KR20220024244A - 혈당을 개선할 수 있는 와송·여주 복합추출물 및 이의 제조방법 - Google Patents

혈당을 개선할 수 있는 와송·여주 복합추출물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 와송 및 여주 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 이에 따라 식물을 이용하여 부작용이 없고, 혈당 수치를 정상범위로 낮추면서 췌장베타세포를 활성시킴으로써 효율적으로 당뇨병을 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

혈당을 개선할 수 있는 와송·여주 복합추출물 및 이의 제조방법 {Orostachys japonicas and Momordica charantia Linn complex-extract for improving blood sugar and method of manufacturing the same}
본 발명은 혈당을 개선할 수 있는 와송·여주 복합추출물 및 이의 제조방법에 관한 것으로 보다 상세하게는 와송과 여주를 이용하여 혈당을 개선하여 효율적으로 당뇨를 개선, 예방 및 치료할 수 있는 와송·여주 복합추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 과제 결과물로서 과제정보는 다음과 같다.
1. 과제번호 : 2017-나-6
2. 부처명 : 전라북도
3. 연구관리 전문기관 : 전북테크노파크
4. 연구사업명 : 2017년도 전라북도 선도기업 기술개발 역량강화지원사업
5. 연구과제명 : 와송을 활용한 당뇨병 개선 바이오 소재 및 제품개발
6. 주관기관 : 제너럴바이오(주)
7. 연구기간 : 2017.10.01 ~ 2018.09.30
당뇨병은 탄수화물 대사에 작용하는 인슐린 (insulin)의 작용이 정상적으로 이루어지지 않아 일어나는 내분비 장애의 가장 대표적인 질병으로, 주로 소아에서 발생하며 췌장 (pancreas)의 인슐린 분비가 감소에 의한 제1형 당뇨병 및 성인에서 주로 발생하며 인체 각 조직이 인슐린에 대해 무반응성의 인슐린 저항성 증상을 나타내는 제2형 당뇨병으로 분류된다.
당뇨병의 주된 치료제로서는 설포닐우레아 (sulfonylureas)계 약물, 비구아니드 (biguanides)계 등의 경구로 섭취하는 혈당강하제와 DNA 재조합법에 의하여 얻은 인슐린 등이 사용되고 있다. 하지만 이런 약물들은 저혈당증 유발, 신장독성, 유산증, 설사와 배탈, 면역거부반응 등 많은 부작용을 가지고있어 부작용이 적은 천연물을 이용하려는 연구가 활발해지고 있다.
한편, 와송(瓦松)은 바위솔(Orostachys japonicus A. Berger)이라 하며 일명 암송(岩松), 옥송(屋松), 작엽하초(昨葉何草) 등으로 불리는 돌나물과(Crassulaceae)의 다년생 초본 식물로서 한방에서 해열, 소종, 지혈, 이습 등에 사용되며[金在佶, 1984, 原色天然藥物大事典(上卷), 南山堂, 서울, p.447] 민간요법으로 암치료에도 많이 이용되고 있다[배성식,1990, 한방과 건강, 1, 26].
이 식물은 바위 곁에 붙어서 자라는 육질의 다년생 초본이지만 꽃이 피고 열매를 맺으면 고사하는 특징이 있다. 근생엽은 로제트형으로 퍼지며 끝이 굳어져서 가시처럼 되고 원줄기에 잎이 달리며 엽병이 없고 여름철에 나오는 근생엽과 더불어 끝이 굳어지지 않고 다만 뾰족해질 뿐이며 피침형으로서 녹색이지만 자주색 또는 분을 칠한 듯한 백색인것도 있다. 꽃은 9월에 피고 백색이며 총상화서는 길이 6∼15cm로서 화병이 없는 꽃이 밀착하고 포는 피침형이며 끝이 뾰족하다. 꽃받침은 5개로서 피침형이고 녹색이며 꽃잎도 5개로서 피침형 예두이고 길이 6mm 정도이다. 수술은10개이며 꽃잎보다 길고 자방은 5개이며 화분은 적색이지만 점차 흑색으로 된다[이창복, 1979, 大韓植物圖鑑, 鄕文社 서울, p.402]. 와송은 여름부터 가을에 걸쳐 채취하며 뿌리를 제거한 전초(全草)를 햇볕에 말려 약용으로 한다[金在佶, 1984, 原色天然藥物大事典(上卷), 南山堂, 서울, p.447].
