KR20220024082A - 조절 cd4+ t 세포를 생성하기 위한 스핑고지질 - Google Patents

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KR20220024082A
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궈량 추이
쓰충 마
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도이체스 크렙스포르슝스첸트룸
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Abstract

본 발명은 약제로 사용하기 위한 및 자가면역 질환을 겪는 대상체를 예방하거나 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 화학식 I의 성분에 관한 것으로, 식 중 R1은 6 내지 20개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이며; R2는 H 또는 누락되어서 O는 이중 결합을 통해 결합되는 것이고, R3은 H 또는 아실기 -C(O)R5이고, 여기서 R5는 1 내지 10개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알킬렌기이고, R4는 H 또는 포스페이트기이다. 본 발명은 추가로 전구체 CD4+ T 세포를 제공하는 단계, 본원에서 정의되는 성분의 존재 하에 단계 1)에서 제공된 상기 전구체 CD4+ T 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로, 생성된 조절 T 세포(Treg 세포)를 단리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 조절 T 세포(Treg 세포)를 생성하는 방법에 관한 것이다.

Description

조절 CD4+ T 세포를 생성하기 위한 스핑고지질
조절 T 세포(Treg 세포 또는 Treg)는 처음에 CD4+CD25+ T 세포로 설명되었다. Treg 세포는 주로 면역계의 조절에 관여된다. 이의 형성 기전으로 인해, Treg 세포는 가슴샘에서 분화되어 그 후 신체의 말초 내로 수송되는 자연 Treg 세포(nTreg), 및 신체의 말초에서 생성되는 유도된/적응 Treg 세포(iTreg)로 구분된다. Treg 세포는 CD4의 발현을 특징으로 하고 또한 활성화된 효과기 T 세포(CD25low, CD25-, T 세포로도 명명됨)에서의 CD25의 발현에 비해 인터류킨-2 수용체 α 사슬의 증가된 발현(CD25high, CD25+로도 명명됨)을 특징으로 한다. 따라서, Treg 세포는 CD25의 발현 수준에 의해 효과기 T 세포와 구별될 수 있다. 약 2 내지 10%의 CD4+ T 세포는 고수준의 CD25(CD25high)를 발현하며 Treg 세포이다. CD25의 고발현에 더하여, Treg 세포는 또한 활성화된 효과기 T 세포(CD127high, CD127+, T 세포로도 명명됨)에서의 CD127의 발현에 비해, 인터류킨-7 수용체 α 사슬의 저발현(CD127low, CD127-로도 명명됨)을 갖는다. 또한, 전형적으로 CD4+CD25high Treg 세포는 전사 인자 Forkheadbox(Foxp3)를 발현하며, 이는 본원에 후술되는 바와 같이, 이의 발생 및 억제 능력을 위해 필수적이다.
Treg 세포에 의한 면역계 조절의 주요 초점은 활성화의 억제 및 또한 자가-반응성 효과기 T 세포, 즉 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 B 세포의 증식 억제, 그리고 수지상 세포, 대식구 및 자연 살해 세포의 활성화 제어이다. 조절 T 세포는 외래 항원에 대한 면역 반응의 제한 및 자가항원에 대한 관용성의 유지에서 필수적 역할을 담당한다. 관용성 유지 및 이에 따른 자가면역 질환의 연관된 예방에 부가하여, 조절 T 세포는 알러지원 및 병원성 미생물에 대한 면역 반응의 억제성 제어에서 중요한 역할을 담당한다. 이들은 또한 기관 이식에 대한 면역계의 관용성 유도에 기여하며 임신 동안 태아에 대한 과도한 면역 반응에 대해 보호한다. 따라서, Treg 세포는 항원, 전형적으로 자가항원에 대한 관용성을 촉진하거나 유지한다. CD4+CD25+ T 세포만 높은 억제 활성을 갖는다.
자가면역 질환은 신체가 자가-항원과 반응한다는 공통점을 가진다. 이는 침입자 마커로서 오해석되며 담체 세포는 고유 면역계에 의해 공격받는다.
Treg 세포는 갑상샘염, 난소염, 위염 또는 염증성 장 질환 등을 포함하는 매우 다양한 자가면역 질환에서 결함이 있는 것으로 나타났다. 이들 결함은 염증발생 조직에서 Treg 세포수의 손실, 결함이 있는 Treg 세포, 인터류킨-2 수용체를 통한 감소된 신호전달 및 억제 활성의 불안정성으로 나타난다. 이에 따라, FOXP3을 발현하는 CD4+CD25+ T 세포는 자가면역 반응의 조절에서 일차적으로 중요한 것으로 인식되었다. 예를 들어, Foxp3 유전자에서의 돌연변이는 비-기능적 Treg 세포를 초래하며 인간에서 고증식성 T 세포를 갖는 치사 다중자가면역 질환을 초래할 수 있다. 다발성 경화증(MS)을 갖는 환자의 말초혈로부터 단리된 Treg 세포는 기능적 장애를 갖는 것으로 확인되었다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 다발성 경화증의 실험실 동물 모델에서의 연구는 CD4+CD25+ T 세포의 입양 전달을 통한 증가하는 기능적 Treg 세포수가 어느 정도의 보호를 제공할 수 있음을 드러내었다.
이식편-대-숙주병에서 나타나는 자가면역성이 보고되었다(Tivol et al., Blood, 2005).
저위험 부작용을 제공하는 성분을 사용하는 CD4+CD25+ T 세포를 표적화하는 자가면역 질환의 효과적인 치료 방법을 제공하는 것이 당분야에서 요구된다. 상기 요구는 면역-억제성 약물로의 현재 치료 방법도 기능하는 면역 세포를 불활성화하는 한편, 약물은 유해한 부작용의 위험을 보유한다는 점으로부터 나오는 것이다.
본 발명은 자가면역 질환의 치료를 위한 Treg 세포의 생성에서 스핑고지질의 유용성을 개시한다.
본 발명에서, 자가면역 질환은 스핑고지질을 사용함으로써 Treg 세포의 생성을 촉진하여 치료받을 수 있는 것으로 나타났으며, 여기서 Treg 세포는 생체 내뿐만 아니라 시험관 내 모두 생성될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성되는 Treg 세포는 자가면역 질환을 겪는 대상체 내로 도입될 수 있다.
하기에서, 본 발명이 상세히 기재된다. 본 발명의 특성이 개별 단락에 기재된다. 그러나, 이것은 하나의 단락에 기재된 특성이 다른 단락에 기재된 특성 또는 특성들로부터 단리되어 존재함을 의미하지는 않는다. 오히려, 하나의 단락에 기재된 특성은 다른 단락에 기재된 특성 또는 특성들과 조합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "포함한다/포함하고/포함하는"은 개시된 특성 및 구체적으로 언급되지 않은 추가 특성이 포함되거나 이를 포괄함을 의미한다. 용어 "포함한다/포함하고/포함하는"은 또한 나타낸 특성으로 "구성된다/구성되고/구성되는"의 개념도 의미하는 것이며, 따라서 나타낸 특성 이외의 추가 특성이 포함되지 않음도 의미하는 것이다. 따라서, 본 발명의 대상은 나타내는 특성에 부가하여 추가 특성을 특징으로 할 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한, 화학식 I의 성분을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
식 중,
R1은 6 내지 20개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이며;
R2는 H 또는 누락되어서 O는 이중 결합을 통해 결합되는 것이고,
R3은 H 또는 아실기 -C(O)R5이고, 여기서 R5는 1 내지 10개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이고,
R4는 H 또는 포스페이트기이다.
제2 양태에서, 본 발명은 자가면역 질환을 겪는 대상체를 예방하거나 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 화학식 I의 성분을 제공한다
[화학식 I]
Figure pct00002
식 중,
R1은 6 내지 20개 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐기이며;
R2는 H 또는 누락되어서 O는 이중 결합을 통해 결합되는 것이고,
R3은 H 또는 아실기 -C(O)R5이고, 여기서 R5는 1 내지 10개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이고,
R4는 H 또는 포스페이트기이다.
상기의 하나의 실시형태에서, 본 발명은 화학식 I의 성분을 제공하며, 여기서 성분은 스핑가닌, 스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 3-케토-스핑가닌이고, 바람직하게는 화학식 I의 성분은 스핑가닌이다.
상기의 하나의 실시형태에서, 성분은 에리트로-형태, 바람직하게는 에리트로-스핑가닌, 에리트로-스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 에리트로-3-케토-스핑가닌이며, 보다 더 바람직하게는 성분은 D-에리트로-형태, 보다 더 바람직하게는 D-에리트로-스핑가닌, D-에리트로-스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 D-에리트로-3-케토-스핑가닌, 가장 바람직하게는 D-에리트로-스핑가닌이다.
상기의 하나의 실시형태에서, 성분은 제제와의 조합으로 사용된다. 바람직한 실시형태에서, 제제는 레티노산, 코팍손, 인슐린, CD3과 상호작용할 수 있는 분자, CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 전환 성장 인자 β(TGFβ), 인터류킨-2(IL-2), 단쇄 지방산, 담즙산, 다당류 A, n3 다중불포화 지방산, 레티노산, 비타민 D(VitD), 비타민 C(VitC), 폴리페놀, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 라파마이신 및/또는 자가반응성 단백질로부터의 펩티드 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 제제는 TGFβ 및/또는 IL-2이다.
