KR20210157357A - 신경 돌기 생장 및 시냅스 형성 활성을 갖는 신규 prolylFK506 유도체 및 그의 용도 - Google Patents

신경 돌기 생장 및 시냅스 형성 활성을 갖는 신규 prolylFK506 유도체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

신경 돌기 생장 및 시냅스 형성 활성을 갖는 신규 prolylFK506 유도체 및 그의 용도{Novel prolylFK506 derivatives and their usage with neurite growth and synaptogenic activity}
본 발명은 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물; 상기 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 의약외품 조성물; 상기 약학적 조성물을 이용한 신경계 질환의 예방 또는 치료 방법; 및 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) 균주를 이용한 상기 신규 화합물의 생산방법에 관한 것이다.
세계적으로 인구 고령화가 빠르게 진행되면서 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 등의 퇴행성 신경질환 환자가 급속히 증가하고 있다. 그러나, 현재 이들 신경손상 질환들에 대하여 손상된 신경을 회복시키고 신경세포를 재생시키는 등의 근본적 치료가 실시되지 못하고 통증 완화나 악화 완화 등을 목적으로 한 치료가 행하여지고 있다. 이는 신경손상을 지연시키는 효과를 넘어 신경손상 질환의 치료에 사용될 수준의 신경재생 및 회복 효과를 제공해 주는 약물이 없었기 때문이다. 퇴행성신경질환을 앓는 환자가 계속해서 증가할 것으로 예상됨에 따라 병의 진행을 근원적으로 억제할 수 있는 DMTs(Disease-modifying treatments, 질병조절치료제)의약품 개발이 더욱 중요해지는 추세이다. 신경손상에 의한 장애가 발생한 환자는 사회 및 가정에서의 역할에 크게 제한을 받게 되고, 이로 인한 개인적 손실 및 삶의 질이 악화되기 때문이다. 따라서 신경손상에 관련되는 다양한 질환들에 단독 또는 병용 요법으로 활용될 수 있는 신경재생의 효과를 제공해 줄 수 있는 약물의 개발이 절실하다 할 수 있다.
FK506은 인간 세포내에서 FK506-binding protein(FKBP)12와 결합한 후 calcineurin(CaN)에 결합하여 그 활성을 저해함으로써 interleukin의 전사를 방해하여 면역억제 작용을 보이며, 또한 FKBP52 (또는 51)와 결합함으로써 정확히 규명되지 않은 기작을 통해 신경재생 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다[Nat. Chem. Biol. 2015, 11, 33]. 다만, 여전히 면역억제활성으로 인한 부작용이 없는 신경손상 질환의 치료제로 적용 가능한 신경재생 물질은 보고가 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 다양한 노력을 한 결과로 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 주요 성분으로 활용이 가능한 신규 화합물 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸 프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520) (이하 '4종 신규 화합물'로 통칭)의 신경세포 성장 촉진 효과를 규명하고, 이들의 제조공정을 개발하고, 더 나아가 이들을 유효성분으로 활용한 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개발하고, 이 조성물이 면역억제 활성으로 인한 부작용 없이 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명의 4종 신규 화합물은 FK506 화합물보다 면역억제활성이 현저히 감소되었으며, 신경세포 성장촉진 활성능 등의 유효성이 향상된 점에 그 의의가 있다.
본 발명의 하나의 목적은 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 4종 신규화합물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 4종 신규화합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus)를 배양하는 단계를 포함하는 상기 4종 신규화합물의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 4종 신규 화합물의 생산균주를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 4종 신규화합물인, 하기의 [화학식 1]로 표시되는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 하기의 [화학식 2]로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 하기의 [화학식 3]으로 표시되는 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 하기의 [화학식 4]로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸- 프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 4]
Figure pat00004
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 4종 신규화합물인, 하기의 [화학식 1]로 표시되는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 하기의 [화학식 2]로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 하기의 [화학식 3]으로 표시되는 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 하기의 [화학식 4]로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00005
[화학식 2]
Figure pat00006
[화학식 3]
Figure pat00007
[화학식 4]
Figure pat00008
본 발명에서 사용된 용어, "FK506, 타크롤리무스(tacrolimus) 또는 푸지마이신(fujimycin)"은 다양한 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스(Streptomyces tsukubaensis)로 부터 최초로 분리된 면역억제활성을 갖는 물질로 23-원 매크롤리드(23-membered ring macrolide) 폴리케티드(polyketide)이다. 면역억제작용은 사이클로스포린보다도 강하고, 장기이식시 특히 간을 이식할 때 거부반응을 억제시키기 위해 사용하는 것으로 알려져 있다. 상기 FK506은 PKS/NRPS(polyketide synthase/nonribosomal peptide synthetase) 복합 시스템에 의해 합성될 수 있으나, 본 발명의 FK506 유도체는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)의 생합성 유전자 결손을 통해 제조된 신규한 균주를 통해 생산된 신규한 화합물일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "FK520 또는 아스코마이신(ascomycin)"은 역시 면역억제제로서, 23개의 탄소로 형성되는 매크롤리드 구조의 화합물이며, FK506의 C21 위치의 에틸 유사체이다.
본 발명의 일 구체예로서, 본 발명의 화합물은 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “이성질체”란 화학식은 같으나 동일하지는 않은 화합물의 관계를 의미하며, 예를 들어 구조 이성질체, 기하 이성질체, 광학 이성질체(거울상 이성질체), 입체 이성질체, 부분 입체 이성질체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “약제학적으로 허용가능한 염”은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서, 이 염에 기인한 부작용이 모체 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미할 수 있다. 예를 들어 상기 염은 약학적으로 허용가능한 유리산(Free acid)에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동 몰량의 화합물 및 물중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조된 것일 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 염은 염기를 사용하여 제조된 약학적으로 허용가능한 금속염일 수 있다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명의 화합물은 용매화물 또는 전구약물(Pro-drug) 형태일 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 용매화물은 바람직하게는 수화물 및 에탄올화물을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 신경계 질환 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 트란스큐톨(Transcutol), 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 트리아세틴(Triacetin) 및 이들의 혼합물로 예시할 수 있는 공계면활성제(Co-surfactant); 크레모포어(Cremophor), 트윈(Tween), 미리즈(Myrj), 폴록사머(Poloxamer), 플루로닉(Pluronic), 루트롤(Lutrol), 임비토르(Imwitor), 스판(Span), 라브라필(Labrafil) 등의 단독 또는 혼합물로 예시할 수 있는 계면활성제(Surfactant); 미그리올(Miglyol), 캅텍스(Captex), 에틸올레이트(Ethyl oleate) 등의 단독 또는 혼합물로 예시할 수 있는 오일(Oil); 및, 에리소르빈산(Erythorobic acid), 구연산(Citric acid) 등의 단독 또는 혼합물로 예시할 수 있는 유기산류 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “신경계 질환”이란, 신경계통의 질환을 통칭하는 것으로 일 구체예로서, 신경손상으로 인한 질환이 포함될 수 있다. 신경 손상질환으로는 퇴행성 신경질환(Neurodegenerative disease), 말초신경장애(Peripheral nerve injury), 외상성뇌손상(Traumatic brain injury)과 뇌혈관장애로 나타나는 뇌졸중(Cerebral infarction) 등이 예시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로 상기 퇴행성 신경질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는 질환을 의미하는 것으로, 예를 들어 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(Olivopontocerebellar atrophy: OPCA), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome); 선조체-흑질 퇴행증(Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨스-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam) 또는 픽병(Pick's disease)일 수 있다.
