KR20220019760A - 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-pgdh)를 억제하여 노화된 조직을 젊어지게 하는 방법 - Google Patents

15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-pgdh)를 억제하여 노화된 조직을 젊어지게 하는 방법 Download PDF

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헬렌 엠. 블루
아델라이다 로사 팔라
앤드류 트리 반 호
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 발명의 개시는 근육 위축을 개선하고, 근육 질량, 기능 및 강도를 증가시키기 위한 노화, 이영양성 근육에서 치료 표적으로서의 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)의 확인에 기초한 조성물 및 방법을 제공한다. 노화된 조직의 젊어짐(rejuvenation)을 위한 조성물 및 방법이 본원에 추가로 제공된다. 특히, SW033291과 같은 15-PGDH 억제제는 근육 또는 조직에서 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 수준을 상승시키는 데 사용된다.

Description

15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)를 억제하여 노화된 조직을 젊어지게 하는 방법
교차-참조
본 출원은 2019년 6월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/860,180호; 2019년 7월 18일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/875,915호; 2019년 8월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/882,981호; 및 2019년 8월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/883,025호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
미연방 후원 연구 및 개발하에 이루어진 발명에 대한 권리에 대한 진술
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 수여되는 계약 AG020961에 따라 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
근육 소모 질병에서, 주로 감소된 단백질 합성을 빈번히 동반하는 과도한 단백질 분해로 인해 근육 질량 및 강도의 급격한 손실이 발생한다. 이러한 근육 기능의 손실로 인해 삶의 질이 감소되고 이환율 및 사망률이 증가된다. 근육 위축이 어떻게 발생하는지에 대해서는 많이 공지되어 있지만, 위축을 효과적으로 예방하거나 늦추는 현재의 치료 전략은 운동으로 제한된다. 근육 질량 및 강도를 증가시키기 위한 그럴듯한 전략은, 예를 들어, TGF-β 패밀리의 조절 또는 인슐린 수용체 신호전달 경로를 통해 단백질 균형을 변경하는 것이다.
디노프로스톤(dinoprostone)으로도 공지된 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 여성의 분만을 유도하고, 조혈 줄기 세포 이식을 증가시키는 것을 포함하여 다양한 임상 환경에서 사용되어 왔다. PGE2는 항응고제 및 항혈전제로 사용될 수 있다. 염증을 해소할 수 있는 지질 매개체로서의 PGE2의 역할이 또한 널리 공지되어 있다. 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID)인 COX-1 및/또는 COX-2의 억제제는 주로 PGE2 생합성을 통해 프로스타노이드를 억제함으로써 염증을 억제한다. PGE2는 사이클로옥시게나제(COX) 및 프로스타글란딘 E 신타제 효소에 의해 아라키돈산으로부터 합성된다. PGE2의 수준은 PGE2 분해 효소, 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)에 의해 생리학적으로 조절된다. 15-PGDH는 PGE2 15-OH의 15-케토 기로의 비활성화 전환을 촉매한다.
효과적인 치료를 필요로 하는 대상체에서 노화 및/또는 위축된 근육에서 단백질의 손실 및 결과로서 발생하는 근섬유 및/또는 근관 크기의 손실 및 결과적인 위축된 근육의 강도, 지구력 또는 질량의 손실을 예방하거나 역전시키기 위한 효과적인 치료가 당 분야에 필요하다. 또한, 연령-관련 질병 및 장애를 갖는 대상체에서 조직, 예를 들어, 비-골격근 조직에서 기능의 손실을 예방하거나 역전시키기 위한 효과적인 치료가 당 분야에 필요하다. 본 발명의 개시는 이들 필요를 만족시키고 또한 다른 이점을 제공한다.
일 양태에서, 대상체에서 노화된 골격근의 기능을 향상시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 노화된 골격근의 하나 이상의 노화 세포에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근에 투여하여 노화된 골격근의 기능을 향상시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 노화된 골격근의 하나 이상의 노화 세포에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근에 투여하여 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력을 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 노화된 골격근에서 PGE2의 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 노화된 골격근에서 PGE2 수준을 증가시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근에 투여하여 노화된 골격근에서 PGE2의 수준을 증가시키는 것을 포함한다.
상기 방법 중 어느 하나에서, 대상체는 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는다.
또 다른 양태에서, 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는 대상체에서 노화된 골격근을 젊어지게 하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는 대상체에 투여하여 노화된 골격근을 젊어지게 하는 것을 포함한다.
상기 방법 중 어느 하나에서, 하나 이상의 노화 바이오마커는 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 15-PGDH 수준의 증가, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 PGE2 수준의 감소, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 PGE2 대사물의 증가, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 노화 세포의 증가 또는 더 큰 축적, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 하나 이상의 아트로젠(atrogene)의 발현 증가, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 미토콘드리아 생물발생 및/또는 기능의 감소, 및 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 전환 성장 인자 경로 신호전달의 증가로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 하나 이상의 아트로젠은 Atrogin1(MAFbx1), MuSA(Fbxo30) 및 Trim63(MuRF1)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 전환 성장 인자 경로 신호전달의 증가는 액티빈 수용체, 미오스타틴, SMAD 단백질 및 골 형태형성 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현의 증가를 포함한다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 노화된 골격근은 젊은 골격근에 비해 노화 세포의 증가된 축적을 갖는다. 일부 경우에, 노화 세포는 하나 이상의 노화 마커를 발현한다. 일부 경우에, 노화 세포는 비-노화 세포에 비해 하나 이상의 노화 마커의 증가된 수준을 갖는다. 일부 경우에, 하나 이상의 노화 마커는 p15Ink4b, p16Ink4a, p19Arf, p21, Mmp13, Il1a, Il1b 및 Il6로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 노화 세포는 대식세포이다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 노화된 골격근은 손상되지 않고/않거나 운동을 겪지 않고/않거나 재생을 겪지 않는다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 노화된 골격근에 세놀리틱 제제(senolytic agent)를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 세놀리틱 제제는 Bcl2 억제제, 판-티로신(pan-tyrosine) 키나제 억제제, 다사티닙(dasatinib) 및 케르세틴(quercetin)의 조합 요법, 플라보노이드, FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드, 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, HSP90 억제제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 15-PGDH 억제제는 소분자 화합물, 차단 항체, 나노바디 및 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 15-PGDH 억제제는 SW033291이다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 15-PGDH 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 대상체는 인간이다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 대상체는 적어도 30세이다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 투여는 전신 투여 또는 국소 투여를 포함한다. 상기 방법 중 어느 하나에서, PGE2의 수준은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 존재하는 PGE2의 수준에 비해 노화된 골격근에서 증가된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, PGE2의 수준은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 존재하는 PGE2의 수준에 비해 적어도 10% 만큼 증가된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, PGE2의 수준은 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 증가된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, PGE2의 수준은 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내인 수준으로 증가된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 근섬유 및/또는 근관 단면적 및/또는 직경을 증가시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 산화성(타입 IIa) 및/또는 해당(타입 IIb) 섬유의 단면적 및/또는 직경을 증가시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH 발현을 감소시키거나 차단한다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH의 효소적 활성을 감소시키거나 차단한다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 노화된 골격근의 근육 질량 증가, 근육 강도 증가, 근육 지구력 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해 노화된 골격근의 근육 질량 증가, 근육 강도 증가, 근육 지구력 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 노화된 골격근의 근육 질량 증가, 근육 강도 증가, 근육 지구력 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내의 수준으로 노화된 골격근의 근육 질량 증가, 근육 강도 증가, 근육 지구력 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 노화된 골격근의 기능을 향상시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해 노화된 골격근의 기능을 향상시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 노화된 골격근의 기능을 향상시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내의 수준으로 노화된 골격근의 기능을 향상시킨다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 기능은 단백질 합성의 증가, 세포 증식의 증가, 세포 생존의 증가, 단백질 분해의 감소 또는 이들의 임의의 조합이다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해, 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 노화된 골격근에서 PGE2 대사물의 수준을 감소시킨다. 일부 경우에, PGE2 대사물은 15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 대상체는 노화로 인한 근감소증을 갖는다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 하나 이상의 아트로젠의 발현 수준은 15-PGDH 억제제를 투여하기 전의 노화된 골격근에 비해 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 감소된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 미토콘드리아 복합체의 하나 이상의 구성요소의 발현 수준은 15-PGDH 억제제를 투여하기 전의 노화된 골격근에 비해 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 증가된다. 일부 경우에, 미토콘드리아 복합체의 하나 이상의 구성요소는 Ndufa11, Ndufa12, Ndufa13, Ndufa2, Ndufa3, Ndufa4, Ndufa5, Ndufa10, Ndufb5, Ndufc1, Ndufs4, Ndufs8, Ndufv1, Ndufv2, Uqcrb, Uqcrc1, Uqcrh, Uqcrq, Ucqr10, Cox8b, Cox7a1, Cox7a2, Cox7b, Cox6c, Cox5a, Cox5b, Atp5f1, Atp5g1, Atp5h, Atp5j2, Atp5o, Atp5e 및 Atp5k로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 과산화소체 증식제-활성화된 수용체 감마 보조활성인자 1-알파(Pgc1α)의 발현 수준은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 증가된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, Tnfaip1, Klhdc8a, Fbxw11, Tnfaip3, Herc3, Herc2, Hdac4, Traf6, Ankib1, Mib1, Pja2, Ubr3, Thbs1, Smad3, Acvr2a, Rgmb, Tgfb2 및 Mstn으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 감소된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 상기 방법은 대상체에서 근육 줄기 세포(MuSC)의 증식의 증가와 독립적이다. 상기 방법 중 어느 하나에서, 투여는 1일 1회, 1일 2회, 1주일에 1회 또는 1개월에 1회 투여를 포함한다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 노화된 비-골격근 조직을 젊어지게 하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 15-PGDH 억제제의 양을 대상체에 투여하여 노화된 비-골격근 조직을 젊어지게 하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 투여는 대상체의 노화된 비-골격근 조직에서 PGE2의 수준을 증가시킨다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직에서의 PGE2의 수준은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근 조직에 비해 증가된다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직에서의 PGE2의 수준은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근 조직에 비해 적어도 10%만큼 증가된다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직에서의 PGE2의 수준은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 증가된다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직에서의 PGE2의 수준은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내의 수준으로 증가된다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직은 표피 조직, 상피 조직, 혈관 조직, 심장 근육, 뇌, 뼈, 연골, 감각 기관, 신장, 갑상선, 폐, 평활근, 갈색 지방, 비장, 간, 심장, 소장, 결장, 피부, 난소 및 기타 생식 조직, 모발, 치아 조직, 혈액, 와우 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 대상체는 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는다. 일부 경우에, 하나 이상의 노화 바이오마커는 젊은 비-골격근 조직에 비한 15-PGDH 수준의 증가, 젊은 비-골격근 조직에 비한 PGE2 수준의 감소, 젊은 비-골격근 조직에 비한 PGE2 대사물의 증가, 젊은 비-골격근 조직에 비한 노화 세포의 증가 또는 더 큰 축적, 젊은 비-골격근 조직에 비한 하나 이상의 아트로젠의 발현의 증가, 젊은 비-골격근 조직에 비한 미토콘드리아 생물발생 및/또는 기능의 감소, 및 젊은 비-골격근 조직에 비한 전환 성장 인자 경로 신호전달의 증가로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직은 젊은 비-골격근 조직에 비해 노화 세포의 증가된 축적을 갖는다. 일부 경우에, 노화 세포는 하나 이상의 노화 마커를 발현한다. 일부 경우에, 노화 세포는 비-노화 세포에 비해 하나 이상의 노화 마커의 증가된 수준을 갖는다. 일부 경우에, 하나 이상의 노화 마커는 p15Ink4b, p16Ink4a, p19Arf, p21, Mmp13, Il1a, Il1b 및 Il6로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 노화 세포는 대식세포이다. 일부 경우에, 상기 방법은 노화된 비-골격근 조직에 세놀리틱 제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 세놀리틱 제제는 Bcl2 억제제, 판-티로신 키나제 억제제, 다사티닙 및 케르세틴의 조합 요법, 플라보노이드, FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드, 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, HSP90 억제제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 15-PGDH 억제제는 소분자 화합물, 차단 항체, 나노바디 및 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 15-PGDH 억제제는 SW033291이다. 일부 경우에, 15-PGDH 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, 대상체는 인간이다. 일부 경우에, 대상체는 적어도 30세이다. 일부 경우에, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH 발현을 감소시키거나 차단한다. 일부 경우에, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH의 효소적 활성을 감소시키거나 차단한다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근의 기능은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근의 기능에 비해 향상된다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직의 기능은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근의 기능에 비해 적어도 10%만큼 향상된다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직의 기능은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 향상된다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직의 기능은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내의 수준으로 향상된다. 일부 경우에, 기능은 증가된 단백질 합성, 증가된 세포 증식, 증가된 세포 생존, 감소된 단백질 분해 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근 조직에 비해, 및/또는 젊은 비-골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 노화된 비-골격근 조직에서 PGE2 대사물의 수준을 감소시킨다. 일부 경우에, PGE2 대사물은 15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 골격근의 기능을 향상시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 골격근에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 대상체에 투여하여 대상체에서 골격근의 기능을 향샹시키는 것을 포함하며, 상기 골격근은 건강하며, 상기 방법은 대상체에서 근육 줄기 세포(MuSC)의 증식의 증가와 독립적이다. 일부 경우에, 골격근은 손상되지 않은 것이다. 일부 경우에, 골격근은 재생을 겪지 않는다. 일부 경우에, 골격근은 유의하거나 실질적인 운동을 겪지 않는다. 일부 경우에, 기능은 15-PGDH 억제제를 투여하기 전의 골격근에 비해 향상된다. 일부 경우에, 기능은 단백질 합성의 증가, 세포 증식의 증가, 세포 생존의 증가, 단백질 분해의 감소 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 경우에, 상기 방법은 15-PGDH 억제제의 투여 전의 골격근에 비해 근육 질량의 증가, 근육 강도의 증가, 근육 지구력의 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시킨다. 일부 경우에, 골격근은 젊은 골격근이다. 일부 경우에, 대상체는 30세 미만이다. 일부 경우에, 골격근은 노화된 골격근이다. 일부 경우에, 대상체는 30세 초과이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 대상체에서 노화된 및/또는 위축된 근육의 질량, 강도 및/또는 지구력을 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료적 유효량의 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH) 억제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체의 노화된 및/또는 위축된 근육에서 근섬유 및/또는 근관 크기를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 대상체는 근감소증, 당뇨병, 근이영양증, 근감소성 비만, 신경병증, 암 악액질, HIV 악액질, 근육 고정, 근육 불용, 쇠약, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 근육 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 인간은 30세 이상이다(예를 들어, 연령-관련 근감소증을 갖는 성인). 일부 구현예에서, 인간은 아동(예를 들어, 뒤시엔느 근이영양증과 같은 근이영양증을 갖는 아동)이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간이 그 또는 그녀의 연령을 기준으로 15-PGDH 억제제를 이용한 치료를 위해 선택되는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 인간이 당뇨병, 쇠약, 근이영양증, 근감소성 비만, 신경병증, 암 악액질 또는 HIV 악액질, 또는 고정 또는 불용으로 인한 근육 위축의 진단에 기초하여 15-PGDH 억제제를 이용한 치료를 위해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 근육 위축은 뒤시엔느 근이영양증, 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 원위 근이영양증, 에머리-드레이푸스 근이영양증, 안면견갑상완근 근이영양증, 지대근 근이영양증, 근긴장성 근이영양증 및 안인두근 근이영양증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 근이영양증은 뒤시엔느 근이영양증이다.
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH를 불활성화시키거나, 15-PGDH 활성(예를 들어, 효소적 활성)을 차단한다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH의 안정성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 소분자 화합물, 차단 항체, 나노바디(nanobody) 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 소분자 화합물은 SW033291이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH 발현을 감소시키거나 차단한다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, siRNA 또는 shRNA이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 변형된 RNA, 예를 들어, 변형된 mRNA(mmRNA)이다.
일부 구현예에서, 근육은 골격근이다. 일부 구현예에서, 근육은 손상되지 않고/않거나 운동 및/또는 재생을 겪지 않는다. 일부 구현예에서, 억제제는 근육 손상, 운동 또는 재생과 독립적으로 대상체의 노화된 및/또는 위축된 근육에서 근섬유 및/또는 근관 크기를 증가시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 치료적 유효량은 대상체의 노화된 및/또는 위축된 근육에서 근육 질량 또는 근섬유 및/또는 근관 단면적 또는 직경을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 치료적 유효량은 대상체에서 근육 줄기 세포(MuSC)의 증식의 증가와 독립적으로 또는 이에 대한 필요 없이 근육 강도, 근육 기능, 근육 질량 및/또는 근육 지구력을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 치료적 유효량은 대상체의 노화된 및/또는 위축된 근육에서 프로스타글란딘 E2(PGE2) 수준을 증가시키거나, 상승시키거나, 회복시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 치료적 유효량은 대상체의 노화된 및/또는 위축된 근육에서 PGE2 대사물 수준을 감소시킨다.
일부 구현예에서, PGE2 대사물은 15-케토-PGE2 또는 13,14-디하이드로-15-케토-PGE2(PGEM)이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 전신 또는 국소 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 노화된 및/또는 위축된 근육은 (예를 들어, 젊은 근육에 비해) 노화 세포의 증가된 축적을 갖는다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세놀리틱 제제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세놀리틱 제제는 Bcl2 억제제(예를 들어, 나비토클락스(navitoclax)(ABT-263), ABT-737), 판-티로신 키나제 억제제(예를 들어, 다사티닙), 플라보노이드(예를 들어, 케르세틴), FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드(예를 들어, FOXO4-DRI), 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, HSP90 억제제(예를 들어, 17-DMAG), 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체의 노화된 및/또는 위축성 근육에서 Atrogin1 수준 또는 활성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체의 노화된 및/또는 위축성 근육에서 EP4 활성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 특히 성숙한 근육 세포의 근육 세포 사멸에 대한 보호를 발생시킨다.
본 발명의 개시는 특히 대상체에서 15-PGDH를 억제함으로써 연령-관련 질환 또는 질병을 갖는 대상체에서 비-골격근 조직의 건강, 기능 및/또는 성능을 개선하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명의 개시는 연령-관련 장애를 갖는 대상체에서 비-골격근 조직의 기능을 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH) 억제제의 치료적 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체에서 비-골격근 조직에서 PGE2 및/또는 PGD2의 수준을 증가시키거나 회복시킨다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 연령-관련 장애는 심혈관 질병, 만성 호흡기 질병, 영양 질병, 신장 질병, 위장 또는 소화 질병, 신경 장애, 감각 장애, 청력 장애, 피부 또는 피하 질병, 뇌혈관 질병, 골다공증, 골관절염, 조기 노화 질병, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 심혈관 질병은 심방 세동, 뇌졸중, 허혈성 심장 질병, 심근병증, 심내막염, 뇌내 출혈, 고혈압, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 만성 호흡기 질병은 만성 폐쇄폐병, 석면증, 규폐증, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 영양 질병은 트라코마, 설사 질병, 뇌염, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 신장 질병은 만성 신장 질병이다. 일부 구현예에서, 위장 또는 소화기 질병은 NASH, 췌장염, 궤양, 장폐색, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 신경학적 장애는 알츠하이머병, 치매, 파킨슨병, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 감각 장애는 청력 상실, 시력 상실, 후각 또는 미각의 상실, 황반 변성, 망막색소 변성증, 녹내장, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 피부 또는 피하 질병은 연조직염, 궤양, 진균성 피부 질병, 고름피부증, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 조기 노화 질병은 불완전골생성증, 블룸 증후군, 코케인 증후군, 허친슨-길포드 조로 증후군, 하악말단지골 이형성증, 조로증, 프로제로이드 증후군, 로트문드-톰슨 증후군, 세이프 증후군, 베르너 증후군, 다운 증후군, 선단노화증, 로트문드-톰슨 증후군, 모세관확장실조와 같은 조기 노화 증후군으로 이어지는 면역결핍, 또는 HIV와 같은 조기 노화로 이어지는 감염성 질병이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간이 연령-관련 장애의 진단을 기초로 하여 15-PGDH 억제제를 사용한 치료를 위해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비-골격근 조직은 표피, 상피, 혈관, 심장 근육, 뇌, 뼈, 연골, 감각 기관, 신장, 갑상선, 폐, 평활근, 갈색 지방, 비장, 간, 심장, 뇌, 소장, 결장, 피부, 난소 및 기타 생식 조직, 모발, 치아 조직, 와우, 희소돌기아교세포, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH를 불활성화시키거나 15-PGDH 활성을 차단한다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH의 효소적 활성을 감소시키거나 차단한다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 소분자 화합물, 차단 항체, 나노바디 또는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 소분자 화합물은 SW033291이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH 발현을 감소시키거나 차단한다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, siRNA 또는 shRNA이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체의 비-골격근 조직에서 PGE2의 수준을 증가시키거나 회복시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 치료적 유효량은 대상체의 비-골격근 조직에서 PGE2 및/또는 PGD2 대사물 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, PGE2 대사물은 15-케토-PGE2 또는 13,14-디하이드로-15-케토-PGE2(PGEM)이다. 일부 구현예에서, PGD2 대사물은 15-케토-PGD2 또는 13,14-디하이드로-15-케토-PGD2이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 치료적 유효량은 대상체의 비-골격근 조직에서 단백질 합성을 증가시키고/시키거나, 세포 증식을 증가시키고/시키거나, 세포 생존을 증가시키고/시키거나, 텔로미어를 연장시키고/시키거나, 단백질 분해를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 전신 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 국소 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-골격근 조직은 (예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 비해) 노화 세포의 증가된 축적을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세놀리틱 제제를 대상체에 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세놀리틱 제제는 Bcl2 억제제, 판-티로신 키나제 억제제, 플라보노이드, FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드, 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, HSP90 억제제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 개시의 다른 목적, 특징, 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
도 1a-1d. 노화된 근육에서의 강도 및 PGE2 수준의 감소. (도 1a) 젊은(2개월, n=9), 중년(18개월, n=5) 및 노화(25개월, n=5) 수컷 마우스에서의 족저굴곡근 강직성 토크. (도 1b) PGE2 이화작용 체계. 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2(PGEM). (도 1c) 젊은(2개월) 및 노화(25개월) 마우스(연령 그룹 당 n=4 마우스)의 근육 조직에서 검정된 15-PGDH 특이적 효소 활성. (도 1d) 질량분광법에 의해 정량화된 근육 조직 용해질의 PGE2 및 PGEM 수준(젊은 근육 조직의 경우 n=14 마우스, 및 노화의 경우 n=8). *P<0.05, **P<0.001, ****P<0.0001. 다중 비교를 위한 본페로니 보정(Bonferroni correction)을 사용한 ANOVA 검정(도 1a 및 1d); 만-휘트니 검정(Mann-Whitney test)(도 1c). 평균±s.e.m.
도 2. 15-PGDH, 노화 조직에서 노화 세포의 구성요소. 4주 교대 요법에 걸쳐 비히클(veh) 또는 ABT-263(ABT)으로 처리되고, 2개월 후에 분석된 20개월 C57Bl/6 야생형 마우스의 근육 조직에서의 15-PGDH(Hpgd)의 발현(2개월령 마우스에서 조건 당 n=3 및 23개월령 마우스에서 조건 당 n=4). *P<0.05. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정; 평균+s.e.m. 약어: mo, 개월.
도 3a-3e. 15-PGDH 억제는 내인성 PGE2 수준을 증가시킴으로써 노화된 마우스에서 개선된 근육 기능을 유도한다. (도 3a) 노화된 마우스는 15-PGDH 억제제, SW033291(SW) 또는 비히클로 매일 처리되었고, 근육 기능이 1개월에 측정되었다. 실험 계획 (상부). 좌측에서 우측으로: 절개된 비복근(GA) 및 전경골근(TA)의 중량으로 평가된 질량. 족저굴곡근 강직성 힘(절대값)으로 평가된 강도. 족저굴곡근 강직성 힘(기준선으로 표준화된 값). 탈진까지의 시간 및 거리로 평가된 지구력. (도 3b) 1개월 비히클 처리되거나 SW 처리된 노화된 근육의 대표적인 TA 단면. DAPI, 청색; LAMININ, 녹색. 바(Bar)=50 μm. (도 3c) 비히클- 및 SW-처리된 노화된 GA에서의 근섬유 단면적(CSA)(그룹 당 n=4). (도 3d) 평균 CSA(그룹 당 n=4). (도 3e) 질량분광법에 의해 정량화된 근육 조직 용해질에서의 PGE2 및 PGEM 수준(그룹 당 n=3). *P<0.05, **P<0.001, ****P<0.0001. 만-휘트니 검정(도 3a 및 3d). 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 3c 및 3e); 평균±s.e.m. 약어: mo, 개월; i.p. 복강 내.
도 4a-4d. AAV9-전달된 shRNA에 의한 15-PGDH 넉다운은 노화된 마우스에서 개선된 근육 기능을 유도한다. 15-PGDH에 대한 shRNA(sh15PGDH) 또는 스크램블(scr) 대조군의 작제물을 갖는 AAV9의 GA로의 근육 내(i.m.) 주사. (도 4a) 실험 계획. (도 4b) scr 및 sh15PGDH 감염된 근육 및 젊은 대조군에서의 15-PGDH의 발현 수준(그룹 당 n=5). (도 4c) 절개된 비복근(GA)의 중량. (도 4d) 족저굴곡근 강직성 힘(절대값). *P<0.05. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 4b); 만-휘트니 검정(도 4c 및 4d). 평균±s.e.m. 약어: mo, 개월; i.m. 근육 내.
도 5a 및 5b. 15-PGDH 억제는 뒤시엔느 근이영양증 마우스 모델에서 개선된 근육 기능을 유도한다. (도 5a) 뒤시엔느 근이영양증(DMD) 마우스(mdx4cv/mTRKO(G2)) 및 대조군(mTRKO(G2))의 GA 근육에서의 노화 마커 및 15-PGDH(Hpgd)의 발현(유전자형 당 n=4). (도 5b) DMD 마우스 및 대조군 마우스는 15-PGDH 억제제, SW033291(SW) 또는 비히클로 매일 처리되었고, 근육 기능이 1개월에 측정되었다. 실험 계획 (상부). 족저굴곡근 강직성 힘(각각의 유전자형에 대해 비히클-처리에 대해 표준화된 값, 하부). *P<0.05, ****P<0.0001. 만-휘트니 검정(도 5a 및 5b). 평균±s.e.m. 약어: mo, 개월; i.p. 복강 내.
도 6a-6f. 배양된 근관의 PGE2 처리는 근육 위축 경로의 억제를 유도한다. (도 6a) (좌측) 비히클 및 SW 처리된 노화된 근육(조건 당 n=3); (우측) shscr 및 sh15PGDH 처리된 노화된 근육(조건 당 n=5)에서의 Atrogin1의 발현 수준. (도 6b) 분화 시간경과 동안의 PGE2 수용체, EP1-4(Ptger1-4)의 발현 수준. (도 6c) 분화 시간경과 동안의 Pax7 및 Myh의 발현 수준. (도 6d) 24시간 동안 굶주리고, EP4 길항제, ONO-AE3-208의 존재하에서 비히클, PGE2 또는 SW로 동시에 처리된 분화된 근관에서의 위축 마커, Atrogin1의 발현 수준(좌측), 및 근관 직경(중간). PGE2 또는 비히클 후-분화에 노출된 근관의 대표적 이미지(우측). 바=50 μm. (도 6e) EP4fl/fl 또는 EP4Δ/Δ 근관의 직경 및 MYH 염색된 양성 영역. (도 6f) 노화된 및 이영양성 마우스에서의 15-PGDH 조절의 그래픽 설명. 노화된 또는 DMD 근육에서의 근육 질량 및 강도 손실의 구조는 PGE2의 수준을 회복하기 위해 15-PGDH 억제제 또는 세놀리틱스(senolytics)의 사용에 의해 달성될 수 있으며, 이는 처리된 DMD 또는 노화된 마우스에서 하류 위축 매개체 Atrogin1, 근육 비대의 감소된 수준, 및 증가된 강도를 발생시킨다. *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0005 ****P<0.0001. 만-휘트니 검정(도 6a, 6d-좌측, 및 6e); 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 갖는 ANOVA 검정(도 6d-우측); 평균±s.e.m.
도 7a-7c. 프로스타글란딘 및 PGE2 대사물을 검출하기 위한 젊은 및 노화된 근육의 질량분광법 분석. (도 7a) 분석되는 프로스타글란딘(PGE2, PGF2α 및 PGD2) 및 PGE2 대사물(15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2)의 화학 구조, 화학식, 정확한 질량 및 분자량. 내부 표준 PGF2α-D9 및 PGE2-D9을 모든 복합 표준에 첨가하였다. (도 7b) 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화-탠덤 질량분광법(LC-ESI-MS/MS) 분석을 위한 보정선을 0.1 ng/ml 내지 500 ng/ml의 최종 농도로 스톡 용액을 희석시킴으로써 제조하였다. 표준 곡선 방정식 및 상관 계수가 각각의 표준에 대해 제시된다. (도 7c) 대표적 크로마토그램. 개별 피크는 분석되는 프로스타글란딘 및 이의 대사물의 우수한 크로마토그래피 분해능을 나타낸다. cps: 초 당 카운트.
도 8a-8p. 노화 동안 에이코사노이드 수준의 분석은 PGE2 분해 효소 15-PGDH의 증가를 밝혀내었다. (도 8a) PGE2 및 PGD2 이화작용 체계. (도 8b) 질량분광법에 의해 정량화된 근육 조직 용해질에서의 PGE2, PGD2, PGF2a 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2(PGEM) 수준(젊은 근육 조직의 경우 n=12 마우스, 및 노화의 경우 n=8). (도 8c) 젊은(2개월, 좌측) 및 노화(25개월, 우측) 근육 조직으로부터의 질량분광법에 의해 분석된 PGE2, PGD2 수준의 대표적 크로마토그램. (도 8d) 젊은(2개월) 및 노화(25개월) 마우스의 조직에서 검정된 15-PGDH 특이적 효소 활성. 활성은 젊은 마우스에 비한 변화 백분율로 표현된다. (도 8e) 젊은(3개월) 및 노화된 마우스(> 24개월)로부터의 15-PGDH(Hpgd) RNAseq 발현 데이터(각각 n=4, 6). TPM, 백만 당 전사체. (도 8f) 젊은(3개월) 및 노화(25개월)의 근육 용해질로부터의 15-PGDH 면역블롯(각각 n=4). (도 8g-8p) 젊은(3개월) 및 노화(24개월) C57BL/6의 비복근(GA)으로의 15-PGDH에 대한 shRNA(sh15PGDH) 또는 스크램블(scr) 대조군의 작제물을 갖는 AAV9의 근육 내(i.m.) 주사. (도 8g) 실험 계획. (도 8h) scr 및 sh15PGDH 감염된 근육 및 젊은 대조군에서의 15-PGDH의 발현 수준(그룹 당 n=5). (도 8i) scr 및 scr 처리로 표준화된 sh15PGDH 감염된 노화된 근육의 근육 조직에서 검정된 15-PGDH 특이적 효소 활성(연령 그룹 당 n=5 마우스). (도 8j) 질량분광법에 의해 정량화된 근육 조직 용해질에서의 PGE2, PGD2, PGF2a 수준(그룹 당 n=4). (도 8k) scr 및 sh15PGDH 감염된 노화된 근육의 대표적인 TA 단면. DAPI, 청색; LAMININ, 녹색. 바=50 μm. (도 8l) scr 및 sh15PGDH 감염된 노화된 GA에서의 근섬유 단면적(CSA)(그룹 당 n=7). (도 8m) 평균 CSA. (도 8n) 절개된 TA의 중량 (도 8o) 절개된 GA의 중량. (도 8p) 족저굴곡근 강직성 힘(절대값). *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 8h 및 8l-8p); 다중 t-검정(도 8b, 8d 및 8j), 만-휘트니 검정(도 8e, 8f 및 8i). 평균±s.e.m. 약어: Spl. 비장; Mus. 근육; mo 개월; i.m. 근육 내.
도 9a-9c. 젊은 및 노화된 근육의 질량분광법 분석은 프로스타글란딘 및 PGE2 대사물을 검출한다. (도 9a) 분석되는 프로스타글란딘(PGE2, PGF2α 및 PGD2), PGE2 대사물(15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2), PGA2 및 이의 대사물, 13,14-디하이드로-15-케토 PGA2, 및 내부 표준 PGF2α-D9 및 PGE2-D4 및 PGD2-D4의 화학 구조, 화학식, 정확한 질량 및 분자량. (도 9b) PGE2 교정 곡선은 범위 0.05-500ng/mL에서 선형이었다. 표준 곡선 방정식 및 상관 계수가 제시된다. (도 9c) 분석된 프로스타글란딘 및 이들의 대사물의 크로마토그래피 분리를 제시하는 표준 혼합물의 대표적인 크로마토그램. 분석물 피크 강도는 cps(초 당 카운트)로 표현된다.
도 10. 젊은 및 노화된 근육의 질량분광법 분석. 대표적 크로마토그램은 젊은(2개월, 좌측) 및 노화(25개월, 우측) 근육 조직으로부터의 질량분광법에 의해 분석된 대사물 PGE2의 전이 상태를 나타낸다.
도 11. 젊은 및 노화된 조직에서의 15-PGDH 특이적 활성 검정. 젊은(회색) 및 노화(흑색) 조직으로부터 제조된 용해질에서의 15-PGDH 특이적 활성의 운동 측정.
도 12a-12d. 젊은 대 노화된 C57BL/6로부터의 사두근의 전사체 분석. (도 12a-12d) RNA 시퀀싱은 젊은(3개월) 및 노화된 마우스(> 24개월)에 대해 수행되었다(각각 n=4, 6). (도 12a) rlog 형질전환 후의 젊은 및 노화된 샘플의 유클리드 샘플 거리의 히트맵 (도 12b) 젊은 대 노화 샘플의 차별적으로 발현된 유전자의 볼케이노 플롯(Volcano plot). (도 12c) 프로스타글란딘 E2 수용체(Ptger 1-4)의 TPM 값의 박스 및 휘스커 플롯(Box and whiskers plot). (도 12d) (도 12b)로부터 차별적으로 상향- 및 하향-조절된 유전자의 GO 텀(GO term) 및 KEGG 분석. 약어: mo., 개월; n.s., 유의하지 않음; TPM 백만 당 전사체.
도 13. 15-PGDH 수준은 노화된 근육에서 상승된다. 공개적으로 이용 가능한 데이터 GSE25941(Raue et al. 2012)로부터 분석된 젊은 인간(25 ± 3 yrs)과 비교하여 외측광근으로부터의 노화된 인간(78 ± 6 yrs) 생검으로부터의 15-PGDH(Hpgd) 마이크로어레이 발현 데이터(각각 n=15, 21). *P<0.0001. 만-휘트니 검정.
도 14a-14c. 15-PGDH의 AAV9 매개 넉다운. (도 14a) shscr에 비한 젊은 sh15PGDH의 근육 조직에서 PGE2, PGD2, PGF2a 수준의 질량분광법 정량화(그룹 당 n=4). (도 14b) scr 및 sh15PGDH 감염된 노화된 근육의 TA 단면의 대표적 이미지, DAPI, 청색; GFP, 녹색; LAMININ, 백색 (도 14c) 족저굴곡근 강직성 힘(기준선에 비함). *P<0.05. 다중 t-검정(도 14a), 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 14c). 평균+s.e.m. 약어: TA: 전경골근; scr: 스크램블됨, n.s., 유의하지 않음.
