KR20220003079A - 검정 - Google Patents

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KR20220003079A
KR20220003079A KR1020217039494A KR20217039494A KR20220003079A KR 20220003079 A KR20220003079 A KR 20220003079A KR 1020217039494 A KR1020217039494 A KR 1020217039494A KR 20217039494 A KR20217039494 A KR 20217039494A KR 20220003079 A KR20220003079 A KR 20220003079A
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프레데릭 트리에벨
크리스텔 브리뇽
마튜 앙진
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이뮤텝 에스.에이.에스.
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Abstract

림프구-활성화 유전자 3(LAG-3)의 효능제에 대해서 스크리닝하거나 이의 활성을 결정하기 위한 검정이 기재된다. 검정에 따르면, 복수의 효과기 T 세포가 제공되며, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절된다. 효능제의 활성은, 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 변화되는 정도로부터 결정된다. 검정은 효능제의 생산에서 품질 제어 단계의 부분으로서 효능제의 제제(preparation)의 효력을 결정하기 위해서 또는 효능제의 제제의 안정성 시험을 위해서 사용될 수 있다. 검정을 수행하기 위한 키트가 또한 기재된다.

Description

검정
본 발명은 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3: lymphocyte-activation gene 3)의 효능제에 대해서 스크리닝하거나 이의 활성을 결정하기 위한 검정(이의 제제(preparation)의 효력(potency)을 결정하는 것 포함)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 검정을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.
T 세포 기능의 자극은 항원-제시 세포의 표면 상의 MHC 클래스 I 또는 II 분자(CD8 T 세포의 경우 MHC I, CD4 T 세포의 경우 MHC II)에 의해 제시된 짧은 펩티드와 T 세포 수용체(TCR)의 상호작용 시에 시작된다. 1차 T 세포에서, TCR 자체는 T 세포 활성화를 시작하기 위해 하류 경로를 활성화할 수 없다. 이것은 또한 헬퍼 T 세포를 위한 CD4 및 세포독성 T 세포를 위한 CD8과 같은 공수용체를 필요로 한다. 이들 공수용체는 각각의 MHC 분자에 결합하고, T 세포와 APC의 상호작용을 안정화시킨다. 항원-로딩된 MHC에 대한 TCR 결합 이외에, 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포 둘 다는 완전히 활성화되고 반응하기 위해 다수의 2차 신호를 필요로 한다. 헬퍼 T 세포의 경우, 이들 중 첫 번째는 CD28에 의해 제공된다. 이 단백질은 APC 상에서 발현되는 두 분자(CD80 및 CD86)에 대한 수용체이며, T-세포 증식을 개시하여, 항원에 특이적인 T 세포 클론의 확장으로 이어진다. 세포독성 T 세포는 활성화를 위해 CD28에 덜 의존하지만, CD70 및 CD137과 같은 다른 공자극성 분자로부터의 신호를 필요로 한다.
TCR은 여러 신호 전달 캐스케이드를 통한 T 세포 활성화를 매개하는 신호전달 분자의 복합체에 매우 근접하게 위치한다(TCR 신호전달의 개요에 대해서는 도 1 참조). 이러한 신호전달 분자는 단백질의 CD3 패밀리를 포함한다. TCR이 펩티드-MHC 복합체와 적절하게 결속되면, 연관된 CD3 쇄의 입체배좌 변화가 유도되는데, 이것은 인산화 및 하류 단백질과의 회합으로 이어진다. TCR 제타 쇄는 또한 TCR 결속 시 인산화된다. 이들 분자는 C-말단 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 통해, Src 키나제, 백혈구-특이적 티로신 키나제(LCK) 및 Fyn에 의해 인산화된다.
인산화된 CD3 ITAM은 Syk 패밀리 키나제 제타-활성화된 단백질 70 kDa(ZAP70)를 동원하고, 활성화한다. 그런 다음 ZAP70은 T 세포의 활성화를 위한 링커(LAT: Linker for Activation of T cell)라고 불리는 막 연관 스캐폴딩 단백질을 인산화한다. LAT는 그 다음 76 kDa(Slp-76)의 제2 분자 스캐폴드인 SH2-도메인-함유 백혈구 단백질을 동원한다. 그런 다음 Slp-76은 ZAP70에 의해 인산화되고, 생성된 LAT-Slp-76 복합체는 신호전달 효과기 분자의 동원을 위한 스캐폴드로서의 역할을 한다. 인터류킨-2 유도성 티로신 키나제(ITK: Interleukin-2 inducible tyrosine kinase)는 LAT-Slp-76 복합체와 상호작용하고, 자가-인산화(auto-phosphorylation)에 의해 활성화된다. 이것은 효과기 분자인 포스포리파제 C 감마(PLC-γ1)의 인산화를 촉진한다. PLC-γ1은 원형질막에서 포스파티딜이노시톨 트리포스페이트(PIP2)를 절단하여 2차 메신저 디아실글리세롤(DAG) 및 이노시톨 트리포스페이트(IP3)를 생성함으로써 TCR 신호를 변환한다.
막 연관 지질인 DAG는 단백질 키나제 C(PKC) 및 RAS 구아닐 뉴클레오티드-방출 단백질(RasGRP)의 다양한 이소폼을 포함하여 다수의 하류 단백질을 활성화한다. 일단 DAG에 의해 활성화되면, PKC-쎄타는 NF-κB 경로 활성화에 참여하는 반면, RasGRP는 MAPK 신호전달 경로의 중요한 활성화인자이다. IP3는 소포체로부터 세포질로 Ca2+의 유출을 자극한다. 상승된 Ca2+ 수준은 단백질 포스파타제인 칼시뉴린의 활성화를 유도하는데, 그 다음 이것은 활성화된 T 세포의 T 세포 전사 인자 핵 인자(NFAT)를 탈인산화한다. 그 다음 탈인산화된 NFAT는 핵으로 이동하여 특정 유전자의 전사 유도에서 다른 전사 인자와 결합한다.
병원체나 자가-항원에 대한 제어되지 않은 면역 반응은 염증 조직 손상 및 자가 면역 질환을 유발할 수 있다. 이를 방지하기 위해서, 면역 반응은 총괄적으로 면역 관문이라 지칭되는 공자극성 신호와 및 저해성 신호 사이의 균형에 의해 조절되는데, 이는 자가 관용(self-tolerance)을 유지하고, 조직 손상으로부터 숙주를 보호하는 데 필요하다. 활성화된 T 세포는 다수의 공자극성 수용체, 예컨대, 림프구 활성화-유전자 3(LAG-3), 예정사 단백질 1(PD-1: programmed cell death protein 1), 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA-4: cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 및 T 세포 면역글로불린 및 면역수용체 티로신-기반 저해성 모티프[ITIM] 도메인(TIGIT)을 발현한다. 저해성 면역 관문 수용체는 자가 단백질뿐만 아니라 만성 감염 및 종양 항원에 대한 T 세포 반응을 조절하는 것으로 나타났다. 저해성 면역 관문 수용체는 여러 유형의 암에 사용할 수 있는 잠재력으로 인해 암 면역 요법의 표적이다.
