KR20220029221A - Pak1 억제활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

Pak1 억제활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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KR20220029221A
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Abstract

본 발명은 신규한 화합물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 화합물들을 처리하는 경우, PAK1의 활성이 억제되고, 그 하부인자의 발현 감소 효과를 확인하여 암에 대한 치료효과를 확인하였다.
또한, 현재 PAK1의 활성억제제로 사용되고 있는 IPA-3과 비교하는 경우에도 우수한 억제활성을 나타냈으며, PAK1의 활성을 억제할 수 있는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물은 암의 종양에 대한 생장 억제력이 우수하여 암의 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

PAK1 억제활성을 갖는 신규 화합물 및 이의 용도 {Novel compounds having PAK1 inhibitory activity and uses thereof}
본 발명은 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, PAK1의 활성을 억제할 수 있는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 전 세계적으로 매년 900만명이 걸리고 500만명이 이로 인해 사망하는 것으로 추정되며, 우리나라에서는 매년 10만명의 새로운 환자가 발생하고 현재 25만명의 환자가 암으로 치료를 받고 있다.
암은 서양에서는 두번째로 많은 사망원인이고, 우리나라에서도 가장 흔한 사망원인으로 지목되고 있다. 우리나라에서 가장 많이 발생하는 암은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 유방암, 자궁경부암 등으로, 이러한 6대 암이 우리나라의 암발생의 66%를 차지하고 있으며, 폐암은 그 중에서도 가장 높은 사망률을 보인다.
폐암은 크게 비소세포폐암과 소세포폐암으로 나눌 수 있으며, 병기에 따라 각각 치료방법이 다르고, 치료받는 환자의 전신 상태와 개개인의 치료 선호도에 따라서도 치료방법을 달리 한다. 폐암의 치료는 주로 수술, 항암화학요법, 방사선 치료 등이 있다. 수술적 치료의 경우에는 한쪽 폐 전체를 절제하는 전폐 절제술, 폐의 한 엽을 절제하는 폐엽 절제술, 우측 폐에서만 가능한, 폐의 두엽을 한 번에 제거하는 양엽 절제, 쐐기 절제술 및 분절 절제술이 있으며, 항암화학요법은 비소세포폐암에 주로 시스플라틴(Cisplatin), 비노렐빈(Vinorelbine), 탁솔(Taxol), 탁소터(Taxotere), 젬시타빈(Gemcitabine), 알림타(Alimta) 등의 항암제를 사용하고, 소세포 폐암에 에토포사이드(Etoposide), 아드리아마이신(Adriamycin), 빈크리스틴(Vincristine), 싸이톡산(Cyclophosphamide), 아이포스파마이드(Ifosphamide) 등의 항암제를 사용하는 방식으로 치료하며, 제한성 병기에서는 방사선 치료를 병용한다(서울 아산병원 암센터 발행 : 환자와 일반인을 위한 안내서-폐암에 대한 이해(2012.02.01)).
그러나 이러한 치료방법에도 불구하고, 각 치료별 단점이 존재하는데, 폐의 호흡을 담당하는 폐의 일부분을 외과적으로 떼어내는 수술적 치료의 경우에는, 대부분 상대적인 폐기능 저하, 폐 합병증, 심장 합병증, 상처 부위 감염, 농흉, 신체 각 장기의 기능 부전, 애성(쉰 목소리) 등의 부작용이 동반될 수 있으며, 항암화학요법의 경우에는 빠르게 분열하는 정상적인 세포들까지 손상시켜 구토, 설사, 변비 등의 소화기계 문제와 탈모, 주사 맞은 부위의 피부 손상, 말초신경염 등의 여러 가지 부작용들을 초래할 수 있고, 방사선 치료의 경우에는 피부염, 탈모, 심신피로, 식욕 부진 등의 증세가 나타날 수 있으며, 식도염과 방사선 폐렴이 특징적으로 나타날 수 있다. 이러한 기존의 치료방식의 부작용 때문에, 암의 새로운 치료방법이 꾸준히 요구되고 있으며, 그 중 암과 관련이 있다고 밝혀진 PAK1에 대해서도 연구가 진행 중이다.
본 발명자들은 기존의 상기와 같은 문제점을 해결하고 PAK1을 억제하는 효과를 가지는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기 위해 연구, 노력한 결과, PAK1의 활성 억제능이 우수한 신규 화합물을 합성하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 PAK1의 활성을 억제하는 신규 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는, 항암보조제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
R1 및 R3는 각각 독립적으로 C1-3 알콕시; 할로젠; 또는
Figure pat00002
; 이고,
R2 및 R4는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; 또는 할로젠이고,
L은 -CH2-, -CH2CH2- 또는 -CH2O- 이다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
1) 2,6-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 8);
2) 2,6-비스((E)-3-플루오로-4-메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 9);
3) 2,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온(화합물 10);
4) 3,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)테트라하이드로-4H-피란-4-온(화합물 13);
5) 2-((E)-4-플루오로-3-(페나진-2-일메톡시)벤질리딘)-6-((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 14).
