KR20210149506A - 심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법, 이에 따라 선별된 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 심혈관 질환의 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 바이오마커로서 14-3-3 단백질, 이의 선별방법, 이를 이용한 심혈관 질환 진단용 키트, 심혈관 질환 진단을 위한 정보제공방법, 이의 억제제를 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 심혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법, 이에 따라 선별된 바이오마커 및 상기 바이오마커를 이용한 심혈관 질환의 진단방법{Method for screening biomarkers diagnosing cardiovascular diseases, biomarkers screened thereby and method for diagnosing cardiovascular diseases using the same}

본 발명은 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 바이오마커로서 14-3-3 단백질, 이의 선별방법, 이를 이용한 심혈관 질환 진단용 키트, 심혈관 질환 진단을 위한 정보제공방법, 이의 억제제를 포함하는 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 심혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

심혈관 질환(cardiovascular disease; CVD)은 뇌와 심장에 혈액을 공급하는 혈관에 이상이 생긴 질환을 포함하며, 협심증, 심근경색 및 뇌경색 등이 이에 해당한다. 보다 구체적으로, 심혈관 질환은 심장이나 혈관에 관련된 모든 질환을 포함하며, 예컨대, 관상동맥 심장질환, 울혈성 심부전, 말초 혈관 질환, 심장 마비, 뇌졸중 또는 일과성 허혈 발작, 신장 혈관 질환 등을 폭넓게 포함한다. 한국인에 있어서, 심장 질환은 암에 이어 사망원인 2위이며, 뇌혈관 질환으로 인한 사망률이 3위로 나타나고 있다. 나아가, 2015년 세계보건기구(WHO)가 발표한 전세계 사망원인 1위는 심혈관 질환이다. 이처럼 심혈관 건강은 생명과 밀접한 연관이 있으므로, 관리와 예방이 중요하다. 나아가, 이들 질환은 치료 가능한 질환이므로, 질환의 발병을 초기에 진단하고 치료하는 것은 중요하다.

심혈관 질환을 진단하기 위해, 심전도 검사, 운동부하 검사, 심초음파 검사, 심장 핵의학검사, 관상동맥 촬영(CT), 및 심혈관조영술 등이 있다. 그러나 이들 진단 방법은 특별한 장치를 요구하거나, 조영제를 투여하기 위해 침습적인 시술이 선행되어야 하며, 비용이 높아, 쉽게 실시하기 어렵다.

이에, 상대적으로 간편한 방법으로 심혈관 질환을 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하고자 하는 시도가 있다. 최근 시장보고에 의하면 종래에 사용되는 CK-MB, 심장 트로포닌(cardiac Troponin), 미오글로빈(myoglobin) 및 콜레스테롤과 함께 골수세포형과산화효소(myeloperoxidase), 뇌 나트륨이뇨 펩티드(brain natriuretic peptide; BNP), hs-CRP, mehocysteine, 지방산 결합 단백질(fatty acid binding protein; FABP), 뇨 알부민(urinary albumin), 아스파르테이트아미노전달효소(aspartate transaminase), LDH, HbA1c 등이 심장 질환 관련 바이오마커로 사용되고 있다. 심근경색을 포함, 심혈관 질환의 현장 진단 마커 시장은 빠른 성장을 보이는 분야로 응급실 뿐 아니라 병동에 이르기까지 폭넓게 이용되고 있다. 응급 및 현장 진단용 심근 경색 마커들은 각 마커 별로 혈액 내 나타나는 기간과 이에 따른 민감도와 특이도가 특징적으로 발현되는 것으로 조사되고 있다.

바이오마커를 활용한 진단키트는 체외 진단형 키트 형태로 2007년 이래로 시장규모는 연간 3 내지 10%씩 꾸준히 증가하고 있고, 2019년 현재 약 71.7억 달러의 매출 규모에 달한다. 한편 진단키트 중 가장 큰 비중을 차지하는 것은 면역화학적 진단기기로 2017년을 기준으로 약 23.3억 달러의 시장 규모를 달성하였으며, 로슈가 가장 높은 점유율을 차지하고, 지멘스와 애보트가 그 뒤를 잇는다. 국내 체외 진단기기 시장규모는 약 4174억원(2014년 기준)으로 추정되며, 앞으로도 지속적인 성장이 예상된다. 이는 BT 산업에 큰 영향을 받고 있으며, 타 국가 대비 우위에 있는 IT 기술을 융합하여 경쟁력 있는 산업을 육성할 수 있을 것으로 예측되고 있다.

본 발명자들은 간단한 방법으로 심혈관 질환을 특이적으로 진단할 수 있는 체외진단 키트에 적용가능한 바이오마커를 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 심근비대 유도 세포에서 14-3-3 단백질, 특히 이의 베타, 입실론 및 제타 아형(isoform)의 발현이 정상 심근 세포는 물론 다른 조직 및/또는 다른 조직의 암세포들에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 제1양태는 14-3-3 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 심혈관 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하는 것이다.

본 발명의 용어, "14-3-3 단백질"은 모든 진핵세포에서 발현되는 서열이 유지된 조절 분자(conserved regulatory molecules)의 패밀리이다. 14-3-3 단백질은 키나아제, 포스파타아제, 및 막관통수용체(transmembrane receptors)를 포함한 다수의(multitude) 기능적으로 다양한 신호전달 단백질에 대한 결합능을 갖는다. 14-3-3 리간드로서 200여종 이상의 신호전달 단백질이 보고되었다. 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease) 환자의 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에서 증가된 양의 14-3-3 단백질이 관찰된다. 또한, 이의 에타 아형(isoform)은 활액(synovial fluid)에 존재하는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)에 대한 바이오마커임이 보고된 바 있다. 그러나, 14-3-3 단백질 및 이의 아형들의 심혈관 질환의 상관관계에 대해서는 확인된 바 없다.

