KR20210153037A - 전립선 특이 막 항원 결합 이중 모드 방사선 추적자 및 치료법 - Google Patents
전립선 특이 막 항원 결합 이중 모드 방사선 추적자 및 치료법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 선택적으로 킬레이트화 방사성 양이온을 포함하고, F는 선택적으로 18F인 화학식 (V)에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
Description
본 발명은 킬레이트화(chelated) 방사성 양이온을 포함하거나, F가 선택적으로 18F인 다음 화학식 (V)에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 합성 동안에 라세미화(racemization)를 방지하는 상기 화합물을 합성하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서, 특허 출원들과 제조업자의 설명서들을 포함하는 많은 문헌들이 언급된다. 본 발명의 특허성과 관련되는 것으로는 간주되지 않는 이들 문헌들의 개시 사항들은 여기에 전체적으로 참조로 포함된다. 보다 상세하게는, 모든 참조된 문헌들은 각각의 개별적인 문헌이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타내는 바와 같은 정도로 참조로 포함된다.
전립선암
전립선암(PCa)은 수십 년에 걸쳐 생존율에 비해 높은 발병률을 가지는 남성들에게서 가장 통상적인 악성 질병으로 남아 있다. 전립선암 내에서의 과발현으로 인하여, 전립선 특이 막 항원(prostate-specific membrane antigen)(PSMA) 또는 글루타메이트 카르복시펩티다아제(glutamate carboxypeptidase II)(GCP II)가 내부 방사선 요법 및 PCa의 영상화를 위한 매우 민감한 방사성 표지제들의 개발을 위해 우수한 표적으로 그 적격성이 입증되었다. 전립선 특이 막 항원은 촉매 중심에 주가교 하이드로옥시도 리간드(hydroxido ligand)를 갖는 두 개의 아연(II) 이온들을 포함하는 세포 외 가수분해 효소이다. 이는 전이성 및 호르몬 불응성 전립선 암종들 내에서 크게 상향 조절되지만, 그 생리적 발현은 신장, 침샘, 소장, 뇌와 건강한 전립선 조직 내에서도 낮은 정도까지 보고되었다. 장 내에서, PSMA는 페트로일글루타메이트(pteroylglutamate)(엽산)로의 페트로일폴리(pteroylpoly)-γ-글루타메이트(glutamate)의 전환에 의해 엽산의 흡수를 가능하게 한다. 뇌 속에서, 이는 N-아세틸(acetyl)-라스파르틸(laspartyl)-L-글루타메이트(glutamate)(NAAG)를 N-아세틸(acetyl)-L-아스파르테이트(aspartate) 및 글루타메이트로 가수 분해한다.
전립선 특이 막 항원(PSMA)
전립선 특이 막 항원(PSMA)은 전립선암 상피 세포들 상에서 크게 과발현되는 II형 막횡단 당단백질이다. 그 명칭에도 불구하고, PSMA는 또한 폭넓게 다양한 비전립선암들의 신생 혈관들 내에서 변화되는 정도로 발현된다. PSMA 발현을 나타내는 가장 통상적인 비전립선암들은 유방, 폐, 결장 및 신장 세포 암종을 포함한다.
PSMA를 표적으로 하는 분자들의 일반적으로 필수적인 구조들은 P1' 글루타메이트 모이어티(moiety)에 연결되는 아연 결합 기(요소(urea), 포스폰산(phosphinate) 또는 포스포르아미데이트(phosphoramidate)와 같은)를 포괄하는 결합 단위를 포함하며, 이는 PSMA에 대한 높은 친화도와 특이성을 보장하고, 통상적으로 다른 효과기(effector) 기능에 더 연결된다. 상기 효과기 부분은 보다 유연하며, 구조적 변형들을 향해 어느 정도까지는 견딘다. 입구 깔때기는 리간드 결합을 위해 중요한 두 가지 다른 구조적 특징들을 수용한다. 첫 번째 것은 상기 입구 깔때기의 벽에서의 양성으로 대전된 영역 및 PSMA의 P1 위치에서의 음성으로 대전된 기능성들의 선호에 대한 메커니즘적 설명인 아르기닌 패치이다. 이는 리간드-골격 내의 음성으로 대전된 잔기들의 선호적인 포함에 대한 원인인 것으로 나타난다. PSMA 리간드들 상의 양성 전하들의 효과에 대한 면밀한 분석은 현재의 지식으로는 지금까지 수행되지 못하고 있다. 결합에 따라, 아르기닌 측쇄들의 협동적인 재배치는 S1 소수성 부속 포켓의 개방인 몇몇 요소계 억제제(inhibitor)들의 요오드-벤질기를 수용하는 것으로 나타났던 두 번째의 중요한 구조를 가져올 수 있으며, 이에 따라 PSMA에 대한 이들의 높은 친화성에 기여한다.
Zhang 등은 PSMA의 원격 결합 부위를 발견하였으며, 이는 이좌 결합 모드(bidentate binding mode)에 대해 채용될 수 있다(Zhang 등의 "Journal of the American Chemical Society"(132, 12711-12716, 2010)). 이른바 아렌(arene)-결합 부위는 Arg463, Arg511 및 Trp541의 측쇄들에 의해 성형되는 간단한 구조적 주제이며, GCPII 입구 뚜껑의 일부이다. 말단 억제제 모이어티에 의한 상기 아렌-결합 부위의 진입은 결합 효과들로 인해 PSMA에 대한 억제제 친화성의 실질적인 증가를 가져올 수 있다. PSMA I&T는 비록 결합 모드의 결적 구조 분석이 이용가능 하지는 않지는 이러한 방식으로 PSMA와 상호작용하는 의도로 개발되었다. Zhang 등에 따른 필연적인 특징은 링커(linker) 단위(PSMA I&T의 경우에는 수베린산(suberic acid))이며, 이는 GCPII의 입구 뚜껑의 개방 형태를 가능하게 하고, 이에 따라 상기 아렌-결합 부위의 접근성을 가능하게 한다. 또한, 상기 링커의 구조적 조성이 종양 표적화 및 생물학적 활성에 대해서뿐만 아니라 높은 영상화 품질 및 효과적인 표적 내부 방사선 요법 모두에 대해 매우 중요한 성질들인 영상화 대조 및 약동학에 대해 상당한 영향을 가지는 것으로 나타났다(Liu 등의 "Bioorganic & medicinal chemistry letters"(21, 7013-7016, 2011)).
두 가지 카테고리들의 PSMA 표적화 억제제들이 현재 임상 환경들에서 사용되고 있다. 한편으로는, PSMA I&T와 같은 방사성 핵종 복합화(radionuclide complexation)를 위한 킬레이트 단위들을 가지는 추적자(tracer)들 또는 연관 화합물들이 존재한다. 다른 한편으로는, 표적화 단위 및 효과기 분자들을 포함하는 소분자들이 존재한다.
선택적인 PSMA 영상화를 위해 가능 흔히 사용되는 제제들은 PSMA HBED-CC, PSMA-617 및 PSMA I&T이며, 이들은 대부분 68Ga(88.9% β+, Eβ+, max＝1.89MeV, t½＝68분)로 표지된다. 이들 중에서 68Ga-PSMA-HBED-CC(68Ga-PSMA-11로도 알려짐)이 현재까지 PCa의 PET 영상화를 위한 절대 표준으로 간주되고 있다.
18
F 표지
근래 들어, 몇몇 그룹들은 PCa 진단을 위해 새로운 18F-표지 요소계 억제제들에 중점을 두어 왔다. 상업적으로 분포된 68Ge/68Ga 방사성 핵종 발생기들(68Ge; t½＝270.8d)로부터 얻어질 수 있는 방사성 금속 68Ga에 비하여, 방사성 동위 원소 18F-불소(96.7%의 β+, Eβ+,max＝634keV)는 이의 생산을 위해 현장에서의 사이클로트론(cyclotron)을 요구한다. 이러한 한계에도 불구하고, 18F는 그 보다 긴 반감기(t½＝109.8분) 및 보다 낮은 양전자 에너지로 인하여 통상적인 취급과 영상 품질의 측면들에서 상당한 이점들을 제공한다. 또한, 사이클로트론 내에서의 대규모 생산의 가능성이 존재하며, 이는 보다 큰 환자 처리량 및 생산 비용의 감소를 위해 유익할 수 있다. 상기 18F-표지 요소계의 PSMA 억제제인 18F-DCFPyl은 원발 및 전이성 PCa의 검출(Rowe 등의 "Molecular Imaging and Biology"(1-9, 2016))과 비교 연구에서 68Ga-PSMA-HBED-CC에 대한 우수성(Dietlein 등의 "Molecular Imaging and Biology"(17, 575-584, 2015))의 유망한 결과를 입증하였다. PSMA-617의 구조에 기초하여, 18F-표지 유사체(analogue) PSMA-1007이 최근에 개발되었으며, 상당한 종양 대 기관 비율들을 나타내었다(Cardinale 등의 "Journal of nuclear medicine: official publication, Society of Nuclear Medicine"(58, 425-431, 2017); Giesel 등의 "European journal of nuclear medicine and molecular imaging"(43, 1929-1930, 2016)). 68Ga-PSMA-HBED-CC로의 비교 연구는 두 추적자들의 유사한 진단 정확도 및 18F-PSMA-1007의 감소된 오줌 청소를 나타내었고, 전립선의 보다 우수한 평가를 가능하게 하였다(Giesel 등의 "European journal of nuclear medicine and molecular imaging"(44, 678-688, 2017)).
18F 표지들을 도입하기 위한 매력적인 접근 방식은 실리콘-불소 수용체(silicon-fluoride acceptor: SIFA)들의 사용이다. 실리콘-불소 수용체들은, 예를 들면, Lindner 등의 "Bioconjugate Chemistry"(25, 738-749, 2014)에 기재되어 있다. 실리콘-불소 결합을 보존하기 위해, 실리콘-불소 수용체들의 사용은 실리콘 원자 주위에 입체 구조적으로 요구되는 기들의 필요성을 도입한다. 이는 결국 실리콘-불소 수용체들을 매우 소수성이 되게 한다. 표적 분자들에 대한, 특히 PSMA의 표적 분자에 대한 결합의 측면에서, 상기 실리콘-불소 수용체에 의해 제공되는 소수성 모이어티가 Zhang 등의 "Journal of the American Chemical Society"(132, 12711-12716, 2010)에 기재되어 있는 바와 같이 소수성 포켓을 가지는 방사선-진단 또는 치료 화합물의 상호 작용들을 구현하는 목적을 위해 활용될 수 있다. 아직까지 결합 이전에, 분자들들 내로 도입되는 보다 높은 정도의 친유성은 적합한 생체 내 생물 분포(biodistribution)를 가지는 방사성 약물(radiopharmaceutical)들의 개발에 대하여 심각한 문제점, 즉 표적으로 하지 않는 조직 내의 낮은 비특이적 결합을 제기한다.
소수성 문제에 대한 해결의 실패
많은 시도들에도 불구하고, 상기 실리콘-불소 수용체들에 의해 야기되는 소수성 문제는 종래 기술 분야에서 만족스럽게 해결되지 못하고 있다.
보다 상세하게 설명하면, Schirrmacher E. 등("Bioconjugate Chem. V"(2007, 18, 2085-2089))은 실리콘-불소 수용체의 하나의 예인 매우 효과적인 표지 신톤(synthon)인 p-(디(di)-삼차 부틸플루오로실릴(tert-butylfluorosilyl))벤즈알데히드(benzaldehyde)([18F]SIFA-A)를 이용하여 상이한 18F-표지 펩티드들을 합성하였다. 상기 SIFA 기술은 예기치 않게 효과적인 동위 원소 19F-18F 교환을 가져왔으며, HPLC 정제를 적용하지 않고 225 내지 680GBq/μmol(6081-18 378Ci/mmol)의 높은 특이적 활성들로 거의 정량적인 수율로 18F-신톤을 산출하였다. [18F]SIFA-벤즈알데히드가 최종적으로 높은 방사 화학적 수율들로 상기 N-말단 아미노-옥시(N-AO) 유도체화 펩티드들인 AO-Tyr3-옥테오테이트(octreotate)(AO-TATE), 사이클로(cyclo)(fK(AO-N)RGD) 및 N-AO-PEG2-[D-Tyr-Gln-Trp-Ala-Val-Ala-His-Thi-Nle-NH2](AO-BZH3, 봄베신 유도체)를 표지하는 데 이용되었다. 그럼에도 불구하고, 상기 표지 펩티드들은 매우 친유성(이러한 논문에 기재된 조건들을 이용하여 HPLC 정체 시간들로부터 얻어질 수 있는 바와 같은)이며, 이에 따라 동물 모델들이나 인간들에서 다른 평가를 위해서는 적합하지 않을 수 있다.
Wangler C. 등("Bioconjugate Chem."(2009, 20(2), pp 317-321)에서, 단백질(랫(rat) 혈청 알부민(RSA))의 첫 번째 SIFA계 키트 유사 방사선-플루오르화가 기재되어있다. 표지제(labelling agent)로서, 4-(디(di)-삼차 부틸(tert-butyl)[18F]플루오로실릴(fluorosilyl))벤젠티올(benzenethiol)(Si[18F]FA-SH)이 간단한 동위 원소 교환에 의해 40%-60%의 방사 화학적 수율(RCY)로 생산되었고, 생성물을 20분-30분 내에 12%의 전체적인 RCY로 말레이미드(maleimide) 유도체화 혈청 알부민에 직접 결합시켰다. 기술적으로 간단한 표지 절차에 어떠한 정교한 정제 절차들이 요구되지 않으며, PET로의 생체 내 영상화를 위한 Si-18F 화학의 성공적인 응용의 간단한 예이다. 마우스들의 시간-활성도 곡선들 및 μPET 영상들은 대부분의 활성이 간 내에 국소화되는 것을 보여주었고, 이에 따라 상기 표지제가 너무 친유성이며, 생체 내 프로브를 간담즙 분비 및 과도한 간 대사 작용으로 지향시키는 것을 입증하였다.
Wangler C. 등("Bioconjug Chem."(2010, Dec. 15; 21(12): 2289-96) 참조)은 후속하여 새로운 SIFA-옥테오테이트 유사체들(SIFA-Tyr3-옥테오테이트, SIFA-Asn(AcNH-β-Glc)-Tyr3-옥테오테이트 및 SIFA-Asn(AcNH-β-Glc)-PEG-Tyr3-옥테오테이트)을 합성하고 평가하여 SIFA 기술의 주요한 결점인 결과적인 방사성 약물들의 높은 친유성을 극복하기 위해 노력하였다. 이들 화합물들에서, 친수성 링커들 및 약동학적 조절제(modifier)들이 펩티드와 SIFA-모이어티 사이, 즉, 탄수화물 및 PEG 링커에 더하여 탄수화물 사이에 도입되었다. 결합체(conjugate)들의 친유성의 측정으로서, 상기 로그 P(ow)가 결정되었고, SIFA-Asn(AcNH-β-Glc)-PEG-Tyr3-옥테오테이트에 대해 0.96 및 1.23 SIFA-Asn(AcNH-β-Glc)-Tyr3-옥테오테이트에 대해 1.23인 것으로 발견되었다. 이들 결과들은 상기 SIFA 모이어티의 높은 친유성이 친수성 모이어티들을 적용하여 미미하게만 보상될 수 있는 점을 보여준다. 첫 번째 영상화 연구는 과도한 간 청소/간 흡수를 나타내었고, 이에 따라 첫 번째 인간 연구로는 결코 이전되지 못하였다.
Bernard-Gauthier 등("Biomed Res Int."(2014; 2014: 454503))은 문헌에서 작은 보결 분자단(prosthetri group)들 및 낮은 분자량의 다른 화합물들로부터 표지된 펩티드들 및 가장 최근의 어피바디(affibody) 분자들까지의 범위로 보고되었던 매우 과다한 상이한 SIFA 종들을 검토하였다. 이들 데이터에 기초하여도, SIFA계 보결 분자단들의 친유성의 문제는 지금까지 해결되지 않고 있다. 즉, SIFA 결합 펩티드의 전체적인 친유성을 대략 -2.0 보다 낮은 로그 D까지 감소시키는 방법론은 설명되지 않고 있다.
Lindner S. 등("Bioconjug Chem."(2014, Apr. 16; 25(4): 738-49)에, 특이적 GRP 수용체 리간드들로서 폴리에틸렌글리콜 활성화 봄베신(PEGylated bombesin)(PESIN) 유도체들 및 특이적 avβ3 결합제들로서 RGD(아르기닌-글리신-아스파르트산에 대한 1글자 코드) 펩티드들이 합성되었고, 실리콘-불소 수용체(SIFA) 모이어티로 표지되었던 것이 기재되어 있다. 상기 SIFA 모이어티의 높은 친유성을 보상하기 위해, 다음의 다양한 친수성 구조 변형들이 도입되었고, 감소된 로그 D 값들을 야기하였다. SIFA-Asn(AcNH-β-Glc)-PESIN, SIFA-Ser(β-Lac)-PESIN, SIFA-Cya-PESIN, SIFA-LysMe3-PESIN, SIFA-γ-카르복시(carboxy)-d-Glu-PESIN, SIFA-Cya2-PESIN, SIFA-LysMe3-γ-카르복시-d-Glu-PESIN, SIFA-(γ-카르복시-d-Glu)2-PESIN, SIFA-RGD, SIFA-γ-카르복시-d-Glu-RGD, SIFA-(γ-카르복시-d-Glu)2-RGD 및 SIFA-LysMe3-γ-카르복시-d-Glu-RGD. 이들 펩티드들 모두-친유성을 감소시키기 위한 목적으로 이미 개량되었고 유도됨-는 +2 내지 -1.22 사이의 범위 내의 로그 D 값을 나타내었다.
Niedermoser S. 등("J Nucl Med."(2015, Jul; 56(7): 1100-5)에서, 새로이 개발된 18F-SIFA- 및 18F-SIFAlin-(SIFA＝실리콘-불소 수용체) 변형 TATE 유도체들이 소마토스타틴(somatostatin) 수용체를 지니는 종양들의 고품질의 영상화를 위해 현재의 임상적으로 절대 표준인 68Ga-DOTATATE과 비교되었다. 이러한 목적을 위해, 18F-SIFA-TATE 및 두 가지의 상당한 복합 유사체들인 18F-SIFA-Glc-PEG1-TATE와 18F-SIFAlin-Glc-Asp2-PEG1-TATE가 개발되었다. 상기 제제들은 로그 D＜-1.5를 나타내지 않았다.
상술한 관점에서, 본 발명의 기초가 되는 기술적인 문제는 실리콘-불소 수용체(silicone-fluoride acceptor)를 함유하며, 동시에 바람직한 생체 내의 성질들에 의해 특징지어지는 방사선-진단 및 방사선-치료의 제공에서 알 수 있다.
다음에서 보다 분명하게 되는 바와 같이, 본 발명은 표적으로서 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen: PSMA)에 대해 높은 친화도로 결합하는 특이적 결합체(conjugate)들을 이용하는 원리 검증을 구현한다. 이에 따라, 본 발명의 기초가 되는 다른 기술적인 문제는 암, 바람직하게는 전립선암인 의학적 적응(indication)을 위한 개선된 방사선 치료법 및 진단법의 제공에서 알 수 있다.
국제 특허 출원 공개공보 PCT/EP2018/070533에는 PSMA 결합 화합물들의 속이 개시되어 있다. 앞서의 특허 출원으로부터 상기 화합물들의 유리한 하위 세트들이 여기에 개시된다. 본 출원은 국제 특허 출원 공개공보 PCT/EP2018/070533의 출원 시점에서의 발명자들에 의해서는 인식되지 않았던 유리한 특징들의 선택에 기초한다.
이들 기술적 문제들은 특허 청구 범위의 주제물에 의해 해결된다. 이에 따라, 일부 측면들에서, 본 발명은 킬레이트화(chelated) 방사성 양이온을 포함하거나, F가 선택적으로 18F인 화학식 (V)에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(salt)에 관한 것이다.
개시되는 화합물들은 염들의 형태가 될 수 있다. 또한, 본 발명은 화학식 (Va)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이며,
여기서, 각각의 X는 독립적으로 OH 또는 O-이고;
M은 킬레이트화 방사성 양이온이거나 존재하지 않으며;
F는 선택적으로 18F이다.
또한, 18F-불소에 의한 SIFA에 대한 킬레이트제(chelator) 및 동위 원소 교환의 이용의 결합은 현장의 사이클로트론을 구비하는 센터들 또는 사이클로트론 센터들로부터의 수송에 의해 18F-불소를 얻는 센터들에서 [18F][natIon] 추적자(tracer)들로 사용될 수 있는 "쌍의(paired)" 진단 추적자들을 야기하는 반면, 18F-불소에 접근하지는 못하지만 Ge-68/Ga-68 발생기와 같은 방사성 동위 원소 발생기들에 접근할 수 있는 센터들 내에서는 대응되는 버전들에 예를 들어 [natF][68Ga] 추적자들이 이용될 수 있다.
중요하게는, 두 경우들에서 화학적으로 동일한 방사성 약물(radiopharmaceutical)이 주입되며, 이에 따라 예상되는 생체 내 거동에서의 차이는 없다. 현재는 화학적 차이로 인하여, 현장에서 환자 코호트(cohort)에 의해 제공되는 18F-표지 화합물의 임상 데이터는 다른 현장에서 다른 그룹에 의해 제공되는 68Ga-유사체(analogue)의 임상 데이터와 직접적으로 비교될 수는 없는 반면, 본 발명에 따른 방사성 약물들 및/또는 진단법들은 직접적으로 비교될 수 있으며, 이에 따라 이러한 데이터를 연계하는(예를 들어, 유럽에 있는 센터에서의 F-18로의 작업으로부터의 데이터와 인도에 있는 다른 센터에서의 Ga-68로의 작업으로부터의 데이터) 것이 가능할 것이다.
또한, 적절하게 선택될 때, 킬레이트(chelate)도 베타선을 방출하는 동위 원소들 Lu-177, Y-90, 또는 알파선을 방출하는 동위 원소 Ac-225와 같은 치료 동위 원소로의 표지를 위해 이용될 수 있으며, 이에 따라 진단 ([18F][natLu] 추적자들) 및 치료 방사성 약물들([natF][177Lu])을 연결하는 "쌍의" 추적자들의 개념을 확장시킬 수 있다.
