KR20220007873A - 뮤신-16에 대한 인간화된 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents
뮤신-16에 대한 인간화된 항체 및 이의 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본원은 뮤신-16 (MUC16)의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항-뮤신-16 (MUC16) 약제를 포함하는 조성물, 방법 및 용도를 제공한다. 또한 본원은 장애, 예컨대, 양성 MUC16 발현과 연관된 암 및 질환을 관리, 치료 또는 예방하기 위한 용도 및 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2019년 5월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/845,065호의 이익 및 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로 본원에 원용된다.
정부 지원의 성명서
본 발명은 국립 보건원에 의해 수여된 P01 CA190174-01, P01 CA190174-02 및 P01 CA190174-03 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
뮤신은 세포 항상성 및 상피 표면의 보호를 위한 중요한 생체 분자이다. 암, 예컨대, 난소암에서 뮤신의 발현 변화는 진단, 예후 및 치료를 위한 바이오마커로서 유용하다 (Singh AP, et al., Lancet Oncol 2008; 9(11): 1076-85). MUC16은 대부분의 난소 암종 세포 상에 과잉 발현되는 뮤신이며, 난소암의 검출 및 진행을 위한 확립된 대용 혈청 마커 (CA-125)이다 (Badgwell D, et al., Dis Markers 23(5-6):397410 (2007); Bast RC, Jr, et al., Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81 (2005); Fritsche HA, et al., Clin Chem 44(7): 1379-80 (1998); 및 Krivak TC et al., Gynecol Oncol 115(1):81-5 (2009)).
MUC16은 절단되어 방출되는 거대 세포외 도메인 (CA-125) 및 보유하고 있는 도메인 (MUC-CD)으로 구성된 고도로 글리코실화된 뮤신이다 (도 1). MUC-CD는 절단 부위에 근접한 비-반복 세포외 도메인 (MUC16 엑토도메인), 막관통 도메인 및 잠재적인 인산화 부위를 갖는 세포질 꼬리를 포함한다. 절단 부위에 대해 원위부인, 방출된 세포외 도메인 (CA-125)은 156 개의 아미노산의 16-20 개의 탠덤(tandem) 반복부를 함유하며, 각각은 많은 잠재적인 글리코실화 부위를 갖는다 (O'Brien TJ, et al., Tumor Biol 22(6):348-66 (2001)). MUC16 항원은 이와 달리 자궁, 자궁내막, 나팔관, 난소, 및 복강 및 흉강의 장막의 정상 조직에서 낮은 수준으로만 발현되기 때문에, MUC16은 암의 표적화 및 치료를 포함한 면역-기반 요법을 위한 잠재적으로 매력적인 표적이다.
MUC16의 세포외 도메인의 유의한 부분은 절단되고 분비되며 (즉, CA-125), 이는 난소 암종에 대한 표적 항원으로서 사용될 MUC16의 이 부분의 유용성을 제한한다. 많은 보고된 MUC16 단클론 항체는 당단백질의 거대 분비된 CA-125 분획 상에 존재하는 에피토프에 결합하며, 보유하고 있는 MUC16 엑토도메인에 대해서는 결합하지 않는다 (Bellone S Am J Obstet Gynecol 200(1):75 el-10 (2009), Berek JS. Expert Opin Biol Ther. 4(7): 1159-65 (2004); O'Brien TJ, et al., Int J Biol Markers 13(4): 188-95 (1998)). 따라서, 떨어지지 않은 MUC16의 영역에 대한 새로운 항체의 생성이 진단적 및 치료적 목적을 위해 필요하다.
발명의 요약
본원은 뮤신 16 (MUC16)에 면역특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하고 MUC16-매개 장애, 예컨대, 암을 관리 또는 치료하기 위해 MUC16의 발현 및/또는 활성을 조정하는 항-뮤신 16 (MUC16) 작제물의 조성물, 방법 및 용도를 제공한다.
본원은, 특정 실시양태에 있어서, 뮤신 16 (MUC16) 폴리펩티드를 면역특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-뮤신 16 (MUC16) 작제물을 제공하며, 여기서 항체 모이어티는 4H11 또는 18C6 뮤린 단클론 항체의 인간화된 중쇄 가변 도메인 및 인간화된 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 (a) (i) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 136, 137 및 138의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 가변 중쇄 (VH)로서, 서열번호 136의 아미노산 위치 1, 3, 5, 11 및 19, 서열번호 137의 아미노산 위치 5, 7, 8 및 9, 및 서열번호 138의 아미노산 위치 12, 14, 18, 22 및 23으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 124, 125 및 126의 마우스 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3에 대해 인간화되는, 가변 중쇄 (VH); (ii) 각각 서열번호 14, 15 및 16의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 120, 121, 122 및 123의 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FW1), LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 가변 경쇄 (VL)로서, 서열번호 120의 위치 3, 9, 15, 18 및 22, 서열번호 122의 아미노산 위치 7 및 27, 및 서열번호 123의 아미노산 위치 3 및 9로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 104, 105, 106 및 107의 마우스 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 경쇄 (VL); 또는 (b)(i) 서열번호 4 또는 5를 포함하는 가변 중쇄 (VH); 및 (ii) 서열번호 2 또는 3을 포함하는 가변 경쇄 (VL); 또는 (c) (i) 각각 서열번호 35, 36 및 37의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 175, 176, 177 및 178의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 가변 중쇄 (VH)로서, 서열번호 175의 아미노산 위치 10, 11, 12, 13, 15, 19 및 23, 서열번호 177의 아미노산 위치 5, 14, 16, 18, 22 및 23, 및 서열번호 178의 아미노산 위치 6으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 159, 160, 161 및 162의 마우스 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 중쇄 (VH); 및 (ii) 각각 서열번호 32, 33 및 34의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 155, 156, 157 및 158의 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FW1), LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 가변 경쇄 (VL)로서, 서열번호 155의 위치 7, 9, 11 및 18, 서열번호 156의 아미노산 위치 5, 및 서열번호 157의 아미노산 위치 9 및 18로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 139, 140, 141 및 142의 마우스 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 경쇄 (VL); 또는 (d) (i) 서열번호 22 또는 23을 포함하는 가변 중쇄 (VH); 및 (ii) 서열번호 20 또는 21을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, (a)(i)의 HC-FW1은 서열번호 130을 포함하고/하거나; (a)(i)의 HC-FW2는 서열번호 131을 포함하고/하거나; (a)(i)의 HC-FW3은 서열번호 132를 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 112를 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 113을 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 114를 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 115를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, (a)(i)의 HC-FW1은 서열번호 133을 포함하고/하거나; (a)(i)의 HC-FW2는 서열번호 134를 포함하고/하거나; (a)(i)의 HC-FW3은 서열번호 135를 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 116을 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 117을 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 118을 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 119를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, (c)(i)의 HC-FW1은 서열번호 167을 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW2는 서열번호 168을 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW3은 서열번호 169를 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW4는 서열번호 170을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 147을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 148을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 149를 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 150을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, (c)(i)의 HC-FW1은 서열번호 171을 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW2는 서열번호 172를 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW3은 서열번호 173을 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW4는 서열번호 174를 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 151을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 152를 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 153을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 154를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 인간 MUC16을 면역특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 서열번호 53의 인간 MUC16 펩티드를 면역특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 MUC16 c114 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16은 글리코실화된다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16은 Asn1800 또는 Asn1806에서 N-글리코실화된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-뮤신 16 (MUC16) 작제물의 항체 모이어티는 (a)(i) 서열번호 12 또는 13을 포함하는 중쇄 및 (ii) 서열번호 10 또는 11을 포함하는 경쇄; 또는 (b)(i) 서열번호 30 또는 31을 포함하는 중쇄 및 (ii) 서열번호 28 또는 29를 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-뮤신 16 (MUC16) 작제물의 항체 모이어티는 MUC16의 엑토도메인에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv (scFv)이다. 일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 단일 쇄 Fv (scFv)이고, scFv는 서열번호 53-68 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, VH 쇄 및 VL 쇄는 인간 VH 쇄 및 VL 쇄이다. 일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 단클론 항체이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물은 마트리겔 침윤 검정에서 MUC16을 발현하는 종양 세포의 인 비트로(in vitro) 침윤을 억제한다. 일부 실시양태에 있어서, 종양 세포는 난소 종양 세포이다.
일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 인간-유래 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 중쇄 불변 영역은 감마 1, 감마 2, 감마 3 및 감마 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아이소타입을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 경쇄 불변 영역은 카파 및 람다로 이루어진 군으로부터 선택된 아이소타입을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄를 포함하는 면역글로불린이다. 일부 실시양태에 있어서, 면역글로불린은 IgG이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물은 단일특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물은 다중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물은 이중특이적이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물은 탠덤 scFv, 디아바디 (Db), 단일 쇄 디아바디 (scDb), 이중-친화도 재표적화 (DART) 항체, F(ab')2, 이중 가변 도메인 (DVD) 항체, 놉-인투-홀(knob-into-hole) (KiH) 항체, 독 앤드 록(dock and lock) (DNL) 항체, 화학적으로 가교된 항체, 이종다합체 항체, 또는 이종컨쥬게이트 항체이다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물은 펩티드 링커에 의해 연결된 2 개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16을 면역특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 제1 항체 모이어티이고, 여기서 항-MUC16 작제물은 제2 항원을 면역특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 항원은 T 세포의 표면 상의 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 항원은 CD3이다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 항원은 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 제2 항원은 CD3ε이다. 일부 실시양태에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항-MUC16 작제물은 항-CD3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적 항-MUC16 작제물은 서열번호 42, 69-75 및 88-95 중 어느 하나를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물은 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 공동-자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 CD3 제타 (ζ) 쇄 세포질 시그널링 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 서열번호 53-68 중 어느 하나의 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, CAR은 서열번호 80-87 및 97-103 중 어느 하나를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물은 펩티드 약제, 검출제, 이미징제, 치료제 또는 세포독성제에 추가로 컨쥬게이션된다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 서열번호 2-5, 10-13, 20-23 및 28-31 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 본원에 제공된 항-MUC16 작제물의 아미노산을 제공한다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 서열번호 2-5, 10-13, 20-23 및 28-31 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 제공된 항-MUC16 작제물의 아미노산을 제공한다. 본원은 특정 실시양태에 있어서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물, 본원에 제공된 폴리펩티드, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 제공된 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 면역 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에 있어서, 세포는 T 세포 또는 B 세포이다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물, 본원에 제공된 폴리펩티드, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 제공된 벡터의 치료적 유효량; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, MUC16-연관 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 환자에서 MUC16-연관 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물, 본원에 제공된 폴리펩티드, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 제공된 벡터의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16-연관 질환 또는 장애는 암이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 난소, 폐, 췌장, 유방, 자궁, 나팔관 또는 원발성 복막의 암이다. 일부 실시양태에 있어서, 암은 전이성 암이다. 일부 실시양태에 있어서, 약학 조성물은 환자에서의 전이를 억제하거나 감소시킨다. 일부 실시양태에 있어서, 환자는 인간 환자이다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 이펙터 세포를 생산하는 방법으로서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물을 코딩하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 환자로부터 단리된 하나 이상의 일차 세포에 도입하고, 환자에 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 방법은 환자에 세포를 투여하기 전에 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에 있어서, 일차 세포는 T 세포이다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 치료 방법은 환자에 추가적인 치료제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 치료제는 항-암제이다. 일부 실시양태에 있어서, 치료제는 화학요법제이다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 샘플 중 MUC16을 검출하는 방법으로서, (a) 샘플을 본원에 제공된 항-MUC16 작제물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-MUC16 작제물 및 샘플에 존재하는 MUC16 사이의 결합을 직접적으로 또는 간접적으로 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물은 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에 있어서, 검출가능한 표지는 색소생산성, 효소적, 방사성 동위원소적, 동위원소적, 형광성, 독성적, 화학발광성, 핵 자기 공명 조영제이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물 및 샘플 중 임의의 MUC16 사이의 결합은 검출가능한 표지를 검출함으로써 직접적으로 검출된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물 및 샘플 중 임의의 MUC16 사이의 결합은 이차 항체를 사용하여 간접적으로 검출된다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, MUC16-연관 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법으로서, a) 개체에 본원에 제공된 항-MUC16 작제물의 유효량을 투여하는 단계; 및 b) 항-MUC16 작제물 및 개체 중 임의의 MUC16 사이의 결합 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 결정하는 단계이되, 여기서 역치 수준을 초과하는 결합 수준은 개체가 MUC16-연관 질환 또는 장애를 가짐을 나타내는, 단계를 포함하는 것인, 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물은 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에 있어서, 검출가능한 표지는 색소생산성, 효소적, 방사성 동위원소적, 동위원소적, 형광성, 독성적, 화학발광성, 핵 자기 공명 조영제이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물 및 샘플 중 임의의 MUC16 사이의 결합은 검출가능한 표지를 검출함으로써 직접적으로 검출된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물 및 샘플 중 임의의 MUC16 사이의 결합은 이차 항체를 사용하여 간접적으로 검출된다.
MUC16-연관 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법으로서, a) 개체로부터 유래된 세포를 포함하는 샘플을 본원에 제공된 항-MUC16 작제물과 접촉시키는 단계; 및 b) 항-MUC16 작제물에 결합된 샘플 중 세포의 수를 결정하는 단계이되, 여기서 역치 수준을 초과하는 항-MUC16 작제물에 결합된 세포의 수에 대한 값은 개체가 MUC16-연관 질환 또는 장애를 가짐을 나타내는, 단계를 포함하는 것인, 방법이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물은 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에 있어서, 검출가능한 표지는 색소생산성, 효소적, 방사성 동위원소적, 동위원소적, 형광성, 독성적, 화학발광성, 핵 자기 공명 조영제이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물 및 샘플 중 임의의 MUC16 사이의 결합은 검출가능한 표지를 검출함으로써 직접적으로 검출된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물 및 샘플 중 임의의 MUC16 사이의 결합은 이차 항체를 사용하여 간접적으로 검출된다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물, 항-MUC16 폴리펩티드, 항-MUC16 작제물 또는 항-MUC16 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 임의의 폴리펩티드 및 이의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애는 암이다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서 본원에 제공된 항-MUC16 작제물, 항-MUC16 폴리펩티드, 항-MUC16 작제물 또는 항-MUC16 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 임의의 폴리펩티드 및 이의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애는 암이다.
또한, 본원은 특정 실시양태에 있어서, 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애의 진단을 위한, 본원에 제공된 항-MUC16 작제물, 항-MUC16 폴리펩티드, 항-MUC16 작제물 또는 항-MUC16 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 임의의 폴리펩티드 및 이의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애는 암이다.
도 1a는 MUC16의 구조의 개략도를 도시한다. 도 1b는 58 개의 아미노산 엑토도메인, 25 개의 아미노산 막관통 도메인, 및 31 개의 아미노산 세포질 꼬리를 포함하는, MUC16 c114 (서열번호 44)로 칭하는, MUC16의 절삭된 형태의 도식 및 아미노산 서열을 도시한다. 도면의 번호는 Muc16를 식별하는 원본 공개물인, Yin and Lloyd (2001) J Biol Chem 276: 27371-27375을 기반으로 한다.
도 2는 야생형 MUC16-C114 (서열번호 44) 및 N30 돌연변이체 MUC16-C114 (서열번호 50) 엑토도메인 사이의 아미노산 정렬을 도시한다.
도 3a-3e는 MUC16 카복시-말단에 결합하는 항체의 인 비트로 특성화를 예시한다. 도 3a는 다음의 4 개의 별개의 영역을 강조하는 MUC16 상부구조의 분자 레이아웃의 카툰 표현을 도시한다: N-말단 도메인, 탠덤 반복부 [TR] 영역, SEA (정자 단백질, 엔테로키나제 및 아그린) 도메인, 및 막곁(juxtamembrane) [JM] 영역 또는 엑토도메인 및 막관통 [TM] 영역을 포함하는 카복시-말단 도메인. 엑토도메인 영역 내에서 발견되고 이 연구에서 테스트된 항체의 표적-결합 부위인 MUC16 펩티드-2의 서열이 도시된다. 도 3b는 2 개의 주요 항체 후보의 방사성표지된 변이체에 대한 포화 결합 검정으로부터의 결과를 도시하는 그래프를 제공한다. [89Zr]Zr-DFO-9C9 (왼쪽) 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11 (오른쪽) (실선) 대 대조군 항체 (파선)에 대한 결합 친화도 곡선이 도시된다. 도 3c는 4℃에서 항체 중 하나의 최소 흡수를 나타내지만, SKOV3c114 세포에서 [89Zr]Zr-DFO-9C9의 느린 흡수와 비교하여 37℃에서 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 비교적 빠른 흡수를 나타내는 [89Zr]Zr-DFO-4H11 대 [89Zr]Zr-DFO-9C9의 세포 내재화 프로파일을 예시하며; 도 3d는 [89Zr]Zr-DFO-4H11 대 [89Zr]Zr-DFO-9C9의 비슷한 인 비트로 혈청 안정성을 나타내는 그래프 표현을 제공한다. 도 3e는 과량의 표지되지 않은 9C9 항체의 존재 하에 스트렙타비딘-기능화된 자기 비드 상에 포획된 비오틴화된 MUC16 펩티드-2에 대한 [89Zr]Zr-DFO-4H11 결합의 차단을 나타내는 그래프 표현을 제공한다 (차단되지 않은 것 (중간 막대)과 차단된 것 (오른쪽 막대)을 비교함, MUC16 펩티드-2가 없는 대조군 샘플이 또한 도시됨 (왼쪽 막대)).
도 4a-4d는 [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 방사성약리학적 프로파일의 인 비보 특성화를 예시한다. 도 4a는 주사-후 (p.i.) 24 시간에서의 종양 (T) 묘사를 나타내고 최대 96 시간 p.i까지 종양에서의 활성 흡수를 점진적으로 증가시키는 SKOV3c114 이종이식편에서의 [89Zr]Zr-DFO-9C9 (170 - 200 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스(chelex)-처리된 PBS에 현탁된 6.29 - 7.4 MBq)의 대표적인 연속 PET 이미지 [상단: 관상면 슬라이스; 하단: 최대 세기 투영 (MIP)]를 제공한다. 초기 시점에는 간 (L) 및 신장 (K)에서 가시적인 높은 농도의 활성이 있지만, 나중 시점에서 점차적으로 감소한다. 도 4b는 주사-후 (p.i.) 24 시간에서의 종양 (T) 및 림프절 (LN)을 묘사하고, 최대 96 시간 p.i까지 점진적으로 증가하는 종양에서의 PET 신호 세기를 갖는, SKOV3c114 이종이식편에서의 [89Zr]Zr-DFO-4H11 (170 - 200 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 6.29 - 7.4 MBq)의 대표적인 연속 PET 이미지 [상단: 관상면 슬라이스; 하단: 최대 세기 투영(MIP)]를 제공한다. 고대비 PET 이미지는 [89Zr]Zr-DFO-4H11로 수득되었으며, 간 (L) 및 림프절 (LN)은 나중 시점에서 배경 활성을 나타내는 유일한 비-종양 조직이었다. 도 4c는 두 방사성면역컨쥬게이트와 연관된 활성의 높은 비슷한 종양 흡수를 나타내는 SKOV3c114 이종이식편에서의 [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 인 비보 생체분포의 그래프 표현을 제공한다. SKOV3c114 종양에서의 [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 흡수는 항체의 각각의 방사성표지된 변이체와 공동-주사된 과량의 표지되지 않은 항체의 존재 하에 차단될 수 있었으며, 아이소타입 대조군의 것보다 유의하게 더 높았다. 비-종양 조직의 인 비보 활성 농도 사이의 상이함은 신장 및 겨드랑이 림프절 (LN) 사이에서 가장 두드러졌다. [89Zr]Zr-DFO-9C9는 [89Zr]Zr-DFO-4H11 및 아이소타입 대조군보다 신장에서 유의하게 더 높은 활성 농도를 나타내는 반면, [89Zr]Zr-DFO-4H11은 [89Zr]Zr-DFO-9C9 또는 아이소타입 대조군으로 주사된 마우스의 LN에서 유의하게 더 높은 활성 농도를 나타냈다. **는 p-값 ≤ 0.005를 나타내고; ***는 p-값 ≤ 0.0005를 나타내며; ***는 p-값 ≤ 0.00005를 나타낸다. 도 4d는 생명 유지에 필수적인 관심 장기에서 활성 농도의 종양-대-배경 (T:B) 비로부터 평가된 바와 같이 [89Zr]Zr-DFO-9C9 대 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 인 비보 방사성약리학적 프로파일 간의 비교를 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 5a-5e는 인간화된 4H11 항체의 인 비트로 특성화를 예시한다. 도 5a는 DFO-컨쥬게이션된 인간화된 4H11 항체 (DFO-hu4H11)의 카툰 표현을 제공한다. 도 5b는 SKOV3 세포 (점선)에 대한 결합의 결여와 대조적으로 SKOV3c114 세포 (또는 SKOV3+ 세포, 실선)에 대한 DFO-hu4H11의 결합을 보여주는 유세포 분석으로부터의 히스토그램을 제공하고; 도 5c는 89Zr-표지된 hu4H11 항체 ([89Zr]Zr-DFO-hu4H11)의 카툰 표현을 제공한다. 도 5d는 크기-배제 정제된 방사성면역컨쥬게이트에 비해 조질의 표지화 반응물의 즉각적인 박층 크로마토그래프 분석에서 높은 방사선화학적 순도를 나타내는 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 품질 관리를 제공하고; 도 5e는 스트렙타비딘-기능화된 다이나비드 상에 포획된 비오틴화된 MUC16 펩티드-2에 대한 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 낮은 비-특이적 결합 및 큰 (> 90%) 면역반응 분율의 그래프 표현을 제공한다. 표적-결합의 특이성은 표지되지 않은 DFO-hu4H11의 막대한 과량의 존재 하에 자기 비드 상의 MUC16 펩티드-2에 결합하는 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 차단에 의해 확립되었다.
도 6a-6c는 인간화된 4H11 항체의 방사성약리학적 프로파일의 인 비보 특성화를 예시한다. 도 6a는 36 시간에서 종양 (T)의 명확한 묘사에 이어 96 시간 p.i.에서 종양의 대다수의 주사된 활성의 점차적인 증대를 나타내는 SKOV3c114 이종이식편에서의 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 (200 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 7.4 MBq)의 대표적인 연속 PET 이미지 [상단: 관상면 슬라이스; 하단: 최대 세기 투영 (MIP)]를 제공하며; 도 6b는 종양에서 높은 활성 농도를 나타내는 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 인 비보 생체분포를 예시하며, 뼈 및 겨드랑이 림프절을 제외하고 대부분의 비-종양 배경 장기가 ≤ 8 %ID/g을 갖는다. 종양 활성 흡수는 표지되지 않은 DFO-hu4H11의 40-배 과량의 공동-주사에 의해 차단될 수 있다. **는 p-값 ≤ 0.005를 나타내고; 도 6c는 생명 유지에 필수적인 관심 장기에서 활성 농도의 종양-대-배경 (T:B) 비로부터 평가된 바와 같이 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 인 비보 방사성약리학적 프로파일을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 7a-7d는 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 생체분포의 인 비보 및 엑스 비보 분석을 예시한다. 도 7a는 SKOV3c114 종양에서 우선적이고 표적화된 흡수를 나타내는 양측 이종이식편 (왼쪽 어깨: SKOV3c114 종양; 오른쪽 어깨: SKOV3 종양)에서의 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 (250 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 9.25 MBq)의 대표적인 연속 PET 이미지 [상단: 관상면 슬라이스; 중간: 횡단 슬라이스; 하단: 최대 세기 투영 (MIP)의 PET-CT 오버레이]를 제공한다. 도 7b는 동일한 카세트에서 방사선자동사진법(autoradiography)을 위해 노출된 SKOV3 종양에서 임의의 신호의 거의 부재와 비교하여 SKOV3c114 종양에서 신호의 더 크고 이질적인 분포를 나타내는 (7a에 도시된 마우스로부터의) 수확된 양측 종양의 엑스 비보 분석으로부터의 대표적인 방사선자동사진법 이미지 (파선 원: 고 활성 핫스팟 파선 삼각형: 저 활성-활성이 없는 콜드 스팟)를 제공한다. 도 7c는 괴사 면적 (파선 삼각형) 대 활발하게 분열하는 종양 세포의 둥지(nest)를 포함하는 면적 (파선 원)을 나타내는 종양 섹션 (7b에 도시됨)의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 제공한다. 도 7d는 종양 아키텍처 및 종양을 포함하는 세포의 형태학에서 구별되는 상이함을 나타내는 SKOV3 (오른쪽) 종양 대 포르말린-고정된 파라핀-임베딩된 SKOV3c114 (왼쪽) 종양의 비교적 H&E 염색을 제공한다.
도 8a-8b는 MUC16-발현 세포주 및 HGSOC 환자-유래된 이종이식 모델에서 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 PET 이미징을 예시한다. 도 8a는 오른쪽 어깨에 피하 이종이식된 MUC16-양성 OVCAR3 종양을 보유하는 누드 마우스에서 72 시간 p.i.에서의 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 (150 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 5.55 MBq)의 대표적인 PET 이미지 [왼쪽: 관상면 슬라이스; 오른쪽 최대 세기 투영 (MIP)]를 제공한다. 도 8b는 오른쪽 어깨에 HGSOC 종양의 PDX를 보유하고 종양 (T)에서 높은 활성 농도를 나타내고 심장 및 하행 대동맥을 포함한 혈액 풀 (BP)에서 일부 지속적인 활성을 나타내는 2 마리의 마우스에서의 72 시간 p.i.에서 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 (150 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 5.55 MBq)의 대표적인 PET 이미지 [MIP]를 제공한다.
도 9a-9d는 FACS 분석에 의한, 대조군 MUC16- A2780 및 SKOV3 세포주에 대한 것은 아닌, MUC16+ OVCAR3 세포주, 및 MUC16 c344 및 c114 펩티드를 발현하는 형질주입체 세포주에 대한 4H11 및 18C6 마우스 mAb 및 인간화된 항체의 인 비트로 결합을 예시한다. 도 9a는 검정된 세포주에 대한 4H11 및 18C6 마우스 mAb 항체의 결합에 대한 평균 형광을 도시한다. 도 9b는 검정된 세포주에 대한 4H11 및 18C6 마우스 mAb 항체의 결합에 대한 형광 백분율 양성 세포를 도시한다. 도 9c는 검정된 세포주에 대한 4H11 및 18C6 인간화된 항체의 결합에 대한 평균 형광을 도시한다. 도 9d는 검정된 세포주에 대한 4H11 및 18C6 인간화된 항체의 결합에 대한 형광 백분율 양성 세포를 도시한다.
도 10a 및 10b는 FACS 분석에 의한, 대조군 MUC16- SKOV3 세포주에 대한 것은 아닌, MUC16+ OVCAR3 세포주, 및 MUC16 c344 및 c114 펩티드를 발현하는 형질주입체 SKOV3 세포주에 대한 4H11 인간화된 항체의 인 비트로 결합을 예시한다.
도 11은 4H11 인간화된 항체가 마트리겔 침윤 검정에서 미처리된 세포와 비교하여 MUC16+ OVCAR3, OVCA-433 및 CAOV3 세포주의 침윤을 억제한다는 것을 예시한다.
도 12는 4H11 인간화된 항체가 마트리겔 침윤 검정에서 미처리된 세포와 비교하여 MUC16 c344 및 c114 펩티드를 발현하는 형질주입체 SKOV3 세포주의 침윤을 억제한다는 것을 예시한다. 돌연변이체 MUC16 펩티드 N123mut c114를 발현하는 SKOV3 세포주를 침윤에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 2는 야생형 MUC16-C114 (서열번호 44) 및 N30 돌연변이체 MUC16-C114 (서열번호 50) 엑토도메인 사이의 아미노산 정렬을 도시한다.
도 3a-3e는 MUC16 카복시-말단에 결합하는 항체의 인 비트로 특성화를 예시한다. 도 3a는 다음의 4 개의 별개의 영역을 강조하는 MUC16 상부구조의 분자 레이아웃의 카툰 표현을 도시한다: N-말단 도메인, 탠덤 반복부 [TR] 영역, SEA (정자 단백질, 엔테로키나제 및 아그린) 도메인, 및 막곁(juxtamembrane) [JM] 영역 또는 엑토도메인 및 막관통 [TM] 영역을 포함하는 카복시-말단 도메인. 엑토도메인 영역 내에서 발견되고 이 연구에서 테스트된 항체의 표적-결합 부위인 MUC16 펩티드-2의 서열이 도시된다. 도 3b는 2 개의 주요 항체 후보의 방사성표지된 변이체에 대한 포화 결합 검정으로부터의 결과를 도시하는 그래프를 제공한다. [89Zr]Zr-DFO-9C9 (왼쪽) 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11 (오른쪽) (실선) 대 대조군 항체 (파선)에 대한 결합 친화도 곡선이 도시된다. 도 3c는 4℃에서 항체 중 하나의 최소 흡수를 나타내지만, SKOV3c114 세포에서 [89Zr]Zr-DFO-9C9의 느린 흡수와 비교하여 37℃에서 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 비교적 빠른 흡수를 나타내는 [89Zr]Zr-DFO-4H11 대 [89Zr]Zr-DFO-9C9의 세포 내재화 프로파일을 예시하며; 도 3d는 [89Zr]Zr-DFO-4H11 대 [89Zr]Zr-DFO-9C9의 비슷한 인 비트로 혈청 안정성을 나타내는 그래프 표현을 제공한다. 도 3e는 과량의 표지되지 않은 9C9 항체의 존재 하에 스트렙타비딘-기능화된 자기 비드 상에 포획된 비오틴화된 MUC16 펩티드-2에 대한 [89Zr]Zr-DFO-4H11 결합의 차단을 나타내는 그래프 표현을 제공한다 (차단되지 않은 것 (중간 막대)과 차단된 것 (오른쪽 막대)을 비교함, MUC16 펩티드-2가 없는 대조군 샘플이 또한 도시됨 (왼쪽 막대)).
도 4a-4d는 [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 방사성약리학적 프로파일의 인 비보 특성화를 예시한다. 도 4a는 주사-후 (p.i.) 24 시간에서의 종양 (T) 묘사를 나타내고 최대 96 시간 p.i까지 종양에서의 활성 흡수를 점진적으로 증가시키는 SKOV3c114 이종이식편에서의 [89Zr]Zr-DFO-9C9 (170 - 200 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스(chelex)-처리된 PBS에 현탁된 6.29 - 7.4 MBq)의 대표적인 연속 PET 이미지 [상단: 관상면 슬라이스; 하단: 최대 세기 투영 (MIP)]를 제공한다. 초기 시점에는 간 (L) 및 신장 (K)에서 가시적인 높은 농도의 활성이 있지만, 나중 시점에서 점차적으로 감소한다. 도 4b는 주사-후 (p.i.) 24 시간에서의 종양 (T) 및 림프절 (LN)을 묘사하고, 최대 96 시간 p.i까지 점진적으로 증가하는 종양에서의 PET 신호 세기를 갖는, SKOV3c114 이종이식편에서의 [89Zr]Zr-DFO-4H11 (170 - 200 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 6.29 - 7.4 MBq)의 대표적인 연속 PET 이미지 [상단: 관상면 슬라이스; 하단: 최대 세기 투영(MIP)]를 제공한다. 고대비 PET 이미지는 [89Zr]Zr-DFO-4H11로 수득되었으며, 간 (L) 및 림프절 (LN)은 나중 시점에서 배경 활성을 나타내는 유일한 비-종양 조직이었다. 도 4c는 두 방사성면역컨쥬게이트와 연관된 활성의 높은 비슷한 종양 흡수를 나타내는 SKOV3c114 이종이식편에서의 [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 인 비보 생체분포의 그래프 표현을 제공한다. SKOV3c114 종양에서의 [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 흡수는 항체의 각각의 방사성표지된 변이체와 공동-주사된 과량의 표지되지 않은 항체의 존재 하에 차단될 수 있었으며, 아이소타입 대조군의 것보다 유의하게 더 높았다. 비-종양 조직의 인 비보 활성 농도 사이의 상이함은 신장 및 겨드랑이 림프절 (LN) 사이에서 가장 두드러졌다. [89Zr]Zr-DFO-9C9는 [89Zr]Zr-DFO-4H11 및 아이소타입 대조군보다 신장에서 유의하게 더 높은 활성 농도를 나타내는 반면, [89Zr]Zr-DFO-4H11은 [89Zr]Zr-DFO-9C9 또는 아이소타입 대조군으로 주사된 마우스의 LN에서 유의하게 더 높은 활성 농도를 나타냈다. **는 p-값 ≤ 0.005를 나타내고; ***는 p-값 ≤ 0.0005를 나타내며; ***는 p-값 ≤ 0.00005를 나타낸다. 도 4d는 생명 유지에 필수적인 관심 장기에서 활성 농도의 종양-대-배경 (T:B) 비로부터 평가된 바와 같이 [89Zr]Zr-DFO-9C9 대 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 인 비보 방사성약리학적 프로파일 간의 비교를 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 5a-5e는 인간화된 4H11 항체의 인 비트로 특성화를 예시한다. 도 5a는 DFO-컨쥬게이션된 인간화된 4H11 항체 (DFO-hu4H11)의 카툰 표현을 제공한다. 도 5b는 SKOV3 세포 (점선)에 대한 결합의 결여와 대조적으로 SKOV3c114 세포 (또는 SKOV3+ 세포, 실선)에 대한 DFO-hu4H11의 결합을 보여주는 유세포 분석으로부터의 히스토그램을 제공하고; 도 5c는 89Zr-표지된 hu4H11 항체 ([89Zr]Zr-DFO-hu4H11)의 카툰 표현을 제공한다. 도 5d는 크기-배제 정제된 방사성면역컨쥬게이트에 비해 조질의 표지화 반응물의 즉각적인 박층 크로마토그래프 분석에서 높은 방사선화학적 순도를 나타내는 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 품질 관리를 제공하고; 도 5e는 스트렙타비딘-기능화된 다이나비드 상에 포획된 비오틴화된 MUC16 펩티드-2에 대한 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 낮은 비-특이적 결합 및 큰 (> 90%) 면역반응 분율의 그래프 표현을 제공한다. 표적-결합의 특이성은 표지되지 않은 DFO-hu4H11의 막대한 과량의 존재 하에 자기 비드 상의 MUC16 펩티드-2에 결합하는 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 차단에 의해 확립되었다.
도 6a-6c는 인간화된 4H11 항체의 방사성약리학적 프로파일의 인 비보 특성화를 예시한다. 도 6a는 36 시간에서 종양 (T)의 명확한 묘사에 이어 96 시간 p.i.에서 종양의 대다수의 주사된 활성의 점차적인 증대를 나타내는 SKOV3c114 이종이식편에서의 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 (200 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 7.4 MBq)의 대표적인 연속 PET 이미지 [상단: 관상면 슬라이스; 하단: 최대 세기 투영 (MIP)]를 제공하며; 도 6b는 종양에서 높은 활성 농도를 나타내는 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 인 비보 생체분포를 예시하며, 뼈 및 겨드랑이 림프절을 제외하고 대부분의 비-종양 배경 장기가 ≤ 8 %ID/g을 갖는다. 종양 활성 흡수는 표지되지 않은 DFO-hu4H11의 40-배 과량의 공동-주사에 의해 차단될 수 있다. **는 p-값 ≤ 0.005를 나타내고; 도 6c는 생명 유지에 필수적인 관심 장기에서 활성 농도의 종양-대-배경 (T:B) 비로부터 평가된 바와 같이 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 인 비보 방사성약리학적 프로파일을 나타내는 막대 그래프를 제공한다.
도 7a-7d는 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 생체분포의 인 비보 및 엑스 비보 분석을 예시한다. 도 7a는 SKOV3c114 종양에서 우선적이고 표적화된 흡수를 나타내는 양측 이종이식편 (왼쪽 어깨: SKOV3c114 종양; 오른쪽 어깨: SKOV3 종양)에서의 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 (250 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 9.25 MBq)의 대표적인 연속 PET 이미지 [상단: 관상면 슬라이스; 중간: 횡단 슬라이스; 하단: 최대 세기 투영 (MIP)의 PET-CT 오버레이]를 제공한다. 도 7b는 동일한 카세트에서 방사선자동사진법(autoradiography)을 위해 노출된 SKOV3 종양에서 임의의 신호의 거의 부재와 비교하여 SKOV3c114 종양에서 신호의 더 크고 이질적인 분포를 나타내는 (7a에 도시된 마우스로부터의) 수확된 양측 종양의 엑스 비보 분석으로부터의 대표적인 방사선자동사진법 이미지 (파선 원: 고 활성 핫스팟 파선 삼각형: 저 활성-활성이 없는 콜드 스팟)를 제공한다. 도 7c는 괴사 면적 (파선 삼각형) 대 활발하게 분열하는 종양 세포의 둥지(nest)를 포함하는 면적 (파선 원)을 나타내는 종양 섹션 (7b에 도시됨)의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 제공한다. 도 7d는 종양 아키텍처 및 종양을 포함하는 세포의 형태학에서 구별되는 상이함을 나타내는 SKOV3 (오른쪽) 종양 대 포르말린-고정된 파라핀-임베딩된 SKOV3c114 (왼쪽) 종양의 비교적 H&E 염색을 제공한다.
도 8a-8b는 MUC16-발현 세포주 및 HGSOC 환자-유래된 이종이식 모델에서 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 PET 이미징을 예시한다. 도 8a는 오른쪽 어깨에 피하 이종이식된 MUC16-양성 OVCAR3 종양을 보유하는 누드 마우스에서 72 시간 p.i.에서의 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 (150 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 5.55 MBq)의 대표적인 PET 이미지 [왼쪽: 관상면 슬라이스; 오른쪽 최대 세기 투영 (MIP)]를 제공한다. 도 8b는 오른쪽 어깨에 HGSOC 종양의 PDX를 보유하고 종양 (T)에서 높은 활성 농도를 나타내고 심장 및 하행 대동맥을 포함한 혈액 풀 (BP)에서 일부 지속적인 활성을 나타내는 2 마리의 마우스에서의 72 시간 p.i.에서 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 (150 μCi; 측면 꼬리 정맥을 통해 주사된 200 μL의 킬렉스-처리된 PBS에 현탁된 5.55 MBq)의 대표적인 PET 이미지 [MIP]를 제공한다.
도 9a-9d는 FACS 분석에 의한, 대조군 MUC16- A2780 및 SKOV3 세포주에 대한 것은 아닌, MUC16+ OVCAR3 세포주, 및 MUC16 c344 및 c114 펩티드를 발현하는 형질주입체 세포주에 대한 4H11 및 18C6 마우스 mAb 및 인간화된 항체의 인 비트로 결합을 예시한다. 도 9a는 검정된 세포주에 대한 4H11 및 18C6 마우스 mAb 항체의 결합에 대한 평균 형광을 도시한다. 도 9b는 검정된 세포주에 대한 4H11 및 18C6 마우스 mAb 항체의 결합에 대한 형광 백분율 양성 세포를 도시한다. 도 9c는 검정된 세포주에 대한 4H11 및 18C6 인간화된 항체의 결합에 대한 평균 형광을 도시한다. 도 9d는 검정된 세포주에 대한 4H11 및 18C6 인간화된 항체의 결합에 대한 형광 백분율 양성 세포를 도시한다.
도 10a 및 10b는 FACS 분석에 의한, 대조군 MUC16- SKOV3 세포주에 대한 것은 아닌, MUC16+ OVCAR3 세포주, 및 MUC16 c344 및 c114 펩티드를 발현하는 형질주입체 SKOV3 세포주에 대한 4H11 인간화된 항체의 인 비트로 결합을 예시한다.
도 11은 4H11 인간화된 항체가 마트리겔 침윤 검정에서 미처리된 세포와 비교하여 MUC16+ OVCAR3, OVCA-433 및 CAOV3 세포주의 침윤을 억제한다는 것을 예시한다.
도 12는 4H11 인간화된 항체가 마트리겔 침윤 검정에서 미처리된 세포와 비교하여 MUC16 c344 및 c114 펩티드를 발현하는 형질주입체 SKOV3 세포주의 침윤을 억제한다는 것을 예시한다. 돌연변이체 MUC16 펩티드 N123mut c114를 발현하는 SKOV3 세포주를 침윤에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다.
상세한 설명
일 양태에 있어서 본 출원은 MUC16의 에피토프, 예컨대, MUC16의 보유하고 있는 세포외 도메인 (MUC16 엑토도메인)의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-MUC16 작제물과 같은 항-MUC16 항체 약제를 제공한다.
파지 디스플레이 기술을 사용하여, 인간 MUC16의 보유하고 있는 세포외 도메인에 대해 특이적인 scFv를 식별하였다. 유세포 분석 검정은 이들 항체가 MUC16-발현 암 세포주를 인식한다는 것을 입증하였다. 따라서, 본 출원은 MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는 항-MUC16 항체 약제, 예컨대, 항-MUC16 작제물을 제공한다. 항-MUC16 항체 약제는 예를 들어, 항-MUC16 항체, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체 및 이의 항원-결합 단편, 항-MUC16 scFv, 항-MUC16 항체 융합 단백질(예컨대, 항-MUC16 Fc 융합 단백질 및 키메라 항원 수용체(CAR)), 다중-특이적 항체, 예컨대, 이중특이적 항체, 및 이의 항-MUC16 항체 콘쥬게이트(즉, 항-MUC16 면역콘쥬게이트)를 포함한다.
다른 양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제, 예컨대, 항-MUC16 항체, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체 및 이의 항원-결합 단편, 항-MUC16 scFv, 항-MUC16 항체 융합 단백질 (예컨대, 항-MUC16 Fc 융합 단백질 및 키메라 항원 수용체 (CAR)), 다중-특이적 항체, 예컨대, 이중특이적 항체, 및 이의 항-MUC16 항체 컨쥬게이트 (즉, 항-MUC16 면역컨쥬게이트)를 코딩하는 핵산을 제공한다.
다른 양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체 및 이의 항원-결합 단편, 항-MUC16 scFv, 항-MUC16 항체 융합 단백질 (예컨대, 항-MUC16 Fc 융합 단백질 및 키메라 항원 수용체 (CAR)), 다중-특이적 항체, 예컨대, 이중특이적 항체, 및 이의 항-MUC16 항체 컨쥬게이트 (즉, 항-MUC16 면역컨쥬게이트)를 포함하는 조성물, 예컨대, 약학 조성물을 제공한다.
또한, 예컨대, 암 치료를 위해 항-MUC16 항체 약제 및 항체를 제조하고 사용 방법뿐만 아니라 이러한 방법에 유용한 키트 및 제조 물품을 제공한다.
또한, 본원은 본 기술의 하나 이상의 항-MUC16 항체 약제, 또는 이의 기능적 변이체 (예컨대, 치환 변이체) 및 사용 설명서를 포함하는, MUC16-연관 병리의 검출 및/또는 치료를 위한 키트를 개시한다. 특정 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 하나 이상의 검출가능한 표지에 커플링된다. 일 실시양태에 있어서, 하나 이상의 검출가능한 표지는 방사성 표지, 형광성 표지, 또는 색소생산성 표지를 포함한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에 있어서, 키트는 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제에 특이적으로 결합하는 이차 항체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 방사성 표지, 형광성 표지, 또는 색소생산성 표지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 검출가능한 표지에 커플링된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 다음 참고문헌은 본 기술에 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al., (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에 사용된 바와 같이, 다음 용어는 달리 명시되지 않는 한, 하기에 이에 대해 부여된 의미를 갖는다. 본원에 사용된 전문용어는 특정 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것일뿐이며 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "MUC16" 또는 "MUC16 폴리펩티드" 또는 "MUC16 펩티드"는 Yin BW and Lloyd KO, 2001, J Biol Chem. 276(29):27371-5에 기재된 바와 같은 MUC 16 결속된(tethered) 뮤신 단백질을 지칭한다. GenBank™ 수탁 번호 NP_078966.2 (서열번호 1)는 예시적인 인간 MUC16 핵산 서열을 제공한다. GenBank™ 수탁 번호 NP 078966.2 (서열번호 1)는 예시적인 인간 MUC16 아미노산 서열을 제공한다. 천연 MUC16은 세포내 도메인, 막관통 도메인, 추정 절단 부위에 근접한 엑토도메인, 및 각각 156 개의 아미노산 길이를 갖는 12-20 개의 반복부의 거대한, 많이 글리코실화된 영역을 포함한다 (도 1a). "미성숙" MUC16은 MUC16 신호 서열 (서열번호 1의 아미노산 잔기 1-60)을 포함하는 서열번호 1을 지칭한다. "성숙 MUC16"은 세포 표면 상에 발현된 바와 같은, 즉, 신호 서열이 세포 가공에 의해 제거된 천연 MUC 16, 예를 들어, 서열번호 1의 첫번째 60 개의 아미노산 잔기가 제거된 서열번호 51을 지칭한다 (즉, 서열번호 1은 MUC16의 "미성숙" 형태임).