다른 일 예로 상기 신경손상질환은 간질, 중풍, 뇌졸중, 허혈성 뇌질환, 척수 손상 질환, 말초신경질환, 행동 장애, 발달장애, 정신 지체, 다운증후군 또는 정신분열증을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 일 예로 상기 신경손상질환은 신경세포 손상 또는 세포 사멸 등을 원인으로 하는 질환일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 신경계 질환의 발병 가능성이 있거나 상기 질환이 의심되는 증상 또는 상태를 가진 개체에게 투여하여 신경계 질환의 발병 가능성을 낮추거나 상기 증상 또는 상태를 완화하는 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 신경계 질환 발병 의심 개체에 투여하여 신경계 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 4종 신규 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 면역억제활성이 감소된 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 상기 4종 신규 화합물의 면역억제활성 효과를 인비트로 T세포 활성분석법으로 확인하여 FK506 보다 현저하게 감소된 면역억제활성을 확인할 수 있었다(표 7).
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 4종 신규화합물의 신경 돌기 생장을 통한 신경세포 성장촉진 활성능을 확인하였다(도 26).
본 발명의 또 다른 구체예에서는 상기 4종 신규화합물의 기능성 시냅스 형성 활성 효과를 확인하여 FK506 보다 증가된 흥분성 시냅스 전류의 빈도를 확인하여 4종 신규화합물의 신경계 질환 치료효과를 확인할 수 있었다(도 27).
본 발명의 또 다른 구체예에서는 상기 4종 신규화합물의 in vivo 신경재생활성 효능을 평가하기 위해서, 신경 독성 화합물인 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)에 의해 유도되는 파킨슨병 쥐 모델을 질환동물모델을 이용하여, MPTP에 의해 퇴행된 신경세포 및 신경섬유의 회복정도를 확인하여 4종 신규화합물의 퇴행성 신경질환 치료효과를 확인할 수 있었다(도 28).
또한, 본 발명의 다른 구체예에서는 상기 4종의 신규화합물의 세포독성 조사를 위한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay (도 29), 간이 유전 독성 평가를 위한 Ames test, cardiac repolarization에 대한 잠재적인 영향 평가를 위한 human eag-related gene (hERG) assay에서 안전성을 확인할 수 있었다.
상기 결과는 상기 4종 신규화합물이 면역억제활성에 기인한 부작용 없이 신경계 질환의 치료효과 및 안전성을 확인한 물질로, 신경계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “신경계 질환”, “예방”, 및 “치료”는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 신경계 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 모든 동물을 의미할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 4종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상, 또는 이것의 이성질체나 염을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은 0.001 mg/kg 내지 1000 mg/kg일 수 있으며, 구체적으로는 0.05 mg/kg 내지 200 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 유발을 최소화하면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 약학적 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는 상기 4종 신규 화합물의 면역억제활성은 현저하게 감소되나 신경 돌기 생장 및 시냅스 형성 활성 효과, 퇴행성 신경질환 치료효과와 함께 안전성이 뛰어남을 확인하였다.
상기 결과는 상기 4종 신규화합물이 면역억제활성으로 인한 부작용을 현저하게 감소시켜 지속적인 신경계 질환의 치료에 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 4종 신규화합물의 생물학적 제조공정으로, 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus)를 배양하는 단계를 포함하는 상기 4종 신규화합물의 생산방법을 제공한다.
상기 4종 신규 화합물 중 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506) 또는 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14171BP)를 배양하는 단계를 통하여 생산될 수 있다.
또한, 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506) 또는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14170BP)를 배양하는 단계를 통하여 생산될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 4종 신규화합물의 생산방법은 일반적으로 스트렙토마이세스 속 배양 공정에서 채택되는 배양온도를 사용한다. 본 발명의 구현에 적합한 배양온도로는 바람직하게는 23-30℃를 적용할 수 있고, 보다 바람직하게는 25-28℃의 배양온도를 적용할 수 있다.
또한, 상기 생산방법에서는 배양공정의 pH를 6.5-9 사이로 유지하는데, 바람직하게는 배양 pH를 7-8로 유지한다.
한편, 상기 생산방법에서는 배양액에서의 용존산소 수준을 높게 유지하는 것이 중요한데, 배양 초기의 용존산소 수준을 100%로 하였을 때 배양 종료 시점까지의 용존산소 수준을 30% 이상으로 유지하는 것이 중요하다. 이를 구현하기 위해서는 통상적으로 800-1,500 rpm 수준으로 교반해 주는 것이 바람직하다.
상기 생산방법에서의 배양 세포체로부터의 생산된 4종 신규 화합물의 추출은 1차 추출공정, 2차 추출공정 및 3차 추출공정의 실시를 통하여 달성되는데, 본 발명에서는 1차 추출공정으로 유기용매 추출법을 사용하는데, 이때 사용할 수 있는 용매로는 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 메탄올(Methanol), 아세톤(Acetone) 등이 있을 수 있으나, 에틸아세테이트 또는 메탄올의 사용이 바람직하다. 그리고 2차 추출공정으로 실리카겔 크로마토그래피(Silica gel chromatography)를 사용하는데, 이때 사용할 수 있는 용매로는 메탄올, 메틸렌클로라이드(Methylene chloride)가 바람직하다. 그리고 3차 추출공정으로 크로마토그래피를 사용하는데, 이때 사용할 수 있는 용매로는 아세토니트릴(Acetonitrile), 아세트산암모늄 버퍼(Ammonium acetate buffer), 아세트산(Acetic acid), 개미산(Formic acid) 등이 있을 수 있으나, 아세토니트릴의 사용이 바람직하다. 이러한 방법의 적용은 4종 신규 화합물의 회수를 용이하게 하며, 또한 수율도 높게 해 준다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 4종 신규 화합물의 제조에 이용될 수 있는 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14170BP), 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14171BP)를 제공한다.
상기 생산균주는 재조합 균주일 수 있고, 상기 재조합은 형질전환과 같은 유전적 변형(genetically modification)에 의해 이루어질 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 4종의 화합물, 이성질체, 약제학적으로 허용 가능한 염, 신경계 질환, 예방에 관하여는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
본 발명에서 상기 의약외품 조성물은 신경계 질환의 예방 또는 개선 효과를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
상기 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 바람직하게는 경구의 제형일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 구체적으로, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 또 다른 하나의 양태는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
상기 4종의 화합물, 이성질체, 식품학적으로 허용 가능한 염, 신경계 질환, 예방에 관하여는 전술한 바와 같다.
본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하며, 일반약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있으므로, 신경계 질환의 예방 또는 개선 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "개선"은 상기 식품 조성물의 섭취로 신경계 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 완화 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성)식품(health functional food)은 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다.
여기서 '기능(성)'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
구체적으로, 상기 건강기능식품은 상기 4종의 신규 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품으로 인정되는 제형이면 다양한 형태의 제형으로 제한 없이 제조될 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별하고 적절한 양으로 사용할 수 있다.
본 발명의 목적을 위한 또 다른 하나의 양태는 신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 4종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 면역억제활성은 현저하게 감소되나 신경 돌기 생장 및 시냅스 형성 활성 효과가 뛰어나고, 신경 독성 물질 MPTP에 의해 유도된 파킨슨병 쥐 모델에서 신경계질환 특히, 퇴행성 신경질환 치료효과가 뛰어남을 확인하였다. 이와 함께 세포독성 및 안전성 실험에서 뛰어난 안전성을 확인하였다. 따라서, 본원 4종의 신규 화합물은 신경계 질환의 치료에 있어 면역억제 활성에 대한 부작용 없이 효과적으로 활용될 수 있어, 기존 약물 치료에 비교하여 보다 근본적인 치료 효과를 기대할 수 있을 것이다.