대부분의 포유류에서 7가지 구별되는 14-3-3 단백질을 부호화(encode)하는 7개 유전자가 존재한다: 인간에 대해, YWHAB(14-3-3 베타), YWHAE(14-3-3 입실론), YWHAG(14-3-3 감마), YWHAH(14-3-3 에타), YWHAQ(14-3-3 세타), 및 YWHAZ(14-3-3 제타). 진핵생물(eukaryotes)은, 다중 유전자가 발현되는 경우, 단일 14-3-3 유전자의 결실을 수용할 수 있으나, 모든 14-3-3의 결손(deletion)은 죽음을 야기한다.

14-3-3 단백질은 일반적으로 9 또는 10 알파 나선(helices)을 가지며, 이들의 아미노-말단 나선을 따라 동종(homo)- 및/또는 이종(hetero)-이합체(dimer) 상호작용을 형성하는 테트라트리코 펩티드 반복 수퍼패밀리(Tetratrico Peptide Repeat(TPR) superfamily)와 구조적으로 유사하다. 이들 단백질은, 2가 양이온 상호작용(divalent cation interaction), 인산화(phosphorylation)와 아세틸화(acetylation), 및 단백질분해 절단(proteolytic cleavage)을 포함한, 다수의 알려진 일반적인 개질 도메인(modification domains)을 포함한다.

14-3-3은 펩티드에 결합한다. 비-인산화된 리간드에 대한 결합이 보고되었음에도 불구하고, 인산화된 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 14-3-3 단백질에 대한 공통의 인식 모티프(common recognition motif)가 존재한다. 이러한 상호작용은, 자연 상태에서 양친매성(amphipathic)인, 이른바 결합 홈(groove) 또는 틈(cleft)을 따라 발생한다. 지금까지, 이들 단백질의 6개 클래스에 대한 결정 구조가 밝혀지고 공개적으로 기탁되었다.

구체적으로, 본 발명의 심혈관 질환 진단용 조성물에 바이오마커로 사용되는 상기 14-3-3 단백질은 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 14-3-3 감마, 14-3-3 에타, 14-3-3 세타 및 14-3-3 제타로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 14-3-3 단백질은 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 및 14-3-3 제타로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 6종의 14-3-3 단백질 아형인 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 14-3-3 감마, 14-3-3 에타, 14-3-3 세타 및 14-3-3 제타는 각각 서열번호 1 내지 6의 유전자에 의해 코딩될 수 있으며, 서열번호 7 내지 14의 아미노산 서열로 표현될 수 있다. 나아가, 이들 단백질은 서열번호 15 내지 21로 표시되는, 20개 내외(±3)의 아미노산 서열로 구성되는, 펩타이드 단편 및/또는 이의 이온에 의해 질량분석기법으로 동정될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예예서는 심근 비대 세포로부터 발현되는 일련의 단백질 중 정상 심근 세포에 비해 과발현되는 일련의 단백질을 확인하였다. 나아가, 인간 정상 폐 상피 세포주, 인간 폐암 세포주, 인간 정상 위 세포주, 인간 위암 세포주, 인간 정상 간 세포주, 및 인간 간암 세포주에서 발현되는 단백질의 종류 및 발현량과 비교하여 심근 비대 세포에서 특이적으로 발현량이 증가하는 단백질을 분리 및 동정하여, 14-3-3 단백질; 예컨대, 이의 6종 아형 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 14-3-3 감마, 14-3-3 에타, 14-3-3 세타 및 14-3-3 제타;의 발현이 정상 심근 세포에 비해 심근 비대 세포에서 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 특히 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 및 14-3-3 제타의 3종 아형은 정상 심근 세포는 물론 다른 조직의 정상 세포주 및 암 세포주에 비해 심근 비대 세포에서 특이적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이는 이들 단백질의 발현을 측정함으로써 심혈관 질환을 진단할 수 있음을 나타내는 것이다(도 6 및 7).

본 발명의 조성물을 이용하여 진단 가능한 심혈관 질환은 심근 비대 세포에 의해 유발되는 질환일 수 있다. 예컨대, 상기 심혈관 질환은 안지오텐신 II(angiotensin II; Ang II) 또는 엔도텔린-1(endothelin-1; ET-1)에 의해 유발되는 질환으로서, 구체적으로는 심근비대증(비대성 심근병증, hypertrophic cardiomyopathy), 심근조직 괴사(심근 경색증, myocardial infarction), 고혈압(hypertension), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 관동맥성 심장병(coronary heart disease), 재발협착증(restenosis), 심부전(heart failure), 전신성 고혈압(systemic hypertension), 폐동맥 고혈압(pulmonary hypertension), 관상동맥질환(coronary artery disease), 신부전증(renal failure), 만성 심부전증(chronic heart failure), 및 허혈(ischaemia)/재관류(reperfusion) 손상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이때, 상기 14-3-3 단백질의 수준을 측정하는 제제는 이에 특이적으로 결합하는 단백질, 항체, 앱타머, 수용체 또는 리간드를 포함할 수 있다. 또는 상기 14-3-3 단백질을 코딩하는 유전자를 검출할 수 있는 제제일 수 있다. 구체적으로, 14-3-3 단백질의 수준을 측정하는 제제는 이에 특이적으로 결합하는 키나아제, 포스파타아제, 막관통 수용체 및/또는 다양한 14-3-3 리간드일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 생체 시료 중 특이적으로 14-3-3 단백질 및/또는 이를 코딩하는 유전자를 정량할 수 있는 한, 해당 물질을 제한없이 사용할 수 있다. 상기 정량은 절대적인 양을 측정하는 것 뿐만 아니라 상대적인 양의 변화를 측정하는 것을 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 제2양태는 정상 심근 세포 및 심근 비대 세포의 용해물 또는 이의 분비물에 포함된 일련의 단백질을 분리하는 제1단계; 분리된 단백질 중 정상 심근 세포에 비해 심근 비대 세포에서 보다 많이 발현되는 단백질을 선별하는 제2단계; 및 단백질체학 데이터베이스 검색 엔진(proteomics database search engine)을 이용하여 상기 제2단계로부터 선택된 단백질을 동정하는 제3단계를 포함하는, 심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법을 제공한다.

