KR20220019758A - 락토바실러스 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 적어도 하나의 락토바실러스 균주에 관한 것이며, 방법은 당해 적어도 하나의 균주의 유효 용량의 투여에 의한 치료를 포함한다. 적어도 하나의 유해 효과는 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준일 수 있고, 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 추가 유해 효과와 조합될 수 있다.

Description

락토바실러스 조성물 및 이의 용도

본 발명은 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 적어도 하나의 락토바실러스(Lactobacillus) 균주에 관한 것이며, 방법은 당해 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량의 투여에 의한 치료를 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 유해 효과는 선택적으로 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 추가 유해 효과와 조합된, 가용성 프렉탈카인(fractalkine)의 증가된 수준이다.

스트레스는 환경 조건과 같은 스트레스 요인에 대한 유기체의 반응이다. 스트레스는 위협, 도전 또는 물리적 또는 심리적 장벽과 같은 조건에 반응하는 신체의 방법을 포함한다. 이러한 조건, 위협, 도전 또는 장벽이 스트레스 요인이라고 알려져 있다. 자율 신경계 및 시상하부-뇌하수체-부신(HPA: hypothalamic-pituitary-adrenal) 축은 스트레스에 반응하는 두 가지 주요 시스템이다.

교감신경 수질(SAM: sympathoadrenal medullary) 축은 교감 신경계를 통해 투쟁-도피 반응을 활성화할 수 있는 반면, 부교감 신경계는 신체를 항상성으로 되돌린다. HPA 축은 대사, 심리적, 면역학적 기능과 같은 많은 신체 기능에 영향을 미치는 코르티솔의 방출을 조절한다. SAM 및 HPA 축은 변연계, 전전두엽 피질, 편도체, 시상하부 및 말단 선조를 비롯한 여러 뇌 영역에 의해 조절된다.

급성 스트레스는 면역계를 과도하게 활성화시켜, 염증과 항염증 사이의 불균형을 초래한다. 스트레스는 면역계의 균형을 교란하여, 말초 및 중추에 염증을 유발한다. 이러한 불균형은 심혈관 질환, 신경퇴행성 질환 및 암과 같은 다양한 스트레스 관련 질환으로 이어진다(문헌[Liu et al, 2017, Front Hum Neurosci; 11: 316]).

스트레스는 또한 염증에 대한 위장관계의 반응을 증가시키고 이전 염증을 재활성화하고 염증 과정을 가속화할 수 있다(문헌[Yaribeygi et al, 2017, EXCLI J. 16: 1057-1072]). 예를 들어, 만성 스트레스는 급성 심리사회적 스트레스에 의해 악화될 수 있는 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease)의 위험을 증가시킬 수 있다. 부분적으로 염증성 기원을 가질 수 있는 과민성 대장 증후군도 스트레스와 관련이 있다.

따라서, 인간, 특히 만성 스트레스로 고통받는 개인에서 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하기 위한 효과적인 방법을 찾는 것이 당업계에 필요하다.

본 발명은 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 적어도 하나의 락토바실러스 균주를 제공하며, 이 방법은 당해 적어도 하나의 균주의 유효 용량의 투여에 의한 치료를 포함한다.

본 발명에 따르면, 적어도 하나의 락토바실러스 균주는 적어도 하나의 균주의 부재 하에서 인간의 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과에 비해서 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 바람직하게 감소시키고/시키거나 예방한다.

제1 양태에서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 투여는 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과로서의 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준을 감소시키고/시키거나 예방한다.

제2 양태에서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주는 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 추가 유해 효과를 감소시키거나 예방하는 것과 조합하여 급성 심리사회적 스트레스에 대한 유해 효과로서의 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준을 감소시키고/시키거나 예방한다. 적어도 하나의 추가 유해 효과는 생화학적 지표 및/또는 생리학적 지표로부터 선택될 수 있다. 적어도 하나의 추가 유해 효과는 가용성 CD163의 증가된 수준일 수 있다.

제3 양태에서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 투여는 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과로서의 가용성 CD163의 증가된 수준을 감소시키고/시키거나 예방한다. 이러한 투여는 급성 심리사회적 스트레스의 하나 이상의 추가 유해 효과를 감소시키거나 예방할 수 있다.

제4 양태에서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 투여는 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소시키고/시키거나 예방하고, 유해 효과는 생리학적 지표이다. 생리학적 지표는 증가된 맥박, 증가된 심박수, 증가된 고주파수 심박수 변이도(heart rate variability), 증가된 장 투과성, 및 증가된 복통, 헛배부름 및/또는 팽만감과 같은 불리한 장 기능으로부터 선택될 수 있다.

"감소 및/또는 예방하는 데 사용"이란, 본 발명자들은 장애, 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 효과, 증상 및/또는 다른 마커를 예방하며, 지연시키고, 이로부터 보호하며, 이의 증상을 감소시키고/거나 제거하는 효과를 대상체에서 야기하는 용도의 의미를 포함한다.

"예방하다", "예방" 또는 "예방하는"이란, 본 발명자들은 예방될 사건, 효과 또는 병태가 발생하는 것으로부터 보호되거나, 지연되거나, 감소되거나(예를 들어, 중증도가 감소되며), 발생하지 않도록 차단되거나, 중단된다는 의미를 포함한다. 이러한 예방은 전형적으로 사건이 발생하기 전에 또는 효과 또는 병태가 발현되기 전에 수행되지만, 상기 예방은 동일한 종류의 사건의 추가 발생을 예방하기 위해 이루어질 수도 있는 것으로 이해될 것이다. 또한, 이러한 용어는 사건 또는 병태가 더 악화되거나 진전되지 않으면서 현재 상태에서 유지되는 의미를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

예를 들어, 급성 심리사회적 스트레스의 에피소드와 연관되거나 이에 선행하는 스트레스의 생화학적 지표(예를 들어, 가용성 프렉탈카인)의 척도는 적어도 하나의 균주의 투여 부재와 비교할 때 또는 적어도 하나의 균주가 없는 상응하는 조성물의 투여와 비교할 때 적어도 하나의 균주(또는 적어도 하나의 균주를 포함하는 조성물)의 투여 이후에 적어도 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%만큼 감소될 수 있다.

"심리사회적 스트레스"란, 본 발명자들은 사회적 평가, 사회적 배제, 목표 지향적인 성과를 주장하는 '성취' 상황을 포함할 수 있는 사회적 위협 상황에 의해 유발되는 스트레스의 의미를 포함한다(문헌[Kogler et al, 2015, Neuroimage 119:235-251] 참고, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨). 심리사회적 스트레스는 다른 사람과 관계를 맺어야 하는 욕구 및/또는 사회적 자아를 유지하려는 욕구의 충족이 위협받는 상황에서 발생할 수 있다. '성취 상황'은 개인이 자신의 성과가 평가될 것이라고 믿는 상황이다. 따라서 심리사회적 스트레스는 개인의 수행이 다른 사람들에게 부정적으로 평가될 위협이 있는 상황에서 유발되는 스트레스를 포함한다.

"심리사회적 스트레스"라는 용어는 특정 심리사회적 스트레스 요인에 의해 유발되는 효과(들)를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 심리 사회적 스트레스 요인은 특히 사회적 배제 또는 성취 부족이 그 판단으로 인해 발생할 수 있는 다른 사람의 수행에 대한 부정적인 판단 가능성을 포함한다.

심리사회적 스트레스는 생리학적 스트레스를 배제하기 위한 것임을 이해할 것이다. "생리학적 스트레스"라는 것은, 본 발명자들은 통증, 배고픔, 산화 스트레스 등과 같은 신체 조직의 잠재적 손상 및 신체적 위협과 관련된 스트레스의 의미를 포함한다(상기 문헌[Kogler et al, 2015] 참고). 또한 심리사회적 스트레스는 국제공개 WO 00/70972호에 기술된 바와 같은 신체 활동 또는 운동에 의해 유발된 스트레스 및 감염 또는 알레르기에 의해 유발된 임의의 스트레스를 배제하기 위한 것임을 이해할 것이다. 생리학적 스트레스는 '투쟁-도피' 반응을 유발하는 반면, 심리사회적 스트레스 동안에는 보상 처리가 감소하면서 감정 조절과 목표 지향적 행동으로 주의가 이동한다(상기 문헌[Kogler et al, 2015] 참고).

"급성 심리사회적 스트레스"의 맥락에서 "급성"이란, 본 발명자들은 스트레스 요인의 존재 및/또는 스트레스 요인에 대한 스트레스 반응이 시간 제한적이라는 의미를 포함한다. 따라서 급성 스트레스 요인은 전형적으로 단기적인 도전을 수반한다. 예를 들어, 급성 스트레스 요인(및/또는 그 스트레스 요인에 대한 스트레스 반응)은 전형적으로 하루 미만, 예를 들어 12, 11, 10, 9, 8, 7시간 이하 또는 바람직하게는 6, 5, 4, 3, 2 또는 1시간 미만 동안 존재한다. 하루에 한 번 이상의 급성 심리사회적 스트레스 에피소드가 발생할 수 있으며, 동일하거나 유사한 급성 스트레스 요인이 짧은 기간 이내(예를 들어, 24 내지 72시간 기간 이내)에 한번 초과의 급성 심리사회적 스트레스 에피소드를 초래할 수 있고, 여전히 급성 스트레스를 유발하는 것으로 간주된다는 것을 이해할 것이다.

급성 심리사회적 스트레스 요인(또는 급성 심리사회적 스트레스를 유발하는 자극)의 예는 다음 상황을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 구두 발표 또는 연설하기; 검사를 받는 중; 중요한 전화하기; 중요한 회의 참여; 마감일까지 일해야 하는 것(또는 임박한 마감일에 가까워짐); 괴롭힘을 당하는 것; 질환, 사별 또는 실직과 같은 예기치 않은 심각한 소식을 듣는 것.

"급성"이라는 용어는 일반적으로 "만성"이라는 용어의 의미를 배제하도록 의도된다는 것을 이해할 것이다. "만성"이란 것은, 본 발명자들은 지속적인 상태의 의미를 포함한다. 지속적인 상태는 변동을 포함할 수 있고 정적 상태만 포함하지 않는다는 것을 이해할 것이다. "급성"이라는 제한된 시간 프레임과 달리, 상황이 "만성"이 되려면 전형적으로 수일, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6주에 걸쳐 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월 초과에 걸쳐 반복 또는 지속성이 필요하다.

"만성 스트레스"라는 것은, 본 발명자들은 지속적인 스트레스 상태의 의미를 포함한다. 만성 스트레스는 일반적으로 개인이 자신이 거의 또는 전혀 통제할 수 없다고 인식하는 장기간 동안 겪는 정서적 압박에 대한 반응을 포함한다. 만성 스트레스 상태의 예는 사별 기간, 실업 기간, 외로움 또는 지속적인 결혼 문제와 같은 심각한 삶의 사건 이후에 발생하는 스트레스가 있다.

또한 급성 스트레스 사건이 만성 스트레스 기간에 선행하거나 이것으로 이어질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 급성 스트레스 요인은 예기치 않은 심각한 소식(예를 들어, 질병, 사별 또는 실업)의 통지일 수 있고, 만성 스트레스 요인은 뉴스의 주제였던 부정적인 상황(예를 들어, 질병, 사별, 또는 실업)의 지속일 수 있다.

"급성 심리사회적 스트레스의 효과"란, 본 발명자들은 급성 심리사회적 스트레스 요인의 존재로 인해 직접적으로 또는 간접적으로 발생하는 물리적 척도의 의미를 포함한다. "유해"란, 본 발명자들은 해를 입히거나 손상을 입히는 의미를 포함한다. 따라서 "급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과"와 관련하여 급성 심리사회적 스트레스가 개인에게 해를 입히거나 손상을 일으키는 특정 지표를 유발, 악화 또는 악화시킬 수 있다는 의미를 포함한다.

바람직하게는, 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과는 스트레스의 생화학적 및/또는 생리학적 지표 중 하나 이상으로부터 선택된다. 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과는 급성 심리사회적 스트레스의 에피소드 이전, 도중 또는 이후에 명백해질 수 있다는 것(예를 들어 측정 가능)을 이해할 것이다. 바람직하게는, 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과는 급성 심리사회적 스트레스 에피소드 동안 및/또는 에피소드 후 1시간 이내에 측정될 수 있다.

