KR20220009984A

KR20220009984A - 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응을 치료하는데 사용하기 위한 합토글로빈

Info

Publication number: KR20220009984A
Application number: KR1020217040408A
Authority: KR
Inventors: 미하엘 휴겔쇼퍼; 크리스티앙 샤에르; 도미닉 샤에르
Original assignee: 유니베르시태트 취리히; 체에스엘 베링 아게
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2022-01-25
Also published as: SG11202112117TA; CN114007639A; AU2020277640A1; EP3968988A1; BR112021022940A2; US20220211808A1; CA3138650A1; WO2020234195A1; IL287864A; JP2022533365A; CL2021003033A1

Abstract

본 발명은 일반적으로 혈관외 용혈 및 무세포 헤모글로빈(Hb)의 뇌척수액(CSF)으로의 방출을 수반하는 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 CSF를, 상기 합토글로빈(Hp) 또는 이의 기능적 유사체가 무세포 헤모글로빈(Hb)과 복합체를 형성해 상기 무세포 Hb를 중화시키기에 충분한 시간 동안, 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계를 포함하는 것인, 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 추가로 Hp를 포함하는 인공 CSF의 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응을 치료하는데 사용하기 위한 합토글로빈

본 발명은 일반적으로 뇌척수액(CSF) 구획으로의 출혈성 뇌졸중 후, 특히 지주막하 출혈(SAH) 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 특허 또는 특허 출원을 포함한 모든 참조는 본 발명의 완전한 이해를 가능하게 하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 참조는 이러한 문서 중 어느 것이 호주 또는 기타 국가에서 당업계의 일반적인 상식의 일부를 형성한다는 승인을 구성하는 것으로 해석되어서는 안된다.

출혈성 뇌졸중은 뇌의 내부 또는 표면에 있는 혈관의 파열과 함께 주변 조직으로의 출혈을 수반한다. 출혈성 뇌졸중의 예는 i) 뇌의 혈관 파열을 수반하는 뇌내 출혈(본원에서 ICH라고 함); ii) 뇌실계로 출혈하는 뇌실내 출혈(본원에서 IVH라고 함); 및 iii) 지주막하 공간으로 알려진 뇌와 뇌를 덮고 있는 조직 사이의 공간에서의 출혈을 수반하는 지주막하 출혈(본원에서 SAH라고 함)을 포함한다. 가장 흔한 SAH는 파열 동맥류(본원에서 aSAH라고 함)에 의해 야기된다. SAH의 다른 원인은 두부 손상, 출혈 장애 및 혈액 희석제(blood thinner) 사용을 포함한다.

IVH의 대략 30%는 주로 대상체의 뇌실계에 국한되며 전형적으로 뇌실내 외상, 동맥류, 혈관 기형 또는 종양, 특히 맥락총의 종양에 의해 유발된다. 나머지 70%는 본질적으로 이차성이며, 실질내 또는 SAH 여부에 관계없이 기존 출혈의 확장으로부터 야기된다. IVH는 중등도 내지 중증 외상성 뇌 손상의 35%에서 발생하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 IVH는 통상적으로 광범위한 관련 손상 없이 발생하지 않는다.

동맥류성 지주막하 출혈(aSAH)은 SAH의 가장 흔한 원인이며 사망률 및 장기 신경학적 장애의 가장 높은 비율과 관련이 있다¹ ^, ². 동맥류 복구 및 신경 집중 치료의 발전에도 불구하고, 병원내 중례 치명률 중간값은 유럽에서 44.4%, 미국에서 32.2%이다³. 생존자의 35%는 출혈 사건 후 1년 동안 전반적인 삶의 질이 좋지 못하고 83-94%는 직장으로 복귀할 수 없는 것으로 보고된다⁴ ^- ⁶. 미국에서 파열된 두개내 동맥류로 인한 aSAH의 추정 발병률은 10,000명당 1명으로 매년 대략 27,000명의 새로운 사례가 발생한다. 또한, aSAH는 남성보다 여성에게 더 흔하며(2:1); 최고 발병률은 55세 내지 60세 사람에서 나타난다.

출혈성 뇌졸중 환자의 관리 개선 및 지난 수십 년간 치명률의 감소에도 불구하고, 이 집단에서 장애 및 사망률은 여전히 높다. 뇌 손상은 SAH 직후 및 후 SAH 후 첫날에 발생할 수 있다. 이러한 조기 뇌 손상은 증가된 두개내압, 헤르니아형성, 뇌내, 뇌실내 출혈, 및 수두증과 같은 뇌에 대한 물리적 영향으로 인한 것일 수 있다. 혈관조영술 뇌혈관 경련(ACV)을 포함하여 후속적으로 2차 신경학적 이상 반응이 발생하며, 이것은 더 심각한 경우 지연성 뇌허혈(DCI) 및 뇌경색으로 이어질 수 있다. 지연성 허혈성 신경학적 결손(DIND)의 발생을 갖는 2차 신경학적 이상 반응은 전형적으로 초기 출혈 또는 출혈 후 4일 내지 14일 사이에 발생하며, 이러한 환자에서 장애 및 사망률에 대한 주요 기여인자이다. DIND는 뇌허혈의 독특한 증후군이다. 중가된 두통, 수막증 및 체온에는 전형적으로 의식의 변동적인 저하 및 국소 신경학적 증상의 출현이 뒤따른다. 임상 DIND는 적어도 두 개의 글래스고 혼수 척도(Glasgow Coma scale; GCS) 수준에 의한 의식의 지연된 감소 및/또는 새로운 국소 신경학적 결손으로 정의될 수 있다. 연속 CT 스캔은 수술 후, 임상 악화 시점에 및 모니터링 기간 후에 수행하여 지연 경색을 선별할 수 있다. 이것은 선택된 경우에 MRI로 보완될 수 있다. DIND의 발병기전은 부분적으로만 이해되고 있지만, 다인성인 것으로 널리 받아들여지고 있다⁷. 예를 들어, 신경염증은 부상 확장 및 뇌 손상에 중요한 역할을 한다. 적혈구 분해 산물은 혈관경련과 조직 손상을 유발하는 염증성 사이토카인의 방출로 이어질 수 있다⁸. 말초 면역 세포는 손상된 조직에서 모집되고 활성화된다. 이들 세포는 뇌 실질에 들어가 염증성 사이토카인을 방출할 수 있다⁹. 또한, 내재적 톨-유사 수용체가 경색 후 상향조절되어 광범위한 신경염증을 야기한다. 신경염증은 또한 SAH 후 발생하는 2차 이상 반응과 관련이 있다¹⁰. 뇌혈관 경련(CV)을 겪는 혈관은 지연된 신경학적 악화에 기여하는 백혈구 부착 능력을 증가시켰다¹⁵.

또한 잠재적으로 뇌 손상을 일으킬 수 있는 것은 염증, 대뇌 미세혈전증, 피질 확산성 허혈, 혈액-뇌 장벽 파괴, 및 지연성 뇌허혈(DCI)이다.

불행히도, 이러한 과정에 대한 약리학적 치료는 아직 출혈성 뇌졸중에서 효능을 나타내지 않았다. 경장 니모디핀 및 aSAH의 주범 동맥류의 혈관내 치료는 환자의 결과를 개선하기 위한 무작위 임상 시험으로부터의 증거에 의해 뒷받침되는 유일한 치료 옵션으로 남아 있다. 따라서, 출혈성 뇌졸중 후 환자에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 및/또는 예방하기 위한 특정 치료법에 대한 긴급하고 충족되지 않은 요구가 있다.

본 발명의 측면에서, 혈관외 용혈 및 무세포 헤모글로빈(Hb)의 뇌척수액(CSF)으로의 방출을 수반하는 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응 (adverse secondary neurological outcome)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 CSF를, 합토글로빈(Hp)이 무세포 헤모글로빈(Hb)과 복합체를 형성해 상기 무세포 Hb를 중화시키기에 충분한 시간 동안, 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계를 포함하는 것인, 방법이 제공된다.

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법에 따라 뇌실내 출혈 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 합토글로빈(Hp) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법에 따라 뇌실내 출혈 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 합토글로빈(Hp) 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법에 따라 뇌실내 출혈 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 치료학적 유효량의 합토글로빈(Hp)의 용도가 제공된다.

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 인공 CSF 또는 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.

도 1은 횡경사대 접근(transclival approach)을 통한 갓 도축된 돼지로부터의 돼지 뇌저 동맥 단리의 예시적인 예이다. 광범위한 기계적 혈관 조작을 피하면서 해부 현미경 하에서 동물당 5-6개 혈관 고리(길이 2mm)를 준비하였다.
도 2는 좌측뇌실의 전두각으로 들어가는 외부 뇌실 드레인(EVD), 오른쪽 정면 백질의 이식된 신경모니터링 프로브 및 후두하 척추 바늘이 있는 실험 설정의 계획 및 수술중 사진을 보여준다.
도 3은 디지털 감산 혈관조영술(DSA)로부터의 혈관 직경의 반자동 정량화를 보여준다. 좌측 도면 및 우측 상단의 인레이는 전대뇌 동맥(ACA), 중대뇌 동맥(MCA), 내경동맥(ICA)의 수조 부분 및 뇌저 동맥(BA)에서 선형 관심 영역(ROI)의 예시적인 선택을 보여준다. 이들은 ACA, cICA 및 BA의 직선 부분에서 0.5mm(숫자 5개) 간격으로 자동으로 설정되고 MCA의 곡선 부분(숫자 3개)에서 수동으로 설정되었다. 모든 ROI의 경우 혈관 직경은 2010년에 Fischer 등(우측 하단)에 의해 이전에 기술된 바와 같이 단면의 강도 프로파일(우측 중앙)로부터 계산되었고 각 혈관의 모든 ROI에 걸쳐 평균을 내었다.
도 4는 단리된 돼지 뇌저 동맥을 사용한 혈관 기능 실험에서 무세포 Hb의 효과를 보여준다. A, 완충액에 MAHMA NONOate(60nM)를 첨가한 후, 돼지 두개기부로부터 혈관 분절의 NO-매개된 혈관 확장 반응이 관찰될 수 있다(회색 트레이스). 10μM oxyHb를 함유하는 완충액(검은 트레이스)에서, MAHMA NONOate의 첨가 후 혈관 확장 반응이 관찰되지 않았다. 트레이스는 완충액 및 완충액 + Hb에 대해 각각 15개 및 14개 용기의 평균 ± SD를 보여준다. B, 10μM Hb를 함유하는 완충액에 등몰 농도의 Hp를 첨가한 후, MAHMA NONOate에 대한 혈관 확장 반응이 회복된다. 트레이스는 그룹당 16개 혈관의 평균 ± SD를 보여준다. 이 실험에서 혈관 반응은 최적의 IC1/IC100 비율로 수동적 스트레칭 후 장력(= 100%) 및 PF2α의 첨가 후 긴장 수축의 수준(= 0%)에 대해 정규화되었다.
도 5는 Hp-컬럼에 의한 Hb의 선택적 제거 전(어두움)과 후(밝음)의 (원심분리된) 용혈 환자 CSF 샘플의 이미지 및 흡수 스펙트럼을 보여준다. Hb 제거는 CSF에 침지된 돼지 뇌저 동맥 분절의 긴장 기록의 일시적 감소에 의해 표시된 바와 같이 MAHMA NONOate 투여에 대한 혈관 확장 반응을 회복하였다(회색). 확장성 NO-신호는 Hb-고갈 전 동일한 CSF 샘플에서 결합되지 않은 상태로 유지된다(검정색).
도 6은 CSF에 MAHMA-NONOate를 투여한 후 aSAH가 있는 환자(n = 9)로부터의 CSF에 침지된 돼지 뇌저 동맥에서의 확장성 NO-신호 결합을 보여준다. 동맥은 용혈 전 CSF(좌측 패널), 용혈 CSF(중간 패널) 및 용혈 CSF에 Hp를 첨가한 후(우측 패널)에 순차적으로 조사되었다.
도 7은 디지털 감산 혈관조영술, 해부학적 표본 사진 및 T1 강조 MR 영상의 곡선형 다평면 재구성(곡선 MPR)에서의 대뇌동맥륜(circle of Willis)을 보여준다. 곡선 MPR의 밝은(흰색) 신호는 관상 영상 이미지에 표시된 바와 같이 후교통 동맥(PCOM)과 뇌저 동맥(BA)을 둘러싸고 있는 주입된 혈단백(이 예에서는 Hb-Hp 복합체)을 나타낸다. 곡선 MPR에서 점선(1-3)은 관상 절편의 위치를 나타낸다.
도 8은 핵("Nuclei") 및 표지된 화합물("TCO-Hb" 또는 "TCO-HbHp")에 대해 염색된, TCO-표지된 Hb(A) 및 TCO-표지된 Hb:Hp(B)의 주사 후 측뇌실을 통한 양 뇌 절편의 대표적인 조직학적 이미지를 보여준다. A , Hb는 뇌실계로부터 뇌실막 장벽을 통해 뇌 간질 공간으로 침투한다(A의 "TCO-Hb" 이미지에서 밝은 영역). B , 뇌실막 장벽을 통해 뇌 간질 공간으로의 Hb:Hp 복합체의 침투는 Hb 단독에 비해 대폭 감소된다. 그러나, 뇌실막 장벽의 무결성이 방해받는 경우(예를 들어, EVD의 이식 후 국부 손상), Hb:Hp가 국부적으로 뇌 조직(화살촉)으로 침투한다. 전체 슬라이드 스캔은 10x 배율로 수득된 단일 이미지를 스티칭하여 생성되었다. 상부 패널은 핵 염색(Hoechst) 및 각각 TCO-표지된 Hb 또는 Hb:Hp(Tet-Cy5)의 오버레이를 표시하는 반면 하부 패널은 표지된 단백질만을 보여준다.
도 9는 핵("Nuclei") 및 표지된 화합물("TCO-Hb" 또는 "TCO-HbHp")에 대해 염색된, TCO-표지된 Hb(A) 및 TCO-표지된 Hb:Hp(B)의 주사 후 중뇌를 통한 양 뇌 절편의 대표적인 조직학적 이미지를 보여준다. A , Hb는 두개골 지주막하 CSF 공간으로부터 중뇌의 아교 경계막을 통해 뇌 실질로 침투한다(A의 "TCO-Hb" 이미지에서 밝은 영역). B , Hb:Hp 복합체의 분포는 침투하는 피질 혈관의 CSF로 채워진 혈관주위 공간(Virchow-Robin-Spaces)으로 제한된다. 전체 슬라이드 스캔은 10x 배율로 수득된 단일 이미지를 스티칭하여 생성되었다. 상부 패널은 핵 염색 및 표지된 화합물의 오버레이를 표시하는 반면 하부 패널은 표지된 화합물만을 보여준다.
도 10은 TCO-표지된 Hb(A-D) 또는 Hb:Hp 복합체(E-H)의 주입 후 양으로부터의 중뇌 뇌실주위 영역에 있는 작은 동맥의 대표적인 공초점 이미지를 보여준다. 혈관 평활근 세포(aSMA), 성상세포 엔드-피트(AQP4) 및 TCO-표지된 Hb(테트라진-Cy5)에 대해 120μm 바이브라톰 부분을 염색하였다. 흑색에서 백색으로의 기울기 이미지(Hb 신호)는 해당 이미지로부터의 표지된 혈단백의 신호만을 표시한다. CSF로부터 혈관 구조(평활근 세포층) 및 뇌 실질(성상세포 영역)으로의 무세포 Hb의 비편재화는 Hp에 의해 차단된다. 기준자는 20μm이다.
도 11은 Hb(A) 또는 Hb:Hp 복합체(B)의 주입 후 두 마리 양의 측면 투영에서 예시적인 DSA의 비교를 보여준다. 뇌저 동맥의 분절 혈관경련(화살표)은 Hb 주입 후 60분에 명백한 반면 Hb:Hp 복합체가 주입된 동물에서는 분절 혈관경련이 검출되지 않았다.
도 12는 측면 투영에서 중대뇌 동맥(화살촉, 상부 패널) 및 배복측 투영에서 전대뇌 동맥(화살표, 하부 패널) 뿐만 아니라 중대뇌 동맥(별표, 하부 패널)의 분절 혈관경련의 예시적인 기준선(A) 및 Hb 주입 60분 후(B) 혈관조영상을 보여준다. 이미지는 모든 주요 혈관 영역에서 발생하는 분절 혈관경련을 보여준다.
도 13. 상부 패널(A)은 Hb 또는 Hb:Hp 주입 60분 후 대뇌 동맥 직경의 상대적 변화를 보여준다(ACA: 전대뇌 동맥, BA: 뇌저 동맥, ICA: 내경동맥, MCA: 중대뇌 동맥). 다이아몬드는 평균과 95% 신뢰 구간을 나타낸다(n=그룹당 양 4마리). 하부 패널은 aCSF(B), Hb 또는 Hb:Hp(C) 주입 60분 후 모든 분석된 동맥 영역의 상대 직경 변화의 누적 분석을 보여준다. 다이아몬드는 평균과 95% 신뢰 구간을 나타낸다. (ACA: 전대뇌 동맥, BA: 뇌저 동맥, ICA: 내경동맥, MCA: 중대뇌 동맥).
도 14는 표시된 바와 같이 (A) Hb 및 (나중에) Hp의 뇌실내 주입 후 지주막하 공간으로부터 수집된 양 CSF 샘플의 순차적 SEC 용출 프로파일을 보여준다. Hb 및 Hb-Hp 복합체의 표준 용출 프로파일은 상단에 나타내어져 있고; (B) 기준선, Hb 주입 45분 후 및 Hp 주입 45분 후 중대뇌 동맥(MCA)의 DSA를 보여준다.
도 15는 60분 치료후 혈관조영술 전 또는 후에 수집된 양 CSF에 침지된 돼지 뇌저 동맥의 NO-매개된 이완의 결합을 보여준다. 인공 CSF 주입 후(CSF-heme 0μM Hb = ctrl CSF; 좌측 패널), Hb 주입 후(CSF-heme 200-240μM Hb; 중간 패널): Hb-Hp 주입 후(CSF-heme 200-240μM; 우측 패널). 중간 패널의 점선은 등몰 Hp의 생체외 추가를 통한 NO-반응의 구제를 보여준다. 확장성 반응은 모든 실험에서 MAHMA-NONOate의 단일 볼루스로 유도되었다.
도 16은 급성 출혈 후 1일, 4일, 7일, 11일 및 14일에 환자 샘플에서 CSF 단백질의 분류를 보여준다. LC-MSMS에 의해 확인된 단백질은 로그-변환된 정규화 이온 강도 비율의 K-평균 군집화(K-means clustering)에 의해 분석되었다. 우측 패널은 확인된 단백질의 주성분 분석을 보여준다. 군집 1: 변경되지 않은 상태로 남아 있는 단백질(즉, ALB). 군집 2: 시간이 지남에 따라 감소하는 단백질(즉, HP, HPR). 군집 3: 시간이 지남에 따라 증가하는 단백질(즉, HBB, HBA, FTH, HBD, CAT, CA1, FTL). 약어: ALB, 알부민; HP, 합토글로빈; HPR, 합토글로빈 관련 단백질; HBB, Hb-베타; HBA, Hb-알파; FTH, 페리틴 중쇄; HBD, Hb-델타; CAT, 카탈라제; CA1, 탄산 탈수효소; FTL, 페리틴 경쇄.
도 17은 네 번째 뇌실의 맥락 조직(tela choroidea)에 있는 세동맥의 조직형태학적 분석을 보여준다. 양 뇌의 120μm 절편을 알파-평활근 액틴(αSMA)으로 염색하였다. (A) 연구된 뇌 절편의 해부학적 상황의 예시. 치료에 대해 맹검된 연구원이 맥락 조직에 있는 혈관의 공초점 이미지를 기록하였다. (B) Image J 소프트웨어를 사용한 αSMA 포지티브 구조의 내부 및 외부 둘레의 수공 설계에 기반하여, 각 혈관에 대한 내강 면적(A_inner) 및 총 혈관 단면적(A_outer)을 정량화하고, 내강 면적 분율(lumen area fraction)을 계산하였다. 이러한 측정은 3명의 맹검 연구원에 의해 모든 이미지에 대해 수행하였으며, 평균값을 추가로 분석하였다. (C) Hb 및 Hb-합토글로빈 처리된 양의 맥락 조직에 있는 세동맥의 대표적인 이미지. (D) 모든 분석된 혈관에 대한 플롯 데이터 및 통계 분석(n=57). (E) 양(n=3)당 평균 내강 면적에 대한 플롯 데이터 및 통계 분석. 점은 개별 동물을 나타낸다. 다이아몬드는 평균과 95% CI를 나타낸다. 겹침 표시(평균선 위와 아래의 가로선)는 겹치지 않는다면 그룹 간의 통계적으로 유의한 차이를 정의한다(p < 0.05).
도 18은 10μM oxyHb를 함유하는 완충액 내지 MAHMA NONOate (60nM) 내지 재조합 Hp 1-1 또는 혈장-유래 Hp 2-2의 첨가 전(좌측 두 개의 상자 그림) 및 후의 완충액에 침지된 단리된 뇌저 동맥 분절의 반응을 보여준다. Hp 1-1과 Hp 2-2 사이에는 NO-유도된 혈관확장 반응의 회복에 있어 유의한 차이를 관찰할 수 없다. N=시험된 조건당 4개의 혈관 분절.
이 실험에서 혈관 반응은 최적의 IC1/IC100 비율로 수동적 스트레칭 후 장력(= 100%) 및 PF2α의 첨가 후 긴장 수축의 수준(= 0%)에 대해 정규화되었다.
도 19는 10μM oxyHb를 함유하는 완충액 내지 MAHMA NONOate(60nM) 내지 등몰 농도의 혈장-유래 Hp 1-1(검은 점 트레이스) 또는 혈장-유래 Hp 2-2(회색 트레이스)의 첨가 전("Hb 침지" 상부 패널) 및 후("Hp 침지" 하부 패널)에 침지된 단리된 뇌저 동맥 분절의 반응을 보여준다. 혈장-유래 Hp 1-1과 Hp 2-2 사이에는 NO에 대한 혈관확장 반응의 회복에 있어 질적 차이를 알아볼 수 없다. N=시험된 조건당 6개의 혈관 분절.
이 실험에서 혈관 반응은 최적의 IC1/IC100 비율로 수동적 스트레칭 후 장력(= 100%) 및 PF2α의 첨가 후 긴장 수축의 수준(= 0%)에 대해 정규화되었다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 또는 "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 요소 또는 정수의 포함 또는 요소 또는 정수의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 요소 또는 정수의 배제 또는 요소 또는 정수의 그룹의 배제를 의미하지는 않은 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 임의의 이전 간행물(또는 이로부터 파생된 정보) 또는 알려진 임의의 문제에 대한 언급은 이전 간행물(또는 이로부터 파생된 정보) 또는 알려진 문제가 본 명세서와 관련된 노력 분야에서 일반적인 상식의 일부를 형성한다는 승인이나 인정 또는 임의의 형태의 제안이 아니며 그렇게 받아들여져서도 안된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 측면을 포함한다는 것을 주지해야 한다. 따라서, 예를 들면, "제제(an agent)"에 대한 언급은 단일 수지 뿐만 아니라 둘 이상의 제제를 포함하고; "조성물(the composition)"에 대한 언급은 단일 조성물 뿐만 아니라 둘 이상의 조성물을 포함하는 등이다.

반대되는 표시가 없는 경우, 본 명세서 전체에 걸쳐 "%" 함량에 대한 언급은 % w/w(중량/중량)를 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 총 단백질의 적어도 80%의 합토글로빈 함량을 포함하는 용액은 총 단백질의 적어도 80% w/w의 합토글로빈 함량을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로 간주된다.

