KR20220027089A - Sox9-유도된 핍지교세포 전구 세포 - Google Patents

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파라스투 코샤크라그
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Abstract

다능성 줄기 세포 (PSC)로부터 핍지교세포 전구 세포 (OPC)의 생성을 위해 SOX9로 본질적으로 이루어진 분화제가 본원에 제공된다. 또한, PSC를 생성하는 방법, 및 PSC를 사용하여 OPC 및 핍지교세포를 생성하는 방법이 제공된다.

Description

SOX9-유도된 핍지교세포 전구 세포
관련 출원
본 출원은 2019년 5월 31일에 출원된 미국 가출원 번호 62/855,135의 35 U.S.C. § 119(e) 하에서의 이익을 주장하며, 이는 전체가 본원에 참조로 포함된다.
연방 지원 연구
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 AG048056, HG008525 및 MH103910에 따라 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
배경
핍지교세포는 핍지교세포 전구 세포 (OPC)로부터 기원하는 중추신경계의 아교 세포의 아유형이다. OPC는 중추신경계 세포의 약 5%를 차지한다. 핍지교세포는 미엘린을 생성하여 축삭을 지지하고 절연하는데 도움이 된다. 중추신경계의 미엘린초는 확장된 핍지교세포 형질막으로 구성된다. 성숙한 핍지교세포는 자가-재생될 수 없지만, OPC는 건강한 개체에서 중추신경계 손상 후 핍지교세포를 다시 채울 수 있다.
본 개시내용은 뜻밖에도 전사 인자 SOX9의 과발현이 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)로부터 (예컨대, 세포 성장 및/또는 분화 배양 조건을 위한 최적화 없이) 짧게는 4일 내에 핍지교세포 전구 세포 (OPC) (예컨대, O4-양성 OPC)를 생성하기에 충분하다는 것을 입증하는 실험 데이터를 제공한다. 이 데이터는 SOX9가 연골세포 발달의 기본 마스터 조절인자로 관련되어 있다는 점을 감안할 때 특히 놀라운 것이었다. 그럼에도 불구하고, 본원의 데이터는 SOX9 과발현 후에 연골세포 형태가 관찰되지 않았음을 나타낸다 - 오히려, SOX9 과발현은 핍지교세포의 분화를 유도하기에 충분하였다.
또한, 생성된 핍지교세포는 일부 실시양태에서 '면역보호적'이며 - 면역억제 인자 (예컨대, 항염증성 시토카인)를 분비한다.
따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 다능성 줄기 세포 (PSC)를 SOX9로 본질적으로 이루어진 전사 인자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전사 인자는 SOX9를 코딩하는 하나 이상의 조작된 핵산으로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 방법은 인터루킨 10 (IL-10) 및/또는 인터페론 베타 (IFNβ)를 코딩하는 적어도 하나의 조작된 핵산을 다능성 줄기 세포에 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 OPC를 배양하여 핍지교세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 OPC 또는 핍지교세포를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이들 제약 조성물은, 예컨대 다발성 경화증, 횡단 척수염, 및 다른 선천성 및 비-선천성 탈수초성 장애와 같은 탈수초성 장애를 치료 (예컨대, 개선)하기 위해 사용될 수 있다.
도 1a-1d는 SOX9 과발현이 hiPSC를 연골세포가 아닌 OPC로 분화하도록 유도한다는 것을 나타낸다. 도 1a는 치밀한 세포-세포 패킹 및 뚜렷한 명확한 콜로니 경계를 갖는 콜로니-유사 형태를 나타내는 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hiPSC)를 나타낸다. 도 1b-1c는 SOX9로 형질감염된 세포가 유도 4일 후 분지되고 확장된 형태로 분화된다는 것을 나타낸다. 도 1d는 5 μg, 10 μg 및 20 μg의 상이한 양의 DNA를 형질감염시켜 만든 상이한 집단 중 O4-양성, GalC-음성 세포의 비율을 나타낸다. 그래프는 4일 동안 독시사이클린으로 처리한 후 O4-양성, GalC-음성 세포의 백분율을 나타낸다.
도 2a-2d는 특정 SOX9 줄기 세포 클론이 거의 완전한 OPC 분화를 달성할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 2a-2b는 개별 콜로니에서 4일 후의 형태 변화를 나타낸다. 도 2a는, 독시사이클린의 부재 하의 대조군 세포는 4일 후에 줄기 세포 분화가 없다는 것을 나타낸다. 도 2b는, 독시사이클린의 존재 하에 세포는 분화하고 iPSC 콜로니를 남긴다는 것을 나타낸다. 도 2c-2d는 SOX9가 4 dpi에서 hiPSC를 유도된 핍지교세포로 신속하고 효율적으로 유도한다는 것을 나타낸다. 비-유도된 세포와 비교한 O4 (도 2c) 또는 NG2 (도 2d) 핍지교세포 마커에 대한 유동 세포측정의 막대 플롯.
도 3a-3b는 SOX9-유도된 OPC가 hiPSC-유래된 뉴런 주위에 조밀한 미엘린을 형성하고 인간 대뇌 오가노이드에서 성숙한 마커를 발현한다는 것을 나타낸다. 도 3a는 4주 후 OPC 및 hiPSC-유도된 뉴런의 공동 배양을 나타낸다. 공동 배양물을 횡단면으로 자르고, 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지 처리하였다. 미엘린 (M) 층은 축삭 (A)을 감싸며, 이는 분화된 OPC의 기능성을 입증한다. 도 3b는 분화된 OPC가 인간 대뇌 오가노이드를 수초화할 수 있다는 것을 나타낸다. 유도성 OPC와 혼합된 대뇌 오가노이드는 SOX9 과발현에 의해 분화되도록 유도되었고 성숙한 미엘린 마커 MOG에 대해 양성으로 염색되었다.
도 4는 OPC가 항염증성 시토카인을 분비하도록 조작될 수 있음을 나타낸다. ELISA 검정을 이용하여 상이한 양의 형질감염된 DNA로 조작된 분화된 OPC로부터 분비된 항염증성 시토카인 IL10을 검출하였다.
도 5a-5b는 SOX9-유도된 OPC가 쉬버러 (Shiverer) 마우스에서 저수초화된 축삭을 수초화할 수 있다는 것을 나타내는 데이터를 포함한다. 도 5a는 마우스가 SOX9-유도된 OPC를 받은 처리 코호트에서 뇌 슬라이스의 TEM 이미지를 나타낸다. 도 5b는 마우스가 PBS 주사를 받은 대조군으로부터의 뇌 슬라이스의 TEM 이미지를 나타낸다. 흰색 화살표는 조밀한 미엘린 형성을 나타낸다. 배율 9300X.
도 6은 이식된 SOX9-유도된 세포를 갖는 쉬버러 마우스가 PBS-주사된 동물보다 상당히 더 많은 수초화된 축삭을 갖는다는 것을 나타낸다. 쉬버러 마우스에 PBS-주사되거나 SOX9-유도된 세포 이식으로부터 수초화된 축삭의 수의 정량화.
도 7은 SOX9-유도된 세포가 일차 핍지교세포와 전사체적으로 유사하다는 것을 나타낸다. SOX9-유도된 세포로부터의 RNA-seq 샘플에 대한 주성분 (PC) 분석은 일차 성숙 핍지교세포 (OL)로부터의 샘플과 겹치며, 핍지교세포 전구 세포 (OPC)와 유사하고, 새로 형성된 핍지교세포 (Ol) 및 PGP1 hiPSC와 뚜렷하게 분리된다.
도 8은 분화를 위한 전사 인자 (TF)를 유도적으로 발현하는 조작된 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hiPSC)가 디쉬에서 공동 배양되는 병렬 프로그래밍의 개략도를 나타낸다. TF가 유도되고, 다수의 세포 유형이 동일한 배양 배지에서 생성된다. 이 개략도는 병렬 프로그래밍이 세포-자율 운명 사양을 활용하여 동일한 디쉬에서 다수의 세포 유형의 동시 분화를 가능하게 할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 9는 TF-유도성 분화를 위해 조작된 hiPSC가 발달적으로-고무된 대뇌 오가노이드의 형성에 통합되어 수초화를 합성적으로 가속화하는 직교 프로그래밍의 개략도를 나타낸다.
도 10a는 미엘린 밀집에 대한 G-비율의 정량화가 생리학적 범위 내에 있다는 것을 나타낸다. 도 10b는 대뇌 오가노이드에서 미엘린 밀집에 대한 G-비율의 정량화가 생리학적 유사성을 나타낸다는 것을 나타낸다. *** P < 0.001.
도 11은 더 많은 SOX9 피기박(PIGGYBAC)TM DNA의 형질감염이 게놈에 통합되는 SOX9 피기박TM 벡터의 양을 증가시킨다는 것을 나타내는 그래프이다. X-축은 형질감염된 DNA의 양을 나타낸다. Y-축은 외인성 SOX9 플라스미드의 집단 평균 카피 수를 나타낸다.
도 12는 SOX9 DNA의 양을 최대 2.5 μg까지 증가시키는 전기천공이 O4+ 세포의 백분율에 대해 유동 세포측정에 의해 측정된 OPC 분화 효율을 개선하였다는 것을 나타내는 그래프이다.
유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)는 성체 분화 세포로부터 재프로그래밍되며 많은 표현형으로 발달할 수 있다. iPSC는 환자로부터 수득하여 특정 병태를 개선하는데 필요한 임의의 세포 유형으로 변경할 수 있어 환자-특이적 자가 임상 적용을 가능하게 하는 동시에 면역 반응 또는 거부의 위험을 최소화할 뿐만 아니라 유사한 임상 적용에 대한 동종이계 세포의 확장 가능한 생성을 가능하게 한다. 신경퇴행성 및 미엘린 퇴행성 질환, 심근경색 및 골 결함 복구와 같은 임상 적용을 위한 줄기 세포 요법의 사용이 유망하지만, 비제어된 증식, 낮은 세포 생존, 음성 면역 반응, 원하지 않는 세포 유형으로의 분화, 불일치 및 긴 절차 시간과 관련된 상당한 제한이 있다. 예컨대, 신경 줄기 세포를 사용하여 핍지교세포를 생성할 수 있지만, 과정이 비효율적이고 세포는 종종 미엘린 생성 능력이 없는 뉴런 또는 별아교세포를 형성한다. 한편, O4-양성 OPC는 주로 핍지교세포로 발달하는 것으로 보인다. 또한, OPC가 CNS에 통합될 수 있고 선천적으로 저수초화된 마우스 모델을 재수초화할 수 있다는 것이 입증되었다 (Najm et al., Nat. Biotechnol. 31, 426-433 (2013)). 그러나, 이러한 프로토콜은 긴 배양 시간, 복잡한 배양 조건 및 낮은 분화 효율로 인해 여전히 적용에 있어 크게 비실용적이다. 예컨대, 기술적으로 가장 성공적인 프로토콜 중 하나는 200일 초과의 분화 및 ~12%의 표면 마커 O4 항원 발현 세포를 얻기 위해 7가지 배지 조건을 필요로 한다 (Wang et al., Cell Stem Cell. 12, 252-264 (2013)). 보다 최근의 연구에서, 타임라인은 44-75일로 단축되었고, 요법은 ~30%-70% O4 발현 효율을 달성하는데 4-5단계로 단순화되었다 (Douvaras et al., Nat. Protoc. 10, 1143-54 (2015); Ehlrich et al., Proc Natl Acad Sci, 114(11):E2243-E2252 (2017)).
본원에 제공된 기술은 이러한 많은 제한을 극복한다. 본 개시내용은 iPSC와 같은 줄기 세포의 SOX9-매개된 직접적 재프로그래밍 방법을 제공하여 일부 경우에는 고효율 (예컨대, 분화 마커를 발현하는 세포의 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%)로 짧게는 1 내지 8일에 원하는 세포 유형을 생성한다. 예컨대, 세포는 2-8일, 3-8일 또는 4-8일 이내에 재프로그래밍될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 10일 미만, 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만, 3일 미만, 2일 미만, 또는 1일 미만에 본원에 기재된 방법을 이용하여 재프로그래밍될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 1일 이내에 재프로그래밍될 수 있다 (예컨대, 분화 마커를 발현함). 일부 실시양태에서, 세포는 4일 내에 재프로그래밍될 수 있다 (예컨대, 분화 마커를 발현함). 본 개시내용은 또한 면역 (염증) 반응으로부터 원하는 세포 유형을 보호하는 방법을 제공한다.
