KR20210155968A - 액상매질에서의 응집체 생산장치 및 액상매질에서의 응집체 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액상매질에서의 응집체 생산장치 및 액상매질에서의 응집체 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 액상매질에 부유하는 나노 혹은 마이크로 크기의 세포를 배양하면서 정상파를 이용하여 스패로이드 생성을 비약적으로 증가시키고, 액상매질의 환경의 조절 및 세척을 용이하게 할 수 있는, 액상매질에서의 응집체 생산장치 및 액상매질에서의 응집체 생산방법에 관한 것이다.

Description

액상매질에서의 응집체 생산장치 및 액상매질에서의 응집체 생산방법 {Spheroid Producing Device in Liquid Phase Medium and Method Thereof}

본 발명은 액상매질에서의 응집체 생산장치 및 액상매질에서의 응집체 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 액상매질에 부유하는 나노 혹은 마이크로 크기의 세포를 배양하면서 정상파를 이용하여 스패로이드 생성을 비약적으로 증가시키고, 액상매질의 환경의 조절 및 세척을 용이하게 할 수 있는, 액상매질에서의 응집체 생산장치 및 액상매질에서의 응집체 생산방법에 관한 것이다.

다양한 질병에 대한 치료 및 예방을 위해 현대 사회에서는 줄기세포에 대한 연구가 지속적으로 이어져오는 추세이고, 줄기세포에 대한 연구에서 줄기세포의 배양을 통해 효과적으로 스패로이드를 생성하는 것에 대해 많은 관심이 쏟아지고 있다. 스패로이드는 덩어리 형태의 세포구형의 집합체로서, 기초적인 생물학 연구에서부터 세포 치료제, 약물 스크리닝 시스템 개발 등 세포의 응용 분야에 있어서 큰 활용 가능성을 갖는다.

한편, 종래의 세포 배양방법에는 2차원 배양방법(2D cell culture)으로서 2차원의 플레이트 상에서 세포를 배양하는 방식이 존재한다. 이에 따라 세포 배양을 진행하게 되면 세포는 바닥에 붙어 형태를 변화시키거나 세포 분열을 하게 되지만 실제 생체 내에서 세포는 이러한 과정으로 자라지 않고, 주변의 세포와 액체에 둘러싸인 3차원 공간에서 성장, 분열, 분화하기 때문에 2차원 배양방법으로 배양된 세포를 이용한 연구결과는 임상과 상이한 차이를 보일 수 있다는 문제점이 있다. 또한, 이러한 문제점으로 인해 생체 내와 유사한 환경을 갖도록 3차원 세포 응집체인 스패로이드를 배양하는 3차원 세포배양(3D cell culture)이 주목받고 있으나, 기존 3차원 세포배양은 방법은 세포의 3차원 응집체 형성 단계에서 많은 시간이 소모되고, 비균일한 크기의 응집체가 형성되거나 배양 시 가해지는 물리적인 힘 (shear stress 등)에 의한 세포 특성의 변형 존재 등의 단점으로 인해 필요한 만큼의 충분한 세포배양을 단기간에 진행하기 어렵다는 문제점이 있다.

또한, 세포의 분리나 조작을 위해서 사용하는 방법들로 특히 외부에서 전기장, 자기장 또는 광(Light)을 이용하는 방법 또한 존재한다. 하지만 광학적(Optical)방법은 국지적인 가열이 세포 내 효소활동 등에 악영향을 미칠 뿐 아니라 대규모로 조작하기 힘들며, 전기장을 이용하는 방법은 줄 히팅(Joule-Heating)에 의한 온도상승, 전기장에 민감한 단백질 등에 영향을 주게 된다. 그리고 자기장을 이용하는 방법은 자성을 띄는 물질을 반드시 세포에 주입해야 한다는 단점이 있다. 이와 같은 단점들을 극복하기 위해 음향파를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다.

음향파의 경우, 체적 탄성파와 표면 탄성파로 나눌 수 있는데 표면 탄성파(Surface Acoustic Wave, 이하 SAW)가 정상압력장(Standing Pressure Field)에서 입자들이 특정 위치로 움직이는 현상을 이용할 수 있으며, 이러한 SAW를 사용하는 경우 장치가 단순하고 소형화가 가능하며 경제적인 점, 세포에 음파를 주어도 전자기장을 인가하는 것과 달리 세포생존에 영향을 주지 않으며, 유체를 통해 빠르게 큰 힘을 전달 할 수 있으며, 다양한 응용분야에 사용이 가능하며, 시스템 집적화와 대량생산이 용이하다는 장점을 가지고 있다.

이와 같이 종래의 스패로이드 제작 방법들은 시스템의 제작이 힘들고 스패로이드의 생존률, 균일성을 유지하는데 기술적 한계가 있고, 이를 극복하기 위하여 상기와 같은 장점을 가진 음향파를 이용한 스패로이드를 배양하는 기술에 대한 필요가 요구되었다.

등록특허 10-1965900 (스페로이드 형성 및 카운팅 기기 및 이의 제조 방법, 그리고 이를 이용한 스페로이드 배양 방법 및 계수 방법) 공개특허 10-2019-0093108 (암줄기세포 스페로이드 제조방법)