제1양태에 사용된 14-3-3 단백질은 상기 본 발명의 바이오마터 선별방법을 통해 심혈관 질환 진단용 바이오마커로 동정되었다.

상기 선별방법의 제1단계에 사용되는 심근 비대 세포는 정상 심근 세포에 안지오텐신 II 또는 엔도텔린-1을 처리하여 준비할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또는 심혈관 질환이 발병한 개체의 조직으로부터 분리된 세포 또는 상기 개체로부터 수집한 혈액이나 혈청, 또는 이로부터 분리한 엑소좀을 사용할 수 있다.

예컨대, 상기 제1단계는 전기영동(electrophoresis), 웨스턴블롯(western blot) 또는 둘 모두에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 단백질 분리 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 민감성을 높이기 위하여, 상기 제1단계에 따른 단백질 분리에 앞서 세포, 세포의 용해물, 및/또는 이의 분비물로부터 단백질을 추출하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

나아가, 본 발명의 선별방법은 제2단계로부터 수득한 단백질을 액체 크로마토그래피-질량분석을 통해 분리분석하는 제2-1단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

예컨대, 상기 제2-1단계는 C18 트랩 나노컬럼을 구비한 나노 및 모세관 액체 크로마토그래피 컬럼과 연결된, 오비트랩(orbitrap) 질량 분석기와 선형 트랩 사극자(linear trap quadropole) 이온 트랩이 결합된 질량분석기를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, Nano-ESI(nEASY)-LTQ-Orbitrap Velos Pro장비를 이용하여 0.2% 포름산 수용액 및 0.2% 포름산 아세토니트릴 용액을 용매로 사용하여 비율을 조절하는 용매 구배에 의해, 직경 75 μm, 길이 2 cm의 C18 트랩 컬럼 및 이에 연결된 직경 75 μm, 길이 50 cm의 C18 분석 컬럼을 300 nL/min의 유속으로 통과시키고, 이어지는 오비트랩(orbitrap) 질량 분석기와 선형 트랩 사극자(linear trap quadropole) 이온 트랩이 결합된 질량분석기를 이용한 고해상도 질량분석을 통해 단백질을 분리 및 동정하였다. 질량분석시에는 배제시간(exclusion time) 180초, 반복 횟수(repeat count) 2, 반복 기간(repeat duration) 30초, 배제질량폭(exclusion mass width) 10 ppm 및 배제 크기 500의 변수를 사용하였으며, 단독으로 하전된 이온(singly charged ion)은 수집에서 제외하였다.

또한, 본 발명의 선별방법은 상기 제2-1단계에 앞서 제2단계로부터 수득한 단백질을 분해하는 제2-0단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 상기 제2-0단계는 당업계에 공지된 단백질 분해 방법을 제한없이 사용하여 수행할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 선별방법에 있어서, 상기 제3단계는 Mascot 또는 Sequest 엔진을 사용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 현재 당업계에 사용되는 Mascow 프로그램 및 Sequest 프로그램 등이 있으나, 상기 목적을 달성할 수 있는 한, 특정 프로그램에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, Sequest 프로그램을 이용하여 제3단계를 수행하였으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 전구체 이온 질량 오차(precursor ion mass tolerance) 10 ppm, 단편 이온 질량 오차(fragment ion mass tolerance) 0.6 Da, 최대 미절단(maximum missed cleavages) 2를 허용하는 조건 하에 수행할 수 있으나, 구체적인 수행 조건은 이에 제한되지 않는다.

나아가, 본 발명의 선별방법은 상기 제3단계로부터 동정된 단백질들에 대해 가상 시뮬레이션 프로그램(in silico pathway analysis tool)을 이용하여 신호전달 경로를 분석하는 제4단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제4단계를 통해, 선별된 단백질 후보군의 신호전달 경로 및 네트워크 등을 분석함으로써 해당 단백질의 심혈관 질환 진단용 바이오마커로서의 유용성을 검증할 수 있다.

본 발명의 제3양태는 제1양태의 조성물을 포함하는, 심혈관 질환 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 검체 내의 14-3-3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 정성 및/또는 정량적으로 검출하기 위하여 사용될 수 있다.

예컨대, 상기 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) 키트, RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 블랏팅(blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 제1양태의 조성물과 검체 중의 심혈관 질환 진단용 바이오마커인 14-3-3 단백질의 발현을 정성 및/또는 정량적으로 확인할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.