스트레스의 생화학적 지표의 예는 사이토카인, 특히 염증성 사이토카인 및/또는 조눌린(zonulin) 및/또는 코르티솔 및/또는 가용성 CD163의 증가된 수준을 포함한다. 바람직하게는 염증성 사이토카인은 가용성 프렉탈카인(CX3CL1 유전자에 의해서 인간에서 암호화된 케모카인[C-X3-C 모티프] 리간드 1) 중 하나이다. C-반응성 단백질(CRP, CRP 유전자에 의해서 인간에서 암호화됨), 인터페론 감마(IFNγ, IFNG 유전자에 의해서 인간에서 암호화됨), 인터류킨 10(IL-10 또는 인간 사이토카인 합성 저해 인자[CSID], IL10 유전자에 의해서 인간에서 암호화됨), 인터류킨 1 베타(IL-1β, IL1B 유전자에 의해서 인간에서 암호화됨), 인터류킨 6(IL-6, IL6 유전자에 의해서 인간에서 암호화됨), 인터류킨 8(IL-8 또는 케모카인 [C-X-C 모티프] 리간드 8, CXCL8, CXCL8 유전자에 의해서 인간에서 암호화됨) 또는 종양 괴사 인자 알파(TNFα, 카크헥신(cachexin) 또는 카켁틴(achectin), TNFA 유전자에 의해서 인간에서 암호화됨). 햅토글로빈 2 전구체라고도 불리는 조눌린(대립유전자 알파-2[2-2]의 비절단 형태)은 인간에서 HP 유전자에 의해서 암호화된 단백질이며(문헌[Fasano, 2011, Physiol Rev, 91(1):151-175] 참고, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함됨), 소화관의 벽의 세포들 사이에서 융합막(tight junction)의 투과성을 조절한다. 조눌린은 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)에 의해서 분비되는 폐쇄띠(zonula occludens) 독소의 포유동물 유사체인 것으로 간주되고, 따라서, 조눌린은 셀리악병 및 1형 진성 당뇨병의 기전에 연루되어 있다. 히드로코르티손으로도 알려진 코르티솔은 글루코코르티코이드 부류의 호르몬에 속하는 스테로이드 호르몬이며, 주로 부신 내 부신피질에서 생산되지만, 장내 국소 합성의 증거도 존재한다(문헌[Taves et al, 2011, Am J Physiol Endocrinal Metab, 301(1):E11-E24] 참고, 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함됨). CD163(CD163 유전자에 의해서 인간에서 암호화됨)은 스캐빈저 수용체 시스테인이 풍부한 패밀리 유형 B에 속하는 스캐빈저 수용체이다. 막 결합 CD163은 1048개의 아미노산 잔기 세포외 도메인, 단일 막관통 분절 및 여러 스플라이스 변이체가 있는 세포질 꼬리를 갖는다. 가용성 CD163(sCD163)은 종양 괴사 인자-알파 전환 효소(TACE)라고도 알려진 ADAM17에 의한 효소 절단의 결과로 막 결합 수용체의 엑토도메인 셰딩(shedding)에 의해 생성된다. sCD163은 혈장과 뇌척수액에서 발견된다. sCD163은 간경변, 2형 당뇨병, 대식세포 활성화 증후군, 고셔병, 패혈증, HIV 감염, 류마티스 관절염 및 호지킨 림프종을 비롯한 광범위한 염증성 질환에서 상향조절된다. sCD163은 또한 지주막하 출혈 후 뇌척수액에서 상향조절된다.

스트레스의 생화학적 지표는 당업계에 공지된 임의의 적절한 척도에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 스트레스의 생화학적 지표는 혈장 또는 혈청에서 측정된다. 예를 들어, 사이토카인(케모카인 포함), 펩타이드 또는 단백질의 수준은 측정할 사이토카인에 특이적인 항체를 사용한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 또는 MesoScale Discovery(미국 메릴랜드주 록빌 소재)의 멀티플렉스 키트에 의해 결정될 수 있다. 코르티솔과 같은 호르몬에 대한 측정 기술은 면역검정(예를 들어, ELISA) 및 탠덤 질량 분석법을 사용한 액체 크로마토그래피(LC MS/MS)를 포함한다. 스트레스의 생화학적 지표는 다른 생물학적 샘플, 예를 들어, 소변, 대변, 타액, 호흡, 눈물, 림프액, 뇌척수액, 활액 또는 조직 생검에서 측정될 수 있음을 또한 인식할 것이다.

스트레스의 생리학적 지표의 예는 증가된 맥박, 증가된 심박수, 증가된 고주파수 심박수 변이도, 증가된 장 투과성, 및 증가된 복통, 헛배부름 및/또는 팽만감과 같은 불리한 장 기능을 포함한다.

스트레스의 생리학적 지표는 당업계에 공지된 임의의 적절한 척도에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 심박수 측정값은 심전도에 의해 결정될 수 있고 장 기능 측정값은 시각적 아날로그 척도가 있는 설문지에 의해 결정될 수 있다.

가장 바람직한 실시형태에서, 스트레스의 생화학적 지표는 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준, 바람직하게는 혈장 내 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준이다.

따라서, 본 발명에 따른 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주는 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과로서 혈장에서 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준을 감소 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 것이고, 이 방법은 당해 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량의 투여에 의한 치료를 포함한다.

프렉탈카인

프렉탈카인은 N-말단 근처에서 시스테인을 분리하는 3개의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는, CX₃C 케모카인 패밀리의 유일하게 알려진 구성원이다. 마우스에서, 프렉탈카인은 뉴로택틴으로도 알려져 있다. 막 결합 프렉탈카인(CX3CL1)은 N-말단 도메인(잔기 1 내지 76), 뮤신 유사 줄기(잔기 77 내지 317), 막관통 알파 나선(잔기 318 내지 336) 및 세포질 꼬리(잔기 337 내지 373)를 포함하는 373개 아미노산(신호 펩티드 제거 후 인간 성숙 길이)을 가지고 있다(문헌[Jones et al, 2010, Mol Interv, 10(5):263-70]; [Bazan et al, 1997, Nature, 385(6617):640-644]; 이들 둘의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 포함됨).

프렉탈카인 발현의 주요 부위는 폐, 신장 및 장의 뉴런 및 상피 세포이며, 프렉탈카인은 또한 염증 병태 하에서 내피 및 평활근 세포에 의해 발현될 수 있다(상기 문헌[White et al, 2012]). 활성화된 내피 세포에서 발현되는 막 결합 프렉탈카인은 백혈구의 강력한 부착을 촉진한다. 프렉탈카인은 NK 세포, 세포 독성 T 림프구 및 감마-델타 세포의 표면 상의 케모카인 수용체 CX3CR1과 상호작용하여 부착 및 이동 기능을 도출한다. 막 고정 프렉탈카인은 또한 염증 병태 동안 단핵구에서 발현되는데, 이는 프렉탈카인이 염증성 질환에서 역할을 한다는 것을 시사한다(상기 문헌[Jones et al, 2010] 참고). 소교세포가 CX3CR1 수용체를 발현하기 때문에, 뉴런에서 발현되는 막 고정 프렉탈카인은 소교세포 이동에 필수적인 것으로 밝혀져 있다. 프렉탈카인은 또한 공간 학습 후 짧은 시간 기간 동안 해마에서 상향조절된다.

가용성 95 kDa 형태의 프렉탈카인(가용성 프렉탈카인 또는 가공된 프렉탈카인)은 케모카인 도메인 및 세포외 점액 유사 줄기를 함유한다. 가용성 프렉탈카인은 셰딩 프로테아제 ADAM10 또는 ADAM17에 의해 뮤신 줄기의 기저부에서 막 결합 프렉탈카인의 절단을 통해 방출된다(문헌[Zunke et al, 2017, Biochim Biophys Acta Mol Cell Res, 1864(11 Pt B):2059-2070]). ADAM10에 의한 셰딩은 구성적인 것으로 여겨지는 반면, ADAM17에 의한 셰딩은 염증 병태에서와 같은 세포 활성화에 대한 응답으로 여겨진다(상기 문헌[White et al, 2012] 참고). ADAM10에 대한 적어도 2개의 절단 부위가 알려져 있다(문헌[White et al, 2012, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 32:589-594]). 가용성 프렉탈카인은 T 세포, 단핵구 및 자연 살해(NK) 세포를 강력하게 화학 유인한다.

프렉탈카인 및 이의 수용체 CX3CR1의 양은 여러 형태의 암, 염증성 질환 및 심혈관 질환에서 증가하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 용해성 프렉탈카인의 상승된 수준은 파열된 관상동맥 플라크가 있는 환자에서 보고되었으며(문헌[Ikejima et al, 2010, Circ J, 74:337-345]), 프렉탈카인은 원발성 인간 평활근 세포에 대한 증식 및 항-세포자멸 효과에 의한 심혈관 질환에 연루되어 있다(문헌[White et al, 2010, Cardiovasc Res, 85:825-835]). 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준은 류마티스 관절염의 활액에서도 보고되어 있다(문헌[Ruth et al, 2001, Arthritis Rheum, 44:1568-1581]). 막 고정 프렉탈카인을 발현하는 장 상피 세포는 IL-1β에 의한 자극에 응답하여 가용성 프렉탈카인을 방출하는 것으로 나타났다(문헌[Muehlhoefer et al, 2000, J Immunol, 164:3368-3376]). 또한, 인간의 장내 미세혈관 내피 세포는 IFN-γ 또는 TNFα 단독에 의해서가 아니라 IFN-γ 및 TNFα의 조합에 의한 자극에 대한 응답으로 가용성 프랙탈킨을 셰딩하는 것으로 나타났으며, 이는 건강한 대조군으로부터보다 궤양성 대장염 및 크론병 환자로부터의 세포에서 더 높았다(문헌[Sans et al, 2007, Gastroenterology, 132(1):139-53]).

염증성 장 질환의 두 뮤린 모델에 항-프렉탈카인 단클론성 항체의 투여는 체중 감소 억제를 포함한 긍정적인 결과를 나타냈고, 이는 IBD의 발병기전에서 프렉탈카인의 역할을 시사한다(문헌[Nishimura et al, 2009, Ann N Y Acad Sci, 1173:350-6]). 문헌[Nishimura et al., 2009]은 대장염 발병에서 프렉탈카인-프렉탈카인 수용체(CX3CL1-CX3CR1) 상호작용의 생물학적 중요성을 강조한다.

염증성 장 질환을 갖는 환자의 결장은 프렉탈카인의 수치 증가 및 프렉탈카인 수용체-양성 세포의 많은 수를 나타낸다. 프렉탈카인-프렉탈카인 수용체 경로를 방해하기 위해 항-프렉탈카인 단클론성 항체를 마우스에 주사하면 혈관내 단핵구 순찰 행동이 효율적으로 저해하였고; 결장에서 염증성 사이토카인의 발현을 감소시켰고; 옥사-유도 마우스 대장염 모델에서 혈관 무결성을 유지하고 대장염 증상을 유의하게 억제하였다(문헌[Kuboi et al. 2019, Int Immunol. 2019 Apr 26;31(5):287-302]). 항-프렉탈카인 항체는 또한 또 다른 IBD 모델인 T-세포 전달 대장염의 증상을 개선하였다. 문헌[Kuboi et al. 2019]에서의 결과는 프렉탈카인-프렉탈카인 수용체 축이 뮤린 대장염 모델의 발병기전에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타내는데, 이는 프렉탈카인-프렉탈카인 수용체 상호작용 및 관련 경로의 파괴가 크론병(CD) 및 궤양성 대장염(UC)을 비롯한 염증성 장 질환(IBD) 치료에 효과적인 전략이 될 수 있음을 시사한다.

프렉탈카인 및 이의 수용체는 화학요법-유도 말초 신경병증(CIPN)에서 역할을 한다. 프렉탈카인 및 프렉탈카인-수용체가 고도로 발현되면, 이들은 척수 미세아교세포를 활성화시켜 P38/MAPK 신호전달 경로를 통해 TNF-α 및 IL-1b와 같은 염증 인자를 생성하여 CIPN을 유발한다(문헌[Clark and Malcangio, 2012, Exp Neurol. 2012 Apr;234(2):283-92]). 가스트로딘은 프렉탈카인 및 프렉탈카인 수용체 경로 감소를 통해 척수 미세아교세포의 활성화를 저해하여 마우스에서 유도된 CIPN을 완화하였다(문헌[Qin et al., Drug Chem Toxicol. 2018 Dec 17:1-8]).

당뇨병성 망막병증(DR)의 병태생리학적 기전은 복잡하고 밀접하게 관련되어 있으며, 산화 스트레스, NF-κB 및 염증 매개체와 관련이 있을 가능성이 있다. 다양한 산화 스트레스 및 염증 매개체(프렉탈카인 포함)의 발현을 RT-PCR, 웨스턴 블롯 분석 및 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 당뇨병-유도 래트에서 평가하였다. 일부 래트는 실로스타졸로 치료를 받았다. 당뇨병 래트의 망막에서, 당뇨병 마우스의 프렉탈카인 mRNA 수준은 건강한 래트에 비해 5배 증가하였고, 프렉탈카인 발현은 4배 증가하였다. 실로스타졸을 사용한 치료는 프렉탈카인 mRNA 수준을 66% 감소시켰고, 프렉탈카인 발현을 62% 감소시켰다. 산화 스트레스 및 염증의 다른 마커를 모니터링하였고, 실로스타졸은 당뇨병 눈에서 염증 반응 및 산화 스트레스를 감소시키는 것으로 나타났다. 실로스타졸의 항-염증 효과는 산화 스트레스 감소, NF-κB 활성 저해 및 그 다음 염증 매개체 감소를 통해 간접적으로 나타날 수 있다. 실로스타졸은 이러한 기전을 통해 당뇨병성 망막병증의 진행을 예방하는 데 도움이 될 수 있다(문헌[Yeh et al. Curr Eye Res 2019 Mar;44(3):294-302]).

따라서, 가용성 프렉탈카인의 감소는 상승된 가용성 프렉탈카인이 연루된 병태 또는 질환에 대한 보호 및/또는 치료를 제공하는 데 유리할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 본 개시내용 이전에는, 급성 심리사회적 스트레스와 프렉탈카인 방출 간에는 어떠한 관련도 없었다.