면역계의 기능장애로 인한 자가면역 질환은 줄기 세포 요법을 받을 수 있다. 전 세계적으로 대략 250만명의 유병률을 갖는 다발성 경화증 (MS)은 빈번한 중간엽 줄기 세포 (MSC) 요법 표적인 자가면역 질환이다. 그러나, 현재까지의 성공은 주로 상기에서 언급된 제한으로 인해 제한적이었다. 줄기 세포의 장애물을 극복하기 위한 현재 전략은 긴 배양 시간, 복잡한 배양 조건 및 낮은 효율로 인해 여전히 적용에 있어 크게 비실용적이다.
본원에 제공된 데이터는 iPSC의 SOX9-매개된 직접적 재프로그래밍이, 일부 실시양태에서, 배지 요법 최적화를 필요로 하지 않으면서 OPC (예컨대, O4-양성 OPC)를 생성하는데 활용될 수 있다는 것을 입증한다. 이 접근법은 기존 재프로그래밍 방법보다 훨씬 더 빠르고 더 효율적이다. 본원에 제공된 데이터는 또한 이들 iPSC 및 이들 iPSC로부터 생성된 세포가 염증성 시토카인을 분비하도록 프로그래밍될 수 있고, 따라서 세포가 면역보호성을 갖도록 할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 개시내용은 SOX9가 OPC의 형성을 유도하기에 충분하다는 것을 입증하는 예상치 못한 결과에 적어도 부분적으로 기초한다. 이러한 OPC는, 예컨대 탈수초성 장애를 갖는 대상체에서 축삭을 둘러싼 손상된 미엘린초을 재건하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 분화제는 분화 (세포가 하나의 세포 유형으로부터 또 다른 유형으로 변화하는 과정, 예컨대 본원에서 PSC가 OPC로 분화할 수 있음)를 유발하는 작용제이다. 계통-특정화 유전자는 분화제를 코딩한다. 본원에 사용된 분화제의 예는 전사 인자 (및 전사 인자를 코딩하는 핵산), 예컨대 OLIG 전사 인자 (예컨대, OLIG1, OLIG2, OLIG3 및 OLIG4), NKX 호메오박스 전사 인자 (예컨대, NKX2.1, NKX2.2, NKX6.1, NKX6.2, 및 NKX6.3), OCT 전사 인자 (예컨대, OCT1, OCT2, OCT 4 및 OCT6), SOX 전사 인자 (예컨대, SRY, SOX1, SOX2, SOX3, SOX4, SOX5, SOX6, SOX7, SOX8, SOX9, SOX10, SOX11, SOX12, SOX13, SOX14, SOX15, SOX17, SOX18, SOX21 및 SOX30), 및 ASCL 전사 인자 (예컨대, ASCL1 및 ASCL2)를 포함한다. 본원에 사용된 전사 인자는 유전자의 프로모터 또는 인핸서 영역의 DNA에 결합하고 RNA 폴리머라제 또는 다른 전사 인자와 상호작용하여 RNA 전사를 조절하는 단백질이다. 또한, 예컨대 2018년 3월 15일에 공개된 "줄기 세포의 분화를 제어하는 전사 인자"라는 제목의 WO2018/049382; 2019년 6월 6일에 공개된 "핍지교세포 전구 세포의 생성을 위한 방법 및 조성물"이라는 제목의 WO 2019/108894; 및 2020년 2월 27일에 공개된 "줄기 세포의 분화를 제어하는 전사 인자"라는 제목의 US20200063105를 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원의 방법은 (a) PSC (예컨대, iPSC)를 분화제와 접촉시키는 단계이며, 여기서 분화제는 SOX9, 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어지는 것인 단계, 및 (b) PSC를 배양하여 OPC를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원의 방법은 (a) PSC (예컨대, iPSC)를 전사 인자와 접촉시키는 단계이며, 여기서 전사 인자는 SOX9, 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어지는 것인 단계, 및 (b) PSC를 배양하여 OPC를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 PSC는 SOX9 이외의 외인성 전사 인자, 또는 전사 인자를 코딩하는 외인성 핵산을 포함하지 않는다. 따라서, 본 개시내용의 SOX9로 본질적으로 이루어진 PSC 중 어느 것도 외인성 OLIG, NKX 또는 OCT 전사 인자, 또는 OLIG, NKX 또는 OCT 전사 인자 중 임의의 하나 이상을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본 개시내용의 본질적으로 SOX9로 이루어진 PSC 중 어느 것도 외인성 SRY, SOX1, SOX2, SOX3, SOX4, SOX5, SOX6, SOX7, SOX8, SOX10, SOX11, SOX12, SOX13, SOX14, SOX15, SOX17, SOX18, SOX21 또는 SOX30, 또는 SRY, SOX1, SOX2, SOX3, SOX4, SOX5, SOX6, SOX7, SOX8, SOX10, SOX11, SOX12, SOX13, SOX14, SOX15, SOX17, SOX18, SOX21 또는 SOX30 중 임의의 하나 이상을 코딩하는 외인성 핵산을 포함하지 않는다는 것을 이해해야 한다.
핍지교세포 전구 세포 및 핍지교세포
핍지교세포 전구 세포 (OPC)는 프로테오글리칸 PDGFRA 및 NG2 (CSPG4)의 발현으로 특징지어지는 중추 신경계의 아교 세포의 아유형이다. 이들은 핍지교세포에 대한 전구체이며, 이는 미엘린초 포장을 생성함으로써 축삭을 지지하고 절연하는 기능을 하는 신경교이다. 성숙한 핍지교세포는 자가-재생될 수 없지만, OPC는 건강한 개체의 중추신경계 손상 후 핍지교세포를 다시 채울 수 있다.
일부 실시양태에서, OPC 또는 이의 집단은 미엘린 염기성 단백질 (MBP), NK2 호메오박스 1 (NKX2-1), 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG), 미엘린 관련된 핍지교세포 염기성 단백질 (MOBP), 핍지교세포 전사 인자 2 (OLIG2), 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 핍지교세포 전사 인자 1 (OLIG1), SRY-박스 전사 인자 8 (SOX8), SRY-박스 전사 인자 10 (SOX10), 미엘린 조절 인자 (MYRF), 혈소판 유래된 성장 인자 수용체 알파 (PDGFRA), 기질 메탈로펩티다제 15 (MMP15), 단백질지질 단백질 1 (PLP1), 막횡단 단백질 88B (TMEM88B), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 6 (ENPP6), 및 뉴로파신 (NFASC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16개의 핍지교세포 유전자를 발현한다.
일부 실시양태에서, 적어도 1개의 유전자가 OPC 또는 이의 집단에서 하향 조절된다. 일부 실시양태에서, 미엘린 조절 인자 (MYRF), POU 부류 5 호메오박스 1 (POU5F1), 나노그 (Nanog) 호메오박스 (NANOG), 및 SRY-박스 전사 인자 2 (SOX2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 중 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 또는 적어도 4개가 OPC 또는 이의 집단에서 하향 조절된다.
줄기 세포가 핍지교세포로 발달함에 따라, 발달의 각각의 단계는 특정 세포 표면 마커로 특징지어질 수 있다. 예컨대, 막 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 NG2 (CSPG4)는 초기의 증식성 OPC의 마커로 사용될 수 있다. 핍지교세포 마커 O4는 중기 내지 후기 OPC의 지표로 사용될 수 있다 (Jackman, N et al., Physiology (24):290-7 (2009)). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 OPC는 O4를 발현하는 중기 내지 후기 OPC이다. 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 및 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG)은 OPC의 핍지교세포로의 말단 분화에서 발현된다. 둘 다 핍지교세포-특이적 유전자이며, 성숙한 핍지교세포 형성의 마커로 사용될 수 있다. MOG는 핍지교세포 세포의 표면 및 미엘린초의 외층에서 발견되는 막 단백질이다. GalC는 핍지교세포 막에서 발견되는 갈락토실세라미다제 효소이며, 후기 OPC (유사분열 후) 및 초기의 성숙한 핍지교세포의 마커로 사용될 수 있다. GalC는 말단 분화의 마커로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 핍지교세포는 MOG 및/또는 GalC를 발현하는 성숙한 핍지교세포일 수 있다. 핍지교세포 발달 단계의 추가 마커 (예컨대, 초기 OPC, 중기 및 후기 OPC 및 성숙한 핍지교세포에 대한 마커)는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다. 예컨대 문헌 (Jackman, N et al., Physiology (24):290-7 (2009))을 참조한다.
일부 실시양태에서, 핍지교세포는 2',3'-사이클릭 뉴클레오티드 3' 포스포디에스테라제 (CNPase), 단백질지질 단백질 1 (PLP1), 갈락토실세라미다제 (GALC), 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG), 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 및 미엘린 관련된 당단백질 (MAG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 6개의 바이오마커를 발현한다.
일부 실시양태에서, OPC는 SOX9를 발현하도록 조작되고/되거나 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산을 포함한다.
다능성 줄기 세포
OPC (예컨대, O4-양성 OPC)를 생성하기 위해 다능성 줄기 세포를 재프로그래밍하는 방법이 본원에 제공된다. 다능성 줄기 세포는 분열에 의해 자가-재생되고, 초기 배아의 3가지 일차 배세포 층으로 발달하여 성체 신체 (태반과 같은 배아외 조직은 아님)의 모든 세포로 발달하는 능력을 갖는 세포이다. 배아 줄기 세포 (ESC) 및 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)는 다능성 줄기 세포이다. ESC는 배아의 미분화된 내부 매쓰 세포에서 유래되며 3가지 일차 배층 (외배엽, 내배엽 및 중배엽)의 모든 유도체로 분화할 수 있다. iPSC는 성체 세포로부터 직접적으로 생성될 수 있다 (Takahashi, K; Yamanaka, S. Cell 126(4):663-76, 2006). 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 ESC이다. 일부 실시양태에서, 다능성 세포는 iPSC이다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 인간 ESC이다. 일부 실시양태에서, 다능성 세포는 iPSC이다. 일부 실시양태에서, 다능성 세포는 인간 iPSC이다.
iPSC와 같은 다능성 줄기 세포는 SOX9를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, SOX9 또는 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어진 분화제가 다능성 줄기 세포에 도입된다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 (예컨대, iPSC)에 도입된 유일한 분화제는 SOX9 또는 SOX9를 코딩하는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 (예컨대, iPSC)에 도입된 유일한 전사 인자는 SOX9 또는 SOX9를 코딩하는 핵산이다.
본 개시내용의 줄기 세포는 조작된다. 조작된 세포는 적어도 하나의 조작된 (예컨대, 재조합 또는 합성) 핵산을 포함하거나, 달리 자연 발생 대응물과 구조적 및/또는 기능적으로 상이하도록 변형된 세포이다. 따라서, 외인성 핵산 서열을 함유하는 세포는 조작된 세포로 간주된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 조작된 다능성 줄기 세포 (예컨대, 유도된 다능성 줄기 세포), 핍지교세포 전구 세포 (OPC), 또는 핍지교세포이다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, SOX9를 발현하도록 조작된 세포는 SOX9를 구성적으로 발현하도록 조작되거나 SOX9를 유도적으로 발현하도록 조작될 수 있다.
SRY-박스 9 (SOX9)
일부 실시양태에서, OPC를 생성하도록 조작된 다능성 줄기 세포는 SRY-박스 9 (SOX9)를 포함한다. SOX9는 SOX (SRY-관련된 HMG-박스) 계열의 전사 인자의 구성원이며, 높은 이동성 그룹 (HMG)-박스 DNA 서열로 특징지어진다. 이 HMG 박스는 진핵생물 종 전반에 걸쳐 고도로 보존된 DNA 결합 도메인이다. Sox 계열은 단일 기능이 없으며, 많은 구성원은 발달의 여러 상이한 측면을 조절할 수 있는 능력을 갖는다. SOX9는 연골 형성과 관련이 있다. 예컨대, 문헌 (Bi et al., Nat Genet. 1999 May;22(1):85-9)을 참조한다.
본원에 사용된 SOX9, 또는 이의 상동체 또는 변이체는 인간 또는 다른 포유동물 SOX9일 수 있다. (예컨대, 다른 종으로부터의) 다른 SOX9 전사 인자는 일반적으로 공지되어 있으며, SOX9를 코딩하는 핵산은 진뱅크 (GenBank)와 같은 공개적으로 이용 가능한 유전자 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 일부 실시양태에서, 야생형 인간 SOX9를 코딩하는 핵산은 수탁 번호 Z46629 하에 NCBI RefSeq에 기재된 핵산의 오픈 리딩 프레임과 적어도 80% (예컨대, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 동일하다.