도 15a-15m. 소분자에 의한 15-PGDH 억제는 내인성 PGE2 수준을 증가시킴으로써 노화된 마우스의 개선된 근육 기능을 유도한다. (도 15a) 실험 계획. 젊은(3개월) 및 노화된(>24개월) 마우스는 15-PGDH 억제제, SW033291(SW) 또는 비히클로 매일 처리되었고, 근육 기능이 1개월에 측정되었다. (도 15b) 비히클 및 비히클 처리로 표준화된 SW 처리된 노화된 근육의 근육 조직에서 검정된 15-PGDH 특이적 효소 활성(연령 그룹 당 n=4 마우스). (도 15c) 질량분광법에 의해 정량화된 근육 조직 용해질의 에이코사노이드 수준(젊은 근육 용해질의 경우 n=10, 노화된 veh의 경우 n=5 및 노화된 SW의 경우 n=7). (도 15d) 1개월 비히클 처리되거나 SW 처리된 노화된 근육의 대표적인 TA 단면. DAPI, 청색; LAMININ, 녹색. 바=50 μm. (도 15e) 비히클 및 SW 처리된 노화된 GA에서의 근섬유 단면적(CSA)(그룹 당 n=4). (도 15f) 평균 CSA. (도 15g) 산화성(MHC2a) 및 해당 섬유(MHC2b)에 대해 염색된 1개월 처리된 비히클 또는 SW 처리된 노화된 근육의 대표적 TA 단면, LAMININ, 청색; MHC2a, 녹색 및 MHC2b, 적색, 바=50 μm (도 15h) 평균 CSA. (도 15i) MHC2a의 단면적. 그룹 당 n=4 (도 15j) MHC2b의 단면적. 그룹 당 n=4 (도 15k) 절개된 비복근(GA), 전경골근(TA) 및 가자미근의 중량. (도 15l) 족저굴곡근 강직성 힘(절대값). (도 15m) 탈진까지의 시간. *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001. 만-휘트니 검정(도 15b 및 15h); 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 15c, 15e, 15f 및 15j-15m). 평균±s.e.m. 약어: mo, 개월; i.p. 복강 내.
도 16a-16c. 노화된 비히클 및 SW 처리된 근육의 분석. (도 16a) 대표적 크로마토그램은 노화된 비히클 처리(좌측) 및 노화된 SW 처리(우측) 근육 조직으로부터의 질량분광법에 의해 분석된 대사물 PGE2 수준의 전이 상태를 나타낸다. (도 16b) 비히클 처리에 비한 SW 처리의 근육 조직에서 PGE2, PGD2, PGF2a 수준의 질량분광법 정량화(그룹 당 n=4). (도 16c) 족저굴곡근 강직성 힘(기준선에 비함). **P<0.01. 다중 t-검정(도 16b), 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 16c). 약어: n.s., 유의하지 않음.
도 17a-17g. 15-PGDH는 노화된 근육 미세환경에서 세포에 의해 발현된다. (도 17a) 뒷다리 근육에서 젊은(2개월) 및 노화(25개월)로부터의 분류된 대식세포(Cd11b+/Cd11c-/F4/80+/Cd31-), 내피(Cd31+/Cd11b-/Cd11c-/F4/80-) 및 근원성 및 줄기 세포(α7+/Cd11b-/Cd45-/Cd31-/Sca1-)에서의 15-PGDH(Hpgd)의 발현. (도 17b) FACS 분리된 젊은(2개월) 및 노화된 대식세포(25개월)에서의 p16Ink4a 및 p21의 발현(각각 n=3 및 5). (도 17c-17g) INK-ATTAC 12개월령 마우스가 16개월 동안 1주일에 2회 비히클 또는 AP20187(AP)로 처리되어 노화 세포를 제거하였고, 골격근 조직이 28개월에서 분석되었다. (도 17c) 실험 계획. (도 17d) 비히클(veh) 또는 AP로 처리된 젊은(2개월) 및 노화된(28개월) INK-ATTAC 마우스의 사두근에서의 15-PGDH 효소(Hpgd)의 발현. 2개월의 경우 n=5, veh 또는 AP로 처리된 28개월의 경우 n=6. (도 17e) 질량분광법에 의해 정량화된 근육 조직 용해질의 에이코사노이드 수준(젊은 근육 조직 용해질의 경우 n=10, 비히클-처리의 경우 n=3 및 AP 처리의 경우 n=3). (도 17f) 뒷다리 근육으로부터 비히클(veh) 또는 AP(28개월)로 처리된 성체(12개월) 및 노화된 INK-ATTAC로부터의 분류된 대식세포 및 내피 세포에서의 15-PGDH(Hpgd)의 발현. (도 17g) 비히클(veh) 또는 AP로 처리된 성체(12개월) 및 노화된 INK-ATTAC(28개월)의 절개된 비복근(GA), 전경골근(TA)의 중량(좌측), 그립 강도 및 트레드밀 지구력(우측). 각각 n=6, 7 및 15. *P<0.05, ***P<0.001, ****P<0.0001. 다중 t-검정(a), 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 17e-17g). 평균±s.e.m.
도 18a 및 18b. 젊은 및 노화된 마우스로부터의 분류된 세포의 노화 마커의 발현. (도 18a) 젊은(3개월) 및 노화된 마우스(24개월)로부터의 대식세포(Cd11b+/Cd11c-/F4/80+/Cd31-)의 분류. (도 18b) 분류된 내피(Cd31+/Cd11b-/Cd11c-/F4/80-)에서 젊은(2개월) 및 노화(24개월)에서의 p16 및 p21의 발현. (조건 당 n=5 마우스). *P<0.05, ****P<0.0001. 만-휘트니 검정(도 18b). 평균+s.e.m. 약어: mo., 개월.
도 19a-19g. INK-ATTAC 및 세놀리틱 처리된 노화된 마우스 특성규명. (도 19a) 비히클(veh) 또는 AP로 처리된 젊은(2개월) 및 노화된(28개월) INK-ATTAC 마우스의 사두근에서의 표시된 노화 마커의 발현. veh 또는 AP로 처리된 젊은 마우스의 경우 n=5, 노화된 마우스의 경우 n=6. (도 19b) 대표적 크로마토그램은 노화된 INK-ATTAC 비히클 처리(좌측) 및 노화된 INK-ATTAC AP 처리(우측) 근육 조직으로부터의 질량분광법에 의해 분석된 대사물 PGE2 수준의 전이 상태를 나타낸다. (도 19c) 비히클(veh) 또는 AP로 처리된 성체(12개월) INK-ATTAC, 노화된(28개월) INK-ATTAC 마우스의 분류된 대식세포 및 내피 세포에서의 p21의 발현. (조건 당 n=4). (도 19d-19g) 20개월 C57Bl/6 야생형 마우스는 4주 교대 요법에 걸쳐 비히클(veh) 또는 ABT-263(ABT)으로 처리되었고, 2개월 후에 분석되었다. (도 19d) 계획(상단). 4주 교대 요법 동안 비히클 또는 ABT263(ABT)으로 처리된 젊은 또는 노화된 C57Bl/6 야생형(wt) 마우스의 노화 마커의 발현(젊은 마우스에서 조건 당 n=3 및 노화된 마우스에서 조건 당 n=4)(하단). (도 19e) 젊은(2개월), 노화된 ABT-처리 및 노화된 비히클-처리 근육(23개월)의 대표적인 TA 단면. DAPI, 청색; 15-PGDH, 녹색; WGA, 적색. (바=20 μm). (도 19f) 근육 조직 섹션에서 15-PGDH+ 면역염색된 세포의 정량화. (ABT로 처리된 노화된 n=4 마우스 및 비히클 대조군으로 처리된 n=4 마우스에 대한 근육 단면(섹션 당 약 5,000-8,000 DAPI 양성 세포)) (도 19g) 15-PGDH(Hpgd)의 발현(젊은 2개월령 마우스에서 n=3 및 노화된 23개월령 마우스에서 조건 당 n=4) *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 19a, 19c, 19d-좌측 및 19g). 만-휘트니 검정(도 19f 및 19d-우측). 평균+s.e.m. 약어: mo., 개월.
도 20a-20k. 15-PGDH의 과발현은 SW033291을 사용한 치료에 의해 구제된 근육 위축을 유도한다. (도 20a-20h) 젊은 C57BL/6(4개월) 마우스의 전경골근(TA)으로의 15-PGDH 발현을 유도하는 CMV 또는 대조군의 작제물을 갖는 AAV9의 근육 내(i.m.) 주사. (도 20a) 실험 계획. (도 20b) scr 및 15-PGDH O.E. 감염된 젊은 근육에서의 15-PGDH(Hpgd)의 발현(그룹 당 n=5). (도 20c) 질량분광법에 의해 정량화된 근육 조직 용해질에서의 PGE2, PGD2, PGF2a 및 PGEM 수준(그룹 당 n=4). (도 20d) i.m 주사 1개월 후의 대표적인 TA 단면. DAPI, 청색; LAMININ, 녹색. 바=50 μm (도 20e) 15-PGDH 과발현 벡터 및 대조군이 주사된 근육의 근섬유 단면적 (그룹 당 n=3). (도 20f) 절개된 전경골근(TA)의 중량. (도 20g) 족저굴곡근 강직성 힘(절대값). (도 20h) qPCR에 의해 측정된 MuRF1(Trim63), Atrogin-1(Fbxo32), p62, Lc3b, Atg4 및 Atg6의 발현 수준(n=3). (도 20i-20k) 15-PGDH 억제제, SW033291(SW) 또는 비히클을 이용한 매일 복강 내(i.p.) 처리와 함께 젊은 C57BL/6(3개월) 마우스의 전경골근(TA)으로의 15-PGDH 발현을 유도하는 CMV 또는 대조군의 작제물을 갖는 AAV9의 근육 내(i.m.) 주사(그룹 당 n=4 마우스). (도 20i) 실험 계획. (도 20j) 절제된 TA 근육의 중량. (도 20k) 족저굴곡근 강직성 힘(절대값). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 ****P<0.0001. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정 (도 20J 및 20K); 다중 t-검정 (도 20c), 만-휘트니 검정 (도 20b 및 20e-20h). 평균±s.e.m.
도 21a-21k. PGE2는 15-PGDH 억제의 이로운 효과를 매개한다. (도 21a-21g) 노화된(>24개월) C57BL/6 마우스의 비복근(GA)으로의 프로스타글란딘 D2 신타제인 PTGDS에 대한 shRNA(shPTGDS) 또는 스크램블(scr) 대조군의 작제물을 갖는 AAV9의 근육 내(i.m.) 주사. (도 21a) 실험 계획. (도 21b) qPCR에 의해 측정된 Ptgds의 발현(그룹 당 n=4). (도 21c) 질량분광법에 의해 정량화된 근육 조직 용해질에서의 PGD2 수준(그룹 당 n=4). (도 21d) 절개된 GA의 중량. (도 21e) 족저굴곡근 강직성 힘(기준선으로 표준화된 값). (도 21f) 족저굴곡근 강직성 힘(절대값). (도 21g) 트레드밀에서 탈진까지의 거리. (도 21h-21k) EP4f/f 마우스 또는 한배 새끼 대조군(EP4+/+)의 GA로 Cre 발현을 유도하는 MCK 프로모터의 작제물을 갖는 AAV9의 근육 내(i.m.) 주사. 이후, 마우스는 15-PGDH 억제제, SW033291(SW) 또는 비히클로 매일 처리되었고, 근육 기능이 1개월에 측정되었다. (도 21h) 실험 계획. (도 21i) 절개된 GA의 중량 (도 21j) 족저굴곡근 강직성 힘(기준선으로 표준화된 값). (도 21k) 족저굴곡근 강직성 힘(절대값). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 ****P<0.0001. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 21b, 21d-21g 및 21i-21k); 만-휘트니 검정(도 21c). 평균±s.e.m. 약어: mo., 개월; i.p. 복강 내; i.m. 근육 내.
도 22. 근관에서의 프로스타글란딘 수용체의 발현. 근관(4일차 분화된 근관)의 PGE2 수용체, EP1-4(Ptger1-4), PGD2 수용체(Ptgdr1-2) 및 PGF2a 수용체(Ptgfr)의 발현 수준.
도 23a 및 23b. PGE2 처리는 근육에서 CREB의 활성화를 유도한다. (a) 0, 30 또는 60분 후 i.m.으로 PGE2가 주사된 젊은(3개월) C57BL/6 마우스로부터의 근육 용해질의 면역블롯. (b) (a)에서의 면역블롯의 정량화. **P<0.01. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정 (b). 평균+s.e.m.
도 24a-24i. 15-PGDH 억제는 근육 기능을 개선하기 위해 다중 경로에 영향을 미친다. (도 24a-24c) 노화된 근육 마우스의 RNA 시퀀싱 분석은 15-PGDH 억제제, SW033291(SW) 또는 비히클로 매일 처리되었고, 근육 기능이 1개월에 측정되었다(각각 n=3). (도 24a) 상향조절된(좌측) 및 하향조절된(우측) 유전자의 KEGG 및 GO 텀 분석. (도 24b) (도 24a)에서 확인된 미토콘드리아 유전자의 히트맵. (도 24c) qPCR에 의한 Pgc1a의 발현 수준(그룹 당 n=4). (도 24d) 핵 DNA에 대한 미토콘드리아 DNA의 상대적 정량화(그룹 당 n=4). (도 24e) (도 24a)에서 확인된 단백질 유비퀴틴 관련 유전자(상단) 및 TGF-베타 신호전달 경로(하단)의 히트맵. (도 24f) 0, 15 또는 30분의 PGE2(10 ng/ml)로 처리된 인간 근육 생검으로부터 유래된 근원성 전구체로부터 분화된 근관(MT)의 면역블롯. (도 24g) 노화된 비히클 및 SW 처리된 마우스로부터의 근육 용해질의 면역블롯(상부) 및 정량화(하부)(각각 n=4). (도 24h) qPCR에 의해 측정된 비히클 및 SW 처리에서 MuRF1(Trim63), Atrogin-1(Fbxo32) 및 미오스타틴(Mstn)의 발현 수준(노화된 veh의 경우 n=12 및 노화된 SW의 경우 n=8). (도 24i) qPCR에 의해 측정된 scr 및 sh15PGDH 처리에서 MuRF1(Trim63), Atrogin-1(Fbxo32) 및 미오스타틴(Mstn)의 발현 수준(노화된 shscr의 경우 n=5 및 노화된 sh15PGDH의 경우 n=4). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 ****P<0.0001. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 24c); 만-휘트니 검정(도 24d 및 24g-i). 평균±s.e.m. 약어: KEGG: 교토 유전자 및 유전체 백과사전(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes); GO: 유전자 온톨로지(Gene Ontology); BP: 생물학적 과정(Biological Process); MF: 분자 기능(Molecular Function); CC: 세포 성분(Cellular Component).
도 25a-25d. PGE2 처리는 근관에서 단백질 합성을 증가시킨다. (도 25a) 24시간 동안 굶주리고 EP4 길항제인 ONO-AE3-208(1μM)의 존재하에서 비히클, PGE2(10 ng/ml) 또는 SW(1 μM)로 동시 처리된 분화 후 근관의 직경. (조건 당 n=4) (도 25b) (도 25a)에서와 같이 처리된 굶주린 근관의 대표적 이미지, DAPI, 청색; MYH, 적색. 바=50 μm. (도 25c) 좌측: 4일 동안 비히클 또는 PGE2로 처리된 분화 후 근관의 직경. 우측: 4일 동안 비히클 또는 PGE2로 처리된 분화 후 근관의 대표적 이미지. DAPI, 청색; 미오신 중쇄(MYH), 적색. 바=50 μm. DM, 분화 배지. (도 25d) 좌측: PGE2(10 ng/ml) 또는 비히클로 매일(4일) 처리된 분화된 뮤린 근관으로의 퓨로마이신 혼입의 면역블롯. 사이클로헥시미드가 퓨로마이신 첨가 동안 대조군으로 첨가되었다. 우측: 로딩 대조군은 폰소 S(Ponceau S) 염색으로 표시된다. 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 25a); 만-휘트니 검정(도 25b). ***P<0.001, ****P<0.0001. 평균+s.e.m.
도 26a-26d. 노화된 근육에서의 15-PGDH 억제 또는 넉다운의 특성규명. (도 26a) 비히클 및 SW 처리된 노화된 근육에서의 위축 마커의 발현 수준(각각 n=8 및 5). (도 26b) 젊은(3개월) 비히클 및 SW 처리된 노화된 근육에서의 자가포식 마커의 발현 수준(젊은 근육의 경우 n=4, 노화된 veh의 경우 n=12 및 노화된 SW의 경우 n=8). (도 26c) 비히클 및 SW 처리된 노화된 근육에서의 염증 및 노화 마커의 발현 수준(조건 당 n=3). (도 26d) shscr 및 sh15PGDH AAV9 처리된 노화된 근육에서의 염증 및 노화 마커의 발현 수준(조건 당 n=5). 만-휘트니 검정(도 26a, 26c 및 26d), 다중 비교를 위한 본페로니 보정을 사용한 ANOVA 검정(도 26b), *P<0.05, **P<0.01. 평균+s.e.m. 약어: n.s., 유의하지 않음.
도 27a 및 27b. PGE2 분해 효소 15-PGDH는 노화된 조직에서 증가된다. (도 27a) PGE2 및 PGD2 이화작용 체계. (도 27b) 젊은(2개월) 및 노화(25개월) 마우스의 조직에서 검정된 15-PGDH 특이적 효소 활성. 활성은 젊은 마우스에 비한 변화 백분율로 표현된다. *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0005. 다중 t-검정(도 27b). 평균±s.e.m. 약어: Spl. 비장; Mus. 근육.
도 28. 젊은 및 노화된 조직의 15-PGDH 특이적 활성 검정. 젊은(회색) 및 노화(흑색) 조직으로부터 제조된 용해질에서의 15-PGDH 특이적 활성의 운동 측정.
1. 서문
본 발명의 개시는 부분적으로 PGE2 신호전달의 손실이 노화 및 근이영양증 동안 근이영양증과 관련하여 골격근의 소모에 기여하고, PGE2 이화작용이 조절되지 않아 노화, 이영양성, 또는 위축성 근육 조직에 대한 해로운 영향을 발생시킨다는 발견에 기초한다. 노화된 근육 조직에서, PGE2는 더 낮은 수준에서 검출되며, 이는 이전에 노화와 관련이 없는 현상이다. 또한, 부분적으로 노화 세포의 축적에 기인하여 노화된 또는 이영양성 근육의 수준인 상승된 PGE2 분해 효소 15-PGDH는 근육 조직 PGE2 수준의 감소를 발생시킨다. 따라서, 본 발명의 개시는, 예를 들어, 근육 위축, 근육 질량, 기능 및 강도 증가를 개선하기 위해 노화된 및/또는 이영양성 근육에서 치료 표적으로서의 15-PGDH 활성의 사용에 기초한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 15-PGDH(예를 들어, 활성 또는 수준, 예를 들어, mRNA 및/또는 단백질)의 감소 또는 억제는 노화 및 근이영양증에서 골격근 기능의 개선을 발생시킬 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 노화된 및/또는 이영양성 근육을 치료하기 위해 15-PGDH의 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 상기 방법은 노화, 위축성 또는 이영양성 근육에서 PGE2의 수준을 증가(예를 들어, PGE2 분해 효소인 15-PGDH를 억제함으로써)시키는 것을 포함한다.
예를 들어, 손상, 운동 또는 재생의 부재하에서 노화, 위축 또는 이영양성 근육에서의 PGE2 수준의 상승, 증가 또는 회복은 근육 소모를 개선시킬 수 있으며, 이는 근이영양증과 같은 근육 소모 질병 및 노화에서 PGE2 분해 효소 15-PGDH에 대한 이전의 인식되지 않은 역할을 드러낼 수 있다. 특히, PGE2는 손상의 부재하에서 항상성에서 성숙한 근섬유에 작용할 수 있다. 따라서, 15-PGDH 억제제(예를 들어, SW033291)는 비활성 PGE2 대사물, 예를 들어, PGEM의 감소된 수준과 함께 노화, 위축성 및/또는 이영양성 골격근에서 PGE2의 수준을 회복시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 15-PGDH 억제제의 사용은 근육 질량, 강도, 운동 성능 및/또는 기능을 증가시키거나 향상시킬 수 있다. PGE2 신호전달의 경로는 분화된 근육 세포 및 근섬유에서 EP4 수용체를 통해 발생할 수 있으며, 근육 위축의 중요한 매개체인 Atrogin1 발현의 억제를 통해 근육 질량을 직접 조절할 수 있다. 15-PGDH 억제는 국소적 또는 전신적 전략에 의해 달성될 수 있으며, 이는 노화, 위축성 및 이영양성 근육 미세환경의 유해한 효과를 극복하고, 노화 및 이영양성 근육에서 근육 질량, 강도 및 지구력의 강력한 증가를 발생시킨다.
본 발명의 개시는 또한 PGE2 분해 효소인 15-PGDH 또는 이의 전사체가 다양한 노화 조직, 특히 비-골격근 조직에서 상승된다는 발견에 부분적으로 기초한다. 이와 같이, 15-PGDH 단백질 또는 전사체는, 예를 들어, 연령-관련 장애 또는 질병을 갖는 대상체에서 비-골격근 조직에서 노화에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 또한, 15-PGDH는 비-골격근 조직에서 노화 및 노화-관련 과정을 역전시키거나 늦추어 이들의 기능을 개선시키기 위해 억제될 수 있다. 다음 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예를 들어, 결장, 뇌, 피부, 비장 또는 간에서 노화-관련 질환 또는 질병을 갖는 대상체에서 비-골격근 조직에서 상승된 15-PGDH 수준은 이들 조직에서 PGE2 및/또는 PGD2 분해 및 이에 따라 노화에서 나타나는 조직 기능에 대한 유해한 효과를 갖는 PGE2 및/또는 PGD2 및 PGE2 및/또는 PGD2 신호전달의 더 낮은 수준을 초래하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 개시는 연령-관련 질병 또는 질환을 갖는 대상체에서 비-골격근 조직에서 치료 표적으로서 15-PGDH 활성의 사용에 기초한 조성물 및 방법을 제공한다. 이들 조직에서 15-PGDH를 억제하는 것은 조직에서 PGE2 및/또는 PGD2 수준을 회복시키거나 증가시킬 수 있고, 이들의 기능, 건강 및/또는 생리학적 활성을 개선시킬 수 있다. 따라서, 15-PGDH를 감소시키는 것은 개선된 삶의 질 및 연령-관련 질병에 대한 결과로 이어질 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 비-골격근 조직의 비제한적인 목록은, 예를 들어, 표피, 혈관, 심장 근육, 뇌, 뼈, 연골, 평활근, 갈색 지방, 비장, 간 등을 포함한다. 15-PGDH 상승은 노화된 조직의 질병, 예를 들어, 심혈관 질병(예를 들어, 심방 세동, 뇌졸중, 허혈성 심장 질병, 심근병증, 심내막염, 뇌내 출혈), 만성 호흡기 질병(예를 들어, 만성 폐쇄폐병, 석면증, 규폐증), 영양 질병(트라코마, 설사 질병, 뇌염), 신장 질병(예를 들어, 만성 신장 질병), 위장 및 소화 질병(예를 들어, NASH, 췌장염, 궤양, 장폐색), 신경 장애(예를 들어, 알츠하이머병, 치매, 파킨슨병), 감각 장애(예를 들어, 청력 상실, 황반 변성, 녹내장), 피부 및 피하 질병(예를 들어, 연조직염, 궤양, 진균성 피부 질병, 고름피부증), 골다공증, 골관절염, 류마티스 관절염 등에서 발생할 수 있다. 또한, 조기 노화 증후군을 유발하는 이들 조직의 유전적 장애, 예를 들어, 블룸 증후군, 코케인 증후군, 허친슨-길포드 조로 증후군, 하악말단지골 이형성증, 조로증, 프로제로이드 증후군, 로트문드-톰슨 증후군, 세이프 증후군, 베르너 증후군, 다운 증후군, 선단노화증, 및 로트문드-톰슨 증후군뿐만 아니라 조기 노화 증후군을 유발하는 이들 조직의 면역결핍, 예를 들어, 모세관확장실조, 및 조기 노화 증후군을 유발하는 이들 조직의 감염성 질병, 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)가 또한 15-PGDH 억제로부터 이익을 얻을 수 있다.
비-골격근 조직을 15-PGDH의 억제제로 처리하는 것은 처리가 상승된 수준의 효소를 발현하는 특정 세포 유형(예를 들어, 병에 걸리거나 노화된 비-골격근 조직)에 국한될 수 있으며, PGE2 및/또는 PGD2의 생리학적 "젊음" 수준을 달성하기 위해 PGE2 및/또는 PGD2의 내인성 수준을 회복하는 능력을 제공하고, 노화 및 노화-관련 질환에서 해로운 영향을 갖는 것으로 생각되는 노화 세포 침윤이 높은 비-골격근 조직(예를 들어, 결장, 피부, 비장)을 표적화할 수 있고, 지속적이고 전신적인 PGE2 및/또는 PGD2 이점을 제공하기 위해 상대적으로 긴 반감기를 갖는 분자로 또는 유전자 요법을 사용하여 15-PGDH를 표적화할 가능성을 제공하는 것과 같은 다수의 이점을 제공할 수 있다.
2. 총론
본원에 개시된 방법을 실행하는 것은 분자생물학 분야에서 일상적인 기술을 이용한다. 본원에 기재된 일반적인 사용 방법을 개시하는 기본 텍스트는 문헌[Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다.
핵산에 대해, 크기는 킬로베이스(kb), 염기쌍(bp), 또는 뉴클레오티드(nt)로 제공된다. 단일-가닥 DNA 및/또는 RNA의 크기는 뉴클레오티드로 제공될 수 있다. 이들은 아가로스 또는 아크릴아미드 젤 전기영동, 시퀀싱된 핵산, 또는 공개된 DNA 서열로부터 유래된 추정치이다. 단백질에 대해, 크기는 킬로달톤(kDa) 또는 아미노산 잔기수로 제공된다. 단백질 크기는 젤 전기영동, 시퀀싱된 단백질, 유도된 아미노산 서열, 또는 공개된 단백질 서열로부터 추정된다.
상업적으로 이용 가능하지 않은 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 문헌[Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에 기재된 바와 같이 자동 합성기를 이용하여 문헌[Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)]에 처음 기재된 고상 포스포라미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 임의의 당 분야에서 인정된 전략, 예를 들어, 문헌[Pearson and Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)]에 기재된 바와 같은 천연 아크릴아미드 젤 전기영동 또는 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 수행된다.
3. 정의
본원에서 사용되는 바와 같은 하기 용어는 달리 특정되지 않는 한 이들에 기인되는 의미를 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 단수 관사 또는 정관사는 하나의 구성원을 갖는 양태를 포함할 뿐만 아니라 하나 초과의 구성원을 갖는 양태를 포함한다. 예를 들어, 단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 상기 세포를 포함하며, "제제"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 1개 이상의 제제에 대한 언급을 포함하며, 기타 사항도 마찬가지이다.
본원에서 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 특성 또는 정밀도가 제공되는 경우 측정된 양에 대한 허용 가능한 오차 정도를 의미한다. 전형적으로, 예시적인 오차의 정도는 제공된 값 또는 값의 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. "약 X"에 대한 임의의 언급은 구체적으로 적어도 값 X, 0.8X, 0.81X, 0.82X, 0.83X, 0.84X, 0.85X, 0.86X, 0.87X, 0.88X, 0.89X, 0.9X, 0.91X, 0.92X, 0.93X, 0.94X, 0.95X, 0.96X, 0.97X, 0.98X, 0.99X, 1.01X, 1.02X, 1.03X, 1.04X, 1.05X, 1.06X, 1.07X, 1.08X, 1.09X, 1.1X, 1.11X, 1.12X, 1.13X, 1.14X, 1.15X, 1.16X, 1.17X, 1.18X, 1.19X 및 1.2X를 나타낸다. 따라서, "약 X"는, 예를 들어, "0.98X"의 청구범위 제한에 대한 서면 설명 지원을 교시하고 제공하기 위한 것이다.
"연령-관련 질환" 또는 "연령-관련 질병"은, 예를 들어, 조직 기능의 손실 또는 감소, 조직 건강의 손실 또는 감소, 조직의 하나 이상의 생리학적 활성의 손실 또는 감소, 조직 세포의 감소된 단백질 합성, 조직 세포의 증가된 단백질 분해, 조직의 감소된 생존 또는 생존력, 조직 내의 세포의 감소된 증식, 조직 세포의 단축된 텔로미어, 조직 세포의 미토콘드리아 기능장애, 조직에서 노화 세포의 증가된 존재, 조직에서 PGE2 및/또는 PGD2의 감소된 수준 등을 포함하여 비-골격근 조직에서 연령 또는 시간 경과 증가와 관련된 임의의 징후 또는 특징을 나타내거나 잠재적으로 나타내는 임의의 질병, 질환 또는 장애를 나타낸다. 질환 또는 질병은 시간 경과로 인한 자연적 노화 과정, 라이프스타일 요인 또는 질병, 예를 들어, 감염성 질병과 같은 다른 요인, 또는 조기 노화를 유발하는 유전적 질환의 결과일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "비-골격근" 조직은 골격근이 아닌(예를 들어, 복합 흉근(musculi pectoralis complex), 광배근, 대원근 및 견갑하근, 상완요골근, 이두근, 상완근, 방형회내근, 원형회내근, 요측수근굴근, 척측수근굴근, 표재지굴근, 심수지굴근, 단수무지굴근, 무지대립근, 엄지모음근, 단수무지굴근, 장요근, 허리근, 복직근, 대퇴직근, 대둔근, 중둔근, 내측 슬건, 비복근, 외측 슬건, 대퇴사두근 기전, 장수내전근, 단내전근, 대내전근, 내측비복근, 외측비복근, 가자미근, 후경골근, 전경골근, 장지굴근, 단지굴근, 장족무지굴근, 장족무지신근, 안구 근육, 인두 근육, 괄약근 근육, 손 근육, 팔 근육, 발 근육, 다리 근육, 가슴 근육, 배 근육, 등 근육, 엉덩이 근육, 어깨 근육, 두경부 근육이 아닌) 신체 내의 임의의 조직을 나타낼 수 있으며, 다수의 조직 유형을 포함하는 기관뿐만 아니라 기관 또는 조직 내의 특정 세포 유형을 포함할 수 있다. 예를 들어, "비-골격근 조직"은 다음 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 상피 조직, 신경 조직, 결합 조직, 평활근, 심장 근육, 표피 조직, 혈관 조직, 심장, 신장, 뇌, 뼈, 연골, 갈색 지방, 비장, 간, 결장, 감각 기관, 갑상선, 폐, 혈액, 소장, 치과 조직, 난소 또는 다른 생식 조직 또는 기관, 모발, 와우, 희소돌기아교세포, 및 이들의 조합.
"근감소증"은 연령과 관련된 근육 질량, 강도 및/또는 신체적 성능의 손실을 나타낸다. 근감소증은 상이한 개인에서 상이한 비율로 발생할 수 있는 점진적 과정이며, 진단을 위한 최소 연령이 없다. 예를 들어, 인간은 이들이 적어도, 예를 들어, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75세 이상인 경우 본원에 제공된 방법의 목적을 위한 근감소증을 갖는 것으로 간주될 수 있다.
"노화된 근육" 또는 "노화 근육"은, 예를 들어, 근육 질량 또는 강도의 손실, 감소된 단백질 합성, 근세포내 및 근세포외 지질의 축적, 미토콘드리아 기능장애, 아트로젠(예를 들어, Atrogin1, Murf 및 MuSA)의 발현, 노화 세포의 증가된 존재, PGE2 대사물(예를 들어, PGEM)의 증가된 수준 등을 포함하는 발달된 근육에서 연령 또는 시간 경과 증가와 관련된 임의의 징후 또는 특징을 나타내거나 잠재적으로 나타내는 임의의 근육(예를 들어, 골격근)을 나타낸다. 일부 구현예에서, 노화된 또는 노화 근육은 근감소증을 갖는 대상체의 근육을 나타낸다.
"근육 위축" 또는 "위축성 근육"은 근육 조직의 임의의 손실 또는 소모, 예를 들어, 근감소증, 당뇨병, 근이영양증, 근감소성 비만, 신경병증, 암 악액질, 또는 HIV 악액질, 쇠약, 또는 고정화 또는 불용으로 인한 근육 위축과 같은 질환과 관련하여, 예를 들어, 임의의 이유에 의한 근육 크기, 질량 또는 기능의 임의의 양의 감소를 나타낸다.
용어 "프로스타글란딘 E2", "PGE2" 및 "디노프로스톤"은 사이클로옥시게나제(COX) 효소 및 말단 프로스타글란딘 E 신타제(PGE5)를 통해 아라키돈산으로부터 합성될 수 있는 프로스타글란딘을 나타낸다. PGE2는 혈관확장, 염증, 및 수면/깸 주기의 조절을 포함하는 다수의 생물학적 기능에서 역할을 한다. PGE2에 대한 구조적 및 기능적 정보는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 PubChem: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Dinoprostone의 "Dinoprostone"에 대한 항목에서 찾을 수 있다.
용어 "프로스타글란딘 D2" 또는 "PGD2"는 사이클로옥시게나제(COX) 효소 및 PGD2 신타제(PTDS)를 통해 아라키돈산으로부터 합성될 수 있는 프로스타글란딘을 나타낸다. PGD2는 PGE2의 구조 이성질체이며, PGE2의 9-케토 및 11-하이드록시 기는 PGD2에서 반전된다. PGD2는 혈관수축, 염증, 수면 중 체온 조절, 화학주성 및 남성 성 발달을 포함하는 다수의 생물학적 기능에서 역할을 한다. PGD2에 대한 구조적 및 기능적 정보는, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 PubChem: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/448457의 "Prostaglandin D2"에 대한 항목에서 찾을 수 있다.
"15-PGDH"(15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제)는, 예를 들어, PGE2의 15-케토-프로스타글란딘 E2(15-케토-PGE2)로의 산화, 또는 PGD2의 15-케토-프로스타글란딘 D2(15-케토-PGD2)로의 산화를 촉매함으로써 다수의 활성 프로스타글란딘의 불활성화에 관여하는 효소이다. 인간 효소는 HPGD 유전자(Gene ID: 3248)에 의해 인코딩된다. 상기 효소는 단쇄 비금속효소 알콜 데하이드로게나제 단백질 패밀리의 일원이다. 효소의 다중 아이소형은, 예를 들어, 인간에 존재하며, 이들 중 임의의 것은 본 발명의 방법을 사용하여 표적화될 수 있다. 예를 들어, 임의의 인간 아이소형 1-6(예를 들어, GenBank 등록 번호 NP_000851.2, NP_001139288.1, NP_001243236.1, NP_001243234.1, NP_001243235.1, NP_001350503.1, NP_001243230.1)이 표적화될 수 있는데, 임의의 아이소형이 임의의 GenBank 등록 번호 NP_000851.2, NP_001139288.1, NP_001243236.1, NP_001243234.1, NP_001243235.1, NP_001350503.1, NP_001243230.1, 또는 임의의 다른 15-PGDH 효소의 아미노산 서열에 대해 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 동일성을 가질 수 있기 때문이다.