상기 화합물들, 특히 본 발명의 PSMA 표적화 화합물들의 다른 이점은 PSMA I&T와 같은 다른 PSMA 표적화 방사성 약물과 비교할 때에 마우스들의 신장들 내의 이들의 놀랍게도 낮은 축적이다. 특정 이론에 의해 제한받지 않고, 구조적 요소인 SIFA와 킬레이트제(chelator)의 결합이 신장 내에서의 예기치 않은 축적의 감소를 제공하는 것으로 여겨진다.
친유성/친수성의 측면에서, 상기 로그 P 값(때때로 로그 D 값으로도 지칭됨)은 근래에 이루어진 측정이다.
"친유성(lipophilicity)"이라는 용어는 지질 용액들 내에 용해되거나 흡수되거나, 지질 유사 표면 또는 기질에서 흡수되는 강도를 지칭한다. 이는 물과 비교될 경우에 지질들(분자적 의미)에 대한, 유기 혹은 무극성 지질들에 대한, 또는 작은 쌍극자 모멘트를 갖는 지질들, 용액들 혹은 표면들에 대한 선호를 나타낸다. "소수성(hydrophobicity)"이라는 용어는 여기서 균등한 의미로 사용된다. 친유성 및 소수성이라는 표현들은 상술한 치환기들에 대응되는 의미로 사용된다.
두 가지의 혼합되지 않거나 실질적으로 혼합되지 않는 용매들의 계면에서의 분자의 질량속(mass flux)은 그 친유성에 의해 지배된다. 분자가 친유성일수록, 친유성 유기 상내에 가용성이 된다. 물 및 n-옥탄올(octanol) 사이에서 관찰되는 분자의 분배 계수(partition coefficient)는 친유성의 표준 측정으로 채용된다. A 종의 분배 계수 P는 비율 P＝[A]n-octanol/[A]water로 정의된다. 공통적으로 보고되는 수치는 로그 P 값이며, 이는 상기 분배 계수의 로그이다. 이온화될 수 있는 분자의 경우, 복수의 구별되는 마이크로 종들(상기 분자의 이온화된 및 이온화되지 않은 형태들)이 원칙적으로 두 상들 내에 존재할 것이다. 이온화 가능한 종들의 전체적인 친유성을 설명하는 양은 비율 D＝[모든 마이크로 종들의 농도들]n-octanol/[모든 마이크로 종들의 농도들의 합계]water로 정의되는 바와 같은 분포 계수(distribution coefficient) D이다. 로그 P와 유사하게, 종종 상기 분산 계수의 로그인 로그 D가 보고된다. 흔히, 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)와 같은 완충액 시스템이 상술한 로그 P의 결정에서 물에 대한 대안으로 이용된다.
첫 번째 분자 상의 치환기의 친유성 특성이 평가되고 및/또는 정량적으로 결정될 경우, 상기 치환기에 대응되는 두 번째 분자가 평가될 수 있으며, 여기서 상기 두 번째 분자는, 예를 들면, 상기 치환기를 상기 첫 번째 분자의 나머지에 연결하거나, 얻어진 (상기)자유 원자가(들)를 연결하는 결합을 끊어 얻어지며, 이에 따라 수소(들)에 연결된다.
선택적으로는, 분자의 로그 P에 대한 치환기의 기여가 결정될 수 있다. 분자 R-X의 로그 P에 대한 치환기 X의 기여 πX X는 πX X＝log PR-X-log PR-H로 정의되며, 여기서 R-H는 치환되지 않은 모 화합물이다.
일보다 큰 P 및 D의 값들뿐만 아니라 영보다 큰 로그 P, 로그 D 및 πX X 값들은 친유성/소수성 특성을 나타내는 반면, 일보다 작은 P 및 D의 값들뿐만 아니라 영보다 작은 로그 P, 로그 D 및 πX X 값들은 각각의 분자들이나 치환기들의 친수성 특성을 나타낸다.
본 발명에 따라 전체 분자의 친유성 또는 친유성 기를 특징짓는 앞서 설명한 파라미터들은 실험적 수단들에 의해 결정될 수 있고 및/또는 해당 기술 분야에 알려진 연산 방법들에 의해 예측될 수 있다(예를 들면, Sangster의 "Octanol-water Partition Coefficients: fundamentals and physical chemistry"(John Wiley & Sons, Chichester, 1997) 참조).
바람직한 실시예에서, 본 발명의 화합물들의 로그 P 값은 -5 내지 -1.5이다. 상기 로그 P 값이 -3.5 내지 -2.0인 것이 특히 바람직하다.
바람직한 실시예에서, 상기 킬레이트기는 방사성인 킬레이트화 양이온을 포함한다. 보다 바람직한 것은 킬레이트화 방사성 금속 동위 원소이다.
상기 킬레이트기에 의해 킬레이트화될 수 있는 양이온들의 바람직한 예들은 43Sc, 44Sc, 47Sc, 51Cr, 52mMn, 58Co, 52Fe, 56Ni, 57Ni, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga. 68Ga, 89Zr, 90Y, 89Y, <Tc, 99mTc, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 110mIn, 111In, 113mIn, 114mIn, 117mSn, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 151Pm, 149Tb, 152Tb, 155Tb, 161Tb, 153Sm, 157Gd, 161Tb, 166Ho, 165Dy, 169Er, 169Yb, 175Yb, 172Tm, 177Lu, 186Re, 188Re, 191Pt, 197Hg, 198Au, 199Au, 212Pb, 203Pb, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 227Th의 양이온들, 18F를 포함하는 양이온 분자, 또는 18F-[AlF]2+와 같은 양이온이며, 보다 바람직하게는 44Sc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 90Y, 111In, 161Tb, 166Ho, 177Lu, 188Re, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac 및 227Th의 양이온들 또는 18F를 포함하는 양이온 분자이다. 양이온들은 Lu-177, Y-90, 또는 Ac-225로부터 선택될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 앞서 여기에 개시된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물들을 포함하거나 이들로 구성되는 약학 조성물(pharmaceutical composition)을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 앞서 여기에 개시된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물들을 포함하거나 이들로 구성되는 진단 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 앞서 여기에 개시된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물들을 포함하거나 이들로 구성되는 치료 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 운반체(carrier)들, 부형제(excipient)들 및/또는 희석제(diluent)들을 더 포함할 수 있다. 적합한 약학적 운반체들, 부형제들 및/또는 희석제들의 예들은 해당 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 인산염 완충 식염수 용액들, 물, 오일/물 에멀션(emulsion)들과 같은 에멀션들, 다양한 유형들의 습윤제(wetting agent)들, 살균 용액 등을 포함한다. 이러한 운반체들을 포함하는 조성물들은 잘 알려진 종래의 방법들로 조제될 수 있다. 이들 약학적 조성물들은 적합한 도스(dose)로 대상에 투여될 수 있다. 적합한 조성물들의 투여는 다른 방식들로도, 예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 피하, 근육 내, 국소, 피내, 비강 내 또는 기관지 내 투여에 의해 유효할 수 있다. 상기 투여가, 예를 들어, 췌장 내의 부위로나, 뇌동맥 내로나, 뇌 조직 내로 직접적인 주사 및/또는 전달에 의해 수행되는 것이 특히 바람직하다. 또한, 상기 조성물들은 표적 부위, 예를 들어, 췌장이나 뇌와 같은 외부 또는 내부 표적 부위로 생물 전달에 의해 투여될 수 있다. 투여 요법은 의사와 임상적 요소들을 참여시켜 결정될 것이다. 의료계에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 임의의 한 명의 환자에 대한 투여량은 환자의 사이즈, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 시간 및 투여의 루트, 일반적인 건강, 그리고 동시에 투여되는 다른 약물들을 포함하여 많은 인자들에 의존한다. 약학적으로 활성인 물질은 0.1ng 내지 10㎎/㎏의 도스(dose) 당 체중의 양으로 존재할 수 있지만, 이러한 예시적인 범위 위나 아래의 도스들은 특히 앞서 언급된 인자들을 고려하여 계획된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의학에서의 사용을 위한 앞서 여기에 개시된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물들을 제공한다.
바람직한 의학에서의 사용은 핵 분자 영상화로도 호칭되는 핵 진단 영상화와 같은 핵의학 및/또는 바람직하게는 병든 조직에 대한 PSMA의 과발현과 연관된 질병들의 표적 방사선 요법이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 전립선암을 진단 및/또는 병기(staging)하는 방법에 사용되는 앞서 여기에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물을 제공한다. 전립선암만이 PSMA를 발현시키는 암은 아니다. PSMA 발현을 나타내는 것으로 알려진 비전립선암들은 유방, 폐, 결장 및 신장 세포 암종을 포함한다. 따라서 PSMA 결합 모이어티를 가지는 여기에 개시되는 임의의 화합물이 PSMA 발현을 가지는 암의 진단, 영상화 또는 치료에 사용될 수 있다.
바람직한 작용(indication)들은 이에 한정되는 것은 아니지만, 고등급 신경 교종(high grade gliomas), 폐암, 특히 전립선암 및 전이된 전립선암과 같은 암의 검출이나 병기, 중간 위험에서 고위험의 일차 전립선암이 있는 환자들에서의 전이성 질환의 검출, 그리고 생화학적으로 재발하는 전립선암이 있는 환자들 내의 낮은 혈청 PSA 값들에서도 전이 부위들의 검출이다. 다른 바람직한 적용은 혈관 신생(neoangiogensis)의 영상화 및 시각화이다.
치료, 특히 방사선 치료를 위해 수행되는 의학적 적용의 측면들에서, 암은 바람직한 적용이다. 전립선암은 특히 바람직한 적용이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 암, 바람직하게는 전립선암을 진단 및/또는 병기하는 방법에서의 앞서 여기에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물의 사용을 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 사항들에 관한 것이다.
킬레이트화 방사성 양이온을 포함하거나, F가 선택적으로 18F인 화학식 (V)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
상기 화합물은 Sc, Cu, Ga, Y, In, Tb, Ho, Lu, Re, Pb, Bi, Ac, Er 및 Th의 양이온들로부터 선택되는 킬레이트화 양이온을 포함할 수 있다. 상기 킬레이트화 양이온은 방사성이 될 수 있다. 상기 킬레이트화 방사성 양이온은 갈륨, 에르븀, 구리, 스칸듐, 루테튬 또는 이트륨의 임의의 방사성 동위 원소(들)가 될 수 있다.
화학식 (Va)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
여기서, 각각의 X는 독립적으로 OH 또는 O-이고;
M은 킬레이트화 방사성 양이온이거나 존재하지 않으며;
F는 선택적으로 18F이다.
화학식 (Va)의 화합물에서, X는 OH가 될 수 있다. X는 O-가 될 수 있다. 기들인 X의 하나 또는 그 이상은 M이 존재할 때에 M으로 킬레이트화될 수 있다.
화학식 (Va)의 화합물에서, M은 킬레이트화 방사성 양이온이 될 수 있다. M은 존재하지 않을 수 있다. M은 하나 또는 그 이상의 X 기들로 킬레이트화된 방사성 양이온이 될 수 있다. M은 하나 또는 그 이상의 N 원자들로 킬레이트화된 방사성 양이온이 될 수 있다. M은 하나 또는 그 이상의 N 원자들이나 하나 또는 그 이상의 X 기들로 킬레이트화된 방사성 양이온이 될 수 있다. M은 하나 또는 그 이상의 N 원자들 및 하나 또는 그 이상의 X 기들로 킬레이트화된 방사성 양이온이 될 수 있다.
상기 화학식 (V) 또는 화학식 (Va)의 화합물에서, F는 18F가 될 수 있다. F는 19F가 될 수 있다.
상기 화학식 (V) 또는 화학식 (Va)의 화합물에서, 상기 킬레이트화 방사성 양이온은 43Sc, 44Sc, 47Sc, 51Cr, 52mMn, 58Co, 52Fe, 56Ni, 57Ni, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y, 89Y, <Tc, 99mTc, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 110mIn, 111In, 113mIn, 114mIn, 117mSn, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 151Pm, 149Tb, 152Tb, 155Tb, 161Tb, 153Sm, 157Gd, 161Tb, 166Ho, 165Dy, 169Er, 169Yb, 175Yb, 172Tm, 177Lu, 186Re, 188Re, 191Pt, 197Hg, 198Au, 199Au, 212Pb, 203Pb, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 227Th의 양이온들, 18F를 포함하는 양이온 분자, 또는 18F-[AlF]2+와 같은 양이온, 보다 바람직하게는 44Sc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 90Y, 111In, 161Tb, 166Ho, 177Lu, 188Re, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac 및 227Th의 양이온 또는 18F를 포함하는 양이온 분자로부터 선택될 수 있다. 상기 킬레이트화 방사성 양이온은 Sc, Cu, Ga, Y, In, Tb, Ho, Lu, Re, Pb, Bi, Ac, Er 및 Th의 양이온들로부터 선택될 수 있다. 상기 킬레이트화 방사성 양이온은 Ga가 될 수 있다. 상기 킬레이트화 방사성 양이온은 Lu-177, Y-90, 또는 Ac-225가 될 수 있다.
상기 화학식 (Va)의 화합물에서, M은 43Sc, 44Sc, 47Sc, 51Cr, 52mMn, 58Co, 52Fe, 56Ni, 57Ni, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 89Zr, 90Y, 89Y, <Tc, 99mTc, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111Ag, 110mIn, 111In, 113mIn, 114mIn, 117mSn, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 151Pm, 149Tb, 152Tb, 155Tb, 161Tb, 153Sm, 157Gd, 161Tb, 166Ho, 165Dy, 169Er, 169Yb, 175Yb, 172Tm, 177Lu, 186Re, 188Re, 191Pt, 197Hg, 198Au, 199Au, 212Pb, 203Pb, 211At, 212Bi, 213Bi, 223Ra, 225Ac, 227Th의 양이온들, 18F를 포함하는 양이온 분자, 또는 18F-[AlF]2+와 같은 양이온; 보다 바람직하게는 44Sc, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 68Ga, 90Y, 111In, 161Tb, 166Ho, 177Lu, 188Re, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac 및 227Th의 양이온들 또는 18F를 포함하는 양이온 분자로부터 선택될 수 있다. M은 Sc, Cu, Ga, Y, In, Tb, Ho, Lu, Re, Pb, Bi, Ac, Er 및 Th의 양이온들로부터 선택될 수 있다. M은 Ga가 될 수 있다. M은 Lu-177, Y-90, 또는 Ac-225가 될 수 있다.
가능한 한 몇몇 이성질체들을 가지는 화합물들을 합성하는 것이 유리하다. 상기 이성질체들이 분리될 수 있는 반면, 단일 이성질체만이 생체 내에 사용될 수 있으며, 이에 따라 잘못된 이성질체는 간단히 폐기되고 사용되지 않는다. 따라서 정의된 키랄 중심들의 임의의 것의 라세미화(racemisation) 또는 반전을 최소화하는 조건들은 이상적으로는 회피된다.
또한, 다음의 단계들을 포함하는 상기 화합물을 생산하는 방법이 설명된다.
a) 화학식 (I)의 화합물을,
화학식 (II)의 화합물과 반응시켜,
화학식 (III)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하며,
여기서, PG1은 tBu이고, PG2는 Fmoc이며, PG3은 Dde이고;
반응 조건들은 염기의 사용을 수반하며, 여기서 상기 염기는 2,4,6-콜리딘(collidine) 또는 2,6-디메틸피리딘(dimethylpyridine)이고;
b) 화학식 (IV)의 화합물을 형성하기 위한 조건들 하에서 상기 화학식 (III)의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하며;
c) 화학식 (V)의 화합물을 형성하기 위한 조건들 하에서 상기 화학식 (IV)의 화합물을 반응시키는 단계를 포함한다.
여기서, 상기 화학식 (II)의 화합물은 상기 화학식 (I)의 화합물과의 반응 이전에 2-(1H-벤조트리아졸(benzotriazole)-1-일(yl)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 테트라플루오로보레이트(tetramethylaminium tetrafluoroborate)(TBTU), 1-하이드록시(hydroxy)-7-아자벤조트리아졸(azabenzotriazole)(HOAt) 및 2,4,6-콜리딘과의 반응에 의해 예비 활성화된다. 상기 예비 활성화는 5분 이하 동안 일어난다.
짧은 활성화 시간과 함께 염기(base)로서 2,4,6-콜리딘 또는 2,6-디메틸피리딘의 사용은 DIPEA와 같은 다른 질소 염기들과 비교할 때에 활성화된 키랄 화합물 (II)의 라세미화를 최소화하는 데 기여한다. 보다 입체 구조적으로 저해되는 염기는 상기 산의 키랄 중심 상의 산 부분을 추출하지 못하며, 이에 따라 아민에 대한 결합 전에 라세미화를 저하시킨다.
화학식 (VI)에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 여기에 개시된다.
여기서, 상기 킬레이트화 금속은 알려져 있고, 킬레이트화되는 산성 기들은 단지 대표적으로 COO-로 나타내며, 균등한 네 번째 산도 부분적으로 킬레이트화될 수 있으며, 이에 따라 문자적으로 COOH가 되지 않을 수 있다.
화학식 (VII)에 따른 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 여기에 개시된다.
상기 화학식 (V) 또는 화학식 (VI)의 화합물을 포함하는 약학 또는 진단 조성물이 여기에 개시된다. 상기 결합체, 화합물 또는 조성물은 암의 진단이나 영상화제로 사용될 수 있다.
화학식 (V) 또는 화학식 (VI)에 따른 결합체, 화합물 또는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 영상화 및/또는 진단하는 방법이 개시된다.
암의 치료에서의 사용을 위한 화학식 (V) 또는 화학식 (VI)에 따른 결합체, 화합물 또는 조성물이 개시된다.
혈관 신생(neoangiogenesis)/혈관 형성(angiogenesis)의 진단, 영상화 또는 방지에서의 사용을 위한 화학식 (V) 또는 화학식 (VI)에 따른 결합체, 화합물 또는 조성물이 개시된다.
암 진단이나 영상화제로서의 사용이나 암의 치료에서의 사용을 위한 화학식 (V) 또는 화학식 (VI)에 따른 결합체, 화합물 또는 조성물이 개시되며, 여기서 상기 암은 전립선, 유방, 폐, 결장 및 신장 세포 암종이다.
도 1:
OriginPro 2016G 내의 아홉의 기준 물질들의 결정의 예시적인 연관성.
도 2a: [19F][natGa]-rhPSMA7-rac의 품질 관리([19F][natGa]D/L-Dap-R/S-DOTAGA-rhPSMA-7-rac)(배치 10, 핵의학의 부문에서 [18F][natGa]D/L-Dap-R/S-DOTAGA-rhPSMA-7의 생산을 위한 전구체, TUM). HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA.구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실(Nucleosil) 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 2b: 피크 할당: D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1; 거울상 이성질체 D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1과 동시 주입된 도 2a로부터의 rhPSM7-rac. HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 2c: D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1의 HPLC 프로파일; HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 3a: 피크 할당: L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2; 거울상 이성질체 L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2와 동시 주입된 도 2a로부터의 rhPSM7-rac. HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 3b: L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2의 HPLC 프로파일; HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 4a: 피크 할당: D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3; 거울상 이성질체 D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3과 동시 주입된 도 2a로부터의 rhPSM7-rac. HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 4b: D-Dap-D-DOTAGA-rhPSMA-7.3의 HPLC 프로파일; HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 5a: 피크 할당: L-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.4; 거울상 이성질체 D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3과 동시 주입된 도 2a로부터의 rhPSM7-rac. HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 5b: L-Dap-D-DOTAGA-rhPSMA-7.4의 HPLC 프로파일; HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 6a: PSMA에 대한 rhPSMA 7.1 및 7.2의 결합 친화도들(IC50[nM]). 친화도들은 방사성 리간드로서 LNCaP 세포들(150000세포들/웰) 및 ((4-[125I]요오드벤조일)KuE([125I]IB-KuE; c＝0.2nM)을 이용하여 결정되었다(1시간, 4℃, HBSS＋1%의 BSA). 데이터는 평균±SD로 나타낸다(n＝3, 3가지의 다른 실험들에서).
도 6b: PSMA에 대한 rhPSMA7 이성질체들의 결합 친화도들[nM]의 결정. 각각의 네 개의 칼럼들은 rhPSAM7.1(왼쪽) 내지 rhPSMA7.4(오른쪽)에 대한 개별적인 친화도 측정들을 보여준다. 조건들은 도 6a에 대한 범례에서 설명되는 바와 같다.
도 7: 개별적인 IC50[nM] 측정들의 도시는 도 6a 및 도 6b에 나타난다. rhPSMA7.1의 값 No. 5는 삭제되었다. 조건들은 도 6a에 대한 범례에서 설명되는 바와 같다.
도 8: 개별적인 내재화 측정들([125I]IB-KuE의 %]의 도시. 기준 리간드([125I]I-BA)KuE(c＝0.2nM)의 %로서 1시간에서 LNCaP 세포들에 대해 결정된 내재화된 활성(c＝0.5nM)(37℃, DMEM F12＋5%의 BSA, 125000세포/웰). 데이터는 비특이적 결합에 대해 수정되고(10μmol의 PMPA), 평균±SD로 나타낸다(n＝3).
도 9: rhPSMA 이성질체들의 로그 P의 개별적인 측정들의 도시.
도 10: LNCaP 종양이 있는 SCID 마우스들에서의 1시간 p.i.에서 18F-표지 rhPSMA 추적자들의 생물 분포(%ID/g로). 데이터는 평균±SD로 나타낸다(rhPSMA7.1에 대해 n＝4, 7.2에 대해 n＝5, 7.3에 대해 n＝4, 7.4에 대해 n＝5 및 7-rac에 대해 n＝3).
도 11: LNCaP 종양이 있는 SCID 마우스들에서의 1시간 p.i.에서 PMPA(8㎎/㎏)와 동시 주입된 18F-rhPSMAs의 생물 분포[%ID/g]. 데이터는 평균±SD로 나타낸다(n＝3).