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00003
상기 화학식 1에서,
R1 및 R3는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; C1-3 알콕시; 할로젠;
Figure pat00004
; 또는 하이드록시; 이고,
R2 및 R4는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; C1-3 알콕시; 할로젠; 또는 하이드록시; 이고,
L은 -CH2-; -CH2CH2-; 또는 -CH2O-; 이다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
1) 2,6-비스((E)-4-하이드록시-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 1);
2) 2,6-비스((E)-3-브로모-4-하이드록시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 2);
3) 2,6-비스((E)-3,4-디하이드록시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 3);
4) 2,6-비스((E)-3-하이드록시-4-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 4);
5) 2,6-비스((E)-3,4-디메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 5);
6) 2,6-비스((E)-3,4-디메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 6);
7) 2,6-비스((E)-3,4-디플루오로벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 7);
8) 2,6-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 8);
9) 2,6-비스((E)-3-플루오로-4-메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 9);
10) 2,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온(화합물 10);
11) 2,5-비스((E)-3-하이드록시-4-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온(화합물 11);
12) 2,5-비스((E)-3,4-디하이드록시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온(화합물 12);
13) 3,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)테트라하이드로-4H-피란-4-온(화합물 13);
14) 2-((E)-4-플루오로-3-(페나진-2-일메톡시)벤질리딘)-6-((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 14).
본 발명의 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 PAK1의 활성을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 간암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 뇌암, 후두암, 전립선암, 방광암, 식도암, 갑상선암, 혈액암, 신장암 및 직장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 항암보조제를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 항암보조제는 항암제와 병용 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 병용 투여는 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(seqeuntial)으로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 PAK1의 활성 억제를 통한 항암 효과를 가지며 종래의 PAK1 억제제보다 심장독성을 일으킬 수 있는 PAK2의 감소가 적고 뛰어난 수준의 항암 효과를 나타내는 바, 다양한 암 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1는 본 발명의 화합물들과 기존에 알려진 PAK1 저해제인 IPA-3의 PAK1과의 결합 친화도(binding affinity)를 확인한 결과로서, 도 1a는 결합친화도를 Autodock Vina, Autodock 4 및 Dock 6로 확인한 결과이며, 도 1b는 MHY4571과 PAK와의 결합 형태를 3D로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 화합물들의 PAK1, PAK2의 활성 억제 정도를 P-PAK1, P-PAK2 및 PAK1의 발현과 대조군인 β-actin의 발현 비교를 통해 확인한 것으로서, 도 2a는 본 발명의 화합물을 처리한 경우의 발현을 관찰한 결과이고, 도 2b는 MHY4571을 처리했을 때의 발현을 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명의 화합물들을 처리시 폐암세포주의 생존율을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 화합물이 MHY 4571의 농도에 따른 정상 표피세포(BEAS-2B)와 폐암세포(HCC2108, NCI-H1703, HCC 95)사멸 및 증식억제 효과를 확인한 결과로서, 도 4a는 MTT assay를 통해 MHY 4571의 상기 세포주들에 대한 세포 생존율을 확인한 결과이며, 도 4b는 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)를 통해 정상 표피세포(BEAS-2B)와 폐암세포(NCI-H1703)를 관찰해 정상 표피세포(BEAS-2B)와 폐암세포(NCI-H1703)에서 괴사(necrotic), 초기 세포자살(early apoptotic), 후기 세포자살(late apoptotic)이 발생하는 세포를 확인한 결과이고, 도 4c는 Colony formation assay를 통해 상기 세포주들을 관찰한 결과이다.
도 5는 MHY4571 처리시 다른 대장암(HT-29 Cell), 전립선암(PC3 Cell), 간암(HepG2 Cell) 세포에서 세포독성의 정도를 관찰한 결과이다.
도 6은 MHY4571가 처리된 세포에서 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과로서, 도 6a는 PARP, Cleaved PARP, Procaspase-3 단백질의 발현정도를 대조군인 β-actin과의 비교를 통해 확인한 결과이고, 도 6b는 P-EGFR, EGFR, P-Akt, Akt, P-ERK 및 ERK를 대조군인 β-actin과의 비교를 통해 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 화합물 MHY4571의 처리시 단백질 발현의 변화를 관찰한 결과로서, 도 7a는 P-PAK1, PAK1, P-CREB, CREB 및 E2F8을 대조군인 β-actin과의 비교를 통해 확인한 결과이고, 도 7b는 P-PAK1/PAK1, P-CREB/CREB 및 E2F8/β-actin의 값을 확인한 결과이다.
도 8은 면역저하 생쥐(H1703 cell xenograft)에 본 발명의 화합물인 MHY4571을 시스플라틴과 병용 투여하는 방법을 표현한 모식도 이다.
도 9는 면역저하 생쥐(H1703 cell xenograft)에 본 발명의 화합물인 MHY4571을 단독으로 투여하거나, 시스플라틴과 병용투여한 경우의 차이 비교를 위해 종양의 크기 변화를 관찰한 결과로서, 도 9a는 MHY4571을 단독으로 처리할 때, 농도에 따른 종양의 크기변화를 관찰한 결과이며, 도 9b는 MHY4571과 시스플라틴을 각각 또는 병용 투여한 경우, 시간의 흐름에 따른 종양의 크기 변화를 관찰한 결과이다.
도 10은 본 발명의 화합물인 MHY4571과 시스플라틴(cisplatin)의 병용요법을 폐암세포주에서 결과를 확인한 것으로서, 도 10a는 시스플라틴(cisplatin), MHY4571을 단독 투여하는 경우 및 시스플라틴과 MHY4571의 병용투여 시, 세포의 생존율을 나타낸 결과이며, 도 10b는 Colony formation을 통한 세포사멸을 확인한 결과이고, 도 10c는 Fa-Cl Plot을 확인한 결과이며, 도 10d는 Isobologram의 결과이고, 도 10e는 FACS assay를 통해, 괴사(necrotic), 초기 세포자살(early apoptotic), 후기 세포자살(late apoptotic)이 발생하는 세포를 관찰한 결과이다.