LAG-3은 4개의 세포외 Ig 슈퍼패밀리 도메인을 갖는 CD4 상동 유형 I 막 단백질이다. CD4와 유사하게, LAG-3은 T 세포 표면에서 올리고머화되고, APC 상의 MHC 클래스 II 분자에 결합하지만, CD4보다 훨씬 더 높은 친화도를 갖는다. LAG-3은 활성화된 CD4-양성 및 CD8-양성 T 림프구에서 발현되며, 여기서 그것은 세포 표면에서 CD3-TCR 복합체와 회합하고, 신호 전달을 음성적으로 조절한다. 결과적으로, 그것은 T 세포 증식, 기능 및 항상성을 음성적으로 조절한다. 특정 TCR에 의한 MHC 클래스 II-펩티드 복합체의 인식이 발생하면, 세포내 신호는 TCR을 통해 T 세포에서 그리고 MHC 클래스 II 분자를 통해 APC에서 전달된다. T 세포로의 LAG-3 신호전달의 음성적 조절 역할은 1차 CD4+ 및 CD8+ 인간 T-세포 반응에서 작동한다(문헌[Macon-Lemaitre, et al., Immunology. 2005 Jun; 115(2):170-178]). 그러나 LAG-3가 T 세포에서 신호 전달을 음성적으로 조절하는 분자 기전은 알려져 있지 않다. LAG-3의 저해 기능은 세포내(IC) 영역을 필요로 하지만, 이 영역은 알려진 신호전달 기전을 갖는 전형적인 신호전달 모티프를 함유하지 않는다. Maeda 등(문헌[J. Biol. Chem. 2019, RA119.007455])은 최근 LAG-3이 막-근위 영역의 FxxL 모티프 및 C-말단 EX 반복부를 통해 2개의 독립적인 저해 신호를 변환한다고 보고하였다. 그러나, 이러한 모티프는 저해성 보조 수용체에 대해 이전에 보고된 적이 없으며, LAG-3에 의해 변환된 저해성 신호의 분자 기전은 여전히 파악하기 어렵다.
국제공개 WO 2017/037203호에는 LAG-3의 효능제인 항체(예컨대, 인간화 단클론성 항체 IMP761) 및 이의 항원-결합 단편 및 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 증식 및/또는 활성화와 연관된 병태, 특히, 염증 및 자기면역 장애의 치료를 위한 이의 용도가 기재되어 있다.
면역 관문 수용체를 표적으로 하도록 설계된 항체 및 다른 약물의 활성을 측정하는 데 사용되는 종래의 방법은 1차 인간 세포 및 세포 증식 및 기능적 종점, 예컨대, 세포 증식, 표면 마커 발현 및 사이토카인 생산의 측정에 의존한다. 이러한 검정은 공여자 1차 세포, 복합체 검정 프로토콜 및 부적격 검정 시약에 대한 의존으로 인해 힘들고 매우 가변적이다. 결과적으로, 이러한 검정은 품질 관리 약물 개발 환경에서 확립하기 어렵다. 이러한 어려움을 해결하기 위해서, Promega Corporation은 개별 및 조합 면역 관문 면역요법 표적을 위한 세포-기반 생물발광 리포터 생물검정을 개발하였다(문헌[Cheng et al., June 2016, Promega, "Quantitative Cell-Based Bioassays for Indivisual and Combination Immune Checkpoint Immunotherapy Targets"]).
Promega에서 개발한 생물검정은 PD-1, CTLA-4, LAG-3 및 TIGIT에 대한 차단 생물검정을 포함한다. 이러한 검정은 표면 상의 관심 공저해성 수용체를 발현하도록 유전자 조작되었으며, NFAT 반응 요소(NFAT-RE)의 제어 하에 파이어플라이 루시퍼라제 리포터 유전자를 함유하는 주카트(Jurkat) T 세포의 사용에 의존한다. 이 세포는 내인성 TCR, CD3 및 CD28 수용체를 발현한다. 세포가 적절한 리간드와 결속하는 경우, TCR은 세포내 신호를 전달하여, NFAT-RE-매개 발광을 증가시킨다. 생물발광 신호는 루시퍼라제 기질 및 표준 발광계를 사용하여 검출 및 정량된다. 검정은 또한 항원-독립적인 방식으로 TCR을 활성화하도록 설계된 조작된 세포 표면 단백질을 발현하고, 표면 상의 공저해성 수용체에 대한 자연 리간드를 발현하는 인공-항원 제시 세포(aAPC)(PD-1 CTLA-4 및 TIGIT의 경우, 차단 생물검정) 또는 스타필로코컬 엔테로톡신 E(SEE: Staphylococcal Enterotoxin E) 초항원 존재 하에서 라지(Raji) 세포(LAG-3의 경우 차단 생물검정 - 라지 세포는 자연적으로 LAG-3 리간드인 MHC 클래스 II를 발현함)를 사용한다. 주카트 세포에 대한 TCR 결속은 루시퍼라제 활성을 유도한다. 자연 리간드와 공저해성 수용체의 공동 결속은 루시퍼라제 활성을 저해한다. 공저해성 수용체가 이의 자연 리간드에 결합하는 것의 항체-매개된 차단은 루시퍼라제 활성을 회복시킨다.
이러한 생물검정은 길항제 항체 스크리닝, 효력 시험 및 안정성 연구에 사용하는 데 필요한 성능을 입증한다. 그러나, 이들은 LAG-3 효능제 항체(예를 들어, 국제공개 WO 2017/037203호에 기재된 IMP761)와 같은 효능제 항체를 시험하는 데 적합하지 않다. 특히, 차단 생물검정에서 LAG-3에 대한 자연 리간드의 존재(예컨대, MHC 클래스 II 발현 라지 세포)는 효능제 시험을 방해할 것이다. 따라서, LAG-3의 효능제를 확인하고 시험하기 위한 시험관내 검정을 제공할 필요가 있다.
본 발명에 이르러서 놀랍게도 IMP761이 LAG-3의 효능작용을 통해 LAG-3 양성 T-세포에서 TCR 신호 전달, 특히 NFAT-조절된 유전자 발현을 저해한다는 것을 발견하였다. 본 출원인은 이것이 LAG-3 효능제의 활성 또는 LAG-3 효능제의 제제를 결정하고, 새로운 LAG-3 효능제를 확인하기 위한 시험관내 생물검정의 기초를 형성할 수 있음을 인식하였다.
본 발명에 따라서, 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3)의 효능제의 활성을 결정하기 위한 시험관내 검정이 제공되며, 이것은,
복수의 효과기 T 세포를 제공하는 단계로서, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절되는, 단계; 및
효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 변화하는(즉, 증가되거나 감소되는) 정도로부터 효능제의 활성을 결정하는 단계를 포함한다.
효능제의 활성을 결정하기 위한 본 발명의 검정은 예를 들어, 효능제의 생산에서 품질 제어 단계의 일부로서 효능제의 제제의 효력을 결정하기 위한 검정(특히, Good Manufacturing Practice, GMP에 따른 제품 출시에 필요한 세포-기반 효력 검정으로서) 또는 예를 들어, 저장 기간 후 효능제의 제제의 안정성 시험을 위한 검정 또는 제품 특징규명 검정으로서의 검정을 포함한다.
