형광 신호는 산성 환경, 예컨대 파고솜에서 발견되는 환경을 증가시킨다. 도 9a & 9b에 제시된 바와 같이, Dectin-1 항체-커플링된 비드는 HEK-블루 hDectin-1a 세포에서 식균작용을 촉진시킨다. 도 9b에 제시된 바와 같이, 259931 Dectin-1 항체 클론에 접합된 pHrodo-표지된 비드는 15e2 클론 (이소타입 대조군에 비해 2.1배 더 높음)에 비해 이소타입 대조군에 비해 더 높은 수준의 식균작용 (이소타입 대조군에 비해 4.5배 더 높음)을 촉진시켰다. HEK-블루 hDectin-1a의 처리는 표적화된 식균작용을 유도하는데 충분하였다. 일부 세포는 또한 다중 비드를 포식하였고, 이는 높은 내재화 효율을 나타낸다. HEK 세포가 식균작용에 수반되는 또 다른 수용체인 Fcγ 수용체를 발현하지 않고, 일반적으로 식균성이 아니기 때문에, 이들 결과는 Dectin-1-의존성 식균작용에 대한 높은 특이성의 지표이다.
Dectin-1 항체에 의한 자극 시에 관찰되는 Dectin-1-매개된 식균작용의 특이성을 경쟁 검정에 의해 추가로 시험하였다. 관찰된 식균작용이 Dectin-1 항체-접합된 비드에 의한 Dectin-1 수용체 자극으로 인한 것인 경우, 유리 Dectin-1 항체의 첨가가 비드의 식균작용을 감소시킬 것으로 예상된다. 이 실험에서, pHrodo-표지된 비드를 20 ng 내지 400 ng 범위의 증가된 양의 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군 (IgG2a)과 함께 혼합하였다. 400,000개의 비드의 모든 결합 부위를 점유하기 위해 20 ng의 항체가 필요하기 때문에 (제조자의 지침에 따라), 20 ng보다 많은 임의의 양은 과량의 비결합 항체를 생성할 것이다. 도 10에 제시된 바와 같이, Dectin-1-특이적 항체-유도된 식균작용의 수준은 과량의 유리 Dectin-1 항체의 존재 하에 감소하였다. 과량의 유리 항체는 pHrodo-표지된 Dectin-1 항체-접합된 비드와 경쟁하여, 비드의 식균작용을 감소시켰다. 이 관찰은 항체-유도된 식균작용이 Dectin-1 자극에 대해 특이적임을 뒷받침한다.
Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합된 3가지 크기의 pHrodo-표지된 비드, 0.85 μm, 3.4 μm 및 8 μm를 사용하여 식균작용을 또한 실험하였다. 3가지 모든 크기의 비드는 Dectin-1-매개된 식균작용을 통해 흡수되는 것을 발견되었다 (도 11a & 11b). 이들 데이터는 Dectin-1이 세포 (~10-20 μm), 박테리아 (~0.2-2 μm), 더 큰 바이러스 (~0.5-1 μm) 및 단백질 응집물과 같은 크기 범위의 질환-유발 인자 내에서 크기가 상이한 입자를 효과적으로 포식할 수 있다는 결론을 뒷받침한다.
Dectin-1이 2가지 상이한 이소형으로 발현되기 때문에, Dectin-1 항체가 Dectin-1의 이소형 A 및 B 둘 다에 의한 식균작용을 자극하는 능력을 시험하였다. HEK-블루 hDectin-1a 및 HEK-블루 hDectin-1b 세포를 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군에 접합된 pHrodo-표지된 비드와 함께 인큐베이션하였다. 비드에 접합된 15e2 또는 259931 Dectin-1 항체 클론을 이 실험에서 시험하였다. 이들 2가지 클론은 Dectin-1의 A 및 B 이소형 둘 다에 상이한 친화도로 결합할 수 있다 (표 2 참조). 도 12a & 12b에 제시된 바와 같이, 15e2 및 259931 Dectin-1 항체 클론은 Dectin-1의 이소형 A를 과발현하는 HEK 세포에서 식균작용을 비슷한 수준으로 촉진시켰다. 그러나, 259931은 15e2 클론에 비해 Dectin-1의 이소형 B를 과발현하는 HEK 세포에서 더 높은 수준의 식균작용을 촉진시켰다. 표 2에 제시된 바와 같이, 259931 클론은 15e2 클론에 비해 이소형 B에 대해 더 높은 친화도를 가졌다. 이 결과는 Dectin-1 항체에 의해 결속된 특이적 에피토프가 발현되는 Dectin-1 이소형에 따라 식균성 능력에 대해 상이한 효과를 가짐을 나타낸다. Dectin-1 항체는 Dectin-1 이소형 A 및 B 과발현 세포주 둘 다에서 식균작용을 촉진시킬 수 있고, 따라서 Dectin-1의 어느 한 형태를 발현하는 일차 세포에서 식균작용을 촉진시킬 수 있다.