도 1은 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 2는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 3은 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 4는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 5는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 6은 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 7은 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 8은 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 9는 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 10은 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 11은 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 12는 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 13은 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 14는 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 15는 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 16은 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 17은 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 18은 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 19는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)에 대한 고성능액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 20은 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (1H-NMR) 결과이다.
도 21는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (13C-NMR) 결과이다.
도 22은 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (COSY-NMR) 결과이다.
도 23는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (HSQC-NMR) 결과이다.
도 24는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)에 대한 핵자기공명 분석 (HMBC-NMR) 결과이다.
도 25은 본 발명의 신규 화합물 4종의 면역억제활성 감소 정도를 조사한 결과이다.
도 26은 본 발명의 신규 화합물 4종의 신경세포 성장 촉진능을 조사한 결과이다.
도 27은 본 발명의 신규 화합물 4종의 시냅스 형성 활성 효과로 인한 신경계 질환 치료능을 조사한 결과이다(a: FK506 또는 4종 신규 화합물에 노출시켜 배양한 해마 신경 세포, b: 신경세포에서 흥분성 시냅스 전류의 측정, c: 신경세포에서의 흥분성 시냅스 전류의 빈도).
도 28은 본 발명의 신규 화합물 4종에 의한 파킨슨 동물질환 모델의 도파민 신경회로 회복 및 치료능을 조사한 결과이다(a: 신경섬유의 밀도의 변화, b: 도파민성 신경세포체의 개수).
도 29은 본 발명의 신규 화합물 4종의 세포독성 조사를 위한 MTT assay을 조사한 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506) 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외(J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합(Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임(In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD, tcsD 및 fkbL 유전자의 비활성화를 초래하여 9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14171BP)을 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD, tcsD와 fkbL 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합(Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드 (Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드(Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀(E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드(Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드(Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편(Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDLF/FkbDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDRF/FkbDRR을 설계하였다. tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. fkbL 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbLLF/FkbLLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbLRF/FkbLRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 하기 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소(Hydroxylase)를 제거하기 위한 플라스미드, pΔfkbD는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신(Apramycin)이 있는 37℃(pSG5-기본으로 하는 복제단위(Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주(Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD를 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD에 C21 측쇄를 변형하기 위한 플라스미드, pΔtcsD를 도입하여 fkbD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 추가적으로 제작한 fkbD와 tcsD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD에 C1 프롤릴 고리를 형성하기 위한 플라스미드, pΔfkbL를 도입하여 fkbD와 tcsD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 fkbL 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD,tcsD,fkbL는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였다.
제작한 fkbD,tcsD,fkbL 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD,tcsD,fkbL은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2020년 4월 14일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC14171BP).
사용한 균주와 플라스미드 정보
Strain/vector Relevant characteristic
Bacterial strains
Escherichia coli
DH5α Host for general cloning
ET12567/pUZ8002 Donor strain for intergeneric conjugation between E. coli and streptomyces
Streptomyces
Streptomyces kanamyceticus Wild-type FK506 producing strain
ΔfkbD,tcsD,fkbL Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbD,tcsD.fkbL
ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL Mutant of S. kanamyceticus with an in-frame deletion of fkbD-fkbM,tcsD,fkbL
Plasmid
pKC1139 High-copy-number temperature-sensitive E. coli -Streptomyces shuttle vector
pΔfkbD Deletion plasmid with in-frame deletion of 51-bp internal fkbD fragment
pΔfkbD-fkbM Deletion plasmid with in-frame deletion of 1100-bp internal fkbDM fragment
pΔtcsD Deletion plasmid with in-frame deletion of 1154-bp internal tcsD fragment
pΔfkbL Deletion plasmid with in-frame deletion of 873-bp internal fkbL fragment
사용한 프라이머 정보
Primer Sequence 5’to 3’ (Restriction site underlined) Restriction enzyme
FkbDLF TATAAAGCTTCGGAGCCCCGGTGGACCT HindIII
FkbDLR TTAATCTAGACGTCGCCTCGTCGTCGCT XbaI
FkbDRF GTAATCTAGAGTCGGCTACTGCCTCTAC XbaI
FkbDRR GAATGAATTCCGACGAACAGCGGTTCCT EcoRI
FkbD-MLF TATAAAGCTTCGGAGCCCCGGTGGACCT HindIII
FkbD-MLR TTAATCTAGACGTCGCCTCGTCGTCGCT XbaI
FkbD-MRF TATATCTAGAGACACCGAAGGCGCGCTC XbaI
FkbD-MRR TTAAGAATTCGAACACCGAGGCCGTCCA EcoRI
TcsDLF GCTAAGCTTCTCAGGCGTCTGCGGATGC HindIII
TcsDLR ATCGGATCCTTCGCTCACCGGGGCTGCC BamHI
TcsDRF AGCAGATCTGGCATGTTCTGGTCAGTCC BglI
TcsDRR GTCGAATTCCATGCCACGAACGGGTCGA EcoRI
FkbLLF AATAAGCTTCCACGAGCCCGGT HindIII
FkbLLR AAATCTAGACACATCGCGTTCGAC XbaI
FkbLRF AATTCTAGACACGGAGAGGATCTG XbaI
FkbLRR AAAGAATTCCCACCACCCCCG EcoRI
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14171BP)의 배양을 통하여 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크(Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지(수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물(10%) 50 ml/L, TES buffer(5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨(0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물(3.68%) 80 ml/L, L-프롤린(20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨(1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기(Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트 (Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드(분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 1]로 표시되는 물질인 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)을 얻을 수 있었다.
제조한 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석(High performance liquid chromatography analysis), 질량분석(Mass spectrometry), 핵자기공명 분석(Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 분석 결과는 표 3과 도 1 내지 도 6으로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD,fkbL으로부터 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506; 분자식 C43H71NO11, 분자량 777.50)에 대한 분석 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
분석법 분석결과
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C43H71NNaO11 +:800.4919, found: m/z 800.4924
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.7
2 58.7 4.36 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 29.0 1.97 (1H, m)2.19 (1H, m)
4 24.6 1.97 (1H, m)1.98 (1H, m)
5 47.3 3.53 (1H, m)3.63 (1H, m)
6
7
8 171.6
9 39.0 2.55 (1H, d, J=15.0 Hz)
2.62 (1H, d, J=15.0 Hz)
10 98.4
11 38.4 1.59 (1H, m)
12 32.5 1.56 (1H, m)
1.98 (1H, m)
13 74.4 3.40 (1H, m)
14 70.8 3.85 (1H, brd, J=10.0 Hz)
15 77.4 3.53 (1H, m)
16 36.3 1.34 (1H, m)
1.45 (1H, m)
17 25.4 1.60 (1H, m)
18 49.0 1.67 (1H, m)
2.36 (1H, m)
19 140.6
20 122.6 4.98 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 53.4 3.26 (1H, m)
22 214.8
23 43.4 2.31 (1H, brd J=15.0 Hz)
2.68 (1H, brd J=15.0 Hz)
24 69.1 4.02 (1H, m)
25 40.9 1.82 (1H, m)
26 77.8 5.18 (1H, brs)
27 132.3
28 129.4 4.97 (1H, d, J=5.0 Hz)
29 34.8 2.26 (1H, m)
30 34.8 0.94 (1H, m)
2.04 (1H, m)
31 84.2 3.00 (1H, m)
32 73.6 3.40 (1H, m)
33 31.2 1.33 (1H, m)
1.98 (1H, m)
34 30.7 1.03 (1H, m)1.59 (1H, m)
35 33.4 1.46 (1H, m)1.63 (1H, m)
36 20.4 1.22 (2H, m)
37 14.0 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz)
38 16.9 0.95 (3H, d, J=6.5 Hz)
39 18.9 0.76 (3H, d, J=6.5 Hz)
40 15.4 1.63 (3H, s)
41 9.8 0.85 (3H, d, J=6.5 Hz)
42 14.2 1.65 (3H, s)
43 56.2 3.36 (3H, s)
44 57.7 3.37 (3H, s)
45 56.6 3.40 (3H, s)
1H, 13C-NMR로부터 특징적인 작용기로써 1개의 ketone 탄소(δC 214.8)와 2개의 carbonyl 탄소(δC 171.6, 169.7), 2개의 olefine 골격(δC 140.6, 122.6; δC 132.3, 129.4)이 확인되었고, dioxygenated 4급탄소(δC 98.4), oxygenated 메틴탄소 7개(δC 84.2, 77.8, 77.4, 74.4, 73.6, 70.8, 69.1), 3개의 메톡시 탄소 (δC 57.7, 56.6, 56.2)가 관측되었으며, 6개의 메틸탄소(δC 18.9, 16.9, 15.4, 14.0, 9.8)가 관측되었으며, 탄소는 모두 43개로 이루어진 FK506 유도체로 관측되었다.