도 12: 아미드 결합들의 대사성 절단에 의해 생성되는 가능한 종들. iL: 절단은 증가된 친유성을 갖는 종들을 형성한다. DF: 탈불화; nd: 방사성이 아니기 때문에 검출 가능하지 않음.
도 13: 왼쪽: 중첩되는 피크 1(rhPSMA7.2) 및 2(rhPSMA7.3)의 도식적 해석; 오른쪽: 시스타트 피크피트 소프트웨어에 의한 피크 프로파일들의 디콘볼루션 및 통합; 위: 실험 데이터 적정, 아래: 디콘볼루션된 단일 피크들.
도 14a: 고전적 통합의 재현성(HPLC 프로그램에 의해) 및 피크 4(rhPSMA7.1)의 디콘볼루션('피크피트'에 의해)을 평가하기 위한 상대적 변화들의 정량화(주사된 라세미 혼합물의 % 변화로). 두 방법들은 이러한 피크에 대해 유사한 성능을 나타낸다.
도 14b: 고전적 통합의 재현성(HPLC 프로그램에 의해) 및 피크 3(rhPSMA7.4)의 디콘볼루션('피크피트'에 의해)을 평가하기 위한 상대적 변화들의 정량화(주사된 라세미 혼합물의 % 변화로). 두 방법들은 이러한 피크에 대해 유사한 성능을 나타낸다.
도 15: 주사된 용액 내의 그 비율에 대한 혈액, 간, 신장, 종양 및 오줌 내의 각 rhPSAM7.1-7.4 이성질체의 퍼센티지 변화([18F][natGa]rhPSMA7-rac. 데이터는 평균값들±SD로 나타낸다(n＝4; 또한, 도 16 참조).
도 16: 주사된 용액 내의 그 비율에 대한 혈액, 간, 신장, 종양 및 오줌 내의 각 샘플 및 실험을 위한 rhPSAM7.1-7.4 이성질체의 퍼센티지 변화([18F][natGa]rhPSMA7-rac). 분석들은 시스타트 피크피트로 수행되었다.
도 17: 왼쪽: 간 샘플이 있는 TLC 플레이트의 TLC 스캐너 프로파일(2018년 7월 30일, 전체적인 cts: 142cts). 이들의 불량한 통계들과 cts＜200를 갖는 제한된 유효성의 데이터 세트로 인해 제거되었다. 오른쪽: 간 샘플이 있는 TLC 플레이트의 프로포이미지: 이동 추적자의 긴 테일링.
도 18: 왼쪽: 품질 관리 샘플을 구비하는 TLC 플레이트의 TLC 스캐너 프로파일(2018년 8월 1일, 전체적인 cts: 384). 오른쪽: 오줌, 신장, 간, 종양, 혈액 및 QK 샘플이 있는 TLC 플레이트의 예시적인 포스포이미지.
도 19: 추적자의 임상적 적용 이전에 핵의학의 부문에서 품질 관리의 일부로서 [F-18]rhPSMA7-rac(30.07.2018)의 [F-18]rhPSMA7-rac(2018년 7월 30일). 추적자의 테일링이 조제 완충액 내에서(및 이에 따라 단백질의 부존재에서)도 관찰되는 점에 유의한다.
도 20: 오줌 샘플의 방사성-TLC에 의한 유리 [F-18]불소 및 '온전한' [F-18]rhPSMA7-rac의 정량화(2018년 7월 30일).
도 21: 왼쪽: 각기 [F-18]rhPSAM-7.x 추적자가 주입된 4의 정상적인 마우스들로부터 수집되고 모아진 오줌의 방사성-HPLC 분석. 오른쪽: 각기 1시간(7.1., 7.2.), 0.5시간(7.3.) 및 2시간(7.4.)의 기간 동안에 [F-18]rhPSAM-7.x 추적자로 수집된 '저온' 오줌의 방사성-HPLC 분석.
HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA; 구배: 5% 등용매 0분-3분, 25%-35% B 3분-43분, 95%-95% B 43분-48분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜.
도 22: 카트리지 고정 및 TLC에 의한 오줌 내의 방사성 종들의 분리. 위: 1.6분에서의 작은 비율 및 34.5분에서의 온전한 추적자를 보여주는 마우스들 내에서의 [F-18]rhPSMA 7.3의 30분 p.i.에서의 오줌의 방사성-HPLC 분석. 아래(왼쪽): 마우스들의 오줌은 [F-18]rhPSMA7.3의 30분 p.i.에서 희석되었고, STRATA-X 카트리지 고정이 수행되었다. 상기 카트리지는 세척되었고, MeCN/물(60/40(v/v)＋1%의 TFA)로 용리되었다; 온전한 추적자만이 검출되었다. 아래(오른쪽): 카트리지 고정(유지되지 않은 성분들)으로부터의 돌발 및 상기 카트리지로부터 최종적으로 용리된 MeCN/물 부분 모두가 TLC에 의해 분석되었다(바닥, 우측). 96.1%의 [F-18]rhPSMA7.3과 단지 3.9%의 [F-18]불소가 카트리지의 용출물 내에서 발견되었던 반면, 역비율은 상기 카트리지의 돌발에서 발견되었다(3.4%의 [F-18]rhPSMA 7.3 및 단지 96.6%의 [F-18]불소).
도 23: 마우스들의 신선하고 비방사성인 오줌에 [F-18]rhPSMA 7.3이 첨가되었고, 0.5μmol의 저온 F-19 불소; 2시간 동안의 배양이 수반되었다.
방사선은 [F-18]불소(1.6분에서 피크)를 나타내는 매우 친수성인 부분으로 완전히(98.5%) 전환되었다. 유의: 1.6분에서의 피크는 후속하여 QMA 카트리지 상에 고정되었고, NaCl(1M)로 용리되었다(＝불소).
도 24: SUVmax로 입증되는 바와 같은 18F-rhPSMA-7(왼쪽) 및 18F-rhPSMA-7.3(오른쪽)의 종양 병변들 내의 임상적 생물 분포 및 흡수. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 25: SUVmean으로 입증되는 바와 같은 18F-rhPSMA-7(왼쪽) 및 18F-rhPSMA-7.3(오른쪽)의 종양 병변들 내의 임상적 생물 분포 및 흡수. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 26: 배경에 대한 방사선 SUVmax로 입증되는 바와 같은 18F-rhPSMA-7(왼쪽) 및 18F-rhPSMA-7.3(오른쪽)의 종양 병변들 내의 임상적 생물 분포 및 흡수. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 27: 배경에 대한 방사선 SUVmean으로 입증되는 바와 같은 18F-rhPSMA-7(왼쪽) 및 18F-rhPSMA-7.3(오른쪽)의 종양 병변들 내의 임상적 생물 분포 및 흡수. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 28: 18F-rhPSMA-7.3 PET-영상화의 두 가지의 임상의 예들.
도 2a: [19F][natGa]-rhPSMA7-rac의 품질 관리([19F][natGa]D/L-Dap-R/S-DOTAGA-rhPSMA-7-rac)(배치 10, 핵의학의 부문에서 [18F][natGa]D/L-Dap-R/S-DOTAGA-rhPSMA-7의 생산을 위한 전구체, TUM). HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA.구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실(Nucleosil) 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 2b: 피크 할당: D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1; 거울상 이성질체 D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1과 동시 주입된 도 2a로부터의 rhPSM7-rac. HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 2c: D-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.1의 HPLC 프로파일; HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 3a: 피크 할당: L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2; 거울상 이성질체 L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2와 동시 주입된 도 2a로부터의 rhPSM7-rac. HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 3b: L-Dap-R-DOTAGA-rhPSMA-7.2의 HPLC 프로파일; HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 4a: 피크 할당: D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3; 거울상 이성질체 D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3과 동시 주입된 도 2a로부터의 rhPSM7-rac. HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 4b: D-Dap-D-DOTAGA-rhPSMA-7.3의 HPLC 프로파일; HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 5a: 피크 할당: L-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.4; 거울상 이성질체 D-Dap-S-DOTAGA-rhPSMA-7.3과 동시 주입된 도 2a로부터의 rhPSM7-rac. HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45분-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 5b: L-Dap-D-DOTAGA-rhPSMA-7.4의 HPLC 프로파일; HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA. 구배: 25%-35% B 0분-40분, 95%-95% B 40분-45분, 35%-35% B 45-50분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜, 샘플: 1mM(DMSO), 10㎕.
도 6a: PSMA에 대한 rhPSMA 7.1 및 7.2의 결합 친화도들(IC50[nM]). 친화도들은 방사성 리간드로서 LNCaP 세포들(150000세포들/웰) 및 ((4-[125I]요오드벤조일)KuE([125I]IB-KuE; c＝0.2nM)을 이용하여 결정되었다(1시간, 4℃, HBSS＋1%의 BSA). 데이터는 평균±SD로 나타낸다(n＝3, 3가지의 다른 실험들에서).
도 6b: PSMA에 대한 rhPSMA7 이성질체들의 결합 친화도들[nM]의 결정. 각각의 네 개의 칼럼들은 rhPSAM7.1(왼쪽) 내지 rhPSMA7.4(오른쪽)에 대한 개별적인 친화도 측정들을 보여준다. 조건들은 도 6a에 대한 범례에서 설명되는 바와 같다.
도 7: 개별적인 IC50[nM] 측정들의 도시는 도 6a 및 도 6b에 나타난다. rhPSMA7.1의 값 No. 5는 삭제되었다. 조건들은 도 6a에 대한 범례에서 설명되는 바와 같다.
도 8: 개별적인 내재화 측정들([125I]IB-KuE의 %]의 도시. 기준 리간드([125I]I-BA)KuE(c＝0.2nM)의 %로서 1시간에서 LNCaP 세포들에 대해 결정된 내재화된 활성(c＝0.5nM)(37℃, DMEM F12＋5%의 BSA, 125000세포/웰). 데이터는 비특이적 결합에 대해 수정되고(10μmol의 PMPA), 평균±SD로 나타낸다(n＝3).
도 9: rhPSMA 이성질체들의 로그 P의 개별적인 측정들의 도시.
도 10: LNCaP 종양이 있는 SCID 마우스들에서의 1시간 p.i.에서 18F-표지 rhPSMA 추적자들의 생물 분포(%ID/g로). 데이터는 평균±SD로 나타낸다(rhPSMA7.1에 대해 n＝4, 7.2에 대해 n＝5, 7.3에 대해 n＝4, 7.4에 대해 n＝5 및 7-rac에 대해 n＝3).
도 11: LNCaP 종양이 있는 SCID 마우스들에서의 1시간 p.i.에서 PMPA(8㎎/㎏)와 동시 주입된 18F-rhPSMAs의 생물 분포[%ID/g]. 데이터는 평균±SD로 나타낸다(n＝3).
도 12: 아미드 결합들의 대사성 절단에 의해 생성되는 가능한 종들. iL: 절단은 증가된 친유성을 갖는 종들을 형성한다. DF: 탈불화; nd: 방사성이 아니기 때문에 검출 가능하지 않음.
도 13: 왼쪽: 중첩되는 피크 1(rhPSMA7.2) 및 2(rhPSMA7.3)의 도식적 해석; 오른쪽: 시스타트 피크피트 소프트웨어에 의한 피크 프로파일들의 디콘볼루션 및 통합; 위: 실험 데이터 적정, 아래: 디콘볼루션된 단일 피크들.
도 14a: 고전적 통합의 재현성(HPLC 프로그램에 의해) 및 피크 4(rhPSMA7.1)의 디콘볼루션('피크피트'에 의해)을 평가하기 위한 상대적 변화들의 정량화(주사된 라세미 혼합물의 % 변화로). 두 방법들은 이러한 피크에 대해 유사한 성능을 나타낸다.
도 14b: 고전적 통합의 재현성(HPLC 프로그램에 의해) 및 피크 3(rhPSMA7.4)의 디콘볼루션('피크피트'에 의해)을 평가하기 위한 상대적 변화들의 정량화(주사된 라세미 혼합물의 % 변화로). 두 방법들은 이러한 피크에 대해 유사한 성능을 나타낸다.
도 15: 주사된 용액 내의 그 비율에 대한 혈액, 간, 신장, 종양 및 오줌 내의 각 rhPSAM7.1-7.4 이성질체의 퍼센티지 변화([18F][natGa]rhPSMA7-rac. 데이터는 평균값들±SD로 나타낸다(n＝4; 또한, 도 16 참조).
도 16: 주사된 용액 내의 그 비율에 대한 혈액, 간, 신장, 종양 및 오줌 내의 각 샘플 및 실험을 위한 rhPSAM7.1-7.4 이성질체의 퍼센티지 변화([18F][natGa]rhPSMA7-rac). 분석들은 시스타트 피크피트로 수행되었다.
도 17: 왼쪽: 간 샘플이 있는 TLC 플레이트의 TLC 스캐너 프로파일(2018년 7월 30일, 전체적인 cts: 142cts). 이들의 불량한 통계들과 cts＜200를 갖는 제한된 유효성의 데이터 세트로 인해 제거되었다. 오른쪽: 간 샘플이 있는 TLC 플레이트의 프로포이미지: 이동 추적자의 긴 테일링.
도 18: 왼쪽: 품질 관리 샘플을 구비하는 TLC 플레이트의 TLC 스캐너 프로파일(2018년 8월 1일, 전체적인 cts: 384). 오른쪽: 오줌, 신장, 간, 종양, 혈액 및 QK 샘플이 있는 TLC 플레이트의 예시적인 포스포이미지.
도 19: 추적자의 임상적 적용 이전에 핵의학의 부문에서 품질 관리의 일부로서 [F-18]rhPSMA7-rac(30.07.2018)의 [F-18]rhPSMA7-rac(2018년 7월 30일). 추적자의 테일링이 조제 완충액 내에서(및 이에 따라 단백질의 부존재에서)도 관찰되는 점에 유의한다.
도 20: 오줌 샘플의 방사성-TLC에 의한 유리 [F-18]불소 및 '온전한' [F-18]rhPSMA7-rac의 정량화(2018년 7월 30일).
도 21: 왼쪽: 각기 [F-18]rhPSAM-7.x 추적자가 주입된 4의 정상적인 마우스들로부터 수집되고 모아진 오줌의 방사성-HPLC 분석. 오른쪽: 각기 1시간(7.1., 7.2.), 0.5시간(7.3.) 및 2시간(7.4.)의 기간 동안에 [F-18]rhPSAM-7.x 추적자로 수집된 '저온' 오줌의 방사성-HPLC 분석.
HPLC-조건들: 용매 A: H20＋0.1%의 TFA; 용매 B: MeCN＋0.1%의 TFA; 구배: 5% 등용매 0분-3분, 25%-35% B 3분-43분, 95%-95% B 43분-48분; 유량: 1㎖/분, 칼럼: 뉴클레오실 100-5 C18, 125 x 4.6㎜.
도 22: 카트리지 고정 및 TLC에 의한 오줌 내의 방사성 종들의 분리. 위: 1.6분에서의 작은 비율 및 34.5분에서의 온전한 추적자를 보여주는 마우스들 내에서의 [F-18]rhPSMA 7.3의 30분 p.i.에서의 오줌의 방사성-HPLC 분석. 아래(왼쪽): 마우스들의 오줌은 [F-18]rhPSMA7.3의 30분 p.i.에서 희석되었고, STRATA-X 카트리지 고정이 수행되었다. 상기 카트리지는 세척되었고, MeCN/물(60/40(v/v)＋1%의 TFA)로 용리되었다; 온전한 추적자만이 검출되었다. 아래(오른쪽): 카트리지 고정(유지되지 않은 성분들)으로부터의 돌발 및 상기 카트리지로부터 최종적으로 용리된 MeCN/물 부분 모두가 TLC에 의해 분석되었다(바닥, 우측). 96.1%의 [F-18]rhPSMA7.3과 단지 3.9%의 [F-18]불소가 카트리지의 용출물 내에서 발견되었던 반면, 역비율은 상기 카트리지의 돌발에서 발견되었다(3.4%의 [F-18]rhPSMA 7.3 및 단지 96.6%의 [F-18]불소).
도 23: 마우스들의 신선하고 비방사성인 오줌에 [F-18]rhPSMA 7.3이 첨가되었고, 0.5μmol의 저온 F-19 불소; 2시간 동안의 배양이 수반되었다.
방사선은 [F-18]불소(1.6분에서 피크)를 나타내는 매우 친수성인 부분으로 완전히(98.5%) 전환되었다. 유의: 1.6분에서의 피크는 후속하여 QMA 카트리지 상에 고정되었고, NaCl(1M)로 용리되었다(＝불소).
도 24: SUVmax로 입증되는 바와 같은 18F-rhPSMA-7(왼쪽) 및 18F-rhPSMA-7.3(오른쪽)의 종양 병변들 내의 임상적 생물 분포 및 흡수. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 25: SUVmean으로 입증되는 바와 같은 18F-rhPSMA-7(왼쪽) 및 18F-rhPSMA-7.3(오른쪽)의 종양 병변들 내의 임상적 생물 분포 및 흡수. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 26: 배경에 대한 방사선 SUVmax로 입증되는 바와 같은 18F-rhPSMA-7(왼쪽) 및 18F-rhPSMA-7.3(오른쪽)의 종양 병변들 내의 임상적 생물 분포 및 흡수. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 27: 배경에 대한 방사선 SUVmean으로 입증되는 바와 같은 18F-rhPSMA-7(왼쪽) 및 18F-rhPSMA-7.3(오른쪽)의 종양 병변들 내의 임상적 생물 분포 및 흡수. 데이터는 평균±SD로 나타낸다.
도 28: 18F-rhPSMA-7.3 PET-영상화의 두 가지의 임상의 예들.
다음의 실시예들을 통해 본 발명을 설명한다.
실시예 1: 물질 및 방법들
Fmoc-(9-플루오레닐메톡시카르보닐(fluorenylmethoxycarbonyl)-) 및 모든 다른 보호 아미노산 유사체들은 바켐(Bachem)(부펜도르프, 스위스) 또는 아리리스 바이오테크(Iris Biotech)(마크트레드비츠, 독일)로부터 구매되었다. 트리클로라이드 폴리스티렌(tritylchloride polystyrene)(TCP) 수지는 펩켐(PepChem)(튀빙겐, 독일)으로부터 수득되었다. 케마테크(Chematech)(다종, 프랑스)에서 킬레이트제들 DOTAGA-무수물, (R)-DOTA-GA(tBu)4 및 (S)-DOTA-GA(tBu)4가 전달되었다. 모든 필요한 용매들 및 다른 유기 시약들은, 알파 아에사르(Alfa Aesar)(카를스루에, 독일), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(뮌헨, 독일) 또는 VWR(다음슈타트, 독일)로부터 구매되었다. 펩티드들의 고상 합성은 인텔리-믹서(Intelli-Mixer) 주사기 셰이커(shaker)(네오랩(Neolab), 하이델베르크, 독일)를 이용하여 수작업으로 수행되었다. 분석 및 조제 역상 고압 크로마토그래피(RP-HPLC)가 각기 SPD-20A UV/Vis 검출기(220㎚, 254㎚)를 구비한 쉬마드주(Shimadzu) 구배 시스템(gradient system)들(쉬마드주 도이칠란드사(Shimadzu Deutschland GmbH), 노이파른, 독일)을 이용하여 수행되었다. A 뉴클레오실(Nucleosil) 100 C18(125 x 4.6㎜, 5㎛의 입자 크기) 칼럼(씨에스사(CS GmbH), 랑게르베헤, 독일)이 1㎖/min의 유량에서 분석적 측정들을 위해 사용되었다. 두 특정한 구배들 및 대응되는 정체 시간 t R 이 본문에 언급된다. 조제 HPLC 정제는 5㎖/분의 일정한 유량에서 물토스페르(Multospher) 100 RP 18(250 x 10㎜, 5㎛의 입자 크기) 칼럼(씨에스사, 랑게르베헤, 독일)으로 이루어졌다. 분석 및 조제 방사성 RP-HPLC는 뉴클레오실(Nucleosil) 100 C18(5㎛, 125 x 4.0㎜) 칼럼(씨에스사, 랑게르베헤, 독일)을 이용하여 수행되었다. 모든 HPLC 조작들의 용리제(eluent)들은 모두 0.1%의 트리플루로오 아세트산(trifluoroacetic acid)을 함유하는 물(용매 A) 및 아세토니트릴(acetonitrile)(용매 B)이었다. 상기 물질들의 특성화를 위한 대전기 분무 이온화(electrospray ionization)-질량 스텍트럼들이 발현L CMS 질량 분석기(애드비온사(Advion Ltd.), 할로, 영국) 상에서 얻어졌다. NMR 스펙트럼들은 300K에서 브루커(Bruker) AVHD-300 또는 AVHD-400 분광기들 상에 기록되었다. pH 값들은 세븐이지(SevenEasy) pH-미터(메틀러 톨레도(Mettler Toledo), 기센, 독일)로 측정되었다.
합성 프로토콜들
1) 고상 펩티드 분석 추종 Fmoc-전략
TCP-수지 적재(GP1)
Fmoc-보호 아미노산(AA)이 있는 트리클로라이드 폴리스티렌(TCP) 수지의 적재(loading)가 실온에서 2시간 동안 DIPEA(4.5eq.)를 구비한 무수 DCM 내에서 TCP-수지(1.95mmol/g) 및 Fmoc-AA-OH(1.5eq.)의 용액을 교반하여 수행되었다. 남아있는 트리틸클로라이드(Remaining tritylchloride)는 15분 동안 메탄올(2㎖/g 수지)의 첨가에 의해 유착되었다. 후속하여, 상기 수지는 여과되었고, DCM(2 x 5㎖/g 수지), DMF(2 x 5㎖/g 수지), 메탄올(5㎖/g 수지)로 세척되었으며, 진공 내에서 건조되었다. Fmoc-AA-OH의 최종 적재는 다음 식에 의해 결정되었다.
m2＝mass of loaded 수지[g]
m1＝mass of unloaded 수지[g]
MW＝AA의 분자량[g/mol]
MHCl＝HCl의 분자량[g/mol]
On-수지 아미드 결합 형성(GP2)
수지 결합 펩티드에 대한 구축 단위의 결합(conjugation)을 위해, TBTU 및 HOBT의 혼합물이 DMF(10㎖/g 수지) 내의 5분 동안 염기로서 DIPEA 또는 2,4,6-트리메틸피리딘(trimethylpyridine)로 예비 활성화를 위해 사용된다. 각 결합 단계에 대한 추출물 화학량론 및 반응 시간은 합성 프로토콜에 정해진다. 반응 후, 상기 수지는 DMF(6 x 5㎖/g 수지)로 세척되었다.