제3 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시험관 내 조절 T 세포(Treg 세포)를 생성하는 방법을 제공한다:
1) 전구체 CD4+ T 세포를 제공하는 단계,
2) 본원에서 정의되는 화학식 I의 성분의 존재 하에 단계 1)에서 제공된 전구체 CD4+ T 세포를 배양하는 단계, 및 선택적으로
3) 생성된 조절 T 세포(Treg 세포)를 단리하는 단계.
상기의 하나의 실시형태에서, 본 발명은 조절 T 세포(Treg 세포)의 생성을 유도할 수 있는 추가 화합물의 존재 하에; 바람직하게는 CD3과 상호작용할 수 있는 분자, CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 전환 성장 인자 β(TGFβ), 인터류킨-2(IL-2), 단쇄 지방산, 담즙산, 다당류 A, n3 다중불포화 지방산, 레티노산, 비타민 D(VitD), 비타민 C(VitC), 폴리페놀, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 라파마이신 및/또는 자가반응성 단백질로부터의 펩티드 단편의 존재 하에; 보다 바람직하게는 TGFβ 및/또는 IL-2의 존재 하에; 보다 더 바람직하게는 (1) TGFβ 및/또는 IL-2; 및 (2) 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체; 및/또는 (3) 펩티드 단편의 존재 하에; 더욱 더 바람직하게는 TGFβ, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체의 존재 하에 또는 TGFβ 및 펩티드 단편의 존재 하에; 가장 바람직하게는 TGFβ, IL-2, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체의 존재 하에 또는 TGFβ, IL-2 및 펩티드 단편의 존재 하에, 전구체 CD4+ T 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 상기 방법을 제공한다.
상기의 하나의 실시형태에서, 전구체 CD4+ T 세포는 대상체로부터, 바람직하게는 비장, 림프절 또는 말초혈로부터 단리된 나이브 CD4+ T 세포이거나, 전구체 CD4+ T 세포는 대상체로부터 단리된, 바람직하게는 정맥내 혈액으로부터 단리된 비장세포 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC)이다.
상기의 하나의 실시형태에서, 전구체 CD4+ T 세포는 세포 표면 마커를 사용하는 유세포측정 정렬 또는 자기 세포 정렬을 사용하여 단리되며, 바람직하게는 이들 세포 표면 마커는 CD4+ 및 CD25+ 또는 CD25high이거나 CD4+ 및 CD25+ 또는 CD25high 및 CD127- 또는 CD127low이다.
상기의 하나의 실시형태에서, 대상체는 자가면역 질환을 겪는다.
상기의 하나의 실시형태에서, 단계 2)에서의 성분은 0.1 내지 20 μM의 최종 농도, 바람직하게는 1 내지 15 μM의 최종 농도, 보다 바람직하게는 3 내지 10 μM의 최종 농도, 가장 바람직하게는 5 내지 6.25 μM의 최종 농도로 첨가된다.
상기의 하나의 실시형태에서, 단계 2)에서의 전구체 CD4+ T 세포는 24 내지 144시간 동안, 바람직하게는 24시간 내지 120시간 동안, 보다 바람직하게는 48시간 내지 96시간 동안 배양된다.
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한, 바람직하게는 약제로 사용하기 위한, 보다 바람직하게는 자가면역-질환을 겪는 대상체를 예방하거나 치료하는 방법에서 사용하기 위한 조절 T 세포(Treg 세포)를 제공한다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 자가면역 질환은 자가면역 뇌염, 자가면역 뇌척수염, 류마티스 관절염, 1형 당뇨병, 건선, 자가면역 신장 질환, 전신 홍반성 루푸스, 셀리악병, 염증성 장 질환 또는 이식편-대-숙주병이며, 바람직하게는 자가면역 질환은 다발성 경화증이다.
제5 양태에서, 본 발명은 전환 성장 인자 베타(TGFβ) 및/또는 인터류킨-2(IL-2) 및 화학식 I의 성분, 및 선택적으로 조절 T 세포(Treg 세포)의 생성을 유도할 수 있는 추가 화합물, 바람직하게는 CD3과 상호작용할 수 있는 분자, CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 단쇄 지방산, 담즙산, 다당류 A, n3 다중불포화 지방산, 레티노산, 비타민 D(VitD), 비타민 C(VitC), 폴리페놀, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 라파마이신 및/또는 자가반응성 단백질로부터의 펩티드 단편을 포함하는 키트를 제공하며; 바람직하게는 키트는 (1) TGFβ 및/또는 IL-2; 및 (2) 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체; 및/또는 (3) 펩티드 단편을 포함하고; 보다 더 바람직하게는 키트는 TGFβ, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함하거나 키트는 TGFβ 및 펩티드 단편을 포함하고; 가장 바람직하게는 키트는 TGFβ, IL-2, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함하거나 키트는 TGFβ, IL-2 및 펩티드 단편을 포함한다.
본 발명은 이전 보고(Wu et al., 2019)의 추적 연구에서 수행된 예상치 못한 발견으로부터 생성된다. 공개된 보고에서, 단백질 SPTLC2(유전자 Sptlc2에 의해 인코딩됨)(Hanada et al., 2003)가 감염에 대한 보호 T 세포 반응을 위해 요구됨이 확인되었다. T 세포는 감염 및 암에 대해 보호하는 것으로 알려져 있으므로, SPTLC2가 또한 항-종양 T 세포 기능을 위해 요구된다고 가정하였다. 상기 가설을 시험하기 위해, Sptlc2 Flox/Flox 마우스(Xian-Cheng Jiang 교수(Upstate University, New York)에 의해 생성됨)를 Cd4-Cre 마우스(Jackson Laboratory에서 시판됨)와 번식시켜 Sptlc2 Flox/Flox Cd4-Cre 마우스를 생성하였다. 유전자 Sptlc2 및 Cd4는 각각 단백질 SPTLC2 및 CD4(CD4는 T 세포에 대한 마커 단백질임)를 인코딩한다. Sptlc2 Flox/Flox Cd4-Cre 마우스에서, 유전자 Sptlc2는 CD4 단백질-발현 T 세포에서 결함이 있었다. 실제로, T 세포에서 Sptlc2의 유전적 결핍은 항-종양 면역성을 손상시켰다(도 1a). 하나의 예상치 못한 관찰은 조절 T 세포(Treg 세포)로 불리는 T 세포의 하위세트가 SPTLC2 결핍에 의해 감소된다는 것이었다. Treg 세포는 B16 종양 성장을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Klages et al., 2010). 그러나, 증가된 종양 성장은 Sptlc2 Flox/Flox Cd4-Cre 마우스에서 Treg 세포의 감소와 연관되었다. 따라서, 데이터는 SPTLC2가 미세환경과 무관하게, Treg 세포 형성을 증강시켰다는 아이디어를 뒷받침한다. Treg 세포는 자가면역성의 억제에서 필수적이므로, SPTLC2의 저해는 자가면역 질환을 치료하기 위해 유용할 수 있다.
자가면역성을 치료하기 위한 SPTLC2의 저해 가능성을 탐색하기 위해, Foxp3Cre-YFP 마우스(Alexander Rudensky 교수(Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York)에 의해 생성됨; YFP = 황색 형광 단백질)와 Sptlc2 Flox/Flox 마우스를 교배함으로써 Sptlc2의 Treg 세포-특이적 결핍을 갖는 마우스 계통인 Sptlc2 Flox/Flox Foxp3Cre-YFP 마우스를 번식시켰다. 상기 계통에서, 유전자 Sptlc2는 Foxp3 단백질 발현-Treg 세포에서 결함이 있다. 시험관 내 배양 검정을 사용하여, SPTLC2가 Treg 세포의 면역억제성 기능을 위해 요구됨이 확인되었다(도 2). Treg 세포가 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 1형 당뇨병 및 이식편-대-숙주(GvH)병과 같은 자가면역 질환의 발생을 예방하기 위한 자가-관용성의 유지에서 매우 중요한 역할을 담당하므로, SPTLC2가 다발성 경화증을 위한 EAE 마우스 모델을 사용하여 자가면역성을 조절하는지가 결정되었다.
Sptlc2 Flox/Flox Foxp3Cre-YFP 마우스에서는 야생형 대조군 마우스에 비해 보다 중증 EAE가 발생하였다(도 3). 이들 결과는 본 발명자들로 하여금 스핑가닌과 같은 SPTLC2 하류의 대사 산물 보충이 Treg 세포 생성을 증강시키고 자가면역 질환을 완화하는 것으로 가정하도록 고무시켰다. SPTLC2 하류의 대사 경로를 도 4d에 나타낸다. 상기 가설을 시험하기 위해, 스핑가닌이 시험관 내 Treg 세포 생성 시스템 내 T 세포에 첨가되었다. 사이토카인 TGF-β는 보고된 바와 같이 Foxp3-발현 Treg 세포를 유도하였다(Chen et al., 2003). 스핑가닌은 Foxp3 단백질 발현을 추가 증가시켰다(도 4a). 반면에, 염증성 T 세포(인터류킨-17-생산 T 세포, 또는 Th17 세포로도 불림)-분화 조건 하에, 스핑가닌은 IL-17 생산을 감소시켰다. Th17 세포는 EAE 발생을 촉진하고 Treg 세포는 이를 길항하므로(Park et al., 2005; McGeachy et al., 2005), 스핑가닌이 EAE 증상을 완화하는지가 시험되었다. 스핑가닌으로의 EAE 마우스 처리는 EAE 임상 스코어를 감소시켰다(도 5). 종합적으로, 본 발명자들의 실험 결과는 1) 스핑가닌이 시험관 내 및 생체 내 모두 면역억제성 Treg 세포를 증가시켰고 염증성 Th17 세포를 감소시켰으며 2) 스핑가닌이 EAE 증상을 완화하였음을 제시한다. 따라서, 1) 염증을 억제하기 위해 Treg 세포를 생성하는 새로운 방법 및 2) 자가면역 질환을 치료하기 위한 소분자 성분이 확인되었다.