와송을 본초학적으로 문헌을 통하여 고찰하여 보면 당본초(唐本草)에는 구중(口中)의 건조(乾燥)와 통증에 사용한다고 하며 본초강목에는 대장하혈에 물로 추출하여 복용하고, 모든 상처에 도포하면 수렴 효과가 있다고 하며 본초재신에는 백독(百毒)을 치료하고 종(腫)을 소실시키며 분류초약성에는 치질의 종통출혈을 다스리는 데는 약초를 전액(煎液)으로하여 세척한다고 하며 본초재신에는 창(瘡)과 유(癒)에 효과가 있다고 한다[上海科學技術出版社 小學館編 ;中藥大事典, 小學館, 1985, p.526].
한편, 대한민국 공개특허공보 제10-2005-0006964호(이하 ‘특허문헌 1’이라 한다)에 게재된 발명에는 와송을 이용한 항당뇨성 조성물이 개시되어 있다.
그러나 특허문헌 1은 와송만을 이용하여 당뇨병 개선 또는 치료에 효능이 제한적인 문제가 있다.
대한민국 공개특허공보 10-2005-0006964(2005. 01. 17. 공개)
본 발명은 와송만을 이용할 경우에 효능이 제한적인 것을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 와송 이외에 다른 식물, 즉 여주를 더 부가하여 효율적으로 당뇨를 개선, 예방 및 치료할 수 있는 추출물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 추출물은 와송 및 여주 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 기술적 특징으로 한다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명에 따른 추출물의 제조방법은 와송 분말을 증류수에 녹인 다음 환류 추출하는 단계; 여주 분말을 증류수에 녹인 다음 환류 추출하는 단계; 및 상기 와송 추출물과 상기 여주 추출물을 중량비 기준으로 8:2의 비율로 혼합하는 단계를 포함하여 구성되는 것을 기술적 특징으로 한다.
본 발명에 따른 추출물은 식물을 이용하여 부작용이 없고, 혈당 수치를 정상범위로 낮춤과 동시에 췌장베타세포를 활성시킴으로써 효율적으로 당뇨병을 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1 및 도 2는 혈당측정 결과를 나타내는 그래프
도 3은 당화혈색소의 측정 결과를 나타내는 그래프
도 4 및 도 5는 경구 당 부하검사 결과를 나타내는 그래프
도 6 및 도 7은 췌장 H&E 염색 결과를 나타내는 사진 및 그래프
도 8은 췌장의 면역염색 결과를 나타내는 사진
도 9는 피하 및 복강 내 지방조직 부검 결과 사진
도 10은 간의 지방조직 부검 결과 사진
도 11은 부검 후 체중 측정 결과를 나타내는 그래프
도 12는 부검 후 간 무게 측정 결과를 나타내는 그래프
도 13은 간 무게/체중 비율 결과를 나타내는 그래프
도 14 및 도 15는 간 손상 수치 측정 결과를 나타내는 그래프
도 16 및 도 17은 지방축적 측정 결과를 나타내는 그래프
도 18은 간의 H&E 염색 결과를 나타내는 사진
도 19 및 도 20은 간의 Oil-red O 염색 결과를 나타내는 사진 및 그래프
도 21은 지질대사 관련 유전자의 발현 결과를 나타내는 그래프
도 22는 지질생합성 관련 유전자의 발현 결과를 나타내는 그래프
도 23은 지질대사 및 지질생합성 관련 전사조절인자의 발현 결과를 타나내는 그래프
도 24는 웨스턴블랏을 통한 Akt 발현 결과를 나타내는 사진
도 25는 당 수용체 및 당 신생합성 관련 유전자의 발현 결과를 나타내는 그래프
도 26은 와송 추출물이 투여된 인슐린 저항성 실험모델의 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 그래프
도 27은 와송·여주 복합추출물이 투여된 인슐린 저항성 실험모델의 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 그래프
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 "발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙"에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야지, 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되서는 안 된다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해해야 한다.
실시예. 와송·여주 복합추출물
와송 및 여주의 열매는 남원에 소재한 영농조합법인으로부터 구매하였다. 와송 및 여주의 지상부로 이루어진 건조분말 1kg을 증류수 10L에 넣고 균질기(homogenizer)를 이용해 밤새 저으면서 2회에 걸쳐 환류추출하였다. 추출물은 동결건조시켜 와송·여주 복합 추출물을 완성하였다. 본 발명에서 사용되는 와송과 여주의 혼합 비율은 8:2의 비율로 혼합하였다. 와송·여주 복합추출물의 조성을 HPLC(High-performance liquid chromatography) 분석한 결과 5개의 주요 성분이 확인되었고, 그 결과는 아래의 표 1과 같다.