정확한 구조를 확인하기 위하여, 2D-NMR을 확인하였다. gCOSY로부터 proton의 연결을 확인한 결과, H-2~H-4사이의 coupling으로부터 본 화합물은 pipecolyl 골격의 FK506이 아닌, CH2작용기가 없는 prolyl 골격을 가지고 있음을 확인하였다. gHMBC 데이터로부터 H-9(δH 2.55, 2.62)이 C-8(δC 171.6), C-10(δC 98.4)과 correlation으로부터 본 화합물은 C-9에 ketone이 아닌 CH2로 환원된 골격임을 확인하였다. FK506 기본 골격인 C36-C37사이의 exomethylene이 관측되지 않고, gCOSY 2D-NMR에서 triplet으로 관측되는 H37이 H36a/b 및 H36a/b와 H35a/b 사이에 각각 coupling correlation을 보이는 것으로부터, C36-C37의 골격이 dihydrogenation 된 것임을 확인할 수 있었다. 이와 함께, 3개의 메톡시 작용기가 C-13, C-15 및 C-31에는 메톡시가 존재하는 구조임을 확인하였다. 이를 종합하여, 본 화합물은 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)임을 확인하였다.
실시예 2: 9-데옥소-31- O -디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31- O -demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506) 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외(J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합(Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임(In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD-fkbM, tcsD 및 fkbL 유전자의 비활성화를 초래하여 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14170BP)을 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD-fkbM, tcsD와 fkbL 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합(Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드(Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드(Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀(E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드(Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드(Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편(Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD-fkbM 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MLF/FkbD-MLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MRF/FkbD-MRR을 설계하였다. tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. fkbL 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbLLF/FkbLLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbLRF/FkbLRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 상기 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소(Hydroxylase)와 31-O-메틸변환효소를 함께 제거하기 위한 플라스미드, pΔfkbD-fkbM는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신(Apramycin)이 있는 37℃ (pSG5-기본으로 하는 복제단위(Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주(Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다.
2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD-fkbM를 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM에 C21 측쇄를 변형하기 위한 플라스미드, pΔtcsD를 도입하여 fkbD-fkbM 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD-fkbM,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 추가적으로 제작한 fkbD-fkbM와 tcsD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD에 C1 프롤릴 고리를 형성하기 위한 플라스미드, pΔfkbL를 도입하여 fkbD-fkbM와 tcsD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 fkbL 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM, tcsD, fkbL 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2020년 4월 14일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC14170BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14170BP)의 배양을 통하여 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크(Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지(수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물(10%) 50 ml/L, TES buffer(5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨(0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물(3.68%) 80 ml/L, L-프롤린(20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨(1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기(Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드(분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 2]로 표시되는 물질인 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)을 얻을 수 있었다.
제조한 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석(High performance liquid chromatography analysis), 질량분석(Mass spectrometry), 핵자기공명 분석(Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)에 대한 분석 결과는 표 4와 도 7 내지 도 12로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL으로부터 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506; 분자식 C42H73NO11, 분자량 763.49)에 대한 분석 결과를 하기의 표 4에 나타내었다.
분석법 분석결과
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C42H69NNaO11 +:786.4763, found: m/z 786.4767
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.8
2 58.7 4.36 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 29.0 1.97 (1H, m)2.19 (1H, m)
4 24.8 1.97 (1H, m)1.98 (1H, m)
5 47.3 3.52 (1H, m)3.63 (1H, m)
6
7
8 171.7
9 39.1 2.54 (1H, d, J=15.0 Hz)
2.63 (1H, d, J=15.0 Hz)
10 98.4
11 38.4 1.59 (1H, m)
12 32.5 1.56 (1H, m)
1.98 (1H, m)
13 74.4 3.40 (1H, m)
14 70.8 3.85 (1H, brd, J=10.0 Hz)
15 77.3 3.51 (1H, m)
16 36.3 1.34 (1H, m)
1.45 (1H, m)
17 25.4 1.60 (1H, m)
18 49.0 1.67 (1H, m)
2.35 (1H, m)
19 140.8
20 122.6 4.98 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 53.4 3.26 (1H, m)
22 216.3
23 43.5 2.31 (1H, brd J=15.0 Hz)
2.68 (1H, brd J=15.0 Hz)
24 69.1 4.02 (1H, m)
25 40.9 1.82 (1H, m)
26 77.9 5.18 (1H, brs)
27 132.4
28 129.4 4.97 (1H, d, J=5.0 Hz)
29 34.9 2.32 (1H, m)
30 39.1 1.12 (1H, m)
1.90 (1H, m)
31 75.0 3.41 (1H, m)
32 75.5 3.34 (1H, m)
33 32.0 1.33 (1H, m)
1.95 (1H, m)
34 30.9 1.04 (1H, m)1.61 (1H, m)
35 33.3 1.45 (1H, m)1.63 (1H, m)
36 20.4 1.22 (2H, m)
37 14.0 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz)
38 16.9 0.95 (3H, d, J=6.5 Hz)
39 18.9 0.76 (3H, d, J=6.5 Hz)
40 15.4 1.65 (3H, s)
41 9.8 0.89 (3H, d, J=6.5 Hz)
42 14.1 1.65 (3H, s)
43 57.7 3.36 (3H, s)
44 58.7 3.36 (3H, s)
1H, 13C-NMR로부터 특징적인 작용기로써 1개의 ketone 탄소(δC 216.3)와 2개의 carbonyl 탄소(δC 171.7, 169.8), 2개의 olefine 골격(δC 140.8, 122.6;δC 132.4, 129.4)이 확인되었고, dioxygenated 4급탄소(δC 98.4), oxygenated 메틴탄소 7개(δC 77.9, 77.3, 75.5, 75.0, 74.4, 70.8, 69.1), 2개의 메톡시 탄소(δC 58.7, 57.7)가 관측되었으며, 5개의 메틸탄소(δC 18.9, 16.9, 15.4, 14.0, 9.8)가 관측되었으며, 탄소는 모두 42개로 이루어진 FK506 유도체로 관측되었다. 정확한 구조를 확인하기 위하여, 2D-NMR을 확인하였다. gCOSY로부터 proton의 연결을 확인한 결과, H-2~H-4사이의 coupling으로부터 본 화합물은 prolyl 골격을 가지고 있음을 확인하였다. gHMBC 데이터로부터 H-9(δH 2.54, 2.63)이 C-8(δC 171.7), C-10(δC 98.4)과 correlation으로부터 본 화합물은 C-9에 ketone이 아닌 CH2로 환원된 골격임을 확인하였다. 이와 함께, 2개의 메톡시 작용기가 C-13, C-15에 결합되어 있어, C-31에는 메톡시가 존재하지 않는 구조임을 확인하였다.