예컨대, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 단백질들을 코딩하는 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명의 키트는 상기 단백질들의 발현 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등일 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아민) 또는 TMB(테트라메틸 벤지딘)일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 질량분석기를 사용한 MRM 방법으로 14-3-3 단백질의 7종 아형을 동시에 정량분석함으로써 심혈관 질환 고위험군의 진단, 심근 비대 및 심근조직 괴사의 진단에 활용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 제4양태는 심혈관 질환 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생체 시료를 제1양태의 조성물과 반응시켜 상기 시료 중의 14-3-3 단백질의 수준을 측정하는 제1단계; 및 상기 제1단계로부터 측정된 14-3-3 단백질의 수준이 정상 개체에 대해 측정된 14-3-3 단백질의 수준과 비교하여 상기 제1단계로부터 측정된 14-3-3 단백질의 수준이 더 높은 경우 개체에 심혈관 질환이 발병한 것으로 판단하는 제2단계를 포함하는, 심혈관 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "개체"는 심혈관 질환을 진단하고자 하는 대상을 의미한다. 이때, 상기 개체는 사람을 비롯하여, 개, 말, 소, 쥐, 염소, 토끼, 닭, 오리, 거위 등의 알츠하이머성 치매가 발병될 수 있는 동물이라면 제한 없이 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, "정상 개체"란 심혈관 질환이 발병한 것으로 진단되지 않은 개체를 의미하며, 정상 개체로부터 분리된 시료와 심혈관 질환 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 비교함으로써, 심혈관 질환 발병이 의심되는 개체의 심혈관 질환 발병 여부를 정확하게 예측할 수 있다.

상기 생체 시료는 세포, 세포 용해물, 세포 분비물 또는 혈액, 혈청 또는 소변으로부터 분리된 엑소좀을 포함할 수 있다.

예컨대, mRNA 발현수준 측정은 생체 시료에서 바이오마커인 14-3-3 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA칩 분석법(DNA chip technology assay) 등이 있다.

예컨대, 단백질 발현수준 측정은 생체 시료에서 바이오마커인 14-3-3 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제5양태는 14-3-3 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 14-3-3 단백질 억제제는 14-3-3 단백질의 활성을 저해하거나, 14-3-3 단백질을 코딩하는 유전자에 작용하여 14-3-3 단백질의 발현을 저해하는 물질일 수 있으나, 14-3-3 단백질의 활성을 저해하거나 발현을 감소시킴으로써 심혈관 질환을예방하거나 치료할 수 있는 한, 작용기전 및/또는 방식에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 억제제는 14-3-3 단백질에 특이적으로 결합하여 활성을 저해할 수 있는 단백질이나 소분자 화합물 또는, 14-3-3 단백질의 발현을 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA 또는 silencing RNA) 또는 shRNA(short hairpin RNA 또는 small haripin RNA) 등 다양한 형태의 물질 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 심혈관 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여로 심혈관 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 14-3-3 단백질의 활성 및/또는 발현을 저해으로써 이와 관련 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분으로서 14-3-3 단백질 억제제를 조성물의 총중량을 기준으로 0.1 내지 75 중량%로, 보다 바람직하게는 1 내지 50 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.

경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

이때, 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명의 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 kg 당 1 내지 100 mg, 바람직하게는 5 내지 60 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 제6양태는 심혈관 질환 치료용 후보물질을 14-3-3 단백질을 과발현하는 세포에 처리하는 제1단계; 상기 심혈관 질환 치료용 후보물질을 처리 전과 후 14-3-3 단백질을 과발현하는 세포의 14-3-3 단백질 수준을 측정하여 비교하는 제2단계; 및 상기 심혈관 질환 치료용 후보물질 처리 후 세포에서 측정된 14-3-3 단백질 수준이 심혈관 질환 치료용 후보물질 처리 전 세포에 비해 감소된 경우 심혈관 질환 치료 효과를 갖는 것으로 판단하는 제3단계를 포함하는, 심혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

예컨대, 상기 14-3-3 단백질은 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 및 14-3-3 제타로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

예컨대, 상기 14-3-3 단백질을 과발현하는 세포는 정상 심근 세포에 안지오텐신 II, 엔도텔린-1 또는 둘 모두를 처리하여 준비한 심근 비대 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "후보물질"은 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이들로 한정되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기분자(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 또한, 천연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다. 달리 지시되지 않는 한, 제제, 물질 및 화합물은 호환성 있게(interchangeably) 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 후보물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다.

본 발명은 심혈관 질환 진단을 위한 새로운 바이오마커로서 14-3-3 단백질을 발굴하였으며, 이는 정상 심근 세포에 비해 심근 비대 세포에서 현저히 발현이 증가될 뿐만 아니라 다른 조직 세포 및 이의 암세포에 비해서도 현저히 증가된 발현량을 나타내므로 심혈관 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 나아가 이를 이용한 심혈관 질환 예방 또는 치료 용도 및 심혈관 질환 치료제의 스크리닝에도 활용될 수 있다.