가장 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 적어도 하나의 균주의 투여는 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과로서 혈장에서 가용성 프렉탈카인의 상승 수준을 감소시키거나 예방할 수 있고, 이에 의해서 상승된 가용성 프렉탈카인이 연루된 장애, 병태 또는 질환, 예컨대, 암, 화학요법-유도 말초 신경병증(CIPN), 당뇨병성 망막병증(DR), 염증성 질환, 심혈관 질환, 염증성 장 질환(IBD), 과민성 대장 증후군(IBS), 궤양성 대장염 및 크론병에 대한 보호 및/또는 경감을 제공한다.

환자 군

본 발명에 따른 적어도 하나의 균주는 급성 심리사회적 스트레스를 경험하는 임의의 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 데 유용할 수 있다.

특히, 적어도 하나의 균주는 청소년(12 내지 17세), 청년(18 내지 30세) 및 30, 40, 50, 60, 70 및 80세 초과의 성인을 포함하는 인간(남성 및/또는 여성)에서 사용하기에 적합하다.

치료될 인간은 만성 스트레스를 갖는 개체 또는 만성 스트레스가 없는 개체일 수 있다.

"만성 스트레스"란, 본 발명자들은 시롬-멜라메이드 번아웃 설문지(SMBQ)에서 3.75점 이상의 점수의 의미를 포함한다(문헌[Grossi et al, 2003, J Psychosomatic Res 55: 309-316]). 따라서, 치료될 인간은 SMBQ에서 3.75점 이상의 점수로 표시되는 만성 스트레스를 가질 수 있다. 대안적으로, 치료될 인간은 SMBQ에서 3.75점 미만의 점수로 표시되는 만성 스트레스를 갖지 않을 수 있다.

또한 "만성 스트레스"가 우울증을 포함하도록 의도된 것이 아님을 이해할 것이다. 우울증이란 중 자가 평점 우울 척도(Zung Self-Rating Depression Scale)에서 45점 이상의 의미를 포함한다(문헌[Zung, 1965, Arch Gen Psychiatry, 12:63-70], 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함됨).

락토바실러스 균주

본 발명에 따른 적어도 하나의 락토바실러스 균주는 생존 가능하거나, 불활성화되거나, 사멸될 수 있다. 바람직하게는, 균주는 생존 가능하다. 예를 들어, 바람직하게는 균주는 동결 건조된다.

이롭게는, 적어도 하나의 락토바실러스 균주는 프로바이오틱 균주이다.

프로바이오틱 박테리아는, "적절한 양으로 투여되는 경우, 숙주에 건강상 이익을 부여하는 살아 있는 미생물"로서 정의될 수 있다(문헌[Hill et al, Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2014, 11(8):506-514]). 박테리아가 프로바이오틱의 정의를 충족하기 위해서는, 상기 박테리아는 전형적으로 창자에서 생존하고 콜로니화하며, 생성 및 저장 과정들에서 생존하고, 소모자의 건강에 긍정적인 효과를 갖는다는 증거를 가질 수 있어야 한다.

"적어도 하나의 프로바이오틱 균주"란, 본 발명자들은 적절한 양으로 투여된 경우 숙주에게 건강상 이익을 부여하는 박테리아의 하나 이상의 균주(들)의 의미를 포함한다.

바람직하게는 본 발명의 제1 양태에 따른 "적어도 하나의 균주"는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가쎄리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 악시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 및 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) 종으로부터 선택된다.

바람직하게는 본 발명에 따른 "적어도 하나의 균주"는 적어도 하나의 락토바실러스 플란타룸 균주이다.

바람직하게는, 적어도 하나의 락토바실러스 플란타룸 균주는 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™), 락토바실러스 플란타룸 DSM 15313(HEAL 19™), 락토바실러스 플란타룸 DSM 15316(HEAL 99™), 락토바실러스 플란타룸 DSM 6595 (299™), 락토바실러스 플란타룸 DSM 9843 (299v^®), 락토바실러스 플란타룸 DSM 32131 (GOS42™), 락토바실러스 플란타룸 DSM 17852(LB3e™) 및 락토바실러스 플란타룸 DSM 17853(LB7c™)으로부터 선택된다.

락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™), 락토바실러스 플란타룸 DSM 15313(HEAL 19™) 및 락토바실러스 플란타룸 DSM 15316(HEAL 99™)은 2002년 11월 27일에 Probi AB에 의해 독일 브라운슈바이크 D-38124, 마쉐로데르 베크 1b 소재의 DSMZ-독일 생물 자원 센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁되었다.

락토바실러스 플란타룸 DSM 6595(299™)는 1991년 7월 2일에 Probi(즉, Probi AB)의 명칭 하에 의해 독일 브라운슈바이크 D-3300, 마쉐로데르 베크 1 B 소재의 DSM-독일 생물 자원 센터에 기탁되었다.

락토바실러스 플란타룸 DSM 9843(299V^®)은 1995년 3월 16일에 Probi AB에 의해 독일 브라운슈바이크 D-38124, 마쉐로데르 베크 1b 소재의 DSM-독일 생물 자원 센터에 기탁되었다.

락토바실러스 플란타룸 DSM 32131(GOS42™)은 2015년 9월 2일에 Probi AB에 의해 독일 브라운슈바이크 D-38124, 인호펜스트라쎄 7 소재의 라이프니츠 과학협회 DSMZ-독일 미생물 및 세포 배양물 수집 센터(DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 기탁되었다.

락토바실러스 플란타룸 DSM 17852(LB3e™) 및 락토바실러스 플란타룸 DSM 17853(LB7c™)은 2006년 1월 6일에 Probac AB에 의해 독일 브라운슈바이크 D-38124, 마쉐로데르 베크 1b 소재의 DSMZ-독일 생물 자원 센터에 기탁되었다. 미생물 기탁물 DSM 17852 및 DSM 17853과 연관된 모든 권리 및 의무들은 후속적으로, 현재 DSM 17852 및 DSM 17853 균주의 기탁자인 Probi AB에게 주어지고 이에 의해 승인되었다.

바람직하게는, 적어도 하나의 락토바실러스 플란타룸 균주는 장 상피에 부착되어 장에서 유지될 수 있다. 이러한 종의 특정 균주는 만노스-특이적 부착을 포함하며(문헌[Adlerberth et al, 1996, Appl Environ Microbiol, 62(7):2244-2251], 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함됨), 이러한 균주는 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™), 락토바실러스 플란타룸 DSM 15316(HEAL 99^TM), 락토바실러스 플란타룸 DSM 9843(299v^®) 및 락토바실러스 플란타룸 DSM 6595(299™)를 포함한다.

가장 바람직하게는, 적어도 하나의 락토바실러스 플란타룸 균주는 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)이다.

조성물

본 발명에 따른 적어도 하나의 균주는 적어도 하나의 적합한 담체를 포함하는 조성물에 존재할 수 있다. 예를 들어, 담체는 희석제 또는 부형제일 수 있다. 상기 조성물은 고체 또는 액체 제형으로서 존재할 수 있으며, 따라서, 적어도 하나의 담체는 고체 또는 액체일 수 있거나, 적어도 하나의 고체 구성요소와 적어도 하나의 액체 구성요소 둘 다 포함할 수 있다.

적합한 액체 담체의 예는 물, 우유, 코코넛수, 과일 음료 및 쥬스, 우유 대용물(두유, 귀리 음료, 견과 및 다른 식물-기초 음료), 스파클링 음료, 오일 제형, 예컨대, 너트 또는 식물성 오일, 예컨대, 코코넛, 평지씨, 올리브, 옥수수/메이즈 중 하나; 팜; 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 다른 수성 용매를 포함한다.

적합한 고체 담체 또는 부형제의 예는 말토덱스트린, 인슐린, 셀룰로스, 예컨대, 미세결정질 셀룰로스(MCC), 히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC) 또는 히드록시-프로필셀룰로스(HPC), 당(sugar) 알코올, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜, 락토스, 소듐 시트레이트, 칼슘 카르보네이트, 디베이직(dibasic) 칼슘 포스페이트 및 글리신, 붕해제, 예컨대, 전분(바람직하게는 옥수수, 감자, 타피오카 또는 다른 식물성 전분), 소듐 전분 글리콜레이트, 크로스카멜로스 소듐 및 소정의 복잡한 실리케이트, 및 과립화 결합제, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스, 젤라틴 및 아카시아를 포함한다. 추가로, 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크(talc)가 포함될 수 있다.

본 발명의 제1 양태에 따른 실시형태에서, 담체는 약제학적으로 그리고/또는 영양학적으로(식품 등급) 허용 가능한 담체 또는 부형제로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 담체 물질은 식품일 수 있다.

적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및 희석제의 예는 당업자에게 잘 알려져 있는 것들, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th ed., vol. 1 & 2 (ed. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company)]에 기재된 것들을 포함한다.

"식용-등급"이란, 본 발명자들은 '일반적으로 안전한 것으로 인식되는'(GRAS: generally recognized as safe) 기준을 충족시키는 담체, 성분 및 부형제를 포함한다.

"식품"이란, 본 발명자들은 유기체에 대한 영양적 이익 또는 뒷받침을 제공하기 위해 소모되는 임의의 성분을 포함한다. 적합한 식품 담체의 예는 음료(예를 들어, 쥬스), 유제품(예를 들어, 요구르트, 치즈, 아이스크림, 유아용 조제 분유(infant formula) 및 스프레드, 예컨대, 마가린), 대체유(dairy-alternative) 제품(예를 들어, 대두, 견과 또는 다른 식물-기초 음료, 요구르트 및 스프레드), 시리얼-기초 제품(예를 들어, 빵, 비스킷, 아침식사용 시리얼, 파스타 및 건조 식품 바(bar), 예컨대, 건강 바), 및 이유식(예를 들어, 퓌레 과일 및/또는 채소)을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 건조한 비-발효 조성물, 발효 조성물, 또는 건조한 발효 조성물일 수 있다. 이러한 맥락에서 발효는 특히 혐기성 조건에서 락트산 박테리아에 의한 락트산 발효를 포함한다. 건조한 비-발효 조성물의 경우, 실질적으로 발효는 대상체에 의한 섭취 전에 발생하지 않고, 따라서 발효는 대상체에 의한 조성물의 섭취 후에야 위장관에서 발생한다.

그러므로, 본 발명에 따른 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 식품 형태로 존재하고, 이러한 식품은 시리얼-기초 제품, 유제품, 쥬스 음료, 또는 발효 식품이다.

발효 식품의 예는 발효유 제품(예를 들어, 요구르트, 케피어 또는 라씨), 발효된 유제품-무함유 대체유(dairy-free milk alternative)(예컨대, 코코넛 우유 케피어), 발효 시리어-기초 제품(예컨대, 귀리, 오트밀, 옥수수, 수수, 밀), 발효된 채소(예컨대, 소금에 절인 양배추, 김치, 또는 피클), 발효된 콩과 식물 또는 대두(예컨대, 나토 또는 템페) 및 발효된 차(예컨대, 콤부차)를 포함한다. 유제품 무함유 대체유의 다른 예는 아몬드, 콩 및 귀리 기반 "구르트"를 포함한다.

본 발명에 따른 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 균주는 천연 발생하지 않는 조성물에 존재하고, 예를 들어, 상기 조성물은 균주(들) 및 물 이외의 것을 포함한다.

사용 시, 본 발명에 따른 적어도 하나의 균주 또는 적어도 하나의 균주를 포함하는 조성물은 포유류에게 투여되기 전에 액체 또는 고체와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 섭취 전에 적어도 하나의 균주 또는 이의 조성물을 물, 우유, 코코넛수, 과일 음료 및 쥬스, 우유 대용물(두유, 귀리 음료, 견과류 및 다른 식물-기초 음료), 스파클링 음료, 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 다른 수성 용매 또는 음료로부터 선택되는 하나 이상의 액체를 포함하는 담체와 혼합할 수 있다. 유사하게는, 적어도 하나의 균주 또는 이의 조성물은 하나 이상의 식품으로 구성된 담체와 혼합될 수 있다. 적합한 식품 담체는 오트밀 담체, 보리 담체, 발효 또는 비-발효 유제품, 예컨대, 요구르트, 아이스크림, 밀크쉐이크, 과일 쥬스, 음료, 수프, 빵, 비스킷, 파스타, 아침식사용 시리얼, 건강 바를 포함한 건조 식품 바, 식물-기초 식품, 예컨대, 콩 제품, 스프레드, 이유식, 소아 영양식, 영아조제 분유, 출생 시부터의 모유 대체품을 포함한다.

바람직하게는, 제형은 균주를 포함하는 조성물의 1일 용량 또는 단위, 1일 하위용량 또는 이의 적절한 분획을 함유하는 단위 투여량이다.

본 발명에 따른 조성물은 식이요법 보충제일 수 있다. "식이요법 보충제"란, 본 발명자들은 입에 의해, 예를 들어, 알약, 캡슐, 정제 또는 액체로서 섭취되는 경우 식이요법을 보충하고자 하는 제조된 생성물의 의미를 포함한다. 식이요법 보충제는 생존에 필수적인 성분 및/또는 생존에 필수적인 것으로 확인되지는 않았지만 유익한 생물학적 효과를 가질 수 있는 성분을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물이 식이요법 보충제의 형태로 존재하는 경우, 첨가되는 담체(들)는 당업자에게 널리 공지된 것, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th ed., vol. 1 & 2 (ed. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company)]에 기재된 것을 포함한다. 식이요법 보충제에서 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분은 당업자에게 공지되어 있고, 또한 적어도 하나의 균주와 통상 함께 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 로젠지, 츄잉껌, 또는 좌제 형태로 제공될 수 있다.