"15-PGDH 억제제"는 15-PGDH의 발현, 안정성 또는 활성의 임의의 양태를 임의의 방식으로 억제하거나, 줄이거나, 감소시키거나, 약화시키거나, 폐지시키거나, 제거하거나, 늦추거나, 대응할 수 있는 임의의 제제를 나타낸다. 15-PGDH 억제제는, 예를 들어, 15-PGDH를 인코딩하는 유전자, 예를 들어, 인간 HPGD 유전자의 발현, 예를 들어, 전사, RNA 처리, RNA 안정성 또는 번역의 임의의 양태를, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내에서 억제제의 부재하에서 대조군과 비교하여, 예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상만큼 감소시킬 수 있다. 유사하게, 15-PGDH 억제제는, 예를 들어, 15-PGDH 효소의 활성, 예를 들어, 효소적 활성을, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내에서 억제제의 부재하에서 대조군과 비교하여, 예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상만큼 감소시킬 수 있다. 또한, 15-PGDH 억제제는, 예를 들어, 15-PGDH 효소의 안정성을, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내에서 억제제의 부재하에서 대조군과 비교하여, 예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상만큼 감소시킬 수 있다. 본원에서 "제제" 또는 "화합물"로도 언급되는 "15-PGDH 억제제"는 천연 발생 또는 합성의 임의의 분자, 예를 들어, 펩티드, 단백질, 올리고펩티드(예를 들어, 약 5 내지 약 25개의 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20 또는 25개의 아미노산 길이), 소분자(예를 들어, 약 2500 달톤 미만, 예를 들어, 2000 미만, 1000 미만, 또는 500 달톤 미만의 분자량을 갖는 유기 분자), 항체, 나노바디, 다당류, 지질, 지방산, 억제성 RNA(예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA), 변형된 RNA, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 아피머, 약물 화합물, 또는 다른 화합물일 수 있다.
"세놀리틱 제제"는 노화 세포의 사멸을 유도할 수 있는, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내에서 노화 세포 집단의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 사멸을 유도할 수 있는 임의의 제제를 나타낸다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 세놀리틱 제제의 비제한적인 목록은 Bcl2 억제제(예를 들어, 나비토클락스(ABT-263), ABT-737), 판-티로신 키나제 억제제(예를 들어, 다사티닙), 플라보노이드(예를 들어, 케르세틴), FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드(예를 들어, FOXO4-DRI), 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, HSP90 억제제(예를 들어, 17-DMAG), 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 세놀리틱 제제는 노화된 및/또는 위축성 근육 내의 노화 세포, 예를 들어, 대식세포 및/또는 섬유지방성 전구(FAP) 세포; 및/또는 비-골격근 조직 내의 대식세포 및/또는 섬유지방세포의, 예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 사멸을 유도할 수 있다.
용어 "발현" 및 "발현된"은, 예를 들어, 단백질(예를 들어, 15-PGDH)을 인코딩하는 핵산 서열의 전사 및/또는 번역 생성물의 생성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 유전자(예를 들어, 인간 HPGD 유전자) 또는 이의 일부에 의해 인코딩되는 전사 및/또는 번역 생성물의 생성을 나타낸다. 세포에서 DNA 분자의 발현 수준은 세포 내에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 세포에 의해 생성되는 상기 DNA에 의해 인코딩되는 단백질의 양에 기초하여 평가될 수 있다.
용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 기능적 단편에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 나타낸다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 차례로 각각 면역글로불린 클래스, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다. 상기 용어는 동일한 항원 특이성을 갖는 항체 단편 및 이의 융합 생성물을 포함한다.
예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄"(약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 따라서, 용어 "가변 중쇄", "VH" 또는 "VH"는 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 나타내는 한편; 용어 "가변 경쇄", "VL" 또는 "VL"은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 나타낸다. 등가 분자는, 예를 들어, 항체 단편을 변형시키거나 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택함으로써 유도된 원하는 항원 특이성을 갖는 항원 결합 단백질을 포함한다.
용어 "항원-결합 부분" 및 "항원-결합 단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 항원(예를 들어, 15-PGDH 단백질)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체-결합 단편의 예는 Fab 단편(VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편), F(ab')2 단편(힌지 영역에서 이황화 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), 단일쇄 Fv(scFv), 이황화-결합된 Fv(dsFv), 상보성 결정 영역(CDR), VL(경쇄 가변 영역), VH(중쇄 가변 영역), 나노바디, 및 이들의 임의의 조합 또는 표적 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 펩티드의 임의의 다른 기능적 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology (Paul ed., 4th ed. 2001)] 참조).
어구 "특이적으로 결합한다"는 비-표적 화합물에 결합하는 것보다 샘플 내의 표적에 더 큰 친화성, 결합력, 더 용이하게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 표적에 결합하는 분자(예를 들어, 소분자 또는 항체와 같은 15-PGDH 억제제)를 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적(예를 들어, 15-PGDH)에 특이적으로 결합하는 분자는 비-표적 화합물보다 적어도 2배 더 큰 친화성, 예를 들어, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 25배, 50배 이상의 친화성으로 표적에 결합한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 15-PGDH에 특이적으로 결합하는 분자는 전형적으로 비-15-PGDH 표적보다 적어도 2배 더 큰 친화성으로 15-PGDH에 결합할 것이다.
화합물의 문맥에서 용어 "유도체"는 제공된 화합물의 아미드, 에테르, 에스테르, 아미노, 카르복실, 아세틸, 및/또는 알콜 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 개선; 상기 증상이 발생하기 전의 상기 증상 소견의 예방; 질병 또는 질환의 진행의 늦춤 또는 완전한 예방(재발 에피소드 사이의 더 긴 기간, 증상 악화의 늦춤 또는 예방 등에 의해 명백할 수 있음); 완화 기간 발생의 향상; 질병 또는 질환의 진행성-만성 단계에서 야기되는 비가역적 손상의 늦춤(일차 및 이차 단계 둘 모두); 상기 진행성 단계의 발생의 지연; 또는 이들의 임의의 조합 중 어느 하나를 나타낸다.
용어 "투여하다", "투여하는" 또는 "투여"는 본원에 기재된 화합물과 같은 제제 또는 조성물의 원하는 생물학적 작용 부위로의 전달을 가능하게 하기 위해 이용될 수 있는 방법을 나타낸다. 이들 방법은 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 혈관 내, 심장 내, 수막강 내, 비내, 피내, 유리체 내 등), 경점막 주사, 경구 투여, 좌약으로서의 투여, 및 국소 투여를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 당업자는 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상을 예방하거나 경감시키기 위해 본원에 기재된 화합물의 치료적 유효량을 투여하기 위한 추가 방법을 인지할 것이다.
용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 용량" 또는 "유효량"은 이롭거나 원하는 임상 효과를 발생시키기에 충분한 화합물(예를 들어, 15-PGDH 억제제)의 양을 나타낸다. 치료적 유효량 또는 용량은 환자의 연령, 크기, 질병 또는 질환의 유형 또는 정도, 질병 또는 질환의 단계, 투여 경로, 이용되는 보충 요법의 유형 또는 정도, 진행 중인 질병 과정 및 원하는 치료 유형(예를 들어, 공격적 대 통상적 치료)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 각각의 환자에 대해 개별적인 요인을 기초로 할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 약학적 화합물 또는 조성물의 치료적 유효량은 세포 배양 및 동물 모델로부터 초기에 추정될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 방법에서 결정된 IC50 값은 동물 모델에서 시작점으로 작용할 수 있는 반면, 동물 모델에서 결정된 IC50 값은 인간에서 치료적 유효 용량을 발견하는데 사용될 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 유의한 자극을 야기시키지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 파괴하지 않는 담체 또는 희석제를 나타낸다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간을 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 포유동물은 뮤린, 래트, 유인원, 인간, 농장 동물 또는 인간 소비를 위한 가축, 예를 들어, 돼지, 소 및 양뿐만 아니라 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대상체는 또한 어류 및 가금류와 같은 척추동물을 포함한다.
화합물의 투여의 맥락에서 용어 "급성 요법"은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체로의 화합물의 일시적 또는 간단한 적용, 또는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체로의 화합물의 반복 적용을 나타내며, 적용 사이에 원하는 기간(예를 들어, 1일)이 경과한다. 일부 구현예에서, 급성 요법은 치료 과정 또는 연장된 기간에 걸친 대상체로의 화합물의 급성 노출(예를 들어, 단일 용량)을 포함한다. 다른 구현예에서, 급성 요법은 대상체로의 화합물의 간헐적 노출(예를 들어, 반복 용량)을 포함하며, 각각의 노출 사이에 원하는 기간이 경과한다.
화합물의 투여의 맥락에서 용어 "만성 요법"은 화합물의 양 또는 수준이 선택된 기간에 걸쳐 실질적으로 일정하도록 하는 연장된 기간에 걸친 대상체, 예를 들어, 인간 대상체로의 화합물의 반복된 만성 적용을 나타낸다. 일부 구현예에서, 만성 요법은 연장된 기간에 걸친 대상체로의 화합물의 연속 노출을 포함한다.
"발현 카세트"는 숙주 세포에서 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소를 갖는 재조합적 또는 합성으로 생성된 핵산 작제물이다. 발현 카세트는 플라스미드, 바이러스 유전체 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 카세트는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전사되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 프로모터는 이종성 프로모터일 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터의 맥락에서, "이종성 프로모터"는 자연의 생성물(예를 들어, 야생형 유기체)에서 발견되는 것과 동일한 폴리뉴클레오티드에 그렇게 작동 가능하게 연결되지 않을 프로모터를 나타낸다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 중합체를 나타낸다. 특별히 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명백히 명시된 서열 뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환), 대립유전자, 오쏠로그(ortholog), SNP 및 상보성 서열을 암묵적으로 포함한다. 특정 구현예에서, 하기에 더 상세히 기재되는 바와 같이 변형된 RNA 분자, 예를 들어, 세포 내로 도입되는 경우 증가된 안정성 및/또는 번역을 허용하기 위한 특정한 화학적 변형을 갖는 mRNA가 사용된다. siRNA 또는 shRNA와 같은 핵산 억제제를 포함하여 본 발명의 방법에서 사용되는 임의의 RNA는, 예를 들어, 문헌[Dar et al. (2016) Scientific Reports 6: article no. 20031 (2016)]에 기재된 바와 같고, crdd.osdd.net/servers/sirnamod/에서 접근 가능한 데이터베이스에 제시된 바와 같이, 예를 들어, 안정성 및/또는 효능을 향상시키기 위해 화학적 변형과 함께 사용될 수 있음이 인지될 것이다.
"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 3개 용어 모두는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 사용되는 상기 용어는 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결된 전장 단백질을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 기재하는 맥락에서 동일한 2개 이상의 서열 또는 특정된 하위서열을 나타낸다. "실질적으로 동일한" 2개의 서열은 비교 창, 또는 특정 영역이 지정되지 않은 경우 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 수동 정렬 및 육안 검사를 통해 측정된 바와 같은 지정된 영역에 걸쳐 최대 일치성을 위해 비교 및 정렬되는 경우 적어도 60%의 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여, 상기 정의는 또한 시험 서열의 상보체를 나타낸다. 아미노산 서열과 관련하여, 일부 경우에, 동일성은 길이가 적어도 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 더욱 바람직하게는 길이가 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열이 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 대안적으로 파라미터가 지정될 수 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 비한 시험 서열에 대한 서열 동일성 퍼센트를 계산한다. 핵산과 단백질의 서열 비교를 위해, BLAST 2.0 알고리즘 및 디폴트 파라미터가 사용된다.
4. 위축성 및/또는 노화된 근육에서 근육 질량, 지구력, 강도 또는 기능을 향상시키는 방법
일 구현예에서, 대상체에서 노화된 골격근의 근육 기능을 향상시키는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 노화 세포(예를 들어, 노화된 골격근 근처 또는 내, 예를 들어, 노화된 골격근 미세환경 내에 존재)에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준(예를 들어, mRNA 및/또는 단백질 수준)을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근에 투여하여 노화된 골격근의 근육 기능을 향상시키는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상체에서 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력을 증가시키는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 노화 세포(예를 들어, 노화된 골격근 근처 또는 내, 예를 들어, 노화된 골격근 미세환경 내에 존재)에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준(예를 들어, mRNA 및/또는 단백질 수준)을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근에 투여하여 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력을 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 대상체의 노화된 골격근에서 PGE2의 수준을 증가시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 노화된 골격근에서 PGE2 수준을 증가(예를 들어, 15-PGDH 활성을 억제하거나 15-PGDH 발현 수준을 감소시킴에 의함)시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근(예를 들어, 감소된 PGE2의 수준을 가짐)에 투여하여 노화된 골격근에서 PGE2의 수준을 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는 대상체에서 노화된 골격근을 젊어지게 하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 대상체에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준(예를 들어, mRNA 및/또는 단백질 수준)을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는 대상체에 투여하여 노화된 골격근을 젊어지게 하는 것을 포함한다.
본원에 제공된 방법은 노화된 골격근의 기능을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 노화된 골격근을 젊어지게 하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 제공된 방법은 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도, 근력 및/또는 근육 지구력을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
다양한 양태에서, 노화된 골격근은 하나 이상의 노화 세포(예를 들어, 골격근 조직 내에 또는 근처에 존재함)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 노화된 골격근은 복수의 노화 세포(예를 들어, 골격근 조직 내에 또는 근처에 존재함)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 노화된 골격근은 노화 세포(예를 들어, 골격근 조직 내 또는 근처에서)(예를 들어, 젊은 골격근에 비해)의 증가된 축적을 가질 수 있다. 일부 경우에, 노화된 골격근은 젊은 골격근에서 전형적으로 발견되는 수보다 높은(예를 들어, 실질적으로 더 높은) 다수의 노화 세포를 가질 수 있다. 노화 세포는 하나 이상의 노화 마커를 발현할 수 있다. 노화 세포는 비-노화 세포에 비해 하나 이상의 노화 마커의 증가된 수준을 가질 수 있다. 하나 이상의 노화 마커는, 비제한적으로, p15Ink4b, p16Ink4a, p19Arf, p21, Mmp13, Il1a, Il1b 및 Il6일 수 있다. 다양한 양태에서, 대상체는 골격근 내에 존재하는 노화 세포의 수준에 기초하고/하거나 하나 이상의 노화 마커의 존재 또는 수준에 기초하여 치료를 위해 선택(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 일부 경우에, 골격근 내의 노화 세포의 존재(예를 들어, 젊은 근육에서 전형적으로 발견되는 수보다 높은 수) 및/또는 하나 이상의 노화 마커의 존재 및/또는 수준은 치료(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 것)가 치료적 이점을 제공할 가능성이 있음을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 노화 세포는 15-PGDH를 발현(예를 들어, 노화된 골격근 내에서 PGE2의 수준을 감소시키는 데 효과적인 수준에서)할 수 있다. 일부 경우에, 노화 세포는 대식세포일 수 있다.
다양한 양태에서, 대상체는 하나 이상의 노화 바이오마커를 발현할 수 있다. 노화의 바이오마커는, 비제한적으로, 15-PGDH 수준의 증가(예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해), PGE2 수준의 감소(예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해), PGE2 대사물의 증가(예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해), 노화 세포의 증가 또는 더 큰 축적(예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해), 하나 이상의 아트로젠(예를 들어, Atrogin1(MAFbx1), MuSA(Fbxo30) 및 Trim63(MuRF1))의 발현의 증가(예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해), 미토콘드리아 생물발생 및/또는 기능의 감소(예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해), 및 전환 성장 인자 경로 신호전달의 증가(예를 들어, 전환 성장 인자 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 액티빈 수용체, 미오스타틴, SMAD 단백질 및 골 형태형성 단백질 중 하나 이상의 발현의 증가)(예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 노화의 바이오마커는 (예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해) (예를 들어, 노화된 골격근 내에서) 15-PGDH의 증가된 수준 또는 활성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 노화의 바이오마커는 (예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해) (예를 들어, 노화된 골격근 내에서) PGE2의 감소된 수준을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 노화의 바이오마커는 (예를 들어, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비해) 증가된 수준의 PGE2 대사물(예를 들어, 15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 노화의 바이오마커의 존재는 대상체가 본원에 개시된 임의의 방법에 따른 치료로부터 이익을 얻을 수 있음을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 하나 이상의 노화 바이오마커의 존재에 기초하여 본원에 개시된 방법(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함)에 의한 치료를 위해 선택된다.
다양한 양태에서, 노화된 골격근 내에 존재하는 PGE2의 수준은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 골격근에 존재하는 수준에 비해 증가(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 골격근에서 PGE2 수준은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 골격근에 존재하는 수준에 비해 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 이상)만큼 증가(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 다양한 양태에서, 노화된 골격근 내에 존재하는 PGE2의 수준은 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준까지 증가(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 골격근에서 PGE2 수준은 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내(예를 들어, 약 40% 이내, 약 35% 이내, 약 30% 이내, 약 25% 이내, 약 20% 이내, 약 15% 이내, 약 10% 이내, 약 5% 이내 또는 약 1% 이내)의 수준까지 증가(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다.
다양한 양태에서, 노화된 골격근 내에 존재하는 PGE2 대사물의 수준은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 골격근에 존재하는 수준에 비해 감소(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 골격근에서 PGE2 대사물 수준은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 골격근에 존재하는 수준에 비해 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 이상)만큼 감소(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 다양한 양태에서, 노화된 골격근 내에 존재하는 PGE2 대사물의 수준은 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준까지 감소(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 골격근에서 PGE2 대사물 수준은 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내(예를 들어, 약 40% 이내, 약 35% 이내, 약 30% 이내, 약 25% 이내, 약 20% 이내, 약 15% 이내, 약 10% 이내, 약 5% 이내 또는 약 1% 이내)의 수준까지 감소(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. PGE2 대사물은 15-케토 PGE2, 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2, 또는 둘 모두일 수 있다.
일부 경우에, 치료(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함)는 근섬유 및/또는 근관 단면적 및/또는 직경의 증가(예를 들어, 치료 전의 노화된 골격근에 비해, 및/또는 젊은 골격근의 수준과 실질적으로 유사한(또는 50% 이하 이내) 수준까지 증가)를 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 치료(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함)는 산화(타입 IIa) 및/또는 해당(타입 IIb) 섬유의 단면적 및/또는 직경의 증가(예를 들어, 치료 전의 노화된 골격근에 비해, 및/또는 젊은 골격근의 수준과 실질적으로 유사한(또는 약 50% 이하 이내) 수준까지 증가)를 발생시킬 수 있다.
일부 경우에, 치료(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함)는 Atrogin1(MAFbx1), MuSA(Fbxo30) 및 Trim63(MuRF1)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아트로젠의 발현 수준(예를 들어, 노화된 골격근에서)의 감소(예를 들어, 치료 전의 노화된 골격근에 비해, 및/또는 젊은 골격근의 수준과 실질적으로 유사한(또는 약 50% 이하 이내) 수준까지 증가)를 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 치료(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함)는 미토콘드리아 복합체의 하나 이상의 구성요소의 발현 수준(예를 들어, 노화된 골격근에서)의 증가(예를 들어, 치료 전의 노화된 골격근에 비해, 및/또는 젊은 골격근의 수준과 실질적으로 유사한(또는 약 50% 이하 이내) 수준까지 증가)를 발생시킬 수 있다. 하나 이상의 미토콘드리아 복합체의 구성요소는 Ndufa11, Ndufa12, Ndufa13, Ndufa2, Ndufa3, Ndufa4, Ndufa5, Ndufa10, Ndufb5, Ndufc1, Ndufs4, Ndufs8, Ndufv1, Ndufv2, Uqcrb, Uqcrc1, Uqcrh, Uqcrq, Ucqr10, Cox8b, Cox7a1, Cox7a2, Cox7b, Cox6c, Cox5a, Cox5b, Atp5f1, Atp5g1, Atp5h, Atp5j2, Atp5o, Atp5e 및 Atp5k로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 치료(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함)는 과산화소체 증식제-활성화된 수용체 감마 보조활성인자 1-알파(Pgc1α)의 발현 수준의 증가(예를 들어, 치료 전의 노화된 골격근에 비해, 및/또는 젊은 골격근의 수준과 실질적으로 유사한(또는 약 50% 이하 이내) 수준까지 증가)를 발생시킬 수 있다. 일부 경우에, 치료(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함)는 Tnfaip1, Klhdc8a, Fbxw11, Tnfaip3, Herc3, Herc2, Hdac4, Traf6, Ankib1, Mib1, Pja2, Ubr3, Thbs1, Smad3, Acvr2a, Rgmb, Tgfb2 및 Mstn으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준의 감소(예를 들어, 치료 전의 노화된 골격근에 비해, 및/또는 젊은 골격근의 수준과 실질적으로 유사한(또는 약 50% 이하 이내) 수준까지 증가)를 발생시킬 수 있다.
다양한 양태에서, 노화된 골격근의 근육 기능은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 골격근에 비해 향상(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 골격근의 근육 기능은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 골격근에 비해 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 이상)만큼 향상(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 다양한 양태에서, 노화된 골격근의 근육 기능은 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준까지 향상(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 골격근의 근육 기능은 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내(예를 들어, 약 40% 이내, 약 35% 이내, 약 30% 이내, 약 25% 이내, 약 20% 이내, 약 15% 이내, 약 10% 이내, 약 5% 이내 또는 약 1% 이내)의 수준까지 향상(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 근육 기능은 증가된 단백질 합성, 증가된 세포 증식, 증가된 세포 생존, 감소된 단백질 분해 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
다양한 양태에서, 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 골격근에 비해 증가(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 골격근에 비해 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 이상)만큼 증가(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 다양한 양태에서, 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력은 젊은 골격근과 실질적으로 유사한 수준까지 증가(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력은 젊은 골격근의 약 50% 이하 이내(예를 들어, 약 40% 이내, 약 35% 이내, 약 30% 이내, 약 25% 이내, 약 20% 이내, 약 15% 이내, 약 10% 이내, 약 5% 이내 또는 약 1% 이내)의 수준까지 증가(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명의 개시는 대상체에서 골격근의 기능을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 골격근에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 대상체에 투여하여 대상체에서 골격근의 기능을 향상시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 골격근은 건강한 골격근이다. 일부 경우에, 골격근은 손상되지 않고/않거나, 재생을 겪지 않았거나 겪지 않고/않거나, 유의하거나 실질적인 운동을 겪지 않았거나 겪지 않는다. 일부 경우에, 골격근은 이영양증, 위축성 또는 노화된 골격근이 아니다. 일부 경우에, 상기 방법은 대상체에서 근육 줄기 세포의 증식의 증가와 독립적이다. 일부 경우에, 골격근은 젊은 골격근이다. 일부 경우에, 대상체는 30세 미만(예를 들어, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1세)이다. 다양한 양태에서, 상기 방법은 근육 질량의 증가, 근육 강도의 증가, 근육 지구력의 증가 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용한, 예를 들어, 치료 전의 골격근에 비함)을 발생시킨다. 다양한 양태에서, 상기 방법은 단백질 합성의 증가, 세포 증식의 증가, 세포 생존의 증가, 단백질 분해의 감소 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용한, 예를 들어, 치료 전의 골격근에 비함)을 발생시킨다.
본 발명의 개시는 15-PGDH 억제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에서 노화된 및/또는 위축성 근육의 기능을 증가시키는 방법을 추가로 제공한다. 15-PGDH 억제제의 투여는, 예를 들어, 근육 내 주사에 의해 전신 또는 국소적일 수 있고, 대상체에서 질량, 기능, 강도, 지구력, 운동 성능 또는 근육 기능의 임의의 다른 척도를 향상시키는 것을 포함하는 노화된 및/또는 위축된 근육의 임의의 다수의 양태를 향상시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체에서 노화된 및/또는 위축된 근육에서 근섬유 및/또는 근관의 크기의 증가, 예를 들어, 이들의 직경 또는 단면의 증가를 초래한다. 다른 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체, 특히 성숙한 근육 세포에서 근육 세포 사멸에 대한 보호를 발생시킨다.
특정 구현예에서, 대상체에서 15-PGDH의 억제는 대상체의 근육에서 PGE2의 증가, 예를 들어, PGE2 수준의 상승, 증가 또는 회복 및 PGE2 대사물, 예를 들어, 15-케토-PGE2 또는 13,14-디하이드로-15-케토-PGE2(PGEM)의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 억제는 또한 대상체의 위축된 및/또는 노화된 근육에서 EP4 활성의 증가를 초래한다. 일부 구현예에서, 억제는 또한 대상체의 위축된 및/또는 노화된 근육에서 Atrogin1 수준 또는 활성의 감소를 초래한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 15-PGDH 억제제 투여의 이점, 예를 들어, 향상된 근육 강도, 질량, 운동 성능, 지구력, 근섬유 또는 근관 크기 등은 대상체의 위축된 및/또는 노화된 근육에서 근육 줄기 세포(MuSC)의 수 또는 증식의 임의의 증가와 독립적으로 발생한다. 즉, 대상체에서 MuSC의 수 또는 증식의 증가가 존재할 수 있지만, 본원에 기재된 효과는 MuSC를 필요로 하지 않으며, MuSC의 수 또는 증식의 증가 없이도 발생할 것이다. 특정 구현예에서, 노화된 및/또는 위축성 근육은 손상되지 않거나 운동 또는 재생을 겪지 않는다.
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 노화 및/또는 위축된 근육 내의 노화 세포, 예를 들어, 대식세포 및/또는 섬유지방성 전구(FAP) 세포에서 15-PGDH 활성을 억제하거나 15-PGDH 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로의 세놀리틱 제제의 투여를 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 세놀리틱 제제의 예는 특히 Bcl2 억제제, 예를 들어, 나비토클락스(ABT-263으로도 공지됨) 및 ABT-737, 다사티닙과 같은 판-티로신 키나제 억제제와 함께 케르세틴과 같은 플라보노이드, FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드, 예를 들어, FOXO4-DRI, 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, 다사티닙 및 케르세틴을 포함하는 조합 요법, 및 HSP90 억제제, 예를 들어, 17-DMAG를 포함한다. 세놀리틱 제제는, 예를 들어, 단일 약학적 제형 내에서, 또는 개별적으로 15-PGDH 억제제와 함께 투여될 수 있음이 인지될 것이다.
대상체
대상체는 노화된 및/또는 위축성 골격근을 갖거나 노화된 및/또는 위축성 골격근을 가질 위험이 있는 임의의 대상체, 예를 들어, 인간 또는 기타 포유동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 성인(예를 들어, 연령-관련 근감소증을 갖는 성인)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 아동(예를 들어, 뒤시엔느 근이영양증과 같은 근이영양증을 갖는 아동)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 여성(예를 들어, 성인 여성)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 남성(예를 들어, 성인 남성)이다.
일부 구현예에서, 대상체는 인간이고, 상기 방법은 인간이 그 또는 그녀의 연령을 기준으로 15-PGDH 억제제를 이용한 치료를 위해 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 인간은 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100세 이상의 연령, 또는 인간이 근감소증 또는 노화된 근육을 갖거나 잠재적으로 갖는 임의의 연령을 기초로 하여 치료를 위해 선택될 수 있다. 일부 구현에에서, 대상체는 근육 강도 또는 기능을 평가하는 임의의 방법, 예를 들어, 그립 시험, 보행 속도, 근력 시험, 기능 시험, 저항 시험 또는 트레드밀을 사용하고/하거나, 영상화 기반 시험에 의하고/의하거나, 근육 질량의 평가에 의하고/의하거나, 예를 들어, 의사 또는 다른 자격을 갖춘 의료 전문가에 의해 대상체로부터 채취된 근육 생검에서의 분자 또는 세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 노화된 및/또는 위축성 근육을 갖는 것으로 결정된다.
일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병, 쇠약, 근이영양증, 근감소성 비만, 신경병증, 악액질, 예를 들어, 암 악액질 또는 HIV 악액질과 같은 근육 위축과 관련된 질환 또는 질병을 갖거나, 고정화 또는 근육 불용으로 인한 근육 위축을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 뒤시엔느 근이영양증(DMD), 베커 근이영양증, 선천성 근이영양증, 원위 근이영양증, 에머리-드레이푸스 근이영양증, 안면견갑상완근 근이영양증, 지대근 근이영양증, 근긴장성 근이영양증(MDD) 및 안인두근 근이영양증으로 구성된 군으로부터 선택되는 근이영양증을 갖는다. 특정 구현예에서, 근이영양증은 뒤시엔느 근이영양증이다.
특정 구현예에서, 근육은 골격근이다. 일부 구현예에서, 근육은 손상되지 않고/않거나 운동 또는 재생을 겪지 않는다. 근육은 복합 흉근(musculi pectoralis complex), 광배근, 대원근 및 견갑하근, 상완요골근, 이두근, 상완근, 방형회내근, 원형회내근, 요측수근굴근, 척측수근굴근, 표재지굴근, 심수지굴근, 단수무지굴근, 무지대립근, 엄지모음근, 단수무지굴근, 장요근, 허리근, 복직근, 대퇴직근, 대둔근, 중둔근, 내측 슬건, 비복근, 외측 슬건, 대퇴사두근 기전, 장수내전근, 단내전근, 대내전근, 내측비복근, 외측비복근, 가자미근, 후경골근, 전경골근, 장지굴근, 단지굴근, 장족무지굴근, 장족무지신근, 안구 근육, 인두 근육, 괄약근 근육, 손 근육, 팔 근육, 발 근육, 다리 근육, 가슴 근육, 배 근육, 등 근육, 엉덩이 근육, 어깨 근육, 두경부 근육 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 신체의 임의의 근육일 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 근육 위축과 관련된 질환 또는 질병의 진단에 기초하거나; 근육 위축의 존재 또는 이에 대한 잠재성의 결정에 기초하거나; 대상체의 연령, 예를 들어, 근감소증 또는 근감소증에 대한 잠재성과 관련된 연령에 기초하거나, 노화된 및/또는 위축성 근육의 본원에 기재된 특징 중 임의의 것의 검출에 기초하여 치료를 위해 확인된다. 예를 들어, PGE2 대사물, 예를 들어, 15-케토-PGE2 또는 PGEM의 상승된 수준, 근육에서의 감소된 단백질 합성, 감소된 근섬유 및/또는 근관 크기, 감소된 근육 질량, 감소된 근육 강도, 기능 또는 지구력, Atrogin1의 증가된 수준 또는 활성, EP4의 감소된 활성, 노화 표현형과 관련된 유전자, 예를 들어, Ptges, Cox2의 상승된 발현, 노화 세포의 상승된 수, 하나 이상의 노화 마커의 존재, 특히 노화 세포, 예를 들어, 대식세포 및/또는 섬유지방성 전구 세포에서의 15-PGDH의 상승된 수준 또는 활성의 근육에서의 검출은 대상체가 15-PGDH 억제제를 이용한 치료를 위한 후보임을 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 검출은 근육이 손상되지 않거나 운동 또는 재생을 겪지 않는 경우에 이루어진다.
대상체에서 근육 기능, 강도, 지구력, 질량 또는 본원에 기재된 특징 중 임의의 특징의 평가는 당업자에게 공지된 임의의 매우 다양한 방법을 사용하여, 예를 들어, 근육 성능의 분석에 의해, 예를 들어, 그립 테스트, 보행 속도, 근력 시험, 기능 시험, 저항 시험 또는 트레드밀에 의해, 영상화 기반 시험에 의해, 근육 질량의 평가에 의해, 및/또는, 예를 들어, 대상체로부터 채취한 근육 생검에서의 분자 또는 세포 분석에 의해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 농장 동물, 예를 들어, 인간 소비를 위한 가축, 예를 들어, 돼지, 소, 양, 가금류 또는 어류이고, 상기 방법은, 예를 들어, 노화 동물, 예를 들어, 노화된 및/또는 위축성 근육을 갖는 동물에서 근육 질량, 기능 또는 강도를 향상시키기 위해 사용된다. 일부 상기 구현예에서, 동물에게 15-PGDH의 소분자 억제제가 투여된다. 일부 구현예에서, 15-PGDH의 핵산 억제제, 예를 들어, shRNA를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트는 핵산 억제제가 동물의 세포, 예를 들어, 근육 세포에서 발현되도록 동물에 도입된다. 일부 구현예에서, 15-PGDH의 폴리펩티드 억제제, 예를 들어, 항체 또는 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트는 폴리펩티드 억제제가 동물의 세포, 예를 들어, 근육 세포에서 발현되도록 동물에 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 요법은, 예를 들어, 내인성 15-PGDH 인코딩 유전자의 전부 또는 일부가 동물의 세포, 예를 들어, 근육 세포에서 덜 활성이거나, 덜 안정하거나, 덜 고도로 발현되는 유전자의 형태로 대체되도록 사용된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 15-PGDH 억제제를 인코딩하는 변형된 RNA, 예를 들어, shRNA 또는 화학적으로 변형된 mRNA와 같은 화학적으로 변형된 RNA 억제제는 RNA 억제제 또는 발현된 단백질 억제제가 동물의 근육 세포에 존재하도록 동물에 도입된다.
5. 연령-관련 질환을 갖는 대상체에서 조직 기능을 향상시키는 방법
또 다른 구현예에서, 대상체에서 노화된 비-골격근 조직을 젊어지게 하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 15-PGDH를 억제하는 데 효과적인 15-PGDH 억제제의 양을 대상체에 투여하여 노화된 비-골격근 조직을 젊어지게 하는 것을 포함한다.
다양한 양태에서, 노화된 비-골격근 조직은 하나 이상의 노화 세포(예를 들어, 노화된 조직 내에 또는 근처에 존재함)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직은 복수의 노화 세포(예를 들어, 노화된 조직 내에 또는 근처에 존재함)를 가질 수 있다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직은 노화 세포의 증가된 축적(예를 들어, 노화된 비-골격근 조직 내 또는 근처에서)(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 비해)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직은 젊은 비-골격근 조직에서 전형적으로 발견되는 수보다 높은(예를 들어, 실질적으로 더 높은) 노화 세포의 수를 가질 수 있다. 노화 세포는 하나 이상의 노화 마커를 발현할 수 있다. 노화 세포는 비-노화 세포에 비해 하나 이상의 노화 마커의 증가된 수준을 가질 수 있다. 하나 이상의 노화 마커는, 비제한적으로, p15Ink4b, p16Ink4a, p19Arf, p21, Mmp13, Il1a, Il1b 및 Il6일 수 있다. 다양한 양태에서, 대상체는 노화된 비-골격근 조직 내에 존재하는 노화 세포의 수준에 기초하고/하거나 하나 이상의 노화 마커의 존재 또는 수준에 기초하여 치료를 위해 선택(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 일부 경우에, 노화된 비-골격근 조직 내의 노화 세포의 존재(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에서 전형적으로 발견되는 수보다 높은 수) 및/또는 하나 이상의 노화 마커의 존재 및/또는 수준은 치료(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 것)가 치료적 이점을 제공할 가능성이 있음을 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 노화 세포는 15-PGDH를 발현(예를 들어, 노화된 비-골격근 조직 내에서 PGE2의 수준을 감소시키는 데 효과적인 수준에서)할 수 있다. 일부 경우에, 노화 세포는 대식세포일 수 있다.
다양한 양태에서, 대상체는 하나 이상의 노화 바이오마커를 발현할 수 있다. 노화의 바이오마커는, 비제한적으로, 15-PGDH 수준의 증가(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해), PGE2 수준의 감소(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해), PGE2 대사물의 증가(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해), 노화 세포의 증가 또는 더 큰 축적(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해), 하나 이상의 아트로젠(예를 들어, Atrogin1(MAFbx1), MuSA(Fbxo30) 및 Trim63(MuRF1))의 발현의 증가(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해), 미토콘드리아 생물발생 및/또는 기능의 감소(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해), 및 전환 성장 인자 경로 신호전달의 증가(예를 들어, 전환 성장 인자 신호전달 경로와 관련된 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 액티빈 수용체, 미오스타틴, SMAD 단백질 및 골 형태형성 단백질 중 하나 이상의 발현의 증가)(예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 노화의 바이오마커는 (예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해) (예를 들어, 노화된 비-골격근 조직 내에서) 15-PGDH의 증가된 수준 또는 활성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 노화의 바이오마커는 (예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해) (예를 들어, 노화된 비-골격근 조직 내에서) PGE2의 감소된 수준을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 노화의 바이오마커는 (예를 들어, 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해) PGE2 대사물(예를 들어, 노화된 비-골격근 조직 내에서, 예를 들어, 15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2)의 증가된 수준을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 노화의 바이오마커의 존재는 대상체가 본원에 개시된 임의의 방법에 따른 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있음을 나타낼 수 있다. 젊은 비-골격근은 30세 미만(예를 들어, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1세)의 대상체로부터의 비-골격근을 포함할 수 있다.