도 1은 정상 심장 세포주(T0445, control) 및 이에 심근비대증을 유도하는 것으로 알려진 엔도테린-1(endothelin-1, ET-1) 또는 안지오텐신 II(angiotensin II, Ang II)를 처리한 지 각각 4시간 및 24시간 후, (A) 정상 심장 세포와 심근비대증이 유도된 세포의 면역염색법 결과, 및 (B) 세포 면적의 평균값을 나타낸 도이다. ET-1 또는 Ang II 처리 후 4시간 만에 심장 세포의 비대증이 유도되었고, 해당 효과는 24시간까지 지속되었다.
도 2는 정상 세포로부터 심근비대증이 유도되는 과정의 각 시점에서 세포로부터의 분비물(secretome)에서, 심혈관질환 환자에서 발현이 증가하는 것으로 알려진 바이오마커인, 양성 나트륨이뇨 펩티드(benign natriuretic peptide; BNP) 및 심방 나트륨이뇨 펩티드(atrial natriuretic peptide; ANP)를 웨스턴 블롯팅 방법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다. (A-1 및 A-2)는 ET-1을 처리 후 시간에 따른 마커의 발현의 변화를, (B-1 및 B-2)는 Ang II를 처리 후 시간에 따른 마커의 발현의 변화를 반(semi)-정량적으로 나타낸다. ET-1 및 Ang II 처리 후 15분 후로부터 BNP 및 ANP의 발현량이 모두 증가하기 시작하였으며 24시간까지 발현량의 증가와 감소를 2번 반복하였다.
도 3은 나노-액체 크로마토그래피-고분해능 질량분석기법을 활용하여 정상 심장 세포와 심근 비대 유도 세포에서 유래된 분비물을 비교·분석하고, 발현량에서 차이를 보이는 예컨대, 심근 비대 유도 세포에서 유의미하게 증가한, 단백질을 동정한 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 세포를 분주하고 각각 2개 플레이트씩 ET-1 또는 Ang II를 처리하여 심근 비대를 유도하여, 정상 심장 세포주와 함께 분석하였다. 총 4개 플레이트의 심근 비대 세포 시료를 2개 플레이트의 정상 세포주와 비교하여 존재비(abundance ratio)＞1.4의 심근 비대 유도 세포에서 발현이 증가된 단백질 중, 공통된 것을 선별하여 32개의 단백질을 검출하였다.
도 4는 도 3에 개시한 본 발명의 일 실시예에 따라 스크리닝된 심근 비대 유도 세포에서 과발현된 32가지 단백질 중 가장 존재비가 높은 14-3-3 단백질, (A) 14-3-3 감마(gamma, m/z 745.72), (B) 14-3-3 입실론(epsilon, m/z 696.65) 및 (C) 14-3-3 세타(theta, m/z 715.66)의 펩타이드 MS/MS 서열분석(sequencing) 결과를 나타낸 도이다. 공지의 심혈관질환 바이오마커 후보(볼드로 표시)는 제외하였으며, 전하(charge)와 교차 상관 스코어(cross-correalation score; Xcorr) 값이 가장 높은 펩티드 단편을 선택하였다.
도 5는 도 3에 개시한 본 발명의 일 실시예에 따라 스크리닝된 심근 비대 유도 세포에서 과발현된 32가지 단백질 중 가장 존재비가 높은 14-3-3 단백질, (A) 14-3-3 에타(eta, m/z 720.66), (B) 14-3-3 제타(zeta, m/z 711.33) 및 (C) 14-3-3 베타(beta, m/z 796.43)의 펩타이드 MS/MS 서열분석(sequencing) 결과를 나타낸 도이다. 공지의 심혈관질환 바이오마커 후보(볼드로 표시)는 제외하였으며, 전하와 교차 상관 스코어(Xcorr) 값이 가장 높은 펩티드 단편을 선택하였다.
도 6은 다양한 조직 세포 시료의 분비물과 세포 용해물(cell lysate)에서 발굴된 14-3-3 단백질 바이오마커 후보군 펩타이드들의 MRM 정량분석 결과를 나타낸 도이다. 14-3-3 단백질의 발현을 폐 정상 세포(L132), 폐암 세포(A549), 간암 세포(Hep-3B), 간 정상 세포(HRG), 위 정상 세포(HFE-145), 위암 세포(MKN-1), 심장 정상 세포(T0445)와 각각 ET-1와 Ang II로 심근 비대를 유도한 세포에 대해 비교·분석하였다. (A) 내지 (C)는 각각 14-3-3 입실론, 14-3-3 제타, 및 14-3-3 에타의 발현량을 나타내며, 좌측의 회색 바는 세포 용해물에서, 우측의 검은색 바는 분비물에 대한 결과는 나타낸다. 14-3-3 입실론, 14-3-3 제타, 및 14-3-3 베타의 경우, 분비물에서 다른 조직의 세포보다 심근 비대 유도 심장 세포에서 현저하게 높은 양의 14-3-3 단백질 동형(isotype)이 발현되었다.
도 7은 다양한 조직 세포 시료의 분비물과 세포 용해물에서 발굴된 14-3-3 단백질 바이오마커 후보군 펩타이드들의 MRM 정량분석 결과를 나타낸 도이다. 14-3-3 단백질의 발현을 폐 정상 세포(L132), 폐암 세포(A549), 간암 세포(Hep-3B), 간 정상 세포(HRG), 위 정상 세포(HFE-145), 위암 세포(MKN-1), 심장 정상 세포(T0445)와 각각 ET-1와 Ang II로 심근 비대를 유도한 세포에 대해 비교·분석하였다. (A) 및 (B)는 각각 14-3-3 베타, 및 14-3-3 세타의 발현량을 나타내며, 좌측의 회색 바는 세포 용해물에서, 우측의 검은색 바는 분비물에 대한 결과는 나타낸다. 14-3-3 입실론, 14-3-3 제타, 및 14-3-3 베타의 경우, 분비물에서 다른 조직의 세포보다 심근 비대 유도 심장 세포에서 현저하게 높은 양의 14-3-3 단백질 동형이 발현되었다.
도 8은 나노-액체크로마토그래피-고분해능 질량분석기로 측정한 secretome 단백질 분석결과를 IPA 프로그램으로 인-실리코 경로(in silico pathway)를 분석한 결과를 나타낸 도이다. (A) ET-1 처리 후, 및 (B) Ang II 처리 후의 세포 모두에서, Hippo 신호전달(signaling)이 현저하게 저하되었고, 당분해(glycolysis), 당신생합성(gluconeogenesis), 액틴 세포골격 신호전달(actin cytoskeleton signaling), 및 14-3-3 매개 신호전달이 현저하게 증가하였다. 이들은 모두 세포의 크기 조절, 증식, 및 사멸(apotosis)과 관련된 신호전달과 매우 밀접한 관계를 갖는 네트워크에 해당하여, 세포의 크기가 비대해 지면서, 이를 억제하기 위한 또는 세포의 사멸을 막기 위한 신호전달 네트워크가 활성화 된 것으로 보인다.
도 9는 마이크로-액체 크로마토그래피-질량분석기를 이용하여, 정상 개체(healthy control; HC) 및 급성 심근경색 환자군(acute myocardial infarction; AMI)으로부터 채취한 혈액으로부터 측정한 혈청 내 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 및 14-3-3 제타의 발현량을 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다(각각 n=5). 정상 개체에 비해 급성 심근경색 환자군에서 상기 3종 아형 모두의 발현이 현저히 증가하여 7 내지 8배 높게 검출되었다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 심근비대 유도 세포의 제조