서열번호 44의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드는 본원에서 MUC16 C114로서 지칭되며, 성숙 MUC16의 C-말단 114 개의 아미노산 잔기로 이루어진다 (서열번호 51은 성숙 MUC16의 서열임). MUC16 C114는 58 개의 아미노산 엑토도메인, 25 개의 아미노산 막관통 도메인 및 31 개의 아미노산 세포질 꼬리를 포함한다 (도 1b). MUC16c114는 서열번호 44의 위치 1, 24 및 30의 아스파라긴 아미노산 잔기 (원래 MUC16 공개물 Yin BW and Lloyd KO, 2001, J Biol Chem. 276(29):27371-5에 따라 아미노산 위치 Asnl777, Asnl800, 및 Asnl806으로서 또한 지칭됨)에서 N-글리코실화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "단수형"은 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 수치 값 또는 수치 범위를 변형하기 위해 사용될 때 용어 "약"은, 값 또는 범위의 5% 내지 10% 초과 및 5% 내지 10% 미만의 편차가 인용된 값 또는 범위의 의도된 의미 내로 유지됨을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 대상체에 대한 약제의 "투여"는 이의 의도된 기능을 수행하기 위해 대상체에 약제를 도입하거나 전달하는 임의의 경로를 포함한다. 투여는, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 복강내, 피하를 포함한 임의의 적합한 경로, 및 본원에 기재된 바와 같은 다른 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다. 투여는 자기-투여 및 타인에 의한 투여를 포함한다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 비-자연 발생 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 코딩되는 아미노산은 20 개의 공통 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 및 피롤리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R 기, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합되는 α 탄소를 갖는 약제를 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 형성하는 아미노산은 D 형태이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 형성하는 아미노산은 L 형태이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드를 형성하는 제1 복수의 아미노산은 D 형태이고 제2 복수의 아미노산은 L 형태이다.
아미노산은 본원에서 이들의 일반적으로 알려진 3 문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권고되는 1-문자 기호에 의해 지칭된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 이들의 일반적으로 허용된 단일-문자 코드에 의해 지칭된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어는 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-자연 발생 아미노산, 예컨대, 아미노산 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 용어는 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결되는 전장 단백질을 포함한 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체 분자뿐만 아니라 면역원-결합력을 보유하는 항체 분자의 단편을 또한 의미한다. 또한, 이러한 단편은 당업계에 잘 알려져 있으며, 인 비트로 및 인 비보 둘 모두에서 자주 이용된다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자뿐만 아니라 잘-알려진 활성 단편인 F(ab')2 및 Fab를 의미한다. 온전한 항체의 Fc 단편이 결여된 F(ab')2 및 Fab 단편은 순환으로부터 더욱 신속하게 제거되며, 더 적은 온전한 항체의 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다 (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). 본 기술의 항체는 전체 천연 항체, 단클론 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 카멜화된(camelised) 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, Fab, Fab', 단일 쇄 V 영역 단편 (scFv), 단일 도메인 항체 (예컨대, 나노바디 및 단일 도메인 낙타류 항체), VNAR 단편, 이중-특이적 T-세포 인게이저(engager) 항체, 미니바디, 디설파이드-연결된 Fv (sdFv), 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 인트라바디, 융합 폴리펩티드, 비관습적 항체 및 위의 것들 중 임의의 것의 항원-결합 단편을 포함한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 즉 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형 (예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다
특정 실시양태에서, 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호-연접된 2 개 이상의 중쇄 (H) 및 2 개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 (CH) 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3 개의 도메인인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 CL 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 칭하는, 더욱 보존된 영역이 산재되어 있는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭하는, 초가변성의 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 배열된 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대, 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 제1 구성요소 (Cl q)를 포함한 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 본원에 상호교환적으로 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분", "항원-결합 단편", 또는 "항원-결합 영역"은 항원에 결합하고 항체에 항원 특이성을 부여하는 항체의 영역 또는 부분; 항원-결합 단백질의 단편을 지칭하며, 예를 들어, 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 (예컨대, 펩티드/HLA 복합체)을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 나타났다. 용어 항체의 "항체 단편" 내에 포함된 항원-결합 부분의 예는 VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지(bridge)에 의해 연결된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CHI 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989)); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
항체 및 항체 단편은 포유류 (예컨대, 인간, 비-인간 영장류, 염소, 기니피그, 햄스터, 말, 마우스, 랫트, 토끼 및 양) 또는 비-포유동물 항체 생산 동물 (예컨대, 닭, 오리, 거위, 뱀, 유미목 양서류)로부터 전체적으로 또는 부분적으로 유래될 수 있다. 항체 및 항체 단편은 동물에서 생산되거나, 동물의 외부에서, 예컨대, 효모 또는 파지로부터 (예컨대, 단일 항체 또는 항체 단편으로서 또는 항체 라이브러리의 일부로서) 생산될 수 있다.
게다가, Fv 단편의 2 개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 이들을, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 만들 수 있게 하는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 사용하여 접합될 수 있다. 이들은 단일 쇄 Fv (scFv)로서 알려져 있으며; 예컨대, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); 및 Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883 (1988)을 참고한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려진 종래의 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
"단리된 항체" 또는 "단리된 항원-결합 단백질"은 이의 자연 환경의 구성요소로부터 식별 및 분리되고/되거나 회수된 것이다. "합성 항체" 또는 "재조합 항체"는 일반적으로 재조합 기술을 사용하거나 당업자에게 알려진 펩티드 합성 기술을 사용하여 생성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일-쇄 가변 단편" 또는 "scFv"는 VH:VL 이종이합체를 형성하도록 공유적으로 연결된 면역글로불린 (예컨대, 마우스 또는 인간)의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)는 직접적으로 접합되거나, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연접시키거나 VH의 C-말단을 VL의 N-말단과 연접시키는 펩티드-코딩 링커 (예컨대, 약 10, 15, 20, 25 개의 아미노산)에 의해 접합된다. 링커는 보통 가요성을 위해 글리신이 풍부할 뿐만 아니라, 가용성을 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하다. 링커는 세포외 항원-결합 도메인의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 연결할 수 있다
불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, scFv는 원래 면역글로불린의 특이성을 보유한다. 단일 쇄 Fv 폴리펩티드 항체는 Huston, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)에 의해 기재된 바와 같이 VH- 및 VL-코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있다. 또한, 미국특허 제5,091,513호, 제5,132,405호 및 제4,956,778호; 및 미국특허 공개공보 제20050196754호 및 제20050196754호를 참고한다. 억제 활성을 갖는 길항성 scFv가 기재되었다 (예컨대, Zhao et al., Hybridoma (Larchmt) 27(6):455-51 (2008); Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle (2012); Shieh et al., J Imunol 183(4):2277-85 (2009); Giomarelli et al., Thromb Haemost 97(6):955-63 (2007); Fife et al., J Clin Invst 116(8):2252-61 (2006); Brocks et al., Immunotechnology 3(3): 173-84 (1997); Moosmayer et al., Ther Immunol 2(10):31- 40 (1995) 참고). 자극 활성을 갖는 작용성 scFv가 기재되었다 (예컨대, PPeter et al., J Biol Chem 25278(38):36740-7 (2003); Xie et al., Nat Biotech 15(8):768-71 (1997); Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 17(5-6):427-55 (1997); Ho et al., Bio Chim Biophys Acta 1638(3):257-66 (2003) 참고).
본원에 사용된 바와 같이, "항원"은 항체 (또는 이의 항원 결합 단편)가 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 자연 발생 또는 합성 화합물일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 표적 항원은 폴리펩티드 (예컨대, MUC16 폴리펩티드)일 수 있다. 항원은 또한 동물에서 면역 반응을 생성하기 위해 동물에 투여될 수 있다.
용어 "항원 결합 단편"은 항원에 대한 결합을 담당하는 폴리펩티드의 일부를 보유하는 전체 면역글로불린 구조의 단편을 지칭한다. 본 기술에서 유용한 항원 결합 단편의 예는 scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 및 F(ab')2를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 살아있는 세포로부터 유래된 샘플 재료를 의미한다. 생물학적 샘플은 조직, 세포, 세포의 단백질 또는 막 추출물, 및 대상체로부터 단리된 생물학적 유체 (예컨대, 복수액 또는 뇌척수액 (CSF))뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함할 수 있다. 본 기술의 생물학적 샘플은 유방 조직, 콩팥 조직, 자궁경부, 자궁내막, 두경부, 담낭, 이하선 조직, 전립선, 뇌, 뇌하수체, 신장 조직, 근육, 식도, 위, 소장, 결장, 간, 비장, 췌장, 갑상선 조직, 심장 조직, 폐 조직, 방광, 지방 조직, 림프절 조직, 자궁, 난소 조직, 부신 조직, 고환 조직, 편도선, 흉선, 혈액, 모발, 협측, 피부, 혈청, 혈장, CSF, 정액, 전립선액, 정장액(seminal fluid), 소변, 대변, 땀, 타액, 가래, 점액, 골수, 림프 및 눈물로부터 채취한 샘플을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 생체 샘플은 내부 장기의 생검 또는 암으로부터 또한 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 진단 또는 연구를 위해 대상체로부터 수득될 수 있거나, 대조군으로서 또는 기초 연구를 위해 질환이 없는 개체으로부터 수득될 수 있다. 샘플은 예컨대, 정맥 천자 및 외과적 생검을 포함하는 표준 방법에 의해 수득될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 생물학적 샘플은 바늘 생검에 의해 수득된 조직 샘플이다.
본원에 사용된 바와 같은 "이중특이적 항체" 또는 "BsAb"는 별개의 구조를 갖는 2 개의 표적, 예컨대, 2 개의 상이한 표적 항원, 또는 동일한 표적 항원 상의 2 개의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 다양한 상이한 이중특이적 항체 구조가 당업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에 있어서, 이중특이적 항체의 각각의 항원 결합 모이어티는 VH 및/또는 VL 영역을 포함하며; 일부 이러한 실시양태에 있어서, VH 및/또는 VL 영역은 특정 단클론 항체에서 발견되는 영역이다. 일부 실시양태에 있어서, 이중특이적 항체는 각각 상이한 단클론 항체로부터의 VH 및/또는 VL 영역을 포함하는 2 개의 항원 결합 모이어티를 함유한다. 일부 실시양태에 있어서, 이중특이적 항체는 2 개의 항원 결합 모이어티를 함유하며, 여기서 2 개의 항원 결합 모이어티 중 하나는 제1 단클론 항체로부터의 CDR을 함유하는 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하고, 다른 항원 결합 모이어티는 제2 단클론 항체로부터의 CDR을 함유하는 VH 및/또는 VL 영역을 갖는 항체 단편 (예컨대, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fd, Fv, dAB, scFv 등)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨쥬게이션된"은 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의한 2 개의 분자의 회합을 지칭한다. 적합한 유형의 회합은 화학적 결합 및 물리적 결합을 포함한다. 화학 결합은 예를 들어, 공유 결합 및 배위 결합을 포함한다. 물리적 결합은 예를 들어, 수소 결합, 쌍극자 상호작용, 반데르발 힘, 정전기 상호작용, 소수성 상호작용 및 방향족 스태킹(stacking)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대조군"은 비교 목적으로 실험에 사용된 대안적인 샘플이다. 대조군은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다. 예를 들어, 실험의 목적이 특정 유형의 질환에 대한 치료를 위한 치료제의 효험의 상관관계를 결정하는 것인 경우, 양성 대조군 (원하는 치료적 효과를 나타내는 것으로 알려진 조성물) 및 음성 대조군 (요법을 받지 않거나 위약을 받는 대상체 또는 샘플)이 전형적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스(consensus) FR"은 컨센서스 면역글로불린 서열의 프레임워크 (FR) 항체 영역을 의미한다. 항체의 FR 영역은 항원과 접촉하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 원하는 치료적 및/또는 예방적 효과를 달성하기에 충분한 양, 예컨대, 본원에 기재된 질환 또는 병태, 또는 본원에 기재된 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상의 예방 또는 이의 감소를 초래하는 양을 지칭한다. 치료적 또는 예방적 적용의 맥락에서, 대상체에 투여되는 조성물의 양은 조성물, 질환의 정도, 유형 및 중증도, 및 개체의 특성화, 예컨대, 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중 및 약물에 대한 내성에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 이러한 인자 및 기타 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 조성물은 또한 하나 이상의 추가적인 치료적 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 방법에서, 치료적 조성물은 본원에 기재된 질환 또는 병태의 하나 이상의 징후 또는 증상을 갖는 대상체에 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 조성물의 "치료적 유효량"은 질환 또는 병태의 생리학적 효과가 개량 또는 제거되는 조성물 수준을 지칭한다. 치료적 유효량은 1 회 이상의 투여로 제공될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플에서 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일 양태에 있어서, 하나의 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 대조군 또는 참조 샘플로부터의 해당 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교될 수 있다. 다른 양태에 있어서, 하나의 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 본원에 개시된 조성물의 투여 후 동일한 샘플로부터의 해당 유전자의 발현 수준과 직접적으로 비교될 수 있다. 용어 "발현"은 또한 다음 이벤트 중 하나 이상을 지칭한다: (1) (예컨대, 전사에 의한) 세포 내의 DNA 서열로부터 RNA 주형의 생산; (2) (예컨대, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성 및/또는 3' 단부 형성에 의한) 세포 내의 RNA 전사체의 가공; (3) 세포 내의 RNA 서열의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; (4) 세포 내의 폴리펩티드 또는 단백질의 번역-후 변형; (5) 세포 표면 상의 폴리펩티드 또는 단백질의 제시; 및 (6) 세포로부터 폴리펩티드 또는 단백질의 분비 또는 제시 또는 방출.
용어 "링커"는 2 개의 서열을 연접 또는 연결하는, 예컨대, 2 개의 폴리펩티드 도메인을 연결하는 합성 서열 (예컨대, 아미노산 서열)을 지칭한다. 일부 실시양태에 있어서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 아미노산 서열을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, "인간화된" 형태의 비-인간 (예컨대, 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 역량을 갖는 비-인간 종, 예컨대, 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류으로부터의 초가변 영역 잔기 (공여자 항체)로 대체된 인간 면역글로불린이다. 일부 실시양태에 있어서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화된 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않은 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능, 예컨대, 결합 친화도를 추가로 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상, 전형적으로 2 개의 가변 도메인 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv)을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 FR 영역이 결합 친화도를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있지만, 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프, 및 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 FR 서열의 영역이다. FR에서 이들 아미노산 치환의 수는 전형적으로 H 쇄에서 6 개 이하, L 쇄에서 3 개 이하이다. 인간화된 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것들을 또한 포함할 수 있다. 자세한 내용은 Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)을 참고한다. 예컨대, Ahmed & Cheung, FEBS Letters 588(2):288-297 (2014)을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 일반적으로 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예컨대, VL에서의 약 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), VH에서의 약 31-35B (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예컨대, VL에서의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 및 VH에서의 26-32 (H1), 52A-55 (H2) 및 96-101 (H3)(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "F(ab)"는 항원에 결합하지만 1가이고 Fc 부분을 갖지 않은 항체 구조의 단편을 지칭하며, 예를 들어, 효소 파파인에 의해 소화된 항체는 2 개의 F(ab) 단편 및 Fc 단편 (예컨대, 중쇄 (H) 불변 영역; 항원에 결합하지 않은 Fc 영역)을 산출한다.
본원에 사용된 바와 같이, "F(ab')2"는 전체 IgG 항체의 펩신 소화에 의해 생성된 항체 단편을 지칭하며, 여기서 이 단편은 2 개의 항원 결합 (ab') (2가) 영역을 갖고, 여기서 각각의 (ab1) 영역은 2 개의 별도의 아미노산 쇄, 항원에 결합하기 위해 S-S 결합에 의해 연결된 H 쇄의 일부 및 경쇄 (L)를 포함하고, 나머지 H 쇄 부분은 함께 연결된다. "F(ab')2" 단편은 2 개의 개별 Fab' 단편으로 분할될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "CDR"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성 결정 영역 아미노산 서열로서 정의된다. 예컨대, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)를 참고한다. 일반적으로, 항체는 가변 영역에 3 개의 중쇄 및 3 개의 경쇄 CDR 또는 CDR 영역을 포함한다. CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 대부분의 접촉 잔기를 제공한다. 특정 실시양태에 있어서, CDR 영역은 Kabat 시스템을 사용하여 기술된다 (Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242(1991)).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호교환적이고 당업계에서 일반적인 의미를 갖는다. 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만 다양한 이펙터 기능, 예컨대, Fc 수용체와의 상호작용을 나타낼 수 있는 항체 부분, 예컨대, 경쇄 및/또는 중쇄의 카복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더욱 보존된 아미노산 서열을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "에피토프"는 당업계의 용어이며, 항체가 면역특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된 영역을 지칭할 수 있다. 에피토프는 예컨대, 폴리펩티드의 인접 아미노산 (선형 또는 인접 에피토프)일 수 있거나, 에피토프는 예컨대, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 2 개 이상의 비인접 영역으로부터 합쳐질 수 있다 (입체형태적, 비-선형, 비연속적 또는 비-인접 에피토프).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "리간드"는 수용체에 결합하는 분자를 지칭한다. 특히, 리간드는 다른 세포 상의 수용체에 결합하여, 세포-간 인식 및/또는 상호작용을 가능하게 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "친화도"는 결합 강도의 척도를 의미한다. 이론에 얽매이지 않으면서, 친화도는 항체 조합 부위 및 항원 결정인자 사이의 입체화학적 맞춤의 근사, 이들 사이의 접촉 영역의 크기, 및 하전된 소수성 기의 분포에 의존한다. 친화도는 또한 용어 "결합활성(avidity)"을 포함하며, 이는 가역적 복합체 (예컨대, 1가 또는 다가)의 형성 후 항원-항체 결합의 강도를 지칭한다. 항원에 대한 항체의 친화도를 계산하기 위한 방법은 친화도를 계산하기 위한 결합 실험의 사용을 포함하여 당업계에 알려져 있다. 기능적 검정 (예컨대, 유세포 분석 검정)에서 항체 활성은 또한 항체 친화도를 반영한다. 항체 및 친화도는 표현형으로 특성화될 수 있으며, 기능적 검정 (예컨대, 유세포 분석 검정)을 사용하여 비교될 수 있다. 현재 개시된 주제에서 유용한 핵산 분자는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, 현재 개시된 주제에서 유용한 핵산 분자는 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 통상적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열과 "실질적인 상동성" 또는 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 이중-가닥 핵산 분자의 하나 이상의 가닥과 혼성화할 수 있다. "혼성화하다"는 다양한 엄격성의 조건 하에서, 상보성 폴리뉴클레오티드 서열 (예컨대, 본원에 기재된 유전자), 또는 이의 부분 사이의 이중-가닥 분자를 형성하기 위한 쌍을 의미한다. (예컨대, Wahl, G. M. and S. L. Berger, Methods Enzymol. 152:399 (1987); Kimmel, A. R., Methods Enzymol. 152:507 (1987) 참고).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "면역특이적으로 결합한다", "면역특이적으로 인식한다", "특이적으로 결합한다" 및 "특이적으로 인식한다"는 항체의 맥락에서 유사한 용어이며, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 항원-결합 부위를 통해 항원 (예컨대, 에피토프 또는 면역 복합체)에 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편을 지칭하며, 항체 또는 항원-결합 단편의 다른 항원과의 교차-반응성을 배제하지 않는다.
용어 "실질적으로 상동성" 또는 "실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열 중 임의의 하나) 또는 핵산 서열 (예를 들어, 본원에 기재된 핵산 서열 중 임의의 하나)에 대해 적어도 50% 이상의 상동성 또는 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 예를 들어, 이러한 서열은 비교에 사용된 서열 (예컨대, 야생형, 또는 천연 서열)에 대해 아미노산 수준 또는 핵산에서 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 이상 상동이거나 동일하다. 일부 실시양태에 있어서, 실질적으로 상동이거나 실질적으로 동일한 폴리펩티드는 비교에 사용된 서열에 대해 하나 이상의 아미노산 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 함유한다. 일부 실시양태에 있어서, 실질적으로 상동이거나 실질적으로 동일한 폴리펩티드는 상동 서열을 대체하기 위해 D-아미노산 및 레트로인버소(retroinverso) 아미노산을 포함하는 하나 이상의 비-자연 아미노산 또는 아미노산 유사체를 함유한다.
서열 상동성 또는 서열 동일성은 통상적으로 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705의 서열 분석 소프트웨어 패키지, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램)를 사용하여 측정된다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및/또는 다른 변형에 대한 상동성의 정도를 할당함으로써 동일하거나 유사한 서열을 매칭시킨다. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적 접근법에서, BLAST 프로그램은 밀접하게 관련된 서열을 나타내는 e-3 내지 e-100의 확률 스코어와 함께 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유사체"는 참조 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 기능을 갖는 구조적으로 관련된 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 포함하는 현재 개시된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 특성화에 유의하게 영향을 주지 않거나 이를 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭한다. 보존적 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함할 수 있다. 변형은 당업계에 알려진 표준 기술, 예컨대, 부위-지시된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 현재 개시된 항-MUC16 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 인간 scFv에 도입될 수 있다. 아미노산은 이들의 물리화학적 특성, 예컨대, 전하 또는 극성에 따라 그룹으로 분류될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 동일한 그룹 내의 아미노산으로 대체되는 것이다. 예를 들어, 아미노산은 전하에 의해 분류될 수 있다: 양으로 하전된 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 중성 전하 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 또한, 아미노산은 극성에 의해 분류될 수 있다: 극성 아미노산은 아르기닌 (염기성 극성), 아스파라긴 및 아스파르트산 (산성 극성), 글루탐산 (산성 극성), 글루타민, 히스티딘 (염기성 극성), 리신 (염기성 극성), 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함하고; 비-극성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판 및 발린을 포함한다. 따라서, CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 그룹으로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있으며, 변경된 항체는 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 보유하고 있는 기능 (즉, 위에 (c) 내지 (1)에 제시된 기능)에 대해 테스트될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 명시된 서열 또는 CDR 영역 내의 하나 이하, 2 개 이하, 3 개 이하, 4 개 이하, 5 개 이하의 잔기가 변경된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 핵산 분자 또는 폴리펩티드"는 세포 또는 세포로부터 수득된 샘플에 정상적으로 존재하지 않는 핵산 분자 (예컨대, cDNA, DNA 또는 RNA 분자) 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 이 핵산은 다른 유기체로부터 유래될 수 있거나, 예를 들어, 세포 또는 샘플에서 정상적으로 발현되지 않는 mRNA 분자일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조정하다"는 양성적으로 또는 음성적으로 변경하는 것을 지칭한다. 예시적인 조정은 약 1%, 약 2%, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 100% 변화를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증가하다"는 비제한적으로, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 100%만큼 양성적으로 변경하는 것을 포함하여, 약 5% 이상만큼 양성적으로 변경하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "감소하다"는 비제한적으로, 약 5%, 약 10%, 약 25%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 또는 약 100%만큼 음성적으로 변경하는 것을 포함하여, 약 5% 이상만큼 음성적으로 변경하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단리된" 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자는 핵산 분자의 자연 공급원 (예컨대, 마우스 또는 인간)에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 분리된 것이다. 더욱이, "단리된" 핵산 분자, 예컨대, cDNA 분자는 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 재료 또는 배양 배지가 실질적으로 없을 수 있거나, 화학적으로 합성될 때 화학 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 예를 들어, 표현 "실질적으로 없는"은 약 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만의 기타 재료, 예컨대, 세포 재료, 배양 배지, 기타 핵산 분자, 화학 전구체 및/또는 기타 화학물질을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자의 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 세포"는 세포를 자연적으로 수반하는 분자성 및/또는 세포성 구성요소로부터 분리된 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "신생물"은 세포 또는 조직의 병리학적 증식, 및 다른 조직 또는 장기로의 후속 이동 또는 이의 침윤을 특성화하는 질환을 지칭한다. 신생물 성장은 전형적으로 제어되지 않고 점진적이며, 정상 세포의 증식(multiplication)을 이끌어내지 않거나, 이의 중단을 야기할 조건 하에서 발생한다. 신생물은 비제한적으로, 방광, 결장, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 아교세포, 식도, 나팔관, 담낭, 심장, 창자, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 흉막, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관, 비뇨 생식관, 요관, 요도, 자궁 및 질로 이루어진 군으로부터 선택된 장기, 또는 이의 조직 또는 세포 유형을 포함한 다양한 세포 유형, 조직 또는 장기에 영향을 줄 수 있다. 신생물은 암, 예컨대, 육종, 암종 또는 형질세포종 (형질 세포의 악성 종양)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 투여와 양립가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아 및 항진균 화합물, 등장성 및 흡수 지연 화합물 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적으로 허용가능한 담체 및 이들의 제형은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 예컨대, 세포, 또는 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되고, 재료가 이렇게 변형된 세포로부터 유래되었음을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 그렇지 않으면 비정상적으로 발현되거나, 과소 발현되거나, 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "별도의" 치료적 용도는 상이한 경로에 의해 동시에 또는 실질적으로 동시에 2 개 이상의 활성 성분의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "순차적" 치료적 사용은 투여 경로가 동일하거나 상이한, 상이한 시간에서의 2 개 이상의 활성 성분의 투여를 지칭한다. 보다 특히, 순차적 사용은 다른 하나 또는 다른 것들의 투여가 시작되기 전에 활성 성분 중 하나의 전체 투여를 지칭한다. 따라서, 다른 활성 성분 또는 성분들의 투여 전에 활성 성분 중 하나를 몇 분, 몇 시간 또는 며칠에 걸쳐 투여하는 것이 가능하다. 이 경우에는 동시 치료가 없다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동시" 치료적 용도는 동일한 경로에 의해 동시에 또는 실질적으로 동시에 2 개 이상의 활성 성분의 투여를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 개별 유기체, 척추동물, 포유류 또는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 개체, 환자 또는 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료하는" 또는 "치료"는 대상체, 예컨대, 인간에서 본원에 기재된 질환 또는 장애의 치료를 포함하며, 다음을 포함한다: (i) 질환 또는 장애를 억제시키는 것, 즉 이의 발달을 정지시키는 것; (ii) 질환 또는 장애를 완화시키는 것, 즉 장애의 퇴행을 유발하는 것; (iii) 장애의 진행을 저속화하는 것; 및/또는 (iv) 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상의 진행을 억제, 완화 또는 저속화하는 것. 일부 실시양태에 있어서, 치료는 질환과 연관된 증상이, 예컨대, 경감하거나, 감소되거나, 치유되거나, 관해 상태에 놓이는 것을 의미한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 장애의 다양한 치료 모드는 "실질적"을 의미하는 것으로 의도되며, 이는 전체 치료도 포함하지만 전체 치료 미만을 포함하며, 여기서 일부 생물학적으로 또는 의학적으로 관련된 결과가 달성된다는 것을 이해해야 한다. 치료는 만성 질환에 대한 계속되는 연장 치료, 또는 급성 병태의 치료를 위한 단일 또는 수회 투여일 수 있다.
항-MUC16 항체 약제
본원은 MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항-MUC16 항체 약제를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16의 보유하고 있는 세포외 도메인에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는 항-MUC16 작제물이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 항-MUC16 항체 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16-발현 세포 (예컨대, MUC16-발현 암 세포)에 결합한다.
항-MUC16 항체 약제, 예컨대, 항-MUC16 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예컨대, 단클론 항체, 다클론 항체, 재조합적으로 생산된 항체, 단일특이적 항체, 다중특이적 항체 (이중특이적 항체 (BsAb) 포함)), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 면역글로불린, 합성 항체, 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 쇄 항체 또는 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 낙타화된 항체, 아피바디 및 디설파이드-연결된 Fv (dsFv), Fc 융합 단백질, 면역컨쥬게이트, 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 항체 및 항원-결합 단편은 당업계에 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16에 특이적으로 결합하는 전장 항체 (예컨대, 전장 IgG) 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 실시양태에 있어서, MUC16에 면역특이적으로 결합하는 항체 약제에 대한 언급은 항체 약제가 비-표적에 대한 이의 결합 친화도의 약 10 배 이상 (예를 들어, 약 10, 102, 103, 104, 105, 106 또는 107 배 이상 중 임의의 것을 포함함)인 친화도로 MUC16에 결합한다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-표적은 MUC16이 아닌 항원이다. 결합 친화도는 당업계에 알려진 방법, 예컨대, ELISA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석, 또는 방사성면역침전 검정 (RIA)에 의해 결정될 수 있다. Kd는 당업계에 알려진 방법, 예컨대, 예를 들어, Biacore 기기를 활용하는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정, 또는 예를 들어, Sapidyne 기기를 활용하는 동역학 배제 검정 (KinExA)에 의해 결정될 수 있다.
인간 서열을 함유하는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 인간 CDR 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열)가 본원에 광범위하게 논의되었지만, 비-인간 항-MUC16 항체 약제가 또한 고려된다. 일부 실시양태에 있어서, 비-인간 항-MUC16 항체 약제는 본원에 기재된 바와 같은 항-MUC16 항체 약제 및 비-인간 프레임워크 서열로부터의 인간 CDR 서열을 포함한다. 비-인간 프레임워크 서열은, 일부 실시양태에 있어서, 예컨대, 포유류, 예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 소 (예컨대, 젖소, 황소, 물소), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류 (예컨대, 마모셋, 레서스 원숭이) 등을 비롯한 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 CDR 서열을 사용하여 합성 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인을 생성하기 위해 사용될 수 있는 임의의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-인간 항-MUC16 항체 약제는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 CDR 서열을 비-인간 프레임워크 서열 (예컨대, 마우스 또는 닭 프레임워크 서열) 상에 이식함으로써 생성된 항-MUC16 항체 약제를 포함한다.
예시적인 인간 MUC16의 완전한 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 인간 MUC16 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 인간 MUC16의 보유하고 있는 세포외 도메인 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 MUC16 엑토도메인에 면역특이적으로 결합한다 (도 1). 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 인간 MUC16을 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 재조합 MUC16 폴리펩티드를 발현하는 세포에 면역특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16 폴리펩티드는 서열번호 43에 제시된 아미노산 서열을 갖는 MUC16-c344이다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16 폴리펩티드는 서열번호 44에 제시된 아미노산 서열을 갖는 MUC16-c114이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 인간 이외의 종으로부터의 MUC16 폴리펩티드와 교차-반응한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 인간 MUC16에 대해 완전히 특이적이며, 종 또는 다른 유형의 비-인간 교차-반응성을 나타내지 않는다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 암세포 (예컨대, 고형 종양)의 세포 표면 상에 발현된 MUC16을 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 난소암 세포, 유방암 세포, 전립선암 세포, 결장암 세포, 폐암 세포, 뇌암 세포, 췌장암 세포, 신장암 세포, 나팔관암 세포, 자궁 (예컨대, 자궁내막) 암 세포, 원발성 복막암 세포 또는 MUC16을 발현하는 임의의 다른 조직의 암 세포 중 하나 이상의 세포 표면 상에 발현된 MUC16을 특이적으로 인식한다 . 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 암 세포주, 예컨대, 난소암 세포주, 예컨대, OVCAR3, OVCA-432, OVCA-433 및 CAOV3의 세포 표면 상에 발현된 MUC16을 특이적으로 인식한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16 단백질의 하나 이상의 대립형질 변이체 또는 이의 단편과 교차-반응한다. 일부 실시양태에 있어서, 대립형질 변이체는 자연 발생 MUC16 또는 이의 단편과 비교할 때, 최대 약 30 개, 예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 또는 30 개 중 임의의 것의 아미노산 치환, 예컨대, 보존적 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16 단백질의 임의의 대립형질 변이체 또는 이의 단편과 교차-반응하지 않는다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16 단백질의 하나 이상의 종간 변이체와 교차-반응한다. 일부 실시양태에 있어서, 예를 들어, MUC16 단백질 또는 이의 단편은 인간 MUC16이며, MUC16 단백질의 종간 변이체 또는 이의 단편은 이의 마우스 또는 랫트 변이체이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16 단백질의 임의의 종간 변이체와 교차-반응하지 않는다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 중 임의의 것에 따르면, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16에 특이적으로 결합하는 항-MUC16 항체 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 인간화된 18C6 항-MUC16 항체의 항체 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
인간화된 4H11 항-MUC16 항체 약제
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 4H11 항-MUC16 항체의 항체 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하며 (PCT 공개공보 WO2011/119979호), 여기서 4H11 항-MUC16 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역 (HC-FW) 또는 경쇄 프레임워크 영역 (LC-FW)에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다.
일부 실시양태에 있어서, 마우스 4H11 항-MUC16 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개 이상의 아미노산 잔기는 인간 항체 HC-FW 및/또는 LC-FW에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 인간 LC-FW는 면역글로불린 카파 가변 4-1 (IGKV4-1) 유전자 또는 면역글로불린 카파 접합 2 (IGKJ2) 유전자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 인간 HC-FW는 면역글로불린 중쇄 가변 3-21 (IGHV3-21) 유전자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 더욱 마우스-유사하며, 이는 약 10 개 이하의 아미노산 잔기인 마우스 4H11 항-MUC16 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역이 인간 항체 HC-FW 또는 LC-FW에서의 상응하는 아미노산으로 변형됨을 의미한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 더욱 인간-유사하며, 이는 10 개 이상의 아미노산 잔기인 마우스 4H11 항-MUC16 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역이 인간 항체 HC-FW 또는 LC-FW에서의 상응하는 아미노산으로 변형됨을 의미한다. 일부 실시양태에 있어서, 마우스 4H11 항-MUC16 항체 서열과 관련하여 이루어진 인간 아미노산 치환이 더 많을수록, 인간에 투여될 때 항-MUC16 항체 약제에 대해 더 낮은 면역원성이 예상된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 항체의 구조 및/또는 활성을 유지하기 위해 마우스 서열에 대해 변형되지 않을 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 4 또는 5의 1, 2 또는 3 개의 HC-CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 4 또는 5의 중쇄 가변 도메인의 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 17, 18 및 19에 제시된 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 124, 125 및 126에 제시된 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 HC-FW1, HC-FW2 및/또는 HC-FW3에서의 하나 이상의 아미노산 잔기가 각각 인간 HC-FW1, HC-FW2 및/또는 HC-FW3에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 124, 125 및 126의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 HC-FW1, HC-FW2 및/또는 HC-FW3에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각각 서열번호 127, 128 및 129에 제시된 인간 HC-FW1, HC-FW2 및/또는 HC-FW3에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 136, 137 및 138에 제시된 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 서열번호 136의 위치 1에서의 X는 S 또는 E이고/이거나, 서열번호 136의 위치 3에서의 X는 K 또는 Q이고/이거나, 서열번호 136의 위치 5에서의 X는 Q 또는 V이고/이거나, 서열번호 136의 위치 11에서의 X는 F 또는 L이고/이거나, 서열번호 136의 위치 19에서의 X는 K 또는 R이고/이거나; 서열번호 137의 위치 5에서의 X는 S 또는 A이고/이거나, 서열번호 137의 위치 7에서의 X는 E 또는 G이고/이거나, 서열번호 137의 위치 8에서의 X는 M 또는 K이고/이거나, 서열번호 137의 위치 9에서의 X는 R 또는 G이고/이거나; 서열번호 138의 위치 12에서의 X는 T 또는 S이고/이거나, 서열번호 138의 위치 14에서의 X는 H 또는 Y이고/이거나, 서열번호 138의 위치 18에서의 X는 G 또는 N이고/이거나, 서열번호 138의 위치 22에서의 X는 S 또는 A이고/이거나, 서열번호 138의 위치 23에서의 X는 G 또는 E이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 130, 131 및 132의 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 130, 131 및 132의 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 130, 131 및 132에 대한 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 133, 134 및 135의 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 133, 134 및 135의 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 갖거나 서열번호 133, 134 및 135에 대한 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 4 또는 5를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 4 또는 5에 제시된 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 2 또는 3의 1, 2 또는 3 개의 LC-CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 2 또는 3의 경쇄 가변 도메인의 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 14, 15 및 16에 제시된 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 2 또는 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 2 또는 3에 제시된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 104, 105, 106 및 107에 제시된 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FW1), LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및/또는 LC-FW4에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각각 인간 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및/또는 LC-FW4에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 104, 105, 106 및 107의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및/또는 LC-FW4에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각각 서열번호 108, 109, 110 및 111에 제시된 인간 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및/또는 LC-FW4에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 120, 121, 122 및 123에 제시된 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 서열번호 120의 위치 3에서의 X는 E 또는 V이고/이거나, 서열번호 120의 위치 9에서의 X는 S 또는 D이고/이거나, 서열번호 120의 위치 15에서의 X는 A 또는 L이고/이거나, 서열번호 120의 위치 18에서의 X는 K 또는 R이고/이거나, 서열번호 120의 위치 22에서의 X는 S 또는 N이고/이거나; 서열번호 122의 위치 7에서의 X는 T 또는 S이고/이거나, 서열번호 122의 위치 27에서의 X는 L 또는 V이고/이거나, 서열번호 123의 위치 3에서의 X는 P 또는 Q이고/이거나, 서열번호 123의 위치 9에서의 X는 V 또는 I이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 112, 113, 114 및 115의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 112, 113, 114 및 115의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 112, 113, 114 및 115에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 116, 117, 118 및 119의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 116, 117, 118 및 119의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 116, 117, 118 및 119에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 4 또는 5의 중쇄 가변 도메인의 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 2 또는 3의 경쇄 가변 도메인의 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 17, 18 및 19에 제시된 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 각각 서열번호 14, 15 및 16에 제시된 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 4 또는 5를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 2 또는 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 4 또는 5에 제시된 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 2 또는 3에 제시된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 130에 제시된 HC-FW1, 서열번호 131에 제시된 HC-FW2, 서열번호 132에 제시된 HC-FW3, 서열번호 112에 제시된 LC-FW1, 서열번호 113에 제시된 LC-FW2, 서열번호 114에 제시된 LC-FW3 및/또는 서열번호 115에 제시된 LC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 133에 제시된 HC-FW1, 서열번호 134에 제시된 HC-FW2, 서열번호 135에 제시된 HC-FW3, 서열번호 116에 제시된 LC-FW1, 서열번호 117에 제시된 LC-FW2, 서열번호 118에 제시된 LC-FW3 및/또는 서열번호 119에 제시된 LC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 17, 18 및 19에 제시된 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 130, 131 및 132에 제시된 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 각각 서열번호 14, 15 및 16에 제시된 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 112, 113, 114 및 115에 제시된 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 17, 18 및 19에 제시된 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 133, 134 및 135에 제시된 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 각각 서열번호 14, 15 및 16에 제시된 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 116, 117, 118 및 119에 제시된 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항체 중쇄 가변 도메인은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 4 또는 5에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 2 또는 3에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
인간화된 18C6 항-MUC16 항체 약제
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 18C6 항-MUC16 항체의 항체 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인을 포함하며 (PCT 공개공보 WO2016/149368호), 여기서 18C6 항-MUC16 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 항체 중쇄 프레임워크 영역 (HC-FW) 또는 경쇄 프레임워크 영역 (LC-FW)에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다.
일부 실시양태에 있어서, 마우스 18C6 항-MUC16 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개 이상의 아미노산 잔기는 인간 항체 HC-FW 및/또는 LC-FW에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 인간 LC-FW는 면역글로불린 카파 가변 2-28 (IGKV2-28) 유전자 또는 면역글로불린 카파 접합 4 (IGKJ4) 유전자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 인간 HC-FW는 면역글로불린 중쇄 가변 2-5 (IGHV2-5) 유전자로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 더욱 마우스-유사하며, 이는 약 10 개 이하의 아미노산 잔기인 마우스 18C6 항-MUC16 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역이 인간 항체 HC-FW 또는 LC-FW에서의 상응하는 아미노산으로 변형됨을 의미한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제는 더욱 인간-유사하며, 이는 10 개 이상의 아미노산 잔기인 마우스 18C6 항-MUC16 중쇄 가변 도메인 및/또는 항체 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역이 인간 항체 HC-FW 또는 LC-FW에서의 상응하는 아미노산으로 변형됨을 의미한다. 일부 실시양태에 있어서, 마우스 18C6 항-MUC16 항체 서열과 관련하여 이루어진 인간 아미노산 치환이 더 많을수록, 인간에 투여될 때 항-MUC16 항체 약제에 대해 더 낮은 면역원성이 예상된다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 항체의 구조 및/또는 활성을 유지하기 위해 마우스 서열에 대해 변형되지 않을 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 22 또는 23의 1, 2 또는 3 개의 HC-CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 22 또는 23의 중쇄 가변 도메인의 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 159, 160, 161 및 162에 제시된 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2, HC-FW3 및/또는 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및/또는 HC-FW4에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각각 인간 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및/또는 HC-FW4에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 159, 160, 161 및 162의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및/또는 HC-FW4에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각각 서열번호 163, 164, 165 및 166에 제시된 인간 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및/또는 HC-FW4에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 175, 176, 177 및 178에 제시된 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 서열번호 175의 위치 10에서의 X는 G 또는 T이고/이거나, 서열번호 175의 위치 11에서의 X는 I 또는 L이고/이거나, 서열번호 175의 위치 12에서의 X는 L 또는 V이고/이거나, 서열번호 175의 위치 13에서의 X는 Q 또는 K이고/이거나, 서열번호 175의 위치 15에서의 X는 S 또는 T이고/이거나, 서열번호 175의 위치 19에서의 X는 S 또는 T이고/이거나, 서열번호 175의 위치 23에서의 X는 S 또는 T이고/이거나; 서열번호 177의 위치 5에서의 X는 S 또는 T이고/이거나, 서열번호 177의 위치 14에서의 X는 F 또는 V이고/이거나, 서열번호 177의 위치 16에서의 X는 K 또는 T이고/이거나, 서열번호 177의 위치 18에서의 X는 A 또는 T이고/이거나, 서열번호 177의 위치 22에서의 X는 T 또는 P이고/이거나, 서열번호 177의 위치 23에서의 X는 A 또는 V이고/이거나; 서열번호 178의 위치 6에서의 X는 S 또는 L이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 167, 168, 169 및 170의 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 167, 168, 169 및 170의 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 167, 168, 169 및 170에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 171, 172, 173 및 174의 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 171, 172, 173 및 174의 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 171, 172, 173 및 174에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 22 또는 23을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 22 또는 23에 제시된 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 20 또는 21의 1, 2 또는 3 개의 LC-CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 20 또는 21의 경쇄 가변 도메인의 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 20 또는 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 20 또는 21에 제시된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 139, 140, 141 및 142에 제시된 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FW1), LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및/또는 LC-FW4에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각각 인간 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및/또는 LC-FW4에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 139, 140, 141 및 142의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및/또는 LC-FW4에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 각각 서열번호 143, 144, 145 및 146에 제시된 인간 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및/또는 LC-FW4에서의 상응하는 아미노산으로 변형된다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 155, 156, 157 및 158에 제시된 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 서열번호 155의 위치 7에서의 X는 A 또는 S이고/이거나, 서열번호 155의 위치 9에서의 X는 P 또는 L이고/이거나, 서열번호 155의 위치 11에서의 X는 V 또는 L이고/이거나, 서열번호 155의 위치 18에서의 X는 S 또는 P이고/이거나, 서열번호 156의 위치 5에서의 X는 R 또는 K이고/이거나, 서열번호 157의 위치 9에서의 X는 R 또는 S이고/이거나, 서열번호 157의 위치 18에서의 X는 R 또는 K이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 147, 148, 149 및 150의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 147, 148, 149 및 150의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 147, 148, 149 및 150에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 151, 152, 153 및 154의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 151, 152, 153 및 154의 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 151, 152, 153 및 154에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 22 또는 23의 중쇄 가변 도메인의 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 20 또는 21의 경쇄 가변 도메인의 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 각각 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 22 또는 23을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 20 또는 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 22 또는 23에 제시된 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 20 또는 21에 제시된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 167에 제시된 HC-FW1, 서열번호 168에 제시된 HC-FW2, 서열번호 169에 제시된 HC-FW3, 서열번호 170에 제시된 HC-FW4, 서열번호 147에 제시된 LC-FW1, 서열번호 148에 제시된 LC-FW2, 서열번호 149에 제시된 LC-FW3 및/또는 서열번호 150에 제시된 LC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 서열번호 171에 제시된 HC-FW1, 서열번호 172에 제시된 HC-FW2, 서열번호 173에 제시된 HC-FW3, 서열번호 174에 제시된 HC-FW4, 서열번호 151에 제시된 LC-FW1, 서열번호 152에 제시된 LC-FW2, 서열번호 153에 제시된 LC-FW3 및/또는 서열번호 154에 제시된 LC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 167, 168, 169 및 170에 제시된 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 각각 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 147, 148, 149 및 150에 제시된 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 각각 서열번호 35, 36 및 37에 제시된 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 171, 172, 173 및 174에 제시된 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 각각 서열번호 32, 33 및 34에 제시된 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 151, 152, 153 및 154에 제시된 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항체 중쇄 가변 도메인은 서열번호 22 또는 23의 아미노산 서열, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 22 또는 23에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 20 또는 21의 아미노산 서열, 또는 최대 약 5 개 (예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5 개 중 임의의 것)의 아미노산 치환을 포함하거나 서열번호 20 또는 21에 대해 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
본원에 제공된 인간화된 4H11 및 18C6 항체 약제의 예시적인 항체 서열은 하기 표에 도시되어 있다. 표 1의 예시적인 CDR 서열은 IgBLAST 알고리즘을 사용하여 예측된다. 예를 들어, Ye J. et al., Nucleic Acids Research 41:W34-W40 (2013)을 참고하며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 당업자는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 CDR 위치의 예측에 대해 많은 알고리즘이 알려져 있고, 본원에 기재된 항체로부터의 CDR을 포함하지만 IgBLAST 이외의 예측 알고리즘에 기반한 항체 약제가 본 기술의 범주 내에 있음을 인식할 것이다.