일부 실시양태에서, SOX9를 코딩하는 핵산은 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1과 적어도 80% (예컨대, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 동일하다. 일부 실시양태에서, SOX9를 코딩하는 아미노산 서열은 서열식별번호: 2와 적어도 80% (예컨대, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%) 동일하다.
본원에 기재된 SOX9는 이의 야생형 대응물에 비해 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 변이체는 이러한 방법을 열거하는 참조 문헌, 예컨대 문헌 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York)에서 발견되는 것과 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경하는 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 그룹 내의 아미노산 사이에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
일부 실시양태에서, 분화제는 SOX9, 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로만 이루어진다.
OPC 생성 방법
OPC를 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 SOX9를 코딩하는 적어도 하나의 조작된 핵산을 다능성 줄기 세포에 도입하는 단계, 및 다능성 줄기 세포를 배양하여 OPC를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, OPC는 O4, NG2, 또는 이들의 조합을 발현한다.
본 개시내용의 OPC는 항염증성 시토카인을 추가로 포함할 수 있다. 항염증성 시토카인에 대한 논의에 대해, 예컨대 문헌 (Opal et al., Chest. 2000 (4):1162-72 and Benveniste et al., Sci STKE. 2007 (416):pe70)을 참조한다. 신체의 OPC는 자연적으로는 항염증성 시토카인을 발현하지 않는다 (Cannella B, Raine CS. Ann. Neurol. 2004 Jan;55(1):46-57). 예컨대, 본 개시내용의 OPC는 항염증성 시토카인을 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항염증성 시토카인은 면역계를 활성화시키는 (예컨대, T-세포 활성화를 억제하는) OPC의 능력을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, OPC의 존재 및 부재 하에 T-세포에 의해 분비되는 전염증성 시토카인 (예컨대, IL17 및 IFNγ를 포함하는 면역계를 활성화시키는 시토카인)의 수준을 사용하여 면역계를 활성화시키는 OPC의 능력을 결정할 수 있다. 다른 실시양태에서, 시험관내 세포 증식 검정을 이용하여 T 세포 증식에 대한 조작된 OPC에 의해 발현되는 시토카인 (예컨대, IL10 및 IFNβ)의 효과를 평가할 수 있다. 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)을 포함하는 관련 기술분야에 공지된 검정을 이용하여 시토카인 수준을 결정할 수 있다 (하기 실시예 섹션의 실시예 3 참조). 일부 실시양태에서, 항염증성 시토카인을 보유하는 OPC는 T-세포 활성화를 (예컨대, 분비된 전염증성 시토카인의 더 낮은 수준에 의해 측정되는 바와 같이) 동일하거나 실질적으로 조건하에서 항염증성 시토카인을 보유하지 않는 OPC와 비교하여 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 감소시킨다.
본 개시내용에 적합한 항염증성 시토카인은 인터페론 및 인터루킨을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 세포는 인터페론 베타 (IFNβ) 및/또는 인터루킨 10 (IL10)을 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 OPC는 IFNβ (예컨대, 본원에서 IFNβ1로도 지칭됨)를 발현/포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 OPC는 IL10을 발현/포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 OPC는 IFNβ 및 IL10 둘 다를 발현/포함한다. 인터페론 및 시토카인의 서열은 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 진뱅크를 포함하여 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예시적인 인터페론 베타 1 (IFNβ) 서열은 진뱅크 등록 식별자 NM_002176 하에 나열된다. 예시적인 IL10 서열은 진뱅크 등록 식별자 NM_000572 하에 나열된다. 일부 실시양태에서, 오픈 리딩 프레임만이 본원에 기재된 SOX9 및 시토카인을 발현하는데 사용된다는 것을 이해해야 한다.
항염증성 시토카인은 분비되거나 또 다른 항염증성 시토카인의 분비를 촉진할 수 있다. 예컨대, 항염증성 시토카인은 IL10의 분비를 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항염증성 시토카인을 보유하는 OPC는 항염증성 시토카인을 보유하지 않는 대조군 대응물보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1,000배, 적어도 1,500배, 적어도 2,000배, 적어도 3,000배, 적어도 4,000배, 적어도 5,000배, 적어도 6,000배, 적어도 7,000배, 적어도 8,000배, 적어도 9,000배, 또는 적어도 10,000배 더 많은 IL10를 분비한다.
일부 실시양태에서, 항염증성 시토카인을 보유하는 OPC는 항염증성 시토카인을 보유하지 않는 대조군 대응물보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1,000배, 적어도 1,500배, 적어도 2,000배, 적어도 3,000배, 적어도 4,000배, 적어도 5,000배, 적어도 6,000배, 적어도 7,000배, 적어도 8,000배, 적어도 9,000배, 또는 적어도 10,000배 더 많은 IFNβ를 분비한다.
일부 실시양태에서, iPSC는 IL-10 및 SOX9를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 조작된 iPSC는 IL-10 및 SOX9의 발현 유도 1-10일 이내에 OPC (예컨대, O4+ 세포)로 분화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포 (예컨대, iPSC 또는 OPC)는 IL-10을 분비한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포 (예컨대, 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC)는 IL-10을 대조군 세포보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1,000배, 적어도 1,500배, 적어도 2,000배, 적어도 3,000배, 적어도 4,000배, 적어도 5,000배, 적어도 6,000배, 적어도 7,000배, 적어도 8,000배, 적어도 9,000배, 또는 적어도 10,000배 더 높은 수준으로 분비한다. 대조군 세포는 자연 발생 iPSC 또는 OPC, IL-10을 발현하도록 특별히 변형되지 않은 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC, 또는 IL-10을 유도 가능하게 발현하도록 조작되었지만 유도제가 결여된 (즉, IL-10 발현이 유도되지 않은) 조건 하에서 배양된 iPSC 또는 OPC일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조군 세포는 조작된 세포와 동일한 유형의 세포 (예컨대, iPSC 또는 OPC)이다. 일부 실시양태에서, iPSC 또는 OPC는 IL-10을 SOX9 발현 유도 1-10일 이내에 대조군 세포보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배 더 높은 수준으로 분비한디.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 (예컨대, 유도제의 존재 하에 또는 유도제의 부재 하에) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20일의 배양 과정에 걸쳐 (예컨대, 꾸준히/지속적으로) IL-10을 분비한다.
일부 실시양태에서, iPSC 또는 iPSC-유래된 세포는 IL10 및/또는 IFNβ를 발현하도록 조작된다.
일부 실시양태에서, iPSC는 IFNβ 및 SOX9를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 조작된 iPSC는 IFNβ 및 SOX9의 발현 유도 1-10일 이내에 OPC (예컨대, O4+ 세포)로 분화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포 (예컨대, 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC)는 IL-10을 분비한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포 (예컨대, 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC)는 IL-10을 대조군 세포보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1,000배, 적어도 1,500배, 적어도 2,000배, 적어도 3,000배, 적어도 4,000배, 적어도 5,000배, 적어도 6,000배, 적어도 7,000배, 적어도 8,000배, 적어도 9,000배, 또는 적어도 10,000배 더 높은 수준으로 분비한다. 대조군 세포는 자연 발생 iPSC 또는 OPC, IFNβ를 발현하도록 특별히 변형되지 않은 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC, 또는 IFNβ를 유도 가능하게 발현하도록 조작되었지만 유도제가 결여된 조건 하에서 배양된 iPSC 또는 OPC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC는 IL-10을 IFNβ 및 SOX9 발현 유도 1-10일 이내에 대조군 세포보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배 더 높은 수준으로 분비한다.
일부 실시양태에서, iPSC는 IFNβ, IL-10 및 SOX9를 발현하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 조작된 iPSC는 IFNβ, IL-10 및 SOX9의 발현 유도 1-10일 이내에 OPC (예컨대, O4+ 세포)로 분화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC는 IL-10을 분비한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포 (예컨대, 조작된 OPC 또는 조작된 iPSC)는 IL-10을 대조군 세포보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배, 적어도 200배, 적어도 300배, 적어도 400배, 적어도 500배, 적어도 600배, 적어도 700배, 적어도 800배, 적어도 900배, 적어도 1,000배, 적어도 1,500배, 적어도 2,000배, 적어도 3,000배, 적어도 4,000배, 적어도 5,000배, 적어도 6,000배, 적어도 7,000배, 적어도 8,000배, 적어도 9,000배, 또는 적어도 10,000배 더 높은 수준으로 분비한다. 대조군 세포는 자연 발생 iPSC 또는 OPC, IFNβ 및 IL-10을 발현하도록 특별히 변형되지 않은 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC, IFNβ 및 IL-10을 유도 가능하게 발현하도록 조작되었지만 유도제가 결여된 조건 하에서 배양된 iPSC 또는 OPC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 iPSC 또는 조작된 OPC는 IL-10을 IFNβ, IL-10 및 SOX9의 발현 유도 1-10일 이내에 대조군 세포보다 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 또는 적어도 100배 더 높은 수준으로 분비한다.
핵산은 일반적으로 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드이며, 일부 경우에서 포스포디에스테르 결합 (예컨대, 포스포디에스테르 "백본")을 함유할 수 있다. 핵산은 자연에서 발생하지 않는 경우 "조작된" 것으로 간주된다. 조작된 핵산의 예는 재조합 핵산 및 합성 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 SOX9를 코딩한다.
SOX9, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합을 코딩하는 핵산은 화학적 형질감염, 바이러스 형질도입 (예컨대, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 센다이바이러스, 및 아데노-관련된 바이러스 벡터 사용) 및 전기천공을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 공지된 방법을 이용하여 다능성 줄기 세포에 도입될 수 있다. 예컨대, 게놈 통합을 필요로 하지 않는 방법은 SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ 또는 이들의 조합)을 코딩하는 mRNA의 형질감염 및 에피솜 플라스미드의 도입을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 (예컨대, mRNA)은 에피솜 벡터 (예컨대, 에피솜 플라스미드)를 사용하여 다능성 줄기 세포에 전달된다. 다른 실시양태에서, 다능성 줄기 세포를 재프로그래밍하기 위한 전사 인자를 코딩하는 핵산은 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 게놈 통합 방법이 공지되어 있으며, 피기박TM 트랜스포존 시스템, 슬리핑 뷰티 시스템, 렌티바이러스 시스템, 아데노-관련된 바이러스 시스템, 및 CRISPR 유전자 편집 시스템의 사용을 포함하여 임의의 방법이 본원에서 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 본 개시내용의 SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합) 및/또는 항염증성 시토카인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 측면에 배치된 피기박TM 역 말단 반복 서열을 포함하는 피기박TM 트랜스포존 벡터에 존재한다. 피기박TM 트랜스포사제는 삽입 서열 (예컨대, SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합)을 코딩하는 서열)의 각각의 측면 상의 피기박TM 역 말단 반복부를 인식하고, 삽입 서열을 절단하고, 절단된 요소를 또 다른 핵산에 삽입하는 효소이다. 피기박TM 트랜스포사제는 TTAA 서열을 갖는 표적 부위에 절단된 서열을 삽입할 수 있다. 피기박TM 트랜스포사제를 코딩하는 예시적인 서열은 진뱅크 수탁 번호: EF587698에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합)은 피기박TM 트랜스포존 벡터로 클로닝된 다음, 높은 카피 수로 iPSC로 뉴클레오펙션되고, 피기박TM 트랜스포사제를 공동-전달함으로써 게놈에 통합된다 (예컨대, 세포당 평균 10개 카피). 일부 실시양태에서, 게놈에 통합된 높은 카피 수는 세포당 SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5 내지 50개 카피 포함 (예컨대, 평균 5 내지 50개 카피 포함 또는 정확히 5 내지 50개 카피 포함)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 50개 카피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포는 SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 15개 카피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 (또는 평균적으로 세포 집단)는 SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 1 내지 20개 카피, 2 내지 20개 카피, 3 내지 20개 카피, 4 내지 20개 카피, 5 내지 20개 카피, 6 내지 20개 카피, 7 내지 20개 카피, 8 내지 20개 카피, 9 내지 20개 카피, 11 내지 20개 카피, 12 내지 20개 카피, 13 내지 20개 카피, 14 내지 20개 카피, 5 내지 6개 카피, 5 내지 7개 카피, 5 내지 8개 카피, 5 내지 9개 카피, 5 내지 10개 카피, 5 내지 20개 카피, 5 내지 30개 카피, 5 내지 40개 카피, 10 내지 20개 카피, 10 내지 11개 카피, 10 내지 12개 카피, 10 내지 13개 카피, 10 내지 14개 카피, 10 내지 15개 카피, 10 내지 16개 카피, 10 내지 17개 카피, 10 내지 18개 카피, 10 내지 19개 카피, 15 내지 16개 카피, 15 내지 17개 카피, 15 내지 18개 카피, 15 내지 19개 카피, 10 내지 30개 카피, 10 내지 40개 카피, 10 내지 50개 카피, 15 내지 20개 카피, 15 내지 25개 카피, 15 내지 30개 카피, 15 내지 35개 카피, 15 내지 40개 카피, 15 내지 45개 카피, 15 내지 50개 카피, 20 내지 30개 카피, 20 내지 40개 카피, 20 내지 50개 카피, 30 내지 40개 카피, 30 내지 50개 카피, 또는 40 내지 50개 카피를 갖는다. 일부 실시양태에서, 세포 (또는 평균적으로 세포 집단)는 SOX9 및/또는 시토카인 (예컨대, IL-10, IFNβ, 또는 이들의 조합)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 카피를 갖는다. 일부 경우에서, 카피 수는 세포 집단 (예컨대, 세포의 다클론 집단)에서 세포당 SOX9 및/또는 시토카인을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 평균 카피 수를 지칭한다. 일부 경우에, 카피 수는 세포 또는 세포 집단 (예컨대, 세포의 클론 집단)의 모든 세포에서 SOX9 및/또는 시토카인을 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 정확한 카피 수를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 세포당 평균 20개 미만 카피 (그러나 적어도 1개 카피)의 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산을 갖는다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단은 세포당 평균적으로 19개 미만, 18개 미만, 17개 미만, 16개 미만, 15개 미만, 14개 미만, 13개 미만, 12개 미만, 11개 미만, 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 또는 2개 미만 (그러나 적어도 1개 카피)의 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산을 갖는다.