예를 들어, 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 동결-건조된 락토바실러스를 포함하는 캡슐 형태의 식이요법 보조제이다.

본 발명에 따른 일 구현예에서, 적어도 하나의 균주는 (예를 들어, 조성물에서) 약 1x10⁶ 내지 약 1x10¹⁴ CFU/용량, 바람직하게는 약 1x10⁸ 내지 약 1x10¹² CFU/용량, 더욱 바람직하게는 약 1x10⁹ 내지 약 1x10¹¹ CFU/용량, 가장 바람직하게는 약 1x10¹⁰ CFU/용량의 양으로 존재한다. 적어도 하나의 균주가 하나 초과의 균주로 구성되는 경우, 이러한 양은 균주들의 조합의 용량당 총 CFU를 나타낸다. 예를 들어, 적어도 하나의 균주는 약 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10¹⁰, 1x10¹¹, 1x10¹² 또는 약 1x10¹³ CFU/용량의 양으로 존재할 수 있다. 적어도 하나의 균주는 약 1x10¹⁴, 1x10¹³, 1x10¹², 1x10¹¹, 1x10¹⁰, 1x10⁹, 1x10⁸ 또는 약 1x10⁷ CFU/용량의 양으로 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 적어도 하나의 균주는 또한, 상기 적어도 하나의 균주가 섭취 전에 첨가되거나 혼합되는 물 또는 임의의 다른 수성 비히클에서 단독으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 즉시-방출, 지연-방출 또는 제어-방출 적용을 위해, 풍미제 또는 착색제를 함유할 수 있는 정제, 캡슐, 분말, 질좌제, 엘릭셔, 용액 또는 현탁액 형태로 경구, 협측 또는 설하 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 분말화된 조성물, 예컨대, 신속-용융 미생물 조성물, 예를 들어, 국제공개 WO 2017/060477호 또는 Probi^® Fast Melt technology에 관한 Probi의 UK 특허 출원 제1708932.7호 또는 Probi의 국제공개 WO 2018/224509호에 기재된 것들의 형태로 투여될 수 있으며, 이들 3개 모두의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 분말이 신속-용융 미생물 조성물에 존재하지 않는 경우, 이는 섭취 전에 식품(예를 들어, 요구르트) 또는 음료(예를 들어, 물 또는 우유)에 첨가되기에 적합할 수 있다.

조성물이 분말 형태로 존재하는 경우 조성물은 전형적으로 밀봉된 용기에 충전될 것이며, 이는 조성물에서 박테리아를 보호하고 이의 생존율을 유지시키기 위한 산소 및 수분 장벽을 제공한다. 그러므로, 조성물이 분말 형태로 존재하는 경우, 바람직하게는 조성물은 밀봉된 알루미늄 호일 스틱에 포장되고, 이때 각각의 스틱은 1회 용량의 조성물, 즉, 1회 용량의 박테리아를 포함한다. 적합한 용기의 비제한적인 예는 스틱, 백, 파우치 또는 캡슐을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 용기는 알루미늄 호일 또는 폴리에틸렌 스틱이며, 이는 전형적으로 웰딩(welding)에 의해 밀봉된다. 상기 스틱은 전형적으로 간단히 찢음 개방(tear opening)하도록 구성된다. 스틱은 찢음 노치(tear notch)를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 제어-방출 고체 투여 형태, 예를 들어, 국제공개 WO 03/026687호 및 미국 특허 제8,007,777호 및 미국 특허 제8,540,980호에 기재된 것들 중 임의의 것으로서 제형화될 수 있으며, 이들의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다. 조성물은 층상 투여 형태, 예를 들어, 국제공개 WO 2016/003870호에 기재된 임의의 층상 투여 형태를 포함하여 Probi's BIO-tract ^® 기법으로서 제형화될 수 있으며, 이의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

정제는 선택적으로 하나 이상의 부속 성분과 함께 압축 또는 성형(moulding)에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 적합한 기계에서 선택적으로 결합제(예를 들어, 포비돈, 젤라틴, 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제(예를 들어, 소듐 전분 글리콜레이트, 가교된 포비돈, 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성 또는 분산 작용제와 혼합된 자유-유동 형태, 예컨대, 분말 또는 과립의 적어도 하나의 프로바이오틱 균주(예를 들어, 냉동-건조됨)를 압축시킴으로써 제조될 수 있다. 성형된 정제는 적합한 기계에서 불활성 액체 희석제로 보습된 분말화된 화합물의 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다. 상기 정제는 선택적으로 코팅되거나 채점(scored)될 수 있고, 예를 들어, 요망되는 방출 프로파일을 제공하기 위해 다양한 비율의 히드록시프로필메틸셀룰로스를 사용하여 그 안에서 활성 성분의 느린 또는 제어 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.

치료 방법

본 발명은 또한 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 인간에게 유효 용량의 적어도 하나의 락토바실러스 균주 또는 이의 조성물을 투여함으로써 치료하는 것을 포함한다.

특히, 치료 방법은 상기에 기재된 본 발명의 양태에 따른 적어도 하나의 균주인 용도를 위한 상기에 기재된 방법을 포함한다.

"치료하다", "치료하는" 및 "치료"란, 본 발명자들은 치료될 질환 또는 병태가 호전되며, 중증도가 감소되고, 제거되며, 추가 발생하지 않도록 차단되고, 추가 발생으로부터 보호되며, 지연되고/되거나 중단된다는 의미를 포함한다. "치료하다", "치료하는" 및 "치료"라는 용어는 또한 주어진 질환 또는 병태와 관련된 하나 이상의 증상, 효과, 적응증 및/또는 다른 마커를 지연시키고/시키거나, 이로부터 보호하고/하거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나 제거하는 의미를 포함한다. 이러한 용어 중 하나가 질환 또는 병태의 맥락에서 사용되는 경우 이러한 치료는 전형적으로 질환 또는 병태가 나타난 후에 발생한다. 또한, 이러한 용어는 질환 또는 병태가 더 악화되거나 진전되지 않으면서 현재 상태에서 유지되는 의미를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

본 발명에 따른 방법에 의해서 치료될 인간은 본 발명의 상기 양태와 관련하여 상기에 주어진 임의의 인간일 수 있다. 예를 들어, 인간은 남성 또는 여성일 수 있고, 청소년(12 내지 17세), 청년(18 내지 30세) 또는 30, 40, 50, 60, 70 또는 80세 초과의 성인일 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 투여는 본 발명의 상기 양태와 관련하여 상기 기재된 바와 같이 경구, 협측 또는 설하 투여를 포함한다.

본 발명의 방법에 따른 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일마다, 또는 1주일에 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 7회의 투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는 투여는 적어도 1일 1회 수행된다.

본 발명에 따른 투여는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 동안 또는 적어도 1, 2, 3 또는 4주 동안 반복되는 투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 투여는 적어도 1회/일로 적어도 7일 동안, 예컨대, 적어도 1주 동안, 바람직하게는 적어도 2주 동안, 보다 바람직하게는 적어도 3주 동안, 가장 바람직하게는 적어도 4주 동안 반복된다.

본 발명의 방법에 따른 투여는 본 발명에 따라서 바람직하게는 약 1x10⁶ 내지 약 1x10¹⁴ CFU/단위 용량, 바람직하게는 약 1x10⁸ 내지 약 1x10¹² CFU/단위 용량, 더욱 바람직하게는 약 1x10⁹ 내지 약 1x10¹¹ CFU/단위 용량, 가장 바람직하게는 약 1x10¹⁰ CFU/단위 용량의 단위 투여량이다. 본 발명의 방법에 따른 투여는 바람직하게는 약 1x10⁶ 내지 약 1x10¹⁴ CFU/단위 용량, 바람직하게는 약 1x10⁸ 내지 약 1x10¹² CFU/단위 용량, 더욱 바람직하게는 약 1x10⁹ 내지 약 1x10¹¹ CFU/단위 용량, 가장 바람직하게는 약 1x10¹⁰ CFU/단위 용량의 유효 용량을 초래한다. 바람직하게는, 각각의 대상체는 1일당 적어도 하나의 단위 용량, 예컨대, 1일당 하나의 단위 용량이 투여된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따른 투여는 바람직하게는 약 1x10⁶ 내지 약 1x10¹⁴ CFU/일, 바람직하게는 약 1x10⁸ 내지 약 1x10¹² CFU/일, 더욱 바람직하게는 약 1x10⁹ 내지 약 1x10¹¹ CFU/일, 가장 바람직하게는 약 1x10¹⁰ CFU/일의 1일 용량을 초래한다.

바람직한 1일 용량은 또한, 하나 초과의 하위-용량의 투여에 의해, 예를 들어, 바람직한 1일 용량의 절반을 포함하는 단위 용량의 1일 2회 투여에 의해 달성될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 그러므로, 유효 용량에 대한 바람직한 범위는 또한, 실질적인 단위 용량 횟수가 얼마이든지 간에 바람직한 1일 투여가 달성됨을 나타낼 수 있다.

대상체는 치료적 유효량의 본 발명에 따른 적어도 하나의 균주 또는 본 발명의 제1 양태에 따른 조성물을 물, 또 다른 수성 용매 또는 식품, 예를 들어 요거트와 조합하여 소모하도록 지시를 받을 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 본 발명에 따른 적어도 하나의 균주가 급성 심리사회적 스트레스 인자에 의해서 유발되는 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하기 위한 효과를 가질 수 있도록 바람직하게는 급성 심리사회적 스트레스의 에피소드(들) 이전에 수행되어야 한다. 따라서, 바람직하게는 본 발명에 따른 적어도 하나의 균주의 투여는 급성 심리사회적 스트레스의 에피소드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 전, 보다 바람직하게는 급성 심리사회적 스트레스의 에피소드의 적어도 1, 2, 3 또는 4주 전에 시작된다.

본 발명에 따른 바람직한 실시형태에서, 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법은 인간에게 10¹⁰ CFU의 본 발명에 따른 적어도 하나의 균주 또는 이의 조성물을 적어도 30일 동안 투여하는 치료를 포함한다.

인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방함으로써, 본 발명에 따른 방법은 질환, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 특히, 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과로서 혈장에서 가용성 프렉탈카인의 상승 수준을 감소 및/또는 예방함으로써, 본 발명에 따른 치료 방법은 암, 화학요법-유도 말초 신경병증(CIPN), 당뇨병성 망막병증(DR), 염증성 질환, 심혈관 질환, 염증성 장 질환(IBD), 과민성 대장 증후군(IBS), 궤양성 대장염 및 크론병으로부터 선택된 하나 이상의 질환, 장애 또는 병태의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 또는 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 방법에서, 바람직하게는 급성 심리사회적 스트레스의 유해 효과는 특히 혈장에서 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준이다.

방법에서의 용도

본 발명의 추가 양태는 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법에서, 본 발명에 따른 적어도 하나의 균주를 포함하는 조성물 또는 이의 조성물의 용도를 제공한다. 특히, 방법은 본 발명의 상기 방법에 따른 방법이다.

본 명세서 내에서 명백히 사전-공개된 문헌의 목록 또는 논의는 상기 문헌이 당업계의 일부이거나 통상의 일반적인 지식이라고 인정하는 것으로 반드시 간주되지 않아야 한다.

본 발명은 이제 하기 실시예 및 도면을 참조로 하여 더욱 상세히 설명될 것이다.

도 1은 TSST 시험 후 코르티솔 수준 ln(nmol/L)의 변화를 도시한다. 실선으로서 LPHEAL9; 점선으로서 PLACEBO. 0에서의 파선은 TSST 챌린지 전 제1 샘플에서의 수준(BASE)을 나타내고, 각각의 시간 지점은 해당 BASE 판독값으로부터의 변화를 나타낸다: PREP = TSST 챌린지 전 제2 샘플; v-TSST = TSST 챌린지 직후; R+10, R+20, R+30, R+40, R+60 = 회복 페이즈(phase) 내의 TSST 챌린지 10, 20, 30, 40 및 60분 후.
도 2는 TSST 시험 후 프렉탈카인 수준 sqrt(pg/mL)의 변화를 도시한다. 선 및 x축 조건은 도 1과 같다.
도 3은 TSST 시험 후 가용성 CD163 수준(log10[ng/mL])의 변화를 도시한다. 결과가 R+60에 대해서 나타내지 않은 것을 제외하고는, 선 및 x축 조건은 도 1과 같다.
도 4는 TSST 시험 후 프렉탈카인 수준(pg/mL)의 변화를 도시하며, (1) 시험일에 3.75 이상(만성 스트레스, HS)의 SMBQ 값을 갖는 대상체 대 시험일에 3.75 미만(낮은 스트레스, LS)의 SMBQ 값을 갖는 대상체 및 (2) "활성"(엘. 플란타룸 DSM 15312 치료전) 군 대 "위약" 대조군에서의 대상체의 2-인자 비교를 사용한다. y축의 0은 TSST 챌린지 전 제1 샘플에서의 수준(BASE)을 나타내고, 각각의 시간 지점은 해당 BASE 판독값으로부터의 변화를 나타낸다: 0 = v-TSST(TSST 챌린지 직후); 10, 20, 30, 40, 60 = 회복 페이즈 내의 TSST 챌린지 10, 20, 30, 40 및 60분 후.
도 5는 TSST 시험 후 가용성 CD163 수준(ng/mL)의 변화를 도시한다. 비교 및 그래프 표현 상세사항은 도 4에 대한 것과 동일하다.
도 6은 TSST 시험후 코르티솔 수준 (nmol/L)의 변화를 도시한다. 비교 및 그래프 표현 상세사항은 도 4에 대한 것과 동일하다.