본 발명은, 적어도 부분적으로, Hp가 생체내에서 뇌혈관경련과 같은 무세포 Hb-매개된 2차 신경학적 이상 반응을 감소시키거나 예방할 수 있다는 본 발명자들의 놀라운 발견에 근거한다. 따라서, 본원에 개시된 측면에서, 혈관외 용혈 및 뇌척수액(CSF)으로의 무세포 헤모글로빈(Hb)의 방출을 수반하는 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 합토글로빈(Hp)에 Hp 또는 이의 기능적 유사체가 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 무세포 Hb를 중화시키기에 충분한 시간 동안 이를 필요로 하는 대상체의 CSF를 노출시킴을 포함한다.

출혈성 뇌졸중

CSF 구획으로의 출혈성 뇌졸중 또는 출혈은 본원에서 상호교환적으로 뇌 출혈, 대뇌 출혈 또는 두개내 출혈이라고도 한다. 이것은 전형적으로 뇌의 혈관이 파열되어 국소 출혈을 일으키는 것을 특징으로 한다. 출혈의 위치는 다를 수 있다. 예를 들면, CSF 구획으로의 출혈은 뇌실내 출혈, 실질내 출혈 및/또는 지주막하 출혈로부터 초래될 수 있다.

출혈성 뇌졸중은, 당업계의 숙련가에게 친숙한 바와 같이, 상이한 자연적 과정, 평가 및 관리를 갖는 다양한 병리로 구성된다. 이것은 일반적으로 병인에 따라 일차 또는 이차로 분류된다.

하나의 양태에서, 출혈성 뇌졸중은 뇌실내 출혈(IVH) 또는 지주막하 출혈(SAH)이다. 하나의 양태에서, 출혈성 뇌졸중은 동맥류성 지주막하 출혈(aSAH)이다.

대상체에서 출혈성 뇌졸중, 특히 SAH를 진단하는 방법은 당업계의 숙련가에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 뇌혈관 조영술, 컴퓨터 단층촬영(CT) 및 대상체의 CSF에서 oxyHb 및 빌리루빈의 분광광도 분석을 포함한다(예를 들면, 참조; Cruickshank AM., 2001, ACP Best Practice No 166, J. Clin . Path., 54(11):827-830).

출혈성 뇌졸중은 자발성 출혈(예를 들어, 파열된 동맥류의 결과로서) 또는 외상성 출혈(예를 들어, 두부에 대한 외상의 결과로서)일 수 있다는 것이 당업계의 숙련가들에 의해 이해될 것이다. 하나의 양태에서, 출혈성 뇌졸중은 비외상성 출혈로도 알려진 자발성 출혈이다. 하나의 양태에서, 출혈성 뇌졸중은 외상성 출혈이다.

용어 "뇌척수액" 또는 CSF는 뇌실 및 두개골 및 척추 지주막하 공간 내의 유체를 의미하는 것으로 이해된다. 뇌실, 두개골 및 척추 지주막하 공간은 본원에서 "CSF 구획"으로 집합적으로 지칭된다. 따라서, 본원에 개시된 양태에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF 구획을 노출시킴을 포함한다.

CSF는 맥락막총에 의해 주로 분비되지만 전적으로 그러한 것은 아니며, 맥락막총은 뇌실 내강으로의 과립형 뇌막 돌출부로 구성되고, 이의 상피 표면은 뇌실막과 연관되어 있다. 연구에서는 또한 뇌 간질액, 뇌실막 및 모세혈관도 CSF 분비에서 역할을 할 수 있음을 제안하였다. CSF 용적은 성인에서 약 150mL로 추정되며, 전형적으로 두개골 및 척추 지주막하 공간에서 125mL 내지 뇌실에서 25mL 사이에 분포하지만 개인 간에 현저한 차이가 있다. 성인에서 CSF 분비는 하루 400 내지 600mL로 다양하며, CSF의 약 60 내지 75%는 측뇌실의 맥락막총 및 제3 뇌실과 제4 뇌실의 맥락 조직에 의해 생성된다. CSF의 맥락막 분비는 전형적으로 두 단계를 포함한다: (i) 압력 구배에 따라 맥락막 모세혈관에서 맥락막 간질 구획으로의 혈장의 수동 여과 및 (ii) 탄산 탈수효소 및 막 이온 운반체 단백질을 수반하는, 맥락막 상피를 가로질러 간질 구획에서 심실 내강으로의 능동 수송. CSF는 전해질 균형의 조절, 활성 분자의 순환 및 이화산물의 제거에 의해 뇌 간질액과 신경 환경의 항상성에 필수적인 역할을 한다. CSF는 맥락막총 분비 산물을 이들의 작용 부위로 수송하여 함침에 의해 뇌의 특정 영역의 활성을 조절하는 반면 시냅스 전달은 활성의 보다 빠른 변화를 생성한다. 뇌 대사의 폐기물, 과산화 산물 및 글리코실화된 단백질은 노화와 관련된 CSF 회전율 감소와 함께 축적된다(Sakka et al., 2011, European Annals of Otorhinolaryngology , Head and Neck Diseases, 128(6):309-316).

2차 신경학적 이상 반응

SAH와 같은 출혈성 뇌졸중에서 살아남은 환자는 하나 이상의 2차 신경학적 이상 반응 또는 합병증이 발생할 상당한 위험이 있다. 본원에 사용된 용어 "2차 신경학적 이상 반응"는 출혈성 뇌졸중에 뒤따르는 신경학적 이상 반응(뇌 조직에 대한 이차 손상)을 지칭한다. 출혈성 뇌졸중 후 이차 손상은 일차 손상(예를 들어, 질량 효과 및 신체적 혼란)에 의해, 혈종에 대한 생리학적 반응(예를 들어, 염증)에 의해 및/또는 혈액 및 혈액 성분의 방출에 의해 개시된 일련의 사건으로 인해 발생할 수 있다. 2차 신경학적 이상 반응은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 지연성 허혈성 신경학적 결손(DIND), 지연성 뇌허혈(DCI), 신경독성, 아폽토시스, 염증, 산화질소 고갈, 산화 조직 손상, 뇌혈관경련, 뇌혈관 반응성, 부종 및 확산 탈분극을 포함한다(예를 들면, 참조; Al-Tamimi et al., World Neurosurgery, 73(6):654-667 (2010); Macdonald et al., Neurocrit. Care, 13:416-424 (2010); and Macdonald et al., J. Neurosurg. 99:644-652 (2003)).

용어 "치료하는(treating)", "치료(treatment)", "치료하다(treat)" 등은 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 증상을 포함하는 2차 신경학적 이상 반응을 완화, 최소화, 감소, 경감, 개선 또는 달리 억제하는 것을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "치료하는", "치료" 등은 또한 2차 신경학적 이상 반응이 발생할 경향이 있거나 발생할 위험이 있지만, 아직 발병한 것으로 진단되지 않은 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응이 발생하는 것을 방지하거나 2차 신경학적 이상 반응의 발병 또는 후속 진행을 지연시키는 것을 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 그러한 맥락에서, 용어 "치료하는", "치료" 등은 "예방(prophylaxis)", "예방적(prophylactic)" 및 "방지적(preventative)"과 같은 용어와 상호교환적으로 사용된다. 그러나, 본원에 개시된 방법이 치료될 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응이 발생하는 것을 완전히 방지할 필요는 없음을 이해해야 한다. 본원에 개시된 방법은 단지 치료의 부재하에서 관찰되는 것보다 2차 신경학적 이상 반응이 더 적고/적거나 덜 심각한 2차 신경학적 이상 반응이 존재하는 정도까지 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 완화, 감소, 경감, 개선 또는 달리 억제하는 것으로 충분할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법은 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응의 수 및/또는 중증도를 감소시킬 수 있다.

본원에서 대상체에 대한 언급은 대상체가 출혈성 뇌졸중을 앓았다는 것을 의미하는 것이 아니라 출혈성 뇌졸중의 위험이 있는 대상체를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 하나의 양태에서, 대상체는 출혈성 뇌졸중 또는 이의 증상을 갖는다(즉, 경험하고 있다). 또 다른 양태에서, 대상체는 치료 시점에 출혈성 뇌졸중을 앓지 않았지만 출혈성 뇌졸중의 위험이 있다. 예시적인 예로서, 대상체는 아직 파열되지 않았지만 파열 위험이 있는 동맥류를 갖는다. 이 경우, 대상체는 동맥류 파열의 위험을 최소화하기 위해 외과적 개입을 받을 수 있다(예를 들어, 외과적 클리핑 또는 혈관내 고리에 의해). 따라서 본원에 기술된 방법은 동맥류가 외과적 개입 전, 동안 또는 후에 파열되는 경우 2차 신경학적 이상 반응을 최소화, 감소, 폐지 또는 억제하기 위한 예방적 조치로서 대상체에게 적합하게 처방될 수 있다. 그 맥락에서, 본원에 기술된 방법은 외과적 개입 전, 동안 또는 후에 예방적 조치로서 사용될 수 있다.

본원에 개시된 방법이 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응의 수 및/또는 중증도에 있어서 주관적, 정성적 및/또는 정량적 감소를 제공하는 정도는 CSF를 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키기 전의 2차 신경학적 이상 반응의 수 및/또는 중증도와 비교할 때, 예를 들면, 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 55%, 바람직하게는 약 50% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 55% 내지 약 65%, 바람직하게는 약 60% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 65% 내지 약 75%, 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 85%, 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 85% 내지 약 95%, 또는 가장 바람직하게는 약 90% 내지 100%까지의 백분율 감소로서 나타낼 수 있다.

출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응의 수 및/또는 중증도에 있어서의 주관적, 정성적 및/또는 정량적 감소를 측정할 수 있는 적절한 방법은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며 주로 측정하고자 하는 2차 신경학적 이상 반응의 특성에 따라 좌우될 것이다. 예시적인 예는 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.

하나의 양태에서, 2차 신경학적 이상 반응은 지연성 허혈성 신경학적 결손(DIND), 지연성 뇌허혈(DCI), 신경독성, 염증, 산화질소 고갈, 산화 조직 손상, 뇌혈관경련, 뇌혈관 반응성, 부종 및 확산성 탈분극으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 2차 신경학적 이상 반응은 지연성 허혈성 신경학적 결손(DIND)이다. SAH 후 DIND는 증가된 두통, 수막증 및/또는 체온에 이어 전형적으로 의식의 변동적인 저하 및 국소 신경학적 증상의 출현이 뒤따르는 것을 특징으로 하는 심각하고 잘 이해되지 않은 뇌허혈 증후군이다. DIND는 특징적으로 출혈성 발작 후 적어도 3 내지 4일에 나타나는 신경학적 기능의 저하로서 정의된다. 이것을 임상/증상성 혈관경련 또는 지연성 뇌허혈(DCI)이라고도 한다. DIND는 초기 출혈 생존자의 이환율과 사망률의 중요한 원인으로 남아 있다. DIND의 보고된 유병률은 약 20% 내지 35%이지만, 혈액 부하가 높은 사람들에서는 40%까지 높을 수 있다. DIND는 환자의 대략 20%에서 뇌경색에 기인하고 aSAH 후 모든 사망 및 장애의 약 13%에 기인한다. DIND를 결정하는 적절한 방법은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 문헌[Dreier et al., Brain, 2006; 129(12): 3224-3237]에 기술되어 있고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다. 하나의 양태에서, DIND는 대량 탈분극을 확산함으로써, 증가로서, 예를 들면, 피질 뇌파 검사법에 의해 음의 느린 전압 변화를 확산함으로써 결정된다. 하나의 양태에서, DIND는 적어도 2개의 GCS 수준에 의한 의식의 지연된 감소 및/또는 새로운 국소 신경학적 결손과 관련이 있다.

하나의 양태에서, 2차 신경학적 이상 반응은 뇌혈관경련이다. 뇌혈관경련 또는 CV("혈관조영 뇌혈관경련"이라고도 함)는 출혈성 뇌졸중 후 국소 허혈의 가장 흔한 원인 중 하나이며 SAH-관련 장애 및 사망의 최대 약 23%를 차지할 수 있다. CV는 전형적으로 지주막하 공간으로의 출혈성 뇌졸중 후 뇌 기저부(즉, 대뇌 동맥)의 혈관, 특히 대용량 동맥의 지속적인 수축에 의해 유발되는 혈관 협착을 특징으로 한다. 따라서 용어 "혈관경련"은 전형적으로 혈관조영술로 결정된 동맥 협착과 관련하여 사용된다. 혈관의 지속적인 수축은 원위 뇌 영역의 관류를 감소시키고 뇌혈관 저항을 증가시킨다. CV를 치료하지 않고 방치하면, 주로 뇌 조직으로의 제한된 혈액 공급으로 인해, 뇌 허혈 및 경색의 형태로 궁극적으로 신경독성(뇌세포 손상)을 야기할 수 있다. CV는 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 검출될 수 있으며, 이의 예시적인 예는 디지털 감산 혈관조영술(DSA), 컴퓨터 단층촬영(CT) 혈관조영술(CTA), 자기 공명(MR) 혈관조영술(MRA), 경두개 도플러 초음파 검사 및 카테터(뇌) 혈관조영술(CA)을 포함한다. 하나의 양태에서, CV는 디지털 감산 혈관조영술(DSA)에 의해 검출된다. 이론이나 특정 적용 방식에 결부됨이 없이, 대뇌 동맥의 혈관경련은 전형적으로 SAH 후 약 3일에 시작하여 약 7 내지 8일 후에 최고조에 이르고 약 14일에 해소되며(예를 들어, 참고; Weir et al., Ω., 48:173-178 (1978)), SAH 후 4일 내지 12일 사이에 혈관조영술을 받은 환자의 적어도 2/3에서 어느 정도의 혈관조영술 협착이 발생한다.

CV의 발병률은 SAH 후의 시간 간격에 따라 좌우된다. 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 최고 발병률은 전형적으로 SAH 후 약 7-8일(범위, 3-12일)에 발생한다. SAH 후의 시간 외에도, 혈관경련의 유병률에 영향을 미치는 다른 주요 요인은 지주막하 혈액의 용적, 밀도, 시간적 지속성 및 분포이다. CV의 예후 인자는 CT 스캔에서의 지주막하 혈액의 양, 고혈압, 해부학적 및 전신적 요인, 임상 등급 및 환자가 항섬유소 용해제를 제공받고 있는지 여부를 포함할 수 있다.

CV의 증상은 전형적으로 아급성으로 발달하고 변동될 수 있으며 과도한 졸음, 혼수, 혼미, 편측 부전마비 또는 편마비, 의지결여, 언어 장애, 시야 결함, 응시 장애 및 뇌신경 마비를 포함할 수 있다. 일부 증상은 국소화되지만, 이들은 일반적으로 임의의 특정 병리학적 과정을 진단하지는 않는다. 뇌혈관조영술이 전형적으로 대뇌 동맥을 시각화하고 연구하기 위한 최적 표준으로 사용되지만, 경두개 도플러 초음파 검사도 사용될 수 있다.

본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 Hp가 생체내에서 무세포 Hb-매개된 CV를 감소시키거나 달리 예방할 수 있음을 발견하였다. 본원에 개시된 방법이 Hb-매개된 CV를 감소시키거나 달리 예방하는 정도는 출혈성 뇌졸중 후 무세포 Hb에 의해 유도되는 혈관수축(혈관 협착)의 정도, 출혈성 뇌졸중 후 대상체의 CSF에서의 무세포 Hb의 농도, CSF가 Hp에 노출된 기간 및 지속성 출혈의 존재 또는 부재와 같은 몇 가지 요인에 따라 좌우될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 개시된 방법이 대상체에서 CV를 감소시키거나 달리 예방했는지 여부를 평가하는 수단은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 디지털 감산 혈관조영술(DSA), 컴퓨터 단층촬영(CT) 혈관조영술(CTA), 자기 공명(MR) 혈관조영술(MRA) 및 카테터 혈관조영술(CA)을 포함한다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF를 노출시키는 것은 DSA에 의해 결정된 바와 같이 60분의 노출 기간 후 수축된 뇌혈관 내강의 평균 직경을 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 또는 보다 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%까지 회복시킨다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF를 노출시키는 것은 DSA에 의해 결정된 바와 같이 60분의 노출 기간 후 수축된 전대뇌 동맥 내강의 평균 직경을 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 또는 보다 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%까지 회복시킨다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF를 노출시키는 것은 DSA에 의해 결정된 바와 같이 60분의 노출 기간 후 수축된 내경동맥 내강의 평균 직경을 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 또는 보다 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%까지 회복시킨다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF를 노출시키는 것은 DSA에 의해 결정된 바와 같이 60분의 노출 기간 후 수축된 내측 대뇌 동맥 내강의 평균 직경을 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 또는 보다 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%까지 회복시킨다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF를 노출시키는 것은 DSA에 의해 결정된 바와 같이 60분의 노출 기간 후 수축된 뇌저 동맥 내강의 평균 직경을 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 또는 보다 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%까지 회복시킨다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF를 노출시키는 것은 생체내 관류 영상(예를 들어, MRI 관류, CT 관류)에 의해 결정된 바와 같이 60분의 노출 기간 후 수축된 작은 실질 혈관(예를 들어 대뇌 세동맥)의 평균 내강 면적을 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 35%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 45%, 바람직하게는 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 80%까지 증가시킨다. 하나의 양태에서, 작은 실질 혈관은 대뇌 세동맥이다. 하나의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF를 노출시키는 것은 생체내 관류 영상(예를 들어, MRI 관류, CT 관류)에 의해 결정된 바와 같이 60분의 노출 기간 후 작은 실질 혈관 수축 방지에 의한 대뇌 미량관류를 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 35%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 45%, 바람직하게는 적어도 55%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 80%까지 회복시킨다. 하나의 양태에서, 작은 실질 혈관은 대뇌 세동맥이다.

하나의 양태에서, 2차 신경학적 이상 반응은 지연성 뇌허혈(DCI)이다. DCI는 전형적으로 aSAH를 가진 환자의 약 1/3에서 발생하며 이들 환자의 절반에서 사망 또는 영구 장애를 유발한다(Dorsch and King, Journal of Clinical Neuroscience, 1:19-26 (1994)). DCI는 종종 조직 허혈로 인한 지연된 신경학적 악화를 특징으로 하며 통상적으로 편마비, 실어증, 실행증, 반맹 또는 무시와 같은 국소적 신경 손상의 발생 및/또는 글래스고 혼수 척도(총 점수 또는 이의 개별 구성 요소 중 하나[눈, 양쪽 운동, 언어])와 연관된다(예를 들어, 참조; Frontera et al., Stroke, 40:1963-1968 (2009); Kassell et al., J. Neurosurg., 73:18-36 (1990); and Vergouwen et al., Stroke, 41:e47-e52 (2010)). 이것은 적어도 1시간 동안 지속될 수 있고, 동맥류 폐쇄 직후에 명백하지 않으며, 뇌의 임상 평가, CT 또는 MRI 스캔에 의해 다른 원인에 기인할 수 없다. DCI 및 지연성 뇌경색의 발달은 SAH 후 좋지 않은 결과의 가장 중요한 원인 중 하나이다.

뇌경색은 또한 DCI의 결과일 수 있다. 예를 들어, DCI로 인한 경색은 전형적으로 뇌로의 동맥 또는 정맥 혈액 공급 부족으로부터 야기되는 뇌 세포 사멸 영역의 존재로서 정의된다. 이것은 SAH 후 약 6주 이내에 뇌의 CT 또는 MRI 스캔에 의해, 또는 약 6주 이내에 사망 전에 수행된 최신 CT 또는 MRI 스캔에 의해 검출되거나 부검시 판명될 수 있고, 조기 동맥류 폐색 후 약 24 내지 48시간 사이의 CT 또는 MRI 스캔에는 존재하지 않으며, 외과적 클리핑 또는 혈관내 치료와 같은 다른 원인에 기인하지 않는다. 뇌실 카테터 또는 실질내 혈종으로 인한 CT 영상의 저밀도는 일반적으로 DCI로부터의 뇌경색의 증거로 간주되지 않는다.

Vergouwen 등(Stroke. 2010;41:2391-2395)에 의해 보고된 바와 같이, "지연성 뇌허혈에 의해 유발된 임상적 악화" 및 "뇌경색"에 대한 통일된 정의는 이의 병인에 대한 가정 없이 형태학적 및 임상적 특성 측면에서 가장 관련성이 높은 요소를 포착해야 한다. CT/MRI에서의 뇌경색은 SAH 후 3개월에 기능적 결과와 강한 상관관계가 있기 때문에, 이의 예상되는 높은 관찰자간 동의 비율, 진정 및 혼수 상태의 환자에서 DCI를 검출하는 능력, 및 DCI의 결과의 객관적인 정량화를 고려할 때, 신경영상에서의 뇌경색이 DCI 단독에 의해 유발된 임상적 악화보다 더 나은 결과 척도일 수 있다. DCI의 이전 정의는 종종 DCI의 임상적 특징을 혈관조영술/경두개 도플러 소견 또는 신경영상 또는 부검에서의 뇌경색과 결부시켰지만, 저자는 이들이 별도로 보고되어야 한다고 제안한다. 이들은 또한 DCI에 의해 유발된 임상적 악화가 관찰자간 동의 비율이 더 낮을 것으로 의심되기 때문에 결과의 이차적 척도에 지나지 않아야 한다고 제안한다. Vergouwen 등에 따르면, DCI에 의해 유발된 임상적 악화의 제안된 정의는 다음과 같다: "국소 신경 장애(예를 들어, 편마비, 실어증, 실행증, 반맹 또는 무시)의 발생 또는 글래스고 혼수 척도(총 점수 또는 이의 개별 구성 요소 중 하나[눈, 양쪽 운동, 언어]). 이것은 적어도 1시간 동안 지속되어야 하고, 동맥류 폐쇄 직후에 명백하지 않으며, 임상 평가, 뇌의 CT 또는 MRI 스캔, 및 적절한 실험실 연구에 의해 다른 원인에 기인할 수 없다."