예시적인 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 국제 면역유전학 정보 시스템®(INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM®) (IMGT)에 따라 한정된다. 예를 들어, Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 43:D413-422 (2015)를 참고하며, 이의 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 원용된다. 당업자는 본원에 기재된 항체로부터의 VH 또는 VL 서열을 포함하지만 IMGT 이외의 알고리즘에 기반한 항체 약제가 본 기술의 범주 내에 있음을 인식할 것이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 항체 중쇄 불변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 IgG2 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 IgG3 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 중쇄 불변 영역은 서열번호 8, 9, 26, 27 또는 47의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, IgG4 중쇄 불변 영역은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 람다 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 경쇄 불변 영역은 서열번호 6, 7, 24, 25 또는 49의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다.
전장 항-MUC16 항체
일부 실시양태에서 항-MUC16 항체 약제는 전장 항-MUC16 항체이다. 일부 실시양태에 있어서, 전장 항-MUC16 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM이다. 일부 실시양태에 있어서, 전장 항-MUC16 항체는 IgG 불변 도메인, 예컨대, 이의 변이체를 비롯한 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중 임의의 것의 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 전장 항-MUC16 항체는 람다 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 전장 항-MUC16 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 전장 항-MUC16 항체는 전장 인간 항-MUC16 항체이다. 일부 실시양태에 있어서, 전장 항-MUC16 항체는 마우스 면역글로불린의 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 전장 항-MUC16 항체는 향상된 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성 (CDC) 이펙터 기능을 갖도록 변경되거나 달리 변화된 Fc 서열을 포함한다.
따라서, 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, IgG1 또는 IgG4 불변 도메인을 포함하는 전장 항-MUC16 항체를 제공하며, 여기서 항-MUC16 항체는 종양 세포 상의 MUC16에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, IgG1은 인간 IgG1이다. 일부 실시양태에 있어서, IgG1은 인간 IgG4이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 중쇄 불변 영역은 서열번호 8, 9, 26 또는 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 경쇄 불변 영역은 서열번호 6, 7, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 중쇄 불변 영역은 서열번호 8, 9, 26 또는 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 항-MUC16 경쇄 불변 영역은 서열번호 6, 7, 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16-발현 세포 (예컨대, MUC16-발현 암 세포)에 대한 항-MUC16 항체의 결합은 종양 성장 또는 종양의 전이를 억제하거나, 종양의 퇴행을 유도한다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16-발현 세포 (예컨대, MUC16-발현 암세포)에 대한 항-MUC16 항체의 결합은 MUC16-발현 세포의 인 비트로 마트리겔 침윤을 억제한다.
일부 실시양태에 있어서, IgG1 또는 IgG4 불변 도메인을 포함하는 전장 항-MUC16 항체를 제공하며, 여기서 항-MUC16 항체는 a) 서열번호 4 또는 5를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 b) 서열번호 2 또는 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, IgG1은 인간 IgG1이다. 일부 실시양태에 있어서, IgG4는 인간 IgG4이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 중쇄 불변 영역은 서열번호 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 경쇄 불변 영역은 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체는 서열번호 12 또는 13을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 10 또는 11을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, IgG1 또는 IgG4 불변 도메인을 포함하는 전장 항-MUC16 항체를 제공하며, 여기서 항-MUC16 항체는 a) 서열번호 22 또는 23을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 b) 서열번호 20 또는 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, IgG1은 인간 IgG1이다. 일부 실시양태에 있어서, IgG4는 인간 IgG4이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 중쇄 불변 영역은 서열번호 26 또는 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 경쇄 불변 영역은 서열번호 24 또는 25의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체는 서열번호 30 또는 31을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 28 또는 29를 포함하는 경쇄를 포함한다.
키메라 항-MUC16 작제물
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16에 특이적으로 결합하는 항-MUC16 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 이의 변이체이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 항-MUC16 CAR이다. CAR은 당업계에 잘 알려져 있으며, 항-MUC16 항체 약제는 당업계에 알려진, 예컨대, Sadelain et al., Nature 545: 423- 431 (2017)에 기재된 임의의 CAR에 따른 CAR일 수 있으며, 이의 개시내용은 본 기술에서 사용하기 위해 본원에 명시적으로 원용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "키메라 항원 수용체 (CAR)"는, 결과적으로 세포내 면역 세포 (예컨대, T 세포 또는 NK 세포) 시그널링 도메인에 직접적으로 또는 간접적으로 연결되는, 막관통 도메인 (예컨대, 면역 세포 공동-자극 시그널링 분자 막관통 도메인)에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 세포외 항원-결합 도메인의 일부로서 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 함유하는 인공적으로 작제된 하이브리드 단일-쇄 단백질 또는 단일-쇄 폴리펩티드를 지칭한다. 세포내 시그널링 도메인 (ISD)은 항원-의존적, TCR-연관 T 세포 활성화 분자, 예컨대, CD3ζ, TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d의 세포내 도메인의 일부로부터의, 일차 시그널링 서열 또는 일차 면역 세포 시그널링 서열을 포함한다. ISD는 공동-자극 시그널링 서열; 예컨대, 항원-비의존적 공동-자극 분자, 예컨대, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등의 세포내 도메인의 일부를 추가로 포함할 수 있다. CAR의 특성화는 MHC-제한 (TCR-모방 항체의 경우) 또는 비-MHC-제한 (세포 표면 단백질에 대한 항체의 경우) 방식으로 단클론 항체의 항원-결합 특성을 이용하여 선택된 표적에 대한 면역 세포 (예컨대, T 세포 또는 NK 세포) 특이성 및 반응성을 재지시하는 능력을 포함한다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 면역 세포 (예컨대, T 세포 또는 NK 세포)에 항원 가공과 무관하게 항원을 인식하는 능력을 제공하여, 종양 탈출의 주요 메커니즘을 우회한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 CAR은 본원에 기재된 항-MUC16 항체 모이어티 중 임의의 것에 따른 항-MUC16 항체 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티를 포함하는 항-MUC16 CAR을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 CAR의 항-MUC16 항체 모이어티는 a) 서열번호 4 또는 5를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 b) 서열번호 2 또는 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 CAR은 서열번호 80-83 또는 97-99 중으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 CAR의 항-MUC16 항체 모이어티는 a) 서열번호 22 또는 23을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 b) 서열번호 20 또는 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 22 또는 23의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 20 또는 21의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 CAR은 서열번호 84-87 또는 100-103 중으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 T 세포 수용체 (TCR) 막관통 도메인을 포함하는 항-MUC16 키메라 수용체이다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 PCT 특허 출원 공개공보 WO2017070608호에 기재된 바와 같은 항체-T 세포 수용체 (abTCR)이며, 이의 개시내용은 본 기술에 사용하기 위해 및 본원의 하나 이상의 청구범위에 포함되기 위해 본원에 명시적으로 원용된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 abTCR은 본원에 기재된 항-MUC16 항체 모이어티 중 임의의 것에 따른 항-MUC16 항체 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티를 포함하는 항-MUC16 abTCR을 제공한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 abTCR의 항-MUC16 항체 모이어티는 a) 서열번호 4 또는 5를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 b) 서열번호 2 또는 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 abTCR의 중쇄 가변 도메인은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 abTCR의 항-MUC16 항체 모이어티는 a) 서열번호 22 또는 23을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 b) 서열번호 20 또는 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 abTCR의 중쇄 가변 도메인은 서열번호 22 또는 23의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 20 또는 21의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 MUC16에 특이적으로 결합하는 항-MUC16 항체 모이어티 및 공동-자극 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 공동-자극 수용체이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 MUC16에 결합시 기능적으로 발현되는 표면 상의 면역 세포를 자극할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 기능적 일차 면역 세포 시그널링 서열이 결여되어 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 임의의 일차 면역 세포 시그널링 서열이 결여되어 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 항-MUC16 항체 모이어티, 막관통 도메인 및 공동-자극 시그널링 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄는 함께 항-MUC16 항체 모이어티, 막관통 모듈, 및 공동-자극 시그널링 도메인을 포함하는 공동-자극 시그널링 모듈을 형성한다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄는 별도의 폴리펩티드 쇄이고, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 다합체, 예컨대, 이량체이다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄는 예컨대, 펩티드 연결에 의해, 또는 다른 화학적 연결, 예컨대, 디설파이드 연결에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄는 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 모이어티는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv (scFv)이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 scFv는 서열번호 53-68 중 어느 하나로부터 선택된 서열을 포함한다.
본 기술의 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체에 사용하기 위한 공동-자극 면역 세포 시그널링 도메인의 예는 키메라 수용체 (예컨대, CAR 또는 abTCR)와 협력하여 작용하여, 키메라 수용체 관여(engagement) 후 신호 전달을 개시할 수 있는 T 세포 수용체 (TCR)의 공동-수용체의 세포질 서열뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체, 및 동일한 기능적 역량을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전 활성화에 불충분하며, 이차 또는 공동-자극 신호가 또한 요구된다는 것이 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 2 개의 별개의 부류의 세포내 시그널링 서열인, TCR을 통해 항원-의존적 일차 활성화를 개시하는 서열 (본원에서 "일차 면역 세포 시그널링 서열"로서 지칭됨) 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여, 이차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 서열 (본원에서 "공동-자극 면역 세포 시그널링 서열"로서 지칭됨)에 의해 매개된다고 할 수 있다.
자극 방식으로 작용하는 일차 면역 세포 시그널링 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로서 알려진 시그널링 모티프를 함유할 수 있다. ITAM-함유 일차 면역 세포 시그널링 서열의 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. "기능적" 일차 면역 세포 시그널링 서열은 적절한 수용체에 대해 작동가능하게 커플링될 때, 면역 세포 활성화 신호를 전달할 수 있는 서열이다. 일차 면역 세포 시그널링 서열의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있는 "비-기능적" 일차 면역 세포 시그널링 서열은 면역 세포 활성화 신호를 전달할 수 없다. 본원에 기재된 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 기능적 일차 면역 세포 시그널링 서열, 예컨대, ITAM을 포함하는 기능적 시그널링 서열이 결여되어 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 임의의 일차 면역 세포 시그널링 서열이 결여되어 있다.
공동-자극 면역 세포 시그널링 서열은 예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한 공동-자극 분자의 세포내 도메인의 일부일 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체의 항-MUC16 항체 모이어티는 a) 서열번호 4 또는 5를 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 b) 서열번호 2 또는 3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체의 항-MUC16 항체 모이어티는 a) 서열번호 22 또는 23을 포함하는 중쇄 가변 도메인; 및 b) 서열번호 20 또는 21을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 중쇄 가변 도메인은 서열번호 22 또는 23의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상 (예를 들어, 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 중 임의의 것)의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하며, 경쇄 가변 도메인은 서열번호 20 또는 21의 아미노산 서열, 또는 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 면역 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체는 다른 키메라 수용체를 발현하는 면역 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에 있어서, 다른 키메라 수용체는 CAR 또는 abTCR이다. 일부 실시양태에 있어서, 다른 키메라 수용체는 MUC16에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 다른 키메라 수용체는 MUC16에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, 다른 키메라 수용체는 MUC16의 높은 발현 및/또는 높은 호기성 해당과정을 특성화하는 암과 연관된 항원에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 다른 키메라 수용체는 본원에 기재된 임의의 암 중 임의의 것 (예컨대, 신장암, 자궁경부암, 전립선암, 유방암, 결장암, 뇌암 또는 췌장암)과 연관된 항원에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 다른 키메라 수용체는 신장암과 연관된 항원에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 신장암은 콩팥 세포 암종 (RCC)이다. 일부 실시양태에 있어서, RCC는 전이성 RCC이다. 일부 실시양태에 있어서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에 있어서, 면역 세포에서 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체의 발현은 유도성이다. 일부 실시양태에 있어서, 면역 세포에서 항-MUC16 키메라 공동-자극 수용체의 발현은 다른 키메라 수용체를 통한 시그널링시 유도성이다.
결합 친화도
결합 친화도는 Kd, Koff, Kon 또는 Ka로 표시될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Koff"는 동역학 선택 설정으로부터 결정된 바와 같이 항체 약제/항원 복합체로부터 항체 약제의 해리에 대한 오프(off)-속도 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Kon"은 항체 약제/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 항체 약제의 회합에 대한 온(on)-속도 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 평형 해리 상수 "Kd"는 특정 항체 약제-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하고, 평형에서 항체 약제 분자의 용액에 존재하는 모든 항체-결합 도메인 중 절반을 채우기 위해 요구되는 항원의 농도를 기재하며, Koff/Kon와 동등하다. Kd의 측정은 모든 결합제가 용액 중에 있다고 상정한다. 예컨대, 효모 발현 시스템에서 항체 약제가 세포 벽에 결속되는 경우, 상응하는 평형 속도 상수는 EC50으로서 표현되고, 이는 Kd의 양호한 근사치를 제공한다. 친화도 상수 Ka는 해리 상수 Kd의 역수이다.
해리 상수 (Kd)는 항원에 대한 항체 모이어티의 친화도를 나타내는 지표로서 사용된다. 예를 들어, 다양한 마커 약제로 마킹된 항체 약제를 사용한 스캐차드 (Scatchard) 방법에 의해뿐만 아니라, Biacore (Amersham Biosciences에 의해 제조됨), 사용자 매뉴얼 및 첨부된 키트에 따른 표면 플라즈몬 공명에 의한 생체분자 상호작용의 분석을 사용함으로써 용이한 분석이 가능하다. 이들 방법을 사용하여 유래될 수 있는 Kd 값은 M (몰)의 유닛으로 표현된다. 표적에 특이적으로 결합하는 항체 약제는 예를 들어, ≤ 10-7 M, ≤ 10-8 M, ≤ 10-9 M, ≤ 10-10 M, ≤ 10-11 M, ≤ 10-12 M 또는 ≤ 10-13 M의 Kd를 가질 수 있다.
항체 약제의 결합 특이성은 당업계에 알려진 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-, EIA-, BIAcore-테스트 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 항-MUC16 항체 약제의 결합 친화도는 표면 상에 MUC16을 발현하는 세포 (예컨대, HepG2 세포)에 대한 항-MUC16 항체 약제의 결합 친화도를 테스트함으로써 측정된다
일부 실시양태에서, 항-MUC16 항체 약제는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M (예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)의 Kd로 표적 MUC16 (예컨대, nMUC16)에 특이적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 항-nMUC16 항체 약제 및 nMUC16 사이의 결합의 Kd, 항-sMUC16 항체 약제 및 sMUC16 사이의 결합의 Kd, 또는 항-MUC16 항체 약제 및 MUC16 (임의의 포맷) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 1×10-7 M 내지 약 5×10-13 M, 약 10-7 M 내지 약 10-12 M, 약 10-7 M 내지 약 10-11 M, 약 10-7 M 내지 약 10-10 M, 약 10-7 M 내지 약 10-9 M, 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 약 1×10-8 M 내지 약 5×10-13 M, 약 10-8 M 내지 약 10-12 M, 약 10-8 M 내지 약 10-11 M, 약 10-8 M 내지 약 10-10 M, 약 10-8 M 내지 약 10-9 M, 약 5×10-9 M 내지 약 1×10-13 M, 약 5×10-9 M 내지 약 1×10-12 M, 약 5×10-9 M 내지 약 1×10-11 M, 약 5×10-9 M 내지 약 1×10-10 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-12 M, 약 10-9 M 내지 약 10-11 M, 약 10-9 M 내지 약 10-10 M, 약 5×10-10 M 내지 약 1×10-13 M, 약 5×10-10 M 내지 약 1×10-12 M, 약 5×10-10 M 내지 약 1×10-11 M, 약 10-10 M 내지 약 10-13 M, 약 1×10-10 M 내지 약 5×10-13 M, 약 1×10-10 M 내지 약 1×10-12 M, 약 1×10-10 M 내지 약 5×10-12 M,약 1×10-10 M 내지 약 1×10-11 M, 약 10-11 M 내지 약 10-13 M, 약 1×10-11 M 내지 약 5×10-13 M, 약 10-11 M 내지 약 10-12 M, 또는 약 10-12 M 내지 약 10-13 M이다. 일부 실시양태에서, 항-nMUC16 항체 약제 및 nMUC16 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 및 비-표적 사이의 결합의 Kd는 항-MUC16 항체 약제 및 표적 사이의 결합의 Kd를 초과하며, 본원에서 일부 실시양태에 있어서, 표적 (예컨대, 세포 표면-결합된 MUC16)에 대한 항-MUC16 항체 약제의 결합 친화도가 비-표적에 대한 것에 비해 크다는 것으로서 지칭된다. 일부 실시양태에 있어서, 비-표적은 MUC16이 아닌 항원이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 (nMUC16에 대한 것) 및 비-MUC16 표적 사이의 결합의 Kd는 항-MUC16 항체 약제 및 표적 MUC16 사이의 결합의 Kd의 약 10 배 이상, 예컨대, 약 10-100 배, 약 100-1000 배, 약 103-104 배, 약 104-105 배, 약 105-106 배, 약 106-107 배, 약 107-108 배, 약 108-109 배, 약 109-1010 배, 약 1010-1011 배, 또는 약 1011-1012 배일 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M (예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)의 Kd로 비-표적에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 비-표적은 MUC16이 아닌 항원이다. 따라서, 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 및 비-MUC16 표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 1 x 10-1 M 내지 약 5 x 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 약 1×10-1 M 내지 약 5×10-5 M, 약 10-1 M 내지 약 10-4 M, 약 1×10-1 M 내지 약 5×10-4 M, 약 10-1 M 내지 약 10-3 M, 약 1×10-1 M 내지 약 5×10-3 M, 약 10-1 M 내지 약 10-2 M, 약 10-2 M 내지 약 10-6 M, 약 1×10-2 M 내지 약 5×10-6 M, 약 10-2 M 내지 약 10-5 M, 약 1×10-2 M 내지 약 5×10-5 M, 약 10-2 M 내지 약 10-4 M, 약 1×10-2 M 내지 약 5×10-4 M, 약 10-2 M 내지 약 10-3 M, 약 10-3 M 내지 약 10-6 M, 약 1×10-3 M 내지 약 5×10-6 M, 약 10-3 M 내지 약 10-5 M, 약 1×10-3 M 내지 약 5×10-5 M, 약 10-3 M 내지 약 10-4 M, 약 10-4 M 내지 약 10-6 M, 약 1×10-4 M 내지 약 5×10-6 M, 약 10-4 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-5 M 내지 약 10-6 M이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제가 표적 MUC16 (예컨대, 세포 표면-결합된 MUC16)을 높은 결합 친화도로 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 비-표적에 결합하는 것을 언급할 때, 항-MUC16 항체 약제는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M (예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)의 Kd로 표적 MUC16 (예컨대, 세포 표면-결합된 MUC16)에 결합할 것이며, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M (예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)의 Kd로 비-표적에 결합할 것이다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제가 세포 표면-결합된 MUC16을 특이적으로 인식하는 것을 언급할 때, 항-MUC16 항체 약제의 결합 친화도는 대조군 항-MUC16 항체 약제와 비교된다. 일부 실시양태에 있어서, 대조군 항-MUC16 항체 약제 및 세포 표면-결합된 MUC16 사이의 결합의 Kd는 본원에 기재된 항-nMUC16 항체 약제 및 세포 표면-결합된 MUC16 사이의 결합의 Kd의 약 2 배 이상, 예컨대, 약 2 배, 약 3 배, 약 4 배, 약 5 배, 약 6 배, 약 7 배, 약 8 배, 약 9 배, 약 10 배, 약 10-100 배, 약 100-1000 배, 약 103-104 배, 약 104-105 배, 약 105-106 배, 약 106-107 배, 약 107-108 배, 약 108-109 배, 약 109-1010 배, 약 1010-1011 배, 또는 약 1011-1012 배일 수 있다.
항-Muc16 항체 약제의 기능적 활성
특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 MUC16 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하는 세포의 인 비트로 마트리겔 침윤을 억제한다. 일부 실시양태에 있어서, MUC16은 서열번호 44 (MUC16 c114)를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 글리코실화된 MUC16 c114를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이다. 특정 실시양태에 있어서, MUC16 폴리펩티드는 글리코실화된다. 특정 실시양태에 있어서, MUC16 폴리펩티드의 글리코실화된 형태는 아미노산 잔기 Asn30 (성숙 MUC16 (서열번호 1)의 Asn1806에 상응함)에서 N-글리코실화된다. 특정 실시양태에 있어서, MUC16 폴리펩티드는 아미노산 잔기 Asn24 및 Asn30 (성숙 MUC16 (서열번호 1)의 Asn1800 및 Asn1806에 각각 상응함)에서 N-글리코실화된다. 특정 실시양태에 있어서, MUC16 폴리펩티드는 서열번호 44의 아미노산 잔기 Asn1, Asn24 및 Asn30 (Yin and Lloyd (2001) J Biol Chem 276: 27371-27375에서 각각 Asn1777, Asn1800 및 Asn1806으로서 또한 지칭됨)에서 N-글리코실화된다. 특정 실시양태에 있어서, 글리코실화는 N-연결된 키토바이오스(chitobiose)를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 글리코실화는 N-연결된 키토바이오스로 이루어진다. 특정 실시양태에 있어서, 마트리겔 침윤은 세포가 대조군 항체 (예컨대, 표적 MUC16이 아닌 항체)로 처리된 세포의 인 비트로 마트리겔 침윤과 비교하여 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10-배 이상 억제된다. 특정 실시양태에 있어서, 마트리겔 침윤은 세포가 대조군 항체 (예컨대, 표적 MUC16이 아닌 항체)로 처리된 세포의 인비트로 마트리겔 침윤과 비교하여 약 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10-배 억제된다.
MUC16 항-MUC16 항체 약제 또는 마트리겔 침윤의 항원-결합 단편-매개된 억제를 결정하기 위한 검정은 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, BD BioCoat™ Matrigel™ 침윤 삽입물 또는 챔버 (24 웰 플레이트 중 카탈로그 # 354480) 및 대조 삽입물 (24 웰 플레이트 중 카탈로그 # 354578)은 BD Biosciences, MA로부터 구매할 수 있다. 마트리겔 침윤 검정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행될 수 있다. 간단히 말해서, 24 웰 플레이트 중 마트리겔 챔버 (-20℃에서 저장됨) 및 대조군 삽입물 (4℃에서 저장됨)을 실온이 되게 한다. 두 삽입물은 37℃ 5% CO2 가습된 항온처리기에서 2 시간 동안, 삽입물뿐만 아니라 24 웰 플레이트의 외부 웰에서 0.5 mL의 무혈청 배지로 재수화된다. 배양된 SKOV3 세포는 트립신화되고, 배양 배지로 세척된다. 백만 개의 세포는 다른 원심분리 튜브에 분리되고, 무혈청 배지로 3 회 세척된다. 이들 세포는 나중에 0.5 mL 무혈청 배지 중 5,000 개의 세포를 제공하도록 조정된다. 재수화된 삽입물 중의 배지를 제거하고, 삽입물을 화학유인물질로서 작용하는 웰 중 배양 배지를 함유한 10% 소 태아 혈청 (FBS) 0.75 mL를 함유하는 새로운 24 웰 플레이트로 옮겼다. 즉시, 무혈청 배지 중 세포 (5,000 개의 세포) 0.5 mL가 삽입물에 첨가된다. 적절한 주의를 기울여, 삽입물 및 외부 웰에 포집된 기포가 없는 것을 관찰한다. 24 웰 플레이트는 37℃ 5% C02 가습된 항온처리기에서 48 시간 동안 항온처리된다. 항온처리 후, 마트리겔 또는 대조군 삽입물에 면 선단의 면봉을 삽입함으로써 "스크러빙(scrubbing)"에 의해 막의 상부 표면으로부터 비-침윤성 세포를 제거하고, 막 표면 상의 면봉의 선단을 움직이면서 부드럽게 압력을 인가한다. 스크러빙은 배지로 적신 제2 면봉으로 반복된다. 이어서, 삽입물은 증류수 중 0.5% 크리스탈 바이올렛 염색제 0.5 mL를 함유한 새로운 24 웰 플레이트에서 30 분 동안 염색된다. 염색 후, 삽입물은 3 비커의 증류수에서 세정되어, 과량의 염색제를 제거한다. 삽입물은 새로운 24 웰 플레이트에서 공기 건조된다. 침윤된 세포는 200x 배율의 도립 현미경 하에서 수작업 카운팅된다. 삼중막의 몇몇 필드를 카운팅하고 도면에 기록되었다.
특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 마우스 모델 연구에서 전이를 억제 또는 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 퇴행을 유도할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포주는 무흉선 누드 마우스에 도입될 수 있으며, 무흉선 마우스에 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편을 1 회 이상 투여할 수 있고, 주사된 종양 세포의 종양 진행은 수주 및/또는 수개월의 기간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 일부 경우에 있어서, 무흉선 누드 마우스에 대한 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 투여는 종양 세포주의 도입 전에 발생할 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, MUC16 c114를 발현하는 SKOV3 세포가 본원에 기재된 마우스 이종이식 모델에 활용된다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 모의-처치된 마우스와 비교하여, 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 방법에 의해 판정된 바와 같이 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 또는 100%만큼 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하거나 종양 퇴행을 유도한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 모의-처치된 마우스와 비교하여, 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 방법에 의해 판정된 바와 같이 약 25% 또는 35% 이상, 내지 임의로 약 75%만큼 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하거나 종양 퇴행을 유도한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 모의-처치된 마우스와 비교하여, 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 방법에 의해 판정된 바와 같이 약 1 배, 1.2 배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 3.5 배, 4 배, 4.5 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 15 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배 또는 100 배 이상만큼 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하거나 종양 퇴행을 유도한다. 모의-처치된 마우스는 예를 들어, 포스페이트 완충 식염수 또는 대조군 (예컨대, 항-IgG 항체)으로 처리될 수 있다.
종양 성장 억제 또는 종양 퇴행을 결정하는 것은 예를 들어, 촉지가능한 종양의 물리적 측정 또는 다른 시각적 검출 방법에 의해, 기간에 걸쳐 종양 크기를 모니터링함으로써 판정될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포주는 시각화제, 예컨대, 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 루시퍼라제를 재조합적으로 발현하도록 생성될 수 있으며, 이어서, GFP의 인 비보 시각화는 현미경에 의해 수행될 수 있고, 루시퍼라제의 인 비보 시각화는 이종이식 마우스에 루시퍼라제 기질을 투여하고 루시퍼라제 기질을 처리하는 루시퍼라제 효소로 인한 발광을 검출함으로써 수행될 수 있다. GFP 또는 루시퍼라제의 검출의 정도 또는 수준은 이종이식 마우스에서 종양의 크기와 상관관계가 있다.
특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 모의-처치된 마우스와 비교하여 종양 이종이식 모델에서 동물의 생존을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 모의-처치된 마우스와 비교하여, 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 방법에 의해 판정된 바와 같이 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상만큼 종양 이종이식 모델에서 마우스의 생존을 증가시킨다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 종양 이종이식 모델에서 모의-처치된 마우스와 비교하여, 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 방법에 의해 판정된 바와 같이 약 25% 또는 35% 이상, 내지 임의로 약 75%만큼 종양 이종이식 모델에서 마우스의 생존을 증가시킨다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 종양 이종이식 모델에서 모의-처치된 마우스와 비교하여, 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 방법에 의해 판정된 바와 같이 약 1 배, 1.2 배, 1.3 배, 1.4 배, 1.5 배, 2 배, 2.5 배, 3 배, 3.5 배, 4 배, 4.5 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 15 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배 또는 100 배 이상만큼 종양 이종이식 모델에서 마우스의 생존을 증가시킨다. 생존은 예를 들어, 종양 세포주 주사 후 시간 (예컨대, 일 또는 주)에 대한 생존 마우스의 수의 생존 곡선을 플롯팅함으로써 결정될 수 있다. 모의-처치된 마우스는 예를 들어, 포스페이트 완충 식염수 또는 대조군 (예컨대, 항-IgG 항체)으로 처리될 수 있다.
특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은, 세포와 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편과의 접촉시 MUC16 폴리펩티드를 발현하는 세포에 내재화된다. "내재화되는" 또는 "내재화"는 세포에 의해 내재화되는 분자와 관련하는 경우, 세포막의 세포내 표면으로 및/또는 세포 세포질로 세포막을 가로지르는 세포막의 세포외 표면과 접촉하는 분자의 통과를 지칭한다. 특정 실시양태에 있어서, 글리코실화된 MUC16 c114를 재조합적으로 발현하는 세포는 SKOV3 세포이다. 특정 실시양태에 있어서, MUC16 c114의 글리코실화된 형태는 예컨대, 서열번호 44의 Asnl, Asn24 및 Asn30 (Yin and Lloyd (2001) J Biol Chem 276: 27371-27375에서 각각 Asn1777, Asn1800 및 Asn1806으로서 또한 지칭됨)에서 N-글리코실화된다. 특정 실시양태에 있어서, 글리코실화는 N-연결된 키토바이오스를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 글리코실화는 N-연결된 키토바이오스로 이루어진다.
예를 들어, 방사성표지된 항체를 사용하여 세포에 대한 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 내재화를 결정하기 위한 검정이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 89Zr-표지된 항체의 내재화는 MUC16 c114를 발현하는 SKOV3 세포에 대해 조사될 수 있다. 간단히 말해서, 대략 1 x 105 개의 세포가 12-웰 플레이트에 씨딩되고, 밤새 37℃ 5% CO2 항온처리기에서 항온처리된다. 하나의 부피의 방사성표지된 단백질이 각각의 웰에 첨가되고, 플레이트가 37℃ 및 4℃에서 1, 5, 12 및 24 시간 동안 항온처리된다. 각각의 항온처리 기간 후, 배지가 수집되고, 세포는 1 mL의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 세정된다. 표면-결합된 활성은 4℃에서 100 mM의 글리신을 갖는 100 mM 아세트산 (1:1, pH 3.5) 1 mL에서 세포를 세척함으로써 수집된다. 이어서, 부착 세포는 1 mL의 1 M NaOH로 용해된다. 각각의 세척물이 수집되고, 활성에 대해 카운팅된다. 모든 세척물의 총 활성에 대한 최종 세척물의 활성의 비는 내재화된 %를 결정하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에 있어서, 검정은 37℃에서 수행된다. 특정 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편과 항온처리된 세포의 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 이상에서 내재화된다. 특정 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편과 항온처리된 세포의 약 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%에서 내재화된다. 특정 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은, 세포를 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시킨지 1, 2, 3, 4, 8, 12, 16, 20 또는 24 시간 이내에 내재화된다.
핵산
항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편 (예컨대, 항-MUC16 항체, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체)을 코딩 하는 핵산 분자가 또한 고려된다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 전장 항-MUC16 항체 중 임의의 것 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한 전장 항-MUC16 항체를 코딩하는 핵산 (또는 핵산의 세트)을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제를 코딩하는 핵산 (또는 핵산의 세트)은 펩티드 태그 (예컨대, 단백질 정제 태그, 예컨대, His-태그, HA 태그)를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본원에서 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제를 포함하는 단리된 숙주 세포, 항-MUC16 항체 약제의 폴리펩티드 구성요소를 코딩하는 단리된 핵산, 또는 항-MUC16 항체 약제의 폴리펩티드 구성요소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 고려된다.
본 출원은 또한 이들 핵산 서열에 대한 변이체를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 적어도 적당히 엄격한 혼성화 조건 하에서 본 출원의 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 항-MUC16 항체, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체), 이의 항원-결합 단편 또는 항-MUC16 항체 모이어티를 코딩하는 핵산 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 기술은 또한, 본 기술의 핵산이 삽입되는 벡터를 제공한다.
간단히 요약하면, 항-MUC16 항체 약제를 코딩하는 자연적 또는 합성 핵산에 의한 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편의 발현은 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하여, 핵산이 예를 들어, 프로모터 (예컨대, 림프구-특이적 프로모터) 및 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함한 5' 및 3' 조절 요소에 작동가능하게 연결됨으로써 달성될 수 있다. 벡터는 진핵 숙주 세포에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 및 발현 벡터는 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
본 기술의 핵산은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용한 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 그 전체가 본원에 참조로 원용되는, 미국특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호를 참고한다. 일부 실시양태에 있어서, 본 기술은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 다수의 유형의 벡터에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 비제한적으로, 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하는 벡터에 클로닝될 수 있다. 특히 관심 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Green and Sambrook (2013, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 하나 이상의 유기체에서 기능적인 복제 원점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다 (예컨대, WO 01/96584호; WO 01/29058호; 및 미국특허 제6,326,193호 참고).
다수의 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 벡터에 삽입되고 레트로바이러스 입자에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 인 비보 또는 엑스 비보에서 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에 있어서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다. 일부 실시양태에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 장기적 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구이며, 이는 이들이 트랜스진의 장기적이고 안정한 통합 및 딸 세포에서 이의 증식을 허용하기 때문이다. 렌티바이러스 벡터는 비-증식 세포, 예컨대, 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대, 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 부가된 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 부가된 이점을 갖는다.
추가적인 프로모터 요소, 예컨대, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 30-110 bp 업스트림 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터는 최근 출발 부위의 다운스트림에 또한 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터 요소 사이의 공간은 자주 가요성이어서, 프로모터 기능은 요소가 다른 것에 대해 역전되거나 이동될 때 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 공간은 활성이 저하하기 시작하기 전에 50 bp 떨어져 증가될 수 있다.
적합한 프로모터의 일 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 신장 성장 인자-1α (EF-1α)이다. 그러나, 비제한적으로, 시미안 바이러스 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대, 비제한적으로, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함한 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 기술은 구성적 프로모터의 사용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 기술의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현을 원할 때, 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 발현을 원하지 않을 때, 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제의 발현은 유도성이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제를 코딩하는 핵산 서열은 본원에 기재된 임의의 유도성 프로모터를 포함한 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
유도성 프로모터
유도성 프로모터의 사용은 발현을 원할 때, 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 발현을 원하지 않을 때, 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 진핵 세포에 사용하기 위한 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 호르몬-조절된 요소 (예컨대, Mader, S. and White, J. H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607 (1993) 참고), 합성 리간드-조절된 요소 (예컨대, Spencer, D. M. et al 1993) Science 262: 1019-1024 참고) 및 이온화 방사선-조절된 요소 (예컨대, Manome, Y. et al., Biochemistry 32: 10607-10613 (1993); Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1014- 10153 (1992) 참고)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 인 비트로 또는 인 비보 포유동물 시스템에 사용하기 위한 추가의 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 Gingrich et al., Annual Rev. Neurosci 21:377-405 (1998)에서 검토된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제를 발현하는 데 사용하기 위한 유도성 프로모터 시스템은 Tet 시스템이다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제를 발현하는 데 사용하기 위한 유도성 프로모터 시스템은 대장균(E. coli)으로부터의 lac 억제인자 시스템이다.
본 기술에서 사용하기 위한 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 Tet 시스템이다. 이러한 시스템은 Gossen et al., (1993)에 의해 기재된 Tet 시스템을 기반으로 한다. 예시적인 실시양태에 있어서, 관심 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 Tet 오퍼레이터 (TetO) 부위를 포함하는 프로모터의 제어 하에 있다. 비활성 상태에서, Tet 억제인자 (TetR)는 TetO 부위에 결합하고 프로모터로부터의 전사를 억압할 것이다. 활성 상태에서, 예컨대, 유도제, 예컨대, 테트라사이클린 (Tc), 무수테트라사이클린, 독시사이클린 (Dox), 또는 이의 활성 유사체의 존재 하에, 유도제는 TetO로부터 TetR의 방출을 야기하여, 전사가 일어나도록 한다. 독시사이클린은 1-디메틸아미노-2,4a,5,7,12-펜타하이드록시-11-메틸-4,6-디옥소-1,4a,11,11a,12,12a-헥사하이드로테트라센-3-카복사미드의 화학명을 갖는 항생제의 테트라사이클린 패밀리의 구성원이다.
일 실시양태에 있어서, TetR은 포유동물 세포, 예컨대, 뮤린 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 대부분의 아미노산은 유전 코드의 축퇴성으로 인해 하나 초과의 코돈에 의해 코딩되어, 핵산에 의해 코딩된 아미노산 서열에서 임의의 변경 없이, 주어진 핵산의 뉴클레오티드 서열에서 실질적인 변이를 허용한다. 그러나, 많은 유기체는 "코돈 편향"으로서 또한 알려진 코돈 용법에서 상이함 (즉, 주어진 아미노산에 대한 특정 코돈(들)의 사용에 대한 편향)을 나타낸다. 코돈 편향은 보통 특정 코돈에 대한 tRNA의 우세한 종의 존재와 상관관계가 있으며, 이는 결국 mRNA 번역의 효율을 증가시킨다. 따라서, 특정 유기체 (예컨대, 원핵생물)로부터 유래된 코딩 서열은 코돈 최적화를 통해 상이한 유기체 (예컨대, 진핵생물)에서 개선된 발현을 위해 맞추어질 수 있다.
Tet 시스템의 다른 특이적 변이는 다음의 "Tet-오프" 및 "Tet-온" 시스템을 포함한다. Tet-오프 시스템에서, 전사는 Tc 또는 Dox의 존재 하에 비활성이다. 해당 시스템에서, 단순 헤르페스 바이러스로부터의 VP16의 강력한 전사활성화 도메인에 융합된 TetR로 구성되는 테트라사이클린-제어된 전사활성인자 단백질 (tTA)은 테트라사이클린-반응성 프로모터 요소 (TRE)의 전사 제어 하에 있는 표적 핵산의 발현을 조절한다. TRE는 프로모터 (일반적으로 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 즉시-초기 프로모터로부터 유래된 최소의 프로모터 서열)에 융합된 TetO 서열 콘카타머(concatamer)로 만들어진다. Tc 또는 Dox의 부재 하에, tTA는 TRE에 결합하며, 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. Tc 또는 Dox의 존재 하에, tTA는 TRE에 결합할 수 없으며, 표적 유전자로부터의 발현은 비활성으로 유지된다.
반대로, Tet-온 시스템에서, 전사는 Tc 또는 Dox의 존재 하에 활성이다. Tet-온 시스템은 역 테트라사이클린-제어된 전사활성인자, rtTA를 기반으로 한다. tTA와 같이, rtTA는 TetR 억제인자 및 VP16 전사활성화 도메인으로 구성된 융합 단백질이다. 그러나, TetR DNA 결합 모이어티에서의 4 개의 아미노산 변화는 rtTA의 결합 특성화를 변경하여, Dox의 존재 하에 표적 트랜스진의 TRE에서 tetO 서열만 인식할 수 있도록 한다. 따라서, Tet-온 시스템에서, TRE-조절된 표적 유전자의 전사는 Dox의 존재 하에서만 rtTA에 의해 자극된다.
다른 유도성 프로모터 시스템은 대장균으로부터의 lac 억제인자 시스템이다 (Brown et al., Cell 49:603-612 (1987) 참고). lac 억제인자 시스템은 lac 오퍼레이터 (lacO)를 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절함으로써 기능한다. lac 억제인자 (lacR)는 LacO에 결합하므로, 관심 폴리뉴클레오티드의 전사를 방지한다. 관심 폴리뉴클레오티드의 발현은 적합한 유도제, 예컨대, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)에 의해 유도된다.
폴리펩티드 또는 이의 일부의 발현을 판정하기 위해, 세포에 도입될 발현 벡터는 또한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 형질주입되거나 감염시키려는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 식별 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 다른 양태에 있어서, 선택가능한 마커는 DNA의 별도의 조각에 운반될 수 있으며, 공동-형질주입 절차에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두는 적절한 조절 서열과 플랭킹되어, 숙주 세포에서 발현을 가능하게 할 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는 예를 들어, 항생제-저항성 유전자, 예컨대, neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질주입된 세포를 식별하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고 발현이 일부 쉽게 검출가능한 특성, 예컨대, 효소적 활성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포에 도입된 이후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다 (예컨대, Ui-Tel et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 알려진 기술을 사용하여 제조되거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 나타내는 최소의 5' 플랭킹 영역을 갖는 작제물은 프로모터로서 식별된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-구동된 전사를 조정하는 능력에 대해 약제를 평가하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 전장 항-MUC16 항체 중 임의의 것에 따른 전장 항-MUC16 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 핵산은 전장 항-MUC16 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 핵산 서열 각각은 별도의 벡터에 함유된다. 일부 실시양태에 있어서, 핵산 서열의 적어도 일부는 동일한 벡터에 함유된다. 일부 실시양태에 있어서, 핵산 서열 전부는 동일한 벡터에 함유된다. 벡터는 예를 들어, 포유동물 발현 벡터 및 바이러스 벡터 (예컨대, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스로부터 유래된 것들)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
유전자를 세포에 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예컨대, 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법은 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 유전자총, 미세주사법 및 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Green and Sambrook (2013, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)을 참고한다. 일부 실시양태에 있어서, 숙주 세포로의 폴리뉴클레오티드의 도입은 칼슘 포스페이트 형질주입에 의해 수행된다.
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예컨대, 인간 세포에 삽입하는 가장 광범위하게 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 1, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참고한다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대, 매크로분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수-중-유 에멀젼, 미셀, 혼합된 미셀 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 포함한다. 인 비트로 및 인 비보 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예컨대, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 활용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제형의 사용은 숙주 세포로의 핵산의 도입 (인 비트로, 엑스 비보 또는 인 비보)에 고려된다. 다른 양태에 있어서, 핵산은 지질과 연관될 수 있다. 지질과 연관된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 연관된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중 현탁액으로서 함유되거나, 미셀에 함유되거나 이와 복합체화되거나, 이와 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관된 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "압괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중 산재되어, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라, 장-쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체를 함유하는 화합물 부류, 예컨대, 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드를 포함한다.
숙주 세포에 외인성 핵산을 도입하거나 이와 달리 본 기술의 억제제에 세포를 노출시키기 위해 사용된 방법에 관계 없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 검정, 예컨대, 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예컨대, 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯) 또는 본 기술의 범주 내에 속하는 약제를 식별하기 위한 본원에 기재된 검정에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
항-MUC16 항체 약제 및 항-MUC16 항체 모이어티의 제조
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 단클론 항체이거나 단클론 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 단클론 항체로부터의 VH 및 VL 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 단클론 항체로부터의 CH1 및 CL 도메인, 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 단클론 항체는 예컨대, 하이브리도마 방법, 파지 디스플레이 방법을 포함한 당업계에 알려진 방법을 사용하거나, 재조합 DNA 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 추가적으로, 예시적인 파지 디스플레이 방법이 본원 및 하기 실시예에 기재된다.
하이브리도마 방법에서, 햄스터, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역제로 면역화되어, 면역제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 대안적으로, 림프구는 인 비트로에서 면역화될 수 있다. 면역제는 관심 단백질의 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간 기원의 세포를 원하는 경우, 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원을 원하는 경우, 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화된 세포주와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다. 불멸화된 세포주는 보통 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 보통, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주가 이용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화된 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 부모 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 ("HAT 배지"), 이는 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시양태에 있어서, 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의해 항체의 안정한 고-수준 발현을 지지하고, 배지, 예컨대, HAT 배지에 대해 민감하다. 일부 실시양태에 있어서, 불멸화된 세포주는 뮤린 골수종 세포주이며, 이는 예를 들어, 살크 연구소 세포 분배소(Salk Institute Cell Distribution Center), San Diego, California 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection), Manassas, Virginia로부터 수득될 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단클론 항체의 생산을 위해 기재되었다.