예시적인 투여 형태

상기 지칭된(그리고 본원에서 참조에 의해 포함된) 제형 외에도, 하기 실시예는 본 발명에 따른 약제학적 제형 및 다른 제형을 예시한다.

실시예 A: 정제

락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU

락토스 200 mg

전분 50 mg

폴리비닐피롤리돈 5 mg

마그네슘 스테아레이트 4 mg

정제는 상기 성분을 습식 과립화하고, 뒤이어 압축함으로써 제조된다.

실시예 B: 정제 제형

하기 제형 A 및 B는 성분을 포비돈 용액에 의해 습식 과립화하고, 뒤이어 마그네슘 스테아레이트를 첨가하고 압축함으로써 제조된다.

제형 A

(a) 락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU 1x10¹⁰ CFU

(b) 락토스 B.P. 210 mg 26 mg

(c) 포비돈 B.P. 15 mg 9 mg

(d) 소듐 전분 글리콜레이트 20 mg 12 mg

(e) 마그네슘 스테아레이트 5 mg 3 mg

제형 B

(a) 락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU 1x10¹⁰ CFU

(b) 락토스 150 mg -

(c) Avicel PH 101^® 60 mg 26 mg

(d) 포비돈 B.P. 15 mg 9 mg

(e) 소듐 전분 글리콜레이트 20 mg 12 mg

(f) 마그네슘 스테아레이트 5 mg 3 mg

제형 C

락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU

락토스 200 mg

전분 50 mg

포비돈 5 mg

마그네슘 스테아레이트 4 mg

하기 제형 D 및 E는 혼합 성분을 직접 압축함으로써 제조된다. 제형 E에 사용되는 락토스는 직접 압축 형태이다.

제형 D

락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU

전호화(pregelatinised) 전분 NF15 150 mg

제형 E

락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU

락토스 150 mg

Avicel ^® 100 mg

제형 F(제어 방출 제형)

제형은 성분(하기)을 포비돈 용액에 의해 습식 과립화하고, 뒤이어 마그네슘 스테아레이트를 첨가하고 압축함으로써 제조된다.

(a) 락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU

(b) 히드록시프로필메틸셀룰로스 112 mg

(Methocel K4M Premium)^®

(c) 락토스 B.P. 53 mg

(d) 포비돈 B.P.C. 28 mg

(e) 마그네슘 스테아레이트 7 mg

방출은 약 6시간 내지 8시간의 기간에 걸쳐 발생하고, 12시간 후에 완료되었다.

실시예 C: 캡슐 제형

제형 A

캡슐 제형은 상기 실시예 B에서 제형 D의 성분들을 혼합하고, 2-부분 경질 젤라틴 캡슐로 충전함으로써 제조된다. 제형 B(하기)는 유사한 방식으로 제조된다.

제형 B

(a) 락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU

(b) 락토스 B.P. 143 mg

(c) 소듐 전분 글리콜레이트 25 mg

(d) 마그네슘 스테아레이트 2 mg

제형 C

(a) 락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU

(b) Macrogol 4000 BP 350 mg

캡슐은 Macrogol 4000 BP를 용융시키고, 용융물에서 락토바실러스 균주(들)를 분산시키고, 용융물을 2-부분 경질 젤라틴 캡슐로 충전함으로써 제조된다.

제형 D(제어 방출 캡슐)

하기 제어 방출 캡슐 제형은 압출기를 사용하여 성분 a, b 및 c를 압출하고, 뒤이어 압출물을 구형화하고 건조시킴으로써 제조된다. 이후, 건조된 펠렛을 방출-제어 막(d)으로 코팅하고, 2-조각, 경질 젤라틴 캡슐로 충전한다.

(a) 락토바실러스 균주(들) 1x10¹⁰ CFU

(b) 미세결정질 셀룰로스 125 mg

(c) 락토스 BP 125 mg

(d) 에틸 셀룰로스 13 mg

실시예 D: 분말 제형

제형 A (신속-용융 미생물 조성물)

(a) 락토바실러스 균주(들) 80 mg (바람직하게는 1x10¹⁰ CFU)

(b) 에리트리톨 450 mg

(c) 이눌린 227.5 mg

(d) 자일리톨 227.5 mg

(e) 레몬향 10 mg

(f) 이산화규소 5 mg

제형 B(신속-용융 미생물 조성물)

(a) 락토바실러스 균주(들) 80 mg (바람직하게는 1x10¹⁰ CFU)

(b) 에리트리톨 425 mg

(c) 이눌린 215 mg

(d) 자일리톨 215 mg

(e) 말토덱스트린 50 mg

(f) 레몬향 10 mg

(g) 이산화규소 5 mg

실험예 1

도입부

장기간 동안의 스트레스(만성 스트레스) 및 스트레스-관련 건강 문제는 다수의 탈공화 국가에서 우려의 근원인데, 이는 그것이 예를 들어, 개인의 웰빙, 의료 시스템에 영향을 미치고 질병결근(sickness absence)의 원인이 되기 때문이다. 스트레스-관련 건강 문제에 대한 추가 지식을 얻기 위해서, 트리어 사회 스트레스 시험(TSST: Trier Social Stress Test)은 실험실 환경에서 심리사회적 스트레스를 유도하는 데 널리 사용되는 도구이다(문헌[Kirschbaum et al, 1993, Neuropsychobiology, 28(1-2):76-81]).

이 연구의 목적은 디자인 과학부(Department of Design Sciences)(Ingvar Kamprad Design Center, Faculty of Engineering [LTH], Lund University, 스웨덴 소재)의 가상 현실 실험실에서 급성 스트레스 상황인 TSST에 노출되기 4주 전에 스트레스를 많이 받은 사람(만성 스트레스로 고통받음)이 연구 제품을 복용할 때 락토바실러스 균주가 스트레스 마커, 장 건강 및 염증에 어떻게 영향을 미치는 지를 조사하는 것이었다.

목적

1차 목적

ㆍ 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)의 섭취가 급성 스트레스(TSST)에 노출된 만성 스트레스가 있는 대상체의 혈청 코르티솔의 상승된 수준에 대응할 수 있는지 여부를 평가하기 위해서.

2차 목적

ㆍ 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)의 섭취가 급성 스트레스(TSST)에 노출된 만성 스트레스가 있는 대상체에서 인터류킨-6 및 다른 염증 마커의 증가를 감소시킬 수 있는지를 평가하기 위해서;

ㆍ 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)의 섭취가 급성 스트레스(TSST)에 노출된 만성 스트레스가 있는 대상체에서 위의 투과성(조눌린)에 영향을 미칠 수 있는지를 평가하기 위해서;

ㆍ 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)의 섭취가 급성 스트레스(TSST)에 노출된 만성 스트레스가 있는 대상체에서 생리학적 데이터, 예컨대, 맥박 및 심박수 변이도에 영향을 줄 수 있는지를 평가하기 위해서;

ㆍ 복통, 헛배부름 및 팽만감에서 시간(각각 4주 및 TSST 전/후)에 따른 변화를 평가하기 위해서;

ㆍ 연구 동안 수집된 이상 반응(AE: adverse event)의 빈도.

연구 계획

전체 연구 설계

본 연구는 만성 스트레스가 있거나 없는 건강한 성인(19 내지 35세)에서 수행된 전향적, 이중 맹검, 위약 대조, 병렬, 단일 센터 연구였다. 연구 기간은 2개페이즈로 이루어진 6주였다.

페이즈 1: 2주 동안 도입(run-in). 프로바이오틱 제품 섭취 안함.

페이즈 2: 4주 동안 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™) 또는 위약 섭취. 30±3일에 수행된 TSST 챌린지.

따라서, 2주의 도입 기간 후, 대상체를 30일 동안 1일 1회 위약 캡슐 또는 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™) 함유 캡슐을 섭취하도록 무작위화하였다. TSST 챌린지를 30±3일에 수행하였다.

연구 집단의 선택

스트레스 수준이 높은 70명의 남성 및 여성을 모집하였다.

결과를 가능한 한 비교할 수 있도록 하기 위해서, 모집된 여성을 가능하면 월경 주기의 황체기에 TSST를 만들었다. 여성에게 피임법을 사용했는지 질문하였다.

포함 기준

대상체는 다음 기준을 충족하였다:

1. 19 내지 35세;

2. 3.75 이상의 시롬-멜라메이드 번아웃 설문지(SMBQ) 점수;

3. 스웨덴어를 구어 및 서면 용어로 이해함;

4. 연구 포함 및 일련 번호 및 연구 제품(활성 또는 위약) 획득과 관련된 서면 동의서;

5. 연구 제품 도입 시작 2주 전 또는 진행 중인 전체 연구 동안 프로바이오틱 제품 섭취 없음.

제외 기준

대상체는 다음 기준 중 어느 것도 충족하지 않았다:

1. 30 초과의 BMI;

2. 임신;

3. 연구 동안 또는 연구 제품 도입 시작 전 3개월 동안 항생제 섭취;

4. 스트레스 관련 문제로 인한 이전 또는 지속적인 의료 서비스 접촉;

5. 알려진 신체적(당뇨병, 폐 또는 심혈관 질환, 체강 질환, 갑상선 문제, 위장 질환) 또는 정신 질환;

6. 향정신성 약물, 베타 차단제, 천식 또는 류마티스 약물, 스테로이드 약물 또는 코르티손을 함유한 크림의 섭취.

연구 동안 제외 기준

1. 항생제 치료;

2. 대상체가 시험 당일에 방문할 수 없었고, 새로운 날짜를 예약할 수 없었음;

3. 이상 반응- 대상체가 계속하기를 원하지 않았음.

식이 조절

연구에 참여하는 동안, 모든 대상체는 프로바이오틱스를 함유한 다른 제품을 섭취하지 않는 것과 관련된 특정 식이 규정을 따르도록 지시받았다. 연구 참가자에게 섭취하지 말아야 할 제품을 포함한 목록을 제공하였다.

치료제

치료제 투여

페이즈 1에 필요한 모든 캡슐은 방문 1에서 나누어 주었다. 남은 캡슐을 수집하고 계수하였다. 연구 제품은 외부에 포장되었고, 연구에 참여하지 않은 Probi AB의 특수 직원이 라벨링을 담당하였다.

연구 제품의 아이덴티티

연구 제품은 10¹⁰ cfu/캡슐 농도의 동결 건조된 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)를 함유한 캡슐 또는 박테리아가 없는 위약 캡슐로 이루어졌다. 캡슐에 사용된 충전제는 옥수수 전분 및 마그네슘 스테아레이트였다. 프로바이오틱 및 위약 제품 둘 다는 백색 분말이었고, 유사한 외관, 질감 및 맛을 가졌다. 프로바이오틱 혼합물은 미량의 콩을 함유하였다. 연구 제품은 캡슐을 입에 넣고 씹는 방식으로 아침 식사와 관련하여 1일 1회 복용하였다.

대상체를 치료군에 배정하는 방법

연구 제품은 대상체당 40개 캡슐의 라벨이 있는 패키지로 준비되었으며, 라벨링은 해당 무작위 목록(701, 702, ..)에 따라 수행되었다. 연구 직원은 무작위 배정된 순서대로 연구 제품을 대상체에게 제공하였다.

맹검

연구는 이중맹검이었고, 연구에 참여한 대상체, 연구 직원, Probi 직원은 각각의 대상체에게 어느 제품이 배포되었는지 알지 못했다. 코드를 깨는 것은 비상 상황에서 허용되었지만, 연구 중에 맹검이 파괴되지 않았다.

사전 및 동반 의약

연구 동안 의약이 허용되었고, 연구 일지에 기록하였다.

치료 순응도

연구가 끝날 때, 참가자에게 올바른 양의 캡슐을 섭취했는지 확인하기 위해 남은 캡슐을 돌려달라고 요청하였다. 참가자는 또한 연구 일지에 연구 제품의 섭취량을 기록해야 했다. 프로토콜에 따라 연구 제품의 80%를 초과하게 복용한 대상체에 대한 분석을 수행하였다.

효능 및 안전성 변수

연구 흐름도

각각의 방문에서 수행된 활동은 연구 흐름도에 제시되어 있다(표 1).

효능

1차 평가변수

1차 평가변수는 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)의 섭취가 급성 스트레스(TSST)에 노출된 만성 스트레스가 있는 대상체의 혈청 코르티솔의 상승된 수준에 대응할 수 있는지 여부를 평가하는 것이었다. 코르티솔을 방문 2에서 8회 측정하였다; TSST 챌린지 전 2회(BASE, PREP), 챌린지 직후(R+0) 및 회복 페이즈 동안 5회(R+10, R+20, R+30, R+40, R+60).

2차 평가변수

시롬-멜라메이드 번아웃 설문지(SMBQ)

SMBQ를 모집 단계에서 그리고 개입 후 TSST 챌린지 전에 측정하였다(방문 2, 28일).

심박수(HR) 및 고주파수 심박수 변이도(HF-HRV)

심박수(HR) 및 고주파수 심박수 변이도(HF-HRV)를 방문 2에서 TSST 챌린지 동안 측정하였다. 각각의 조건에서 5분 동안 측정을 수행하였다: BASE, PREP, SPEECH, MATH 및 4개의 후속 회복 기간 동안(R+10,… R+40), 즉 8개 조건.