SAH를 포함하여, 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응은 또한 면역 세포 활성화 및/또는 CSF 구획으로의 침윤 및 염증성 사이토카인의 방출을 포함한 염증과 관련된 것으로 나타났다. Miller 등(Biomed Res Int. 2014; 2014: 384342)에 의해 논의된 바와 같이, 연구에서는 염증이 SAH 후 신경학적 손상의 직접적인 매개체이며 SAH-후 혈관경련의 원인 인자인 것으로 나타났다. SAH의 병태생리에 관련된 주요 염증 분자는 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 셀렉틴(L-셀렉틴 및 P-셀렉틴), 인테그린(예를 들어, 림프구 기능-관련 항원 1(LFA-1)) 및 Mac-1 인테그린(CD11b/CD18)), TNFa, 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1), 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), 염증유발성 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-6, IL-1B, IL-8) 및 엔도텔린 1(ET-1)을 포함한다. 본원에 개시된 양태에서, 2차 신경학적 이상 반응은 셀렉틴(예를 들어, L-셀렉틴 및 P-셀렉틴), 인테그린(예를 들어, 림프구 기능-관련 항원 1(LFA-1)) 및 Mac-1 인테그린(CD11b/CD18)), TNFa, 단핵구 화학유인 단백질 1(MCP-1), 세포간 접착 분자 1(ICAM-1), 염증유발성 인터루킨 및 엔도텔린 1(ET-1)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 염증 마커의 차등적 발현과 관련이 있다. 하나의 양태에서, 염증유발성 인터루킨은 IL-1, IL-6, IL-1B 및 IL-8로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

Nissen 등은 DIND가 있는 환자에서 P-셀렉틴의 혈청 농도가 DIND가 없는 환자와 비교할 때 유의하게 더 높다는 것을 이전에 보여주었다(J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001;71:329-333). 저자는 또한 DIND가 있는 환자에서 L-셀렉틴의 혈청 농도가 DIND가 없는 환자와 비교할 때 유의하게 더 낮다는 것을 보여주었다. 따라서, 하나의 양태에서, 본원에 기술된 방법이 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응의 수 및/또는 중증도를 감소시키는 정도는, 치료 전 대상체에서의 P-셀렉틴의 농도와 비교할 때, 예를 들면, 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 55%, 바람직하게는 약 50% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 55% 내지 약 65%, 바람직하게는 약 60% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 65% 내지 약 75%, 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 85%, 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 85% 내지 약 95%, 또는 가장 바람직하게는 약 90% 내지 100%까지의 대상체의 혈청 또는 CSF에서의 P-셀렉틴 농도의 감소에 의해 결정된다. 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법이 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응의 수 및/또는 중증도를 감소시키는 정도는, 치료 전 대상체에서의 L-셀렉틴의 농도와 비교할 때, 예를 들면, 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 55%, 바람직하게는 약 50% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 55% 내지 약 65%, 바람직하게는 약 60% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 65% 내지 약 75%, 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 85%, 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 85% 내지 약 95%, 또는 가장 바람직하게는 약 90% 내지 100%까지의 대상체의 혈청 또는 CSF에서의 L-셀렉틴 농도의 증가에 의해 결정된다. P-셀렉틴 및 L-셀렉틴의 농도를 측정할 수 있는 방법은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 Nissen 등(J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001;71:329-333)에 기술되어 있고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

염증유발성 사이토카인 IL-1B, IL-6, IL-8, TNFα 및 MCP-1 뿐만 아니라 엔도텔린-1의 수준도 SAH 후 환자에서 상승한 것으로 나타났다(Miller et al. Biomed Res Int. 2014; 2014: 384342). 따라서, 본원에 개시된 양태에서, 본원에 기술된 방법이 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응의 수 및/또는 중증도를 감소시키는 정도는, 치료 전 대상체에서의 염증유발성 사이토카인의 농도와 비교할 때, 예를 들면, 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 55%, 바람직하게는 약 50% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 55% 내지 약 65%, 바람직하게는 약 60% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 65% 내지 약 75%, 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 85%, 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 85% 내지 약 95%, 또는 가장 바람직하게는 약 90% 내지 100%까지의 대상체의 혈청 또는 CSF에서의 염증유발성 사이토카인 농도의 감소에 의해 결정되며, 여기서 염증유발성 분자는 IL-1B, IL-6, IL-8, TNFα, MCP-1 및 엔도텔린-1로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본원에 기술된 바와 같은 염증 매개체의 농도를 측정할 수 있는 방법은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이다.

CSF의 산화질소(NO) 고갈은 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응의 병인에 기여하는 것으로 나타났다(참조; Pluta et al. JAMA. 2005;293(12):1477-1484). NO 수준은 (1) 동맥의 외막에서 뉴런 산화질소 합성효소(NOS)를 함유하는 뉴런에 대한 옥시헤모글로빈의 독성; (2) 내피 NOS의 내인성 억제; 및 (3) 지주막하 응괴로부터 방출된 옥시헤모글로빈에 의한 산화질소의 소거로 인해 SAH 후 CSF에서 감소된다. 따라서, 본원에 개시된 양태에서, 본원에 기술된 방법이 출혈성 뇌졸중 후 2차 신경학적 이상 반응의 수 및/또는 중증도를 감소시키는 정도는, 치료 전 대상체의 CSF에서의 NO의 농도와 비교할 때, 예를 들면, 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 55%, 바람직하게는 약 50% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 55% 내지 약 65%, 바람직하게는 약 60% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 65% 내지 약 75%, 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 85%, 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 85% 내지 약 95%, 또는 가장 바람직하게는 약 90% 내지 100%까지의 대상체의 CSF에서의 NO 농도의 증가에 의해 결정된다. CSF에서의 NO 농도를 측정할 수 있는 방법은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 Pluta 등(JAMA. 2005;293(12):1477-1484)에 기술되어 있고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 치료적 Hp가 CSF 구획으로부터 뇌의 간질 공간으로의 무세포 Hb의 침투를 방지할 수 있음을 발견하였다. 이러한 놀라운 발견은 Hp와의 복합체화를 통한 CSF 구획에서의 무세포 Hb의 구획화가 뇌 혈관계 및 뇌 실질에 대한 무세포 Hb(주로 oxyHb)의 독성 효과를 방지할 수 있음을 시사한다. 따라서, 하나의 양태에서, 2차 신경학적 이상 반응은 뇌 실질 내에서의 2차 신경학적 이상 반응이다.

합토글로빈

합토글로빈(Hp)은 이황화 결합으로 연결된 2개의 알파 쇄와 2개의 베타 쇄를 포함하는 사량체 구조를 갖는다. 베타 쇄(245개 아미노산)는 약 40kDa의 질량(이 중 약 30% w/w는 탄수화물이다)을 가지며 모든 표현형에 의해 공유된다. 알파 쇄는 적어도 두 가지 형태로 존재한다: 알파1(83개 아미노산, 9kDa) 및 알파2(142개 아미노산, 17.3kDa). 따라서, Hp는 Hp1-1, Hp2-1 및 Hp2-2라고 하는 세 가지 표현형으로 발생한다. Hp1-1은 2개의 알파1 쇄를 함유하고, Hp2-2는 2개의 알파2 쇄를 함유하며, Hp2-1은 1개의 알파1 및 1개의 알파2 쇄를 함유한다. Hp 1-1은 100kDa, 또는 Hb와 복합체화될 때 165kDa의 분자량을 갖는다. Hp1-1은 단일 이소형으로 존재하며, Hp 이량체라고도 한다. Hp2-1은 220kDa의 평균 분자량을 가지며 선형 중합체를 형성한다. Hp2-2는 400kDa의 평균 분자량을 가지며 고리형 중합체를 형성한다. 각각의 상이한 중합체 형태는 상이한 이소형이다. Hp 다형성을 연구하기 위한 PCR 방법론이 고안되었다(Koch et al. 2002, Clin . Chem. 48: 1377-1382).

2개의 주요 대립유전자인 Hp1과 Hp2가 염색체 16에서 발견되는 Hp 유전자에 대해 존재한다. 두 개의 대립유전자는 구조적 다형성을 갖는 3가지 상이한 가능한 유전자형을 담당한다: 동형접합체(1-1 또는 2-2) 및 이형접합체 2-1. 서구 인구에서, Hp 1-1의 분포는 ~16%, Hp 2-1은 ~48%, Hp 2-2는 ~36%로 추정된다. Hp는 이황화 결합으로 연결된 두 개의 하위단위 α 및 β 쇄로 절단된다. 대립유전자 둘 다는 동일한 β 쇄를 공유한다. β 쇄는 Hb 결합을 담당하므로 두 유전자형 모두 유사한 Hb 결합 친화도를 갖는다.

무세포 Hb와 복합체를 형성하여 무세포 Hb의 생물학적 활성을 중화할 수 있는 한, Hp의 자연 발생 형태 및 재조합 형태가 본원에 기술된 방법에 적합하다는 것을 이해해야 한다. 적합한 자연 발생 형태의 Hp는 당업계의 숙련가들에게 알려져 있으며, 이의 예시적인 예는 Koch 등(2002, Clin . Chem. 48: 1377-1382) 및 Kasvosve 등(2010, Chapter 2 - Haptoglobin Polymorphism and Infection; Advances in Clinical Chemistry, 50:23-46)에 기술되어 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.

하나의 양태에서, Hp는 혈장 유래 Hp를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다. Hp는 바람직하게는 인간 Hp이다. Hp-(예를 들어, 혈장)의 천연 공급원으로부터 Hp를 단리하기 위한 다양한 프로토콜은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 미국 특허 제4,061,735호 및 제4,137,307호(Funakoshi 등) 및 미국 특허 공개 제20140094411호(Brinkman)에 기술되어 있고, 이들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. Hp의 천연 공급원으로부터 Hp를 단리하기 위한 또 다른 적합한 방법이 Katnik & Jadach(1993, Arch. Immunol . Ther . Exp. (Warz) 41: 303-308), Tseng 등(2004, Protein Expr Purif 33: 265-273), Katnik 등(1995, Eur J. Clin . Chem . Clin . Biochem. 33:727-732), Yang 및 Mao(1999, J. Chromatogr . B. Biomed . Sci . Appl., 731: 395-402), 및 Basler & Burrel(1983 Inflammation 7(4): 387-400)에 기술되어 있다.

본원에 사용된 용어 "합토글로빈"은 Hp의 모든 표현형(모든 이소형 포함)을 포함하는 것으로 이해해야 한다. Hp는 동종(동일한 이소형의 Hp로 본질적으로 구성되는 한) 또는 이종(Hp1-1, Hp1-2 및 Hp2-2를 포함한 상이한 Hp 이소형의 조합을 포함하는 한)일 수 있다. Hp의 조성은 궁극적으로 공급원의 표현형에 따라 좌우된다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, 혼주된 혈장 샘플이 Hp를 추출/정제하는데 사용되는 경우, Hp의 하나 이상의 이소형이 단리될 가능성이 있을 것이다. 단리물에 존재하는 Hp 이소형을 결정하기 위한 적합한 방법은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 Shih 등(2014, Hematology, 89(4):443-447)에 논의되고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 단리물에 존재하는 Hp 이소형을 결정하는 다른 적합한 방법은 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPLC-SEC 분석), Hp ELISA, 및 비탁 판독을 포함하며, Hp의 다른 이소형은 전형적으로 다른 분석에서 다른 신호를 제공할 것이다.

하나의 양태에서, Hp는 Hp1-1 동종이량체, Hp1-2 다량체, Hp2-2 다량체 및 상술한 것들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 양태에서, Hp는 Hp2-2 다량체를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다. Hp는 자연 발생 Hp(예를 들어, 혈장 유래)일 수 있거나 이들은 재조합 단백질로 생산될 수 있으며, 이의 예시적인 예는 본원의 다른 곳에 기술되어 있다. 하나의 양태에서, 혈장 유래 Hp는 Hp2-2를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다. 또 다른 양태에서, 혈장 유래 Hp는 Hp1-1을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다. 추가 양태에서, Hp는 재조합 Hp를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다.

달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 Hp는 천연 또는 자연 발생 Hp의 기능적 유사체를 포함한다. 용어 "기능적 유사체"는 생물학적 활성이 적어도 유사체가 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 이의 생물학적 활성을 중화시키는 능력인 한, 자연 발생(천연) Hp와 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 공유하는 제제를 의미하는 것으로 이해해야 한다. "실질적으로 동일한 생물학적 활성"이란 전형적으로 기능적 유사체가 자연 발생 Hp 이소형(예를 들어, Hp1-1, Hp1-2 및 Hp2-2)을 포함하여 자연 발생 Hp의 결합 친화도의 적어도 40%(예를 들어, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165% 등)인 무세포 Hb에 대한 결합 친화도를 가짐을 의미한다. 제제가 Hp의 기능적 유사체인지 여부를 결정하기 위한 적합한 방법은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 본원의 다른 곳에 기술되어 있다(예를 들어, 무세포 Hb-유도된 뇌혈관경련을 감소시키는 기능적 유사체의 능력).

본원에 개시된 양태에서, Hp의 기능적 유사체는 천연 Hp의 기능적 단편이다. 천연 Hp의 기능적 단편은 단편이 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 이의 생물학적 활성을 중화하는 능력을 보유하는 한 임의의 적절한 길이일 수 있다.

또 다른 양태에서, 기능적 유사체는 자연 발생(천연) Hp 분자(즉, 비교기)와 다른 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 기능적 유사체는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 이상) 아미노산 치환에 의해 천연 Hp의 알파 및/또는 베타 쇄의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 가지며, 여기서 상기 차이는 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 이의 생물학적 활성을 중화시키는 유사체의 능력을 없애지 않거나 완전히 없애지 않는다. 일부 양태에서, 기능적 유사체는, 천연 Hp와 비교하여, 무세포 Hb와 복합체를 형성하는 유사체의 능력을 향상시키는 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 양태에서, 기능적 유사체는 하나 이상의 보존적 아미노산 치환에 의해 천연 Hp의 알파 및/또는 베타 쇄의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 본원에 사용된 용어 "보존적 아미노산 치환"은 주어진 위치에서 아미노산 동일성을 변화시켜 이를 대략 등가의 크기, 전하 및/또는 극성의 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 아미노산의 자연 보존적 치환의 예는 다음의 8개 치환체 그룹을 포함한다(일반적인 한 글자 코드로 지정): (1) M, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) K, R, (4) A, G; (5) S, T; (6) Q, N; (7) E, D; 및 (8) C, S.

하나의 양태에서, 기능적 유사체는 천연 Hp의 알파 및/또는 베타 쇄의 아미노산 서열과 적어도 85% 이상의 서열 동일성을 갖는다. "적어도 85%"에 대한 언급은, 예를 들면, 최적 정렬 또는 최적 적합 분석 후, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 따라서, 하나의 양태에서, 서열은, 예를 들면, 최적 정렬 또는 최적 적합 분석 후, 본원에 확인된 서열과 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 86%, 바람직하게는 적어도 87%, 바람직하게는 적어도 88%, 바람직하게는 적어도 89%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 바람직하게는 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 94%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 바람직하게는 적어도 99% 또는 바람직하게는 100% 서열 동일성 또는 서열 상동성을 갖는다.

본원에 사용된 용어 "동일성", "유사성", "서열 동일성", "서열 유사성", "상동성", "서열 상동성" 등은 정렬된 서열의 임의의 특정 아미노산 잔기 위치에서, 아미노산 잔기는 정렬된 서열 사이에서 동일하다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "유사성" 또는 "서열 유사성"은 정렬된 서열의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열 사이에 유사한 유형임을 나타낸다. 예를 들면, 류신은 이소류신 또는 발린 잔기로 치환될 수 있다. 본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 이것은 보존적 치환으로 지칭될 수 있다. 하나의 양태에서, 변형은 비변형된(천연) Hp 폴리펩티드와 비교할 때 변형된 폴리펩티드의 결합 특이성 또는 기능적 활성에 영향을 미치지 않도록 아미노산 서열은 그 안에 함유된 임의의 아미노산 잔기의 보존적 치환에 의해 변형될 수 있다.

일부 양태에서, 펩티드 서열에 대한 서열 동일성은 최대 상동성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후 상응하는 펩티드 서열의 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율과 관련되며, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적 치환도 고려하지 않는다. N- 또는 C- 말단 확장 또는 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되어서는 안된다. 2개 이상의 아미노산 서열의 정렬을 수행하고 이들의 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 두 아미노산 서열의 동일성 또는 유사성의 백분율은 알고리즘, 예를 들면, BLAST, FASTA 또는 Smith-Waterman 알고리즘을 사용하여 쉽게 계산될 수 있다.

아미노산 서열 "유사성"을 결정하는 기술은 당업계의 숙련가들에게 잘 알려져 있다. 일반적으로 "유사성"은 아미노산이 동일하거나 전하 또는 소수성과 같은 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는 적절한 위치에서 2개 이상의 펩티드 서열의 정확한 아미노산 대 아미노산 비교를 의미한다. 그후 소위 "유사성 백분율"은 비교된 펩티드 서열 사이에서 결정될 수 있다. 일반적으로, "동일성"은 두 펩티드 서열의 정확한 아미노산 대 아미노산 대응을 지칭한다.

2개 이상의 펩티드 서열은 또한 이들의 "동일성 백분율"을 결정함으로써 비교될 수 있다. 두 서열의 동일성 퍼센트는 정렬된 두 서열 사이의 정확한 일치 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것으로 설명될 수 있다. 핵산 서열에 대한 대략적인 정렬은 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다(Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)). 이 알고리즘은 Dayhoff(Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA)에 의해 개발되고 Gribskov(Nucl . Acids Res. 14(6):6745-6763, 1986)에 의해 정규화된 스코어링 매트릭스를 사용하여 펩티드 서열에 사용하도록 확장될 수 있다. 서열 간의 동일성 또는 유사성 퍼센트를 계산하는데 적합한 프로그램은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.

비교 창을 정렬하기 위한 최적의 서열 정렬은 알고리즘의 컴퓨터화 구현에 의해(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) 또는 검사에 의해 수행될 수 있으며 최상의 정렬(즉, 비교 창에서 가장 높은 상동성 백분율을 야기함)은 선택된 다양한 방법 중 어느 것에 의해 생성된다. 예를 들면 Altschul 등(1997, Nucl . Acids Res.25:3389)에 의해 개시된 바와 같은 BLAST 계열의 프로그램도 참조할 수 있다. 서열 분석에 대한 상세한 설명은 Ausubel 등의 Unit 19.3에서 찾아볼 수 있다("Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15).

하나의 양태에서, 기능적 유사체는 유사체의 안정성을 증가시키거나 유사체의 용해도를 증가시키기 위해 천연 Hp에 비한 아미노산 치환 및/또는 기타 변형을 포함한다.

기능적 유사체는 자연 발생 화합물/펩티드일 수 있거나 당업계의 숙련가들에게 공지된 방법을 사용하여 화학적 합성에 의해 합성적으로 생산될 수 있다.

Hp는 미생물에서 재조합 단백질로서 적절하게 생산될 수 있으며, 이것은 단리될 수 있고, 원하는 경우, 추가로 정제될 수 있다. 재조합 Hp의 생산에 적합한 미생물은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 박테리아, 효모 또는 진균, 진핵생물 세포(예를 들어, 포유동물 또는 곤충 세포), 또는 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 심리키 삼림열 바이러스, 배큘로바이러스, 박테리오파지, 신드비스 바이러스 또는 센다이 바이러스)를 포함한다. 재조합 펩티드를 생산하는데 적합한 박테리아는 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 또는 펩티드 서열을 발현할 수 있는 임의의 다른 박테리아를 포함한다. 재조합 펩티드를 생산하기 위한 적합한 효모 유형의 예시적인 예는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다(Candida), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 효모를 포함한다. 해당 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한 재조합적으로 생성된 펩티드 서열을 단리하고 정제하는 방법도 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다.

본원에 기술된 바와 같이 재조합 Hp의 단리를 용이하게 하기 위해, Hp의 펩티드 서열 또는 이의 기능적 유사체가 친화성 크로마토그래피에 의한 단리를 가능하게 하는 이종 폴리펩티드에 번역에 의해 융합(공유 결합)되는 융합 폴리펩티드가 제조될 수 있다. 적합한 이종 폴리펩티드의 예시적인 예는 His-태그(예를 들어, His₆. 6 히스티딘 잔기), GST-태그(글루타티온-S-트랜스퍼라제) 등이다.

재조합 Hp를 제조하기 위해, 예를 들면, 결합 화학에 의해 생성되거나 가장 다양한 구조에 대한 고속 대량 스크리닝 기술에 의해 수득되는 파지 라이브러리 및/또는 펩티드 라이브러리가 또한 적합하다(예를 들면, 참조; Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; and Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol . Biol. 2002 December; 50(6):837-54).

재조합 Hp의 예시적인 예는 수탁 번호 NP_005134(문헌[Morishita et al. 2018, Clin . Chim . Acta 487, 84-89]에 기술된 바와 같음) 및 수탁 번호. P00738을 갖는 펩티드를 포함한다.

Hp는 융합 단백질의 일부로서 하나 이상의 이종 모이어티에 융합, 커플링 또는 부착될 수 있다. 하나 이상의 이종 모이어티는 Hp의 활성 또는 안정성을 개선, 향상 또는 확장할 수 있다. 하나의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이, Hp는 생체내에서 Hp의 반감기를 연장하기 위해 이종 모이어티에 적절하게 부착된다. 적절한 반감기 연장 이종 모이어티는 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEGylation), 글리코실화 PEG, 하이드록실 에틸 전분(HESylation), 폴리시알산, 엘라스틴-유사 폴리펩티드, 헤파로산 중합체 및 히알루론산을 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 양태에서, 이종 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG화), 글리코실화 PEG, 하이드록실 에틸 전분(HESylation), 폴리시알산, 엘라스틴-유사 폴리펩티드, 헤파로산 중합체 및 히알루론산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또 다른 양태에서, 이종 모이어티는 Hp에 융합된 이종 아미노산 서열일 수 있다.

대안적으로, 또는 추가로, 이종 모이어티는 Hp에 화학적으로 접합, 예를 들어 공유 결합될 수 있다. 반감기 연장 이종 모이어티는 당업계의 숙련가들에게 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 Hp에 융합, 접합 또는 달리 부착될 수 있으며, 이의 예시적인 예는 화학적 링커를 통한 것이다. 이 접합 기술의 원리는 Conjuchem LLC(예를 들어, 미국 특허 제7,256,253호 참조)에 의해 예시적인 방식으로 기술되었으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.

또 다른 양태에서, 이종 모이어티는 반감기 향상 단백질(HLEP)이다. 적절한 반감기 향상 단백질은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 알부민 또는 이의 단편을 포함한다. 따라서, 하나의 양태에서, HLEP는 알부민 또는 이의 단편이다. 알부민 또는 이의 단편의 N-말단은 Hp의 알파 및/또는 베타 쇄의 C-말단에 융합될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 알부민 또는 이의 단편의 C-말단은 Hp의 알파 및/또는 베타 쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 무세포 Hb에 대한 Hp의 결합을 없애지 않는 한 하나 이상의 HLEP가 Hp의 알파 및/또는 베타 쇄의 N- 또는 C-말단 부분(들)에 융합될 수 있다. 그러나, 융합 단백질의 Hp 성분이 여전히 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 무세포 Hb를 중화할 수 있는 한, 무세포 Hb에 대한 Hp의 결합의 약간의 감소가 허용될 수 있음을 이해해야 한다.

융합 단백질은 Hp와 이종 모이어티 사이에 위치하는 화학적 결합 또는 링커 서열을 추가로 포함할 수 있다. 링커 서열은 하나 이상의 아미노산, 특히 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 15개, 바람직하게는 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 5개 또는 보다 바람직하게는 1 내지 3개(예를 들어, 1, 2 또는 3)개의 아미노산으로 구성된 펩티드 링커일 수 있으며, 이것은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 링커 서열은 야생형 Hp의 상응하는 위치에 존재하지 않는다. 상기 링커 서열에 존재하는 바람직한 아미노산은 Gly 및 Ser을 포함한다. 바람직한 양태에서, 링커 서열은 본원에 개시된 방법에 따라 치료될 대상체에 대해 실질적으로 비-면역원성이다. 실질적으로 비-면역원성이란 링커 서열이 그것이 투여되는 대상체에서 링커 서열에 대한 검출 가능한 항체 반응을 일으키지 않을 것임을 의미한다. 바람직한 링커는 교대하는 글리신 및 세린 잔기로 구성될 수 있다. 적합한 링커는 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 제WO2007/090584호에 기술되어 있다. 하나의 양태에서, Hp와 이종 모이어티 사이의 펩티드 링커는 인간 단백질에서 천연 도메인간 링커로 작용하는 펩티드 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다. 자연 환경에서 이러한 펩티드 서열은 단백질 표면에 가깝게 위치할 수 있고 면역계에 접근할 수 있으므로 이 서열에 대해 자연적인 내성을 가정할 수 있다. 예시적인 예가 제WO 2007/090584호에 제공되어 있다. 적합한 절단 가능한 링커 서열은, 예를 들어, 제WO 2013/120939 A1호에 기술되어 있다.