이어서, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지는 폴리펩티드에 대해 지시된 단클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 단클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해 또는 인 비트로 결합 검정, 예컨대, 방사성면역검정 (RIA) 또는 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 기술 및 검정은 당업계에 알려져 있다. 단클론 항체의 결합 친화도는 예를 들어, Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)의 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 식별한 후, 클론은 희석 절차를 제한함으로써 서브 클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 위에 언급된, Goding. 이 목적을 위한 적합한 배양 배지는 예를 들어, 둘베코 변형된 이글스 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유류의 복수로서 인 비보에서 성장될 수 있다.
서브 클론에 의해 분비된 단클론 항체는 예를 들어, 종래의 면역글로불린 정제 절차, 예컨대, 단백질 A-Sepharose, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 중 임의의 것에 따르면, 항-MUC16 항체 약제는 항체 라이브러리 (예컨대, scFv 또는 Fab 단편을 제시하는 파지 라이브러리)로부터 선택된 클론으로부터의 서열을 포함한다. 클론은 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체 단편에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 식별될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성화를 보유하는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 이러한 방법은 예컨대, Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)에서 검토되고 예컨대, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 기재된 바와 같이 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별도로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되며, 이는 이어서 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 scFv 단편 또는 Fab 단편과 같은 항체 단편을 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마 작제의 요구 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 의해 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기-항원에 대해 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 (예컨대, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 최종적으로, 나이브 라이브러리는 또한 Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비재배열된 V-유전자를 클로닝하는 것, 및 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도의 가변 CDR3 영역을 코딩하고 인 비트로에서 재배열을 달성하는 것에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개공보는 예를 들어, 미국특허 제5,750,373호, 및 미국특허 공개공보 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호 및 제2009/0002360호를 포함한다.
항-MUC16 항체 약제는 표적 MUC16 (예컨대, nMUC16)에 대해 특이적인 항-MUC16 항체 모이어티에 대한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이를 사용하여 제조될 수 있다. 라이브러리는 1 x 109 이상 (예컨대, 약 1 × 109, 2.5 × 109, 5 × 109, 7.5 × 109, 1 × 1010, 2.5 × 1010, 5 × 1010, 7.5 × 1010 또는 1 × 1011 이상 중 임의의 것)의 고유 인간 항체 단편의 다양성을 갖는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 라이브러리는 모든 인간 중쇄 및 경쇄 서브패밀리를 포함하는, 건강한 공여자로부터의 인간 PMBC 및 비장으로부터 추출된 DNA로부터 작제된 나이브 인간 라이브러리이다. 일부 실시양태에 있어서, 라이브러리는 다양한 질환을 갖는 환자, 예컨대, 자가면역 질환을 갖는 환자, 암 환자, 및 감염성 질환을 갖는 환자로부터 단리된 PBMC로부터 추출된 DNA로부터 작제된 나이브 인간 라이브러리이다. 일부 실시양태에 있어서, 라이브러리는 반-합성 인간 라이브러리이며, 여기서 중쇄 CDR3은 완전히 무작위화되고, 모든 아미노산 (시스테인을 제외함)은 임의의 주어진 위치에 동등하게 존재할 가능성이 있다 (예컨대, Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005 참고). 일부 실시양태에 있어서, 반-합성 인간 라이브러리의 중쇄 CDR3은 약 5 내지 약 24 개 (예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 개 중 임의의 것)의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, 라이브러리는 완전-합성 파지 디스플레이 라이브러리이다. 일부 실시양태에 있어서, 라이브러리는 비-인간 파지 디스플레이 라이브러리이다.
높은 친화도로 표적 MUC16 (예컨대, nMUC16)에 결합하는 파지 클론은 고형 지지체 (예컨대, 예를 들어, 용액 패닝(panning)을 위한 비드 또는 세포 패닝을 위한 포유동물 세포)에 결합되고, 이어서 비-결합된 파지의 제거 및 특이적으로 결합된 파지의 용리가 이어지는, 표적 MUC16에 대한 파지의 되풀이되는 결합에 의해 선택될 수 있다. 이어서, 결합된 파지 클론은 용리되고 발현 및 정제를 위해 적절한 숙주 세포, 예컨대, 대장균 XL1-Blue를 감염시키는 데 사용된다. 세포 패닝의 예에서, 세포 표면 상의 HEK293 세포 과잉-발현 MUC16은 파지 라이브러리와 혼합되고, 이 후 세포가 수집되고, 결합된 클론이 용리되고 발현 및 정제를 위해 적절한 숙주 세포를 감염시키는 데 사용된다 (모두 실시예 참고). 패닝은 용액 패닝, 세포 패닝, 또는 둘 모두의 조합으로 다중 (예컨대, 약 2, 3, 4, 5 또는 6 회 이상 중 임의의 것) 라운드 동안 수행되어, 표적 MUC16에 특이적으로 결합하는 파지 클론이 풍부화될 수 있다. 풍부화된 파지 클론은 예를 들어, ELISA 및 FACS를 포함한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 표적 MUC16에 대한 특이적 결합에 대해 테스트될 수 있다.
단클론 항체는 또한 재조합 DNA 방법, 예컨대, 미국특허 제4,816,567호에 기재된 것들에 의해 제조될 수 있다. 본 기술의 단클론 항체를 코딩하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여 (예컨대, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함) 용이하게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 위에 기재된 바와 같은 하이브리도마 세포 또는 본 기술의 MUC16-특이적 파지 클론은 이러한 DNA의 공급원으로서 제공될 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터에 위치될 수 있으며, 이어서 이를 숙주 세포, 예컨대, 시미안 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포에 형질주입시켜, 재조합 숙주 세포에서 단클론 항체의 합성을 수득한다. DNA는 또한 예를 들어, 상동 비-인간 서열 대신 인간 중-쇄 및 경-쇄 불변 도메인 및/또는 프레임워크 영역에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (미국특허 제4,816,567호; 위에 언급된 Morrison et al.) 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 전부 또는 일부를 공유적으로 접합함으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 기술의 항체 약제의 불변 도메인으로 치환될 수 있거나, 본 기술의 항체 약제의 하나의 항원-조합 부위의 가변 도메인으로 치환될 수 있어, 키메라 2가 항체 약제를 생성할 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 포함한다. 중쇄는 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 절삭되어, 중-쇄 가교를 방지한다. 대안적으로, 관련 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되어, 가교를 방지한다.
인 비트로 방법이 또한 1가 항체를 제조하기에 적합하다. 항체의 이의 단편, 특히 Fab 단편을 생산하기 위한 소화는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)는 면역글로불린 불변-도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중-쇄 불변 도메인과의 것이다. 일부 실시양태에 있어서, 경-쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중-쇄 불변 영역 (CH1)은 융합체 중 하나 이상에 존재한다. 면역글로불린 중-쇄 융합 및 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입되고, 적합한 숙주 유기체에 공동-형질주입된다.
인간 및 인간화된 항체
항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편은 인간화된 항체 약제 또는 인간 항체 약제일 수 있다. 비-인간 (예컨대, 뮤린) 항체 모이어티의 인간화된 형태는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 전형적으로 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 이의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화된 항체 모이어티는, 수용자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 역량을 갖는 비-인간 종, 예컨대, 마우스, 랫트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기 (공여자 항체)로 대체되는 인간 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 이의 단편 (수용자 항체)을 포함한다. 일부 사례에 있어서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화된 항체 모이어티는 또한 수용자 항체뿐만 아니라 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 또한 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 하나 이상, 및 전형적으로 2 개의 가변 도메인 모두를 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것들과 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것들이다.
일반적으로, 인간화된 항체 약제는 비-인간인 공급원으로부터 이에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로서 지칭되며, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 일부 실시양태에 따르면, 인간화는 본질적으로 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환함으로써 Winter 및 공동-작업자들의 방법 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체 모이어티는 항체 모이어티 (미국특허 제4,816,567호)이며, 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 수가 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환되었다. 실제로, 인간화된 항체 모이어티는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능한 일부 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체 모이어티이다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체 모이어티가 생성될 수 있다. 예를 들어, 현재 면역화시 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 완전 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예컨대, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식-계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중-쇄 접합 영역 (JH) 유전자의 동형접합체 결실이 내인성 항체 생산의 완전 억제를 초래한다는 것이 기재되었다. 이러한 생식-계열 돌연변이체 마우스로의 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달은 항원 시험감염(challenge)시 인간 항체의 생산을 초래할 것이다. 예컨대, Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); 미국특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호; 제5,545,807호; 및 WO 97/17852호를 참고한다. 대안적으로, 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예컨대, 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 마우스에 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 시험감염시, 인간 항체 생산은 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 면에서 인간에서 볼 수 있는 것과 밀접하여 닮음이 관찰된다. 이 접근법은 예를 들어, 미국특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호, 및 Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)에 기재되어 있다.
인간 항체 약제는 또한 인 비트로 활성화된 B 세포에 의해 (미국특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참고) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당업계에 알려진 다양한 기술을 사용함으로써 생성될 수 있다. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Cole et al. 및 Boerner et al.의 기술이 또한 인간 단클론 항체의 제조에 이용가능하다. Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991).
항-MUC16 항체 약제 변이체
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 약제의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 약제의 아미노산 서열 변이체는 항체 약제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체 약제의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실 및/또는 이로의 삽입 및/또는 이의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특성화, 예컨대, 항원-결합을 보유한다면, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 최종 작제물에 도달하도록 만들어질 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항-MUC16 항체 약제 변이체를 제공한다. 치환 돌연변이유발에 대한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환을 관심 항체 약제에 도입하고, 원하는 활성, 예컨대, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 생산물을 스크리닝할 수 있다.
보존적 치환이 하기 표 3에 도시된다.
아미노산은 공통 측-쇄 특성에 따라 다음의 상이한 부류로 그룹화될 수 있다: 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 산성: Asp, Glu; 염기성: His, Lys, Arg; 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro; 및 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 포함한다.
예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙된 항체 약제이며, 이는 예컨대, 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간단히 말해서, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체 모이어티가 파지 상에 나타나고 특정 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변경 (예컨대, 치환)은 예컨대, 항체 친화도를 개선하기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예컨대, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) 참고), 및/또는 특이성 결정 잔기 (SDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 테스트된다. 이차 라이브러리로부터의 작제 및 재선택에 의한 친화도 성숙은 예컨대, Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기재되어 있다.
친화도 성숙의 일부 실시양태에 있어서, 다양한 방법 (예컨대, 에러-프론(error-prone) PCR, 쇄 셔플링(chain shuffling) 또는 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발) 중 임의의 것에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자에 다양성을 도입한다. 이어서, 이차 라이브러리를 생성한다. 그 다음, 라이브러리를 스크리닝하여, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 약제 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하며, 여기서 몇몇 HVR 잔기 (예컨대, 한번에 4-6 개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여된 HVR 잔기는 예컨대, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
일부 실시양태에 있어서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체 약제의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예컨대, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 위에 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 일부 실시양태에 있어서, 각각의 HVR은 비변경되거나, 1, 2 또는 3 개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체 약제의 잔기 또는 영역의 식별을 위해 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 칭한다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹 (예컨대, 하전된 잔기, 예컨대, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)이 식별되고 중성 또는 음성 하전된 아미노산 (예컨대, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체되어, 항체 약제와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 초기 치환에 대한 기능적 감도를 나타내는 아미노산 위치에서 추가 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 약제 복합체의 결정 구조가 항체 약제 및 항원 사이의 접점을 식별하기 위해 결정될 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화 또는 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 함유하는지 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기 내지 100 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드의 길이의 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합체뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 약제를 포함한다. 항체 약제 분자의 다른 삽입 변이체는 항체 약제의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예컨대, ADEPT의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체 약제의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
Fc 영역 변이체
일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체 또는 항-MUC16 Fc 융합 단백질)의 Fc 영역에 도입되어, Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 영역 변이체는 종종 Fc 수용체 (FcR)에 대한 결합과 관련된 향상된 ADCC 이펙터 기능을 갖는다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 영역 변이체는 감소된 ADCC 이펙터 기능을 갖는다. 이펙터 기능을 변경할 수 있는 Fc 서열에 대한 변화 또는 돌연변이의 많은 예가 있다. 예를 들어, WO 00/42072호 및 Shields et al., J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)는 FcR에 대한 개선된 또는 축소된 결합을 갖는 항체 변이체를 기재한다. 이러한 공개물의 내용은 구체적으로 본원에 참조로 원용된다.
항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC)은 종양 세포에 대한 치료적 항체의 작용의 메커니즘이다. ADCC는 세포-매개된 면역 방어이고, 이에 의해 면역계의 이펙터 세포는 막-표면 항원이 특이적 항체 (예컨대, 항-MUC16 항체)에 의해 결합된 표적 세포 (예컨대, 암 세포)를 활성적으로 용해시킨다. 전형적인 ADCC는 항체에 의한 NK 세포의 활성화를 포함한다. NK 세포는 Fc 수용체인 CD16을 발현한다. 이 수용체는 표적 세포의 표면에 결합된 항체의 Fc 부분을 인식하고, 이에 결합한다. NK 세포의 표면 상의 가장 일반적인 Fc 수용체는 CD16 또는 FcγRIII로 칭한다. 항체의 Fc 영역에 대한 Fc 수용체의 결합은 NK 세포 활성화, 세포용해 과립의 방출 및 그 결과인 표적 세포 아폽토시스를 초래한다. 종양 세포 사멸에 대한 ADCC의 기여는 고-친화도 FcR로 형질주입된 NK-92 세포를 사용하는 특이적 테스트로 측정될 수 있다. 결과는 FcR을 발현하지 않는 야생형 NK-92 세포와 비교된다.
일부 실시양태에 있어서, 본 기술은 일부이지만 전부는 아닌 이펙터 기능을 보유하는 Fc 영역을 포함하는 항-MUC16 항체 약제 변이체 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체 변이체)를 고려하며, 이는 이를 인 비보 항-MUC16 항체 약제의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대, CDC 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 적용에 대한 바람직한 후보가 되게 한다. 인 비트로 및/또는 인 비보 세포독성 검정을 수행하여, CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행하여, 항체 약제가 FcγR 결합이 결여되지만 (따라서, ADCC 활성이 결여될 수 있음), FcRn 결합 능력을 유지하는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지 상의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 판정하기 위한 인 비트로 검정의 비-제한적인 예는 미국특허 제5,500,362호 (예컨대, Hellstrom, I. et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참고) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 미국특허 제5,821,337호 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참고)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.); 및 CytoTox 96™ 비-방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, Wis.) 참고). 이러한 검정을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 인 비보에서, 예컨대, Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 판정될 수 있다. C1q 결합 검정을 또한 수행하여, 항체 약제가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인할 수 있다. 예컨대, WO 2006/029879호 및 WO 2005/100402호의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참고한다. 보체 활성화를 판정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참고). FcRn 결합 및 인 비보 클리어런스(clearance)/반감기 결정이 또한 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예컨대, Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참고).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2 개 이상에서의 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국특허 제7,332,581호).
FcR에 대한 개선된 또는 축소된 결합을 갖는 특정 항체 약제 변이체가 기재된다 (예컨대, 미국특허 제6,737,056호; WO 2004/056312호, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참고).
일부 실시양태에 있어서, ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 변이체 Fc 영역은 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 치환은 변이체 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체는 이의 변이체 Fc 영역에서 다음의 아미노산 치환을 포함한다: S298A, E333A 및 K334A.
일부 실시양태에 있어서, 예컨대, 미국특허 제6,194,551호, WO 99/51642호, 및 Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에 기재된 바와 같이 변경된 (즉, 개선된 또는 축소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
일부 실시양태에 있어서, 반감기를 증가시키고/시키거나 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합을 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체를 제공한다. 증가된 반감기 및 FcRn에 대한 개선된 결합을 갖는 항체는 US2005/0014934A1호 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 그 안에 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예컨대, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (미국특허 제7,371,826호).
또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 관한 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국특허 제5,648,260호; 미국특허 제5,624,821호; 및 WO 94/29351호를 참고한다.
본원에 기재된 Fc 변이체 중 임의의 것, 또는 이의 조합을 포함하는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체)가 고려된다.
글리코실화 변이체
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편은 항-MUC16 항체 약제가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키기 위해 변경된다. 항-MUC16 항체 약제에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실은 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 폴리펩티드 부분의 아미노산 서열을 변경하여, 하나 이상의 글리코실화 부위를 생성 또는 제거함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편이 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중촉각 올리고당을 포함한다. 예컨대, Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997)를 참고한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예컨대, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산뿐만 아니라 이중촉각 올리고당 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 본 기술의 항-MUC16 항체 약제에서 올리고당의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항-MUC16 항체 약제 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
Fc의 CH2 도메인에 부착된 N-글리칸은 이종성이다. CHO 세포에서 생성된 항체 또는 Fc 융합 단백질은 푸코실트랜스퍼라제 활성에 의해 푸코실화된다. Shoji-Hosaka et al., J. Biochem. 140:777- 83 (2006)을 참고한다. 보통, 작은 백분율의 자연 발생 비푸코실화된 IgG가 인간 혈청에서 검출될 수 있다. Fc의 N-글리코실화는 FcγR에 대한 결합에 중요하며; N-글리칸의 비푸코실화는 FcγRIIIa에 대한 Fc의 결합 역량을 증가시킨다. 증가된 FcγRIIIa 결합은 ADCC를 향상시킬 수 있으며, 이는 세포독성이 바람직한 특정 항체 약제 치료적 적용에서 유리할 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 향상된 이펙터 기능은 Fc-매개된 세포독성이 비바람직할 때 유해할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 단편 또는 CH2 도메인은 글리코실화되지 않는다. 일부 실시양태에 있어서, CH2 도메인에서 N-글리코실화 부위는 글리코실화를 방지하기 위해 돌연변이된다.
일부 실시양태에 있어서, Fc 영역을 포함하는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체를 제공하며, 여기서 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조는 감소된 푸코스를 갖거나 푸코스가 결여되며, 이는 ADCC 기능을 개선할 수 있다. 구체적으로, 야생형 CHO 세포에서 생산된 동일한 항-MUC16 항체 약제 상의 푸코스의 양에 비해 감소된 푸코스를 갖는 항-MUC16 항체 약제가 본원에서 고려된다. 즉, 이들은 천연 CHO 세포 (예컨대, 천연 글리코실화 패턴을 생산하는 CHO 세포, 예컨대, 천연 FUT8 유전자를 함유하는 CHO 세포)에 의해 생산된 경우, 이들이 가질 것에 비해 적은 양의 푸코스를 갖는 것을 특성화한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 그 상의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만의 N-연결된 글리칸이 푸코스를 포함하는 것이다. 예를 들어, 이러한 항-MUC16 항체 약제에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65%, 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제는 그 상의 N-연결된 글리칸 중 아무 것도 푸코스를 포함하지 않는 것, 즉 항-MUC16 항체 약제가 푸코스가 완전히 없거나, 푸코스를 갖지 않거나, 비푸코실화된 것이다. 푸코스의 양은 예를 들어, WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 바와 같이 Asn297에 부착된 모든 당구조의 합 (예컨대, 복합체, 하이브리드 및 고도의 만노스 구조)에 대한 Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 위치 약 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 작은 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 ±3 아미노산 업스트림 또는 다운스트림, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예컨대, 미국특허 공개공보 제2003/0157108호 (Presta, L.); US 2004/0093621호 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참고한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 약제 변이체와 관련된 공개물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108호; WO 2000/61739호; WO 2001/29246호; US 2003/0115614호; US 2002/0164328호; US 2004/0093621호; US 2004/0132140호; US 2004/0110704호; US 2004/0110282호; US 2004/0109865호; WO 2003/085119호; WO 2003/084570호; WO 2005/035586호; WO 2005/035778호; WO2005/053742호; WO2002/031140호; Okazaki et al., J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국특허 출원 US 2003/0157108 A1호, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1호, Adams et al., 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대, α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예컨대, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107호 참고)를 포함한다.
예컨대, 항-MUC16 항체 약제의 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분되는, 이등분된 올리고당을 갖는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체를 추가로 제공한다. 이러한 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 약제 변이체의 예는 예컨대, WO 2003/011878호 (Jean-Mairet et al.); 미국특허 제6,602,684호 (Umana et al.); US 2005/0123546호 (Umana et al.), 및 Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체를 또한 제공한다. 이러한 항-MUC16 항체 약제 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 약제 변이체는 예컨대, WO 1997/30087호 (Patel et al.); WO 1998/58964호 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764호 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에 있어서, Fc 영역을 포함하는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체는 FcγRIII에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, Fc 영역을 포함하는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 변이체는 인간 이펙터 세포 (예컨대, T 세포)의 존재 하에 ADCC 활성을 갖거나, 이와 달리 인간 야생형 IgG1Fc 영역을 포함하는 동일한 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체)와 비교하여 인간 이펙터 세포의 존재 하에 증가된 ADCC 활성을 갖는다.
시스테인 조작된 변이체
일부 실시양태에 있어서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환되는 시스테인 조작된 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 치환된 잔기는 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기가 이에 의해 항-MUC16 항체 약제의 접근가능한 부위에 배치되고, 다른 모이어티, 예컨대, 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 항-MUC16 항체 약제를 컨쥬게이션하여, 본원에 추가로 기재된 바와 같은 항-MUC16 면역컨쥬게이트를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 시스테인 조작된 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 항-MUC16 항체, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체)는 미국특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
유도체
일부 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편은 당업계에 알려져 있으며 용이하게 이용가능한 추가적인 비-단백성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항-MUC16 항체 약제의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체의 비-제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레익 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 프롤리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 (예컨대, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서 이의 안정성으로 인해 제조시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량의 것일 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항-MUC16 항체 약제에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일한 또는 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용된 중합체의 수 및/또는 유형은, 비제한적으로, 개선될 항-MUC16 항체 약제의 특정 특성 또는 기능, 항-MUC16 항체 약제 유도체가 정의된 조건 하의 요법에서 사용될 것인지 여부 등을 포함한 고려사항을 기반하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편 및 비단백성 모이어티의 컨쥬게이트를 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 비단백성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장의 것일 수 있으며, 비제한적으로, 보통 세포에 해를 끼치지 않지만, 항-MUC16 항체 약제-비단백성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백성 모이어티를 가열하는 파장을 포함한다.
항체 컨쥬게이트
특정 실시양태에 있어서, 본원은 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 상기 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 약제, 예컨대, 이미징제 또는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 또한, 본원은 이중특이적 항체 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 상기 이중특이적 항체는 하나 이상의 약제, 예컨대, 이미징제 또는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 또한, 본원은 항체 중쇄 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 상기 항체 중쇄는 하나 이상의 약제, 예컨대, 이미징제 또는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 또한, 본원은 항체 경쇄 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 상기 항체 경쇄는 하나 이상의 약제, 예컨대, 이미징제 또는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 또한, 본원은 융합 단백질 컨쥬게이트를 제공하며, 여기서 상기 융합 단백질은 약제, 예컨대, 이미징제 또는 세포독성제에 컨쥬게이션된다. 특정 실시양태에 있어서, 약제는 공유적으로 또는 비-공유적으로 컨쥬게이션된다.
특정 실시양태에 있어서, 이미징제는 검출가능한 표지, 예컨대, 색소생산성, 효소적, 방사성 동위원소성, 동위원소성, 형광성, 독성적, 화학발광성, 핵 자기 공명 조영제 또는 다른 표지이다.
검출가능한 그룹은 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 재료일 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 면역검정 및 이미징 분야에서 잘 개발되었다. 일반적으로, 이러한 방법에 유용한 거의 모든 임의의 표지가 본 기술에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 기술의 실시에 유용한 표지는 자기 비드 (예컨대, Dynabeads™), 형광 염료 (예컨대, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 텍사스 레드 및 로다민 등), 방사성 표지 (예컨대, 3H, 14C, 35S, 125I, 121I, 131I, 112In, 99mTc), 기타 이미징제, 예컨대, 미세기포 (초음파 이미징용), 18F, 11C, 15O, 89Zr, 89Zr-DFO (양전자 방출 단층촬영용), 99mTC, 111In (단일 광자 방출 단층촬영용), 효소 (예컨대, 호스 래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 것들), 및 열량측정 표지, 예컨대, 콜로이드성 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱 (예컨대, 폴리스티렌, 폴리프로필렌 및 라텍스 등) 비드를 포함한다. 이러한 표지의 사용을 설명하는 특허는 미국특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함하며, 각각은 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 본원에 원용된다. 또한 Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.)을 참고한다.
표지는 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 검정의 원하는 구성요소에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 위에 표시된 바와 같이, 인자, 예컨대, 필요한 감도, 화합물과의 컨쥬게이션의 용이성, 안정성 요구사항, 이용가능한 계측화 및 폐기 규정에 따라 표지를 선택하여 다양한 표지를 사용할 수 있다.
적합한 색소생산성 표지의 비-제한적인 예는 디아미노벤지딘 및 4-하이드록시아조-벤젠-2-카복실산을 포함한다.
적합한 효소 표지의 비-제한적인 예는 말레이트 데하이드로게나제, 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알콜 데하이드로게나제, 알파-글리세롤 포스페이트 데하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 글루코아밀라제, 및 아세틸콜린 에스테라제를 포함한다.
적합한 방사성 동위원소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 베타-방출체, 감마-방출체, 양전자-방출체 및 x-선 방출체를 포함한다. 적합한 방사성 동위원소 표지의 비-제한적인 예는 3H, 18F, 111In, 125I, 131I, 32P, 33P, 35S, 11C, 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 223Ra, 223Ra, 89Zr, 177Lu 및 109Pd를 포함한다. 특정 실시양태에 있어서, 111In은, 간에서 125I 또는 131I-표지된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 탈할로겐화의 문제를 회피하기 때문에 인 비보 이미징에 대해 바람직한 동위원소이다다. 또한, 111In은 이미징에 대해 더욱 유리한 감마 방출 에너지를 갖는다 (Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)). 예를 들어, 1-(P-이소티오시아네이토벤질)-DPTA로 단클론 항체에 커플링된 111In은 비-종양성 조직, 특히 간에서 흡수를 거의 나타내지 않으므로, 종양 국소화의 특이성을 향상시킨다 (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)).
적합한 비-방사성 동위원소 표지의 비-제한적인 예는 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr 및 56Fe를 포함한다.
적합한 형광 표지의 비-제한적인 예는 152Eu 표지, 플루오레세인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, 녹색 형광 단백질 (GFP) 표지, o-프탈데하이드 표지 및 플루오레사민 표지를 포함한다.
화학발광성 표지의 비-제한적인 예는 루미놀 표지, 이소루미놀 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시퍼라제 표지 및 에쿠오린 표지를 포함한다.
핵 자기 공명 조영제의 비-제한적인 예는 중금속 핵, 예컨대, Gd, Mn 및 철을 포함한다.
위에-기재된 표지를 상기 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편, 이중특이적 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 및 융합 단백질에 컨쥬게이션시키기 위한 당업자에게 알려진 기술은 예를 들어, Kennedy et at., Clin. CMm. Acta 70: 1-31 (1976), 및 Schurs et al, Clin. CMm. Acta 81: 1-40 (1977)에 기재되어 있다. 후자에 언급된 커플링 기술은 글루타르알데히드 방법, 퍼아이오데이트 방법, 디말레이미드 방법 및 m-말레이미도벤질-N-하이드록시-석신이미드 에스테르 방법이며, 이들 방법 모두는 본원에 참조로 원용된다.
세포독성제의 비제한적인 예는 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 방사성 금속 이온, 예컨대, 알파-방출체, 및 독소, 예컨대, 슈도모나스 외독소, 아브린, 콜레라 독소, 리신 A 및 디프테리아 독소를 포함한다.
특정 실시양태에 있어서, 약제는 진단제이다. 진단제는 항원을 함유하는 세포의 위치를 찾아냄으로써 질환을 진단 또는 검출하는 데 유용한 약제이다. 유용한 진단제는 방사성 동위원소, 염료 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘 복합체를 가짐), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 자기 공명 이미징 (MRI)을 위한 강화제 (예컨대, 상자성 이온)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 미국특허 제6,331,175호는 MRI 기술 및 MRI 강화제에 컨쥬게이션된 항체의 제조를 기재하며, 이는 그 전체가 참조로 원용된다. 바람직하게는, 진단제는 방사성 동위원소, 자기 공명 이미징에 사용하기 위한 강화제 및 형광 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편에 방사성 금속 또는 상자성 이온을 로딩하기 위해, 이를 이온 결합을 위한 다수의 킬레이팅기가 부착된 긴 꼬리를 갖는 시약과 반응시키는 것이 필요할 수 있다. 이러한 꼬리는 중합체, 예컨대, 폴리리신, 폴리사카라이드, 또는 킬레이팅기, 예컨대, 예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA), 포르피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카바존, 폴리옥심, 및 이 목적을 위해 유용한 것으로 알려진 유사 기에 결합될 수 있는 펜던트기를 갖는 다른 유도체화된 또는 유도체화가능한 쇄일 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 사용하여 항체에 커플링된다. 킬레이트는 보통 면역반응성의 최소 손실 및 최소 응집 및/또는 내부 가교로 분자에 대한 결합의 형성을 가능하게 하는 기에 의해 항체에 연결되고, 항체에 킬레이트를 컨쥬게이션시키기 위한 다른 더욱 특이한 방법 및 시약은 1989년 4월 25일자로 발행된 "항체 컨쥬게이트"라는 제목의 Hawthorne에 대한 미국특허 제4,824,659호에 개시되어 있으며, 이의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 원용된다. 특히 유용한 금속-킬레이트 조합은 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체를 포함하며, 이는 방사선-이미징를 위해 진단 동위원소와 함께 사용된다. 비-방사성 금속, 예컨대, 망간, 철 및 가돌리늄과 복합체화될 때 동일한 킬레이트가, 본원에 제공된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편과 함께 사용될 때 MRI에 유용하다.
매크로사이클릭 킬레이트, 예컨대, NOTA, DOTA 및 TETA는 다양한 금속 및 방사성금속, 가장 특히 각각 갈륨, 이트륨 및 구리의 방사성핵종와 함께 사용된다. 이러한 금속-킬레이트 착물은 고리 크기를 관심 금속에 맞춤으로써 매우 안정적으로 제조될 수 있다. 본원은 안정적으로 결합하는 핵종, 예컨대, RAIT에 대한 223Ra에 관심이 있는 다른 고리-형 킬레이트, 예컨대, 매크로사이클릭 폴리에테르를 포함한다.
약학 조성물
또한, 본원은 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편, 항체 약제를 코딩하는 핵산, 항체 약제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 조성물 (예컨대, 본원에서 제형으로서 또한 지칭되는 약학 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 항-MUC16 항체, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편의 적합한 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 항-MUC16 항체 약제를 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 수득된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성이고, 완충액, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필파라벤; 카테콜; 레조시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10 개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 올리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대, 소듐; 금속 착물 (예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온 계면활성제, 예컨대, TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 예시적인 제형은 명확히 본원에 참조로 원용되는 WO98/56418호에 기재되어 있다. 피하 투여를 위해 채택된 동결건조된 제형은 WO97/04801호에 기재되어 있다. 이러한 동결건조된 제형은 적합한 희석제를 이용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있으며, 재구성된 제형은 본원에서 치료될 개체에 피하 투여될 수 있다. 리포펙틴 또는 리포솜이 본 기술의 항-MUC16 항체 약제를 세포에 전달하는데 사용될 수 있다.
본원의 제형은 또한 치료될 특정 적응증에 대한 필요에 따라 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편 이외에 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편 이외에 항-신생물제, 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적을 위해 효과적인 양의 조합으로 적합하게 존재한다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제형에 존재하는 항-MUC16 항체 약제의 양, 질환 또는 장애 또는 치료의 유형, 및 위에 논의된 다른 인자에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로 동일한 투여량으로 및 본원에 기재된 바와 같은 투여 경로로 또는 지금까지 이용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 항-MUC16 항체, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 예를 들어, 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐 중에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중에, 또는 매크로에멀젼 중에 포집될 수 있다. 서방성 제제가 제조될 수 있다.
항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 항-MUC16 항체, 예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편의 서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체 약제 (또는 이의 단편)를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 매트릭스는 형상화된 물품, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대, LUPRON DEPOTTM (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구체), 및 폴리-D (-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 중합체, 예컨대, 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산은 100 일 초과 동안 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 특정 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체 약제가 장기간 동안 신체에서 유지될 때, 이들은 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성에서의 가능한 변화를 초래한다. 관련된 메커니즘에 따라 항-MUC16 항체 약제의 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지는 경우, 안정화는 설프히드릴 잔기를 변형하고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체) 또는 이의 항원-결합 단편은 시트레이트, NaCl, 아세테이트, 석시네이트, 글리신, 폴리소르베이트 80 (Tween 80), 또는 전술한 것들의 임의의 조합을 포함하는 완충액 중에 제형화된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 약 100 mM 내지 약 150 mM 글리신을 포함하는 완충액 중에 제형화된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 약 50 mM 내지 약 100 mM NaCl을 포함하는 완충액 중에 제형화된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 약 10 mM 내지 약 50 mM 아세테이트를 포함하는 완충액 중에 제형화된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 약 10 mM 내지 약 50 mM 석시네이트를 포함하는 완충액 중에 제형화된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 약 0.005% 내지 약 0.02% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충액 중에 제형화된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 약 5.1 내지 5.6의 pH를 갖는 완충액 중에 제형화된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 10 mM의 시트레이트, 100 mM의 NaCl, 100 mM의 글리신, 및 0.01%의 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충액 중에 제형화되며, 여기서 제형은 pH 5.5이다.
인 비보 투여에 사용될 제형은 멸균성이어야 한다. 이는 예컨대, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
항-MUC16 항체 약제를 사용한 치료 방법
특정 실시양태에 있어서, 본원은 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 암 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암, 특히 대상체에서 MUC16-양성암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 치료적 유효 용량, 예컨대, 본원에 기재된 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 따라 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 하나 이상의 추가적인 약학적 활성제와 조합되어 투여된다.
특정 종의 대상체에서 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 사용을 위해, 해당 특정 종의 MUC16에 결합하는 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편이 사용된다. 예를 들어, 인간을 치료하기 위해, 인간 MUC16에 결합하는 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편이 사용된다. 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린이다.
또한, 특정 종의 대상체에서 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 사용을 위해, 항-MUC16 항체 약제, 바람직하게는 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편의 불변 영역이 해당 특정 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 인간을 치료하기 위해, 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 면역글로불린인 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있으며, 여기서 면역글로불린은 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에 있어서, MUC16-양성암은 난소암, 폐암, 췌장암, 유방암, 나팔관암, 자궁 (예컨대, 자궁내막) 암, 원발성 복막암 또는 MUC16 수용체를 발현하는 임의의 다른 조직의 암이다.
일부 실시양태에 있어서, 치료는 비제한적으로, 검출가능한 또는 검출가능하지 않은 것에 관계없이, 증상의 경감, 질환의 정도의 축소, 질환의 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 저속화, 질환 상태의 호전 또는 일시적완화, 및 관해 (부분 또는 완전에 관계없이)를 포함하는 유익한 또는 원하는 임상 결과를 달성하는 것일 수 있다. 구체적인 실시양태에 있어서, "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 암 (예컨대, 난소암, 폐암, 췌장암, 유방암, 나팔관암, 자궁 (예컨대, 자궁내막) 암 또는 원발성 복막암, 또는 MUC16 수용체를 발현하는 임의의 다른 조직의 암)을 갖는 대상체에 대한 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기재된 약학 조성물의 투여는 다음 효과 중 1, 2, 3 또는 4 개 이상을 달성한다: (i) 암의 하나 이상의 증상의 중증도의 감소 또는 호전; (ii) 암과 연관된 하나 이상의 증상의 지속기간의 감소; (iii) 암과 연관된 증상의 재발의 예방; (iv) 대상체의 입원의 감소; (v) 입원 기간의 감소; (vi) 대상체의 생존의 증가; (vii) 다른 요법의 치료적 효과의 향상 또는 개선; (viii) 암과 연관된 하나 이상의 증상의 발달 또는 발병의 억제; (ix) 암과 연관된 증상의 수의 감소; (x) 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 판정된 바와 같은 삶의 질의 개선; (x) 종양의 재발의 억제; (xi) 종양 및/또는 이와 연관된 하나 이상의 증상의 퇴행; (xii) 종양 및/또는 이와 연관된 하나 이상의 증상의 진행의 억제; (xiii) 종양의 성장의 감소; (xiv) 종양 크기 (예컨대, 부피 또는 직경)의 감소; (xv) 새롭게 형성된 종양의 형성의 감소; (xvi) 원발성, 영역내(regional) 및/또는 전이성 종양의 예방, 근절, 제거 또는 제어; (xvii) 전이의 수 또는 크기의 감소; (xviii) 사망률의 감소; (xix) 무재발 생존의 증가; (xx) 당업자에게 이용가능한 종래의 방법, 예컨대, 자기 공명 이미징 (MRI), 역동적 조영-증강 MRI (DCE-MRI), X-선, 및 전산화 단층촬영 (CT) 스캔, 또는 양전자 방출 단층촬영 (PET) 스캔에 의해 측정된 바와 같이 종양의 크기가 유지되고 증가되지 않거나 표준 요법의 투여 후 종양의 증가에 비해 덜 증가되는 것; 및/또는 (xxi) 환자에서 관해의 길이의 증가. 치료는 전술한 것들 중 하나 이상을 달성하는 것일 수 있다.
본원에 제공된 방법에 따라 치료되는 대상체는 임의의 포유류, 예컨대, 설치류, 고양이, 개, 말, 소, 돼지, 원숭이, 영장류 또는 인간 등일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에 있어서, 대상체는 개이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다.
특정 실시양태에 있어서, 본원에 제공된 방법에 따라 치료되는 대상체는 비제한적으로, 난소, 폐, 췌장, 유방, 자궁, 나팔관 또는 원발성 복막 암, 또는 MUC16을 발현하는 임의의 다른 조직의 암을 포함하는 MUC16-양성암으로 진단되었다.
진단적 용도
특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 본원에 기재된 병태 (예컨대, MUC16-양성암 세포를 포함하는 병태)를 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하기 위한 진단적 목적에 사용될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 진단적 목적에 사용하기 위한 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 표지된다.
특정 실시양태에 있어서, 본원은 (a) 본원에 기재된 하나 이상의 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편을 사용하여 대상체의 세포 또는 조직 샘플에서 MUC16 또는 이의 단편의 발현을 검정하는 단계; 및 (b) MUC16 또는 이의 단편 발현의 수준을 대조군 수준, 예를 들어, 정상 조직 샘플 (예컨대, 본원에 기재된 병태를 갖지 않는 대상체로부터의 것, 또는 병태의 발병 전에 동일한 환자로부터의 것)에서의 수준과 비교하여, MUC16 또는 이의 단편 발현의 대조군 수준에 비해 MUC16 또는 이의 단편 발현의 검정된 수준의 증가 또는 감소가 본원에 기재된 병태를 나타내는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 병태의 검출을 위한 방법을 제공한다.
본원에 기재된 항체는 본원에 기재되거나 당업자에게 알려진 바와 같은 고전적인 면역조직학적 방법 (예컨대, Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); 및 Jalkanen et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987) 참고)을 사용하여 생물학적 샘플에서 MUC16 또는 이의 단편의 수준을 검정하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 유전자 발현을 검출하기에 유용한 다른 항체-기반 방법은 면역검정, 예컨대, 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 및 방사성면역검정 (RIA)을 포함한다. 적합한 항체 검정 표지는 당업계에 알려져 있으며, 효소 표지, 예컨대, 글루코스 산화효소; 방사성 동위원소, 예컨대, 아이오딘 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (121In) 및 테크네튬 (99Tc); 발광성 표지, 예컨대, 루미놀; 및 형광성 표지, 예컨대, 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 검정 표지는 직접 검출을 위해 본원에 제공된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편에 컨쥬게이션된다. 일부 실시양태에 있어서, 검정 표지는 본원에 제공된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편에 결합하는 이차 항체에 컨쥬게이션된다. 이차 항체 유형은 일차 항체의 부류 (예컨대, IgG 또는 IgM), 공급원 숙주 및 바람직한 표지의 종류에 따라 선택된다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 부류 또는 아이소타입 특이적 항체 (예컨대, IgG, IgM, IgA, IgE 또는 IgG)이다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 하위부류 특이적 항체 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG2, IgG4, IgA1 또는 IgA2)이다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 하나 이상의 부류 또는 하위부류의 항체에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 일차 항체의 중쇄에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 일차 항체의 경쇄에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 일차 항체의 카파 경쇄에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 일차 항체의 람다 경쇄에 결합한다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 항-Fc 또는 항-F(ab) 또는 항-(Fab')2 단편 항체이다. 일부 실시양태에 있어서, 이차 항체는 토끼, 마우스, 염소, 당나귀 또는 닭 항체이다.
특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 병태 (예컨대, MUC16-양성암)의 모니터링이 초기 진단 후 일정 기간 동안 진단 방법을 반복함으로써 수행된다.
표지된 분자의 존재는 인 비보 스캐닝을 위해 당업계에 알려진 방법을 사용하여 대상체에서 (즉, 인 비보에서) 검출될 수 있다. 당업자는 특정 표지를 검출하기 위한 적절한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 기술의 진단 방법에 사용될 수 있는 방법 및 장치는 전산화 단층촬영 (CT), 전신 스캔, 예컨대, 양전자 방출 단층촬영 (PET), 자기 공명 이미징 (MRI) 및 초음파촬영을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본원은 (a) 본원에 개시된 항-MUC16 작제물 중 임의의 것의 유효량을 대상체에 투여하는 단계이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 MUC16을 발현하는 암세포에 국소화되도록 구성되며, 방사성 동위원소로 표지되는, 단계; 및 (b) 참조 값보다 큰 항-MUC16 작제물에 의해 방출된 방사성 수준을 검출함으로써 대상체에서 종양의 존재를 검출하는 단계이되, 임의로 여기서 방사성 동위원소는 89Zr-데스페리옥사민 B (DFO)인 단계를 포함하는, 인 비보 대상체에서 암을 검출하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에 있어서, 대상체는 암으로 진단되거나, 암을 갖는 것으로 의심된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 일부 실시양태에 있어서, 항-MUC16 작제물에 의해 방출된 방사성 수준은 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 방출 전산화 단층촬영을 사용하여 검출된다. 선행하는 실시양태 중 임의의 것에서, 방법은 방사성핵종에 컨주게이션된 본 기술의 항-MUC16 작제물을 포함하는 면역컨쥬게이트의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 방사성핵종은 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소, 오제-방출체, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
항-MUC16 항체 약제의 전달
본원에 기재된 바와 같은 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 본원에 기재된 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 함유하는 조성물, 또는 이를 발현하는 세포는 다양한 경로에 의해 대상체에 전달될 수 있다. 이들은 비경구, 비강내, 기관내, 경구, 피내, 국부, 근육내, 복강내, 경피, 정맥내, 종양내, 결막 및 피하 경로를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 흡입기 또는 네뷸라이저 및 스프레이로서 사용하기 위한 에어로졸화제를 포함하는 제형의 사용에 의해 폐 투여가 또한 이용될 수 있다. 일 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물은 대상체에 비경구적으로 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 상기 비경구 투여는 정맥내, 근육내 또는 피하이다.
병태의 치료 및/또는 예방에 효과적일 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 조성물의 양은 질환의 성질에 따라 달라질 것이며, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다.
조성물에 이용될 정확한 용량은 또한 투여의 경로 및 암의 유형에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각각의 대상체의 환경에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 유효 용량은 또한 투여의 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태 (연령, 체중 및 건강을 포함함), 환자가 인간 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 의약, 또는 치료가 예방적 또는 치료적인지 여부에 따라 달라질 수 있다. 치료 투여량은 안전성 및 효험을 최적화하기 위해 최적으로 적정된다.
특정 실시양태에 있어서, 최적 투여량 범위의 식별을 돕기 위해 인 비트로 검정이 이용된다. 유효 용량은 인 비트로 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편에 대해, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/환자 체중 kg, 및 더욱 보통 0.01 내지 15 mg/환자 체중 kg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/체중 kg, 10 mg/체중 kg, 또는 1-10 mg/kg의 범위 이내 또는 다시 말해, 70 kg 환자에 대해 각각 70 mg 또는 700 mg 또는 70-700 mg의 범위 이내일 수 있다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종으로부터의 항체에 비해 인체 내에서 더 긴 반감기를 갖는다. 따라서, 낮은 투여량의 인간 항체 및 적은 빈도의 투여가 종종 가능하다.