본 발명에 따라서 LAG-3의 효능제에 대해서 스크리닝하기 위한 시험관내 검정이 제공되며, 이 검정은,
복수의 효과기 T 세포를 제공하는 단계로서, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절되는, 단계; 및
후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 후보물질 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 변화하는(즉, 증가되거나 감소되는) 정도를 결정함으로써 후보물질 효능제가 LAG-3의 효능제인지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
LAG-3의 효능제에 대한 스크리닝을 위한 본 발명의 검정은 예를 들어, 후보물질 효능제의 라이브러리로부터 LAG-3의 효능제를 확인하는 데 사용될 수 있다. 이러한 후보물질 효능제는 약물(예를 들어, 합성 소분자) 또는 생물 작용제, 예컨대, 재조합 또는 자연 단백질, 항체 또는 이의 단편 또는 유도체일 수 있다.
리포터는 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서 효과기 T 세포에서 발현될 수 있다.
선택적으로, 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 감소된다.
예를 들어, 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해는 효과기 T 세포에서 리포터의 기본 발현 수준의 감소를 유발할 수 있다(도 2(a) 참조). 따라서, 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현의 기본 수준과 비교하여, 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 리포터의 기본 발현 수준이 감소되는 정도를 결정함으로써, LAG-3의 효능제의 활성(LAG-3의 효능제의 제제의 효력 포함)이 결정될 수 있거나, LAG-3의 효능제가 확인될 수 있다.
"효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해"라는 용어는 본 명세서에서 효과기 T 세포의 표면 상에서 발현된 LAG-3의 효능작용이 효과기 T 세포 내에서 TCR-매개된 신호 전달을 저해한다는 의미로 사용되며, 리포터의 발현에서 결과적인 변화(즉, 증가 또는 감소)가 동반된다. 효과기 T 세포 내의 임의의 TCR-매개된 신호전달 경로는 저해될 수 있다. 예를 들어, 리포터 유전자의 발현은 신호전달 경로의 일부인 전사 인자의 결합에 반응성인 프로모터 또는 반응 요소(RE)의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 효과기 T 세포 내의 칼시뉴린/NFAT 신호전달 경로가 저해될 수 있다. 특히, 리포터 유전자의 발현은 NFAT 반응 요소의 제어 하에 있을 수 있어서, LAG-3의 효능작용 후 칼시뉴린/NFAT 신호전달의 감소는 리포터 유전자로부터의 리포터의 발현의 감소를 야기한다.
리포터의 발현은 TCR을 통한 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 각각의 효과기 T 세포에서 변화(즉, 증가 또는 감소)할 수 있다. 선택적으로 본 발명의 검정은 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 및 부재 하에서 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 T-세포 활성화에 의해서 효과기 T 세포를 활성화하는 단계; 및 효과기 T 세포의 활성화에 응답한, 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여, 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 변화하는 정도로부터, 효능제 또는 후보물질 효능제의 활성(제제의 효력 포함)을 결정하는 단계를 더 포함한다.
따라서, 본 발명에 따라서, 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3)의 효능제의 활성을 결정하기 위한 시험관내 검정이 제공되며, 이것은,
복수의 효과기 T 세포를 제공하는 단계로서, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 이의 발현은 TCR을 통한 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 변화하고, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절되는, 단계;
효능제의 존재 및 부재 하에서 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 T-세포 활성화에 의해서 효과기 T 세포를 활성화시키는 단계; 및
효과기 T 세포의 활성화에 응답한, 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여, 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 변화되는 정도로부터, 효능제의 활성을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르면, LAG-3의 효능제에 대해서 스크리닝하기 위한 시험관내 검정이 또한 제공되며,
복수의 효과기 T 세포를 제공하는 단계로서, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 이의 발현은 TCR을 통한 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 변화하고, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절되는, 단계;
후보물질 효능제의 존재 및 부재 하에서 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 T-세포 활성화에 의해서 효과기 T 세포를 활성화시키는 단계; 및
효과기 T 세포의 활성화에 응답한, 후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여, 후보물질 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 변화하는 정도로부터, 후보물질 효능제의 활성을 결정하는 단계를 포함한다.
선택적으로 리포터의 발현은 TCR을 통한 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 각각의 효과기 T 세포에서 증가되고, 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해의 결과로서, 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 감소되며, 여기서 효능제 또는 후보물질 효능제의 활성은, 효과기 T 세포의 활성화에 응답한, 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여, 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 감소하는 정도로부터 결정된다.
효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서 효과기 T 세포의 활성화에 응답한 리포터의 발현과 비교하여, 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 리포터의 발현이 변화하는 정도가 더 클수록, LAG-3에 대한 효능제 또는 후보물질 효능제의 활성(또는 제제의 효력)이 더 크다.
선택적으로 효과기 T-세포는 무세포 T-세포 활성화에 의해서 활성화된다.
"무세포 T-세포 활성화"라는 용어는 효과기 T 세포 이외의 임의의 세포의 부재 하에 하나 이상의 무세포 T-세포 활성화인자의 사용에 의한 효과기 T 세포의 활성화를 지칭하기 위해 사용된다. 특히, 무세포 T-세포 활성화는 항원 제시 세포(APC), 인공 APC(aAPC), 또는 라지 세포와 같은 다른 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II-발현 세포를 사용하지 않고도 발생한다.
T 세포의 무세포 활성화는 세포 기반 시약이 특별한 저장 조건을 필요로 하기 때문에 유리하다. 세포는 전형적으로 냉동 저장된 후 사용하기 전에 해동해야 한다.
"TCR을 통한 효과기 T 세포의 활성화"에 대한 언급은 본 명세서에 T-세포 활성화인자에 의한 TCR의 결속 시 신호가 효과기 T 세포 내의 TCR에 의해 변환되어, 효과기 T 세포 내의 리포터 발현의 변화(즉, 증가 또는 감소)를 초래한다는 것을 의미하도록 사용된다. 예를 들어, 리포터 유전자로부터의 발현은 효과기 T 세포의 활성화 신호에 반응하는 프로모터 또는 반응 요소(RE)의 제어 하에 있을 수 있다. 예를 들어, 반응 요소는 TCR을 통한 효과기 T 세포의 활성화 후 하나 이상의 전사 인자에 의해 결합될 수 있다.
선택적으로, 효과기 T 세포는 효과기 T 세포를 T-세포 활성화인자에 의한 효과기 T 세포의 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 활성화에 대한 조건 하에서 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, T-세포 활성화인자와 접촉시킴으로써 활성화된다.
본 발명에 따르면 LAG-3의 효능제의 활성을 결정하거나 이에 대해서 스크리닝하기 위해서 시험관내 검정을 수행하기 위한 키트가 또한 제공되며, 이것은 복수의 효과기 T 세포로서, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절되고, 리포터의 발현은 TCR을 통해서 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 각각의 효과기 T 세포에서 변화(증가 또는 감소)하는, 복수의 효과기 T 세포; 및 효과기 T 세포의 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 활성화를 가능하게 하는 T-세포 활성화인자를 포함한다.
항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, T 세포 활성화인자는 초항원, 예컨대, 스타필로코컬 엔테로톡신(SE)과 구별된다. SE는 MHC 클래스 II 및 TCR에 대한 결합 영역을 갖는다. 이들은 먼저 MHC 클래스 II에 결합한 다음, TCR의 가변 알파 또는 베타 쇄에 결합한다. T 세포 수용체와의 상호작용은 SE가 TCR과 MHC 사이의 쐐기 역할을 하도록 한다. 이것은 임의의 항원성 펩티드를 TCR로부터 멀리 위치시키고, T-세포 활성화를 위한 정상적인 기전을 우회한다. 따라서 SE는 MHC 클래스 II-의존적 T 세포 활성화인자이다.