다양한 양태에서, 노화된 비-골격근 조직 내에 존재하는 PGE2의 수준은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해 증가(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 비-골격근 조직에서 PGE2 수준은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 이상)만큼 증가(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 다양한 양태에서, 노화된 비-골격근 조직 내에 존재하는 PGE2의 수준은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준까지 증가(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 비-골격근 조직에서 PGE2 수준은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내(예를 들어, 약 40% 이내, 약 35% 이내, 약 30% 이내, 약 25% 이내, 약 20% 이내, 약 15% 이내, 약 10% 이내, 약 5% 이내 또는 약 1% 이내)의 수준까지 증가(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다.
다양한 양태에서, 노화된 비-골격근 조직 내에 존재하는 PGE2 대사물의 수준은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해 감소(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 비-골격근 조직에서 PGE2 대사물 수준은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 이상)만큼 감소(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 다양한 양태에서, 노화된 비-골격근 조직 내에 존재하는 PGE2 대사물의 수준은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준까지 감소(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 비-골격근 조직에서 PGE2 대사물 수준은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내(예를 들어, 약 40% 이내, 약 35% 이내, 약 30% 이내, 약 25% 이내, 약 20% 이내, 약 15% 이내, 약 10% 이내, 약 5% 이내 또는 약 1% 이내)의 수준까지 감소(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. PGE2 대사물은 15-케토 PGE2, 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2, 또는 둘 모두일 수 있다. PGE2 대사물은 15-케토 PGE2, 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2, 또는 둘 모두일 수 있다.
다양한 양태에서, 노화된 비-골격근 조직의 기능은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 비-골격근 조직에 비해 향상(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 비-골격근 조직의 기능은 치료(예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함) 전의 노화된 비-골격근 조직에 존재하는 수준에 비해 적어도 10%(예를 들어, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70% 이상)만큼 향상(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 다양한 양태에서, 노화된 비-골격근 조직의 기능은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준까지 향상(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 이용한 치료 후)될 수 있다. 노화된 비-골격근 조직의 기능은 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내(예를 들어, 약 40% 이내, 약 35% 이내, 약 30% 이내, 약 25% 이내, 약 20% 이내, 약 15% 이내, 약 10% 이내, 약 5% 이내, 약 1% 이내)의 수준까지 향상(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해)될 수 있다. 기능은 증가된 단백질 합성, 증가된 세포 증식, 증가된 세포 생존, 감소된 단백질 분해 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 치료(예를 들어, 본원에 제공된 방법에 따라, 예를 들어, 15-PGDH 억제제를 사용함)는 노화된 비-골격근 조직의 젊어짐(rejuvenation)(예를 들어, 노화된 비-골격근 조직의 하나 이상의 기능의 증가)을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 개시는 15-PGDH 억제제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 연령-관련 질환 또는 질병을 갖는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에서 비-골격근 조직의 기능, 건강 및 기타 특성을 증가시키는 방법을 제공한다. 15-PGDH 억제제의 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있으며, 대상체에서 조직 기능 또는 조직 기능 또는 건강의 임의의 다른 척도를 평가하기 위한 임의의 검정에서 기능, 생리학적 활성, 지구력, 성능을 향상시키는 것을 포함하여 조직의 임의의 다양한 양태를 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체에서 비-골격근 조직에서 세포 사멸에 대한 보호를 발생시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체에서 비-골격근 조직에서 단백질 분해를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체에서 비-골격근 조직에서 단백질 합성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 (예를 들어, 트레드밀에서 측정되는 바와 같이, 예를 들어, 운동 동안) 지구력을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 대상체의 증가된 지구력(예를 들어, 운동 동안)은 노화된 비-골격근 조직(예를 들어, 심장, 폐, 뼈 등)의 증가된 기능 및/또는 젊어짐으로 인한 것일 수 있다.
본 발명의 개시는 또한 연령-관련 질환을 갖는 대상체의 비-골격근 조직에서 15-PGDH 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 예를 들어, 노화 또는 노화된 비-골격근 조직의 바이오마커로서의 15-PGDH의 사용 및/또는, 예를 들어, 15-PDGH 수준 또는 활성의 상승된 수준, 예를 들어, 연령-관련 질환이 없는 대상체에서의 대조군 수준에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상의 증가가 조직에서 노화 또는 기능의 손실 또는 감소를 나타내는 비-골격근 조직의 기능의 손실 또는 감소에 대해 유용하다. 상기 방법에서, 15-PGDH는, 예를 들어, 15-PGDH 단백질을 인코딩하는 전사체의 수준을 검출하거나, 15-PGDH 폴리펩티드의 수준을 검출하거나, 15-PGDH 효소적 활성을 검출함으로써 임의의 다수의 방식으로 평가될 수 있다.
특정 구현예에서, 대상체에서 15-PGDH의 억제는 PGE2 및/또는 PGD2의 증가, 예를 들어, 대상체의 비-골격근 조직에서 PGE2 및/또는 PGD2 수준의 상승, 증가 또는 회복, 및 15-케토-PGE2, 13,14-디하이드로-15-케토-PGE2(PGEM), 15-케토-PGD2 및 13,14-디하이드로-15-케토-PGD2와 같은 PGE2 및/또는 PGD2 대사물의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 억제는 또한 비-골격근 조직에서 PGE2 수용체, 예를 들어, EP1, EP2, EP3 및/또는 EP4(Ptger1, Ptger2, Ptger3, Ptger4로도 공지됨)를 통한 증가된 신호전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 억제는 또한 PGD2 수용체, 예를 들어, DP1 및/또는 DP2(PTGDR1, PTGDR2/CRTH2로도 공지됨)를 통한 증가된 신호전달을 초래한다.
특정 구현예에서, 비-골격근 조직에서 15-PGDH 억제제 투여의 본원에 기재된 이점, 예를 들어, 향상된 조직 건강, 기능, 생리학적 활성 등은 대상체에서 조직의 임의의 재생과 독립적으로 발생한다. 즉, 예를 들어, 조직이 상처나거나 손상된 경우에 대상체에서 조직의 재생이 있을 수 있지만, 본원에 기재된 효과는 재생을 필요로 하지 않으며 재생 없이도 발생할 것이다. 특정 구현예에서, 비-골격근 조직은 상처나거나 손상되지 않으며, 재생을 겪지 않았거나 겪지 않는다.
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제의 투여는 대상체의 비-골격근 조직 내의 노화 세포, 예를 들어, 대식세포, 섬유지방세포(fibroadipocyte), 기타 단핵 간질 조직 상주 세포, 예를 들어, 기타 면역 세포, 섬유모세포, 내피 세포, 지방전구세포 및/또는 지방세포에서 15-PGDH 활성을 억제하거나 15-PGDH 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체로의 세놀리틱 제제의 투여를 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 세놀리틱 제제의 예는 특히 Bcl2 억제제, 예를 들어, 나비토클락스(ABT-263으로도 공지됨) 및 ABT-737, 다사티닙과 같은 판-티로신 키나제 억제제와 함께 케르세틴과 같은 플라보노이드, FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드, 예를 들어, FOXO4-DRI, 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, 다사티닙 및 케르세틴을 포함하는 조합 약물 요법, 및 HSP90 억제제, 예를 들어, 17-DMAG를 포함한다. 세놀리틱 제제는, 예를 들어, 단일 약학적 제형 내에서, 또는 개별적으로 15-PGDH 억제제와 함께 투여될 수 있음이 인지될 것이다.
대상체
대상체는 연령-관련 질환을 갖거나 연령-관련 질환을 가질 위험이 있는 임의의 대상체, 예를 들어, 인간 또는 다른 포유동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 성인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 아동(예를 들어, 조로증을 갖는 아동)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 여성(예를 들어, 성인 여성)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 남성(예를 들어, 성인 남성)이다.
일부 구현예에서, 대상체는 인간이고, 상기 방법은 연령-관련 질환 또는 질병의 진단, 또는 연령-관련 질환 또는 질병이 발생할 잠재성 또는 위험에 기초하여 15-PGDH 억제제를 이용한 치료를 위해 인간이 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 인간은 그 또는 그녀의 연령에 기초하여 선택된다. 예를 들어, 인간은 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100세 이상의 연령, 또는 인간이 연령-관련 질환 또는 질병을 갖거나 잠재적으로 갖는 임의의 연령을 기초로 하여 치료를 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간은 흡연, 음주, 식이, 신체 활동 부족, 불충분한 수면, 약물 사용, UV 선에 대한 노출, 극한 온도에 대한 노출, 스트레스, 과체중과 같은 하나 이상의 비-골격근 조직의 조기 노화와 관련된 환경, 생활방식 또는 의학적 요인, 또는 감염, 정신 질환, 암, 당뇨병 등과 같은 건강-관련 요인의 존재 또는 잠재적 존재에 기초하여 연령-관련 질환 또는 질병에 대한 잠재성을 기초로 하여 선택된다. 일부 구현예에서, 대상체는 하나 이상의 조직의 조기 노화에 의해 야기되는 연령-관련 질환, 예를 들어, 유전 장애, 예를 들어, 불완전골생성증, 블룸 증후군, 코케인 증후군, 허친슨-길포드 조로 증후군, 하악말단지골 이형성증, 조로증, 프로제로이드 증후군, 로트문드-톰슨 증후군, 세이프 증후군, 베르너 증후군, 다운 증후군, 선단노화증, 로트문드-톰슨 증후군, 모세관확장실조와 같은 조기 노화 증후군으로 이어지는 이들 조직의 면역결핍, 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 조기 노화 증후군으로 이어지는 이들 조직의 감염성 질병을 갖는다.
일부 구현예에서, 대상체는 비-골격근 조직의 기능, 성능, 건강, 강도, 지구력, 생리학적 활성 또는 임의의 다른 특성의 임의의 척도를 평가하는 임의의 방법, 예를 들어, 성능-기반, 영상화-기반, 생리학적, 분자, 세포 또는 기능 검정을 사용하여 결정된 바와 같이 노화된 조직을 갖거나, 연령-관련 질환 또는 질병을 갖는 것으로 결정된다. 예를 들어, 심장은 혈관조영상, 심전도, 트레드밀 시험, 심장초음파상 등과 같은 심장 기능 또는 건강을 평가하는 임의의 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-골격근 관련 조직에서 15-PGDH 전사체, 단백질 또는 효소적 활성의 상승된 수준의 검출, 또는 조직에서 PGE2 및/또는 PGD2의 감소된 수준의 검출에 기초하여 치료를 위해 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 비-골격근 조직의 건강, 기능, 성능 또는 임의의 다른 특성을 평가하는 것을 포함하거나, 예를 들어, 조직에 대한 15-PGDH 억제제의 이전 투여의 잠재적 효과를 확인하기 위해 대상체의 비-골격근 조직 내의 15-PGDH(예를 들어, 15-PGDH 단백질, 전사체 또는 활성) 및/또는 PGE2 및/또는 PGD2의 수준을 평가하는 것을 포함하는 15-PGDH 억제제의 투여에 후속하는 추가 단계를 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 조직의 건강, 기능, 성능, 15-PGDH 수준, PGE2 수준, PGD2 수준 또는 다른 특성이 검출되거나 검사되고, 15-PGDH 억제제의 투여 전의 조직의 건강, 기능, 성능, 15-PGDH 수준, PGE2 수준, PGD2 수준 또는 다른 특성 또는 대조군 값과 비교되며, 여기서 15-PGDH 억제제의 투여 전에 획득된 값과 비교하거나 대조군 값에 비해 억제제의 투여 이후에 조직에서 조직의 건강, 기능 또는 성능이 개선되고, 15-PGDH 수준이 감소되고, PGE2 수준 및/또는 PGD2 수준이 증가되었다는 결정은 15-PGDH 억제제가 대상체의 비-골격근 조직에서 이로운 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에서, 대상체는 연령-관련 질환, 장애 또는 질병, 예를 들어, 심혈관 질병 또는 질환(예를 들어, 심방 세동, 뇌졸중, 허혈성 심장 질병, 심근병증, 심내막염, 뇌내 출혈, 고혈압), 만성 호흡기 질병 또는 질환(예를 들어, 만성 폐쇄폐병, 석면증, 규폐증), 영양 질병 또는 질환(예를 들어, 트라코마, 설사 질병, 뇌염), 신장 질병 또는 질환(예를 들어, 만성 신장 질병), 위장 또는 소화 질병 또는 질환(예를 들어, NASH, 췌장염, 궤양, 장 폐색), 신경학적 장애(예를 들어, 알츠하이머병, 치매, 파킨슨병, 인지 저하), 감각 장애(예를 들어, 청력 상실, 시력 상실, 후각 또는 미각 상실, 황반 변성, 색소성 망막염, 녹내장), 피부 또는 피하 질병 또는 질환(예를 들어, 연조직염, 궤양, 진균성 피부 질병, 고름피부증), 골다공증, 골관절염, 류마티스 관절염, 하나 이상의 비-골격근 조직에서 조기 노화를 유발하는 유전적 질병(예를 들어, 조로증, 불완전 골형성, 블룸 증후군, 코케인 증후군, 허친슨-길포드 조로 증후군, 하악말단지골 이형성증, 프로제로이드 증후군, 로트문드-톰슨 증후군, 세이프 증후군, 베르너 증후군, 다운 증후군, 선단노화증, 로트문드-톰슨 증후군), 조기 노화 증후군으로 이어지는 이들 조직의 면역결핍(예를 들어, 모세관확장실조), 또는 조기 노화 증후군으로 이어지는 이들 조직의 감염성 질병(예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)) 등을 갖는다.
15-PGDH 억제제의 투여는 임의의 이들 질환의 개선을 제공할 수 있고, 예를 들어, 골다공증, 탈모, 노화된 피부, 인지 장애, 감각 장애, 노화된 조혈 줄기 세포 기능 및 위장 기능을 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 임의의 비-골격근 조직, 또는 상기 조직을 포함하는 기관, 또는 상기 조직 내의 세포, 예를 들어, 상피 조직, 신경 조직, 결합 조직, 평활근, 심장 근육, 표피 조직, 혈관 조직, 심장, 신장, 뇌, 뼈, 연골, 갈색 지방, 비장, 간, 결장, 감각 기관, 갑상선, 폐, 혈액, 소장, 치아 조직, 난소 또는 기타 생식 조직, 모발, 와우, 회소돌기아교세포 등을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 연령-관련 질환, 장애 또는 질병의 진단을 기초로 하거나; 비-골격근 조직 기능, 건강 또는 성능의 연령-관련 손실의 존재 또는 이에 대한 잠재성의 결정을 기초로 하거나; 대상체의 연령, 예를 들어, 연령-관련 질환 또는 장애와 관련된 연령을 기초로 하거나; 노화된 비-골격근 조직의 임의의 본원에 기재된 특징, 예를 들어, 15-케토-PGE2, PGEM, 15-케토-PGD2 또는 13,14-디하이드로-15-PGD2와 같은 PGE2 및/또는 PGD2 대사물의 상승된 수준, PGE2 및/또는 PGD2의 감소된 수준, 감소된 단백질 합성, 감소된 미토콘드리아 활성, EP1, EP2, EP3, EP4, DP1 및/또는 DP2 수용체를 통한 감소된 신호전달, p16(Ink4a) 또는 p21(Cdkn1a)와 같은 노화 표현형과 관련된 유전자의 상승된 발현, 조직의 세포에서 짧아진 텔로미어 길이, 비-골격근 조직에서 노화 세포의 상승된 수, 또는 특히 노화 세포, 예를 들어, 대식세포, 섬유지방세포, 섬유모세포, 내피 세포 등에서 15-PGDH의 상승된 수준 또는 활성의 검출을 기초로 하여 치료를 위해 확인된다.
일부 구현예에서, 대상체는 애완 동물 또는 돼지, 소, 양, 가금류 또는 어류와 같은 농장 동물이고, 상기 방법은, 예를 들어, 노화 동물에서 비-골격근 조직 기능 또는 건강을 향상시키기 위해 사용된다. 일부 상기 구현예에서, 동물에게 15-PGDH의 소분자 억제제가 투여된다. 일부 구현예에서, 15-PGDH의 핵산 억제제, 예를 들어, shRNA를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트는 핵산 억제제가 동물의 세포, 예를 들어, 비-골격근 조직의 세포에서 발현되도록 동물에 도입된다. 일부 구현예에서, 15-PGDH의 폴리펩티드 억제제, 예를 들어, 항체 또는 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 발현 카세트는 폴리펩티드 억제제가 동물의 세포, 예를 들어, 비-골격근 조직의 세포에서 발현되도록 동물에 도입된다. 일부 구현예에서, 유전자 요법은, 예를 들어, 내인성 15-PGDH 인코딩 유전자의 전부 또는 일부가 동물의 세포, 예를 들어, 비-골격근 조직 세포에서 덜 활성이거나, 덜 안정하거나, 덜 고도로 발현되는 유전자의 형태로 대체되도록 사용된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 15-PGDH 억제제를 인코딩하는 변형된 RNA, 예를 들어, shRNA 또는 화학적으로 변형된 mRNA와 같은 화학적으로 변형된 RNA 억제제는 RNA 억제제 또는 발현된 단백질 억제제가 동물의 세포에 존재하도록 동물에 도입된다.
6. 15-PGDH 수준 평가
예를 들어, 바이오마커로서 15-PGDH를 사용하거나 15-PGDH의 억제제의 효능을 평가하는 경우 비-골격근 조직 또는 골격근 조직에서 15-PGDH의 수준을 평가하기 위해, 임의의 다수의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 15-PGDH의 수준은 15-PGDH를 인코딩하는 유전자(예를 들어, Hpgd 유전자)의 전사를 검사하거나, 조직(예를 들어, 골격근 또는 비-골격근 조직)에서 15-PGDH 단백질의 수준을 검사하거나, 조직(예를 들어, 골격근 또는 비-골격근 조직)에서 15-PGDH 효소 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다. 상기 방법은 전체 조직 또는 조직 내의 세포 서브셋, 예를 들어, 노화 세포에 대해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어, 적절한 반응 완충액에서 15-PGDH 효소, NAD(+) 및 PGE2의 존재하에서 후보 화합물을 인큐베이션하고, NADH의 생성을 모니터링하는 것과 같은 표준 방법(예를 들어, 문헌[Zhang et al., (2015) Science 348: 1224] 참조)을 사용하거나, 형광측정 PicoProbe 15-PGDH Activity Assay Kit(BioVision)와 같은 임의의 다수의 이용 가능한 키트를 사용하거나, 예를 들어, 공보 EP2838533호에 기재된 임의의 방법 및/또는 지수를 사용함에 의한 15-PGDH 효소 활성의 측정을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 반-정량적 RT-PCR, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR), 정량적 RT-PCR(qRT-PCR), 다중화 분지형 DNA(bDNA) 검정, 마이크로어레이 하이브리드화, 또는 서열 분석(예를 들어, RNA 시퀀싱("RNA-Seq"))과 같은 일상적인 기술을 사용하여 분석될 수 있는 15-PGDH-인코딩 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA) 발현의 검출을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 발현을 정량하는 방법은, 예를 들어, 문헌[Fassbinder-Orth, Integrative and Comparative Biology, 2014, 54:396-406; Thellin et al., Biotechnology Advances, 2009, 27:323-333; 및 Zheng et al., Clinical Chemistry, 2006, 52:7 (doi: 10/1373/clinchem.2005.065078)]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 수준을 측정하기 위해 실시간 또는 정량적 PCR 또는 RT-PCR이 사용된다. 예를 들어, 문헌[Nolan et al., Nat. Protoc, 2006, 1:1559-1582; Wong et al., BioTechniques, 2005, 39:75-75]을 참조한다. 유전자 발현을 측정하기 위한 정량적 PCR 또는 RT-PCR 검정이 또한 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, TaqMan® Gene Expression Assays, ThermoFisher Scientific).
일부 구현예에서, 상기 방법은, 예를 들어, 당업자에게 공지된 면역검정, 2차원 젤 전기영동 및 정량적 질량 분광법과 같은 일상적인 기술을 사용함에 의한 15-PGDH 단백질 발현 또는 안정성의 검출을 포함한다. 단백질 정량화 기술은 일반적으로 문헌["Strategies for Protein Quantitation," Principles of Proteomics, 2nd Edition, R. Twyman, ed., Garland Science, 2013]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 또는 안정성은 면역검정, 비제한적인 예로, 효소 면역검정(EIA), 예를 들어, 효소 다중화 면역검정 기술(EMIT), 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), IgM 항체 포획 ELISA(MAC ELISA) 및 미세입자 효소 면역검정(MEIA); 모세관 전기영동 면역검정(CEIA); 방사선면역측정법(RIA); 면역방사측정법(IRMA); 면역형광(IF); 형광 분극 면역검정(FPIA); 및 화학발광 검정(CL)에 의해 검출된다. 원하는 경우, 상기 면역검정은 자동화될 수 있다. 면역검정은 또한 레이저 유도 형광과 함께 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Schmalzing et al., Electrophoresis, 18:2184-93 (1997); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-80 (1997)] 참조).
7. 바이오마커로서의 15-PGDH
일부 구현예에서, 15-PGDH는 노화된 골격근 및/또는 비-골격근 조직, 또는 노화-관련 질환 또는 질병의 존재 또는 이에 대한 잠재성에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 골격근 및/또는 비-골격근 조직에서, 예를 들어, 전체 조직 또는 노화 세포와 같은 조직 내의 특정 세포에서 15-PGDH 수준 증가의 검출은 조직의 노화, 노화와 관련된 조직의 기능 또는 건강의 손실 또는 감소, 또는 연령-관련 질환 또는 질병의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 연령-관련 질환 또는 질병이 없는 대상체로부터의 대조군 조직과 비교하여 골격근 및/또는 비-골격근 조직에서의 15-PGDH의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상의 검출된 증가는 조직의 노화, 노화와 관련된 조직의 기능 또는 건강의 손실 또는 감소, 또는 연령-관련 질환 또는 질병의 존재를 나타낼 수 있다.
8. 15-PGDH 억제제
15-PGDH의 발현, 안정성 또는 활성, 예를 들어, 효소적 활성을 어떤 방식으로든 줄이거나, 감소시키거나, 대응하거나, 약화시키거나, 억제하거나, 차단하거나, 하향조절하거나, 제거하는 임의의 제제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 억제제는 15-PGDH의 발현, 안정성 및/또는 활성, 예를 들어, 15-PGDH의 효소적 활성을 어떤 방식으로든 줄이거나, 감소시키거나, 대응하거나, 약화시키거나, 억제하거나, 차단하거나, 하향조절하거나, 제거하는 소분자 화합물, 펩티드, 폴리펩티드, 핵산, 항체, 예를 들어, 차단 항체 또는 나노바디, 또는 임의의 다른 분자일 수 있다.
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH의 활성, 안정성 또는 발현을 생체 내 또는 시험관 내에서, 예를 들어, 억제제의 부제하에서 대조군 수준에 비해 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상만큼 감소시킨다.
예를 들어, 억제제의 효능은, 예를 들어, 적절한 반응 완충액에서 15-PGDH 효소, NAD(+) 및 PGE2의 존재하에서 후보 화합물을 인큐베이션하고, NADH의 생성을 모니터링하는 것과 같은 표준 방법(예를 들어, 문헌[Zhang et al., (2015) Science 348: 1224] 참조)을 사용하거나, 형광측정 PicoProbe 15-PGDH Activity Assay Kit(BioVision)와 같은 임의의 다수의 이용 가능한 키트를 사용하거나, 예를 들어, 공보 EP2838533호에 기재된 임의의 방법 및/또는 지수를 사용함으로써 15-PGDH 효소 활성을 측정하여 평가될 수 있다.
억제제의 효능은 또한, 예를 들어, RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 반-정량적 RT-PCR, 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR), 정량적 RT-PCR(qRT-PCR), 다중화 분지형 DNA(bDNA) 검정, 마이크로어레이 하이브리드화, 또는 서열 분석(예를 들어, RNA 시퀀싱("RNA-Seq"))과 같은 일상적인 기술을 사용하여 분석될 수 있는 감소된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA) 발현의 검출에 의해 평가될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 발현을 정량하는 방법은, 예를 들어, 문헌[Fassbinder-Orth, Integrative and Comparative Biology, 2014, 54:396-406; Thellin et al., Biotechnology Advances, 2009, 27:323-333; 및 Zheng et al., Clinical Chemistry, 2006, 52:7 (doi: 10/1373/clinchem.2005.065078)]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 수준을 측정하기 위해 실시간 또는 정량적 PCR 또는 RT-PCR이 사용된다. 예를 들어, 문헌[Nolan et al., Nat. Protoc, 2006, 1:1559-1582; Wong et al., BioTechniques, 2005, 39:75-75]을 참조한다. 유전자 발현을 측정하기 위한 정량적 PCR 또는 RT-PCR 검정이 또한 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, TaqMan® Gene Expression Assays, ThermoFisher Scientific).
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH-인코딩 폴리뉴클레오티드의 발현 수준이 시험관 내 또는 생체 내에서 참조 값, 예를 들어, 억제제의 부재하에서의 값과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 이상만큼 감소되는 경우에 효과적인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 15-PGDH-인코딩 폴리뉴클레오티드의 발현 수준이 참조 값과 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배 이상만큼 감소되는 경우에 효과적인 것으로 간주된다.
15-PGDH 억제제의 효과는 또한, 예를 들어, 당업자에게 공지된 면역검정, 2차원 젤 전기영동 및 정량적 질량분광법과 같은 일상적인 기술을 사용하여 단백질 발현 또는 안정성을 검출함으로써 평가될 수 있다. 단백질 정량화 기술은 일반적으로 문헌["Strategies for Protein Quantitation," Principles of Proteomics, 2nd Edition, R. Twyman, ed., Garland Science, 2013]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 단백질 발현 또는 안정성은 면역검정, 비제한적인 예로, 효소 면역검정(EIA), 예를 들어, 효소 다중화 면역검정 기술(EMIT), 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), IgM 항체 포획 ELISA(MAC ELISA) 및 미세입자 효소 면역검정(MEIA); 모세관 전기영동 면역검정(CEIA); 방사선면역측정법(RIA); 면역방사측정법(IRMA); 면역형광(IF); 형광 분극 면역검정(FPIA); 및 화학발광 검정(CL)에 의해 검출된다. 원하는 경우, 상기 면역검정은 자동화될 수 있다. 면역검정은 또한 레이저 유도 형광과 함께 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Schmalzing et al., Electrophoresis, 18:2184-93 (1997); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-80 (1997)] 참조).
15-PGDH 단백질 수준이 15-PGDH 억제제의 존재하에서 감소되는지의 여부를 결정하기 위해, 상기 방법은 참조 값, 예를 들어, 억제제의 부재하에서의 수준에 대해 억제제의 존재하에서의 단백질(예를 들어, 15-PGDH 단백질)의 수준을 비교하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 단백질은 15-PGDH 단백질의 수준이 참조 값과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 이상만큼 감소되는 경우에 억제제의 존재하에서 감소된다. 일부 경우에, 15-PGDH 단백질은 15-PGDH 단백질의 수준이 참조 값과 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배 이상만큼 감소되는 경우에 억제제의 존재하에서 감소된다.
소분자
특정 구현예에서, 15-PGDH는 소분자 억제제의 투여에 의해 억제된다. 대조군, 예를 들어, 억제제의 부재하에서의 발현, 안정성 또는 활성에 비해 15-PGDH의 발현, 안정성 또는 활성을, 예를 들어, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 이상만큼 감소시키는 임의의 소분자 억제제가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 시험관 내 또는 생체 내에서 15-PGDH의 효소적 활성을 감소시킬 수 있는 소분자 억제제가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 소분자 화합물의 비제한적인 예는 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 공보 EP 2838533호에 개시된 소분자를 포함한다. 소분자는 특히 공보 EP 2838533의 표 2에 개시된 소분자, 즉, SW033291, SW033291 이성질체 B, SW033291 이성질체 A, SW033292, 413423, 980653, 405320, SW208078, SW208079, SW033290, SW208080, SW208081, SW206976, SW206977, SW206978, SW206979, SW206980, SW206992, SW208064, SW208065, SW208066, SW208067, SW208068, SW208069, SW208070뿐만 아니라 이들의 조합, 유도체, 이성질체 또는 토토머를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 사용되는 15-PGDH 억제제는 SW033291 (2-(부틸설피닐)-4-페닐-6-(티오펜-2-일)티에노[2,3-b]피리딘-3-아민; PubChem CID: 3337839)이다.
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 티아졸리딘디온 유도체(예를 들어, 벤질리덴티아졸리딘-2,4-디온 유도체), 예를 들어, (5-(4-(2-(티오펜-2-일)에톡시)벤질리덴)티아졸리딘-2,4-디온), 5-(3-클로로-4-페닐에톡시벤질리덴)티아졸리딘-2,4-디온, 5-(4-(2-사이클로헥실에톡시)벤질리덴)티아졸리딘-2,4-디온, 5-(3-클로로-4-(2-사이클로헥실에톡시)벤질)티아졸리딘-2,4-디온, (Z)-N-벤질-4-((2,4-디옥소티아졸리딘-5-일리덴)메틸)벤즈아미드, 또는 전체 내시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Choi et al. (2013) Bioorganic & Medicinal Chemistry 21:4477-4484; Wu et al. (2010) Bioorg. Med. Chem. 18(2010) 1428-1433; Wu et al. (2011) J. Med. Chem. 54:5260-5264; 또는 Yu et al. (2019) Biotechnology and Bioprocess Engineering 24:464-475]에 개시된 임의의 화합물이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 COX 억제제 또는 화학예방제, 예를 들어, 시글리타존(ciglitazone)(CID: 2750), 또는 전체 내시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Cho et al. (2002) Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 67(6):461-465]에 개시된 임의의 화합물이다.
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 벤즈이미다졸 기, 예를 들어, (1-(4-메톡시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)(피페리딘-1-일)메타논을 함유하는 화합물(CID: 3474778), 또는 트리아졸 기, 예를 들어, 3-(2,5-디메틸-1-(p-톨릴)-1H-피롤-3-일)-6,7,8,9-테트라하이드로-5H-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]아제핀을 함유하는 화합물(CID: 71307851), 또는 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program [인터넷]에 공표된 Duveau et al. (2015) ("Discovery of two small molecule inhibitors, ML387 and ML388, of human NAD+-dependent 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase")]에 개시된 임의의 화합물이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 1-(3-메틸페닐)-1H-벤즈이미다졸-5-일)(피페리딘-1-일)메타논(CID: 4249877) 또는 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Niesen et al. (2010) PLoS ONE 5(11):e13719]에 개시된 임의의 화합물이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 2-((6-브로모-4H-이미다조[4,5-b]피리딘-2-일티오)메틸)벤조니트릴(CID: 3245059), 피페리딘-1-일(1-m-톨릴-1H-벤조[d]이미다졸-5-일)메타논(CID: 3243760), 또는 3-(2,5-디메틸-1-페닐-1H-피롤-3-일)-6,7,8,9-테트라하이드로-5H-[1,2,4]트리아졸로[4,3-a]아제핀(CID: 2331284), 또는 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program [인터넷]에 공표된 Jadhav et al. (2011) ("Potent and selective inhibitors of NAD+-dependent 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase (HPGD)")]에 개시된 임의의 화합물이다.
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 TD88 또는 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Seo et al. (2015) Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 97:35-41, 또는 Shao et al. (2015) Genes & Diseases 2(4):295-298]에 개시된 임의의 화합물이다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제는 EEAH(아르토카르푸스 헤테로필루스(Artocarpus heterophyllus)의 에탄올 추출물) 또는 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Karna (2017) Pharmacogn Mag. 2017 Jan; 13(Suppl 1): S122-S126]에 개시된 임의의 화합물이다.
억제성 핵산
일부 구현예에서, 제제는 억제성 핵산, 예를 들어, 안티센스 DNA 또는 RNA, 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 억제성 RNA는 15-PGDH 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열(예를 들어, 15-PGDH-인코딩 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 인간 HPGD 유전자, Gene ID: 3248, 예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000860.6, NM_001145816.2, NM_001256301.1, NM_001256305.1, NM_001256306.1, NM_001256307.1 또는 NM_001363574.1에 제시된 바와 같은 이의 임의의 전사체 변이체를 포함함)의 20-500, 20-250, 20-100, 50-500 또는 50-250개의 연속적 뉴클레오티드로부터의, 예를 들어, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90 또는 적어도 100개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 부분)과 동일하거나 실질적으로 동일(예를 들어, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일)한 서열을 표적화한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법은 shRNA 또는 siRNA를 사용하여 대상체, 예를 들어, 근감소증 또는 노화 또는 위축성 근육을 갖는 대상체; 또는 연령-관련 질환, 장애 또는 질병을 갖는 대상체를 치료하는 것을 포함한다. shRNA는 그것이 세포에서 생성하는 siRNA를 통해 표적 유전자 발현을 침묵시키는 데 사용될 수 있는 헤어핀 턴을 갖는 인공 RNA 분자이다. 예를 들어, 문헌[Fire et. al., Nature 391:806-811, 1998; Elbashir et al., Nature 411:494-498, 2001; Chakraborty et al., Mol Ther Nucleic Acids 8:132-143, 2017; 및 Bouard et al., Br. J. Pharmacol. 157:153-165, 2009]을 참조한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 노화 및/또는 위축성 근육을 갖는 대상체, 또는 연령-관련 질환, 장애 또는 질병을 갖는 대상체를 치료하는 방법은 치료적 유효량의 변형된 RNA 또는 15-PGDH mRNA의 일부(예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000860.6, NM_001145816.2, NM_001256301.1, NM_001256305.1, NM_001256306.1, NM_001256307.1, 또는 NM_001363574.1 중 임의의 것에 기재된 인간 15-PGDH-인코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)에 하이브리드화될 수 있는 shRNA 또는 siRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는, 예를 들어, 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터), 인핸서 및 전사 종결자를 포함하는 당 분야에 공지된 적절한 발현 조절 요소를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 15-PGDH-특이적 마이크로RNA(miRNA 또는 miR)이다. 마이크로RNA는 RNA 침묵 및 유전자 발현의 전사 후 조절에서 기능하는 작은 비-코딩 RNA 분자이다. mRNA 전사체 내에서 상보적인 서열을 갖는 miRNA 염기쌍. 결과적으로, mRNA 전사체는 mRNA 가닥의 절단, 폴리(A) 꼬리의 단축을 통한 mRNA의 불안정화, 및 리보솜에 의한 mRNA 전사체의 단백질로의 번역 효율의 감소와 같은 하나 이상의 메커니즘에 의해 침묵될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, RNase H-의존성 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)일 수 있다. ASO는 표적 mRNA의 상보적 서열에 결합하고, 표적 RNA의 RNase H-매개 절단 및 리보솜의 입체 차단에 의한 번역 억제 둘 모두에 의해 유전자 발현을 감소시키는 단일 가닥의 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 15-PGDH mRNA의 일부(예를 들어, GenBank 등록 번호 NM_000860.6, NM_001145816.2, NM_001256301.1, NM_001256305.1, NM_001256306.1, NM_001256307.1 또는 NM_001363574.1 중 임의의 것에 기재된 바와 같은 인간 15-PGDH-인코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)에 하이브리드화될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 약 10-30개의 뉴클레오티드(예를 들어, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 또는 30개의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 그것이 결합하는 mRNA 전사체의 일부에 대해 100% 상보성을 갖는다. 다른 구현예에서, DNA 올리고뉴클레오티드는 그것이 결합하는 mRNA 전사체의 일부에 대해 100% 미만의 상보성(예를 들어, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70% 상보성)을 갖지만, RNase H가 mRNA 전사체를 절단하기 위한 안정한 RNA:DNA 듀플렉스를 여전히 형성할 수 있다.