특정 실시양태에 있어서, 예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 발현하는 조작된 세포, 또는 CAR의 투여에서, 대상체는 약 100만 내지 약 천억개의 세포, 예컨대, 100만 내지 약 5천만개의 세포 (예컨대, 약 500만개의 세포, 약 2천5백만개의 세포, 약 5억개의 세포, 약 10억개의 세포, 약 50억개의 세포, 약 200억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 400억개의 세포, 또는 전술한 값들 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위), 예컨대, 약 천만 내지 약 천억개의 세포 (예컨대, 약 2천만개의 세포, 약 3천만개의 세포, 약 4천만개의 세포, 약 6천만개의 세포, 약 7천만개의 세포, 약 8천만개의 세포, 약 9천만개의 세포, 약 100억개의 세포, 약 250억개의 세포, 약 500억개의 세포, 약 750억개의 세포, 약 900억개의 세포, 또는 전술한 값들 중 임의의 2 개에 의해 정의된 범위), 및 일부 경우에, 약 1억개의 세포 내지 약 500억개의 세포 (예컨대, 약 1억2천만개의 세포, 약 2억5천만개의 세포, 약 3억5천만개의 세포, 약 4억5천만개의 세포, 약 6억5천만개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억개의 세포, 약 300억개의 세포, 약 450억개의 세포)의 범위 또는 이들 범위 사이의 임의의 값으로 대상체에 투여된다. 일부 실시양태에 있어서, 총 세포의 용량 및/또는 세포의 개별 하위-집단의 용량은 약 104 내지 약 109 개의 세포/체중 킬로그램 (kg), 예컨대, 105 내지 106 개의 세포 / 체중 kg의 범위 이내, 예를 들어, 약 1 x 105 개의 세포/체중 kg, 1.5 x 105 개의 세포/체중 kg, 2 x 105 개의 세포/체중 kg, 또는 1 x 106 개의 세포/체중 kg, 2 x 106 개의 세포/체중 kg, 5 x 106 개의 세포/체중 kg, 또는 10 x 106 개의 세포/체중 kg이다. 예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 세포는 약 104 내지 약 109 개의 T 세포/체중 킬로그램 (kg), 예컨대, 105 내지 107 개의 T 세포/체중 kg으로, 또는 이의 오차의 특정 범위 이내로 투여된다.
항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 다중 차례 투여될 수 있다. 단일 투여량 사이의 간격은 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년 또는 2 년일 수 있다.
병용 요법
일부 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 암 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 (예컨대, 난소암, 췌장암, 폐암, 유방암, 나팔관암, 자궁 (예컨대, 자궁내막) 암 또는 원발성 복막암)을 치료하기 위한 본원에 제공된 방법은 하나 이상의 추가적인 치료제를 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 추가적인 치료제는 대상체에서 암 (예컨대, 난소암, 췌장암, 폐암, 유방암, 나팔관암, 자궁 (예컨대, 자궁내막) 암 및 원발성 복막암)을 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에 있어서, 추가적인 치료제는 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한 치료의 임의의 부작용을 치료하기 위한 것이다.
일부 실시양태에 있어서, 추가적인 약제는 난소암을 치료하는 데 사용되는 약제이다. 일부 실시양태에 있어서, 추가적인 약제는 췌장암을 치료하는 데 사용되는 약제이다. 일부 실시양태에 있어서, 추가적인 약제는 폐암을 치료하는 데 사용되는 약제이다. 일부 실시양태에 있어서, 추가적인 약제는 유방암을 치료하는 데 사용되는 약제이다. 일부 실시양태에 있어서, 추가적인 약제는 나팔관암을 치료하는 데 사용되는 약제이다. 일부 실시양태에 있어서, 추가적인 약제는 자궁 (예컨대, 자궁내막) 암을 치료하는 데 사용되는 약제이다. 일부 실시양태에 있어서, 추가적인 약제는 원발성 복막암을 치료하는 데 사용되는 약제이다.
본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편은 추가적인 치료제와 동시에 또는 순차적으로 (전 및/또는 후에) 투여될 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 추가적인 치료제는 동일한 또는 상이한 조성물로 투여될 수 있으며, 동일한 또는 상이한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 제1 요법 (이는 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 추가적인 치료제)은 제2 요법 (본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 추가적인 치료제) 이전에 (예컨대, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주 또는 12 주 전에), 이와 동시에, 또는 이후에 (예컨대, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주 또는 12 주 후에) 암 (예컨대, 난소암, 췌장암, 폐암, 유방암, 나팔관암, 자궁 (예컨대, 자궁내막) 암 및 원발성 복막암)을 갖는 대상체에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편과 병용하여 대상체에 투여되는 추가적인 치료제는 동일한 조성물 (약학 조성물)로 투여된다. 다른 실시양태에 있어서, 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편과 조합하여 투여되는 추가적인 치료제는 본원에 기재된 항-MUC16 항체 약제 또는 이의 항원-결합 단편과 상이한 조성물로 대상체에 투여된다 (예컨대, 2 개 이상의 약학 조성물이 사용됨).
제조 물품 및 키트
본 기술의 일부 실시양태에 있어서, 높은 MUC16 발현 및/또는 높은 호기성 해당과정을 특성화하는 암 (예컨대, 신장암, 자궁경부암 또는 전립선암)의 치료를 위해, 또는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체)를 이의 표면 상에 MUC16을 발현하는 세포에 전달하기 위해 유용한 재료를 함유하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품은 용기 및 용기와 연관된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본원에 기재된 질환 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접속 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공가능한 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백(bag) 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 하나 이상의 활성제는 본 기술의 항-MUC16 항체 약제이다. 표지 또는 패키지 삽입물은 조성물이 특정 병태를 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 표지 또는 패키지 삽입물은 항-MUC16 항체 약제 조성물을 환자에 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 본원에 기재된 병용 요법을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 고려된다.
패키지 삽입물은 이러한 치료적 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 치료적 제품의 상업적 패키지에 관례적으로 포함되는 설명서를 지칭한다. 일부 실시양태에 있어서, 패키지 삽입물은 조성물이 암 (예컨대, HCC, 흑색종, 폐 편평상피 세포 암종, 난소암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경모세포종, 간모세포종, 빌림스 종양(Wilms' tumor), 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위암종 또는 지방육종)을 치료하기 위해 사용됨을 나타낸다.
추가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대, 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충된 식염수, 링거액(Ringer's solution) 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충액, 희석제, 여과제, 바늘 및 시린지를 포함한 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
다양한 목적을 위해, 예컨대, 높은 MUC16 발현 및/또는 높은 호기성 해당과정을 특성화하는 암 (예컨대, 신장암, 자궁경부암 또는 전립선암)의 치료를 위해, 또는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체)를 이의 표면 상에 MUC16을 발현하는 세포에 전달하기 위해 유용한, 임의로 제조 물품과 조합된 키트를 또한 제공한다. 본 기술의 키트는 항-MUC16 항체 약제 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기 (또는 유닛 투여량 형태 및/또는 제조 물품)를 포함하며, 일부 실시양태에 있어서, 다른 약제 (예컨대, 본원에 기재된 약제) 및/또는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 키트는 치료에 적합한 개체의 선택의 설명을 추가로 포함할 수 있다. 본 기술의 키트에 공급된 설명서는 전형적으로 표지 또는 패키지 삽입물 (예컨대, 키트에 포함된 종이 시트) 상의 서면 설명서이지만, 기계-판독가능한 설명서 (예컨대, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 보유된 설명서)가 또한 허용가능하다.
예를 들어, 일부 실시양태에 있어서, 키트는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체)를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 키트는 a) 항-MUC16 항체 약제를 포함하는 조성물, 및 b) 항-MUC16 항체 약제의 효과 (예컨대, 치료 효과, 검출 효과)를 향상시키는 하나 이상의 다른 약제의 유효량을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 키트는 a) 항-MUC16 항체 약제를 포함하는 조성물, 및 b) 높은 MUC16 발현 및/또는 높은 호기성 해당과정을 특성화하는 암 (예컨대, 신장암, 자궁경부암 또는 전립선암)의 치료를 위해 개체에 항-MUC16 항체 약제 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 키트는 a) 항-MUC16 항체 약제를 포함하는 조성물, b) 항-MUC16 항체 약제의 효과 (예컨대, 치료 효과, 검출 효과)를 향상시키는 하나 이상의 다른 약제의 유효량, 및 c) 높은 MUC16 발현 및/또는 높은 호기성 해당과정을 특성화하는 암 (예컨대, 신장암, 자궁경부암 또는 전립선암)의 치료를 위해 개체에 항-MUC16 항체 약제 조성물 및 다른 약제(들)를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 항-MUC16 항체 약제 및 다른 약제(들)는 별도의 용기에 또는 단일 용기에 존재할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나의 별개의 조성물 또는 2 개 이상의 조성물을 포함할 수 있으며, 여기서 하나의 조성물은 항-MUC16 항체 약제를 포함하고 다른 조성물은 다른 약제를 포함한다.
일부 실시양태에 있어서, 키트는 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체)를 코딩하는 핵산 (또는 핵산의 세트)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 키트는 a) 항-MUC16 항체 약제를 코딩하는 핵산 (또는 핵산의 세트), 및 b) 핵산 (또는 핵산의 세트)을 발현하기 위한 숙주 세포를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 키트는 a) 항-MUC16 항체 약제를 코딩하는 핵산 (또는 핵산의 세트), 및 b) i) 숙주 세포에서 항-MUC16 항체 약제를 발현시키는 것, ii) 항-MUC16 항체 약제를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) 높은 MUC16 발현 및/또는 높은 호기성 해당과정을 특성화하는 암 (예컨대, 신장암, 자궁경부암 또는 전립선암)의 치료를 위해 개체에 항-MUC16 항체 약제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 위한 설명서를 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 키트는 a) 항-MUC16 항체 약제를 코딩하는 핵산 (또는 핵산의 세트), b) 핵산 (또는 핵산의 세트)을 발현하기 위한 숙주 세포, 및 c) i) 숙주 세포에서 항-MUC16 항체 약제를 발현시키는 것, ii) 항-MUC16 항체 약제를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) 높은 MUC16 발현 및/또는 높은 호기성 해당과정을 특성화하는 암 (예컨대, 신장암, 자궁경부암 또는 전립선암)의 치료를 위해 개체에 항-MUC16 항체 약제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 위한 설명서를 포함한다.
또한 본원은 본 기술의 항-MUC16 작제물, 뮤린 항-MUC16 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 사용 설명서를 포함하는 키트를 개시하며, 여기서 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합 단편은 (a) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH), 및 각각 서열번호 14, 15 및 16의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 가변 경쇄(VL); 또는 (b) 각각 서열번호 35, 36 및 37의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH), 및 각각 서열번호 32, 33 및 34의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다. 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합 단편 (예컨대, US 9,169,328호에 기재된 것들)은 항-MUC16 작제물을 사용한 치료에 반응성인 환자를 식별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합 단편은 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학, 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC/MS), 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 면역침전 또는 면역전기영동을 통해 환자로부터 수득된 샘플에서 MUC16-발현 종양을 검출하는 데 사용된다.
본 기술의 키트는 적합한 패키징으로 있다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 항아리 및 가요성 패키징 (예컨대, 실링된 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 키트는 임의로 추가적인 구성요소, 예컨대, 완충액 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 바이알 (예컨대, 실링된 바이알), 병, 항아리 및 가요성 패키징 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
항-MUC16 항체 약제 조성물의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투약 스케줄 및 투여의 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 유닛 용량, 대량 패키지 (예컨대, 다중-용량 패키지) 또는 하위-유닛 용량일 수 있다. 예를 들어, 연장된 기간, 예컨대, 1 주, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 7 개월, 8 개월 또는 9 개월 이상 중 임의의 것 동안 개체의 효과적 치료를 제공하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 항-MUC16 항체 약제 (예컨대, 전장 항-MUC16 항체)의 충분한 투여량을 함유하는 키트를 제공할 수 있다. 키트는 또한 항-MUC16 항체 약제 및 약학 조성물의 다중 유닛 용량 및 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있으며, 저장 및 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국에서의 사용을 위해 충분한 양으로 패키징될 수 있다.
당업자는 본 기술의 범주 및 사상 내에서 몇몇 실시양태가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 본 기술은 이제 다음의 비-제한적인 실시예를 참조하여 더욱 상세히 기재될 것이다. 다음의 실시예는 본 기술을 추가로 예시하지만, 물론 이의 범주를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
본 기술은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 임의의 방식으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 다음의 실시예는 본 기술의 예시적 항-MUC16 항체의 제조, 특성화 및 용도를 나타낸다. 다음의 실시예는 본 기술의 인간 및 이중특이적 항체의 생산, 및 이들의 결합 특이성 및 인 비보 생물학적 활성의 특성화를 나타낸다.
실시예 1: MUC16의 카복시-말단에 결합하는 항체의 인 비트로 특성화
뮤린 단클론 항체는 MUC16 카복시-말단 (본원에서 "펩티드-2"로 칭함)의 엑토도메인 (막곁) 부분의 펩티드 서열에 대해 이전에 개발되었다. 이 실시예는 MUC16에 대한 차등적 결합을 나타내는 6 개의 뮤린 단클론 항체의 테스트를 설명하였다. 연구의 목표는 임상에서 인간화 및 잠재적 번역을 위한 최상의 항체 후보를 식별하는 것이었다. 연구는 3 가지 단계로 나누어 진행되었다. 제1 단계에서, 6 개의 항체를 비교 인 비트로 스크리닝 과정의 결과를 기반으로 평가하였다. 이 연구 단계의 목적은 다음의 3 개의 매개변수를 기반으로 인 비보 분석을 위한 두 가지 주요 후보를 선택하는 것이었다: 1) 생체접합에 대한 항체의 순응성; 2) 방사성화학적 수율 및 몰 활성을 포함하는 항체의 방사성표지화 결과; 및 3) 면역반응 분율, 포화 결합 및 세포 내재화의 결정을 포함하는 세포-기반 검정에서 방사성면역컨쥬게이트의 성능.
연구의 제2 단계에서, 인 비트로 스크리닝 과정으로부터 식별된 2 개의 주요 후보의 인 비보 종양-표적화 및 방사성약리학적 프로파일을 평가하였다 (실시예 2 참고).
최종적으로, 연구의 제3 단계에서, 이전 단계로부터 식별된 주요 MUC16 카복시-말단 결합 항체의 인간화를 수행하였다. 이어서, 인간화된 변이체를 인 비보 종양-표적화 및 방사성약리학적 프로파일에 대해 평가하였다 (실시예 3 참고).
연구에서 선택된 항체 중 3 개, 9C9, 4H11 및 4A5는 이전에 각각의 하이브리도마 배양물로부터의 상청액을 사용한 효소 연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 인간 Fc 항체 도메인에 융합된 엑토도메인 MUC16 카복시-말단의 58 개의 아미노산 잔기를 함유하는 정제된 재조합 pFUSE MUC16c114를 사용한 웨스턴 블롯팅, MUC16-발현 OVCAR3 세포를 사용한 유세포 분석 및 포화 결합 검정을 포함하는 다양한 분석 방법을 사용하여 MUC16 카복시-말단에 대한 강력하고 높은 친화도 결합을 입증하였다. 2 개의 다른 항체인 4C7 및 29G9는 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석을 통해 MUC16에 결합하는 것으로 나타났다. 마지막 항체인 4A2는 ELISA에서만 양성을 보였다.
내재화 후 세포 내에서 잔류하는 능력과 조합된, 항체에 의한 종양-표적화의 생물학적 반감기 및 인 비보 약동학과 잘 매칭하는 물리적 (붕괴) 반감기 (t1/2 = 72.4 시간)를 포함하는 89Zr의 이상적인 특성화는 다양한 MUC16 카복시-말단-결합 항체를 방사성표지화하고 인 비트로 및 인 비보 방사성약리학적 프로파일을 평가하기 위한 동위원소의 선택으로 이루어졌다. 89Zr은 89Y(p,n)89Zr 반응을 통해 TR19/9 사이클로트론 (Ebco Industries Inc.)의 Memorial Sloan Kettering Cancer Center에서 생산되었으며 196-496 MBq/mg의 특이적 활성도를 갖는 89Zr을 산출하도록 정제되었다. 활성 측정은 CRC-15R Dose Calibrator (Capintec)를 사용하여 이루어졌다. 활성의 정량화를 위해, 자동 Wizard 감마 계수기 (Perkin Elmer)에서 샘플을 카운팅하였다. 리간드의 방사성표지화는 즉각적인 박층 크로마토그래피 종이 (Agilent Technologies)를 사용하여 모니터링하고, Winscan 방사성-TLC 소프트웨어 (Bioscan Inc.)를 사용하여 Bioscan AR-2000 방사성-ITLC 플레이트 판독기에서 분석하였다.
항체를 89Zr로 방사성표지하기 위해, 데스페리옥사민의 이소티오시아네이트-기능화된 변이체 (p-SCN-Bn-DFO)를 컨쥬게이션하여, 동일한 반응 조건을 사용하여 모든 6 개의 항체의 DFO-면역컨쥬게이트를 생산하였다. 목적은 항체의 구조에 무작위로 분포된 리신 잔기에 대한 엡실론-아민(들)과 이기능적 킬레이터의 생체컨쥬게이션을 용이하게 하는 것이었다. 간단히 말해서, 항체를 2-3 mg/mL의 평균 농도로 시트레이트 완충액 (25 mM의 소듐 시트레이트, 150 mM의 소듐 클로라이드)에 현탁하였다. 항체는 킬렉스 PBS로 미리-평형화된 일회용 Sephadex G-25 PD10 탈염 컬럼 (17085101; GE Healthcare, Life Sciences)을 사용하여 완충액-교환되었고, 50,000 분자량 컷오프 (Amicon Ultra 4 Centrifugal Filtration Units, Millipore)를 갖는 원심분리 필터 유닛을 사용하여 농축시켜, 12-15 mg/mL의 최종 농도를 수득하였다. 항체 용액의 pH를 0.1M Na2CO3를 사용하여 8.5-9.0으로 조정하였다. 이후, 10 몰 당량의 이소티오시네이토-데스페리옥사민 (p-SCN-Bn-DFO) (B-705; Macrocyclics, Inc.)을 10 mg/mL의 농도로 DMSO (41640; Sigma Aldrich)에 용해시켰다. 반응물을 500 rpm으로 설정된 열혼합기에서 1 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. DFO-컨쥬게이션된 항체를 PD10 탈염 컬럼을 사용하여 정제하고, 위에 기재된 바와 같이 원심분리 필터 유닛을 사용하여 농축시켰다.
89Zr은 MSKCC의 방사선화학 및 분자 이미징 프로브 코어에 의해 1M 옥살산에 용해된 [89Zr]Zr-옥살레이트로서 제공되었다. 용액을 pH ~7에 도달하도록 1M 소듐 카보네이트로 중화시켰다. 킬렉스 PBS pH 7.4에 용해된 각각의 면역컨쥬게이트를 중화된 89Zr과 함께 1 시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 방사성표지화 반응의 진행은 실리카-겔 함침된 유리-극세사 종이 스트립 (iTLC-SG; Varian)에 0.5 μL의 조질의 반응 혼합물을 스폿팅함으로써 방사성-즉각적인 박층 크로마토그래피 (방사성-ITLC)를 통해 모니터링하고, 이동상의 용매로서 50 mM EDTA pH 5.5를 사용하는 ITLC 스캐너 (AR-2000; Bioscan Inc.)에서 분석하였다. ITLC에서, 89Zr-표지된 방사성면역컨쥬게이트 복합체는 기점에 남아 있는 반면, 유리 89Zr은 이동상에서 EDTA에 의해 흡수되어 용매 전면과 함께 이동하였다. 방사성-ITLC 데이터를 사용하여 조질의 방사선화학적 수율을 계산하였다. 이어서, 89Zr-방사성면역컨쥬게이트를 PD10 탈염 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제한 다음, 원심 여과를 통해 최종 부피를 농축하여 추적자 용량을 제조하였다. 정제된 방사성면역컨쥬게이트의 방사선화학적 순도는 동물 실험에 사용하기 전에 방사성-ITLC를 통해 확인하였다.
혈청 안정성을 결정하기 위해, 100 μL의 각각의 방사성면역컨쥬게이트를 900 μL의 인간 혈청 (H4522; Sigma Aldrich)과 함께 항온처리하고, 37℃로 설정된 열혼합기에서 지속적으로 교반하였다. 각각의 미세원심분리기 튜브로부터 샘플을 채취하고, 0, 1, 3, 5 및 7 일차에 방사성-ITLC를 통해 분석하였다. 모든 샘플을 삼중으로 분석하였다. 방사성면역컨쥬게이트의 혈청 안정성은 방사성-ITLC 스트립의 기점에서 보유하고 있는 89Zr의 백분율로서 측정하고, % 온전한 것으로서 보고하였다.
89Zr-DFO-항체의 면역반응 분율을 Lindmo et al. (1984) J Immunol Methods 72:77-89)에 의해 기재된 절차에 따라 변형된 세포 결합 검정을 사용하여 결정하였다. 이를 위해, SKOV3c114 세포를 1% BSA (pH 7.4)가 보충된 500 μL PBS에서 5.0 x 105 - 5.0 x 106 개의 세포/mL 범위의 농도로 미세원심분리 튜브에 현탁하였다. 다양한 방사성면역컨쥬게이트의 분취량 - 50 μL의 1 μCi/mL 스톡을 각각의 튜브에 첨가하여, 튜브당 세포 및 방사성면역컨쥬게이트의 최종 부피가 500 μL가 되도록 만들었다. 샘플을 37℃ 및 500 rpm으로 설정된 열혼합기에서 60 분 동안 항온처리하였다. 이어서, 처리된 세포를 원심분리 (4 분 동안 1400 rpm)를 통해 펠렛화하고, 상청액을 흡인하고, 펠렛을 빙냉 PBS로 3 회 세척한 후, 상청액을 제거하고 세포 펠렛과 연관된 방사능을 카운팅하였다. 활성 데이터를 배경-보정하고, 적절한 대조군 샘플의 총 카운트 수와 비교하였다. 면역반응 분율을 정규화된 세포 농도의 역수에 대해 플롯팅된 총/결합된 방사능의 선형 회귀 분석에 의해 결정하였다. 추가적으로, 주요 항체 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 면역반응성을 비드-기반 결합 검정에서 평가하였다 (도 5 참고).
SKOV3c114 세포를 생성하기 위해, American Type Cell Culture (ATCC, Manassas, VA)로부터 구입한 SKOV3 세포를 MUC16의 카복시-말단으로부터의 114 개의 아미노산을 코딩하는 플라스미드 phrGFP-MUC16c114로 형질주입시켰다. 형질주입되지 않은 SKOV3 (야생형) 세포를 또한 배양하여, 실험에서 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 1.5 mM의 L-글루타민, 100 유닛/mL 페니실린 G 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청 및 800 μg/mL의 제네티신 G418을 함유하도록 변형된 RPMI McCoy의 5A 배지에서 배양하였다. 세포를 물-재킷된(jacketed) 항온처리기에서 37℃로 유지하고, 5% CO2를 공급하였다. 세포주는 칼슘 및 마그네슘이 없는 Hank의 완충된 염 용액에서 0.25% 트립신/0.53 mM의 EDTA를 사용하여 일주일당 1 회 T-150 플라스크 (1:5)를 분할함으로써 계대배양하였다. MUC16-발현 OVCAR3 세포를 ATCC로부터 수득하고, 열 비활성화된 소 태아 혈청 (20% v/v, GIBCO, Life Technologies), 2 mM의 L-글루타민, 10 mM의 HEPES, 1 mM의 소듐 피루베이트, 4.5 g/L의 글루코스, 1.5 g/L의 소듐 바이카보네이트, 0.01 mg/mL의 소 인슐린 (Gemini Bio-Products, 700-112P), 100 유닛/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지를 사용하여 배양하였다.
포화 결합 연구를 위해, MUC16 카복시-말단 결합 항체의 89Zr-표지된 변이체의 6 개의 농도, 0.1, 1, 5, 10, 25, 50 및 100 nM을 1% BSA가 보충된 PBS에 현탁된 500,000 개의 SKOV3c114 세포와 함께 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 동시에, SKOV3c114 세포에 대한 항체의 비-특이적 결합에 대해 병렬 설정을 준비하고 분석하였다. 후자는 MUC16 카복시-말단 결합 항체의 89Zr-방사성면역컨쥬게이트 변이체 및 100 nM의 각각의 표지되지 않은 항체를 SKOV3c114 세포의 혼합물에 첨가함으로써 제조하였다. 모든 실험을 삼중으로 수행하였다.
다양한 방사성면역컨쥬게이트의 내재화를 SKOV3c114 세포를 사용하여 조사하였다. 대략 1 × 105 개의 세포를 12-웰 플레이트에 씨딩하고, 밤새 항온처리하였다. 2 mL 부피의 방사성면역컨쥬게이트 (SKOV3c114 배지 mL당 1 μCi)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃ 대 4℃에서 1, 4, 12 및 24 시간 동안 항온처리하였다. 각각의 항온처리 기간 후, 세포 상청액을 수집하고, 세포를 1 mL의 빙냉 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)로 2 회 헹구었다. 표면-결합된 활성은 1 mL의 100 mM 아세트산 + 100 mM 글리신 (1:1, pH 3.5)에서 세포를 세척함으로써 수집하였다. 이어서, 부착 세포를 1 M 수산화나트륨 1 mL로 용해시켰다. 각각의 세척물을 수집하고, 활성에 대해 카운팅하였다. 퍼센트 내재화된 활성을 용해물의 활성, 및 배지, PBS, 산 및 염기 세척물으로부터의 총 활성의 비로서 계산하였다.
동일한 조건 하에서 면역컨쥬게이트의 생체컨쥬게이션 및 방사성표지화를 수행함에도 불구하고, 1.16 MBq/nmol (0.21 mCi/mg) 내지 31.8 MBq/nmol (5.74 mCi/mg) 범위의 방사성면역컨쥬게이트의 다양한 방사성화학적 수율 및 몰 활성을 수득하였다 (표 4). 하나의 항체인 4A2는 다른 5 개의 항체의 생체컨쥬게이션 및 방사성표지화에 사용된 것과 동일한 조건 하에서 방사성표지될 수 없었고, 추가의 분석으로부터 제외되었다. 항체 29G9 및 4A5는 89Zr을 이용한 방사성표지화시 낮은 몰 활성을 산출하였다. 구체적으로, [89Zr]Zr-DFO-4A5의 극히 낮은 몰 활성은 이전에 MUC16-발현 OVCAR3 세포에 대한 효율적인 결합 친화도 (KD = 7.3 ± 1.1 nM)를 입증한 동일한 항체의 방사성요오드화된 변이체와 비교하여 불량하다 (Dharma et al. (2010) Appl Immunohistochem Mol Morphol. 18:462-472). 그럴듯하게, 4A5의 리신 잔기는, 4A5의 방사성요오드화에 보다 용이하게 접근가능할 수 있는 티로신 잔기와 비교하여 용매에 접근가능하지 않고 아민-기반 컨쥬게이션에 순응할 수 없으며, 따라서 항체를 방사성표지하는 데 사용된 2 개의 방법 사이의 방사성화학적 수율의 상이함을 야기할 수 있다. 낮은 면역반응 분율은 표적에 대한 방사성표지된 항체의 접근을 차단할 수 있는 낮은 몰 활성 (큰 비표지된 분율)과 연결될 수 있다. 요약하면, 낮은 방사성화학적 수율 및 불량한 몰 활성으로 인해 29G9 및 4A5이 또한 이 연구에서 더 이상 추구되지 않았다.
제시된 모든 데이터는 평균 ± SD로서 표현된다. 적용가능한 경우, 통계적 상이함을 쌍을 이루지 않은, 양측 스튜던트 t 테스트 (언급된 경우 Welch의 보정 포함)에 의해 분석하였다. 95% 신뢰 수준 (P < 0.05)에서의 상이함은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었으며, 별표로 표시된다.
나머지 3 개의 항체, 9C9, 4H11 및 4C7 중에서, 4C7의 방사성면역컨쥬게이트는 가장 적은 몰 활성을 산출하고, 가장 낮은 면역반응 분율을 나타내었다. 포화 결합 검정으로부터 유래된 상대적으로 높은 결합 친화도 (> 10 nM)와 조합된 이러한 결과는 스크리닝 워크플로우(workflow)의 제2 단계로부터 4C7을 배제하였다.
따라서, 9C9 및 4H11을 2 개의 주요 MUC16 카복시-말단 결합 항체로서 식별하였다. 이들의 89Zr-표지된 변이체 - [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11은 높은 몰 활성, ≥ 80% 면역반응 분율 및 5-11 nM 범위의 결합 친화도를 포함하여 유리한 인 비트로 특성화를 나타냈다 (표 4 및 도 3b). 현재 연구에서 포화 결합 검정으로부터 유래된 결합 친화도 값은 9C9 및 4H11의 방사성요오드화된 변이체로 수행된 유사한 실험에서 수득된 이전에 보고된 값과 부합하였다 (Dharma et al. (2010) Appl Immunohistochem Mol Morphol. 18:462-472).
특히, MUC16 카복시-말단 도메인에서 펩티드-2에 대한 비슷한 결합 친화도에도 불구하고, 9C9 및 4H11의 89Zr-방사성면역컨쥬게이트는 상이한 비율의 세포 흡수 프로파일을 나타내었다 (도 3c). SKOV3c114 세포에 대한 두 방사성면역컨쥬게이트의 결합은 낮았으며, 4℃에서 비슷하였다. 그러나, 37℃에서 [89Zr]Zr-DFO-4H11은 4 시간 이내에 내재화되는 정규화된 적용된 활성의 12.47 ± 3.02%로 더 많은 방사능 흡수를 나타내었고, 이어서 24 시간에 14.09 ± 1.34%에 도달하는 느린 축적이 뒤따랐다 (도 3c). 반면, [89Zr]Zr-DFO-9C9는 1 시간에 5.22 ± 1.34% 내재화되는 비교적 느린 세포 흡수를 나타내었고, 이어서 24 시간에 11.89 ± 2.21%에 도달하는 점차적인 축적이 뒤따랐다. 2 개의 주요 항체 후보에 의해 달성된 세포 흡수 비율 및 최대 세포 내재화 값의 이러한 상이함은 항체 부류의 아미노산 조성, 또는 9C9 대 4H11로부터 scFv의 결합 포켓(들)의 결정 구조로부터 추론될 수 있는 MUC16 펩티드-2에 대한 결합의 기하학의 상이함에 의해 영향을 받을 수 있는 방사성면역컨쥬게이트의 전체 전하를 포함하는 하나 초과의 인자에 기인할 수 있다. 주요 항체 후보 둘 모두에 대한 방사성면역컨쥬게이트는 혈청에서 항온처리시 비슷하고 높은 안정성을 나타내었다 (도 3d). 흥미롭게도, CAR T-세포를 개발하기 위해 9C9 및 4H11의 단일 쇄 가변 단편 (scFv)의 사용을 탐구하는 것을 목표로 하는 관련없는 연구는 두 항체 모두로부터의 scFv의 서열이 동일하다는 것을 밝혀 (데이터는 도시되지 않음), 두 항체 모두가 MUC16 엑토도메인의 막곁 영역 내의 펩티드-2 서열의 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인해 MUC16 상에 동일한 분자 풋프린트(footprint)를 가질 수 있음을 시사하였다. 이를 과량의 표지되지 않은 9C9 항체의 존재 하에 비오틴화된 펩티드-2에 대한 [89Zr]Zr-DFO-mu4H11 결합의 차단을 달성함으로써 본 연구에서 실험적으로 검증하였다 (도 3e).
실시예 2: MUC16의 카복시-말단에 결합하는 항체의 인 비보 특성화
2 개의 주요 후보로서 9C9 및 4H11을 식별하고, 연구의 제2 단계를 이들 항체로 수행하였다. 이 제2 단계는 이러한 항체의 종양-표적화 능력 및 전반적인 방사성약리학적 프로파일의 인 비보 특성화를 포함하였다. 이를 위해, 방사성면역컨쥬게이트 [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11을 높은 방사성화학적 순도 및 높은 몰 활성으로 합성하고, 피하 이종이식된 SKOV3c114 종양을 보유한 마우스에서 PET 이미징 및 생체분포 연구를 통해 테스트하였다.
8-10-주령 nu/nu 암컷 마우스를 Charles River Laboratories에서 구입하였다. 동물을 환기된 우리에 수용하고, 음식 및 물을 자유식으로 제공하고, 종양 세포를 접종하기 전에 대략 1 주 동안 순응시켰다. SKOV3c114 종양을 신선한 배지/BD Matrigel (356234, BD Biosciences)의 1:1 혼합물의 150 μL 세포 현탁액 중 5 x 106 개의 세포의 피하 주사를 통해 각각의 마우스의 오른쪽 어깨에 체내이식하였다. 실험은 SKOV3c114 세포를 주사한 지 대략 3 주 후에 수행되었다. 양측 종양 모델을 생성하기 위해, 5 x 106 개의 SKOV3 세포를 오른쪽 어깨에 접종한 후, 2 주 후 8-10-주령 암컷 nu/nu 마우스의 왼쪽 어깨에 5 x 106 개의 SKOV3c114 세포를 접종하였다. 10 x 106 개의 OVCAR3 세포를 6-8-주령 암컷 누드 마우스의 오른쪽 어깨에 체내이식하였다. HGSOC 환자-유래된 이종이식편의 씨드는 MSKCC 항-종양 판정 코어에 의해 제공되었으며, 피하 이종이식편으로서 계대 및 확장되었다.
PET 이미징 실험을 Inveon PET/CT 스캐너 (Siemens Healthcare)에서 수행하였다. 오른쪽 어깨에 피하 이종이식된 SKOV3c114 종양을 보유하는 마우스에 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 주요 MUC16 카복시-말단 결합 항체 (150-260 μCi; 200 μL의 킬렉스 PBS 중 5.55-9.62 MBq)의 89Zr-표지된 방사성면역컨쥬게이트 변이체를 투여하였다. 동물을 2% 이소플루란 (Baxter Healthcare) 및 의료용 공기 가스 혼합물의 흡입에 의해 마취하고, 스캐너 침대에 놓았다. 각각의 마우스에 대한 PET 데이터를 방사성면역컨쥬게이트 주사 후 다양한 시점에서 정적 스캔을 통해 기록하였다. ASIPro VM 소프트웨어 (Concorde Microsystems)를 사용하여 이미지를 분석하였다. Inveon PET/CT 스캐너에서 마우스 호텔을 사용하여 양측 종양 모델의 PET 이미지를 획득하고, AMIDE 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하였다. 간단히 말해서, 3-차원 정렬된 하위세트 기대 최대화 (3D OSEM) 재구성된 이미지를 추적자의 주사된 용량에 대해 교정하였고, PET 및 CT 이미지를 오버레이하기 전에 1.5의 반치전폭 (FWHM) 값을 적용함으로써 가우스 함수를 사용하여 평탄화하였다.
SKOV3c114+ 종양의 피하 이종이식편을 보유하는 암컷 누드 마우스에서 주요 MUC16 카복시-말단 결합 항체의 89Zr-표지된 변이체를 사용하여 생체분포 연구를 수행하였다. 마우스에 21-30 μCi; 측면 꼬리 정맥 주사를 통해 200 μL PBS에 현탁된 각각의 방사성면역컨쥬게이트의 0.77-1.11 MBq를 투여하였다. 차단 아암의 경우, 동물에 50-배 과량의 표지되지 않은 항체를 공동-주사하였다. 동물 (그룹당 n=4)을 CO2 질식으로 안락사시켜, 마우스에 주사한 후 다양한 시점에서 방사성면역컨쥬게이트의 생체분포를 분석하였다. 안락사에 이어, 생명 유지에 필수적인 장기, 예컨대, 혈액, 심장, 폐, 간, 비장, 위, 췌장, 대장, 소장, 췌장, 난소, 나팔관 및 자궁를 포함한 생식기, 신장, 뼈, 근육, 꼬리, 겨드랑이 림프절 및 종양(들)을 수확하고, 무게를 칭량하고, 89Zr에 대해 교정된 감마 계수기에서 방사능에 대해 검정하였다. 카운트를 알려진 표준으로부터 생성된 교정 곡선을 사용하여 활성으로 전환하였다. 카운트 데이터는 배경 및 붕괴를 주사 시간으로 보정하였으며, 각각의 조직 샘플에 대한 그램당 주사된 용량 퍼센트 (%ID/g)를 마우스당 주사된 총 활성에 대한 정규화에 의해 계산하였다.
방사성면역컨쥬게이트의 주사 후 (p.i.) 24 시간 간격의 [89Zr]Zr-DFO-9C9의 연속 PET 이미징 (도 4a)은 24 시간에 피하 종양을 묘사한 다음, 최대 96 시간 p.i 시간 진행을 갖는 종양의 활성의 점차적인 증대가 뒤따랐다. [89Zr]Zr-DFO-9C9는 빠르면 24 시간 p.i.에 간에서 높은 방사능 농도를 보였고, 나중 시점에서 이 조직으로부터의 신호가 명백히 워시아웃되었다. 특히, [89Zr]Zr-DFO-9C9는 신장에서 비교적 높은 방사능 농도를 나타냈다. 이는 신체에 의한 클리어런스를 위한 콩팥 여과 컷-오프 초과인 분자량을 갖는 전장 항체-기반 방사성면역컨쥬게이트에 대한 예상치 못한 관찰이다. 추가적으로, 마우스의 신장은 MUC16 또는 MUC16 막곁 카복시-말단 도메인의 유사체를 발현하여 이 장기에서의 항체의 존재를 정당화하는 것으로 알려져 있지 않다. 게다가, [89Zr]Zr-DFO-9C9를 주사한 마우스의 종적 PET 연구로부터의 최대 세기 투영 (MIP) 이미지는 방사성면역컨쥬게이트의 24 시간 - 96 시간 p.i. 사이에 신장으로부터의 활성이 점차적으로 워시아웃되는 것을 나타낸다. 그럴듯하게, 초기 시점에서의 마우스의 간 및 신장의 높은 방사능 농도는, 고도로 관류된 이들 장기 및 9C9 항체의 느린 인 비보 약동학의 조합으로 인해 발생할 수 있다. [89Zr]Zr-DFO-9C9의 72 및 96 시간 p.i의 MIP 이미지에서 볼 수 있는 심장 및 대동맥궁의 PET 신호에 의해 입증된 전신 순환 활동의 지속성은 종양에 의해 제공되는 표적 싱크의 존재에도 불구하고 이 항체에 대한 매우 느린 인 비보 약동학적 프로파일을 시사한다. 이러한 인 비보 관찰은 이 연구의 이전 단계에서 9C9 항체에 의해 입증된 비교적 느린 인 비트로 세포 흡수 프로파일을 확증한다.
반면, 방사성면역컨쥬게이트 주사 후 24 시간 간격의 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 연속 PET 이미징 (도 2b)은 24 시간 p.i.에서 피하 SKOV3c114 종양을 묘사하였다. [89Zr]Zr-DFO-9C9 대 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 연속 PET 이미지의 대접전 비교는 초기 시점에서의 SKOV3c114 종양의 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 방사능 농도가 [89Zr]Zr-DFO-9C9의 것보다 더 높았음을 시사한다. [89Zr]Zr-DFO-4H11은 또한 24 시간 p.i.에서의 간의 방사능 흡수를 나타내었지만, 이 장기의 활성 농도는 나중 시점에서 감소한 반면 종양에서의 활성 증대는 방사성면역컨쥬게이트의 최대 96 시간 p.i.로 점진적으로 증가하였다. 종양 (항체에 대한 일차 표적 싱크) 및 간 (외인성 면역글로불린에 대한 클리어런스 부위) 이외에, [89Zr]Zr-DFO-4H11을 주사한 마우스에 대한 MIP 이미지는 겨드랑이 림프절에서 양측 대칭 PET 병소를 보여주었다. 이러한 이상(anomaly) 외에도, [89Zr]Zr-DFO-4H11의 인 비보 방사성약리학적 프로파일은 대응하는 [89Zr]Zr-DFO-9C9에 비해 더 유리하였다. [89Zr]Zr-DFO-4H11은 빠르면 24 시간에서의 SKOV3c114 종양에서의 비교적 빠른 흡수, 및 나중 시점에서의 간을 제외한 전신 순환 및 배경 장기에 남아 있는 최소 활성으로 인해, 고대비 PET 이미지를 산출하였다.
PET 이미징으로부터의 관찰은 독립적인 생체분포 연구에 의해 확증되었고, 여기서 종양 및 관심 장기는 피하 SKOV3c114 이종이식편에서 방사성면역컨쥬게이트의 96 시간 p.i.에 수확하였다 (도 6c). 종양에서 항체 결합 및 활성 흡수의 특이성을 검증하기 위해, 두 방사성면역컨쥬게이트의 인 비보 생체분포 연구에 차단 아암을 포함하였다. 피하 SKOV3c114 이종이식편에 각각 [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 특이적인 흡수를 차단하기 위해 표지되지 않은 9C9 또는 4H11 항체의 50-배 과량 (질량)을 공동-주사하였다. 방사성면역컨쥬게이트의 표적-매개된 흡수 및 이의 연관 활성은 감소할 것으로 예상되지만, 비-특이적인 흡수를 나타내는 조직의 활성 농도는 변하지 않을 것으로 예상된다. 그러나, 종양에서 방사성면역컨쥬게이트의 표적-매개된 특이적 흡수의 효율적인 차단은 종종 심장, 폐, 간, 비장 및 신장을 포함하는 잘-관류된 비-표적 배경 장기에서 약간 증가된 활성 농도로 나타날 수 있다. 이는 종양에 의해 제공되는 표적-풍부 싱크의 차단으로 인한 전신 순환에서 지속되는 상당한 양의 방사성면역컨쥬게이트에 기인할 수 있다.
요약하면, [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 생체분포 프로파일은 두 방사성면역컨쥬게이트에 대한 PET 이미징 프로파일과 일치하였다. PET 이미징 연구에서 언급된 몇 가지 사례별 예외를 제외하고 대부분의 비-표적 배경 장기에서의 활성 흡수는 비슷하고 낮았다 (≤ 5 %ID/g). 구체적으로, [89Zr]Zr-DFO-9C9는 신장에서 높은 활성 농도 (11.2 ± 2.35 %ID/g)를 보였으며, 이는 이 장기에서 [89Zr]Zr-DFO-4H11 (4.3 ± 1.00 %ID/g; p-값 = 0.0016) 및 [89Zr]Zr-DFO-아이소타입 IgG (4.9 ± 0.57 %ID/g; p-값 = 0.002)의 흡수보다 유의하게 더 높았다. 50-배 과량의 표지되지 않은 9C9 항체와 공동-주사된 SKOV3c114 이종이식편은 신장에서 [89Zr]Zr-DFO-9C9로부터의 활성 흡수의 차단을 나타내지 않았으며 (13.3 ± 2.64 %ID/g), 이는 이 장기에서의 활성 흡수가 비-특이적일 수 있음을 시사한다.
흥미롭게도, PET 이미지와 달리, 비교 생체분포 연구는 96 시간 p.i.에서의 SKOV3c114 이종이식편의 간의 방사능 농도가 2 개의 MUC16-표적화 방사성면역컨쥬게이트 ([89Zr]Zr-DFO-9C9의 경우 9.1 ± 2.49 %ID/g 대 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 경우 6.3 ± 1.41 %ID/g; p-값 = 0.099) 또는 아이소타입 IgG (6.4 ± 1.02 %ID/g; p-값 = 0.091)간에 유의한 상이함이 없었음을 확인하였다. [89Zr]Zr-DFO-4H11 대 [89Zr]Zr-DFO-9C9 (4.2 ± 0.48 %ID/g; p-값 = 0.002) 또는 아이소타입 IgG (3.4 ± 0.40 %ID/g; p-값 = 0.001)를 주사한 SKOV3c114 이종이식편의 겨드랑이 림프절에서 활성 농도 (11.5 ± 2.80 %ID/g)가 상승하였음에도 불구하고, 이러한 조직의 흡수는 표지되지 않은 4H11 항체의 50-배 과량을 공동-주사한 마우스에서 차단될 수 없었기 때문에 (13.2 ± 2.72 %ID/g p -값 = 0.43), 비-특이적이었다. [89Zr]Zr-DFO-4H11이 주사된 SKOV3c114 이종이식편으로부터의 수확된 PET- 및 생체분포-양성 림프절의 H&E 염색된 섹션의 추가적인 조직병리학적 분석은 신생물 세포의 존재를 나타내지 않았다. 최종적으로, [89Zr]Zr-DFO-9C9 (18.7 ± 2.37 %ID/g) 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11 (17.4 ± 2.51 %ID/g)의 종양 흡수는 아이소타입 IgG와 비슷하고 이보다 유의하게 더 높았다 (4.7 ± 0.42 %ID/g; p-값 = 각각 0.00002 및 0.00006). 게다가, [89Zr]Zr-DFO-9C9 및 [89Zr]Zr-DFO-4H11의 종양 흡수는 MUC16-표적화된 방사성면역컨쥬게이트에 각각의 표지되지 않은 변이체의 50-배 과량을 함께 공동-주사할 때 차단될 수 있었다 (6.8 ± 1.81 %ID/g 및 7.4 ± 2.18 %ID/g) (도 4c).