일부 실시양태에서, 고농도의 DNA를 세포 집단에 도입함으로써 높은 카피 수를 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 고농도의 DNA는 100만개 세포당 1,000 ng 이상의 DNA, 100만개 세포당 2,000 ng 초과의 DNA, 100만개 세포당 5,000 ng 초과의 DNA, 또는 100만개 세포당 10,000 ng 초과의 DNA의 DNA 농도이다.
일부 실시양태에서, 낮은 카피 수는 낮은 농도의 DNA를 세포 집단에 도입함으로써 얻어진다. 일부 실시양태에서, 낮은 농도의 DNA는 100만개 세포당 1,000 ng 미만의 DNA, 100만개 세포당 500 ng 미만의 DNA, 400 ng 미만의 DNA, 100만개 세포당 300 ng 미만의 DNA인 DNA 농도이다.
일부 실시양태에서, PSC는 조작된 핵산에 의해 코딩되는 다른 전사 인자의 부재 하에 PSC를 핍지교세포 전구 세포 (OPC)로 분화시키기에 충분한 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산 수준을 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이, 핍지교세포 전구 세포는 O4 및 다른 OPC-특이적 마커를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 마커에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, PSC 세포 집단에서 SOX9의 평균 카피 수 (예컨대, 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 또는 1 내지 20개 카피)는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 PSC를 OPC로 분화시키기에 충분하다.
특정 카피 수 또는 카피 수의 범위는 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현하는 세포의 백분율을 초래할 수 있다. 예컨대, 다능성 줄기 세포 집단의 적어도 10%는 집단 평균 10개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단의 적어도 15%는 집단 평균 15개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단의 적어도 20%는 집단 평균 20개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단의 적어도 20%는 집단 평균 20개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단의 10-25%는 집단 평균 10 내지 20개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%는 집단 평균 5 내지 10개, 5 내지 15개, 또는 5 내지 20개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%는 집단 평균 10 내지 15개 또는 10 내지 20개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%는 집단 평균 10 내지 15개 또는 10 내지 20개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 집단의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%는 집단 평균 15 내지 20개 카피의 SOX9를 갖는 다능성 줄기 세포 집단에서 O4 및/또는 다른 OPC-특이적 마커를 발현할 수 있다.
플라스미드는, 예컨대 SOX9- 및/또는 시토카인-통합된 세포의 선별을 허용하고/하거나 전사를 제어하기 위해 항생제 내성 및/또는 유도성 (예컨대, 독시사이클린-유도성)이 되도록 설계될 수 있다.
일부 실시양태에서, 피기박TM 트랜스포존 벡터는 SOX9를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 측면에 배치된 피기박TM 역 말단 반복 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 피기박TM 트랜스포존 벡터는 적어도 하나의 시토카인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 측면에 배치된 피기박TM 역 말단 반복 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 피기박TM 트랜스포존 벡터는 SOX9 및 시토카인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 측면에 배치된 피기박TM 역 말단 반복 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 피기박TM 역 말단 반복 서열이 측면에 배치된 동일한 카세트에서 SOX9 및 적어도 하나의 시토카인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열. 이 카세트에서 적어도 2개의 시토카인 또는 SOX9 및 적어도 하나의 시토카인은, 예컨대 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 2A 서열과 같은 폴리펩티드 절단 신호에 의해 관심 단백질 (예컨대, SOX9, 시토카인 또는 이들의 조합)을 코딩하는 핵산을 분리함으로써, 연결되지 않은 단백질을 생성하도록 분리되거나 분리되지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, IFNβ 및/또는 IL10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 피기박TM 역 말단 반복 서열이 측면에 배치된다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산은 다능성 줄기 세포에 도입되는 발현 플라스미드 상에 존재한다. 일부 실시양태에서, 발현 플라스미드는 항생제 내성 유전자 (예컨대, bsd, neo, hygB, pac, ble, 또는 Sh bla) 또는 형광 단백질 (RFP, BFP, YFP, 또는 GFP)을 코딩하는 유전자와 같은 선별 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항생제 내성 유전자는 퓨로마이신 내성 유전자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 선별 마커는 관심 단백질을 발현하는 세포의 선별을 가능하게 한다. 일부 경우에서, 관심 단백질은 SOX9 또는 시토카인이다.
본원에 기재된 임의의 조작된 핵산은 통상적인 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예컨대, 재조합 또는 합성 기술을 이용하여 본원에 기재된 SOX9, 시토카인, 또는 이들의 조합을 코딩하는 핵산을 생성할 수 있다. 통상적인 클로닝 기술을 이용하여 SOX9, 시토카인 또는 이들의 조합을 피기박TM 트랜스포존 벡터에 삽입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조작된 핵산 (임의적으로 발현 플라스미드 상에 존재)은 프로모터 (프로모터 서열)에 작동가능하게 연결된 SOX9, 시토카인, 또는 이들의 조합을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터 (예컨대, 테트라사이클린-조절된 서열을 포함)이다. 유도성 프로모터는, 예컨대 SOX9, 시토카인 또는 이들의 조합의 발현의 시간적 및/또는 공간적 제어를 가능하게 한다.
핵산 서열의 나머지 부분의 전사 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 프로모터 제어 영역. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라제 및 다른 전사 인자와 같이 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 하위-영역을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성, 활성화 가능성, 억제성, 조직-특이적 또는 이들의 조합일 수 있다. 프로모터는 이것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 이끌거나 전사를 이끈다. 본원에서, 프로모터는 핵산 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 ("이끌기") 위해 프로모터가 조절하는 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및 배향에 있을 때 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주된다.
유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에서, 유도제의 영향을 받거나, 유도제에 의해 접촉될 때 전사 활성을 개시하거나 향상시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 유도제는 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는데 활성인 방식으로 조작된 핵산과 접촉하는 내인성 또는 일반적으로 외인성 상태, 화합물 또는 단백질일 수 있다.
본 개시내용에 따라 사용하기 위한 유도성 프로모터는 본원에 기재되거나 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터의 예는, 제한 없이, 화학적/생화학적으로-조절되는 및 물리적으로-조절되는 프로모터, 예컨대 알콜-조절된 프로모터, 테트라사이클린-조절된 프로모터 (예컨대, 안히드로테트라사이클린 (aTc)-반응적 프로모터 및 테트라사이클린 억제인자 단백질 (tetR), 테트라사이클린 오퍼레이터 서열 (tetO) 및 테트라사이클린 트랜스작용인자 융합 단백질 (tTA)을 포함하는 다른 테트라사이클린 반응적 프로모터 시스템), 스테로이드-조절된 프로모터 (예컨대, 래트 글루코코르티코이드 수용체, 인간 에스트로겐 수용체, 나방 엑디손 수용체에 기반한 프로모터, 및 스테로이드/레티노이드/갑상선 25 수용체 슈퍼패밀리로부터의 프로모터), 금속-조절된 프로모터 (예컨대, 효모, 마우스 및 인간으로부터의 메탈로티오네인 (금속 이온에 결합하고 격리하는 단백질) 유전자로부터 유래된 프로모터), 발병기전-조절된 프로모터 (예컨대, 살리실산, 에틸렌 또는 벤조티아디아졸 (BTH)에 의해 유도됨), 온도/열-유도성 프로모터 (예컨대, 열 쇼크 프로모터), 및 광-조절된 프로모터 (예컨대, 식물 세포로부터의 광 반응적 프로모터)를 포함한다.
(예컨대, SOX9를 발현하는) 다능성 줄기 세포의 제제는 표준 줄기 세포 배양 조건 하에 배양될 수 있다. 예컨대, 다능성 줄기 세포는 mTeSRTM1 배지와 같은 인간 ESC 및 iPSC를 위한 임의의 상업적으로 이용 가능한 피더-비함유 유지 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 첨가된 영양소 또는 성장 인자 없이 상업적으로 이용 가능한 줄기 세포 배지에서 배양된다.
(예컨대, SOX9를 발현하는) 다능성 줄기 세포의 제제는, 일부 실시양태에서, OPC (예컨대, O4-양성 OPC)를 생성하기 전에 짧게는 4 내지 10일 동안 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 4-10일, 4-9일, 4-8일, 4-7일, 4-6일 또는 4-5일 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 OPC (예컨대, O4-양성 OPC)를 생성하기 전에 4일 미만 (예컨대, 1, 2 및 3일) 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 제제의 세포의 적어도 10% (적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%)가 단지 배양 4-10일 (예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일) 후에 O4를 발현한다.
(예컨대, SOX9를 발현하는) 다능성 줄기 세포의 제제는, 예컨대 104 내지 1010개의 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포의 제제는 104, 105, 106, 107, 108, 109, 또는 1010개의 세포를 포함한다.
O4 및 다른 OPC-특이적 마커의 발현은 공지된 방법을 이용하여 단백질 발현 또는 핵산 발현을 기반으로 평가될 수 있다. 추가의 OPC-계통 마커는 Sox1, Pax6, 네스틴, Islet1, A2B5, Sox10, Olig2, Olig1, PDGFRa, NG2, RIP, O1, PLP1, CNPase, GalC, MBP, MAG 및 MOG를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, OPC는 OCT4, 나노그 및/또는 SOX2를 발현하지 않는다. 예시적인 방법은 형광단에 접합된 항-O4 항체를 사용하는 면역형광, 항-O4 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석, O4를 표적으로 하는 프라이머를 사용한 정량적 폴리머라제 연쇄 반응, 및 항-O4 항체를 사용한 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (예컨대, FACS를 사용하여) O4-양성 OPC에 대한 분류를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 OPC를 배양하여 핍지교세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. OPC의 배양은 성장 호르몬 (예컨대, 섬유아세포 성장 인자)을 포함하여 핍지교세포 분화를 유도하는 인자를 포함하는 배지의 사용을 포함할 수 있다. 핍지교세포는 세포 표면 마커 (예컨대, MOG 및 GalC)로 특징지어질 수 있다. 핍지교세포는 또한 미엘린을 형성하는 능력에 의해 특징지어질 수 있거나 대안적으로 특징지어질 수 있다. 하기에 예시되는 바와 같이, 본원에 개시된 방법에 의해 조작된 세포는 일정 기간 (예컨대, 몇 주) 동안 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 몰드에서) iPSC-유래된 뉴런과 공동 배양되고 수초화에 대해 평가될 수 있다 (예컨대, 공동 배양물은 수초화를 평가하기 위해 고정되고, 수지에 포매되고, 절단되고, 염색되고, 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지 처리될 수 있다). 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조작된 세포는 수초화된 축삭의 수를 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 수초화 정도는 g-비율을 결정함으로써 계산될 수 있다. 축삭 g-비율은 미엘린초의 내경과 외경 사이의 비율이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 임의의 조작된 세포가 투여된 대상체로부터의 축삭 g-비율은 대조군 (예컨대, 조작된 세포 투여 전의 대상체 또는 건강한 대상체)으로부터의 미엘린의 g-비율과 유사하다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 임의의 조작된 세포가 투여된 대상체로부터의 축삭 g-비율은, 대상체로부터의 미엘린의 축삭 g-비율이 평균적으로 0.6-0.8인 경우, 대조군 (예컨대, 조작된 세포 투여 전의 대상체 또는 건강한 대상체)으로부터의 축삭 g-비율과 유사하다. 예컨대, 문헌 (Mohammadi et al., Front Neurosci. 2015 Nov 27;9:441)을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 OPC는 IL-10 및/또는 IFNβ를 발현하도록 조작되었다. 일부 실시양태에서, OPC는 (예컨대, 시토카인 발현이 유도성 프로모터에 의해 제어되는 경우 유도제와 함께) IL-10 및/또는 IFNβ를 발현하도록 배양된다. 특정 이론에 얽매이지 않고, IL-10 및/또는 IFNβ를 발현하도록 조작된 OPC는 미엘린 퇴행성 질환 (예컨대, 다발성 경화증)을 갖는 대상체의 치료에 유용할 수 있다. 특정 이론에 얽매이지 않고, IL10 및 IFNβ를 분비하는 능력을 갖는 조작된 OPC와 같은 면역-관용 세포는 축삭을 재생하고 재수초화할 수 있을 뿐만 아니라 면역 공격으로부터 자신 및 인접 세포를 보호할 수 있다. 일부 실시양태에서, IL10 및 IFNβ를 분비하도록 조작된 OPC는 투여된 OPC에 대한 숙주의 면역 반응을 감소 또는 억제하고 재생을 촉진할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조작된 OPC는 다른 세포 (예컨대, 뉴런)와 함께 배양되어 수초화된 오가노이드를 생성한다. 일부 실시양태에서, 수초화된 오가노이드는 이를 필요로 하는 대상체 (예컨대, 탈수초성 장애를 갖는 대상체)에 이식된다. 일부 실시양태에서, 오가노이드는 대뇌 오가노이드 (예컨대, 부분적 또는 완전한 대뇌 오가노이드)이다. 일부 실시양태에서, 조작된 수초화된 오가노이드는 화합물 스크리닝 (예컨대, 치료 약물) 또는 질환 모델링에 사용된다.