적합한 안티센스 분자, siRNA, miRNA 및 shRNA는 올리고뉴클레오티드 합성의 표준 방법에 의해 또는 표적화되는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공함으로써 계약 연구 기관 또는 공급업체로부터 상기 분자를 주문함으로써 생성될 수 있다. 일반적인 용어의 상기 안티센스 분자의 제조 및 배치는 현대 참고 문헌, 예를 들어, 문헌[Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies, 4 th edition by N.S. Templeton; Translating Gene Therapy to the Clinic: Techniques and Approaches, 1 st edition by J. Laurence and M. Franklin; High-Throughput RNAi Screening: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) by D.O. Azorsa and S. Arora; 및 Oligonucleotide-Based Drugs and Therapeutics: Preclinical and Clinical Considerations by N. Ferrari and R. Segui]에 기재된 표준 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
억제성 핵산은 또한 단백질에 결합하는 짧은 합성 올리고뉴클레오티드 서열인 RNA 압타머를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Li et al., Nuc. Acids Res. (2006), 34:6416-24]을 참조). 이들은 표적화된 분자에 대한 높은 친화성 및 특이성 둘 모두에 대해 주목할만 하며, 항체보다 작다는(일반적으로, 6 kD 미만) 추가적인 이점을 갖는다. 원하는 특이성을 갖는 RNA 압타머는 일반적으로 조합 라이브러리로부터 선택되고, 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 리보뉴클레아제에 대한 취약성을 감소시키도록 변형될 수 있다.
항체
일부 구현예에서, 제제는 항-15-PGDH 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 차단 항체(예를 들어, 표적에 결합하고 표적의 기능, 예를 들어, 15-PGDH 효소 활성을 직접 방해하는 항체)이다. 일부 구현예에서, 항체는 중화 항체(예를 들어, 표적에 결합하고 표적의 하류 세포 효과를 부정하는 항체)이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 15-PGDH에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 항원-결합 단편, 예를 들어, F(ab')2, Fab', Fab, scFv 등이다. 용어 "항체 또는 항원 결합 단편"은 또한 이중 또는 다중 항원 또는 에피토프 특이성을 갖는 다중-특이적 및 하이브리드 항체를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항-15-PGDH 항체는 본원에 개시된 항체 서열의 중쇄 서열 또는 이의 일부, 및/또는 경쇄 서열 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-15-PGDH 항체는 본원에 개시된 바와 같은 항-15-PGDH 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-15-PGDH 항체는 단일 단량체 가변 항체 도메인, 예를 들어, 단일 VHH 도메인을 포함하는 나노바디 또는 단일-도메인 항체(sdAb)이다.
15-PGDH에 결합하는 항체를 제조하기 위해, 당 분야에 공지된 많은 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); 및 Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed. 1986))]을 참조한다. 일부 구현예에서, 항체는 항체 반응의 유도를 위한 항원으로 동물 또는 동물들(예를 들어, 마우스, 토끼 또는 래트)을 면역화함으로써 제조된다. 일부 구현예에서, 항원은 애쥬번트(예를 들어, 프로인트 애쥬번트)와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 초기 면역화 후, 항체 생성을 개선하기 위해 항원의 하나 이상의 후속 부스터 주사가 투여될 수 있다. 면역화 후, 항원-특이적 B 세포는, 예를 들어, 비장 및/또는 림프 조직으로부터 수확된다. 모노클로날 항체를 생성하기 위해, B 세포는 골수종 세포와 융합되고, 이는 이후 항원 특이성에 대해 스크리닝된다.
관심 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자는 세포로부터 클로닝될 수 있으며, 예를 들어, 모노클로날 항체를 인코딩하는 유전자는 하이브리도마로부터 클로닝되고 재조합 모노클로날 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자 라이브러리는 또한 하이브리도마 또는 형질 세포로부터 제조될 수 있다. 추가로, 파지 또는 효모 디스플레이 기술은 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이형화학성 Fab 단편을 확인하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992); Lou et al. m PEDS 23:311 (2010); 및 Chao et al., Nature Protocols, 1:755-768 (2006)] 참조). 대안적으로, 항체 및 항체 서열은, 예를 들어, 문헌[Xu et al., Protein Eng Des Sel, 2013, 26:663-670; WO 2009/036379; WO 2010/105256; 및 WO 2012/009568]에 개시된 것과 같은 효모-기반 항체 제시 시스템을 사용하여 분리되고/되거나 확인될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 생성물의 무작위 조합은 상이한 항원 특이성을 갖는 대규모 항체 푸울을 생성한다(예를 들어, 문헌[Kuby, Immunology (3rd ed. 1997)] 참조). 단일쇄 항체 또는 재조합 항체의 생성을 위한 기술(미국 특허 4,946,778호, 미국 특허 4,816,567호)은 또한 항체를 생성하도록 적합화될 수 있다.
항체는 원핵생물 및 진핵생물 발현 시스템을 포함하는 임의의 수의 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 시스템은 포유동물 세포, 예를 들어, 하이브리도마 또는 CHO 세포이다. 상기 많은 시스템은 상업적 공급업체로부터 널리 이용 가능하다. 항체가 VH 및 VL 영역 둘 모두를 포함하는 구현예에서, VH 및 VL 영역은 단일 벡터를 사용하여, 예를 들어, 디-시스트로닉 발현 유닛에서 발현될 수 있거나, 상이한 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 다른 구현예에서, VH 및 VL 영역은 별도의 벡터를 사용하여 발현될 수 있다.
일부 구현예에서, 항-15-PGDH 항체는 친화성 성숙된 하나 이상의 CDR, 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함한다. 키메라 항체의 경우, 키메라 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 하나의 종, 예를 들어, 마우스로부터의 항원 결합 영역(중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역)이 또 다른 종, 예를 들어, 인간의 효과기 영역(불변 도메인)에 융합된 키메라 항체가 제조될 수 있다. 또 다른 예로서, 항체의 효과기 영역이 상이한 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스의 효과기 영역으로 치환된 "클래스 전환된" 키메라 항체가 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 항-15-PGDH 항체는 인간화된 하나 이상의 CDR, 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함한다. 인간화 항체의 경우, 인간화 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, US 8,095,890호를 참조한다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 이에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 비제한적인 예로서, 면역화시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어, 마우스)이 생성될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 점라인 돌연변이체 마우스에서의 항체 중쇄 연결 영역(JH) 유전자의 동형접합 결실이 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 발생시키는 것으로 기재되었다. 상기 점라인 돌연변이체 마우스에서의 인간 점라인 면역글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 공격시 인간 항체의 생성을 발생시킬 것이다. 예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immun., 7:33 (1993)] 및 미국 특허 번호 5,591,669호, 5,589,369호 및 5,545,807호를 참조한다.
일부 구현예에서, 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 나노바디(nanobody) 또는 디아바디(diabody))이 생성된다. 온전한 항체의 단백질분해 소화(예를 들어, 문헌[Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth., 24:107-117 (1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조) 및 단편을 생성하기 위한 재조합 숙주 세포의 사용과 같은 항체 단편의 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 예를 들어, 항체 단편은 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 E. 콜리 세포로부터 직접 회수되고, 화학적으로 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Carter et al., BioTechnology, 10:163-167 (1992)] 참조). 또 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 생성을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
결합 친화성 및 결합 동역학을 측정하기 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 이들 방법은 고체상 결합 검정(예를 들어, ELISA 검정), 면역침전, 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, Biacore™(GE Healthcare, Piscataway, NJ)), 역학적 배제 검정(예를 들어, KinExA®), 흐름세포측정법, 형광-활성화 세포 분류(FACS), BioLayer 간섭법(예를 들어, Octet™(
Figure pct00001
, Inc., Menlo Park, CA)) 및 웨스턴 블롯 분석을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
펩티드
일부 구현예에서, 제제는 펩티드, 예를 들어, 15-PGDH에 결합하고/하거나 이의 효소적 활성 또는 안정성을 억제하는 펩티드이다. 일부 구현예에서, 제제는 펩티드 압타머이다. 펩티드 압타머는 특정 표적 분자에 결합하도록 선택되거나 조작된 인공 단백질이다. 전형적으로, 펩티드는 단백질 스캐폴드에 의해 표시되는 가변 서열의 하나 이상의 펩티드 루프를 포함한다. 펩티드 앱타머 선택은 효모 2-하이브리드 시스템을 포함하여 상이한 시스템을 이용하여 이루어질 수 있다. 펩티드 압타머는 또한 파지 디스플레이 및 다른 표면 디스플레이 기술, 예를 들어, mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 박테리아 디스플레이 및 효모 디스플레이에 의해 구성된 조합 펩티드 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Reverdatto et al., 2015, Curr. Top. Med. Chem. 15:1082-1101]을 참조한다.
일부 구현예에서, 제제는 아피머(affimer)이다. 아피머는 전형적으로 약 12-14 kDa의 분자량을 갖는 작고 매우 안정한 단백질로서, 이는 항체의 것과 유사한 특이성 및 친화성으로 이들의 표적 분자에 결합한다. 일반적으로, 아피머는 모노클로날 항체와 유사한 방식으로 높은 친화성 및 특이성으로 원하는 상이한 표적 단백질에 결합하도록 무작위화될 수 있는 2개의 펩티드 루프 및 N-말단 서열을 나타낸다. 단백질 스캐폴드에 의한 2개의 펩티드 루프의 안정화는 펩티드가 취할 수 있는 가능한 입체형태를 제한하여, 자유 펩티드의 라이브러리에 비해 결합 친화성 및 특이성을 증가시킨다. 아피머 및 아피머를 제조하는 방법은 당 분야에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌[Tiede et al., eLife, 2017, 6:e24903]을 참조한다. 아피머는 또한, 예를 들어, Avacta Life Sciences로부터 상업적으로 이용 가능하다.
벡터 및 변형된 RNA
일부 구현예에서, 15-PGDH 억제 활성을 제공하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA와 같은 핵산 억제제, 또는 15-PGDH를 억제하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적절한 벡터를 사용하여 세포, 예를 들어, 근육 세포, 비-골격근 조직 세포로 도입된다. 본 발명의 개시와 함께 사용될 수 있는 전달 벡터의 예는 바이러스 벡터, 플라스미드, 엑소좀, 리포솜, 박테리아 벡터 또는 나노입자이다. 일부 구현예에서, 임의의 본원에 기재된 15-PGDH 억제제, 예를 들어, 핵산 억제제 또는 폴리펩티드 억제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 사용하여 세포, 예를 들어, 근육 세포, 비-골격근 조직 세포로 도입된다. 적합한 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 15-PGDH 억제제, 예를 들어, 핵산 억제제 또는 폴리펩티드 억제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 억제제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 갖는 전형적으로 재조합적으로 생성되는 발현 카세트의 형태로 제공된다. 일부 경우에, 프로모터는 모든 또는 대부분의 조직 유형에서 유전자 발현을 지시하는 보편적인 프로모터이고; 다른 경우에, 프로모터는 표적화되는 조직의 세포에서 특이적으로 유전자 발현을 지시하는 것이다.
일부 구현예에서, 15-PGDH의 핵산 또는 단백질 억제제는 변형된 RNA를 사용하여 대상체, 예를 들어, 대상체의 골격근 또는 비-골격근 조직으로 도입된다. 예를 들어, 대상체의 세포에 도입되는 경우 RNA, 예를 들어, shRNA 또는 15-PGDH 폴리펩티드 억제제를 인코딩하는 mRNA의 번역, 효능 및/또는 안정성을 향상시키기 위한 RNA의 다양한 변형이 당 분야에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, 변형된 mRNA(mmRNA), 예를 들어, 15-PGDH의 폴리펩티드 억제제를 인코딩하는 mmRNA가 사용된다. 다른 구현예에서, 15-PGDH 발현의 RNA 억제제를 포함하는 변형된 RNA, 예를 들어, siRNA, shRNA 또는 miRNA가 사용된다. 사용될 수 있는 RNA 변형의 비제한적인 예는 항-역-캡 유사체(ARCA), 예를 들어, 100-250 뉴클레오티드 길이의 폴리A 꼬리, 3'UTR 내의 AU-풍부 서열의 공지된 안정한 mRNA로부터의 서열에 의한 대체, 및 변형된 뉴클레오시드 및 구조, 예를 들어, 슈도우리딘, 예를 들어, N1-메틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'티오RNA, 5-메틸시티딘, 6-메틸아데노신, 아미드 3 결합, 티오에이트 결합, 이노신, 2'-데옥시리보뉴클레오티드, 5-브로모-우리딘 및 2'-O-메틸화 뉴클레오시드의 포함을 포함한다. 사용될 수 있는 화학적 변형의 비제한적인 목록은, 예를 들어, 온라인 데이터베이스 crdd.osdd.net/servers/sirnamod/에서 찾을 수 있다. RNA는 특히 물리적 장애, 양이온성 담체, 전기천공, 유전자 총, 초음파, 나노입자, 컨쥬게이트 또는 고압 주입에 의한 RNA 세포내이입의 생성을 포함하는 임의의 공지된 방법을 사용하여 생체 내에서 세포에 도입될 수 있다. 변형된 RNA는 또한, 예를 들어, 시트레이트 완충 식염수에서 직접 주사에 의해 도입될 수 있다. RNA는 또한 음으로 하전된 RNA와 양이온성 지질 또는 중합체, 예를 들어, 리포플렉스(lipoplexes), 폴리플렉스(polyplexes), 다중양이온 및 덴드리머 사이의 전하-전하 상호작용에 의해 자발적으로 생성되는 자가-조립된 리포플렉스 또는 폴리플렉스를 사용하여 전달될 수 있다. 폴리-L-리신, 폴리아미도아민 및 폴리에틸렌이민, 키토산 및 폴리(β-아미노 에스테르)와 같은 중합체가 또한 사용될 수 있다. 각각의 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Youn et al. (2015) Expert Opin Biol Ther, Sep 2; 15(9): 1337-1348; Kaczmarek et al. (2017) Genome Medicine 9:60,; Gan et al. (2019) Nature comm. 10: 871; Chien et al. (2015) Cold Spring Harb Perspect Med. 2015;5:a014035]을 참조한다.
9. 투여 방법
본원에 기재된 화합물은 대상체에서 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은, 예를 들어, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경구, 정맥 내, 두개 내, 척수강 내, 척추 내, 병변 내, 비강 내, 피하, 뇌실 내, 국소 및/또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 일 예에서, 화합물은 근육 내, 예를 들어, 근육 내 주사에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 화합물은 급성 요법에 따라 투여된다. 특정 예에서, 화합물은 대상체에 1회 투여된다. 다른 예에서, 화합물은 한 시점에서 투여되고, 두번째 시점에서 다시 투여된다. 또 다른 예에서, 화합물은 짧은 기간(예를 들어, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월 이상)에 걸쳐 간헐적 용량으로 반복적으로(예를 들어, 매일 1회 또는 2회) 대상체에 투여된다. 일부 경우에, 화합물 투여 사이의 시간은 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월 이상이다. 다른 구현예에서, 화합물은 원하는 기간에 걸쳐 만성 요법에 따라 연속적으로 또는 만성적으로 투여된다. 예를 들어, 화합물은 화합물의 양 또는 수준이 선택된 기간에 걸쳐 실질적으로 일정하도록 투여될 수 있다.
대상체로의 화합물의 투여는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 달성될 수 있다. 도입되는 화합물의 양은 성별, 연령, 체중, 질병 또는 장애의 유형, 장애의 단계, 및 원하는 결과를 생성하는 데 필요한 양과 같은 요인을 고려할 수 있다. 일반적으로, 치료 목적을 위해 화합물을 투여하기 위해, 세포는 약리학적으로 효과적인 용량으로 제공된다. "약리학적 유효량" 또는 "약리학적 유효 용량"은 원하는 생리학적 효과를 발생시키기에 충분한 양 또는 원하는 결과, 특히 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 소견을 감소시키거나 제거하는 것을 포함하는 질환 또는 질병을 치료하기 위한 원하는 결과를 달성할 수 있는 양이다.
신체의 임의의 수의 근육, 예를 들어, 이두근; 삼두근; 상완요골근; 상완근(위팔근); 표재 구획 손목굴근; 삼각근; 슬건의 대퇴이두근, 박근, 반건형근 및 반막상근; 사두근의 대퇴직근, 외측광근, 내측광근 및 중간광근; 장딴지의 비복근(외측 및 내측), 전경골근, 및 가자미근; 가슴의 대흉근 및 소흉근; 윗등의 광배근; 능형근(대 및 소); 목, 어깨 및 등에 걸쳐 있는 등세모근; 배의 복직근; 엉덩이의 대둔근, 중둔근 및 소둔근; 손의 근육; 괄약근; 안구근육; 및 인두근육에 본원에 기재된 화합물이 직접 주사되거나 달리 투여될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 표적화되는 비-골격근 조직으로의 주사에 의해 국소적으로 투여되거나, 표적화되는 조직에 근접한 투여에 의해 투여될 수 있다.
10. 약학적 조성물
본원에 기재된 화합물의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 약학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 본원에 기재된 약학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다(예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED.,,, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)] 참조).
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적 조성물을 제형화하는데 있어서 당업자에게 공지된 임의의 표준의 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 따라서, 약학적으로 허용되는 염으로 제공되는 것과 같이 그 자체이거나 컨쥬게이트로서의 화합물은 약학적으로 허용되는 희석제, 예를 들어, 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 수성 에탄올, 또는 글루코스의 용액, 만니톨, 덱스트란, 프로필렌 글리콜, 오일(예를 들어, 식물성 오일, 동물 오일, 합성 오일 등), 미정질 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록실프로필 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 포스페이트, 젤라틴, 폴리소르베이트 80 등에서의 제형으로, 또는 적절한 부형제 중 고체 제형으로 제조될 수 있다.
약학적 조성물은 종종 하나 이상의 완충제(예를 들어, 중성 완충 식염수 또는 인산염 완충 식염수), 탄수화물(예를 들어, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어, 글리신, 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트, 부틸화된 하이드록시톨루엔, 부틸화된 하이드록시아니솔 등), 정균제, 킬레이트제, 예를 들어, EDTA 또는 글루타티온, 제형이 수용자의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약하게 고장성이 되도록 하는 용질, 현탁제, 증점제, 보존제, 착향제, 감미제, 및 착색 화합물을 적절하게 추가로 포함할 것이다.
본원에 기재된 약학적 조성물은 투여 제형과 양립되는 방식으로 그리고 치료적으로 효과적일 양으로 투여된다. 투여되는 양은, 예를 들어, 개인의 연령, 체중, 신체 활동, 및 식이, 치료되는 질환 또는 질병, 및 질환 또는 질병의 단계 또는 중증도를 포함하는 다양한 요인에 좌우된다. 특정 구현예에서, 용량의 크기는 또한 특정 개인에서 치료제(들)의 투여를 수반하는 임의의 유해한 부작용의 존재, 특성, 및 정도에 의해 결정될 수 있다.
그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 수준 및 투여 빈도는 가변적일 수 있고, 이용되는 특정 화합물의 활성, 대사 안정성 및 상기 화합물의 작용 길이, 연령, 체중, 유전적 특징, 전반적 건강, 성별, 식이, 투여 방식 및 시간, 배출 속도, 약물 조합, 특정 질환의 중증도, 및 치료를 받는 숙주를 포함하는 다양한 요인에 좌우될 수 있음이 이해되어야 한다.
특정 구현예에서, 화합물의 용량은 고체, 반고체, 동결건조된 분말, 또는 액체 투여 형태, 예를 들어, 정제, 환약, 펠렛, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액, 에멀젼, 좌약, 정체 관장, 크림, 연고, 로션, 젤, 에어로졸, 포움 등, 바람직하게는 정확한 투여량의 간단한 투여에 적합한 단위 투여 형태를 취할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단위 투여 형태"는 인간 및 다른 포유동물에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각각의 단위는 적합한 약학적 부형제와 회합된 원하는 발생, 내성, 및/또는 치료 효과를 발생하도록 계산된 소정량의 치료제를 함유한다(예를 들어, 앰풀). 또한, 더욱 농축된 투여 형태가 제조될 수 있으며, 이로부터 더욱 희석된 단위 투여 형태가 이후에 생성될 수 있다. 따라서, 더욱 농축된 투여 형태는 실질적으로 더 많은, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상의 양의 치료 화합물을 함유할 것이다.
상기 투여 형태를 제조하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기] 참조). 투여 형태는 전형적으로 퉁상적인 약학적 담체 또는 부형제를 포함하며, 다른 약제, 담체, 애쥬번트, 희석제, 조직 투과 향상제, 가용화제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적절한 부형제는 당 분야에 널리 공지된 방법에 의해 특정 투여 형태 및 투여 경로에 대해 맞춤화될 수 있다(예를 들어, 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 상기] 참조).
적합한 부형제의 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트래거캔쓰, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 식염수, 시럽, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 및 폴리아크릴산, 예를 들어, 카르보폴, 예를 들어, 카르보폴 941, 카르보폴 980, 카르보폴 981 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 투여 형태는 윤활제, 예를 들어, 활석, 마그네슘 스테아레이트, 및 무기질유; 습윤제; 유화제; 현탁제; 보존제, 예를 들어, 메틸-, 에틸-, 및 프로필-하이드록시-벤조에이트(예를 들어, 파라벤); pH 조절제, 예를 들어, 무기 및 유기 산 및 염기; 감미제; 및 착향제를 추가로 포함할 수 있다. 투여 형태는 또한 생물분해성 중합체 비드, 덱스트란, 및 사이클로덱스트린 포함 복합체를 포함할 수 있다.
경구 투여를 위해, 치료적 유효 용량은 정제, 캡슐, 에멀젼, 현탁액, 용액, 시럽, 스프레이, 로젠지, 분말, 및 지속-방출 제형의 형태로 존재할 수 있다. 경구 투여를 위한 적합한 부형제는 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함한다.
치료적 유효 용량은 또한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 상기 투여 형태는 투여 전에 재구성을 위한 완충제, 예를 들어, 바이카르보네이트를 포함할 수 있거나, 완충제가, 예를 들어, 물을 이용한 재구성을 위한 동결건조된 투여 형태로 포함될 수 있다. 동결건조된 투여 형태는 적합한 혈관수축제, 예를 들어, 에피네프린을 추가로 포함할 수 있다. 동결건조된 투여 형태는 재구성을 위한 완충제와 함께 선택적으로 패키징된 주사기 내에 제공될 수 있어, 재구성된 투여 형태가 즉시 개인에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 추가의 화합물 또는 약물은 대상체에 공동-투여될 수 있다. 상기 화합물 또는 약물은 치료되는 질병의 징후 또는 증상을 완화하고, 면역 반응의 유도에 의해 야기되는 부작용을 감소시키는 등의 목적으로 공동 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 15-PGDH 억제제는 세놀리틱 제제, PGE2 수준 또는 PGD2 수준을 향상시키는 화합물, Atrogin1 수준 또는 활성을 감소시키는 화합물, EP1, EP2, EP3, EP4, DP1 및/또는 DP2 수용체를 통해 신호전달을 증가시키는 화합물, 및/또는 근육 질량, 강도 또는 기능; 또는 표적화되는 비-골격근 조직의 기능, 건강 또는 임의의 다른 원하는 특성을 향상시키는 것을 목표로 하는 임의의 다른 화합물과 함께 투여된다.
11. 키트
본원에 기재된 조성물의 다른 구현예는 15-PGDH 억제제를 포함하는 키트이다. 키트는 전형적으로 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있는 용기를 함유하며, 이는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함할 수 있다. 표지가 전형적으로 키트에 동반되며, 이는 키트 내용물의 사용에 대한 설명서 또는 다른 정보를 제공하는 전자 또는 컴퓨터 판독가능 형태일 수 있는 임의의 서면 또는 기록 자료를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 노화 및/또는 위축된 근육의 치료를 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 연령-관련 질환, 장애 또는 질병을 갖는 대상체에서 비-골격근 조직의 치료를 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 15-PGDH의 발현 또는 활성을 길항하는 제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 15-PGDH mRNA 또는 단백질 발현 또는 활성, 예를 들어, 효소 활성을 억제하거나 저해하는 억제성 핵산(예를 들어, 안티센스 RNA, 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)), 또는 15-PGDH 억제 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 변형된 RNA, 예를 들어, 변형된 shRNA 또는 siRNA, 또는 폴리펩티드 15-PGDH 억제제를 인코딩하는 변형된 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 15-PGDH-억제 폴리펩티드를 인코딩하는 억제 핵산 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 하나 이상의 플라스미드, 박테리아 또는 바이러스 벡터를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 15-PGDH-인코딩 mRNA의 일부에 하이브리드화될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 15-PGDH 단백질에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체(예를 들어, 모노클로날, 폴리클로날, 인간화, 이중특이적, 키메라, 차단 또는 중화 항체) 또는 이의 항체 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 차단 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 압타머(예를 들어, 펩티드 또는 핵산 압타머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 아피머를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 변형된 RNA를 포함한다. 특정 구현예에서, 키트는 15-PGDH에 결합하거나 이의 효소적 활성을 억제하는 소분자 억제제, 예를 들어, SW033291을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들어, 15-PGDH의 발현 또는 활성을 길항하는 제제와의 조합 요법으로 투여하기 위한 제제를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 방법의 실행을 위한 지침(예를 들어, 프로토콜)을 포함하는 교육 자료(예를 들어, 노화된 및/또는 위축된 근육의 질량, 강도 또는 기능을 향상시키기 위한 키트를 사용하고/하거나, 비-골격근 조직의 기능, 건강 또는 다른 특성을 향상시키기 위한 키트를 사용하기 위한 설명서)를 추가로 포함할 수 있다. 교육 자료는 전형적으로 서면 또는 인쇄된 자료를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 설명서를 저장하고 이를 최종 사용자에게 전달할 수 있는 임의의 매체가 본 발명의 개시에 의해 고려된다. 상기 매체는 전자 저장 매체(예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체(예를 들어, CD ROM) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 매체는 상기 교육 자료를 제공하는 인터넷 사이트에 대한 주소를 포함할 수 있다.
실시예
본 발명의 개시는 특정 실시예를 통해 보다 상세히 기재될 것이다. 하기 실시예는 예시 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 개시를 제한하려는 의도가 아니다. 당업자는 본질적으로 동일한 결과를 산출하기 위해 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 중요하지 않은 파라미터를 용이하게 인식할 것이다.
실시예 1. 프로스타글란딘 E2 분해 효소를 표적화하는 것은 근감소증 및 근이영양증을 개선한다.
요약
근감소증은 현재까지 효과적인 치료 접근법이 부족한 노화와 관련된 근육 소모 증후군이다. 여기서, 본 발명자는 PGE2 수준의 손실이 노화된 골격근에서 근육 위축에 기여한다는 것을 확인하였다. 본 발명자는 노화된 근육에서 노화 세포의 축적이 상승된 PGE2 분해 효소(15-PGDH) 수준에 기여한다는 것을 제시한다. 15-PGDH 효소를 억제하기 위한 약리학적 제제인 SW033291 또는 15-PGDH를 넉다운시키는 유전자 요법을 사용하여, 본 발명자는 노화된 마우스의 근육 질량, 강도 및 운동 성능의 증가를 관찰하였다. 본 발명자는 뒤시엔느 근위축증을 갖는 마우스(mdxcv4/mTRKO(G2))에서 15-PGDH의 유사한 감소 및 강도의 증가를 관찰하였다. 전신 세놀리틱 치료(ABT-263)를 사용하여, 본 발명자는 근육 조직에서 15-PGDH 수준이 감소함을 제시하였다. 유전적 및 세포 배양 모델을 사용하여, 본 발명자는 근육 질량의 조절제로서 분화된 세포 및 근섬유에서 EP4 수용체를 통해 신호전달하는 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 역할을 밝혀내었다. PGED 신호전달은 근육 위축의 중요한 매개체인 Atrogin1 발현을 억제한다. 여기서, 본 발명자는 근육 질량 및 강도 손실을 역전시키고, 노화 및 근이영양증에 대항하는 효과적인 표적으로서 15-PGDH 억제, 프로스타글란딘 E2 분해 효소를 밝혀냈다.
서문
위축은 주로 단백질 합성 감소를 빈번히 동반하는 과도한 단백질 분해로 인한 근육 질량 및 강도의 신속한 손실로부터 발생한다. 이러한 근육 기능의 손실로 인해 삶의 질이 감소되고 이환율 및 사망률이 증가된다. 근육 위축이 어떻게 발생하는지에 대해서는 많이 공지되어 있지만, 위축을 효과적으로 예방하거나 늦추는 현재의 치료 전략은 운동으로 제한된다. 현재 조사 중인 실험적 접근법은 주로, 예를 들어, 미오스타틴 억제제를 통해 단백질 균형을 변경함으로써 근육 질량을 증가시키는 것에 관한 것이다(1).
여기서, 본 발명자는 PGE2 경로의 조정이 노화된 마우스의 위축된 근육에서 가능을 증가시킬 수 있는지 시험하였다. 본 발명자는 PGE2 이화작용이 조절되지 않아 노화된 뮤린 근육 조직에 대한 해로운 영향을 발생시킨다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 본 발명자는 노화된 근육 조직에서 PGE2가 젊은 근육 조직보다 낮은 수준으로 검출된다는 것을 제시하며, 이는 이전에 노화된 근육과 관련되지 않은 발견이다. 본 발명자는 노화된 근육에서 PGE2 합성, 이화작용 및 신호전달의 조절장애에 대한 세포 및 분자 기초를 밝혀낸다. 본 발명자는 노화된 근육 조직에서 PGE2 대사산물(PGEM)로 검출 가능한 PGE2를 불활성화시키는 이화작용 효소인 15-PGDH의 억제에 의해 PGE2 수준을 증가시키는 전략을 설계한다. 15-PGDH 억제는 노화된 근육 미세환경의 유해한 효과를 극복하며, 이는 노화된 마우스에서 강도, 근육 질량 및 지구력의 강력한 증가로 이어진다.
노화된 근육 조직에서 감소된 PGE2 수준의 발견
근육 강도의 점진적인 감소는 발바닥쪽 굽힘 토크(plantar flexion torque)에 의해 상이한 연령에서 평가된 마우스의 비복근(GA)에 대해 본원에 제시된 바와 같이 노화를 수반한다(도 1a). PGE2는 첫 번째 단계가 속도 제한 효소 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)에 의해 매개되고, PGE2의 불안정한 15-케토-PGE2로의 전환을 포함하고, 두 번째 단계가 프로스타글란딘 환원효소 2에 의해 매개되고, 15-케토-PGE2의 더욱 안정한 13,14-디하이드로-15-케토-PGE2 대사산물로의 전환을 포함하는 2-단계 공정에 의해 이화된다(3, 4)(도 1b). PGE2의 감소에 따라, 15-PGDH 활성은 노인 근육 조직에서 극적으로 증가되었다(도 1c). 노화 동안 PGE2 신호전달 경로의 추가 분석은 질량분광법 분석에 의해 제시된 바와 같이 PGE2의 수준이 노화된 근육에서 더 낮다는 것을 밝혀내었다(도 1d). 함께, 이는 PGE2가 노화된 근육 미세환경 또는 니치(niche)에서 이화된다는 것을 시사한다.
PGE2의 이화작용은 노화된 조직의 노화 세포에서 15-PGDH 상향조절을 통해 이루어진다.
노화 세포는 노화에 따라 축적되어 조직 기능에 악영향을 미치는 것으로 보고되었다. PGE2는 노화 관련 분비 표현형(SASP)의 성분으로 가정되었다(5, 6). 본 발명자는 15-PGDH 발현 및 PGE2 불활성화가 노화된 근육의 노화 세포로 인한 것이라는 가설을 세웠다. 이러한 가능성을 해결하기 위해, 본 발명자는 노화 세포에서 아폽토시스를 유도하기 위해 Bcl-2, Bcl-w 및 Bcl-xL을 억제함으로써 작용하는 세놀리틱 제제인 나비토클락스로도 공지된 ABT-263으로 노화된 마우스(20개월)를 처리하였다(7)(도 2a). ABT-263 처리 2개월 후, PGE2 분해 효소(15-PGDH) mRNA의 수준이 현저하게 감소되었으며(도 2a), 이는 노화된 근육의 주요 세포 공급원이 세놀리틱 처리에 의해 조직에서 제거되는 노화 세포임을 나타낸다. 이들 결과는 PGE2 불활성화가 노화와 관련된 근육 소모 표현형에 기여하는 노화된 근육 조직의 노화 세포에 의해 부분적으로 매개됨을 시사한다.
15-PGDH 억제는 노화된 마우스에서 근육 기능의 개선으로 이어진다.
본 발명자는 PGE2 불활성화가 노화된 마우스에서 근육 소모 및 근육 기능의 감소의 주요 구성요소인 것인지 확인하고자 하였다. 본 발명자는 노화된 마우스를 15-PGDH 억제제인 SW033291(SW)로 1개월 동안 매일 처리하였고, 15-PGDH 억제가 노화된 마우스에서 근육 질량, 강도 및 지구력을 유의하게 증가시키는 것을 발견하였다(도 3a). 본 발명자는 조직학적 분석을 수행하였고, SW-처리된 노화된 마우스에서 근섬유 단면적이 더 크다는 것을 발견하였다(도 3b-d). 표현형이 PGE2의 증가된 수준으로 인한 것인지 확인하기 위해, 본 발명자는 근육 샘플에 대해 질량분광법을 수행하였고, SW 처리가 젊은 근육의 수준과 동등하게 근육에서 PGE2 수준을 상승시키는 것을 발견하였다(도 3e). 효과가 15-PGDH의 억제를 통한 것인지 확인하기 위해, 본 발명자는 아데노-관련 바이러스 AAV9에 의해 노화된 근육에 전달된 shRNA(sh15PGDH)의 사용에 의해 효소의 넉다운을 통한 독립적인 방법을 사용하였다(도 4a). AAV9 매개 sh15PGDH 넉다운에서 Hpgd(15-PGDH)의 수준이 AAV9 매개 shRNA 스크램블(shscr) 대조군과 비교하여 qPCR에 의해 mRNA 수준에서 감소되었음을 확인하였다(도 4b). 본 발명자는 AAV(shscr)로 감염된 대조군의 근육에 비해 근육 질량 및 근력이 증가되었음을 발견하였다(도 4c,d).
15-PGDH 억제는 뒤시엔느 마우스에서 근육 기능의 개선으로 이어진다.