종합하면, SKOV3c114에서 MUC16의 엑토도메인을 표적화하는 2 개의 주요 항체와 연관된 방사능의 종양-대-배경 장기 흡수 비를 비교하기 위해 PET 이미징 및 생체분포 연구를 사용한 인 비트로 연구 및 인 비보 평가로부터의 결과 (도 4d)는 [89Zr]Zr-DFO-4H11이 상대적으로 더 나은 인 비보 방사성약리학적 프로파일을 산출함을 나타내었다. 이러한 발견은 이전에 HGSOC 및 소엽 유방암 환자로부터 수득된 포르말린-고정된 파라핀 임베딩된 수술 표본의 면역조직화학적 염색에서 우수한 성능을 입증한 4H11 항체의 뮤린 변이체의 임상적 유용성에 대한 신뢰성을 제공한다.
실시예 3: 인간화된 4H11 항체
MUC16c114에 대한 인간화된 변이체의 결합 친화도에 대한 최소 절충을 보장하기 위해 뮤린 4H11을 인간화하였다. 인간화된 중쇄에 대한 서열을 서열번호 4로서 제공하고, 인간화된 경쇄에 대한 서열은 서열번호 2로서 제공하였다. 전임상 세팅에서 인 비트로 표적 결합 능력 및 인 비보 약리학적 프로파일의 유지를 검증하기 위해, 4H11의 인간화된 변이체 ("이하 hu4H11로서 지칭됨")를 뮤린 변이체에 대해 이전에 기재된 바와 같이 DFO와 컨쥬게이션시켰다 (도 5a). 면역컨쥬게이트의 MALDI-ToF 분석은 항체당 ~1 개의 DFO가 컨쥬게이션된 것으로 밝혀졌다. 방사성표지화 이전에, SKOV3c114 세포 대 SKOV3 세포를 사용하여 유세포 분석을 통해 DFO-면역컨쥬게이트를 표적 결합에 대해 테스트하였다.
히스토그램의 X-축에서 오른쪽으로의 형광 피크의 이동은 SKOV3c114 세포에 대한 DFO-hu4H11 면역컨쥬게이트의 양성 결합을 나타내는 반면, 염색되지 않은 세포 및 이차 항체만으로 염색된 세포와 비교하여 형광 피크에서의 이동의 결여는 SKOV3 (wt) 세포에 대한 결합의 부재를 나타내었다 (도 5b). 특히, SKOV3 (wt) 세포주는 MUC16의 발현에 의존하는 것으로 알려져 있지 않은 OvCa 서브타입인 난소 투명 세포 암종을 더 잘 나타낸다. 계속해서, 89Zr을 사용한 DFO-hu4H11의 방사성표지화는 23.6 MBq/nmol (n=9)의 몰 활성을 갖는 방사성면역컨쥬게이트의 높은 방사성화학적 수율 및 순도를 일관되게 제공하였다 (도 5c-d). [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 표적-결합 분율은 96 ± 0.53%인 것으로 밝혀졌으며, 스트렙타비딘 자기 비드 상에 포획된 비오틴화된 MUC16 펩티드-2에 대한 방사성면역컨쥬게이트의 결합은 비드 기반 방사성리간드 결합 검정에서 막대한 과량의 표지되지 않은 4H11 항체의 존재 하에 부분적으로 차단될 수 있었다 (도 5e).
인 비트로 표적-결합 능력을 특성화하는 hu4H11 면역컨쥬게이트를 이의 인 비보 생체분포 및 방사성약리학적 프로파일을 평가하기 위해 추가로 테스트하였다. 뮤린 이전모델(predecessor) 종적 PET 이미징 연구에 의해 나타난 인 비보 프로파일과 일치하게, hu4H11은 방사성면역컨쥬게이트 주사 후 초기 시점에서 피하 이종이식된 SKOV3c114 종양을 명확하게 묘사할 수 있었다 (도 6a). 전신 순환에서 일부 활성의 지속성이 72 시간 p.i.의 중간 시점에서 관찰되었지만, 대다수의 주사된 활성은 144 시간 p.i.까지 종양에서 발견되었다. 생체분포 연구로부터의 결과는 PET 이미지로부터의 관찰에 합치하였으며, 혈액 풀의 배경 활성의 감소와 동시발생하는 SKOV3c114 종양의 활성의 점차적인 증대를 보여주었다 (도 6b). [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 종양 흡수는 차단 아암에서 억압되었으며, 여기서 마우스에 표지되지 않은 hu4H11 항체의 40-배 과량 (질량 대비)을 공동-주사하고, 72 시간 p.i에서 인 비보 생체분포에 대해 평가하였다 (22.4 ± 3.65 대 14.3 ± 1.50 %ID/g; p-값 = 0.006). 이의 뮤린 이전모델과 달리, [89Zr]Zr-DFO-hu4H11은 SKOV3c114 이종이식편에서 PET-양성 겨드랑이 림프절을 나타내지 않았다. 그러나, 생체분포 연구에서 양측 겨드랑이 림프절을 수확하는 것은 36 시간 p.i.에서의 7.9 ± 1.23 %ID/g - 144 시간 p.i.에서의 10.3 ± 4.04 %ID/g 사이의 범위의 활성 농도를 나타냈다. 특히, 차단 아암에서의 마우스의 72 시간 p.i.에서의 겨드랑이 림프절의 억압된 방사능 농도의 부재는 이 조직의 흡수가 비-특이적일 수 있음을 시사하였다. 방사성추적자로서, [89Zr]Zr-DFO-hu4H11은 우수한 종양-대-배경 장기 비를 보여주었다 (도 6c). 이러한 유리한 인 비보 프로파일은 면역PET 및 표적화된 방사선요법을 위한 방사성의약품을 비롯한 hu4H11-기반 약물의 미래 개발에 좋은 징조이다.
MUC16 카복시-말단 발현 세포에 대한 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11 결합의 인 비보 특이성의 추가 조사를 SKOV3c114 세포가 nu/nu 마우스의 왼쪽 어깨에 체내이식된 종양 모델 대 오른쪽 어깨에 체내이식된 SKOV3 종양 모델의 양측 종양 모델에서 수행하였다. [89Zr]Zr-DFO-hu4H11은 SKOV3 종양에서 최소 비-특이적 흡수에 비해 이 종양에서 방사능의 높은 종양 흡수에 의해 나타난 바와 같이 SKOV3c114 세포에 의해 발현된 표적에 대한 결합에 대해 우수한 특이성을 입증하였다 (도 7a). 후자는 일반적으로 불량한 혈관형성된 고형 종양 조직에서 전장 항체-기반 이미징제의 인 비보 향상된 투과성 및 잔류에 기인한다.
[89Zr]Zr-DFO-hu4H11이 주사된 마우스로부터의 양측 종양의 엑스 비보 분석은 MUC16 카복시-말단-발현 SKOV3c114 종양의 혈관주위 공간 및 건강한 종양 세포가 풍부한 영역에서 방사능의 초점성 축적을 밝혀냈다 (도 7b 및 7c; 파선 원). 반면, SKOV3c114 종양의 괴사 영역 (도 7b 및 7c; 파선 삼각형)은 방사능의 부재를 나타냈다. 양측 종양 모델에서 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 PET 이미지와 일치하게, 표적-음성 SKOV3 종양은 최소의 방사능 축적을 나타냈다 (도 7b). 양측 종양의 H&E 염색을 통한 조직병리학적 분석은 난소 투명 세포 암종을 대표하는 세포주인 SKOV3 세포의 특성화인 투명한 세포질의 전형적인 세포 형태학과 현저하게 구별되는 아키텍처 및 형태학적 특징을 지닌 SKOV3c114 종양을 밝혀냈다 (도 7d). 이전 보고서는 NIH/3T3 세포에서 MUC16의 카복시-말단 도메인의 발현이 형질전환을 유도하고 이 세포주에서 전이 특성을 강화하는 반면, SKOV3 세포에서 카복시-말단 도메인의 이소성 발현이 인 비트로 세포 운동성 및 침윤성 및 인비보 종양형성능을 증가시킴을 나타냈다.
MUC16 펩티드-2를 인공적으로 과잉발현하지 않는 모델에서 4H11-기반 방사성추적자의 유용성을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 HGSOC의 대표적인 세포주이며 MUC16의 방대한 양을 자연적으로 발현하는 OVCAR3 세포를 사용하여 피하 이종이식편 모델을 개발하였다. 이 모델에서 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 PET 이미지는 72 시간 p.i.의 중간 시점에서 OVCAR3 종양의 높은 방사능 농도를 보여주었다 (도 8a). 최종적으로, 임상에서 면역PET 약제로서 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11을 사용하기 위한 실현가능성을 조사하고 개념 증명을 입증하기 위해, 본 발명자들은 HGSOC를 대표하는 환자-유래된 이종이식 (PDX) 모델을 사용하였다. 이 모델에서 [89Zr]Zr-DFO-hu4H11의 PET 이미지는 72 시간 p.i.에서 PDX 종양의 높은 방사능 농도를 나타냈다. 특히, OVCAR3뿐만 아니라 PDX 모델로부터의 PET 이미지는 마우스의 심장 및 하행 대동맥을 포함하는 혈액 풀 (BP)에서 지속되는 배경 활성을 나타냈다. 이는 인간화된 4H11 항체를 이용한 이전 실험으로부터의 관찰과 일치하며 (도 5-7), 종양(들)에 의해 제공되는 표적 싱크 부피와 독립적인 현상인 것으로 보인다. 전신 순환에서의 활성의 지속성은 인 비보에서 항체의 약동학 및 생물학적 반감기의 특성화 특징을 나타낼 수 있다.
이 연구는 항체-기반 약물의 개발 동안 최상의 후보를 식별하기 위한 방사성약리학적 스크리닝의 유용성을 강조하였다. 결합 친화도 및 세포 내재화 비율을 포함하여 항체의 주요 특징을 특성화하기 위한 몇 가지 핵 및 표지가 없는 생물물리학적 및 생화학적 분석 방법의 진화에도 불구하고, 이러한 기술은 주요 항체 후보의 인 비보 거동을 예측하거나 특성화하는 능력에서 여전히 제한된다. 인 비트로 방사측정 검정으로부터 유래된 결과는 주요 항체 후보를 더 잘 스크리닝하고 특성화할 수 있는 전략으로서 비-침윤적 핵 이미징 및 생체분포 연구에 의해 밝혀진 인 비보 방사성약리학적 프로파일과 조합하여 사용할 수 있다. 방사성약리학적 스크리닝은 항체의 인 비보 약동학의 시각화, 추적성 및 정량적 평가의 고유한 이익을 제공하며, 이 모든 것은 미세투약에도 불구하고 높은 감도로 달성할 수 있다. 이 정보를 갖는 것은 항체가 잠재적인 독성을 야기할 수 있는 비-표적 장기와 가질 수 있는 이상 상호작용을 요약하는 동시에 약물로서의 효능을 정의하기 위해 항체와 이의 동족 표적의 접근성 및 관여의 더 나은 이해 및 특성화에 기여할 수 있다.
실시예 4: 인간화된 4H11 항체의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 특성화
4H11 인간화된 항체 (H1L1, H1L2, H2L1, H2L2)의 상대적인 결합 친화도를 비오틴 CAP 칩 (GE Healthcare)을 이용하는 BIACore-X100 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 비교하였다. 검정 포맷은 비오틴화된 MUC16 펩티드-2 (TLDRSSVLVDGYSPNRNE; 서열번호 52)를 스트렙타비딘 코팅된 센서에 포획하고, 단일 주기 동역학을 사용하여 다양한 농도에서 항체를 흘려보내는 것으로 이루어졌다. 리간드 포획은 65 초 동안 분당 5 μl의 속도로 0.5 μg/ml의 비오틴화된 MUC16 펩티드-2를 흐르게 함으로써 수행하였다. 이어서, 4H11 인간화된 항체를 다양한 테스트 농도 (150 nM, 75 nM, 37.5 nM, 18.8 nM 및 9.4 nM)로 흘려보냈다. 첨가된 항체의 효과를 측정하기 위해 사용된 검정 조건은 다음과 같다: 결합 시간 2 분, 해리 시간 10 분, 유속 분당 30 μl.
모든 4 개의 항체의 상대적 결합 친화도는 1-3 nM KD와 비슷하였다 (표 5). 마우스 IgG 4H11에 대한 센서그램은 인간화된 항체와 유사한 경향을 나타냈다 (미도시됨). 그러나, 특히 고농도에서 동역학적 오프-스텝에 대해 점착성이 관찰되었다.
실시예 5: 인간화된 18C6 항체의 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 특성화
18C6 인간화된 항체 (H1L1, H1L2, H2L1, H2L2)의 상대적인 결합 친화도를 CM5 칩 (GE Healthcare)을 이용하는 BIACore-X100 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 비교하였다. 검정 포맷은 거의 포화 조건 하에서 항-마우스 IgG로 코팅된 CM5 칩 상에 4 개의 인간화된 항체 H1L1, H1L2, H2L1, H2L2, 또는 항-인간 IgG로 코팅된 CM5 칩 상에 부모 마우스 18C6 IgG를 포획하고, 다양한 농도에서 MUC16 펩티드-2 당펩티드 (TLDRSSVLVDGYSPNRNE; 서열번호 52)을 흘려보내는 것으로 이루어졌다.
리간드 포획은 인간화된 항-Muc16 항체 18C6 H1L1, 18C6 H1L2, 18C6 H2L1, 18C6 H2L2) 및 부모 18C6 마우스 항체를 포화 조건 하에서 각각의 칩에 흐르게 함으로써 수행하였다. 이어서, MUC16 펩티드-2를 다양한 테스트 농도 (150 nM, 75 nM, 37.5 nM, 18.8 nM 및 9.4 nM)로 흘려보냈다. 글리코펩티드의 효과를 측정하기 위해 사용된 검정 조건은 다음과 같다: 결합 시간 2 분, 해리 시간 10 분, 유속 분당 30 μl.
테스트된 모든 4 개의 항체의 상대적인 결합 친화도는 서로 비슷하였으며, 부모 18C6 마우스 항체와 유사하였다 (표 6).
실시예 6: 형광 활성화된 세포 분류 분석에 의한 인간화된 4H11 및 18C6 항체의 특성화
이 실시예에서, MUC16-양성 세포 (OVCAR3) 또는 MUC16 펩티드를 발현하는 세포 (SKOV3 및 A2780 형질주입체)에 결합하는 항체의 능력을 판정하였다.
OVCAR3, SKOV3 및 A2780 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)을 통해 수득하였으며, 공급자의 설명서에 따라 배양물 중 유지하였다. MUC16 발현 세포주는, MUC16-음성 인간 난소암 세포주 (SKOV3 및 A2780)에 녹색 형광 단백질 융합 단백질 (Stratagene, LaJolla, CA)을 생성하는 활력 phrGFP 벡터 발현 시스템을 사용하여 종양 촉진 효과에 필수적인 C-말단 MUC16의 서열 요소를 형질주입시킴으로써 생성하였다 (A2780-phrGFP-MUC16c344 및 SKOV3-phrGFP-MUC16c344). 안정한 세포주를 각각의 배양 배지에서 제네티신 (G418, Invitrogen, Grand Island, NY)을 사용하여 선택하고, 녹색 형광 단백질의 발현에 의해 단리하였다. 안정한 형질주입체를 각각 이들의 배양 배지 중 G418에서 일상적으로 유지시켰다. ΔMUC16c114 형질주입체는 추정 절단 부위에서 카복시 말단 (아미노산 1776 내지 1890)까지 MUC16 단백질의 세포 표면 발현을 갖는다. ΔMUC16c344 형질주입체는 아미노산 1547에서 카복시 말단 (아미노산 1890)까지 MUC16 단백질의 세포 표면 발현을 갖는다.
부착된 표적 세포를 0.05% 트립신 및 0.1% EDTA로 제거하고, 세척하고, 혈구계산기로 카운팅하였다. 세포를 튜브당 0.5 - 1 x 106 개 이상의 세포로 다중 Eppendorf 튜브에 분배하였다. 세포를 1% FCS 및 0.025% 소듐 아지드 (FACS 완충액)를 함유하는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)로 세척하였다. 내부 FACS 염색을 위해, Eppendorf 튜브의 세포를 1:10 희석된 FACS 투과성화 용액 2 (BD BioSciences, San Jose, CA)로 실온에서 10 분 동안 투과성화한 다음, 빙냉 FACS 완충액으로 2 회 세척하였다. 표면 FACS 염색을 위해, 세포를 얼음에서 30 분 동안 Alex Fluor 647에 컨쥬게이션된 4H11 또는 18C6 마우스 mAb 또는 4H11 또는 18C6 인간화된 항체의 1 mg/튜브 없이 또는 이와 함께 항온처리하였다. 모든 세포를 FACS 완충액으로 3 회 세척하였다. 4H11 또는 18C6 마우스 mAb로 표지된 세포를 얼음에서 30 분 동안 제2 항체 염소 항-마우스 IgG2b-PE (피코에리트린) 1 mg/튜브와 함께 추가로 항온처리한 다음, FACS 완충액으로 3 회 세척하였다. 세포를 FACS Calibur 기계로 분석하였다. 4H11 또는 18C6 마우스 mAb 검정에 대한 평균 PE 형광 및 백분율 PE 양성 세포에 대한 데이터를 도 9a 및 9b에 도시하였다. 4H11 또는 18C6 인간화된 항체 검정에 대한 평균 Alexa-647 형광 및 백분율 Alexa-647 양성 세포에 대한 데이터를 도 9c 및 9d에 도시하였다. H1L2 인간화된 4H11 항체 및 H1L1 인간화된 18C6 항체에 대한 데이터를 도시하였다.
별도의 실험에서, 4H11 항체의 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 상이한 조합을 포함하는 전장 인간화된 4H11 항체 (IgG1-Fc)를 검정하였다. 항-인간 IgG1-Fc-PE 항체를 MUC16 펩티드를 발현하는 MUC16-양성 OVCAR3 또는 SKOV3 형질주입체 세포의 형광 염색에 사용하였다. 도 10a 및 10b는 검정된 4H11 H1L1, H1L2, H2L1 및 H2L2 항체에 대한 평균 PE 형광 및 백분율 PE 양성 세포에 대한 데이터를 제공한다.
4H11 L1, L2, H1 및 H2에 대한 아미노산 서열인 가변 영역은 본원에서 각각 서열번호 2, 3, 4 및 5로서 제공하였다. 18C6 L1, L2, H1 및 H2에 대한 아미노산 서열인 가변 영역은 본원에서 각각 서열번호 20, 21, 22 및 23으로서 제공하였다.
실시예 7: 마트리겔 침윤 검정에 의한 인간화된 4H11 및 18C6 항체의 특성화
기저막 침윤의 항체 억제를 Rao, et al. (2017) ACS Chem. Biol. 12 (8): 2085-2096에 이전에 기재된 바와 같이 마트리겔 침윤 챔버에서 결정하였으며, 이는 그 전체가 참조로 원용된다. 침윤에 필요한 MUC16의 C-말단 부분을 발현하는 SKOV3 세포주를 위에 기재한 바와 같이 생성하였다. 난소암 세포 (OVCAR3, OVCA-433 및 CAOV3)를 발현하는 야생형 MUC16뿐만 아니라 형질주입된 세포를 마트리겔 침윤 챔버에 노출하기 전에 4H11 항체의 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 상이한 조합을 포함하는 전장 인간화된 4H11 항체 (IgG1-FC) 없이 또는 이를 포함하여 사전처리하였다. 침윤한 세포의 수를 카운팅하였다. 도 11은 MUC16-양성 OVCAR, VCA-433 및 CAOV3 세포주에 대한 예시적인 데이터를 도시하고, 도 12는 MUC16-발현 SKOV3 세포주 및 부모 SKOV3 세포주에 대한 예시적인 데이터를 도시한다. 돌연변이체 MUC16 펩티드 N123mut c114를 발현하는 SKOV3 세포주를 침윤에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다.
실시예 8: 항-MUC16 이중특이적 항체의 생성
이 실시예는 인간화된 4H11 및 18C6 항-MUC16 scFv로부터 항-MUC16 이중-특이적 항체 (BsAb)의 생성을 설명한다. N-말단 단부에 항-MUC16 scFv를 포함하고 C-말단 단부에 마우스 단클론 항체의 항-인간 CD3ε scFv를 포함하는 단일-쇄 BsAb를 생성하였다. 4H11 항-MUC16 BsAb 및 18C6 항-MUC16 BsAb를 표준 DNA 기술을 사용하여 부모 클론 L2K로부터 유래된 항-MUC16 scFv 및 항-인간 CD3ε scFv 항체를 코딩하는 DNA 단편을 발현 벡터에 클로닝함으로써 생성하였다. 헥사히스티딘 (His) 태그를 항체 정제 및 검출을 위해 C-말단 단부에서 항-MUC16 BsAb의 다운스트림에 삽입하였다. 예시적인 4H11 항-MUC16 BsAb에 대한 서열은 서열번호 44, 69-71 및 88-91에 제공하였다. 예시적인 18C6 항-MUC16 BsAb에 대한 서열은 서열번호 72-75 및 92-95에 제공하였다.
차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 항-MUC16 BsAb 발현 벡터로 형질주입하고, 안정한 발현을 글루타민 합성효소 (GS)-기반 방법인 메티오닌 설폭시민 (MSX)을 사용한 표준 약물 선택에 의해 달성하였다 (Fan, et al., Biotechnology Bioengineering. 109 (4), 1007-1005 (2012)). 분비된 항-MUC16 BsAb 분자를 함유하는 CHO 세포 상청액을 수집하였다. 항-MUC16 BsAb를 FPLC AKTA 시스템에 의해 HisTrap HP 컬럼 (GE healthcare)을 사용하여 정제하였다. 간단히 말해서, CHO 세포 배양물을 청징하고 낮은 이미다졸 농도 (20 mM)로 컬럼에 로딩한 다음, 등용매 높은 이미다졸 농도 용리 완충액 (500 mM)을 사용하여, 결합된 항-MUC16 이중-특이적 항체 단백질을 용리하였다. BsAb에 대한 밴드는 BsAb가 성공적으로 정제되었음을 나타내는 SDS-PAGE에 의해 관찰하였다.
실시예 9: 항-MUC16 BsAb - MUC16+ 세포 특이성
이 실시예에서, MUC16을 발현하는 암세포에 대한 결합에 대한 4H11 및 18C6 항-MUC16 BsAb의 특이성을 판정하였다. 일 연구에서, MUC16+ OVCAR3 세포주 및 MUC16- SKOV3 세포주의 2 개의 표적 세포주를 사용하였다. OVCAR3 및 SKOV3 세포주를 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)을 통해 수득하고, ATCC 문헌에 따라 배양물 중에서 유지시켰다. 2 개의 표적 세포주에 대한 항-MUC16 항체 결합의 FACS 분석을 수행하여, 항체 결합이 MUC16+ OVCAR3 세포주에서만 관찰되는지 확인하였다. SKOV3 또는 OVCAR3 세포주를 항-MUC16 Ab에 이어서 이차 항체와 함께 항온처리하거나, 대조군으로서 이차 항체만과 함께 항온처리하였다. MUC16+ OVCAR3 세포주는 대조군 세포에 대한 결합 증가를 나타낼 것으로 예상되는 반면, SKOV3은 신호가 낮거나 전혀 나타나지 않는다.
실시예 10: 항-MUC16 BsAb - 지시된 세포 세포독성
이 실시예에서, MUC16-특이적 세포 독성을 유도하는 4H11 및 18C6 항-MUC16 BsAb의 능력을 판정하였다. 4H11 항-MUC16 BsAb 및 18C6 항-MUC16 BsAb를, 16 시간 동안 5:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 MUC16+ OVCAR3 표적 세포주 또는 MUC16- SKOV3 표적 세포주 및 인간 활성화된 T 세포와 약 0.2 μg/ml의 농도에서 항온처리하였다. 세포독성을 락테이트 탈수소효소 (LDH) 방출 검정에 의해 측정하였다. BsAb는 OVCAR3 세포의 세포 용해를 유도할 수 있을 것으로 예상되는 반면, SKOV3의 세포 용해는 최소일 것으로 예상되며, 이는 MUC16+ 표적 특이성이 T 세포 활성화에 필요함을 나타낸다. 실험은 4H11 및 18C6 항-MUC16 BsAb가 MUC16+ 암 세포주의 효력있는 특이적인 사멸을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 11: NSG 마우스에서 인간 MUC16
+
전이성 난소암의 요법
이 실시예에서, 전이성 난소암의 마우스 이종이식 모델에서 4H11 및 18C6 항-MUC16 BsAb의 인 비보 치료적 효험을 판정하였다. 6-8 주령 사이의 암컷 NSG 마우스에 0 일차 (D0)에 MUC16-C114 및 GFP-LUC를 발현하도록 변형된 3 x 106 개의 SKOV3-MUC-CD 종양 세포를 복강내 (i.p.) 주사하였다. 이어서, 이들 마우스를 7 일차 (D7)에 1 x 107 개의 인간 T 세포로 정맥내 (i.v.) 치료하고, 4H11 또는 18C6 항-MUC16 BsAb의 5 μg으로 i.p. 치료하였다. 5 μg의 BsAb를 이용한 추가적인 치료를 총 6 개의 BsAb 치료에 대해 D9, D11, D14, D16 및 D18에 i.p. 투여하였다. 동물을 D14, D21, D28 및 D42에 이미징하였다.
항-MUC16 BsAb로 치료된 동물은 치료되지 않은 마우스 또는 T-세포만으로 치료된 마우스와 비교하여 지연된 질환 진행을 나타낼 것으로 예상된다. 항-MUC16 BsAb를 사용한 치료는 T-세포-단독 요법 또는 무치료와 비교하여 종양-보유 마우스에서 생존을 유의하게 연장할 것으로 예상된다. T-세포 및 항-MUC16 BsAb로 치료된 종양-보유 마우스는 항-종양 면역 반응의 유도를 나타내는 치료 7 일 후의 전신 IL-2 및 IFN-γ의 유의하게 상승된 수준을 나타낼 것으로 예상된다. 이러한 결과는 항-MUC16 BsAb의 투여가 MUC16+ 전이성 난소암의 이종발생 모델에서 질환 진행을 지연시키고 생존을 개선한다는 것을 입증한다.
실시예 12: 항-MUC16 키메라 항원 수용체 (CAR)의 생성
이 실시예는 인간화된 4H11 및 18C6 항-MUC16 scFv로부터 항-MUC16 키메라 항원 수용체 (CAR)의 생성을 설명한다. 항-CD19 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 CAR T 세포는 표준 재조합 기술을 사용하여 이전에 만들어졌으며, 이를 생성하고 이들의 활성을 특성화하는 방법에 대한 초기 공개물을 기재하였다 (Brentjens et al., Sci. Trans. Med. 5(177):177ra38 (2013), Pegram et al. Leukemia 29(2):415-22 (2015)). 4H11 및 18C6 항-MUC16 CAR T 세포는 유사하게 만들어지고 특성화될 것이다.
4H11 및 18C6 항-MUC16 scFv 서열 (예컨대, 서열번호 53-56 또는 61-64 (4H11) 및 57-60 또는 65-68 (18C6) 중 어느 하나를 포함하는 scFv 서열)을 CAR의 항원 결합 도메인을 생성하는 데 활용하였다. scFv의 가변 중쇄 및 경쇄를 (Gly4Ser)3 링커를 통해 연접하였다. 리더 펩티드 (예컨대, CD8 신호 서열; 예컨대, 서열번호 76)를, 국소화를 위해 scFv의 N-말단에 첨가하였다. 대안적인 실시양태에 있어서, c-Myc 태그를 첨가하여, 유세포 분석에 의한 CAR의 검출을 허용할 수 있다. CD8 막관통 도메인 (예컨대, 서열번호 77)은 항원 결합 도메인을 따른다. CAR의 세포질 측면에서, 4-1BB CAR T 세포의 증가된 지속성으로 인해 4-1BB (예컨대, 서열번호 78)를 공동자극 요소로서 사용하였다 (Oka et al. PNAS. 101:13885-90 (2004)). CAR은 원하는 경우 CD8 막관통 도메인의 업스트림에 스페이서 도메인을 포함하도록 최적화시킬 수 있다. CAR을 코딩하는 핵산을 4-1BB 시그널링 (예컨대, 서열번호 78) 및 CD3ζ 활성화 도메인 (예컨대, 서열번호 79)을 함유하는 SFG 레트로바이러스 벡터에 클로닝하여, 2세대 CAR을 형성할 수 있다 (Brentjens et al. Clin Cancer Res. 13(18 Pt 1):5426-35 (2007)). c-Myc 태그가 없는 임상 등급 작제물을 또한 생성할 수 있으며, 이에 대해 CAR의 검출을 허용하는 항-이디오타입 mAb를 생성할 수 있다.
안정한 HEK293T 바이러스 생산 세포주를 생성하고, 서브클로닝하고, 이전에 기재된 바와 같이 일차 인간 T 세포를 형질도입하는데 사용하였다 (Curran et al. American Society of Gene Therapy 23(4):769-78 (2015)). 형질도입 후, CAR 발현을 항-이디오타입 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 검증하여, 항-MUC16 scFv를 검출하였다.
실시예 13: 항-MUC16 키메라 항원 수용체 (CAR)의 특성화
이 실시예에서, MUC16-특이적 세포 독성을 유도하기 위해 4H11 또는 18C6 항-MUC16 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 CART 세포의 능력을 판정하였다. 활성화된 4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포를, 16 시간 동안 5:1의 이펙터:표적 (E:T) 비로 MUC16+ OVCAR3 표적 세포주 또는 MUC16- SKOV3 표적 세포주와 함께 항온처리하였다. 세포독성을 락테이트 탈수소효소 (LDH) 방출 검정에 의해 측정하였다. 4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포는 OVCAR3 세포의 세포 용해를 유도할 수 있을 것으로 예상되는 반면, SKOV3의 세포 용해는 최소일 것으로 예상되며, 이는 MUC16+ 표적 특이성이 T 세포 활성화에 필요함을 나타낸다. 실험은 4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포가 MUC16+ 암 세포주의 효력있는 특이적인 사멸을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 14: NSG 마우스에서 인간 MUC16
+
전이성 난소암의 요법
이 실시예에서, 전이성 난소암의 마우스 이종이식 모델에서 4H11 또는 18C6 항-MUC16 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 CART 세포의 인 비보 치료적 효험을 판정하였다. 6-8 주령 사이의 암컷 NSG 마우스에 0 일차 (D0)에 MUC16-C114 및 GFP-LUC를 발현하도록 변형된 3 x 106 개의 SKOV3-MUC-CD 종양 세포를 복강내 (i.p.) 주사하였다. 이어서, 이들 마우스를 1 x 107 개의 4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포 또는 대조군 T-세포로 정맥내 (i.v.) 치료하였다. 4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포를 사용한 추가적인 치료를 다중 치료를 위한 하위시퀀스(subsequence) 간격으로 정맥내 투여할 수 있다. 동물을 D14, D21, D28 및 D42에 이미징하였다.
4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포로 치료된 동물은 치료되지 않은 마우스 또는 대조군 T-세포로 치료된 마우스와 비교하여 지연된 질환 진행을 나타낼 것으로 예상된다. 4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포를 사용한 치료는 T-세포-단독 요법 또는 무치료와 비교하여 종양-보유 마우스에서 생존을 유의하게 연장할 것으로 예상된다. 4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포로 치료된 종양-보유 마우스는 항-종양 면역 반응의 유도를 나타내는 치료 7 일 후의 전신 IL-2 및 IFN-γ의 유의하게 상승된 수준을 나타낼 것으로 예상된다. 이러한 결과는 4H11 항-MUC16 CART 세포 또는 18C6 항-MUC16 CART 세포의 투여가 MUC16+ 전이성 난소암의 이종발생 모델에서 질환 진행을 지연시키고 생존을 개선한다는 것을 입증한다.
예시적인 실시양태
본 개시내용은 다음의 비-제한적인 실시양태의 관점에서 기재될 수 있다:
실시양태 1: 일 양태에서 본 출원은 뮤신 16 (MUC16) 폴리펩티드를 면역특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-뮤신 16 (MUC16) 작제물을 제공한다. 일부 실시양태에 있어서, 항체 모이어티는 다음을 포함한다: (a) (i) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 136, 137 및 138의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 가변 중쇄 (VH)이되, 여기서 서열번호 136의 아미노산 위치 1, 3, 5, 11 및 19, 서열번호 137의 아미노산 위치 5, 7, 8 및 9, 및 서열번호 138의 아미노산 위치 12, 14, 18, 22 및 23으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 124, 125 및 126의 마우스 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3에 대해 인간화되는, 가변 중쇄 (VH); 및 (ii) 각각 서열번호 14, 15 및 16의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 120, 121, 122 및 123의 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FW1), LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 가변 경쇄 (VL)이되, 여기서 서열번호 120의 위치 3, 9, 15, 18 및 22, 서열번호 122의 아미노산 위치 7 및 27, 및 서열번호 123의 아미노산 위치 3 및 9로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 104, 105, 106 및 107의 마우스 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 경쇄 (VL); 또는 (b) (i) 서열번호 4 또는 5를 포함하는 가변 중쇄 (VH); 및 (ii) 서열번호 2 또는 3을 포함하는 가변 경쇄 (VL); 또는 (c) (i) 각각 서열번호 35, 36 및 37의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 175, 176, 177 및 178의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 가변 중쇄 (VH)이되, 여기서 서열번호 175의 아미노산 위치 10, 11, 12, 13, 15, 19 및 23, 서열번호 177의 아미노산 위치 5, 14, 16, 18, 22 및 23, 및 서열번호 178의 아미노산 위치 6으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 159, 160, 161 및 162의 마우스 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 중쇄 (VH); 및 (ii) 각각 서열번호 32, 33 및 34의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 155, 156, 157 및 158의 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FW1), LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 가변 경쇄 (VL)이되, 여기서 서열번호 155의 위치 7, 9, 11 및 18, 서열번호 156의 아미노산 위치 5, 및 서열번호 157의 아미노산 위치 9 및 18로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 139, 140, 141 및 142의 마우스 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 경쇄 (VL); 또는 (d) (i) 서열번호 22 또는 23을 포함하는 가변 중쇄 (VH); 및 (ii) 서열번호 20 또는 21을 포함하는 가변 경쇄 (VL).
실시양태 2: 실시양태 1의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 (a)(i)의 HC-FW1은 서열번호 130을 포함하고/하거나; (a)(i)의 HC-FW2는 서열번호 131을 포함하고/하거나; (a)(i)의 HC-FW3은 서열번호 132를 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 112를 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 113을 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 114를 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 115를 포함한다.
실시양태 3: 실시양태 1의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 (a)(i)의 HC-FW1은 서열번호 130을 포함하고; (a)(i)의 HC-FW2는 서열번호 131을 포함하고; (a)(i)의 HC-FW3은 서열번호 132를 포함하고; (a)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 112를 포함하고; (a)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 113을 포함하고; (a)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 114를 포함하고; (a)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 115를 포함한다.
실시양태 4: 실시양태 1의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 (a)(i)의 HC-FW1은 서열번호 133을 포함하고/하거나; (a)(i)의 HC-FW2는 서열번호 134를 포함하고/하거나; (a)(i)의 HC-FW3은 서열번호 135를 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 116을 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 117을 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 118을 포함하고/하거나; (a)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 119를 포함한다.
실시양태 5: 실시양태 1의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 (a)(i)의 HC-FW1은 서열번호 133을 포함하고; (a)(i)의 HC-FW2는 서열번호 134를 포함하고; (a)(i)의 HC-FW3은 서열번호 135를 포함하고; (a)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 116을 포함하고; (a)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 117을 포함하고; (a)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 118을 포함하고; (a)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 119를 포함한다.
실시양태 6: 실시양태 1의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 (c)(i)의 HC-FW1은 서열번호 167을 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW2는 서열번호 168을 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW3은 서열번호 169를 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW4는 서열번호 170을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 147을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 148을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 149를 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 150을 포함한다.
실시양태 7: 실시양태 1의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 (c)(i)의 HC-FW1은 서열번호 167을 포함하고; (c)(i)의 HC-FW2는 서열번호 168을 포함하고; (c)(i)의 HC-FW3은 서열번호 169를 포함하고; (c)(i)의 HC-FW4는 서열번호 170을 포함하고; (c)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 147을 포함하고; (c)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 148을 포함하고; (c)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 149를 포함하고; (c)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 150을 포함한다.
실시양태 8: 실시양태 1의 항-MUC16 작제물이되, (c)(i)의 HC-FW1은 서열번호 171을 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW2는 서열번호 172를 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW3은 서열번호 173을 포함하고/하거나; (c)(i)의 HC-FW4는 서열번호 174를 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 151을 포함하고/하거나; (c) (ii)의 LC-FW2는 서열번호 152를 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 153을 포함하고/하거나; (c)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 154를 포함한다.
실시양태 9: 실시양태 1의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 (c)(i)의 HC-FW1은 서열번호 171을 포함하고; (c)(i)의 HC-FW2는 서열번호 172를 포함하고; (c)(i)의 HC-FW3은 서열번호 173을 포함하고; (c)(i)의 HC-FW4는 서열번호 174를 포함하고; (c)(ii)의 LC-FW1은 서열번호 151을 포함하고; (c)(ii)의 LC-FW2는 서열번호 152를 포함하고; (c)(ii)의 LC-FW3은 서열번호 153을 포함하고; (c)(ii)의 LC-FW4는 서열번호 154를 포함한다.
실시양태 10: 실시양태 1-7 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항체 모이어티는 MUC16의 엑토도메인에 면역특이적으로 결합한다.
실시양태 11: 실시양태 1-9 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 MUC16은 인간 MUC16이다.
실시양태 12: 실시양태 1-11 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일 쇄 Fv (scFv)이다.
실시양태 13: 실시양태 12의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항체 모이어티는 단일 쇄 Fv (scFv)이고, scFv는 서열번호 53-68 중 어느 하나를 포함한다.
실시양태 14: 실시양태 1-13 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 VH 쇄 및 VL 쇄는 인간화 VH 쇄 및 VL 쇄이다.
실시양태 15: 실시양태 1-14 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항체 모이어티는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 MUC16 c114 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합한다.
실시양태 16: 실시양태 1-15 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 마트리겔 침윤 검정에서 MUC16을 발현하는 종양 세포의 인 비트로 침윤을 억제한다.
실시양태 17: 실시양태 16의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 종양 세포는 난소 종양 세포를 포함할 수 있다.
실시양태 18: 실시양태 16 또는 17의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 MUC16은 글리코실화될 수 있다.
실시양태 19: 실시양태 18의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 MUC16은 서열번호 44에 대해 N24 또는 N30에서 N-글리코실화된다.
실시양태 20: 실시양태 1-19 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항체 모이어티는 단클론 항체이다.
실시양태 21: 실시양태 1-20 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항체 모이어티는 인간-유래 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
실시양태 22: 실시양태 21의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 중쇄 불변 영역은 감마 1, 감마 2, 감마 3 및 감마 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아이소타입을 갖는다.
실시양태 23: 실시양태 21 또는 22 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 경쇄 불변 영역은 카파 및 람다로 이루어진 군으로부터 선택된 아이소타입을 갖는다.
실시양태 24: 실시양태 1-23 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항체 모이어티는 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄를 포함하는 면역글로불린이다.
실시양태 25: 실시양태 24의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 면역글로불린은 IgG이다.
실시양태 26: 실시양태 1-24 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 단일특이적이다.
실시양태 27: 실시양태 1-24 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 다중특이적이다.
실시양태 28: 실시양태 1-24 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 다중특이적이다.
실시양태 29: 실시양태 21 또는 실시양태 28의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 다중특이적 또는 이중특이적 항-MUC16 작제물은 항-CD3 항체 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
실시양태 30: 실시양태 1-24 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 탠덤 scFv, 디아바디 (Db), 단일 쇄 디아바디 (scDb), 이중-친화도 재표적화 (DART) 항체, F(ab')2, 이중 가변 도메인 (DVD) 항체, 놉-인투-홀 (KiH) 항체, 독 앤드 록 (DNL) 항체, 화학적으로 가교된 항체, 이종다합체 항체, 또는 이종컨쥬게이트 항체이다.
실시양태 31: 실시양태 30의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 작제물은 펩티드 링커에 의해 연결된 2 개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다.
실시양태 32: 실시양태 27-31 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 MUC16을 면역특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 제1 항체 모이어티이고, 항-MUC16 작제물은 제2 항원을 면역특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티를 추가로 포함한다.
실시양태 33: 실시양태 14의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 제2 항원은 T 세포의 표면 상의 항원이다.
실시양태 34: 실시양태 33의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 제2 항원은 CD3이다.
실시양태 35: 실시양태 34의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 제2 항원은 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시양태 36: 실시양태 36의 항-MUC16 작제물이되, 제2 항원은 CD3ε이다.
실시양태 37: 실시양태 36의 항-MUC16 작제물이되, 항-MUC16 작제물은 서열번호 42, 69-75 및 88-95 중 어느 하나를 포함한다.
실시양태 38: 실시양태 1-19 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 키메라 항원 수용체 (CAR)이다.
실시양태 39: 청구항 16의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 CAR은 공동-자극 도메인을 포함한다.
실시양태 40: 실시양태 38 또는 39의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 CAR은 CD3 제타 (ζ) 쇄 세포질 시그널링 도메인을 포함한다.
실시양태 41: 실시양태 38-40 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 CAR은 서열번호 53-68 중 어느 하나의 scFv를 포함한다.
실시양태 42: 실시양태 38-41 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 CAR은 서열번호 80-87 및 97-103 중 어느 하나를 포함한다.
실시양태 43: 실시양태 1-42 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 펩티드 약제, 검출제, 이미징제, 치료제 또는 세포독성제에 추가로 컨쥬게이션된다.
실시양태 44: 서열번호 2-5, 10-13, 20-23 및 28-31 중 하나 이상의 아미노산 서열, 또는 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다.
실시양태 45: 실시양태 44의 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
실시양태 46: 프로모터에 작동가능하게 연결된 실시양태 45의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.
실시양태 47: 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물, 실시양태 44의 폴리펩티드, 실시양태 45의 폴리뉴클레오티드, 또는 실시양태 46의 벡터를 포함하는 세포이다.
실시양태 48: 실시양태 47의 세포이되, 여기서 세포는 포유동물 세포이다.
실시양태 49: 실시양태 48의 세포이되, 여기서 세포는 면역 세포이다.
실시양태 50: 실시양태 49의 세포이되, 여기서 세포는 림프구이다.
실시양태 51: 실시양태 50의 세포이되, 여기서 세포는 T 세포 또는 B 세포이다.
실시양태 52: 약학 조성물로서, 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물, 실시양태 31의 폴리펩티드, 실시양태 45의 폴리뉴클레오티드, 실시양태 46의 벡터, 또는 실시양태 47-51 중 어느 하나의 세포의 치료적 유효량; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
실시양태 53: MUC16-연관 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 환자에서 MUC16-연관 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물 또는 실시양태 52의 약학 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
실시양태 54: 실시양태 53의 방법이되, 여기서 상기 MUC16-연관 질환 또는 장애는 암이다.
실시양태 55: 실시양태 41의 방법이되, 여기서 상기 암은 난소, 폐, 췌장, 유방, 자궁, 나팔관 또는 원발성 복막의 암이다.
실시양태 56: 실시양태 41 또는 55의 방법이되, 여기서 상기 암은 전이성 암이다.
실시양태 57: 실시양태 53-56 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 약학 조성물은 환자에서의 전이를 억제하거나 감소시킨다.
실시양태 58: 실시양태 53-57 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 상기 환자는 인간 환자이다.
실시양태 59: 이펙터 세포를 생산하는 방법으로서, 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물 또는 실시양태 44의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함한다.
실시양태 60: 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물 또는 실시양태 44의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 환자로부터 단리된 하나 이상의 일차 세포에 도입하고, 환자에 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포를 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이다.
실시양태 61: 실시양태 60의 방법이되, 환자에 세포를 투여하기 전에 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 62: 실시양태 60 또는 61의 방법이되, 여기서 일차 세포는 림프구이다.
실시양태 63: 실시양태 62의 방법이되, 여기서 일차 세포는 T 세포이다.
실시양태 64: 실시양태 53-63 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 방법은 환자에 추가적인 치료제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 65: 청구항 24 내지 30 중 어느 한 항의 방법이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물이다.