적합한 HLEP 서열의 예시적인 예가 아래에 기술되어 있다. 마찬가지로 각각의 HLEP의 정확한 "N-말단 아미노산" 또는 정확한 "C-말단 아미노산"에 대한 융합체, 또는 HLEP의 하나 이상의 아미노산의 N-말단 결실을 포함하는 각각의 HLEP의 "N-말단 부분" 또는 "C-말단 부분"에 대한 융합체가 본원에 개시되어 있다. 융합 단백질은 하나 이상의 HLEP 서열, 예를 들어, 2개 또는 3개의 HLEP 서열을 포함할 수 있다. 이러한 다중 HLEP 서열은 탠덤으로, 예를 들어 연속 반복으로 Hp의 알파 및/또는 베타 쇄의 C-말단 부분에 융합될 수 있다.

하나의 양태에서, 이종 모이어티는 반감기 연장 폴리펩티드이다. 하나의 양태에서, 반감기 연장 폴리펩티드는 알부민, 알부민 계열의 구성원 또는 이의 단편, 큰 유체역학 용적을 갖는 용매화된 무작위 쇄(예를 들어, XTEN(참조; Schellenberger et al. 2009; Nature Biotechnol. 27:1186-1190), 호모-아미노산 반복체(HAP) 또는 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 트랜스페린 또는 이의 변이체 또는 단편, 인간 융모막 성선 자극 호르몬-β 서브유닛의 카복실-말단 펩티드(CTP), 신생아 Fc 수용체(FcRn), 특히 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 예를 들어, Fc 단편에 결합할 수 있는 폴리펩티드, 생리학적 조건하에 알부민, 알부민-계열의 구성원 또는 이의 단편 또는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 바람직하게는 면역글로불린 G1(IgG1)의 Fc 단편, 면역글로불린 G2(IgG2)의 Fc 단편 또는 면역글로불린 A(IgA)의 Fc 단편이다. 본원에 사용된 바와 같은 반감기 향상 폴리펩티드는 Hp의 치료 활성 또는 생물학적 활성을 안정화 또는 연장할 수 있고, 특히 Hp의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있는 전장 반감기 향상 단백질 또는 이의 하나 이상의 단편일 수 있다. 이러한 단편은 10개 이상의 아미노산 길이일 수 있거나, 적어도 약 15개, 바람직하게는 적어도 약 20개, 바람직하게는 적어도 약 25개, 바람직하게는 적어도 약 30개, 바람직하게는 적어도 약 50개, 또는 보다 바람직하게는 적어도 약 100개 또는 그 이상의 HLEP 서열로부터의 연속 아미노산을 포함할 수 있거나, HLEP 단편이 HLEP 부재하에서의 각각의 HP에 비해, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 25%의 기능적 반감기 연장을 제공하는 한 각각의 HLEP의 특정 도메인 중의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 이종 모이어티가 Hp에 기능적 반감기 연장을 제공하는지 여부를 결정하는 방법(생체내 또는 시험관내)은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 본원의 다른 곳에 기술되어 있다.

본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질의 HLEP 부분은 야생형 HLEP의 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 보존적이든 비보존적이든 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하며, 여기서 이러한 변화는 Hp가 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 무세포 Hb를 중화시키는 능력을 실질적으로 변경하지 않는다. HLEP는 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들어 인간, 원숭이, 소, 양 또는 돼지로부터 적합하게 유래될 수 있다. 비-포유류 HLEP는 암탉 및 연어를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질은 Hp 및 HLEP와 같은 이종 모이어티를 암호화하는 적어도 2개의 DNA 서열의 프레임내 결합에 의해 생성될 수 있다. 당업계의 숙련가들은 융합 단백질 DNA 서열의 번역이 단일 단백질 서열을 초래할 것임을 이해할 것이다. 본원에 개시된 양태에 따른 펩티드 링커를 암호화하는 DNA 서열의 프레임내 삽입의 결과로서, Hp, 적합한 링커 및 이종 모이어티를 포함하는 융합 단백질이 수득될 수 있다.

본원에 개시된 양태에서, Hp는 이종 모이어티에 융합된다. 하나의 양태에서, 이종 모이어티는 알부민 또는 이의 단편, 트랜스페린 또는 이의 단편, 인간 융모막 성선 자극 호르몬의 C-말단 펩티드, XTEN 서열, 호모-아미노산 반복체(HAP), 프롤린-알라닌-세린 반복체(PAS), 아파민, 알파-태아단백질, 비타민 D 결합 단백질, 생리학적 조건하에 알부민 또는 면역글로불린 불변 영역에 결합할 수 있는 폴리펩티드, 신생아 Fc 수용체(FcRn), 특히 면역글로불린 불변 영역 및 이의 일부, 바람직하게는 면역글로불린의 Fc 부분에 결합할 수 있는 폴리펩티드, 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다. 또 다른 양태에서, 이종 모이어티는 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리시알산(PSA), 엘라스틴-유사 폴리펩티드, 헤파로산 중합체, 히알루론산 및 알부민 결합 리간드, 예를 들어 지방산 쇄, 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

용어 "인간 혈청 알부민"(HSA) 및 "인간 알부민"(HA) 및 "알부민"(ALB)은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 용어 "알부민" 및 "혈청 알부민"은 더 광범위하고, 인간 혈청 알부민(및 이의 단편 및 변이체) 뿐만 아니라 다른 종의 알부민(및 이의 단편 및 변이체)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "알부민"은 알부민의 하나 이상의 기능적 활성(예를 들어, 생물학적 활성)을 갖는 알부민 폴리펩티드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 집합적으로 지칭한다. 특히, "알부민"은 성숙한 형태의 인간 알부민을 포함한 인간 알부민 또는 이의 단편 또는 다른 척추동물로부터의 알부민 또는 이의 단편, 또는 이들 분자 또는 이의 단편의 유사체 또는 변이체를 지칭한다. 본원에 개시된 일부 양태에서, 대체 용어 "FP"는 HELP를 식별하는데 사용되며, 특히 알부민을 HELP로 정의하는데 사용된다.

본원에 기술된 융합 단백질은 인간 알부민의 자연 발생 다형성 변이체 및/또는 인간 알부민의 단편을 적절하게 포함할 수 있다. 일반적으로 말해서, 알부민 단편 또는 변이체는 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 40개, 또는 가장 바람직하게는 70개 이상 아미노산의 길이일 것이다.

하나의 양태에서, HLEP는 FcRn 수용체에 대한 결합이 향상된 알부민 변이체이다. 이러한 알부민 변이체는 야생형 알부민에 융합된 Hp 또는 이의 기능적 단편과 비교하여 Hp 또는 이의 기능적 유사체의 더 긴 혈장 반감기를 야기할 수 있다. 본원에 기술된 융합 단백질의 알부민 부분은 적절하게는 인간 알부민의 적어도 하나의 서브도메인 또는 도메인 또는 이의 보존적 변형을 포함할 수 있다.

하나의 양태에서, 이종 모이어티는 면역글로불린 분자 또는 이의 기능적 단편이다. 면역글로불린 G(IgG) 불변 영역(Fc)은 치료 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 당업계에 알려져 있다(예를 들면, 참조; Dumont J A et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). 중쇄의 IgG 불변 영역은 3개의 도메인(CH1-CH3)과 힌지 영역으로 구성된다. 면역글로불린 서열은 임의의 포유동물로부터, 또는 각각 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래될 수 있다. 항원-결합 도메인이 없는 IgG 및 IgG 단편은 또한 HLEP로서를 포함하여 이종 모이어티로서 사용될 수 있다. Hp 또는 이의 기능적 유사체는 항체의 힌지 영역 또는 절단 가능할 수도 있는 펩티드 링커를 통해 IgG 또는 IgG 단편에 적절하게 연결될 수 있다. 여러 특허 및 특허 출원은 치료 단백질의 생체내 반감기를 향상시키기 위해 면역글로불린 불변 영역에 대한 치료 단백질의 융합을 기술한다. 예를 들면, 제US 2004/0087778호 및 제WO 2005/001025호는 펩티드의 반감기를 증가시키고 그렇지 않으면 생체내에서 빠르게 제거되는 생물학적 활성 펩티드와 Fc 도메인 또는 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부와의 융합 단백질을 기술한다. 향상된 생물학적 활성, 연장된 순환 반감기 및 더 큰 용해도를 달성하는 Fc-IFN-β 융합 단백질이 기술되어 있다(제WO 2006/000448 A2호). 연장된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효능을 갖는 Fc-EPO 단백질(제WO 2005/063808 A1호) 뿐만 아니라 G-CSF(제WO 2003/076567 A2호), 글루카곤-유사 펩티드-1(제WO 2005/000892 A2호), 응고 인자(제WO 2004/101740 A2호) 및 인터루킨-10(미국 특허 제6,403,077호)와의 Fc 융합체가 개시되어 있으며, 모두 반감기 향상 특성을 갖는다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 적합한 HLEP의 예시적인 예는 또한 제WO 2013/120939 A1호에 기술되어 있으며, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 Hp가 CSF에 존재하는 무세포 Hb에 결합하고 이와 복합체를 형성하여 무세포 Hb의 불리한 생물학적 효과를 중화시키기에 충분한 CSF 내의 Hp의 양 또는 농도를 의미한다. 펩티드의 치료학적 유효량은 여러 요인에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업계의 숙련가들은 이해할 것이며, 이러한 요인의 예시적인 예는 Hp가 대상체에게 직접 투여되는지 여부(예를 들어, 척추강내, 두개내 또는 뇌실내), 치료할 대상체의 건강 및 신체 상태, 치료할 대상체의 분류학적 그룹, 출혈의 중증도(예를 들어, 출혈의 정도), 투여 경로, CSF 구획 내의 무세포 Hb의 농도 및/또는 양 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합을 포함한다.

Hp의 치료학적 유효량은 전형적으로 당업계의 숙련가들에 의해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이다. 적절한 치료학적 유효량의 Hp의 예시적인 예는 약 2μM 내지 약 20mM, 바람직하게는 약 2μM 내지 약 5mM, 바람직하게는 약 100μM 내지 약 5mM, 바람직하게는 약 2μM 내지 약 300μM, 바람직하게는 약 5μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 5μM 내지 약 50μM, 또는 보다 바람직하게는 약 10μM 내지 약 30μM를 포함한다.

하나의 양태에서, Hp의 치료학적 유효량은 약 2μM 내지 약 20mM이다. 하나의 양태에서, Hp의 치료학적 유효량은 약 2μM 내지 약 5mM이다. 하나의 양태에서, Hp의 치료학적 유효량은 약 100μM 내지 약 5mM이다. 하나의 양태에서, Hp의 치료학적 유효량은 약 2μM 내지 약 300μM이다. 하나의 양태에서, Hp의 치료학적 유효량은 약 5μM 내지 약 50μM이다. 하나의 양태에서, Hp의 치료학적 유효량은 약 10μM 내지 약 30μM이다.

하나의 양태에서, Hp의 치료학적 유효량은 출혈 후 대상체의 CFS 내의 무세포 Hb 농도와 적어도 등몰량이다. 또 다른 양태에서, Hp의 치료학적 유효량은 CSF에서 약 3μM 내지 약 300μM 무세포 Hb와 복합체를 형성하기에 충분한 양이다. CSF에서 무세포 Hb의 농도를 측정하는 적절한 방법은 당업계의 숙련가들에게 알려져 있으며, 이의 예시적인 예는 문헌[Cruickshank AM., 2001, ACP Best Practice No 166, J. Clin . Path., 54(11):827-830) and Hugelshofer M. et al., 2018. World Neurosurg .;120:e660-e666)]에 기술되어 있고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원에 기술된 바와 같이, 치료학적 유효량의 Hp를 달성하는 것은 Hp 또는 이의 기능적 유사체가 노출되는 CSF의 최종 용적에 따라 좌우될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들면, Hp를 성인 인간 대상체에게(예를 들어, 척추강내로) 투여하고자 하는 경우, 성인 인간 대상체에서 CSF의 평균 용적이 150mL임을 고려하면, 약 310μM Hp의 5mL 용액을 대상체에게 투여함으로써 약 10μM Hp의 치료학적 유효량이 달성될 수 있다. 또 다른 예시적인 예에서, 본원에 기술된 방법은 대상체로부터 50mL의 CSF를 제거하고 이를 약 30μM Hp를 포함하는 인공 CSF 50mL로 대체하여 대상체의 CSF 구획에서 약 10 μM Hp의 치료학적 유효량을 달성함을 포함한다.

Hp의 투여량은 또한 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들면, 여러 분할 용량이 매일, 매주 또는 기타 적절한 시간 간격으로 투여될 수 있거나, 투여량은 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 줄일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "노출"은 Hp가 CSF에 존재하는 무세포 Hb(이의 주요 형태는 oxyHb임)에 결합하여 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 Hb:Hp 복합체의 형성이 뇌 조직에 대한 무세포 Hb의 불리한 생물학적 효과를 실질적으로 중화시키도록 하는 방식으로 CSF를 Hp와 접촉시키는 것을 의미한다. "실질적으로 중화시킨다"는 치료학적 Hp의 부재하에서의 뇌 조직에 대한 무세포 Hb의 생물학적 효과와 비교하여, 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%를 포함하여 적어도 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 15% 내지 약 25%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 35%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 35% 내지 약 45%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 45% 내지 약 55%, 바람직하게는 약 50% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 55% 내지 약 65%, 바람직하게는 약 60% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 65% 내지 약 75%, 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 75% 내지 약 85%, 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 85% 내지 약 95%, 또는 가장 바람직하게는 약 90% 내지 100%까지의 백분율 감소로서 주관적으로 또는 정성적으로 표시되는 바와 같은 뇌 조직에 대한 무세포 Hb의 불리한 생물학적 효과의 감소를 의미한다. 무세포 Hb의 불리한 생물학적 효과의 감소를 (정성적으로 또는 정량적으로) 측정 또는 결정할 수 있는 방법은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 본원의 다른 곳에서 기술되어 있다.

본원에 또한 주지된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 최초로, 치료학적 유효량의 Hp가 뇌혈관 NO-신호전달과 함께 CSF에서 무세포 oxyHb의 간섭을 방지하여 혈관경련 및 DIND의 발병률을 감소시킬 수 있음을 보여주었다. 동적 MRI를 이용하여, 본 발명자들은 뇌실계에 주사한 후 지주막하 공간에서 Hb 및 Hb:Hp 복합체의 빠르고 육안으로 동일한 분산을 확인하였다. 조직학적 분석에서는 또한 예기치 않게도 CSF 구획에서 뇌의 간질 공간으로 Hb가 광범위하게 침투하는 것으로 밝혀진 반면 Hb:Hp 복합체는 대체로 지주막하 공간에 국한되었다. 이러한 놀라운 발견은 Hp와의 복합체화를 통한 CSF 구획 내의 무세포 Hb의 구획화가 뇌 혈관계 및 뇌 실질에 대한 무세포 Hb(주로 oxyHb)의 독성 효과를 방지할 수 있음을 시사한다.

본원에 기술된 바와 같이 치료학적 유효량의 Hp에 이를 필요로 하는 대상체의 CSF가 노출되는 방식은, 예를 들면, 상기 노출이 이를 필요로 하는 대상체의 CSF 구획 내에서(즉, 생체내) 또는 대상체로부터 수득된 CSF에서 체외에서(즉, 생체외) 수행되어야 하는지 여부에 따라 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 상기 노출이 이를 필요로 하는 대상체의 CSF 구획 내에서(즉, 생체내) 수행되어야 하는 경우, Hp의 투여 경로는 Hp가 CSF 구획 내에서 무세포 Hb와 접촉할 수 있도록 선택될 것이다. 적절한 투여 경로는 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 척추강내, 두개내 및 뇌실내를 포함한다. 하나의 양태에서, 치료학적 유효량의 Hp는, 예를 들면, CSF를 일시적으로 배출하고 두개내압을 감소시키기 위해 출혈성 뇌졸중 후에 대상체에 배치되는 외부 심실 배출구를 통해 투여된다.

하나의 양태에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 Hp를 대상체에게 두개내 투여함을 포함한다.

하나의 양태에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 Hp를 대상체에게 척추강내 투여함을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 Hp를 척추관으로 대상체에게 척추강내 투여함을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 Hp를 지주막하 공간으로 대상체에게 척추강내 투여함을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 치료학적 유효량의 Hp를 대상체에게 뇌실내 투여함을 포함한다.

대안적으로 또는 추가로, 본원에 기술된 방법은 이를 필요로 하는 대상체로부터 CSF를 제거하는 단계, Hp가 CSF 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 이를 중화시키기에 충분한 시간 동안 CSF를 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계, CSF에 형성된 Hb:Hp 복합체를 제거하여 Hb가 감소된 CSF를 생성하는 단계 및 Hb가 감소된 CSF를 대상체에게 (예를 들어, 척추강내로 또는 뇌실내로) 투여하는 단계를 포함한다. CSF 구획으로부터 CSF를 제거하는 단계는 전형적으로 CSF가 완전히 없는 CSF 구획을 초래하지 않는다는 것을 이해할 것이며, 적어도 일부 CSF가 CSF 구획에 남을 것이라는 점에 유의해야 한다. 임의로, CSF 구획에 존재할 수 있는 잔류 Hb의 적어도 일부를 제거하기 위해 일단 CSF가 제거되면 CSF 구획을 약제학적으로 허용되는 세척 용액으로 세정할 수 있다. 세척 용액은 CSF 구획에 존재할 수 있는 잔류 무세포 Hb의 적어도 일부를 추가로 복합체화하여 중화시키기 위해 임의로 Hp를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 세척 용액은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같은 인공 CSF이다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 방법은 이를 필요로 하는 대상체의 CSF 구획으로부터 CSF의 샘플을 제거하는 단계, Hp를 CSF 샘플에 첨가하여 Hp가 풍부한 CSF 샘플을 수득하는 단계, Hp가 풍부한 CSF 샘플을 대상체의 CSF 구획에 투여하여 Hp가 대상체의 CSF 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 무세포 Hb를 중화시키기에 충분한 시간 동안 CSF 구획을 Hp에 노출시키는 단계 및 임의로 상기 단계들을 반복하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, CSF 샘플에 첨가되는 Hp의 양은, 대상체에게 투여 시, 대상체의 CSF 내에서 치료학적 유효량의 Hp를 제공하도록 결정될 것이다. 따라서, CSF 샘플에 첨가되는 Hp의 양은 제거되었다가 대상체에게 다시 투여되는 CSF 샘플의 용적에 따라 좌우될 것이다.

하나의 양태에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(i) 출혈 후 대상체의 CSF 구획으로부터 CSF의 샘플을 수득하는 단계;

(ii) 단계 (i)의 CSF 샘플에 Hp를 첨가하여 Hp가 풍부한 CSF 샘플을 수득하는 단계;

(iii) Hp가 풍부한 CSF 샘플을 대상체에게 투여하여, Hp가 대상체의 CSF 구획에서 무세포 Hb와 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계; 및

(iv) 임의로, 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계.

제거되었다가 대상체에게 재투여될 CSF의 용적은 바람직하게는 실질적으로 동일할 것이다. 예를 들면, 50mL의 CSF 샘플이 대상체의 CSF 구획에서 제거되면, Hp를 포함하는 전체 50mL 용적의 CSF가 대상체에게 재투여될 것이다. 그러나, 용적의 차이가 유의한 불리한 임상 결과를 초래하지 않는 한 용적은 유사하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 일부 양태에서, 대상체에게 재투여되는 CSF의 용적은 대상체로부터 제거된 CSF의 용적보다 적을 것이다. 또 다른 양태에서, 대상체에게 재투여되는 CSF의 용적은 Hp를 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 첨가하여 추가 용적을 구성하여 대상체로부터 제거된 CSF의 용적보다 클 것이다.

또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법은 이를 필요로 하는 대상체의 CSF 구획으로부터 일정 용적의 CSF를 제거하는 단계, 대상체로부터 제거된 CSF의 용적을 Hp를 포함하는 인공 CSF의 용적으로 대체하여, Hp가 대상체의 CSF 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하여 무세포 Hb를 중화시키기에 충분한 시간 동안 대상체의 CSF를 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 인공 CSF에서 Hp의 양은, 대상체에게 투여시, 대상체의 CSF 내에서 치료학적 유효량의 Hp를 제공하도록 결정될 것이다. 따라서, 인공 CSF에 첨가되는 Hp의 양은 대상체에게 투여될 인공 CSF의 용적에 따라 좌우될 것이다.

하나의 양태에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(i) 출혈 후 대상체의 CSF 구획으로부터 일정 용적의 CSF를 제거하는 단계;

(ii) Hp를 포함하는 인공 CSF를 제공하는 단계;

(iii) 단계 (ii)의 인공 CSF를 대상체에게 투여하여, Hp가 대상체의 CSF 구획에서 무세포 Hb와 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계; 및

(iv) 임의로, 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계.

대상체에게 투여되는 인공 CSF의 용적은 바람직하게는 대상체로부터 제거된 CSF의 용적과 실질적으로 동일할 것이다. 예를 들면, 50mL의 CSF 샘플이 대상체의 CSF 구획으로부터 제거되면, 치료학적 유효량의 Hp를 포함하는 인공 CSF의 약 50mL의 용적이 제거된 CSF의 용적을 대체하기 위해 사용될 것이다. 그러나, 용적의 차이가 유의한 불리한 임상 결과를 초래하지 않는 한 용적은 유사하지 않을 수 있음을 이해할 것이다. 일부 양태에서, 대상체에게 투여되는 인공 CSF의 용적은 대상체로부터 제거된 CSF의 용적보다 작을 것이다. 또 다른 양태에서, 대상체에게 투여되는 인공 CSF의 용적은 대상체로부터 제거된 CSF의 용적보다 클 것이다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 방법은 출혈성 뇌졸중 후 약 21일 이내에 CSF를 Hp에 노출시킴을 포함한다. 본원에 개시된 또 다른 양태에서, 상기 방법은 출혈성 뇌졸중 후 약 2일 내지 약 4일에 CSF를 Hp에 노출시킴을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 방법은 출혈성 뇌졸중 후 약 5일 내지 약 14일에 CSF를 Hp에 노출시킴을 포함한다.

본 발명자들은 놀랍게도 지주막하 공간 내의 무세포 Hb를 치료학적 유효량의 Hp에 적어도 약 2분 동안 노출시키는 것이 CSF에서 검출 가능한 Hb:Hp 복합체를 형성하기에 충분하다는 것을 보여주었다. 따라서, 하나의 양태에서, CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간은 적어도 약 2분(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14분 등)이다. 하나의 양태에서, CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간은 적어도 약 4분이다. 또 다른 양태에서, CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간은 적어도 약 5분이다. 또 다른 양태에서. CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간은 적어도 약 10분이다. 하나의 양태에서, CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간은 약 2분 내지 약 45분, 바람직하게는 약 2분 내지 약 20분, 또는 보다 바람직하게는 약 4분 내지 약 10분이다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 치료 또는 예방이 필요한 포유동물 대상체를 지칭한다. 적합한 대상체의 예시적인 예는 영장류, 특히 인간, 고양이 및 개 등과 같은 반려 동물, 말, 당나귀 등과 같은 작업 동물, 양, 소, 염소, 돼지 등과 같은 가축 동물, 토끼, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등과 같은 실험실 시험 동물 및 동물원 및 야생 동물 공원에 있는 것, 사슴, 딩고 등과 같은 포획된 야생 동물을 포함한다. 하나의 양태에서, 대상체는 인간이다. 추가의 양태에서, 대상체는 (i) 출생부터 약 2세, (ii) 약 2세에서 약 12세 또는 (iii) 약 12세에서 약 21세 사이의 소아 환자이다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 방법은 체외로 치료학적 유효량의 Hp에 CSF를 노출시킴을 포함한다.