선택적으로, 효과기 T 세포는 리포터의 발현의 최대 저해가 과량의 LAG-3의 효능제의 존재 하에서 일어나는 농도의 T-세포 활성화인자와 접촉된다. 이러한 농도의 T 세포 활성화인자의 사용은 검정의 정확도를 최적화한다.
본 출원인은, 과량의 LAG-3 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현의 최대 저해가 일어나는 T-세포 활성화인자의 농도가 T-세포 활성화인자의 차선의(sub-optimal) 농도(즉, 리포터의 최대 발현이 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서 T-세포 활성화인자에 의해서 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 관찰되는 T-세포 활성화인자의 농도보다 낮은 농도)라는 것을 발견하였다.
선택적으로, T-세포 활성화인자는 리포터의 최대 발현이 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서 T-세포 활성화인자에 의해서 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 관찰되는 T-세포 활성화인자의 농도보다 낮은 농도에서 효과기 T 세포와 접촉된다.
항원-의존적 자극은 항원-특이적 T 세포만을 확장시키는 반면, 항원-독립적인 자극은 효과기 T 세포의 100%까지 확장한다는 것이 이해될 것이다.
효과기 T 세포의 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 활성화를 가능하게 하는 T-세포 활성화인자의 예는 항-CD3 항체이다. 항-CD3 항체는 CD3에 결합하고, APC로부터의 항원성 펩티드 없이 TCR 복합체를 활성화한다(즉, 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 효과기 T-세포 자극)(도 2(b) 참조). 항-CD3 항체는 효과기 T 세포의 100%까지 활성화할 수 있다.
선택적으로, T-세포 활성화인자는 항-CD3 항체 또는 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 효과기 T-세포 활성화 능력을 보유하는 이의 단편 또는 유도체를 포함한다. 항-CD3 항체의 적합한 예는 OKT3 및 UCHT1을 포함한다. 선택적으로 항-CD3 항체는 OKT3이다.
선택적으로 항-CD3 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 약 6 내지 30 x 10-12 M(전체 항체의 경우 1 내지 4 ng/ml 또는 이의 단편 또는 유도체의 경우 몰 당량)의 농도에서 효과기 T-세포와 접촉된다.
선택적으로, 본 발명의 키트는 항-CD3 항체 또는 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 효과기 T-세포 활성화 능력을 보유하는 이의 단편 또는 유도체를 약 6 내지 30 x 10-12 M(전체 항체의 경우 1 내지 4 ng/ml)의 농도로 검정에서 사용이 가능하도록 하는 농도로 포함한다. 예를 들어, 키트는 약 6 내지 30 x 10-12 M(전체 항체의 경우 1 내지 4 ng/ml)의 농도의 항-CD3 항체 또는 이의 단편 또는 유도체의 하나 이상의 분취물을 포함할 수 있다.
선택적으로 효과기 T 세포는 효능제 또는 후보물질 효능제의 몇몇 상이한 농도로 접촉된다. 예를 들어, 복수의 상이한 검정이 병렬로 수행될 수 있으며, 여기서 각각의 상이한 검정에 대한 효과기 T 세포는 상이한 농도의 효능제 또는 후보물질 효능제와 접촉된다.
선택적으로, 리포터의 발현 저해를 위한 후보물질 효능제 또는 효능제의 IC50 값이 결정된다. 이것은 예를 들어, 효과기 T 세포를 몇몇 농도의 후보물질 효능제 또는 효능제와 접촉시킴으로써 얻은 결과로부터 생성된 용량-반응 곡선으로부터 수행될 수 있다.
선택적으로 본 발명의 검정은 음성 대조군 검정(예를 들어, 검정과 병렬로)을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서, 그러나 효능제 또는 후보물질 효능제와 동일한 유형이지만 LAG-3에 대한 효능제 활성이 결여되어 있다고 공지된 분자(즉, 음성 대조군으로서)의 존재 하에서, 효과기 T 세포는 T-세포 활성화인자에 의한 효과기 T 세포의 항원-독립적인 활성화를 위한 조건 하에서 T-세포 활성화인자와 접촉될 수 있다.
예를 들어, 효능제 또는 후보물질 효능제가 항체인 경우, 선택적으로 음성 대조군으로 사용하기 위한 분자도 항체이다. 바람직하게는 음성 대조군 항체는 효능제 또는 후보물질 효능제 항체와 동일한 이소타입의 항체이다.
선택적으로 T 세포 활성화인자는 무세포 T 세포 활성화인자이다.
선택적으로, 본 발명의 키트는 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포를 포함하지 않는다.
선택적으로 본 발명의 키트는 라지 세포를 포함하지 않는다.
선택적으로, 본 발명의 키트는 APC, aAPC 또는 임의의 다른 MHC 클래스 I-, 또는 MHC 클래스 II-발현 세포, 예컨대, 라지 세포를 포함하지 않는다.
선택적으로, 본 발명의 키트에 있는 유일한 세포는 효과기 T 세포이다.
선택적으로, 본 발명의 키트의 효과기 T 세포, 예를 들어 "해동 및 사용" 세포는 동결된다.
또한, 본 발명의 검정을 수행하기 위한 본 발명의 키트가 본 발명에 따라 제공된다.
선택적으로 리포터 유전자는 비상동 리포터 유전자이다.
유전자 리포터는 약제학 및 생물의학 연구를 위한 유전자 발현과 결합된 세포 이벤트 및 유전자 발현을 연구하기 위한 지표로 널리 사용된다. 전형적으로 리포터를 암호화하는 리포터 유전자는 발현 벡터 내에 클로닝된 다음 세포로 전달된다. 전달 후, 리포터 단백질 자체 또는 리포터 단백질의 효소 활성을 직접 측정하여 리포터의 존재에 대해 세포를 검정한다. 바람직한 리포터는 효과기 T 세포에서 발현되는 경우 쉽게 식별되고 정량적으로 측정될 수 있는 것이다. 형광 및 발광 리포터를 비롯한 많은 적합한 예가 당업자에게 공지되어 있다. 선택적으로, 리포터는 생물발광 리포터, 예컨대, 루시퍼라제이다.
생물발광은 살아있는 유기체에서 발견되는 특별한 형태의 화학발광이다. 이러한 부류의 화학발광은 효소-촉매 과정이며, 여기서 높은 광자 방출 효율이 자연 진화를 통해 유도된다. 효소를 루시퍼라제라고 하고, 광자 방출 기질은 루시페린이다. 생물발광 화학은 여러 독립적인 기원에서 진화했으며, 많은 별개의 분자 구조를 포함한다. 많은 자연 형태 중 두 가지가 유전자 리포터 검정에 널리 사용되었: 파이어플라이 루시퍼라제 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라제(문헌[Fan, and Wood (2007) Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5, 127-36] 참고).
생물발광 리포터 유전자 검정은 10 내지 1,000배 더 높은 검정 감도를 제공할 수 있다는 점에서 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 검정에 비해 뚜렷한 이점이 있다. 형광 및 발광 둘 다는 여기 상태 분자 궤도에서 저에너지 궤도로의 에너지 전이의 결과로 광자를 생성한다. 그러나, 이것은 여기 상태 오비탈이 생성되는 방법이 상이하다. 발광에서, 여기 상태는 발열 화학 반응의 산물인 반면, 형광에서는 여기 상태가 광의 흡수에 의해 생성된다. 리포터 검정에서, 생물발광은 광자가 여기 상태를 생성하는 데 필요하지 않기 때문에 유리하다. 따라서 이들은 샘플로부터 광자 유출을 측정하는 경우 고유한 배경을 구성하지 않는다. 생성된 낮은 배경은 검정의 선형 범위에서 4 내지 8차수에 걸쳐 광의 작은 변화를 정밀하게 측정할 수 있다.