실시양태 66: 샘플 중 MUC16을 검출하는 방법으로서, (a) 샘플을 실시양태 1-31 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 항-MUC16 작제물 및 샘플 중 임의의 MUC16 사이의 결합을 직접적으로 또는 간접적으로 검출하는 단계를 포함한다.
실시양태 67: 실시양태 31의 방법이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된다.
실시양태 68: 실시양태 31의 방법이되, 여기서 검출가능한 표지는 색소생산성, 효소적, 방사성 동위원소적, 동위원소적, 형광성, 독성적, 화학발광성, 핵 자기 공명 조영제이다.
실시양태 69: 실시양태 67 또는 68의 방법이되, 여기서 항-MUC16 작제물 및 샘플의 임의의 MUC16 사이의 결합은 검출가능한 표지를 검출함으로써 직접적으로 검출된다.
실시양태 70: 실시양태 66의 방법이되, 여기서 항-MUC16 작제물 및 샘플의 임의의 MUC16 사이의 결합은 이차 항체를 사용하여 간접적으로 검출된다.
실시양태 71: MUC16-연관 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법으로서, a) 개체에 실시양태 1-31 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물의 유효량을 투여하는 단계; 및 b) 항-MUC16 작제물 및 개체의 임의의 MUC16 사이의 결합 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 역치 수준을 초과하는 결합 수준은 개체가 MUC16-연관 질환 또는 장애를 가짐을 나타낸다.
실시양태 72: MUC16-연관 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법으로서, a) 개체로부터 유래된 세포를 포함하는 샘플을 실시양태 1-31 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물과 접촉시키는 단계; 및 b) 항-MUC16 작제물에 결합된 샘플 중 세포의 수를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 역치 수준을 초과하는 항-MUC16 작제물에 결합된 세포의 수에 대한 값은 개체가 MUC16-연관 질환 또는 장애를 가짐을 나타낸다.
실시양태 73: 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한, 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물, 실시양태 44의 폴리펩티드, 실시양태 45의 폴리뉴클레오티드, 실시양태 46의 벡터, 또는 실시양태 47-51 중 어느 하나의 세포의 용도이다.
실시양태 74: 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조에서, 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물, 실시양태 44의 폴리펩티드, 실시양태 45의 폴리뉴클레오티드, 실시양태 46의 벡터, 또는 실시양태 47-51 중 어느 하나의 세포의 용도이다.
실시양태 75: 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애의 진단을 위한 실시양태 1-31 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물의 용도이다.
실시양태 76: 실시양태 62-75 중 어느 하나의 용도이되, 여기서 양성 MUC16 발현과 연관된 질환 또는 장애는 암이다.
실시양태 77: 실시양태 76의 용도이되, 여기서 암은 난소암이다.
실시양태 78: 실시양태 1-43 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물, 뮤린 항-MUC16 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 사용 설명서를 포함하는 키트로서, 여기서 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합은 단편은 (a) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH), 및 각각 서열번호 14, 15 및 16의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL); 또는 (b) 각각 서열번호 35, 36 및 37의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH), 및 각각 서열번호 32, 33 및 34의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL)를 포함한다.
실시양태 79: 실시양태 78의 키트이되, 여기서 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합 단편은 항-MUC16 작제물을 사용한 치료에 반응성인 환자를 식별하는 데 사용된다.
실시양태 80: 실시양태 79의 키트이되, 여기서 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합 단편은 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학, 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC/MS), 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 면역침전 또는 면역전기영동을 통해 환자로부터 수득된 샘플에서 MUC16-발현 종양을 검출하는 데 사용된다.
실시양태 81: 실시양태 68의 항-MUC16 작제물이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 알파 방출체, 오제-방출체, 베타-방출체, 감마-방출체, 양전자-방출체 또는 x-선 방출체에 컨쥬게이션되고, 임의로 여기서 양전자-방출체는 89Zr-데스페리옥사민 B (DFO)이다.
실시양태 82: 인 비보에서 대상체의 암을 검출하는 방법으로서, (a) 실시양태 1-31 중 어느 하나의 항-MUC16 작제물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계이되, 여기서 항-MUC16 작제물은 MUC16을 발현하는 암세포에 국소화되도록 구성되고 방사성 동위원소로 표지되는, 단계; 및 (b) 참조 값보다 큰 항-MUC16 작제물에 의해 방출된 방사성 수준을 검출함으로써 대상체에서 종양의 존재를 검출하는 단계이되, 임의로 방사성 동위원소는 89Zr-데스페리옥사민 B (DFO)인, 단계를 포함한다.
실시양태 83: 실시양태 82의 방법이되, 여기서 대상체는 암으로 진단되거나 암을 갖는 것으로 의심된다.
실시양태 84: 실시양태 82 또는 83의 방법이되, 여기서 항-MUC16 작제물에 의해 방출된 방사성 수준은 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 방출 전산화 단층촬영을 사용하여 검출된다.
실시양태 85: 실시양태 82-84 중 어느 하나의 방법이되, 방사성핵종에 컨쥬게이션된 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물을 포함하는 면역컨쥬게이트의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
실시양태 86: 실시양태 82-85 중 어느 하나의 방법이되, 여기서 방사성핵종은 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소, 오제-방출체, 또는 이들의 임의의 조합이다.
등가물
본 기술은 본 출원에 기재된 특정 실시양태의 관점에서 제한되지 않으며, 이는 본 기술의 개별 양태의 단일 예시로서 의도된다. 당업자에게 명확한 바와 같이, 본 기술의 많은 변형 및 변화는 이의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다. 본 기술의 범주 내에서 기능적으로 등가인 방법 및 장치는 본원에 열거된 것들과 함께 전술한 설명으로부터 당업자에게 명확할 것이다. 이러한 변형 및 변화는 본 기술의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 기술은 특정 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않으며, 이는 물론 달라질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 전문용어는 특정 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것일 뿐이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
또한, 본 개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠시 그룹의 관점에서 기재되는 경우, 당업자는 본 개시내용이 또한 이에 의해 마쿠시 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 관점에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 모든 목적을 위해, 특히 서면 설명을 제공하는 관점에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 이의 하위범위의 조합을 포함한다. 임의의 나열된 범위는 동일한 범위를 적어도 동등한 2분의 1, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 나누어 충분히 기재하고 이를 가능하게 하는 것으로서 쉽게 인식될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1 등으로 용이하게 나눌 수 있다. 또한, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 표현은 인용된 수를 포함하고 위에서 논의한 바와 같이 이후에 하위범위로 나눌 수 있는 범위를 지칭한다. 최종적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3 개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2 또는 3 개의 세포를 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1-5 개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 세포 등을 갖는 그룹을 지칭한다.
본원에 언급되거나 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 공개물은 본 명세서의 명시적 교시와 일치하지 않는 정도까지 모든 도면 및 표를 포함하여 그 전체가 참조로 원용된다.
본 개시내용은 본 출원에 기재된 특정 실시양태의 관점에서 제한되지 않으며, 이는 본 개시내용의 개별 양태의 단일 예시로서 의도된다. 본 개시내용의 모든 다양한 실시양태가 본원에 기재되지는 않을 것이다. 당업자에게 명확한 바와 같이, 본 개시내용의 많은 변형 및 변화는 이의 정신 및 범주를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다. 본 개시내용의 범주 내에서 기능적으로 등가인 방법 및 장치는 본원에 열거된 것들과 함께 전술한 설명으로부터 당업자에게 명확할 것이다. 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구항의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 개시내용은 첨부된 청구항의 관점에 의해서만, 이러한 청구항이 적격인 등가물의 전체 범주와 함께 제한된다.
본 개시내용은 특정 용도, 방법, 시약, 화합물, 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않으며, 이는 물론 달라질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 전문용어는 특정 실시양태를 기재하는 목적을 위한 것일 뿐이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
또한, 본 개시내용의 특징 또는 양태가 마쿠시 그룹의 관점에서 기재되는 경우, 당업자는 본 개시내용이 또한 이에 의해 마쿠시 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 관점에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 임의의 모든 목적을 위해, 특히 서면 설명을 제공하는 관점에서, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 및 모든 가능한 하위범위 및 이의 하위범위의 조합을 포함한다. 임의의 나열된 범위는 동일한 범위를 적어도 동등한 2분의 1, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 나누어 충분히 기재하고 이를 가능하게 하는 것으로서 쉽게 인식될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 본원에 논의된 각각의 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1 등으로 용이하게 나눌 수 있다. 또한, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 표현은 인용된 수를 포함하고 위에서 논의한 바와 같이 이후에 하위범위로 나눌 수 있는 범위를 지칭한다. 최종적으로, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3 개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2 또는 3 개의 세포를 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1-5 개의 세포를 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 세포 등을 갖는 그룹을 지칭한다.
SEQUENCE LISTING
<110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER
EUREKA THERAPEUTICS, INC.
<120> HUMANIZED ANTIBODIES TO MUCIN-16 AND METHODS OF USE THEREOF
<130> 115872-0832
<140> PCT/US2020/031886
<141> 2020-05-07
<150> 62/845,065
<151> 2019-05-08
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<211> 14507
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Leu Lys Pro Ser Gly Leu Pro Gly Ser Ser Ser Pro Thr Arg Ser
1 5 10 15
Leu Met Thr Gly Ser Arg Ser Thr Lys Ala Thr Pro Glu Met Asp Ser
20 25 30
Gly Leu Thr Gly Ala Thr Leu Ser Pro Lys Thr Ser Thr Gly Ala Ile
35 40 45
Val Val Thr Glu His Thr Leu Pro Phe Thr Ser Pro Asp Lys Thr Leu
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Ser Ser Val Val Gly Arg Thr Thr Gln Ser Leu Gly
65 70 75 80
Val Met Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ser Thr Ser Arg Gly Met Thr His
85 90 95
Ser Glu Gln Arg Thr Ser Pro Ser Leu Ser Pro Gln Val Asn Gly Thr
100 105 110
Pro Ser Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Ser Met Val Ser Gly Leu Ser Ser
115 120 125
Pro Arg Thr Arg Thr Ser Ser Thr Glu Gly Asn Phe Thr Lys Glu Ala
130 135 140
Ser Thr Tyr Thr Leu Thr Val Glu Thr Thr Ser Gly Pro Val Thr Glu
145 150 155 160
Lys Tyr Thr Val Pro Thr Glu Thr Ser Thr Thr Glu Gly Asp Ser Thr
165 170 175
Glu Thr Pro Trp Asp Thr Arg Tyr Ile Pro Val Lys Ile Thr Ser Pro
180 185 190
Met Lys Thr Phe Ala Asp Ser Thr Ala Ser Lys Glu Asn Ala Pro Val
195 200 205
Ser Met Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val Thr Asp Ser His Thr Pro Gly
210 215 220
Arg Thr Asn Pro Ser Phe Gly Thr Leu Tyr Ser Ser Phe Leu Asp Leu
225 230 235 240
Ser Pro Lys Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Glu Thr Ser Leu Glu Leu
245 250 255
Ile Leu Ser Thr Thr Gly Tyr Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Gly Ser
260 265 270
Ala Gly His Ser Arg Ile Ser Thr Ser Ala Pro Leu Ser Ser Ser Ala
275 280 285
Ser Val Leu Asp Asn Lys Ile Ser Glu Thr Ser Ile Phe Ser Gly Gln
290 295 300
Ser Leu Thr Ser Pro Leu Ser Pro Gly Val Pro Glu Ala Arg Ala Ser
305 310 315 320
Thr Met Pro Asn Ser Ala Ile Pro Phe Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala
325 330 335
Glu Thr Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Ile Ser Ser Leu Gly Thr
340 345 350
Pro Ser Ile Ser Thr Lys Gln Thr Ala Glu Thr Ile Leu Thr Phe His
355 360 365
Ala Phe Ala Glu Thr Met Asp Ile Pro Ser Thr His Ile Ala Lys Thr
370 375 380
Leu Ala Ser Glu Trp Leu Gly Ser Pro Gly Thr Leu Gly Gly Thr Ser
385 390 395 400
Thr Ser Ala Leu Thr Thr Thr Ser Pro Ser Thr Thr Leu Val Ser Glu
405 410 415
Glu Thr Asn Thr His His Ser Thr Ser Gly Lys Glu Thr Glu Gly Thr
420 425 430
Leu Asn Thr Ser Met Thr Pro Leu Glu Thr Ser Ala Pro Gly Glu Glu
435 440 445
Ser Glu Met Thr Ala Thr Leu Val Pro Thr Leu Gly Phe Thr Thr Leu
450 455 460
Asp Ser Lys Ile Arg Ser Pro Ser Gln Val Ser Ser Ser His Pro Thr
465 470 475 480
Arg Glu Leu Arg Thr Thr Gly Ser Thr Ser Gly Arg Gln Ser Ser Ser
485 490 495
Thr Ala Ala His Gly Ser Ser Asp Ile Leu Arg Ala Thr Thr Ser Ser
500 505 510
Thr Ser Lys Ala Ser Ser Trp Thr Ser Glu Ser Thr Ala Gln Gln Phe
515 520 525
Ser Glu Pro Gln His Thr Gln Trp Val Glu Thr Ser Pro Ser Met Lys
530 535 540
Thr Glu Arg Pro Pro Ala Ser Thr Ser Val Ala Ala Pro Ile Thr Thr
545 550 555 560
Ser Val Pro Ser Val Val Ser Gly Phe Thr Thr Leu Lys Thr Ser Ser
565 570 575
Thr Lys Gly Ile Trp Leu Glu Glu Thr Ser Ala Asp Thr Leu Ile Gly
580 585 590
Glu Ser Thr Ala Gly Pro Thr Thr His Gln Phe Ala Val Pro Thr Gly
595 600 605
Ile Ser Met Thr Gly Gly Ser Ser Thr Arg Gly Ser Gln Gly Thr Thr
610 615 620
His Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser Ala Asp Leu
625 630 635 640
Thr Leu Ala Thr Asn Gly Val Pro Val Ser Val Ser Pro Ala Val Ser
645 650 655
Lys Thr Ala Ala Gly Ser Ser Pro Pro Gly Gly Thr Lys Pro Ser Tyr
660 665 670
Thr Met Val Ser Ser Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Leu Gln Ser Ser
675 680 685
Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Leu Asn Thr Arg
690 695 700
His Pro Phe Ser Ser Pro Glu Pro Asp Ser Ala Gly His Thr Lys Ile
705 710 715 720
Ser Thr Ser Ile Pro Leu Leu Ser Ser Ala Ser Val Leu Glu Asp Lys
725 730 735
Val Ser Ala Thr Ser Thr Phe Ser His His Lys Ala Thr Ser Ser Ile
740 745 750
Thr Thr Gly Thr Pro Glu Ile Ser Thr Lys Thr Lys Pro Ser Ser Ala
755 760 765
Val Leu Ser Ser Met Thr Leu Ser Asn Ala Ala Thr Ser Pro Glu Arg
770 775 780
Val Arg Asn Ala Thr Ser Pro Leu Thr His Pro Ser Pro Ser Gly Glu
785 790 795 800
Glu Thr Ala Gly Ser Val Leu Thr Leu Ser Thr Ser Ala Glu Thr Thr
805 810 815
Asp Ser Pro Asn Ile His Pro Thr Gly Thr Leu Thr Ser Glu Ser Ser
820 825 830
Glu Ser Pro Ser Thr Leu Ser Leu Pro Ser Val Ser Gly Val Lys Thr
835 840 845
Thr Phe Ser Ser Ser Thr Pro Ser Thr His Leu Phe Thr Ser Gly Glu
850 855 860
Glu Thr Glu Glu Thr Ser Asn Pro Ser Val Ser Gln Pro Glu Thr Ser
865 870 875 880
Val Ser Arg Val Arg Thr Thr Leu Ala Ser Thr Ser Val Pro Thr Pro
885 890 895
Val Phe Pro Thr Met Asp Thr Trp Pro Thr Arg Ser Ala Gln Phe Ser
900 905 910
Ser Ser His Leu Val Ser Glu Leu Arg Ala Thr Ser Ser Thr Ser Val
915 920 925
Thr Asn Ser Thr Gly Ser Ala Leu Pro Lys Ile Ser His Leu Thr Gly
930 935 940
Thr Ala Thr Met Ser Gln Thr Asn Arg Asp Thr Phe Asn Asp Ser Ala
945 950 955 960
Ala Pro Gln Ser Thr Thr Trp Pro Glu Thr Ser Pro Arg Phe Lys Thr
965 970 975
Gly Leu Pro Ser Ala Thr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ala Thr Ser Leu
980 985 990
Ser Ala Thr Val Met Val Ser Lys Phe Thr Ser Pro Ala Thr Ser Ser
995 1000 1005
Met Glu Ala Thr Ser Ile Arg Glu Pro Ser Thr Thr Ile Leu Thr
1010 1015 1020
Thr Glu Thr Thr Asn Gly Pro Gly Ser Met Ala Val Ala Ser Thr
1025 1030 1035
Asn Ile Pro Ile Gly Lys Gly Tyr Ile Thr Glu Gly Arg Leu Asp
1040 1045 1050
Thr Ser His Leu Pro Ile Gly Thr Thr Ala Ser Ser Glu Thr Ser
1055 1060 1065
Met Asp Phe Thr Met Ala Lys Glu Ser Val Ser Met Ser Val Ser
1070 1075 1080
Pro Ser Gln Ser Met Asp Ala Ala Gly Ser Ser Thr Pro Gly Arg
1085 1090 1095
Thr Ser Gln Phe Val Asp Thr Phe Ser Asp Asp Val Tyr His Leu
1100 1105 1110
Thr Ser Arg Glu Ile Thr Ile Pro Arg Asp Gly Thr Ser Ser Ala
1115 1120 1125
Leu Thr Pro Gln Met Thr Ala Thr His Pro Pro Ser Pro Asp Pro
1130 1135 1140
Gly Ser Ala Arg Ser Thr Trp Leu Gly Ile Leu Ser Ser Ser Pro
1145 1150 1155
Ser Ser Pro Thr Pro Lys Val Thr Met Ser Ser Thr Phe Ser Thr
1160 1165 1170
Gln Arg Val Thr Thr Ser Met Ile Met Asp Thr Val Glu Thr Ser
1175 1180 1185
Arg Trp Asn Met Pro Asn Leu Pro Ser Thr Thr Ser Leu Thr Pro
1190 1195 1200
Ser Asn Ile Pro Thr Ser Gly Ala Ile Gly Lys Ser Thr Leu Val
1205 1210 1215
Pro Leu Asp Thr Pro Ser Pro Ala Thr Ser Leu Glu Ala Ser Glu
1220 1225 1230
Gly Gly Leu Pro Thr Leu Ser Thr Tyr Pro Glu Ser Thr Asn Thr
1235 1240 1245
Pro Ser Ile His Leu Gly Ala His Ala Ser Ser Glu Ser Pro Ser
1250 1255 1260
Thr Ile Lys Leu Thr Met Ala Ser Val Val Lys Pro Gly Ser Tyr
1265 1270 1275
Thr Pro Leu Thr Phe Pro Ser Ile Glu Thr His Ile His Val Ser
1280 1285 1290
Thr Ala Arg Met Ala Tyr Ser Ser Gly Ser Ser Pro Glu Met Thr
1295 1300 1305
Ala Pro Gly Glu Thr Asn Thr Gly Ser Thr Trp Asp Pro Thr Thr
1310 1315 1320
Tyr Ile Thr Thr Thr Asp Pro Lys Asp Thr Ser Ser Ala Gln Val
1325 1330 1335
Ser Thr Pro His Ser Val Arg Thr Leu Arg Thr Thr Glu Asn His
1340 1345 1350
Pro Lys Thr Glu Ser Ala Thr Pro Ala Ala Tyr Ser Gly Ser Pro
1355 1360 1365
Lys Ile Ser Ser Ser Pro Asn Leu Thr Ser Pro Ala Thr Lys Ala
1370 1375 1380
Trp Thr Ile Thr Asp Thr Thr Glu His Ser Thr Gln Leu His Tyr
1385 1390 1395
Thr Lys Leu Ala Glu Lys Ser Ser Gly Phe Glu Thr Gln Ser Ala
1400 1405 1410
Pro Gly Pro Val Ser Val Val Ile Pro Thr Ser Pro Thr Ile Gly
1415 1420 1425
Ser Ser Thr Leu Glu Leu Thr Ser Asp Val Pro Gly Glu Pro Leu
1430 1435 1440
Val Leu Ala Pro Ser Glu Gln Thr Thr Ile Thr Leu Pro Met Ala
1445 1450 1455
Thr Trp Leu Ser Thr Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Ser Thr Asp
1460 1465 1470
Leu Asp Ile Ser Ser Pro Ser Ser Pro Met Ser Thr Phe Ala Ile
1475 1480 1485
Phe Pro Pro Met Ser Thr Pro Ser His Glu Leu Ser Lys Ser Glu
1490 1495 1500
Ala Asp Thr Ser Ala Ile Arg Asn Thr Asp Ser Thr Thr Leu Asp
1505 1510 1515
Gln His Leu Gly Ile Arg Ser Leu Gly Arg Thr Gly Asp Leu Thr
1520 1525 1530
Thr Val Pro Ile Thr Pro Leu Thr Thr Thr Trp Thr Ser Val Ile
1535 1540 1545
Glu His Ser Thr Gln Ala Gln Asp Thr Leu Ser Ala Thr Met Ser
1550 1555 1560
Pro Thr His Val Thr Gln Ser Leu Lys Asp Gln Thr Ser Ile Pro
1565 1570 1575
Ala Ser Ala Ser Pro Ser His Leu Thr Glu Val Tyr Pro Glu Leu
1580 1585 1590
Gly Thr Gln Gly Arg Ser Ser Ser Glu Ala Thr Thr Phe Trp Lys
1595 1600 1605
Pro Ser Thr Asp Thr Leu Ser Arg Glu Ile Glu Thr Gly Pro Thr
1610 1615 1620
Asn Ile Gln Ser Thr Pro Pro Met Asp Asn Thr Thr Thr Gly Ser
1625 1630 1635
Ser Ser Ser Gly Val Thr Leu Gly Ile Ala His Leu Pro Ile Gly
1640 1645 1650
Thr Ser Ser Pro Ala Glu Thr Ser Thr Asn Met Ala Leu Glu Arg
1655 1660 1665
Arg Ser Ser Thr Ala Thr Val Ser Met Ala Gly Thr Met Gly Leu
1670 1675 1680
Leu Val Thr Ser Ala Pro Gly Arg Ser Ile Ser Gln Ser Leu Gly
1685 1690 1695
Arg Val Ser Ser Val Leu Ser Glu Ser Thr Thr Glu Gly Val Thr
1700 1705 1710
Asp Ser Ser Lys Gly Ser Ser Pro Arg Leu Asn Thr Gln Gly Asn
1715 1720 1725
Thr Ala Leu Ser Ser Ser Leu Glu Pro Ser Tyr Ala Glu Gly Ser
1730 1735 1740
Gln Met Ser Thr Ser Ile Pro Leu Thr Ser Ser Pro Thr Thr Pro
1745 1750 1755
Asp Val Glu Phe Ile Gly Gly Ser Thr Phe Trp Thr Lys Glu Val
1760 1765 1770
Thr Thr Val Met Thr Ser Asp Ile Ser Lys Ser Ser Ala Arg Thr
1775 1780 1785
Glu Ser Ser Ser Ala Thr Leu Met Ser Thr Ala Leu Gly Ser Thr
1790 1795 1800
Glu Asn Thr Gly Lys Glu Lys Leu Arg Thr Ala Ser Met Asp Leu
1805 1810 1815
Pro Ser Pro Thr Pro Ser Met Glu Val Thr Pro Trp Ile Ser Leu
1820 1825 1830
Thr Leu Ser Asn Ala Pro Asn Thr Thr Asp Ser Leu Asp Leu Ser
1835 1840 1845
His Gly Val His Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Ala Thr Asp Arg
1850 1855 1860
Ser Leu Asn Thr Gly Val Thr Arg Ala Ser Arg Leu Glu Asn Gly
1865 1870 1875
Ser Asp Thr Ser Ser Lys Ser Leu Ser Met Gly Asn Ser Thr His
1880 1885 1890
Thr Ser Met Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Ile
1895 1900 1905
His Pro Arg Pro Glu Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Thr Thr Leu
1910 1915 1920
Thr Ser Thr Pro Gly Asn Arg Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Phe
1925 1930 1935
Ser Ser Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Ser Thr Gly Ile Thr Ser
1940 1945 1950
Gly Pro Asp Ile Asn Ser Ala Pro Met Thr His Ser Pro Ile Thr
1955 1960 1965
Pro Pro Thr Ile Val Trp Thr Ser Thr Gly Thr Ile Glu Gln Ser
1970 1975 1980
Thr Gln Pro Leu His Ala Val Ser Ser Glu Lys Val Ser Val Gln
1985 1990 1995
Thr Gln Ser Thr Pro Tyr Val Asn Ser Val Ala Val Ser Ala Ser
2000 2005 2010
Pro Thr His Glu Asn Ser Val Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Ser
2015 2020 2025
Pro Tyr Ser Ser Ala Ser Leu Glu Ser Leu Asp Ser Thr Ile Ser
2030 2035 2040
Arg Arg Asn Ala Ile Thr Ser Trp Leu Trp Asp Leu Thr Thr Ser
2045 2050 2055
Leu Pro Thr Thr Thr Trp Pro Ser Thr Ser Leu Ser Glu Ala Leu
2060 2065 2070
Ser Ser Gly His Ser Gly Val Ser Asn Pro Ser Ser Thr Thr Thr
2075 2080 2085
Glu Phe Pro Leu Phe Ser Ala Ala Ser Thr Ser Ala Ala Lys Gln
2090 2095 2100
Arg Asn Pro Glu Thr Glu Thr His Gly Pro Gln Asn Thr Ala Ala
2105 2110 2115
Ser Thr Leu Asn Thr Asp Ala Ser Ser Val Thr Gly Leu Ser Glu
2120 2125 2130
Thr Pro Val Gly Ala Ser Ile Ser Ser Glu Val Pro Leu Pro Met
2135 2140 2145
Ala Ile Thr Ser Arg Ser Asp Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Ser
2150 2155 2160
Thr Ala Asn Pro Ser Leu Gly Thr Ala Ser Ser Ala Gly Thr Lys
2165 2170 2175
Leu Thr Arg Thr Ile Ser Leu Pro Thr Ser Glu Ser Leu Val Ser
2180 2185 2190
Phe Arg Met Asn Lys Asp Pro Trp Thr Val Ser Ile Pro Leu Gly
2195 2200 2205
Ser His Pro Thr Thr Asn Thr Glu Thr Ser Ile Pro Val Asn Ser
2210 2215 2220
Ala Gly Pro Pro Gly Leu Ser Thr Val Ala Ser Asp Val Ile Asp
2225 2230 2235
Thr Pro Ser Asp Gly Ala Glu Ser Ile Pro Thr Val Ser Phe Ser
2240 2245 2250
Pro Ser Pro Asp Thr Glu Val Thr Thr Ile Ser His Phe Pro Glu
2255 2260 2265
Lys Thr Thr His Ser Phe Arg Thr Ile Ser Ser Leu Thr His Glu
2270 2275 2280
Leu Thr Ser Arg Val Thr Pro Ile Pro Gly Asp Trp Met Ser Ser
2285 2290 2295
Ala Met Ser Thr Lys Pro Thr Gly Ala Ser Pro Ser Ile Thr Leu
2300 2305 2310
Gly Glu Arg Arg Thr Ile Thr Ser Ala Ala Pro Thr Thr Ser Pro
2315 2320 2325
Ile Val Leu Thr Ala Ser Phe Thr Glu Thr Ser Thr Val Ser Leu
2330 2335 2340
Asp Asn Glu Thr Thr Val Lys Thr Ser Asp Ile Leu Asp Ala Arg
2345 2350 2355
Lys Thr Asn Glu Leu Pro Ser Asp Ser Ser Ser Ser Ser Asp Leu
2360 2365 2370
Ile Asn Thr Ser Ile Ala Ser Ser Thr Met Asp Val Thr Lys Thr
2375 2380 2385
Ala Ser Ile Ser Pro Thr Ser Ile Ser Gly Met Thr Ala Ser Ser
2390 2395 2400
Ser Pro Ser Leu Phe Ser Ser Asp Arg Pro Gln Val Pro Thr Ser
2405 2410 2415
Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Asn
2420 2425 2430
Thr Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Ser Asn Val Gly Gly Thr Pro Ser
2435 2440 2445
Thr Leu Pro Pro Phe Thr Ile Thr His Pro Val Glu Thr Ser Ser
2450 2455 2460
Ala Leu Leu Ala Trp Ser Arg Pro Val Arg Thr Phe Ser Thr Met
2465 2470 2475
Val Ser Thr Asp Thr Ala Ser Gly Glu Asn Pro Thr Ser Ser Asn
2480 2485 2490
Ser Val Val Thr Ser Val Pro Ala Pro Gly Thr Trp Thr Ser Val
2495 2500 2505
Gly Ser Thr Thr Asp Leu Pro Ala Met Gly Phe Leu Lys Thr Ser
2510 2515 2520
Pro Ala Gly Glu Ala His Ser Leu Leu Ala Ser Thr Ile Glu Pro
2525 2530 2535
Ala Thr Ala Phe Thr Pro His Leu Ser Ala Ala Val Val Thr Gly
2540 2545 2550
Ser Ser Ala Thr Ser Glu Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ser Glu Ser
2555 2560 2565
Lys Ala Ile His Ser Ser Pro Gln Thr Pro Thr Thr Pro Thr Ser
2570 2575 2580
Gly Ala Asn Trp Glu Thr Ser Ala Thr Pro Glu Ser Leu Leu Val
2585 2590 2595
Val Thr Glu Thr Ser Asp Thr Thr Leu Thr Ser Lys Ile Leu Val
2600 2605 2610
Thr Asp Thr Ile Leu Phe Ser Thr Val Ser Thr Pro Pro Ser Lys
2615 2620 2625
Phe Pro Ser Thr Gly Thr Leu Ser Gly Ala Ser Phe Pro Thr Leu
2630 2635 2640
Leu Pro Asp Thr Pro Ala Ile Pro Leu Thr Ala Thr Glu Pro Thr
2645 2650 2655
Ser Ser Leu Ala Thr Ser Phe Asp Ser Thr Pro Leu Val Thr Ile
2660 2665 2670
Ala Ser Asp Ser Leu Gly Thr Val Pro Glu Thr Thr Leu Thr Met
2675 2680 2685
Ser Glu Thr Ser Asn Gly Asp Ala Leu Val Leu Lys Thr Val Ser
2690 2695 2700
Asn Pro Asp Arg Ser Ile Pro Gly Ile Thr Ile Gln Gly Val Thr
2705 2710 2715
Glu Ser Pro Leu His Pro Ser Ser Thr Ser Pro Ser Lys Ile Val
2720 2725 2730
Ala Pro Arg Asn Thr Thr Tyr Glu Gly Ser Ile Thr Val Ala Leu
2735 2740 2745
Ser Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Gly Ser Leu Val Phe Ser Gln
2750 2755 2760
Ser Ser Glu Asn Ser Glu Thr Thr Ala Leu Val Asp Ser Ser Ala
2765 2770 2775
Gly Leu Glu Arg Ala Ser Val Met Pro Leu Thr Thr Gly Ser Gln
2780 2785 2790
Gly Met Ala Ser Ser Gly Gly Ile Arg Ser Gly Ser Thr His Ser
2795 2800 2805
Thr Gly Thr Lys Thr Phe Ser Ser Leu Pro Leu Thr Met Asn Pro
2810 2815 2820
Gly Glu Val Thr Ala Met Ser Glu Ile Thr Thr Asn Arg Leu Thr
2825 2830 2835
Ala Thr Gln Ser Thr Ala Pro Lys Gly Ile Pro Val Lys Pro Thr
2840 2845 2850
Ser Ala Glu Ser Gly Leu Leu Thr Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser
2855 2860 2865
Pro Ser Lys Ala Phe Ala Ser Leu Thr Thr Ala Pro Pro Thr Trp
2870 2875 2880
Gly Ile Pro Gln Ser Thr Leu Thr Phe Glu Phe Ser Glu Val Pro
2885 2890 2895
Ser Leu Asp Thr Lys Ser Ala Ser Leu Pro Thr Pro Gly Gln Ser
2900 2905 2910
Leu Asn Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ala Ser Thr Ala Ser Ser Ser
2915 2920 2925
Leu Ser Lys Ser Pro Glu Lys Asn Pro Arg Ala Arg Met Met Thr
2930 2935 2940
Ser Thr Lys Ala Ile Ser Ala Ser Ser Phe Gln Ser Thr Gly Phe
2945 2950 2955
Thr Glu Thr Pro Glu Gly Ser Ala Ser Pro Ser Met Ala Gly His
2960 2965 2970
Glu Pro Arg Val Pro Thr Ser Gly Thr Gly Asp Pro Arg Tyr Ala
2975 2980 2985
Ser Glu Ser Met Ser Tyr Pro Asp Pro Ser Lys Ala Ser Ser Ala
2990 2995 3000
Met Thr Ser Thr Ser Leu Ala Ser Lys Leu Thr Thr Leu Phe Ser
3005 3010 3015
Thr Gly Gln Ala Ala Arg Ser Gly Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser
3020 3025 3030
Leu Ser Thr Glu Lys Glu Thr Ser Phe Leu Ser Pro Thr Ala Ser
3035 3040 3045
Thr Ser Arg Lys Thr Ser Leu Phe Leu Gly Pro Ser Met Ala Arg
3050 3055 3060
Gln Pro Asn Ile Leu Val His Leu Gln Thr Ser Ala Leu Thr Leu
3065 3070 3075
Ser Pro Thr Ser Thr Leu Asn Met Ser Gln Glu Glu Pro Pro Glu
3080 3085 3090
Leu Thr Ser Ser Gln Thr Ile Ala Glu Glu Glu Gly Thr Thr Ala
3095 3100 3105
Glu Thr Gln Thr Leu Thr Phe Thr Pro Ser Glu Thr Pro Thr Ser
3110 3115 3120
Leu Leu Pro Val Ser Ser Pro Thr Glu Pro Thr Ala Arg Arg Lys
3125 3130 3135
Ser Ser Pro Glu Thr Trp Ala Ser Ser Ile Ser Val Pro Ala Lys
3140 3145 3150
Thr Ser Leu Val Glu Thr Thr Asp Gly Thr Leu Val Thr Thr Ile
3155 3160 3165
Lys Met Ser Ser Gln Ala Ala Gln Gly Asn Ser Thr Trp Pro Ala
3170 3175 3180
Pro Ala Glu Glu Thr Gly Ser Ser Pro Ala Gly Thr Ser Pro Gly
3185 3190 3195
Ser Pro Glu Met Ser Thr Thr Leu Lys Ile Met Ser Ser Lys Glu
3200 3205 3210
Pro Ser Ile Ser Pro Glu Ile Arg Ser Thr Val Arg Asn Ser Pro
3215 3220 3225
Trp Lys Thr Pro Glu Thr Thr Val Pro Met Glu Thr Thr Val Glu
3230 3235 3240
Pro Val Thr Leu Gln Ser Thr Ala Leu Gly Ser Gly Ser Thr Ser
3245 3250 3255
Ile Ser His Leu Pro Thr Gly Thr Thr Ser Pro Thr Lys Ser Pro
3260 3265 3270
Thr Glu Asn Met Leu Ala Thr Glu Arg Val Ser Leu Ser Pro Ser
3275 3280 3285
Pro Pro Glu Ala Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Pro Gly Gly
3290 3295 3300
Thr Arg Gln Ser Leu Ala Thr Met Ser Ser Val Ser Leu Glu Ser
3305 3310 3315
Pro Thr Ala Arg Ser Ile Thr Gly Thr Gly Gln Gln Ser Ser Pro
3320 3325 3330
Glu Leu Val Ser Lys Thr Thr Gly Met Glu Phe Ser Met Trp His
3335 3340 3345
Gly Ser Thr Gly Gly Thr Thr Gly Asp Thr His Val Ser Leu Ser
3350 3355 3360
Thr Ser Ser Asn Ile Leu Glu Asp Pro Val Thr Ser Pro Asn Ser
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Val Ser Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys His Lys Thr Glu Thr Trp
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Val Ser Thr Thr Ala Ile Pro Ser Thr Val Leu Asn Asn Lys Ile
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Met Ala Ala Glu Gln Gln Thr Ser Arg Ser Val Asp Glu Ala Tyr
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Ser Ser Thr Ser Ser Trp Ser Asp Gln Thr Ser Gly Ser Asp Ile
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Thr Leu Gly Ala Ser Pro Asp Val Thr Asn Thr Leu Tyr Ile Thr
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Ser Thr Ala Gln Thr Thr Ser Leu Val Ser Leu Pro Ser Gly Asp
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Ser Ala Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Ile Gly Leu Glu Thr Leu
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Arg Ala Asn Val Ser Ala Val Lys Ser Asp Ile Ala Pro Thr Ala
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Thr Met Gly Thr Asn Ser Ile Ser Thr Thr Thr Pro Asn Pro Glu
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Thr Thr Ser Thr Glu His Pro Ser Thr Trp Ser Ser Thr Ala Ala
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Ser Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp Met Thr Ser Asn Leu Lys Val
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Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Asn Ala Ser
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Phe Ser Thr Asp Thr Ser Ile Val Leu Ser Glu Val Pro Thr Gly
6965 6970 6975
Thr Thr Ala Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Thr Ser Ser Gly Arg
6980 6985 6990
Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ser Gln Ser Thr Val Leu Pro Glu Ile
6995 7000 7005
Ser Thr Arg Thr Met Thr Arg Leu Phe Ala Ser Pro Thr Met Thr
7010 7015 7020
Glu Ser Ala Glu Met Thr Ile Pro Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly
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Ser Thr Ser Gln Asp Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Lys
7040 7045 7050
Ser Gln Ala Lys Thr His Ser Thr Leu Thr Gln Arg Phe Pro His
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Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Gly Pro Gly Asp Met Ser
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Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Pro Pro Ile Ser Ser
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Ser Pro Glu Leu Val Thr Ser Ser Pro Pro Lys Leu Ser His Thr
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Ser Arg Ile Gln Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Ser Pro Lys Leu
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Ser Ala Val Leu Ser Glu Val Ser Ile Gly Ala Thr Thr Glu Ile
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Gly Gln Val Lys Thr Thr Glu Val Leu Asp Ala Ser Ala Glu Pro
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Val Pro Glu Thr Thr Ser Ser Leu Ala Thr Ser Leu Gly Ala Glu
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Thr Ser Thr Ala Leu Pro Arg Thr Thr Pro Ser Val Phe Asn Arg
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Glu Ser Glu Thr Thr Ala Ser Leu Val Ser Arg Ser Gly Ala Glu
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Arg Ser Pro Val Ile Gln Thr Leu Asp Val Ser Ser Ser Glu Pro
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Thr Val Ser Lys Thr Thr Pro Asn Phe Phe His Ser Glu Leu Asp
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Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser Leu Ala Ala Lys
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Thr Val Pro Trp Thr Thr Ser Ile Phe Phe His Ser Lys Ser Asp
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Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu
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Ser Ser Gly Ala Ala Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Leu Thr His
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Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Ala Thr Glu Arg Glu Leu Gln Gly
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Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr
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Ser Gly Cys Arg Leu Ala Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Ser Ser
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Gly Thr Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
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Leu Met Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr
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Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
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Val Asp Leu Arg Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ser Pro
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Thr Ile Met Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn
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Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala
12440 12445 12450
Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu Asp Pro Lys Ser
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Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu
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Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser Val Pro Thr
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12515 12520 12525
Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu
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Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu
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Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu
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Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser
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Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
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Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr
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Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His
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Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
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Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr
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Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr
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Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Cys Pro Gly Ser Arg Lys
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Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
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Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp
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Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp
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Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val
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Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile
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Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr
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Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr
13820 13825 13830
Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
13835 13840 13845
Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
13850 13855 13860
His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu
13865 13870 13875
Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly
13880 13885 13890
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
13895 13900 13905
His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu
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Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met
13925 13930 13935
Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp
13940 13945 13950
Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser
13955 13960 13965
Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser
13970 13975 13980
Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr
13985 13990 13995
Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe
14000 14005 14010
His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro
14015 14020 14025
Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu
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Pro Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr
14045 14050 14055
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14060 14065 14070
Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr
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Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu
14090 14095 14100
Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser
14105 14110 14115
Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro
14120 14125 14130
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr
14135 14140 14145
His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr
14150 14155 14160
Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe
14165 14170 14175
Tyr Val Leu Asp Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro
14180 14185 14190
Gln Asn Leu Ser Ile Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile
14195 14200 14205
Val Asn Trp Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr
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Ile Thr Leu Leu Arg Asp Ile Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr
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14240 14245 14250
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14255 14260 14265
Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu Gln Val Phe Leu Asp
14270 14275 14280
Lys Thr Leu Asn Ala Ser Phe His Trp Leu Gly Ser Thr Tyr Gln
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Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Ser Ser Val Tyr Gln
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Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn Phe Thr
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Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Lys Ala Gln Pro Gly Thr
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Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn
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Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys
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Val Asp Ser Leu Cys Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp
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Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu Ile Gly Leu Ala Gly Leu
14450 14455 14460
Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly Val Leu Val Thr Thr
14465 14470 14475
Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val Gln Gln Gln Cys
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Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp Leu Gln
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<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 2
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
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Arg
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<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 3
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Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
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Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
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100 105 110
Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 4
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu His
65 70 75 80
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<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 6
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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<210> 7
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 7
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 8
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 9
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
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275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 10
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 10
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
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Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 11
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
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Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
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Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 12
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 12
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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450
<210> 13
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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100 105 110
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115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
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Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 14
Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln
1 5 10
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 15
Trp Ala Ser
1
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 16
Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr
1 5
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 17
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 18
Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile
1 5
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 19
Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 20
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 21
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 22
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 23
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Val Leu Thr Ile Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 24
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 25
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 25
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 26
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 27
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 28
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 29
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 30
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 30
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 31
<211> 453
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 31
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
50 55 60
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Val Val Leu Thr Ile Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 32
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 33
Tyr Met Ser
1
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 34
Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 35
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val Gly Met Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 36
Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys
1 5
<210> 37
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 37
Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 38
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 39
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 40
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 40
Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser Thr Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser
195 200 205
Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
6xHis tag
<400> 41
His His His His His His
1 5
<210> 42
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 42
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Lys Leu Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser
20 25 30
Ala Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
35 40 45
Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro
145 150 155 160
Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
165 170 175
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Glu Met Arg Leu Glu
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Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp
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Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
210 215 220
Leu His Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
275 280 285
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
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Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser
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Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
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465 470 475 480
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
485 490 495
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly
500 505 510
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Asn Leu Ser Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Thr Leu Leu
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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<220>
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polypeptide
<400> 45
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polypeptide
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 49
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
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Thr Ser Met Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Glu Val Ser Ser Ser Ile
1835 1840 1845
His Pro Arg Pro Glu Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Thr Thr Leu
1850 1855 1860
Thr Ser Thr Pro Gly Asn Arg Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Phe
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Ser Ser Ile Pro Val Glu Glu Val Ile Ser Thr Gly Ile Thr Ser
1880 1885 1890
Gly Pro Asp Ile Asn Ser Ala Pro Met Thr His Ser Pro Ile Thr
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Pro Pro Thr Ile Val Trp Thr Ser Thr Gly Thr Ile Glu Gln Ser
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Thr Gln Pro Leu His Ala Val Ser Ser Glu Lys Val Ser Val Gln
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Thr Gln Ser Thr Pro Tyr Val Asn Ser Val Ala Val Ser Ala Ser
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Pro Thr His Glu Asn Ser Val Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ser Ser
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Arg Arg Asn Ala Ile Thr Ser Trp Leu Trp Asp Leu Thr Thr Ser
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Ser Thr Leu Asn Thr Asp Ala Ser Ser Val Thr Gly Leu Ser Glu
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Thr Pro Val Gly Ala Ser Ile Ser Ser Glu Val Pro Leu Pro Met
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Ala Ile Thr Ser Arg Ser Asp Val Ser Gly Leu Thr Ser Glu Ser
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Ser Val Val Thr Ser Val Pro Ala Pro Gly Thr Trp Thr Ser Val
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2450 2455 2460
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Ser Thr Leu Pro Ala Gly Thr Thr Gly Ser Leu Val Phe Ser Gln
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Gly Met Ala Ser Ser Gly Gly Ile Arg Ser Gly Ser Thr His Ser
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Thr Ser Pro Pro Ser Val Asp Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe
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Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Thr Pro Ser Leu Ile Ser Ser Thr
4985 4990 4995
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Thr Glu Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Arg Leu Arg Glu Ser Ser
5420 5425 5430
Thr Ser Glu Lys Thr Ser Ser Thr Thr Glu Thr Asn Thr Ala Phe
5435 5440 5445
Ser Tyr Val Pro Thr Gly Ala Ile Thr Gln Ala Ser Arg Thr Glu
5450 5455 5460
Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile Ser Asp Leu Asp Arg Pro Thr
5465 5470 5475
Ile Ala Pro Asp Ile Ser Thr Gly Met Ile Thr Arg Leu Phe Thr
5480 5485 5490
Ser Pro Ile Met Thr Lys Ser Ala Glu Met Thr Val Thr Thr Gln
5495 5500 5505
Thr Thr Thr Pro Gly Ala Thr Ser Gln Gly Ile Leu Pro Trp Asp
5510 5515 5520
Thr Ser Thr Thr Leu Phe Gln Gly Gly Thr His Ser Thr Val Ser
5525 5530 5535
Gln Gly Phe Pro His Ser Glu Ile Thr Thr Leu Arg Ser Arg Thr
5540 5545 5550
Pro Gly Asp Val Ser Trp Met Thr Thr Pro Pro Val Glu Glu Thr
5555 5560 5565
Ser Ser Gly Phe Ser Leu Met Ser Pro Ser Met Thr Ser Pro Ser
5570 5575 5580
Pro Val Ser Ser Thr Ser Pro Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Leu
5585 5590 5595
Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Ser Val Leu Val Thr Thr Thr Asn
5600 5605 5610
Val Leu Gly Thr Thr Ser Pro Glu Pro Val Thr Ser Ser Pro Pro
5615 5620 5625
Asn Leu Ser Ser Pro Thr Gln Glu Arg Leu Thr Thr Tyr Lys Asp
5630 5635 5640
Thr Ala His Thr Glu Ala Met His Ala Ser Met His Thr Asn Thr
5645 5650 5655
Ala Val Ala Asn Val Gly Thr Ser Ile Ser Gly His Glu Ser Gln
5660 5665 5670
Ser Ser Val Pro Ala Asp Ser His Thr Ser Lys Ala Thr Ser Pro
5675 5680 5685
Met Gly Ile Thr Phe Ala Met Gly Asp Thr Ser Val Ser Thr Ser
5690 5695 5700
Thr Pro Ala Phe Phe Glu Thr Arg Ile Gln Thr Glu Ser Thr Ser
5705 5710 5715
Ser Leu Ile Pro Gly Leu Arg Asp Thr Arg Thr Ser Glu Glu Ile
5720 5725 5730
Asn Thr Val Thr Glu Thr Ser Thr Val Leu Ser Glu Val Pro Thr
5735 5740 5745
Thr Thr Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Val Ile Thr Ser Ser
5750 5755 5760
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5765 5770 5775
Ile Ser Thr Glu Thr Ile Thr Arg Leu Ser Thr Phe Pro Phe Val
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Thr Gly Ser Thr Glu Met Ala Ile Thr Asn Gln Thr Gly Pro Ile
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Gly Thr Ile Ser Gln Ala Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Ser Thr
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Ala Ser Trp Glu Gly Thr His Ser Pro Val Thr Gln Arg Phe Pro
5825 5830 5835
His Ser Glu Glu Thr Thr Thr Met Ser Arg Ser Thr Lys Gly Val
5840 5845 5850
Ser Trp Gln Ser Pro Pro Ser Val Glu Glu Thr Ser Ser Pro Ser
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Ser Pro Val Pro Leu Pro Ala Ile Thr Ser His Ser Ser Leu Tyr
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Ser Ala Val Ser Gly Ser Ser Pro Thr Ser Ala Leu Pro Val Thr
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Ser Leu Leu Thr Ser Gly Arg Arg Lys Thr Ile Asp Met Leu Asp
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Thr His Ser Glu Leu Val Thr Ser Ser Leu Pro Ser Ala Ser Ser
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Thr Ile His Phe Ser Glu Asn Thr Ala Glu Thr Asn Met Gly Thr
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Thr Asn Ser Met His Lys Leu His Ser Ser Val Ser Ile His Ser
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Gln Pro Ser Gly His Thr Pro Pro Lys Val Thr Gly Ser Met Met
5975 5980 5985
Glu Asp Ala Ile Val Ser Thr Ser Thr Pro Gly Ser Pro Glu Thr
5990 5995 6000
Lys Asn Val Asp Arg Asp Ser Thr Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu
6005 6010 6015
Lys Glu Asp Ser Thr Ala Leu Val Met Asn Ser Thr Thr Glu Ser
6020 6025 6030
Asn Thr Val Phe Ser Ser Val Ser Leu Asp Ala Ala Thr Glu Val
6035 6040 6045
Ser Arg Ala Glu Val Thr Tyr Tyr Asp Pro Thr Phe Met Pro Ala
6050 6055 6060
Ser Ala Gln Ser Thr Lys Ser Pro Asp Ile Ser Pro Glu Ala Ser
6065 6070 6075
Ser Ser His Ser Asn Ser Pro Pro Leu Thr Ile Ser Thr His Lys
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Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro Ser Gly Val Thr Ser Leu Gly
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Pro Ser Ala Arg Thr Gln Asp Phe Val Asp Ser Glu Thr Thr Ser
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Ser Ala Glu Glu Ala Asn Ser Leu Ser Ser Gln Ala Pro Leu Leu
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Val Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Thr Ser Thr Leu Gln Glu His
6170 6175 6180
Ser Thr Ser Ser Leu Val Ser Val Thr Ser Val Pro Thr Pro Thr
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Leu Ala Lys Ile Thr Asp Met Asp Thr Asn Leu Glu Pro Val Thr
6200 6205 6210
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Thr Thr Asp Thr His Thr Met His Pro Ser Ile Asn Thr Ala Val
6230 6235 6240
Ala Asn Val Gly Thr Thr Ser Ser Pro Asn Glu Phe Tyr Phe Thr
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Val Ser Pro Asp Ser Asp Pro Tyr Lys Ala Thr Ser Ala Val Val
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Ile Thr Ser Thr Ser Gly Asp Ser Ile Val Ser Thr Ser Met Pro
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Arg Ser Ser Ala Met Lys Lys Ile Glu Ser Glu Thr Thr Phe Ser
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Leu Ile Phe Arg Leu Arg Glu Thr Ser Thr Ser Gln Lys Ile Gly
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Ser Ser Ser Asp Thr Ser Thr Val Phe Asp Lys Ala Phe Thr Ala
6320 6325 6330
Ala Thr Thr Glu Val Ser Arg Thr Glu Leu Thr Ser Ser Ser Arg
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Thr Ser Ile Gln Gly Thr Glu Lys Pro Thr Met Ser Pro Asp Thr
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Ser Thr Arg Ser Val Thr Met Leu Ser Thr Phe Ala Gly Leu Thr
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Lys Ser Glu Glu Arg Thr Ile Ala Thr Gln Thr Gly Pro His Arg
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Ala Thr Ser Gln Gly Thr Leu Thr Trp Asp Thr Ser Ile Thr Thr
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Ser Gln Ala Gly Thr His Ser Ala Met Thr His Gly Phe Ser Gln
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Leu Asp Leu Ser Thr Leu Thr Ser Arg Val Pro Glu Tyr Ile Ser
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Leu Leu Ser Leu Pro Ala Ile Thr Ser Pro Ser Pro Val Pro Thr
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Thr Gly Pro Pro Leu Gly Ser Thr Ser Gln Gly Thr Phe Thr Leu
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Thr Asn Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly His Gly Ser Gln Ser Ser
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Val Leu Ala Asp Ser Glu Lys Thr Lys Ala Thr Ala Pro Met Asp
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Thr Thr Ser Thr Met Gly His Thr Thr Val Ser Thr Ser Met Ser
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Val Ser Ser Glu Thr Thr Lys Ile Lys Arg Glu Ser Thr Tyr Ser
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Leu Thr Pro Gly Leu Arg Glu Thr Ser Ile Ser Gln Asn Ala Ser
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Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ser Gln Ser Thr Val Leu Pro Glu Ile
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Ser Gln Ala Lys Thr His Ser Thr Leu Thr Gln Arg Phe Pro His
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Ser Arg Ile Gln Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Ser Pro Lys Leu
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Ser Ala Val Leu Ser Glu Val Ser Ile Gly Ala Thr Thr Glu Ile
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7220 7225 7230
Ser Ala Glu Ser Thr Met Leu Pro Glu Ile Ser Thr Thr Arg Lys
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Ser Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Pro Ser Leu Val Ile
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Ser Ala Met Ile Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Ala
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Ser Ser His Ser Ser Ser Ala Ser Val Thr Ser Leu Leu Thr Pro
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7520 7525 7530
Thr Met Ser Gln Asp Ile Ser Ile Gly Thr Ile Pro Arg Ile Ser
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7550 7555 7560
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Ile Gln Gly Phe Pro His Pro Glu Met Thr Thr Ser Met Gly Arg
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Gly Pro Gly Gly Val Ser Trp Pro Ser Pro Pro Phe Val Lys Glu
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Thr Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Ser Leu Pro Ala Val Thr Ser
7625 7630 7635
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7640 7645 7650
Pro Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Pro Ala Thr Thr
7655 7660 7665
Thr Asp Ile Leu Gly Thr Ser Thr Glu Pro Gly Thr Ser Ser Ser
7670 7675 7680