CSF가 체외로 Hp에 노출되는 경우(생체외), 치료학적 유효량은 Hp가 노출될 CSF의 용적, CSF가 용액에 있는 Hp에 노출되거나 기질(예를 들어, 친화성 크로마토그래피를 위해)에 고정되어 있는지 여부 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들어, CSF가 친화성 크로마토그래피에 의한 무세포 Hb의 복합체화 및 제거를 위해 Hp에 노출되는 경우, 기질에 고정된 Hp의 양은 초기 통과 동안 무세포 Hb의 완전한 복합체화를 초래할 필요는 없으며, 기질 상에서의 다중 통과는 CSF로부터 무세포 Hb의 실질적으로 모두를 복합체화하여 제거하기 위해 필요할 수 있다.

하나의 양태에서, 상기 방법은 (i) 출혈성 뇌졸중 후 및 CSF를 Hp에 노출시키기 전에 대상체로부터 CSF 샘플을 수득하는 단계; (ii) 단계 (i)에서 수득된 CSF 샘플에서 무세포 Hb의 양을 측정하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)의 무세포 Hb 농도에 기초하여 적어도 등몰량의 Hp를 측정하는 단계를 포함한다. CSF 샘플에서 무세포 Hb의 양을 측정하는 적절한 방법은 당업계의 숙련가들에게 알려져 있을 것이며, 이의 예시적인 예는 Oh 등(2016, Redox Biology, 9: 167-177)에 기술되어 있고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원의 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 무세포 Hb와 CSF 내 Hb의 복합체화는 뇌 조직에 대한 무세포 Hb의 불리한 생물학적 활성을 중화시킬 것이다. 본원에 개시된 방법에 따라 형성된 무세포 Hb:Hp 복합체를 추출하거나 제거하는 것이 일반적으로 불필요하지만, 일부 경우에는 상기 복합체를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법이 대상체로부터 CSF를 제거하고 후속적으로 CSF를 Hp에 체외로 노출시키는 것을 포함하는 경우, 대상체에게 CSF를 재투여하기 전에 CSF에서 형성된 무세포 Hb:Hp 복합체를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 상기 방법은 CSF에 형성된 Hp:무세포 Hb 복합체를 제거함을 포함한다.

하나의 양태에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(i) 출혈 후 대상체로부터 CSF를 수득하는 단계;

(ii) Hp가 CSF 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하도록 하는 조건하에서 단계 (i)의 CSF를 Hp에 노출시키는 단계;

(iii) 단계 (ii) 이후에 CSF로부터 Hp:무세포 Hb 복합체를 추출하여 단계 (i)의 CSF와 비교할 때 더 적은 양의 무세포 Hb를 갖는 Hb가 감소된 CSF를 수득하는 단계;

(iv) 임의로, 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하여 무세포 Hb가 실질적으로 없는 Hb가 감소된 CSF를 수득하는 단계; 및

(v) 단계 (iii) 또는 단계 (iv)로부터 수득된 Hb가 감소된 CSF를 대상체의 CSF 구획에 투여하는 단계.

본원에 사용된 바와 같이, "Hb가 감소된 CSF"는 CSF가 단계 (iii) 이전의 무세포 Hb의 양과 비교할 때 더 적은 양의 무세포 Hb를 갖도록 무세포 Hb의 양이 제거된 CSF를 의미한다. 용어 "Hb가 감소된 CSF"는 모든 무세포 Hb가 CSF로부터 제거되었음을 의미하는 것이 아니며 따라서 적어도 일부 무세포 Hb가 있는 양태를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 하나의 양태에서, Hb가 감소된 CSF는 대상체로부터 수득된 CSF에서의 무세포 Hb의 양과 비교할 때 적어도 약 5%, 바람직하게는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 약 15%, 바람직하게는 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 약 25%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 바람직하게는 적어도 약 35%, 바람직하게는 적어도 약 40%, 바람직하게는 적어도 약 45%, 바람직하게는 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 55%, 바람직하게는 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 65%, 바람직하게는 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 또는 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 더 적은 무세포 Hb를 포함한다. 하나의 양태에서, Hb가 감소된 CSF는 대상체로부터 수득된 CSF에서의 무세포 Hb의 양과 비교할 때 약 5% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 10% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 30% 내지 약 40%, 바람직하게는 약 40% 내지 약 50%, 바람직하게는 약 50% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 60% 내지 약 70%, 바람직하게는 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%, 또는 보다 바람직하게는 약 90% 내지 약 99% 더 적은 무세포 Hb를 포함한다.

본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, Hb가 감소된 CSF는 CSF로부터 추가의 무세포 Hb를 제거하고, 바람직하게는 무세포 Hb가 실질적으로 없는 Hb가 감소된 CSF를 수득하기 위해 임의로, 단계 (ii) 및 (iii)을 반복함으로써 추가로 처리될 수 있다. "무세포 Hb가 실질적으로 없는"이란 Hb가 감소된 CSF가 대상체로부터 수득된 CSF에서의 무세포 Hb의 양과 비교할 때 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 80% 내지 약 90%, 또는 보다 바람직하게는 약 90% 내지 약 99% 더 적은 무세포 Hb를 포함함을 의미한다.

하나의 양태에서, 상기 방법은 단계 (ii) 및 (iii)을 적어도 한 번(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11회 등) 반복함을 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 방법은 무세포 Hb가 실질적으로 없는 Hb가 감소된 CSF를 수득하기 위해 필요에 따라 단계 (ii) 및 (iii)을 적어도 1회, 바람직하게는 2회, 바람직하게는 3회, 바람직하게는 4회, 바람직하게는 5회, 바람직하게는 6회, 바람직하게는 7회, 바람직하게는 8회, 바람직하게는 9회, 또는 보다 바람직하게는 10회 반복함을 포함한다.

무세포 Hb가 실질적으로 없는 Hb가 감소된 CSF를 수득하기 위해 단계 (ii) 및 (iii)을 반복해야 하는 횟수는 대상체로부터의 CSF 내의 무세포 Hb의 농도, 사용된 Hb의 농도, 추출 방법 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 요인에 따라 좌우될 수 있음을 이해해야 한다. 일부 경우에, 특히 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하면 CSF가 박테리아, 효모, 진균 및 바이러스와 같은 오염 물질에 노출될 수 있는 경우 단계 (ii) 및 (iii)을 한 번만 수행하는 것이 바람직할 수 있다.

CSF로부터 Hp:무세포 Hb 복합체를 추출하는 적합한 방법은 당업계의 숙련가들에게 알려져 있을 것이며, 이의 예시적인 예는 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 크기 배제 크로마토그래피는, 유리 Hb 및 Hp에 비해 더 큰 크기 덕분에, Hp:무세포 Hb 복합체를 식별하고 CSF 내의 다른 구성요소로부터 분리할 수 있게 한다. 친화성 크로마토그래피는 유리 Hb에 대한 결합은 무시할 수 있는 수준이면서 Hb:Hp 복합체에 특이적으로 결합하는 결합제를 사용함으로써 Hp:무세포 Hb 복합체를 식별하고 CSF의 다른 구성요소로부터 분리할 수 있게 한다. 적합한 결합제는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같은 항체 또는 이의 항-결합 단편을 포함한다.

하나의 양태에서, 단계 (ii)는 단계 (i)의 CSF를 Hp가 고정된 기질 위로 통과시킴을 포함한다. 이것은 유리하게는 CSF 내의 무세포 Hb가 Hp에 결합하여 무세포 Hb를 기질에 이동시키고 Hb가 감소된 CSF가 기질로부터 편리하게 용출되도록 한다. 따라서, 하나의 양태에서, 단계 (ii)에서 Hp는 기질 상에 고정된다. 적합한 기질은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 크기 배제 크로마토그래피 수지 및 친화성 크로마토그래피 수지를 포함한다. 하나의 양태에서, 기질은 친화성 크로마토그래피 수지이다.

하나의 양태에서, 단계 (ii)는 CSF 내의 무세포 Hb가 수지에 결합하도록 하는 조건하에서 친화성 크로마토그래피 수지를 통해 단계 (i)의 CSF를 통과시킴을 포함하고; 단계 (iii)은 단계 (ii) 후에 수지로부터 CSF를 용출시킴을 포함하며; 단계 (iv)는 용출된 CSF를 회수함을 포함한다.

단계 (iii) 또는 단계 (iv)로부터 수득된 Hb가 감소된 CSF를 단계 (vi)에서 대상체의 CSF 구획에 투여하기 전에, 대상체의 CSF 구획에 존재할 수 있고 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 2차 신경학적 이상 반응을 초래할 수 있는 잔류 무세포 Hb를 제거하기 위해 Hb가 감소된 CSF에 치료학적 유효량의 Hp를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 상기 방법은 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 단계 (v) 이전에 Hb가 감소된 CSF에 치료학적 유효량의 Hp를 첨가하는 단계를 포함한다.

당업계의 숙련가들은 일단 CSF가 출혈성 뇌졸중 후 대상체의 CSF 구획으로부터 제거되면, CSF 구획에 잔류 무세포 Hb가 남아 있을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 잔류 무세포 Hb의 적어도 일부를 제거하여 이러한 잔류 무세포 Hb가 야기할 수 있는 2차 신경학적 이상 반응을 없애거나 감소시키기 위해 (일단 CSF가 상기 단계 (i)에 따라 제거되면) CSF 구획을 세정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 상기 방법은 단계 (i) 이후에 CSF 구획을 세척 용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함한다.

적합한 세척 용액은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이다. 하나의 양태에서, 세척 용액은 인공 CSF이다.

인공 뇌척수액(aCSF)은 전형적으로 염분(salt content)을 포함하여 천연 CSF를 모방하는 유체이다. aCSF의 적합한 조성물은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 제US 2006/0057065호 및 문헌[Matzneller et al. (Pharmacology, 2016; 97(5-6):233-44)]에 기술되어 있고, 이들의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 NaCl을 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 NaCl 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 NaHCO₃을 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 NaHCO₃ 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 KCl을 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 KCl 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 NaH₂PO₄를 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 NaH₂PO₄ 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 MgCl₂를 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 MgCl₂ 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 글루코스를 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 글루코스 농도를 포함할 것이다. 대안적으로, 인공 CSF는 대상체에게 aCSF를 투여하는데 사용되는 임의의 카테터에서 박테리아 성장의 가능성을 줄이도록 글루코스를 생략할 수 있다.

하나의 양태에서, 인공 CSF/세척 용액은 NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂0, CaCl₂H₂O 및 글루코스를 포함한다.

하나의 양태에서, 세척 용액은 Hp를 포함한다.

하나의 양태에서, 세척 용액은 약 2μM 내지 약 20mM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 세척 용액은 약 2μM 내지 약 5mM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 세척 용액은 약 100μM 내지 약 5mM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 세척 용액은 약 2μM 내지 약 300μM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 세척 용액은 약 5μM 내지 약 50μM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 세척 용액은 약 10μM 내지 약 30μM Hp를 포함한다.

하나의 양태에서, 세척 용액은 출혈 후 대상체의 CFS에서의 무세포 Hb 농도와 적어도 등몰량의 Hp를 포함한다. 또 다른 양태에서, 세척 용액은 약 3μM 내지 약 300μM Hp를 포함한다.

일부 양태에서, 본원에 기술된 바와 같이 대상체의 CSF로부터 무세포 Hb를 체외로 제거하는 단계를 생략하고, 대신 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 대상체의 CSF를 인공 CSF로 대체하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:

(i) 출혈 후 대상체로부터 CSF를 제거하는 단계;

(ii) 단계 (i) 이후 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp를 포함하는 세척 용액으로 세정하는 단계;

(iii) 임의로, 단계 (ii)를 반복하는 단계; 및

(iv) 단계 (ii) 또는 단계 (iii) 이후 대상체의 CSF 구획에 인공 CSF를 투여하는 단계.

치료학적 유효량의 Hp를 세척 용액에 혼입함으로써, CSF 구획의 잔류 무세포 Hb를 Hp와 복합체화하여 뇌 조직에 대한 무세포 Hb의 불리한 생물학적 효과를 중화시킬 수 있다.

하나의 양태에서, 인공 CSF는 NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂0, CaCl₂H₂O 및 글루코스를 포함한다. 하나의 양태에서, 인공 CSF는 Hp를 포함한다.

하나의 양태에서, 인공 CSF는 약 2μM 내지 약 20mM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 인공 CSF는 약 2μM 내지 약 5mM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 인공 CSF는 약 100μM 내지 약 5mM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 인공 CSF는 약 2μM 내지 약 300μM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 인공 CSF는 약 5μM 내지 약 50μM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 인공 CSF는 약 10μM 내지 약 30μM Hp를 포함한다.

하나의 양태에서, 인공 CSF는 출혈 후 대상체의 CFS에서의 무세포 Hb 농도와 적어도 등몰량의 Hp를 포함한다. 또 다른 양태에서, 인공 CSF는 약 3μM 내지 약 300μM Hp를 포함한다.

보조 요법

본원에 기술된 바와 같이 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료하거나 예방하는 방법은 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 하나 이상의 2차 신경학적 이상 반응을 감소, 억제, 예방 또는 완화하도록 설계된 하나 이상의 다른 치료 전략과 함께 순차적으로 또는 병용하여(예를 들어, 동시에) 적절하게 수행될 수 있다. 따라서, 하나의 양태에서, 상기 방법은 뇌실내 출혈 후 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 제2 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 뇌실내 출혈 후 2차 신경학적 이상 반응을 치료하거나 예방하기 위한 적절한 다른 치료 전략 또는 제2 제제는 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 다음을 포함한다:

(i) 응고장애 교정 - 예를 들어, 비타민 K 길항제(VKA), 신규 경구 항응고제(NOAC, 예를 들어, 다비가트란, 리바록사반 및 아픽사반), 인자 8 억제제 우회 활성(FEIBA) 및 활성화된 재조합 인자 VII(rFVIIa), 프로트롬빈 복합 농축물, 활성탄, 항혈소판 요법(APT) 및 아스피린 단독요법 사용;

(ii) 혈압 강하 - 예를 들어, 항고혈압제, 이의 예시적인 예는 (i) 클로르탈리돈, 클로르티아지드, 디클로로페나미드, 하이드로플루메티아지드, 인다파미드 및 하이드로클로로티아지드를 포함한 티아지드와 같은 이뇨제; 부메타니드, 에타크린산, 푸로세미드 및 토르세미드와 같은 루프 이뇨제; 아밀로리드 및 트리암테렌과 같은 칼륨 결핍 작용제; 및 스피로노락톤, 에피레논 등과 같은 알도스테론 길항제; (ii) 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 베반톨롤, 비소프롤롤, 보핀돌롤, 카르테올롤, 카르베딜롤, 셀리프롤롤, 에스몰롤, 인데놀롤, 메타프롤롤, 나돌롤, 네비볼롤, 펜부톨롤, 핀돌롤, 프로파놀롤, 소탈롤, 테르타톨롤, 틸리솔롤 및 티몰롤 등과 같은 베타-아드레날린성 차단제; (iii) 암로디핀, 아라니디핀, 아젤니디핀, 바르니디핀, 베니디핀, 베프리딜, 시날디핀, 클레비디핀, 딜티아젬, 에포니디핀, 펠로디핀, 갈로파밀, 이스라디핀, 라시디핀, 레밀디핀, 레르카니디핀, 니카르디핀, 니페디핀, 닐바디핀, 니모데핀, 니솔디핀, 니트렌디핀, 마니디핀, 프라니디핀 및 베라파밀 등과 같은 칼슘 채널 차단제; (iv) 베나제프릴; 캡토프릴; 실라자프릴; 델라프릴; 에날라프릴; 포시노프릴; 이미다프릴; 로시노프릴; 모엑시프릴; 퀴나프릴; 퀴나프릴라트; 라미프릴; 페린도프릴; 페린드로프릴; 콰니프릴; 스피라프릴; 테노카프릴; 트란돌라프릴 및 조페노프릴 등과 같은 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제; (v) 오마파트릴라트, 카독사트릴 및 에카도트릴, 포시도트릴, 삼파트릴라트, AVE7688, ER4030 등과 같은 중성 엔도펩티다제 억제제; (vi) 테조센탄, A308165, 및 YM62899 등과 같은 엔도텔린 길항제; (vii) 하이드랄라진, 클로니딘, 미녹시딜 및 니코티닐 알콜 등과 같은 혈관확장제; (viii) 칸데사르탄, 에프로사르탄, 이르베사르탄, 로사르탄, 프라토사르탄, 타소사르탄, 텔미사르탄, 발사르탄 및 EXP-3137, FI6828K, 및 RNH6270 등과 같은 안지오텐신 II 수용체 길항제; (ix) 니프라딜롤, 아로티놀롤 및 아모술랄롤 등과 같은 α/β 아드레날린성 차단제; (x) 테라조신, 우라피딜, 프라조신, 부나조신, 트리마조신, 독사조신, 나프토피딜, 인도라민, WHIP 164, 및 XENOlO 등과 같은 알파 1 차단제; 및 (xi) 로펙시딘, 티아메니딘, 목소니딘, 릴메니딘 및 구아노벤즈 등과 같은 -알파 2 효능제를 포함한다.

(ii-b) 혈관 확장제 - 예를 들어, 하이드랄라진(아프레솔린), 클로니딘(카타프레스), 미녹시딜(로니텐), 니코티닐 알콜(로니아콜), 시드논 및 나트륨 니트로프루시드.

(iii) 발작, 글루코스 및 체온의 관리 - 예를 들어, 항간질제, 혈당 수준을 조절하기 위한 인슐린 주입, 정상 체온 유지 및 치료적 냉각;

(iv) 외과적 치료 - 예를 들어, 혈종 제거(외과적 혈전 제거), 감압 두개골 절제술(DC), 최소 침습 수술(MIS; 예를 들어 기저핵 출혈의 세침 흡인), 재조합 조직형 플라스미노겐 활성제(rtPA)를 사용한 MIS;

(v) 수술 시기 - 예를 들어, 증상 발생 후 4 내지 96시간;

(vi) 트롬빈 억제 - 예를 들어, 히루딘, 아르가트로반, 세린 프로테아제 억제제(예를 들어, 나파모스타트 메실레이트);

(vii) 헴 및 철 독성 예방 - 예를 들어, 주석-메소포르피린과 같은 비특이 헴 옥시게나제(HO) 억제제, 데페록사민과 같은 철 킬레이트제;

(viii) PPARg 길항제 및 효능제 - 예를 들어, 로시글리타존, 15d-PGJ2 및 피오글리타존;

(ix) 미세아교세포 활성화의 억제 - 예를 들어, 튜프트신 단편 1-3(미세아교세포/대식세포 억제 인자) 또는 미노사이클린(테트라사이클린-계열 항생제);

(x) NF - 에리스로이드 -2 관련 인자 2( Nrf2 )의 상향조절;

(xi) 사이클로- 옥시게나제 (COX) 억제 - 예를 들어, 셀레콕십(선택적 COX-2 억제제);

(xii) 매트릭스 메탈로프로테이나제;

(xiii) TNF -α 조절제 - 예를 들어, CGS 21680과 같은 아데노신 수용체 효능제, ORF4-PE와 같은 TNF-α-특이 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드; 및

( xiv ) 혈압 상승 - 예를 들어, 카테콜아민

( xv ) TLR4 신호전달의 억제제 - 예를 들어, 항체 Mts510 및 TAK-242(사이클로헥센 유도체);

하나의 양태에서, 제2 제제는 혈관확장제이다. 적절한 혈관확장제는 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 시드논 및 나트륨 니트로프루시드를 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 양태에서, 제2 제제는 시드논 및 나트륨 니트로프루시드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

인공 CSF

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 Hp를 포함하는 인공 뇌척수액(CSF)이 제공된다.

인공 뇌척수액(aCSF)은 전형적으로 염분을 포함하여 천연 CSF를 모방하는 유체이다. aCSF의 적합한 조성물은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 제US 2006/0057065호 및 문헌[Matzneller et al. (Pharmacology, 2016; 97(5-6):233-44], 이들의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 NaCl을 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 NaCl 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 NaHCO₃을 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 NaHCO₃ 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 KCl을 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 KCl 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 NaH₂PO₄을 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 NaH₂PO₄ 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 MgCl₂을 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 MgCl₂ 농도를 포함할 것이다. aCSF는 당업계의 숙련가들에게 친숙한 바와 같이 천연 CSF에서 발견되는 것과 유사한 농도의 글루코스를 포함할 수 있으며, 전형적으로 천연 CSF에서 약 15% 이내, 보다 바람직하게는 약 10% 이내 농도의 글루코스 농도를 포함할 것이다. 대안적으로, 인공 CSF는 대상체에게 aCSF를 투여하는데 사용되는 임의의 카테터에서 박테리아 성장의 가능성을 줄이도록 글루코스를 생략할 수 있다.

하나의 양태에서, Hp는 Hp1-1 동종이량체, Hp1-2 다량체, Hp2-2 다량체 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 양태에서, Hp는 Hp2-2 다량체를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다.

약제학적 조성물

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법에 따라 뇌실내 출혈 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 유효량의 Hp, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법에 따라 뇌실내 출혈 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 유효량의 Hp, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

하나의 양태에서, 조성물은 약 2μM 내지 약 20mM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 조성물은 약 2μM 내지 약 5mM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 조성물은 약 100μM 내지 약 5mM Hp, 또는 이의 기능적 유사체를 포함한다. 하나의 양태에서, 조성물은 약 2　μM 내지 약 300μM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 조성물은 약 5μM 내지 약 50μM Hp를 포함한다. 하나의 양태에서, 조성물은 약 10μM 내지 약 30μM Hp를 포함한다.

하나의 양태에서, 조성물은 출혈 후 대상체의 CFS에서의 무세포 Hb 농도와 적어도 등몰량의 Hp를 포함한다. 또 다른 양태에서, 조성물은 약 3μM 내지 약 300μM Hp를 포함한다.

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 방법에 따라 뇌실내 출혈 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 기술된 바와 같은 치료학적 유효량의 Hp의 용도가 제공된다.

하나의 양태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 척추강내 투여용으로 제형화된다. 적절한 척추강내 전달 시스템은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 문헌[Kilburn et al. (2013, Intrathecal Administration. In: Rudek M., Chau C., Figg W., McLeod H. (eds) Handbook of Anticancer Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Cancer Drug Discovery and Development. Springer, New York, NY)]에 기술되어 있고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

또 다른 양태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 두개내 투여용으로 제형화된다. 적절한 척추강내 전달 시스템은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 문헌[Upadhyay et al. (2014, PNAS, 111(45):16071-16076)]에 기술되어 있고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

또 다른 양태에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 뇌실내 투여용으로 제형화된다. 적절한 척추강내 전달 시스템은 당업계의 숙련가들에게 친숙할 것이며, 이의 예시적인 예는 문헌[Cook et al. (2009, Pharmacotherapy . 29(7):832-845)]에 기술되어 있고, 이의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.

적합한 약제학적 조성물 및 이의 단위 투여 형태는 추가의 활성 화합물 또는 원리를 갖거나 갖지 않으면서 통상적인 성분을 통상적인 비율로 포함할 수 있으며, 이러한 단위 투여 형태는 사용하고자 하는 의도된 1일 투여량 범위에 상응하는 임의의 적합한 유효량의 활성 성분을 함유할 수 있다.

키트

본원에 개시된 또 다른 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 인공 CSF, 또는 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 키트가 제공된다. (Hp를 포함하는) 본원에 기술된 바와 같은 활성제는 활성제의 동시, 개별 또는 순차 투여를 허용하도록 구성된 성분 키트의 형태로 제공될 수 있다. 각 담체, 희석제, 아주반트 및/또는 부형제는 조성물의 다른 성분과 상용성이고 대상체에 의해 생리학적으로 허용되는 한 "약제학적으로 허용 가능"해야 한다. 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고 약학 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분을 액체 담체, 희석제, 보조제 및/또는 부형제 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 다와 균일하고 긴밀하게 결합시킨 다음, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.