본 발명자의 발견을 근육 위축 및 높은 노화 세포 침윤을 특징으로 하는 다른 근육 소모 질병으로 확장하기 위해, 본 발명자는 골격근 및 심장 DMD 표현형을 요약(8,9)하는 "인간화된" 텔로미어 길이를 갖는 mdx4cv/mTRKO(G2) 뒤시엔느 근이영양증(DMD) 마우스 모델을 분석하였다. qPCR에 의해, 본 발명자는 노화 및 노화-관련 분비 표현형(SASP) 마커의 수준을 분석하였고, 이들이 mdx4cv/mTRKO(G2) 마우스(10)에서 크게 상승되는 것을 발견하였다(도 5a). 중요하게는, 본 발명자는 mTRKO(G2) 대조군과 비교하여 mdx4cv/mTRKO(G2)에서 분해 효소인 15-PGDH가 유의하게 증가된다는 것을 발견하였다(도 5a). PGE2 불활성화가 DMD에서 관찰되는 근육 소모에 기여했는지 밝히기 위해, 본 발명자는 8개월령 mdx4cv/mTRKO(G2) 및 mTRKO(G2) 대조군을 SW로 처리하고, 처리 4주 후 비히클 처리된 대조군에 비해 이들 마우스에서 근육 강도의 22%의 증가를 관찰하였다(도 5b).
PGE2는 근육 섬유의 EP4 수용체를 통해 위축을 예방한다.
15-PGDH 억제가 근육 위축의 개선으로 이어지는 하류 메커니즘을 이해하기 위해, 본 발명자는 SW 또는 AAV-sh15PGDH로 처리된 노화된 근육의 qPCR 분석을 수행하였다. 본 발명자는 EP4 수용체의 PGE2 자극이 ATROGIN1의 억제를 통해 위축 표현형의 개선을 책임질 수 있다고 가정하였다(11-14). 본 발명자의 데이터는 AAV9 sh15PGDH 전달에 의한 15-PGDH의 SW 처리 및 넉다운이 mRNA 수준에서 Fbxo32(Atrogin1)의 발현을 감소시킨다는 것을 확인한다(도 6a).
근육에서 PGE2의 작용 메커니즘을 추가로 설명하기 위해, 본 발명자는 PGE2가 분화된 근관에서 EP4 수용체를 통해 신호를 보내는지 시험하였다. 본 발명자는 모든 PGE2 수용체, EP1-EP4(Ptger1-4)의 수준을 분석하였고, 이전에 기재된 바와 같이, 본 발명자는 EP4가 근육 줄기 세포(MuSC)에서 고도로 발현되는 것을 발견하였다(15). 그러나, 본 발명자는 또한 EP4가 비록 MuSC보다 낮은 수준이지만 분화된 근모세포 및 근관에서 발현된다는 것을 발견하였다(도 6b,c). 시험관 내에서 위축을 모방하고 PGE2 신호전달의 효과를 설명하기 위해, 본 발명자는 EP4 길항제(ONO-AE3-208)의 존재하에서 비히클, PGE2 또는 PGE2로 굶주린 근관을 처리하였다. 본 발명자는 PGE2가 굶주린 근관에서 Atrogin1 발현을 크게 감소시켰다는 것을 발견하였다(도 6d). 또한, 본 발명자는 PGE2가 굶주리거나 굶주리지 않은 배양된 근관에서 근관 직경을 증가시켰다는 것을 발견하였다(도 6d). EP4 길항제(ONO-AE3-208)의 존재하에서, 상기 효과는 폐기되어 PGE2가 EP4 수용체를 통해 근관에서 비대를 촉진한다는 증거를 제공한다(도 6d). SW가 PGE2와 독립적으로 근관에 대한 효과를 매개할 수 있는지 확인하기 위해, 본 발명자는 배양된 근관에 대한 이의 영향을 평가하였다. 노화 세포 또는 15-PGDH를 발현하는 다른 세포의 부재하에서, 본 발명자는 SW 처리된 굶주린 근섬유가 생체 내에서의 SW 처리 후 관찰된 근섬유 단면적의 증가(도 3b-d)와 대조적으로 근관 직경의 증가를 나타내지 않음(도 6d)을 발견하였다. 근관에서 EP4 수용체의 역할을 확인하기 위해, 본 발명자는 대조군으로 작용하는 빈 벡터를 갖는 cre-발현 렌티바이러스로 감염 후에 수용체가 유전적으로 제거되는 EP4flox/flox 근모세포를 사용하였다. EP4 수용체의 부재하에서, 더 작은 근관이 관찰되었으며, 이는 EP4 수용체가 근관 분화에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다(도 6e). 이들 결과는 근육 위축에서 EP4 수용체를 통한 PGE2 신호전달에 대한 역할을 제시한다. 또한, 본 발명자는 근육 조직과 마찬가지로 배양된 근관의 PGE 처리가 위축-관련 유비퀴틴 리가제인 Atrogin1을 억제한다는 것을 입증한다(도 6f).
논의
본 발명자는 감소되는 경우에 근육 위축을 개선하는, 노화 및 위축성 근육의 치료 표적으로서의 15-PGDH를 밝혀내었다. 본 발명자는 이전에 젊은 근육 재생의 맥락에서 근육 줄기 세포(MuSC) 기능에서 PGE2 신호전달의 중요성을 제시하였다(15). 이는 손상된 근육으로의 PGE2-처리된 MuSC의 이식 또는 손상된 근육으로의 PGE2의 국소화된 근육 내 전달을 수반하였다. 이전 연구는 젊은 마우스의 재생에서 15-PGDH 억제를 연관시켰으며, 15-PGDH의 소분자 억제제인 SW033291의 전신 전달이 조혈, 간 및 결장 조직 재생을 개선시키는 내인성 PGE2의 강력한 유도제임을 제시하였다(16). 여기서, 본 발명자는 15-PGDH가 이전에 근육 노화에서 인식되지 않은 역할을 가지고 있음을 제시한다. 젊은 근육 조직에서는 낮은 수준으로만 발현되며, 15-PGDH 수준은 노화 세포가 축적됨에 따라 증가한다. 또한, 본 발명자는 15-PGDH의 억제가 노화된 마우스에서 골격근 기능을 개선시키는 것을 제시한다. 근육에서의 분해를 방지함으로써 내인성 PGE2 수준의 전신 재구성은 근육 위축을 개선하여 질량 및 강도를 증가시킨다. 본 발명자의 발견은 DMD 및 노화와 같은 근육 소모 질병에서 PGE2 분해 효소의 역할에 대한 예상치 못한 증거를 제공하며, 이것이 강력한 치료 표적을 구성함을 제시한다.
참고문헌
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재료 및 방법
마우스
본 발명자는 스탠포드 대학의 기관 지침 및 실험 동물 관리에 대한 행정 패널(APLAC)에 따라 모든 실험 및 프로토콜을 수행하였다. 중년(18개월) 및 노화(>24개월) 마우스 C57BL/6을 노화된 근육 연구를 위해 미국 국립노화연구소(NIA)에서 획득하였고, 젊은(2-4개월) 야생형 C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratory로부터 획득하였다. 마우스를 연구 기간 동안 12시간 명/암 주기로 특정 병원체가 없는 하우징에 유지시켰다.
ABT-263 치료를 위해, 20개월령 C57/Bl6 마우스를 이전에 기재(1)된 바와 같이 주기 사이에 2주의 휴식 시간과 함께 2주기의 1주 동안 경구 위관영양에 의해 비히클(에탄올:폴리에틸렌 글리콜 400:Phosal 50 PG) 또는 ABT-263(에탄올:폴리에틸렌 글리콜 400:Phosal 50 PG 중)으로 처리하였다. 뒤시엔느 근이영양증(DMD) 마우스 모델의 경우, 본 발명자는 이전에 기재(2)된 바와 같이 생성된 8-10개월령 mdx4cv/mTRKO(G2)를 사용하였다.
마우스를 이전에 기재(3)된 바와 같이 1개월 동안 SW033291(SW)(Cayman Chemicals) 또는 비히클로 처리하였다. 탈진까지의 시간 및 거리는 SW-처리된 마우스 및 이들의 대조군에 대해 이전에 기재(4)된 바와 같이 수행하였다(도 3a).
마우스 트랜스제닉 계통은 The Jackson Laboratory (EP4flox/flox) No. 028102에서 구입하였다. 본 발명자는 적절한 PCR-기반 전략에 의해 이들 유전자형을 검증하였다. 특정되지 않는 한 암컷 및 수컷 마우스로 연구를 수행하였다.
면역형광 염색 및 영상화
본 발명자는 이전에 기재(5)된 바와 같이 조직학을 위해 수용자 전경골근(TA) 또는 비복근(GA) 조직을 수집하고 준비하였다. 본 발명자는 4% PFA를 사용하여 근육으로부터 횡단면을 고정하고, PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100를 사용하여 차단 및 투과시키고, 항-LAMININ(Millipore, 클론 A5, 카탈로그 # 05-206, 1:200) 및 이후 AlexaFluor 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, 1:200) 또는 밀 배아 응집소-Alexa 647 컨쥬게이트(WGA, Thermo Fisher Scientific)와 함께 인큐베이션하였다. 본 발명자는 DAPI(Invitrogen)로 핵을 대조염색하였다.
근관의 경우, 본 발명자는 4% PFA를 사용한 고정, PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100을 사용한 차단 및 투과화 및 1차 항체 항-MyHC(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # 14-6503-82, 클론 MF-20, 1:500) 및 이후 AlexaFluor 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, 1:500)를 이용한 염색을 수행하였다. 본 발명자는 DAPI(Invitrogen)로 핵을 대조염색하였다.
본 발명자는 40x/0.9 N.A. 대물렌즈를 갖는 Zeiss 510 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss Microimaging)에서 다수의 연속 초점면을 포착하거나 20Х/0.75 N.A. 대물렌즈를 갖는 KEYENCE BZ-X700 올-인-원(all-in-one) 형광 현미경(Keyence)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 본 발명자는 Keyence Advanced Analysis Software를 사용하여 근섬유 영역을 분석하였다. 단면적의 경우, 근육의 최대 단면적을 정량화하거나, 상기와 같이 각각의 마우스에 대해 400개 초과의 근섬유를 포함하는 적어도 10개 필드의 LAMININ-염색된 근섬유 단면을 포착하였다. 데이터 분석은 맹검이었다. 영상 획득 및 스코어링을 수행하는 연구자들은 분석되는 샘플 그룹에 제공된 처리 조건을 인지하지 못했다.
세포 배양
DMEM/F10(50:50), 15% FBS, 2.5 ng ml-1 섬유모세포 성장 인자-2 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 근원성 세포 배양 배지에서 일차 근모세포를 성장시켰다. 분화 실험을 위해, 컨플루언트(confluent) 근모세포를 5% 말 혈청, DMEM을 함유하는 배지에서 성장시켰다. 본 발명자는 4일차 분화된 근관에 10 ng/ml 프로스타글란딘 E2(Cayman Chemicals), 1 μM의 SW033291(ApexBio) 또는 1μM의 ONO-AE3-208(Cayman Chemicals)을 첨가하였다. 근모세포를 EP4fl/fl 마우스로부터 분리시키고, 이전에 기재(5)된 바와 같이 mCherry/Cre 렌티바이러스 또는 모의 감염을 받았다.
정량적 RT-PCR
본 발명자는 RNeasy Micro Kit(Qiagen)를 이용하여 MuSC로부터 RNA를 분리하였다. 근육 샘플의 경우, 본 발명자는 액체 질소에서 조직을 급속 동결시키고, FastPrep FP120 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 Trizol(Invitrogen)에서 근육을 균질화시킨 후, RNA를 분리시켰다. 본 발명자는 SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit(Bioline)를 사용하여 각각의 샘플로부터의 전체 mRNA로부터 cDNA를 역전사하였다. 본 발명자는 ABI 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems)에서 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems) 또는 TaqMan Assays(Applied Biosystems)을 사용하여 cDNA를 RT-PCR에 적용하였다. 본 발명자는 10분 동안 95℃에서 샘플을 순환시키고, 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃에서 40회 순환시켰다. 상대 전사체 수준을 정량하기 위해, 본 발명자는 처리된 샘플 및 처리되지 않은 샘플을 비교하기 위해 2-ΔΔCt를 이용하였고, Gapdh에 비한 결과로 표현하였다.
SYBR Green qRT-PCR의 경우, 본 발명자는 다음 프라이머 서열을 사용하였다: Gapdh, 정방향 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3', 역방향 5'-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3'; Hpgd, 정방향 5'- TCCAGTGTGATGTGGCTGAC-3', 역방향 5'-ATTGTTCACGCCTGCATTGT-3'; Ptger1, 정방향 5' GTGGTGTCGTGCATCTGCT-3', 역방향 5'-CCGCTGCAGGGAGTTAGAGT-3', Ptger2, 정방향 5'-ACCTTCGCCATATGCTCCTT-3', 역방향 5'-GGACCGGTGGCCTAAGTATG-3', Cox2, 정방향, 5'-AACCCAGGGGATCGAGTGT-3', 역방향 5'-CGCAGCTCAGTGTTTGGGAT-3'; Fbxo32, 정방향 5'-TAGTAAGGCTGTTGGAGCTGATAG-3', 역방향 5'- CTGCACCAGTGTGCATAAGG-3'. 뮤린 노화 마커 및 노화 관련 마커의 경우, 본 발명자는 이전에 기재(6)된 프라이머를 사용하였다.
TaqMan Universal PCR Master Mix 시약 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 샘플에서 Pax7, Myh, p21, Ptger3 및 Ptger4를 정량하기 위해 TaqMan Assays(Applied Biosystems)를 사용하였다. 전사체 수준을 Gapdh 수준에 비해 표현하였다. SYBR Green qPCR을 위해, 투입 cDNA 샘플을 표준화하기 위해 Gapdh qPCR을 이용하였다. Taqman qPCR을 위해, 다중 qPCR은 표적 신호(FAM)가 이들의 내부 Gapdh 신호(VIC)에 의해 개별적으로 표준화되는 것을 가능하게 한다.
15-PGDH 운동 검정
15-PGDH 활성을 제조업체의 프로토콜에 따라 BioVision PicoProbe 15-PGDH Activity Assay Kit(Cat # K562)를 사용하여 근육 용해질에서 분석하였다.
질량분광법
분석물:
모든 프로스타글란딘 표준 PGF2α; PGE2; PGD2: 15-케토 PGE2; 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2; PGE2-D4; 및 PGF2α-D9을 Cayman Chemical로부터 구입하였다. PGE2-D4 내부 표준의 경우, 위치 3 및 4를 전체 4개의 중수소 원자로 표지하였다. PGF2α-D9의 경우, 위치 17, 18, 19 및 20을 전체 9개의 중수소 원자로 표지하였다.
보정 곡선 제조:
분석물 스톡 용액(5 mg/mL)을 DMSO에서 제조하였다. 이들 스톡 용액을 아세토니트릴/물(1:1 v/v)로 연속 희석하여 일련의 표준 작업 용액을 획득하고, 이를 이용하여 보정 곡선을 생성시켰다. 10 uL의 각각의 표준 작용 용액을 200 μL의 균질화 완충액(아세톤/물 1:1 v/v; 산화를 방지하기 위한 0.005% BHT)으로 스파이킹한 후, 10 uL의 내부 표준 용액(3000 ng/mL의 각각의 PGF2α-D9 및 PGE2-D4)를 첨가하여 보정 곡선을 제조하였다. 보정 곡선을 각각의 세트의 샘플로 새로이 제조하였다. 보정 곡선 범위: PGE2 및 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2의 경우, 0.05 ng/mL 내지 500 ng/mL; PGD2 및 PGF2α의 경우, 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL; 및 15-케토 PGE2의 경우, 0.025 ng/mL 내지 500 ng/mL.
추출 절차:
추출 절차를 문헌[Prasain et al](7)의 추출 절차로부터 변형시켰고, 이는 아세톤 단백질 침전 후 2-단계 액체-액체 추출을 포함하였고; 후자의 단계는 LC-MS/MS 민감성을 향상시킨다. 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT) 및 질소(N2) 가스 하에서의 증발을 산화를 방지하기 위해 사용하였다.
고체 조직을 수거하고, 칭량하고, 액체 질소로 급속 동결시켰다. 근육 조직을 폴리프로필렌 튜브에서 균질화 비드 및 200 μL의 균질화 완충액과 조합하고, 6 m/s의 속도에서 40초 동안 FastPrep 24 균질화기(MP Biomedicals)에서 가공하였다. 균질화 후, 10 μL의 내부 표준 용액(3000 ng/mL)을 조직 균질액에 첨가한 후, 음파 처리하고, 10분 동안 진탕하였다. 샘플을 원심분리하고, 상층액을 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 200 μL의 헥산을 샘플에 첨가한 후, 15분 동안 진탕한 후, 원심분리하였다. 샘플을 40분 동안 -80℃에서 동결시켰다. 헥산 층을 동결된 하부 수성층으로부터 부어서 폐기하였다. 해동 후, 25 μL의 1N 포름산을 하부 수성층에 첨가하고, 샘플을 볼텍싱하였다. 두번째 추출을 위해, 200 μL의 클로로포름을 수성상에 첨가하였다. 샘플을 15분 동안 진탕하여 완전한 추출을 보장하였다. 원심분리를 수행하여 층을 분리시켰다. 하부 클로로포름 층을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고, 40℃에서 질소하에서 증발 건조시켰다. 건조 잔여물을 100 μL 아세토니트릴/10 mM 암모늄 아세테이트(2:8 v/v)에서 재구성하고, LC-MS/MS로 분석하였다.
LC-MS/MS:
많은 프로스타글란딘은 동일한 질량을 갖는 위치 이성질체이고, 유사한 단편화 패턴을 가지므로, 크로마토그래피 분리가 중요하다. 2개의 SRM 전이(1개의 정량자(quantifier) 및 1개의 정성자(qualifier))를 각각의 분석물에 대해 조심스럽게 선택하였다. 특이한 정성자 이온 강도 비율 및 체류 시간이 표적 분석물을 입증하는데 필수적이었다. 모든 분석물을 LC-20ADXR 돌출(prominence) 액체 크로마토그래프 및 8030 삼중 사중극 질량분광기(Shimadzu)를 이용하여 음성 전기분무 LC-MS/MS로 수행하였다. HPLC 조건: Acquity UPLC BEH C18 2.1x100 mm, 1.7 um 입자 크기 컬럼을 0.25 mL/min의 유량으로 50℃에서 수행하였다. 이동상은 A: 물 중 0.1% 아세트산 및 B: 아세토니트릴 중 0.1% 아세트산으로 구성되었다. 용리 프로파일: 5분 동안 35% B에서 최초 유지 후, 3분 동안 35%-40%의 구배 후, 3분 동안 40%-95%; 전체 수행 시간은 14분이었다. 주입 부피는 20 uL였다. 이들 HPLC 조건을 이용하여, 본 발명자는 관심 분석물의 기준선 분리를 달성하였다.
선택된 반응 모니터링(SRM)을 정량화에 사용하였다. 질량 전이는 다음과 같았다: PGD2: m/z 351.10 → m/z 315.15 (정량자) 및 m/z 351.10 → m/z 233.05 (정성자); PGE2: m/z 351.10 → m/z 271.25 (정량자) 및 m/z 351.10 → m/z 315.20 (정성자); PGF2α: m/z 353.10 → m/z 309.20 (정량자) 및 m/z 353.10 → m/z 193.20 (정성자); 15 케토-PGE2: m/z 349.30 → m/z 331.20 (정량자) 및 m/z 349.30 → m/z 113.00 (정성자); 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2: m/z 351.20 → m/z 333.30 (정량자) 및 m/z 351.20 → m/z 113.05 (정성자); PGE2-D4: m/z 355.40 → m/z 275.20; 및 PGF2α-D9: m/z 362.20 → m/z 318.30. 드웰 시간(Dwell time)은 20-30 ms였다.
LabSolutions LCMS(Shimadzu)를 사용하여 정량 분석을 수행하였다. 정량화를 위해 내부 표준 방법을 이용하였다: PGE2-D4를 PGE2, 15-케토 PGE2, 및 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2의 정량을 위한 내부 표준으로 사용하였다. PGF2α-D9는 PGD2 및 PGF2α의 정량을 위한 내부 표준이었다. 보정 곡선은 X가 농도인 1/X2의 가중치 인자를 이용하여 농도 범위에 걸쳐 선형(R>0.99)이었다. 역 계산된 표준 농도는 공칭 값에서 ±15%였고, 정량 하한(LLOQ)에서 ±20%였다.
생체 내 및 제자리 근력 측정
발목 족저굴곡근의 피크 등척성 토크(N·mm)를 이전에 기재(8,9)된 바와 같이 평가하였다. 간단히, 마취된 마우스의 발을 서보모터(servomotor)(모델 300C-LR; Aurora Scientific)에 부착된 발판에 놓았다. 2개의 Pt-Ir 전극 바늘(Aurora Scientific)을 경피적으로 삽입하고, 경골 신경 위에 무릎의 후방/후방-내측에 바로 피하 삽입하였다. 발목 관절을 90° 각도로 고정하였다. 피크 등척성 토크는 200 Hz 주파수 및 0.1-ms 구형파 펄스에서 경골 신경에 전달되는 전류를 변화시킴으로써 달성되었다. 본 발명자는 각각의 측정 사이에 1분의 회복으로 각각의 근육에 대해 3회의 강직성 측정을 수행하였다. 데이터를 Aurora Scientific Dynamic Muscle Data Acquisition 및 Analysis Software를 사용하여 수집하였다.
통계 분석
본 발명자는 3개의 생물학적 복제물이 각각 푸울링되는 적어도 3회의 독립적 실험으로 세포 배양 실험을 수행하였다. 본 발명자는 대조군 샘플이 시험관 내에서 동일한 실험으로부터 또는 생체 내에서 반대측 사지 근육으로부터 유래되는 실험에 대해 쌍을 이룬 t-검정을 이용하였다. α=0.05를 사용하여 처리되지 않은 그룹과 처리된 그룹 사이의 유의성 차이를 결정하기 위해 비모수 만-휘트니 검정(non-parametric Mann-Whitney test)을 사용하였다. ANOVA 또는 다중 t-검정을 도면 범례에 표시된 바와 같이 본페로니 보정(Bonferroni correction)을 이용하여 결정된 유의성 수준을 이용하여 다중 비교를 위해 수행되었다. 달리 기재하지 않는 한, 데이터는 평균 ± s.e.m으로 제시된다.
참고문헌
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실시예 2. 프로스타글란딘 분해 효소 15-PGDH의 억제는 노화된 마우스에서 근육 강도를 증가시킨다.
서문
노화와 함께, 신체 전체의 근육 기능 상실은 삶의 질을 감소시키고, 이환율 및 사망률을 증가시킨다(1, 2). 이러한 파종성 근육 위축 및 강도 상실 또는 근감소증은 미국에서만 연간 180억 달러의 의료 비용을 차지한다(2). 근감소증에 대한 치료제의 확인은 주요 임상적 이점이 될 것이다(1, 2).
노화 동안, 골격근은 구조적 및 기능적 변화를 겪는다. 가장 명백한 것은 하체 근육에서 노화된 인간에서 50-80%만큼 감소할 수 있는 근육 강도의 손실이며, 근섬유의 단면적, 근육 질량 및 강도의 감소가 수반된다(3). 이러한 기능의 손실은 붕괴된 세포-세포 상호작용 및 비정상적인 세포 신호전달 경로, 특히 염증, 단백질 전환 및 미토콘드리아 기능과 관련된 것들로부터 발생한다(1, 4-6). 이러한 다인성 병인으로 인해, 근감소증을 예방하거나, 지연시키거나, 역전시키기 위한 치료 표적을 확인하기 위해 인과적 분자 경로를 푸는 것이 어려운 것으로 입증되었다.
이전에, 본 발명자는 젊은 마우스에서 PGE2가 근육 줄기 세포(MuSC)를 자극하고, 손상된 근육의 재생에 필수적이라는 것을 결정하였으며(7), 이는 뼈, 결장, 간 및 혈액의 재생에서의 이의 기능에 관한 결과와 잘 일치한다(8-10). 본 발명자는 노화에서 프로스타글란딘 신호전달이 잘못될 수 있다고 추론하였다. 밀접하게 관련된 프로스타글란딘 패밀리 구성원(11)을 구별하기 위해 대기압 이온화 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여, 본 발명자는 PGE2 및 PGD2 수준이 노화된 골격근에서 감소된다는 것을 발견하였다.
본 발명자는 노화된 근육에서 프로스타글란딘의 감소가 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)에 의한 증가된 프로스타글란딘 이화작용으로 인한 것일 수 있다고 가정하였다. 여기서, 본 발명자는 상승된 15-PGDH가 노화된 근육 및 특정한 다른 노화 조직의 특징이라는 것을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자는 노화된 마우스에서 15-PGDH의 억제가 근육 질량 및 강도를 증가시키는 것을 제시한다. 유전적 실험은 15-PGDH 억제의 유리한 효과가 증가된 PGE2 신호전달에 특이적임을 입증한다. 본 발명의 결과는 근감소증에 대한 신선한 통찰력을 제공하고, 혁신적인 치료 전략을 제안한다.
노화된 조직에서의 프로스타글란딘 분해 효소(15-PGDH)의 증가
본 발명자는 이전에 젊은 마우스에서 손상된 조직을 재생하기 위해 줄기 세포를 자극하는데 있어서 PGE2 신호전달의 중요성을 입증하였다(7). 본 발명자는 PGE2가 또한 성숙한 근육 근섬유에 대해 작용하고, 근육 조직 항상성의 유지에 중요한 역할을 할 수 있다고 추론하였다. 본 발명자는 노화에서 PGE2 및 막 지방산으로부터 생성된 지질 대사물인 기타 내인성 에이코사노이드의 감소가 발생할 수 있고, 근육 조직 기능에 해로운 영향을 미칠 수 있다고 가정하였다. 노화된 골격근의 에이코사노이드 조성을 분석하기 위해, 본 발명자는 LC-MS/MS를 사용하였다. 이러한 방법은 ELISA와 같은 항체 기반 검정의 교차-반응성을 극복하고, 동일한 질량의 관련 에이코사노이드, PGE2 및 PGD2뿐만 아니라 PGF2α의 이의 분해능에서 다른 질량분광법을 능가한다(도 8a-c, 9a-c 및 10a). 이는 젊은 및 노화된 마우스로부터 뒷다리 근육을 분리하고 균질화한 후, 단백질을 배제하기 위한 아세톤 침전에 의해 달성된다. 이후, LC-MS/MS 민감도를 향상시키기 위해 2-단계 액체-액체 추출을 수행한다. 본 발명자는 노화된 근육에서 PGE2 및 PGD2 수준의 유의한 감소를 관찰하였다(도 8a-c, 9a-c 및 10a). PGE2 및 PGD2는 속도 제한 효소 15-PGDH에 의해 개시되는 다단계 공정에 의해 분해되어 불안정한 15-케토-PGE2 및 15 케토-PGD2 대사물을 생성하고, 이는 이후 13,14-디하이드로-15-케토-PGE2 대사물(PGEM)을 포함하는 다수의 하류 대사물로 전환된다(12, 13). 이들 중간체는 이들의 불안정성으로 인해 LC-MS/MS에 의해 전혀 검출되지 않았거나 낮은 수준으로만 검출되었다(도 8c 및 9c). MS 스펙트럼 플롯은 이러한 방법이 밀접하게 관련된 에이코사노이드를 용이하게 구별함을 입증한다.
본 발명자는 분해 효소 15-PGDH의 증가가 근육에서 PGE2 및 PGD2의 관찰된 감소를 설명할 수 있고, 노화된 조직의 일반적인 특징을 구성할 수 있다는 가설을 세웠다. 일치하게, 본 발명자는 효소의 특정 활성이 노화된 골격근에서뿐만 아니라 노화된 심장, 피부, 비장 및 결장 조직에서도 상승한 것을 발견하였다(도 8d 및 11). 따라서, 15-PGDH mRNA 및 단백질은 노화된 근육에서 유의하게 증가한다(도 8e, 8f, 12a 및 12b). 인간 노화에 대한 이러한 발견의 관련성을 결정하기 위해, 본 발명자는 젊은 및 노화된 인간 근육 샘플에 대한 공개적으로 이용 가능한 마이크로어레이 데이터를 재분석하였고(14), 15-PGDH의 발현이 젊은 집단(25 ± 3 yrs)으로부터의 것에 비해 외측광근으로부터의 노화된 인간(78 ± 6 yrs) 생검에서 유의하게 증가한 것을 발견하였다(도 13a). 함께, 이들 데이터는 노화된 근육에서 관찰되는 프로스타글란딘 수준 감소의 잠재적 조종자로서 15-PGDH를 확인한다.
15-PGDH의 억제 후 노화된 근육 질량 및 강도의 증가
본 발명자는 15-PGDH의 억제가 PGE2 및 PGD2의 수준을 증가시킬 수 있으며, 이는 차례로 노화된 마우스에서 근육 소모를 개선할 수 있다고 가정하였다. 인간과 마찬가지로, 노화된 마우스는 근육 강도의 일반적인 손실인 근감소증을 나타낸다(1). 본 발명자는 먼저 편재성 프로모터(U6)의 제어하에서 GFP 및 15-PGDH에 대한 shRNA 또는 GFP 및 스크램블된(scr) shRNA를 인코딩하는 대조군 AAV9의 아데노-관련 바이러스(AAV9) 근육 내(i.m.) 전달을 수반하는 효소 수준을 감소시키기 위한 유전적 접근법을 사용하였다(도 8g). 결과적인 국소화된 근육 내 유전자 요법 전달 전략은 질량분광법에 의해 평가된 15-PGDH mRNA 수준 및 특정 활성의 유의한 감소 및 PGE2 및 PGD2 수준의 증가를 발생시켰다(도 8h-j 및 14a). 이들 벡터 표적화된 근육은 형질도입된 전경골근(TA) 및 비복근(GA)에서 GFP 리포터의 면역형광 분석에 의해 확인하였다(도 14b). 노화된 근육에서(젊은 근육에서는 아님) 15-PGDH의 유전적 넉다운은 대조군과 비교하여 15-PGDH shRNA 처리된 노화된 근육에서 근섬유 단면적의 현저한 증가를 동반하였다(도 8k-m). 또한, 젊은 근육과는 대조적으로, 노화된 근육에서 15-PGDH의 넉다운은 처리 1개월 후 근육 질량 및 근력 둘 모두에서 유의한 증가를 발생시켰다(도 8n-p 및 14c).
근감소증에서 관찰되는 파종된 근육 소모가 15-PGDH의 소분자 억제제의 전신 전달에 의해 극복될 수 있는지 시험하기 위해, 본 발명자는 노화된 마우스 및 젊은 대조군 마우스를 SW033291(SW) 또는 비히클(10)로 복강 내 처리하였다(도 15a). SW는 이전에 0.1 nM의 겉보기 Ki로 PGE2와 비경쟁적인 15-PGDH의 특정 억제제로 광범위하게 특성규명되었다(10). 생체 내에서, SW는 이전에 골수, 결장, 폐 및 간에서 PGE2 수준을 2배 증가시키고, PGD2 수준을 더 적은 정도로 증가시키고, 이는 젊은 마우스에서 이들 조직의 손상 후 재생을 증가시키는 것으로 나타났다(10). 본 발명자는 1개월의 매일 복강 내 SW 처리 후, 15-PGDH 특이적 활성이 노화된 근육에서 유의하게 감소하였고, 젊은 근육과 동등한 PGE2 및 PGD2 수준의 동시 증가가 LC-MS/MS에 의해 검출된 것을 발견하였다(도 15b, 15c, 16a 및 16b). 조직학적 분석은 근섬유 단면적이 SW-처리된 노화된 마우스에서 유의하게 증가되었으나, 젊은 마우스에서는 그렇지 않은 것을 제시하였으며, 이는 노화된 마우스에서의 근육 위축이 약화된 것을 나타낸다(도 15d-f). 섬유 유형 분석은 SW 처리가 산화성(타입 IIa) 및 해당(타입 IIb) 섬유 둘 모두의 단면적의 증가를 촉진한 것을 제시하였다(도 15g-j). SW-처리된 젊은 마우스는 통계적으로 유의하지 않은 증가된 근육 질량 및 절대 강도에 대한 경향을 나타내었다(도 15k, 15l 및 16c). 대조적으로, SW-처리된 노화된 마우스는 TA, GA 및 가자미근의 질량(도 15k) 및 족저굴곡근 힘(도 15l 및 16c)에서 유의한 증가를 나타내었다. 더욱이, 지구력(트레드밀에서 탈진까지 걸리는 시간)이 증가되었고, 이는 근육 강도에 더하여 전반적인 이로운 전신 효과를 시사한다(도 15m). 종합하면, 소분자 억제제 SW를 사용한 본 발명의 연구는 국소화된 shRNA를 통한 기능의 유전적 손실을 사용하여 본 발명의 결과를 확증하며, 1개월의 기간 동안 전신적인 15-PGDH 활성의 감소가 노화된 마우스에서 골격근 위축을 약화시키고 근육 기능을 증가시키는 데 충분함을 제시한다.
노화된 근육 미세환경에서의 노화 간질 세포에 의한 15-PGDH 발현
본 발명자는 노화된 근육 조직에서 15-PGDH의 세포 공급원을 확인하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자는 분리된 젊은 및 노화된 근육 조직으로부터 형광 활성화 세포 분류에 의해 분리된 세포에서 Hpgd (15-PGDH) mRNA 수준을 분석하였다. 15-PGDH 전사체 수준의 현저한 증가는 FACS 정제된 대식세포(Cd11b+/Cd11c-/F4/80+/Cd31-)에서 검출되었으나, 노화된 근육으로부터 분리된 내피(Cd31+/Cd11b-/Cd11c-/F4/80-) 또는 근원성 줄기 및 전구 세포(α7+/Cd11b-/Cd45-/Cd31-/Sca1-)에서는 검출되지 않았다(도 17a, 18a 및 18b). 또한, 노화된 대식세포 및 내피 세포는 근육을 포함하여 노화와 함께 축적되고 조직 기능에 악영향을 미치는 것으로 보고(15)된 노화 세포의 마커인 세포 주기 조절제 p16(Ink4a, Cdkn2a) 및 p21(Cdkn1a)을 높은 수준으로 발현하였다(도 17b 및 19c). 노화 세포가 노화된 근육에서 15-PGDH의 공급원인지 결정하기 위해, 본 발명자는 이들 세포를 절제하기 위한 두 가지 전력인 유전적 모델 및 세놀리틱 약물 처리를 이용하였다. 먼저, 본 발명자는 세포 사멸을 유도하는 융합 단백질을 활성화시키는 이량체화제(dimerizer)인 AP20187(AP)을 이용한 처리에 대한 반응으로 최소 Ink4a 프로모터(p16)의 제어 하에 FK506-결합-단백질-카스파제8 융합 단백질의 발현에 의해 노화 세포가 제거되는 INK-ATTAC 트랜스제닉 마우스로부터의 근육을 분석하였다(16)(도 17c 및 19a). 노화된 INK-ATTAC 마우스의 16개월 AP 처리 후, 15-PGDH 전사체 수준이 현저하게 감소되었고(도 17d), 이는 LC-MS/MS에 의해 분석된 PGE2 수준의 증가를 발생시켰다(도 17e 및 19b). 이러한 마우스 모델에서 15-PGDH의 세포 공급원을 결정하기 위해, 본 발명자는 대조군 및 AP-처리된 INK-ATTAC 근육으로부터 대식세포를 FACS 분리하였고, p16 및 p21의 감소된 발현과 일치하게(도 19c) 노화 세포의 청소 후 이들 세포에서 15-PGDH의 감소된 수준을 발견하였다(도 17f). 대조적으로, FACS 분리된 노화 내피 세포는 유의한 15-PGDH 수준을 발현하지 않았다(도 17f 및 19c). 특히, 근섬유는 사멸하지 않으며, 이들의 기능이 개선된다. 노화된 마우스에서 노화 세포의 제거는 뒷다리 근육 질량(TA 및 GA), 그립 강도로 평가된 강도, 및 탈진까지 트레드밀에서 달리는 거리의 복합 척도로서 평가된 지구력 및 체중의 증가를 발생시켰다(도 17g). 노화 세포가 절제된 이들 노화된 마우스는 더 먼 거리로 달렸으며, 더 높은 작업 능력을 나타내는 증가된 체질량을 가졌다(도 17g).