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Gly Thr Asn Val Ala Thr Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Ser Gln Ser
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Ser Val Leu Ala Asp Ser Ser Pro Met Cys Thr Thr Ser Thr Met
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Gly Asp Thr Ser Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Leu Glu Thr
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Arg Glu Ser Ser Gly Ser Glu Gly Thr Ser Ser Gly Thr Lys Met
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Ser Thr Val Leu Ser Lys Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr Glu Ile
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Ser Lys Glu Asp Val Thr Ser Ile Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr
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Ile Ser Pro Asp Ile Ser Thr Arg Thr Val Ser Trp Phe Ser Thr
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Ser Pro Val Met Thr Glu Ser Ala Glu Ile Thr Met Asn Thr His
7835 7840 7845
Thr Ser Pro Leu Gly Ala Thr Thr Gln Gly Thr Ser Thr Leu Asp
7850 7855 7860
Thr Ser Ser Thr Thr Ser Leu Thr Met Thr His Ser Thr Ile Ser
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Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Ser Thr Leu Met Arg Arg Gly
7880 7885 7890
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Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Glu Ser Ile Ser Ser Ser Pro
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Thr Thr Asp Thr Glu Lys Thr His Pro Ser Ser Asn Arg Thr Val
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Thr Asp Val Gly Thr Ser Ser Ser Gly His Glu Ser Thr Ser Phe
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Leu Thr Leu Gly Leu Arg Lys Thr Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ser
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Leu Leu Ser Leu Pro Ala Thr Thr Ser Pro Ser Pro Val Ser Ser
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Thr Leu Val Glu Asp Phe Pro Ser Ala Ser Leu Pro Val Thr Ser
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8240 8245 8250
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8435 8440 8445
Thr Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Thr Phe Trp Ser Gly Thr
8450 8455 8460
His Ser Thr Ala Ser Pro Gly Phe Ser His Ser Glu Met Thr Thr
8465 8470 8475
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8480 8485 8490
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8510 8515 8520
Ser Ser Ser Pro His Pro Val Thr Ala Leu Leu Thr Leu Gly Pro
8525 8530 8535
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8540 8545 8550
Ser Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala
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8600 8605 8610
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8630 8635 8640
Ser Ser Leu Thr Ser Gly Leu Arg Glu Ile Ser Thr Ser Gln Glu
8645 8650 8655
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8660 8665 8670
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8990 8995 9000
Arg Leu Ser Thr Ser Pro Ile Lys Thr Glu Ser Thr Glu Met Thr
9005 9010 9015
Ile Thr Thr Gln Thr Gly Ser Pro Gly Ala Thr Ser Arg Gly Thr
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Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Thr Phe Met Ser Gly Thr His Ser
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Thr Ala Ser Gln Gly Phe Ser His Ser Gln Met Thr Ala Leu Met
9050 9055 9060
Ser Arg Thr Pro Gly Asp Val Pro Trp Leu Ser His Pro Ser Val
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Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Ser Ser Pro Val Met
9080 9085 9090
Thr Ser Ser Ser Pro Val Ser Ser Thr Leu Pro Asp Ser Ile His
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Ser Ser Ser Leu Pro Val Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Leu Val
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Lys Thr Thr Glu Leu Leu Gly Thr Ser Ser Glu Pro Glu Thr Ser
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Ser Pro Pro Asn Leu Ser Ser Thr Ser Ala Glu Ile Leu Ala Ile
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Thr Glu Val Thr Thr Asp Thr Glu Lys Leu Glu Met Thr Asn Val
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Val Thr Ser Gly Tyr Thr His Glu Ser Pro Ser Ser Val Leu Ala
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Asp Ser Val Thr Thr Lys Ala Thr Ser Ser Met Gly Ile Thr Tyr
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Pro Thr Gly Asp Thr Asn Val Leu Thr Ser Thr Pro Ala Phe Ser
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Asp Thr Ser Arg Ile Gln Thr Lys Ser Lys Leu Ser Leu Thr Pro
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Gly Leu Met Glu Thr Ser Ile Ser Glu Glu Thr Ser Ser Ala Thr
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Glu Lys Ser Thr Val Leu Ser Ser Val Pro Thr Gly Ala Thr Thr
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Glu Val Ser Arg Thr Glu Ala Ile Ser Ser Ser Arg Thr Ser Ile
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Pro Gly Pro Ala Gln Ser Thr Met Ser Ser Asp Thr Ser Met Glu
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Thr Ile Thr Arg Ile Ser Thr Pro Leu Thr Arg Lys Glu Ser Thr
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Asp Met Ala Ile Thr Pro Lys Thr Gly Pro Ser Gly Ala Thr Ser
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Gln Gly Thr Phe Thr Leu Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ser Trp Pro
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Pro Leu Ser Val Glu Lys Asn Ser Pro Pro Ser Ser Leu Val Ser
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Ser Ser Ser Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Thr Pro Ser
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Gly Ser Ser His Ser Ser Pro Val Pro Val Thr Ser Leu Phe Thr
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Ser Ile Met Met Lys Ala Thr Asp Met Leu Asp Ala Ser Leu Glu
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Ser Leu Ala Ala Ser Lys Ala Thr Thr Glu Thr Glu Ala Ile His
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Lys Val Ile Ser Pro Val Val Thr Ser Ser Ser Ile Arg Asp Asn
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Ser Gln Gly Leu Ser His Ser Glu Met Thr Asn Leu Met Ser Arg
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Val Ala Lys Val Arg Thr Ser Ser Ser Val His Glu Ser His Ser
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Ser Val Leu Ala Asp Ser Glu Thr Thr Ile Thr Ile Pro Ser Met
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Ser Glu Ser Thr Gln Met Thr Ile Thr Thr Gln Lys Ser Ser Pro
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Pro Leu Ala Arg Thr His Ser Thr Val Pro Pro Arg Phe Leu His
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Ser Glu Met Thr Thr Leu Met Ser Arg Ser Pro Glu Asn Pro Ser
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Leu Leu Ser Leu Pro Val Thr Thr Ser Pro Ser Val Ser Ser Thr
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Leu Pro Gln Ser Ile Pro Ser Ser Ser Phe Ser Val Thr Ser Leu
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Leu Thr Pro Gly Met Val Lys Thr Thr Asp Thr Ser Thr Glu Pro
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Val Ser Arg Leu Val Thr Ser Met Val Thr Ser Leu Ala Ala Lys
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Pro Thr Val Ser Pro Gly Val Pro Gly Val Val Thr Ser Leu Val
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Val Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Ala Ser Ser Arg Ala Val
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Thr Ser Thr Thr Leu Pro Thr Leu Thr Leu Ser Pro Gly Glu Pro
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Ser Ser Arg Ala Val Thr Ser Thr Thr Ile Pro Ile Leu Thr Leu
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Ser Ser Ser Glu Pro Glu Thr Thr Pro Ser Met Ala Thr Ser His
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Gly Val Glu Ala Ser Ser Ala Val Leu Thr Val Ser Pro Glu Val
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Pro Gly Met Val Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Arg Ala Val Thr
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Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Ser Pro Thr Val Gln Gly Leu Val
11135 11140 11145
Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Ser Glu Thr Ser Ala Phe Ser
11150 11155 11160
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Val Ala His Pro Gly Thr Glu Ala Ser Ser Val Val Pro Thr Leu
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His Pro Ala Glu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Arg Thr Thr Ser Arg
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Phe Ser His Ser Glu Leu Asp Thr Met Pro Ser Thr Val Thr Ser
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Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Ile Ser Thr Thr Ile Ser Pro
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Gly Ile Pro Gly Val Leu Thr Ser Leu Val Thr Ser Ser Gly Arg
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Asp Ile Ser Ala Thr Phe Pro Thr Val Pro Glu Ser Pro His Glu
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Ser Glu Ala Thr Ala Ser Trp Val Thr His Pro Ala Val Thr Ser
11285 11290 11295
Thr Thr Val Pro Arg Thr Thr Pro Asn Tyr Ser His Ser Glu Pro
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Asp Thr Thr Pro Ser Ile Ala Thr Ser Pro Gly Ala Glu Ala Thr
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Ser Asp Phe Pro Thr Ile Thr Val Ser Pro Asp Val Pro Asp Met
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Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Gly Thr Asp Thr Ser Ile Thr
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Ile Pro Thr Leu Thr Leu Ser Ser Gly Glu Pro Glu Thr Thr Thr
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Ser Phe Ile Thr Tyr Ser Glu Thr His Thr Ser Ser Ala Ile Pro
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Thr Leu Pro Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Met Leu Thr Ser Leu
11390 11395 11400
Val Ile Ser Ser Gly Thr Asp Ser Thr Thr Thr Phe Pro Thr Leu
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Thr Glu Thr Pro Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Ile Gln Leu Ile
11420 11425 11430
His Pro Ala Glu Thr Asn Thr Met Val Pro Arg Thr Thr Pro Lys
11435 11440 11445
Phe Ser His Ser Lys Ser Asp Thr Thr Leu Pro Val Ala Ile Thr
11450 11455 11460
Ser Pro Gly Pro Glu Ala Ser Ser Ala Val Ser Thr Thr Thr Ile
11465 11470 11475
Ser Pro Asp Met Ser Asp Leu Val Thr Ser Leu Val Pro Ser Ser
11480 11485 11490
Gly Thr Asp Thr Ser Thr Thr Phe Pro Thr Leu Ser Glu Thr Pro
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Tyr Glu Pro Glu Thr Thr Ala Thr Trp Leu Thr His Pro Ala Glu
11510 11515 11520
Thr Ser Thr Thr Val Ser Gly Thr Ile Pro Asn Phe Ser His Arg
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Gly Ser Asp Thr Ala Pro Ser Met Val Thr Ser Pro Gly Val Asp
11540 11545 11550
Thr Arg Ser Gly Val Pro Thr Thr Thr Ile Pro Pro Ser Ile Pro
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Gly Val Val Thr Ser Gln Val Thr Ser Ser Ala Thr Asp Thr Ser
11570 11575 11580
Thr Ala Ile Pro Thr Leu Thr Pro Ser Pro Gly Glu Pro Glu Thr
11585 11590 11595
Thr Ala Ser Ser Ala Thr His Pro Gly Thr Gln Thr Gly Phe Thr
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Thr Thr Ser Ser Phe Ser His Ser Ser Pro Asp Ala Thr Pro Val
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Leu Gly Leu Leu Glu Thr Thr Gly Leu Leu Ala Thr Ser Ser Ser
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Thr Val Thr Ser Trp Asn Thr Glu Thr Ser Pro Ser Val Thr Ser
11855 11860 11865
Val Gly Pro Pro Glu Phe Ser Arg Thr Val Thr Gly Thr Thr Met
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Gly Glu Gly Val Ser Pro Thr Thr Ile Leu Arg Thr Thr Met Val
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Lys Thr Thr Thr Thr Phe Asn Thr Leu Ala Gly Ser Leu Phe Thr
11930 11935 11940
Pro Leu Thr Thr Pro Gly Met Ser Thr Leu Ala Ser Glu Ser Val
11945 11950 11955
Thr Ser Arg Thr Ser Tyr Asn His Arg Ser Trp Ile Ser Thr Thr
11960 11965 11970
Ser Ser Tyr Asn Arg Arg Tyr Trp Thr Pro Ala Thr Ser Thr Pro
11975 11980 11985
Val Thr Ser Thr Phe Ser Pro Gly Ile Ser Thr Ser Ser Ile Pro
11990 11995 12000
Ser Ser Thr Ala Ala Thr Val Pro Phe Met Val Pro Phe Thr Leu
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12035 12040 12045
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Arg Asn Ser Ser Leu Glu Tyr Leu Tyr
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12065 12070 12075
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Asp Leu Gly Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Asn
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Leu Thr Asn Gly Ile Gln Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg
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Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Met Pro
12125 12130 12135
Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Val Gly Thr Ser
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Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr
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His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu
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Tyr Trp Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Asp Ile Glu Glu Leu Gly
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Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
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His Gln Ser Ser Val Ser Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr
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Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Ile His His Leu Asp Pro Lys Ser
12395 12400 12405
Pro Gly Leu Asn Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu
12410 12415 12420
Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn
12425 12430 12435
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser Val Pro Thr
12440 12445 12450
Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr Ser Gly
12455 12460 12465
Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Gly Pro Leu Leu
12470 12475 12480
Val Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Lys Tyr Glu
12485 12490 12495
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu
12500 12505 12510
Arg Val Leu Gln Thr Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser
12515 12520 12525
Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ser
12530 12535 12540
Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
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Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp Arg Glu Gln Leu Tyr
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Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His
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Trp Ile Pro Val Pro Thr Ser Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
12605 12610 12615
Asp Leu Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr
12620 12625 12630
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr
12635 12640 12645
Asn Leu Lys Tyr Glu Glu Asp Met His Cys Pro Gly Ser Arg Lys
12650 12655 12660
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Ser Leu Leu Gly Pro Met
12665 12670 12675
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
12680 12685 12690
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp
12695 12700 12705
Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Val Asp
12710 12715 12720
Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile
12725 12730 12735
Lys Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val
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12755 12760 12765
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Leu Pro Ser Pro Thr Ser Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr
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12800 12805 12810
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12815 12820 12825
Gly Leu Leu Gly Pro Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu
12830 12835 12840
Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asn Gly
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<210> 52
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
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1 5 10 15
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<210> 53
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 53
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1 5 10 15
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245 250
<210> 54
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 54
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<210> 55
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 55
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<210> 56
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 56
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 57
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 57
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Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
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Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Glu Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro
180 185 190
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln
195 200 205
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Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
225 230 235 240
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 58
<211> 251
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 58
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
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Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
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Tyr Cys Thr Arg Ile Gly Thr Ala Gln Ala Thr Asp Ala Leu Asp Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 61
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
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Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln
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Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Gln
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile
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Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
195 200 205
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Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 65
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
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Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser
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Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu
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Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr
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Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
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Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 66
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
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Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 67
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Gly Met Gly Val Gly Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
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Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr
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Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
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Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 68
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
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Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Val
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Tyr Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 69
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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Lys Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
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Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Glu Met Arg Leu Glu
180 185 190
Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp
195 200 205
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
210 215 220
Leu His Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
275 280 285
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
290 295 300
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
305 310 315 320
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325 330 335
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr
340 345 350
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355 360 365
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
370 375 380
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Glu Gly Thr Ser
385 390 395 400
Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val
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Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
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Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
435 440 445
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
450 455 460
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
465 470 475 480
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
485 490 495
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly
500 505 510
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
515 520 525
<210> 70
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 70
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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Lys Leu Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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130 135 140
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
145 150 155 160
Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
165 170 175
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp
195 200 205
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
210 215 220
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly
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435 440 445
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
450 455 460
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
465 470 475 480
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
485 490 495
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly
500 505 510
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
515 520 525
<210> 71
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 71
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Lys Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
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65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
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Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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210 215 220
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225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
420 425 430
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
435 440 445
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
450 455 460
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
465 470 475 480
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
485 490 495
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500 505 510
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
515 520 525
<210> 72
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 72
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1 5 10 15
Lys Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Thr
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65 70 75 80
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Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro
145 150 155 160
Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala
225 230 235 240
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
275 280 285
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
290 295 300
Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
305 310 315 320
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
325 330 335
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr
340 345 350
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355 360 365
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr
370 375 380
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Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val
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Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
420 425 430
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
435 440 445
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
450 455 460
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
465 470 475 480
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485 490 495
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly
500 505 510
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
515 520 525
<210> 73
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 73
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Lys Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Thr
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Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
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Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
275 280 285
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Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
305 310 315 320
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
325 330 335
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Thr Asp Lys Ser Thr
340 345 350
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355 360 365
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Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
420 425 430
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
435 440 445
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
450 455 460
Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
465 470 475 480
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
485 490 495
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly
500 505 510
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
515 520 525
<210> 74
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 74
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Lys Leu Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Thr
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165 170 175
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
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Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
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Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
325 330 335
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355 360 365
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420 425 430
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
435 440 445
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<210> 75
<211> 525
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 75
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1 5 10 15
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245 250 255
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260 265 270
Gly Gly Gly Ser Asp Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
275 280 285
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Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
305 310 315 320
Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr
325 330 335
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340 345 350
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Thr Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Asp Ile Val
405 410 415
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
420 425 430
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr
435 440 445
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
450 455 460
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465 470 475 480
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala
485 490 495
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gly
500 505 510
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His His His His
515 520 525
<210> 76
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CD8 signal sequence
<400> 76
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1 5 10 15
His Ala
<210> 77
<211> 71
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CD8 transmembrane sequence
<400> 77
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
1 5 10 15
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
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35 40 45
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50 55 60
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70
<210> 78
<211> 42
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
41BB costimulatory domain
<400> 78
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 79
<211> 112
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Description of Unknown:
CD3 zeta chain
<400> 79
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1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
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100 105 110
<210> 80
<211> 497
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 80
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser
20 25 30
Ala Gly Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
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50 55 60
Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro
145 150 155 160
Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
165 170 175
Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Glu Met Arg Leu Glu
180 185 190
Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp
195 200 205
Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
210 215 220
Leu His Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met
245 250 255
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
260 265 270
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
325 330 335
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
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355 360 365
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
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Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
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420 425 430
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Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg
<210> 81
<211> 497
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 81
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro
20 25 30
Gly Gly Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
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65 70 75 80
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100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr
165 170 175
Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys
180 185 190
Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu
195 200 205
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<211> 497
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
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<400> 96
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420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg
<210> 104
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 104
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys
20
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 105
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 106
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 106
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 107
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg
1 5 10
<210> 108
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 108
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 109
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 110
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 110
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 111
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 111
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 112
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 112
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys
20
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 113
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 114
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 114
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 115
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 115
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 116
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 116
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Asn Cys
20
<210> 117
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 117
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 118
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 118
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 119
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 119
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 120
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(22)
<223> Any amino acid
<400> 120
Asp Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Xaa Ser Leu Ala Val Ser Xaa Gly
1 5 10 15
Glu Xaa Val Thr Met Xaa Cys
20
<210> 121
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 121
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 122
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (27)..(27)
<223> Any amino acid
<400> 122
Gly Val Pro Asp Arg Phe Xaa Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Xaa Ala Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Any amino acid
<400> 123
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Leu Glu Xaa Lys Arg
1 5 10
<210> 124
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 124
Ser Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 125
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 125
Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 126
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 126
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His Leu Gln
1 5 10 15
Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 127
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 127
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 128
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 128
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 129
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 129
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 130
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 130
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 131
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 131
Trp Val Arg Leu Ala Pro Glu Met Arg Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 132
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 132
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu His Leu Gln
1 5 10 15
Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 133
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 133
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 134
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 134
Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 135
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 135
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 136
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Any amino acid
<400> 136
Xaa Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Xaa Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Xaa Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 137
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(9)
<223> Any amino acid
<400> 137
Trp Val Arg Leu Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 138
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(23)
<223> Any amino acid
<400> 138
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Xaa Leu Xaa Leu Gln
1 5 10 15
Met Xaa Ser Leu Arg Xaa Xaa Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 139
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 139
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys
20
<210> 140
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 140
Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 141
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 141
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 142
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 142
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 143
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 143
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 144
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 144
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 145
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 145
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 146
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 147
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 147
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys
20
<210> 148
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 148
Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 149
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 149
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 150
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 150
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 151
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 151
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys
20
<210> 152
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 152
Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 153
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 153
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 154
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 154
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 155
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> Any amino acid
<400> 155
Asp Ile Val Met Thr Gln Xaa Ala Xaa Ser Xaa Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Xaa Val Ser Ile Ser Cys
20
<210> 156
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<400> 156
Trp Phe Leu Gln Xaa Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 157
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> Any amino acid
<400> 157
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Xaa Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 158
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 158
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 159
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 159
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210> 160
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 160
Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 161
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 161
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Ile Ala Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 162
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 162
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 163
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 163
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210> 164
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 164
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 165
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 165
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20 25 30
<210> 166
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 166
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 167
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 167
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210> 168
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 168
Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 169
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 169
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu Lys
1 5 10 15
Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 170
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 170
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 171
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 171
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210> 172
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 172
Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 173
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 173
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1 5 10 15
Ile Thr Asn Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 174
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 175
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(13)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (19)..(19)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (23)..(23)
<223> Any amino acid
<400> 175
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Gln
1 5 10 15
Thr Leu Xaa Leu Thr Cys Xaa Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20 25 30
<210> 176
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 176
Trp Ser Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 177
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)..(18)
<223> Any amino acid
<220>
<221> MOD_RES
<222> (22)..(23)
<223> Any amino acid
<400> 177
Arg Leu Thr Ile Xaa Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Xaa Leu Xaa
1 5 10 15
Ile Xaa Asn Val Asp Xaa Xaa Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg
20 25 30
<210> 178
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Any amino acid
<400> 178
Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 179
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide
<400> 179
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 180
<211> 114
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 180
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Asn Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 181
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<400> 181
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Ala Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 182
<211> 114
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic
polypeptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> Asn or Ala
<400> 182
Asn Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala Ile Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Asn Gly Thr Gln Leu Gln Xaa Phe Thr
20 25 30
Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg Asn
35 40 45
Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala Val Ile Leu
50 55 60
Ile Gly Leu Ala Gly Leu Leu Gly Val Ile Thr Cys Leu Ile Cys Gly
65 70 75 80
Val Leu Val Thr Thr Arg Arg Arg Lys Lys Glu Gly Glu Tyr Asn Val
85 90 95
Gln Gln Gln Cys Pro Gly Tyr Tyr Gln Ser His Leu Asp Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Gln
<210> 183
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 183
Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro Asn Arg
1 5 10 15
Asn Glu
Claims (40)
- 뮤신 16 (MUC16) 폴리펩티드를 면역특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-뮤신 16 (MUC16) 작제물로서, 상기 항체 모이어티는
(a) (i) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 136, 137 및 138의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2 및 HC-FW3을 포함하는 가변 중쇄 (VH)로서, 서열번호 136의 아미노산 위치 1, 3, 5, 11 및 19, 서열번호 137의 아미노산 위치 5, 7, 8 및 9, 및 서열번호 138의 아미노산 위치 12, 14, 18, 22 및 23으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 124, 125 및 126의 마우스 HC-FW1, HC-FW2 및 HC-FW3에 대해 인간화되는, 가변 중쇄 (VH); 및
(ii) 각각 서열번호 14, 15 및 16의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 120, 121, 122 및 123의 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FW1), LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 가변 경쇄 (VL)로서, 서열번호 120의 위치 3, 9, 15, 18 및 22, 서열번호 122의 아미노산 위치 7 및 27, 및 서열번호 123의 아미노산 위치 3 및 9로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 104, 105, 106 및 107의 마우스 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 경쇄 (VL); 또는
(b) (i) 서열번호 4 또는 5를 포함하는 가변 중쇄 (VH); 및
(ii) 서열번호 2 또는 3을 포함하는 가변 경쇄 (VL); 또는
(c) (i) 각각 서열번호 35, 36 및 37의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3, 및 각각 서열번호 175, 176, 177 및 178의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FW1), HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4를 포함하는 가변 중쇄 (VH)로서, 서열번호 175의 아미노산 위치 10, 11, 12, 13, 15, 19 및 23, 서열번호 177의 아미노산 위치 5, 14, 16, 18, 22 및 23, 및 서열번호 178의 아미노산 위치 6으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 159, 160, 161 및 162의 마우스 HC-FW1, HC-FW2, HC-FW3 및 HC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 중쇄 (VH); 및
(ii) 각각 서열번호 32, 33 및 34의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3, 및 각각 서열번호 155, 156, 157 및 158의 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FW1), LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4를 포함하는 가변 경쇄 (VL)로서, 서열번호 155의 위치 7, 9, 11 및 18, 서열번호 156의 아미노산 위치 5, 및 서열번호 157의 아미노산 위치 9 및 18로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은 각각 서열번호 139, 140, 141 및 142의 마우스 LC-FW1, LC-FW2, LC-FW3 및 LC-FW4에 대해 인간화되는, 가변 경쇄 (VL); 또는
(d) (i) 서열번호 22 또는 23을 포함하는 가변 중쇄 (VH); 및
(ii) 서열번호 20 또는 21을 포함하는 가변 경쇄 (VL)
를 포함하며,
여기서 상기 VH 쇄 및 VL 쇄는 인간화되고, 임의로 상기 MUC16 폴리펩티드는 인간 MUC16인, 항-뮤신 16 (MUC16) 작제물. - 제1항에 있어서,
상기 (a)(i)의 HC-FW1이 서열번호 130을 포함하고/하거나;
상기 (a)(i)의 HC-FW2가 서열번호 131을 포함하고/하거나;
상기 (a)(i)의 HC-FW3이 서열번호 132를 포함하고/하거나;
상기 (a)(ii)의 LC-FW1이 서열번호 112를 포함하고/하거나;
상기 (a)(ii)의 LC-FW2가 서열번호 113을 포함하고/하거나;
상기 (a)(ii)의 LC-FW3이 서열번호 114를 포함하고/하거나;
상기 (a)(ii)의 LC-FW4가 서열번호 115를 포함하는,
항-MUC16 작제물. - 제1항에 있어서,
상기 (a)(i)의 HC-FW1이 서열번호 133을 포함하고/하거나;
상기 (a)(i)의 HC-FW2가 서열번호 134를 포함하고/하거나;
상기 (a)(i)의 HC-FW3이 서열번호 135를 포함하고/하거나;
상기 (a)(ii)의 LC-FW1이 서열번호 116을 포함하고/하거나;
상기 (a)(ii)의 LC-FW2가 서열번호 117을 포함하고/하거나;
상기 (a)(ii)의 LC-FW3이 서열번호 118을 포함하고/하거나;
상기 (a)(ii)의 LC-FW4가 서열번호 119를 포함하는,
항-MUC16 작제물. - 제1항에 있어서,
상기 (c)(i)의 HC-FW1이 서열번호 167을 포함하고/하거나;
상기 (c)(i)의 HC-FW2가 서열번호 168을 포함하고/하거나;
상기 (c)(i)의 HC-FW3이 서열번호 169를 포함하고/하거나;
상기 (c)(i)의 HC-FW4가 서열번호 170을 포함하고/하거나;
상기 (c)(ii)의 LC-FW1이 서열번호 147을 포함하고/하거나;
상기 (c)(ii)의 LC-FW2가 서열번호 148을 포함하고/하거나;
상기 (c)(ii)의 LC-FW3이 서열번호 149를 포함하고/하거나;
상기 (c)(ii)의 LC-FW4가 서열번호 150을 포함하는,
항-MUC16 작제물. - 제1항에 있어서,
상기 (c)(i)의 HC-FW1이 서열번호 171을 포함하고/하거나;
상기 (c)(i)의 HC-FW2가 서열번호 172를 포함하고/하거나;
상기 (c)(i)의 HC-FW3이 서열번호 173을 포함하고/하거나;
상기 (c)(i)의 HC-FW4가 서열번호 174를 포함하고/하거나;
상기 (c)(ii)의 LC-FW1이 서열번호 151을 포함하고/하거나;
상기 (c)(ii)의 LC-FW2가 서열번호 152를 포함하고/하거나;
상기 (c)(ii)의 LC-FW3이 서열번호 153을 포함하고/하거나;
상기 (c)(ii)의 LC-FW4가 서열번호 154를 포함하는,
항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 모이어티가 MUC16의 엑토도메인, 또는 서열번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 MUC16 c114 폴리펩티드에 면역특이적으로 결합하는, 항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 모이어티가 전장 항체, 단클론 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv (scFv)이고, 임의로 상기 scFv가 서열번호 53-68 중 어느 하나를 포함하는, 항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
항-MUC16 작제물이 마트리겔 침윤 검정에서 MUC16-발현 종양 세포의 인 비트로(in vitro) 침윤을 억제하며, 임의로 상기 MUC16-발현 종양 세포가 난소 종양 세포인, 항-MUC16 작제물. - 제8항에 있어서,
MUC16이 서열번호 44에 대해 바람직하게는 N24 또는 N30에서 글리코실화되는, 항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 모이어티가 인간-유래 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하고, 임의로 상기 중쇄 불변 영역이 감마 1, 감마 2, 감마 3 및 감마 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아이소타입을 가지며, 임의로 상기 경쇄 불변 영역이 카파 및 람다로 이루어진 군으로부터 선택된 아이소타입을 갖는, 항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 모이어티가 2 개의 동일한 중쇄 및 2 개의 동일한 경쇄를 포함하는 면역글로불린이고, 임의로 상기 면역글로불린이 IgG인, 항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
항-MUC16 작제물이 단일특이적, 다중특이적 또는 이중특이적이며, 임의로 상기 다중특이적 또는 이중특이적 항-MUC16 작제물이 항-CD3 항체 모이어티를 포함하는, 항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 펩티드 링커에 의해 연결된 2 개의 scFv를 임의로 포함하는 탠덤 scFv; (ii) 디아바디 (Db); (iii) 단일 쇄 디아바디 (scDb); (iv) 이중-친화도 재표적화 (DART) 항체; (v) F(ab')2; (vi) 이중 가변 도메인 (DVD) 항체; (vii) 놉-인투-홀 (KiH) 항체; (viii) 독 앤드 록 (DNL) 항체; (ix) 화학적으로 가교된 항체; (x) 이종다합체 항체; 또는 (xi) 이종컨쥬게이트 항체인, 항-MUC16 작제물. - 제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 다중특이적 또는 이중특이적 항-MUC16 작제물이 MUC16을 면역특이적으로 인식하는 제1 항체 모이어티 및 제2 항원을 면역특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티를 포함하는, 항-MUC16 작제물. - 제14항에 있어서,
상기 제2 항원이 T 세포의 표면 상에 발현된 항원이고,
임의로 상기 제2 항원이 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ로 이루어진 군으로부터 선택된 CD3 폴리펩티드이고/이거나, 임의로 상기 항-MUC16 작제물이 서열번호 42, 69-75 및 88-95 중 어느 하나를 포함하는,
항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 공동-자극 도메인,
(ii) CD3 제타
(ζ) 쇄 세포질 시그널링 도메인,
(iii) 서열번호 53-68 중 어느 하나의 scFv, 또는
(iv) 서열번호 80-87 및 97-103 중 어느 하나
중 하나 이상을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)인, 항-MUC16 작제물. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
펩티드 약제, 검출제, 이미징제, 치료제 또는 세포독성제에 추가로 컨쥬게이션되는, 항-MUC16 작제물. - 제17항에 있어서,
항-MUC16 작제물이 알파 방출체, 오제(Auger)-방출체, 베타-방출체, 감마-방출체, 양전자-방출체 또는 x-선 방출체에 컨쥬게이션되며, 임의로 상기 양전자-방출체가 89Zr-데스페리옥사민 B (DFO)인, 항-MUC16 작제물. - 서열번호 2-5, 10-13, 20-23 및 28-31 중 하나 이상의 아미노산 서열 또는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
- 제19항의 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 프로모터에 작동가능하게 연결된 제20항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물, 제19항의 폴리펩티드, 제20항의 폴리뉴클레오티드 또는 제21항의 벡터를 포함하는 세포로서, 임의로 포유동물 세포, 면역 세포, 림프구, T 세포 또는 B 세포인, 세포.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물, 제19항의 폴리펩티드, 제20항의 폴리뉴클레오티드, 또는 제21항의 벡터 또는 제22항의 세포의 치료적 유효량; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약학 조성물.
- MUC16-연관 질환 또는 장애 치료를 필요로 하는 환자에서 MUC16-연관 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물 또는 제23항의 약학 조성물의 치료적 유효량을 상기 환자에 투여하는 단계를 포함하며, 임의로 상기 MUC16-연관 질환 또는 장애는 암인, 방법.
- 제24항에 있어서,
상기 암이 전이성 암 및/또는 난소, 폐, 췌장, 유방, 자궁, 나팔관 또는 원발성 복막의 암인, 방법. - 제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 약학 조성물이 환자에서의 전이를 억제 또는 감소시키고, 임의로 상기 환자가 인간 환자인, 방법. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물 또는 제19항의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산으로 세포를 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는, 이펙터 세포를 생산하는 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물 또는 제19항의 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 환자로부터 단리된 하나 이상의 일차 세포에 도입하는 단계 및
환자에 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포를 투여하는 단계
를 포함하며, 이때 임의로 상기 일차 세포는 림프구 또는 T 세포인, 치료 방법. - 제28항에 있어서,
환자에 세포를 투여하기 전에 세포를 확장하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제28항 또는 제29항에 있어서,
환자에 추가적인 치료제의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - (a) 샘플을 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물과 접촉시키는 단계; 및
(b) 항-MUC16 작제물 및 샘플 중 MUC16 폴리펩티드 사이의 직접 또는 간접 결합을 검출하는 단계
를 포함하며, 이때 임의로 상기 항-MUC16 작제물은 색소생산성 표지, 효소적 표지, 방사성 동위원소적 표지, 동위원소적 표지, 형광성 표지, 독성적 표지, 화학발광성 표지 및 핵 자기 공명 조영제 중으로부터 선택된 검출가능한 표지에 컨쥬게이션되는 것인, 샘플 중 MUC16을 검출하는 방법. - a) 개체에 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물의 유효량을 투여하는 단계; 및
b) 항-MUC16 작제물 및 개체 중 MUC16 폴리펩티드 사이의 직접 또는 간접 결합 수준을 결정하는 단계로서, 역치 수준을 초과하는 직접 또는 간접 결합 수준은 개체가 MUC16-연관 질환 또는 장애를 가짐을 나타내는, 단계
를 포함하는, MUC16-연관 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법. - a) 개체로부터 유래된 세포를 포함하는 샘플을 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물과 접촉시키는 단계; 및
b) 항-MUC16 작제물에 결합된 샘플 중 세포의 수를 결정하는 단계로서, 역치 수준을 초과하는 항-MUC16 작제물에 결합된 세포 수에 대한 값은 개체가 MUC16-연관 질환 또는 장애를 가짐을 나타내는, 단계
를 포함하는, MUC16-연관 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 개체를 진단하는 방법. - 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물, 뮤린 항-MUC16 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 사용 설명서를 포함하는 키트로서, 상기 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합 단편은
(a) 각각 서열번호 17, 18 및 19의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH), 및 각각 서열번호 14, 15 및 16의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL); 또는
(b) 각각 서열번호 35, 36 및 37의 중쇄 상보성 결정 영역 1 (HC-CDR1), HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 가변 중쇄 (VH), 및 각각 서열번호 32, 33 및 34의 경쇄 상보성 결정 영역 1 (LC-CDR1), LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 가변 경쇄 (VL)
를 포함하는, 키트. - 제34항에 있어서,
상기 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합 단편이 항-MUC16 작제물을 사용한 치료에 반응성인 환자를 식별하는데 사용되는, 키트. - 제34항 또는 제35항에 있어서,
상기 뮤린 항-MUC16 항체 또는 항원 결합 단편이 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학, 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 액체 크로마토그래피-질량 분석법 (LC/MS), 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 면역침전 또는 면역전기영동을 통해 환자로부터 수득된 샘플에서 MUC16-발현 종양을 검출하는데 사용되는, 키트. - (a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물의 유효량을 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 항-MUC16 작제물은 MUC16을 발현하는 암세포에 국소화되도록 구성되고 방사성 동위원소로 표지되는, 단계; 및
(b) 참조 값보다 큰 항-MUC16 작제물에 의해 방출된 방사성 수준을 검출함으로써 대상체에서 종양의 존재를 검출하는 단계로서, 임의로 상기 방사성 동위원소는 89Zr-데스페리옥사민 B (DFO)인, 단계
를 포함하는, 인 비보(in vivo)에서 대상체의 암을 검출하는 방법. - 제37항에 있어서,
상기 항-MUC16 작제물에 의해 방출된 방사성 수준이 양전자 방출 단층촬영 또는 단일 광자 방출 전산화 단층촬영을 사용하여 검출되는 것인, 방법. - 제37항 또는 제38항에 있어서,
방사성핵종에 컨쥬게이션된 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항-MUC16 작제물을 포함하는 면역컨쥬게이트의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법. - 제39항에 있어서,
상기 방사성핵종이 알파 입자-방출 동위원소, 베타 입자-방출 동위원소, 오제-방출체, 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
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