본 발명자들은 암의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기 위해 연구, 노력한 결과, PAK1의 억제능이 우수한 항암활성이 있는 신규 화합물을 합성하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00005
상기 화학식 1에서,
R1 및 R3는 각각 독립적으로 C1-3 알콕시; 할로젠; 또는
Figure pat00006
; 이고,
R2 및 R4는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; 또는 할로젠; 이고,
L은 -CH2-; -CH2CH2-; 또는 -CH2O-; 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
1) 2,6-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 8);
2) 2,6-비스((E)-3-플루오로-4-메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 9);
3) 2,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온(화합물 10);
4) 3,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)테트라하이드로-4H-피란-4-온(화합물 13);
5) 2-((E)-4-플루오로-3-(페나진-2-일메톡시)벤질리딘)-6-((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 14).
본 발명에 있어서, "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용되는 유기 또는 무기염을 말한다. 예시적 염으로, 황산염, 구연산염, 아세트산염, 옥살산염, 염산염, 브롬산염, 요오드산염, 질산염, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 아이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 석시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 삭카레이트, 포름에이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트, 메실레이트, 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트 및 파모에이트염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 약학적으로 허용되는 염은 아세테이트 이온, 석시네이트 이온 또는 다른 카운터 이온과 같은 다른 분자의 포함과 관련될 수 있다. 상기 카운터 이온은 모 화합물의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 혹은 무기 잔기일 수 있다. 더욱이, 약학적으로 허용되는 염은 이의 구조에서 하나 이상의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 상기 약학적으로 허용되는 염의 일부인 경우는 다수의 카운터 이온을 가질 수 있다. 따라서, 약학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 이온 및/또는 하나 이상의 카운터 이온을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, “C1-3 알콕시”는 1 내지 3개의 탄소원자를 가지는 불포화된 탄화수소기의 어느 하나 이상의 수소가 하이드록시기(-OH)로 치환된 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, “할로겐”은 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드 원자이다.
본 발명에 있어서, “C1-3 알킬”은 선형 혹은 분지된 1개 내지 3개의 탄소 원자를 가지는 포화된 탄화수소기를 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필 또는 iso-프로필이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00007
상기 화학식 1에서,
R1 및 R3는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; C1-3 알콕시; 할로젠;
Figure pat00008
; 또는 하이드록시; 이고,
R2 및 R4는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; C1-3 알콕시; 할로젠; 또는 하이드록시; 이고,
L은 -CH2-; -CH2CH2-; 또는 -CH2O-; 일 수 있다.
본 발명에 있어서, "예방"이란, 암의 발생이 예상되는 개체에게 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하여 상기 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하는데, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 저해, 전이의 예방, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 경감 또는 일시적인 완화 및 예후의 개선이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 암이 발생한 환자에게 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 투여하여 암이 발생한 환자를 호전시키는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 대상질환인 "암"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭한다. 상기 암의 종류로는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 간암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 뇌암, 후두암, 전립선암, 방광암, 식도암, 갑상선암, 혈액암, 신장암 또는 직장암 등일 수 있으며, 바람직하게는 폐암일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "폐암"은 소세포폐암 또는 비소세포폐암일 수 있으며, 비소세포폐암은 편평상피세포암(Squamous cell carcinoma), 선암(Adenocarcinoma) 또는 대세포암(Large-cell carcinoma)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
1) 2,6-비스((E)-4-하이드록시-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 1);
2) 2,6-비스((E)-3-브로모-4-하이드록시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 2);
3) 2,6-비스((E)-3,4-디하이드록시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 3);
4) 2,6-비스((E)-3-하이드록시-4-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 4);
5) 2,6-비스((E)-3,4-디메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 5);
6) 2,6-비스((E)-3,4-디메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 6);
7) 2,6-비스((E)-3,4-디플루오로벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 7);
8) 2,6-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 8);
9) 2,6-비스((E)-3-플루오로-4-메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 9);
10) 2,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온(화합물 10);
11) 2,5-비스((E)-3-하이드록시-4-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온(화합물 11);
12) 2,5-비스((E)-3,4-디하이드록시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온(화합물 12);
13) 3,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)테트라하이드로-4H-피란-4-온(화합물 13);
14) 2-((E)-4-플루오로-3-(페나진-2-일메톡시)벤질리딘)-6-((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온(화합물 14).