소분자 성분은 화학식 I의 성분이다:
[화학식 I]
Figure pct00003
식 중,
R1은 6 내지 20개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이며;
R2는 H 또는 누락되어서 O는 이중 결합을 통해 결합되는 것이고,
R3은 H 또는 아실기 -C(O)R5이고, 여기서 R5는 1 내지 10개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이고,
R4는 H 또는 포스페이트기이다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 나타낸 수의 탄소 원자를 함유하는, 직쇄 또는 분기쇄일 수 있는 포화 탄화수소쇄를 나타낸다. 화학식 I의 성분 중 알킬 라디칼은 라디칼 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실 및 에이코실 그리고 이의 여러 상이한 분기형 이성질체로부터 선택된다. 10 내지 16개 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 분기형 R1 알킬 라디칼이 특히 바람직하다.
용어 "알케닐"은 나타낸 수의 탄소 원자를 함유하는, 직쇄 또는 분기쇄일 수 있는 불포화 탄화수소쇄를 나타낸다. 알케닐기는 1, 2 또는 3개 불포화 결합을 가질 수 있다. 화학식 I의 성분 중 알케닐 라디칼은 라디칼 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 운데세닐, 도데세닐, 트리데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 옥타데세닐, 노나데세닐 및 에이코세닐 그리고 이의 여러 상이한 분기형 이성질체로부터 선택된다. 10 내지 16개 탄소 원자를 갖는 직쇄 및 분기형 R1 알케닐 라디칼이 특히 바람직하다.
알킬기 또는 알케닐기는 비치환되거나 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 할로알콕시, C1-6 알케닐, -OH, -NH2 및 -NH(CH3)로부터 독립적으로 선택되는 1 또는 2개로 치환될 수 있다.
용어 "할로알킬"은 하나 이상의 수소 원자가 할로에 의해 대체되는 알킬을 나타내며, 모든 수소가 할로에 의해 대체된 알킬 모이어티가 포함된다.
용어 "알콕시"는 -O-알킬 라디칼을 나타낸다.
용어 "할로알콕시"는 하나 이상의 수소 원자가 할로에 의해 대체되는 알콕시를 나타낸다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 라디칼을 나타낸다.
화학식 I의 가장 바람직한 성분은 화학식 C18H39NO2를 갖는 스핑가닌이며, 화학식 I 중 R1은 C13 알킬기이고, R2는 H이고, R3은 H이고 R4는 H이다.
"화학식 I의 성분"이란 하나 이상의, 예컨대 2 또는 3개의 화학식 I의 성분(들)으로 이해된다.
약제로 사용하기 위한, 바람직하게는 자가면역 질환을 겪는 대상체를 예방하거나 치료하는 방법에서 사용하기 위한 화학식 I의 성분이 본원에서 기재된다. 이에 따라, 화학식 I의 성분은 자가면역 질환의 완화에서 효과적인 Treg 세포의 생성을 증강시킴으로써 작용한다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 화학식 I의 성분은 또 다른 제제와의 조합으로 사용된다. "제제"란 일반적 면역-억제 활성을 갖는 임의의 성분, 예컨대 글루코코르티코이드, 예컨대 프레드니손, 덱사메타손 또는 하이드로코르티손, 세포증식억제제, 알킬화제, 예컨대 질소 머스타드(사이클로포스파미드), 니트로소우레아 또는 백금 화합물, 항대사물질, 예컨대 엽산 유사체, 예컨대 메토트렉세이트, 퓨린 유사체, 예컨대 아자티오프린 또는 메르캅토퓨린, 피리미딘 유사체, 예컨대 플루오로우라실, 또는 단백질 합성 저해제, 세포독성 항생제, 예컨대 닥티노마이신, 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신 또는 미트라마이신, 항체, 예컨대 모노클로날 항체, 예컨대 뮤로모납(Muromonab)-CD3, 이뮤노필린 상에 작용하는 약물, 예컨대 시클로스포린(Ciclosporin), 타크롤리무스(Tacrolimus), 시롤리무스(Sirolimus), 에버롤리무스(Everolimus), 인터페론, 예컨대 IFN-β, 오피오이드, 미코페놀레이트, 또는 소형 생물학적 제제, 예컨대 핑골리모드(Fingolimod) 또는 미리오신(Myriocin)이 포함되는, 자가면역 질환을 치료하기 위해 유용하거나 사용되거나 사용될 임의의 성분을 의미한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 제제는 바람직하게는 레티노산, 코팍손, 인슐린, CD3과 상호작용할 수 있는 분자, CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 전환 성장 인자 β(TGFβ), 인터류킨-2(IL-2), 단쇄 지방산, 담즙산, 다당류 A, n3 다중불포화 지방산, 레티노산, 비타민 D(VitD), 비타민 C(VitC), 폴리페놀, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 라파마이신 및/또는 자가반응성 단백질로부터의 펩티드 단편, 보다 바람직하게는 TGFβ 및/또는 IL-2로 구성되는 군으로부터 선택되는 면역-억제제이다.
또한, "제제"에는 주어진 자가면역 질환을 치료하기 위해 특이적으로 사용되거나 사용될 임의의 성분이 포함된다. MS의 경우 이러한 약물의 예는 테크피데라(Tecfidera), 길렌야(Gilenya), 오크레부스(Ocrevus), 코팍손(Copaxone), 아우바지오(Aubagio), 아보넥스(Avonex), 티사브리(Tysabri), 레비프(Rebif), 악타르(Acthar), 렘트라다(Lemtrada) 또는 현재 개발 중인 약물, 예컨대 우블리툭시맙(Ublituximab)과 같은 S1P 조절제, 티사브리, 렘트라다, 아르제라(Arzerra), l ABT-555 또는 젠맙(Genmab)"이다. 1형 당뇨병의 경우 이러한 성분의 예는 인슐린 또는 현재 개발 중인 약물, 예컨대 나트륨-글루코스 공동-수송체(SGLT) 저해제(진퀴스타(Zynquista), 수글라트(Suglat), 포르시가(Forxiga), 자르디안스(Jardiance)), 모노클로날 항체(예로 REMD-477, 페플리주맙), 세포 치료법(예로 VC-01, VC-02 CLBS-03 또는 DCVAC/Dia), 인터류킨 수용체 작용제 및 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체 작용제이다. 다른 자가면역 질환의 치료를 위한 제제의 예는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 또한, "제제"에는 또한 이러한 성분 또는 일반적으로 건강을 촉진하는 성분, 예컨대 비타민, 항산화제 등이 포함된다. 본 발명의 맥락에서, "제제"에 의해 또한 하나 이상의, 예컨대 2, 3 또는 4개의 제제(들)가 사용되고/되거나 조합될 수 있음이 이해된다.
또한, 본 발명은 시험관 내 Treg 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, "조절 T 세포" 또는 "Treg 세포"는 당분야에 알려진 바와 같이, 일반적 개념으로 이해된다. 특히, 본원에서 나타내는 조절 T-세포는 병원성 효과기 T 세포 반응 또는 요망되지 않는 효과기 T 세포 반응을 억제하는, 보다 구체적으로 자가항원에 대해 병원성 효과기 T 세포 반응을 억제하는, 보다 더 구체적으로 자가면역 질환에서 병원성 효과기 T-세포 반응을 억제하는, 가장 구체적으로 자가면역 질환을 완화하는 능력을 갖는 T 세포이다. 또한, 본원에서 나타내는 Treg 세포는 CD4+CD25+ T 세포, 바람직하게는 CD4+CD25high T 세포, 보다 바람직하게는 CD4+CD25+CD127- T 세포, 보다 더 바람직하게는 CD4+CD25highCD127low T 세포로서 특성규명될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 CD25+ 및 CD25high, 용어 CD127+ 및 CD127high, 용어 CD25- 및 CD25low 및 용어 CD127- 및 CD127low는 당분야에 알려진 바와 같은 정의와 함께 사용된다(Simonetta F. et al., 2013). 또한, 본원에서 나타내는 Treg 세포는 FOXP3 단백질의 발현을 특징으로 할 수 있다(Hori et al., 2003). 따라서, 더욱 더 바람직하게는, 본원에서 나타내는 Treg 세포는 CD4+CD25highCD127lowFOXP3+ T 세포이다.