두 번째 접근법으로서, 본 발명자는 노화된 마우스를 판-Bcl 억제제인 나비토클락스로도 공지된 세놀리틱 제제인 ABT-263으로 처리함으로써 노화된 노화 세포에서 아폽토시스를 유도하였다(17)(도 19d). 2개월의 처리 후, 면역조직화학에 의해 검출된 15-PGDH를 발현하는 세포의 백분율 및 근육 조직에서 qRT-PCR에 의해 검출된 전체 15-PGDH 유전자 발현 수준이 현저하게 감소하였다(도 19d-g). 가장 높은 15-PGDH 염색을 나타낸 근육 조직 상주 간질 세포는 이러한 세놀리틱 처리에 의해 절제된 반면(도 19e 및 19f), 근섬유는 보존되었다. 이들 결과는 PGE2가 주변분비 메커니즘에 의해 부분적으로 분해되어 근섬유 부근의 대식세포와 같은 노화 15-PGDH-발현 간질 세포가 PGE2를 분해하고, 노화된 근원성 니치 또는 미세환경의 기능장애에 기여함을 시사한다.
젊은 근육에서 15-PGDH의 이소성 발현 후 감소된 근육 강도
본 발명자는 15-PGDH가 노화와 함께 관찰되는 근육 기능의 손실에 중요한 역할을 하는 경우, 젊은 마우스의 근육에서 PGE2 분해 효소의 이소성 발현이 근육 기능에 해로운 영향을 미칠 것이라고 추론하였다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 본 발명자는 편재성 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에 15-PGDH 유전자(Hpgd)를 전달하고 과발현시키기 위해 AAV9을 사용하였다(도 20a). 본 발명자는 AAV9-CMV-15-PGDH의 근육 내 주사시, 15-PGDH의 발현이 qRT-PCR에 의해 증가되었음을 확인하였다(도 20b). 또한, LC-MS/MS에 의한 분석은 15-PGDH를 발현하는 젊은 근육에서 프로스타글란딘 PGE2 및 PGD2의 현저한 감소를 나타내었으며, 이는 노화된 근육에서 관찰되는 이들 프로스타글란딘의 감소와 유사하다(도 20c). 단지 1개월의 기간 동안 이들 프로스타글란딘의 감소는 개별 근섬유의 평균 단면적의 유의한 감소(도 20d 및 20e) 및 젊은 성체 마우스에서 근육 질량 및 근력으로 검정된 근육 기능의 급격한 손실(도 20f 및 20g)을 발생시켰다. 본 발명자는 qRT-PCR에 의해 근육 위축의 마커를 분석하였고, 급성 위축 모델에서 다른 사람들의 결과(18-21)와 일치하게 아트로젠 Trim63(MuRF1) 및 Fbxo32(Atrogin-1) 및 자가포식 유전자 p62, Lc3b, Atg4 및 Atg6가 15-PGDH를 과발현하는 근육에서 상향조절된 것을 발견하였다(도 20h). 이들 데이터는 15-PGDH 과발현이 근육에서 PGE2 및 PGD2 수준을 감소시키는 데 인과적 역할을 하고, 이는 차례로 근육 질량 및 강도의 감소를 발생시킨다는 강력한 증거를 제공한다. 더욱이, 이들은 15-PGDH 활성이 근육 항상성에 중대한 영향을 미치고 위축 표현형을 유도함을 제시한다.
표적 15-PGDH에 대한 SW의 특이성을 결정하기 위해, 본 발명자는 근육 내 AAV9-매개 유전자 전달 후 효소를 과발현하는 젊은 마우스에서 구조 실험을 수행하였다. 본 발명자는 SW에 의한 과발현된 효소의 억제가 15-PGDH 과발현시 관찰되는 해로운 효과를 극복해야한다고 추론하였다. 따라서, 본 발명자는 비히클 또는 SW로 전신적으로 대조군 및 15-PGDH를 과발현하는 젊은 마우스를 처리하였다(도 20i). 본 발명자는 SW를 이용한 처리가 15-PGDH를 과발현하는 젊은 근육의 질량(도 20j) 및 강도(도 20k)를 증가시킨 것을 발견하였다. 이들 데이터는 소분자 SW를 사용한 15-PGDH 억제가 특히 15-PGDH를 표적화하여 근육 기능을 개선한다는 것을 입증한다.
PGE2에 의해 매개되지만 PGD2에 의해 매개되지는 않는 노화된 마우스에서의 강도 증가
15-PGDH는 노화된 근육에서 PGE2 및 PGD2 둘 모두를 저하시킨다. 특히, 두 개의 프로스타글란딘은 이들의 수용체 및 이들의 하류 신호전달 캐스케이드에 있어서 상이하다(22). 어떤 프로스타글란딘이 노화된 근육 기능의 개선을 주도하는 것을 담당했는지 결정하기 위해, 본 발명자는 SW를 사용한 15-PGDH 억제에 의해 이들의 수준을 증가시켰고, PGD2 합성 효소인 PTGDS의 발현을 억제하였다. 이는 PTGDS를 표적으로 하는 shRNA 또는 스크램블된 대조군 shRNA를 인코딩하는 AAV9 바이러스를 노화된 근육에 근육 내 주사하고, 15-PGDH 억제제, SW 또는 비히클로 1개월 동안 마우스를 처리하여 달성하였다(도 21a). 본 발명자는 qRT-PCR에 의해 감소된 Ptgds mRNA 수준 및 질량분광법에 의해 감소된 수준의 PGD2를 확인함으로써 형질도입된 노화된 근육에서 PTGDS의 넉다운을 검증하였다(도 21b 및 21c). PTGDS의 넉다운 시, SW 처리 후 근육 질량, 힘 및 지구력의 증가가 관찰되었다(도 21d-g). 이들 결과는 PGD2가 아닌 PGE2가 15-PGDH 억제시 노화된 근육에서 관찰되는 증가된 근육 기능의 매개체임을 시사한다.
본 발명자는 노화된 마우스에서 근육 위축을 약화시키는데 있어서 PGE2의 특정 역할을 입증하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 3개의 효소가 PGE2 합성, cPGES, PGES1 및 PGES2를 담당하기 때문에(22), PGE2 합성 경로를 표적화하는 것은 기술적으로 어려운 삼중 넉다운을 수반할 것이다. 대안적 접근법으로서, 본 발명자는 근육의 PGE2 수용체에 초점을 맞추었다. qRT-PCR은 PGE2 수용체인 EP4(Ptger4)가 분화된 근관에서 가장 고도로 발현된 에이코사노이드 수용체임을 제시하였다(도 22a). 관찰된 근육 비대가 생체 내에서 성숙 근육 근섬유에서 PGE2-매개 EP4 신호전달로 인한 것인지 결정적으로 결정하기 위해, 본 발명자는 수용체가 GA 근육의 근섬유에서만 유전적으로 제거된 마우스 모델을 생성시켰다. 이는 노화된 EP4f/f 마우스(MCK-EP4Δ/Δ)의 GA 근섬유로의 근육 크레아틴 키나제(MCK)-프로모터 구동 Cre의 근육 내 AAV9-매개 전달에 의해 달성하였다. 놀랍게도, 노화된 마우스의 근섬유에서 EP4 발현의 손실은 1개월 동안 SW-매개 15-PGDH 억제 처리에 의해 유도된 근육 질량 및 강도에 대한 유리한 효과를 제거하였다(도 21h-k). 이들 데이터는 SW 처리의 관찰된 효과가 주로 노화된 근섬유에 대한 EP4 수용체를 통한 PGE2 신호전달에 의해 매개됨을 입증한다.
15-PGDH 억제 후 미토콘드리아 기능 및 생물발생의 증가
G-결합된 단백질 수용체인 EP4를 통한 PGE2 신호전달은 사이클릭 AMP(cAMP)에 의해 매개되는 것으로 공지되어 있다(12, 22, 23). 본 발명자는 PGE2가 골격근에서 사이클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질(CREB)을 활성화시키는 것을 확인하였다(도 23a 및 23b). PGE2가 노화된 근육에 미치는 영향을 통해 하류 신호전달 경로를 확인하기 위해, 본 발명자는 비히클 및 SW-처리된 노화된 근육의 편향되지 않은 전사체 분석을 수행하였다. 가장 놀라운 것은 미토콘드리아 산화 인산화, ATP 합성 및 기타 대사 및 에너지 생성 과정을 포함하는 미토콘드리아 경로에 대한 강력한 풍부화(enrichment)였다(도 24a). 전자 수송 사슬의 미토콘드리아 복합체 I, II, IV 및 V의 다수의 구성요소는 SW-처리된 노화된 근육에서 현저하게 증가하였다(도 24b). 프로모터에 CREB 결합 모티프를 갖는 미토콘드리아 생물발생에 대한 중요한 보조인자인 과산화소체 증식제-활성화 수용체 감마 보조활성인자 1-알파(Pgc1α)의 mRNA 수준을 검정한 경우(24), 본 발명자는 이의 수준이 젊은 근육에서 관찰된 수준으로 회복되었음을 발견하였다(도 24c). 노화된 근육의 SW 처리 후 미토콘드리아 대 핵 DNA의 증가된 비율에 의해 반영된 바와 같이 전체 미토콘드리아 함량이 증가하였다(도 24d). 함께, 이들 데이터는 PGE2가 근육 성장의 에너지 요구사항을 충족시키기 위해 미토콘드리아 수의 강력한 증가를 촉발한다는 강력한 증거를 제공한다.
유전자 발현 분석은 또한 노화-관련 근육 위축과 관련된 신호전달 경로의 감소를 제시하였다. 노화된 근육의 SW 처리시 가장 하향조절된 유전자 중에는 유비퀴틴 신호전달 경로의 구성원이 있었다(도 24a 및 24e). PGE2 신호전달은 이전에 비-근육 세포에서 AKT/FOXO 경로의 활성화와 관련이 있었다(12, 25, 26). 따라서, 본 발명자는 이러한 경로가 근육 위축에서 역할을 하는 것으로 공지된 E3 유비퀴틴 리가제의 발현을 조절하기 위해 근육에서 기능할 수 있는지 결정하고자 하였다(27-29). 이를 위해, 다른 세포 유형의 부재 하에 근육 세포를 PGE2에 급성 노출시켰다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 제시된 바와 같이, 15 또는 30분 동안 PGE2로 처리된 인간 공여자 근육 세포로부터 유래된 분화된 근관은 FOXO(pFOXO3a)를 비활성화시키는 pAKT의 증가된 수준을 나타내었다(도 24f). 추가로, PGE2 처리된 근관은 하류 표적 포스포-S6 리보솜 단백질(pS6rp)을 활성화시켰으며, 이는 증가된 단백질 합성을 나타내고(도 24f), PGE2 길항제(ONO- AE3-208)의 첨가시 관찰되지 않은 직경의 현저한 증가를 나타내었다(도 25a-c). 확증으로, 본 발명자는 근관의 PGE2 처리 후 퓨로마이신 혼입에 의해 정량화된 단백질 합성의 증가를 관찰하였다(도 25d). SW를 이용한 처리는 노화된 근육 조직에서 상주 간질 세포에 의해 15-PGDH 발현을 억제하는 간접적 메커니즘과 일치하게 배양된 근관의 직경에 영향을 미치지 않았다(도 25a 및 25b). 이들 시험관 내 데이터는 PGE2가 AKT 신호전달을 활성화하고 근관 성장 및 단백질 합성을 향상시키기 위해 근관에 직접 작용할 수 있음을 제시하며, 이는 근육 위축에 대항하는 PGE2에 대한 이전에 연구되지 않은 역할에 대한 증거를 제공한다.
노화된 근육에서 15-PGDH 억제 후 감소된 단백질분해 및 TGF-베타 신호전달
본 발명자는 15-PGDH 억제로 인한 PGE2의 상승이 근관에서 시험관 내에서 관찰되는 바와 같이 AKT/FOXO 경로를 통한 신호전달을 유도하는지의 여부를 노화된 근육 조직에서 생체 내에서 결정하고자 하였다. 본 발명자는 비히클 처리된 대조군과 비교하여 SW 처리된 노화된 근육에서 pFOXO가 증가된 것을 발견하였다(도 24g). FOXO는 이전에 다른 사람들에 의해 근육-특이적 위축-관련 E3 유비퀴틴 리가제 Atrogin-1(Fbxo32), MuRF1(Trim63), Musa1 및 Smart의 발현을 감소시키는 역할을 하는 것으로 나타났다(30-32). RT-qPCR에 의한 분석은 이들 아트로젠 모두뿐만 아니라 E3 유비퀴틴 리가제 Traf6(33)의 발현이 비히클 처리된 대조군에 비해 SW 처리된 노화된 근육에서 감소된 것을 제시하였으며(도 24e, 24h 및 26a), 이는 단백질분해의 조절이 근육 위축의 약화에 기여하는 것을 시사한다. 이러한 발견은 유비퀴틴 리가제 경로의 유전자가 노화된 근육에서 가장 풍부화된 상향조절된 유전자 중 하나(도 12a-d)인 것을 나타낸 젊은 근육에 비한 노화된 근육의 본 발명의 전사체 분석과 잘 맞으며, 아트로젠 발현이 노화와 함께 증가한다는 다른 사람들에 의한 결과(34-36)와 잘 일치한다. 본 발명자는 scr shRNA 대조군과 비교하여 shRNA의 15-PGDH로의 근육 내 전달에 의해 매개되는 노화된 근육에서 15-PGDH 효소의 유전적 억제 후 E3 유비퀴틴 리가제 발현의 유사한 감소를 관찰하였다(도 24i). 흥미롭게도, MyHC 및 PGC1α와 같은 단백질을 탈아세틸화하여 이들의 유비퀴틴화를 발생시킬 뿐만 아니라 아트로젠인 Atrogin-1 및 MuRF1의 발현을 증가(37, 38)시키는 근육 위축의 또 다른 매개체인 히스톤 데아세틸라제 Hdac4가 SW-처리된 근육에서 감소하였다(도 24e). 이들 결과는 PGE2가 노화된 근육에서 관찰되는 증가된 단백질 분해를 완화시키고, 노화된 근육의 근육 위축의 관찰된 개선에 기여하는 아트로젠 발현의 조절을 유도함을 제시한다.
본 발명자의 전사체 분석은 SW 처리 1개월 후에 제2 신호전달 경로인 TGF-베타 경로의 감소를 제시하였고, 이는 노화된 근육에 대한 15-PGDH 억제의 또 다른 상승작용적인 이로운 효과의 증거를 제공한다. 근육 기능에 해롭고 노화에서 노화된 근육 위축과 관련된 것으로 공지된 미오스타틴과 같은 주요 TGF -베타 경로 유전자(Mstn, Tgfb2, Acrv2a, Smad3)(27)의 발현이 감소되었으며, 이는 근육 위축의 관찰된 약화에 기여했을 가능성이 있다(도 24e). 특히, SW 처리된 노화된 마우스의 근육에서 검정된 다른 노화, 염증 및 자가포식 마커에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다(도 26b-d). 함께, 이들 결과는 노화된 근육에서 1개월의 15-PGDH 억제 및 이에 따른 PGE2의 상승이 여러 상승작용적 신호전달 경로를 자극하여 노화된 마우스에서 근육 기능의 개선 및 위축의 약화를 유도함을 제시한다.
논의
골격근은 신체 질량의 40%를 차지한다. 50세 이후, 인간은 10년마다 평균 15%의 근육 질량을 잃게 되며(39), 이는 근감소증에 특징적인 급격한 근육 강도 손실로 이어진다. 현재 근감소증에 대한 요법은 없으며, 이의 의료 부담이 높다(2). 여기서, 본 발명자는 프로스타글란딘 분해 효소인 15-PGDH의 상승된 발현이 마우스 및 인간 둘 모두에서 노화된 근육의 새로운 마커임을 발견하였다. 본 발명자는 증가된 15-PGDH 활성이 근육에 제한되지 않고, 예를 들어, 노화된 심장, 피부, 결장 및 비장과 같은 많은 노화된 조직의 특징임을 발견하였다. 노화에서 15-PGDH의 중대한 역할은 이러한 효소의 과발현이 젊은 마우스에서 근육 소모를 유발한다는 발견에 의해 강조된다. 노화된 마우스에서, 유전적 넉다운 또는 소분자에 의한 15-PGDH의 억제는 근육 위축에 대항하고, 근육 질량, 강도 및 지구력을 현저하게 증가시킨다. 질량분광법 및 표적화된 기능 상실 실험을 사용하여, 본 발명자는 근육 기능의 개선이 증가된 PGE2 수준으로 인한 것임을 제시한다. 본 발명자 및 다른 사람들은 이전에 젊은 마우스에서 손상된 조직을 재생하기 위해 줄기 세포를 자극하는 데 PGE2 신호전달의 중요성을 입증하였다(7-10). 여기서, 본 발명자는 PGE2가 또한 성숙한 근육 근섬유에 대해 작용하고, 근육 조직 항상성의 유지에 중요한 역할한다고 것을 입증한다. 중요하게는, 본 발명자의 데이터는 15-PGDH가 근감소증의 쇠약성 근육 위축 특징에 대항하기 위한 치료 표적을 구성한다는 것을 시사한다.
본 발명자가 아는 한, 증가된 15-PGDH 활성이 노화된 조직에서 PGE2 수준을 감소시킨다는 이전 보고는 없다. 본 발명자의 연구는 골격근에서 매우 유사한 프로스타글란딘 패밀리 구성원의 결정적인 분해능 및 정량화가 가능한 LC-MS/MS 방법의 이점을 얻었다. 따라서, 본 발명자는 노화된 근육에서 PGE2 감소의 크기를 발견하고, 이러한 감소에 15-PGDH를 연관시킬 수 있었다. 위축 표현형에서 이러한 효소의 중요성은 젊은 근육에서 상기 효소의 과발현이 1개월 이내에 근육 질량 및 강도의 현저한 손실을 초래한다는 발견에 의해 강조된다. 종합하면, 본 발명자의 데이터는 근육 질량 및 기능 감소에 있어서 15-PGDH의 인과적 역할을 강조한다. 본 발명자가 다수의 다른 노화된 조직에서 증가된 15-PGDH를 발견한다면, 이러한 발견은 연령-관련 병리에 대한 광범위한 의미를 가질 수 있다.
본 발명자의 데이터는 세포 간 신호전달 메커니즘이 노화된 근육에서 PGE2의 감소에 역할을 한다는 것을 시사한다. 노화된 근육에서 노화 세포의 세놀리틱 치료 또는 유전적 절제 후, 15-PGDH 수준이 감소되고 PGE2의 수반되는 증가가 관찰된다. 이들 결과는 PGE2 이화작용의 주요 부위로서 노화된 근육 환경에서 노화된 간질 세포를 연관시킨다. 노화된 근육 니치에 존재하는 노화 염증 세포 유형 중에서, 대식세포는 15-PGDH를 발현하고 PGE2를 분해하는 우세한 세포 유형인 것으로 보인다. 이들 세포는 "염증노화(inflammaging)"(43)로 지정된 근육 소포 표현형에 기여하기 위해 주변분비 메커니즘을 통해 간접적으로 작용하는 것으로 보인다. 이러한 유해한 미세환경은 세놀리틱 치료로 노화된 간질 세포를 제거하거나 노화된 근육에서 15-PGDH 발현을 억제함으로써 극복될 수 있으며, 이들 둘 모두는 근육 위축을 약화시키기에 충분한 내인성 PGE2 수준을 상승시킨다. 이러한 주변분비 메커니즘을 상세히 조사하기 위해 향후 연구가 필요하다. 본 발명자는 유사한 조직 상주 노화 간질 세포가 본 발명자가 다른 노화 조직에서 검출한 상승된 15-PGDH를 설명한다고 가정한다.
근육 단백질 항상성에서 PGE2의 역할의 이전 연구는 PGE2가 단백질 분해를 유도한다는 것을 시사했지만, 이들 연구는 신체에서 근육을 제거함으로써 침전된 급격한 근육 단백질 이화작용을 겪는 탈신경 절제된 근육에 대해 수행하였다(44, 45). 대조적으로, 여기에서 본 발명자는 15-PGDH의 억제가 PGE2 분해를 방해하고, 근육 위축을 개선하기에 충분한 생리학적 범위 내에서의 내인성 PGE2 수준의 조절로 이어지는 살아 있는 마우스에서의 증거를 제공한다. 본 발명자의 데이터는 COX 효소 수준의 교란이 근육 비대 및 근육 위축으로부터의 회복에서 프로스타글란딘에 대한 역할을 제시한 이전 연구와 잘 맞았다(22, 46, 47). 그러나, COX2는 길항 효과를 갖는 프로스타글란딘의 합성에 중요하기 때문에, 이는 이상적인 치료 표적이 아니다. 여기서, 본 발명자는 근육 기능을 증가시키고 근육 위축을 약화시키는 데 상승작용을 하는 TGF-베타, cAMP/CREB, AKT/FOXO 및 미토콘드리아 기능과 같은 다수의 신호전달 경로를 통한 PGE2 신호전달과 근육 위축 사이의 이전의 인지되지 않은 연관성을 제시한다.
근감소증은 만성 염증, 근육 탈신경, 결함이 있는 미토콘드리아 및 붕괴된 단백질항상성에서 절정에 달하는 조절장애 신호전달 경로의 제요인 다인성 질병이다(4, 48, 49). 특히, 미토콘드리아 기능이 손상된다(50). 근육 기능에 대한 15-PGDH 억제의 이로운 효과의 근간이 되는 메커니즘을 결정하기 위해, 본 발명자는 편향되지 않은 접근법을 취했다. 15-PGDH의 소분자 억제제로 1개월 처리 후 노화된 근육을 비히클 처리된 대조군과 비교한 전사체 분석은 미토콘드리아 기능이 가장 상향조절된 경로 중 하나임을 제시하였다. cAMP/CREB를 통한 EP4 수용체를 통한 PGE2 신호전달은 이전 보고(12, 22, 23)와 일치하게 미토콘드리아 수 및 기능의 관찰된 증가를 설명할 수 있었다. β-아드레날린 수용체(ß-AR) 효능제 또는 코르티코트로핀 방출 인자 수용체 2(CRFR2) 효능제와 같은 다른 cAMP 유도제에 대해 이전에 제시된 골격근에 대한 이로운 효과와 유사하게, cAMP의 PGE2 유도는 주요 미토콘드리아 조절제 Pgc1α 및 다른 산화성 유전자를 포함하는 미토콘드리아 생물발생을 촉진하는 cAMP 반응 요소(CREB 결합 모티프)로 하류 전사 조절제를 활성화시킴으로써 미토콘드리아 기능을 증가시킬 가능성이 있다(51-53). 이러한 신호전달 캐스케이드는 증가된 미토콘드리아 질량 및 근육 위축의 현저한 개선으로 절정에 이른다.
본 발명자의 전사체 분석은 또한 유비퀴틴-프로테아좀 경로 유전자를 포함하여 15-PGDH 억제의 1개월 후에 하향조절되는 주요 신호전달 경로를 제시하였다. 확증에서, 이러한 경로는 젊은 근육에 비한 노화된 근육의 본 발명자의 전사체 분석에서 풍부하였다. 일치하게, 다른 사람들은 노화된 래트(34, 35) 및 인간 근육(36)에서 E3 유비퀴틴 리가제 Atrogin-1 및 MuRF1의 상승된 수준을 보고하였다. 유비퀴틴 리가제 발현이 근감소증에서 인과적 역할을 하는지의 여부는 여전히 논란의 여지가 있다. Atrogin-1 및 MuRF1을 포함하는 특정 E3 유비퀴틴 리가제의 넉아웃 모델은 근육 기능에 해로운 영향을 미쳤지만(54, 55), 급성 탈신경 위축의 상황에서 이로운 효과를 나타내었다(27). 특히, 이들 유전적 모델은 노화 맥락에서 조사되지 않았다. 실제로, 노화된 근육에서 감소된 아트로젠 발현(Atrogin-1 및 MuRF1)을 초래한 라팔로그(rapalog), 세스트린(sestrin) 및 아펠린(Apelin)과 같은 개입(21, 56, 57)은 근육 질량 및 기능을 개선하고 근감소증을 개선시켰다. 일치하게, 본 발명자는 노화된 근육에서 15-PGDH 억제시 다수의 E3-유비퀴틴 리가제의 발현 감소를 관찰하였다. 종합하면, 이들 데이터는 아트로젠 발현의 조절이 노화된 근육 기능에 이롭다는 것을 시사한다. 아트로젠 외에도, 본 발명자는 E3 유비퀴틴 리가제(MuRF1 및 Atrogin-1), MyHC 및 Pgc1a 수준을 조절함으로써 위축을 촉진하는 Hdac4(37, 38, 48) 및 이전에 근육 위축과 관련된 어댑터 단백질이고 비전통적 E3 유비퀴틴 리가제인 Traf6(33)의 하향조절을 관찰하였다. 아트로젠 발현의 조절에 더하여, 자가포식의 향상은 AKT/FOXO 신호전달의 하류에서의 노화 표현형의 역전과 관련이 있었으며(21, 30), 이는 본 발명의 전사체 분석에서 명백하지 않았다. 여기서, 본 발명자는 노화된 마우스에서 15-PGDH의 부분적 억제가 이들 위축 마커의 수를 감소시켜 근육 질량 및 기능을 개선시킴을 제시한다.
본 발명자는 또한 SW 처리된 노화된 근육의 전사체에서 제2 경로인 TGF-베타 신호전달 경로의 현저한 하향조절을 관찰하였다. 이러한 패밀리의 중요한 구성원인 미오스타틴은 근육 성장에 대한 현저한 억제 효과를 나타내며, 넉아웃 동물에서의 이의 상실은 극적인 비대와 관련이 있다(58). 미오스타틴은 액티빈 수용체 및 하류 Smad 전사 인자를 통해 신호를 보내 AKT 경로 및 단백질 합성을 차단하는 한편, 근육 단백질의 분해를 조율하는 유비퀴틴 리가제의 발현을 촉발시킨다(59). 미오스타틴, 전환 성장 인자 베타-2(TGFβ-2) 및 액티빈 수용체 타입-2A를 포함하는 TGF-베타 경로의 몇몇 유전자는 SW-처리된 노화된 근육의 전상체에서 현저하게 감소되었다.
종합하면, 여기서 본 발명자는 노화 및 근감소증과 관련된 근육 소모를 개선시키는 것을 목표로 하는 전략에 대한 이전에 인식되지 않은 마커 및 치료 표적으로서 15-PGDH를 발견한다. 본 발명자의 개입은 노화된 마우스에서의 PGE2의 항상성 수준의 젊은 마우스에서 발견되는 것으로의 생리학적 복원을 수반하기 때문에 유리하다. 결과로서 발생하는 PGE2 수준의 보통의 증가는 TGF-베타 및 유비퀴틴 프로테오좀 경로를 억제하면서 여러 신호전달 경로를 미토콘드리아 생물발생 및 기능을 촉진하도록 조절하여 근육 기능을 증가시킨다. 15-PGDH 활성은 다양한 조직에서 상승되기 때문에, 본 발명자는 이의 부분적 억제가 노화 동안 골격근을 넘어서 확장되는 유리한 효과를 가질 수 있다고 가정한다.
참고문헌
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
재료 및 방법.
마우스
본 발명자는 스탠포드 대학의 기관 지침 및 실험 동물 관리에 대한 행정 패널(APLAC)에 따라 모든 실험 및 프로토콜을 수행하였다. 중년(18-20개월) 및 노화(>24개월) 마우스 C57BL/6을 노화된 근육 연구를 위해 미국 국립노화연구소(NIA)에서 획득하였고, 젊은(2-4개월) 야생형 C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratory로부터 획득하였다. INK-ATTAC 마우스를 이전에 기재(1)된 바와 같이 생성하였다. INK-ATTAC 건강기간 평가. INK-ATTAC 마우스를 C57BL6/J 유전적 배경에 대해 교배시키고, 연구 기간 동안 12시간 명/암 주기로 특정 병원체가 없는 하우징에 유지시켰다. 12개월령에, 수컷 마우스를 기준선 건강기간 평가 및 말기 근육 수확에 이용하거나, 28개월령에서의 평가 및 희생 때까지 매주 2회 비히클 또는 AP20187(2 mg/kg 복강 내 주사; B/B 동종이량체화체, Clontech)을 투여받도록 무작위화하였다(2). 이전에 기재(3)된 바와 같이 5mg/kg의 SW033291(SW)(Cayman Chemicals) 또는 비히클(10% 에탄올, 5% Cremophor EL, 85% D5W(덱스트로스 5% 물))을 복강 내 주사에 의해 1개월 동안 1일 1회 처리하였다. 탈진까지의 시간 및 거리는 SW-처리된 마우스 및 이들의 대조군에 대해 이전에 기재(4)된 바와 같이 수행하였다.
ABT-263 처리를 위해, 20개월령 C57/Bl6 마우스를 이전에 기재(5)된 바와 같이 주기 사이에 2주의 휴식 기간과 함께 2주기의 1주 동안 경구 위관영양에 의해 비히클(에탄올:폴리에틸렌 글리콜 400:Phosal 50 PG) 또는 50 mg/kg/일의 ABT-263(에탄올:폴리에틸렌 글리콜 400:Phosal 50 PG 중)으로 처리하였다. PGE2의 근육 내 주사는 TA 근육으로의 13 nmol PGE2(Cayman Chemicals) 또는 비히클 대조군(PBS)을 사용하여 젊은 마우스에서 수행하였다. 마우스 트랜스제닉 계통을 The Jackson Laboratory (EP4flox/flox; EP4f/f) No. 028102에서 구입하였다(6). 본 발명자는 적절한 PCR-기반 전략에 의해 이들 유전자형을 검증하였다. 연구를 수컷 마우스로 수행하였다.
FACs를 사용한 일차 세포 분리
본 발명자는 이전에 기재(6-9)된 바와 같이 근원성 세포를 분리하고 풍부화시켰다. 간단히 말해서, 뒤다리 근육을 다지고, MACs Dissociator(Miltenyi)에 의해 콜라게나제 및 디스파제 용액을 사용하여 소화시켰다. FACs를 사용하여, 근원성 줄기 및 전구 세포의 경우, 본 발명자는 조혈 계통 및 비-근육 세포(CD45-/CD11b-/CD31-/Sca1-)에 대해 음성인 세포를 분리하였고, α7-인테그린+ 세포 마커에 대해 분류하였다. 대식세포 분리를 위해, 본 발명자는 a7-/Cd11b+/Cd11c-/F4/80+ 집단을 분류하였다. 내피 세포의 경우, 본 발명자는 a7-/Cd11b-/Cd11c-/CD31+를 분류하였다. 본 발명자는 FlowJo v10.0을 이용하여 흐름세포 측정법 산점도를 생성시키고 분석하였다.
shRNA 및 MCK-Cre의 근육 내 AAV9 전달
Hpgd(15-PGDH)(NM_008278)에 대한 shRNA를 U6 프로모터 의존성 하에서 eGFP와 함께 AAV9에 통합(AAV9-eGFP-U6-sh15PGDH)(Vector Biolabs)시켰다. 대조군 마우스는 sh15PGDH(AAV9-eGFP-U6-shscr) 대신 스크램블 펩티드 서열을 함유하는 유사한 구조로 처리하였다. Cre는 근육 특이적 tMCK 프로모터 하에 eGFP와 함께 AAV9에 통합(AAV9-tMCK-eGFP-WPRE)(Vector Biolabs)시켰다. Hpgd(15-PGDH)의 과발현은 CMV 프로모터 하에 AAV9 및 IRES 하에 eGFP를 통합(AA9-CMV-m-HPGD-IRES-eGFP)(Vector Biolabs)시킴으로써 달성되었다. 대조군 바이러스는 AAV9-tMCK-eGFP-WPRE였다. Ptdgs의 넉다운은 U6 프로모터 의존성 하에 통합된 AAV9(AAV9-GFP-U6-m-PTGDS-shRNA)을 사용하여 달성되었고, 대조군 마우스에 2x1011 GC/GA의 최종 농도의 스크램블(AAV9-GFP-U6-scrmb-shRNA)(Vector Biolabs)이 주사되었다. 3-4개월 또는 >24개월령 C57Bl/6 마우스를 2x1011 입자/GA의 최종 농도로의 PBS 중 상기 기재된 AAV9 입자의 20 μl 희석액을 이용한 비복근(GA)으로의 2회의 근육 내 주사 및/또는 2x1011 GC/TA의 최종 농도로의 전경골근(TA)으로의 1회의 근육 내 주사에 적용시켰다.
면역형광 염색 및 영상화
본 발명자는 이전에 기재(6)된 바와 같이 조직학을 위해 수용자 전경골근(TA) 또는 비복근(GA) 조직을 수집하고 준비하였다. 본 발명자는 4% PFA를 사용하여 근육으로부터 횡단면을 고정하거나 근섬유를 분리하고, PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100을 사용하여 차단하고 투과화시키고, 비오틴-항-CD11b(BD Biosciences, 카탈로그 # 553309, 1:100), 항-15-PGDH(Novus Biologicals, 카탈로그 # NB200-179SS, 1:100), 항-LAMININ(Millipore, 클론 A5, 카탈로그 # 05-206, 1:200) 및 이후 AlexaFluor 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, 1:200), 스트렙타비딘-Cy3(Biolegend, 1:500) 또는 밀 배아 응집소-Alexa 647 컨쥬게이트(WGA, Thermo Fisher Scientific)와 함께 인큐베이션하였다. 본 발명자는 DAPI(Invitrogen)로 핵을 대조염색하였다.
동결된 10 uM 절단 섹션의 면역조직화학에 의해 섬유 형결정을 수행하고, 유리 슬라이드에 장착하였다. 공기 건조된 섹션을 실온에서 1시간 동안 PBS/1% 염소 혈청에서 즉시 차단하고, 4℃에서 밤새 PBS/1% 염소 혈청에 희석된 MHC2a(DSHB로부터의 SC71, 1:1000), MHC2b(DSHB로부터의 BF-F3, 1:100)에 대한 항체(10, 11) 및 라미닌(Millipore, 클론 A5, 카탈로그 # 05-206, 1:200)를 사용하여 면역조직염색하였다. PBS/1%BSA에 희석된 IgG1Alexa488, IgM Alexa 405 및 IgG2b Alexa647에 대한 이차 항체(Jackson ImmunoReserch Laboratories, 1:500)를 실온에서 1시간 동안 적용한 후, 핵을 DAPI(Invitrogen)로 대조염색하였다. 20x/0.75 N.A. 대물렌즈를 갖는 KEYENCE BZ-X700 올 인 원 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득하고, 개별 필드를 스티칭하고, Keyence Advanced Analysis Software를 사용하여 분석하였다.