따라서, 본 발명은 특히 하기 양태 [1] 내지 [74]에 관한 것이다:

[1.] 혈관외 용혈 및 무세포 헤모글로빈(Hb)의 뇌척수액(CSF)으로의 방출을 수반하는 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 CSF를, 합토글로빈(Hp)이 무세포 헤모글로빈(Hb)과 복합체를 형성해 상기 무세포 Hb를 중화시키기에 충분한 시간 동안, 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.

[2.] 상기 출혈성 뇌졸중이 자발성 출혈 또는 외상성 출혈인, 항목 [1]의 방법.

[3.] 상기 출혈성 뇌졸중이 뇌실내 출혈 또는 지주막하 출혈인, 항목 [1] 또는 항목 [2]의 방법.

[4.] 상기 지주막하 출혈이 동맥류성 지주막하 출혈인, 항목 [3]의 방법.

[5.] 상기 2차 신경학적 이상 반응이 지연성 허혈성 신경학적 결손(DIND), 지연성 뇌허혈(DCI), 신경독성, 염증, 산화질소 고갈, 산화 조직 손상, 뇌혈관경련, 뇌혈관 반응성 및 부종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항목 [1] 내지 [4] 중의 어느 하나의 방법.

[6.] 상기 2차 신경학적 이상 반응이 뇌혈관경련인, 항목 [5]의 방법.

[7.] 상기 2차 신경학적 이상 반응이 지연성 허혈성 신경학적 결손인, 항목 [5]의 방법의 방법.

[8.] 상기 2차 신경학적 이상 반응이 지연성 뇌허혈인, 항목 [5]의 방법.

[9.] 상기 2차 신경학적 이상 반응이 뇌 실질 내의 2차 신경학적 이상 반응인, 항목 [1] 내지 [8] 중의 어느 하나의 방법.

[10.] 출혈의 개시 후 약 21일 이내에 CSF를 Hp 또는 이의 기능적 유사체에 노출시킴을 포함하는, 항목 [1] 내지 [9] 중의 어느 하나의 방법.

[11.] 출혈의 개시 후 약 2일 내지 약 4일에 CSF를 Hp에 노출시킴을 포함하는, 항목 [10]의 방법.

[12.] 출혈의 개시 후 약 5일 내지 약 14일에 CSF를 Hp에 노출시킴을 포함하는, 항목 [10]의 방법.

[13.] 상기 대상체에게 Hp를 두개내 투여함을 포함하는, 항목 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 방법.

[14.] 상기 대상체에게 Hp를 척추강내 투여함을 포함하는, 항목 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 방법.

[15.] 상기 Hp가 척추관으로 척추강내 투여되는, 항목 [14]의 방법.

[16.] 상기 Hp가 지주막하 공간으로 척추강내 투여되는, 항목 [14]의 방법.

[17.] 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 Hp를 뇌실내 투여함을 포함하는, 항목 [1] 내지 [12] 중의 어느 하나의 방법.

[18.] 상기 CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간이 적어도 약 2분인, 항목 [13] 내지 [17] 중의 어느 하나의 방법.

[19.] 상기 CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간이 약 2분 내지 약 45분인, 항목 [18]의 방법.

[20.] 상기 CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간이 약 2분 내지 약 20분인, 항목 [18]의 방법.

[21.] 상기 CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간이 약 4분 내지 약 10분인, 항목 [18]의 방법.

[22.] 상기 치료학적 유효량의 Hp가 출혈 후 대상체의 CFS에서의 무세포 Hb 농도와 적어도 등몰량인, 항목 [1] 내지 [21] 중의 어느 하나의 방법.

[23.] (i) 출혈 후 CSF를 Hp에 노출시키기 전에 대상체로부터 CSF 샘플을 수득하는 단계; (ii) 단계 (i)에서 수득된 CSF 샘플에서 무세포 Hb의 양을 측정하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)의 무세포 Hb 농도에 기초하여 적어도 등몰량의 Hp를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 항목 [22]의 방법.

[24.] 상기 Hp의 치료학적 유효량이 약 2μM 내지 약 20mM인, 항목 [1] 내지 [23] 중의 어느 하나의 방법.

[25.] 상기 Hp의 치료학적 유효량이 약 2μM 내지 약 300μM인, 항목 [24]의 방법.

[26.] 상기 Hp의 치료학적 유효량이 약 5μM 내지 약 50μM인, 항목 [24]의 방법.

[27.] 상기 Hp의 치료학적 유효량이 약 10μM 내지 약 30μM인, 항목 [24]의 방법.

[28.] 상기 CSF에서 형성된 Hp:무세포 Hb 복합체를 제거함을 추가로 포함하는, 항목 [1] 내지 [27] 중의 어느 하나의 방법.

[29.] 체외에서 상기 CSF를 치료학적 유효량의 Hp에 노출시킴을 포함하는, 항목 [1] 내지 [28] 중의 어느 하나의 방법.

[30.] (i) 출혈 후 대상체의 CSF 구획으로부터 CSF의 샘플을 수득하는 단계;

(iii) Hp가 풍부한 CSF 샘플을 대상체에게 투여하여, Hp가 대상체의 CSF 구획 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계; 및

(iv) 임의로, 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계를 포함하는, 항목 [29]의 방법.

[31.] (i) 출혈 후 대상체의 CSF 구획으로부터 일정 용적의 CSF를 제거하는 단계;

(ii) Hp를 포함하는 인공 CSF를 제공하는 단계;

(iii) 단계 (ii)의 인공 CSF를 대상체에게 투여하여, Hp가 대상체의 CSF 구획 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계; 및

[32.] (i) 출혈 후 대상체로부터 CSF를 수득하는 단계;

(ii) Hp 또는 이의 기능적 유사체가 CSF 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하도록 하는 조건하에서 단계 (i)의 CSF를 Hp에 노출시키는 단계;

(v) 단계 (iii) 또는 단계 (iv)로부터 수득된 Hb가 감소된 CSF를 대상체의 CSF 구획에 투여하는 단계를 포함하는, 항목 [29]의 방법.

[33.] 단계 (vi) 전의 Hb가 감소된 CSF에 치료학적 유효량의 Hp를 첨가함을 추가로 포함하는, 항목 [32]의 방법.

[34.] 상기 Hp가 기질 상에 고정되는, 항목 [32] 또는 항목 [33]의 방법.

[35.] 상기 기질이 친화성 크로마토그래피 수지인, 항목 [34]의 방법.

[36.] 단계 (ii)가 CSF 내의 무세포 Hb가 수지에 결합하도록 하는 조건하에서 친화성 크로마토그래피 수지를 통해 단계 (i)의 CSF를 통과시킴을 포함하고; 단계 (iii)이 단계 (ii) 후에 수지로부터 CSF를 용출시킴을 포함하며; 단계 (iv)가 용출된 CSF를 회수함을 포함하는, 항목 [35]의 방법.

[37.] 임의로, 단계 (i) 후에 CSF 구획을 세척 용액으로 세척함을 포함하는, 항목 [32] 내지 [36] 중의 어느 하나의 방법.

[38.] 상기 세척 용액이 인공 CSF인, 항목 [37]의 방법.

[39.] 상기 인공 CSF가 NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂0, CaCl₂H₂O 및 글루코스를 포함하는, 항목 [31] 또는 항목 [38]의 방법.

[40.] 상기 세척 용액이 Hp를 포함하는, 항목 [37] 내지 [39] 중의 어느 하나의 방법.

[41.] 상기 세척 용액이 약 2μM 내지 약 20mM Hp를 포함하는, 항목 [40]의 방법.

[42.] 상기 세척 용액이 약 2μM 내지 약 300μM Hp를 포함하는, 항목 [41]의 방법.

[43.] (i) 출혈 후 대상체로부터 CSF를 제거하는 단계;

(ii) 단계 (i) 후에 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp를 포함하는 세척 용액으로 세정하는 단계;

(iii) 임의로, 단계 (ii)를 반복하는 단계; 및

(iv) 단계 (ii) 또는 단계 (iii) 후에 대상체의 CSF 구획에 인공 CSF를 투여하는 단계를 포함하는, 항목 [1] 내지 [42] 중의 어느 하나의 방법.

[44.] 상기 인공 CSF가 NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂0, CaCl₂H₂O 및 글루코스를 포함하는, 항목 [43]의 방법.

[45.] 상기 인공 CSF가 Hp를 포함하는, 항목 [43] 또는 항목 [44]의 방법.

[46.] 상기 인공 CSF가 약 2μM 내지 약 20mM Hp를 포함하는, 항목 [45]의 방법.

[47.] 상기 인공 CSF가 약 2μM 내지 약 300μM Hp를 포함하는, 항목 [46]의 방법.

[48.] 상기 Hp가 Hp1-1 동종이량체, Hp1-2 다량체, Hp2-2 다량체 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항목 [1] 내지 [47] 중의 어느 하나의 방법.

[49.] 상기 Hp가 Hp2-2 다량체를 포함하는, 항목 [48]의 방법.

[50.] 상기 Hp가 재조합 단백질인, 항목 [1] 내지 [49] 중의 어느 하나의 방법.

[51.] 상기 Hp가 혈장 유래인, 항목 [1] 내지 [49] 중의 어느 하나의 방법.

[52.] 뇌실내 출혈 후 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 제2 제제를 대상체에게 투여함을 추가로 포함하는, 항목 [1] 내지 [51] 중의 어느 하나의 방법.

[53.] 상기 제2 제제가 혈관확장제인, 항목 [52]의 방법.

[54.] 상기 제2 제제가 시드논 및 나트륨 니트로프루시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항목 [52] 또는 항목 [53]의 방법.

[55.] Hp를 포함하는 인공 뇌척수액(CSF).

[56.] 상기 Hp가 약 2μM 내지 약 20mM의 양으로 존재하는, 항목 [55]의 인공 CSF.

[57.] 상기 Hp가 약 5μM 내지 약 300μM의 양으로 존재하는, 항목 [55]의 인공 CSF.

[58.] 상기 Hp가 약 5μM 내지 약 50μM의 양으로 존재하는, 항목 [55]의 인공 CSF.

[59.] 상기 Hp가 약 10μM 내지 약 30μM의 양으로 존재하는, 항목 [58]의 인공 CSF.

[60.] 상기 Hp가 Hp1-1 동종이량체, Hp1-2 다량체, Hp2-2 다량체 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항목 [57] 내지 [59] 중의 어느 하나의 인공 CSF.

[61.] Hp2-2 다량체를 포함하는, 항목 [60]의 인공 CSF.

[62.] 상기 Hp가 재조합 단백질인, 항목 [59] 또는 [60]의 인공 CSF.

[63.] 상기 Hp가 혈장 유래인, 항목 [57] 또는 [58]의 인공 CSF.

[64.] 치료학적 유효량의 Hp, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 항목 [1] 내지 [54] 중의 어느 하나의 방법에 따라 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.

[65.] 치료학적 유효량의 Hp, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 항목 [1] 내지 [54] 중의 어느 하나의 방법에 따라 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.

[66.] 상기 Hp가 약 2μM 내지 약 20mM의 양으로 존재하는, 항목 [64] 또는 항목 [65]의 조성물.

[67.] 상기 Hp가 약 2μM 내지 약 300μM의 양으로 존재하는, 항목 [66]의 조성물.

[68.] 상기 Hp가 약 5μM 내지 약 50μM의 양으로 존재하는, 항목 [66]의 조성물.

[69.] 상기 Hp가 약 10μM 내지 약 30μM의 양으로 존재하는, 항목 [66]의 조성물.

[70.] 상기 Hp가 Hp1-1 동종이량체, Hp1-2 다량체, Hp2-2 다량체 및 전술한 것 중 임의의 것의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 항목 [64] 내지 [69] 중의 어느 하나의 조성물.

[71.] Hp2-2 다량체를 포함하는, 항목 [70]의 조성물. 추가의 양태에 따르면, 항목 [70]의 조성물은 Hp1-1 동종이량체를 포함한다.

[72.] 항목 [1] 내지 [54] 중의 어느 하나의 방법에 따라 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 치료학적 유효량의 합토글로빈(Hp)의 용도.

[73.] 항목 [1] 내지 [54] 중의 어느 하나의 방법에 따라 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 치료학적 유효량의 합토글로빈(Hp).

[74.] 항목 [55] 내지 [63] 중의 어느 하나의 인공 CSF 또는 항목 [64] 내지 [71] 중의 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트.

당업계의 숙련가들은 본원에 기술된 발명이 구체적으로 기술된 것 이외의 변형 및 수정이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 취지 및 범위 내에 속하는 모든 그러한 변형 및 수정을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 또한 개별적으로 또는 집합적으로 본 명세서에서 언급되거나 표시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 임의의 둘 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.

본 발명의 특정 양태는 이하에서 단지 예시의 목적으로 의도되고 앞서 기술된 일반성의 범위를 제한하도록 의도되지 않은 하기 실시예를 참조하여 기술될 것이다.

실시예

재료 및 방법

A. 생체외 혈관 기능 실험

표적 혈관의 단리

뇌저 동맥은 지역 도축장(SBZ, Zurich, Switzerland)에서 도축된 돼지의 신선한 머리에서 단리하였다. 머리를 맞춤형 고정 장치에 앙와위(supine)로 위치시키고, 경사대를 잔여 연조직의 절제에 의해 후두 관절구의 수준에서 후비공까지 노출시켰다. 경막을 대후두공의 전방 가장자리로부터 조심스럽게 분리하고 개두술을 위한 공간을 만들기 위해 약간 이동시켰다. 경사대의 양측 정중옆 절골술 및 끌(chisel)을 사용한 부분 관절융기절제술로 복측 경막의 노출을 야기하였다. 경막을 조심스럽게 제거하여 복측 뇌간의 혈관주위 지주막 수조를 온전하게 남겨 두었다. 뇌신경 III-XII를 절개하여 뇌간을 이동시켰다. 뇌간을 교중뇌 접합부 및 소뇌각의 수준에서 날카로운 절개에 의해 단리하고 미리 냉각된(4℃) 완충 용액으로 옮겼다. 해부 현미경을 사용하여, 척추 동맥을 해부학적 랜드마크로서 확인하고 척추뇌저 접합부에 근위로 2mm 절단하였다. 조심스러운 지주막 제조는 혈관의 과도한 기계적 조작을 피하면서 뇌저 동맥의 단계적 동원을 가능하게 하였다. 척추뇌저 접합부와 꼬리 대뇌 동맥 사이의 뇌저 동맥 세그먼트는 최대 6개의 혈관 고리(고리당 2mm의 길이)를 제조하는데 사용되었다(도 1).

모든 수술 준비 동안 동맥의 압박 또는 팽창을 피하기 위해 특별한 주의를 기울였다. 동물의 죽음과 완충액으로의 해부된 혈관의 이동 사이의 시간은 90분 미만으로 유지하였다.

완충액 및 화학물질의 제조

크렙스-헨젤라이트-완충액(KHB)은 5리터의 배치로 제조하였다. 2.27M NaCl 및 KCl 뿐만 아니라 1.00M KH₂PO₄의 스톡 용액을 제조하였다. 여러 성분의 이온 조성이 최대 용해도에 가깝기 때문에 화학물질의 올바른 순서를 따르고 각 첨가 단계 후 철저한 혼합이 이러한 완충액의 제조에 중요하다; 특히 석회(CaCO₃) 뿐만 아니라 인산칼슘 및 석고(CaSO₄)로 침전되는 경향이 있는 탄산수소칼슘의 경우. 실온에서 증류수 4리터에, 2.27M KCl 10.35ml와 2.27M NaCl 138.1ml를 혼합하였다. 10.50g NaHCO₃을 첨가하고 모든 염이 완전히 용해될 때까지 완충액을 진탕시켰다. 6.0ml의 1.00M KH₂PO₄를 첨가하고 용액을 다시 진탕시켰다. 1.84g의 CaCl₂ x 2 H₂O에 이어 1.48g MgSO₄ x 7 H₂O를 완충액에 용해시켰다. 121ml의 2.27M NaCl을 첨가하였다. 완충액을 정확히 37℃로 가열하고 적어도 1시간 동안 5% CO₂ 및 95% O₂로 버블링하여 평형화하였다. 진한 오르토-인산을 7.40으로 되도록 적가하여 pH를 조정하였다. 증류수로 용적을 5리터로 조정하였다. 완충액은 실온에서 저장하였다(염은 4℃에서 침전됨). 완충액의 조기 미생물학적 열화를 방지하기 위해 글루코스를 사용 직전에만 2g/l의 농도로 첨가하였다. KHB에 대한 최종 이온 조성은 다음과 같다: 143mM Na⁺, 5.90mM K⁺, 1.20mM Mg₂ ⁺, 2.50mM Ca₂ ⁺, 125mM Cl^-, 25.0mM HCO₃ ^-, 1.20mM의 SO₄ ²⁺, 1.20mM의 PO₄ ^3-, 및 11.1mM 글루코스.

MAHMA - NONOate

MAHMA-NONOate(ENZO Life Sciences, Lausen, Switzerland)을 20mM NaOH에 10mM의 스톡 농도로 되도록 용해시키고 -80℃에서 소량의 분취량으로 저장하였다. 사용 전에, 화학물질을 5mM NaOH에서 25μM의 농도로 희석하고 얼음에 저장하였다. 생리학적 pH에서 이 화학물질의 반감기는 온도에 따라 단지 수 초 내지 수 분에 불과하기 때문에, MAHMA-NONOate를 사용될 때까지 즉시 높은 pH에서 유지하는 것이 중요하다.

PGF2α

프로스타글란딘 F2(PGF2α) Sigma, Buchs, Switzerland)를 PBS pH 7.4에 10mM의 스톡 농도로 되도록 용해시키고 사용시까지 소량의 분취량으로 -80℃에서 저장하였다.

aSAH 환자의 CSF 샘플

뇌수종으로 인한 aSAH 진단 및 EVD 삽입을 받은 취리히 대학 병원(대학 3차 진료소)의 신경 집중 치료실(Neurocritical Care Unit)에 입원한 일련의 환자들을 2017년 4월부터 2018년 12월까지 연구 포함을 위해 선별하였다. 연구는 지역 윤리 검토 위원회의 승인을 받았으며 연구 포함 전에 모든 환자 또는 법정 대리인으로부터 서면 동의를 받았다.

배제 기준은 다음과 같이 정의되었다: 72시간 이내 출처를 알 수 없는 출혈, 72시간 이내 동맥류 확보 실패, 확보되지 않은 동맥류로부터의 재출혈 및 <18세 및 >80세의 나이.

동맥류 보수 후, EVD 카테터로부터 뇌실 CSF를 0일(출혈 발생일)과 14일 사이에 매일 샘플링하였다. CSF를 1500G에서 15분 동안 원심분리하였다(Capricorn CEP 2000 Benchtop centrifuge, Capricorn labs, UK). 분광광도법을 위해 추가 희석 없이 상청액을 수집하였다.

액체 상청액의 가시 범위에 있는 스펙트럼은 Shimadzu UV-1800 분광광도계(Shimadzu, Japan)에서 2nm 분해능으로 350 내지 650nm에서 기록하였다. 스펙트럼은 비-음수 최소 제곱 알고리즘¹¹의 Lawson-Hanson 구현과 이전에 기술된 바와 같은¹² R 통계적 소프트웨어 버전 4.2.3(www.r-project.org)에 의해 옥시-헤모글로빈(Fe²⁺), 메트-헤모글로빈(Fe³ ⁺) 및 빌리루빈의 알려진 농도의 참조 스펙트럼을 피팅함으로써 비권취되었다. 소렛 피크(soret peak)에 대해 2.0 이상의 흡광을 갖는 샘플에서, 비권취(deconvolution)는 높은 흡수에서 분광광도계의 비선형성을 보상하기 위해 435nm보다 큰 파장으로 제한되었다.

와이어 근운동 기록법(wire myography) 실험을 위한 CSF 샘플은 용혈 전(1-3일) 및 용혈(4-14일)로 정의되었다. 단일 날짜로부터의 제한된 사용 가능한 CSF 용적으로 인해, 필요한 경우 연속 날짜의 샘플을 혼주하였다.

와이어 근운동 기록법

혈관 고리를 5ml의 크렙스-헨셀라이트-완충액(KHB)을 함유하는 온도 조절(37℃) 및 연속 통기(95% O₂ 및 5% CO₂ 가스 혼합물) 기관조(organ bath)에 침지된 다중-채널 근운동 기록기 시스템 620M(Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark)의 두 개의 0.2mm 직경 핀 상에 장착하였다. CSF를 사용한 실험을 위해, 기관조에 3D 인쇄된 맞춤형 인레이(용적 2.5ml)와 인공 CSF로 1:1 희석된 CSF 샘플을 장착하여 단일 실험에 필요한 환자 샘플의 용적을 줄였다.

용기는 이전 실험에서 결정된 최적의 IC1/IC100 비율로 점진적으로 늘렸다. 사전-수축제(pre-contracting agent)로서 프로스타글란딘 F2α(PGF2α)를 10μM 농도로 사용하였다. NO 매개된 혈관확장 반응은 MAHMA-NONOate를 침지 완충액에 첨가함으로써 유도하였다. 모든 데이터는 Lab Chart 소프트웨어 버전 7.2.1(AD Instruments, Hastings, UK)을 사용하여 기록하였다. 달리 명시되지 않는 경우, 기록된 헤모글로빈-유도 혈관 기능 반응을 단일 실험 동안, Hb 노출이 없는 최대 NO-확장(= 100%) 및 MAHMA-NONOate 첨가 전의 긴장 수축 수준(= 0%)에 대해 각각 정규화하였다. 따라서 플롯의 응답은 상대적 수축으로 표시된다.

B. oxyHb 유도된 혈관경련의 양 모델

동물, 수용 및 관리

이 연구는 동물 보호 및 복지에 대한 스위스 법률 요건(TschG 455)에 따라 수행되었으며 연방 수의학 당국 'Kantonale Tierversuchskommission Zurich'(허가 번호 ZH234/17)의 윤리적 승인을 받았다.

2 내지 4세의 스위스 알프스 암컷 양(Staffelegghof, Kuttigen bei Aarau, Switzerland)을 취리히 동물 병원 실험실로 옮겨 적어도 7일 동안 새로운 환경에 적응시켰다. 순응 기간 동안 수의사를 통해 신체 검사와 혈액 검사를 사용한 표준화된 선별검사를 수행하였다. 동물을 18-24시간 동안 물에 자유롭게 접근하면서 수술전 금식시켰다.

마취

마취 유도 30분 전, 담당 수의 마취과 의사가 동물의 신체 상태를 다시 확인하였다. 그후 각 동물에 부프레노르핀(0.01mg/kg BW im) 및 메데토미딘(0.07-0.1mg/kg BW im)을 사전 투약하였다. 20분 후, 진정된 동물을 혈관 조영실로 이송하고, 진정 정도와 건강 상태를 다시 임상적으로 평가하였다.

14G, 3.5인치 정맥 카테터를 멸균 전처리하에 왼쪽 경정맥에 삽입하고 외과적으로 피부에 고정하였다. 미다졸람(0.1mg/kg BWT), 케타민(3mg/kg BWT)의 고정 용량 주사 및 프로포폴(0.3-1.5mg/kg BWT)의 가변 용량 주사에 의해 마취 상태가 정맥내로 유도하였다.

그후, 각 동물의 후두를 후두경을 통한 시각 제어하에 직접 분무된 리도카인 10%를 사용하여 탈감작시켰다. 20-30초의 허용 후, 동물 기관에 11 또는 12mm ID-크기의 적절하게 긴 실리콘 기관내 튜브를 사용하여 삽관술을 하였다. 그후 동물을 Allura Clarity 혈관조영술 제품군의 검사 테이블에 있는 유연한 진공 매트리스 위에 왼쪽 측면 황와위로 배치하였다.