259931 Dectin-1 항체 클론이 Dectin-1의 A 또는 B 이소형을 발현하는 세포에서 식균작용을 촉진시키는데 더욱 양호하게 수행하였기 때문에, 이 항체 클론이 상이한 크기의 포식 입자를 촉진시키는 능력을 시험하였다. 이들 결과는 도 13a-13c에 제시된다. 259931 및 15e2 Dectin-1 항체 클론 둘 다 비슷한 효율로 중간 입자의 식균작용을 촉진시켰다. 그러나, 259931 클론은 15e2 클론에 비해 더욱 효율적으로 매우 작거나 또는 매우 큰 입자의 식균작용을 촉진시켰다. 이 결과는 2가지 Dectin-1 항체가 더 작거나 또는 더 큰 입자를 섭취하는 상이한 능력을 가짐을 나타내며, 이는 결속된 에피토프가 우수한 기능적 식균성 능력과 연관이 있음을 제시한다.
실시예 1에 기재된 바와 같이, Dectin-1은 식균성 세포의 한 유형인 인간 단핵구에서 많이 발현된다. 단핵구에서의 식균작용이 Dectin-1의 항체 결속에 의해 촉진될 수 있는지를 확인하기 위해, 인간 PBMC로부터의 정제된 단핵구 (CD14+)를 Dectin-1 항체에 접합된 pHrodo-표지된 비드와 함께 인큐베이션하였다. 도 14a-14c에 제시된 바와 같이, Dectin-1 항체-접합된 비드는 이소타입 대조군 비드에 비해 유의하게 더 높은 수준으로 (1.6배 더 높음) 단핵구에 의한 식균작용을 촉진시켰다. 따라서, Dectin-1을 과발현하는 세포에서 식균작용을 촉진시키는 것 외에도, Dectin-1-특이적 항체는 인간 단핵구에서 식균작용을 촉진시킨다.
단핵구에서 식균작용의 활성화는 Dectin-1의 자극에 대해 특이적이고, Fcγ 수용체 (FcγR)와 무관하다. 도 15에 제시된 바와 같이, FcγR을 차단하기 위한 항체의 첨가는 Dectin-1 항체-접합된 비드에 의한 식균작용의 유도에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 단핵구에서 유도된 식균작용은 Dectin-1 항체에 의해 유도되고, Dectin-1-특이적이고, FcγR-매개된 식균작용으로 인한 것이 아니다.
Dectin-1-매개된 식균작용은 액틴 세포골격을 필요로 하기 때문에, 액틴 해중합 약물인 시토칼라신 D (CytoD)의 첨가 효과를 또한 시험하였다. 단핵구를 CytoD의 존재 또는 부재 하에 Dectin-1 항체-접합된 비드와 함께 인큐베이션하였다. 도 16에 제시된 바와 같이, Dectin-1-매개된 식균작용은 CytoD로의 처리에 의해 억제되었고, 이는 액틴 세포골격의 필요를 입증한다. 활성 액틴 중합이 식균작용을 위해 필요하고, Dectin-1-매개된 식균작용이 CytoD에 의한 처리에 대해 민감성이었기 때문에, Dectin-1 항체-매개된 표적화된 식균작용은 이러한 유형의 세포 수송에 대해 특이적이며, 비-특이적 또는 수동적 메카니즘을 통하지 않는다.
최종적으로, Dectin-1 항체가 인간 대식세포에서 식균작용을 촉진시키는 능력을 분석하였다. 정제된 단핵구를 MCSF (20 ng/ml) 중에서 7 일 동안 배양하여, 대식세포에서 분화시켰다. 이어서, 단핵구-유래된 대식세포를 Dectin-1 항체-접합된 비드와 함께 인큐베이션하여 이들 세포에서 Dectin-1-매개된 식균작용을 시험하였다. 도 17에 제시된 바와 같이, DECTIN-1 항체는 배양된 인간 대식세포에서 비드의 유도된 식균작용을 촉진시켰다. 더 높은 빈도의 식균작용 및 더 많은 수의 포식된 비드는 이소타입 대조군 비드에 비해 Dectin-1 항체-접합된 비드와 함께 인큐베이션한 세포에서 관찰되었다. 이들 결과는 대식세포-발현된 Dectin-1을 통해 조직에서 Dectin-1-매개된 식균작용이 가능함을 입증한다.
이 실시예에 제시된 결과는 확고하고 표적화된 고갈이 상이한 구획, 예컨대 혈액, 골수 및 조직에서 가능함을 강조한다.
