KR20220016053A - 키메라 지카-일본 뇌염 바이러스 - Google Patents

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Abstract

생, 감염성, 약독화 지카 - 일본 뇌염(JEV) 키메라 바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서 상기 지카 바이러스의 prME 단백질을 코딩하는 상기 뉴클레오티드 서열은 일본 뇌염 바이러스의 prME 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환되어, 상기 일본 뇌염 바이러스의 상기 prME 단백질이 발현되도록 하는 폴리뉴클레오티드.

Description

키메라 지카-일본 뇌염 바이러스
본 발명은 지카 및 일본 뇌염 바이러스의 백신접종(vaccination)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 지카 및 일본 뇌염 vir33us의 키메라 바이러스에 관한 것이다.
전세계적으로 확산됨에도 불구하고, 플라비바이러스는 대부분 한정된 고유한 지리적 지역으로 제한된다. 그러나, 최근 경향은 플라비바이러스 감염은 규모가 확대될뿐만 아니라, 새로운 지역으로 확산되고 있으며, 따라서, 플라비바이러스는 신종 바이러스와 재출현 바이러스로서 분류된다(문헌([Ishikawa et al. (2014) vaccine. 32, 1326-1337]; 문헌[Mackenzie et al. (2004) Nat Med. 10(12S), S98-109]; 문헌[Petersen et al. (2016) N Engl J Med. 374(16), 1552-1563]; 문헌[Wilder-Smith & Monath (2016) Lancet Infect Dis. 22. 1473-3099(16), 30588-30586]).
c-LAV는 prM-E 단백질의 뉴클레오티드 서열이 다른 플라비바이러스(예컨대 일본 뇌염 바이러스, 뎅기열, 지카 등)로 대체된, 키메라 감염성 생-약독화 바이러스(예컨대 YFV 17D)로 정의되며, 따라서 키메라 바이러스에서 발현되는 기능성 prM-E 단백질은 모(parental) 플라비바이러스에 속하지 않는다. 몇 가지 안전 문제에도 불구하고, LAV는 체액성 및 세포성 면역 둘 모두를 제공하기 때문에 가장 효율적인 백신이다(문헌[Monath et al. (2015) Vaccine 33, 62-72]; 문헌[Minor (2015) Virol. 479-480, 379-392]).
플라비바이러스에 대한 모든 체액성 반응은 주로 중화 항체의 생성을 초래하는 외피 단백질의 도메인 3 루프 때문이라는 것이 당업계에서 널리 받아들여지고 있다(문헌{Li et al. (2014) Hum Vaccin Immunother. 10, 3579-3593]).
현재까지, 백신 분야는 플라비바이러스 특히 바이러스 표면 단백질에 대해 유도된 중화 항체(nAb)의 경우 바이러스의 구조 단백질에 대한 보호 면역을 구축하는 전략에 광범위하게 의존하고 있다(WHO 생물의약품 표준화 전문가 회의(Expert Committee on Biological Standardisation), WHO 기술 보고서 시리즈 979, 2011, Annex 2: 뎅기열 4가 백신(생, 약독화)의 품질, 안전성 및 효능에 대한 지침; WHO 생물의약품 표준화 전문가 회의, 인간 사용을 위한 일본 뇌염 백신(생, 약독화)의 품질, 안전성 및 효능을 보장하기 위한 권장 사항, 기술 보고서 시리즈 980, 2012). 예컨대, JEV에 대한 2가지 백신, 즉, Ixiaro®(불활화 백신) 및 Imojev®(일본 뇌염 바이러스의 prM 단백질 및 외피 E 단백질을 포함하는 YFV 17D-기반 키메라 생-약독화 백신; c-LAV)(문헌[Li et al. (2014) Hum Vaccin Immunother. 10, 3579-3593]; 문헌[Scott (2016) Drugs 76, 1301-1312])은 보호의 면역 상관관계로 널리 인정되는 JEV-특이적 nAb의 충분히 높은 혈청 역가를 유도하는 능력을 기반으로 승인되었다.
예상되는 병원체의 prME 유전자가 다른 플라비바이러스의 백본에 삽입되는 키메라 백신이 개발되었다.
문헌[Mathenge et al. (2004) J. Gen. Virol. 85, 2503-2513] 및 [Yang (2017) Protein Cell 8, 225-229]은 일본 뇌염 바이러스 백본 및 뎅기열 Prm-E 단백질을 사용하는 키메라 바이러스를 사용한 이중 백신접종을 개시한다.
일본 뇌염(JE)에 대한 Imojev 백신은 잘 정립된 YF170 황열 백신의 YF prME 유전자가 JE 바이러스의 것으로 대체된 황열 바이러스이다. YFD 백신의 안전성은 이 구조를 키메라 바이러스의 백본으로 간주하는 이유였다. 의도치 않게, 키메라 백신에는 지리적으로 다른 지역의 단편이 포함되어 있다. 따라서 황열 백신접종을 위한 변형되지 않은 황열 백신은 일본 뇌염에 대한 키메라 백신(아시아)보다 다른 지역(아프리카 및 남미)에서 사용된다.
최근 미주 지역에서 지카가 유행하면서 쇠약해지는 질병을 억제하거나 예방하기 위한 치료제가 개발되었다. 현재까지 지카 바이러스(ZIKV)에 대한 활성을 나타내는 여러 항바이러스제 및 백신 후보가 보고되었지만 응급 상황에서도 아직 승인된 것은 없다. 일본뇌염(JEV) 및 지카 바이러스는 황열, 뎅기열, 웨스트 나일강, 진드기 매개 뇌염 바이러스와 함께 플라비바이러스라는 속에 속한다.
잘 정립된 약독화 YF17D 황열 백신과 같은 플라비바이러스에 대한 백신이 개발되었다.
또한 하나의 플라비바이러스의 prM/E 유전자가 다른 플라비바이러스의 prM/E 유전자에 삽입되거나 대체된 키메라 백신이 개발되었다. 이의 가장 잘 알려진 예는 Chimerivax 바이러스이다(문헌[Guirakhoo et al. (1999) Virology 257,　363-372]).
C 단백질의 C 말단 부분은 신호 펩티드로 작용하고 바이러스 단백질의 적절한 단백질 분해 과정에서 중요하다는 것이 밝혀졌다. 최적의 처리와 바이러스 적합성은 상관관계가 없기 때문에(문헌[Lee et al. (2000) J. Virol. 74, 24-32] 및 문헌[Lobigs & Lee (2004) J. Virol. 78, 178-86] 참조), 키메라 구조가 모 바이러스 또는 삽입체의 신호 서열을 어느 정도 포함해야 하는지는 예측할 수 없다.
일본 뇌염 바이러스(JEV)와 지카 바이러스(ZIKV)는 공중 보건 문제로 대두되고 있는 플라비바이러스이다. 일반적으로, 플라비바이러스 외피를 표적으로 하는 중화 항체(nAb)는 플라비바이러스 감염에 대한 보호와 상관관계가 있는 것으로 간주된다. JEV의 경우, 상업적으로 이용 가능한 2가지 nAb 유도 백신인, (a) 불활화 백신(Ixiaro®) 및 (b) 키메라 생-약독화 백신(Imojev®, 호주 및 태국에서만 승인됨)이 존재한다. 그러나, 현재까지 ZIKV에 대해 승인된 백신은 없다. 다양한 ZIKV nAb 유도 지카 백신 후보는 (전-)임상 개발의 여러 단계에 있다. 증가하는 증거는 플라비바이러스의 비-구조 단백질도 보호 항원으로 작용할 수 있음을 시사한다.
이용 가능한 승인된 ZIKV 백신이 없다. 생-약독화 백신은 여러 종류의 백신 중에서 가장 효율적인 물질로, 이상적으로는 오래 지속되는 면역을 유도하기 위해 1회 투여만 요구된다. 사전 검증된 생-약독화 백신은 ZIKV 및 JEV에 대해 전 세계적으로 사용할 수 없다. 키메라 생-약독화 JEV 백신(Imojev®)은 효과적인 백신접종을 위해 2회 투여되어야 한다. 다양한 ZIKV 외피 기반 지카 백신 후보가 (전)임상 개발의 여러 단계에 있다. 그러나, ZIKV 외피를 표적으로 하는 중화 항체(nAb)는 뎅기열 바이러스 외피 단백질과 교차-반응하여 잠재적으로 뎅기열 질환의 항체-의존적 증강(ADE: antibody-dependent enhancement)을 유발하는 것으로 나타났다.
본 발명은 키메라 바이러스의 C 단백질 및 비-구조 단백질이 백신으로서 작용하기에 충분하여, 키메라 백신이 prME 삽입물이 유래하는 바이러스뿐만 아니라, 나머지 백본 부분이 유래하는 바이러스에 대해 기능한다는 발견에 기초한다.
따라서 본 발명은 일반적인 유전 구조 A-B-A의 키메라 생-약독화 플라비바이러스 및 적어도 A에 대한 백신접종에서의 이의 용도에 관한 것으로서, 여기서 A는 본래 벡터 백본(벡터)으로 사용된 특정 바이러스 A이고 (ii) B는 다른 바이러스 B의 유전 물질을 나타내고 백신접종 후 상기 바이러스 B 감염으로부터 보호를 유도할 목적으로 본래 A에 도입된 B(백신 표적)의 항원성 표면 단백질을 코딩한다. 놀랍게도 이러한 A-B-A 백신은 또한 본래 항원적으로 관련이 없는 것으로 간주되고 벡터 성분으로만 사용된 바이러스 A(예컨대 Imojev® 및 Dengvaxia®의 경우 YFV)에 대해 효율적으로 면역화하고 완전히 보호하는데 사용될 수 있다. A로부터 보호를 부여하는 기본 메커니즘은 A에 특이적이지만 중화 항체를 포함하지 않기 때문에 본래 A-B-A 백신의 메커니즘과 관련이 없다.
ADE의 위험을 피하는 이중 JEV-ZIKV 백신을 개발하기 위해, 우리는 ZIKV 클론의 백본 내 prM/E 유전자를 JEV의 것으로 대체하여 키메라 생-약독화 ZIK-JEprM/E 백신을 생성하였다. 이러한 개입은 JEV에 대한 외피 기반 nAb의 유도에 의해 JEV에 대한 보호를 제공하고 ZIKV 비-구조 단백질(비-nAb 및 세포 면역에 기반)에 대한 면역을 유도함으로써 ZIKV에 대한 보호를 제공하는 생-약독화 백신을 생성한다. ZIK-JEprM/E는 ZIKV 외피에 대한 항체를 유도하지 못하기 때문에, ADE-매개 뎅기열 바이러스 감염 가능성이 낮다.