본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 화합물의 PAK1의 활성 억제를 통한 항암 효과를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 화합물들이 PAK1와 결합 친화도(binding affinity)가 높아, 기존의 PAK1 저해제인 IPA-3보다 더 높은 효율로 PAK1의 활성을 억제할 수 있다는 사실을 확인했다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 화합물을 in vitro에서 폐암세포에 처리했을 때, 폐암세포의 사멸을 확인하였고(실시예 3-1 참조), 또한, 정상세포와 폐암세포에 MHY4571을 처리해 세포독성 및 폐암 세포의 사멸 정도를 관찰한 결과, 정상세포는 80%가량이 10 μM의 농도에도 생존한 반면, 폐암세포는 20% 내지 50% 가량의 폐암세포만 생존한 것을 확인할 수 있었다(실시예 3-2 참조). 본 발명의 다른 실시예에서는, MHY4571을 in vitro에서 대장암 세포, 전립선암 세포, 간암 세포에 처리했을 때, 세포 사멸을 확인하여 본 발명의 화합물이 폐암외의 암에 대해서도 항암 활성을 가진다는 사실을 확인할 수 있었다(실시예 3-3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 화합물인 MHY4571의 PAK1에 대한 억제 효과의 작용기전을 확인하였는데, MHY4571 처리시, PAK1의 활성화를 담당하는 하부인자인 CREB의 활성 및 CREB의 표적 단백질인 E2F8의 발현이 저하되는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 임상에서 사용중인 시스플라틴(cisplatin)과 MHY4571을 병용투여한 경우에 단독으로 사용한 경우보다 상승효과를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
이를 통해, 본 발명에 따른 화합물은 개별 치료제뿐만 아니라 다른 치료제와의 병용을 통해서도 유의적으로 항암 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는, 항암보조제를 제공한다.
상기 항암보조제는 항암제와 병용투여할 수 있으며, 항암제는 이로 제한되는 것은 아니지만, 시스플라틴(cisplatin)일 수 있다. 상기 병용 투여는 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(seqeuntial)으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다.
또한, 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 암 질환을 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 암이 발병될 가능성이 있거나, 또는 발병된 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 암을 완화 또는 치료할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 본 발명 화합물의 제조
1.1 화합물 1 내지 화합물 13
본 발명의 화합물 중, 화합물 1 내지 화합물 13을 제조하기 위해, 치환된 벤즈알데히드(2당량)와 1당량의 케톤[사이클로헥사논(cyclohexanone) 또는 사이클로펜타논(cyclopentanone) 또는 테트라하이드로-4H-피란-4-온(tetrahydro-4H-pyran-one)]이 들어있는 플라스크 속으로 1M HCl 아세트산 용액(4~8 mL/케톤1g)을 부가하고 실온에서 15 ~ 50시간 교반하였다. 물을 부가하고 생성된 고체를 여과하고 혼재되어 있는 부반응물을 제거하기 위해 물, 헥산, 에테르, 에탄올 또는 헥산/디클로로메탄 혼합용매로 고체를 씻어주어 화합물 1 내지 화합물 13을 얻었다. 2번 및 3번 화합물의 경우, 여과한 후 얻어진 화합물을 각각 메탄올과 디클로로메탄에서 재결정하여 더욱 순수한 화합물을 얻었다. 전체적인 반응은 하기 반응식 1에 나타내었다. 합성된 본 발명의 화합물 1 내지 화합물 13에 대한 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
[반응식 1]
Figure pat00009
화합물 번호 이름 합성시간(시간)/수율 1H 및 13C NMR 값
1
(MHY4573)		 (2E,6E)-2,6-Bis(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone (MHY4573) 50/79.8% 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.51 (s, 2H), 7.55 (s, 2H), 7.10 (s, 2H), 7.01 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.83 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 3.80 (s, 6H), 2.87 (t, 4H, J = 5.5 Hz), 1.71 (quint, 2H, J = 5.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 189.1, 148.5, 148.1, 136.8, 134.2, 127.6, 124.9, 116.2, 115.5, 56.3, 28.6, 23.2.
2
(MHY4574)		 (2E,6E)-2,6-Bis(3-bromo-4-hydroxybenzylidene)cyclohexanone (MHY4574) 50/42.3% 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.75 (s, 2H), 7.66 (d, 2H, J = 2.0 Hz), 7.47 (s, 2H), 7.39 (dd, 2H, J = 8.5, 2.0 Hz), 7.01 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 2.82 (t, 4H, J = 5.0 Hz), 1.69 (quint, 2H, J = 5.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 189.0, 155.5, 135.6, 135.3, 135.1, 132.0, 128.7, 117.0, 110.2, 28.5, 23.0.
3
(MHY4575)		 (2E,6E)-2,6-Bis(3,4-dihydroxybenzylidene)cyclohexanone (MHY4575) 50/27.4% 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.42 (s, 2H), 9.12 (s, 2H), 7.44 (s, 2H), 6.97 (s, 2H), 6.86 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 6.78 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 2.83 (t, 4H, J = 5.5 Hz), 1.69 (quint, 2H, J = 5.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 189.2, 147.5, 145.8, 136.8, 133.8, 127.6, 124.0, 118.3, 116.4, 28.7, 23.2.
4
(MHY4576)		 (2E,6E)-2,6-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclohexanone (MHY4576) 50/77.4% 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.17 (s, 2H), 7.47 (s, 2H), 7.00-6.97 (m, 6H), 3.79 (s, 6H), 2.85 (t, 4H, J = 5.5 Hz), 1.70 (quint, 2H, J = 5.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 189.2, 149.2, 146.9, 136.4, 134.7, 128.9, 123.6, 117.8, 112.6, 56.2, 28.6, 23.1.
5
(MHY4577)		 (2E,6E)-2,6-Bis(3,4-dimethoxybenzylidene)cyclohexanone (MHY4577) 50/82.3% 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.75 (s, 2H), 7.10 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.01 (s, 2H), 6.90 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 3.92 (s, 6H), 3.91 (s, 6H), 2.94 (t, 4H, J = 5.5 Hz), 1.82 (quint, 2H, J = 5.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 190.3, 149.8, 148.8, 137.0, 134.7, 129.2, 124.1, 113.9, 111.1, 56.1, 56.1, 28.7, 23.2.