인간 정상 심장 세포주 T0445를 60 mm 배양 접시에 60%까지 차도록(confluent) 배양한 후, 비대작용제로서 1 μM 안지오텐신 II(angiotensin II; Ang II) 및 200 nM 엔도텔린-1(endothelin-1; ET-1)(Sigma-Aldrich, Germany)으로 처리하였다. 면역 세포 화학 염색을 위하여 상기 배양한 세포를 유리 커버 스립에 분주(seeding)하고 비대작용제와 함께 각각 4시간 및 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 4% 포름알데히드(Sigma, USA)로 20분 동안 처리하여 세포를 고정하고, 면역 형광 염색을 수행하였다. 비특이적 결합을 차단하기 위하여 항체희석완충액(antibody dilution buffer; Abdil, 0.1% Triton X-100을 함유하는 2% 소혈청알부민 용액)을 30분 동안 사용하였다. 이후, 세포를 Abdil 용액에 혼합된 항-유전성 알파-액티닌(Abcam, USA)과 배양하고, 4℃에서 밤새도록 유지하였다. 트리스완충식염수(tris buffered saline; TBS)를 사용하여 종합적으로 세척하고, Abdil 용액에 혼합된 2차 항체, Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 IgG(H+L)(Thermo Fusher Scientific, USA)를 실온에서 2시간 동안 사용하였다. 핵을 Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific, USA)로 10분 동안 염색하고, 장착 용액을 이용하여 커버 슬립을 장착하고, 니콘 도립 현미경 Eclipse Ti-U(Carl Zeiss, Germany)를 사용하여 10× 및 20× 배율로 이미지를 획득하였다. 이미지 J 소프트웨어(Java-based image processing program, USA)를 사용하여 상기 획득한 이미지로부터 제곱 마이크로미터에서의 세포 면적을 산출하였다. 나아가, 평균 세포 표면적을 대조군에 대해 계산하고 각 세포 유형을 처리하였다. 하나의 유리 슬라이드로부터 3개의 영역을 계산하고, 총 3개의 유리 슬라이드를 측정하였다.

실시예 1: 세포주 배양, 단백질 추출 및 정량

심근 비대 세포에서 특이적으로 발현하는 마커를 발굴하기 위한 비교예로서 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul)에서 얻은 인간 정상 폐 상피 세포주 L132 및 인간 폐암 세포주 A549, 인간 위암 세포주 MKN-1, 인간 정상 위 세포주 HFE-145, 및 인간 간암 세포주 Hep3B와 인간 정상 간 세포주 Hepa RG(Thermo Fisher Scientific, MA, USA) 및 불멸화된 인간 심장 세포주 T0445(Abcam, CA)를 사용하였다. 구체적으로, 상기 일련의 세포주를 10% 열-불활성화 FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, USA) 함유 RPMI, DMEM, William's medium E, 및 Prigrow 배지에 정기적으로 배양하였다. 배양 플레이트는 가습 세포 인큐베이터에서 5% CO₂로 37℃에서 유지되었다. 60 mm 플라스티 배양 접시(Corning Life Science, Acton, MA, USA)에서 컨플루언시가 80% 이상될 때까지(약 2×10⁶ 세포/cm²) 배양하였다. HFE-145, MKN-1, L132, A549, Hep3B, Hepa RG, T0445 및 ET-1, Ang II 유도 T0445 세포의 분비물(secretome)을 차가운 PBS를 사용하여 수집하고, 다시 PBS로 2회 세척한 후, TNN-EDTA 용해 완충액(Thermo Scientific, Germany), 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Roche Diagnostics GmbH, Germany)을 혼합하여 세포막을 분해하고 단백질을 수집하였다. 상층액을 수집하기 위해 시료를 4℃에서 15분 동안 10,000×g로 원심분리하였다. 마지막으로 바이신코닉산(bicinchoninic acid; BCA) 키트(Thermo Scientific, USA)를 사용하여 제조업체의 매뉴얼에 따라 수집한 상층액으로부터 단백질 농도를 측정하였다.