다음으로, pHrodo-표지된 항-H3N2 바이러스 항체에 접합된 Dectin-1 항체의 포식을 Dectin-1을 과발현하는 재조합 세포주에서 실험하였고, 이는 Dectin-1 이중특이적 항체에 의해 매개된 바이러스의 포식을 입증하는 개념 증명을 제공한다. 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)을 H3N2 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질에 결합하는 항-H3N2 항체인 pHrodo-표지된 스트렙타비딘-12CA5 항체 (12CA5-SA-pHr)에 접합시켰다. HEK-블루 hDectin-1a 세포를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하고, 96-웰 플레이트에 시딩하였다 (50,000개 / 웰). 15e2-B 또는 이소타입 대조군을 12CA5-SA-pHr과 혼합하고, 30 분 동안 이중특이적 항체가 형성되게 하였다. 가용성의 이중특이적 항체를 40 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식은 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 pHrodo 활성화를 평가함으로써 모니터링하였다. 세포에 대한 이중특이적 Dectin-1/12CA5 항체의 접합의 도해는 도 18a에 제시된다. 이 포맷을 이용하여 세포와 H3N2 바이러스를 연결시킬 수 있다.
18 시간째에, 대표적인 영상은 pHrodo 양성 세포를 제시하였다 (포식된 12CA5 pHrodo 표지된 항체는 파고솜에서 밝은 적색 형광을 냄; 도 18b). 도 18c는 24 시간에 걸친 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 제시한다. 포식을 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대핸 적색 객체 카운트 (pHrodo)의 중첩으로 표현하였다.
이들 결과는 Dectin-1 및 질환-유발 인자 (예를 들어, H3N2 인플루엔자 바이러스)를 표적화하는 이중특이적 항체는 상기 인자가 Dectin-1을 과발현하는 HEK 세포에서 포식되게 할 수 있음을 입증한다. 이들 데이터는 Dectin-1 및 작은 생물학적 인자, 예컨대 인플루엔자 바이러스 (~100 nm)를 표적화하는 이중특이적 항체가 포식 및 식균작용을 통한 제거를 위해 Dectin-1-발현 세포를 질환-유발 인자에 연결시키는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
다음으로, pHrodo-표지된 항-H3N2 바이러스 항체에 접합된 Dectin-1 항체의 포식을 일차 인간 단핵구에서 실험하였고, 이는 일차 인간 식균성 세포에서 Dectin-1 이중특이적 항체에 의해 매개된 바이러스의 포식을 입증하는 개념 증명을 제공한다. 도 19a & 19b는 인간 단핵구에 의한 Dectin-1 이중특이적 항체의 포식을 제시한다. 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)을 H3N2 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질에 결합하는 항-H3N2 항체인 pHrodo 표지된 스트렙타비딘-12CA5 (12CA5-SA-pHr)에 접합시켰다. 인간 단핵구를 세포-침투성 염료 칼세인 AM으로 표지하고, 96-웰 플레이트에 시딩하였다 (50,000개 / 웰). 15e2-B 또는 이소타입 대조군 항체를 12CA5-SA-pHr과 혼합하고, 30 분 동안 이중특이적 항체가 형성되게 하였다. 가용성의 이중특이적 항체를 40 nM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 pHrodo 활성화를 평가함으로써 모니터링하였다. 도 19a는 21 시간에 걸쳐 15e2-B/12CA5-SA-pHr 이중특이적 항체의 포식을 제시하며, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 칼세인-양성 세포에 대한 적색 객체 카운트 (pHrodo)의 중첩으로 표현하였다. ** p<0.01; **** p<0.0001 vs 이소타입. 홀름-사이닥 다중 비교 시험에 의한 2-원 anova. 도 19b는 실험 6 시간째에 pHrodo 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다 (포식된 12CA5 pHrodo 표지된 항체는 파고솜에서 밝은 적색 형광을 냄).
이들 결과는 단핵구가 Dectin-1/H3N2 인플루엔자 바이러스 이중특이적 항체를 포식하였음을 나타낸다. 이들 데이터는 Dectin-1 이중특이적 결합 단백질이 인간 단핵구에 의해 질환-유발 인자, 예컨대 인플루엔자 바이러스의 포식을 촉진시키는데 사용될 수 있다는 개념을 뒷받침한다. 이는 가용성 Dectin-1 이중특이적 항체의 주입에 의해 감염성 질환의 치료를 위해 이들 질환-유발 인자를 제거할 가능성을 강조한다.