루시퍼라제 리포터 기술은 생물발광 과정에 의해 광을 방출하는 발광 기질 루시페린과 효소 루시퍼라제의 상호작용을 기반으로 한다. 생물발광은 다양한 유기체에서 발견되지만, 이것은 효소 검정의 감도 및 편리성 및 단백질 합성과 효소 활성의 긴밀한 결합으로 인해 가장 일반적으로 사용되는 생물발광 리포터인 파이어플라이(포티너스 피랄리스(Photinus pyralis)) 루시퍼라제이다. 61 kDa의 이러한 단량체 효소는 2단계 산화 반응을 촉매하여 전형적으로 녹색에서 노란색 영역, 일반적으로 550 내지 570nm에서 광을 생성한다. 파이어플라이 루시퍼라제(luc)를 암호화하는 유전자는 cDNA이며, 번역 후 변형이 필요하지 않다. 이것은 mRNA에서 번역되는 즉시 성숙한 효소로 사용할 수 있음을 의미한다.
루시퍼라제를 암호화하는 적절한 리포터 유전자는 Promega를 비롯한 여러 회사에서 상업적으로 입수 가능하다.
작동 조절 요소를 루시퍼라제 유전자의 발현에 커플링함으로써, 전형적으로 조절 요소를 루시퍼라제를 암호화하는 유전자의 바로 상류에 배치함으로써, 효과기 T 세포의 활성화는 발광 신호에 의해 용이하게 검출될 수 있다. 전형적으로, 리포터 유전자는 클로닝된 반응 요소의 하류이다.
선택적으로, 리포터 유전자는 프로모터 또는 반응 요소의 제어 하에 있다. 적합한 반응 요소는 NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자) 반응 요소(NFAT-RE)를 포함한다.
상기에서 설명한 바와 같이, TCR 자극은 세포내 칼슘 방출 및 활성화된 T 세포의 세포질 핵 인자(NFAT)를 탈인산화시키는 칼시뉴린의 활성화를 유도한다. 탈인산화된 NFAT는 핵으로 전좌되어 NFAT-RE에 결합하여, 리포터 유전자의 전사를 유도한다.
선택적으로, 효과기 T 세포는 리포터 유전자를 포함하는 비상동 핵산을 포함한다.
선택적으로, 효과기 T 세포는 LAG-3을 암호화하는 비상동 핵산을 포함한다.
용어 "비상동" 리포터 유전자 또는 핵산은 효과기 T 세포에 자연적으로 존재하지 않지만, 효과기 T 세포에 도입된 또는 예를 들어, 클로닝, 재조합 기술, 또는 형질주입(당업자에게 널리 공지된 기술)에 의해 유래된 효과기 T 세포에 도입된 리포터 유전자 또는 핵산에 대한 언급을 포함하도록 본 명세서에서 사용된다.
선택적으로, 효과기 T 세포는 리포터 유전자(선택적으로 여기서 리포터 유전자는 효과기 T 세포에서 리포터 유전자의 발현을 지시하기 위한 프로모터 또는 반응 요소에 작동 가능하게 연결됨) 및 LAG-3을 암호화하는 비상동 핵산을 포함하는 비상동 핵산으로 이중 형질주입된다.
선택적으로, 본 발명의 키트는 효능제 또는 후보물질 효능제와 동일한 유형이지만, 음성 대조군으로서 사용하기 위해서, LAG-3에 대한 효능제 활성이 결여되어 있다고 공지된 분자를 더 포함한다.
예를 들어, 효능제 또는 후보물질 효능제가 항체인 경우, 선택적으로 음성 대조군으로 사용하기 위한 분자도 항체이다. 바람직하게는 음성 대조군 항체는 효능제 또는 후보물질 효능제 항체와 동일한 이소타입의 항체이다.
선택적으로, 본 발명의 키트는 양성 대조군으로 사용하기 위해서 공지된 LAG-3의 효능제를 더 포함한다. 예를 들어, 공지된 효능제는 효능제 항체 또는 효능제 활성을 보유하는 이의 단편 또는 유도체일 수 있다.
자연 리간드는 검정 결과를 방해하였을 것이기 때문에, LAG-3에 대한 자연 리간드의 부재 하에서 본 발명의 검정이 수행되어야 한다는 것이 인식될 것이다.
선택적으로 본 발명의 키트는 LAG-3에 대한 자연 리간드를 포함하지 않는다.
효과기 T 세포는 공자극과 같은 자극에 능동적으로 반응하는 몇몇 T 세포 유형을 포함한다. 이들은 CD4+, CD8+ 및 조절성 T 세포를 포함한다. 적합한 예는 주카트 세포이다. 주카트 세포는 T 세포 백혈병을 갖는 어린이의 말초 혈액에서 처음 유래된 불멸화된 T 림프구이다(문헌[Schneider et al., 1977, Int J Cancer 19 (5):621-6]).
선택적으로 효능제는 효능제 항-LAG-3 항체 또는 항-LAG-3 효능제 활성을 보유하는 이의 단편 또는 유도체이다.
선택적으로 효과기 T 세포는 LAG-3을 암호화하는 핵산이 이중 형질주입된 T 세포주, 및 프로모터 또는 반응 요소의 제어 하에 있는 리포터 유전자, 예를 들어, LAG-3, 및 NFAT/루시퍼라제 리포터 유전자를 암호화하는 핵산이 이중 형질주입된 주카트 세포주(Jurkat LAG-3+/NFAT-luc 세포)를 포함한다. 주카트 LAG3+/NFAT-luc2 세포는 Promega(ref: CS194801)로부터 입수 가능하다. 주카트 LAG3+/NFAT-luc 세포는 BPS Bioscience(카탈로그 번호: 71278)에서 입수 가능하다.
선택적으로, 효능제는 효능제 항-LAG-3 항체 또는 항-LAG-3 효능제 활성을 보유하는 이의 단편 또는 유도체이고, 효과기 T 세포는 주카트 LAG-3+/NFAT-luc2 세포를 포함한다.
선택적으로, 효능제 항-LAG-3 항체는 국제공개 WO 2017/037203호에 기재된 효능제 항-LAG-3 항체이다. 국제공개 WO 2017/037203호에 기재된 효능제 항-LAG-3 항체에는 마우스 단클론성 항체 13E2 및 인간화 13E2-인간 IgG4 Fc 항체(IMP761로 지칭됨)를 포함한다. 항체 13E2 및 IMP761은 하기 표 1에 기재된 VH CDR1-3 및 VL CDR1-3 서열을 포함한다:
Figure pct00001
선택적으로, 효능제 항-LAG-3 항체, 또는 이의 단편 또는 유도체는 각각 서열번호 1 내지 6의 VH CDR1-3 및 VL CDR1-3 서열, 또는 각각 서열번호 7 내지 12의 VH CDR1-3 및 VL CDR1-3 서열을 포함한다.
선택적으로 효능제 항-LAG-3 항체는 IMP761이다.