본 발명은 액상매질에 부유하는 나노 혹은 마이크로 크기의 세포를 배양하면서 정상파를 이용하여 스패로이드 생성을 비약적으로 증가시키고, 액상매질의 환경의 조절 및 세척을 용이하게 할 수 있는, 액상매질에서의 응집체 생산장치 및 액상매질에서의 응집체 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 일 실시예는, 액상매질에서의 응집체 생산장치로서, 내부에 나사산이 구비된 축결합관통홀이 형성되어 있는 덮개; 상기 축결합관통홀에 결합될 수 있고, 외주면에 나사산이 구비된 반사판축, 및 상기 반사판축의 일단에 결합된 반사판; 상측 및 하측이 개방되고 내부에 관통홀이 형성된 실린더; 상기 실린더의 하측에 결합될 수 있는 실린더결합부가 상면에 형성되어 있고, 관통홀형태의 상부진동자수용부가 형성된 상부케이스; 상기 상부케이스의 하측에 결합될 수 있고, 상면에 홈형태의 하부진동자수용홈이 형성된 중앙케이스; 및 상기 상부진동자수용부 및 상기 하부진동자수용홈에 의한 공간에 수용되는 진동자;를 포함하는, 액상매질에서의 응집체 생산장치를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 상부케이스의 실린더결합부의 외주면에는 오링이 결합될 수 있는 케이스오링홈이 형성되어 있고, 상기 케이스오링홈에 오링이 결합된 상태에서 오링의 외주면과 상기 실린더의 내부면이 접하는 형태로 상기 실린더결합부와 상기 실린더가 결합될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 실린더결합부는 상측에서 하측으로 갈수록 내경이 좁아지는 원통형이고, 상기 상부케이스는 관통홀이 형성된 판상형 부재에 상기 실린더결합부가 상측에 결합된 형태일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 중앙케이스의 내부에는 냉각수유로가 형성되어 있고, 상기 중앙케이스의 상면에는 상기 하부진동자수용홈에서 연장되어 홈형태의 배선홈이 형성되어 있을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 반사판축의 일단을 사용자가 회전 조작하는 경우, 상기 반사판축은 상기 축결합관통홀에서 상하 및 회전 이동할 수 있고, 이에 따라 상기 반사판의 위치가 변경될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 덮개에는 관통홀 형태의 가스주입홀, 상기 실린더의 상측의 일단이 안착될 수 있는 덮개단턱, 및 외주면에 오링이 결합될 수 있는 덮개오링홈이 더 형성되어 있고, 상기 덮개오링홈에 오링이 결합된 상태에서 오링의 외주면과 상기 실린더의 내부면이 접하는 형태로 상기 덮개와 상기 실린더가 결합될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 반사판은 원형 디스크형태의 제1반사판; 및 상기 제1반사판의 일면에 구비되는 복수의 제2반사판을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 실린더는, 상측에 형성되고 상측에서 하측으로 갈수록 내경이 줄어드는 상측관통홀; 하측에서 형성되고 하측에서 상측으로 갈수록 내경이 증가하는 하측관통홀; 및 상기 상측관통홀 및 상기 하측관통홀에 양단부가 연결된 유로;를 포함하고, 상기 유로는 복수개로 구비될 수 있다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 응집체 생산장치를 이용하여 액상매질에서 세포를 배양하여 응집체를 생산하는 방법으로서, 상기 응집체 생산장치는, 내부에 나사산이 구비된 축결합관통홀이 형성되어 있는 덮개; 상기 축결합관통홀에 결합될 수 있고, 외주면에 나사산이 구비된 반사판축, 및 상기 반사판축의 일단에 결합된 반사판; 상측 및 하측이 개방되고 내부에 관통홀이 형성된 실린더; 상기 실린더의 하측에 결합될 수 있는 실린더결합부가 상면에 형성되어 있고, 관통홀형태의 상부진동자수용부이 형성된 상부케이스; 상기 상부케이스의 하측에 결합될 수 있고, 상면에 홈형태의 하부진동자수용홈이 형성된 중앙케이스; 및 상기 상부진동자수용부 및 상기 하부진동자수용홈에 의한 공간에 수용되는 진동자;를 포함하는, 응집체를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 세포는 줄기세포이고, 상기 응집체 생산장치 내부에서 액상매질 중에 정상파를 발생시키고, 상기 정상파의 마디에서 응집체를 생성하여 배양시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 미세입자가 분산된 액상매질의 환경을 높은 사용자 편의성으로 미세하게 조절할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포 배양 시 사이즈가 작고 보다 많은 스패로이드를 생성할 수 있음으로써, 동일한 세포 분량으로 보다 효율적으로 스패로이드를 생산할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 진동자에 의한 열적 부작용을 최소화하고, 액상매질의 온도를 균일하게 유지할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 응집체 생산방법을 이용하여 생성한 스패로이드를 통해 혈관신성 및 발달에 영향을 주는 VEGF 유전자 및 세포 증식에 영향을 주는 PCNA 유전자를 많이 발현시킬 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 응집체 생산방법을 이용하여 생성한 스패로이드를 통해 신체에서 혈관신생을 유도하고, 혈류량 유입 증가에 중요한 역할을 하는 CD31단백질을 많이 발현시킬 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 액상매질이 접하는 구성요소들의 세척을 용이하게 할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드는 하지허혈 질환에 보다 비약적인 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 일반적인 소재 혹은 물질의 합성, 입자 배열뿐만 아니라 세포배양과 같은 보다 엄격한 환경에서의 입자 부양/정렬을 수행할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 사용자가 별도의 공구 없이 액상매질이 수용된 공간의 높은 기밀성을 유지하면서 장치를 이용할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치의 외형을 개략적으로 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치의 단면을 개략적으로 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 상부케이스의 외형을 개략적으로 도시한다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상부케이스의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 중앙케이스의 외형을 개략적으로 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 중앙케이스의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 덮개, 실린더, 및 반사부의 외형을 개략적으로 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 덮개의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 반사부의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 반사부의 외형을 개략적으로 도시한다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 반사부의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 실린더의 측단면도들을 개략적으로 도시한다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 정상파에 의하여 입자가 정렬되는 상태를 설명하는 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 현미경 사진을 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 배양 시간별 크기를 분석한 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 시간 변화 따른 세포응집 및 광학사진을 개략적으로 도시한다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 dead signal을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 qRT-PCR을 통한 VEGF 유전자를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 qRT-PCR을 통한 PCNA 유전자를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 BCA assay를 통한 단백질 정량 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 21는 본 발명의 일 실시예에 따른 하지허혈 질환 치료 동물실험을 통한 군별 치료 효과를 나타내는 도면이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 이식을 통해 하지허혈 환부에서 qRT-PCR을 통한 CD31 유전자 정량을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물실험 후 qRT-PCR을 통한 SM-alpha 유전자 정량을 비교한 도면이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물실험 후 H&E staining을 통한 하지 조직을 확인한 도면이다.