또한, 본 발명의 방법에 따라 생성되는 Treg 세포는 바람직하게는 다량의 FOXP3 단백질의 생산을 특징으로 한다(Chen et al., 2003). 또한, 본 발명의 방법에 따라 생성되는 Treg 세포는 바람직하게는 고수준의, PD-1로도 알려진 프로그래밍된 세포사 단백질 1의 발현을 특징으로 한다. PD-1은 면역계를 하향-조절함으로써 세포에 대한 면역계의 반응 조절 및 T 세포 염증 활성을 억제함으로써 자가-관용성의 촉진에서 역할을 담당하는 세포 표면 상의 면역 체크포인트 단백질이다(Ishida et al., 1992). 이는 자가면역 질환을 예방한다. 결과적으로, 본 발명의 방법에 따라 생성되는 Treg 세포는 화학식 I의 성분으로 처리되지 않은 Treg 세포에 비해 더 높은 면역 억제 능력을 갖는다(Park et al., 2016).
본원에서 사용되는 용어 "전구체 CD4+ T 세포"란, Treg 세포, 바람직하게는 CD4+CD25highCD127low T 세포, 보다 바람직하게는 CD4+CD25highCD127lowFOXP3+ T 세포, 보다 더 바람직하게는 FOXP3 단백질의 고발현 및 PD-1 단백질의 고발현을 갖는 CD4+CD25highCD127lowFOXP3+ T 세포, 가장 바람직하게는 본 발명의 Treg 세포로 발생할 수 있는 임의의 CD4+ T 세포를 의미한다. 용어 "전구체 CD4+ T 세포"에는 비장, 림프절, 편도 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 미성숙 CD4+ 가슴샘세포로부터 단리된 나이브 CD4+ T 세포가 포함되는, 바람직하게는 대상체로부터 단리된, 비-Treg CD4+ T 세포가 포함된다.
"나이브 T 세포"는 전형적으로 가슴샘으로부터 유래되고 T 세포 수용체를 발현하는 림프구이다. 나이브 T 세포는 전형적으로 골수에서 기본 발생을 거치고 가슴샘에서 양성적 및 음성적 선택 과정을 추가로 거친다. 그러나, 나이브 T 세포는 말초에서 이의 인지체 항원에 직면하지 않았다. 본원에서 사용되는 용어 "분화" 또는 "분화하는"은 나이브 T 세포가 Treg 세포인, 분화된 T 세포로 추가 발생하도록 유도되는 과정을 나타낸다. 이는 분화된 T 세포가 Treg 세포 계통인, 특정한 분화된 T 세포 계통으로 확인 가능하도록 하는 특정 유전자 발현의 유도에 의해 달성된다. 나이브 CD4+ T 세포는 전형적으로 CD4의 발현을 특징으로 하며 CD25low 또는 CD25-이다(CD4+CD25low T 세포 또는 CD4+CD25- T 세포).
나이브 CD4+ T 세포의 제공은 당분야에 알려져 있고 임의의 방법에 의해 나이브 CD4+ T 세포의 단리를 허용하는 임의의 원천으로부터 수행될 수 있다. 나이브 CD4+ T 세포는 이들이 자연적으로 존재하는 신체 부분으로부터 단리될 수 있다. 따라서, Treg 세포는 가슴샘, 장간막 림프절을 포함하는 림프절, 비장 또는 말초혈로부터 단리될 수 있다. 나이브 CD4+ T 세포를 단리하는 방법은 당분야에 알려져 있다. 나이브 CD4+ T 세포를 단리하는 적합한 방법에는 형광 활성화 세포 정렬(FACS) 또는 자기 세포 정렬을 포함하는 유세포측정 정렬이 포함된다. 이에 따라, 선택 절차는 이전에 기재된 바와 같이(Berod et al., 2014), 나이브 CD4+ T 세포의 특성, 예로 CD4+, CD25-를 고려한다.
이어서 나이브 CD4+ T 세포가 사용되어 Treg 세포로 분화한다. 본 발명에 따르면, 분화는 화학식 I의 성분의 존재 하에 나이브 CD4+ T 세포를 배양함으로써 달성된다.
본 발명의 방법의 하나의 대안적인 실시형태에서, 림프절, 비장 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 단리되는 전구체 CD4+ T 세포가 제공된다. 상기 세포의 제공은 당분야에 알려져 있다(Goyvaerts et al., 2012; Blackley et al., 2007;
Figure pct00004
S. et al., 2018). 상기 세포는 체액 또는 신체 조직을 포함하는 대상체의 신체 부분으로부터 단리될 수 있다. 체액은, 예를 들어 혈액, 예컨대 말초혈, 바람직하게는 정맥내 혈액, 또는 전혈일 수 있다. 신체 조직은 비장, 비장 조직, 또는 편도일 수 있다. 단리된 전구체 CD4+ T 세포, 예컨대 나이브 CD4+ T 세포, PBMC 또는 비장세포는 화학식 I의 성분과 함께 배양된다. 배양은 적합한 배지 중에 수행된다. 적합한 배지는 본 발명의 방법에 따라 생성되는 Treg 세포의 생성을 허용하는 배지이다. 배지는 바람직하게는 액체 배지이며 생리적으로 허용 가능한 용액, 세포 배양 배지 또는 영양분 배지일 수 있다. 이는 알부민 및/또는 혈청 성분을 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 배지는 10% 우태 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 항생제 및 비-필수 아미노산이 보충된 RPMI 1640이다. 배지는 생체 내 존재하는 조건에 최대한 가깝게 하는 Treg 세포의 배양 과정의 경과를 허용하기 위해 및/또는 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포가 대상체 내로 주입될 수 있도록 하기 위해, 생리적으로 허용 가능할 수 있거나 생리적으로 허용 가능해야 한다.
배지는 일반적으로 Treg 세포의 생산을 유도할 수 있는 추가 화합물을 함유할 수 있다. "Treg 세포의 생산을 유도할 수 있는 추가 화합물" 또는 유사한 용어는 병원성 효과기 T 세포 반응 또는 요망되지 않는 효과기 T 세포 반응을 억제하는 능력을 갖는 것을, 바람직하게는 CD4+CD25high, 보다 바람직하게는 CD4+CD25highCD127low, 보다 더 바람직하게는 CD4+CD25highCD127lowFOXP3+를 특징으로 하는 Treg 세포의 생성을 촉진하기 위해 유용하거나 사용되는 것으로 알려져 있거나 개발될 임의의 화합물을 의미한다. 따라서, 배지는 추가 화합물로서 전구체 CD4+ T 세포로부터 Treg 세포의 생산을 유도할 수 있는 화합물, 예컨대 나이브 CD4+ T 세포, 비장세포 또는 PBMC의 Treg 세포로의 분화를 유도할 수 있는 화합물을 함유할 수 있다. 여기에는 CD3과 상호작용할 수 있는 분자, 바람직하게는 항-CD3 항체, CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 바람직하게는 항-CD28 항체, TGFβ, IL-2, 단쇄 지방산, 예로 C1-6 담즙산, 예로 이소알로 리토콜산(Hang et al., 2018), 다당류 A, n3 다중불포화 지방산, 예로 C18-22, 레티노산, VitD, VitC, 폴리페놀 EGCG(Wong et al., 2011), 퀘르세틴, 레스베라트롤, NSAIDS, 예로 아스피린(Javeed et al., 2009) 및/또는 라파마이신이 포함된다. "추가 화합물"이란 "하나 이상의, 예컨대 2, 3 또는 4개의 추가 화합물(들)"로 이해된다.
또한, 상기 나타낸 바와 같은 배지는 추가 화합물로서 자가반응성 단백질, 즉 그에 대해 대상체가 자가-면역 반응을 생성할 수 있는 대상체의 자가 단백질로부터의 펩티드 단편(본원에서 "펩티드 단편"으로도 명명됨)을 함유할 수 있다. 이에 따라, 펩티드 단편은 대상체의 효과기 T 세포가 유도되는 상기 단백질의 서열 또는 에피토프를 포함하거나 이로 구성된다. 따라서, 배지에 첨가될 단백질 및 결과적으로 이의 펩티드 단편은 대상체에서 치료받을 질환에 의존한다. 예를 들어, 1형 당뇨병을 갖는 대상체에서, 효과기 T 세포는 인슐린 특이적이다. 결과적으로, Treg 세포가 1형 당뇨병을 갖는 대상체에 투여되도록 생성되는 경우, 인슐린 펩티드가 배지에 첨가될 수 있다. 추가예는 MS에 대한 미엘린 염기성 단백질(MBP), MS에 대한 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG), MS에 대한 미엘린 연관 당단백질(MAG) 또는 MS에 대한 단백지질 단백질(PLP)이다. "펩티드 단편"이란 "하나 이상의, 예컨대 2, 3 또는 4개의, 펩티드 단편(들)"으로 이해된다.
바람직하게는, 화학식 I의 성분에 부가하여 배지는 TGFβ 및/또는 IL-2를 함유하며, 보다 바람직하게는 배지는 (1) TGFβ 및/또는 IL-2; (2) CD3과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD3 항체 및/또는 CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD28 항체; 및/또는 (3) 상기 정의된 바와 같은, 펩티드 단편을 함유한다. 보다 더 바람직하게는 배지는 (1) TGFβ 및/또는 IL-2; 및 (2) CD3과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD3 항체 및 CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD28 항체; 또는 (3) 상기 정의된 바와 같은, 펩티드 단편을 함유한다. 또한, 보다 더 바람직하게는 배지는 TGFβ, IL-2, CD3과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD3 항체 및 CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD28 항체를 함유하거나 배지는 TGFβ, IL-2 및 상기 정의된 바와 같은, 펩티드 단편을 함유한다. 더욱 더 바람직하게는, 배지는 TGFβ, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 함유하거나 배지는 TGFβ, 및 상기 정의된 바와 같은, 펩티드 단편을 함유한다. 가장 바람직하게는, 배지는 TGFβ, IL-2, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 함유하거나 배지는 TGFβ, IL-2 및 상기 정의된 바와 같은, 펩티드 단편을 함유한다.