6
(MHY4570)		 (2E,6E)-2,6-Bis(3,4-dimethylbenzylidene)cyclohexanone (MHY4570) 50/69.3% 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.76 (s, 2H), 7.25 (s, 2H), 7.23 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 2.93 (t, 4H, J = 5.5 Hz), 2.29 (s, 12H), 1.78 (quint, 2H, J = 5.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 190.6, 137.7, 137.1, 136.7, 135.6, 133.9, 132.0, 129.8, 128.1, 24.0, 23.2, 20.0, 19.8; LRMS (ESI+) 353 [M+Na]+, 385 [M+MeOH+Na] +.
7
(MHY4572)		 (2E,6E)-2,6-Bis(3,4-difluorobenzylidene)cyclohexanone (MHY4572) 50/37.0% 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.67 (s, 2H), 7.27 (dd, 2H, J = 10.5, 2.5 Hz), 7.22 - 7.17 (m, 4H), 2.88 (t, 4H, J = 5.5 Hz), 1.82 (quint, 2H, J = 6.0 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 189.7, 150.5 (dd, J = 250.5, 19.9 Hz), 150.3 (dd, J = 247.4, 19.9 Hz), 136.7, 135.1, 133.1 (dd, J = 3.9, 1.6 Hz), 127.1 (dd, J = 6.1, 3.4 Hz), 119.0 (d, J = 17.5 Hz), 117.6 (d, J = 17.3 Hz), 28.4, 22.8.
8
(MHY4571)		 (2E,6E)-2,6-Bis(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone (MHY4571) 24/72.6% 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.68 (s, 2H), 7.09 - 6.97 (m, 6H), 3.87 (s, 6H), 2.87 (t, 4H, J = 5.2 Hz), 1.77 (quint, 2H, J = 5.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 190.0, 152.7 (d, J = 248.8 Hz), 147.7 (d, J = 12.1 Hz), 136.3, 136.0, 132.6 (d, J = 3.7 Hz), 123.4 (d, J = 6.8 Hz), 116.2 (d, J = 18.6 Hz), 116.0, 56.5, 28.5, 23.1; LRMS (ESI+) 393 [M+Na]+, 425 [M+MeOH+Na]+.
9
(MHY4578)		 (2E,6E)-2,6-Bis(3-fluoro-4-methylbenzylidene)cyclohexanone (MHY4578) 23/66.7% 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.66 (s, 2H), 7.17 (t, 2H, J = 8.0 Hz), 7.11 - 7.07 (m, 4H), 2.87 (t, 4H, J = 5.6 Hz), 2.26 (s, 6H), 1.77 (quint, 2H, J = 6.0 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 190.1, 161.2 (d, J = 243.2 Hz), 136.4, 136.0 (d, J = 2.1 Hz), 135.6 (d, J = 7.6 Hz), 131.5 (d, J = 5.5 Hz), 126.4 (d, J = 3.1 Hz), 125.8 (d, J = 17.3 Hz), 116.6 (d, J = 22.6 Hz), 28.6, 22.9, 14.7 (d, J = 3.4 Hz); LRMS (ESI+) 339 [M+H]+, 393 [M+MeOH+Na]+.
10
(MHY4667)		 (2E,5E)-2,5-Bis(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclopentanone (MHY4667) 15/43.1% 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.53 (s, 2H), 7.19 - 7.12 (m, 6H), 3.94 (s, 6H), 3.10 (s, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 195.9, 153.3 (d, J = 250.4 Hz), 148.0 (d, J = 10.9 Hz), 136.9 (d, J = 2.2 Hz), 133.3 (d, J = 1.6 Hz), 132.7 (d, J = 3.9 Hz), 123.9 (d, J = 7.1 Hz), 116.6 (d, J = 18.7 Hz), 116.2 (d, J = 2.0 Hz), 56.5, 26.5.
11
(MHY4419 (= MHY1266))		 (2E,5E)-2,5-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (MHY4419=MHY1266) 26/56.9% 1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.25 (s, 2H), 7.27 (s, 2H), 7.14 (d, 2H, J = 1.5 Hz), 7.11 (dd, 2H, J = 8.5, 2.0 Hz), 7.01 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 3.81 (s, 6H), 3.01 (s, 4H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 195.5, 149.9, 147.2, 136.0, 133.1, 129.1, 124.3, 117.5, 112.8, 56.3, 26.6.
12
(MHY4420(= MHY1264))		 (2E,5E)-2,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)cyclopentanone (MHY4420=MHY1264) 26/50.5% 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 9.38 (brs, 4H), 7.21 (s, 2H), 7.01 (s, 2H), 6.98 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.81 (dd, 2H, J = 8.0 Hz), 2.97 (s, 4H); 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ 195.5, 148.2, 146.1, 135.1, 133.4, 127.8, 124.6, 118.0, 116.7, 26.6.
13
(MHY4668)		 (3E,5E)-3,5-Bis(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)dihydro-2H-pyran-4(3H)-one (MHY4668) 24/35.2% 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.76 (s, 2H), 7.12 (dd, 2H, J = 10.5, 8.5 Hz), 6.93 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 6.84 - 6.82 (m, 2H), 4.91 (s, 4H), 3.92 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 185.3, 153.2 (d, J = 250.5 Hz), 148.0 (d, J = 10.7 Hz), 135.8 (d, J = 1.0 Hz), 133.0, 131.5 (d, J = 3.9 Hz), 123.5 (d, J = 7.1 Hz), 116.5 (d, J = 18.7 Hz), 116.0, 68.6, 56.5.