이하에서는, 다양한 실시예들 및/또는 양상들이 이제 도면들을 참조하여 개시된다. 하기 설명에서는 설명을 목적으로, 하나이상의 양상들의 전반적 이해를 돕기 위해 다수의 구체적인 세부사항들이 개시된다. 그러나, 이러한 양상(들)은 이러한 구체적인 세부사항들 없이도 실행될 수 있다는 점 또한 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 인식될 수 있을 것이다. 이후의 기재 및 첨부된 도면들은 하나 이상의 양상들의 특정한 예시적인 양상들을 상세하게 기술한다. 하지만, 이러한 양상들은 예시적인 것이고 다양한 양상들의 원리들에서의 다양한 방법들 중 일부가 이용될 수 있으며, 기술되는 설명들은 그러한 양상들 및 그들의 균등물들을 모두 포함하고자 하는 의도이다.

또한, "포함한다" 및/또는 "포함하는"이라는 용어는, 해당 특징 및/또는 구성요소가 존재함을 의미하지만, 하나이상의 다른 특징, 구성요소 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.

또한, 본 발명의 실시예들에서, 별도로 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명의 실시예에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

1. 스패로이드 생산장치

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치의 외형을 개략적으로 도시하고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치의 단면을 개략적으로 도시한다. 이하에서는 도 1, 2를 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 스패로이드 생산장치에 대하여 설명하도록 한다.

본 발명의 액상매질에서의 응집체 생산장치는 내부에 나사산이 구비된 축결합관통홀(120)이 형성되어 있는 덮개(100); 상기 축결합관통홀(120)에 결합될 수 있고, 외주면에 나사산이 구비된 반사판축(200), 및 상기 반사판축(200)의 일단에 결합된 반사판(210); 상측 및 하측이 개방되고 내부에 관통홀이 형성된 실린더(300); 상기 실린더(300)의 하측에 결합될 수 있는 실린더결합부(510)가 상면에 형성되어 있고, 관통홀형태의 상부진동자수용부(520)가 형성된 상부케이스(500); 상기 상부케이스(500)의 하측에 결합될 수 있고, 상면에 홈형태의 하부진동자수용홈(640)이 형성된 중앙케이스(600); 상기 상부진동자수용부(520) 및 상기 하부진동자수용홈(640)에 의한 공간에 수용되는 진동자(400); 및 상기 진동자(400)에 대한 구동을 수행하는 기판(710)을 수용하고 있는 하부케이스(700)를 포함한다.

이와 같은 구조의 본 발명에 따른 응집체 생산장치는 실린더(300), 덮개(100), 진동자(400), 및 상부케이스(500)의 일부에 의하여 형성되는 내부 공간에 액상매질 및 미세입자가 수용되고, 이후 진동자(400)의 동작에 의하여 액상매질 내부에 정상파를 생성하여, 미세입자들을 부양 및 정렬시킬 수 있다.

이와 같은 진동자(400)의 동작 및 정상파의 생성 과정 등은 전술한 선행문헌 1 내지 4에 기재되어 있고, 이와 같은 진동자(400)의 제어 및 동작은 통상적인 정상파에 기반한 미세입자 부양방법의 범위에 해당할 수도 있다.

한편, 도 1, 2에서와 같은 구성에서는 액상매질 및 미세입자가 수용되는 상부케이스(500) 위의 구성, 예를 들어, 실린더(300), 덮개(100), 및 반사판축(200), 반사판(210)의 결합에 있어서 별도의 나사가 필요하지 않고, 사용자가 별도의 공구 없이 실린더(300) 하측을 상부케이스(500)에서 분리하고, 실린더(300) 상측에서 덮개(100)를 분리하고, 덮개(100)에서 반사판축(200)을 분리할 수 있는 이점이 있다.

또한, 분리된 상태에서 간단히 흐르는 물 혹은 세제 등을 통하여 쉽게 세척 및 건조를 할 수 있고, 비교적 간편한 세척으로 분리된 요소들의 완전한 세척이 가능하기 때문에, 추가적인 공정 혹은 실험 등에 있어서 미세오염물의 유입을 용이하게 방지할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 반사판축(200)의 일단을 사용자가 회전 조작하는 경우, 상기 반사판축(200)은 상기 축결합관통홀(120)에서 상하 및 회전 이동할 수 있고, 이에 따라 상기 반사판(210)의 위치가 변경될 수 있다.

즉, 반사판축(200)의 외주면에는 나사산 형태의 축나사결합부(201)가 형성되어 있고, 덮개(100)의 내부면에는 축결합관통홀(120)이 형성되어 있고, 축결합관통홀(120)의 내주면에도 나사산 형태의 표면인 덮개나사결합부(110)가 형성되어 있다. 따라서, 사용자는 반사판축(200)의 상부 단부를 돌리는 행위를 함으로써, 반사판축(200)을 회전 및 상하이동을 도모할 수 있고, 이에 따라 반사판(210)의 수직 위치가 변동한다.

이와 같은 반사판(210)의 수직 위치의 변동을 통하여 정상파의 형태 및 액상매질의 환경 변화를 용이하게 도모할 수 있고, 수행하고자 하는 공정 및 실험에 적합한 환경을 미세하게 수동으로 조작할 수 있다.