본 발명은 본래 병원성인 ZIKV 균주의 약독화된 버전을 개시하며 이는 생-약독화 백신, 이중 백신으로 사용될 수 있고 항체 의존적 증강으로 인한 연속적인 중증 뎅기열 바이러스 감염의 위험이 더 낮다는 이점을 갖는다.
항원 제시 및 분비 특성으로 인한 비-구조 단백질, 특히 NS1은 세포 및 체액성 반응에서도 또한 중요할 수 있다. 따라서, 외피 및 비-구조 단백질 둘 모두에 대한 체액성 및 세포성 반응이 백신접종의 기초를 형성할 수 있는 것으로 보인다(문헌[Pierson et al. (2008) Cell Host Microbe. 4, 229-238]; 문헌[Putnak et al. (1990) J Gen Virol. 71(Pt 8), 1697-1702)]; 문헌[Schlesinger et al. (1993) Virology. 92(1), 132-141]; 문헌[Amorim et al. (2016) Virology 487, 41-49]; 문헌[Rastogi et al. (2016) Virol J. 13, 131]; 문헌[Watterson et al. (2016) Antiviral Res. 130, 7-18]). c-LAV 플라비바이러스 백신(예컨대 Imojev 또는 Dengvaxia®)은 하나의 바이러스(JEV 또는 뎅기열)의 구조적 부분과 또 다른 바이러스(예컨대 YFV)의 비-구조적인 부분을 함유하므로, 이들은 2개의 플라비바이러스에 대한 이중 백신으로서 개발될 가능성을 가지고 있다.
본 발명은 키메라 바이러스에서, 비-구조적 모 항원의 존재는, 심지어 모 PrME 유전자가 존재하지 않는 경우에도, 모 바이러스에 대한 백신으로 사용하기에 충분하다는 것을 입증한다.
본 발명은 또한 지카의 경우와 같이 항체 의존적 증강과 관련된 바이러스 감염에 대해 백신접종이 수행될 수 있다는 이점을 갖는다.
실제로, 첫 번째 감염은 일반적으로 가벼운 질환을 유발하는 반면, 두 번째 감염은 더 심각한 질환 패턴을 유발한다.
후속 감염이 더 심각하다는 사실은 항체 의존적 증강(ADE)의 발달에 기인할 수 있다. 이러한 현상의 원인이 되는 항체는 외피 단백질, 특히 prM 단백질에 대해 생성된다.
키메라 플라비바이러스 백신의 사용 시, 백본의 캡시드 단백질 및 비-구조 단백질에 대해 그리고 막 단백질 및 외피 단백질에 대해 항체가 생성된다. 막 및/또는 외피 단백질에 대한 항체가 병원체에 대한 보호를 제공하는데 필수적이라는 것은 현장에서 일반적으로 인정되고 있다.
당업자는 백본에 의해 코딩된 비-구조 단백질이 또한 항체를 생성할 것이라는 것을 인식했지만, 이러한 반응은 바이러스 감염으로부터 개인을 보호하기에 충분하지 않은 것으로 여겨진다. 결과적으로 키메라 벡터는 예상되는 병원체의 prM 및 E 유전자를 포함하며, 이는 특히 뎅기열 및 지카의 경우 항체-의존적 증강(ADE)을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 외피 단백질 또는 막 단백질로부터 유래하는 중화 항체의 개입이 회피되는 백신접종을 제공하는 것이다.
본 발명은 다음의 진술로 추가로 요약된다:
1. 생, 감염성, 약독화 지카 - 일본 뇌염(JEV) 키메라 바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 지카 바이러스의 prME 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 일본 뇌염 바이러스의 prME 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체되도록 하여, 상기 일본 뇌염 바이러스의 상기 prME 단백질을 발현시킨다.
이에 따라서, 뉴클레오티드 서열은 일본 뇌염 바이러스인 prME 단백질을 코딩하므로, 상기 일본 뇌염 바이러스의 상기 prME 단백질이 발현되도록 하고 뉴클레오티드 서열은 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열을 코딩하여 상기 일본 뇌염 바이러스의 상기 신호 서열이 발현되도록 한다.
2. 진술 1에 있어서, 추가로 지카 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체되어 상기 일본 뇌염 바이러스의 상기 신호 서열이 발현되도록 한다.
이에 따라서, 뉴클레오티드 서열은 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열을 코딩하여 상기 일본 뇌염 바이러스의 상기 신호 서열이 발현되도록 한다. .
3. 진술 1 또는 2에 있어서, 추가로 SEQ ID NO: 1에 도시된 위치 1482에서 A에서 G로의 뉴클레오티드 치환에 의해 야생형 서열과 상이한, 폴리뉴클레오티드.
4. 진술 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, JEV prME 단백질의 코딩된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
5. 진술 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열의 코딩된 아미노산 서열은 서열 GGNEGSIMWLASLAVV[SEQ ID NO: 4]를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
6. 진술 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 지카 C 단백질과 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열을 연결하는 코딩된 아미노산 서열은 서열 EKKRR GGNEG[SEQ ID NO: 7]를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
7. 진술 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, JEV prME 단백질과 지카 NS 단백질을 연결하는 코딩된 아미노산 서열은 서열 ATNVH ADVGC[SEQ ID NO: 8]을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
8. 진술 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스는 BeH819015 균주인, 폴리뉴클레오티드.
9. 진술 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO: 1에 도시된 뉴클레오티드 108 내지 10379로부터 개방 해독 프레임을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 (정지코돈 포함).
10. 진술 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO: 1에 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
11. 진술 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, SEQ ID NO: 2에 도시된 폴리펩티드 서열을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
12. 진술 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 인공 박테리아 염색체인, 폴리뉴클레오티드.
13. 진술 12에 있어서, BAC는 다음을 포함하는, 폴리뉴클레오티드:
- 박테리아 세포 당 10개 초과의 카피로 상기 BAC를 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
- 상기 지카 -JEV 키메라 바이러스의 cDNA를 포함하고 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA를 감염성 RNA 바이러스로 처리하기 위한 시스-조절 요소를 포함하는, 바이러스 발현 카세트.
14. 생, 감염성, 약독화 지카 -일본 뇌염(JEV) 키메라 바이러스로서,
상기 지카 바이러스의 prME 단백질은 일본 뇌염 바이러스의 prME 단백질로 대체되는, 지카 -일본 뇌염(JEV) 키메라 바이러스.
15. 진술 14에 있어서, 추가로 상기 지카 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열은 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열로 대체되는, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
16. 진술 14 내지 15 중 어느 하나에 있어서, prME 폴리펩티드는 서열 QAAEFTV[SEQ ID NO: 9]를 포함하는, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
17. 진술 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, JEV 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질은 SEQ ID 4 및 5에 도시된 아미노산 서열을 갖는, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
18. 진술 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, JEV 바이러스는 SA14-14-2인, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
19. 진술 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스는 BeH819015 균주인, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
20. 진술 14 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 아미노산 서열 GGNEGSIMWLASLAVV[SEQ ID NO: 4]을 포함하는, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
21. 진술 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스의 C 단백질과 JEV 바이러스의 신호 펩티드의 접합부의 아미노산 서열은 아미노산 서열 EKKRR GGNEG[SEQ ID NO: 7]를 갖는, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
22. 백신으로서 사용하기 위한 진술 14 내지 21 중 어느 하나에 따른 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스.
23. 진술 22에 있어서, 지카 바이러스 및/또는 일본 뇌염에 대한 예방에서 백신으로서 사용하기 위한. 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스.
24. 진술 22에 있어서, 지카 바이러스 및 일본 뇌염에 대한 동시 예방에서 백신으로서 사용하기 위한, 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스.
25. 백신으로 사용하기 위한 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스를 코딩하는 진술 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드.
26. 진술 25에 있어서, 지카 바이러스 및/또는 일본 뇌염에 대한 예방에서 백신으로서 사용하기 위한, 폴리뉴클레오티드.
27. 진술 25에 있어서, 지카 바이러스 및 일본 뇌염에 대한 동시 예방에서 백신으로서 사용하기 위한, 폴리뉴클레오티드.
28. 진술 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
29. 진술 14 내지 21 중 어느 하나에 따른 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
30. 다음의 단계를 포함하는, 지카 및/또는 일본 뇌염 감염에 대한 벡신 제조 방법:
a) 다음을 포함하는 BAC를 제공하는 단계
- 박테리아 세포 당 10개 초과의 카피로 상기 BAC를 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
- 진술 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 지카_JEV 키메라 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA를 감염성 RNA 바이러스로 처리하기 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
b) 포유류 세포를 단계 a)의 BAC로 형질감염시키고 감염된 세포를 계대하는 단계
c) 단계 b)의 형질감염된 세포의 복제된 바이러스를 병독성(virulence) 및 항체 생성 능력 및 지카 바이러스 감염에 대한 보호 유도 능력을 검증하는 단계,
d) 단계 c에서 검증된 바이러스를 벡터로 클로닝하는 단계,
e) 벡터를 백신 제형으로 제형화하는 단계.
31. 진술 30에 있어서, 벡터는 박테리아 세포 당 10개 초과의 카피로 상기 BAC를 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 BAC인, 방법.
32. 대상체에서 JE 바이러스 및/또는 지카 바이러스에 대한 중화 및/또는 보호 항체 반응을 유도하여, JE 바이러스 및/또는 지카에 의한 감염을 예방하는 방법으로서, 진술 14 내지 21의 지카 - 일본 뇌염 키메라 바이러스를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
33. 대상체에서 JE 바이러스 및/또는 지카 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하여 JE 바이러스 및/또는 지카에 의한 감염을 예방하는 방법으로서, 진술 14 내지 21의 지카 - 일본 뇌염 키메라 바이러스를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
32. 대상체에서 JE 바이러스 및/또는 지카 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하여 JE 바이러스 및/또는 지카에 의한 감염을 예방하지만, 항체-의존적 증강(ADE) 메커니즘에 의한 후속 뎅기열 및/또는 지카 감염을 향상시키는 항체의 유도를 회피하는 방법으로서, 진술 14 내지 21의 지카 - 일본 뇌염 키메라 바이러스를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
35. 대상체에서 일본 뇌염 바이러스 및 지카 바이러스와 같은 상이한 혈청 복합체로부터 플라비바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하여 어느 하나의 바이러스에 의한 감염을 예방하지만, 항체-의존적 증강(ADE)의 메커니즘에 의한 후속 뎅기열 및/또는 지카 감염을 향상시키는 항체의 유도를 회피하는 방법으로서, 키메라 플라비바이러스를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
따라서 투여는 JE에 대한 면역 유도, 지카에 대한 면역 유도, JE에 대한 항체 유도, JE에 대한 바이러스-중화 항체 유도, 세포 면역 유도, ZIK에 대한 항체 유도, ZIK에 대한 세포 면역 유도 중 하나 이상을 야기한다.