1.2 화합물 14 및 이의 염(화합물 15)
(1) 화합물 A
1,2-벤젠디올(1.0 g, 9.08 mmol)과 Ag2O(4.8 g, 20.71 mmol)에 아세톤을 넣고 10분간 실온에서 격렬하게 교반한 후, 3,4-디아민톨루엔(1.2 g, 9.82 mmol)과 아세트산을 부가하고 실온에서 4시간 교반하였다. 여과한 후 여액을 감압 하에서 증발시켜 얻어진 잔사를 디클로로메탄과 K2CO3수용액에서 추출하여 얻어진 유기층을 MgSO4로 탈수시키고 감압 하에서 증발시켜 얻어진 잔사를 헥산:에틸 아세테이트(5:1) 혼합용매를 전개용매로 하여 컬럼 크로마토그래피하여 2-Methylphenazine(203 mg, 11.5%)를 얻었고, 그 1H NMR 값은 하기와 같다. 전체적인 반응은 하기 반응식 2에 나타내었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.24 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.24 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.14 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.01 (s, 1H), 7.83 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.81 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.68 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 2.65 (s, 3H).
[반응식 2]
Figure pat00010
(2) 화합물 B
상기에서 얻은 화합물인 2-Methylphenazine(195 mg, 1.00 mmol), N-bromosuccinimide (197 mg, 1.1 mmol) 및 benzoyl peroxide(12.2 mg, 0.05 mmol)에 클로로포름(5 mL)을 부가한 후 7일간 환류 교반하였다. 식힌 후, 여과하고 여액을 물과 포화 식염수로 씻어주고 유기층을 MgSO4로 탈수시키고 감압 하에서 증발시켜 얻어진 잔사를 헥산:에틸 아세테이트(5:1) 혼합용매를 전개용매로 하여 컬럼 크로마토그래피하여 2-(Bromomethyl)phenazine(133 mg, 48.5%)를 얻었고, 그 1H NMR은 하기와 같다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.26 - 8.24 (m, 3H), 8.22 (s, 1H), 7.88 - 7.85 (m, 3H), 4.74 (s, 2H).
(3) 화합물 C
(2E,6E)-2,6-Bis(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone(200 mg, 0.54 mmol)을 무수 디클로로메탄(2.5 mL)에 녹이고 0oC로 냉각한 후, 1M BBr3 디클로로메탄 용액을 점적하여 부가하였다. 0oC에서 3시간 교반한 후, 디클로로메탄과 물에서 추출하여 유기층을 MgSO4로 탈수시키고 감압 하에서 증발시켜 얻어진 잔사를 헥산:에틸 아세테이트(3:1) 혼합용매를 전개용매로 하여 컬럼 크로마토그래피하여 (2E,6E)-2-(4-Fluoro-3-hydroxybenzylidene)-6-(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone(52 mg, 27.0%)을 얻었고, 그 1H NMR은 하기와 같다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.74 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.16 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.12 (dd, 2H, J = 11.0, 8.0 Hz), 7.07 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.06 - 7.03 (m, 1H), 7.00 - 6.98 (m, 1H), 5.44 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 2.92 (t, 4H, J = 5.5 Hz), 1.83 (quint, 2H, J = 5.5 Hz).
(4) (2E,6E)-2-(4-fluoro-3-(phenazin-2-ylmethoxy)benzylidene)-6-(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone(화합물 14, MHY4699)
(2E,6E)-2-(4-Fluoro-3-hydroxybenzylidene)-6-(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone(10.5 mg, 0.03 mmol), 2-(Bromomethyl)phenazine(8.6 mg, 0.03 mmol) 및 K2CO3 (11 mg, 0.08 mmol)에 N,N-디메틸포름아마이드(0.6 mL)를 가하고 실온에서 5시간 교반하였다. 물과 에테르에서 추출하여 유기층을 MgSO4로 탈수시키고 감압 하에서 증발시켜 (2E,6E)-2-(4-fluoro-3-(phenazin-2-ylmethoxy)benzylidene)-6-(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone(10.3mg, 63.7%)을 얻었고, 그 1H NMR 및 13C NMR 값은 하기와 같다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 8.31 (d, 1H, J = 1.5 Hz), 8.30 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.27 - 8.24 (m, 2H), 7.94 (dd, 1H, J = 8.5, 1.5 Hz), 7.87 (t, 1H, J = 7.0 Hz), 7.85 (t, 1H, J = 7.0 Hz), 7.67 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.16 (dd, 1H, J = 10.5, 8.5 Hz), 7.11 (dd, 1H, J = 9.5, 1.5 Hz), 7.07 (dd, 1H, J = 11.0, 2.5 Hz), 7.06 - 7.04 (m, 1H), 7.01 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.00 - 6.97 (m, 1H), 5.47 (s, 2H), 3.90 (s, 3H), 2.81 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 2.71 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 1.63 (quint, 2H, J = 5.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 189.9, 153.2 (d, J = 249.5 Hz), 152.7 (d, J = 248.8 Hz), 147.7 (d, J = 11.0 Hz), 146.2 (d, J = 10.8 Hz), 143.9, 143.8, 143.4, 143.4, 139.3, 136.4, 136.1, 136.0, 135.9, 132.7 (d, J = 3.8 Hz), 132.6 (d, J = 4.1 Hz), 130.9, 130.8, 130.5, 129.9, 129.8, 129.6, 127.5, 124.6 (d, J = 6.9 Hz), 123.3 (d, J = 6.9 Hz), 118.2, 116.7 (d, J = 18.7 Hz), 116.3, 115.9 (d, J = 19.3 Hz), 71.2, 56.5, 29.9, 28.4, 22.9.