한편, 덮개(100)와 실린더(300) 사이의 접촉은 덮개(100)의 외주면에 구비된 오링에 의하여 이루어지고, 이에 따라 덮개(100)와 실린더(300) 사이의 기밀성을 도모할 수 있다.

마찬가지로, 상부케이스(500)와 실린더(300) 사이의 접촉은 상부케이스(500)의 실린더결합부(510)의 외주면에 구비된 오링에 의하여 이루어지고, 이에 따라 상부케이스(500)의 실린더결합부(510)와 실린더(300) 사이의 기밀성을 도모할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 진동자(400)는 상부케이스(500)의 상부진동자수용홀(520) 및 하부케이스(700)의 하부진동자수용홈(640)에 의하여 형성되는 공간에 수용된다. 이와 같은 수용형태에서는 진동자(400)가 보다 안정적으로 액상매질에 정상파를 발생시킬 수 있다. 한편, 진동자(400)의 진동에 따른 발열에 의하여 액상매질 내부의 공간이 의도하지 않은 열원을 공급받을 수 있다.

본 발명에서는 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 하부진동자수용홈(640)이 형성된 중앙케이스(600)에 냉각수유로, 바람직하게는 관통홀 형태의 제1냉각수유로(610) 및 제2냉각수유로(620)가 형성되어 있고, 상기 상부케이스(500) 및 상기 중앙케이스(600)는 금속재질로 형성된다.

또한, 기판(710), 전원공급장치 등, 진동자(400)를 구동하는 데 필요한 전기적 요소에 의한 액상매질 환경의 영향을 최소화하기 위하여, 냉각수유로가 있는 중앙케이스(600)의 하측에 위치하는 하부케이스(700)의 내부에 기판(710) 등이 배치된다.

바람직하게는, 하부케이스(700)의 하면에는 고무 재질의 지지부(900)가 구비되어 있을 수도 있다.

한편, 상기 중앙케이스(600)의 상면에는 상기 하부진동자수용홈(640)에서 연장되어 홈형태의 배선홈(650)이 형성되어 있고, 상기 진동자(400)의 신호선 혹은 전원공급선은 상기 배선홈(650)을 따라 외부로 노출되고, 노출되는 배선홈(650)은 상기 하부케이스(700)의 관통홀 등의 구성을 통하여 하부케이스(700) 내부에 배치되는 기판(710), 전원공급 장치 등에 직접적 혹은 간접적으로 연결될 수 있다.

한편, 기판(710)에 신호 혹은 전원을 공급하는 기판신호선(920) 역시 하부케이스(700)의 관통홀 등의 구성을 통하여 외부로 노출되어 있다.

이하에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치의 세부 구성요소들에 대하여 상세하게 설명하도록 한다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 상부케이스(500)의 외형을 개략적으로 도시하고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 상부케이스(500)의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.

상기 실린더결합부(510)는 상측에서 하측으로 갈수록 내경이 좁아지는 원통형이고, 상기 상부케이스(500)는 관통홀이 형성된 판상형 부재에 상기 실린더결합부(510)가 상측에 결합된 형태이다.

구체적으로, 상부케이스(500)에는 중앙측에 상부진동자수용홀(520)이 형성되어 있고, 상기 상부진동자수용홀(520)을 둘러싸는 형태로 실린더결합부(510)가 형성되어 있다.

실린더결합부(510)는 하측에서 상측으로 갈수록 내경이 커지는 실린더(300) 형태로 되어 있고, 이와 같은 구조에 의하여 실린더(300)를 견고하게 지지하면서, 진동자(400)에 의한 진동발생을 보다 안정적으로 수행할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

한편, 상부케이스(500)의 모서리측에서는 상부케이스결합홀(550)이 형성되어 있고, 이와 같은 상부케이스결합홀(550)에 대한 나사체결에 의하여 상부케이스(500)가 중앙케이스(600)에 안정적으로 결합될 수 있다.

한편, 상기 실린더결합부(510)의 외주면에는 케이스오링홈(530)이 형성되어 있고, 케이스오링홈(530)에는 케이스오링(540)이 구비되고, 이와 같은 케이스오링(540)에 의하여 실린더(300)와 상부케이스(500)의 기밀성을 유지할 수 있다.

즉, 상기 상부케이스(500)의 실린더결합부(510)의 외주면에는 오링이 결합될 수 있는 케이스오링홈(530)이 형성되어 있고, 상기 케이스오링홈(530)에 오링이 결합된 상태에서 오링의 외주면과 상기 실린더(300)의 내부면이 접하는 형태로 상기 실린더결합부(510)와 상기 실린더(300)가 결합될 수 있다.

이와 같은 구조에서, 상부케이스(500), 중앙케이스(600), 하부케이스(700), 진동자(400), 기판(710)은 하나의 결합된 구조체가 되고, 이 상태에서 사용자는 단순히 실린더(300), 덮개(100) 등을 별도의 도구 없이 손으로 분해하여 세척 등을 수행할 수 있다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 중앙케이스(600)의 외형을 개략적으로 도시한다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 중앙케이스(600)의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.

상기 중앙케이스(600)의 내부에는 냉각수유로가 형성되어 있다. 구체적으로는 제1냉각수유로(610) 및 제2냉각수유로(620)가 상기 중앙케이스(600)의 내부를 관통하는 형태로 형성됨이 바람직하다. 이 경우, 복수의 응집체 생산장치를 병렬로 연결하고, 하나의 냉각라인을 복수의 응집체 생산장치가 공유할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

상기 중앙케이스(600)의 상면에는 상기 하부진동자수용홈(640)에서 연장되어 홈형태의 배선홈(650)이 형성되어 있다. 이와 같은 하부진동자수용홈(640)의 상면에 진동자(400)의 하면이 지지되고, 상기 배선홈(650)을 통하여 연결되는 진동자신호선(910)에 의하여 진동자(400)가 구동전원을 공급받을 수 있다.