Figure pat00001
실험예 1. 항당뇨 지표에 대한 영향 평가
1-1. 실험 준비
실험을 위해 5주령의 수컷 db/db 마우스와 같은 연령의 wild type C57BL/Ksj-db/+(db/+) 마우스를 준비하였다. 환경은 일반적인 환경 조건(24±2℃, 50±5%의 습도)을 유지하였고, 식이는 멸균된 표준식단으로 공급하였으며, 물은 자유롭게 섭취하도록 공급하였다. 이하에서 수행된 실험은 모두 전북대 동물보호윤리위원회(CNNU 2018-038)의 지침에 맞게 수행하였다. 2주간의 순화과정이 지난 다음 db/+ (그룹 당 6마리) 또는 db/db (그룹당 8마리) 마우스를 무작위적으로 4개의 그룹으로 나누었고, 와송·여주 복합추출물을 다음과 같은 농도로 투여하였다;0, 100, 200 및 400 mg/kg/day. 와송·여주 복합추출물은 식염수에 녹여서 경구섭취시켰고, 섭취 주기는 1주일 중 5일, 하루에 한 번 투여하였고 실험은 6주간 수행하였다.
1-2. 실험 과정
1-1의 마우스를 최소 8시간동안 절식한 후 (1)혈중 포도당 수치와 (2)당화혈색소 수치를 측정하였고, 그 뒤 (3)당(2g/kg 체중)을 경구 투여하고 혈중 포도당 수치를 0, 30, 60, 90, 120분 후 각각 측정하여 혈당 조절 능력을 평가하였다.
1-3. 실험 결과
(1)절식 후 혈당측정결과
도 1에 도시된 바와 같이 와송·여주 복합추출물을 투여 받은 당뇨 유발 마우스 그룹에서 혈당이 유의적으로 감소하는 결과를 확인하였다.
이 결과를 바탕으로 초기 혈당수치와의 차이를 비교분석한 결과 도 2에 도시된 바와 같이 혈당의 변화량 역시 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 감소한 것을 확인하였다.
(2)당화혈색소(HbA1c) 측정결과
도 3에 도시된 바와 같이 와송·여주 복합추출물 투여 받은 당뇨 유발 마우스 그룹에서 당화혈색소의 측정값이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
(3)경구 당 부하검사결과(oral glucose tolerance test)
도 4 및 도 5에 도시된 바와 같이 db/db 마우스 그룹에서 혈당은 120분 후에도 초기 혈당에 비하여 현저히 증가된 것을 확인하였다. 반면 와송·여주 복합추출물을 투여 받은 그룹에서는 당 투여 후 시간이 지남에 따라 혈당이 감소하는 유의적으로 감소하는 결과를 확인하였다. 이러한 결과를 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 당뇨 유발 마우스에서 혈당 조절 능력이 개선됨을 나타낸다.
실험예 2. 췌장의 조직병리학적 변화 분석
2-1. 실험 준비
췌장 조직을 준비하였다.
2-2. 실험 과정
포르말린 고정 후 일반적인 처리과정을 거친 조직절편을 H&E 염색을 통하여 당뇨유발에 의한 췌장의 병리학적 변화를 관찰하였다.
포르말린 고정 조직을 일반적인 조직 처리과정 후 조직절편을 면역 염색(Immunohistochemistry, IHC)을 통하여 당뇨유발에 의한 췌장의 병리학적 변화를 관찰하였다.
2-3. 실험 결과
췌장 H&E 염색 결과, 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이 인슐린 저항성으로 인한 췌장의 랑게르한스 섬 면적이 현저히 증가한 것이 db/db 마우스 군에서 관찰되었는데, 이러한 변화는 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
면역염색을 통하여 인슐린 및 글루카곤의 발현 양상을 비교분석해본 결과, 도 8에 도시된 바와 같이 db/db 마우스 군에서 와송·여주 복합추출물 처리함으로써 인슐린 양성 세포가 증가하였고, 글루카곤 분비양상이 정상에 유사해지는 결과를 확인하였다.
실험예 2의 결과를 통해 와송·여주 복합추출물이 2형 당뇨병이 발생한 개체의 췌장에 긍정적인 영향을 미치는 것을 알 수 있다.
실험예 3. 부검 육안소견 및 간 무게, 체중 비교
3-1. 실험 준비
1-1과 같이 마우스를 준비하였다.
3-2. 실험 과정
실험 기간 6주 후 부검을 실시하였다. 부검 전 8시간 동안은 금식시켰다.