본 발명의 Treg 세포를 생성하는 방식에 따라, 배지는 분화 방식으로 추가 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포로 분화될 나이브 CD4+ T 세포를 포함하는 배지는 바람직하게는, 화학식 I의 성분에 부가하여, TGFβ 및/또는 IL-2 및 선택적으로 CD3과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD3 항체 및/또는 CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD28 항체, 보다 바람직하게는 TGFβ, IL-2, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 함유한다. 비장세포 또는 PBMC를 포함하는 배지는 바람직하게는, 화학식 I의 성분에 부가하여, TGFβ 및/또는 IL-2 및 선택적으로 상기 정의된 바와 같은, 펩티드 단편, 및 선택적으로 CD3과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD3 항체 및/또는 CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 예컨대 항-CD28 항체, 보다 바람직하게는 TGFβ, IL-2, 상기 정의된 바와 같은, 펩티드 단편, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 함유한다.
배지는 또한 첨가제를 함유할 수 있고, 이는 세포 배양, 세포 치료법 및/또는 Treg 세포 배양에서 일반적이다. 이들의 예는 항생제, 아미노산 보충물, 비타민 보충물 및/또는 미량 원소 보충물이다.
배지 중 전구체 CD4+ T 세포의 농도는 전체 부피에 대해 적응되며 바람직하게는 ml 당 1 내지 5 × 106 세포이다.
배양 기간은 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는, 전구체 CD4+ T 세포는 선택적으로 상기 정의된 바와 같은 추가 화합물의 존재 하에, 24 내지 144시간 동안, 바람직하게는 24시간 내지 120시간 동안, 보다 바람직하게는 48시간 내지 96시간 동안 배양된다.
화학식 I의 성분이 배양의 시작부터 배양 단계에 첨가되는 것이 필요하지는 않다. 대신에, 이는 전구체 CD4+ T 세포가 상기 정의된 바와 같은 추가 화합물의 존재 하에 일정 시기 동안 배지 중에 이미 배양된 후, 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 전구체 CD4+ T 세포, 예컨대 나이브 CD4+ T 세포, 비장세포 또는 PBMC의 배양은 12 내지 72시간, 바람직하게는 24 내지 48시간의 시기 동안, TGF-β / IL-2 / CD3과 상호작용할 수 있는 분자 / CD28과 상호작용할 수 있는 분자 / 상기 정의된 바와 같은, 펩티드 단편의 존재 하에 일어날 수 있고, 이후, 화학식 I의 성분이 첨가되고 배양이 12 내지 72시간, 바람직하게는 24 내지 48의 또 다른 시기 동안, 모두 함께 24 내지 144시간, 바람직하게는 24시간 내지 120시간, 보다 바람직하게는 48시간 내지 96시간 동안 진행된다.
화학식 I의 성분은 0.1 내지 20 μM, 바람직하게는 1 내지 15 μM, 보다 바람직하게는 3 내지 10 μM, 가장 바람직하게는 5 내지 6.25 μM의 최종 농도로 배지에 첨가된다.
배양은 Treg 세포를 생성하기 적합한 온도, 바람직하게는 25 내지 37℃, 가장 바람직하게는 37℃에서 일어난다.
배양 후, 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포를 포함하는 배지는 필요에 따른 목적을 위해 그대로 사용될 수도 있고 이들은 단리될 수도, 이에 따라 다른 세포 또는 배지 성분을 배제하기 위해 정제될 수도 있다. 단리는 예를 들어 마커 CD4+CD25highCD127low로 세포를 FACS-정렬하기 위해, 당분야에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다(
Figure pct00005
S. et al., 2018).
본 발명에서는 화학식 I의 성분을 사용하는 본 발명의 방법에 의해 염증성 IL-17 생산 T 세포(Th17 세포)의 생산은 억제되면서 Treg 세포가 생성됨이 나타났다. Th17 세포 생산의 상기 억제는 또한 TGFβ의 존재 하에 수득되지만, TGFβ는 Th17 세포의 생산을 유도한다. 따라서, 화학식 I의 성분을 사용하는 장점은, 자가면역 반응을 완화할 수 있는 고도 억제성 Treg 세포의 생산에 부가하여, 소량의 Th17 세포의 생산에 있다. 결과적으로, 대상체에 대상체에 대한 화학식 I의 성분의 투여에 의해, 화학식 I의 성분의 비-사용 대비 Th17 세포의 생산이 감소되어, Th17 세포로 인한 염증성 반응의 부재 또는 감소를 초래한다. 대상체에 대한 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포의 투여에 의해, 배지 중 Th17 세포 불순물이 적으며, 또한 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포가 투여되는 대상체에서 Th17 세포로 인한 염증성 반응의 부재 또는 감소를 초래한다. 본 발명의 방법에서, Th17 세포의 생산은 화학식 I의 성분의 비-사용 대비 화학식 I의 성분의 존재 하에 크게 감소된다. 따라서, 화학식 I의 성분의 존재 하에 본 발명의 방법의 단계 2)에서 수득된 배양 배지 중 존재하는 전체 Foxp3 발현 CD4+ 세포(예컨대 CD4+CD25highCD127lowFOXP3+)의 1 내지 20%, 바람직하게는 2 내지 15%, 보다 바람직하게는 4 내지 10%, 보다 더 바람직하게는 5 내지 8%, 가장 바람직하게는 약 6.1%가 Th17 세포이다. 이에 따라, 용어 "약"은 나타낸 수치의 ±0.5 내지 10%, 예컨대 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%를 의미한다.
본 발명의 방법에서, Foxp3 발현 CD4+ 세포의 생산은 화학식 I의 성분의 비-사용 대비 화학식 I의 성분의 존재 하에 증강된다. 따라서, 화학식 I의 성분의 존재 하에 본 발명의 방법의 단계 2)에서 수득된 배양 배지 중 존재하는 전체 CD4+ 세포의 31 내지 90%, 바람직하게는 40 내지 86%, 보다 바람직하게는 50 내지 80%, 보다 더 바람직하게는 60 내지 75%, 가장 바람직하게는 약 72% 또는 85.4%는 Foxp3 발현 CD4+ 세포(예컨대 CD4+CD25highCD127lowFOXP3+)이다. 이에 따라, 용어 "약"은 나타낸 수치의 ±0.5 내지 10%, 예컨대 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%를 의미한다.
자가면역 질환은 신체의 정상 부분에 대한 비정상적 면역 반응으로 발생하는 병태이다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 자가면역 질환은 자가면역 뇌염, 자가면역 뇌척수염, 류마티스 관절염, 1형 당뇨병, 건선, 자가면역 신장 질환, 전신 홍반성 루푸스, 셀리악병, 염증성 장 질환, 또는 이식편-대-숙주병이며, 바람직하게는 자가면역 질환은 다발성 경화증이다.
본 발명은 화학식 I의 성분 및 요망되는 특징을 제공하는, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 선택적으로 상기 정의된 바와 같은 제제를 추가로 포함하는 약제를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포 및 요망되는 특징을 제공하는, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 선택적으로 상기 정의된 바와 같은 제제를 추가로 포함하는 약제를 제공한다. 또한, 본 발명은 화학식 I의 성분, 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하며, 선택적으로 상기 정의된 바와 같은 제제를 추가로 포함하는 약제를 제공한다. 약제의 생산을 위해, 화학식 I의 성분 및/또는 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포 및 선택적으로 제제는 하나의(하나 이상의) 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약학 투여형으로 조합되어야 한다.
약제는 전신, 비강, 비경구, 질, 국소, 직장 또는 경구 투여를 포함하는, 대상체에 약제를 투여하기 적합한 임의의 종류의 투여 방식을 위해 제조될 수 있다. 비경구 투여에는 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 복강내 투여가 포함된다.
약제는 경구 투여를 위한 고체 투여형, 예컨대 캡슐, 정제, 알약, 분말, 과립, 경구 투여를 위한 액체 투여형, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭서, 주사 조제물, 예를 들어 멸균 주사 수성 또는 유성 현탁액, 직장 또는 질 투여를 위한 조성물, 바람직하게는 좌약, 및 피부 또는 경피 투여를 위한 투여형, 예컨대 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치를 포함하는 다양한 투여형으로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포는 액체 투여형으로, 보다 바람직하게는 주사 조제물로 제형화된다.
임의의 특정 대상체에 대한 구체적 치료 유효 용량 수준은 화학식 I의 성분 및/또는 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포의 활성, 투여형, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 치료 지속기간 및 의학 분야에 알려진 다른 요인을 포함하는 다양한 요인에 의존할 것이다.