도 1. 본 연구에서 사용된 야생형 및 키메라 ZIKV에서 캡시드-prM(C-prM) 접합부의 아미노산 서열. C 앵커 도메인(= prM 신호 펩티드)의 아미노산 서열 상류 및 하류는 단일 문자 SI 약어로 표시된다; (2b/3) - NS2b/3 프로테아제 절단 부위; (sign) - 신호 펩티다제 절단 부위; *- 서열 정렬을 용이하게 하기 위해 도입된 갭.
도 2. 야생형 및 키메라 바이러스의 구축 및 전파. (A) 야생형 ZIKV 및 JEV 및 이들의 키메라 유도체의 도시적 표현. ZIKV(캡시드 앵커 서열이 있거나 없음)의 prM/E를 생 약독화 JEV SA 14-14-2의 상응하는 서열로 교환함으로써 키메라 바이러스를 구축하였다. (B) Vero E6 세포에 대한 ZIKV 및 키메라 바이러스의 면역염색. 세포를 야생형 ZIKV, ZIKV Canch(ZIK-JEprM/E ZIKCanch) 또는 JEV Canch(ZIK-JEprM/E JECanch)가 있는 ZIK-JEprM/E를 함유하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 후(dpt) 1일차에, 세포를 트립신 처리하고 dpt 3일차 및 5일차에 모노클로날 판 플라비바이러스 모노클로날 Ab(mAb) 4G2를 사용하는 면역염색을 위해 부분을 8-웰 챔버 슬라이드로 옮겼다. (C) ZIK-JEprM/E의 항원성. Vero E6 세포를 0.1의 MOI로 ZIKV, JEV 또는 ZIK-JEprM/E JECanch로 감염시키고 감염 후(dpi) 2일차에 mAb 4G2, ZIKV E-특이적 mAb, JEV E-특이적 mAb, 및 ZIKV NS1-특이적 mAb를 사용하여 염색하였다. (D) BHK-21J 세포에서 ZIKV(닫힌 원) 및 ZIK-JEprM/E(닫힌 사각형)의 복제 역동학. BHK-21J 세포를 6-웰 플레이트에 밤새 씨딩하고 0.01의 MOI로 ZIKV 또는 ZIK-JEprM/E로 감염시키고 세포외 감염성 바이러스를 플라크 분석법으로 매일 정량화하였다. (E) BHK-21J 세포에서 ZIKV 및 ZIK-JEprM/E의 플라크 크기를 발달시키고 6 dpi에 염색하였다. 데이터를 n = 2 복제의 SEM을 나타내는 오차 막대와 함께 평균 값으로 나타냈다. 점선은 분석의 검출 한계(L.O.D: limit of detection)를 나타낸다.
도 3. 표시된 항원으로 백신접종 및 sham-백신접종된 마우스의 비장세포 자극 후 인터페론 감마(IFN-γ) ELISPOT. 인터페론 알파/베타(IFN-α/β)-결핍 마우스를 104 PFU의 ZIK-JEprM/E(n=5)으로 복강내로(i.p) 백신접종하거나 sham-백신접종하였다(2% FBS 배지 사용; n=3). 백신접종 후 10주 차에, 비장세포를 수확하고 IFN-γ ELISPOT에 적용하였다. 데이터를 SEM을 나타내는 오차 막대와 함께 평균 값으로 나타냈다. 값을 대조군 웰의 스폿 수를 빼서 정규화하였다(Vero E6 세포용해물로만 자극됨).
도 4. AG129에서 치명적인 JEV 및 ZIKV 감염에 대한 ZIK-JEprM/E의 보호 효능. 마우스를 104 PFU의 ZIK-JEprM/E(n=8), 또는 키메라 바이러스 YF-JEprM/E로 백신접종하거나(n=8), 2% FBS 배지를 사용하여 비-백신접종하였다(n=8). 백신접종 후 28일차에, 백신접종 및 비-백신접종된 마우스 둘 모두에 1000 LD50의 JEV로 i.p.로 도전시켰다. (A) JEV 도전 후 35일차에 관찰된 백신접종 및 비-백신접종된 마우스의 생존 곡선. (B) (A) 즉, ZIK-JEprM/E 백신접종(n=8)에서의 생존, YF-JEprM/E(n=7)를 이후 104 PFU의 ZIKV를 사용하여 i.p.로 도전시키고 28일차에 추가로 관찰하였다. 비-백신접종된 마우스 군(n=6)을 ZIKV 도전에서 대조군으로서 추가하였다.
도 5a 내지 도 5i는 ZIKV(균주 BeH819015)에서 유래된 뉴클레오티드, JEV(백신 균주 SA14-14-2) i로부터 유래된 뉴클레오티드 및 JECanch cDNA 서열이 있는 백신 ZIK-JEprM/E의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다; Vero E6에 대한 계대에 의해 JEV-E 유전자 영역에서 발생하는 A1482G 돌연변이가 표시된다.
플라비바이러스는 플라비바이리대(Flaviviridae)의 바이러스 패밀리에 속하며 뎅기열 바이러스(DENV: Dengue virus), 일본 뇌염 바이러스(JEV: Japanese encephalitis virus), 웨스트 나일 바이러스(WNV: West Nile virus), 진드기 매개 뇌염 바이러스(TBEV: Tick-borne encephalitis virus), 황열 바이러스(YFV: Yellow fever virus) 및 지카 바이러스(ZIKV: Zika virus), 일본 뇌염 바이러스(JEV: Japanese Encephalitis virus), 머레이 계곡 뇌염 바이러스(MVE: Murray Valley Encephalitis virus), 세인트 루이스 뇌염 바이러스(SLE: St. Louis Encephalitis virus), 진드기 매개 뇌염(TBE: Tick-borne Encephalitis) 바이러스, 러시아 봄-여름 뇌염 바이러스(RSSE: Russian Spring-Summer Encephalitis virus), 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 포와산 바이러스(Powassan virus), 카야사나 산림병 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 우스투 바이러스(Usutu virus), 웨셀스브론 및 옴스크 출혈열 바이러스(Wesselsbron and Omsk Hemorrhagic Fever virus)를 포함하여, 다수의 의학적으로 중요한 바이러스를 포함한다. 플라비바이러스는 비리온에 통합된 3개의 구조 단백질(코어, C; 프리멤브레인, prM; 및 외피, E), 및 7개의 비구조 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5)을 코딩하는 약 10 내지 11 kb 길이의 (+)ssRNA 게놈으로 외피화되어 있다.
C 단백질의 C 말단에 있는 신호 펩티드(C-신호 펩티드; C-앵커 도메인("canch")로도 지칭됨)는 신호 펩티드 서열의 N 말단(세포질에서 바이러스 NS2B/NS3 프로테아제에 의해) 및 C 말단(소포체[ER: endoplasmic reticulum] 내강에서 숙주 신호효소에 의해)에서 순차적 절단의 조정을 통해 플라비바이러스 패키징을 조절한다.
일반적으로, 종래 기술의 c-LAV(키메라 생 약독화 백신)는 구조적 prM 및 E 단백질의 뉴클레오티드 서열이 또 다른 플라비바이러스(예컨대 JEV, DENV, ZIKV 등)의 것으로 대체된 감염성 생-약독화 백신 바이러스로 정의된다. 이러한 c-LAV의 일반 구조는 A-B-A로 기술될 수 있으며 (i) 빌딩 블록 A는 본래 벡터 백본으로 사용되는 특정 바이러스 A의 부분을 포함하며[전형적으로 C 단백질 및 Ns 단백질을 코딩함](벡터) (ii) 빌딩 블록 B는 또 다른 바이러스 B의 유전 물질을 나타내며 백신접종 후 상기 바이러스 B 감염으로부터 보호를 유도할 목적으로 본래 A에 도입된 B의 항원성 표면 단백질(백신 표적)을 코딩한다.
동일한 A-B-A 청사진에 따라, 다른 DENV c-LAV가 현재 개발 중이지만, 벡터 백본으로서 약독화 DENV 균주(문헌[Torresi et al. (2017) Hum Vaccin Immunother. 13, 1059-1072)] 또는 ZIKV(문헌[Xie et al (2017) MBio. 8, e02134-16])를 사용한다.
유사한 c-LAV 후보는 TBEV를 중화하는 nAb에 의해 TBEV로부터 보호하기 위해 DENV4/TBEV(랑가트바이러스) 키메라를 포함하여 외피 및 막 단백질에 의한(문헌[Lai et al. (2003) Adv Virus Res. 61, 469-509]) 중화 항체(nAb) 반응을 표적화할 때마다 다양한 플라비바이러스에 대해 개발되어 왔다(문헌[Pletnev & Men (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95, 1746-1751]).
이전 백신 전략은 플라비바이러스 감염으로부터 보호하고 대부분 각각의 외피 단백질에 대해 지시되는 nAb 반응의 유도에 초점을 맞추었다[문헌(Li et al. (2014) Hum Vaccin Immunother. 10, 3579-3593)]. 그러나, nAb에 의한 백신-매개 보호와 관련하여 이러한 널리 인정되는 상관관계 외에, 역사적 및 최근에 공개된 증거는 또한, 비구조 단백질과, 이의 항원성 및 분비 특성으로 인해, 특히 NS1은 보호 세포 및 체액 면역 반응을 통해 백신 효능에 어느 정도 기여할 수 있음을 시사한다[문헌(Pierson et al. (2008) Cell Host Microbe. 4, 229-238)]; 문헌[Putnak et al. (1990) J Gen Virol. 71(Pt 8), 1697-1702]; 문헌[Schlesinger et al. (1993) Virology 92(1), 132-141]; 문헌[Amorim et al. (2016) Virology 487, 41-49]; 문헌[Rastogi et al. (2016) Virol J. 13, 131]; 문헌[Watterson et al. (2016) Antiviral Res. 130, 7-18]). 본원에서 우리는 예기치 않게 JEV로부터 보호하도록 승인된 c-LAV 플라비바이러스 백신이 임의의 관련 nAb의 유도 없이 대규모 치명적인 백신 도전으로부터 완전히 보호할 수 있는 잠재력이 있으므로 두 번째 플라비바이러스에 대해, 즉, c-LAV의 복제를 위한 비-구조 단백질의 백본을 제공하는 지카 바이러스에 대해서도 보호하는 이중 백신으로서 개발될 수 있음을 보여준다. 즉, 일반 구조 A-B-A의 c-LAV는 2개의 바이러스 B 및 A로의 감염으로부터 보호하는데 왜냐하면 이러한 키메라 백신은 하나의 바이러스 B(JE)의 구조 단백질 및 두 번째 바이러스 A(지카)의 비구조 단백질을 함유하기 때문이다.