3-3. 실험 결과
(1) 부검 육안소견 결과
도 9에 도시된 바와 같이 당뇨가 유발된 db/db 마우스 그룹은 db/+ 그룹에 비하여 피하 및 복강 내 지방조직의 크기가 증가된 것을 확인하였다. 반면, 와송·여주 복합추출물 투여에 의한 지방조직의 변화를 확인할 수 없었다.
(2)간 무게 및 체중 측정 결과
간 크기의 변화는 도 10에 도시된 바와 같다. 도 11 내지 13에 도시된 바와 같이 당뇨가 유발된 db/db 마우스 그룹에서 db/+ 그룹에 비하여 체중 및 간의 무게가 증가한 결과를 확인하였다. 반면 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 체중 및 간 무게 혹은 그 비율이 미약하게 감소하는 것을 확인하였으나, 통계적 유의성은 확인할 수 없었다.
실험예 4. 당뇨병에 의한 간 손상 및 지방침착 확인
4-1. 실험 준비
1-1.과 같은 방법으로 마우스를 준비하였다.
4-2. 실험 과정
4-1의 마우스에서 채취한 혈액시료를 원심분리하여 혈청을 얻고, (1)간 손상 관련 효소인 ALT(alanine aminotransferase), AST(aspartate transaminase)를 측정하였고, (2)9-1 마우스에서 채취한 간에서 중성지방(triglyceride, 이하 ‘TG’) 및 총 콜레스테롤의 양(total cholesterol, 이하 ‘TC’)을 측정하였다.
4-3. 실험 결과
(1)간 손상 수치 측정 결과
혈청학적 분석을 통하여 도 14 및 도 15에 도시된 바와 같이 와송·여주 복합추출물 투여에 의해 ALT 및 AST의 수치가 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
(2)TG 및 TC 측정 결과
도 16 및 도 17에 도시된 바와 같이 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 지방축적이 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.
실험예 5. 간의 조직병리학적 변화 분석1
5-1. 실험 준비
간 조직을 준비하였다.
5-2. 실험 과정
포르말린 고정 후 일반적인 처리과정을 거친 조직절편을 H&E 염색을 통하여 당뇨유발에 의한 간의 병리학적 변화를 관찰하였다.
5-3. 실험 결과
간의 H&E 염색 결과, 도 18에 도시된 바와 같이 db/db 마우스 군에서 간세포 변성(hepatocellular hypertrophy, ballooning degeneration) 및 지방침착(stratosis)을 관찰할 수 있었으며, 이러한 양상은 와송·여주 복합추출물투여에 의해 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다.
실험예 3 내지 5의 결과를 종합하면, 여주·와송·여주 복합추출물이 당뇨에 의해 발생한 간 손상을 감소시키고, 간 손상과 관련된 지방증과 혈당을 조절함으로써 항당뇨 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 6. 간의 조직병리학적 변화 분석2
6-1. 실험 준비
간 조직을 준비하였다.
6-2. 실험 과정
동결고정조직의 절편을 Oil-red O 염색을 통하여 당뇨유발에 의한 간의 지방침착을 조직수준에서 관찰하였다.
6-3. 실험 결과
간의 Oil-red O 염색 결과, 도 19 및 도 20에 도시된 바와 같이 H&E 염색조직 관찰 결과와 유사하게 지방침착이 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 7. 지방 관련 유전자 발현 분석
7-1. 실험 과정
간 조직에서 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다. 다양한 유전자의 발현 변화를 qRT-PCR을 통해 상대정량분석을 실시하여 와송·여주 복합추출물 의한 유전자 발현양상의 변화를 비교분석하였다.
7-2. 실험 결과
지질대사 관련 인자인 Apo B, LPL, 및 L-FABP의 발현을 비교분석한 결과, 도 21에 도시된 바와 같이 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 당뇨 유발 마우스의 간장에서 유의적으로 감소하는 결과를 확인하였다.
지질생합성(de novo lipogenesis)관련 인자인 ACCα, ACCβ, FAS, 및 SCD1의 발현을 비교분석한 결과, 도 22에 도시된 바와 같이 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 당뇨 유발 마우스의 간장에서 유의적으로 감소하는 결과를 확인하였다.
그리고 위와 같은 변화와 밀접한 연관이 있는 전자조절인자 및 그 관련 인자인 SREBP-1, SREBP-2 및 LXRα의 발현을 비교분석한 결과, 도 23에 도시된 바와 같이 와송·여주 복합추출물투여에 의하여 당뇨 유발 마우스의 간장에서 유의적으로 감소하는 결과를 확인하였다. 반면, 간 보호 및 항 당뇨효능이 있다고 알려져 있는 PPARα의 발현은 유의적으로 증가하는 결과를 확인하였다.