배양된 근관의 경우, 본 발명자는 4% PFA를 사용한 고정, PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100을 사용한 차단 및 투과화 및 1차 항체 항-MYH(Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 # 14-6503-82, 클론 MF-20, 1:500) 및 이후 AlexaFluor 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, 1:500)를 이용한 염색을 수행하였다. 본 발명자는 DAPI(Invitrogen)로 핵을 대조염색하였다. 본 발명자는 20Х/0.75 N.A. 대물렌즈를 갖는 KEYENCE BZ- X700 올-인-원 형광 현미경(Keyence)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 본 발명자는 Keyence Advanced Analysis Software를 사용하여 섬유 영역을 분석하였다. 섬유 영역의 경우, 근육의 전체 최대 단면적을 정량화하거나, 상기와 같이 각각의 마우스에 대해 400개 초과의 근섬유를 포함하는 적어도 10개 필드의 LAMININ 또는 WGA 염색된 근섬유 단면을 포착하였다. 섬유 형결정 분석을 위해, 이전에 기재(12)된 바와 같이 MATLAB 어플리케이션 SMASH - Semi-Automatic Muscle Analysis Using Segmentation of Histology이 사용되었다. 데이터 분석은 맹검이었다. 영상 획득 및 스코어링을 수행하는 연구자들은 분석되는 샘플 그룹에 제공된 처리 조건을 인지하지 못했다.
세포 배양
DMEM/F10(50:50), 15% FBS, 2.5 ng ml-1 섬유모세포 성장 인자-2 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 근원성 세포 배양 배지에서 일차 뮤린 근모세포를 성장시켰다. 이전에 기재(13)된 바와 같이 2명의 59세 여성으로부터의 가슴 근육으로부터의 일차 인간 전구세포를 SkGM-2 Skeletal Muscle Growth Medium(Lonza, CC-3245)를 사용하여 성장시켰다. 분화 실험을 위해, 컨플루언트(confluent) 근모세포를 5% 말 혈청, DMEM을 함유하는 배지에서 성장시켰다. 본 발명자는 4일차 분화된 뮤린 근관 또는 7일차 분화된 인간 근관에 10 ng/ml 프로스타글란딘 E2(Cayman Chemicals), 1 μM의 SW033291(ApexBio) 또는 1μM의 ONO-AE3-208(Cayman Chemicals)을 첨가하였다.
시험관 내 SUnSET에 의한 단백질 합성.
SUnSET 검정은 이전에 기재(4)된 바와 같이 단백질 합성 속도를 모니터링하기 위해 사용하였다. 간단히 말해서, 세포를 수확하기 10분 전에, 퓨로마이신을 1 μg/ml로 배양 배지에 첨가하였다. 대조군으로서, 단백질 번역을 차단하는 사이클로헥시미드를 첨가하였다. 이후, 세포 추출물을 항-퓨로마이신 12D10 항체(Millipore)를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 위해 처리하였다.
정량적 RT-PCR
본 발명자는 RNeasy Kit(Qiagen)를 사용하여 MuSC, 근모세포 및 근관으로부터 RNA를 분리하였다. 근육 샘플을 액체 질소에서 급속 동결시킨 후, RNA를 분리하기 전에 FastPrep FP120 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 Trizol(Invitrogen)에서 균질화시켰다. 본 발명자는 SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit(Bioline)를 사용하여 각각의 샘플로부터의 전체 mRNA로부터 cDNA를 역전사하였다. 본 발명자는 ABI 7900HT Real-Time PCR System(Applied Biosystems)에서 SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems) 또는 TaqMan Assays(Applied Biosystems)을 사용하여 cDNA를 RT-PCR에 적용하였다. 본 발명자는 10분 동안 95℃에서 샘플을 순환시킨 후, 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃에서 40회 순환시켰다. 상대 전사체 수준을 정량하기 위해, 본 발명자는 처리된 샘플 및 처리되지 않은 샘플을 비교하기 위해 2-ΔΔCt를 사용하였고, Gapdh에 비한 결과로 표현하였다.
SYBR Green qRT-PCR의 경우, 본 발명자는 다음 프라이머 서열을 사용하였다:
Gapdh, 정방향 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3',
역방향 5'-CCCTTTTGGCTCCACCCT-3';
Hpgd, 정방향 5'- TCCAGTGTGATGTGGCTGAC -3',
역방향 5'-ATTGTTCACGCCTGCATTGT-3';
Ptger1, 정방향 5' GTGGTGTCGTGCATCTGCT-3',
역방향 5'-CCGCTGCAGGGAGTTAGAGT-3';
Ptger2, 정방향 5'-ACCTTCGCCATATGCTCCTT-3',
역방향 5'-GGACCGGTGGCCTAAGTATG-3';
Fbxo32 (Atrogin1), 정방향 5'-TAGTAAGGCTGTTGGAGCTGATAG-3',
역방향 5'- CTGCACCAGTGTGCATAAGG-3';
Trim63 정방향 5'-CATCTTCCAGGCTGCGAATC-3',
역방향 5'- ACTGGAGCACTCCTGCTTGT-3';
Atg4, 정방향 5'-ATGGAGTCAGTTATGTCCAA-3',
역방향 5'-CAATCGGGGAAAACTTCCTT-3';
Atg6 정방향 5'- GGAACTCACAGCTCCATTACTTA-3',
역방향 5'- CATCCTGGCGAGTTTCAATAA-3';
Pgc1α, 정방향 5'- AGACAAATGTGCTTCGAAAAAGAA-3',
역방향 5'- GAAGAGATAAAGTTGTTGGTTTGGC-3';
Ptgdr1 정방향 5'- CCCAGTCAGGCTCAGACTACA-3',
역방향 5'-AAGTTTAAAGGCTCCATAGTACGC-3';
Ptgdr2 정방향 5'-AGCACACCCGATCAGTCAC-3',
역방향 -5'-GTCACCCAGGAACCAGAAGA-3';
Ptgfr 정방향 5'- TCATGAAGGCCTACCAGAGATT-3',
역방향 5'- CTGTGATCACCAGGCCACTA-3'
Musa1 정방향 5'- CTTCAGTCTCGTGGAATGGTAATCTT-3',
역방향 5'- TGCAGTACTGAATCGCCATAC-3'
Smart 정방향 5'- TTTTTGAGGATGAGCTGGTGTGT-3',
역방향 5'- AGGAACGCCTTGAGGTTATTGAG-3'
Traf6 정방향 5'- TGCAAAAGATGGAACTGAGACATC-3',
역방향 5'- TGGGACAATCCTCAATAATGTGTG-3'
Atf7 정방향 5'- TCTGGGAAGCCATAAAGTCAGG-3',
역방향 5'- GCGAAGGTCAGGAGCAGAA-3'
Bnip3 정방향 5'- TGACAGCCCACCTCGC-3',
역방향 5'- TCGACTTGACCAATCCCATA-3'
Ulk2 정방향 5'- GCACCGCCAGAAAACTGAT-3',
역방향 5'- GTTGGGCAATTCCTGAACAT-3'
뮤린 노화 마커 및 노화 관련 마커의 경우, 본 발명자는 이전에 기재(2)된 프라이머를 사용하였다. TaqMan Universal PCR Master Mix 시약 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 샘플에서 p21, Mstn, Ptger3 및 Ptger4를 정량하기 위해 TaqMan Assays(Applied Biosystems)를 이용하였다. 전사체 수준을 Gapdh 수준에 비해 표현하였다. SYBR Green qPCR의 경우, 투입 cDNA 샘플을 표준화하기 위해 Gapdh qPCR을 이용하였다. Taqman qPCR의 경우, 다중 qPCR은 표적 신호(FAM)가 이들의 내부 Gapdh 신호(VIC)에 의해 개별적으로 표준화되는 것을 가능하게 한다. 미토콘드리아 카피 수는 이전에 기재(14)된 방법 및 프라이머를 사용하여 정량화하였다.
마이크로어레이 데이터
마이크로어레이 유전자 발현 프로파일은 공개적으로 이용 가능한 저장소 Gene Expression Omnibus (ncbi.nlm.nih.gov/geo/)로부터 수집하였다. 본 발명자는 Hpgd 발현에 대해 GSE25941(15)로부터의 마이크로어레이 데이터를 분석하였다.
RNA-Seq
RNA-seq의 경우, Trizol 시약(Thermoscientific)을 사용하여 근육 용해질로부터 RNA를 분리하고, Qiagen RNAEasy 키트를 사용하여 정제하였다. 라이브러리를 TruSEQ RNA Library Preparation Kit v2(Illumina)를 사용하여 RNA로부터 작제하고, Stanford Functional Genomics Facility로부터의 NextSeq 550에서 샘플 당 30-40Х106 Х 75-bp 판독으로 시퀀싱하였다.
RNA-Seq 분석
RNA-Seq 분석을 위해, 서열을 STAR(16)를 사용하여 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 유전체(mm9)에 대해 정렬시켰다. RSEM은 전사체를 호출하고, 백만 당 전사체(TPM) 값뿐만 아니라 총 카운트를 계산하는 데 사용하였다(17). 각각의 유전자 및 각각의 샘플에 대한 카운트 수를 포함하는 카운트 매트릭스를 획득하였다. 이러한 매트릭스는 샘플 사이의 유전자의 유의성의 통계적 분석을 계산하기 위해 DESeq2에 의해 분석하였다(18). <0.05의 p-값 컷오프를 갖는 상향조절되거나 하향조절된 유전자를 DAVID를 사용하여 경로 분석에 사용하였다(19). 히트맵을 표준화된 카운트로 생성하고, python의 Seaborn 데이터 시각화 라이브러리를 사용하여 행에 걸쳐 Z-스코어에 대해 플로팅하였다. 이러한 논문에 보고된 데이터는 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스 GSE149924에 기탁되었다.
단백질 추출 및 면역블롯
전체 용해질을 용해 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 4 mM CaCl, 1.5% Triton X-100, 프로테아제 억제제 및 미세구균 뉴클레아제)을 사용하여 제조하였다. 조직 추출물의 경우, 용해질을 6 m/s의 속도로 40초 동안 FastPrep 24 균질화기(MP Biomedicals)로 균질화시켰다. 본 발명자는 다음 항체를 사용하였다: 15-PGDH(Santa Cruz Biotechnology, cat # sc- 271418); 포스포-AKT(Ser 473)(Cell Signaling cat # 4060), AKT(Cell signaling cat # 2920); 포스포-FoxO1(Thr24)/FoxO3a(Thr32) 항체(Cell Signaling cat # 9464T); Foxo3a(Cell Signaling cat # 2497); 포스포-CREB(Ser133)(Cell Signaling cat #9198S); 포스포-S6 리보솜 단백질(Ser235/236)(Cell Signaling cat# 4858); SMC1(Bethyl Laboratories cat# A300-055A-T). 본 발명자는 HRP 컨쥬게이션된 이차 항체를 사용하였고, ECL Western Blotting Substrate(Nacalai USA)와 함께 막을 인큐베이션하고, ChemiDoc Imaging System(BioRad)을 사용하여 영상화시킴으로써 현상시켰다.
15-PGDH 운동 검정
15-PGDH 활성을 제조업체의 프로토콜에 따라 BioVision PicoProbe 15-PGDH Activity Assay Kit(Cat # K562)를 사용하여 조직 용해질에서 분석하였다.
LC-MS/MS에 의한 마우스 조직에서의 PGE2 및 관련 프로스타글란딘의 결정
분석물 표준
모든 프로스타글란딘 표준 PGF2α; PGE2; PGD2; 15-케토 PGE2; 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2; PGD2-D4; PGA2; 13,14-디하이드로 15-케토 PGA2; PGE2-D4; 및 PGF2α-D9를 Cayman Chemical로부터 구입하였다. PGE2-D4 및 PGD2-D4 내부 표준의 경우, 위치 3 및 4를 총 4개의 중수소 원자로 표지하였다. PGF2α-D9의 경우, 위치 17, 18, 19 및 20을 전체 9개의 중수소 원자로 표지하였다.
보정 곡선 제조
분석물 스톡 용액(5 mg/mL)을 DMSO에서 제조하였다. 이들 스톡 용액을 아세토니트릴/물(1:1 v/v)로 연속 희석하여 일련의 표준 작업 용액을 획득하고, 이를 이용하여 보정 곡선을 생성시켰다. 10 uL의 각각의 표준 작용 용액을 200 μL의 균질화 완충액(아세톤/물 1:1 v/v; 산화를 방지하기 위한 0.005% BHT)으로 스파이킹한 후, 10 uL의 내부 표준 용액(3000 ng/mL의 각각의 PGF2α-D9; PGD2-D4 및 PGE2-D4)를 첨가하여 보정 곡선을 제조하였다. 보정 곡선을 각각의 세트의 샘플로 새로이 제조하였다. 보정 곡선 범위: PGA2; PGD2 및 13,14-디하이드로 15-케토 PGE2의 경우, 0.05 ng/mL 내지 500 ng/mL; PGE2; 13,14-디하이드로 15-케토 PGA2 및 PGF2α의 경우, 0.1 ng/mL 내지 500 ng/mL; 및 15-케토 PGE2의 경우, 0.25 ng/mL 내지 500 ng/mL.
샘플 제조 절차
추출 절차를 문헌[Prasain et al](20)의 추출 절차로부터 변형시켰고, 이는 아세톤 단백질 침전 후 2-단계 액체-액체 추출을 포함하였고; 후자의 단계는 LC-MS/MS 민감성을 향상시킨다. 질소(N2) 가스 하에서의 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT) 및 증발을 산화를 방지하기 위해 이용하였다. 고체 조직을 수거하고, 칭량하고, 액체 질소로 급속 동결시켰다. 근육 조직을 폴리프로필렌 튜브에서 균질화 비드 및 200 μL의 균질화 완충액과 조합하고, 6 m/s의 속도에서 40초 동안 FastPrep 24 균질화기(MP Biomedicals)에서 가공하였다. 균질화 후, 10 μL 내부 표준 용액(3000 ng/mL)을 조직 균질물에 첨가한 후, 2분 동안 진탕시켰다(Multi-Tube Vortexer, Thermo Scientific). 샘플을 원심분리하고, 상층액을 깨끗한 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 200 μL 헥산을 샘플에 첨가한 후, 15분 동안 진탕시킨 후(Vortex Mixer, Thermo Scientific), 원심분리하였다. 샘플을 40분 동안 -80℃에서 동결시켰다. 헥산 층을 동결된 하부 수성층으로부터 부어서 폐기하였다. 해동 후, 25 μL의 1N 포름산을 하부 수성층에 첨가하고, 샘플을 볼텍싱하였다. 두번째 추출을 위해, 200 μL의 클로로포름을 수성상에 첨가하였다. 샘플을 15분 동안 진탕하여 완전한 추출을 보장하였다. 원심분리를 수행하여 층을 분리시켰다. 하부 클로로포름 층을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기고, 40℃에서 질소하에서 증발 건조시켰다. 건조 잔여물을 100 μL 아세토니트릴/10 mM 암모늄 아세테이트(2:8 v/v)에서 재구성하고, LC-MS/MS로 분석하였다.
LC-MS/MS
많은 프로스타글란딘은 동일한 질량을 갖는 위치 이성질체이고, 유사한 단편화 패턴을 가지므로, 크로마토그래피 분리가 중요하다. 적어도 2개의 SRM 전이(1개의 정량자 및 1개의 정성자)를 각각의 분석물에 대해 조심스럽게 선택하였다. 특이한 정성자 대 정량자 이온 강도 비율 및 체류 시간이 표적 분석물을 입증하는데 필수적이었다. 모든 분석물을 LC-20ADXR 돌출(prominence) 액체 크로마토그래프 및 8030 삼중 사중극 질량분광기(Shimadzu)를 이용하여 음성 전기분무 LC-MS/MS로 수행하였다. HPLC 조건: Acquity UPLC BEH C18 2.1x100 mm, 1.7 um 입자 크기 컬럼을 0.25 mL/min의 유량으로 50℃에서 수행하였다. 이동상은 A: 물 중 0.1% 아세트산 및 B: 아세토니트릴 중 0.1% 아세트산으로 구성되었다. 용리 프로파일: 5분 동안 35% B에서 최초 유지 후, 3분 동안 35%-40%의 구배 후, 3분 동안 40%-95%; 전체 수행 시간은 14분이었다. 주입 부피는 20 uL였다. 이들 HPLC 조건을 이용하여, 본 발명자는 관심 분석물의 기준선 분리를 달성하였다. 선택된 반응 모니터링(SRM)을 정량화에 사용하였다. 질량 전이는 다음과 같았다: PGD2: m/z 351.10 → m/z 271.3 (정량자); m/z 351.10 → m/z 233.05 (정성자) 및 m/z 351.10 → m/z 189.15 (정성자); PGE2: m/z 351.20 → m/z 271.10 (정량자); m/z 351.20 → m/z 333.15 (정성자) 및 m/z 351.20 → m/z 315.20 (정성자); PGF2α: m/z 353.10 → m/z 3193.3 (정량자) 및 m/z 353.10 → m/z 309.20 (정성자); 15 케토-PGE2: m/z 349.30 → m/z 331.20 (정량자) 및 m/z 349.30 → m/z 113.00 (정성자); 13, 14-디하이드로 15-케토 PGE2: m/z 351.20 → m/z 333.30 (정량자) 및 m/z 351.20 → m/z 113.05 (정성자); PGE2-D4: m/z 355.40 → m/z 275.20 (정량자); PGF2α-D9: m/z 362.20 → m/z 318.30; PGD2-D4: m/z 355.10 → m/z 275.40; PGA2: m/z 332.90 → m/z 271.25 (정량자) 및 m/z 332.90 → m/z 189.10 (정성자); 및 13,14-디하이드로 15-케토 PGA2: m/z 332.90 → m/z 235.15 (정량자) m/z 332.90 → m/z 113.00 (정성자). 드웰 시간은 20-30 ms였다.
LabSolutions LCMS(Shimadzu)를 이용하여 정량 데이터 분석을 수행하였다. 정량화를 위해 내부 표준 방법을 사용하였다: PGE2-D4를 PGE2, 15-케토 PGE2, 및 13, 14-디하이드로 15-케토 PGE2, PGA2; 13,14-디하이드로 15-케토 PGA2의 정량을 위한 내부 표준으로 사용하였다. PGF2α-D9는 PGF2α의 정량화를 위한 내부 표준이었고; PD2-D4는 PGD2의 정량화를 위한 내부 표준이었다. 보정 곡선은 X가 농도인 1/X2의 가중치 인자를 이용하여 농도 범위에 걸쳐 선형(R>0.99)이었다. 역 계산된 표준 농도는 공칭 값에서 ±15%였고, 정량 하한(LLOQ)에서 ±20%였다.
생체 내 근력 측정
발목 족저굴곡근의 피크 등척성 토크(N·mm)를 이전에 기재(21, 22)된 바와 같이 평가하였다. 간단히, 마취된 마우스의 발을 서보모터(servomotor)(모델 300C-LR; Aurora Scientific)에 부착된 발판에 놓았다. 2개의 Pt-Ir 전극 바늘(Aurora Scientific)을 경피적으로 삽입하고, 경골 신경 위에 무릎의 후방/후방-내측에 바로 피하 삽입하였다. 발목 관절을 90° 각도로 고정하였다. 피크 등척성 토크는 200 Hz 주파수 및 0.1- ms 구형파 펄스에서 경골 신경에 전달되는 전류를 변화시킴으로써 달성되었다. 본 발명자는 각각의 측정 사이에 1분의 회복으로 각각의 근육에 대해 3회의 강직성 측정을 수행하였다. 데이터를 Aurora Scientific Dynamic Muscle Data Acquisition 및 Analysis Software를 사용하여 수집하였다.
통계 분석
비모수 만-휘트니 검정(non-parametric Mann-Whitney test)을 사용하여 α=0.05를 사용하여 처리되지 않은 그룹과 처리된 그룹 사이의 유의성 차이를 결정하였다. ANOVA 또는 다중 t-검정을 본페로니 보정(Bonferroni correction)을 이용하여 결정된 유의성 수준 또는 도면 범례에 표시된 바와 같은 피셔 검정을 이용하여 다중 비교를 위해 수행하였다. 달리 기재하지 않는 한, 데이터는 평균 ± s.e.m으로 제시된다.
참고문헌
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
실시예 3. 연령-관련 질병 및 질환에서 비-골격근 조직 기능을 개선시키기 위한 프로스타글란딘 E2 분해 효소 표적화
나이가 들어감에 따라, 삶의 질은 감소되고, 사망률은 증가한다. 연령-관련 질병은 사람들이 노화함에 따라 더 빈번히 발생하는 질병 그룹으로, 이는 수명 감소와 직접적인 관련이 있다(1). 이들 연령-관련 질병은 심혈관 질병(심방 세동, 뇌졸중, 허혈성 심장 질병, 심근병증, 심내막염, 뇌내 출혈), 만성 호흡기 질병(만성 폐쇄폐병, 석면증, 규폐증), 영양 질병(트라코마, 설사 질병, 뇌염), 신장 질병(만성 신장 질병), 위장 및 소화 질병(NASH, 췌장염, 궤양, 장폐색), 신경 장애(알츠하이머병, 치매, 파킨슨병), 감각 장애(청력 상실, 황반 변성, 녹내장), 피부 및 피하 질병(연조직염, 궤양, 진균성 피부 질병, 고름피부증), 골다공증, 골관절염, 류마티스 관절염 등을 포함한다(2).
본 발명자는 이전에 뼈, 결장, 간 및 혈액을 포함하는 다른 조직의 재생에서의 PGE2의 기능에 관한 결과와 잘 일치하게(4-6) PGE2가 젊은 마우스에서 손상된 근육을 재생하도록 근육 줄기 세포(MuSC)를 자극하는 것을 결정하였다(3). 본 발명자는 PGE2 신호전달이 노화에서 잘못될 수 있다고 추론하였다. 여기서, 본 발명자는 노화된 조직에서 PGE2 분해 효소인 15-하이드록시프로스타글란딘 데하이드로게나제(15-PGDH)에 대한 이전의 인식되지 않은 역할을 입증한다. 15-PGDH의 부분적 억제는 PGE2 및/또는 PGD2를 젊은 수준으로 회복시키고, 이에 따라 조직 기능을 젊어지게 할 수 있다. 본 발명의 결과는 노화에 대한 신선한 통찰력을 제공하고, 혁신적인 치료 전략을 밝혀낸다.
본 발명자는 PGE2의 감소가 노화된 조직에서 15-PGDH에 의한 증가된 분해로 인한 것으로 가정하였다(도 27a). 본 발명자는 효소의 특정 활성이 심장, 피부, 비장 및 결장을 포함하는 노화된 조직에서 실제로 증가된 것을 발견하였다(도 27b 및 28). 따라서, 15-PGDH의 억제는 노화된 조직에서 PGE2 및/또는 PGD2 수준을 회복시키거나 증가시킴으로써 노화-관련 질병 및 질환을 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
본 발명자는 심장, 피부, 결장 및 비장과 같은 다수의 조직에서 상승된 활성으로 검출 가능한 새로운 노화 마커로서 15-PGDH를 밝혀낸다. 따라서, 15-PGDH가 노화와 함께 다양한 조직에서 상향조절되기 때문에 PGE2 및/또는 PGD2를 젊은 수준으로 회복시키는 것은 다양성발현의 개선 효과를 제공할 수 있다.
참고문헌
Figure pct00012
재료 및 방법
마우스
스탠포드 대학의 기관 지침 및 실험 동물 관리에 대한 행정 패널(APLAC)에 따라 모든 실험 및 프로토콜을 수행하였다. 노화(>24개월) 마우스 C57BL/6을 노화된 근육 연구를 위해 미국 국립노화연구소(NIA)에서 획득하였고, 젊은(2-4개월) 야생형 C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratory로부터 획득하였다.
15-PGDH 운동 검정
15-PGDH 활성을 제조업체의 프로토콜에 따라 BioVision PicoProbe 15-PGDH Activity Assay Kit(Cat # K562)를 사용하여 조직 용해질에서 분석하였다. 간단히 말해서, 조직을 분리하고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 전체 용해질을 용해 완충액(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 4 mM CaCl, 1.5% Triton X-100, 프로테아제 억제제 및 미세구균 뉴클레아제)을 사용하여 제조하고, 6 m/s의 속도로 40초 동안 FastPrep 24 균질화기(MP Biomedicals)를 사용하여 균질화시켰다.
전술한 개시는 이해의 명료함을 위해 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 기재되었으나, 당업자는 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정한 변화 및 변형이 실시될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 본원에 제공된 각각의 참고문헌은 각각의 참고문헌이 참조로서 개별적으로 포함되는 것과 동일한 정도로 전체내용이 참조로서 포함된다.

Claims (90)

  1. 대상체에서 노화된 골격근의 기능을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법이 노화된 골격근의 하나 이상의 노화 세포에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근에 투여하여 노화된 골격근의 기능을 향상시키는 것을 포함하는, 방법.
  2. 대상체에서 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 노화된 골격근의 하나 이상의 노화 세포에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근에 투여하여 노화된 골격근의 근육 질량, 근육 강도 및/또는 근육 지구력을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  3. 대상체에서 노화된 골격근에서 PGE2의 수준을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 노화된 골격근에서 PGE2 수준을 증가시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 노화된 골격근에 투여하여 노화된 골격근에서 PGE2의 수준을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는 방법.
  5. 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는 대상체에서 노화된 골격근을 젊어지게 하는 방법으로서, 상기 방법이 대상체에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는 대상체에 투여하여 노화된 골격근을 젊어지게 하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 하나 이상의 노화 바이오마커가 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 15-PGDH 수준의 증가, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 PGE2 수준의 감소, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 PGE2 대사물의 증가, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 노화 세포의 증가 또는 더 큰 축적, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 하나 이상의 아트로젠(atrogene)의 발현 증가, 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 미토콘드리아 생물발생 및/또는 기능의 감소, 및 젊은 골격근에 존재하는 수준에 비한 전환 성장 인자 경로 신호전달의 증가로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 하나 이상의 아트로젠이 Atrogin1(MAFbx1), MuSA(Fbxo30) 및 Trim63(MuRF1)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 전환 성장 인자 경로 신호전달의 증가가 액티빈 수용체, 미오스타틴, SMAD 단백질 및 골 형태형성 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현의 증가를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 골격근이 젊은 골격근에 비해 노화 세포의 증가된 축적을 갖는 방법.
  10. 제1항, 제2항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 노화 세포가 하나 이상의 노화 마커를 발현하는 방법.
  11. 제1항, 제2항, 제9항 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 노화 세포가 비-노화 세포에 비해 증가된 수준의 하나 이상의 노화 마커를 갖는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 하나 이상의 노화 마커가 p15Ink4b, p16Ink4a, p19Arf, p21, Mmp13, Il1a, Il1b 및 Il6로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제1항, 제2항 또는 제19항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 노화 세포가 대식세포인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 골격근이 손상되지 않고/않거나 운동을 겪지 않고/않거나 재생을 겪지 않는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세놀리틱 제제(senolytic agent)를 노화된 골격근에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 세놀리틱 제제가 Bcl2 억제제, 판-티로신(pan-tyrosine) 키나제 억제제, 다사티닙(dasatinib) 및 케르세틴(quercetin)의 조합 요법, 플라보노이드, FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드, 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, HSP90 억제제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 소분자 화합물, 차단 항체, 나노바디 및 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 SW033291인 방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 30세인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 전신 투여 또는 국소 투여를 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PGE2의 수준이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 존재하는 PGE2의 수준에 비해 노화된 골격근에서 증가되는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PGE2의 수준이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 존재하는 PGE2의 수준에 비해 적어도 10%만큼 증가되는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, PGE2의 수준이 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 증가되는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, PGE2의 수준이 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내인 수준으로 증가되는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 근섬유 및/또는 근관 단면적 및/또는 직경의 증가를 발생시키는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 산화성(타입 IIa) 및/또는 해당(타입 IIb) 섬유의 단면적 및/또는 직경의 증가를 발생시키는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 15-PGDH 발현을 감소시키거나 차단하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 15-PGDH의 효소적 활성을 감소시키거나 차단하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 노화된 골격근의 근육 질량 증가, 근육 강도 증가, 근육 지구력 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시키는 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해 노화된 골격근의 근육 질량 증가, 근육 강도 증가, 근육 지구력 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시키는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 노화된 골격근의 근육 질량 증가, 근육 강도 증가, 근육 지구력 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시키는 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내의 수준으로 노화된 골격근의 근육 질량 증가, 근육 강도 증가, 근육 지구력 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시키는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 노화된 골격근의 향상된 기능을 발생시키는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해 노화된 골격근의 향상된 기능을 발생시키는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 노화된 골격근의 향상된 기능을 발생시키는 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 젊은 골격근에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내의 수준으로 노화된 골격근의 향상된 기능을 발생시키는 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 기능이 단백질 합성의 증가, 세포 증식의 증가, 세포 생존의 증가, 단백질 분해의 감소 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해, 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 노화된 골격근에서 PGE2 대사물의 감소된 수준을 발생시키는 방법.
  41. 제40항에 있어서, PGE2 대사물이 15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 노화로 인한 근감소증을 갖는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아트로젠의 발현 수준이 15-PGDH 억제제를 투여하기 전의 노화된 골격근에 비해 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 감소되는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 미토콘드리아 복합체의 하나 이상의 구성요소의 발현 수준이 15-PGDH 억제제를 투여하기 전의 노화된 골격근에 비해 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 증가되는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 미토콘드리아 복합체의 하나 이상의 구성요소가 Ndufa11, Ndufa12, Ndufa13, Ndufa2, Ndufa3, Ndufa4, Ndufa5, Ndufa10, Ndufb5, Ndufc1, Ndufs4, Ndufs8, Ndufv1, Ndufv2, Uqcrb, Uqcrc1, Uqcrh, Uqcrq, Ucqr10, Cox8b, Cox7a1, Cox7a2, Cox7b, Cox6c, Cox5a, Cox5b, Atp5f1, Atp5g1, Atp5h, Atp5j2, Atp5o, Atp5e 및 Atp5k로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 과산화소체 증식제-활성화된 수용체 감마 보조활성인자 1-알파(Pgc1α)의 발현 수준이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 증가되는 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, Tnfaip1, Klhdc8a, Fbxw11, Tnfaip3, Herc3, Herc2, Hdac4, Traf6, Ankib1, Mib1, Pja2, Ubr3, Thbs1, Smad3, Acvr2a, Rgmb, Tgfb2 및 Mstn으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 골격근에 비해 및/또는 젊은 골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 감소되는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 대상체에서 근육 줄기 세포(MuSC) 증식의 증가와 독립적인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 1일 1회, 1일 2회, 1주일에 1회 또는 1개월에 1회 투여를 포함하는 방법.
  50. 대상체에서 노화된 비-골격근 조직을 젊어지게 하는 방법으로서, 상기 방법이 대상체에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 15-PGDH 억제제의 양을 대상체에 투여하여 노화된 비-골격근 조직을 젊어지게 하는 것을 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 투여가 대상체의 노화된 비-골격근 조직에서 PGE2의 수준을 증가시키는 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직에서의 PGE2의 수준이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근 조직에 비해 증가되는 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직에서의 PGE2의 수준이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근 조직에 비해 적어도 10%만큼 증가되는 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직에서의 PGE2의 수준이 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 증가되는 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직에서의 PGE2의 수준이 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내의 수준으로 증가되는 방법.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직이 표피 조직, 상피 조직, 혈관 조직, 심장 근육, 뇌, 뼈, 연골, 감각 기관, 신장, 갑상선, 폐, 평활근, 갈색 지방, 비장, 간, 심장, 소장, 결장, 피부, 난소 및 기타 생식 조직, 모발, 치아 조직, 혈액, 와우 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 하나 이상의 노화 바이오마커를 갖는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 하나 이상의 노화 바이오마커가 젊은 비-골격근 조직에 비한 15-PGDH 수준의 증가, 젊은 비-골격근 조직에 비한 PGE2 수준의 감소, 젊은 비-골격근 조직에 비한 PGE2 대사물의 증가, 젊은 비-골격근 조직에 비한 노화 세포의 증가 또는 더 큰 축적, 젊은 비-골격근 조직에 비한 하나 이상의 아트로젠 발현의 증가, 젊은 비-골격근 조직에 비한 미토콘드리아 생물발생 및/또는 기능의 감소, 및 젊은 비-골격근 조직에 비한 전환 성장 인자 경로 신호전달의 증가로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  59. 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직이 젊은 비-골격근 조직에 비해 노화 세포의 증가된 축적을 갖는 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 노화 세포가 하나 이상의 노화 마커를 발현하는 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 노화 세포가 비-노화 세포에 비해 증가된 수준의 하나 이상의 노화 마커를 갖는 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 하나 이상의 노화 마커가 p15Ink4b, p16Ink4a, p19Arf, p21, Mmp13, Il1a, Il1b 및 Il6로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 노화 세포가 대식세포인 방법.
  64. 제50항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 세놀리틱 제제를 노화된 비-골격근 조직에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 세놀리틱 제제가 Bcl2 억제제, 판-티로신 키나제 억제제, 다사티닙 및 케르세틴의 조합 요법, 플라보노이드, FOXO4-p53 상호작용을 방해하는 펩티드, 갈락토올리고당류-코팅된 나노입자를 사용한 노화 세포의 선택적 표적화 시스템, HSP90 억제제, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  66. 제50항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 소분자 화합물, 차단 항체, 나노바디 및 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  67. 제50항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 SW033291인 방법.
  68. 제50항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 안티센스 올리고뉴클레오티드, 마이크로RNA, siRNA 및 shRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  69. 제50항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  70. 제50항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 적어도 30세인 방법.
  71. 제50항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 15-PGDH 발현을 감소시키거나 차단하는 방법.
  72. 제50항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 15-PGDH 억제제가 15-PGDH의 효소적 활성을 감소시키거나 차단하는 방법.
  73. 제50항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근의 기능이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근의 기능에 비해 향상되는 방법.
  74. 제50항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직의 기능이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근의 기능에 비해 적어도 10%만큼 향상되는 방법.
  75. 제50항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직의 기능이 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 향상되는 방법.
  76. 제50항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 노화된 비-골격근 조직의 기능이 젊은 비-골격근 조직에 존재하는 수준의 약 50% 이하 이내인 수준으로 향상되는 방법.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 기능이 증가된 단백질 합성, 증가된 세포 증식, 증가된 세포 생존, 감소된 단백질 분해 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  78. 제50항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 노화된 비-골격근 조직에 비해, 및/또는 젊은 비-골격근에 존재하는 수준과 실질적으로 유사한 수준으로 노화된 비-골격근 조직에서 PGE2 대사물의 감소된 수준을 발생시키는 방법.
  79. 제78항에 있어서, PGE2 대사물이 15-케토 PGE2 및 13,14-디하이드로-15-케토 PGE2로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  80. 대상체에서 골격근의 기능을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법이 골격근에서 15-PGDH 활성을 억제하고/하거나 15-PGDH 수준을 감소시키는 데 효과적인 양의 15-PGDH 억제제를 대상체에 투여하여 대상체에서 골격근의 기능을 향상시키는 것을 포함하고,
    상기 골격근이 건강한 골격근이고,
    상기 방법이 대상체에서 근육 줄기 세포(MuSC)의 증식의 증가와 독립적인, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 골격근이 손상되지 않는 방법.
  82. 제80항 또는 제81항에 있어서, 골격근이 재생을 겪지 않는 방법.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 골격근이 유의하거나 실질적인 운동을 겪지 않는 방법.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 기능이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 골격근에 비해 향상되는 방법.
  85. 제80항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 기능이 단백질 합성의 증가, 세포 증식의 증가, 세포 생존의 증가, 단백질 분해의 감소 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 15-PGDH 억제제의 투여 전의 골격근에 비해 근육 질량의 증가, 근육 강도의 증가, 근육 지구력의 증가 또는 이들의 임의의 조합을 발생시키는 방법.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 골격근이 젊은 골격근인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 대상체가 30세 미만인 방법.
  89. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 골격근이 노화된 골격근인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 대상체가 30세 초과인 방법.
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Patent event date: 20220104

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