본 출원서에서 언급된 BAC는 다음을 포함한다:
- 박테리아 세포 당 10개 초과의 카피로 상기 BAC를 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
- RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA를 감염성 RNA 바이러스로 처리하기 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트.
본 발명의 경우와 같이 RNA 바이러스 게놈은 2개의 바이러스 게놈의 키메라 바이러스 cDNA 구조물이다.
이러한 BAC에서, 바이러스 발현 카세트는 양성-가닥 RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고, 전형적으로
- 상기 cDNA로의 전사를 개시하기 위한 상기 cDNA의 5' 말단에 선행하는 RNA 폴리머라제 구동 프로모터, 및
- 설정된 위치에서 상기 바이러스 cDNA의 RNA 전사체를 절단하기 위한 상기 cDNA의 3' 말단에 뒤따르는 RNA 자기-절단을 위한 요소를 포함한다.
BAC는 효모에서 상기 박테리아 인공 염색체로 이동하고 유지하기 위한 효모 자율 복제 서열을 추가로 포함할 수 있다. 효모 ori 서열의 예는 2μ 플라스미드 기원 또는 ARS1(자율 복제 서열 1) 또는 이의 기능적으로 상동성 유도체이다.
본 발명의 이러한 제1 양태의 RNA 폴리머라제 구동 프로모터는 RNA 폴리머라제 II 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 즉시 조기(CMV-IE: Cytomegalovirus Immediate Early) 프로모터, 또는 시미안 바이러스 40 프로모터 또는 이의 기능적으로 상동성 유도체일 수 있다.
RNA 폴리머라제 구동 프로모터는 동등하게 RNA 폴리머라제 I 또는 III 프로모터일 수 있다.
BAC는 또한 RNA 자기-복제를 위한 요소 예컨대 간염 델타 바이러스의 게놈 리보자임의 cDNA 또는 이의 기능적으로 상동성 요소를 포함할 수 있다.
백신 제제로의 DNA의 제형화는 당업계에 공지되어 있으며 예컨대 문헌[Molecular Medicine Vol 127, (2006) Springer Saltzman, Shen and Brandsma (Eds.) Humana Press. Totoma, N.J]에서 "DNA 백신" 방법의 챕터 6 내지 10 및 문헌[Vaccines (6th Edition) (2013) (Plotkin et al. Eds.)]의 챕터 61 대안적인 백신 전달 방법, 페이지 1200~1231에 상세하게 기술되어 있다. DNA 백신 제조에 적합한 담체, 희석제, 부형제 및 보조제에 대한 세부사항을 또한 아래 표시된 바와 같이 국제공개 WO2005042014호에서 확인할 수 있다.
"허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 특히 면역요법과 관련하여, 인간 및/또는 수의학 약제에서 사용하기에 허용되는 추가 물질을 지칭한다.
예컨대, 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제는 전신 투여 또는 국소 투여에서 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 특정 투여 경로에 따라, 당업계에 잘 알려진 다양한 담체가 사용될 수 있다. 이러한 담체는 당, 전분, 셀룰로스 및 이의 유도체, 맥아, 젤라틴, 활석, 칼슘 설페이트 및 카보네이트, 식물성유, 합성유, 폴리올, 알긴산, 포스페이트 완충된 용액, 유화제, 등장성 염수 및 염 예컨대 히드로클로라이드, 브로마이드 및 설페이트를 포함하는 미네랄 산 염, 유기산 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트 및 감염원성이 없는 물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 부형제를 기술하는 유용한 참고문헌은 본원에 인용되어 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N. J. USA, 1991)]이다.
환자에게 DNA 백신을 제공하기 위해 임의의 안전한 투여 경로가 사용될 수 있다. 예컨대, 경구, 직장, 비경구, 설하, 협측, 정맥 내, 관절 내, 근육 내, 피내, 피하, 흡입, 안구 내, 복강 내, 뇌실 내, 경피 등이 사용될 수 있다. 예컨대 근육 내 및 피하 주사가 면역요법 조성물, 단백질 백신 및 핵산 백신의 투여에 적절할 수 있다. 또한 마이크로입자 충격 또는 전기천공이 핵산 백신의 전달에 특히 유용할 수 있음이 고려된다.
투여 형태는 정제, 분산액, 현탁액, 주사, 용액, 시럽, 트로키제, 캡슐, 좌제, 에어로졸, 경피 패치 등을 포함한다. 이러한 투여 형태는 또한 이러한 목적을 위해 특별히 설계된 제어 방출 장치 또는 이러한 방식으로 추가로 작용하기 위해 수정된 삽입물의 다른 형태를 주입 또는 이식하는 것을 포함할 수 있다. 치료제의 제어 방출은 이를 예컨대 아크릴 수지, 왁스, 고급 지방족 알코올, 폴리락트산 및 폴리글리콜산 및 특정 셀룰로스 유도체 예컨대 히드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함하는 소수성 중합체를 코팅하여 수행될 수 있다. 또한, 제어 방출은 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 미소구체에 의해 수행될 수 있다.
경구 또는 비경구 투여에 적합한 DNA 백신은 분말 또는 과립으로서 또는 용액 또는 수용액 중의 현탁액, 비-수성 액체, 수중유 에멀전 또는 유중수 액체 에멀젼으로서 소정량의 플라스미드 DNA를 함유하는 개별 단위 예컨대 캡슐, 사쉐 또는 정제로 제시될 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 약학 방법에 의해 제조될 수 있지만 모든 방법은 전술된 바와 같은 하나 이상의 제제에 하나 이상의 필수 성분을 구성하는 담체를 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 DNA 플라스미드를 액체 담체 또는 미분화된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 밀접하게 혼합한 다음, 필요한 경우, 생성물을 원하는 제시형태로 성형함으로써 제조된다.
상기 조성물은 투여 제형에 적합한 방식으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 환자에게 투여될 용량은 적절한 기간 동안 환자에게 유익한 반응을 나타내기에 충분해야 한다. 투여될 제제의 양은 대상체의 연령, 성별, 체중 및 이의 일반적인 건강 상태를 포함하여 치료될 대상에 따라 달라질 수 있으며, 인자는 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.
또한 DNA 백신은 참고문헌으로서 주어진 문헌[Darji et al. (2000) FEMS Immunol Med Microbiol 27, 341-349] 및 문헌[Cicin-Sain et al. (2003) J. Virol. 77, 8249-8255]에 예시된 바와 같이 상기 DNA 플라스미드로 형질전환된 살모넬라의 생-약독화 균주를 사용하여 박테리아 형질도입에 의해 전달될 수 있다.
전형적으로 DNA 백신은 인간의 예방적 또는 치료적 면역화에 사용되지만, 특정 바이러스의 경우 또한 가축 동물 예컨대 가축 및 반려 동물을 포함하는 척추 동물(전형적으로 포유류, 조류 및 어류)에 적용될 수 있다. 백신 접종은 원숭이, 마우스, 랫트, 새 및 박쥐와 같은 바이러스의 살아있는 저장소(동물성 전염병)인 동물을 대상으로 한다.
특정 실시형태에서 백신은 보조제, 즉, 면역원성 및/또는 백신 조성물의 효능을 향상시키는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다. 그러나, 생 백신은 결국 바이러스 복제와 무관하게 선천성 면역 반응을 자극할 수 있는 보조제에 의해 유해할 수 있다. 적합한 보조제의 비-제한적인 예는 스쿠알란 및 스쿠알렌(또는 동물 기원의 다른 유지); 블록 공중합체; 세제 예컨대 Tween-80; Quill A, 광유 예컨대 Drakeol 또는 Marcol, 식물성유 예컨대 땅콩유; 코리네박테리움-유래 보조제 예컨대 코리네박테리움 파르붐; 프로피오니박테리움-유래 보조제 예컨대 프로피오니박테리움 아크네; 마이코박테리움 보비스(바실리 칼메트 및 게링 또는 BCG); 인터류킨 예컨대 인터류킨 2 및 인터류킨 12; 모노킨 예컨대 인터류킨 1; 종양 괴사 인자; 인터페론 예컨대 감마 인터페론; 조합물 예컨대 사포닌-알루미늄 히드록시드 또는 Quil-A 알루미늄 히드록시드; 리포좀; ISCOMt) 및 ISCOMATRIX (B) 보조제; 마이코박테리아 세포벽 추출물; 합성 글리코펩티드 예컨대 무라밀 디펩티드 또는 기타 유도체, 아브리딘; 지질 A 유도체; 덱트스란 설페이트; DEAE-덱스트란 또는 알루미늄 포스페이트 포함; 카복시폴리메틸렌 예컨대 Carbopol'EMA; 아크릴 공중합체 에멀젼 예컨대 Neocryl A640; 백신 또는 동물 폭스바이러스 단백질; 서브-바이러스 입자 보조제 예컨대 콜레라 독소, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
실시예
1. ZIK-JEprM/E의 구축
ZIKV 균주 BeH819015 cDNA를 국제공개 WO2014174078A1호에 따라 pShuttleBAC으로 클로닝하여 pShuttle-ZIKV를 수득하였다. 표준 재조합 DNA 기술 및 효모에서의 재조합을 사용하여 각각의 JEV 서열(백신 균주 SA14-14-2)에 대해 pShuttle-ZIKV에서 ZIKV의 prM/E 코딩 서열을 교환하여 키메라 복제 능력 플라비바이러스 백신을 생성하였다. 2개의 변이체 pShuttle-ZIK-JEprM/E_JECanch 및 pShuttle-ZIK-JEprM/E_ZIKCanch를 생성하였으며 이는 ZIKV 또는 JEV 유래 Canch 도메인을 함유한다(도 1 및 도 2a).
Vero E6 세포에서 두 구조물의 형질감염과 면역 형광 현미경에 의한 재조합 바이러스 자손 복제의 비편향 모니터링을 통해 황열 바이러스 ZIKV 키메라(문헌[Kum et al. (2018) NPJ Vaccines. 3, 56])와 유사한 구조로부터의 이전의 증거와 대조적으로, 예기치 않게 ZIKCanch 변이체는 감염성 자손을 생산하지 못하는 것으로 밝혀졌다. 마찬가지로, JECanch 변이체만이 완전히 복제 능력이 있었다(도 2b). 이와 같이 생성된 바이러스 ZIK-JEprM/E는 JEV의 E 단백질과 ZIKV의 NS1 단백질을 발현하는 유전적 키메라임이 입증되었다(도 2e). 추가로 Vero E6 세포에서 키메라 ZIK-JEprM/E(JECanch 변이체)를 5회 계대한 결과 뉴클레오티드 위치 1482에서 예측하지 못한 아데닌-대-구아노신 뉴클레오티드 변화 A1482G(A1482G)가 선택되어(도 5 참조) ZIK-JEprM/E 폴리 단백질에서 미스센스 돌연변이가 생성되며, 이는 JEV E-단백질의 위치 166에서 리신-대-글루타메이트 아미노산 변화(K166E)에 해당한다.