일부 실시양태에서, 다능성 줄기 세포 (예컨대, iPSC) 및/또는 OPC에서 분화제는 SOX9로 본질적으로 이루어진다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 세포 프로그래밍의 확립된 방법의 제한은 발달 생물학의 연장된 타임라인 및 고유한 복잡성을 모방하려는 시도에서 발생한다. 생체내 발달 동안, 세포 유형 사양의 과정은 정의된 집단 크기에서 적절한 세포 유형을 시공간적으로 배치하기 위해 다른 조절 이벤트와 얽혀 있다. 본원에 나타낸 바와 같이, 일부 실시양태에서, 이러한 제한은 발달 과정을 분리하는 능력을 갖는 합성적 생물학-기반 세포 프로그래밍을 사용함으로써 해결될 수 있다. 세포-자율 방식으로 세포 정체성을 완전히 제어한다는 공학적 목표를 달성하기 위해, 분화 과정을 다른 발달 과정과 분리하였다. 현재 프로토콜은 가용성 인자 또는 기계적 신호와 같은 외부 신호에 의존한다. 따라서, 동일한 배양 내에서 독립적으로 상이한 세포 유형의 발달을 제어하는 것은 현저하게 도전적이었다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 동일한 배양 내에서 독립적으로 상이한 세포 유형의 발달을 제어하는 것이 특히 중요하며, 이는 조직이 상이한 계통으로부터의 세포 및 배 층으로 구성되기 때문이며; 예컨대 뇌는 외배엽 계통으로부터의 신경 세포로 구성되지만 중배엽으로부터 유래된 내피 세포에 의해 혈관이 형성된다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 외부 신호를 사용하는 현재의 접근법은 각각의 특수화된 세포 유형에 대해 양립되지 않는 유도 조건으로 인해 두 계통을 동시에 유도하기에는 비실용적이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 프로그래밍 방법은 외부 신호로부터 독립적인 세포 정체성을 달성하는데 필요한 도구를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, SOX9, 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어진 다능성 줄기 세포 (예컨대, iPSC)는 하나 이상의 다른 유형의 세포와 공동 배양된다. 일부 실시양태에서, 다른 세포 유형은 직교 프로그래밍을 위해 특정 분화제를 발현하도록 조작되지 않은 다능성 줄기 세포 (즉, 비변형된 다능성 줄기 세포)이다. 일부 실시양태에서, 비변형된 다능성 줄기 세포는 인간 iPSC (hiPSC)이다. 특정 이론에 얽매이지 않고, SOX9 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 이루어진 다능성 줄기 세포와 또 다른 유형의 다능성 줄기 세포의 공동 배양은 수초화 핍지교세포를 오가노이드에 통합하여 수초화된 오가노이드를 생성하는데 유용할 수 있다. 오가노이드의 비제한적인 예는 전체 뇌 오가노이드, 척수 오가노이드, 혈뇌장벽 오가노이드, 및 뇌-영역 특이적 오가노이드 (예컨대, 전뇌, 중뇌, 소뇌, 및 시상하부 뇌 오가노이드)를 포함한다.
SOX9를 코딩하는 핵산은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있고, SOX9 발현은 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어진 iPSC와 하나 이상의 다른 유형의 세포의 공동 배양 후 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 또는 적어도 20일에 유도될 수 있다. 분화 배지는, 예컨대 다른 유형의 세포 (예컨대, 비변형된 다능성 줄기 세포)에 의한 뉴런 형성을 유도하기 위해 공동 배양 동안 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, SOX9 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어진 다능성 줄기 세포 (예컨대, iPSC)는 병렬 프로그래밍을 위해 SOX9가 아닌 적어도 하나의 분화제를 발현하도록 조작된 다능성 줄기 세포와 공동 배양된다. SOX9 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어진 다능성 줄기 세포 (예컨대, iPSC)는 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 또는 적어도 20일 동안 또 다른 세포 유형과 공동 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, SOX9의 발현 및 다른 분화제의 발현은 유도성이다. SOX9의 발현 및/또는 다른 분화제의 발현은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 또는 적어도 20일 동안 유도될 수 있다.
일부 실시양태에서, SOX9 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어진 다능성 줄기 세포의 제1 집단은 1 내지 50개의 다른 PSC 집단과 함께 배양되어 다수의 세포 유형을 생성한다. 일부 실시양태에서, SOX9 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어진 다능성 줄기 세포의 제1 집단은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 또는 적어도 50개의 다른 PSC 집단과 함께 배양되어 다수의 세포 유형을 생성한다. PSC의 다른 집단은 계통-특정화 유전자를 코딩하는 조작된 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1 내지 50개의 다수의 세포 유형이 생성된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 또는 적어도 50개의 다수의 세포 유형이 생성된다.
제약 조성물 및 이의 용도
또한, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성된 다능성 줄기 세포 (예컨대, 유도된 다능성 줄기 세포), OPC 및/또는 핍지교세포를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다. 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 (예컨대, 나노담체) 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 히드로겔도 제약상 허용되는 담체로 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 부형제의 비제한적인 예는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 포스페이트 완충된 식염수, 비카르보네이트 용액, 보존제, 안정화제, 유화제 (예컨대, 인지질 유화제), 가용화제 (예컨대, 계면활성제), 또는 결합제를 포함할 수 있다. 부형제는 투여 방식 및 경로, 및 표준 제약 관행에 기초하여 선택될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 조작된 세포를 포함하는 조성물과 같은 약제의 제형 및/또는 제조에서의 일반적인 고려사항은, 예컨대 문헌 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005, 전체가 참조로 본원에 포함됨)에서 찾을 수 있다.
본원에 개시된 임의의 제약 조성물은 대상체 (예컨대, 인간 대상체)에게 투여될 수 있다. 추가의 예시적인 대상체는 마우스, 래트, 토끼, 말, 개, 고양이, 염소, 양 및 다른 동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대상체는 탈수초성 장애를 가질 수 있다. 탈수초성 장애는 축삭을 둘러싼 미엘린이 손실되거나 손상된 장애를 포함한다. 자기 공명 이미징 (MRI)을 탈수초성 장애를 진단하는데 사용할 수 있다. 탈수초성 장애의 예는 중추 신경계의 미엘린이 손상된 장애를 포함한다. 일부 실시양태에서, 탈수초성 장애는 OPC에 대한 손상을 포함한다. 탈수초성 장애의 예는 다발성 경화증, 횡단 척수염, 백색질형성장애 (예컨대, 이염색성 백색질형성장애 (MLD) 및 부신백색질형성장애 (ALD))를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 단독으로 또는 적어도 하나의 다른 활성제와 조합하여 대상체에게 치료 효과를 부여하는데 필요한 OPC 및/또는 핍지교세포의 양을 지칭한다. 유효량은 투여 경로, 부형제 사용, 및 다른 활성제와의 공동 사용에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이 다양하다. 투여될 양은, 예컨대 개체의 면역계의 세기 또는 유전적 소인을 포함하여 치료될 대상체에 따라 다르다. 적합한 용량 범위는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있고, 본 개시내용의 폴리펩티드의 마이크로그램 정도일 수 있다. 본원에 개시된 제제의 용량은 투여 경로에 의존적일 수 있고, 대상체의 크기에 따라 다르다.
적절한 투여 경로는, 예컨대 정맥내, 경막내, 실질, 또는 뇌실내 경로와 같은 비경구 경로를 포함한다. 적절한 투여 경로는, 예컨대 정맥내, 경막내, 실질, 또는 뇌실내 주사와 같은 비경구 경로를 포함한다.
실시예
실시예 1: 다능성 줄기 세포 (iPSC)를 핍지교세포 전구 세포 (OPC)로 효율적으로 분화시키는 작용제로서의 SOX9의 확인.
인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hiPSC) 분화에 대한 SOX9 발현의 효과를 결정하기 위해, SOX9를 hiPSC에서 과발현하였다. SOX9는 연골세포 발달의 기본 마스터 조절인자로 관련되어 있다. 놀랍게도, 연골세포 형태는 SOX9 과발현 후에 관찰되지 않았고; 대신 핍지교세포를 연상시키는 세포가 검출되었다. 이러한 놀라운 관찰은 SOX9-유도된 분화 세포를 OPC 마커인 O4를 표적으로 하는 항체로 염색하고 분화에 대해 유동 세포측정을 수행함으로써 확인되었다 (도 1a-1c).
실제로, 집단의 최대 60%가 O4+ 세포로 검출되었고 (도 1d), 이는 다양한 양의 DNA를 사용하여 세포를 형질감염시킨 후 확인되었으며, 이는 OPC로의 분화를 시사한다. 전체 집단이 SOX9의 게놈 통합을 갖는 세포에 대해 선택되었지만, O4 마커 발현은 집단의 일부에서만 관찰되었다. 강력한 분화를 달성하기 위해 SOX9의 특정 발현 수준이 필요할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 이질적 형질감염을 활용하여 상이한 수의 SOX9 통합 및 이에 따른 상이한 SOX9 발현 수준을 갖는 클론을 단리하였다. 강력한 OPC 분화를 달성한 여러 클론을 확인하기 위해 개별 클론을 스크리닝하였다. SOX9 과발현 후 일부 클론에서 상당한 형태학적 변화가 관찰되었으며, 이는 거의 완전한 분화에 기인하였다. 이러한 형태 변화는 전사 인자 (TF)가 유도되지 않은 대조군 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 2a-2b).
이러한 클론을 특성화하기 위해, 세포를 고정시키고 일반적으로 발현되는 발달 단계를 기반으로 선택되는 초기 OPC 및 후기 OPC에 대한 유동 세포측정 분석을 위해 염색하였다. 높은 O4 및 NG2 발현이 이들 클론에서 관찰되었지만, 형질감염되지 않은 대조군에서는 관찰되지 않았으며, 이는 SOX9-유도된 OPC의 분화 능력을 입증한다 (도 2c-2d).
실시예 2: 시험관내에서 미엘린을 형성하기 위해 SOX9-유도된 OPC의 사용.
성숙하고 미엘린을 생성하는 SOX9-유도된 OPC의 능력을 평가하기 위해, SOX9-유도된 OPC가 hiPSC-유도된 뉴런과 공동 배양되는 시험관내 검정이 이용되었다. 전자 현미경 검사를 용이하게 하기 위해, 뉴런의 다발 묶음을 조장하고 이러한 장기간 배양을 건강하게 유지하는 마이크로패턴화된 마이크로홈을 구축함으로써 축삭 묶음의 정렬을 촉진하였다. 4주간의 공동 배양 후, 횡단면으로 자르고, 두 세포 유형 간의 상호작용을 투과 전자 현미경 검사로 평가하였다. 놀랍게도, 공동 배양물에서 강건한 미엘린 형성이 관찰되었다 (도 3a). 축삭을 감싸는 다층의 조밀한 미엘린을 볼 수 있었다.