본 발명의 실시형태는 첨부 도면을 참조하여 단지 예로서 이하에서 설명된다:
도 1은 TCR 신호 전달의 도식적 표현을 도시한다(문헌[Belikov, Aleksey. (2016). The role of reactive oxygen species and mitochondria in T-cell activation. 10.13140/RG.2.1.2916.0568]로부터).
도 2는 본 발명의 실시형태에 따른 IMP761 효력 검정의 작용 방식을 도시한다. 항-CD3 항체의 존재 하에서, 항-CD3 항체는 리포터 주카트 세포의 표면 상의 CD3에 결합하여, TCR-매개된 신호 전달을 통해 NFAT/Luc 리포터 유전자로부터의 루시퍼라제의 발현을 증가시킨다(상단). 리포터 주카트 세포의 표면 상의 LAG-3에 대한 IMP761의 결합은 TCR-매개된 신호 전달을 저해하여 NFAT/Luc 리포터 유전자로부터의 루시퍼라제의 발현을 하향 조절한다(하단).
도 3은 300 ng/ml의 IMP761 또는 인간 IgG4 음성 대조군 항체의 존재 하에서 다양한 농도의 OKT3 및 UCHT1 항-CD3 항체에 의한 주카트 LAG-3+/NFAT-luc2 세포의 자극 효과를 도시한다.
도 4는 본 발명의 실시형태에 따른, IMP761 대 IgG4 음성 대조군에 대한 효능 검정 결과의 예를 도시한다.
도 5는 본 발명의 실시형태에 따른, 온도 스트레스 변성(70℃에서 10분 또는 20분) 후 IMP761의 제제와 비교한, IMP761의 참조 제제(4℃)를 사용한 효력 검정의 결과의 예를 도시한다.
실시예 1
IMP761 효력 검정 프로토콜의 최적화
주카트 Lag-3+/NFAT-luc2 효과기 세포는 MHC II 분자에 의해서 제시되는 초항원 자극을 통해 TCR 활성화 후 길항제 항-LAG-3 항체 활성을 결정하기 위해 Promega에서 처음 개발되었다. LAG-3/MHC II 상호작용의 길항제 항-LAG-3 항체 차단은 TCR 활성화 및 루시퍼라제 활성을 향상시킨다. 효능제 항-LAG-3 항체 활성을 결정하기 위해 주카트 Lag-3+/NFAT-luc2 효과기 세포를 사용하려면 하기에 설명된 바와 같이 매우 상이한 실험 설정이 요구된다.
주카트 세포의 자극인자로서의 항-CD3 항체:
Promega 생물검정에서 주카트 Lag-3+/NFAT-luc2 효과기 세포를 스타필로코컬 엔테로톡신 E 또는 D(SEE 또는 SED)의 존재 하에서 라지 세포를 사용하여 활성화한다. 라지 세포는 LAG-3 리간드인 내인성 MHC 클래스 II를 발현한다. 이는 LAG-3/MHC II 상호작용에 대한 길항제 항-LAG-3 항체의 차단 활성을 시험하는 데 중요하다. 그러나, 효능제 항-LAG-3 항체의 효력을 시험하는 데 LAG-3/MHC II 상호작용이 필요하지 않기 때문에, 라지 세포나 스타필로코컬 엔테로톡신에 대한 요구 사항은 존재하지 않는다. TCR 신호전달을 통해 주카트 Lag-3+/NFAT-luc2 효과기 세포를 활성화하기 위해 항-CD3 항체와 함께 단일 세포 유형-검정을 사용하였다.
항-CD3 농도 및 LAG-3-관련 저해:
2개의 상이한 항-CD3 항체(OKT3 및 UCHT1)의 세포 효력 검정에 대한 효과를 1 내지 500ng/ml 범위의 상이한 항체 농도에서 시험하였다.
주카트 Lag-3+/NFAT-luc2 세포를 24시간 동안 상이한 농도의 OKT3 또는 UCHT1의 존재 하에서 300 ng/ml의 IMP761 또는 인간-IgG4(음성 대조군으로서)와 함께 인큐베이션시켰다. 상이한 농도의 항-CD3 항체에 대해 얻어진 평균 RLU 값을 도 3 및 하기 표 2에 제시한다:
Figure pct00002
루시퍼라제 활성은 각각의 항-CD3 항체의 상이한 농도 범위에 걸쳐 IMP761에 의해 저해된다.
자극 없이 주카트 세포주에서 리포터 발현의 기본 수준이 존재하기 때문에, 루시퍼라제 활성 및 IMP761에 의한 루시퍼라제 활성의 저해를 또한 항-CD3 항체의 부재 하에서 시험하였다. 그러나, 항-CD3 항체로 주카트 세포를 자극하면 더 높은 RLU 값을 제공하므로, IMP761의 저해 효과는 항-CD3 항체(특히, 낮은 농도의 항-CD3 항체)의 존재 하에서 더 분명하다. OKT3 항체에 대한 루시퍼라제 활성의 저해 백분율을 하기 표 3에 제시한다:
Figure pct00003
IMP761의 최대 효과(대략 80%의 저해)는 낮은 농도의 OKT3 항체(1 내지 4 ng/ml)를 사용할 때 관찰되는 것으로 결론내었다. 따라서 최적의 효능 검정은 낮은 농도의 항-CD3 항체(예를 들어, OKT3 항체)로 주카트 세포를 자극하는 것을 포함한다.
실시예 2
IMP761 효력 검정
본 실시예는 시험관내에서 IMP761 단클론성 항체의 활성을 측정하기 위한 본 발명의 실시형태에 따른 효력 검정을 설명한다. 이 방법은 T 세포의 항원-자극을 모방하는 저용량의 항-CD3 항체(OKT3 클론, 3 ng/ml)에 의해 유도된 LAG-3 효과기 세포주의 활성화를 감소시키는 IMP761의 능력을 기반으로 한다. LAG-3 효과기 세포주는 표면에서 LAG-3을 발현하는 주카트 T 세포주이며, NFAT(활성화 T 세포의 핵 인자) 반응 요소(Promega로부터의 주카트 Lag-3 + /NFAT-luc2 효과기 세포)의 제어 하에 루시퍼라제 유전자를 함유한다. 표적에 대한 결합 후, IMP761은 TCR-유도 NFAT-조절 발현의 하향 조절을 촉발한다(도 2, 하단에 개략적으로 설명됨). 세포주의 루시퍼라제 활성은 IMP761 활성의 존재 하에서 약화되는 TCR-구동 세포 활성화를 측정하는 데 사용된다. 따라서, 검정은 TCR 신호전달을 저해하는 능력 측면에서 IMP761 효력을 측정한다.
시약
주카트 LAG-3+/NFAT-luc2 효과기 세포 (Promega, ref: CS194801)
RPMI 1640 (GIBCO, ref: 31870-025)
L-글루타민 (200 mM) (GIBCO, ref: 25030-024)
HEPES (1 M) (GIBCO, ref: 15630-080)
FCS (GIBCO, ref: 10270106)
IMP761 (2.06 mg/ml) (IMMUTEP, lot: 270416)
인간 IgG4, 대조군 (Biolegend, ref: 403402)
항-CD3 (OKT3) (eBioscience, ref: 16-0037-85)
Bio-Glo 시약 (PROMEGA, ref: G7941)
화이트, 96-웰 고체 편평-바닥 마이크로플레이트 (COSTAR, ref: 3917)
검정 배지: RPMI 1640, L-글루타민 (2 mM), Hepes (10 mM), FCS 1%
세포 농도: 1.33 x 106개 세포/ml
프로토콜
1. 0일에 세포 밀도가 대략 1백만개/ml(0.8 내지 120만개/ml)가 되도록 검정 전 제-1일에 주카트 LAG-3+/NFAT-luc2 효과기 세포를 전달한다.