ZIK-JEprM/E JECanch에서 뉴클레오티드 위치: A1482G
ZIK-JEprM/E JECanch 폴리단백질 K459E
JEV SA14-14-2 prM/E 단백질 K333E
JEV SA14-14-2 E 단백질 K166E
뉴클레오티드와 아미노산 치환 간의 대응
생성된 ZIK-JEprM/E 키메라 바이러스는 모 ZIKV에 비해 약독화되었으며, 이는 Vero E6 세포에서 감소된 복제 동력학(도 2c) 및 BHK-21J 세포에서 더 작은 플라크 크기(도 2d)에 의해 입증되었다.
실시예 2. ZIK-JEprM/E의 약독화, 면역원성 및 백신 효능
ZIK-JEprM/E 백신 바이러스는 ZIK-JEprM/E의 104 PFU(플라크 형성 단위)의 용량으로 인터페론 알파/베타(IFN-α/β)-결핍 (AG129) 마우스에 복강 내(i.p.) 접종되었을 때 내약성이 우수하였다; 야생형 ZIKV의 유사하거나 훨씬 더 낮은 용량(< 102 PFU)으로 접종된 마우스는 감염으로 인해 균일하게 사망하였으며 이는 다시 ZIK-JEprM/E 백신 바이러스의 유리한 약독화를 입증한다.
바이러스-특이적 중화 항체(nAb)는 특정 플라비바이러스 백신에 존재하거나 이에 의해 발현되는 각각의 E 단백질에 대해 통상적으로 유도된다. 특정 플라비바이러스에 대한 nAb의 높은 역가는 일반적으로 특정 바이러스 감염으로부터 보호하기 위해 허용된다. 따라서 ZIKV E 서열의 결여에서 ZIK-JEprM/E는 JEV 특이적 nAb 외의 것을 유도할 수 없다. 이에 따라, ZIK-JEprM/E로 백신접종된 AG129는 높은 역가의 항-JEV 중화 항체(nAb)를 발달시켰지만, ZIKV에 대한 nAb는 발달시키지 않았다.
그러나, 중화되지는 않았지만, ZIKV의 다른 단백질에 결합하는 항체(ZIKV NS1 단백질에 대해 지시된 가장 가능성이 높은 비-nAb)는 간접 면역 형광 분석법에 의해 ZIK-JEprM/E AG129 마우스에서 쉽게 검출될 수 있었다. ZIK-JEprM/E로 백신접종된 AG129는 또한 ZIKV에 대한 세포 매개 면역의 강력한 유도를 나타냈으며, 이는 ZIK-JEprM/E로 백신접종 후 10주 차에 ELISPOT에 의해 검출된 바와 같이 다수의 ZIKV-특이적 IFN-γ 분비 비장 세포에 의해 입증되었다(도 3).
ZIK-JEprM/E 백신접종된 AG129 마우스는 생-약독화 JEV 기반 YFV-17D(Chimerivax-JE; Imojev®)로 백신접종된 마우스와 유사하게 JEV를 사용한 치명적인 도전에서 생존하였으며(도 4, 상단 패널) 이는 강력하고 균일하게 치명적인 JEV 감염에 대한 이의 보호 효능을 입증한다.
허가된 JEV 백신 Chimerivax-JE와 대조적으로, ZIK-JEprM/E는 또한 후속의 치명적인 ZIKV 감염으로부터 보호하였으며(도 4, 아래 패널), 이러한 매우 엄격한 도전 모델에서 60% 생존을 부여하였고, 이는 ZIK-JEprM/E가 또한 효율적인 ZIKV 백신임을 보여준다. ZIKV에 대한 ZIK-JEprM/E에 의한 이러한 보호는 (i) 플라비바이러스에 대한 보호가 ZIK-JEprM/E에 의해 유도될 수 없는 nAb의 특이적 유도를 기반으로 하는 것으로 간주되기 때문에 완전히 예상치 못한 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Katholieke Universiteit Leuven <120> Chimeric Zika-Japanese Encephalitis virus <130> ZL915092 <150> EP19168482.8 <151> 2019-04-10 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric Zika-JEV vrius <220> <221> CDS <222> (108)..(10379) <400> 1 agttgttgat ctgtgtgaat cagactgcga cagttcgagt ttgaagcgaa agctagcaac 60 agtatcaaca ggttttattt tggatttgga aacgagagtt tctggtc atg aaa aac 116 Met Lys Asn 1 cca aaa aag aaa tcc gga gga ttc cgg att gtc aat atg cta aaa cgc 164 Pro Lys Lys Lys Ser Gly Gly Phe Arg Ile Val Asn Met Leu Lys Arg 5 10 15 gga gta gcc cgt gtg agc ccc ttt ggg ggc ttg aag agg ctg cca gcc 212 Gly Val Ala Arg Val Ser Pro Phe Gly Gly Leu Lys Arg Leu Pro Ala 20 25 30 35 gga ctt ctg ctg ggt cat ggg ccc atc agg atg gtc ttg gcg att cta 260 Gly Leu Leu Leu Gly His Gly Pro Ile Arg Met Val Leu Ala Ile Leu 40 45 50 gcc ttt ttg aga ttc acg gca atc aag cca tca ctg ggt ctc atc aat 308 Ala Phe Leu Arg Phe Thr Ala Ile Lys Pro Ser Leu Gly Leu Ile Asn 55 60 65 aga tgg ggt tca gtt ggg aaa aaa gag gct atg gaa ata ata aag aag 356 Arg Trp Gly Ser Val Gly Lys Lys Glu Ala Met Glu Ile Ile Lys Lys 70 75 80 ttc aag aaa gat ctg gct gcc atg ctg aga ata atc aat gct agg aag 404 Phe Lys Lys Asp Leu Ala Ala Met Leu Arg Ile Ile Asn Ala Arg Lys 85 90 95 gag aag aag aga cga gga gga aat gaa ggc tca atc atg tgg ctc gcg 452 Glu Lys Lys Arg Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met Trp Leu Ala 100 105 110 115 agc ttg gca gtt gtc ata gct tgt gca gga gcc atg aag ttg tcg aat 500 Ser Leu Ala Val Val Ile Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys Leu Ser Asn 120 125 130 ttc cag ggg aag ctt ttg atg acc atc aac aac acg gac att gca gac 548 Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile Asn Asn Thr Asp Ile Ala Asp 135 140 145 gtt atc gtg att ccc acc tca aaa gga gag aac aga tgc tgg gtc cgg 596 Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly Glu Asn Arg Cys Trp Val Arg 150 155 160 gca atc gac gtc ggc tac atg tgt gag gac act atc acg tac gaa tgt 644 Ala Ile Asp Val Gly Tyr 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Arg Val Val Phe Thr Ile Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala 280 285 290 tac agt ttt aat tgt ctg gga atg ggc aat cgt gac ttc ata gaa gga 1028 Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg Asp Phe Ile Glu Gly 295 300 305 gcc agt gga gcc act tgg gtg gac ttg gtg cta gaa gga gac agc tgc 1076 Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys 310 315 320 ttg aca atc atg gca aac gac aaa cca aca ttg gac gtc cgc atg att 1124 Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu Asp Val Arg Met Ile 325 330 335 aac atc gaa gct agc caa ctt gct gag gtc aga agt tac tgc tat cat 1172 Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr His 340 345 350 355 gct tca gtc act gac atc tcg acg gtg gct cgg tgc ccc acg act gga 1220 Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr Gly 360 365 370 gaa gcc cac aac gag aag cga gct gat agt agc tat gtg tgc aaa caa 1268 Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys Gln 375 380 385 ggc ttc act gac cgt ggg tgg ggc aac gga tgt gga ttt ttc 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gag tgg ttt cat gac ctc gct 1652 Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe His Asp Leu Ala 500 505 510 515 ctc ccc tgg acg tcc cct tcg agc aca gcg tgg aga aac aga gaa ctc 1700 Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp Arg Asn Arg Glu Leu 520 525 530 ctc atg gaa ttt gaa ggg gcg cac gcc aca aaa cag tcc gtt gtt gct 1748 Leu Met Glu Phe Glu Gly Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala 535 540 545 ctt ggg tca cag gaa gga ggc ctc cat cat gcg ttg gca gga gcc atc 1796 Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His His Ala Leu Ala Gly Ala Ile 550 555 560 gtg gtg gag tac tca agc tca gtg atg tta aca tca ggc cac ctg aaa 1844 Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Met Leu Thr Ser Gly His Leu Lys 565 570 575 tgt agg ctg aaa atg gac aaa ctg gct ctg aaa ggc aca acc tat ggc 1892 Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly 580 585 590 595 atg tgt aca gaa aaa ttc tcg ttc gcg aaa aat ccg gtg gac act ggt 1940 Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn Pro Val Asp Thr Gly 600 605 610 cac gga aca gtt gtc att gaa ctc tcc tac tct ggg agt gat ggc ccc 1988 His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro 615 620 625 tgc aaa att ccg att gtt tcc gtt gcg agc ctc aat gac atg acc ccc 2036 Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Met Thr Pro 630 635 640 gtt ggg cgg ctg gtg aca gtg aac ccc ttc gtc gcg act tcc agt gcc 2084 Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ala Thr Ser Ser Ala 645 650 655 aac tca aag gtg ctg gtc gag atg gaa ccc ccc ttc gga gac tcc tac 2132 Asn Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr 660 665 670 675 atc gta gtt gga agg gga gac aag cag atc aac cac cat tgg cac aaa 2180 Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn His His Trp His Lys 680 685 690 gct gga agc acg ctg ggc aag gcc ttt tca aca act ttg aag gga gct 2228 Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr Thr Leu Lys Gly Ala 695 700 705 caa aga ctg gca gcg ttg ggc gac aca gcc tgg gac ttt ggc tct att 2276 Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Ile 710 715 720 gga ggg gtc ttc aac tcc ata gga aga gcc gtt cac caa gtg ttt ggt 2324 Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Arg Ala Val His Gln Val Phe Gly 725 730 735 ggt gcc ttc aga aca ctc ttt ggg gga atg tct tgg atc aca caa ggg 2372 Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly 740 745 750 755 cta atg ggt gcc cta ctg ctc tgg atg ggc gtc aac gca cga gac cga 2420 Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val Asn Ala Arg Asp Arg 760 765 770 tca att gct ttg gcc ttc tta gcc aca gga ggt gtg ctc gtg ttc tta 2468 Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu 775 780 785 gcg acc aat gtg cat gct gat gtg ggg tgc tcg gtg gac ttc tca aag 2516 Ala Thr Asn Val His Ala Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys 790 795 800 aag gag acg aga tgc ggt aca ggg gtg ttc gtc tat aac gac gtt gaa 2564 Lys Glu Thr Arg Cys Gly Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu 805 810 815 gcc tgg agg gac agg tac aag tac cat cct gac