이를 종합하여, 본 화합물은 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)임을 확인하였다.
실시예 3: 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520) 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외(J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합(Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임(In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD, tcsD 및 fkbL 유전자의 비활성화를 초래하여 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolyl-FK520)의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14171BP)을 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD, tcsD와 fkbL 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합(Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드(Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드(Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀(E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드(Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드(Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편(Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDLF/FkbDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbDRF/FkbDRR을 설계하였다. tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. fkbL 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbLLF/FkbLLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbLRF/FkbLRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소(Hydroxylase)를 제거하기 위한 플라스미드, pΔfkbD는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신(Apramycin)이 있는 37℃(pSG5-기본으로 하는 복제단위 (Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주(Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD를 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD에 C21 측쇄를 변형하기 위한 플라스미드, pΔtcsD를 도입하여 fkbD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 추가적으로 제작한 fkbD와 tcsD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD에 C1 프롤릴 고리를 형성하기 위한 플라스미드, pΔfkbL를 도입하여 fkbD와 tcsD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 fkbL 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD,tcsD,fkbL는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD,tcsD,fkbL 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD,tcsD,fkbL은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2020년 4월 14일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC14171BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14171BP)의 배양을 통하여 9-deoxo-prolyl-FK520을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크(Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지(수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물(10%) 50 ml/L, TES buffer(5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨(0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물(3.68%) 80 ml/L, L-프롤린(20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨(1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기(Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드(분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 3]로 표시되는 물질인 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)을 얻을 수 있었다.
제조한 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석(High performance liquid chromatography analysis), 질량분석(Mass spectrometry), 핵자기공명 분석(Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)에 대한 분석 결과는 표 5와 도 13 내지 도 18로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD,tcsD,fkbL으로부터 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520; 분자식 C42H69NO11, 분자량 763.49)에 대한 분석 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.
분석법 분석결과
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C42H69NNaO11 +:786.4763, found: m/z 786.4768
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.9
2 58.9 4.37 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 29.2 1.98 (1H, m)2.20 (1H, m)
4 25.8 1.97 (1H, m)1.98 (1H, m)
5 47.5 3.56 (1H, m)3.65 (1H, m)
6
7
8 171.8
9 39.2 2.57 (1H, d, J=15.0 Hz)
2.62 (1H, d, J=15.0 Hz)
10 98.6
11 38.6 1.59 (1H, m)
12 32.8 1.56 (1H, m)
1.99 (1H, m)
13 74.4 3.40 (1H, m)
14 71.1 3.85 (1H, brd, J=10.0 Hz)
15 77.4 3.54 (1H, m)
16 36.3 1.34 (1H, m)
1.45 (1H, m)
17 25.4 1.61 (1H, m)
18 49.2 1.67 (1H, m)
2.36 (1H, m)
19 141.1
20 122.6 4.99 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 55.5 3.18 (1H, m)
22 215.0
23 43.7 2.33 (1H, brd J=15.0 Hz)2.68 (1H, brd J=15.0 Hz)
24 69.4 4.04 (1H, m)
25 41.2 1.83 (1H, m)
26 78.0 5.19 (1H, brs)
27 132.5
28 129.7 5.02 (1H, d, J=5.0 Hz)
29 35.1 2.28 (1H, m)
30 35.0 0.95 (1H, m)2.05 (1H, m)
31 84.2 3.01 (1H, m)
32 73.8 3.42 (1H, m)
33 31.4 1.36 (1H, m)
1.96 (1H, m)
34 30.9 1.03 (1H, m)1.60 (1H, m)
35 24.8 1.51 (1H, m)1.71 (1H, m)
36 11.9 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz)
37 17.1 0.96 (3H, d, J=6.5 Hz)
38 19.1 0.78 (3H, d, J=6.5 Hz)
39 15.7 1.67 (3H, s)
40 10.0 0.91 (3H, d, J=6.5 Hz)
41 14.4 1.67 (3H, s)
42 56.4 3.36 (3H, s)
43 57.9 3.37 (3H, s)
44 56.8 3.40 (3H, s)
1H, 13C-NMR로부터 특징적인 작용기로써 1개의 ketone 탄소(δC 215.0)와 2개의 carbonyl 탄소(δC 171.8, 169.9), 2개의 olefine 골격(δC 141.1, 122.6;δC 132.5, 129.7)이 확인되었고, dioxygenated 4급탄소(δC 98.6), oxygenated 메틴탄소 7개(δC 84.2, 78.0, 77.4, 74.4, 73.8, 71.1, 69.4), 3개의 메톡시 탄소 (δC 57.9, 57.9, 56.4)가 관측되었으며, 5개의 메틸탄소(δC 19.1, 17.1, 15.7, 14.4, 10.0)가 관측되었으며, 탄소는 모두 42개로 이루어진 FK506 유도체로 관측되었다. 정확한 구조를 확인하기 위하여, 2D-NMR을 확인하였다. gCOSY로부터 proton의 연결을 확인한 결과, H-2~H-4사이의 coupling으로부터 본 화합물은 prolyl 골격을 가지고 있음을 확인하였다. gHMBC 데이터로부터 H-9(δH 2.57, 2.62)이 C-8(δC 171.8), C-10(δC 98.6)과 correlation으로부터 본 화합물은 C-9에 ketone이 아닌 CH2로 환원된 골격임을 확인하였다. 이와 함께, 3개의 메톡시 작용기가 C-13, C-15 및 C-31에 존재하는 구조임을 확인하였다. 또한, gCOSY coupling correlation과 gHMBC long range correlation을 통해서, C-21에 C-35 과 C-36 이 에틸기로 연결된 구조임을 확인하였다. 이를 종합하여, 본 화합물은 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)임을 확인하였다.
실시예 4: 9-데옥소-31- O -디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31- O -demethyl-prolylFK520) 제조
FK506을 생산하는 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스에 대하여 Ban, Y. H. 외(J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 이중교차 상동 재조합(Double cross-over homologous recombination)에 의한 인-프래임(In-frame) 결실 방법을 사용하여 fkbD-fkbM, tcsD 및 fkbL 유전자의 비활성화를 초래하여 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)의 생산균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14170BP)을 제작하였다.
구체적으로 설명하면, FK506을 생산하는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 균주에서 fkbD-fkbM, tcsD와 fkbL 유전자의 결손 돌연변이체를 제작하기 위하여 각각의 유전자를 pKC1139 벡터에 클로닝하여 Escherichia coli ET12567/pUZ8002로 옮긴 후, 접합(Conjugation)을 통해 FK506 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로 형질 전환하였다.
균주제작 방법은 보다 구체적으로 인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드(Plasmids)의 제작, 유전자 결실 균주 제작으로 설명할 수 있다.