일차 인간 단핵구에 의한 40nm 비드의 포식 또한 실험하였다. 도 20a & 20b는 인간 단핵구에 의한 비오틴화 Dectin-1 항체 (15e2-B) 또는 비오틴화 이소타입 (IgG2a-B)에 접합된 스트렙타비딘 FITC-표지된 폴리스티렌 비드 (40 nm)의 포식을 제시한다. 폴리스티렌 FITC 비드를 비오틴화 Dectin-1 항체 또는 이소타입 대조군으로 30 분 동안 포화시켰다. 이어서, 항체/비드 복합체를 배양된 인간 단핵구와 함께 1:6 (세포:비드)의 비로 인큐베이션하였다. 단핵구의 FITC 염색을 인큐사이트 라이브 세포 영상화에 의해 모니터링하였다. 도 20a는 21 시간에 걸쳐 단핵구에 의한 SA-FITC 비드의 포식을 제시하며, 인큐사이트 분석 소프트웨어에 의해 정량화하였고, 녹색 (FITC 양성) 객체 카운트로 표현하였다. 도 20b는 실험 15 시간째에 FITC 양성 세포의 대표적인 영상을 제시한다.
항-Dectin-1 항체는 매우 작은 폴리스티렌 비드 (40 nm)의 포식을 촉진시키는 것으로 확인되었다. 이들 데이터는 매우 작은 입자가 Dectin-1을 표적화함으로써 포식될 수 있음을 제시하고, 매우 작은 질환-유발 인자, 예컨대 바이러스의 식균작용을 촉진시킬 가능성을 나타낸다.
본 개시내용이 이해의 명료함을 위해 설명 및 예시에 의해 다소 상세하게 기재되었지만, 설명 및 예시가 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명시적으로 참조로 포함된다.
Claims (18)
- 질환-유발 인자에 특이적으로 결합하는 제1 결합 도메인, 대식세포 상에서 발현되는 식균성 수용체인 Dectin-1에 결합하고 대식세포의 식균작용 활성을 유도하는 제2 결합 도메인, 및 이뮤노글로불린 Fc 도메인을 포함하는 결합 단백질을 인간 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 표적화된 식균작용에 의해 질환-유발 인자를 제거하거나 또는 그의 수를 감소시키는 방법.
- 제1항에 있어서, 항체의 투여가 상기 인자의 수를 검출 한계 미만으로 감소시키고, 수준이 항체 투여 후 적어도 약 1 주 동안 검출 미만으로 유지되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 질환-유발 인자의 감소가 투여 후 처음 24 시간 또는 48 시간 내에 발생하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 질환-유발 인자의 감소가 가역적인 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 질환-유발 인자의 감소가 증상에서의 감소를 유도하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 질환-연관된 단백질 및 단백질 응집물을 제거하여 비정상적인 단백질 축적을 억제하며 따라서 신경변성, 섬유증 또는 아밀로이드증을 비롯한 질환의 진행을 완화시키거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 암, 종양 또는 림프종 세포를 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 질환의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 미생물 (예를 들어, 박테리아, 진균, 바이러스), 원생동물 기생충을 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 질환의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 노쇠 세포 및 그들의 생성물을 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 노화의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 미생물 (예를 들어, 박테리아, 진균, 바이러스), 원생동물 기생충을 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 질환의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, LDL 및 동맥경화증 또는 가족성 고콜레스테롤혈증을 비롯한 심혈관 질환을 유도하는 다른 인자를 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 질환의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 비만 세포를 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 알러지, 섬유증, COPD, 천식, 및 면역증식성 질환을 비롯한 다른 비만 세포 관련 질환의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 호산구를 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 알러지, 섬유증, COPD, 천식, 및 면역증식성 질환을 비롯한 다른 호산구 관련 질환의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, ILC2 세포를 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 알러지, 섬유증, COPD, 천식, 및 면역증식성 질환을 비롯한 다른 ILC2 세포 관련 질환의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이, 근육, GI 관, 폐, 심장, 관절, 뇌 및 다른 장기에서 염증성 면역 세포를 제거하거나 또는 그의 수준을 감소시키며 따라서 근육염, IBD, RA, 알러지, 섬유증, COPD, 천식, 및 면역증식성 질환을 비롯한 다른 면역 세포 관련 질환의 진행을 억제하거나 또는 예방하는데 사용되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질이 특이적 항체; 공유 결합된 2개의 IgG (IgG2); IgG-scFv; 인트라바디, 펩티바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, SMTP, 및 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 탠덤 디-scFV, 탠덤 트리-scFv, ADAPTIR); Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv 항체, VH, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로부터 선택되는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 결합 단백질의 결합 도메인이 비-인간, 키메라, 인간화, 또는 인간, 바람직하게는 인간화 또는 인간인 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 단백질이 Dectin-1에 결합하는 제1 결합 도메인 및 질환-유발 인자에 의해 발현되는 표적 항원에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체인 방법.
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