장 투과성(조눌린)

혈청 조눌린을 방문 2에서 3회 측정하였다: TSST 챌린지(BASE) 전에 1회, 회복 페이즈 동안 2회(R+10, R+60).

염증 마커

CRP 및 IL-6과 같은 상이한 염증 마커를 방문 2에서 8회 혈장에서 측정하였다; TSST 챌린지 전 2회(BASE, PREP), 챌린지 직후(R+0), 회복 페이즈 동안 5회(R+10, R+20, R+30, R+40, R+60).

장 기능

방문 1에서, 장 기능에 대한 기본 질문을 받았다. 복통, 헛배부름 및 팽만감에 대한 시각적 유사체(visual analogue)(VAS) 척도(0 내지 10)를 작성하여 장 기능에 대한 추가 평가를 3회 수행하였다: 방문 1에 1회 및 방문 2에 2회(TSST 챌린지 전 및 후).

트리어 사회 스트레스 시험(TSST)

트리어 사회 스트레스 시험(TSST)은 실험실 설정에서 사회적 스트레스를 유도하기 위해 널리 사용되는 프로토콜이다(상기 문헌[Kirschbaum et al, 1993]). 간략하면, 시험 참가자에게 위원회 앞에서 연설을 하고 수학 작업을 수행하도록 요청한다. 위원회는 시험 참가자에게 어떠한 감정적인 반응도 보이지 않아 매우 스트레스가 많은 상황을 만드는 3명의 배우로 구성된다. 본 연구에서, TSST는 문헌[Jonsson et al (2010, Psychoneuroendocrinology, 35(9):1397-1403)]에 따라 가상 현실 환경(V-TSST)에서 수행하였고, 코르티솔의 주간 변동을 회피하기 위해서 오후(1시 내지 5시)에 수행하였다. VR-TSST는 3개의 후면 투영 벽(4 m x 3 m)과 1개의 바닥 투영이 있는 CAVE™ 시스템(일리노이 대학교의 전자 시각화 연구소, 동굴 자동 가상 환경(Cave Automatic Virtual Environment))으로 생성하였다. 3D 비전의 경우, 수동 스테레오스코피를 사용하였다. 소프트웨어 Autodesk1 3 ds Max1 9 및 EON Professional 5.5(EON Reality, Inc.)를 사용하여 2개의 가상 공간을 생성하였다: 테이블, 벽에 걸린 그림, 의자 2개, 작은 테이블 및 반대쪽 벽에 문이 있는 대기실. 문 뒤에는 위원회를 구성하는 1명의 여성 및 2명의 남성(aXYZ 디자인 회사에서 설계)이 있는 방이 있었다(상기 문헌[Jonsson et al, 2010]; [Wallergard et al, 2011, Presence, 20(4):325-336] 참고). 위원회로부터의 의견 및 지침은 표준 TSST 프로토콜(상기 문헌[Kirschbaum et al, 1993])에 따라 미리 녹음된 음성으로 제공된다. 의견은 시험 참가자가 볼 수 없는 원격 키보드를 사용하여 시험 리더가 활성화한다. 예를 들어, 참가자가 프레젠테이션을 계속하는 데 어려움이 있으면 중년 남성이 "시간 남았습니다" 또는 "계속 진행하세요. 시간이 되면 알려드리겠습니다"라고 말한다. V-TSST는 건강한 여성 및 남성에서 신뢰할 수 있는 코르티솔 및 심혈관 반응을 유발하는 것으로 나타났다(문헌[Fich et al, 2014, Physiol Behav, 135:91-97]; 상기 문헌[Jonsson et al, 2010]; 문헌[Jonsson et al, 2015, Physiol Behav, 151:327-337]).

시롬-멜라메이드 번아웃 설문지(SMBQ)

SMBQ는 번아웃 증후군의 4가지 차원의 번아웃 증후군을 추정하는 22개의 항목으로 이루어진다: 번아웃, 긴장, 무기력 및 인지적 피로(문헌[Melamed et al, 1992, Behav Med, 18(2):53-60]). SMBQ 글로벌 점수는 4가지 차원의 평균으로 표현된다. 스웨덴어 번역은 문헌[Grossi et al (2003, J Psychosom Res, 55(4):309-16)] 및 문헌[Lundgren-Nilsson et al (2012, BMC Public Health, 12:1)]에 의해서 이미 검증되었다. SMBQ는 포함 시 및 VSST 실험이 수행된 날에 측정되었다.

스피버거 상태 및 특성 불안 척도(STAI: Spielberger state and trait anxiety inventory)

STAI(STAI-S)의 상태 척도는 V-TSST에 대한 참가자의 경험을 추정하기 위해 BASE 전과 회복 60분 후에 평가하였다. 2차 평가에서, "현재 기분이 어떤지 묻는 질문에 답하시오"에서 "V-TSST 동안 기분이 어땠는지에 대한 질문에 답하시오"로 지시가 약간 변경되었다.

심박수(HR)

심전도(ECG) 및 호흡은 ML866 Power Lab 데이터 수집 시스템을 사용하여 1 kHz에서 기록하고, 소프트웨어 Chart 5(ADInstruments Pty Ltd.) 및 MATLAB(MathWorks, Inc., 미국 매사추세츠주 나틱 소재)을 사용하여 분석하였다. ECG는 일회용 전극(Lead II Einthoven)을 사용하여 평가하였고, 호흡은 가슴 위의 스트레인 게이지를 사용하여 평가하였다. 평균 심박수(HR)를 각각의 조건에서 5분 동안 분석하였다: BASE, PREP, SPEECH, MATH 및 4개의 후속 휴식 기간 동안(R+10,… R+40), 즉 8개 조건(상기 문헌[Jonsson et al, 2010] 참고). 하기 HF-HRV에도 동일하게 적용한다.

고주파 수심박수 변이도(HF-HRV)

R-R 간격을 타코그램(ms)으로 변환하고, 4 Hz에서 선형으로 보간하였다. 데이터를 더 선형으로 추세 제거하였고, 고역통과 필터링(2차 버터워스(Butterworth) 필터, 0.10 Hz)을 통해 호흡 주파수 아래의 변동을 제거하였다. 각각의 5분 시퀀스에 대해, 다중 피크 일치 창을 적용한 후 고속 푸리에 변환(1024포인트)을 사용하여 50% 중첩이 있는 128포인트(32초)의 17개의 분절에 대해 HRV 전력 스펙트럼을 계산하였다. 피크 일치 다중 창(PM MW) 방법은 스펙트럼이 피크를 포함할 것으로 예상될 수 있을 때 스펙트럼 추정의 평균 제곱 오차를 최적화한다(문헌[Hansson, 1999, IEEE Trans Signal Processing 47:1141-1146]; 문헌[Hansson and Salomonsson, 1997, IEEE Trans Signal Processing 45: 778-781]). PM MW 방법은 HRV 스펙트럼에 대해 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 것으로 나타났다(문헌[Hansson-Sandsten and Jonsson, 2007, Transactions Biomed Engineering, 54: 1770-1779]; 문헌[Hansson and Jonsson, 2006, Medical Engineering & Physics, 28: 749-761]). 전력 스펙트럼의 적분을 호흡과 관련된 고주파수(HF) 영역(0.12 내지 0.4 Hz)에서 연구하였다(문헌[Berntson et al., 1997, Psychophysiology, 34:623-648]). 데이터를 정규 분포에 접근하도록 로그 변환(ln)하였다. 호흡 측정은 호흡수가 HF 범위 내에 있도록 하기 위해 사용하였다.

생화학적 분석

활성 연구 제품 대 위약의 섭취를 확인하기 위해 경구 락토바실리(lactobacilli)를 분석하였다. 시험 대상체로부터의 타액을 방문 1 및 방문 2에 수집하였다. 타액 및 2x Hogness Freezing Media(9.8mM K₂HPO₄, 2.9mM KH₂PO₄, 10.2mM C₆H₅Na₃O₇ ㆍ 2(H₂O), 2.0mM MgSO₄ ㆍ 7(H₂O), 24.2% 글리세롤)를 같은 양으로 혼합한 후 냉동하고, 80℃에서 저장하였다.

말초 정맥혈을 8회 수집하였다: TSST 챌린지 전 2회(BASE, PREP), 챌린지 직후(TSST, SPEECH+MATH) 및 회복 페이즈 동안 5회(REST+10분, R+20, R+30, R+40 및 R+60). 혈청 및 혈장(코르티솔 및 CRP 분석용 혈장)을 실온에서 2000 x g에서 10분 동안 분리하였다. 사이토카인 분석을 위한 혈장을 빙욕에서 유지시키고, EDTA를 항응고제로 사용하여, 샘플링 후 30분 이내에 2000 x g에서 4℃에서 10분 동안 분리하였다(Eppendorf Centrifuge 5702R).

타액, 혈청 및 혈장 샘플을 드라이아이스에서 동결하고, 그 다음 추가 분석 시까지 80℃에서 저장하였다. 혈청 중의 코르티솔 농도를 루테늄 유도체를 기반으로 하는 전기화학발광 면역검정(ECLI: Electrochemiluminiscence Immunoassay) 검출 기술을 사용한 1단계 경쟁 분석으로 결정하였고, Labmedicin Skane(스웨덴 리젼 스케인 소재의 대학 및 지역 연구소)에서 수행하였다. 조눌린을 ELISA 방법(K5601, Immundiagnostik AG, 독일 벤샤임 소재), 검출 범위 0.25 내지 64ng/ml를 사용하여 혈청에서 분석하였다. 사이토카인 프렉탈카인, IFN-γ, IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α를 멀티플렉스 기술(U-PLEX 인간 7-플렉스[프렉탈카인, IFN-γ, IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α], MesoScale Discovery, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)을 사용하여 분석하였고, 검출 한계는 각각 102 pg/mL, 1.7 pg/mL, 0.14 pg/μl, 0.15 pg/mL, 0.33 pg/mL, 0.15 pg/mL 및 0.51 pg/mL였다. 혈장 중의 가용성 CD163을 ELISA 방법(DY1607, R&D Systems, 미국 미네아폴리스 소재)을 사용하여 분석하였다.

안전성

이상 반응의 보고

이상 반응(AE)은 의약품을 투여받은 환자 또는 임상 시험 대상체에서의 임의의 예상치 못한 의학적 사례이며, 반드시 본 치료와 인과 관계를 갖는 것은 아니다. 따라서 AE는 의약(조사) 제품의 사용과 일시적으로 관련된 임의의 바람직하지 않고 의도하지 않은 징후(비정상적 실험실 소견 포함), 증상 또는 질환일 수 있다.

중대한 이상 반응(SAE)은 임의의 용량에서 발생하는 다음의 유해한 의학적 사례이다:

- 사망에 이르게 하는 것;

- 생명을 위협하는 것('중대한'의 정의에서 '생명을 위협하는'이라는 용어는 사건 당시 환자가 사망할 위험이 있는 사건을 지칭하며, 가설적으로 더 심해지면 사망을 초래할 수 있는 사건을 지칭하지 않음);

- 입원환자 입원 또는 기존 입원의 연장이 필요한 것;

- 지속적인 또는 상당한 장애/무능력을 초래하는 것;

- 선천적 기형/선천적 결함인 것;

- 상기 사건 중 하나를 예방하기 위해 개입이 필요한 중요한 의학적 사건.

이상 반응 인과관계

조사자는 전체로서의 연구 제품과 관련하여 AE의 인과관계를 평가하려고 노력해야 한다. 하기 카테고리를 사용하였다:

가능성 높음: AE와 연구 제품 투여 간의 시간상 명백한 관계. AE와 연구 제품 간의 관계는 이미 알려져 있거나 예상된다. 연구 제품을 중단하거나 투여량을 줄인 후 증상이 사라지거나 증상이 감소한다. 부작용은 환자의 임상적 상태에 의해서 설명될 수 없다.

가능성 있음: AE와 약물 투여 간의 시간상 명백한 관계. AE와 약물 간의 관계는 이미 알려져 있거나 예상된다. 부작용은 또한 다수의 다른 요인에 의해 설명될 수 있다.

가능성 없음: AE와 연구 제품 투여 간의 시간 관계는 가능성이 높지 않음. 부작용은 다른 요인에 의해 설명되기는 하지만 연구 제품과의 관계는 분명하게 배제될 수는 없다.

검출, 보고 및 책임

AE 보고 의무는 연구에서 대상체의 등록과 함께 시작되었다. 조사자는 발병 날짜, 중단 날짜를 기재한 대상체의 임상 보고서에 모든 AE를 기록할 의무가 있다.

분석될 데이터 세트

TSST 챌린지를 경험한 모든 올바르게 포함되고 무작위화된 대상체는 전체 분석 세트(FAS)에 포함되었으며, 연구 제품의 적어도 하나의 캡슐을 복용한 모든 무작위화된 대상체는 안전성 세트에 포함되었다.

대상체가 프로토콜 순응 세트(PPS: per-protocol set)에 포함되기 위해서는 다음 기준을 충족해야 했다:

ㆍ TSST 챌린지를 페이즈 2에서 30일±3일에 수행하였음;

ㆍ 연구 제품의 적어도 80%를 복용하였음;

ㆍ 연구 동안 항생제를 복용하지 않았음;

ㆍ 연구 시작 후 다른 프로바이오틱 제품을 복용하지 않았음(소량 허용).

요약 통계

일반적으로 요약 통계에 의해서 데이터를 요약하였다. 관찰치, 평균값, 표준편차, 중앙값, 사분위수, 최소값 및 최대값을 나타내었다(Statistical Analysis Report, M Åstrom, 2018).