프로그래밍된 OPC가 미엘린을 형성하는 능력을 보다 더 생리학적 맥락에서 나타내기 위해, 프로그래밍된 OPC를 인간 대뇌 오가노이드 모델에 통합하였다. 이 모델은 복잡한 구조 및 다양한 인간 뇌 세포 유형을 포함하는 3D 구성으로 인해 생체내 현상을 가장 잘 모방한다. 비변형된 hiPSC를 유도성 SOX9 iPSC와 혼합하였다. 8주 후, 오가노이드를 절단하고, 성숙한 미엘린 마커에 대해 염색하고, SOX9가 과발현되지 않은 대조군과 비교하였다. 도 3b는 MOG 염색된 오가노이드를 나타내며, 여기서 MOG 발현은 유도 후 오가노이드에서 관찰 가능하고 SOX9가 과발현되지 않은 오가노이드에서는 관찰되지 않는다. 이 생체내-유사 인간 모델의 수초화는 프로그래밍된 OPC의 기능성에 대한 강한 입증이다.
실시예 3: 면역억제성 OPC의 생성.
면역억제성 OPC를 생성하기 위해, iPSC는 SOX9, IL10 및 IFNβ1을 과발현하도록 조작되었고 안정한 세포주를 생성하였다. IL-10 및 IFNβ1은 MS 환자에게 제공하는 치료 이익이 두드러지지만, 일반적으로 OPC에 의해 분비되지 않는다. 또한, OPC가 이러한 시토카인을 효과적으로 생성하기 위한 분비 기구를 가지고 있는지는 분명하지 않다. OPC 분비를 조정하기 위해 성장 인자를 첨가하는 것과 대조적으로, 유전자 조작으로 OPC 내에서 비정상적인 상황으로 IL-10 및 IFNβ1의 높은 분비를 달성할 수 있는지의 여부가 결정되었다. 이들 유전자의 발현은 독시사이클린을 배지에 첨가함으로써 이들 안정한 세포주에서 유도되었고, 이들 세포가 시토카인을 방출하는 능력을 측정하였다. OPC는 유도되지 않은 대조군 세포보다 1000배 더 높은 시토카인 방출을 나타낼 수 있다는 것이 밝혀졌다. 구체적으로, 독시사이클린으로 유도한 지 4일 후에 증가된 IL10 분비 (이는 다운스트림 표적으로서 IFNβ1 분비도 유도함)가 관찰되었다. IL10은 다양한 양의 DNA로 형질감염된 후 지속적으로 분비되었다 (도 4). IL10은 독시사이클린의 부재 하에서 (대조군) 방출되지 않는다.
실시예 4: 생체내에서 미엘린을 형성하기 위해 SOX9-유도된 OPC의 사용.
생체내 설정에서 미엘린 형성을 확인하기 위해, SOX9-유도된 OPC를 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 유전자가 파괴되고 발현이 손상된 선천적 유전 모델인 쉬버러 마우스 모델에 이식하였다. 이들 마우스에서는 조밀한 미엘린이 형성되지 않는다. 파괴된 MBP 유전자로 인해, 관찰되는 임의의 조밀한 미엘린 형성은 생착된 이식 세포의 결과일 것이다. 새로 태어난 동형접합 쉬버러 마우스 (출생 후 1-3일)를 저온-마취하고, 50,000개의 정제된 O4+ 세포를 프리핸드 방법을 이용하여 두개내 주사하였다. 대조군은 동일한 절차를 받았지만, 세포 대신 0.1% 트립판 블루를 갖는 PBS가 주사되었다. 대조군과 비교하여 OPC-주사된 마우스에서 보다 조밀한 미엘린 형성이 검출되었고, 이는 이들 세포가 생착할 수 있고 기능적으로 미엘린을 형성할 수 있다는 것을 입증한다 (도 5).
본 발명자들은 또한 공여자 세포에서만 발현될 수 있는 MBP의 존재에 기초하여 이식 10주 후에 면역염색된 뇌 절편에서 SOX9-유도된 세포의 생착을 검출하였다 (데이터는 표시되지 않음). 대조군에서는 MBP가 관찰되지 않았다. 또한, 뇌 횡단면의 TEM을 기반으로, 본 발명자들은 SOX9-유도된 세포가 이식된 마우스에서 조밀한 미엘린을 관찰하였지만, 대조군에서는 거의 관찰되지 않았다 (데이터는 표시되지 않음). 정량화는 대조군과 비교하여 세포가 이식된 마우스에서 수초화된 축삭의 수의 상당한 증가를 나타내었다 (도 6). 종합하면, 이러한 결과는 SOX9 단독의 유도가 hiPSC를 유도된 핍지교세포로 세포-자율적으로 프로그래밍하기에 충분하고 조작된 줄기 세포-유래된 OPC가 미엘린 결핍이 존재하는 경우 미엘린을 형성할 수 있다는 것을 입증한다.
본원에 나타난 바와 같이, 이들 세포는 항염증성 시토카인을 분비하는 능력과 같은 추가 특색으로 추가로 조작될 수 있다. 종합하면, 이러한 합성적 OPC는 면역계가 핍지교세포 (OL)를 퇴행시키는 MS와 같은 질환에 대한 유망한 후보이다.
실시예 5: 병렬 및 직교 프로그래밍
세포 자율 분화 접근법을 이용하여 긴 발달 타임라인이 특정한 중요한 세포 유형의 출현을 지연시키는 오가노이드 공학에서 주요 제한 중 하나를 해결하였다. 예컨대, 대뇌 오가노이드의 복잡성은 성숙한 미엘린을 형성하는데 103-210일이 필요한 미엘린의 느린 발달에 의해 부분적으로 제한된다. 미엘린-생성 핍지교세포를 분화시키기 위한 전사 인자 (TF)-매개된 배지-독립적 프로토콜의 결여를 해결하기 위해, 수초화를 합성적으로 가속화하도록 핍지교세포를 프로그래밍하기 위한 개별 TF를 발견하는데 인간 TFome 라이브러리가 활용되었다. 핍지교세포 발달에 관여하는 15개의 TF가 확인되었고, 이들의 순위가 스크린에서 질문되었으며, SOX9가 최고 히트를 차지하였다. SOX9-유도된 세포는 추가적인 계통-특정화 신호 없이 4 dpi에서 특징적인 핍지교세포 전구체 마커 O4 (82±6%)를 발현하였다 (도 2c 및 데이터는 나타내지 않음). 유도된 SOX9 세포는 또한 NG2에 대해 양성이었다 (도 2d 및 면역염색 데이터는 나타내지 않음). 핍지교세포 전사체 시그니처는 편향되지 않은 PCA (도 7), MBP, NKX2-1, MOG, MOBP, OLIG2, CSPG4, OLIG1, SOX8, SOX10, MYRF, PDGFRA, MMP15, PLP1, TMEM88B, ENPP6, 및 NFASC를 포함한 주요 핍지교세포 유전자의 상향 조절 (데이터는 표시되지 않음) 및 고도로 가변적인 유전자의 전사체 비교 (데이터는 표시되지 않음)에 기반하여 일차 핍지교세포와 유사한 것으로 관찰되었다. scRNA-seq에 의한 핍지교세포 마커 CSPG4 (NG2) 및 MYRF의 발현도 검출되었다 (데이터는 표시되지 않음). MYRF, POU5F1, 나노그, 및 SOX2를 포함한 다능성 유전자는 scRNA-seq 및 벌크 RNA-seq 모두에서 하향 조절되었다 (데이터는 표시되지 않음).
복잡한 생리학적 조직을 구축하는 조직 공학의 주요 과제 중 하나를 해결하기 위해, 3개의 조작된 hiPSC 세포주 세트를 인간 TFome을 사용하여 발견된 TF를 기반으로 활용하여 병렬 프로그래밍 개념을 도입하였다. 이 접근법에서, 다수의 계통은 동일한 디쉬 내에서 동시에 공동-발달하여 배지-독립적 방식으로 합성 조직을 형성한다 (도 8). SOX9-유도된 세포의 수초화 가능성을 평가하기 위해, 병렬 프로그래밍 접근법을 적용하여 합성 올리고-뉴런 공동 배양물을 생성하였다. 유도성 SOX9 hiPSC는 분화 시 긴 축삭을 돌출시키는 완전히 특성화된 hiPSC-유래된 유도성 뉴런 (Busskamp, V. et al. Mol Syst Biol 10, 760, (2014))과 함께 조합되었다. 이어서, TF 발현이 활성화되었고, 추가적인 외부 배양-특이적 인자 없이 3 dpi에서 피포 과정을 초기화하기 위해 축삭과 접촉하는 핍지교세포가 관찰되었다 (데이터는 표시되지 않음). 광-마이크로패턴화된 마이크로채널에서 30일의 공동 배양 후 TEM에 의해 축삭 둘레에 강건한 미엘린초가 관찰되었다 (데이터는 표시되지 않음). 조밀한 미엘린에 대한 측정 기준인 G-비율은 생리학적 미엘린에 필적하는 0.56±0.02 (도 10a)로 계산되었다 (Stikov, N. et al. NeuroImage 118, 397-405, (2015)). 이러한 결과는 SOX9-유도된 핍지교세포의 시험관내 수초화 기능성을 입증하였다.
대뇌 오가노이드에서 수초화를 합성적으로 가속화하고 인간 뇌 조직의 보다 정확한 모델을 구축하기 위해, 광범위하게 검증된 SOX9-유도된 핍지교세포를 활용하여 직교 세포 프로그래밍의 개념을 도입하였다 (도 9). 이 직교 접근법에서, 외부 유도 조건과 함께 세포-자율 TF 과발현에 의해 분화의 추가 모드가 설치된다 (데이터는 표시되지 않음). 이를 위해, 유도성 SOX9 hiPSC를 비변형된 hiPSC와 조합하고, 배아체를 형성하였다. 4일 후, 독시사이클린을 첨가하여 직교로 프로그래밍된 그룹에서 SOX9 발현을 유도하였고, 이를 SOX9가 유도되지 않은 대조군과 비교하였다. 40 dpi에서, 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG)은 직교로 프로그래밍된 오가노이드의 면역염색된 횡단면에서 관찰되었지만 (데이터는 표시되지 않음), 대조군에서는 관찰되지 않았다. 조밀한 미엘린의 존재를 결정하기 위해, 이러한 횡단면에 대해 TEM을 수행하였다. 직교로 프로그래밍된 오가노이드 내에서 강건한 조밀한 미엘린 형성이 관찰되었으며 (데이터는 표시되지 않음), 이는 SOX9-유도 핍지교세포의 직교 통합의 결과로 미엘린 성숙의 가속화를 입증하였다. 이들 오가노이드 내의 수초화된 축삭을 생체내의 것과 비교하기 위해, G-비율은 0.52±0.04로 계산되었고 (도 10b), 이는 생리학적 유사성을 입증하였다. 본원에서 직교 프로그래밍의 개념은 대뇌 오가노이드 내에서 수초화를 합성적으로 가속화하기 위해 도입되었으며, 이는 일반화될 때 완전한 세포 유형 레퍼토리를 갖는 각각의 조작된 조직 전체를 달성하는 중요한 단계가 될 수 있다.
병렬 프로그래밍-기반 시험관내 수초화 검정.
SOX9-유도된 핍지교세포를 iNGN hiPSC-유래된 뉴런과 공동 배양하여 미엘린 형성을 평가하였다 (Theodorou, E. et al. Genes Dev 23, 575-588, (2009)). 수초화된 축삭의 횡단면 제조를 용이하게 하기 위해, 이러한 세포는 채널을 따라 한 방향으로 축삭의 정렬을 촉진하는 마이크로채널 몰드 내에서 공동 배양되었다. 마이크로채널 몰드는 콜라겐-코팅된 트랜스웰에 PBS 용액 중의 10% (w/v) PEG-디아크릴레이트 (Mn 1000; 폴리사이언시스 인크. (Polysciences Inc.), 펜실베니아주 워링톤) 및 0.5% (w/v) 이르가큐어 (Irgacure) 2959를 첨가함으로써 구축되었다 (Theodorou, E. et al. Genes Dev 23, 575-588, (2009); Bhatia-Gaur, R. et al. Genes Dev 13, 966-977, (1999); Dutta, A. et al. Science 352, 1576-1580, (2016)). 네거티브 마스크를 사용하여 마이크로채널을 만든 다음, 30초 동안 181 mW/cm2의 UV 광으로 감광 매질을 조사하였다. 이어서, SOX9 및 iNGN hiPSC를 마이크로채널에 시딩하고, TF를 독시사이클린에 의해 유도하였다. 공동 배양을 처음 4일 동안 mTeSR1에서 유지한 후, 배지를 장기간 올리고-뉴런 배양을 보존하기 위해 하기 성분으로 대체하였다: 1:200 N2 보충제, 비타민 A가 결여된 1:100 B27 보충제, 1% 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 60 ng/mL T3, 10 ng/mL NT3, 10 ng/mL IGF-I, 200 μM AA, 1:1000 미량 원소 B, 2 ng/mL BDNF 및 2ng/mL GDNF32를 갖는 DMEM-F12. 4주간의 공동 배양 후, 구축물을 고정하고, 수지에 포매하고, 절단하고, 염색하고, 혈관신생 검정에 대해 상기에 기재된 바와 같이 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지 처리하였다.