2. 필요한 경우 검정 배지를 준비하고, 37℃에서 30분 동안 배지를 사전 가온시킨다:
Figure pct00004
3. 필요한 경우 IMP761 품질 제어(QC) 스톡 용액을 준비한다:
24,000 ng/ml의 스톡 용액을 제조한다; 예를 들어,
10 μl의 스톡 IMP761 (2.06 mg/ml) + 848.3μl 검정 배지.
25 μl의 분취물을 -80℃ 동결기에 저장한다.
4. 인간 IgG4 음성 대조군(또는 임의의 다른 항체)인 IMP761 (2.06 mg/ml의 배치 270416) 3X 용액을 준비한다.
항체의 초기 농도에 따라 사전 희석 단계를 조정한다: 100 μg/ml 사전 희석물을 준비하기 위해 2 μl의 스톡 용액을 희석하기 위해 첨가할 검정 배지의 부피(μl 단위)는 다음과 같다:
Figure pct00005
Figure pct00006
5. 3X IMP761 품질 제어(QC) 용액을 준비한다.
스톡 IMP761 QC [24,000 ng/ml] 분취물을 해동하고, 연속 희석물을 제조한다.
Figure pct00007
6. OKT3 시약을 준비한다.
3.6 μl 스톡+ 4 ml 검정 배지 = 0.9 μg/ml
150 μl의 [0.9 μg/ml] + 14,850 μl의 검정 배지 = 9 ng/ml (3X)
7. 주카트 LAG-3/NFAT-luc2 효과기 세포를 준비한다.
제0일에, Trypan Blue 염색을 사용하여 세포를 계수한다.
세포를 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리한다.
배지를 흡인하고, 세포를 검정 배지에서 3.75 x 106개/ml로 재현탁한다.
8. 96웰 플레이트에 3X 용액을 분포시킨다.
에지 효과로 인해서 외부 웰을 사용하지 않는다.
IMP761 / QC / 검정 배지(0) 3X 용액 40 μl를 이중으로 검정 플레이트의 상응하는 웰에 분포시킨다.
항-CD3 / 검정 배지(비자극 대조군: unstim) 3X 용액 40 μl/웰을 검정 플레이트의 각각의 웰에 이중으로 분포시킨다. 최종 농도: 3 ng/ml
웰당 40 μl를 분포시킨다(0.15 x 106개/웰)
Figure pct00008
9. 플레이트(들)를 5% CO2를 함유한 가습 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시킨다.
10. BioGlo 시약을 준비한다.
a) 사용 전에 해동을 가능하게 하기 위해서 동결된 BioGlo 시약을 실온(RT)에 3 내지 6시간 놓는다.
b) 완충액(10 ml)을 기질 병으로 옮기고, 혼합하고, 사용 시까지 암실에서 RT로 유지시킨다.
11. 플레이트(들)를 RT에서 15분 동안 평형화시킨다.
12. 120 μl/웰의 BioGlo를 첨가하고, 방울을 회피하고/제거한다.
13. RT에서 5 내지 15분 동안 인큐베이션시킨다.
14. PerkinElmer 2103 Multilabel reader Envision을 사용하여 발광(RLU), 적분 시간 = 0.5초/웰을 측정한다. 각각의 웰에 대해서 45초 간격으로 3회의 측정치를 수집하고, 3회 측정치의 평균을 계산하여 "RLU 평균"을 얻는다.
결과
도 4는 음성 대조군으로서 IgG4 항체를 사용하여, 효력 검정으로부터 얻은 결과의 예를 나타낸다. IMP761이 존재하지 않을 때 관찰된 활성화로서 최대 활성화를 기록하였다. IMP761 농도가 1000 ng/ml였을 때 관찰된 활성화로서 최대 저해를 기록하였다. 5-파라미터 비선형 회귀 모델은, IMP761의 IC50이 37 ng/ml였다고 결정하였다.
실시예 3
변성된 IMP761 항체를 평가하는 IMP761 효력 검정의 능력
4℃에서 저장된 참조 IMP761의 IC50을 온도 스트레스(70℃에서 10분 및 70℃에서 20) 후 IMP761의 동일한 배치의 IC50과 비교함으로써, 변성된 IMP761 항체의 감소된 효능을 평가하기 위한 실시예 2에 기재된 바와 같은 효력 검정의 능력을 시험하였다. 결과를 도 5 및 하기 표 4에 나타낸다:
Figure pct00009
5-파라미터 비선형 회귀 모델은, 변성된 IMP761 항체(각각 70℃에서 10분 및 20분 후 74 ng/ml 및 81.5 ng/ml)의 IC50이 4℃에서 저장된 참조 IMP761 항체의 IC50(41 ng/ml)보다 높다고 결정하였다.
<110> Immutep S.A.S. <120> Assays <130> P/80025.WO01 <140> PCT/EP2020/062206 <141> 2020-05-01 <150> GB 1906127.4 <151> 2019-05-01 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 1 Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 2 Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 3 Ala Arg Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 4 Gln Asp Val Ile Phe Asp 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 5 Ser Ala Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 6 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 7 Thr Ser Gly Met Gly Leu Gly 1 5 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 8 His Ile Trp Trp Asp Asp Ile Lys Arg Tyr Asn Pro Asp Leu Arg Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 9 Ile Val Glu Gly Ser Tyr Ser Ser Ser Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 10 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ile Phe Asp Val Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 11 Ser Ala Ser Ser Arg Val Ser 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR sequence <400> 12 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5

Claims (50)

  1. 림프구-활성화 유전자 3(LAG-3: lymphocyte-activation gene 3)의 효능제의 활성을 결정하기 위한 시험관내 검정으로서,
    복수의 효과기 T 세포를 제공하는 단계로서, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절되는, 단계; 및
    효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 변화하는 정도로부터 효능제의 활성을 결정하는 단계를 포함하는, 시험관내 검정.
  2. 제1항에 있어서, LAG-3의 효능제의 제제(preparation)의 효력(potency)을 결정하기 위한, 검정.
  3. LAG-3의 효능제에 대해서 스크리닝하기 위한 시험관내 검정으로서,
    복수의 효과기 T 세포를 제공하는 단계로서, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절되는, 단계; 및
    후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여 후보물질 효능제의 존재 하에서 변화하는 정도를 결정함으로써 후보물질 효능제가 LAG-3의 효능제인지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 시험관내 검정.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 리포터는 효능제의 부재 하에서 효과기 T 세포에서 기본 수준으로 발현되거나, 제3항에 있어서, 리포터는 후보물질 효능제의 부재 하에서 효과기 T 세포에서 기본 수준으로 발현되는, 검정.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터의 발현은 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 감소되는, 검정.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터의 발현은 TCR을 통한 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 각각의 효과기 T 세포에서 변화하고,
    효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 및 부재 하에서 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 T-세포 활성화에 의해서 효과기 T 세포를 활성화시키는 단계; 및
    효과기 T 세포의 활성화에 응답한, 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 변화하는 정도로부터, 효능제 또는 후보물질 효능제의 활성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 검정.