tcc ccc cgt aga ttg 2612 Ala Trp Arg Asp Arg Tyr Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu 820 825 830 835 gca gca gca gtc aag caa gcc tgg gaa gat ggt atc tgc ggg atc tcc 2660 Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser 840 845 850 tct gtt tca aga atg gaa aac atc atg tgg aga tca gta gaa ggg gag 2708 Ser Val Ser Arg Met Glu Asn Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu 855 860 865 ctc aac gca atc ctg gaa gag aat gga gtt caa ctg acg gtc gtt gtg 2756 Leu Asn Ala Ile Leu Glu Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val 870 875 880 gga tct gta aaa aac ccc atg tgg aga ggt cca cag aga ttg ccc gtg 2804 Gly Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val 885 890 895 cct gtg aac gag ctg ccc cac ggc tgg aag gct tgg ggg aaa tcg tac 2852 Pro Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr 900 905 910 915 ttc gtc aga gca gca aag aca aat aac agc ttt gtc gtg gat ggt gac 2900 Phe Val Arg Ala Ala Lys Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp 920 925 930 aca ctg aag gaa tgc cca ctc aaa cat aga gca tgg aac agc ttt ctt 2948 Thr Leu Lys Glu Cys Pro Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu 935 940 945 gtg gag gat cat ggg ttc ggg gta ttt cac act agt gtc tgg ctc aag 2996 Val Glu Asp His Gly Phe Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys 950 955 960 gtt aga gaa gat tat tca tta gag tgt gat cca gcc gtt att gga aca 3044 Val Arg Glu Asp Tyr Ser Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr 965 970 975 gct gtt aag gga aag gag gct gta cac agt gat cta ggc tac tgg att 3092 Ala Val Lys Gly Lys Glu Ala Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile 980 985 990 995 gag agt gag aag aat gac aca tgg agg ctg aag agg gcc cat ctg 3137 Glu Ser Glu Lys Asn Asp Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu 1000 1005 1010 atc gag atg aaa aca tgt gaa tgg cca aag tcc cac aca ttg tgg 3182 Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp 1015 1020 1025 aca gat gga ata gaa gag agt gat ctg atc ata ccc aag tct tta 3227 Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu 1030 1035 1040 gct ggg cca ctc agc cat cac aat acc aga gag ggc tac agg acc 3272 Ala Gly Pro Leu Ser His 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Gly Val Leu Val 1150 1155 1160 atc ctg ctc atg gtg cag gaa ggg ctg aag aag aga atg acc aca 3632 Ile Leu Leu Met Val Gln Glu Gly Leu Lys Lys Arg Met Thr Thr 1165 1170 1175 aag atc atc ata agc aca tca atg gca gtg ctg gta gct atg atc 3677 Lys Ile Ile Ile Ser Thr Ser Met Ala Val Leu Val Ala Met Ile 1180 1185 1190 ctg gga gga ttt tca atg agt gac ctg gct aag ctt gca att ttg 3722 Leu Gly Gly Phe Ser Met Ser Asp Leu Ala Lys Leu Ala Ile Leu 1195 1200 1205 atg ggt gcc acc ttc gcg gaa atg aac act gga gga gat gta gct 3767 Met Gly Ala Thr Phe Ala Glu Met Asn Thr Gly Gly Asp Val Ala 1210 1215 1220 cat ctg gcg ctg ata gcg gca ttc aaa gtc aga cca gcg ttg ctg 3812 His Leu Ala Leu Ile Ala Ala Phe Lys Val Arg Pro Ala Leu Leu 1225 1230 1235 gta tct ttc atc ttc aga gct aat tgg aca ccc cgt gaa agc atg 3857 Val Ser Phe Ile Phe Arg Ala Asn Trp Thr Pro Arg Glu Ser Met 1240 1245 1250 ctg ctg gcc ttg gcc tcg tgt ctt ttg caa act gcg atc tcc gcc 3902 Leu Leu Ala Leu Ala Ser Cys Leu Leu Gln Thr Ala Ile Ser Ala 1255 1260 1265 ttg gaa ggc gac ctg atg gtt ctc atc aat ggt ttt gct ttg gcc 3947 Leu Glu Gly Asp Leu Met Val Leu Ile Asn Gly Phe Ala Leu Ala 1270 1275 1280 tgg ttg gca ata cga gcg atg gtt gtt cca cgc act gat aac atc 3992 Trp Leu Ala Ile Arg Ala Met Val Val Pro Arg Thr Asp Asn Ile 1285 1290 1295 acc ttg gca atc ctg gct gct ctg aca cca ctg gcc cgg ggc aca 4037 Thr Leu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Thr Pro Leu Ala Arg Gly Thr 1300 1305 1310 ctg ctt gtg gcg tgg aga gca ggc ctt gct act tgc ggg ggg ttt 4082 Leu Leu Val Ala Trp Arg Ala Gly Leu Ala Thr Cys Gly Gly Phe 1315 1320 1325 atg ctc ctc tct ctg aag gga aaa ggc agt gtg aag aag aac tta 4127 Met Leu Leu Ser Leu Lys Gly Lys Gly Ser Val Lys Lys Asn Leu 1330 1335 1340 cca ttt gtc atg gcc ctg gga cta acc gct gtg agg ctg gtc gac 4172 Pro Phe Val Met Ala Leu Gly Leu Thr Ala Val Arg Leu Val Asp 1345 1350 1355 ccc atc aac gtg gtg gga ctg ctg tta ctc aca agg agt ggg aag 4217 Pro Ile Asn Val Val Gly Leu Leu Leu Leu Thr Arg Ser Gly Lys 1360 1365 1370 cgg agc tgg ccc cct agc gaa gta ctc aca gct gtt ggc ctg ata 4262 Arg Ser Trp Pro Pro Ser Glu Val Leu Thr Ala Val Gly Leu Ile 1375 1380 1385 tgc gca ttg gct gga ggg ttc gcc aag gca gat ata gag atg gct 4307 Cys Ala Leu Ala Gly Gly Phe Ala Lys Ala Asp Ile Glu Met Ala 1390 1395 1400 ggg ccc atg gcc gcg gtc ggt ctg cta att gtc agt tac gtg gtc 4352 Gly Pro Met Ala Ala Val Gly Leu Leu Ile Val Ser Tyr Val Val 1405 1410 1415 tca gga aag agt gtg gac atg tac att gaa aga gca ggt gac atc 4397 Ser Gly Lys Ser Val Asp Met Tyr Ile Glu Arg Ala Gly Asp Ile 1420 1425 1430 aca tgg gaa aaa gat gcg gaa gtc act gga aac agt ccc cgg ctc 4442 Thr Trp Glu Lys Asp Ala Glu Val Thr Gly Asn Ser Pro Arg Leu 1435 1440 1445 gat gtg gcg cta gat gag agt ggt gat ttc tcc ctg gtg gag gat 4487 Asp Val Ala Leu Asp Glu Ser Gly Asp Phe Ser Leu Val Glu Asp 1450 1455 1460 gac ggt ccc ccc atg aga gag atc ata ctc aag gtg gtc ctg atg 4532 Asp Gly Pro Pro Met Arg Glu Ile Ile Leu Lys Val Val Leu Met 1465 1470 1475 acc atc tgt ggc atg aat cca ata gcc ata ccc ttt gca gct gga 4577 Thr Ile Cys Gly Met Asn Pro Ile Ala Ile Pro Phe Ala Ala Gly 1480 1485 1490 gcg tgg tac gta tac gtg aag act gga aaa agg agt ggt gct cta 4622 Ala Trp Tyr Val Tyr Val Lys Thr Gly Lys Arg Ser Gly Ala Leu 1495 1500 1505 tgg gat gtg cct gct ccc aag gaa gta aaa aag ggg gag acc aca 4667 Trp Asp Val Pro Ala Pro Lys Glu Val Lys Lys Gly Glu Thr Thr 1510 1515 1520 gat gga gtg tac aga gta atg act cgt aga ctg cta ggt tca aca 4712 Asp Gly Val Tyr Arg Val Met Thr Arg Arg Leu Leu Gly Ser Thr 1525 1530 1535 caa gtt gga gtg gga gtt atg caa gag ggg gtc ttt cac act atg 4757 Gln Val Gly Val Gly Val Met Gln Glu Gly Val Phe His Thr Met 1540 1545 1550 tgg cac gtc aca aaa gga tcc gcg ctg aga agc ggt gaa ggg aga 4802 Trp His Val Thr Lys Gly Ser Ala Leu Arg Ser Gly Glu Gly Arg 1555 1560 1565 ctt gat cca tac tgg gga gat gtc aag cag gat ctg gtg tca tac 4847 Leu Asp Pro Tyr Trp Gly Asp Val Lys Gln Asp Leu Val Ser Tyr 1570 1575 1580 tgt ggt cca tgg aag cta gat gcc gcc tgg gac ggg cac agc gag 4892 Cys Gly Pro Trp Lys Leu Asp Ala Ala Trp Asp Gly His Ser Glu 1585 1590 1595 gtg cag ctc ttg gcc gtg ccc ccc gga gag aga gcg agg aac atc 4937 Val Gln Leu Leu Ala Val Pro Pro Gly Glu Arg Ala Arg Asn Ile 1600 1605 1610 cag act ctg ccc gga ata ttt aag aca aag gat ggg gac att gga 4982 Gln Thr Leu Pro Gly Ile Phe Lys Thr Lys Asp Gly Asp Ile Gly 1615 1620 1625 gcg gtt gcg ctg gat tac cca gca gga act tca gga tct cca atc 5027 Ala Val Ala Leu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Ser Gly Ser Pro Ile 1630 1635 1640 cta gac aag tgt ggg aga gtg ata gga ctt tat ggc aat ggg gtc 5072 Leu Asp Lys Cys Gly Arg Val Ile Gly Leu Tyr Gly Asn Gly Val 1645 1650 1655 gtg atc aaa aat ggg agt tat gtt agt gcc atc acc caa ggg agg 5117 Val Ile Lys Asn Gly Ser Tyr Val Ser Ala Ile Thr Gln Gly Arg 1660 1665 1670 agg gaa gaa gag act cct gtt gag tgc ttc gag ccc tcg atg ctg 5162 Arg Glu Glu Glu Thr Pro Val Glu Cys Phe Glu Pro Ser Met Leu 1675 1680 1685 aag aag aag cag cta act gtc tta gac ttg cat cct gga gct ggg 5207 Lys Lys Lys Gln Leu Thr Val Leu Asp Leu His Pro Gly Ala Gly 1690 1695 1700 aaa acc agg aga gtt ctt cct gaa ata gtc cgt gaa gcc ata aaa 5252 Lys Thr Arg Arg Val Leu Pro Glu Ile Val Arg Glu Ala Ile Lys 1705 1710 1715 aca aga ctc cgt act gtg atc tta gct cca acc agg gtt gtc gct 5297 Thr Arg Leu Arg Thr Val Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala 1720 1725 1730 gct gaa atg gag gag gcc ctt aga ggg ctt cca gtg cgt tat atg 5342 Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu Pro Val Arg Tyr Met 1735 1740 1745 aca aca gca gtc aat