수지상 Fmoc-탈보호화(GP3)
수지-결합 Fmoc-펩티드가 5분 동안 DMF(v/v, 8㎖/g 수지) 내의 20%의 피페리딘(piperidine)으로 처리되었고, 후속하여 15분 동안 처리되었다. 이후에, 상기 수지는 DMF(8 x 5㎖/g 수지)로 완전히 세척되었다.
수지상 Dde-탈보호화(GP4)
Dde-탈호보화 펩티드(1.0eq.)가 DMF(v/v, 5㎖/g 수지) 내의 2%의 하이드라진 모노하이드레이트(hydrazine monohydrate)의 용액 내에 용해되었고, 20분 동안 흔들어졌다(GP4a). 존재하는 Fmoc-기들의 경우, Dde-탈보호화(deprotection)는 3시간 동안 실온에서(GP4b) 이미다졸의 용액(0.92g/g 수지), NMP(5.0㎖) 내의 하이드록실아민 하이드로클로라이드(hydroxylamine hydrochloride)(1.26g/g 수지) 및 DMF(1.0㎖)의 첨가에 의해 수행되었다. 탈보호화 후에 상기 수지는 DMF(8 x 5㎖/g 수지)로 세척되었다.
산 불안정 보호기들(GP 5)의 동시 탈보호화로 수지로부터의 펩티드 절단
완전히 보호된 수지-결합 펩티드가 TFA/TIPS/물(v/v/v; 95/2.5/2.5)의 혼합물 내에 용해되었고, 30분 동안 흔들어졌다. 용액은 여과로 제거되었고, 상기 수지는 추가 30분 동안 동일한 방식으로 처리되었다. 두 여과물들이 결합되었고, 추가로 5시간 동안 교반되었으며, 질소의 흐름 하에서 농축되었다. 삼차 부탄올(tert-butanol)과 물의 혼합물 내에 잔여물을 용해시키고, 후속하는 동결 건조 후에 원료 펩티드가 얻어졌다.
nat
Ga-복합화(GP6)
natGa-복합화를 위해, 펩티드(1.0eq.)가 H2O 내의 tBuOH의 3:1(v/v) 혼합물 내에 용해되었고, Ga(NO3)3(3.5eq.)의 수성 용액이 첨가되었다. 결과적인 혼합물을 30분 동안 75℃에서 가열한 후에 상기 펩티드가 RP-HPLC에 의해 정제되었다.
2) PSMA 결합 모티프의 합성
Glu-요소-Glu((
t
BuO)EuE(O
t
Bu)2)
상기 tBu-보호 Glu-요소(urea)-Glu 결합 모티프(motif)(EuE)는 tBu-보호 Glu-요소-Lys(EuK)에 대한 앞서 공개된 절차(계획 1)에 따라 합성되었다.
디(di)-삼차 부틸(tert-butyl)(1H-이미다졸(imidazole)-1-카르보닐(carbonyl))-L-글루타메이트(glutamate)(i)
2.0g(7.71mmol, 1.0eq.)의 l-디-삼차 부틸-L-글루타메이트ㆍHCl을 함유하는 DCM의 용액이 얼음 위에서 30분 동안 냉각되었고, 이후에 2.69㎖의 TEA(19.28mmol, 2.5eq.) 및 3.3㎎(0.3mmol, 0.04eq.)의 DMAP로 처리되었다. 5분 동안의 추가적인 교반 후, DCM 내에 용해된 1.38g(8.84mmol, 1.1eq.)의 1,1'-카르보닐디이미다졸(carbonyldiimidazole)(CDI)이 30분의 기간에 걸쳐 첨가되었다. 반응 혼합물은 하룻밤 동안 더 교반되었고, 실온(RT)까지 데워지게 하였다. 상기 반응은 물(2 x) 및 브라인(brine)(2 x)의 동반되는 세척 단계들로 8㎖의 포화 NaHCO3을 사용하여 중단되었으며, Na2SO4 위에서 건조되었다. 나머지 용매는 진공 내에서 제거되었고, 원료 생성물 (S)-디(di)-삼차 부틸(tert-butyl)-2-(1H-이미다졸(imidazole)-1-카르복스아미도(carboxamido))펜탄디오에이트(pentanedioate)(i)가 추가적인 정제 없이 사용되었다.
5-벤질(benzyl)-1-(삼차 부틸(tert-butyl)) (((S)-1,5-디(di)-(삼차-부톡시tert-butoxy)-1,5-디옥소펜탄(dioxopentan)-2-일(yl))카르바모일(carbamoyl))-L-글루타메이트(glutamate)(ii)
2.72g(7.71mmol, 1.0eq.)의 상기 원료 생성물 (S)-디-삼차 부틸-2-(1H-이미다졸(imidazole)-1-카르복스이미도)펜탄디오에이트(i)가 1,2-디클로로에탄(dichloroethane)(DCE) 내에 용해되었고, 얼음 위에서 30분 동안 냉각되었다. 2.15㎖(15.42mmol, 2.0eq.)의 TEA 및 2.54g(7.71mmol, 1.0eq.)의 H-L-Glu(OBzl)-OtBuㆍHCl이 첨가되었고, 용액은 40℃에서 하룻밤 동안 교반되었다. 잔류 용매는 증발되었고, 상기 원료 생성물은 아세트산에틸/헥산/TEA(500:500:0.8; v/v/v)을 함유하는 용리제(eluent) 혼합물로 실리카겔 플래시-크로마토그래피을 이용하여 정제되었다. 상기 용매의 제거 후, 5-벤질-1-(삼차 부틸)-(((S)-1,5-디-삼차-부톡시-1,5-디옥소펜탄-2-일)카르바모일)-L-글루타메이트(ii)가 무색의 오일로 얻어졌다.
(tBuO)EuE(OtBu)
2
(iii)
(tBuO)EuE(OtBu)2를 합성하기 위해, 3.17g(5.47mmol, 1.0eq.)의 5-벤질-1-(삼차 부틸)-(((S)-1,5-디-삼차 부톡시-1,5-디옥소펜탄-2-일)카르바모일)-L-글루타메이트(ii)가 75㎖의 EtOH 내에 용해되었고, 활성탄(10%) 상에서 0.34g(0.57mmol, 0.1eq.)의 팔라듐이 이러한 용액에 주어졌다. 반응 혼합물을 포함하는 플라스크는 초기에 H2로 정화되었고, 상기 용액은 가벼운 H2-압력(벌룬(balloon)) 하에서 실온에서 하룻밤 동안 교반되었다. 원료 생성물은 셀라이트(celite)를 통해 정제되었고, 용매는 진공 내에서 증발되었다. 생성물(iii)은 흡습성 고체(84%)로서 얻어졌다. HPLC(15분 내에서 10% 내지 90% B): t R ＝11.3분. 계산된 단일 동위 원소 질량(C23H49N2O9): 488.3; 파운드(found): m/z＝489.4[M+H]+, 516.4[M+Na]+.
계획 1: (tBuO)EuE(OtBu)2의 합성: a) DCI, TEA, DMAP(DCM); b) H-L-Glu(OBzl)-OtBuㆍHCl, TEA(DCE); c) Pd/C(10%), H2(EtOH).
3) 실리콘-불소 수용체의 합성
SiFA-BA는 앞서 공개한 절차(계획 2)에 따라 합성되었다. 모든 반응들은 진공 가스 매니폴드를 이용하여 아르곤 하에서 건조시킨 반응 용기들 내에서 수행되었다.
((4-브로모벤질(bromobenzyl))옥시(oxy))(삼차 부틸(tert-butyl))디메틸실란(dimethylsilane)(i)
무수 DMF(70mL) 내의 4-브로모벤질알코올(bromobenzylalcohol)(4.68g, 25.0mmol, 1.0eq.)의 교반된 용액에 이미다졸(2.04g, 30.0mmol, 1.2eq.) 및 TBDMSCl(4.52g, 30.0mmol, 1.2eq.)가 첨가되었고, 결과적인 혼합물은 실온에서 16시간 동안 교반되었다. 혼합물은 이후에 얼음 냉각된 H2O(250㎖) 내로 부어졌고, Et2O(5 x 50㎖)로 추출되었다. 결합된 유기 부분들은 포화 수성 NaHCO3(2 x 100㎖) 및 브라인(100㎖)으로 세척되었고, 건조되었으며, 여과되었고, 무색의 오일(7.18g, 95%)로서 (i)을 얻기 위해 플래시 칼럼 크로마토그래피(실리카, 5%의 EtOAc/페트롤)에 의해 정제되었던 원료 생성물을 수득하도록 진공 내에서 농축되었다. 1H NMR(400MHz, CDCl3): δ[ppm]＝0.10(6H, s, SiMe 2t-Bu), 0.95(9H, s, SiMe2tBu), 4.69(2H, s, CH 2OSi), 7.21(2H, d), 7.46(2H, d), HPLC(15분 내에 50% 내지 100% B): t R ＝15분.
디(di)-삼차 부틸(tert-butyl){4-[(삼차 부틸디메틸실릴록시(tert-butyldimethylsilyloxy))메틸(methyl)]페닐(phenyl)}플루오로실란(fluorosilane)(ii)
-78℃에서의 자성 교반 하에서, 펜탄 내의 tBuLi의 용액(7.29㎖, 1.7mol/L, 12.4mmol 2.4eq.)이 건조 THF(15㎖) 내의 ((4-브로모벤질)옥시)(삼차 부틸)디메틸실란(i)(1.56g, 5.18mmol, 1.0eq.)의 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물이 30분 동안 -78℃에서 교반된 후, 얻어진 서스펜션은 30분의 기간에 걸쳐 건조 THF(10㎖) 내의 디-삼차 부틸디플루오로실란(1.12g, 6.23mmol, 1.2eq.)의 냉각된(-78℃) 용액에 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물은 12시간의 기간에 걸쳐 실온까지 데워지게 두어졌고, 포화 수성 NaCl 용액(100㎖)으로 가수 분해되었다. 유기 층이 분리되었고, 수성 층이 디에틸에테르(diethyl ether)(3 x 50㎖)로 추출되었다. 결합된 유기 층들은 황산마그네슘 위에서 건조되었고, 여과되었다. 여과물은 노르스름한 오일(1.88g, 95%)로서 (ii)을 수득하기 위해 진공 내에서 농축되었다. 이는 다른 정제 없이 후속하는 반응들에 대해 사용되었다. NMR 스펙트럼들은 문헌[2]에 보고된 데이터에 따랐다. HPLC(20분 내에 50% 내지 100% B): t R ＝19분.
4-(디(di)-삼차 부틸플루오로실라닐(tert-butylfluorosilanyl))벤질 알코올(benzyl alcohol)(iii)
촉매 양의 농축된 수성 HCl(0.5㎖)이 메탄올(50㎖) 내의 (ii)의 서스펜션(1.88g, 4.92mmol, 1.0eq.)에 첨가되었다. 반응 혼합물은 18시간 동안 실온에서 교반되었고, 이후에 상기 용매와 휘발성 물질들이 감압 하에서 제거되었다. 잔여물은 디에틸에테르(40㎖) 내에 다시 용해되었고, 상기 용액은 포화 수성 NaHCO3 용액으로 세척되었다. 수성 층은 디에틸에테르(3 x 50㎖)로 추출되었다. 결합된 유기 층들은 황산마그네슘 위에서 건조되었고, 여과되었다. 여과물은 고체화되는 노르스름한 오일(1.29g, 98%)로서 (iii)을 얻기 위해 진공 내에서 농축되었다. 생성물은 다른 정제 없이 사용되었다. NMR 스펙트럼들은 문헌[2]에 보고된 데이터에 따랐다. HPLC(15분 내에 50% 내지 100% B): t R ＝8.2분.
4-(디(di)-삼차 부틸플로오로실릴(tert-butylfluorosilyl))벤즈알데히드(benzaldehyde)(iv)
건조 디클로로메탄(dichloromethane)(20㎖) 내의 알코올의 용액 (iii)(1.37g, 5.10mmol, 1.0eq.)이 건조 디클로로메탄(60㎖) 내의 피리디늄 클로로크로메이트(pyridinium chlorochromate)(2.75g, 12.8mmol, 2.5eq.)의 교반되고 얼음 냉각된 서스펜션에 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물이 30분 동안 0℃에서 및 2.5시간 동안 실온에서 교반된 후, 무수 디에틸에테르(40㎖)가 첨가되었고, 상청 용액은 흑색의 검(gum)과 같은 물질로부터 따라졌다. 불용성 물질은 디에틸에테르로 완전히 세척되었고, 결합된 유기 상들은 여과를 위해 실리카 겔(원료 생성물 g 당 10㎝)의 짧은 패드로 통과되었다. 용매들은 노르스름한 오일(1.31g, 96%)로서 무수의 (iv)를 생산하기 위해 진공 내에서 제거되었다. NMR 스펙트럼들은 문헌[2]에 보고된 데이터에 따랐다. HPLC(15분 내에 50% 내지 100% B): t R ＝10.5분.
4-(디(di)-삼차 부틸플루오로실릴(tert-butylfluorosilyl))벤조산(benzoic acid)(v)
실온에서, 1M의 수성 KMnO4(30㎖)가 pH 4.0-4.5에서 (iv)(1.31g, 4.92mmol, 1.0eq.), 삼차 부탄올(30㎖), 디클로로메탄(3.3㎖) 및 1.25M NaH2PO4ㆍH2O 완충액(20㎖)의 혼합물에 첨가되었다. 혼합물은 25분 동안 교반된 후, 5℃까지 냉각되됨에 따라 과잉의 KMnO4(0.78g, 4.92mmol, 1.0eq.)가 첨가되었다. 반응은 이후에 포화 수성 Na2SO3 용액(50㎖)의 첨가에 의해 급랭되었다. 2M의 수성 HCl의 첨가에 따라, MnO2 모두가 용해되었다. 결과적인 용액은 디에틸에테르(3 x 100㎖)로 추출되었다. 결합된 유기 층들은 포화 수성 NaHCO3 용액으로 세척되었고, MgSO4 위에서 건조되었으며, 여과되었고, 백색 고체를 제공하도록 감압 하에서 농축되었으며, 이는 (v)(0.84g, 60%)를 얻기 위해 Et2O/n-헥산으로부터의 재결정(1:3, 12시간 동안)으로 정제되었다. NMR 스펙트럼들은 문헌[2]에 보고된 데이터에 따랐다. HPLC(15분 내에 50% 내지 100% B): t R ＝8.5분.
계획 2: SiFA-BA의 합성: a) TBDMSCl, 이미다졸(DMF); b) tBuLi, 디-삼차 부틸디플루오로실란(THF); c) HCl(MeOH); d) 피리디늄 클로로크로메이트(DCM); e) KMnO4(DCM, 삼차 부탄올, NaH2PO4 완충액).
4) rhPSMA-7.1-7.4의 합성
rhPSMA-7의 네 가지의 다른 이성질체들을 제조하기 위한 첫 번째 합성 단계들은 동일하며, 상술한 표준 Fmoc-SPPS 프로토콜을 적용하고, 수지 결합 Fmoc-D-Orn(Dde)-OH로부터 출발하여 함께 수행된다. DMF(GP3) 내의 20%의 피페리딘으로의 Fmoc 기의 절단(cleavage) 후, (tBuO)EuE(OtBu)2(2.0eq.)가 HOAt(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 DIPEA(6.0eq.)와 4.5시간 동안 결합되었다. DMF(GP4a) 내의 2%의 하이드라진의 혼합물로의 Dde-기의 절단 후, 숙신산 무수물(succinic anhydride)(7.0eq.) 및 DMF 내의 DIPEA(7.0eq.)의 용액이 첨가되었고, 2.5시간 동안 반응을 위해 두어졌다. Fmoc-D-Lys(OtBu)ㆍHCl(2.0eq.)의 결합은 HOAt(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 DIPEA(6.0eq.)의 혼합물을 상기 수지에 첨가하여 이루어졌다. 5분 동안의 예비 활성화 후, DMF 내에 용해된 Fmoc-D-Lys(OtBu)ㆍHCl(2.0eq.)이 첨가되었고, 2.5시간 동안(GP2) 반응을 위해 두어졌다. 후속하여 상기 Fmoc-기의 절단이 DMF(GP3) 내의 20%의 피페리딘의 혼합물을 첨가하여 수행되었다. 최종적으로, 상기 수지는 rhPSMA-7.1-7.4를 합성하기 위해 분할되었다(계획 3).
rhPSMA-7.1(D-Dap-(R)-DOTA-GA):
Fmoc-D-Dap(Dde)-OH(2.0eq.)가 HOAt(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 2,4,6-트리메틸피리딘(trimethylpyridine)(6.7eq.)의 혼합물 내에서 예비 활성화되었고, 수지-결합 펩티드에 2.5시간 동안 첨가되었다. 후속하여 직교 Dde-탈보호화가 NMP 및 DMF의 혼합물 내에 용해된 이미다졸 및 하이드록실아민 하이드로클로라이드를 사용하여 3시간 동안 이루어졌다. SiFA-BA(1.5eq.)는 DMF 내의 활성화 시약들로서 HOAt(1.5eq.), TBTU(1.5eq.) 및 DIPEA(4.5eq.)를 갖는 측쇄의 유리 아민과 2시간 동안 반응되었다. 피페리딘(GP3)으로의 Fmoc-탈보호화 후, (R)-DOTA-GA(tBu)4(2.0eq.)가 HOAT(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 2,4,6-트리메틸피리딘(6.7eq.)과 2.5시간 동안 결합되었다. 산 불안정 보호기(acid labile protecting group)들의 동시 탈보호화로 상기 수지로부터의 절단이 GP5에 따라 TFA 내에서 수행되었다. 펩티드의 natGa-복합화가 GP6에 설명된 바와 같이 수행되었다.
rhPSMA-7.2(L-Dap-(R)-DOTA-GA):
Fmoc-L-Dap(Dde)-OH(2.0eq.)가 HOAt(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 2,4,6-트리메틸피리딘(6.7eq.)의 혼합물 내에서 2.5시간 동안 예비 활성화되었다. 이어서 직교 Dde-탈보호화, SiFA-BA의 결합 및 Fmoc-절단이 rhPSMA-7.1에 대해 설명한 바와 같이 수행되었다. (R)-DOTA-GA(tBu)4(2.0eq.)가 HOAT(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 2,4,6-트리메틸피리딘(6.7eq.)과 2.5시간 동안 결합되었다. 산 불안정 보호기들의 동시 탈호보화로 상기 수지로부터의 절단이 GP5에 따라 TFA 내에서 수행되었다. 펩티드의 natGa-복합화는 GP6에 설명된 바와 같이 수행되었다.
rhPSMA-7.3(D-Dap-(S)-DOTA-GA):
Fmoc-D-Dap(Dde)-OH(2.0eq.)가 HOAt(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 내의 2,4,6-트리메틸피리딘(6.7eq.)의 혼합물 내에서 2.5시간 동안 예비 활성화되었다. 후속하여 직교l Dde-탈보호화, SiFA-BA의 결합 및 Fmoc-절단이 rhPSMA-7.1에 대해 설명한 바와 같이 수행되었다. (S)-DOTA-GA(tBu)4(2.0eq.)는 HOAT(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 2,4,6-트리메틸피리딘(6.7eq.)과 2.5시간 동안 결합되었다. 산 불안정 보호기들의 동시 탈보호화로 상기 수지로부터의 절단이 GP5에 따라 TFA 내에서 수행되었다. 펩티드의 natGa-복합화는 GP6에서 설명한 바와 같이 수행되었다.
rhPSMA-7.4(L-Dap-(S)-DOTA-GA):
Fmoc-L-Dap(Dde)-OH(2.0eq.)가 HOAt(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 2,4,6-트리메틸피리딘(6.7eq.)의 혼합물 내에서 2.5시간 동안 예비 활성화되었다. 후속하는 직교 Dde-탈보호화, SiFA-BA의 결합 및 Fmoc-절단은 rhPSMA-7.1에 대해 설명한 바와 같이 수행되었다. (S)-DOTA-GA(tBu)4(2.0eq.)가 HOAT(2.0eq.), TBTU(2.0eq.) 및 DMF 내의 2,4,6-트리메틸피리딘(6.7eq.)과 2.5시간 동안 결합되었다. 산 불안정 보호기들의 동시 탈보호화로 상기 수지로부터의 절단이 GP5에 따라 TFA 내에서 수행되었다. 펩티드의 natGa-복합화는 GP6에서 설명한 바와 같이 수행되었다.
rhPSMA-7.1:
HPLC(15분 내에 10% 내지 70% B): t R ＝10.5분.
HPLC(40분 내에 25% 내지 35%B): t R ＝31.4분.
rhPSMA-7.2:
HPLC(15분 내에 10% 내지 70% B): t R ＝10.4분.
HPLC(40분 내에 25% 내지 35%B): t R ＝27.9분.
rhPSMA-7.3:
HPLC(15분 내에 10% 내지 70% B): t R ＝10.4분.
HPLC(40분 내에 25% 내지 35%B): t R ＝28.1분.
rhPSMA-7.4:
HPLC(15분 내에 10% 내지 70% B): t R ＝10.5분.
HPLC(40분 내에 25% 내지 35% B): t R ＝29.1분.
rhPSMA-7.1-7.4:
계산된 단일 동위 원소 질량(C63H96FGaN12O25Si): 1536.6, 파운드(found): m/z＝1539.4[M+H]+, 770.3[M+2H]2+.