실시예 2: 분비물 준비

세포 배양 및 세포 배지(cell media; CM) 수집의 첫 단계는 신뢰할 수 있는 분비물(secretome) 분석에 가장 중요하며, 분석할 시료의 품질에 큰 영향을 받는다. 배지를 수집하기 전에, 완전히 합류된 세포 플레이트 배지를 24시간 동안 무혈청 배지로 교체하였다. 불멸화된 인간 심근 세포에서 비대를 유도하기 위해, 1 μM Ang II 또는 200 nM ET-1을 상이한 시간 간격으로 첨가하였다. 소정의 시간 동안 배야한 후, CM을 수집하고, 4000 RCF로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 온전한 세포를 펠렛화한 후, 상층액을 수집하고 임의의 세포 잔해물을 제거하였다. 수집한 상층액을 새로운 튜브에 옮기고 동결 건조기(CHRIST ALPHA 1-2 LD plus, Sigma)로 동결 건조시켰다.

실시예 3: 웨스턴블롯

각 시료로부터 30 μg의 CM을 1-D 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하여 분리한 후, 니트로셀룰로오스 막(Pall Corporation, USA)에 옮겼다. 막을 차단하기 위해, 5% 탈지유를 함유한 PBS로 1시간 동안 처리한 후, 0.5% 트윈 20(TBST)을 포함하는 TBS로 세척하였다. 상기와 같이 처리한 니트로셀룰로오스 막을 1차 항체 항-ANP, 항-BNP(이상 Thermo Fisher Scientific, USA), 및 항-β-액틴(Cell Signaling, USA)과 함께 밤새도록 인큐베이션 하였다. 상기 1차 항체와 인큐베이션 한 막을 TBST로 4회 세척한 후, sheep HRP(horseradish peroxidase) 접합된 이차 항체(GeneTex, USA)를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 웨스턴블롯을 위한 내강 시약(Santa Cruz Biotechnology, USA)을 화학 발광 이미징 시스템인 Ez-Capture MG(ATTO, NY, USA)에 의한 밴드의 가시화에 사용하였다.

실시예 4: 단백질 분해

각 시료(200 μg)의 농도를 측정한 후, 속도 진공 건조기에서 3시간 동안 건조시켰다. 건조된 시료를 6.0 M 우레아(Sigma, USA)로 재구성하고, 200 mM 디티오트레이트톨(dithiothreitol; DTT, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)에서 37℃로 30분 동안 배양함으로써 환원시켰다. 이어서, 100 mM 인돌-3-아세트산(indole-3-acetic acid; IAA, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)에서 37℃로 30분 동안 알킬화시켰다. 상기 시료에 최종 프로테아제:단백질 비율 1:30(w/w)로 트립신을 보충하고, 혼합물을 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 이후 C18 스핀 컬럼(Pierce, Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용하여 제조업자의 매뉴얼에 따라 시료를 세척하였다. 세척한 시료를 진공 동결 건조기로 건조시키고 0,1% 포름산(Thermo Scientific, Spain)을 포함하는 50% 메탄올로 재구성하였다.

실시예 5: 나노-액체 크로마토그래피-고분해능 질량분석기에 의한 분석

상기 실시예 4에 따라 수득한 시료를 EASY-nLC1000 액체 크로마토그래피 시스템이 연결된 LTQ Orbitrap Velos Pro 질량분석기(Thermo Fischer Scientific, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 용매로는 0.1% 포름산이 함유된 증류수(0.1% formic acid in DI warer, 용매 A)와 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴(0.1% formic acid in acetonitrile, 용매 B)을 준비하여 사용하였다. 펩티드를 함유하는 시료를 Acclaim PepMap 100 트랩 컬럼(C18, 75 μm×2 cm, nanoViper, 100 Å, 3 μm, Thermo Scientific)을 통해 로딩하고, 이어지는 Acclaim PepMap 이지-스프레이 분석 컬럼(C18, 75 μm×50 cm, nanoViper, 100 Å, 2 μm, Thermo Scientific)에 의해 펩티드를 분리하였다. 각 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석(LC-MS/MS)을 위해, 시료를 마이크로 리터 픽업이 있는 프리 컬럼에서 최대 2 μL 로딩했다. 펩티드의 분리는 120분에 걸쳐 5 내지 40%의 구배로 이동상에서 용매 B를 사용하여 250 nL/분의 유속으로 달성되었다. 용출된 펩티드는 +2.1 kV의 분무 전압을 사용하여 Orbitrap Velos 질량 분석기로 연구하였다. 전체 스캔은 m/z 300에서 2000에서 60,000의 해상도로 획득하였다. MS/MS 스캔 방법의 10가지 데이터-의존적 획득에 의해 관찰된 Top N 모드는 35 eV의 정규 에너지로 충돌유도분리(collision-induced dissociation; CID) 에너지를 사용하여 적용하였다. 이전에 단편화된 전구체 이온의 동적 배제를 위하여, 신호 임계 값 1000, 배제질량폭(exclusion mass width) 10 ppm, 배제시간(exclusion time) 180초, 반복 지속 시간 30초, 반복 횟수 2 및 분리 폭 1 m/z의 변수를 사용하였다. 단일 하전된 이온(singly charged ion)은 수집에서 제외하였다.