  7. 제6항에 있어서, 리포터의 발현은 TCR을 통한 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 각각의 효과기 T 세포에서 증가되고, 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해의 결과로서, 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 감소되며, 여기서 효능제 또는 후보물질 효능제의 활성은, 효과기 T 세포의 활성화에 응답한, 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서의 리포터의 발현과 비교하여, 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여, 효능제 또는 후보물질 효능제의 존재 하에서 리포터의 발현이 감소하는 정도로부터 결정되는, 검정.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 효과기 T 세포는 효과기 T 세포를 T-세포 활성화인자에 의한 효과기 T 세포의 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 활성화에 대한 조건 하에서 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, T-세포 활성화인자와 접촉시킴으로써 활성화되는, 검정.
  9. 제8항에 있어서, 효과기 T 세포는, 리포터의 발현의 최대 저해가 과량의 LAG-3의 효능제의 존재 하에서 일어나는 T-세포 활성화인자의 농도에서 T-세포 활성화인자와 접촉되는, 검정.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 효과기 T 세포는 리포터의 최대 발현이 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서 T-세포 활성화인자에 의해서 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 관찰되는 T-세포 활성화인자의 농도보다 낮은 T-세포 활성화인자의 농도에서 T-세포 활성화인자와 접촉되는, 검정.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 활성화인자는 항-CD3 항체 또는 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 효과기 T-세포 활성화 능력을 보유하는 이의 단편 또는 유도체를 포함하거나 이들로 이루어지는, 검정.
  12. 제11항에 있어서, 항-CD3 항체는 OKT3인, 검정.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 항-CD3 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는
    약 6 내지 30 x 10-12 M(전체 항체의 경우 1 내지 4 ng/ml 또는 이의 단편 또는 유도체의 경우 몰 당량)의 농도에서 효과기 T-세포와 접촉되는, 검정.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T-세포는 무세포, 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 T-세포 활성화에 의해서 활성화되는, 검정.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포는 효능제 또는 후보물질 효능제의 몇몇 상이한 농도로 접촉되는, 검정.
  16. 제15항에 있어서, 리포터의 발현의 저해에 대한 효능제 또는 후보물질 효능제의 IC50 값을 결정하는 단계를 더 포함하는, 검정.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포는 리포터 유전자를 포함하는 비상동 핵산을 포함하는, 검정.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자는 프로모터 또는 반응 요소의 제어 하에 있는, 검정.
  19. 제18항에 있어서, 반응 요소는 NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자(nuclear factor of activated T cell)) 반응 요소(NFAT-RE)를 포함하는, 검정.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터는 생물발광 리포터, 예컨대, 루시퍼라제를 포함하는, 검정.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포는 LAG-3을 암호화하는 비상동 핵산을 포함하는, 검정.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 음성 대조군 검정을 수행하는 단계를 더 포함하되, 효과기 T 세포는 효능제 또는 후보물질 효능제의 부재 하에서, 그러나 효능제 또는 후보물질 효능제와 동일한 유형이지만, LAG-3에 대한 효능제 활성이 결여되어 있다고 공지된 분자의 존재 하에서 활성화되는, 검정.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, LAG-3에 대한 자연 리간드의 부재 하에서 수행되는, 검정.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제 또는 후보물질 효능제는 항-LAG-3 항체 또는 항-LAG-3 효능제 활성을 보유하는 이의 단편 또는 유도체인, 검정.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포는 주카트(Jurkat)-유래 세포를 포함하는, 검정.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제는 효능제 항-LAG-3 항체, 또는 항-LAG-3 효능제 활성을 보유하는 이의 단편 또는 유도체이고, 효과기 T 세포는 주카트 LAG-3+/NFAT-luc2 세포를 포함하는, 검정.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제 항-LAG-3 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 각각 서열번호 1 내지 6 및 각각 서열번호 7 내지 12의 VH CDR1-3 서열 및 VL CDR1-3 서열을 포함하는, 검정.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제 항-LAG-3 항체는 IMP761인, 검정.
  29. LAG-3의 효능제의 활성을 결정하거나 이에 대해서 스크리닝하기 위해서 시험관내 검정을 수행하기 위한 키트로서,
    복수의 효과기 T 세포로서, 각각의 효과기 T 세포는 이의 표면 상에 LAG-3 및 T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 리포터를 암호화하는 리포터 유전자를 포함하되, 리포터의 발현은 효과기 T 세포 내에서 TCR 신호전달의 LAG-3-매개된 저해에 의해서 조절되고, 리포터의 발현은 TCR을 통해서 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 각각의 효과기 T 세포에서 변화하는, 복수의 효과기 T 세포; 및
    효과기 T 세포의 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 활성화를 가능하게 하는 T-세포 활성화인자를 포함하는, 키트.
  30. 제29항에 있어서, 키트는 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 세포를 포함하지 않는, 키트.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 리포터의 발현은 TCR을 통해서 효과기 T 세포의 활성화에 응답하여 증가되는, 키트.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포는 리포터 유전자를 포함하는 비상동 핵산을 포함하는, 키트.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터 유전자는 프로모터 또는 반응 요소의 제어 하에 있는, 키트.
  34. 제33항에 있어서, 반응 요소는 NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자) 반응 요소(NFAT-RE)를 포함하는, 키트.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 리포터는 생물발광 리포터, 예컨대, 루시퍼라제를 포함하는, 키트.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포는 LAG-3을 암호화하는 비상동 핵산을 포함하는, 키트.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 활성화인자는 무세포 T-세포 활성화인자인, 키트.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, T-세포 활성화인자는 항-CD3 항체 또는 항원-독립적인, MHC 클래스 II-독립적인, TCR-매개된 효과기 T 세포 활성화 능력을 보유하는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는, 키트.
  39. 제38항에 있어서, 항-CD3 항체는 OKT3인, 키트.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 항-CD3 항체 또는 이의 단편 또는 유도체는 약 6 내지 30 x 10-12 M(전체 항체의 경우 1 내지 4 ng/ml 또는 이의 단편 또는 유도체의 경우 몰 당량)의 농도로 검정에서 사용이 가능하도록 하는 농도로 존재하는, 키트.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 효능제와 동일한 유형이지만, 음성 대조군으로서 사용하기 위해서, LAG-3에 대한 효능제 활성이 결여되어 있다고 공지된 분자를 더 포함하는, 키트.
  42. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 양성 대조군으로서 사용하기 위해서 LAG-3의 공지된 효능제를 더 포함하는, 키트.
  43. 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, LAG-3에 대한 자연 리간드를 포함하지 않는, 키트.
  44. 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포는 주카트-유래 세포를 포함하는, 키트.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 효과기 T 세포는 주카트 LAG-3+/NFAT-luc2 세포를 포함하는, 키트.
  46. 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 키트는 APC, aAPC 또는 임의의 다른 MHC 클래스 I- 또는 MHC 클래스 II-발현 세포를 포함하지 않는, 키트.
  47. 제29항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 키트 내의 유일한 세포는 효과기 T 세포인, 키트.
  48. 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, LAG-3의 효능제의 제제의 효력을 결정하기 위한, 키트.
  49. 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 검정을 수행하기 위한 키트.
  50. LAG-3의 효능제의 제제의 효력을 결정하거나 LAG-3의 효능제에 대해서 스크리닝하는, LAG-3의 효능제의 활성을 결정하기 위한 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 따른 키트의 용도.
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