이와 같은 구조에 의하여 보다 안정적으로 실린더(300) 내부에 정상파를 생성시킬 수 있고, 전체적인 세척 및 분리를 용이하게 할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

한편, 상기 중앙케이스(600)의 상면의 모서리측에는 중앙케이스결합홈(630)이 형성되어 있고, 이와 같은 중앙케이스결합홈(630)에 의하여 상기 중앙케이스(600)가 상부케이스(500)에 결합될 수 있다.

도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 덮개(100), 실린더(300), 및 반사부의 외형을 개략적으로 도시한다.

도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 덮개(100), 실린더(300) 및 반사판축(200) 및 반사판(210)을 포함하는 반사부는 별도의 공구없이 분리될 수 있으며, 결합시 동축으로 결합되어, 실린더(300) 내부의 공간을 형성할 수 있다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 덮개(100)의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.

도 8에 도시된 바와 같이, 상기 덮개(100)에는 중앙 위치에 축결합관통홀(120)이 형성되어 있고, 축결합관통홀(120)과 일정길이가 이격되어 관통홀 형태의 가스주입홀(130)이 형성되어 있다.

축결합관통홀(120)에는 내주면에 나사산이 형성되어 있고, 전술한 반사판축(200)이 상기 축결합관통홀(120)에 나사결합하여 위아래로 이동함으로써 결과적으로 반사판(210)의 위치를 이동시켜 정상파의 발생형태를 사용자가 용이하게 변경할 수 있다.

한편, 가스주입홀(130)을 통하여 사용자는 상기 실린더(300) 내부의 환경을 조절할 수 있다. 즉, 가스주입홀(130)을 통하여 분위기가스를 실린더(300) 내부로 주입함으로써, 액상매질 및/또는 액상매질에 접하는 기체상 매질의 환경을 사용자가 용이하게 조절할 수 있다.

한편, 상기 덮개(100)에는 상기 실린더(300)의 상측의 일단이 안착될 수 있는 덮개단턱(150), 및 외주면에 오링이 결합될 수 있는 덮개오링홈(140)이 형성되어 있다.

상기 덮개단턱(150)의 하면은 상기 실린더(300)의 상면과 접하게 되고, 이에 따라 실린더(300) 내부의 기밀성을 도모할 수 있다.

또한, 덮개오링홈(140)에는 덮개오링이 끼워지고, 덮개오링이 상기 실린더(300)의 내측면과 접촉하면서, 기밀성을 유지하는 형태로, 실린더(300) 내부 공간을 형성할 수 있다. 즉, 상기 덮개오링홈(140)에 오링이 결합된 상태에서 오링의 외주면과 상기 실린더(300)의 내부면이 접하는 형태로 상기 덮개(100)와 상기 실린더(300)가 결합된다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 반사부의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.

반사부는 외주면에 나사산이 형성된 반사판축(200); 및 상기 반사판축(200)의 일단에 결합된 반사판(210)을 포함한다. 사용자는 상기 덮개(100)를 관통하는 상기 반사판축(200)을 회전시킴으로써 반사판(210)의 위치를 변경할 수 있다.

바람직하게는, 상기 반사판(210)은 도 9에 도시된 바와 같이, 경사진 형태이고, 반사판축에는 나사산이 형태의 축나사결합부(201)이 형성되어 있다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 반사부의 외형을 개략적으로 도시하고, 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 반사부의 상면 및 측단면도를 개략적으로 도시한다.

도 10 및 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 반사판(210)이 복수로 형성될 수도 있다. 이는 매질을 부양 및 정렬함에 있어서 복수의 선 형태로 정렬하기 위함이다.

구체적으로 본 발명의 일 실시예에 따른 반사부는 반사판축(200), 및 반사판(210)을 포함하고, 상기 반사판(210)은 원형 디스크형태의 제1반사판(210); 및 상기 제1반사판(210)의 일면에 구비되는 복수의 제2반사판(210)을 포함할 수 있다.

이와 같은 형태에서, 사용자는 미세입자의 정렬형태를 변경하고자 한다면, 장치 전체를 바꾸는 것이 아니라, 간단히 반사부의 형태를 변경하면서 동시에 반사판축(200)의 높이를 조절하는 것으로 간단하게 수행할 수 있다.

도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 실린더(300)의 측단면도들을 개략적으로 도시한다.

도 12에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 실린더(300)는, 상측에 형성되고 상측에서 하측으로 갈수록 내경이 줄어드는 상측관통홀(310); 하측에서 형성되고 하측에서 상측으로 갈수록 내경이 증가하는 하측관통홀(320); 및 상기 상측관통홀(310) 및 상기 하측관통홀(320)에 양단부가 연결된 유로(330);를 포함한다.

상기 상측관통홀(310) 및 하측관통홀(320)의 내주면은 각각 상부케이스(500)에 구비되는 케이스오링(540) 및 덮개(100)에 구비되는 덮개오링과 접촉하여 내부 공간을 밀폐할 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 정렬형태에 있어서 보다 일정한 공간에 미세입자를 부양시키기 위하여, 상측관통홀(310), 하측관통홀(320) 및 유로(330)를 이용하여 미세입자를 가이딩하여 부양시킬 수 있다.