이들을 적절한 크기의 동축 순환 호흡 시스템에 즉시 연결하고 분당 6-8회 호흡률 및 10mL/kg BWT의 일호흡량으로 인공 환기를 시작하였다. 이소플루란은 전체 시술에 걸쳐 0.8-2 Vol%의 산소로 전달되었다. 전체 시술에 걸쳐 적절한 헤모글로빈 산소화 상태를 평가하고 보장하기 위해 맥박 산소 측정기 프로브를 동물에 연결하였다. 환기는 카프노그래피(호흡-종기 CO₂)에 의해 및 동맥혈 가스 측정에 의해 뿐만 아니라 동맥-폐포 차이 계산에 의해 및 보어의 폐포 가스 방정식을 사용하여 환기-관류 일치의 상대적 기능을 추정함으로써 평가된 바와 같이 정상 탄산 상태(normocapnia)를 유지하도록 조정되었다. 동맥 CO₂는 특히 4-9kPa 범위에서 뇌혈관 반응성의 주요 인자를 나타내는 것으로 알려져 있기 때문에, 정상적이고 일정한 CO₂의 동맥 분압(2.5-5.5kPa)의 유지가 매우 중요하였다.

요도 카테터(Foley, 크기 9)를 방광에 삽입하여 시술 동안 소변이 흐르도록 하고 시간 경과에 따른 소변 생성을 모니터링하였다. 초음파검사 제어하에, 8F 혈관내 캐뉼러를 나중에 혈관내 카테터를 도입하기 위한 포트로서 오른쪽 외부 경동맥에 삽입하였다. 일단 배치되면, 항응고를 보장하기 위해 100IU/kg/BWT의 비분별된 헤파린을 정맥내 투여하였다. 이것을 시술 전체에 걸쳐 6시간마다 반복하였다. 그후 동물을 나머지 시술은 변경하지 않고 유지되는 최종 신체 위치로 앞다리를 목 아래로 구부리고 뒷다리를 앞으로 구부린 흉골 황와위로 배치하였다.

지속적인 직접 동맥 혈압 모니터링 및 간헐적 혈액 가스 분석을 위한 동맥 혈액 샘플링을 위해 20G Surflo Terumo® 카테터를 사용하여 이개 동맥 둘 다에 캐뉼러를 삽입하였다.

동물을 심박수, 심전도, 침습성 직접 동맥 혈압, 산소 헤모글로빈 포화도, 및 산소, 이산화탄소 및 이소플루란의 흡기 및 호기 산소 농도의 연속 측정(Datex-Ohmeda S3 소형 생명 징후 모니터) 및 기록(노트북 컴퓨터를 통해)을 위해 계측하였다. 동물에게 3mL/kg BWT/hr의 표준 속도로 시술의 전체 기간에 걸쳐 정맥내로 락테이트화 링거 용액을 투여하였으며, 정상 혈압(60-100mmHg 평균 동맥 혈압) 및 2mL/kg/hr의 정상적인 소변 생산량을 유지하기 위해 필요할 때 조정하였다.

마취 상태를 유지하고 필요한 경우 주사기 펌프(Perfusor®, BBraun; 속도 0.5-2mg/kg/hr)에 의해 정맥내 투여되는 이소플루란 흡기 농도 및/또는 프로포폴 가변 속도 주입을 조정함으로써 마취 심도를 변경하였다.

또한, 움직임 인공산물(movement artifact)을 줄이고 인공 호흡을 용이하게 하기 위해, 로쿠로늄을 2시간마다 또는 근육 이완 정도의 임상 평가에서 시술 기간 전반에 걸쳐 후자가 불충분한 것으로 나타났을 때 0.5mcg/kg의 용량으로 간헐적으로 투여하였다.

연구 기간의 완료시, 즉 모든 계획된 데이터 취득이 종료되었을 때, 동물을 마취하에 150mg/kg의 펜토바르비탈의 정맥내 투여에 의해 안락사시켰다. 부착된 모니터링 장비와 경흉부 청진을 통해 사망을 확인하였다.

수술 모델

마취된 양을 맞춤형 고정 장치에 머리를 단단히 고정한 상태로 진공 매트리스에 엎드린 자세로 배치하였다. 피부의 클리핑 및 소독 후, 수술 부위에 멸균 드레이핑을 배치하였다. 신경 외과용 볼트 키트(Raumedic, Helmbrechts, Germany)를 사용하여 신경 모니터링 프로브(Luciole Medical AG, Zurich, Switzerland)를 우측 정면 정중옆 두개 천공을 통해 삽입하였다. 외부 뇌실 드레인(EVD)(DePuys Synthes, Oberdorf, Switzerland)을 11mm 두개 천공을 통해 좌측뇌실의 전두각에 삽입하였다. CSF 방출 및 표준 20G 척추 바늘(Dalhausen, Koln, Germany)을 사용한 샘플링을 위한 후두하 수조 천자는 형광투시 안내하에 수행하였다. CSF 샘플을 즉시 1500G에서 15분 동안 원심분리하였다. Hb 농도 측정 및 혈관 기능 실험을 위해 상청액을 수집하였다. 제어된 뇌실 주사를 위해, PHD Ultra 주사기 펌프(Harvard Apparatus, Holliston, USA)를 EVD에 연결하였다. 뇌실 주사는 30ml/h의 최대 유속으로 수행하였다. 실험 설정의 설명을 위해 (도 2 참조).

모니터링

두개내압(ICP), 뇌 온도, 심박수, 혈압, 산소 포화도 및 호흡-종기 CO₂의 지속적인 모니터링을 모든 동물에서 수행하였다. 또한, 전체 실험 과정 동안 30분마다 동맥 혈액 가스 분석을 분석하고 소변 배출량을 모니터링하였다.

디지털 감산 혈관조영술( DSA )

혈관조영상은 Allura Clarity 혈관조영술 제품군(Philips, Hamburg, Germany)에서 수행하였다. 우측 상악과 경막외 소동정맥 그물 사이의 가장 큰 문합을 우측 경동맥의 동맥 포트를 통해 혈관조영용 마이크로카테터로 선택적으로 카테터 삽입하였다. 이중평면 사측방 및 배복측 투영이 동시에 획득되었다. 11ml 이오버솔 300mg 요오도/ml의 조영제 농축괴(Optiray 300, Guebert AG, Zurich, Switzerland)를 고압 조영제 주입기(Accutron MR, Medtron AG, Saarbrucken, Germany)가 있는 마이크로카테터를 통해 2ml/s로 주입하였다.

DSA로부터의 혈관 직경의 정량

ImageJ를 사용하여 혈관조영술 이미지를 처리하고 ImageJ용 플러그인으로 혈관 직경을 측정하였다¹³. 각 양에 대해, aCSF-전, 처리-전 및 처리-후(Hb 또는 HbHp 주입 후 60분) 시점의 혈관조영상을 비교하였다. 언급된 시점에서의 단일 DSA의 이미지 시퀀스 내에서, 측면 투영은 상시상 정맥동으로 유입되는 피질 정맥의 대조 묘사에 의해 정맥 단계의 시작을 정의하는 역할을 하였다("정맥 T 사인"). 각 시점에 대해 동맥 단계의 마지막 3개 이미지의 스택을 강도 평균화하였다. 모든 혈관 측정은 강도 평균화된 동맥 단계의 aCSF-전, 처리-전 및 처리-후 혈관조영상을 조합한 스택의 배복측 투영에서 수행하였다(도 3). 측정은 대뇌동맥륜의 다음 4개 혈관에서 수행되었다: 전뇌 동맥(ACA), 중뇌 동맥(MCA), 내경동맥(ICA)의 수조 부분 및 뇌저 동맥(BA). 각 혈관에 대해, aCSF-전 이미지에서 가장 근위의 중첩되지 않은 세그먼트를 선택하였다. 해부학적으로 직선 코스를 가진 혈관(ACA, ICA 및 BA)에서 5개의 관심 선형 영역(ROI)을 0.5mm 간격으로 자동 생성하였다. 곡선 MCA에서는 ROI의 비-수직 정렬에서 움직임 인공산물로 측정 오차의 위험이 있기 때문에, 3개의 ROI를 수동으로 정의하였다. 각 선형 ROI에 대해 혈관 직경을 ImageJ 플러그인을 사용하여 결정하였다¹³. ROI당 5개의 측정값을 평균화하고 직경 변화의 평균 값을 계산하였다. 혈관별 평균 직경 변화를 각 양에 대한 aCSF-전, 처리-전 및 처리-후 혈관조영술 간에 비교하였으며 만-휘트니-U 및 크러스컬-월리스 검정을 사용하여 처리 양식(Hb 대 Hb:Hp)에 관련하여 설정하였다.

자기 공명 이미징 (MRI)

생체내 자기 공명 이미징은 임상 3 Tesla MRI 장치(Philips ingenia, Amsterdam, Netherlands)에서 수행하였다. 카테터 배치의 해부학적 배향 및 수술후 제어를 위해 축면 및 시상 T2-강조 영상을 획득하였다. 동적 3D T1-강조 이미징은 MnHb 주입 시간을 포함하는 10분 이상의 높은 시간 해상도로 수행하였다. 동적 3D T1-강조 이미징은 높은 공간 해상도로 10분 간격으로 다음 80분 동안 계속하였다. DICOM 데이터는 이미지 재구성 및 분석을 위해 HOROS 소프트웨어(Nimble Co LLC d/b/a Purview, Annapolis, MD USA)를 사용하여 처리하였다.

헤모글로빈

정제된 옥시헤모글로빈(oxyHb, Fe² ⁺)은 이전에 기술된 바와 같이 접선 유동 여과(TFF)를 통해 오래된 혈액(outdated blood)으로부터 생성되었다. Hb 농도는 항상 원고 전체에 걸쳐 헴-당량(heme-equivalent)으로 표현된다.

조직학적 시각화를 위한 단백질 표지화

조직학적 분석을 위해, 정제된 단백질 용액(Hb, Hp)을 TCO-NHS-에스테르(Jena Bioscience, Jena, Germany)로 표지하였다. TCO-NHS-에스테르를 정제된 단백질 용액(100mM NaHCO₃ 완충액 중 20mg/mL)에 적가하였다. 실온에서 1시간 동안 배양 후, 10% 1M Tris-HCl 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 4000g에서 30분 동안 원심분리하여 변성된 단백질을 제거하였다. 후속적으로 과량의 시약을 일회용 탈염 컬럼(PD-10 Desalting Columns, GE Healthcare, Chicago, IL)을 사용하여 제거하였다. 필요한 경우, 표지된 단백질 용액을 한외여과 장치(Amicon Ultra 15, 10 kDa NMWL, Merck Millipore, Billerica, MA)로 농축하였다. 처리 후, 모든 단백질 용액을 0.22μm 기공 크기를 갖는 폴리에테르설폰 막(Steriflip 필터, Merck Millipore, Burlington, MA)을 통해 멸균 여과하고, 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.

인공 CSF ( aCSF )

aCSF의 최종 조성은 127mM NaCl, 1.0mM KCl, 1.2mM KH₂PO₄, 26mM NaHCO₃, 1.3mM MgCl₂*6H₂O, 2.4mM CaCl₂*2H₂O 및 6.7mM 글루코스였다.

합토글로빈 및 헤모글로빈- 합토글로빈 복합체

인간 혈장으로부터 정제된 합토글로빈(우세한 표현형 2-2)은 CSL Behring AG(Bern, Switzerland)로부터 입수하였다. 표현형 1-1을 갖는 인간 혈장으로부터의 합토글로빈 또한 CSL Behring AG(Bern, Switzerland)로부터 입수하였다. 우세한 표현형 2-2를 갖는 인간 혈장으로부터의 합토글로빈은 제WO 2014/055552 A1호에 이전에 기술된 바와 같이 정제하였다. Hp의 Hb 결합 능력은 HPLC로 정량하였다. 복합체 형성 후 복합체의 순도 및 유리 Hb의 부재를 HPLC를 사용하여 확인하였다.

재조합 합토글로빈 1-1을 제공하기 위한 관류 세포 배양

세포 배양 과정은 바이알 해동, 세포 확장, 관류 반응기의 접종, 반응기에서의 세포 확장 단계에 이은 생산 단계로 구성된다.

세포 배양 상청액은 세포 분리기를 통한 관류 수확물으로서 생산 단계 동안 반응기로부터 연속적으로 배출되고 새로운 배지로 교체된다. 관류 수확물은 반응기 실행 동안 수집된다. 각 관류 수확물은 추가의 중류 처리를 거친다.

HIS 태그를 포함하는 인간 야생형 합토글로빈 표현형 1을 발현하는 CHO 세포 클론을 해동하고 T80 플라스크(37℃, 5% CO2)로 시작하여 3개의 2L 진탕 플라스크로 배양을 연장하는 시드 트레인에서 배양하였다. (파라미터: 37℃, 120rpm, 80% 습도, 5% CO2). 50L BioSep 장치가 장착된 Sartorius DCU 시스템의 20L 유리 용기에 3L 시드트레인을 접종하였다. 3일까지 배치 배양을 수행하고, 그후 VVD(Vessel Volume exchanges per day) 1.0으로 관류를 시작하였다. 이틀마다 ca. 40L의 수확물이 생성되었으며 세포 분해 잔류물을 수확 라인 내에서 Pall® Kleenpak™ Nova NP7 필터 캡슐 0.2μm에 의해 분리하였다. 발효 동안의 세포 농도(ca. 40 x 10⁵개 세포/mL)를 2mM의 최소 글루타민 농도를 유지하도록 조정하였다. (발효 파라미터: 37℃, pH 7.0, 30% pO2, 150rpm, VVD 1.0) 전체 과정 동안 사용된 배지는 변형된 ProCHO5 w/ 8mM L-Gln, 0.25% Pluro(Fa. Lonza)였다. 총 22개의 수확물(ca. 900L)이 생성되었다.

rHaptoglobin1 -1-His( rHp1 - 1)의 정제

무세포 수확물은 30kDa 차단막이 있는 TFF 시스템(Pall Centramate 500 S, Pall Corporation, New York, USA)을 사용하여 30배 농축시켰다. rHaptoglobin 1-1-HIS의 농축물을 20mM 인산나트륨 + 500mmol/L NaCl, pH 7.4로 미리 평형화된 NiSepharose excel 컬럼(GE Healthcare 17-3712-02)에 밤새 부하하였다. 평형 완충액으로 컬럼을 세척한 후, rHaptoglobin1-1-His를 용출 완충액(20mM 인산나트륨 + 500mmol/L NaCl + 150mmol/L 이미다졸, pH 7.4)으로 용출시켰다. 용출액은 30kDa 차단막이 있는 TFF 시스템(Pall)을 사용하여 10배 농축시켰다. 원하지 않는 불순물로부터 rHaptoglobin1-1-His를 분리하기 위해, 물질을 PBS pH 7.4로 미리 평형화된 Superdex 200pg 컬럼(GE Healthcare, Munich, Germany)에 부하하고 rHaptoglobin1-1-His를 함유하는 피크 분획을 혼주하고 UF-PES-20 막(Fa. Hoechst #FP08085)이 있는 교반된 한외여과 셀(모델 402)을 사용하여 대략 40mg/mL rHaptoglobin 1-1-HIS의 최종 농도로 다시 농축시켰다.

Hn - Hb 및 Mn- Hb:Hp 복합체

Mn(III) 프로토포르피린 IX 클로라이드(MnPP)를 알칼리 조건(NaOH 100mM)하에서 4량체 아포헤모글로빈 또는 아포헤모글로빈:합토글로빈 복합체의 빈 "헴-포켓"에 삽입하였다. 그후, 완충액을 염수로 교체하였다. 화합물을 즉시 4℃에서 저장하거나 추가 처리될 때까지 -20℃에서 부동액(1:1:1:1 비율의 프로필렌 글리콜, 글리세린, PBS 0.1M 및 ddH₂O)에 저장하였다.

C. 조직학적 염색 및 이미징

양의 안락사 후, CSF 공간을 뇌를 수확하기 전에 30mL/h의 주입 속도로 EVD를 통해 10mL PFA 4%로 수세하였다. 전체 뇌를 1cm 두께의 관상 슬라이스로 절단하고 4℃에서 밤새 4% PFA에 고정하였다. 그후, 슬라이스를 추가 처리에 적합한 크기로 절편하고 PBS 중 4% 아가로스에 매봉하고 바이브라톰(Leica VT1000 S Vibrating blade microtome, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)을 사용하여 120μm 부동 절편으로 절단하였다. 절편을 처리하였다. 첫 번째 단계에서 부동 절편을 실온에서 4시간 동안 투과 완충액(PBS 중 0.5% Triton-X-100을 갖는 2% BSA)에서 사전처리한 다음 40nM 테트라진-Cy5(Jena Bioscience, Jena, Germany) 및 α-평활근 액틴(1:10'000, 클론 1A4, Sigma)에 대한 FITC-결합 단클론 항체를 함유하는 2mL 차단 완충액(PBS 중 2% BSA)에서 4℃에서 밤새 배양하였다. 그후 핵을 실온에서 40분 동안 Hoechst 33342(1:2'000 희석, Invitrogen, Carlsbad, CA)로 염색하였다. PBS로 15분 동안 3회 세척한 후 절편에 FluoroSafe(Merck Millipore, Burlington, MA)로 장착하였다.

조직학적 절편의 전체 슬라이드 스캔은 Colibri.2, ApoTome.2 시스템 및 전동 스테이지(Carl Zeiss AG, Feldbach, Switzerland)에 결합된 Zeiss Observer.Z1 현미경으로 수득된 10x 배율의 단일 이미지를 함께 연결하여 생성하였다. Leica SP8 공초점 현미경(Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland)을 사용하여 63x 배율의 이미지를 수득하였다.

D. HPLC 측정

정성적 및 정량적 크기-배제 크로마토그래피(HPLC)의 경우 Hb 및 또는 Hp를 함유하는 샘플을 BioSep-SEC-s3000(75×7.8mm) Guard 컬럼(Phenomenex, Torrance, CA)과 결합되고 LKB 2150 HPLC 펌프(LKB-Produkter AB, Bromma, Sweden) 및 Jasco UV-970 Intelligent UV/VIS 검출기(JASCO International Co., Ltd., Tokyo, Japan)에 부착된 분석용 BioSep-SEC-s3000(600×7.8mm) LC 컬럼에서 분리하였다. 인산칼륨 20mM pH 6.8을 이동상으로 사용하였다. 흡수는 414 nm에서 측정하였으며 Lab Chart 소프트웨어 버전 7.2.1(AD Instruments, Hastings, UK)을 사용하여 기록하였다. R 통계 소프트웨어 버전 4.2.3(www.r-project.org)을 사용하여 HPLC 곡선을 분석하고 시각화하였다.

결과

A. 합토글로빈은 생체외 Hb 노출된 돼지 뇌저 동맥에서 NO- 매개된 혈관확장을 회복시킨다

10μM의 농도로 크렙스-헨셀라이트 완충액에 첨가된 무세포 Hb는 와이어 근운동 기록 실험에서 NO-유도된 혈관확장을 완전히 둔화시켰다(도 4a). 등몰 Hp의 첨가는 20분의 배양 기간 후에 NO-반응을 크게 회복시켰다(도 4b). Hp는 또한 용혈이 일어나기 전 출혈 후 2일에 동일한 환자로부터 샘플링된 CSF에서 관찰된 정도로 외인성 NO에 대한 혈관확장 반응을 회복시켰다(도 6). 혈관 기능 실험에서, 혈장-유래 Hp 2-2 및 재조합체(도 18) 또는 혈장 유래 Hp 1-1(도 19) 사이의 NO-반응 회복에 있어서 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

B. 무세포 Hb는 aSAH 환자의 뇌척수액에서 동맥 산화질소-신호전달의 주요 교란인자이다

DIND의 초기 임상 특징은 대뇌 동맥에서의 혈관경련의 발생이다. 무세포 oxyHb(Fe²⁺O₂)/deoxyHb(Fe²⁺)와 혈관확장제 산화질소(NO)의 반응은 혈관수축력 쪽으로 균형을 이동시킬 수 있다. 이러한 탈조절의 메커니즘을 조사하기 위해, 인간 CSF 샘플에 침지된 돼지 뇌저 동맥의 NO-매개된 혈관확장 반응을 생체외에서 정량하였다. 높은 무세포 Hb를 함유하는 DIND 환자로부터의 CSF에서, 단수명 NO-기증자(MAHMA-NONOate)의 투여에 대한 예상되는 확장 반응이 억제되었다(도 5). 그러나, Hp-친화성 컬럼을 사용하여 CSF로부터 무세포 Hb를 선택적으로 제거하는 경우, 생리학적 혈관확장 반응이 회복되었다. Hb 제거 전 및 후의 환자 CSF의 LC-MSMS 분석은 용혈성 CSF 중의 대부분의 단백질 조성이 변하지 않은 채로 남아 있음을 입증하였다. 이 실험은 무세포 Hb를 aSAH 환자의 뇌척수액에서 동맥 NO-신호전달의 주요 교란인자로서 확인하였다.

C. 측뇌실에 주사된 Hb 및 Hb:Hp는 생체내에서 지주막하 공간으로 빠르게 분포한다

동적 3D MRI에서, 측뇌실에 주사된 MnHb 및 MnHb:Hp 복합체는 제3뇌실, 수도관 및 제4뇌실을 통해 생리학적 내부 CSF 경로를 따라 빠르게 분포하는 것으로 나타났다(n=5)(도 7). 수 분 내에, 모든 동물에서 후두와(posterior fossa)의 큰 대뇌 동맥을 침지하는 뇌저 수조에서 MnHb의 높은 신호를 검출할 수 있다(도 8). 주사 후 20분 이내에 대뇌동맥륜을 중대뇌 및 전대뇌와로의 추가 분포가 관찰되었다. 예상대로, CSF 구획에서 Hb 및 Hb:Hp 복합체의 분포 사이에는 차이를 검출할 수 없었다.

D. 합토글로빈은 CSF 구획에서 Hb를 구획화하고 뇌혈관 벽 및 뇌 실질로의 침투를 감소시킨다

조직학적 분석은 뇌실계의 뇌실막 장벽을 통해 CSF로부터 뇌 간질 공간으로의 TCO-표지된 헤모글로빈의 침투를 보여준 반면 Hp의 동시-주입은 이러한 전파를 극적으로 감소시켰다(도 8). 또한, Hb의 강한 간질 침투는 또한 뇌 표면의 아교 경계막(glia limitans)을 통해 지주막하 공간으로부터 볼 수 있었다(도 9a). 이와 달리, Hb:Hp 복합체는 주로 관통하는 피질 혈관의 CSF-채워진 혈관주위 공간(Virchow-Robin 공간)으로 제한되었다(도 9b).

전신 순환에서 크기-제한된 장벽은 큰 Hb-Hp 복합체가 신장, 심근 또는 내성 동맥의 혈관벽과 같은 취약한 조직으로 비편재화되는 것을 방지한다. Hp 보호의 이러한 일반적인 개념을 뇌로 번역하기 위해, TCO-Hb 또는 TCO-Hb-Hp 복합체를 양의 CSF에 주입하였다. 트랜스-사이클로옥텐(TCO)-태그된 혈단백은 테트라진-접합된 형광색소와 클릭-화학 반응 후 매우 높은 신호-대-잡음 비에서 형광 현미경으로 포르말린-고정된 조직 절편에서 시각화되었다. 전뇌와 중뇌의 두 가지 상이한 위치에서 양 뇌 절편의 형광 스캔은, 2시간 이내에 무세포 Hb가 내부 및 외부 CSF 공간으로부터 뇌 실질로 비편재화되어 내부 및 외부 CSF-뇌 계면을 따라 형광 신호의 테두리로 나타남을 입증한다. 이러한 비편재화 패턴은 TCO-Hb-Hp 복합체가 주입된 양의 표본에서는 부재하였다.