gtc acc cac tct gga aca gaa atc gtc gac 5387 Thr Thr Ala Val Asn Val Thr His Ser Gly Thr Glu Ile Val Asp 1750 1755 1760 tta atg tgc cat gcc acc ttc act tca cgt cta cta cag cca atc 5432 Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Ser Arg Leu Leu Gln Pro Ile 1765 1770 1775 aga gtc ccc aac tat aat ctg tat att atg gat gag gcc cac ttc 5477 Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu Tyr Ile Met Asp Glu Ala His Phe 1780 1785 1790 aca gat ccc tca agt ata gca gca aga gga tac att tca aca agg 5522 Thr Asp Pro Ser Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile Ser Thr Arg 1795 1800 1805 gtt gag atg ggc gag gcg gct gcc atc ttc atg acc gcc acg cca 5567 Val Glu Met Gly Glu Ala Ala Ala Ile Phe Met Thr Ala Thr Pro 1810 1815 1820 cca gga acc cgt gac gca ttt ccg gac tcc aac tca cca att atg 5612 Pro Gly Thr Arg Asp Ala Phe Pro Asp Ser Asn Ser Pro Ile Met 1825 1830 1835 gac acc gaa gtg gaa gtc cca gag aga gcc tgg agc tca ggc ttt 5657 Asp Thr Glu Val Glu Val Pro Glu Arg Ala Trp Ser Ser Gly Phe 1840 1845 1850 gat tgg gtg acg gat cat tct gga aaa aca gtt tgg ttt gtt cca 5702 Asp Trp Val Thr Asp His Ser Gly Lys Thr Val Trp Phe Val Pro 1855 1860 1865 agc gtg agg aac ggc aat gag atc gca gct tgt ctg aca aag gct 5747 Ser Val Arg Asn Gly Asn Glu Ile Ala Ala Cys Leu Thr Lys Ala 1870 1875 1880 gga aaa cgg gtc ata cag ctc agc aga aag act ttt gag aca gag 5792 Gly Lys Arg Val Ile Gln Leu Ser Arg Lys Thr Phe Glu Thr Glu 1885 1890 1895 ttc cag aaa aca aaa cat caa gag tgg gac ttt gtc gtg aca act 5837 Phe Gln Lys Thr Lys His Gln Glu Trp Asp Phe Val Val Thr Thr 1900 1905 1910 gac att tca gag atg ggc gcc aac ttt aaa gct gac cgt gtc ata 5882 Asp Ile Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Lys Ala Asp Arg Val Ile 1915 1920 1925 gat tcc agg aga tgc cta aag ccg gtc ata ctt gat ggc gag aga 5927 Asp Ser Arg Arg Cys Leu Lys Pro Val Ile Leu Asp Gly Glu Arg 1930 1935 1940 gtc att ctg gct gga ccc atg cct gtc aca cat gcc agc gct gcc 5972 Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro Val Thr His Ala Ser Ala Ala 1945 1950 1955 cag agg agg ggg cgc ata ggc agg aat ccc aac aaa cct gga gat 6017 Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Asn Lys Pro Gly Asp 1960 1965 1970 gag tat ctg tat gga ggt ggg tgc gca gag act gac gaa gac cat 6062 Glu Tyr Leu Tyr Gly Gly Gly Cys Ala Glu Thr Asp Glu Asp His 1975 1980 1985 gca cac tgg ctt gaa gca aga atg ctc ctt gac aat att tac ctc 6107 Ala His Trp Leu Glu Ala Arg Met Leu Leu Asp Asn Ile Tyr Leu 1990 1995 2000 caa gat ggc ctc ata gcc tcg ctc tat cga cct gag gcc gac aaa 6152 Gln Asp Gly Leu Ile Ala Ser Leu Tyr Arg Pro Glu Ala Asp Lys 2005 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gga gtg atg gaa gcc ctg gga aca ctg cca gga cac atg 6512 Ala Phe Gly Val Met Glu Ala Leu Gly Thr Leu Pro Gly His Met 2125 2130 2135 aca gag aga ttc cag gaa gcc att gac aac ctc gct gtg ctc atg 6557 Thr Glu Arg Phe Gln Glu Ala Ile Asp Asn Leu Ala Val Leu Met 2140 2145 2150 cgg gca gag act gga agc agg cct tac aaa gcc gcg gcg gcc caa 6602 Arg Ala Glu Thr Gly Ser Arg Pro Tyr Lys Ala Ala Ala Ala Gln 2155 2160 2165 ttg ccg gag acc cta gag acc ata atg ctt ttg ggg ttg ctg gga 6647 Leu Pro Glu Thr Leu Glu Thr Ile Met Leu Leu Gly Leu Leu Gly 2170 2175 2180 aca gtc tcg ctg gga atc ttc ttc gtc ttg atg agg aac aag ggc 6692 Thr Val Ser Leu Gly Ile Phe Phe Val Leu Met Arg Asn Lys Gly 2185 2190 2195 ata ggg aag atg ggc ttt gga atg gtg act ctt ggg gcc agc gca 6737 Ile Gly Lys Met Gly Phe Gly Met Val Thr Leu Gly Ala Ser Ala 2200 2205 2210 tgg ctc atg tgg ctc tcg gaa att gag cca gcc aga att gca tgt 6782 Trp Leu Met Trp Leu Ser Glu Ile Glu Pro Ala Arg Ile Ala Cys 2215 2220 2225 gtc ctc att gtt gtg ttc cta ttg ctg gtg gtg ctc ata cct gag 6827 Val Leu Ile Val Val Phe Leu Leu Leu Val Val Leu Ile Pro Glu 2230 2235 2240 cca gaa aag caa aga tct ccc cag gac aac caa atg gca atc atc 6872 Pro Glu Lys Gln Arg Ser Pro Gln Asp Asn Gln Met Ala Ile Ile 2245 2250 2255 atc atg gta gca gta ggt ctt ctg ggc ttg att acc gcc aat gaa 6917 Ile Met Val Ala Val Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Ala Asn Glu 2260 2265 2270 ctc gga tgg ttg gag aga aca aag agt gac cta agc cat cta atg 6962 Leu Gly Trp Leu Glu Arg Thr Lys Ser Asp Leu Ser His Leu Met 2275 2280 2285 gga agg aga gag gag ggg gca acc ata gga ttc tca atg gac att 7007 Gly Arg Arg Glu Glu Gly Ala Thr Ile Gly Phe Ser Met Asp Ile 2290 2295 2300 gac ctg cgg cca gcc tca gct tgg gcc atc tat gct gcc ttg aca 7052 Asp Leu Arg Pro Ala Ser Ala Trp Ala Ile Tyr Ala Ala Leu Thr 2305 2310 2315 act ttc att acc cca gcc gtc caa cat gca gtg acc acc tca tac 7097 Thr Phe Ile Thr Pro Ala Val Gln His Ala Val Thr Thr Ser Tyr 2320 2325 2330 aac aac tac tcc tta atg gcg atg gcc acg caa gct 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Lys Met Gly Gln Val Leu Leu Ile Ala Val Ala Val Ser Ser 2440 2445 2450 gcc ata ctg tcg cgg acc gcc tgg ggg tgg ggg gag gct ggg gcc 7502 Ala Ile Leu Ser Arg Thr Ala Trp Gly Trp Gly Glu Ala Gly Ala 2455 2460 2465 ctg atc aca gcc gca act tcc act ttg tgg gaa ggc tct ccg aac 7547 Leu Ile Thr Ala Ala Thr Ser Thr Leu Trp Glu Gly Ser Pro Asn 2470 2475 2480 aag tac tgg aac tcc tct aca gcc act tca ctg tgt aac att ttt 7592 Lys Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Ala Thr Ser Leu Cys Asn Ile Phe 2485 2490 2495 agg gga agt tac ttg gct gga gct tct cta atc tac aca gta aca 7637 Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Ser Leu Ile Tyr Thr Val Thr 2500 2505 2510 aga aac gct ggc ttg gtc aag aga cgt ggg ggt gga aca gga gag 7682 Arg Asn Ala Gly Leu Val Lys Arg Arg Gly Gly Gly Thr Gly Glu 2515 2520 2525 acc ctg gga gag aaa tgg aag gcc cgc ttg aac cag atg tcg gcc 7727 Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys Ala Arg Leu Asn Gln Met Ser Ala 2530 2535 2540 ctg gag ttc tac tcc tac aaa aag tca ggc atc acc gag gtg tgc 7772 Leu Glu Phe Tyr Ser Tyr 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Val Val Lys Pro Ile Asp Asp Arg Phe Ala His Ala Leu Arg 3190 3195 3200 ttc ttg aat gat atg gga aaa gtt aga aag gac aca caa gag tgg 9752 Phe Leu Asn Asp Met Gly Lys Val Arg Lys Asp Thr Gln Glu Trp 3205 3210 3215 aaa ccc tca act gga tgg gac aac tgg gaa gaa gtt ccg ttt tgc 9797 Lys Pro Ser Thr Gly Trp Asp Asn Trp Glu Glu Val Pro Phe Cys 3220 3225 3230 tcc cac cac ttc aac aag ctc cat ctc aag gac ggg agg tcc att 9842 Ser His His Phe Asn Lys Leu His Leu Lys Asp Gly Arg Ser Ile 3235 3240 3245 gtg gtt ccc tgc cgc cac caa gat gaa ctg att ggc cgg gcc cgc 9887 Val Val Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Ala Arg 3250 3255 3260 gtc tct cca ggg gcg gga tgg agc atc cgg gag act gct tgc cta 9932 Val Ser Pro Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg Glu Thr Ala Cys Leu 3265 3270 3275 gca aaa tca tat gcg cag atg tgg cag ctc ctt tat ttc cac aga 9977 Ala Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Gln Leu Leu Tyr Phe His Arg 3280 3285 3290 agg gac ctc cga ctg atg gcc aat gcc att tgt tca tct gtg cca 10022 Arg Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ser Val Pro 3295 3300 3305 gtt gac tgg gtt cca act ggg aga act acc tgg tca atc cat gga 10067 Val Asp Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Gly 3310 3315 3320 aag gga gaa tgg atg acc act gaa gac atg ctt gtg gtg tgg aac 10112 Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Val Val Trp Asn 3325 3330 3335 aga gtg tgg att gag gag aac gac cac atg gaa gac aag acc cca 10157 Arg Val Trp Ile Glu Glu Asn Asp His Met Glu Asp Lys Thr Pro 3340 3345 3350 gtt acg aaa tgg aca gac att ccc tat ttg gga aaa agg gaa gac 10202 Val Thr Lys Trp Thr Asp Ile Pro Tyr Leu Gly Lys Arg Glu Asp 3355 3360 3365 ttg tgg tgt gga tct ctc ata ggg cac aga ccg cgc acc acc tgg 10247 Leu Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly His Arg Pro Arg Thr Thr Trp 3370 3375 3380 gct gag aac att aaa aac aca gtc aac atg gtg cgc agg atc ata 10292 Ala Glu Asn Ile Lys Asn Thr Val