계획 3: rhPSMA-7.1-7.4의 합성: a) 20%의 피페리딘, (DMF); b) (tBuO)EuE(OtBu)2, HOAt, TBTU, DIPEA, (DMF); c) 2%의 하이드라진, (DMF); d) 숙신산 무수물, DIPEA, (DMF); e) Fmoc-D-Lys(OtBu)ㆍHCl, HOAt, TBTU, DIPEA, (DMF); f1) Fmoc-D-Dap(Dde)-OH, HOAt, TBTU, 2,4,6-콜리딘, (DMF); f2) Fmoc-L-Dap(Dde)-OH, HOAt, TBTU, 2,4,6-콜리딘, (DMF); g) 이미다졸, 하이드록실아민 하이드로클로라이드, (NMP, DMF); h) SiFA-BA, HOAt, TBTU, DIPEA, (DMF); i1) (R)-DOTA-GA(tBu)4, HOAt, TBTU, 2,4,6-콜리딘, (DMF); i2)(S)-DOTA-GA(tBu)4, HOAt, TBTU, 2,4,6-콜리딘, (DMF); j) 절단 및 탈보호화: TFA, TIPS, H2O; k) Ga(NO3)3, (tBuOH, H2O).
5)
18
F-표지
18F-표지를 위해 앞서 공개한 절차가 적용되었지만, 약간 변형되었다. 요약하면, 수성의 18F-가 SAX 카트리지(셉-팩 아셀 플러스(Sep-Pak Accell Plus) QMA 카르보네이트 라이트(Carbonate light))로 통과되었고, 10㎖의 물로 예비 조절되었다. 10mL의 공기로 건조한 후, 20㎖의 공기가 수반된 10㎖의 무수 아세토니트릴(acetonitrile)로 상기 카트리지를 세정하여 물이 제거되었다. 18F는 500㎕의 무수 아세토니트릴 내에 용해된 100μmol의 [K+⊂2.2.2]OH-로 용리되었다. 표지 전에, 무수 아세토니트릴(1M, 30㎕) 내의 30μmol의 옥살산이 첨가되었다. 이러한 혼합물은 10nmol-25nmol의 PSMA-SiFA(무수 DMSO 내의 1mM)의 플루오르화(fluorination)를 위해 전체 또는 부분 표본으로 사용되었다. 결과적인 반응 혼합물은 5분 동안 실온에서 배양되었다. 상기 추적자의 정제를 위해, 셉-팩 C18 라이트 카트리지는 10㎖의 EtOH로 예비 조절되었고, 이어서 10㎖의 H2O가 첨가되었다. 표지 혼합물은 9㎖의 PBS(pH 3)로 희석되었고, 10㎖의 H2O가 수반되어 상기 카트리지로 통과되었다. 상기 펩티드는 500㎕의 물속의 EtOH의 4:1 혼합물(v/v)로 희석되었다. 표지 화합물의 방사 화학적 순도는 방사성 RP-HPLC 및 방사성-TLC(실리카 겔 60 RP-18 F254s, 이동 상(mobile phase): 10%의 2M의 수성 NaOAc 및 1%의 TFA로 보강된 H2O 내의 MeCN의 3:2 혼합물(v/v))에 의해 결정되었다.
6)
125
I-표지
생체 외 연구들을 위한 기준 리간드 ([125I]I-BA)KuE가 앞서 공개한 절차에 따라 제조되었다. 요약하면, 0.1㎎의 the stannylated 전구체 (SnBu3-BA)(OtBu)KuE(OtBu)2가 20㎕의 과산화아세트산(peracetic acid), 5.0㎕(21MBq)의 [125I]NaI(74TBq/mmol, 3.1GBq/㎖, 40mM NaOH, 하르트만 어낼리틱(Hartmann Analytic), 브라운슈바이크, 독일), 20㎕의 MeCN 및 10㎕의 아세트산을 포함하는 용액 내에 용해되었다. 반응 용액은 10분 동안 실온(RT)에서 배양되었고, 카트리지 상에 적재되었으며, 10㎖의 물로 세정되었다(C18 셉-팩 플러스 카트리지, 10㎖의 MeOH 및 10㎖의 물로 예비 조절됨). 2.0㎖의 EtOH/MeCN의 1:1 혼합물(v/v)로의 용리 후, 방사성 용액은 부드러운 질소 스트림 하에서 건조까지 증발되었고, 후속되는 TFA의 증발과 함께 30분 동안 200㎕의 TFA로 처리되었다. ([125I]I-BA)KuE의 원료 생성물은 RP-HPLC에 의해 정제되었다(20분 내에 20% 내지 40% B): t R ＝13.0분.
생체 외 실험들
1) IC
50
의 결정
PSMA-양성 LNCaP 세포들은 10%의 소 태아 혈청으로 보강된 둘베코 변형 이글 배지(Dublecco modified Eagle medium)/글루타맥스(Glutamax)-I(1:1)로의 영양 혼합물(인비트리곤(Invitrigon)) 내에서 성장되었고, 37℃에서 가습된 5%의 CO2 분위기 내에서 유지되었다. PSMA 친화도(IC50)의 결정을 위해, 세포들은 실험 이전에 24±2시간에서 수확되었고, 24-웰(well) 플레이트들 내에 파종되었다(1㎖/웰 내에 1.5 x 105 세포들). 배양 배지의 제거 후, 상기 세포들은 500㎕의 HBSS(1%의 소 혈청 알부민(BSA)이 첨가된 한스 평형 염류 용액(Hank's balanced salt solution), 바이오크롬(Biochrom), 베를린, 독일)로 한 번 처리되었고, 200㎕의 HBSS(1%의 BSA) 내에서의 평형을 위해 얼음 위에 15분 동안 두어졌다. 다음에, HBSS(1%의 BSA, 대조군) 또는 농도를 증가시키는 각각의 리간드(HBSS 내의 10-10-10-4M)를 함유하는 웰 당 25㎕의 용액들이 HBSS(1%의 BSA) 내의 25㎕의 ([125I]I-BA)KuE(2.0nM)의 후속되는 첨가와 함께 첨가되었다. 모든 실험들은 각 농도에 대해 실험들이 적어도 세 번 수행되었다. 얼음 위에서 60분의 배양 후, 상기 실험은 상기 배지의 제거 및 200㎕의 HBSS로의 후속하는 세정에 의해 종료되었다. 양 단계들의 배지는 하나의 부분으로 결합되었고, 유리 방사성 리간드(free radioligand)의 양을 나타낸다. 이후에, 상기 세포들은 250㎕의 1M NaOH로 용해되었고, 후속하는 세척 단계의 200㎕의 HBSS로 결합되었다. 결합 및 유리 방사성 리간드의 정량화는 γ-카운터(counter) 내에서 이루어졌다.
2) 내재화
내재화 연구들을 위해, LNCaP 세포들이 실험 전의 24±2시간에서 수확되었고, 24-웰 플레이트들 내에 파종되었다(1㎖/웰 내에 1.25 x 105 세포). 배양 배지의 제거에 이어서, 세포들은 500㎕의 DMEM-F12(5%의 BSA)로 한 번 세척되었고, 200㎕의 DMEM-F12(5%의 BSA) 내에 37℃에서 적어도 15분 동안 평형이 되도록 두어졌다. 각 웰은 차단(blockade)을 위해 25㎕의 DMEM-F12(5%의 BSA) 또는 100μM의 PMPA 용액으로 처리되었다. 다음에, 25㎕의 68Ga/18F-표지 PSMA 억제제(inhibitor)(5.0nM)가 첨가되었고, 상기 세포들은 37℃에서 60분 동안 배양되었다. 실험은 24-웰 플레이트를 얼음 위에 3분 동안 배치하고, 상기 배지의 후속되는 제거로 종료되었다. 각 웰은 250㎕의 HBSS로 세정되었고, 이들 처음의 두 단계들로부터의 부분들이 결합되었으며, 유리 방사성 리간드의 양을 나타낸다. 표면 결합 활성의 제거는 250㎕의 얼음 냉각된 PMPA(PBS 내에 10μM) 용액으로 5분 동안의 상기 세포들의 배양에 의해 이루어졌고, 다른 250㎕의 얼음 냉각된 PBS로 다시 세정되었다. 내재화된 활성은 250㎕의 1.0M NaOH로의 후속하는 세척 단계의 일부와 함께 250㎕의 1M NaOH 내에서의 세포들의 배양에 의해 결정되었다. 각 실험(대조군 및 차단)은 삼중으로 수행되었다. 최종적으로, 표면 결합 및 내재화된 활성은 γ-카운터 내에서 정량화되었다. 모든 내재화 연구들은 유사하게 수행되었던 ([125I]I-BA)KuE(c＝0.2nM)을 이용하는 참조 연구들에 의해 이루어졌다. 데이터는 비특이적 내재화를 위해 수정되었고, 방사 요오드화 기준 화합물에 대해 관찰된 특이적 내재화에 대해 정규화되었다.
3) 옥탄올-물 분배 계수
대략 1MBq의 표지(표지 추적자)가 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 내에서 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 및 n-옥탄올의 1mL의 1:1 혼합물(부피로) 내에 용해되었다. 실온에서 3분 동안 서스펜션을 격렬하게 혼합한 후, 바이알(vial)은 15,000g에서 3분 동안 원심 분리되었고(바이로퓨지(Biofuge) 15, 헤라우스 세파테크(Heraus Sepatech), 오스테로드, 독일), 두 층들의 100㎕의 부분 표본들이 감마 카운터(gamma counter) 내에서 측정되었다. 상기 실험은 적어도 여섯 번 반복되었다.
4) HSA 결합
HSA 결합을 결정하기 위해, 키랄팩(Chiralpak) HSA 칼럼(50 x 3㎜, 5㎛, H13H-2433)이 0.5㎖/min의 일정한 유량으로 사용되었다. 이동 상(A: NH4OAc, 물속에 50mM, pH 7 및 B: 이소프로판올)이 각 실험에 대해 새롭게 제조되었고, 하루 동안만 사용되었다. 상기 칼럼은 실온에서 유지되었고, 각각의 진행은 획득 시간을 감소시키는 신호의 검출 후에 중단되었다. 모든 물질들은 50%의 2-프로판올 및 50%의 50mM pH 6.9의 아세트산암모늄 완충제 내에 0.5㎎/㎖의 농도로 용해되었다. 선택된 기준 물질들은 상기 펩티드들에 관해 폭넓게 다양한 알부민 결합이 추정되었기 때문에 13%부터 99%까지의 HSA 결합의 범위를 나타낸다. 모든 아홉의 기준 물질들이 OriginPro 2016G로의 비선형 회귀(non-linear regression)를 구현하도록 연속하여 주입되었다.
| 기준 | t R | 로그 t R | Lit. HSA% | 로그 K HSA |
| p-벤질알코올 | 2.40 | 0.38 | 13.15 | -0.82 |
| 아닐린 | 2.72 | 0.43 | 14.06 | -0.79 |
| 페놀 | 3.28 | 0.52 | 20.69 | -0.59 |
| 벤조산 | 4.08 | 0.61 | 34.27 | -0.29 |
| 카르바마제핀 | 4.15 | 0.62 | 75.00 | 0.46 |
| p-니트로페놀 | 5.62 | 0.75 | 77.65 | 0.52 |
| 에스트라디올 | 8.15 | 0.91 | 94.81 | 1.19 |
| 프로베네시드 | 8.84 | 0.95 | 95.00 | 1.20 |
| 길리벤클라미드 | 29.18 | 1.47 | 99.00 | 1.69 |
정체 시간은 수행된 실험에 대해 예시적으로 나타냄; tR 정체 시간; Lit. [%]로의 인간 혈청 알부민 결합의 HSA 문헌 값; 로그 K HAS 인간 혈청 알부민 결합의 로그 K.
생체 내 실험들
모든 동물 실험들은 독일의 일반적인 동물 복지 규정들 및 동물의 보호 및 이용에 대한 연구 가이드라인들에 따라 수행되었다. 종양 이종이식편(xenograft)들을 구현하기 위해, LNCaP 세포들(107 세포/200㎕)이 둘베코 변형 이글 배지/글루타맥스-I(1:1)를 갖는 영양 혼합물 및 매트리겔(Matrigel)(BD 바이오사이언스즈(Biosciences), 독일)의 1:1 혼합물(v/v) 내에 현탁되었고, 6주-8주 연령의 CB17-SCID 마우스들(찰스 리버(Charles River), 술츠펠트, 독일)의 오른쪽 어깨 위로 피하로 접종되었다. 마우스들은 종양들이 5㎜-8㎜의 직경까지 성장되었을 때(접종 후 3주-4주)에 이용되었다.
1) 생물 분포
대략 1-2MBq(＜0.2nmol)의 상기 18F-표지 PSMA 억제제가LNCaP 종양이 있는 수컷 CB-17 SCID 마우스들의 꼬리 정맥 내로 주사되었고, 주사 이후의 1시간 후에 희생되었다(n＝4-5). 선택된 기관들은 제거되었고, 계량되었으며, γ-카운터 내에서 측정되었다.
2) 대사 작용 연구들
a) 분석 설정
분석 역상 고압 크로마토그래피(RP-HPLC)가 SPD-20A UV/Vis 검출기(220㎚, 254㎚)를 구비한 쉬마드주 구배 시스템(gradient system)들(쉬마드주 도이칠란드사, 노이파른, 독일)을 이용하여 수행되었다. 물토스퍼(Multospher) 100 RP18(125 x 4.6㎜, 5㎛의 입자 크기) 칼럼(씨에스사, 랑게르베헤, 독일)이 1㎖/분의 유량에서 분석적 측정들을 위해 이용되었다. 모든 HPLC 조작들을 위한 용리제들은 모두 0.1%의 트리플루로오 아세트산을 함유하는 물(용매 A) 및 아세토니트릴(용매 B)였다. 방사능은 HERM LB 500 검출기(베르톨트 테크놀로지즈사(Berthold Technologies GmbH), 바트 빌드바트, 독일)에 대한 UV-광도계(photometer)의 배출구의 연결을 통해 검출되었다. 모든 HPLC 작업들에 대한 구배는 5% B 등용매(isocratic) 0분-3분, 25%-35% B 3분-43분, 95%-95% B 43분-48분이었다.
방사성 박층 크로마토그래피를 위해, 실리카 겔 60 RP-18 F254s로 코팅된 알루미늄 시트들이 10%의 2M 수성 NaOAc 및 1%의 TFA로 보충된 H2O 내의 MeCN의 3:2 혼합물(v/v)로 구성된 이동상과 함께 사용되었다. 분석은 스캔-램(Scan-RAM) 방사성-TLC 검출기(햅로직 시스템즈사(LabLogic Systems Ltd.), 셰필드, 영국) 또는 CR 35 BIO 포스포이미저(phosphorimager)(두에르 메디칼사(Duerr Medical GmbH), 비트그하임-비징겐, 독일)를 이용하여 수행되었다.
b) rhPSMA 7.1-7.4의 대사 안정성의 결정
생체 내 대사 작용 연구들을 위해, 8-12MBq(＜0.6nmol)의 각각의 18F-표지 리간드(rhPSMA 7.1-7.4)가 암컷의 건강한 CB17-SCID 마우스들(n＝4)의 꼬리 정맥 내로 주사되었다. 마우스들은 마취 하에서 30분 동안 두어졌고, 오줌이 방광 카테터를 이용하여 수집되었다. 오줌 샘플들이 모아였고, 현탁된 고체들을 제거하기 위해 5분 동안 9000rpm로 원심 분리되었다. 상청액은 앞서 언급한 조건들로 방사성-HPLC 분석을 위해 직접 사용되었다. 펩티드-결합 18F와 19F의 동위 원소 교환이 오줌 내에서 일어나는 것을 입증하기 위해, 각 화합물은 암컷의 건강한 CB-17-SCID 마우스들의 오줌 샘플들로 특정한 시간 간격들 동안 배양되었고, 방사성-HPLC 및/또는 방사성-TLC에 의해 분석되었다. 또한, 이러한 실험은 과잉의 Na19F(0.5μmol)의 첨가 및 18F-표지 rhPSMA-7.3으로의 2시간 동안의 배양으로 수행되었다.
c) rhPSMA-7.1-7.4의 생체 내 분포의 결정
각 이성질체(rhPSMA 7.1-7.4)의 상대적 흡수를 정량화하기 위해, 종양이 있는 수컷 CB-17-SCID 마우스에 rhPSMA-7(180-280 MBq, S A ＝247-349GBq/μmol, 완전히 자동화된 절차로 클리니쿰 레흐트 데르 이자르(Klinikum rechts der Isar)에서 생산됨)의 라세미 혼합물과 함께 주사되었다. 동물은 마취 하에서 30분 동안 두어졌고, 희생되었다. 오줌, 혈액, 간, 신장 및 종양이 수집되었고, 이후에 상술한 절차들에 따라 처리되었다. 상기 오줌 샘플은 깨끗한 용액을 생산하도록 5분 동안 9000rpm으로 원심 분리되었고, 방사성-HPLC 분석이 직접적으로 수행되었다. 혈액은 1㎖의 H2O로 희석되었고, 13000g에서 5분 동안 원심 분리되었다. 상청액이 수집되었고, 스트라타(Strata) X 카트리지 상에 적재되었다(33㎛ 폴리머 역상 500㎎, 5㎖의 MeOH로 예비 조절됨, 5㎖의 H2O가 수반됨). 5㎖의 H2O로의 세척 후, 상기 카트리지는 1%의 TFA로 보충된 H2O 내의 MeCN의 6:4 혼합물(v/v)로 용리되었다. 용출물(eluate)은 물로 희석되었고, 방사성-HPLC에 의해 분석되었다. 종양, 신장 및 간은 포터-엘베햄(Potter-Elvehjem) 조직 분쇄기(tissue grinder)(콘테스 글라스사(Kontes Glass Co), 바인랜드, 미국) 또는 MM-400 볼 밀(레슈사(Retsch GmbH), 한, 독일)을 이용하여 균질화되었다.
I) 포터-엘베햄 조직 분쇄기
종양과 신장은 1㎖의 추출 완충액(850㎕의 1M HEPES pH7.4, 100㎕의 20mM PMPA 및 100㎕의 1M NaCl)으로 30분 동안 조직 균질기(homogenizer) 내에서 균질화되었다. 결과적인 균질물(homogenate)이 수집되었고, 13000g에서 5분 동안 원심 분리되었다. 후속하여 상청액이 수집되었고, 다시 원심 분리(13000g, 5분)되었으며, 스트라타 X 카트리지 상에 적재되었다(33㎛ 폴리머 역상 500㎎, 5㎖의 MeOH로 예비 조절됨, 5㎖의 H2O가 수반됨). 5㎖의 H2O로의 세척 후, 상기 카트리지는 1%의 TFA가 보충된 H2O 내의 MeCN의 6:4 혼합물(v/v)로 용리되었다. 각 기관의 용출물은 물로 희석되었고, 방사성-HPLC로 분석되었다.
II) MM-400 볼 밀
기관들(종양, 신장, 간)은 3개의 분쇄 볼(3㎜의 직경) 및 1㎖의 추출 완충액(850㎕의 1M HEPES pH7.4, 100㎕의 20mM PMPA 및 100㎕의 1M NaCl)로 30Hz에서 10분 동안 함께 2㎖의 튜브 내에서 별도로 균질화되었다. 균질물은 13,000g에서 5분 동안 원심 분리되었고, 상청액이 수집되었다. 후속하여, 펠릿(pellet)은 1㎖의 추출 완충액 내에 현탁되었고, 상기 볼 밀로 30Hz에서 10분 동안 균질화되었다. 원심 분리(13000g, 5분) 후, 두 상청액들이 결합되었고, 스트라타 X 카트리지 상에 적재되었다(33㎛ 폴리머 역상 500㎎, 5㎖의 MeOH로 예비 조절됨, 5㎖의 H2O가 수반됨). 5㎖의 H2O로의 세척 후, 상기 카트리지는 1%의 TFA로 보충된 H2O 내의 MeCN의 6:4 혼합물(v/v)로 용리되었다. 각 기관의 용출물은 물로 희석되었고, 방사성-HPLC로 분석되었다. 카트리지 적재 동안의 돌파가 결합되지 않은 F-18의 결과가 되지 않는 것을 입증하기 위해, 상기 상청액도 원심 분리 후에 방사성-TLC에 의해 조사되었다.
최종적으로, 개별적인 이성질체들의 비율들이 추출된 샘플들의 HPLC 프로파일들로부터 결정되었고, rhPSMA-7의 라세미 혼합물의 품질 관리로부터의 이성질체들의 비율들과 비교되었다. 추출 및 카트리지 적재-효율뿐만 아니라 조사된 샘플들의 전체적인 추출 활성으로 보정된 붕괴는 표 2에 나타나있다. 상기 카트리지 용리-효율은 모든 실험들에 대해 ＞99%이었다.
실시예 2: 결과들
크로마토그래프 피크 할당
크로마토그래프 피크 할당은 다음의 UV 프로파일들의 비교에 의해 수행되었다.
a) 상기 rhPSMA7-rac 혼합물
b) 각 거울상 이성질체rhPSMA7 화합물과 함께 주사된 상기 rhPSMA7-rac 혼합물.