요약 통계를 군별로 나타낸다.

효능 분석

1차 효능 분석

1차 평가변수는 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)의 섭취가 급성 스트레스(TSST)에 노출된 만성 스트레스가 있는 대상체의 혈청 코르티솔의 상승된 수준에 대응할 수 있는지 여부를 평가하는 것이었다.

귀무 가설은 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)를 복용한 군과 위약을 복용한 군 간에 코르티솔 수준 차이가 존재하지 않는다는 것이었다.

대립 가설은 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)를 복용한 군과 위약을 복용한 군 간에 코르티솔 수준 차이가 존재한다는 것이다.

분석은 CONDITION을 반복 인자로서, 개입(HEAL 9 및 PLACEBO)을 군 간 인자로서 사용하여 반복 측정 ANOVA에 기초하여 수행하였다. 따라서 시간 경과에 따른 변화 분석(CONDITION)을 또한 포함하였다. AGE 및 BMI를 공변량으로 사용하고, 단계적으로 입력하였다. 각각의 모델에 크게 기여하지 않은 임의의 공변량을 제거하고, 보고하지 않았다. 구형성(sphericity) 가정을 충족하기 위해서, 보정된 p-값, 보정되지 않은 df 및 ε를 사용하여 Greenhouse-Geisser 보정을 수행하고, 보고하였다. 중요한 옴니버스 효과를 다항식 대조를 사용하여 추적하였다.

단일 시점을 사용한 HEAL 9와 PLACEBO 간의 비교를 또한 탐색적 분석으로 수행하였다.

2차 효능 분석

2차 목적은 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)의 섭취가 급성 스트레스(TSST)에 노출된 만성 스트레스가 있는 대상체에서 조눌린, 염증 마커, 맥박 및 심장 박동의 증가를 감소시킬 수 있는 지를 평가하는 것을 포함하였다. 1차 변수에 사용된 것과 동일한 통계 방법을 사용하였다.

또 다른 2차 목적은 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™) 또는 위약 섭취 후 복통, 헛배부름 및 팽만감의 시간 경과에 따른 변화를 평가하는 것이었다. TSST 챌린지 전 및 후의 장 기능 변화는 Wilcoxon 순위 합계 시험(개입 군의 비교) 또는 Wilcoxon 서명 순위 시험(치료 내 전/후 비교)를 사용하여 분석하였다.

일부 변수 간의 상관 관계를 Spearman 순위 상관 관계 시험을 사용함으로써 수행하였다.

연구 환자

대상체의 배치

70명의 대상체를 연구에 포함시켰다(표 2). 대상체 중 1명은 임의의 연구 제품을 소비하기 전에 연구를 종료하였고, 제외된 대상체 중 4명은 일지를 반환하지 않았기 때문에, 이들 대상체에 대한 안전성을 확인할 수 없었다. 65명의 대상체를 안전성 세트에 포함시켰고, 63명의 대상체를 FAS에 포함시켰다. FAS에서 제외된 7명 중에서, 대상체 중 3명은 포함 시점과 TSST 챌린지 사이에 항생제를 복용하였고, 대상체 중 2명은 시험일에 방문할 수 없었고, 1명은 이상반응을 보고하여 계속하기를 원하지 않았다. 대상체 중 5명은 33일 넘게 연구 제품을 복용하였기 때문에 제외하였고, 1명의 대상체는 비교 불가능한 TSST로 인해 제외되어 57명의 대상체가 PPS에 남았다.

결과

인구통계 및 기준 데이터

FAS 모집단은 평균 연령 23.5세, 평균 BMI 23.4인 63명의 대상체로 구성되었다(표 3). PP 모집단은 57명의 대상체(33일 초과의 개입 기간으로 5명의 대상체, 1시간 동안 TSST 시험의 지연지연으로 1명의 대상체가 제외되었음)로 이루어졌다.

프로바이오틱의 사전 복용

방문 1 이전에 프로바이오틱스를 섭취한 대상체는 거의 없었음(70명 중 4명, 6%).

치료 순응도

대상체는 연구 제품의 섭취를 매일 일지에 기록하였다. 추가로, 각각의 대상체에게 분배하고, 반환한 캡슐의 수를 방문 2에서 문서화하였다. 순응도의 요약을 표 4에 제시한다. 순응도는 92% 내지 107% 범위로 양호하였기 때문에, 어떠한 대상체도 80% 미만의 순응도로 인해서 프로토콜 순응도 분석으로부터 제외되지 않아야 했다.

타액 중의 락토바실리 수치

시작 시에, 개입이 시작되기 전에, 대상체의 76%가 타액에서 검출 가능한 수준의 락토바실리를 가졌다. LPHEAL9를 복용한 군에서 타액 중의 락토바실리 수치는 개입 전 7.3 log10 cfu/ml의 중앙값에서 개입 후 9.3 log10 cfu/ml로 유의하게 증가하였다(표 5). 4주 섭취 후, 타액 중의 락토바실리 수준은 위약군에 비해 이 군에서 유의하게 더 높았다.

SMBQ 글로벌 점수 및 상태 특성 불안 척도(STAI-S: State-Trait Anxiety Inventory)

포함 시에는 모든 대상체는 SMBQ 설문지(전체 점수 3.75 이상)에 따라 스트레스를 상당히 많이 받는 것으로 분류되어야 했다. 4주 개입 후 SMBQ 글로벌 점수는 두 군 모두에서 유의하게 감소했지만 어느 시점에서도 군 간의 유의한 차이는 발견되지 않았다(표 6). 대상체의 약 3분의 1은 개입 후 SMBQ 글로벌 점수가 3.75 미만이었으며, 따라서 더 이상 높은 스트레스를 받는 것으로 분류되지 않았다. 개입 전 SMBQ의 전체 점수는 스트레스를 많이 받은 대상체에 대한 TSST 연구에서 이전에 관찰된 것과 거의 동일하였다(평균값 4.64, 문헌[Linninge et al, 2018, Biol Psychol, 138:48-55]).

L. 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™) 군과 위약군 모두 TSST 시험(p<0.0001)와 관련된 상태 특성 불안 척도(STAI-S)에 의해서 측정된 유도 급성 스트레스 효과를 보고하였다. 시험 전 및 후의 STAI-S에 대한 점수(각각 40점 및 54점)는 스트레스를 많이 받은 대상에 대한 TSST 연구에서 초기에 관찰된 것과 거의 동일하였다(상기 문헌[Linninge et al, 2018]).

효능 결과

1차 효능 분석 - 혈청 코르티솔 수준

CONDITION(즉, 시점)(F(6, 342) = 21.42, p < 0.0001, η² = 0.27, ε = 0.409)의 주 효과는, 코르티솔이 스트레스 유도 후 그리고 10분 회복 후 증가하였고, 그 다음 시간의 함수로서 서서히 감소하였다는 것을 나타내었다(선형 대비 F_linear(1, 57) = 18.72, p < 0.0001, η² = 0.25, 2차 대비 F_quad(1, 57) = 24.35, p < 0.0001, η² = 0.30, 및 3차(cubic) 대비 F_cubic(1, 57) = 23.10, p < 0.0001, η² = 0.29, 도 1 참조). 다른 어떠한 유의한 효과도 발견되지 않았다.

시험 전보다 시험 후 더 높은 코르티솔 수준을 갖는 PP 대상체의 사후(Post hoc) 분석(대상체의 77%, LPHEAL9 n=23, PLACEBO n=21)은 두 군 모두에 대해서 기준선, TSST 시험 후 0분 및 10분에 비해 코르티솔 수준의 유의하게 증가를 나타내었다. 위약군의 경우, 코르티솔 수준은 또한 시험 전에 비해서 20분 및 30분에 유의하게 증가하였다. 어느 시점에서든 군 간에 유의한 차이는 없었지만, 시험 후 10분에는 PLACEBO 군에 비해 LPHEAL9 군에서 더 낮은 코르티솔 수준에 대한 경향이 존재하였다(p=0.07).

2차 효능 분석 - 염증 마커 및 조눌린

혈장 중의 가용성 프렉탈카인

프렉탈카인은 증가하고, V-TSST 후 10분에 정점에 도달한 다음 이후 20분 동안 점차적으로 감소하였다(도 2 참고). 그 후, 남은 회복 기간 동안 프렉탈카인이 다시 증가하였다, F(6, 318) = 14.21, p < 0.0001, η² = 0.21, ε = 0.737, F_linear(1, 53) = 7.12, p < 0.010, η² = 0.12 및 F_cubic(1, 53) = 39.61, p < 0.0001, η² = 0.43.

GROUP(즉, 치료군)의 주요 효과를 발견하였다, F(1, 53) = 9.41, p = 0.003, η² = 0.15. 기준선과 비교하여 PLACEBO 군의 프렉탈카인 수준은 더 많이 증가하였고, LPHEAL9 군의 프렉탈카인 수준보다 높게 유지되었다. CONDITION*GROUP 상호작용 효과는 유의하지 않았다.

단일 시점을 비교하는 경우에 군 효과가 또한 확인되었다. 프렉탈카인 수준은 시험 20분 및 60분 후 LPHEAL19 군이 PLACEBO 군보다 유의하게 낮았다.

혈장 중의 가용성 CD163(sCD163)

CONDITION의 주요 효과는 sCD163 값이 준비 시부터 40분 회복 후까지 감소되었다, F(5, 295) = 10.93, p < 0.0001, η² = 0.16, ε = 0.898, 및 F_linear(1, 59) = 38.08, p < 0.0001, η² = 0.39(도 3 참조).

또한 GROUP*CONDITION은 유의하였다, F(5, 295) = 3.07, p = 0.013, η2 = 0.05, ε = 0.898, F_quad(1, 59) = 12.87, p < 0.001, η2 = 0.18. 기준선 후 위약군의 sCD163 값은 준비 시에 감소하였고, 그 다음 증가하였으며 스트레스 유도 후 최대치에 도달하였다. 그 후, 이 값은 시간의 함수로서 서서히 감소하였다. 활성군에 대한 sCD163 값은 준비 동안 증가하였고, 그 다음 회복 동안 감소하였다.

단일 시점 비교는, sCD163 수준이 시험 0, 10, 20 및 60분 후 LPHEAL19 군이 PLACEBO 군보다 유의하게 낮았다는 것을 나타내었다.

sCD163에 대한 결과는 프렉탈카인에 대한 결과를 확인해 주는데, 그 이유는 sCD163 및 프렉탈카인 둘 다가 ADAM-17 프로테아제에 의해서 방출되기 때문이다.

혈장 IFN-γ

초기의 약간의 감소 후 IFN-γ는 증가하고, 스트레스 유도 후 10분에 최대값에 도달하였고, 그 후 그것은 회복 마지막 30분 동안 기준선 수준보다 낮게 감소하였다, F(6, 348) = 10.66, p < 0.0001, η² = 0.16, ε = 0.702, F_quad(1, 58) = 4.87, p = 0.031, η² = 0.08, 및 F_cubic(1, 58) = 41.40, p < 0.0001, η² = 0.42. 다른 어떠한 유의한 효과도 발견되지 않았다.

혈장 IL-1베타

IL-1베타의 수준은 유의하게 변화되지 않았고, 군 간에 어떠한 유의한 차이도 발견되지 않았다.

혈장 IL-10

어떠한 유의한 효과도 발견되지 않았다.

혈장 IL-6

이 결과는 CONDITION의 유의한 주요 효과를 나타내었다, F(6, 330) = 86.74, p < 0.0001, η² = 0.61, ε = 0.502, F_linear(1, 55) = 173.70, p < 0.0001, η² = 0.76, 및 F_cubic(1, 55) = 19.77, p < 0.0001, η² = 0.26. 준비 후, IL-6은 다소 가파르게 증가하기 시작하였다. 10분 회복 후, 그것은 40분 회복 시까지 덜 가파르게 계속 증가하였고, 그 후 보다 가파르게 다시 증가하였다. 다른 어떠한 유의한 효과도 발견되지 않았다.

혈장 IL-8

CONDITION의 주요 효과가 관찰되었다, F(6, 354) = 9.92, p < 0.0001, η² = 0.14, ε = 0.831. 준비 조건 동안 IL-8 수준은 기준선 동안보다 약간 더 낮았다. 그 다음 IL-8 수준은 V-TSST에서 증가하였고, 그 후 30분 회복 시까지 감소하였고, 그 다음 40분 회복 후 두 번째로 증가하였다, F_quad(1, 59) = 14.79, p < 0.001, η² = 0.20, 및 F_cubic(1, 59) = 16.35, p < 0.0001, η² = 0.22.

또한 GROUP의 주요 효과는 유의하였다, F(1, 59) = 4.26, p = 0.043, η² = 0.07. LPHEAL19 군에서 IL-8 수준은 PLACEBO 군의 대상체보다 더 크게 증가하였고, 나머지 회복 기간 동안 더 높게 유지되었다. CONDITION*GROUP 상호작용 효과는 유의하지 않았다.

혈장 TNF-α

CONDITION의 주요 효과는 유의하였다, F(6, 348) = 18.38, p < 0.0001, η² = 0.24, ε = 0.819. 시작 시 그리고 V-TSST의 약간의 감소 후에, TNF-α 수준은 증가하였고, 회복 10분 후 최대치에 도달하였다. 그 다음, 이 수준은 신속한 증가가 일어난 경우 회복 40분까지 서서히 감소하였다, F_linear(1, 58) = 8.32, p = 0.005, η² = 0.13, F_quad(1, 58) = 7.96, p = 0.007, η² = 0.12, 및 F_qubic(1, 58) = 64.61, p < 0.0001, η² = 0.53. 다른 어떠한 유의한 효과도 발견되지 않았다.