Asn Met Val Arg Arg Ile Ile 3385 3390 3395 ggt gat gaa gaa aag tac atg gac tac cta tcc acc caa gtt cgc 10337 Gly Asp Glu Glu Lys Tyr Met Asp Tyr Leu Ser Thr Gln Val Arg 3400 3405 3410 tac ttg ggt gaa gaa ggg tct aca cct gga gtg ctg taa gca 10379 Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Ser Thr Pro Gly Val Leu Ala 3415 3420 ccaatcttaa tgttgtcagg cctgctagtc agccacagct tggggaaagc tgtgcagcct 10439 gtgacccccc caggagaagc tgggaaacca agcctatagt caggccgaga acgccatggc 10499 acggaagaag ccatgctgcc tgtgagcccc tcagaggata ctgagtcaaa aaaccccacg 10559 cgcttggagg cgcaggatgg gaaaagaagg tggcgacctt ccccaccctt caatctgggg 10619 cctgaactgg agatcagctg tggatcccca gaagagggac tagtggttag aggagacccc 10679 ccggaaaacg caaaacagca tattgacgct gggaaagacc agagactcca tgagtttcca 10739 ccacgctggc cgccaggcac agatcgccga atagcggcgg ccggtgtggg gaaatccatg 10799 ggtct 10804 <210> 2 <211> 3422 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Lys Asn Pro Lys Lys Lys Ser Gly Gly Phe Arg Ile Val Asn Met 1 5 10 15 Leu Lys Arg Gly Val Ala Arg Val Ser Pro Phe Gly Gly Leu Lys Arg 20 25 30 Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gly His Gly Pro Ile Arg Met Val Leu 35 40 45 Ala 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2445 Asp Gly Arg Ser Ile Val Val Pro Cys Arg His Gln Asp Glu Leu 2450 2455 2460 Ile Gly Arg Ala Arg Val Ser Pro Gly Ala Gly Trp Ser Ile Arg 2465 2470 2475 Glu Thr Ala Cys Leu Ala Lys Ser Tyr Ala Gln Met Trp Gln Leu 2480 2485 2490 Leu Tyr Phe His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Met Ala Asn Ala Ile 2495 2500 2505 Cys Ser Ser Val Pro Val Asp Trp Val Pro Thr Gly Arg Thr Thr 2510 2515 2520 Trp Ser Ile His Gly Lys Gly Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met 2525 2530 2535 Leu Val Val Trp Asn Arg Val Trp Ile Glu Glu Asn Asp His Met 2540 2545 2550 Glu Asp Lys Thr Pro Val Thr Lys Trp Thr Asp Ile Pro Tyr Leu 2555 2560 2565 Gly Lys Arg Glu Asp Leu Trp Cys Gly Ser Leu Ile Gly His Arg 2570 2575 2580 Pro Arg Thr Thr Trp Ala Glu Asn Ile Lys Asn Thr Val Asn Met 2585 2590 2595 Val Arg Arg Ile Ile Gly Asp Glu Glu Lys Tyr Met Asp Tyr Leu 2600 2605 2610 Ser Thr Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu Glu Gly Ser Thr Pro Gly 2615 2620 2625 Val Leu 2630 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence linking Zika C protein and the signal sequence of the C terminal part of the C protein of the Japanese encephalitis virus <400> 7 Glu Lys Lys Arg Arg Gly Gly Asn Glu Gly 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence linking JEV prME protein and Zika NS protein <400> 8 Ala Thr Asn Val His Ala Asp Val Gly Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence flankeing JEV prME Lys- Glu mutation <400> 9 Gln Ala Ala Glu Phe Thr Val 1 5 <210> 10 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment zika virus <400> 10 Arg Lys Glu Lys Lys Arg Arg Gly Ala Asp Thr Ser Val Gly Ile Val 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala Ala Glu Val Thr Arg Arg Gly 20 25 30 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment Zika JE chimer <400> 11 Arg Lys Glu Lys Lys Arg Arg Gly Ala Asp Thr Ser Val Gly Ile Val 1 5 10 15 Gly Leu Leu Leu Thr Thr Ala Met Ala Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln 20 25 30 <210> 12 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment Zika JE chimer <400> 12 Arg Lys Glu Lys Lys Arg Arg Gly Gly Asn Glu Gly Ser Ile Met Trp 1 5 10 15 Leu Ala Ser Leu Ala Val Val Ala Cys Ala Gly Ala Met Lys Leu Ser 20 25 30 Asn Phe Gln 35

Claims (29)

  1. 생, 감염성, 약독화 지카-일본 뇌염(JEV) 키메라 바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
    뉴클레오티드 서열은 일본 뇌염 바이러스 prME 단백질을 코딩하여, 상기 일본 뇌염 바이러스의 상기 prME 단백질이 발현되도록 하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 서열은 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열을 코딩하여 상기 일본 뇌염 바이러스의 상기 신호 서열이 발현되도록 하는, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    추가로 위치 1482에서 A에서 G 뉴클레오티드로의 치환에 의해 SEQ ID NO: 1로 도시된 JEV E 유전자 영역의 야생형 서열과 비교해서 상이한, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, JEV prME 단백질의 코딩된 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 5의 서열을 갖는, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열의 코딩된 아미노산 서열은 서열 GGNEGSIMWLASLAVV[SEQ ID NO: 4]를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 C 단백질과 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열을 연결하는 코딩된 아미노산 서열은 서열 EKKRR GGNEG[SEQ ID NO: 7]를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 C 단백질과 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열을 연결하는 코딩된 아미노산 서열은 서열 EKKRR GGNEG[SEQ ID NO: 7]를 포함하고/하거나, JEV prME 단백질과 지카 NS 단백질을 연결하는 코딩된 아미노산 서열은 서열 ATNVH ADVGC[SEQ ID NO: 8]를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 바이러스는 BeH819015 균주인, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1로 도시된 뉴클레오티드 108 내지 10379로부터의 개방 해독 프레임을 포함하는, 폴리뉴클레오티드(정지코돈 포함).
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 1로 도시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2로 도시된 폴리펩티드 서열을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 인공 염색체인, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, BAC는:
    - 박테리아 세포 당 10개 초과의 카피로 상기 BAC를 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
    - 상기 지카 -JEV 키메라 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA를 감염성 RNA 바이러스로 처리하기 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  14. 키메라 바이러스의 prME 단백질이 일본 뇌염 바이러스의 prME 단백질인 것을 특징으로 하는 생, 감염성, 약독화 지카 -일본 뇌염(JEV) 키메라 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 키메라 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열은 일본 뇌염 바이러스의 C 단백질의 C 말단 부분의 신호 서열인, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 서열 QAAEFTV[SEQ ID NO: 9]의 prME 폴리펩티드를 포함하는, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, JEV 바이러스의 신호 서열 및 prME 단백질은 SEQ ID 4 및 5로 도시된 아미노산 서열을 갖는, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, JEV 바이러스는 SA14-14-2인, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지카 바이러스는 BeH819015 균주인, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 GGNEGSIMWLASLAVV[SEQ ID NO: 4]를 포함하고, 지카 바이러스의 C 단백질과 JEV 바이러스의 신호 펩티드의 접합부에 아미노산 서열 EKKRR GGNEG[SEQ ID NO: 7]를 포함하는, 지카 - JEV 키메라 바이러스.
  21. 백신으로서 사용하기 위한, 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스, 또는 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스를 코딩하는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드.
  22. 지카 바이러스 및/또는 일본 뇌염에 대한 예방에서 백신으로 사용하기 위한, 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스, 또는 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스를 코딩하는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드.
  23. 제22항에 있어서, 지카 바이러스 및 일본 뇌염에 대한 동시 예방에서 백신으로 사용하기 위한, 키메라 바이러스 또는 폴리뉴클레오티드.
  24. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 지카 일본 뇌염 키메라 바이러스, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  26. 지카 및/또는 일본 뇌염 감염에 대한 백신 제조 방법으로서:
    a) 다음을 포함하는 BAC를 제공하는 단계
    - 박테리아 세포 당 10개 초과의 카피로 상기 BAC를 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
    - 제1항 내지 제13항 중 어느 하나에 따른 지카_JEV 키메라 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA를 감염성 RNA 바이러스로 처리하기 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트
    b) 포유류 세포를 단계 a)의 BAC로 형질감염시키고 감염된 세포를 계대하는 단계
    c) 단계 b)의 형질감염된 세포의 복제된 바이러스의 병독성(virulence) 및 항체 생성 능력 및 지카 바이러스 감염에 대한 보호 유도 능력을 검증하는 단계,
    d) 단계 c에서 검증된 바이러스를 벡터로 클로닝하는 단계,
    e) 벡터를 백신 제형으로 제형화하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 벡터는 박테리아 세포 당 10개 초과의 카피로 상기 BAC를 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 BAC인, 방법.
  28. 대상체에서 JE 바이러스 및/또는 지카 바이러스에 대한 중화 및/또는 보호 항체 반응을 유도하여, JE 바이러스 및/또는 지카에 의한 감염을 예방하는 방법으로서, 제14항 내지 제20항의 지카 - 일본 뇌염 키메라 바이러스를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 대상체에서 JE 바이러스 및/또는 지카 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도하여, JE 바이러스 및/또는 지카에 의한 감염을 예방하는 방법으로서, 제14항 내지 제20항의 지카 - 일본 뇌염 키메라 바이러스를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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