또한, 더욱 바람직하게는 상기 유로(330)는 복수개로 구비됨으로써, 하나의 응집체 생산장치에서 복수의 입자군에서의 실험 및 공정을 수행할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

2. 스패로이드 생산장치를 이용한 스패로이드 생산방법

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 정상파에 의하여 입자가 정렬되는 상태를 설명하는 도면이다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 응집체 생성장치를 이용하여 액상매질에 부유하는 나노 혹은 마이크로 크기의 세포를 배양하면서 정상파를 이용하여 스패로이드를 생산할 수 있다. 구체적으로, 응집체 생산장치를 이용하여 액상매질에서 세포를 배양하여 응집체를 생산하는 방법으로서, 상기 응집체 생산장치는 내부에 나사산이 구비된 축결합관통홀이 형성되어 있는 덮개; 상기 축결합관통홀에 결합될 수 있고, 외주면에 나사산이 구비된 반사판축, 및 상기 반사판축의 일단에 결합된 반사판; 상측 및 하측이 개방되고 내부에 관통홀이 형성된 실린더; 상기 실린더의 하측에 결합될 수 있는 실린더결합부가 상면에 형성되어 있고, 관통홀형태의 상부진동자수용부이 형성된 상부케이스; 상기 상부케이스의 하측에 결합될 수 있고, 상면에 홈형태의 하부진동자수용홈이 형성된 중앙케이스; 및 상기 상부진동자수용부 및 상기 하부진동자수용홈에 의한 공간에 수용되는 진동자;를 포함할 수 있다.

상기 진동자의 동작에 의하여 액상매질 내부에 도 13에 도시된 바와 같이 정상파(w)가 생성되게 되면, 액상매질에는 정상파(w)의 에너지가 전달되어 유체 내부에 유동이 발생한다. 이후, 정상파(w)에 의한 압력장이 형성되고, 이러한 압력장은 유체 내에 섞여 있는 미세한 입자 혹은 세포(c)를 움직일 수 있게 된다. 이와 같이, 정상파(w)가 발생한 상태에서는 유체 내의 미세한 입자 혹은 세포(c) 정상파(w)의 마디 부근으로 움직이게 된다. 이와 같은 원리를 이용하게 되면 도 13에 도시된 바와 같이 액체매질 내의 미세 입자 혹은 세포를 필요에 따라 정렬 혹은 부양 시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 줄기세포이고, 상기 응집체 생산장치 내부에서 액상매질 중에 정상파를 발생시키고, 상기 정상파의 마디에서 응집체를 생성하여 배양시킨다.

도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 현미경 사진을 나타내는 도면이다.

도 14는 2차원 배양방법(2D culture), Hanging drop 방법, 및 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 응집체를 생산하는 방법(Anti gravity)을 이용하여 생산된 스패로이드의 현미경 사진을 각각 도시하고 있다.

각각의 배양법에 따른 세포 농도 조건은 다음과 같다.

- 2D culture: 1 * 10 ^ 6 cells/ 20ml

- Hanging drop: 2.5 * 10^4 cells/ 35ul * 40개

- Anti gravity: 1 * 10 ^ 6 cells/ l1.4ml

구체적으로, 도 14의 (a)는 2D culture, Hanging Drop 방법, 본 발명의 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 이용하여 hMSC(human Mesenchymal Stem Cell, 인간 중간엽 줄기 세포)를 12시간 배양한 후 확보한 고배율, 저배율의 현미경 사진을 나타낸다.

도 14의 (a)에 도시된 바와 같이 12시간 배양 시 Hanging Drop 방법을 사용한 스패로이드에 비해 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드가 높은 밀도로 형성됨을 확인하였다.

도 14의 (b)는 2D culture, Hanging Drop 방법, 본 발명의 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 이용하여 hMSC(human Mesenchymal Stem Cell, 인간 중간엽 줄기 세포)를 24시간 배양한 후 확보한 고배율, 저배율의 현미경 사진을 나타낸다.

도 14의 (b)에 도시된 바와 같이 24시간 배양 시 Hanging Drop 방법을 사용한 스패로이드에 비해 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드의 크기가 전반적으로 작음을 확인하였다.

한편, 도 14의 (c)는 Hanging Drop 방법 및 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 이용하여 생산한 스패로이드의 SEM(Scanning Electron Microscope, 주사전자현미경)이미지를 나타내는 도면이다.

도 14의 (c)에 도시된 바와 같이, 줄기세포를 12시간 배양 시 Hanging Drop 방법을 통해 생성한 스패로이드에 비해 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드에서의 세포 밀도가 높음을 확인하였다.

이와 같은 결과는, 줄기세포의 12시간 및 24시간 배양비교를 통해 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드가 종래의 Hanging Drop방법을 통해 생성한 스패로이드 보다 스패로이드의 형성시간이 빠르고 크기가 작으며 세포 밀도가 높은 스패로이드를 형성할 수 있다는 것을 시사한다.

도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 배양 시간별 크기를 분석한 도면이다.

도 15는 Hanging Drop 방법을 통해 생산한 스패로이드 및 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생산한 스패로이드의 시간별 스패로이드의 크기 및 밀도를 비교한 그래프를 나타낸다. 도 15에 도시된 바와 같이 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생산한 스패로이드의 크기가 Hanging Drop 방법을 통해 생산한 스패로이드의 크기보다 작게 형성됨을 확인하였다.

이는, 생성된 스패로이드의 사이즈 및 개수는 세포배양에 걸리는 시간보다 배양하는 방식의 영향을 많이 받음을 시사하고, 사이즈가 더 작은 스패로이드를 생성할 수 있는 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하면 동일한 세포 개수를 이용하여 세포 배양 시 약 4배의 스패로이드를 생성할 수 있는 효과를 발휘할 수 있다.

도 16은 본 발명의 일 실시예에 시간에 따른 세포 응집 및 광학사진을 개략적으로 도시한다.

도 16은 Hanging Drop 방법을 통해 생산한 스패로이드 및 본 발명의 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 적용하여 TCP(Tissue culture plate)에서 12시간 배양 후, 스패로이드 크기를 비교한 것을 도시한다. 도 16에 도시된 바에 따르면, Hanging Drop 방법을 통해 형성한 스패로이드들은 12시간 동안 약 60%의 크기로 수축(shrinking)이 일어났음을 확인할 수 있고, 본 발명의 응집제 생산방법 에서는, 12시간 동안 크기의 큰 변화 없이 유지됨을 확인하였다.