총 8회 적용 동안 2일마다 대상체에 투여되는 화학식 I의 성분의 총 용량은 1000 μg/kg 체중일 수 있다. 단회 또는 다회 용량으로 대상체에 투여되는 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포의 총 용량은, 예를 들어 이전에 보고된 바와 같이 1회 주입으로, 환자 당 5 × 106 ~ 2.6 × 109의 양일 수 있다(Bluestone et al., 2015). 단회 용량 조성물은 이러한 양 또는 1일 용량을 채우기 위한 이의 하위 분할량을 함유할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 포유류, 예컨대 영장류, 설치류, 고양이과, 개과, 또는 가축 농장 동물이다. 바람직하게는, 대상체는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 소, 말, 염소 또는 양이다.
본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포는 자가면역 질환을 갖는 대상체에 투여될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포는 자가 전구체 CD4+ T 세포로부터, 예컨대 자가 나이브 CD4+ T 세포 또는 자가 PBMC로부터, 즉 자가면역 질환을 예방하거나 치료하기 위해 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포가 재도입되는 동일한 대상체인 공여체로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포는 동종이형 또는 이종이형 전구체 CD4+ T 세포로부터, 예컨대 동종이형 또는 이종이형 나이브 CD4+ T 세포 또는 동종이형 또는 이종이형 비장세포 또는 PBMC로부터, 즉 본 발명의 방법에 따라 생성된 Treg 세포가 도입되는 대상체와 상이한(동일하거나 상이한 종인) 공여체로부터 생성될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 공여체는 건강한 공여체일 수 있다, 즉 공여체는 자가면역 질환을 갖지 않는다. 대안적으로, 공여체는 자가면역 질환을 가질 수 있다. 전구체 CD4+ T 세포가 본 발명의 방법에 의해 치료받은 후, 이들이 단리된 동일한 대상체 내로 재도입되는 자가 세포인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 대상체에 자가면역 질환을 치료하거나 예방하기 충분한 양으로 화학식 I의 성분을 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 대상체에 자가면역 질환을 치료하거나 예방하기 충분한 양으로 본 발명에 따라 생성된 Treg 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 자가면역 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 하기 단계를 포함한다:
1) 전구체 CD4+ T 세포를 제공하는 단계,
2) 화학식 I의 성분의 존재 하에 단계 1)에서 제공된 전구체 CD4+ T 세포를 배양하는 단계,
3) 선택적으로 생성된 조절 T 세포(Treg 세포)를 단리하는 단계, 및
(4) 이렇게 생성된 조절 T 세포(Treg 세포)를 자가면역 질환을 치료하거나 예방하기 충분한 양으로 대상체 내로 복귀시키는 단계.
복귀는 대상체 내로 Treg 세포를 도입하기 적합한 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 특히 바람직한 복귀 방식은 정맥내 적용, 동맥내 적용, 체강내 적용, 척수내 적용 또는 피내 적용이다. 정맥내 적용은 이것이 말초 시스템 내로의, 그리고 이에 따라 Treg 세포가 자연적으로 작용하는 혈액 순환 내로의 직접 도입을 가능하게 하므로 바람직하다.
도 1. T 세포에서의 Sptlc2 결핍이 종양 성장을 증가시켰으나 Treg 세포 형성을 감소시켰다. Sptlc2 Flox/Flox Cd4-Cre(Fl/Fl, 8마리 마우스) 및 Sptlc2 +/+ Cd4-Cre(+/+, 11마리 마우스) 마우스에 2 × 105 흑색종 B16 세포를 피하 임플란트하였다. 종양 크기를 캘리퍼로 측정하고 길이 × 폭 × 폭 / 2로 계산하였다. 선 그래프는 경시적인 종양 성장을 나타낸다(a). 종양을 70 μM 세포 여과기를 통해 부수어 단세포 현탁액을 제조하고, 회전 침강시키고 40% 퍼콜 중에 재현탁하였다. 종양 세포 및 종양-침윤 세포를 함유하는 40% 퍼콜을 80% 퍼콜 상으로 로딩하고 15분 동안 2000 rpm에서 회전시켰다. 종양-침윤 림프구는 원심분리 후 40% 및 80% 퍼콜 사이 중간층에서 확인되었으며 FACS 염색 및 세포 계수를 위해 수집하였다. 막대 그래프는 종양 중량으로 나눈 Treg 세포수로 계산한, 종양 내 FOXP3 단백질-발현 Treg 세포의 밀도를 나타낸다(b). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하며 3회(a) 및 2회(b) 독립 실험의 누적이다. *, p<0.05, 스튜던트(Student's) t-테스트.
도 2. Treg 세포에서의 Sptlc2 결핍이 Treg 세포의 면역억제 기능에 영향을 미쳤다. YFP-양성 CD4+ Treg 세포 및 YFP-음성 CD4+ 비-Treg 세포를 FACS-정렬하였다. 2 × 104 비-Treg 세포를 T 세포 자극 항-CD3 및 항-CD28-코팅 마이크로비드(세포 배양 당 4 × 104 마이크로비드); 16 ng/ml 항-CD3 및 16 ng/ml 항-CD28의 존재 하에 250 μl 완전 배지 중에 배양하였다. 비-Treg 세포를 나타낸 비로 Treg 세포와 공동-배양하였다(예로 "8:1"은 2 × 104 비-Treg 세포 + 2.5 × 103 Treg 세포를 의미함). 선 그래프는 비-Treg:Treg 세포에 걸친 억제%를 나타낸다. 데이터는 3회 독립 실험의 누적이다. 결과는 평균±SEM으로 표시한다. *, p<0.05, 스튜던트 t-테스트.
도 3. Treg 세포에서의 Sptlc2 결핍이 EAE 마우스 모델에서 자가면역성을 증강시켰다. 선 그래프는 EAE 유도 후 일수에 걸친 EAE 임상 스코어를 나타낸다. 5쌍의 마우스를 사용하였다. 결과는 평균±SEM으로 표시한다. *, p<0.05, 스튜던트 t-테스트.
도 4. 스핑가닌이 시험관 내 Treg 세포 생성을 촉진하였고 염증성 Th17 세포 형성을 억제하였다. YFP-음성 CD4+ 비-Treg 나이브 T 세포를 Foxp3Cre-YFP 마우스로부터 FACS-정렬하였다(250 μl 완전 배지 중 1 × 105 세포). 나이브 T 세포를 Treg 세포에 대해서는 사이토카인 TGFβ(5 ng/ml) 및 IL-2(10 ng/ml) 또한 Th17 세포에 대해서는 TGFβ(5 ng/ml), IL-6(20 ng/ml) 및 항-IFNγ(10 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에, 3일 동안 항-CD3 및 항-CD28로 활성화하였다. a: 사이토카인 TGFβ(5 ng/ml) 또는 비히클 대조군 DMSO(TGFβ 없음)의 존재 하에 스핑가닌(5 μM)으로의 Treg 세포 형성의 유도 후 Foxp3 단백질 발현의 유세포측정 분석. b: 스핑가닌(5 μM)의 존재 또는 부재 하에 TGFβ(5 ng/ml), IL-6(20 ng/ml) 및 항-IFNγ(10 μg/ml)로의 Th17 세포 형성의 유도 후 IL-17 단백질 발현의 유세포측정 분석. c: TGFβ(5 ng/ml) 및 L-세린(5 μM), 3-KDS(5 μM), 신가닌(5 μM), 디하이드로세라마이드(50 nM), 세라마이드(50 nM), 스핑고신(1 μM), 스핑고신-1-포스페이트(1 μM), 신가닌-1-포스페이트(1 μM), 또는 비히클 대조군 DMSO(TGFβ만)의 존재 하에 Treg 세포 형성의 유도 후 Foxp3 단백질 발현의 유세포측정 분석. d: 나타낸 바와 같은, 스핑고지질의 구조, 및 스핑고지질 생합성 경로가 도시된다. 각각의 FACS 그래프에서의 수치는 FACS 그래프에 나타낸 전체 세포 집단 내 나타낸 세포 집단의 백분율을 나타낸다.
도 5. 스핑가닌 처리가 EAE 발생을 완화하였다. 선 그래프는 EAE 유도 후 일수에 걸친 EAE 임상 스코어를 나타낸다. 결과를 평균 ± SEM으로 표시한다. *, p<0.05, **, p<0.01, 스튜던트 t-테스트.
[실시예]
방법
마우스. C57BL/6 배경의 Sptlc2 Fl/Fl 및 Foxp3 Cre 마우스는 각각 Xian-cheng Jiang 교수(SUNY Downstate Medical Center, New York) 및 Alexander Rudensky 교수(Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York)로부터 제공받았다. C57BL/6 배경의 Cd4 Cre 마우스는 Jackson Laboratory로부터 구입하였다. 모든 마우스를 DKFZ 특수 병원체-비함유 시설에서 유지하였다. 연령- 및 성별-매칭된 한배새끼(5~10주령)를 모든 실험에서 대조군 마우스로 사용하였다. 모든 연구는
Figure pct00006
의 독일 지역 위원회에서 승인받은 후 DKFZ 규정에 따라 수행하였다.