다음의 명칭들이 다른 이성질체들에 대해 사용된다.
rhPSMA-rac: [19F][natGa]D/L-Dap-R/S-DOTAGA-rhPSMA7
rhPSMA-7-1: [19F][natGa] D -Dap- R -DOTAGA-rhPSMA7
rhPSMA-7-2: [19F][natGa] L -Dap- R -DOTAGA-rhPSMA7
rhPSMA-7-3: [19F][natGa] D -Dap- S -DOTAGA-rhPSMA7
rhPSMA-7-4: [19F][natGa] L -Dap- S -DOTAGA-rhPSMA7
| 리간드 | 명칭 | t R [분] | 전체 혼합물의 통상적인 퍼센티지 |
| [19F][natGa] D -Dap- R -DOTAGA-rhPSMA7 | rhPSMA-7-1 | 31.6 | 21 |
| [19F][natGa] L -Dap- R -DOTAGA-rhPSMA7 | rhPSMA-7-2 | 28.3 | 22 |
| [19F][natGa] D -Dap- S -DOTAGA-rhPSMA7 | rhPSMA-7-3 | 28.9 | 37 |
| [19F][natGa] L -Dap- S -DOTAGA-rhPSMA7 | rhPSMA-7-4 | 30.1 | 20 |
결합 친화도들
첫 번째 세트의 값들(rhPSMA-7.1 및 rhPSMA-7.2; 도 6a)이 각각의 리간드의 natGa-복합화 후에 직접적으로 얻어진 계열 희석 용액을 이용하여 결정되었다. 두 번째 데이터 세트(도 6b)에서 상기 복합화된 리간드들은 복합화되지 않은 natGa-염들을 분리하기 위해 RP-HPLC에 의해 정제되었다. 관찰된 상당한 차이는 존재하지 않았기 때문에, 두 계열들은 합쳐졌고, 평균값들(±SD)의 계산을 위해 이용되었다.
| No | rhPSMA7.1 | rhPSMA7.2 | rhPSMA7.3 | rhPSMA7.4 |
| 1 | 8.74 | 3.17 | nd | nd |
| 2 | 6.91 | 2.97 | nd | nd |
| 3 | 7.27 | 3.36 | nd | nd |
| 4 | 5.04 | 2.64 | 3.17 | 3.4 |
| 5 | 1.21(*) | 2.76 | 2.91 | 3.56 |
| 6 | 7.11 | 3.94 | 5.35 | 2.79 |
| 7 | 8.31 | 5.8 | 5.74 | 4.57 |
| 8 | 4.97 | 4.31 | 4.59 | 3.78 |
| 9 | 6.44 | 4.32 | 4.45 | nd |
| 평균 | 6.85 | 3.70 | 4.37 | 3.62 |
| SD | 1.36 | 1.01 | 1.14 | 0.65 |
* 상기 rhPSMA7.1 시리즈들의 값 번호 5는 삭제되었다(통계 이상점).
| No | 억제제 | IC 50 [nM] |
| 1 | (I-BA)KuE | 7.1±2.4nM |
| 2 | DCFPyL | 12.3±1.2nM |
| 3 | DKFZ1007 | 4.2±0.5nM |
* 동일한 결합 분석을 이용하여 본 발명자들의 실험실에서 수행됨(Robu 등의 "EJNMMI Research"(2018; 8: 30)).
내재화 연구들
| rhPSMA7.1 | rhPSMA7.2 | rhPSMA7.3 | rhPSMA7.4 | |
| 1 | 61.8 | 188.7 | 156.6 | 209.6 |
| 1 | 70.6 | 182.7 | 156.0 | 202.6 |
| 1 | 68.0 | 169.5 | 171.7 | 209.8 |
| 1 | 67.9 | 205.3 | - | - |
| 1 | 71.5 | 212.6 | - | - |
| 1 | 77.5 | 192.3 | - | - |
| 평균 | 69.55 | 191.83 | 161.41 | 207.33 |
| SD | 5.19 | 15.54 | 8.88 | 4.06 |
| No | 억제제 | 내재화[%] |
| 1 | PSMA-1007 | 118±4 |
| 2 | DCFPyL | 118±5 |
* 본 발명자들의 실험실에서 동일한 결합 분석을 이용하여 수행됨(Robu 등의 "EJNMMI Research"(2018; 8: 30)).
친유성들(옥탄올-물 분배 계수)
상기 로그 P 값들의 결정은 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 및 n-옥탄올(＝로그 Poct/PBS) 내에서 수행되었다.
| rhPSMA7.1 | rhPSMA7.2 | rhPSMA7.3 | rhPSMA7.4 | rhPSMA7-rac | |
| 1 | -2.79 | -3.00 | -3.03 | -3.09 | -3.23 |
| 2 | -2.82 | -3.01 | -3.08 | -3.12 | -3.15 |
| 3 | -2.80 | -3.00 | -3.07 | -3.06 | -3.17 |
| 4 | -2.84 | -3.00 | -3.02 | -3.07 | -3.10 |
| 5 | -2.88 | -3.03 | -3.06 | -3.10 | -3.17 |
| 6 | -2.90 | -2.96 | -3.07 | -3.04 | -3.24 |
| 7 | -2.85 | -2.94 | -3.06 | -2.99 | -3.80 |
| 8 | -2.86 | -2.89 | -2.86 | -2.97 | -3.60 |
| 9 | -3.14 | -3.02 | -3.39 | -3.37 | -3.87 |
| 10 | -3.29 | -3.02 | -3.33 | -3.43 | -3.61 |
| 11 | -3.26 | -3.06 | -3.34 | -3.29 | -3.76 |
| 12 | -3.02 | -3.02 | -3.34 | -3.48 | -3.65 |
| 13 | -3.15 | -2.99 | -3.20 | -3.52 | -3.67 |
| 14 | -3.57 | -3.02 | -3.39 | -3.50 | - |
| 15 | -3.40 | -3.06 | -3.40 | -3.44 | - |
| 16 | -3.32 | -3.14 | -3.41 | -3.41 | - |
| 17 | -3.64 | -3.40 | -3.48 | -3.56 | - |
| 18 | -3.92 | -3.50 | -3.49 | -3.61 | - |
| 19 | - | -3.45 | -3.32 | -3.58 | - |
| 20 | - | -3.45 | -3.45 | -3.54 | - |
| 21 | - | -3.53 | -3.53 | -3.42 | - |
| 22 | - | -3.48 | -3.43 | -3.57 | - |
| 23 | - | - | -3.56 | -3.67 | - |
| 평균 | -3.14 | -3.13 | -3.26 | -3.33 | -3.46 |
| SD | 0.34 | 0.22 | 0.19 | 0.22 | 0.29 |
| 억제제 | 로그 P |
| PSMA-1007 | -1.6 |
| DCFyL | -3.4 |
| natGa-18F-rhPSMA7-rac, | -3.46±0.29 |
| 68Ga-natF-rhPSMA7-rac | |
| natGa-18F-rhPSMA7.1 | -3.14±0.34 |
| natGa-18F-rhPSMA7.2 | -3.13±0.22 |
| natGa-18F-rhPSMA7.3 | -3.26±0.19 |
| natGa-18F-rhPSMA7.4 | -3.33±0.22 |
인간 혈장 단백질에 대한 PSMA 억제제들의 결합
| 억제제 | HSA 결합[%] |
| PSMA-1007 | 97.8 |
| DCFyL | 14.3 |
| 68Ga-natF-rhPSMA7-rac | 96.7 |
| natGa-18F-rhPSMA7.1 | 97.7 |
| natGa-18F-rhPSMA7.2 | 97.8 |
| natGa-18F-rhPSMA7.3 | 96.9 |
| natGa-18F-rhPSMA7.4 | 96.6 |
1시간 p.i.에서의 [
18
F][
nat
Ga]rhPSMA7.1-7.4의 생물 분포
| [18F][natGa]-rhPSMA-7-1 | [18F][natGa]-rhPSMA-7-2 | [18F][natGa]-rhPSMA-7-3 | [18F][natGa]-rhPSMA-7-4 | [18F][natGa]-rhPSMA-rac | |
| 혈액 | 0.53±0.13 | 0.56±0.20 | 0.96±0.24 | 1.15±0.30 | 1.1±0.03 |
| 심장 | 0.53±0.03 | 0.32±0.13 | 0.87±0.17 | 0.71±0.26 | 0.69±0.07 |
| 폐 | 1.1±0.21 | 0.89±0.38 | 2.2±0.35 | 1.59±0.61 | 1.4±0.17 |
| 간 | 0.75±0.62 | 0.35±0.08 | 0.69±0.13 | 0.69±0.20 | 0.67±0.07 |
| 지라 | 20.0±4.2 | 10.1±6.3 | 16.6±2.6 | 18.4±9.77 | 11.1±2.3 |
| 췌장 | 0.45±0.12 | 0.21±0.08 | 0.63±0.44 | 0.50±0.30 | 0.60±0.10 |
| 위 | 0.28±0.17 | 0.19±0.08 | 0.44±0.23 | 0.25±0.06 | 0.49±0.07 |
| 장 | 0.30±0.16 | 0.18±0.07 | 0.35±0.07 | 0.37±0.09 | 0.60±0.27 |
| 신장 | 220±24.8 | 87.6±28.8 | 292±45.1 | 153±80.3 | 71.3±13.3 |
| 부신 | 2.0±0.25 | 1.3±0.8 | 2.2±0.83 | 3.57±2.38 | 3.0±0.45 |
| 근육 | 0.32±0.30 | 0.13±0.07 | 0.33±0.15 | 0.31±0.08 | 0.36±0.06 |
| 뼈 | 0.50±0.31 | 0.31±0.24 | 0.38±0.32 | 0.62±0.30 | 0.91±0.11 |
| 종양 | 14.1±4.1 | 6.5±2.3 | 18.3±7.2 | 18.9±3.27 | 10.4±0.67 |
경쟁이 있는 1시간 p.i.에서의 [
18
F][
nat
Ga]rhPSMA7.1-7.4의 생물 분포
| [18F][natGa]-rhPSMA-7-1 | [18F][natGa]-rhPSMA-7-2 | [18F][natGa]-rhPSMA-7-3 | [18F][natGa]-rhPSMA-7-4 | |
| 혈액 | 0.86±0.40 | 1.1±0.31 | 0.55±0.14 | 0.82±0.17 |
| 심장 | 0.37±0.16 | 0.47±0.09 | 0.26±0.04 | 0.37±0.05 |
| 폐 | 0.85±0.29 | 1.1±0.32 | 0.69±0.10 | 0.74±0.14 |
| 간 | 0.43±0.07 | 0.46±0.07 | 0.46±0.14 | 0.48±0.14 |
| 지라 | 0.21±0.08 | 0.26±0.07 | 0.35±0.02 | 0.28±0.15 |
| 췌장 | 0.16±0.10 | 0.12±0.05 | 0.11±0.02 | 0.18±0.09 |
| 위 | 0.97±0.81 | 0.21±0.06 | 0.76±0.74 | 0.20±0.07 |
| 장 | 0.66±0.32 | 0.33±0.10 | 0.94±0.97 | 0.36±0.08 |
| 신장 | 10.9±2.5 | 10.9±1.0 | 15.5±2.2 | 7.2±2.4 |
| 부신 | 0.003±0.004 | 0.07±0.10 | 0.07±0.09 | 0.03±0.04 |
| 근육 | 0.17±0.15 | 0.09±0.03 | 0.09±0.02 | 0.20±0.05 |
| 뼈 | 0.33±0.24 | 0.57±0.39 | 0.34±0.22 | 1.0±0.8 |
| 종양 | 0.94±0.22 | 1.0±0.13 | 1.5±0.4 | 0.99±0.19 |
[
18
F]rhPSMA7-rac의 적용 이후의 혈액, 신장, 간, 오줌 및 종양 내의 각 rhPSMA7.x 이성질체의 양의 상대적 변화들의 정량화
LNCaP 종양이 있는 마우스 내로의 [18F]rhPSMA7-rac의 주사 후의 30분에서 혈액, 간, 신장, 오줌 및 종양 내의 각 rhPSMA7 이성질체의 상대적인 변화들을 정량화하기 위한 목적으로써. 두 가지의 다른 균질화 방법들(포터(potter) 및 볼 밀)이 신장, 간 및 종양 조직으로부터 추적자를 추출하기 위해 이용되었다(물질들 및 방법들 참조).
표 12에는 두 균질화 방법들의 관찰된 효율들 및 후속하는 고상 추출 과정의 효율이 요약되어 있다(단백질 부분으로부터 추적자를 분리하기 위한).
| 포터-엘베햄 조직 분쇄기(n＝1) | |||
| 효율[%] | |||
| 샘플 추출 |
SPE 카트리지- 적재 | 전체 | |
| 혈액 | 93 | 93 | 86 |
| 신장 | 91 | 66 | 60 |
| 종양 | 90 | 59 | 53 |
| MM-400 볼 밀(n＝3) | |||
| 효율[%] | |||
| 샘플 추출 |
SPE 카트리지-적재 | 전체 | |
| 혈액 | 98±2 | 94±2 | 92±3 |
| 간 | 97 | 89±2 | 86±2 |
| 신장 | 63±5 | 68±8 | 43±8 |
| 종양 | 64±18 | 65±3 | 42±14 |
상기 포터를 이용한 상기 샘플들로부터의 활성의 추출이 상당히 효율적이었던 반면, 상기 볼 밀의 이용은 실망스러웠다. 그럼에도 불구하고, 상기 볼 밀로도 ＞60% 추출 효율이 달성되었다.
rhPSMA7의 아미드 결합들의 대사성 절단(metabolic cleavage)에 의해 형성될 수 있었던 가능한 종들을 고려하면, 단지 a) 단지 상당히 증가된 친유성을 갖는 종들과 b) F18-불소가 가능한 것으로 보인다. 따라서 원칙적으로, 도 12에 도시한 "iL" 종들이 조직 샘플(수성 추출)로부터 추출되지 않으며, 이에 따라 최종 분석에서 나타나지 않은 것이 가능한 것으로 여겨진다. 그러나, 이러한 종들이 간 및 장 내에서 생체 내로 나타날 수 있었거나(친유성 화합물들의 간담즙성 분비), 혈장 단백질들과 결합되어야 하였던(혈액에 대해 높은 활성 레벨들을 가져왔으며, 한편으로는 우수한 추출 효율 보였던) 점에 유의해야 한다.
라세미 혼합물 내의 각 이성질체의 정량화에 대해서와 특히 좋지 못하게 분리된 첫 번째 및 두 번째 피크(rhPSMA 7.2 및 rhPSMA7.3)에 대해서, 도식적 근사법이 초기에 이용되었다. 이러한 접근 방식은 a) 각 이성질체가 동일한 피크 형상으로 상기 HPLC 칼럼으로부터 용리되며, b) 상이한 다른 피크 높이들이 선형 인자(linear factor)들에 의해 덜 분리된 피크들(즉, rhPSMA 7.2 및 rhPSMA7.3)을 계산하기 위해 첫 번째 근사치로 이용될 수 있는 가정들에 기초하였다.
이들 가정들을 기초로 하여, 첫 번째 분석이 [18F][natGa]rhPSMA7-rac와 결합된 하나의 LNCaP 종양이 있는 마우스들을 이용하여 수행되었다. 셋의 추가적인 실험들에 의해 이들 실험들을 유효하게 하고, 보다 유효한 과정에 의해 상기 도식적 해석들을 향상시키기 위한 목적으로써, 시스타트 소프트웨어(Systat Software) 패키지인 '피크피트(PeakFit)'가 이용되었다. 피크피트는 푸리에 디콘볼루션(Fourier deconvolution)/필터링 알고리즘으로 가우스 응답 함수(Gaussian response function)를 이용하는 디콘볼루션 과정들에 의해 HPLC 용리 프로파일들의 자동화된 비선형 분리, 분석 및 정량화를 가능하게 한다(https://systatsoftware.com/products/peakfit/).
첫 번째 실험들의 도식적 해석의 비교는 상기 도식적 해석이 두 번째 피크(rhPSMA 7.3)를 과대평가하였던 반면, 상기 첫 번째 피크는 과소평가되었던 점을 보여주었다. 이에 따라, 모든 데이터 세트들은 피크피트(PeakFit)에 의해 재분석되었고, 정량화되었다.
30분 p.i.에서의 종양이 있는 마우스들 내의 4가지의 독립 실험들의 HPLC-분석
1. 방사성-HPLC에 의한 피크 3 및 4(rhPSMA 7.4 및 rhPSMA 7.1)의 평가
상기 디콘볼루션 기술이 양호한 분리를 가지는(비록 이들이 기준선을 분리되지는 않지만) 적어도 두 피크들(rhPSMA 7.4 및 7.1)에 대해 유사한 데이터를 보이는 지가 우선 조사되었다.
2. 방사성-HPLC에 의한 모든 피크들(rhPSMA7.1, 7.2, 7.3 및 7.4)의 평가
도 14a 및 도 14b에는 주사된 용액([18F][natGa]rhPSMA7-rac) 내의 그 퍼센티지에 대하여 주어진 샘플 내에서의 각각의 rhPSAM7.n 이성질체의 퍼센티지 변화가 요약되며, 개별적인 실험에 대한 결과들은 도 14에 도시된다. 각 이성질체의 비율은 시스타트(Systat) '피크피트(PeakFit)'에 의한 HPLC 용리 프로파일의 분석에 의해 정량화되었다. 후속하여, 주사된 용액 내의 그 퍼센티지에 대한 주어진 샘플 내의 각 이성질체의 퍼센티지 변화가 계산되었다.
3. HPLC 데이터의 논의
균질화(신장, 간, 종양)되거나 희석된(혈액) 조직들 및 후속하여 상기 고상 추출 카트리지 상에 고정되고 이로부터 용리된 조직들로부터 추출된 방사능의 방사성-HPLC 분석은 대사 불안정성의 징후를 보이지 않았다. 따라서 친유성 대사성 조각(fragment)들은 관찰되지 않았다. F-18 불소가 샘플 제조를 위해 이용된 조건들 하에서의 HPLC에 의해서는 정확하게 검출될 수 없는 점에 유의해야 한다(TLC 분석 참조).
비록 상기 D-Dap-유도체 rhPSMA7.1 및 7.3을 향하는 분명한 경향이 존재하지만, 전체적인 변화들은 낮았다(최대 15%). 또한, 본문에서 강조되는 도 15 및 도 16에 절대 흡수 값들을 고려하지 않고 "상대적인 변화들"이 도시되는 점도 중요하다.
비록 rhPSMA7.1이 모든 rhPSMA7 화합물들의 가장 약한 친화도와 내재화를 가지지만, 이는 혈액, 간, 신장 및 종양 내에서 가장 큰 양의 퍼센티지 변화를 보인다.
비록 이러한 결과에 대한 원인이 분명하지는 않지만, 심지어 상기 볼 밀로의 조직 샘플들의 균질화도 정량적인 세포 파괴를 가져오지 않았던 점을 추측할 수 있을 것이다. 이에 따라, 가장 높은 내재화를 가지는 rhPSMA7 추적자들(rhPSMA7.2: 191.83%±15.54%, rhPSMA7.4: 207.33±4.06% 및 rhPSMA7.3: 161.41%±8.88%)은 덜 효과적인 방식으로 추출될 수 있었던 반면, 단지 69.55%±5.29%의 낮은 내재화를 가지는 rhPSMA7.1은 효율적으로 추출되었고, 결과적으로 HPLC 분석에서 과대평가된다.
또한, 상기 rhPSMA 화합물들 7.2 및 7.4는 어느 정도는 보다 신속하게 추출되는 것으로 보인다(오줌에 대한 값들을 참조). 이들 화합물들은 비록 두 화합물들이 rhPSMA7.1과 비교할 때에 보다 높은 친화성들과 내재화 속도들을 나타내지만 고상 조직들 및 혈액 내에서 대체로 음성의 전하들을 보여준다. 이러한 점이 7.2 및 7.4(모두 L-Dap 유도체임)의 대사성 분해에 의해 야기될 수 있는 지는 분명하지 않지만, 대사 물질이 없기 때문에 친액성 대사 물질은 검출되지 않았다. 그렇지만 이러한 대사 물질(도 11 참조)이 그 높은 로그 P 값으로 인해 수성 완충 용액들 내에 추출될 수 없는 점도 가능할 수 있다. 이 경우, 이들은 간 내에서(생물 분포 참조)와 아마도 혈액 샘플들(높은 혈청 단백질 결합에 대한 높은 가능성) 내에 나타나야 한다. 상승된 활성 축적이 생물 분포 연구들의 과정에서 간 조직에 대해 관찰되지 않았고, 혈액으로부터의 활성 추출이 매우 효율적이었기 때문에(표 3 참조), 본 발명자들은 rhPSMA 7.2 및 7.4 에 대한 상당한 분해가 일어나지 않았던 것으로 가정하였다. 이러한 가정은 인간들에서의 [18F]rhpsma-rac의 임상적 이용의 내용에서 간 조직(쓸개, 장)에 대한 의심스럽지 않은 SUV-값들에 의해 지지된다.
30분 p.i.에서의 종양이 있는 마우스들 내의 TLC-분석
방사성-TLC 분석은 a) 오줌 샘플들에 대해 작은 부피를 TLC 스트립 상으로 직접 투여하고, b) SPE 프로세스 동안에 고정되지 않은 활성의 작은 부피('돌발 부분(breakthrough fraction)')를 분석하며, c) 작은 부피의 상기 카트리지 용출물들의 분석에 의해 수행되었다.
| 일자 | 샘플 |
TLC 스캐너
|
포스포이미지 | 주석* | ||
| 온전한 추적자 [%] |
18F-불소 [%] |
온전한 추적자 [%] |
18F-불소 [%] |
TLC 신호 강도[cts] (전체적으로 매우 낮음) |
||
| 2018년 7월 30일 | QK |
|||||
| 혈액 | 85.96 | 14.04 | 방법론적인 문제들 |
57 | ||
| 간 | 80.99 | 19.01 | 142 | |||
| 신장 | 94.04 | 5.96 | 369 | |||
| 오줌 | 82.51 | 17.49 | 726 | |||
| 종양 | 94.19 | 5.81 | 172 | |||
| 2018년 8월 1일 | QK |
94.27 | 5.73 | 96.02 | 3.98 | 384 |
| 혈액 | 90.24 | 9.76 | 41 | |||
| 간 | 92.49 | 7.51 | 93.92# | 6.08# | 173 | |
| 신장 | 94.58 | 5.42 | 572 | |||
| 오줌 | 96.2 | 3.80 | 98.55 | 1.55 | 395 | |
| 종양 | 90.53 | 9.47 | 190 | |||
| 2018년 8월 2일 | QK |
97.43 | 2.57 | |||
| 혈액 | TLC에 대해 너무 낮은 활성 레벨 |
96.80 | 3.20 | |||
| 간 | 74.15* | 25.85# | ||||
| 신장 | 96.48 | 3.52 | ||||
| 오줌 | 95.85 | 4.15 | ||||
| 종양 | 46.47 | 4.15 | ||||
(*) 낮은 활성도 레벨로 인하여, ＜200cts의 신호 강도를 가지는 TLC 측정들은 삭제되었다.