대뇌 오가노이드의 직교 세포 프로그래밍.
대뇌 오가노이드는 약간의 변형과 함께 이전에 기재된 바와 같이 생성되었다 (Liang, C. C., Park, A. Y. & Guan, J. L. Nature protocols 2, 329-333, (2007)). 대뇌 오가노이드 내에서 유도된 핍지교세포를 직교적으로 프로그래밍하기 위해, 유도성 SOX9 hiPSC 및 비변형된 hiPSC를 TrypLE 익스프레스 (Express) (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies), 12604013)로 해리시키고, 자동화된 세포 계수기 (카운트리스 II (Countess II), AMQAX1000, 써모피셔 사이언티픽 (ThermoFisher Scientific))를 사용하여 계수하고, 아그리웰 (Aggrewell) 배지 (스템셀 테크놀로지스 (STEMCELL Technologies), 05893)에서 1:1의 비율로 혼합하였다. 이어서, 단일 세포 현탁액을 배아체 형성을 위해 아그리웰400 플레이트 (스템셀 테크놀로지스, 27945)로 옮겼다. 600,000개의 세포를 10 μM Y-27632 ROCK 억제제 (밀리포어 (Millipore), 688001)를 갖는 아그리웰 배지를 함유하는 아그리웰 플레이트에 시딩하였다. 플레이트를 100 x g에서 3분 동안 회전시키고, 밤새 조직 배양 인큐베이터에 두었다. 다음날 (프로토콜 제1일), 명시야 현미경 검사로 배아체 형성을 검증하고, 배지를 N2 보충제 (집코 (Gibco), A13707-01), 비-필수 아미노산 (집코, 11140-050)을 갖는 신경 유도 배지 (DMEM/F12, HEPES 및 GlutaMAX (인비트로겐 (Invitrogen), 11330-032))로 교체하였다. 배지의 절반을 제1일부터 제3일까지 신경 유도 배지로 매일 교체하였다. 제4일에, 배아체를 아그리웰로부터 제거하기 위해 넓은-구멍 끝으로 부드럽게 피펫팅하여 수거하고, 희석하지 않은 마트리겔 (Matrigel)의 소적에 개별적으로 포매하였다 (코닝 (Corning), 354277). 직교 프로그래밍을 위한 TF 발현을 유도하기 위해, 제4일부터 배지에 매일 0.5 μg/mL 독시사이클린을 첨가하였다. 제8일에, 배지를 HEPES 및 GlutaMAX를 함유하는 1:1 DMEM/F12 (인비트로겐, 11330-032) 및 비-필수 아미노산 (집코, 11140-050), N2 보충제 (집코, A13707-01) 및 비타민 A가 없는 B27 보충제 (집코, 12587-010)를 갖는 뉴랄베이설 (Neurobasal) 배지 (인비트로겐, 12348-017)로 이루어진 신경 분화 배지로 교체하였다. 배지를 격일로 교체하였다. 오가노이드를 수거하고, 하전된 유리 슬라이드에 슬라이싱하고, 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 염색을 위해, 샘플을 실온이 되게 하고, 왁스 펜으로 윤곽을 그렸다. 막스워시 세척 배지 (MAXwash Washing Medium) (액티브모티프 (ActiveMotif), 15254)로 3회 세척하여 임의의 남아있는 OCT를 제거한 후, 막스블럭 차단 배지 (MAXblock Blocking medium) (액티브모티프, 15252)를 사용하여 1시간 동안 차단한 다음, 막스워시 세척 배지로 세척하였다. 결합 버퍼 (액티브모티프, 15251) 중의 일차 항체를 첨가하고, 밤새 염색하였다. 샘플을 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 결합 버퍼 중의 이차 항체로 5시간 동안 염색하였다. 샘플을 세척 버퍼로 세척하고, DAPI로 염색한 다음, 벡타쉴드 (VectaShield) 마운팅 매질을 사용하여 이미지 처리를 마운팅하였다.
실시예 6: 핍지교세포 성숙의 장기간 연구
장기간 연구를 수행하고 세포 성숙 및 SOX9-유도된 OPC 분화를 탐색하기 위해, 핍지교세포 분화를 처음에는 줄기 세포 배지에서 유도한 후 세포를 핍지교세포 분화 또는 유지 배지에서 세포를 배양하는 실험 계획을 개발하였다. 이 연구를 이용하여 세포의 안정성 및 성숙에 대한 이상적 조건의 효과를 결정하였다. 따라서, 이 실험은 분화와 성숙의 중간 단계를 모니터링하기 위한 시간 과정으로 설계되었다.
상이한 배양 조건으로부터의 현미경 이미지는 배양 15일 후 핍지교세포가 분지한다는 것을 나타내었다 (데이터는 표시되지 않음). 또한, 배양 31일 후 동일한 연구로부터 현미경 이미지를 촬영하였다. 핍지교세포는 미엘린 피포 과정을 시작하기 위해 축삭 접근을 준비하는 고도로 분지된 형태를 나타내었다 (데이터는 표시되지 않음).
또한, 다양한 마커에 대해 면역조직화학이 이들 세포에서 수행되었다. 세포는 배양 후 제18일에 CNPase-양성, PLP1-양성 GALC-양성, MOG-양성, MBP-양성 및 MAG-양성인 것으로 관찰되었다. MOG는 성숙한 미엘린 단백질이다. MBP는 시그니처 미엘린 마커이다. MAG는 또 다른 성숙한 미엘린 마커이다. 핍지교세포의 분지된 형태도 관찰되었다.
이러한 결과는 SOX9-유도된 OPC 분화 과정의 견고성 및 재현성을 뒷받침한다.
실시예 7: SOX9 카피 수의 효과 결정
단순히 더 많은 SOX9 DNA를 형질감염시킴으로써 SOX9-유도된 OPC 분화의 효율을 개선할 수 있는지를 결정하기 위해, 증가하는 양의 SOX9 DNA를 hiPSC로 형질감염시키고 안정한 세포주를 만들었다. 1.5 μg, 2.5 μg, 5 μg의 SOX9 DNA를 형질감염시키고, 추출된 게놈 DNA에 대해 디지털 소적 PCR (ddPCR)을 이용하여 외인성 SOX9의 집단-평균 카피 수를 정량화함으로써 결정되는 바와 같이, 형질감염된 DNA의 양이 증가할수록 SOX9 피기박TM 플라스미드가 더 많이 게놈적으로 통합된다는 것을 확인하였다 (도 11).
이어서, 게놈적으로 통합된 SOX9의 양을 증가시키면 OPC 분화 효율이 향상되는지의 여부를 평가하였다. OPC 분화 효율은 O4에 대한 염색에 의해 O4-발현 세포의 백분율을 정량화하기 위한 유동 세포측정을 이용하여 평가되었다. 2.5 μg의 SOX9 DNA로 형질감염된 세포는 1.5 μg으로 형질감염된 세포에 비해 더 높은 분화 효율을 갖는 것으로 관찰되었다. 놀랍게도, 5 μg의 SOX9 DNA는 더 많은 게놈 카피 수를 가짐에도 불구하고 OPC 분화 효율을 더 개선하지 않았다 (도 12).
이러한 결과는 높은 수준의 OPC 분화를 달성하기 위해 5 μg 미만의 SOX9 DNA가 필요하다는 것을 시사한다. 이러한 세포에서, 이는 세포당 집단 평균 20개 미만 카피의 SOX9로 해석된다.
서열
SOX9를 코딩하는 핵산 및 아미노산 서열의 비제한적인 예가 하기에 제공된다. 하기에 제공된 핵산 서열은 상기에 기재된 실시예에서 사용되었다.
SOX9를 코딩하는 핵산 서열:
Figure pct00001
SOX9를 코딩하는 아미노산 서열:
Figure pct00002
본원에 개시된 모든 참조 문헌, 특허 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제와 관련하여 참조로 포함되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포괄할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 단수 형태 "하나"는 명백하게 반대로 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
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청구범위 뿐만 아니라 상기 명세서에서, "포함하는", "지니는", "갖는", "함유하는", "수반하는", "보유하는", "구성된" 등과 같은 모든 전환 어구는 개방형, 즉 포함하지만 이에 제한되지 않는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 미국 특허청 특허 심사 절차 매뉴얼, 섹션 2111.03에 제시된 바와 같이, 전환 어구 "~로 이루어진" 및 "~로 본질적으로 이루어진"만이 폐쇄형 또는 반 폐쇄형 전환 어구이다.
수치 앞의 용어 "약" 및 "실질적으로"는 인용된 수치의 ±10%를 의미한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 범위의 상단과 하단 사이의 각각의 값은 본원에서 구체적으로 고려되고 기술된다.