B16 흑색종 임플란트 및 종양-침윤 면역 세포 제조. B16-F10 흑색종 세포를 Sptlc2 Flox/Flox Cd4-Cre, Sptlc2 +/+ Cd4-Cre, Sptlc2 Flox/Flox Foxp3-Cre-YFP 및 Sptlc2 +/+ Foxp3-Cre-YFP 마우스에 피하 주사하였다(마우스 당 2 × 105 세포). 종양을 캘리퍼를 사용해서 2~3일마다 측정하였다. 마우스를 나타낸 시점에 희생시키고 종양을 핀셋 및 가위로 수확하였다. 종양을 70-μm 세포 여과기를 통해 부수어 단세포 재현탁액을 생성하였다. 종양 세포를 원심분리하고 40% 퍼콜 중에 재현탁하고 구배 원심분리를 위해 80% 퍼콜에 로딩하였다. 면역 세포는 원심분리 후 40% 및 80% 퍼콜 사이 중간층에서 확인되었다. 이어서 면역 세포를 유세포측정 염색을 위해 새로운 튜브로 흡입해냈다.
EAE 유도 및 모니터링. 각각의 마우스를 프로인트 완전 아주반트 중에 유화된 200 μg MOG35-55 펩티드로 피하 면역접종하였다. 백일해 독소(마우스 당 400 ng)를 복강내 주사하였다. 나타낸 경우, 마우스에 스핑가닌을 복강내 주사하였다(면역접종일부터 실험 종료 시까지 2일마다). EAE 증상을 하기 스코어링 표준을 사용하여 매일 스코어링하였다: 0, 징후 없음; 1, 늘어진 꼬리; 2, 대부전 마비(1 또는 2개 뒷다리의 불완전 마비); 3, 대마비(2개 뒷다리의 완전 마비); 4, 앞다리 쇠약 또는 마비를 포함하는 대마비; 5, 빈사 상태 또는 사망. 마우스 복지 이유로, 본 발명자들은 스코어가 3에 도달하면 마우스를 희생시켰다.
마우스 일차 T 세포 배양. 완전 배지를 세포 배양을 위해 사용하였고 RPMI 1640 기본 배지를 10% 우태 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 항생제 및 비-필수 아미노산으로 보충하여 제조하였다. Treg 및 Th17 세포 시험관 내 분화를 위해, 나이브 비장 T 세포를 유세포측정 정렬장치를 사용하여 Sptlc2 +/+ Foxp3Cre-YFP 야생형 마우스로부터 정제하였다. Foxp3은 세포 핵에서 발현되며 FOXP3 단백질의 FACS 염색은 세포 고정 및 투과화를 필요로 하고, 이는 세포를 죽이며 후속 세포 배양에 적합하지 않다. 상기 Foxp3Cre-YFP 마우스 계통에서, FOXP3 단백질 발현은 YFP 단백질 발현에 의해 보고된다. FOXP3-발현 세포는 세포 고정 및 투과화 없이 직접 FACS-정렬될 수 없고 따라서 세포 생존성을 보존할 수 없었다. YFP-양성 CD4+ Treg 세포 및 YFP-음성 CD4+ 비-Treg 세포를 FACS-정렬하였다. 나이브 CD4+ T 세포(250 μl 배지 중 1 × 105 세포)를 Treg 세포에 대해서는 사이토카인 TGFβ(5 ng/ml) 및 IL-2(10 ng/ml) 또한 Th17 세포에 대해서는 TGFβ(5 ng/ml), IL-6(20 ng/ml) 및 항-IFNγ(10 μg/ml)의 존재 또는 부재 하에, 3일 동안 T 세포 자극 항-CD3 및 항-CD28로 활성화하였다. 스핑가닌 또는 다른 스핑고지질을 나타낸 바와 같이 첨가하였다(1 또는 5 μM). Foxp3 및 인터류킨-17(IL-17) 단백질 발현을 유세포측정 검정에 의해 조사하였다.
유세포측정. FACS 완충액(0.5% FCS를 포함하는 PBS)을 사용하여 세포 표면 항원을 염색하였다. 세포내 항원을 염색하기 위해, 세포를 Biolegend 고정 완충액(사이토카인에 대해) 또는 eBioscience 고정/투과화 완충액(전사 인자에 대해)으로 고정하였다. 죽은 세포는 LIVE/DEAD 고정형 죽은 세포 염색(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 배제하였다. Treg 세포 공동-배양 억제 검정을 위해, 반응체 세포를 Celltrace Violet(37℃, 20분)으로 표지하고 1% FBS 함유 RPMI 1640 배지로 3회 세척하였다. 샘플을 LSR II에 걸고 Flowjo 소프트웨어(FlowJo, LLC, BD)를 사용하여 분석하였다.
항체 및 사이토카인. 항체는 유세포측정을 사용하여 하기 항체를 검출하기 위해 Biolegend, eBioscience 및 BD Biosciences에서 주문하였다: CD4(GK1.5), IL-17(TC11-18H10.1), 및 Foxp3(FJK-16s). 항-CD3(17A2) 및 항-CD28(37.51)을 세포 배양을 위해 사용하였다.
실시예 1
T 세포에서의 Sptlc2 결핍이 종양 성장을 증가시켰으나 Treg 세포 형성을 감소시켰다. Sptlc2 Flox/Flox Cd4-Cre(Fl/Fl, 8마리 마우스) 및 Sptlc2 +/+ Cd4-Cre(+/+, 11마리 마우스) 마우스에 2 × 105 흑색종 B16 세포를 임플란트하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 본 발명자들은 T 세포에서의 Sptlc2의 유전적 결핍이 항-종양 면역성을 손상시킴을 관찰하였고(도 1a) 본 발명자들은 추가로 조절 T 세포(Treg 세포)로 불리는, T 세포의 하위세트가 SPTLC2 결핍에 의해 감소됨을 관찰하였다(도 1b).
실시예 2
Treg 세포에서의 Sptlc2 결핍이 Treg 세포에서 면역억제 기능에 영향을 미쳤다. 본 발명자들은 유세포측정 정렬장치를 사용하여 Sptlc2 Flox/Flox Foxp3Cre-YFP 마우스 또는 Sptlc2 +/+ Foxp3Cre-YFP 마우스로부터 Treg 및 비-Treg 세포를 정제하였다. Foxp3은 세포 핵에서 발현되며 FOXP3 단백질의 FACS 염색은 세포 고정 및 투과화를 필요로 하고, 이는 세포를 죽이며 후속 세포 배양에 적합하지 않다. 상기 Foxp3Cre-YFP 마우스 계통에서, FOXP3 단백질 발현은 YFP 단백질 발현에 의해 보고된다. 본 발명자들은 세포 고정 및 투과화 없이 FOXP3 발현 세포를 직접 FACS-정렬할 수 없었고 따라서 세포 생존성을 보존할 수 없었다. YFP-양성 CD4+ Treg 세포 및 YFP-음성 CD4+ 비-Treg 세포를 FACS-정렬하였다. 비-Treg 세포를 형광 염료 Celltrace Violet(CTV, 세포 증식을 결정하기 위해)으로 표지하고 T 세포 자극 항-CD3 및 항-CD28의 존재 하에 3일 동안 Sptlc2-결핍 또는 -충분 Treg 세포를 포함하고 또는 이를 포함하지 않고 공동-배양하였다. 억제%는 [(Treg 세포를 포함하지 않은 T 세포 증식율 - Treg 세포를 포함하는 T 세포 증식율)/Treg 세포를 포함하지 않은 T 세포 증식율%]로 계산하였다. 본 발명자들은 SPTLC2가 Treg 세포의 면역억제 기능을 위해 요구됨을 확인하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.
실시예 3
Treg 세포에서의 Sptlc2 결핍이 EAE 마우스 모델에서의 자가면역성을 증강시켰다. EAE를 Sptlc2 Flox/Flox Foxp3Cre-YFP 마우스 또는 Sptlc2 +/+ Foxp3Cre-YFP 마우스에서 유도하였다. 간략하게, 각각의 마우스에 프로인트 완전 아주반트 중에 유화된 200 μg MOG35-55 펩티드를 피하 면역접종하였다. 백일해 독소(마우스 당 400 ng)를 복강내 주사하였다. EAE 증상을 2일마다 스코어링하였다. Sptlc2 Flox/Flox Foxp3Cre-YFP 마우스에서는 야생형 대조군 마우스보다 더 중증 EAE가 발생하였다. 결과를 도 3에 나타낸다.
실시예 4
스핑가닌이 시험관 내 Treg 세포 생성을 촉진하였고 염증성 Th17 세포 형성을 억제하였다. 나이브 비장 T 세포를 유세포측정 정렬장치를 사용하여 Sptlc2 +/+ Foxp3Cre-YFP 야생형 마우스로부터 정제하였다. 나이브 CD4+ T 세포를 사이토카인 TGF-β(도 4a, Treg 세포 형성을 유도하기 위해) 또는 TGF-β + 인터류킨-6(IL-6)(도 4b, Th17 세포 형성을 유도하기 위해)의 존재 또는 부재 하에, 3일 동안 T 세포 자극 항-CD3 및 항-CD28 및 IL-2로 활성화하였다. 스핑가닌(5 μM) 또는 비히클 대조군 DMSO를 첨가하였다. Foxp3 및 인터류킨-17(IL-17) 단백질 발현을 유세포측정 검정에 의해 조사하였다. 대안적으로, 나이브 CD4+ T 세포를 Foxp3 단백질 발현의 유세포측정 분석 전에 스핑가닌 또는 다른 스핑고지질 또는 비히클 대조군의 존재 하에 Treg 세포-유도 조건(도 4a에서와 동일함) 하에 배양하였다(도 4c). 구조 및 스핑고지질 생합성 경로를 도시한다(도 4d). 사이토카인 TGF-β는 보고된 바와 같이 Foxp3-발현 Treg 세포를 유도하였다(Chen et al., 2003). 스핑가닌 또는 다른 스핑고지질이 Foxp3 단백질 발현을 증가시키고, Treg 세포 형성을 유도하고 IL-17 단백질 발현을 감소시킴이 확인되었다.