TLC 데이터의 논의
RP-18 크로마토그래피에 의해 n.c.a. 18F-불소를 검출하는 것이 매우 어렵기 때문에(n.c.a. 불소와 상호작용하는 기질의 유리 Si-OH 기들로 인해), 박층 크로마토그래피가 추출된 용액들 내의 F-18-불소를 정량하는 조사를 위해 수행되었다.
단백질 침전을 위해 통상적으로 사용된 시약들과 염들이 저온 불소에 대해서는 테스트되지 못하기 때문에, 동위 원소 교환에 의한 상기 추적자로부터의 F-18-불소의 가능한 유리(liberation)를 회피하기 위해 단백질 침전은 상기 샘플 제조 프로세스에서는 수행되지 않았다-비록 이러한 단백질 적재가 종종 제한된 피크 분리, 피크 테일링(peak tailing) 및 출발선에 고착되는 활성을 가져왔지만. 조직 추출(또는 혈액 원심 분리) 후에 얻어진 용액들이 TLC 분석을 위해 직접 사용되었다.
비록 분석을 위해 이용 가능한 활성이 모든 샘플들에서 상당히 낮았지만, TLC 결과들은 다음을 제외하면 F-18-불소의 전체적인 함량이 조사된 조직 내에서 대략 6% 아래였던 것을 보여주었다.
- 2018년 7월 30일에 얻어진 오줌 샘플(17.49%의 유리 불소),
- 2018년 8월 2일에 얻어진 간 샘플(25.85%의 유리 불소).
TLC에 의한 오줌의 분석이 유효한 결과로 간주되는 반면(도 20의 프로파일 참조), 상기 간 샘플로 얻어진 결과는 온전한 추적자를 나타내는 피크의 광범위한 테일링에 의해 야기된다(도 18 참조). 또한, 피크 테일링이 임상 적용에 대해 QK 및 PBS 내의 [F-18]rhPSMA7-rac 방출(도 18) 동안에 얻어질지라도 생성물 피크의 테일링을 보여주기 때문에 앞서 언급한 최대 6%의 유리 불소가 과대평가를 나타내는 것으로 결론지을 수 있다. 포스포이미지들에 의해 입증되는 바와 같이, 이러한 테일링은 거의 매번의 TLC 분석에서 관찰되며, F-18-불소의 통합된 영역에 기여한다.
인간들 내에서의 생물 분포 연구들뿐만 아니라 임상 PET 스캔들(2018년 7월의 상태: [F-18]rhPSMA7-rac로의 대략 1400의 스캔들)도 유리된 F-18-불소에 의해 뼈 속에 어떠한 의심스럽거나 인식 가능한 F-18-축적도 가져오지 않았던 점에 유의할 필요가 있다. [F-18]rhPSMA7-rac로부터의 F-18-불소의 유리를 더 조사하기 위해(하나의 오줌 샘플에서 관찰되는 바와 같이) 본 발명자들은 RP-18 HPLC(새로운 RP-18 엔드-캡(end-capped) 칼럼) 및 TLC 분석들에 의해 다른 오줌 샘플들(정상적인 마우스들) 내의 F-18-불소의 발생을 조사하였다.
30분 p.i.에서의 정상적인 마우스들 내의 F-18-불소의 형성의 방사성-TLC-분석
이러한 목적을 위해 정상적인 마우스들이 이용되었다. 오줌 샘플들은 카테터에 의해 30분의 기간에 걸쳐 수집되었다. 오줌은 원심 분리되었고, 직접적으로 HPLC 및 TLC가 수행되었다.
도 21에 도시한 바와 같이, 좌측 칼럼인 유리 F-18-불소가 모든 이성질체들의 오줌 샘플들 내에서 발견되었으며, 신선한 오줌이 [F-18]rhPSMA7.4로 배양되었을 때에도 형성된다(오른쪽 칼럼). F-18-불소의 확인은 a) 이러한 종이 QMA 카트리지들 상에 유지되고(데이터는 도시되지 않음), b) RP-18 칼럼들의 불용 부피로 용리되며, c) 이용된 이동 상들에 관계없이 RP-18 칼럼들 또는 RP-18 TLC 플레이트들 상에 각기 유지될 수 없거나, 고정될 수 없는 점들을 입증하여 수행되었다.
F-18-불소의 이러한 많은 양은 혈액이나 신장, 종양, 간 등과 같은 조직들의 HPLC 분석에서 검출되지 않았고, 마우스들 내의 생물 분포 연구들에서는 뼈 속에서는 상승된 활성 흡수가 관찰되지 않았으며, [F-18]rhPSMA7-rac이 TUM에서 2017년의 임상 스캐닝 종료 동안에 구현되었기 때문에 [F-18]rhPSMA7-rac 화합물로의 임상적 PET 스캔들(2018년 7월의 상태 종료: 전립선암이 있는 환자들에서의 대략 1400의 PET 스캔들) 동안에 뼈 속에서 상승된 활성 흡수가 관찰되지 않았던 사실들로 인하여, 본 발명자들은 [F-18]불소가 상기 추적자의 사구체 여과로부터 하류로 형성될 수 있었으며, 혈액, 조직 또는 뼈 내의 F-18-불소의 검출 가능한 흡수 없이 [F-18]불소의 형성과 후속되는 분비를 가져오는 것으로 결론지었다.
이러한 가정은 신장들 및 오줌 내의 불소의 상대적인 양을 기술하는 불소의 독성학에 대한 문헌에 의해 지지된다. 0.3ppm의 정상적인 오줌의 불소 레벨들이 마우스들에서 관찰되었다(Bouaziz H 등의 "Fluoride"(2005; 38(1): 23-31)). 다른 공개 문헌에서, 정상적인 마우스들의 오줌 내의 평균 불소 농도는 0.13㎍/㎖-0.14㎍/㎖가 되는 것으로 판단되었으며(Poesina ND 등의 "Rom J Morphol Embryol"(2014, 55(2): 343-349)), Inkielewicz I. 등은 랫(rat)들의 혈청 내의 불소 함량이 신장 내의 불소의 약 5%의 농도인 것을 발견하였다(혈청: 0.051㎍/㎖, 신장: 0.942㎍/㎖)("Fluoride"(36(4); 263-266). 상기 추적자의 대부분이 특히 신장 내로 흡수되고, 생리적으로 소거되는 점을 고려하면, 36.6℃의 체온과 결합하여 신장 내의 상승된 불소 레벨은 신장 내에서 rhPSMA-화합물들로부터의 F-18-불소의 지속적인 소거를 가져올 수 있다.
그 결과, 정상적인 마우스들로부터 수집된 신선하고 비방사성의 오줌 샘플들이 다양한 기간들 동안에 [F-18]rhPSMA7.x로 배양되었다(도 21에 대한 범례 참조). 도 22에서 오른쪽 칼럼에 [F-18]rhPSMA7.x로의 오줌의 배양이 탈체로 다양한 정도들까지 유리 [F-18]불소의 형성을 가져오며, 상기 오줌 샘플들 내의 저온 F-19-불소의 다른 농도들에 의해 증진되고, 시간에 걸쳐 증가되는 점을 분명하게 나타낸다.
상술한 추정을 추가적으로 지지하기 위해, 500nmol의 저온의 F-19-불소가 마우스들의 신선하고 비방사성의 오줌에 첨가되었고, [F-18]rhPSMA 7.3의 첨가와 2시간 동안의 배양이 수반되었다. 상기 추정에 따르면, 높은 농도의 [F-19]불소는 상당한 양의 [F-18]불소의 형성을 야기해야 한다. 도 23은 이들 조건들 하에서 98.5%의 방사능이 교환되고, 2시간 내에 [F-18]불소를 형성하는 것을 보여준다(도 23).
동위 원소 교환 속도가 평형에서 네 가지의 관련된 종들([F-18]불소, [F-19]불소, [F-18]rhPSMA 7.3 및 [F-19]rhPSMA 7.3)의 농도들에 의존하기 때문에, 저온 [F-19]rhPSMA 7.3 추적자의 첨가가 수반되는 신선하고 비방사성의 오줌에 대한 [F-18]불소의 첨가(20.6%의 [F-18]불소, 79.4%의 [F-18]rhpsma 7.3)도 상기 방사성 약물 [F-18]rhPSMA 7.3의 표지를 가져오는 지가 조사되었다. 예기치 않게, 오줌에 대해 적은 양인 5nmol의 [F-19]rhPSMA 7.3일지라도 실온에서 [F-18]rhPSMA 7.3의 79.4%부터 85.8%까지의 증가(20.6%로부터 14.2%까지 감소된 F-18]불소)를 가져왔다.
오줌 내의 동위 원소 교환에 의해 얻어진 결과들은 상기 4-(디-삼차 부틸[(18)F]플루오로실릴)-벤질)옥시 모이어티(moiety) 및 이에 따라 모든 rhPSAM7 이성질체들과 결합된 모든 추적자들을 대표하는 것으로 여겨진다.
임상 전 선량 측정, 인간 생물 분포 및 종양 병변들 내의 흡수
다음에서 18F-rhPSMA-7이 natGa-18F-rhPSMA7-rac 및 18F-rhPSMA-7.3 내지 natGa-18F-rhPSMA7.3을 지칭하는 점에 유의하기 바란다.
A) 마우스들 내의 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3의 임상 전 선량 특정
목적은 마우스들에 단일의 정맥 내의 투여가 수반되는 300분까지의 다른 시점들에서 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3의 분포와 분비를 평가하고, 내부 선량 측정을 위한 계산들을 수행하는 것이었다.
방법들
3-5의 마우스들에게 각기 평균 25.6±3.6MBq의 18F-rhPSMA-7 및 28.5±4.8MBq의 18F-rhPSMA-7.3이 시점마다 주사되었다. 중증 복합성 면역 결핍(severe combined immunodeficiency)(SCID)인 마우스들이 실험들을 위해 이용되었다. 모든 동물 실험들은 독일의 일반 동물 복지 규정들 및 동물들의 보호와 이용에 관한 조사 가이드라인들에 따라 수행되었다.
마우스들은 다음의 시점들에서 희생되었다.
18F-rhPSMA-7: 투여 후의 10분, 20분, 40분, 60분, 120분 및 180분.
18F-rhPSMA-7.3: 투여 후의 10분, 60분, 120분, 180분 및 300분.
18F-rhPSMA-7.3에 대해 연장된 신장 흡수를 나타내는 초기의 실험들에 기초하여 마지막 시점(300분)에서 최종적인 실험들을 위해 이용되었던 점에 유의하기 바란다.
다음의 조직들/체액들이 수확되었다.
오줌, 혈액, 심장, 폐, 지라, 췌장, 간, 위(비워짐), 소장(비워짐), 대장(비워짐), 신장, 방광, 고환, 지방, 근육(부분, 대퇴부), 대퇴골, 꼬리 및 뇌. 오줌은 CO2 가스 챔버 내에서 피펫으로 수집되었다. 상기 챔버 내에서의 배뇨를 놓친 경우, 방광이 인슐린 주사기로 흡인되었다. 혈액은 심장으로부터의 인슐린 주사기로의 희생 직후에 회수되었다. 모든 다른 조직들과 기관들이 해부되었고, 플라스틱 용기들 내에서 직접 이송되었다.
상기 플라스틱 용기들 내의 샘플들의 중량들은 전자저울을 이용하여 측정되었다. 전용의 샘플들을 위해 비어있고 미리 표지된 플라스틱 용기들의 중량들이 사전에 측정되었다. 상기 플라스틱 용기들의 무부하 중량(tare weight)은 상기 플라스틱 용기가 있는 측정 샘플들의 중량으로부터 차감되었다. 이에 따라 계산된 중량이 상기 측정 샘플들의 중량으로 지정되었다.
상기 측정 샘플들을 포함하는 플라스틱 용기들은 60초에 걸쳐 계수율(counting rate)(분당 카운트＝cpm)을 측정하기 위해 자동 감마 카운터(퍼킨엘머-월락(PerkinElmer-Wallac), 월샘, 미국)의 특정한 랙(rack) 내에 두어졌다. 또한, 알려진 양의 방사능으로 1%(v/v) 표준(n＝5)이 기관 샘플들의 계수율을 활성으로 전환시키기 위해 상기 샘플들과 함께 측정되었다.
데이터 분석
측정 샘플들의 계수율들은 붕괴에 대해 자동으로 보정되었다. 방사능 분포 비율들(단위: 측정 샘플들 내의 주입된 선량의 퍼센티지[%ID])은 다음의 식을 이용하여 결정되었다. 하나의 마우스로부터 얻어진 모든 측정 샘플들로부터의 계수율들의 합이 투여된 방사능에 대한 계수율로 지정되었다.
[식]
주입된 선량의 퍼센티지(%ID)＝(측정 샘플에 대한 계수율/하나의 마우스로부터의 모든 측정 샘플들에 대한 계수율들의 합) x 100
오줌과 배설물을 제외한 측정 샘플(단위: %ID/g)의 단위 중량 당 방사능 분포 비율은 다음의 식을 이용하여 결정되었다. 측정 샘플의 중량은 상기 샘플을 포함하는 용기로부터 빈 측정 용기의 감산에 의해 결정되었다.
[식]
주입된 선량의 퍼센티지(%ID/g)＝주입된 선량의 퍼센티지(%ID)/측정 샘플의 중량(g)
선량 측정 분석
각각의 방사성 추적자에 대한 통계적 계산들의 일치성을 위해 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3에 대해 동일한 숫자의 시점들이 이용되었다. 이에 따라, 18F-rhPSMA-7에 대해 10분 및 20분의 시점들은 15분의 종료점을 생성하도록 결합되었다.
중요 소스 기관(AUC)들 내의 축적에 대한 활성의 시간 적분은 J. Juan 등의 "Journal of Pharmaceutical Sciences"(1993, 82: 762-763)에 따라 수치 적분 및 물리적 붕괴와 모두와 함께 생성되었다.
Kirshner 등은 두 종들 내의 모형들의 기관 중량들과 전체 체중들의 비율에 의해 동물 내의 주입된 선량 퍼센트의 선형 척도를 이용하는 방법을 구현하였다.
- Kirschner AS, Ice RD, Beierwaltes WH.의 "Radiation Dosimetry of 131I-19-Iodocholesterol"(J Nucl Med. 1973 Sep 1; 14(9): 713-7).
- Kirschner A, Ice R, Beierwaltes W.의 "Letters to the editor"(J Nucl Med. 1975: 248-9).
요약하면, 상기 마우스들 내의 생물 분포로부터 인간 선량 측정을 계산하기 위해, 외삽법(extrapolation)이 동물들 및 인간들 사이의 차이들을 설명하기 위해 필요하였다. 정상 기관 방사선 선량들이 시간 의존적 기관 활성 농도들(그램 당 주입된 선량의 퍼센트(%ID/g)로) 및 마우스들 내의 생물 분포 연구에서 측정된 전체 신체 활성들을 이용하여 70kg의 표준 성인 해부학적 모델(Standard Adult anatomic model)에 대해 평가되었다.
마우스들 내의 조직 활성 농도들은 상기 표준 성인 및 "표준" 25그램의 마우스 내의 상대적인 부분 기관 질량들을 이용하여 70kg의 표준 성인 내의 조직 부분 활성들로 전환되었다. 시간 의존적 전체 신체 활성은 지수 함수와 부합하였고, 주입된 활성 및 전체 신체 활성의 차이는 간 및 GI 추적자 내의 활성 농도들이 연구된 모든 시점들에서 낮았기 때문에 오줌에 분비되는 것으로 추정되었다.
기관 정체 시간은 사다리꼴 공식(trapezoidal rule)을 이용한 수치 적분법으로 계산되었고, 나머지 신체 18F 정체 시간들은 전체 신체 정체 시간과 기관 및 오줌 정체 시간들의 합계 사이의 차이로 계산되었다. 방광 내용물의 정체 시간은 OLINDA/EXM 1.0 선량 측정 소프트웨어에서의 동적 배뇨 모델을 이용하여 산정되었다. 최종적으로, 상기 표준 성인 평균 기관 선량 등가량(mSv/MBq로) 및 유효 선량(또한 mSv/MBq로)가 이후에 OLINDA/EXM 1.0을 이용하여 계산되었다.
마우스들 내의 생물 분포로부터의 반사선 흡수 선량 및 선량 측정의 최종적인 계산: 방사선의 상당한 축적이 일어난 조직들이나 기관들(즉, 소스 기관)은 신장, 지라, 폐, 간 및 심장이었다. 활성 축적 및 소제에 관하여, 혈액으로부터의 소제는 신속하지만, 오줌으로의 소제는 신장 내에서 상대적으로 느리게 쌓이는 것이 발견되었다.