실험예 6 및 실험예 7의 결과를 종합하면, 와송·여주 복합추출물이 2형 당뇨병이 발생한 개체의 간 지방 대사에 관여하여 간에서의 지방축적, 즉 지방증(hepatic steatosis)을 방지하는데 효과가 있음을 알 수 있다.
실험예 8. 당 대사 관련 유전자 발현 분석
8-1. 실험 과정
간 조직에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏 분석(Western blot analysis)을 통한 단백질 발현 분석 및 간 조직에서 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하였다.
다양한 유전자의 발현 변화를 qRT-PCR을 통하여 상대정량분석을 실시하여 와송·여주 복합추출물에 의한 유전자 발현양상의 변화를 비교분석하였다.
8-2. 실험 결과
도 24에 도시된 바와 같이 인슐린 신호전달 및 당 수용체 발현조절에 중요한 역할을 하는 Akt의 활성화(인산화)가 와송·여주 복합추출물을 투여한 마우스의 간에서 증가하는 것을 확인하였다.
당 수용체(GLUT2, 4)의 발현을 확인해 본 결과, 당 수용체 발현이 와송·여주 복합추출물 처리에 의하여 유의적으로 증가하는 결과를 확인하였다(도 25 참조).
당 신생합성 관련 유전자(G6Pase, PEPCK)의 발현을 확인해 본 결과, 와송·여주 복합추출물 처리에 의하여 당뇨 유발 마우스 간에서 당 신생합성 관련 유전자인 G6Pase의 발현이 유의적으로 감소하는 결과를 확인하였다(도 25 참조).
이러한 실험예 8의 실험 결과를 바탕으로 와송·여주 복합추출물이 G6Pase와 같은 당 생성 효소를 조절함으로써 간에서의 포도당 신생과정을 억제하고, 인슐린 민감성을 증가시키는 것을 알 수 있다.
실험예 9. 항당뇨 효능 in vitro 평가
9-1. 실험 과정
간암세포주인 HepG2 cell에 PA(palmitic acid)를 0.4 mM 농도로 처리하여 인슐린저항성, 지방 축적 및 세포손상을 유발하였고, (1)와송 열수추출물 1 ug/mL, (2)와송·여주 복합추출물 농도 13 ng/mL, 100 ng/mL, 1 ug/mL(통계적으로 세포독성이 일어나지 않는 3가지 농도)를 처리한 후, 24시간 배양하였다.
다양한 유전자의 발현 변화를 qRT-PCR을 통하여 상대정량분석을 실시하여 와송·여주 복합추출물에 의한 유전자 발현양상의 변화를 세포수준에서 비교분석하였다.
9-2. 실험 결과
(1)와송 추출물 처리 결과(도 26 참조)
지방 생성 및 대사관련 인자들의 발현이 와송 열수추출물 처리에 의하여 유의적으로 감소하는 결과를 확인하였고 PPARα의 발현은 증가시키는 결과를 확인하였다.
와송 추출물 처리가 PA 처리 간세포에서 당 수용체 발현 증가 및 당 생성관련 인자의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 바탕으로 와송 추출물이 항 당뇨 효능을 가지고 있음을 세포수준에서 확인하였다.
(2)와송·여주 복합추출물 처리 결과(도 27 참조)
와송·여주 복합추출물의 처리가 PA가 처리된 간세포에서 지질 축적 관련 유전자의 발현을 감소시키고, PPARα의 발현을 증가시키는 결과를 확인하였다.
와송·여주 복합추출물의 처리가 PA가 처리된 간세포에서 GLUT4를 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였고, G6Pase의 발현은 유의적으로 감소하는 결과를 확인하였다.
이러한 결과를 바탕으로 와송·여주 복합추출물이 항 당뇨 효능을 가지고 있음을 세포수준에서 확인하였다.

Claims (1)

  1. 와송 지상부 및 여주 지상부를 중량비 8:2로 혼합하여 건조한 분말 1kg에 증류수 10L를 넣고 추출한 와송 및 여주 복합추출물을 유효성분으로 포함하고,
    상기 복합추출물은 카테킨(catechin) 0.7mg/g, 에피갈로카테킨(epigallocatechin) 0.39mg/g, 에피갈로카테킨-갈레이트(epigallocatechin-gallate) 0.14 mg/g, 에피카테킨(epicatechin) 0.07mg/g 및 에피카테킨-갈레이트(epicatechin-gallate) 0.10mg/g를 포함하며,
    상기 복합추출물은 마우스 경구 투여 기준으로 400mg/kg/day 포함되는 것을 특징으로 하는,
    당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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