인-프래임(In-frame) 유전자 결실 플라스미드(Plasmids)의 제작은 대장균-방선균 셔틀(E. coli-Streptomyces shuttle) 벡터 pKC1139를 인-프래임 유전자 결실을 위해서 사용하였다. 플라스미드(Plasmid) 제작은 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스로부터 유래된 포스미드(Fosmid) DNA로부터 삭제를 위한 표적 유전자의 왼쪽- 및 오른쪽-인접 절편(Left- and right-flanking fragments)의 PCR 증폭에 의해 실시하였다. fkbD-fkbM 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MLF/FkbD-MLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbD-MRF/FkbD-MRR을 설계하였다. tcsD 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDLF/TcsDLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 TcsDRF/TcsDRR을 설계하였다. fkbL 유전자의 결실을 위해서는 왼쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbLLF/FkbLLR, 오른쪽-인접 절편의 프라이머 쌍 FkbLRF/FkbLRR을 설계하였다. PCR 절편 모두는 분리하여 HindIII-XbaI 또는 XbaI-EcoRI으로 절단한 후에 pKC1139 벡터에 클로닝 하였다. 본 실시예에서 사용된 균주, 플라스미드 및 프라이머에 대한 정보는 표 1과 표 2에 제시하였다.
유전자 결실 균주 제작을 위해 사용한 플라스미드는 표 1에 요약하였다. C9 수산화효소(Hydroxylase)와 31-O-메틸변환효소를 함께 제거하기 위한 플라스미드, pΔfkbD-fkbM는 대장균 ET12567/pUZ8002에 옮긴 후 접합에 의해 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 내로 도입하여 표적 유전자를 상동 재조합으로 결실시켰다. 결실 플라스미드와 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 염색체 사이에서 단일 교차가 일어난 균주는 아프라마이신(Apramycin)이 있는 37℃(pSG5-기본으로 하는 복제단위(Replicon)를 위한 비-증식 허용온도)에서 아프라마이신-저항성이 있는 피전달접합균주(Transconjugant)의 배양으로 선택하였다. 이후 확보된 콜로니는 28℃에서 선택 없이 3회 증식을 수행하여 두 번째 교차를 허용하였다. 2개의 달성된 이중 교차 돌연변이, 즉 ΔfkbD-fkbM를 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM에 C21 측쇄를 변형하기 위한 플라스미드, pΔtcsD를 도입하여 fkbD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 tcsD 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD-fkbM,tcsD는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였고, 선택적으로 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 추가적으로 제작한 fkbD-fkbM와 tcsD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD에 C1 프롤릴 고리를 형성하기 위한 플라스미드, pΔfkbL를 도입하여 fkbD-fkbM와 tcsD 유전자 결손 방법과 동일한 방법을 이용하여 fkbL 유전자를 결실시켰다. ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL는 아프라마이신-민감성의 발현형질로 선택하였고, 그 후에 PCR로 확인하였다.
제작한 fkbD-fkbM,tcsD,fkbL 유전자 결손 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2020년 4월 14일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC14170BP).
상기 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14170BP)의 배양을 통하여 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)을 제조하였다. 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 250 ml의 베플 삼각 플라스크 (Baffled flask)에 50 ml의 R2YE 배지(수크로오즈 103 g/L, 글루코오즈 10 g/L, 황산칼륨 0.25 g/L, 염화마그네슘 6수화물 10.12 g/L, 카사미노 엑시드 0.1 g/L, 효모 추출물(10%) 50 ml/L, TES buffer(5.73%, pH 7.2) 100 ml/L, 인산칼륨(0.5%) 10 ml/L, 염화칼슘 2수화물(3.68%) 80 ml/L, L-프롤린(20%) 15 ml/L, 미량 원소 용액 2 ml/L, 수산화나트륨(1 N) 5 ml/L)를 첨가하고, 여기에 생산균주를 접종한 다음에 회전식 진탕 배양기에서 28℃, 180 rpm 조건에서 이틀 동안 전배양을 실시하였다. 그 다음에 1 L의 R2YE 배지가 첨가되어 있는 3 L 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 이틀 동안 전배양한 배양액 10 ml를 접종하였다. 접종 후에 28℃, 180 rpm 조건에서 6일 동안 배양을 실시하였다. 6일간 배양 후에 1차 회수 공정을 통해 생산된 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)을 추출하였다.
1차 회수 공정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 30분 동안 혼합해 준 후 원심분리하여 균체를 제거하였고, 균체를 제거한 추출액에 대해서는 회전 증발기(Rotary evaporator)를 이용한 농축을 실시해 주었다. 그 다음에 농축한 추출액을 물에 용해시키고, 2배 용량의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)를 첨가 후 잘 혼합해 준 다음 층 분리가 될 때까지 방치하였다. 층이 분리된 다음에 위층의 유기용매층을 회수하고 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시키고 농축 후의 무게를 측정하였다. 1차 회수 공정을 실시하여 얻어 진 추출액을 실리카겔이 충진된 칼럼을 통과시켜 주었다. 이때 실리카겔의 양은 1차 회수 공정의 추출액 무게의 15배를 사용하였으며, 이동상은 5가지 비율의 메탄올과 메틸렌클로라이드(분액 1. 0:100, 분액 2. 1:100, 분액 3. 1:10, 분액 4. 1:1, 분액 5. 100:0)를 사용하였다. 분액 3에서 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)이 확인되었다. 이렇게 얻어진 분액 3은 회전 증발기를 이용하여 농축하고 HPLC를 이용하여 최종적으로 정제하였다.
이를 동결건조시켜 분말형태의 [화학식 4]로 표시되는 물질인 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)을 얻을 수 있었다.
제조한 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 구체적으로, 고성능액체크로마토그래피 분석(High performance liquid chromatography analysis), 질량분석(Mass spectrometry), 핵자기공명 분석(Nuclear magnetic resonance analysis)을 실시하였다. 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolyl-FK520)에 대한 분석 결과는 표 6과 도 19 내지 도 24로 정리되며, 이러한 결과들로부터 제작한 생산균주 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL으로부터 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)이 생산됨을 확인할 수 있었다.
9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520; 분자식 C41H67NO11, 분자량 749.97)에 대한 분석 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.