결과들
| 표적 기관 | 알파 | 베타 | 광자 | 전체 | EDE 카운트 | ED 카운트 |
| 부신 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.85E-03 | 7.80E-03 | 0.00E000 | 3.90E-05 |
| 뇌 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 2.54E-03 | 4.49E-03 | 0.00E000 | 2.24E-05 |
| 유방 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 2.29E-03 | 4.24E-03 | 6.36E-04 | 2.12E-04 |
| 쓸개 벽 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.54E-03 | 7.49E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| LLI 벽 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 1.41E-02 | 1.61E-02 | 9.66E-04 | 1.93E-03 |
| 소장 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 8.40E-03 | 1.04E-02 | 0.00E000 | 5.18E-05 |
| 위벽 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.05E-03 | 7.00E-03 | 0.00E000 | 8.40E-04 |
| ULI 벽 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 7.31E-03 | 9.26E-03 | 0.00E000 | 4.63E-05 |
| 심벽 | 0.00E000 | 8.82E-04 | 3.54E-03 | 4.42E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 신장 | 0.00E000 | 4.70E-02 | 1.80E-02 | 6.51E-02 | 3.91E-03 | 3.25E-04 |
| 간 | 0.00E000 | 6.35E-04 | 3.63E-03 | 4.27E-03 | 0.00E000 | 2.13E-04 |
| 폐 | 0.00E000 | 1.25E-03 | 3.04E-03 | 4.30E-03 | 5.16E-04 | 5.16E-04 |
| 근육 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.73E-03 | 7.68E-03 | 0.00E000 | 3.84E-05 |
| 난소 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 1.35E-02 | 1.55E-02 | 3.87E-03 | 3.09E-03 |
| 췌장 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 6.13E-03 | 8.08E-03 | 0.00E000 | 4.04E-05 |
| 적색 골수 | 0.00E000 | 1.39E-03 | 5.41E-03 | 6.80E-03 | 8.16E-04 | 8.16E-04 |
| 골원성 세포들 | 0.00E000 | 4.18E-03 | 4.75E-03 | 8.93E-03 | 2.68E-04 | 8.93E-05 |
| 피부 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 2.98E-03 | 4.93E-03 | 0.00E000 | 4.93E-05 |
| 지라 | 0.00E000 | 1.59E-02 | 1.01E-02 | 2.61E-02 | 1.56E-03 | 1.30E-04 |
| 고환 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 9.69E-03 | 1.16E-02 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 흉선 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 3.24E-03 | 5.18E-03 | 0.00E000 | 2.59E-05 |
| 갑상선 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 3.23E-03 | 5.18E-03 | 1.55E-04 | 2.59E-04 |
| 방광 벽 | 0.00E000 | 2.45E-01 | 1.08E-01 | 3.54E-01 | 2.12E-02 | 1.77E-02 |
| 자궁 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 2.61E-02 | 2.80E-02 | 1.68E-03 | 1.40E-04 |
| 전체 신체 | 0.00E000 | 2.37E-03 | 5.39E-03 | 7.77E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 유효 선량 등가량(mSy/MBq) | 3.56E-02 | |||||
| 유효 선량(mSy/MBq) | 2.66E-02 | |||||
| 표적 기관 | 알파 | 베타 | 광자 | 전체 | EDE 카운트 | ED 카운트 |
| 부신 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.64E-03 | 7.59E-03 | 0.00E000 | 3.79E-05 |
| 뇌 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 2.54E-03 | 4.49E-03 | 0.00E000 | 2.24E-05 |
| 유방 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 2.25E-03 | 4.20E-03 | 6.30E-04 | 2.10E-04 |
| 쓸개 벽 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 4.96E-03 | 6.91E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| LLI 벽 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 7.25E-03 | 9.20E-03 | 5.52E-04 | 1.10E-03 |
| 소장 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.79E-03 | 7.73E-03 | 0.00E000 | 3.87E-05 |
| 위벽 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 4.70E-03 | 6.65E-03 | 0.00E000 | 7.98E-04 |
| ULI 벽 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.33E-03 | 7.27E-03 | 0.00E000 | 3.64E-05 |
| 심벽 | 0.00E000 | 8.82E-04 | 3.48E-03 | 4.36E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 신장 | 0.00E000 | 4.70E-02 | 1.76E-02 | 6.47E-02 | 3.88E-03 | 3.23E-04 |
| 간 | 0.00E000 | 6.35E-04 | 3.39E-03 | 4.02E-03 | 0.00E000 | 2.01E-04 |
| 폐 | 0.00E000 | 1.25E-03 | 3.01E-03 | 4.26E-03 | 5.11E-04 | 5.11E-04 |
| 근육 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 4.01E-03 | 5.96E-03 | 0.00E000 | 2.98E-05 |
| 난소 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 7.21E-03 | 9.16E-03 | 2.29E-03 | 1.83E-03 |
| 췌장 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.86E-03 | 7.80E-03 | 0.00E000 | 3.90E-05 |
| 적색 골수 | 0.00E000 | 1.39E-03 | 4.29E-03 | 5.68E-03 | 6.82E-04 | 6.82E-04 |
| 골원성 세포들 | 0.00E000 | 4.18E-03 | 4.09E-03 | 8.27E-03 | 2.48E-04 | 8.27E-05 |
| 피부 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 2.38E-03 | 4.32E-03 | 0.00E000 | 4.32E-05 |
| 지라 | 0.00E000 | 1.59E-02 | 9.90E-03 | 2.58E-02 | 1.55E-03 | 1.29E-04 |
| 고환 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 5.09E-03 | 7.03E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 흉선 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 3.20E-03 | 5.15E-03 | 0.00E000 | 2.57E-05 |
| 갑상선 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 3.23E-03 | 5.17E-03 | 1.55E-04 | 2.59E-04 |
| 방광 벽 | 0.00E000 | 7.87E-02 | 3.66E-02 | 1.15E-01 | 6.92E-03 | 5.76E-03 |
| 자궁 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 1.12E-02 | 1.31E-02 | 7.87E-04 | 6.56E-05 |
| 전체 신체 | 0.00E000 | 2.27E-03 | 3.93E-03 | 6.19E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 유효 선량 등가량(mSy/MBq) | 1.82E-02 | |||||
| 유효 선량(mSy/MBq) | 1.22E-02 | |||||
| 표적 기관 | 알파 | 베타 | 광자 | 전체 | EDE 카운트 | ED 카운트 |
| 부신 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 7.93E-03 | 1.10E-02 | 0.00E000 | 5.52E-05 |
| 뇌 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 4.07E-03 | 7.19E-03 | 0.00E000 | 3.59E-05 |
| 유방 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 3.55E-03 | 6.67E-03 | 1.00E-03 | 3.34E-04 |
| 쓸개 벽 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 7.46E-03 | 1.06E-02 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| LLI 벽 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 1.28E-02 | 1.59E-02 | 9.53E-04 | 1.91E-03 |
| 소장 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 9.42E-03 | 1.25E-02 | 0.00E000 | 6.27E-05 |
| 위벽 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 7.02E-03 | 1.01E-02 | 0.00E000 | 1.22E-03 |
| ULI 벽 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 8.57E-03 | 1.17E-02 | 0.00E000 | 5.85E-05 |
| 심벽 | 0.00E000 | 1.32E-03 | 5.39E-03 | 6.71E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 신장 | 0.00E000 | 5.11E-02 | 2.07E-02 | 7.18E-02 | 4.31E-03 | 3.59E-04 |
| 간 | 0.00E000 | 9.70E-04 | 5.02E-03 | 5.99E-03 | 0.00E000 | 3.00E-04 |
| 폐 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 4.66E-03 | 6.61E-03 | 7.93E-04 | 7.93E-04 |
| 근육 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 6.55E-03 | 9.67E-03 | 0.00E000 | 4.83E-05 |
| 난소 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 1.26E-02 | 1.57E-02 | 3.92E-03 | 3.14E-03 |
| 췌장 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 8.29E-03 | 1.14E-02 | 0.00E000 | 5.70E-05 |
| 적색 골수 | 0.00E000 | 2.22E-03 | 6.79E-03 | 9.01E-03 | 1.08E-03 | 1.08E-03 |
| 골원성 세포들 | 0.00E000 | 6.70E-03 | 6.52E-03 | 1.32E-02 | 3.97E-04 | 1.32E-04 |
| 피부 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 3.83E-03 | 6.95E-03 | 0.00E000 | 6.95E-05 |
| 지라 | 0.00E000 | 1.52E-02 | 1.15E-02 | 2.67E-02 | 1.60E-03 | 1.34E-04 |
| 고환 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 8.96E-03 | 1.21E-02 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 흉선 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 5.08E-03 | 8.20E-03 | 0.00E000 | 4.10E-05 |
| 갑상선 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 5.15E-03 | 8.27E-03 | 2.48E-04 | 4.14E-04 |
| 방광 벽 | 0.00E000 | 1.56E-01 | 7.14E-02 | 2.27E-01 | 1.36E-02 | 1.14E-02 |
| 자궁 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 2.04E-02 | 2.36E-02 | 1.41E-03 | 1.18E-04 |
| 전체 신체 | 0.00E000 | 3.52E-03 | 6.33E-03 | 9.86E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 유효 선량 등가량(mSy/MBq) | 2.94E-02 | |||||
| 유효 선량(mSy/MBq) | 2.17E-02 | |||||
| 표적 기관 | 알파 | 베타 | 광자 | 전체 | EDE 카운트 | ED 카운트 |
| 부신 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 7.79E-03 | 1.09E-02 | 0.00E000 | 5.46E-05 |
| 뇌 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 4.06E-03 | 7.18E-03 | 0.00E000 | 3.59E-05 |
| 유방 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 3.53E-03 | 6.65E-03 | 9.97E-04 | 3.32E-04 |
| 쓸개 벽 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 7.11E-03 | 1.02E-02 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| LLI 벽 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 8.45E-03 | 1.16E-02 | 6.94E-04 | 1.39E-03 |
| 소장 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 7.78E-03 | 1.09E-02 | 0.00E000 | 5.45E-05 |
| 위벽 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 6.80E-03 | 9.92E-03 | 0.00E000 | 1.19E-03 |
| ULI 벽 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 7.33E-03 | 1.05E-02 | 0.00E000 | 5.23E-05 |
| 심벽 | 0.00E000 | 1.32E-03 | 5.36E-03 | 6.68E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 신장 | 0.00E000 | 5.11E-02 | 2.04E-02 | 7.16E-02 | 4.29E-03 | 3.58E-04 |
| 간 | 0.00E000 | 9.70E-04 | 4.87E-03 | 5.84E-03 | 0.00E000 | 2.92E-04 |
| 폐 | 0.00E000 | 1.95E-03 | 4.63E-03 | 6.58E-03 | 7.90E-04 | 7.90E-04 |
| 근육 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 5.47E-03 | 8.59E-03 | 0.00E000 | 4.30E-05 |
| 난소 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 8.61E-03 | 1.17E-02 | 2.93E-03 | 2.35E-03 |
| 췌장 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 8.12E-03 | 1.12E-02 | 0.00E000 | 5.62E-05 |
| 적색 골수 | 0.00E000 | 2.22E-03 | 6.09E-03 | 8.31E-03 | 9.97E-04 | 9.97E-04 |
| 골원성 세포들 | 0.00E000 | 6.70E-03 | 6.11E-03 | 1.28E-02 | 3.84E-04 | 1.28E-04 |
| 피부 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 3.45E-03 | 6.57E-03 | 0.00E000 | 6.57E-05 |
| 지라 | 0.00E000 | 1.52E-02 | 1.14E-02 | 2.66E-02 | 1.59E-03 | 1.33E-04 |
| 고환 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 6.08E-03 | 9.20E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 흉선 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 5.06E-03 | 8.18E-03 | 0.00E000 | 4.09E-05 |
| 갑상선 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 5.15E-03 | 8.27E-03 | 2.48E-04 | 4.13E-04 |
| 방광 벽 | 0.00E000 | 5.18E-02 | 2.66E-02 | 7.84E-02 | 4.70E-03 | 3.92E-03 |
| 자궁 | 0.00E000 | 3.12E-03 | 1.11E-02 | 1.43E-02 | 8.55E-04 | 7.13E-05 |
| 전체 신체 | 0.00E000 | 3.45E-03 | 5.42E-03 | 8.87E-03 | 0.00E000 | 0.00E000 |
| 유효 선량 등가량(mSy/MBq) | 1.85E-02 | |||||
| 유효 선량(mSy/MBq) | 1.28E-02 | |||||
결론
방사선 분포 비율들은 마우스들에서 모든 조사된 시점들에서 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3 모두의 투여 후에 신장들 내에서 가장 높았다. 또한, 모든 다른 평가된 조직들과 비교할 경우에 두 방사선 추적자들에 대해 지라 및 방광 내에서 높았다, 여기서 활성 비율들은 8%ID/g 보다 낮았다.
신장 내에서와 방광을 통한 분비에서 대부분의 18F-rhPSMA-7/18F-rhPSMA-7.3 활성 증가가 높은 활성들을 보여기 때문에, 주요 분비 루트는 신장과 배뇨 기관을 통하는 것으로 정의된다.
3.5시간 및 1.0시간의 방광 배뇨 간격(voiding interval)을 이용하여 추정된 전체 유효 선량들은 각기 18F-rhPSMA-7에 대해 2.66E-02mSv/MBq 및 1.22E-02mSv/MBq였고, 18F-rhPSMA-7.3에 대해 2.17E-02mSv/MBq 및 1.28E-02mSv/MBq였다. 임상 스캔에 대해 370MBq(10mCi)까지의 주입은 1시간의 배뇨 간격으로 산정할 경우에 두 제제들에 대해 5mSv 보다 작은 바람직한 방사선 노출을 가져올 수 있었다.
두 방사성 추적자들 사이에 언급할 가치가 있는 차이들은 18F-rhPSMA-7.3으로서 신장 흡수에 관해서만은 분명하게 더 이상 정체 없이 보다 점진적으로 축적되는 경향이 있는 것이다. 아직까지 방사선 노출은 두 제제들 사이에서 비교될만하다.
B) 인간 생물 분포 및 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3의 종양 병변들 내의 흡수
다음의 단락들은 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3의 생물 분포를 설명한다. 개념 증명 평가가 동정적 사용(compassionate use) 하에서 수행되었다. 상기 제제는 독일 의약품 법령(The German Medicinal Products Act)(AMG) 제13조 제2b항에 따르고, 책임 규제 기관(오버바이에른 정부)에 따라 적용되었다.
모든 대상들은 바이오그라프(Biograph) mCT 스캐너(지멘스 메디컬 솔루션즈(Siemens Medical Solutions), 에를랑겐, 독일) 상에서 검사되었다. 모든 PET 스캔들은 베드(bed) 위치 당 2분-4분의 획득 시간으로 3D-모드로 획득되었다. 방사 데이터는 무작위, 불응 시간, 분산 및 감쇠에 대해 보정되었고, 후재건을 매끄럽게 하는 가우스 필터(Gaussian filter)(이분의 일 최대에서 5㎜의 전체 폭)가 수반되어 부분 집합 기대값 최대화(ordered-subsets expectation maximization) 알고리즘에 의해 반복적으로 재구성되었다.
방법들
인간 생물 분포는 각기 47 및 32의 환자들 내의 임상 18F-rhPSMA-7- 및 18F-rhPSMA-7.3-PET/CT 시험들을 분석하여 평가되었다. 18F-rhPSMA-7 대 18F-rhPSMA-7.3에 대하여 각기 평균 주입 활성들은 324(236-424의 범위)MBq 대 345(235-420의 범위)MBq였고, 흡수 시간들은 84(42-166의 범위)분 대 76(59-122의 범위)분이었다.
평균 및 최대 표준화 흡수 값들(SUVmean/SUVmax)은 배경(소둔근), 정상적인 기관들(침샘, 혈액 풀, 폐, 간, 지라, 췌장, 십이지장, 신장, 방광, 뼈) 및 세 가지의 대표적인 종양 병변들에 대해 결정되었다. 종양 흡수는 각기 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3에 대하여 89의 병변들(26의 일차 종양들/국소 재발, 23의 뼈, 38의 림프절 및 2의 내장 전이들) 및 63의 병변들(14의 일차 종양들/국소 재발, 30의 뼈, 18의 림프절 및 1의 내장 전이) 내에서 분석되었다.
SUV의 계산을 위해, 관심의 대상인 원형 영역들이 단층 슬라이스들 내에서 중점적으로 증가된 흡수를 가지는 영역 주위에 그려졌으며, 50%의 등윤곽으로 관심의 대상인 삼차원 체적(VOI)에 자동적으로 채용되었다. 기관-배경 및 종양-배경 비율들이 계산되었다.
결과들
18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3의 인간 생물 분포는 다른 PSMA-리간드들로부터 알려진 통상적인 패턴을 보여주었다. 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3에 대한 흡수 파라미터들은 18F-rhPSMA-7.3에 대해 방광 내의 낮은 활성 정체 및 종양 병변들 내의 보다 높은 흡수와 매우 유사하였으며, 18F-rhPSMA-7 대 18F-rhPSMA-7.3에 대한 SUVmean은 18F-rhPSMA-7 대 18F-rhPSMA-7.3에 대해 각기 16.9 대 16.0(귀밑샘), 19.6 대 19.6(턱밑샘), 2.0 대 1.9(혈액 풀), 0.7 대 0.7(폐), 7.0 대 7.3(간), 9.1 대 8.5(지라), 32.4 대 35.5(신장), 2.5 대 2.8(췌장), 10.9 대 11.0(십이지장), 1.1 대 1.3(질병이 없는 뼈), 그리고 10.2 대 2.0(방광)이었다. 특히, 18F-rhPSMA-7.3 대 18F-rhPSMA-7의 흡수 값들은 방광 내의 정체에 대해 상당히 낮았고(2.0±0.8 대 6.3±21.2, p＜0.05), 종양 병변들에 대해 상당히 높았다(32.5±42.7 대 20.0±20.2, p＜0.05).
| SUVmax | SUVmean | ||||||
| 평균 | 최소 | 최대 | 평균 | 최소 | 최대 | ||
| 배경 | 1.0 | 0.6 | 1.8 | 0.6 | 0.4 | 1.2 | |
| 귀밑샘 | 23.8 | 8.2 | 42.3 | 16.9 | 5.5 | 32.7 | |
| 턱밑샘 | 27.0 | 10.1 | 43.8 | 19.6 | 7.0 | 29.7 | |
| 혈액 풀 | 2.4 | 1.6 | 3.9 | 2.0 | 1.1 | 17.0 | |
| 폐 | 1.1 | 0.5 | 3.1 | 0.7 | 0.3 | 2.0 | |
| 간 | 9.5 | 4.5 | 25.2 | 7.0 | 3.2 | 17.7 | |
| 지라 | 11.8 | 4.7 | 21.0 | 9.1 | 3.4 | 17.1 | |
| 신장 | 44.8 | 19.1 | 75.2 | 32.4 | 13.2 | 54.7 | |
| 췌장 | 3.7 | 1.8 | 7.9 | 2.5 | 1.3 | 5.5 | |
| 십이지장 | 14.8 | 2.8 | 32.7 | 10.9 | 1.9 | 23.9 | |
| 뼈 | 1.7 | 0.8 | 3.1 | 1.1 | 0.6 | 2.1 | |
| 방광 | 8.5 | 0.5 | 112.0 | 6.3 | 0.3 | 85.7 | |
| 종양 | 27.6 | 3.1 | 167.2 | 20.0 | 2.1 | 115.7 | |
| SUVmax | SUVmean | ||||||
| 평균 | 최소 | 최대 | 평균 | 최소 | 최대 | ||
| 배경 | 1.0 | 0.6 | 1.7 | 0.7 | 0.4 | 1.1 | |
| 귀밑샘 | 24.6 | 11.2 | 38.3 | 16.0 | 8.2 | 25.0 | |
| 턱밑샘 | 28.4 | 14.6 | 47.4 | 19.6 | 10.4 | 33.4 | |
| 혈액 풀 | 2.8 | 1.9 | 3.9 | 1.8 | 1.3 | 2.5 | |
| 폐 | 1.1 | 0.7 | 1.9 | 0.7 | 0.4 | 1.1 | |
| 간 | 9.7 | 4.6 | 15.4 | 7.3 | 3.2 | 12.3 | |
| 지라 | 11.4 | 5.0 | 22.5 | 8.5 | 3.7 | 17.9 | |
| 신장 | 51.9 | 30.9 | 99.9 | 35.5 | 20.7 | 70.6 | |
| 췌장 | 4.2 | 2.4 | 7.8 | 2.8 | 1.6 | 5.2 | |
| 십이지장 | 16.4 | 6.1 | 32.2 | 11.0 | 3.0 | 23.0 | |
| 뼈 | 2.1 | 1.1 | 3.4 | 1.3 | 0.7 | 2.2 | |
| 방광 | 3.1 | 1.1 | 6.0 | 2.0 | 0.7 | 4.1 | |
| 종양 | 44.0 | 2.4 | 316.0 | 32.5 | 1.6 | 224.1 | |
| SUVmax | SUVmean | ||||||
| 평균 | 최소 | 최대 | 평균 | 최소 | 최대 | ||
| 귀밑샘 | 25.2 | 8.2 | 45.3 | 28.3 | 9.2 | 54.5 | |
| 턱밑샘 | 28.7 | 10.1 | 54.7 | 33.3 | 11.7 | 61.8 | |
| 혈액 풀 | 2.5 | 1.3 | 4.8 | 3.2 | 1.6 | 21.3 | |
| 폐 | 1.1 | 0.4 | 3.3 | 1.1 | 0.4 | 4.0 | |
| 간 | 10.4 | 4.7 | 42.0 | 11.9 | 4.6 | 44.3 | |
| 지라 | 12.5 | 4.7 | 35.0 | 15.1 | 5.7 | 39.5 | |
| 신장 | 48.1 | 18.2 | 98.7 | 55.2 | 19.8 | 109.3 | |
| 췌장 | 3.9 | 1.5 | 11.3 | 4.3 | 1.9 | 10.8 | |
| 십이지장 | 15.7 | 2.8 | 31.3 | 18.4 | 3.2 | 35.3 | |
| 뼈 | 1.7 | 0.9 | 2.9 | 1.8 | 1.0 | 3.2 | |
| 방광 | 8.7 | 0.6 | 112.0 | 10.2 | 0.5 | 142.8 | |
| 종양 | 32.0 | 3.1 | 278.6 | 36.0 | 3.5 | 289.3 | |
| SUVmax | SUVmean | ||||||
| 평균 | 최소 | 최대 | 평균 | 최소 | 최대 | ||
| 귀밑샘 | 24.7 | 11.9 | 46.2 | 25.2 | 12.4 | 44.6 | |
| 턱밑샘 | 28.2 | 14.0 | 62.1 | 30.6 | 15.7 | 62.3 | |
| 혈액 풀 | 2.8 | 1.5 | 5.2 | 2.9 | 1.7 | 4.9 | |
| 폐 | 1.0 | 0.6 | 1.8 | 1.0 | 0.6 | 1.8 | |
| 간 | 9.7 | 4.0 | 19.0 | 11.4 | 4.1 | 20.7 | |
| 지라 | 11.4 | 3.6 | 22.4 | 13.3 | 3.9 | 28.6 | |
| 신장 | 51.8 | 25.7 | 93.0 | 55.6 | 27.6 | 95.5 | |
| 췌장 | 4.1 | 2.2 | 6.9 | 4.4 | 2.3 | 7.8 | |
| 십이지장 | 16.2 | 6.9 | 34.3 | 17.1 | 4.7 | 39.4 | |
| 뼈 | 2.0 | 1.1 | 3.2 | 2.1 | 1.0 | 3.6 | |
| 방광 | 3.1 | 0.9 | 5.5 | 3.1 | 0.9 | 6.8 | |
| 종양 | 43.6 | 1.7 | 321.2 | 50.8 | 1.8 | 356.4 | |
결론
인간 생물 분포는 가장 정상적인 조직들에 대해 18F-rhPSMA-7 및 18F-rhPSMA-7.3 사이에서 유사하다. 방광 내의 추적자 체류는 상당히 낮지만, 18F-rhPSMA-7.3에 대해 상당히 높은 종양 병변들 내의 흡수는 임상적 영상화에 대한 분명한 이점을 가진다. 바람직한 인간 생물 분포 및 18F-rhPSMA-7.3의 종양 병변들의 높은 흡수를 갖는 영상화 샘플들이 도 28에 도시된다.
Claims (16)
- 킬레이트화(chelated) 방사성 양이온을 포함하거나, F가 선택적으로 18F인 화학식 (V)에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항에 있어서, 화학식 (Va)에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며,
여기서, 각각의 X는 독립적으로 OH 또는 O-이고;
M은 킬레이트화 방사성 양이온이거나 존재하지 않으며;
F는 선택적으로 18F인 것을 특징으로 하는 화합물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 킬레이트화 방사성 양이온은 Sc, Cu, Ga, Y, In, Tb, Ho, Lu, Re, Pb, Bi, Ac, Er 및 Th의 양이온들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제3항에 있어서, 상기 킬레이트화 방사성 양이온은 Ga인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제3항에 있어서, 상기 킬레이트화 방사성 양이온은 Lu-177, Y-90, 또는 Ac-225인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항의 화합물을 생산하기 위한 방법에 있어서,
a) 화학식 (I)의 화합물을:
화학식 (II)의 화합물과 반응시켜,
화학식 (III)의 화합물을 형성하는 단계를 포함하며,
여기서, PG1는 tBu이고, PG2는 Fmoc이며, PG3은 Dde이고,
반응 조건들은 염기의 사용을 수반하며, 상기 염기는 2,4,6-콜리딘(collidine) 또는 2,6-디메틸피리딘(dimethylpyridine) 이고;
b) 상기 화학식 (III)의 화합물을 화학식 (IV)의 화합물을 형성하기 위해 적합한 조건들 하에서 반응시키는 단계를 포함하며;
c) 상기 화학식 (IV)의 화합물을 화학식 (V)의 화합물을 형성하기 위해 적합한 조건들 하에서 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물은 상기 화학식 (I)의 화합물과의 반응 이전에 2-(1H-벤조트리아졸(benzotriazole)-1-일(yl))-1,1,3,3-테트라메틸알루미늄 테트라플루오로보레이트(tetramethylaminium tetrafluoroborate)(TBTU), 1-하이드록시(hydroxy)-7-아자벤조트리아졸(azabenzotriazole)(HOAt) 및 2,4,6-콜리딘과의 반응에 의해 예비 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 예비 활성화는 5분 이하 동안 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 (VI)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 (VII)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항 내지 제10항 중에서 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학 또는 진단 조성물.
- 암 진단 또는 영상화제로서의 제1항 내지 제11항 중에서 어느 한 항에 따른 결합체(conjugate), 화합물 또는 조성물의 사용.
- 제1항 내지 제12항 중에서 어느 한 항에 따른 결합체, 화합물 또는 조성물을 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는 암을 영상화하고 및/또는 진단하기 위한 방법.
- 암의 치료에서의 제1항 내지 제13항 중에서 어느 한 항에 따른 결합체, 화합물 또는 조성물의 사용.
- 혈관 신생(neoangiogenesis)/혈관 형성(angiogenesis)의 진단, 영상화 또는 방지를 위한 제1항 내지 제14항 중에서 어느 한 항에 따른 결합체, 화합물 또는 조성물.
- 암의 치료에서의 제1항 내지 제15항 중에서 어느 한 항에 따른 결합체, 화합물 또는 조성물의 사용으로서, 상기 암은 전립선, 유방, 폐, 결장 또는 신장 세포 암종인 것을 특징으로 하는 사용.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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