도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 dead signal을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

도 17의 (a)에 도시된 바에 따르면, 2D culture, Hanging Drop 방법, 본 발명의 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 이용하여 생성한 스패로이드 모두에서 live signal인 초록색만을 확인할 수 있으며, dead signal인 붉은색은 확인할 수 없다.

도 17의 (b)에 도시된 바에 따르면, 2D culture, Hanging Drop 방법, 본 발명의 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 이용하여 생성한 스패로이드 모두에서 DAPI signal인 푸른색만을 확인할 수 있으며, dead signal인 붉은색은 확인할 수 없다.

도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 qRT-PCR을 통한 VEGF 유전자를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

구체적으로, 도 18은 2D culture, Hanging Drop 방법, 본 발명의 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 이용하여 생산된 스패로이드의 qRT-PCR (Real-time polymerase chain reaction, 실시간 중합효소연쇄반응)을 통한 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor, 혈관내피성장인자) 유전자를 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 도 18에 도시된 바와 같이 본 발명의 응집체 생산방법을 이용하여 생성한 스패로이드에서 혈관생성에 영향을 주는 VEGF유전자가 다른 군들에 비해 유의미하게 많이 발현됨을 확인하였다.

도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 qRT-PCR을 통한 PCNA 유전자를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.

구체적으로, 도 19는 2D culture, Hanging Drop 방법, 본 발명의 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 이용하여 생산된 스패로이드의 qRT-PCR (Real-time polymerase chain reaction, 실시간 중합효소연쇄반응)을 통한 PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) 유전자를 확인한 결과를 나타내는 도면이다. 도 19에 도시된 바와 같이 본 발명의 응집체 생산방법을 이용하여 생성한 스패로이드에서 세포 증식에 영향을 주는 PCNA 유전자가 다른 군들에 비해 유의미하게 많이 발현됨을 확인하였다.

도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 BCA assay를 통한 단백질 정량 비교한 결과를 나타내는 도면이다.

구체적으로, 도 20은 2D culture, Hanging Drop 방법, 본 발명의 응집체 생산장치를 이용한 응집체 생산방법을 이용하여 생산된 스패로이드의 단백질 정량을 통한 세포 증식에 대해 비교한 결과를 도시한다. 도 20에 도시된 바와 같이 본 발명의 응집체 생산방법을 통해 생산한 스패로이드는 세포 증식으로 인해 다른 군에 비해 유의미하게 단백질 양이 많이 발현됨을 확인하였다.

도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 하지허혈 질환 치료 동물실험을 통한 군별 치료 효과를 나타내는 도면이다.

구체적으로, 도 21의 (a)는 하지허혈 질환 치료 동물실험을 통한 군별 대표사진을 나타내는 도면이고, 도 21의 (b) 및 도 21의 (c)는 하지허혈 질환 치료 동물실험을 통한 군별 치료 효과를 나타내는 도면이다.

구체적으로, 도 21의 (b) 및 도 21의 (c)는 하지허혈 질환 모델의 질환 부위에 군별로 수득한 1 * 10⁶ cells을 injection한 후 28일이 지난 후의 치료효과를 확인한 결과를 나타낸다. 도 21의 (b) 및 도 21의 (c)에 도시된 바와 같이 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생산한 스패로이드가 다른 군들에 비해서 치료 효과가 좋은 것이 확인되었다.

도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 응집체 생산장치를 이용하여 생산된 스패로이드의 qRT-PCR을 통한 CD31 유전자 정량을 비교한 결과를 나타내는 도면이다.

도 22의 (a)는 동물실험을 통한 28일간의 치료 기간을 거친 후, 하지 샘플을 수득하여 qRT-PCR을 통한 CD31유전자를 정량 비교한 결과를 나타낸다. 본 발명의 응집체 생산방법를 이용하여 생산한 스패로이드가 다른 군과의 비교에서 신체에서 허혈성 질환 부위에 혈관신생을 증진시키고, 이에 따른 혈류량 유입 증가를 유도하는데 중요한 역할을 하는 CD31유전자가 유의미하게 많이 발현됨을 확인하였다.

도 22의 (b)는 동물실험을 통한 28일간의 치료 기간을 거친 후, 하지 샘플을 수득하여 면역 염색을 통한 CD31 단백질을 정성적으로 비교한 결과를 나타낸다. 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생산한 스패로이드가 Normal 군처럼 초록색으로 발현되는 CD31 단백질이 많이 발현됨을 확인하였다. 다른 군들도 CD31 단백질이 발현되긴 하였으나 발현 정도가 상대적으로 낮음이 확인된다.

도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물실험 후 qRT-PCR을 통한 SM-alpha 유전자 정량을 비교한 도면이다.

도 23의 (a)는 동물실험을 통한 28일간의 치료 기간을 거친 후, 하지 샘플을 수득하여, 동물실험을 통한 28일간의 치료 기간을 거친 후, 하지 샘플을 수득하여 면역 염색을 통한 평활근의 수축에 관여하는 액틴 단백질인 SM-alpha 단백질이 많이 발현됨을 확인하였다.

도 23의 (b)는 동물실험을 통한 28일간의 치료 기간을 거친 후, 하지 샘플을 수득하여 면역 염색을 통한 SM-alpha 단백질을 정성적으로 비교한 결과를 나타낸다. 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생산한 스패로이드가 Normal 군처럼 초록색으로 발현되는 SM-alpha 단백질이 많이 발현됨을 확인하였다. 다른 군들도 SM-alpha 단백질이 발현되긴 하였으나 발현 정도가 상대적으로 낮음이 확인된다.