분석법 분석결과
질량분석 (ESI-HR-MS) Calcd. for C41H67NNaO11 +:772.4614, found: m/z 772.4619
핵자기공명 분석 번호 carbon (ppm) proton (ppm)
1 169.8
2 58.7 4.36 (1H, brd, J=5.0 Hz)
3 29.0 1.96 (1H, m)2.18 (1H, m)
4 25.4 1.97 (1H, m)1.98 (1H, m)
5 47.3 3.54 (1H, m)3.63 (1H, m)
6
7
8 171.6
9 39.1 2.56 (1H, d, J=15.0 Hz)2.62 (1H, d, J=15.0 Hz)
10 98.4
11 38.4 1.59 (1H, m)
12 32.6 1.56 (1H, m)1.98 (1H, m)
13 74.4 3.40 (1H, m)
14 70.9 3.85 (1H, brd, J=10.0 Hz)
15 77.3 3.52 (1H, m)
16 36.3 1.34 (1H, m)1.45 (1H, m)
17 25.4 1.60 (1H, m)
18 49.0 1.69 (1H, m)2.35 (1H, m)
19 140.8
20 122.4 4.97 (1H, d, J=5.0 Hz)
21 55.3 3.17 (1H, m)
22 214.7
23 43.8 2.32 (1H, brd J=15.0 Hz)2.66 (1H, brd J=15.0 Hz)
24 69.1 4.02 (1H, m)
25 40.9 1.82 (1H, m)
26 77.9 5.18 (1H, brs)
27 132.4
28 129.4 4.97 (1H, d, J=5.0 Hz)
29 34.9 2.32 (1H, m)
30 39.1 1.12 (1H, m)1.90 (1H, m)
31 75.0 3.41 (1H, m)
32 75.5 3.34 (1H, m)
33 32.0 1.33 (1H, m)1.95 (1H, m)
34 30.9 1.04 (1H, m)1.61 (1H, m)
35 24.6 1.49 (1H, m)1.72 (1H, m)
36 11.7 0.87 (3H, t, J=7.5 Hz)
37 16.9 0.95 (3H, d, J=6.5 Hz)
38 18.9 0.77 (3H, d, J=6.5 Hz)
39 15.4 1.65 (3H, s)
40 9.8 0.89 (3H, d, J=6.5 Hz)
41 14.1 1.65 (3H, s)
42 56.2 3.37 (3H, s)
43 57.7 3.37 (3H, s)
1H, 13C-NMR로부터 특징적인 작용기로써 1개의 ketone 탄소(δC 214.7)와 2개의 carbonyl 탄소(δC 171.6, 169.8), 2개의 olefine 골격(δC 140.8, 122.4;δC 132.4, 129.4)이 확인되었고, dioxygenated 4급탄소(δC 98.4), oxygenated 메틴탄소 7개(δC 77.9, 77.3, 75.5, 75.0, 74.4, 70.9, 69.1), 2개의 메톡시 탄소(δC 57.7, 56.2)가 관측되었으며, 5개의 메틸탄소(δC 18.9, 16.9, 15.4, 11.7, 9.8)가 관측되었으며, 탄소는 모두 41개로 이루어진 탄소수가 줄여진 FK506 유도체로 관측되었다. 정확한 구조를 확인하기 위하여, 2D-NMR을 확인하였다. gCOSY로부터 proton의 연결을 확인한 결과, H-2~H-4사이의 coupling으로부터 본 화합물은 prolyl 골격을 가지며, H21-H35-36의 coupling correlation으로부터 FK520 형태를 취하고 있음을 확인하였다. gHMBC 데이터로부터 H-9(δH 2.56, 2.62)이 C-8(δC 171.6), C-10(δC 98.4)과 correlation으로부터 본 화합물은 C-9에 ketone이 아닌 CH2로 환원된 골격임을 확인하였다. 이와 함께, 2개의 메톡시 작용기가 C-13, C-15에 결합되어 있어, C-31에는 메톡시가 존재하지 않는 구조임을 확인하였다. 이를 종합하여, 본 화합물은 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)임을 확인하였다.
실시예 5: 4종 신규 화합물의 면역억제활성 조사
4종 신규 화합물의 면역억제활성 감소 정도를 통상의 인비트로(In vitro) T-세포 활성 분석법(J. Immunol. 143: 718-726, 1989)을 이용하여 조사하였다. CD4+ T 세포가 분열되는 것은 면역반응이 일어나고 있음을 보여주는 지표로 CD4+ T 세포를 Cell TraceTM Violet(CTV)으로 염색하여 세포가 면역반응에 따른 분열을 하여 T 세포가 증식하는 경우에 각 세포의 CTV 보유량이 감소되는 현상이 나타나므로 이를 지표로 이용하여 면역억제활성 정도를 조사하였다.
6~8주령의 B6J 실험용 쥐의 지라(Spleen)로부터 단세포(Single cell)를 박리하고 MagniSort® Mouse CD4 T cell Enrichment Kit(eBioscience)를 사용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. CD4+ T 세포를 Cell TraceTM Violet(CTV) Cell Proliferation Kit(Molecular Probes)로 염색하고 FK506 또는 4종 신규 화합물을 0.01 ng/ml, 0.1 ng/ml, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1000 ng/ml 농도가 되게 첨가한 다음에 72시간 동안 배양하였다. T 세포의 활성화를 위해 Dynabeads® Mouse T-Activator CD3/CD28(Gibco)를 사용하였다. 대조구로는 활성화되지 않은 T 세포를 사용하였다. 배양 후에 유세포 분석기(flow cytometry)로 CTV 강도(intensity)를 분석하였다.
하기 표 7와 도 25는 유세포 분석기를 이용하여 CTV 강도를 측정한 것으로 T 세포 증식 정도를 보여주어, FK506 및 4종 신규 화합물의 면역억제활성 정도를 보여준다. 하기 표 7와 도 25에 나타난 바와 같이 본원발명에서 제시하고 있는 모든 신규화합물들은 FK506보다 현저히 감소된 면역억제활성을 나타내었다. 특히, 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)은 현재까지 보고된 신경재생활성이 유지 또는 향상된 FK506 유도체들 중 가장 낮은 면역억제활성을 보였다.
Structural analogs Immunosuppression
IC50 (ng/ml)
FK506 0.027
9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506 3088.1
9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506 5556.7
9-deoxo-prolylFK520 3288.8
9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520 7091.0
이러한 결과로부터, 본 발명에 따른 4종 신규 화합물들이 FK506에 비교하여 면역억제활성이 크게 감소되었음을 확인할 수 있었으며, 4종의 신규 화합물이 최소 1.14× 105배 이상의 IC50(ng/ml) 농도를 보임에 따라 면역억제활성이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다. 이로부터 4종 신규 화합물 중 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물이 면역억제활성에 기인한 부작용에 대한 염려 없이 사용할 수 있다고 판단하였다.
실시예 6: 4종 신규 화합물들의 신경세포 성장촉진 활성 조사
4종 신규 화합물의 신경세포 성장 촉진능을 초대배양한 마우스 해마 신경세포(hippocampal neuron)를 이용하여 Jing Sun 외에 의해 보고된 방법(J. Neuroinflam. 15: 180, 2018)에 따라 조사하였다. 구체적으로, 초대배양한 해마 신경 세포에 FK506 또는 4종 신규 화합물 중 하나를 함께 처리하였고(처리 농도: 1 ng/ml) 대조군은 아무 처리도 해 주지 않았다. 신경돌기의 길이는 인화된 사진을 이용하여 기존에 보고된 방법(J. Pharmacol. Exp. Ther. 302: 1278-1285, 2002)에 따라 측정하였다.
그 결과를 도 26에 제시하였다. 도 26에서 알 수 있듯이 본 발명의 신규 화합물 4종은 우수한 신경 축삭 생장(neurite growth) 효과를 나타내었다.
즉, 본 발명의 신규 화합물 4종은 우수한 신경세포 성장 촉진능을 갖고 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)의 경우 FK506에 비하여 우수한 신경 축삭 생성효과를 보임을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 4종 신규 화합물들은 신경계 질환의 예방 또는 치료 목적으로 사용할 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예 7: 4종 신규 화합물의 신경계 질환 치료 효과 확인
4종 신규 화합물의 기능성 시냅스 형성 활성을, 초대 배양한 해마 신경 세포를 이용하여 D. Park. 외에 의해 보고된 방법(Sci. Rep. 7: 7260, 2017)에 따라 조사하였다. 구체적으로 FK506 또는 4종 신규 화합물에 노출시켜(처리 농도: 1 ng/ml) 초대 배양한 10일-14일차 해마 신경 세포를 대상으로 패치-고정 레코딩을 시행하여, 흥분성 시냅스 전류의 빈도를 측정하였다. 흥분성 시냅스 전류의 빈도는 시냅스 수의 변화를 확인할 수 있는 지표로 사용된다.
측정한 흥분성 시냅스 전류의 빈도를 나타낸 결과를 도 27에 제시하였다.