도 8 및 9의 Hb-Hp 복합체 분포의 예시를 위해, EVD 카테터의 팁이 약간 뇌 실질 쪽으로 배치된 전뇌의 절편을 선택하였다. 이 위치에서, 소량의 TCO-Hb-Hp를 뇌 조직에 직접 주사하여 염색 및 이미징 절차에 대한 양성 대조군으로서 역할을 하였다. 이 외에도, 유일하게 뚜렷한 Hb-Hp 신호는 연막 표면으로부터 뇌로 관통하는 작은 동맥과 함께 인식될 수 있다. 양을 희생하기 전에 SEC 및 SDS-페이지 분석을 위해 지주막하 공간으로부터 CSF를 수집하였다. 뇌 절편에 Hb-Hp 신호가 없음에도 불구하고, Cy5-테트라진과의 TCO-반응 후 강하게 형광성을 나타내는 유형 2-2 Hp 중합체의 사다리로 구성된 CSF에서 큰 Hb-Hp 복합체가 확인되었다. 종합적으로, 이러한 데이터는 Hb-Hp 복합체가 CSF 공간에서 구획화된 상태로 남아 있음을 뒷받침한다. 혈관 구조의 공초점 현미경 검사를 위해, TCO-Hb 또는 TCO-Hb-Hp가 주입된 동물로부터의 양 뇌 절편을 혈관 평활근 세포(αSMA) 및 아쿠아포린-4(AQP4) 양성 성상세포 엔드-피트에 대해 염색하였다.

도 10은 TCO-표지된 Hb 또는 Hb-Hp 복합체가 각각 주입된 양 중뇌의 뇌실주위 영역에서 상이한 구경의 여러 작은 동맥의 공초점 이미지를 보여준다. 이미지는 Hb-Hp 복합체가 관통 동맥의 CSF-채워진 혈관주위 공간(Virchow-Robin 공간) 내에서 고농도로 구획화된 상태로 남아 있음을 확인시켜 준다. 이 공간은 한쪽에는 동맥의 가장 바깥쪽 층(즉, 외막)에 의해 그리고 다른 쪽에는 성상세포 엔드-피트(즉, 아교 경계막)에 의해 묘사된다. Hp의 부재하에서 무세포 Hb는 성상세포 장벽을 가로질러 뇌 조직으로 및 추가적으로 혈관 평활근 층으로 비편재화되어 내피하 공간에 도달한다. 이러한 관찰은 무세포 Hb가 아닌 큰 Hb-Hp 복합체가 대뇌 동맥에서 혈관확장성 NO 신호전달을 방해하여 혈관경련을 유도하는 이유를 설명할 수 있다.

E. 지주막하 공간의 무세포 Hb는 생체내에서 급성 혈관경련을 유도하며, 이것은 합토글로빈의 공동-주입에 의해 예방될 수 있다

지주막하 공간의 무세포 Hb는 동물의 100%(4/4)에서 급성 혈관조영 혈관경련을 유도하였다. 혈관경련은 Hb의 뇌실 주사 60분 후 후방 및 전방 두개와의 동맥(뇌저 동맥, 소뇌 동맥, 전뇌 동맥)에 재현 가능하게 국소화되었다(도 11a 및 12b). 그러나, 혈관경련은 또한 내측 두개와(내측 대뇌 동맥, 내경동맥)에서 더 높은 개체간 변화로 검출될 수 있다(도 12). Hp의 공동-주입은 분절 동맥 혈관경련의 유도를 완전히 방지하였다(도 11b). Hb:Hp 공동-주입을 받은 한 동물은 Hb-주입된 동물에서 보여지는 혈관경련의 분절 패턴 없이 모든 분석된 혈관 영역에서 더 작은 혈관 직경을 보였다(데이터는 표시되지 않음). 혈관 경련의 시각적 인상을 객관화하기 위해 사전 정의된 4개의 대뇌 동맥 영역의 DSA 이미지에서 혈관 직경의 반자동 정량화를 수행하였다. Hb:Hp 주입 동물과 비교하여 Hb 주입 동물에서 뇌저 동맥(BA)의 현저한 협착이 전뇌 동맥(ACA) 및 중뇌 동맥(MCA)에서 관찰되었을 뿐만 아니라 수조 내경동맥(ICA)의 현저한 협착이 관찰되었다(도 13a). Hb-유도된 혈관 수축은 모든 동맥 분절의 통합 분석에서 훨씬 더 분명해졌다(도 13b). Hb-Hp 주입 후 또는 등용적의 인공 CSF의 주입 후에도 동맥 직경의 유의한 변화는 관찰되지 않았으며, 이것은 각 실험의 초기 단계 동안 일반적인 통제 절차로서 수행되었다(도 13c).

F. 생체내 Hb 주입 후 Hp의 순차적 투여는 CSF에서 Hb의 완전한 복합체화를 야기한다

순차적으로 주사된 Hp는 생체내 지주막하 공간에 분산된 유리 Hb와 빠르고 완전하게 결합한다. 뇌실계에 Hp를 투여한지 이미 10분 후, 후두하에서 수집된 CSF 샘플에서 복합체화되지 않은 Hb는 검출되지 않았다(도 14).

생체내 혈관조영 혈관경련의 시점에 수집된 양 CSF의 혈관수축 효과는 생체외 혈관 기능 실험에서 Hp에 의해 중화될 수 있다.

G. 생체내 혈관조영 혈관경련의 시점에 수집된 양 CSF의 혈관수축 효과는 생체외 혈관 기능 실험에서 Hp에 의해 중화될 수 있다

Hb 주사 전에 수집된 양 CSF에 노출된 단리된 뇌저 동맥은 aCSF에서 NO 유사 혈관에 대해 유사한 확장 반응을 보였다. 혈관조영 혈관경련의 시점에 수집된 출혈성 CSF에 노출된 후 NO 반응은 크게 감소하였다. (CSF 샘플에서 개별 Hb 농도로 조정된) 등몰 Hp의 첨가에 의한 생체외 치료는 NO 반응성을 광범위하게 회복시킨다. Hb:Hp 복합체 주입 후 60분에 수집된 CSF에의 노출은 NO-유도된 혈관확장을 손상시키지 않았다(도 15).

H. 무세포 Hb는 aSAH 환자의 뇌척수액에서 동맥 산화질소-신호전달의 주요 교란인자이다

정량적 LC-MSMS 단백질체 분석은 출혈 후 2일 내지 13일 사이에 외부 뇌실 드레인(EVD) 카테터로부터 수집된 aSAH 환자로부터의 순차적 CSF 샘플에 대해 수행하였다. 로그-변환된 정규화 이온 강도 비율(x일자/2일자)의 k-평균 군집화 분석에 의해 적어도 두 개의 독특한 펩티드로 식별된 모든 단백질을 분류하였다(도 16). 카테고리 3은 시간이 지나도 변하지 않는 단백질을 함유하였다. 카테고리 2는 시간이 지남에 따라 증가하는 단백질을 포함하였다. 카테고리 2는 거의 독점적으로 적혈구(RBC) 성분, 즉 Hb 및 RBC 효소로 구성되었으며, aSAH 후 지주막하 공간에서 발생하는 지연된 용혈 과정을 예시한다. 카테고리 2 내에서, Hp는 초기 샘플에 풍부했지만 시간이 지남에 따라 고갈되어 압도적인 분율의 무세포 Hb를 남겼다. 카테고리 1은 시간이 지남에 따라 감소하고 주로 혈장 단백질로 구성된 단백질을 나타낸다.

I. 제4 뇌실 맥락 조직 에 있는 세동맥의 조직형태학적 분석

본 연구에서 관찰된 작은 실질 혈관(직경 범위 50-100μm)의 혈관주위 Hb 노출을 큰 대뇌 동맥에 대한 기능 판독값과 연결하기 위해, 조직형태계측학적 분석을 수행하였다. 이를 위해, 평활근 세포에 대한 제4 뇌실을 통해 120μm 양 뇌 절편을 염색하였다(도 17a). 맥락 조직의 작은 알파-평활근 액틴(αSMA)-양성 혈관의 공초점 이미지는 치료에 대해 맹검된 연구원에 의해 획득되었다(그룹당 n=3마리, Hb-처리된 양의 총 25개 이미지, Hb-합토글로빈-처리된 양의 경우 32개 이미지). 뇌실주위 영역은 뇌실내 주입된 고정액에 매우 빠르게 노출되기 때문에 최상의 구조적 보존을 보장하기 위해 이 분석을 위해 선택되었다. 각 용기에 대해, αSMA 포지티브 구조의 내부 및 외부 둘레에 기반하여 내강 및 총 단면적을 정량하였으며, 이것은 3명의 맹검 연구원에 의해 수동으로 결정되었다(도 17b). 수축된 외관을 가진 혈관은 모든 Hb 주입 동물에서 풍부했지만, Hb-합토글로빈 주입 동물에서는 아무것도 발견되지 않았다(도 17c). 도 17d 및 17e는 모든 분석된 혈관의 내강 분율 영역의 정량적 분석 뿐만 아니라 양 1마리당 평균을 보여준다. 두 가지 분석 방식 모두에서, Hb-합토글로빈 처리 동물과 비교하여 Hb의 더 작은 내강 면적으로 차이는 통계적으로 유의하였다.

요약 및 결론

aSAH 환자에서, 지연성 허혈성 신경학적 결손(DIND)은 주로 출혈 후 4일 내지 14일 사이에 발생한다. 이러한 시간적 프로파일은 4일 내지 14일 사이에 CSF oxyHb 피크와 함께 용해하는 적혈구로부터 지주막하 구획으로의 oxyHb의 방출과 상관관계가 있다. 소규모 관찰 임상 연구에서, DIND가 발생한 aSAH 환자와 DIND가 발생하지 않은 aSAH 환자의 누적 CSF oxyHb 수준 간에 상당한 차이가 관찰되었다. 이차적인 신경학적 악화는 불리한 결과의 주요 기여인자이며 DIND의 예방이 aSAH 환자 치료의 판도를 바꿀 것이다.

이 연구에서, 대뇌 동맥에 대한 무세포 Hb를 통한 NO-소거의 효과 및 이러한 독성을 예방하거나 달리 감소시키는 합토글로빈의 잠재력을 조사하기 위해 생체외 및 생체내 모델을 설정하였다. 무세포 oxyHb를 통한 벽내 NO-고갈 및 연속적인 혈관수축의 개념은 생체외 단리된 돼지 뇌저 동맥에서 확인되었다. Hb-노출된 동맥을 합토글로빈으로 처리하면 NO-유도된 혈관확장이 완전히 회복되었다. 또한, aSAH 환자로부터 수집된 출혈성 CSF의 NO-의존성 혈관활성 효과가 동일 모델에서 입증되었다. 출혈성 CSF 중의 수많은 알려진 혈관활성 분자에도 불구하고, 합토글로빈 처리에 의한 oxyHb의 소거는 단리된 대뇌 동맥에서 NO에 대한 혈관확장 반응을 생리학적 수준으로 회복시켰다. 혈관확장성 NO-반응을 회복시키는 효율에 있어서의 차이는 Hp 2-2와 Hp 1-1(재조합 또는 혈장 유래) 간에 관찰되지 않았다.

생체내에서 관찰된 효과를 확인하기 위해, 고도로 번역된 대형 동물 모델을 확립하였다. 양의 CSF 구획에 무세포 oxyHb를 주사하여 모든 동물에서 재현 가능하게 혈관조영 혈관경련을 유도하였다. 예방적 관점에서 더 중요한 것은 oxyHb와 합토글로빈의 복합체화가 생체내에서 이러한 혈관반응성을 없앤다는 것이다. 게다가, NO-유도된 혈관확장을 회복시키기 위한 치료학적 합토글로빈 투여의 개념은 혈관조영 혈관경련이 있는 동물로부터 수집된 출혈성 CSF에 노출된 동맥에서 생체외에서 나타났다. 이러한 결과는 뇌 혈관경련 및 DIND를 포함하는 2차 신경학적 이상 반응의 발생을 줄이기 위한 뇌혈관 NO-신호전달과 CSF의 무세포 oxyHb의 방해를 방지하기 위한 aSAH 환자에서의 치료학적 합토글로빈 투여에 대한 근거를 강력하게 뒷받침한다.

CSF 구획에 주사된 무세포 oxyHb의 분포를 연구하기 위해, 생체내 및 생체외 이미징을 위한 몇 가지 새로운 표지화 방법이 개발되었다. 동적 MRI를 사용하여, 뇌실계에 주사한 후 지주막하 공간에서 Hb 및 Hb:Hp 복합체의 빠르고 육안으로 동일한 분산이 확인되었다. 조직학적 분석에서는 Hb가 CSF로부터 뇌의 간질 공간으로 광범위하게 침투하는 것으로 밝혀진 반면 Hb:Hp 복합체는 주로 지주막하 공간에 국한되었다. 이러한 예상치 못한 발견은 합토글로빈과의 복합체화를 통한 CSF 공간에서의 무세포 Hb의 구획화가 뇌 혈관계 및 뇌 실질에 대한 무세포 Hb의 독성 효과 예방에 적어도 부분적으로 기여하여 aSAH 환자의 CSF 구획에서 충분한 Hb-소거 능력에 도달하기 위한 치료적 접근법으로서 합토글로빈의 척추강내 투여를 강조한다는 것을 강력하게 시사한다.

모든 유형의 자발성 또는 외상성 두개내 출혈은 혈관외 용혈 및 CSF 및/또는 뇌 간질 공간으로의 무세포 Hb의 방출을 동반한다는 것을 주지할 때, 합토글로빈 치료의 치료학적 가능성은 aSAH 환자에 제한되지 않을 수 있다. 따라서, 무세포 두개내 헤모글로빈을 소거하기 위한 성공적인 치료적 접근법은 신경과 환자의 큰 집단에 막대한 잠재적 영향을 미친다.

참조문헌

Claims

혈관외 용혈 및 무세포 헤모글로빈(Hb)의 뇌척수액(CSF)으로의 방출을 수반하는 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응 (adverse secondary neurological outcome)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 CSF를, 합토글로빈(Hp)이 무세포 헤모글로빈(Hb)과 복합체를 형성해 상기 무세포 Hb를 중화시키기에 충분한 시간 동안, 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 출혈성 뇌졸중이 자발성 출혈 또는 외상성 출혈인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 출혈성 뇌졸중이 뇌실내 출혈 또는 지주막하 출혈인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 지주막하 출혈이 동맥류성 지주막하 출혈인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 신경학적 이상 반응이 지연성 허혈성 신경학적 결손(DIND), 지연성 뇌허혈(DCI), 신경독성, 염증, 산화질소 고갈, 산화 조직 손상, 뇌혈관경련, 뇌혈관 반응성 및 부종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 2차 신경학적 이상 반응이 뇌혈관경련인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 2차 신경학적 이상 반응이 지연성 허혈성 신경학적 결손인, 방법.
제5항에 있어서, 상기 2차 신경학적 이상 반응이 지연성 뇌허혈인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 신경학적 이상 반응이 뇌 실질 내의 2차 신경학적 이상 반응인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈의 개시 후 약 21일 이내에 CSF를 Hp 또는 이의 기능적 유사체에 노출시킴을 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 출혈의 개시 후 약 2일 내지 약 4일에 CSF를 Hp에 노출시킴을 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 출혈의 개시 후 약 5일 내지 약 14일에 CSF를 Hp에 노출시킴을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 Hp를 두개내 투여함을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 Hp를 척추강내 투여함을 포함하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 Hp가 척추관으로 척추강내 투여되는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 Hp가 지주막하 공간으로 척추강내 투여되는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 치료학적 유효량의 Hp를 뇌실내 투여함을 포함하는, 방법.
제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간이 적어도 약 2분인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간이 약 2분 내지 약 45분인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간이 약 2분 내지 약 20분인, 방법.
제18항에 있어서, 상기 CSF가 치료학적 유효량의 Hp에 노출되는 시간이 약 4분 내지 약 10분인, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적 유효량의 Hp가 출혈 후 대상체의 CSF에서의 무세포 Hb 농도와 적어도 등몰량인, 방법.
제22항에 있어서, (i) 출혈 후 CSF를 Hp에 노출시키기 전에 대상체로부터 CSF 샘플을 수득하는 단계; (ii) 단계 (i)에서 수득된 CSF 샘플에서 무세포 Hb의 양을 측정하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)의 무세포 Hb 농도에 기초하여 적어도 등몰량의 Hp를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Hp의 치료학적 유효량이 약 2μM 내지 약 20mM인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 Hp의 치료학적 유효량이 약 2μM 내지 약 300μM인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 Hp의 치료학적 유효량이 약 5μM 내지 약 50μM인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 Hp의 치료학적 유효량이 약 10μM 내지 약 30μM인, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CSF에서 형성된 Hp:무세포 Hb 복합체를 제거함을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 체외에서 상기 CSF를 치료학적 유효량의 Hp에 노출시킴을 포함하는, 방법.
제29항에 있어서,
(i) 출혈 후 대상체의 CSF 구획으로부터 CSF의 샘플을 수득하는 단계;
(ii) 단계 (i)의 CSF 샘플에 Hp를 첨가하여 Hp가 풍부한 CSF 샘플을 수득하는 단계;
(iii) Hp가 풍부한 CSF 샘플을 대상체에게 투여하여, Hp가 대상체의 CSF 구획 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계; 및
(iv) 임의로, 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계를 포함하는, 방법.
제29항에 있어서,
(i) 출혈 후 대상체의 CSF 구획으로부터 일정 용적의 CSF를 제거하는 단계;
(ii) Hp를 포함하는 인공 CSF를 제공하는 단계;
(iii) 단계 (ii)의 인공 CSF를 대상체에게 투여하여, Hp가 대상체의 CSF 구획 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하기에 충분한 시간 동안 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp에 노출시키는 단계; 및
(iv) 임의로, 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하는 단계를 포함하는, 방법.
제29항에 있어서,
(i) 출혈 후 대상체로부터 CSF를 수득하는 단계;
(ii) Hp 또는 이의 기능적 유사체가 CSF 내의 무세포 Hb와 복합체를 형성하도록 하는 조건하에서 단계 (i)의 CSF를 Hp에 노출시키는 단계;
(iii) 단계 (ii) 이후에 CSF로부터 Hp:무세포 Hb 복합체를 추출하여 단계 (i)의 CSF와 비교할 때 더 적은 양의 무세포 Hb를 갖는 Hb가 감소된 CSF를 수득하는 단계;
(iv) 임의로, 단계 (ii) 및 (iii)을 반복하여 무세포 Hb가 실질적으로 없는 Hb가 감소된 CSF를 수득하는 단계; 및
(v) 단계 (iii) 또는 단계 (iv)로부터 수득된 Hb가 감소된 CSF를 대상체의 CSF 구획에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제32항에 있어서, 단계 (vi) 전의 Hb가 감소된 CSF에 치료학적 유효량의 Hp를 첨가함을 추가로 포함하는, 방법.
제32항 또는 제33항에 있어서, 상기 Hp를 기질 상에 고정시키는, 방법.
제34항에 있어서, 상기 기질이 친화성 크로마토그래피 수지인, 방법.
제35항에 있어서, 단계 (ii)가, CSF 내의 무세포 Hb가 친화성 크로마토그래피 수지에 결합하도록 하는 조건하에서 상기 수지를 통해 단계 (i)의 CSF를 통과시킴을 포함하고; 단계 (iii)이 단계 (ii) 후에 상기 수지로부터 CSF를 용출시킴을 포함하며; 단계 (iv)가 용출된 CSF를 회수함을 포함하는, 방법.
제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 임의로, 단계 (i) 후에 CSF 구획을 세척 용액으로 세척함을 포함하는, 방법.
제37항에 있어서, 상기 세척 용액이 인공 CSF인, 방법.
제31항 또는 제38항에 있어서, 상기 인공 CSF가 NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂0, CaCl₂H₂O 및 글루코스를 포함하는, 방법.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 용액이 Hp를 포함하는, 방법.
제40항에 있어서, 상기 세척 용액이 약 2μM 내지 약 20mM Hp를 포함하는, 방법.
제41항에 있어서, 상기 세척 용액이 약 2μM 내지 약 300μM Hp를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 출혈 후 대상체로부터 CSF를 제거하는 단계;
(ii) 단계 (i) 후에 대상체의 CSF 구획을 치료학적 유효량의 Hp를 포함하는 세척 용액으로 세정하는 단계;
(iii) 임의로, 단계 (ii)를 반복하는 단계; 및
(iv) 단계 (ii) 또는 단계 (iii) 후에 대상체의 CSF 구획에 인공 CSF를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제43항에 있어서, 상기 인공 CSF가 NaCl, KCl, KH₂PO₄, NaHCO₃, MgCl₆H₂0, CaCl₂H₂O 및 글루코스를 포함하는, 방법.
제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 인공 CSF가 Hp를 포함하는, 방법.
제45항에 있어서, 상기 인공 CSF가 약 2μM 내지 약 20mM Hp를 포함하는, 방법.
제46항에 있어서, 상기 인공 CSF가 약 2μM 내지 약 300μM Hp를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Hp가 Hp1-1 동종이량체, Hp1-2 다량체, Hp2-2 다량체 및 상술한 것들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제48항에 있어서, 상기 Hp가 Hp2-2 다량체를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Hp가 재조합 단백질인, 방법.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Hp가 혈장 유래인, 방법.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌실내 출혈 후 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 제2 제제를 대상체에게 투여함을 추가로 포함하는, 방법.
제52항에 있어서, 상기 제2 제제가 혈관확장제인, 방법.
제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 제2 제제가 시드논 및 나트륨 니트로프루시드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
Hp를 포함하는 인공 뇌척수액(CSF).
제55항에 있어서, 상기 Hp가 약 2μM 내지 약 20mM의 양으로 존재하는, 인공 CSF.
제55항에 있어서, 상기 Hp가 약 5μM 내지 약 300μM의 양으로 존재하는, 인공 CSF.
제55항에 있어서, 상기 Hp가 약 5μM 내지 약 50μM의 양으로 존재하는, 인공 CSF.
제58항에 있어서, 상기 Hp가 약 10μM 내지 약 30μM의 양으로 존재하는, 인공 CSF.
제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Hp가 Hp1-1 동종이량체, Hp1-2 다량체, Hp2-2 다량체 및 상술한 것들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 인공 CSF.
제60항에 있어서, Hp2-2 다량체를 포함하는, 인공 CSF.
제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 Hp가 재조합 단백질인, 인공 CSF.
제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 Hp가 혈장 유래인, 인공 CSF.
치료학적 유효량의 Hp, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 따라 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
치료학적 유효량의 Hp, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 따라 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 Hp가 약 2μM 내지 약 20mM의 양으로 존재하는, 조성물.
제66항에 있어서, 상기 Hp가 약 2μM 내지 약 300μM의 양으로 존재하는, 조성물.
제66항에 있어서, 상기 Hp가 약 5μM 내지 약 50μM의 양으로 존재하는, 조성물.
제66항에 있어서, 상기 Hp가 약 10μM 내지 약 30μM의 양으로 존재하는, 조성물.
제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Hp가 Hp1-1 동종이량체, Hp1-2 다량체, Hp2-2 다량체 및 상술한 것들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
제70항에 있어서, Hp2-2 다량체를 포함하는, 조성물.
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 따라 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 치료학적 유효량의 합토글로빈(Hp)의 용도.
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항의 방법에 따라 출혈성 뇌졸중 후 대상체에서 2차 신경학적 이상 반응의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 치료학적 유효량의 합토글로빈(Hp).
제55항 내지 제63항 중 어느 한 항의 인공 CSF 또는 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.