SEQUENCE LISTING <110> President and Fellow of Harvard College <120> SOX9-INDUCED OLIGODENDROCYTE PROGENITOR CELLS <130> H0498.70691WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/855,135 <151> 2019-05-31 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1527 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 atgaatctcc tggacccctt catgaagatg accgacgagc aggagaaggg cctgtccggc 60 gcccccagcc ccaccatgtc cgaggactcc gcgggctcgc cctgcccgtc gggctccggc 120 tcggacaccg agaacacgcg gccccaggag aacacgttcc ccaagggcga gcccgatctg 180 aagaaggaga gcgaggagga caagttcccc gtgtgcatcc gcgaggcggt cagccaggtg 240 ctcaaaggct acgactggac gctggtgccc atgccggtgc gcgtcaacgg ctccagcaag 300 aacaagccgc acgtcaagcg gcccatgaac gccttcatgg tgtgggcgca ggcggcgcgc 360 aggaagctcg cggaccagta cccgcacttg cacaacgccg agctcagcaa gacgctgggc 420 aagctctgga gacttctgaa cgagagcgag aagcggccct tcgtggagga ggcggagcgg 480 ctgcgcgtgc agcacaagaa ggaccacccg gattacaagt accagccgcg gcggaggaag 540 tcggtgaaga acgggcaggc ggaggcagag gaggccacgg agcagacgca catctccccc 600 aacgccatct tcaaggcgct gcaggccgac tcgccacact cctcctccgg catgagcgag 660 gtgcactccc ccggcgagca ctcggggcaa tcccagggcc caccgacccc acccaccacc 720 cccaaaaccg acgtgcagcc gggcaaggct gacctgaagc gagaggggcg ccccttgcca 780 gaggggggca gacagccccc tatcgacttc cgcgacgtgg acatcggcga gctgagcagc 840 gacgtcatct ccaacatcga gaccttcgat gtcaacgagt ttgaccagta cctgccgccc 900 aacggccacc cgggggtgcc ggccacgcac ggccaggtca cctacacggg cagctacggc 960 atcagcagca ccgcggccac cccggcgagc gcgggccacg tgtggatgtc caagcagcag 1020 gcgccgccgc cacccccgca gcagccccca caggccccgc cggccccgca ggcgcccccg 1080 cagccgcagg cggcgccccc acagcagccg gcggcacccc cgcagcagcc acaggcgcac 1140 acgctgacca cgctgagcag cgagccgggc cagtcccagc gaacgcacat caagacggag 1200 cagctgagcc ccagccacta cagcgagcag cagcagcact cgccccaaca gatcgcctac 1260 agccccttca acctcccaca ctacagcccc tcctacccgc ccatcacccg ctcacagtac 1320 gactacaccg accaccagaa ctccagctcc tactacagcc acgcggcagg ccagggcacc 1380 ggcctctact ccaccttcac ctacatgaac cccgctcagc gccccatgta cacccccatc 1440 gccgacacct ctggggtccc ttccatcccg cagacccaca gcccccagca ctgggaacaa 1500 cccgtctaca cacagctcac tcgacct 1527 <210> 2 <211> 509 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 2 Met Asn Leu Leu Asp Pro Phe Met Lys Met Thr Asp Glu Gln Glu Lys 1 5 10 15 Gly Leu Ser Gly Ala Pro Ser Pro Thr Met Ser Glu Asp Ser Ala Gly 20 25 30 Ser Pro Cys Pro Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Glu Asn Thr Arg Pro 35 40 45 Gln Glu Asn Thr Phe Pro Lys Gly Glu Pro Asp Leu Lys Lys Glu Ser 50 55 60 Glu Glu Asp Lys Phe Pro Val Cys Ile Arg Glu Ala Val Ser Gln Val 65 70 75 80 Leu Lys Gly Tyr Asp Trp Thr Leu Val Pro Met Pro Val Arg Val Asn 85 90 95 Gly Ser Ser Lys Asn Lys Pro His Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe 100 105 110 Met Val Trp Ala Gln Ala Ala Arg Arg Lys Leu Ala Asp Gln Tyr Pro 115 120 125 His Leu His Asn Ala Glu Leu Ser Lys Thr Leu Gly Lys Leu Trp Arg 130 135 140 Leu Leu Asn Glu Ser Glu Lys Arg Pro Phe Val Glu Glu Ala Glu Arg 145 150 155 160 Leu Arg Val Gln His Lys Lys Asp His Pro Asp Tyr Lys Tyr Gln Pro 165 170 175 Arg Arg Arg Lys Ser Val Lys Asn Gly Gln Ala Glu Ala Glu Glu Ala 180 185 190 Thr Glu Gln Thr His Ile Ser Pro Asn Ala Ile Phe Lys Ala Leu Gln 195 200 205 Ala Asp Ser Pro His Ser Ser Ser Gly Met Ser Glu Val His Ser Pro 210 215 220 Gly Glu His Ser Gly Gln Ser Gln Gly Pro Pro Thr Pro Pro Thr Thr 225 230 235 240 Pro Lys Thr Asp Val Gln Pro Gly Lys Ala Asp Leu Lys Arg Glu Gly 245 250 255 Arg Pro Leu Pro Glu Gly Gly Arg Gln Pro Pro Ile Asp Phe Arg Asp 260 265 270 Val Asp Ile Gly Glu Leu Ser Ser Asp Val Ile Ser Asn Ile Glu Thr 275 280 285 Phe Asp Val Asn Glu Phe Asp Gln Tyr Leu Pro Pro Asn Gly His Pro 290 295 300 Gly Val Pro Ala Thr His Gly Gln Val Thr Tyr Thr Gly Ser Tyr Gly 305 310 315 320 Ile Ser Ser Thr Ala Ala Thr Pro Ala Ser Ala Gly His Val Trp Met 325 330 335 Ser Lys Gln Gln Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Ala 340 345 350 Pro Pro Ala Pro Gln Ala Pro Pro Gln Pro Gln Ala Ala Pro Pro Gln 355 360 365 Gln Pro Ala Ala Pro Pro Gln Gln Pro Gln Ala His Thr Leu Thr Thr 370 375 380 Leu Ser Ser Glu Pro Gly Gln Ser Gln Arg Thr His Ile Lys Thr Glu 385 390 395 400 Gln Leu Ser Pro Ser His Tyr Ser Glu Gln Gln Gln His Ser Pro Gln 405 410 415 Gln Ile Ala Tyr Ser Pro Phe Asn Leu Pro His Tyr Ser Pro Ser Tyr 420 425 430 Pro Pro Ile Thr Arg Ser Gln Tyr Asp Tyr Thr Asp His Gln Asn Ser 435 440 445 Ser Ser Tyr Tyr Ser His Ala Ala Gly Gln Gly Thr Gly Leu Tyr Ser 450 455 460 Thr Phe Thr Tyr Met Asn Pro Ala Gln Arg Pro Met Tyr Thr Pro Ile 465 470 475 480 Ala Asp Thr Ser Gly Val Pro Ser Ile Pro Gln Thr His Ser Pro Gln 485 490 495 His Trp Glu Gln Pro Val Tyr Thr Gln Leu Thr Arg Pro 500 505

Claims (58)

  1. 다능성 줄기 세포 (PSC)를 배양하여 핍지교세포 전구 세포 (OPC)를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 PSC는 조작된 핵산에 의해 코딩되는 다른 전사 인자 부재 하에 PSC를 OPC로 분화시키기에 충분한 수준으로 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산을 발현하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, SOX9를 코딩하는 조작된 핵산이 PSC에 의해 발현되는 조작된 핵산에 의해 코딩되는 유일한 전사 인자인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 집단의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 또는 적어도 60%가 O4 및/또는 NG2를 발현하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PSC를 조작된 핵산으로 형질감염시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 조작된 핵산이 피기박(PiggyBac) 벡터인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, PSC가 세포당 집단 평균 20개 미만 카피의 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산을 갖는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, PSC가 세포당 집단 평균 5 내지 20개, 10 내지 20개, 또는 15 내지 20개 카피의 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산을 갖는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단의 OPC가 미엘린 염기성 단백질 (MBP), NK2 호메오박스 1 (NKX2-1), 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG), 미엘린 관련된 핍지교세포 염기성 단백질 (MOBP), OLIG2 (핍지교세포 전사 인자 2), 콘드로이틴 술페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 핍지교세포 전사 인자 1 (OLIG1), SRY-박스 전사 인자 8 (SOX8), SRY-박스 전사 인자 10 (SOX10), 미엘린 조절 인자 (MYRF), 혈소판 유래된 성장 인자 수용체 알파 (PDGFRA), 기질 메탈로펩티다제 15 (MMP15), 단백질지질 단백질 1 (PLP1), 막횡단 단백질 88B (TMEM88B), 엑토뉴클레오티드 피로포스파타제/포스포디에스테라제 6 (ENPP6), 및 뉴로파신 (NFASC)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 핍지교세포 유전자를 발현하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 미엘린 조절 인자 (MYRF), POU 부류 5 호메오박스 1 (POU5F1), 나노그 호메오박스 (NANOG), 및 SRY-박스 전사 인자 2 (SOX2)의 다능성 유전자 중 적어도 하나가 세포 집단의 OPC에서 하향 조절되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, PSC가 인간 PSC인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, PSC가 유도된 PSC (iPSC)인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, PSC가 IL-10 및 IFNβ로부터 선택되는 시토카인을 코딩하는 조작된 핵산을 추가로 발현하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, PSC가 IL-10을 코딩하는 조작된 핵산 및 IFNβ를 코딩하는 조작된 핵산을 추가로 발현하는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 세포 집단의 OPC가 IL-10 및/또는 IFNβ를 발현하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, OPC가 IL-10 및/또는 IFNβ를 분비하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단의 OPC를 배양하여 핍지교세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 핍지교세포가 2',3'-사이클릭 뉴클레오티드 3' 포스포디에스테라제 (CNPase), 단백질지질 단백질 1 (PLP1), 갈락토실세라미다제 (GALC), 미엘린 핍지교세포 당단백질 (MOG), 미엘린 염기성 단백질 (MBP), 및 미엘린 관련된 당단백질 (MAG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 바이오마커를 발현하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 세포 집단.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 OPC를 포함하는 제약 조성물.
  20. 제16항 또는 제17항의 방법에 의해 생성된 핍지교세포를 포함하는 제약 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항의 제약 조성물을 탈수초성 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 탈수초성 장애가 다발성 경화증, 횡단 척수염, 이염색성 백색질형성장애 (MLD) 및 부신백색질형성장애 (ALD)로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 조작된 핵산에 의해 코딩되는 다른 전사 인자의 부재 하에 다능성 줄기 세포 (PSC)를 핍지교세포 전구 세포 (OPC)로 분화시키기에 충분한 수준으로 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산을 포함하는 PSC.
  24. 제23항에 있어서, SOX9를 코딩하는 조작된 핵산이 PSC에 의해 발현되는 조작된 핵산에 의해 코딩되는 유일한 전사 인자인 PSC.
  25. 제23항 또는 제24항의 PSC의 제1 집단을 PSC의 적어도 하나의 다른 집단과 함께 배양하여 다수의 세포 유형을 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 PSC의 적어도 하나의 다른 집단은 계통-특정화 유전자를 코딩하는 조작된 핵산을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, SOX9를 코딩하는 조작된 핵산 및/또는 계통-특정화 유전자를 코딩하는 조작된 핵산이 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, PSC의 제1 집단을 PSC의 적어도 하나의 다른 집단과 배양하는 단계, 및 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산 및/또는 계통-특정화 유전자를 코딩하는 조작된 핵산의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제23항 또는 제24항의 PSC의 제1 집단을 PSC의 적어도 하나의 다른 집단과 배양하여 수초화된 오가노이드를 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 PSC의 적어도 하나의 다른 집단은 비변형된 PSC를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, SOX9를 코딩하는 조작된 핵산이 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  30. 제26항에 있어서, PSC의 제1 집단을 PSC의 적어도 하나의 다른 집단과 배양하는 단계, 및 SOX9를 코딩하는 조작된 핵산의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
  31. (a) 다능성 줄기 세포 (PSC)를 전사 인자와 접촉시키는 단계이며, 여기서 전사 인자는 SOX9, 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어지는 것인 단계, 및 (b) PSC를 배양하여 핍지교세포 전구 세포 (OPC)를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  32. (a) 다능성 줄기 세포 (PSC)를 분화제와 접촉시키는 단계이며, 여기서 분화제는 SOX9, 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 본질적으로 이루어지는 것인 단계, 및 (b) PSC를 배양하여 핍지교세포 전구 세포 (OPC)를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 세포 집단이 적어도 70%의 OPC를 포함하는 것인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 PSC가 배양 배지에 존재하는 것인 방법.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, PSC가 인간 PSC인 방법.
  36. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, PSC가 유도된 PSC (iPSC)인 방법.
  37. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, OPC가 O4 및/또는 NG2를 발현하는 것인 방법.
  38. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, IL-10 및 IFNβ로부터 선택되는 시토카인을 코딩하는 조작된 핵산이 (a)의 PSC에 도입되는 것인 방법.
  39. 제37항에 있어서, IL-10을 코딩하는 조작된 핵산 및 IFNβ를 코딩하는 조작된 핵산이 다능성 줄기 세포에 도입되는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, IL-10 및 IFNβ가 동일한 조작된 핵산에 의해 코딩되는 것인 방법.
  41. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 PSC가 1 내지 10일 동안 배양되는 것인 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 31 내지 10일 동안 OPC를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, OPC가 IL-10을 분비하는 것인 방법.
  44. 제13항에 있어서, OPC에 의해 분비되는 IL-10의 수준이 대조군 세포보다 적어도 50배, 적어도 100배, 또는 적어도 1,000배 더 높고, 여기서 대조군 세포는 i) 자연 발생 OPC, (ii) IL-10을 발현하도록 조작되지 않은 OPC, 및/또는 (iii) 유도성 프로모터 하에 IL-10을 발현하도록 조작되고 유도제의 부재 하에 배양되는 OPC인 방법.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 분화제가 1 내지 50개 카피의 SOX9를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 본질적으로 이루어지는 것인 방법.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 조작된 핵산이 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 프로모터가 유도성 프로모터인 방법.
  48. 제47항에 있어서, (b)의 PSC가 유도성 프로모터를 유도하여 전사 인자 및/또는 시토카인의 전사를 활성화시키는 작용제의 존재 하에 배양되는 것인 방법.
  49. 제31항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 조작된 핵산이 피기박(PIGGYBAC)TM 트랜스포존 벡터 상에 존재하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 피기박TM 트랜스포존 벡터가 전사 인자 중 적어도 하나를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열의 측면에 배치된 피기박™ 역 말단 반복 서열을 포함하는 것인 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 피기박TM 트랜스포사제 또는 피기박TM 트랜스포사제를 코딩하는 조작된 핵산을 PSC에 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, OPC를 배양하여 핍지교세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제31항 내지 제52항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 세포 집단.
  54. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 OPC를 포함하는 제약 조성물.
  55. 제52항의 방법에 의해 생성된 핍지교세포를 포함하는 제약 조성물.
  56. 제54항 또는 제55항의 제약 조성물을 탈수초성 장애를 갖는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 탈수초성 장애가 다발성 경화증, 횡단 척수염, 이염색성 백색질형성장애 (MLD), 및 부신백색질형성장애 (ALD)로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 제31항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 분화제가 SOX9, 또는 하나 이상의 카피의 SOX9를 코딩하는 핵산으로 이루어지는 것인 방법.
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