도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물실험 후 H&E staining을 통한 하지 조직을 확인한 도면이다.

구체적으로, 도 24의 (a)는 동물실험을 통한 28일 간의 치료 기간을 거친 후, 하지 조직 샘플을 수득하여 H&E staining을 통해 하지 조직에서의 조직 상태를 확인한 도면을 나타낸다. Hematoxylin은 보라색을 띄며 핵에 염색되고, Eosin은 분홍색을 띄며 세포질에 염색된다. 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드 군에서 Normal 군과 가은 분홍색의 정상조직이 발견되었으며 다른 군들에서는 보라색을 띄는 염증들이 다수 발견되었다.

도 24의 (b)는 동물실험을 통한 28일 간의 치료 기간을 거친 후, 하지 조직 샘플을 수득하여 Masson's trichrome staining을 하지 조직에서의 조직 상태를 확인한 도면을 나타낸다. 콜라겐 섬유는 푸른색을, 세포질 및 근육은 붉은색을 핵은 검은색을 나타낸다. 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드 군에서 Normal 군과 같은 분홍색 혹은 붉은색의 정상조직이 발견되었으며 다른 군들에서는, 푸른색을 띄는 fibrosis들이 발견되었다.

도 24의 (c)는 동물실험을 통한 28일 간의 치료 기간을 거친 후, 하지 조직 샘플을 수득하여 Sirius red staining을 통해 하지 조직에서의 조직상태를 확인한 도면을 나타낸다. 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드 군에서 Normal 군과 같은 정상 조직이 발견되었으며 다른 군들에서는 fibrosis들이 발견되었다.

이와 같은 결과는, 본 발명의 응집체 생산장치를 이용하여 생성한 스패로이드가 하지허혈 질환에 보다 효과적인 것을 시사한다.

이상과 같이 실시 예들이 비록 한정된 실시 예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등 물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims (8)

1. 액상매질에서의 응집체 생산장치로서,
   내부에 나사산이 구비된 축결합관통홀이 형성되어 있는 덮개;
   상기 축결합관통홀에 결합될 수 있고, 외주면에 나사산이 구비된 반사판축, 및 상기 반사판축의 일단에 결합된 반사판;
   상측 및 하측이 개방되고 내부에 관통홀이 형성된 실린더;
   상기 실린더의 하측에 결합될 수 있는 실린더결합부가 상면에 형성되어 있고, 관통홀형태의 상부진동자수용부가 형성된 상부케이스;
   상기 상부케이스의 하측에 결합될 수 있고, 상면에 홈형태의 하부진동자수용홈이 형성된 중앙케이스; 및
   상기 상부진동자수용부 및 상기 하부진동자수용홈에 의한 공간에 수용되는 진동자;를 포함하는, 액상매질에서의 응집체 생산장치.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 상부케이스의 실린더결합부의 외주면에는 오링이 결합될 수 있는 케이스오링홈이 형성되어 있고,
   상기 케이스오링홈에 오링이 결합된 상태에서 오링의 외주면과 상기 실린더의 내부면이 접하는 형태로 상기 실린더결합부와 상기 실린더가 결합되는, 액상매질에서의 응집체 생산장치.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 실린더결합부는 상측에서 하측으로 갈수록 내경이 좁아지는 원통형이고,
   상기 상부케이스는 관통홀이 형성된 판상형 부재에 상기 실린더결합부가 상측에 결합된 형태인, 액상매질에서의 응집체 생산장치.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 중앙케이스의 내부에는 냉각수유로가 형성되어 있고,
   상기 중앙케이스의 상면에는 상기 하부진동자수용홈에서 연장되어 홈형태의 배선홈이 형성되어 있는, 액상매질에서의 응집체 생산장치.
   
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 반사판축의 일단을 사용자가 회전 조작하는 경우, 상기 반사판축은 상기 축결합관통홀에서 상하 및 회전 이동할 수 있고, 이에 따라 상기 반사판의 위치가 변경될 수 있는, 액상매질에서의 응집체 생산장치.
   
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 덮개에는 관통홀 형태의 가스주입홀, 상기 실린더의 상측의 일단이 안착될 수 있는 덮개단턱, 및 외주면에 오링이 결합될 수 있는 덮개오링홈이 더 형성되어 있고,
   상기 덮개오링홈에 오링이 결합된 상태에서 오링의 외주면과 상기 실린더의 내부면이 접하는 형태로 상기 덮개와 상기 실린더가 결합되는, 액상매질에서의 응집체 생산장치.
   
7. 응집체 생산장치를 이용하여 액상매질에서 세포를 배양하여 응집체를 생산하는 방법으로서,
   상기 응집체 생산장치는
   내부에 나사산이 구비된 축결합관통홀이 형성되어 있는 덮개;
   상기 축결합관통홀에 결합될 수 있고, 외주면에 나사산이 구비된 반사판축, 및 상기 반사판축의 일단에 결합된 반사판;
   상측 및 하측이 개방되고 내부에 관통홀이 형성된 실린더;
   상기 실린더의 하측에 결합될 수 있는 실린더결합부가 상면에 형성되어 있고, 관통홀형태의 상부진동자수용부이 형성된 상부케이스;
   상기 상부케이스의 하측에 결합될 수 있고, 상면에 홈형태의 하부진동자수용홈이 형성된 중앙케이스; 및
   상기 상부진동자수용부 및 상기 하부진동자수용홈에 의한 공간에 수용되는 진동자;를 포함하는, 응집체를 생산하는 방법.
   
8. 청구항 7에 있어서,
   상기 세포는 줄기세포이고,
   상기 응집체 생산장치 내부에서 액상매질 중에 정상파를 발생시키고, 상기 정상파의 마디에서 응집체를 생성하여 배양시키는, 응집체를 생산하는 방법.
   
   

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