그 결과, 자발적 흥분성 시냅스후 전류(sEPSCs)는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)과 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)에서 각각 3.29 ± 0.22 (p<0.001, n = 7) 및 2.63 ± 0.27 (p<0.05, n = 6)으로 증가됨을 확인할 수 있었으며 이는 FK506(2.61 ± 0.18 (p<0.05, n = 10))에 비하여 증가된 수치에 해당됨을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명의 신규 화합물 4종 중 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)과 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)을 처리한 그룹에서 흥분성 시냅스 전류의 빈도가 유의미하게 증가했음을 확인하였다. 이는 상기 실시예 6에서 신규 화합물을 처리한 그룹이 보인 신경세포 성장촉진 활성 향상이, 기능성 시냅스 형성의 증가와도 연관될 수 있음을 시사한다.
실시예 8: 4종 신규 화합물의 퇴행성 신경질환 치료 효과 확인
4종 신규 화합물의 합성독소 MPTP에 의한 도파민성 신경섬유의 밀도 변화를 조사하였다. 구체적으로 깨어있는 동물의 특정한 뇌 부위에 약물을 주입할 수 있는 캐뉼라 (cannula) 주입 시스템을 이용하여, 생리식염수, FK506, 4종 신규 화합물 (처리 농도: 5 mg/ml)을 3일 동안 투여하고, 2일차에 신경독성 화합물인 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)를 복강 내 주입하여 파킨슨 질환동물 모델을 만들어 운동 능력과 연관된 흑색질 - 선조체 도파민 신경경로 (nigrostriatal pathway)의 퇴행을 유도하였다. 4일차에 도파민성 신경세포 특이적 표지자인 TH 항체를 이용하여 면역조직화기법(IHC) 염색을 시행하여 도파민성 신경세포체의 개수 및 신경섬유의 밀도의 변화를 측정하였다.
측정한 도파민성 신경세포체의 개수 및 신경섬유의 밀도의 변화를 나타낸 결과를 도 28에 제시하였다.
그 결과, 도파민성 신경세포체의 개수는 회복되었고, 신경섬유의 밀도는 회복됨을 확인하였다.
즉, 본 발명의 신규 화합물 4종 인 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)을 처리한 그룹에서 모두 FK506보다 우수한 신경섬유밀도의 회복을 보이고 면역억제능도 거의 없음을 확인하였다.
상기의 결과는 신규 화합물 4종이 모두 신경계 질환의 치료용도 특히, 퇴행성 신경질환 타겟 약물 물질로 사용이 가능함을 시사한다.
실시예 9: 4종 신규 화합물의 안전성 확인
4종 신규 화합물의 안전성을, 세포독성 조사를 위한 MTT assay, 간이 유전 독성 평가를 위한 Ames test, cardiac repolarization에 대한 잠재적인 영향 평가를 위한 hERG assay에서 수행하였다. 방법적으로는 일반적으로 사용하는 방법에 따라 조사하였다.
구체적으로 MTT assay는 4종 신규 화합물에 cytotoxicity 실험 농도 (1 ng/ml = 1.24 nM)보다 80 ~ 800배 높은 농도 (100 nM ~ 1,000 nM)의 약물을 시험농도로 설정하여, 포유동물 유래 정상 세포(HEK293 T Cell)에 대한 약물 독성 평가를 측정하였다. Ames test는 신규 화합물 4종의 처리 농도를 각각 plate 당 4, 16, 64 mg 처리하여 실시하였으며, 4종 신규 화합물에 히스티딘 요구성 균주 (Samonella Typhimurium TA98), 트립토판 요구성 균주 (Escherichia Coli WP2 uvrA)에서의 복귀돌연변이 유발성을 지표로 하여 측정하였다. hERG assay는 신규 화합물 4종의 처리 농도를 각각 0, 2, 8, 32 mM씩 세포수 2개 이상에 처리하여 실시하였다. 하나의 CHO hERG cells에 normal tyrode solution을 관류시키며, hERG channel current가 3 ~ 4 sweeps 동안 일정하게 기록되는 것을 확인 후, 부형대조군 및 4종 신규 화합물 처리군을 약 1 ~ 2분 이상 관류시켜 hERG channel current의 크기가 일정하게 기록되는 것을 시행하여, 상대 전류 (relative current, pA 또는 nA) 크기 및 억제 비율 (suppression rate, %)를 측정하였다.
이중 MTT assay 결과를 도 29에 제시하였다. 도 29에서 알 수 있듯이 본 발명의 신규 화합물 4종은 세포 독성이 거의 관찰되지 않았다.
즉, 본 발명의 신규 화합물 4종 인 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)을 처리한 그룹에서 모두 세포 독성이 관찰되지 않았으며, Ames test에서의 사용한 시험 균주의 복귀돌연변이 유발 및 hERG assay에서의 cardiac repolarization에 위험은 없는 안전한 물질임을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC14170BP
수탁일자 : 20200414
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC14171BP
수탁일자 : 20200414

Claims (16)

  1. 하기의 [화학식 1]로 표시되는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 하기의 [화학식 2]로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 하기의 [화학식 3]으로 표시되는 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 하기의 [화학식 4]로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00009


    [화학식 2]
    Figure pat00010


    [화학식 3]
    Figure pat00011


    [화학식 4]
    Figure pat00012
    .
  2. 하기의 [화학식 1]로 표시되는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 하기의 [화학식 2]로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 하기의 [화학식 3]으로 표시되는 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 하기의 [화학식 4]로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00013


    [화학식 2]
    Figure pat00014


    [화학식 3]
    Figure pat00015


    [화학식 4]
    .
    Figure pat00016
    .
  3. 제2항에 있어서, 상기 신경계 질환은 신경손상질환인 것인, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 신경계 질환은 퇴행성 신경질환(Neurodegenerative disease), 말초신경장애(Peripheral nerve injury), 외상성뇌손상(Traumatic brain injury) 및 뇌졸중(Cerebral infarction)에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 면역억제활성이 감소된 것을 특징으로 하는 것인, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 신경 돌기 생장 및 시냅스 형성 활성을 나타내는 것인, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제2항 내지 6항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 신경계 질환은 퇴행성 신경질환(Neurodegenerative disease), 말초신경장애(Peripheral nerve injury), 외상성뇌손상(Traumatic brain injury) 및 뇌졸중(Cerebral infarction)에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 신경계 질환의 예방 또는 치료방법.
  9. 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14171BP)를 배양하는 단계를 포함하는 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506)의 생산방법.
  10. 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14171BP)를 배양하는 단계를 포함하는 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520)의 생산방법.
  11. 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14170BP)를 배양하는 단계를 포함하는 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506)의 생산방법.
  12. 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL(수탁번호 KCTC14170BP)를 배양하는 단계를 포함하는 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520)의 생산방법.
  13. 수탁번호 KCTC14171BP로 기탁된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD,tcsD,fkbL 균주.
  14. 수탁번호 KCTC14170BP로 기탁된 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) ΔfkbD-fkbM,tcsD,fkbL 균주.
  15. 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  16. 9-데옥소-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-31-O-디메틸-36,37-디히드로-프롤릴FK506(9-deoxo-31-O-demethyl-36,37-dihydro-prolylFK506), 9-데옥소-프롤릴FK520(9-deoxo-prolylFK520), 및 9-데옥소-31-O-디메틸-프롤릴FK520(9-deoxo-31-O-demethyl-prolylFK520) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 화합물, 이의 이성질체 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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