(5) (2E,6E)-2-(4-fluoro-3-(phenazin-2-ylmethoxy)benzylidene)-6-(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone dihydrochloride(화합물 15, MHY4705)
상기 방법으로 합성한 (2E,6E)-2-(4-fluoro-3-(phenazin-2-ylmethoxy)benzylidene)-6-(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone(10.3 mg, 0.02 mmol)에 2N HCl 수용액(0.1 ml)과 1,4-dioxane(0.1 mL)을 부가한 후 실온에서 2시간 교반하였다. 감압 하에서 용매를 제거하여 화합물 14의 염인 (2E,6E)-2-(4-fluoro-3-(phenazin-2-ylmethoxy)benzylidene)-6-(4-fluoro-3-methoxybenzylidene)cyclohexanone dihydrochloride(10.2mg, 87.5%)를 얻었고, 그 1H NMR 값은 하기와 같다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.31 (s, 1H), 8.29 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 8.25 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 8.24 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.99 (dd, 1H, J = 8.5, 1.5 Hz), 7.96 (t, 1H, J = 6.5 Hz), 7.94 (t, 1H, J = 6.5 Hz), 7.54 (s, 2H), 7.45 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.32 (dd, 1H, J = 11.0, 8.5 Hz), 7.27 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.25 (dd, 1H, J = 11.5, 8.5 Hz), 7.15 - 7.11 (m, 1H), 7.09 - 7.04 (m, 1H), 5.60 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.78 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 2.68 (t, 2H, J = 5.5 Hz), 1.50 (quint, 2H, J = 5.5 Hz).
실시예 2. 본 발명 화합물의 PAK1에 대한 활성 억제능 확인
먼저, 상기 실시예 1을 통해 제조된 본 발명의 화합물에 대하여, PAK1과의 결합 친화도(binding affinity)를 확인하기 위해 Autodock Vina, AutoDock 4와 Dock 6 program을 수행하였고, 그 결과 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 화합물들은 모두 PAK1과 좋은 결합 친화도를 나타내었고, 특히 MHY4571은 기존에 알려진 PAK1 저해제인 IPA-3보다 orthosteric site에서 더 높은 binding affinity를 가짐을 확인할 수 있었다. 또한 MHY4571과 PAK1의 결합 형태를 3D로 예측해 보았을 때, 도 1b에 나타낸 바와 같이 밀접한 결합을 할 수 있음을 확인할 수 있었다.
다음으로, 본 발명의 화합물을 다양한 농도(0, 1, 2.5, 5, 10 μM)로 폐암 세포주에 처리하고, 24시간이 경과하였을 때 폐암 세포주(NCI-H1703)의 단백질 활성 억제 정도를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 그 결과, 도 2a에서 나타난 바와 같이 P-PAK1의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 MHY4571을 0, 2.5, 5, 7.5 10 μM의 농도로 처리한 뒤, 발현을 관찰한 경우, 도 2b에 나타낸 바와 같이, P-PAK1의 발현이 농도 비례하여 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 본 발명 화합물의 항암 활성 확인
3.1 폐암세포에 대한 세포 사멸능 확인
본 발명의 화합물을 다양한 농도(0, 0.1, 1, 10 μM)로 폐암세포(in vitro)(NCI-H1703)에 처리한 후, 생존율을 측정한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 농도에 비례하여 폐암세포가 유의적으로 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, MHY4571 및 MHY4572는 10 μM의 농도만큼 투여하는 경우, 90% 이상의 폐암세포가 사멸하는 것을 확인할 수 있었다.
3.2 정상세포 및 폐암세포에서 세포 생존율 확인
MHY4571의 정상 표피세포(BEAS-2B)와 폐암세포(HCC 2108, NCI-H1703, HCC 95)에 대한 세포 독성 및 항암 활성 확인을 위해, MHY4571을 정상세포 및 폐암세포에 다양한 농도(0, 1, 5, 7.5, 10 μM)로 처리하고 24시간 뒤에 관찰한 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, 정상 표피세포에서는 세포사멸이 20% 내외로 적은 것에 비해, 폐암세포에서는 50% 이상 사멸됨을 확인할 수 있었다. 상기 세포주를 FACS assay한 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 정상세포(BEAS-2B)에서는 세포독성을 관찰할 수 없었으나, 폐암세포(NCI-H1703)에서는 MHY4571의 농도가 5μM를 넘어갈 때부터 세포괴사 및 후기 세포사멸이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 상기 폐암 세포주(NCI-H1703)를 colony formation를 통해 관찰해 보았을 때, 도 4c에 나타난 바와 같이, MHY4571의 처리시 세포사멸이 유의하게 증가하여 10μM 농도로 처리했을 때는 20% 이하의 세포만 생존해 있는 것을 확인할 수 있었다.