혈청 조눌린

어떠한 유의한 효과도 발견되지 않았다.

2차 효능 분석 - 맥박 및 심박수 변이도

맥박수(HR)

CONDITION의 주요 효과는 유의하였다, F(6, 330) = 107.49, p < 0.0001, η² = 0.66, ε = .44, Fl_inear = (1, 55) = 157.37, p < 0.0001, η² = 0.74, F_quad(1, 55) = 18.94, p < 0.0001, η² = .26, F_cubic(1, 55) = 115.22, p < 0.0001, η² = 0.68. 기준선 후, HR은 증가하였고, SPEECH에서 최대값이었고, 그 후 그것은 대략 기준선 수준에서 유지되었다.

심박수 변이도(HF-HRV)

HF-HRV는 PREP, SPEECH 및 MATH 동안 감소하였고, 이어서 초기 10분 회복 동안 증가하였다. 그 다음, 그것은 나머지 회복 기간 동안 약간 감소하였다. F(3, 330) = 6.12, p = 0.001, η² = 0.10, ε = 0.46, F_linear(1, 55) = 8.09, p = 0.006, η2 = 0.13, 및 F_quad(1, 55) = 13.32, p = 0.001, η² = 0.20.

2차 효능 분석 - 장 기능

복통, 헛배부름 및 팽만감을 3회 평가하였다: 연구 제품 섭취 전, TSST 시험 전 개입 기간 후, TSST 시험 후. 장 기능에서 군 간에는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.

안전성 평가

위장 이상 반응이 21명의 대상체에서 보고되었다(32%). 이상 반응 대부분은 경증이었고, 연구 제품의 섭취와 관련될 가능성이 있었다(표 7). 보고된 위장관 이상 반응에서는 군 간에 차이가 없었고; LPHEAL9 군에서는 9명의 대상체에서 16건의 사건이 보고되었으며, 위약군에서는 12명의 대상체가 20건의 사건을 보고하였다. 가장 흔한 위장관 이상 반응은 복통(8건)이었고, 그 다음이 팽만감(7건) 그리고 꼬르륵 거리는 위(rumbling stomach) 및 메스꺼움(각각 5건)이었다.

위약군의 1명의 대상체는 TSST 시험이 끝난 직후에 스트레스 관련 중대한 이상 반응을 가졌다. 대상체는 기절하여 넘어져서 어깨가 탈골되었다. 대상체는 어깨를 맞추기 위해서 병원을 방문해야 했다. 대상체는 1개월 전에도 이를 경험하였지만, 포함 동안 연구 직원에게 이를 보고하지 않았다. 이 사건은 연구 제품의 섭취와 관련될 가능성이 낮았다.

토의 및 전체 결론

시험에 이르기까지 만성 스트레스가 있는 개인에서, TSST로 인한 급성 심리사회적 스트레스 에피소드는 락토바실러스 균주 치료군에 비해 위약군에서 더 높고 더 긴 코르티솔 방출을 초래하였다. 따라서, 락토바실러스 균주 (L. 플란타룸 DSM 15312)로의 사전치료는 위약 대조군에 비해 급성 심리사회적 스트레스로 인한 코르티솔 방출을 감소시켰다.

최초로, 급성 심리사회적 스트레스의 에피소드가 프랙탈킨의 방출을 유발한다는 것이라고 결정되었다. 급성 심리사회적 스트레스(TSST) 에피소드에 노출된 만성 스트레스가 있는 개인에서, 회복 페이즈 동안 10분에 프렉탈카인의 방출이 관찰되었으며, 그 다음 회복 페이즈의 60분에 추가 방출이 관찰되었다. 락토바실러스 균주 (L. 플란타룸 DSM 15312)로의 사전치료는 위약 대조군과 비교하여 프렉탈카인 수준(가용성 프렉탈카인의 방출)을 크게 감소시켰다.

만성 스트레스가 있는 개인에서, TSST로 인한 급성 심리사회적 스트레스 에피소드는 위약 대조군의 기준선과 비교하여 가용성 CD163의 혈장 수준을 증가시켰다. 그러나, 락토바실러스 균주 (L. 플란타룸 DSM 15312)로의 사전치료는 시험 중 및 시험 후에 이러한 증가를 방지할 수 있다. 따라서, sCD163에 대한 결과는 프렉탈카인 및 sCD163이 모두 ADAM17 프로테아제에 의해 방출되기 때문에 프렉탈카인의 급성 심리사회적 스트레스 유발 방출에 대한 락토바실러스 균주 (L. 플란타룸 DSM 15312)의 효과를 확인하는 것으로 보인다.

따라서, 락토바실러스 투여, 특히 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)는 인간의 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과, 특히 혈장 중의 상승된 수준의 코르티솔, 가용성 프렉탈카인 및 가용성 CD163을 감소 및/또는 예방하는 데 유용하다.

실험예 2

도입부

실험예 1에서 관찰된 락토바실러스 치료의 긍정적인 효과가 만성 스트레스의 맥락에서 급성 심리사회적 스트레스에 국한되는지, 또는 급성 심리사회적 스트레스를 경험하는 모든 개인에게 혜택을 줄 것으로 기대할 수 있는지 확인하기 위해 본 발명자들은 실험예 1에서 TSST 시험 당일 만성 스트레스로 정의되지 않은 개인으로부터의 추가 데이터 분석을 수행하였다.

방법

방법의 상세사항은 모두 실험예 1에 따른다. 그러나, 실험예 1에서는 TSST 시험 당일 스트레스가 낮은 대상체 또는 스트레스가 높은 대상체의 혼합이 포함되었다. 실험예 2는 TSST 시험 당일 SMBQ 점수가 3.75 이상이었던 실시예 1의 개인(이러한 개인은 "높은 스트레스"[HS] 대상체로 지정됨)와 TSST 시험 당일 SMBQ 점수가 3.75 미만이었던 실시예 1의 개인(이러한 개인은 "낮은 스트레스"[LS] 대상체로 지정됨)에 대한 별도의 분석을 포함한다.

결과

시험 당일 활성(L. 플란타룸 DSM 15312 [HEAL 9™])군 내의 9명의 대상체 및 위약군 내의 12명 대상체는 SMBQ 점수가 3.75 미만이었고, LS 대상체로 지정되었다.

HS 및 LS 대상체에서 프렉탈카인, 가용성 CD163 및 코르티솔의 수준만을 하기 표 8 내지 표 10에 나타낸다.

혈장 중의 가용성 프렉탈카인

만성적으로 스트레스를 받는 대상체(SMBQ 값 3.75 이상, n=42)와 LS 대상체(SMBQ 값 3.75 미만, n=21)(치료군 병합) 간에는 어떤 시점에서도 유의한 차이가 없었다. 프렉탈카인 수준은 시험 30분 후 위약군 내의 해당 대상체에 비해 LP HEAL9을 복용한 LS 대상체에서 유의하게 낮았다. 도 4 및 표 8 참조.

혈장 중의 가용성 CD163

마지막 시점(p=0.021)에서 만성 스트레스를 받은 대상체(SMBQ 값 3.75 이상)과 LS 대상(SMBQ 값 3.75 미만)(각각 -12.30 및 10.81)(치료군 병합) 간에 유의한 차이가 존재하였다. LP HEAL9를 복용한 LS 대상체의 경우 sCD163 수준은 시험 후 0분 및 10분 후에 위약군의 해당 대상체에 비해 유의하게 낮았다. 도 5 및 표 9 참조.

혈청 코르티솔

만성적으로 스트레스를 받는 대상체(SMBQ 값 3.75 이상, n=42)와 LS 대상체(SMBQ 값 3.75 미만, n=21)(치료군 병합) 간에는 어떤 시점에서도 유의한 차이가 없었다. LS 대상체의 경우, 시험 10분 후 LP HEAL9 군과 위약군 사이에는 코르티솔의 유의한 차이가 존재하였다(p=0.025). 도 6 및 표 10 참조.

Claims (31)

1. 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법으로서, 인간에게 적어도 하나의 락토바실러스(Lactobacillus) 균주의 유효 용량을 투여함으로써 치료하는 것을 포함하되, 유해 효과는 가용성 프렉탈카인(fractalkine)의 상승된 수준인, 방법.
2. 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법으로서, 인간에게 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량을 투여함으로써 치료하는 것을 포함하되, 적어도 하나의 유해 효과는 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준 및 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 추가 유해 효과인, 방법.
3. 제2항에 있어서, 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 추가 유해 효과는 스트레스의 생화학적 및/또는 생리학적 지표 중 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 생화학적 지표는 하나 이상의 사이토카인, 특히 염증성 사이토카인 및 바람직하게는 코르티솔 및/또는 가용성 CD163 중 하나 이상의 증가된 수준으로부터 선택되는, 방법.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 유해 효과는 가용성 CD163의 증가된 수준인, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준은 가용성 프렉탈카인의 증가된 혈장 수준인, 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료될 인간은 만성 스트레스를 갖는, 방법.
8. 제7항에 있어서, 만성 스트레스는 시롬-멜라메이드 번아웃 설문지(Shirom-Melamed Burnout Questionnaire)에서 3.75 이상의 점수로 제시되는, 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량은 용량당 약 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10¹⁴ 콜로니 형성 단위(CFU: colony forming units)인, 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량은 용량당 약 1 x 10⁸ 내지 약 1 x 10¹² CFU인, 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량은 용량당 약 1 x 10⁹ 내지 약 1 x 10¹¹ CFU인, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량은 용량당 1 x 10¹⁰ CFU인, 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량은 적어도 1회/일 투여되는, 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효 용량은 적어도 1주 동안 매일 투여되는, 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 유효 용량은 적어도 4주 동안 매일 투여되는, 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가쎄리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 류테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 악시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 및 락토바실러스 존소니이(Lactobacillus johnsonii) 종으로부터 선택되는, 방법.
17. 제16항에 있어서, 적어도 하나의 락토바실러스 플란타룸 균주는 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312, 락토바실러스 플란타룸 DSM 15313, 락토바실러스 플란타룸 DSM 15316, 락토바실러스 플란타룸 DSM 6595, 락토바실러스 플란타룸 DSM 9843, 락토바실러스 플란타룸 DSM 32131, 락토바실러스 플란타룸 DSM 17852, 및 락토바실러스 플란타룸 DSM 17853으로부터 선택되는, 방법.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 적어도 하나의 락토바실러스 플란타룸 균주는 장 상피에 부착되어 장에서 유지될 수 있는, 방법.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 락토바실러스 플란타룸 균주는 만노스-특이적 부착을 포함하는, 방법.
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 락토바실러스 플란타룸 균주는 락토바실러스 플란타룸 DSM 15312(HEAL 9™)인, 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주는 적어도 하나의 담체, 부형제 및/또는 희석제 물질을 포함하는 조성물의 형태로 투여되는, 방법.
22. 제21항에 있어서, 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 로젠지(lozenge), 츄잉껌, 또는 좌제 형태로 제공되는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 조성물은 캡슐의 형태로 제공되는, 방법.
24. 제21항에 있어서, 담체 물질은 식품인, 방법.
25. 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 적어도 하나의 락토바실러스 균주로서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량의 투여에 의한 치료를 포함하되, 유해 효과는 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준인, 적어도 하나의 락토바실러스 균주.
26. 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 방법에 사용하기 위한 적어도 하나의 락토바실러스 균주로서, 적어도 하나의 락토바실러스 균주의 유효 용량의 투여에 의한 치료를 포함하되, 적어도 하나의 유해 효과는 가용성 프렉탈카인의 상승된 수준 및 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 추가 유해 효과인, 적어도 하나의 락토바실러스 균주.
27. 제25항에 있어서, 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 추가 유해 효과는 스트레스의 생화학적 및/또는 생리학적 지표이되, 선택적으로 생화학적 지표는 하나 이상의 사이토카인, 특히 염증성 사이토카인의 증가된 수준으로부터 선택되고, 바람직하게는 가용성 CD163 또는 코르티솔의 증가된 수준인, 적어도 하나의 락토바실러스 균주.
28. 인간에서 급성 심리사회적 스트레스의 적어도 하나의 유해 효과를 감소 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한, 제21항에 정의된 바와 같은 조성물.
29. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 암, 염증성 질환, 심혈관 질환, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군(IBS: irritable bowel syndrome), 궤양성 대장염 및/또는 크론병의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 및/또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 방법.
30. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 인간에서 암, 화학요법-유도 말초 신경병증(CIPN: chemotherapy-induced peripheral neuropathy), 당뇨병성 망막병증(DR: diabetic retinopathy), 염증성 질환, 심혈관 질환, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군(IBS), 궤양성 대장염 및/또는 크론병의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 및/또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 적어도 하나의 락토바실러스 프로바이오틱 균주.
31. 제28항에 있어서, 인간에서 암, 화학요법-유도 말초 신경병증(CIPN), 당뇨병성 망막병증(DR), 염증성 질환, 심혈관 질환, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군(IBS), 궤양성 대장염 및/또는 크론병의 적어도 하나의 증상을 치료, 예방 및/또는 감소시키는 방법에 사용하기 위한, 조성물.

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