실시예 5
스핑가닌 처리가 EAE 발생을 완화하였다. C57BL/6 마우스에 프로인트 완전 아주반트 중에 유화된 200 μg MOG35-55 펩티드를 피하 면역접종하여 EAE 발생을 유도하였다. 백일해 독소(마우스 당 400 ng)를 복강내 주사하였다. 마우스에 스핑가닌을 복강내 주사하였다(1000 μg/kg 체중, 1일부터 15일까지 2일마다 1회 주사). EAE 증상을 매일 스코어링하였다. 결과를 도 5에 나타낸다.
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Claims (17)

  1. 약제로 사용하기 위한, 화학식 I의 성분:
    [화학식 I]
    Figure pct00008

    (식 중,
    R1은 6 내지 20개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이며;
    R2는 H 또는 누락되어서 O는 이중 결합을 통해 결합되는 것이고,
    R3은 H 또는 아실기 -C(O)R5이고, 여기서 R5는 1 내지 10개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알킬렌기이고,
    R4는 H 또는 포스페이트기임).
  2. 자가면역 질환을 겪는 대상체를 예방하거나 치료하는 방법에 사용하기 위한, 화학식 I의 성분:
    [화학식 I]
    Figure pct00009

    (식 중,
    R1은 6 내지 20개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이며;
    R2는 H 또는 누락되어서 O는 이중 결합을 통해 결합되는 것이고,
    R3은 H 또는 아실기 -C(O)R5이고, 여기서 R5는 1 내지 10개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알킬렌기이고,
    R4는 H 또는 포스페이트기임).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 성분은 스핑가닌, 스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 3-케토-스핑가닌이며, 바람직하게 상기 성분은 스핑가닌인, 성분.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 성분은 에리트로-형태, 바람직하게는 에리트로-스핑가닌, 에리트로-스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 에리트로-3-케토-스핑가닌이며, 보다 더 바람직하게 상기 성분은 D-에리트로-형태, 보다 더 바람직하게는 D-에리트로-스핑가닌, D-에리트로-스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 D-에리트로-3-케토-스핑가닌, 가장 바람직하게는 D-에리트로-스핑가닌인, 성분.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 성분은 바람직하게는 레티노산, 코팍손, 인슐린, CD3과 상호작용할 수 있는 분자, CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 전환 성장 인자 β(TGFβ), 인터류킨-2(IL-2), 단쇄 지방산, 담즙산, 다당류 A, n3 다중불포화 지방산, 레티노산, 비타민 D(VitD), 비타민 C(VitC), 폴리페놀, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 라파마이신 및/또는 자가반응성 단백질로부터의 펩티드 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 보다 바람직하게는 전환 성장 인자 β(TGFβ) 및/또는 인터류킨-2(IL-2)으로부터 선택되는 제제와의 조합으로 사용되는, 성분.
  6. 하기 단계를 포함하는, 시험관 내 조절 T 세포(Treg 세포)를 생성하는 방법:
    1) 전구체 CD4+ T 세포를 제공하는 단계,
    2) 화학식 I의 성분의 존재 하에 단계 1)에서 제공된 상기 전구체 CD4+ T 세포를 배양하는 단계:
    [화학식 I]
    Figure pct00010

    (식 중,
    R1은 6 내지 20개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알케닐기이며;
    R2는 H 또는 누락되어서 O는 이중 결합을 통해 결합되는 것이고,
    R3은 H 또는 아실기 -C(O)R5이고, 여기서 R5는 1 내지 10개 탄소 원자를 갖는 알킬기 또는 알킬렌기이고,
    R4는 H 또는 포스페이트기임), 및 선택적으로
    3) 생성된 조절 T 세포(Treg 세포)를 단리하는 단계.
  7. 제6항에 있어서,
    화학식 I의 상기 성분은 스핑가닌, 스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 3-케토-스핑가닌이며, 바람직하게 상기 성분은 스핑가닌인, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    화학식 I의 상기 성분은 에리트로-형태, 바람직하게는 에리트로-스핑가닌, 에리트로-스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 에리트로-3-케토-스핑가닌이며, 보다 바람직하게 상기 성분은 D-에리트로-형태, 보다 더 바람직하게는 D-에리트로-스핑가닌, D-에리트로-스핑가닌-1-포스페이트 및/또는 D-에리트로-3-케토-스핑가닌, 가장 바람직하게는 D-에리트로-스핑가닌인, 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 T 세포(Treg 세포)의 생성을 유도할 수 있는 추가 화합물의 존재 하에;
    바람직하게는 CD3과 상호작용할 수 있는 분자, CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 전환 성장 인자 β(TGFβ), 인터류킨-2(IL-2), 단쇄 지방산, 담즙산, 다당류 A, n3 다중불포화 지방산, 레티노산, 비타민 D(VitD), 비타민 C(VitC), 폴리페놀, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 라파마이신 및/또는 자가반응성 단백질로부터의 펩티드 단편의 존재 하에;
    보다 바람직하게는 TGFβ 및/또는 IL-2의 존재 하에;
    보다 더 바람직하게는 (1) TGFβ 및/또는 IL-2; 및 (2) 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체; 및/또는 (3) 펩티드 단편의 존재 하에;
    더욱 더 바람직하게는 TGFβ, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체의 존재 하에 또는 TGFβ 및 펩티드 단편의 존재 하에;
    가장 바람직하게는 TGFβ, IL-2, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체의 존재 하에 또는 TGFβ, IL-2 및 펩티드 단편의 존재 하에,
    전구체 CD4+ T 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전구체 CD4+ T 세포는 대상체로부터, 바람직하게는 비장, 림프절 또는 말초혈로부터 단리된 나이브 CD4+ T 세포이거나, 상기 전구체 CD4+ T 세포는 대상체로부터 단리된, 바람직하게는 정맥내 혈액으로부터 단리된 비장세포 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC)인, 방법.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전구체 CD4+ T 세포는 세포 표면 마커를 사용하는 유세포측정 정렬 또는 자기 세포 정렬을 사용하여 단리되며, 바람직하게 이들 세포 표면 마커는 CD4+ 및 CD25+ 또는 CD25high이거나, CD4+ 및 CD25+ 또는 CD25high 및 CD127- 또는 CD127low인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 대상체는 자가면역 질환을 겪는, 방법.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 2)에서의 상기 성분은 0.1 내지 20 μM의 최종 농도로, 바람직하게는 1 내지 15 μM의 최종 농도로, 보다 바람직하게는 3 내지 10 μM의 최종 농도로, 가장 바람직하게는 5 내지 6.25 μM의 최종 농도로 첨가되는, 방법.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 2)에서의 상기 전구체 CD4+ T 세포는 24 내지 144시간 동안, 바람직하게는 24시간 내지 120시간 동안, 보다 바람직하게는 48시간 내지 96시간 동안 배양되는, 방법.
  15. 바람직하게는 약제로 사용하기 위한, 보다 바람직하게는 자가면역-질환을 겪는 대상체를 예방하거나 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득 가능한 조절 T 세포(Treg 세포).
  16. 제2항 내지 제5항, 제12항 내지 제14항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 자가면역 질환은 자가면역 뇌염, 자가면역 뇌척수염, 류마티스 관절염, 1형 당뇨병, 건선, 자가면역 신장 질환, 전신 홍반성 루푸스, 셀리악병, 염증성 장 질환 또는 이식편-대-숙주병이며, 바람직하게는 자가면역 질환이 다발성 경화증인, 성분, 방법, 또는 조절 T 세포(Treg 세포).
  17. 전환 성장 인자 베타(TGFβ) 및/또는 인터류킨-2(IL-2), 및
    제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 정의되는 상기 성분, 및 선택적으로
    조절 T 세포(Treg 세포)의 생성을 유도할 수 있는 추가 화합물, 바람직하게 CD3과 상호작용할 수 있는 분자, CD28과 상호작용할 수 있는 분자, 단쇄 지방산, 담즙산, 다당류 A, n3 다중불포화 지방산, 레티노산, 비타민 D(VitD), 비타민 C(VitC), 폴리페놀, 퀘르세틴, 레스베라트롤, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID), 라파마이신 및/또는 자가반응성 단백질로부터의 펩티드 단편을 포함하는 키트로서;
    보다 바람직하게 상기 키트는 (1) TGFβ 및/또는 IL-2; 및 (2) 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체; 및/또는 (3) 펩티드 단편을 포함하며;
    보다 더 바람직하게 상기 키트는 TGFβ, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함하거나, 키트는 TGFβ 및 펩티드 단편을 포함하고;
    가장 바람직하게 상기 키트는 TGFβ, IL-2, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함하거나, 키트는 TGFβ, IL-2 및 펩티드 단편을 포함하는, 키트.
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