3.3 대장암, 전립선암, 간암에 대한 항암활성 확인
폐암 외의 다른 암에서의 항암활성을 추가적으로 확인하기 위해, MHY4571을 대장암(HT-29), 전립선암(PC3), 간암(HepG2) 세포주에 다양한 농도(0, 1, 5, 7.5, 10 μM)로 24시간 처리하고, MTT를 통해 세포 사멸을 확인한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 다른 암세포주에서도 세포사멸이 일어남을 확인할 수 있었고, 특히 대장암 (HT-29), 전립선암 (PC3)에서 유의적으로 암세포의 세포사멸이 일어나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 본 발명 화합물의 작용기전 확인
MHY4571을 다양한 농도(0, 2.5, 5, 7.5, 10 μM)의 농도로 24시간 처리한 폐암 세포주(NCI-H1703)를 웨스턴블롯을 통해 관찰한 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이 PARP, Procaspase-3, ERK 및 Akt의 활성이 감소하는 것을 확인하였고, 작용기전을 세부적으로 관찰한 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이 PAK1의 활성화를 담당하고 있는 하부 전사인자인 CREB의 활성화가 저해되고 CREB의 표적 단백질인 E2F8의 발현이 저하됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 본 발명 화합물과 시스플라틴의 병용처리시 항암활성의 상승효과 확인
도 8에 기재된 방식으로 MHY4571과 항암제인 platinum계열의 시스플라틴을 각각 또는 병용하여 마우스 모델에 처리하였다(H1703 cell xenograft). MHY4571을 단독으로 6.25, 12.5, 25mg/kg 만큼 처리한 뒤, 22일이 지나는 동안 시간 경과에 따른 종양세포의 크기를 관찰한 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 22일자에서 대조군에 비해 95%가량의 종양세포 크기의 감소가 일어남을 확인할 수 있었다.
MHY4571과 시스플라틴을 병용하여 처리한 후, 30일간 시간 경과에 따른 종양세포의 크기를 관찰한 결과, 도 9b에 나타난 바와 같이 단독으로 처리한 경우보다 병용하여 투여한 경우가 종양의 크기를 현저하게 억제하는 것으로 확인되었다. 또한, 종양 세포의 사멸을 관찰한 결과에서도, 도 10a에 나타난 바와 같이 MHY4571보다 시스플라틴과 병용하여 처리한 경우가 현저하게 뛰어난 항암활성을 나타냄을 확인하였고, 도 10b와 같이 Colony formation assay를 통해 관찰하였을 때도, 마찬가지의 결과를 확인할 수 있었다.
또한, Fa-Cl Plot 및 Isobologram을 통해 관찰한 결과, 도 10c 및 도 10d에 나타낸 바와 같이, 병용 투여하는 경우에 상승된 항암활성이 있음을 확인할 수 있었고, FACS assay로 시스플라틴, MHY4571을 각각 처리한 경우와 병용처리한 경우 및 대조군을 확인했을 때에도, 도 10e에 나타낸 바와 같이, 병용처리한 경우에 종양세포의 괴사와 후기 세포사멸이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, MHY4571을 기존 항암제(시스플라틴)와 병용하는 경우, 항암 활성이 유의적으로 상승됨을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure pat00011

    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R3는 각각 독립적으로 C1-3 알콕시; 할로젠; 또는
    Figure pat00012
    ; 이고,
    R2 및 R4는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; 또는 할로젠; 이고,
    L은 -CH2-; -CH2CH2-; 또는 -CH2O-; 이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    1) 2,6-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    2) 2,6-비스((E)-3-플루오로-4-메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    3) 2,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온;
    4) 3,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)테트라하이드로-4H-피란-4-온;
    5) 2-((E)-4-플루오로-3-(페나진-2-일메톡시)벤질리딘)-6-((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온.
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00013

    상기 화학식 1에서,
    R1 및 R3는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; C1-3 알콕시; 할로젠;
    Figure pat00014
    ; 또는 하이드록시; 이고,
    R2 및 R4는 각각 독립적으로 C1-3 알킬; C1-3 알콕시; 할로젠; 또는 하이드록시; 이고,
    L은 -CH2-; -CH2CH2-; 또는 -CH2O-; 이다.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    1) 2,6-비스((E)-4-하이드록시-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    2) 2,6-비스((E)-3-브로모-4-하이드록시벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    3) 2,6-비스((E)-3,4-디하이드록시벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    4) 2,6-비스((E)-3-하이드록시-4-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    5) 2,6-비스((E)-3,4-디메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    6) 2,6-비스((E)-3,4-디메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    7) 2,6-비스((E)-3,4-디플루오로벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    8) 2,6-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    9) 2,6-비스((E)-3-플루오로-4-메틸벤질리딘)사이클로헥산-1-온;
    10) 2,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온;
    11) 2,5-비스((E)-3-하이드록시-4-메톡시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온;
    12) 2,5-비스((E)-3,4-디하이드록시벤질리딘)사이클로펜탄-1-온;
    13) 3,5-비스((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)테트라하이드로-4H-피란-4-온;
    14) 2-((E)-4-플루오로-3-(페나진-2-일메톡시)벤질리딘)-6-((E)-4-플루오로-3-메톡시벤질리딘)사이클로헥산-1-온.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 PAK1의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 암은 대장암, 폐암, 유방암, 위암, 간암, 피부암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 뇌암, 후두암, 전립선암, 방광암, 식도암, 갑상선암, 혈액암, 신장암 및 직장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 3항의 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는, 항암보조제.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 항암보조제는 항암제와 병용 투여하는 것을 특징으로 하는, 항암보조제.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin)인 것을 특징으로 하는, 항암보조제.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 병용 투여는 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(seqeuntial)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 항암보조제.
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