실시예 6: Sequest를 이용한 단백질 동정

Proteome Discoverer v.2.2 프로그램(Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, USA)을 이용하여 상기 실시예 5를 통해 액체 크로마토그래피-고분해능 질량분석기로 검출된 피크로부터 단백질을 동정하였다. 전구체 이온 질량 오차(precursor ion mass tolerance)는 10 ppm, 단편 이온 질량 오차(fragment ion mass tolerance)는 0.6 Da, 최대 미절단(maximum missed cleavages)은 2를 허용하는 것으로, 가변적 개질(variable modification)은 산화(+15.995 Da)와 카바미도메틸(carbamidomethyl, +57.021 Da)을 사용하였다. 펩티드 매칭 기준은 SEQUEST HT 스코어 ＞1를 사용하였으며, 교차 상관 스코어(cross-correalation score; Xcorr) 기준은 +1 펩티드에 대해 ＞1.2, +2 펩티드에 대해 ＞2.2, +3 펩티드에 대해 ＞3.0이었다. 단백질 당 2개 이상의 특이적인 펩티드가 발견되었을 때, 단백질을 동정하였다. 서로 다른 그룹간의 통계적 처리는 카이제곱 검정법(chi-square test)을 사용하였다.

실시예 7: 펩티드 바이오마커 후보군 정량

용액 내 소화 후 시료를 LTQ Orbitrap Velos pro와 연결된 UHPLC-ESI-MS/MS 시스템으로 분석하였다. 5 μL의 시료를 로딩하고, 4 μm Proteo Phenomenex(90 Å 기공, LC 컬럼 250×4.6 mm, Jupiter, USA)를 사용하여 분리하였다. 분리 구배는 용매 구배를 사용하여 30분 동안 0.3 mL/분으로 수행하였으며, 0.1% 포름산이 함유된 증류수(0.1% formic acid in DI warer, 용매 A)와 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴(0.1% formic acid in acetonitrile, 용매 B)을 준비하여, 다음과 같이 용매 B의 선행 구배를 사용하였다: 0분 0%, 17분 100%, 21분 100%, 22분 0%, 30분 0%. 15000의 해상도에서 전체 MS 스캔을 진행하였으며, 300 내지 2000 m/z의 스캔 범위로 처리하였다. 고분해능 질량 분석기의 분무 전압은 +3.9 kV였으며, 이를 통해 용리된 펩티드를 검사하였다. 총 스캔 사건은 7이고 충돌 에너지는 25였다. 14-3-3 감마, 엡실론, 세타, 에타, 제타, 베타 및 액틴의 전구체 이온 및 이에 상응하는 일치 생성물 이온은 각각 m/z=745.7, 696.6, 715.6, 720.6, 711.3, 796.4 및 652.0와 765.3, 742.3, 871, 698.7, 742.2, 761.5 및 595.0이었다.

실시예 8: 통계적 분석

모든 데이터는 3회 결과에 대해 평균±표준편차(standard deviation; SD)로 제시되었으며, 웨스턴블롯 결과는 β-액틴 및 대조군과 비교하여 배수 변화로 보고하였다. 두 그룹의 차이는 스튜던트 테스트(Student's test, Origin 2017, USA)에 의해 결정되었으며, p-값이 ＜0.05인 그룹만을 보고하였다.

실시예 8: 인간 혈장 시료의 분석

건강한 정상 개체 및 급성심근경색 환자로부터 채취한 혈장 시료를 이용하여 고려대 의과대학병원에서 기관의 생명윤리심의위원회(Institutional Review Board KUGH12118-005)로부터 승인을 받아 분석을 진행하였다. 구체적으로, 각각 5개의 시료에 대해 마이크로-액체 크로마토그래피-질량분석기를 사용하여 단백질 단편을 정량적으로 분석하였다. MRM 총 스캔 사건은 4이고 충돌 에너지는 25였다. 이때, 14-3-3 입실론, 제타, 베타 및 액틴의 전구체 이온과 이에 상응하는 일치 생성물 이온은 각각 m/z=696.6, 711.3, 796.4 및 652.0와 742.3, 742.2, 761.5 및 595.0이었다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Method for screening biomarkers diagnosing cardiovascular diseases, biomarkers screened thereby and method for diagnosing cardiovascular diseases using the same <130> KPA200227-KR <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 beta <400> 1 ggaagtggag ctaccgccac cgccgccgcc gattccggag ccggggtagt cgccgccgcc 60 gccgccgctg cagccactgc aggcaccgct gccgccgcct gagtagtggg cttaggaagg 120 aagaggtcat ctcgctcgga gcttcgctcg gaagggtctt tgttccctgc agccctccca 180 cgggaatgac aatggataaa agtgagctgg tacagaaagc caaactcgct gagcaggctg 240 agcgatatga tgatatggct gcagccatga aggcagtcac agaacagggg catgaactct 300 ccaacgaaga gagaaatctg ctctctgttg cctacaagaa tgtggtaggc gcccgccgct 360 cttcctggcg tgtcatctcc agcattgagc agaaaacaga gaggaatgag aagaagcagc 420 agatgggcaa agagtaccgt gagaagatag aggcagaact gcaggacatc tgcaatgatg 480 ttctggagct gttggacaaa tatcttattc ccaatgctac acaaccagaa agtaaggtgt 540 tctacttgaa 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tctggtattc actttactat gtgatagaag tagcatgttg ctgccagaat acaagcattg 1620 cttttggcaa attaaagtgc atgtcatttc ttaatacact agaaagggga aataaattaa 1680 agtacacaag tccaagtcta aaactttagt acttttccat gcagatttgt gcacatgtga 1740 gagggtgtcc agtttgtcta gtgattgtta tttagagagt tggaccacta ttgtgtgttg 1800 ctaatcattg actgtagtcc caaaaaagcc ttgtgaaaat gttatgccct atgtaacagc 1860 agagtaacat aaaataaaag tacattttat aaaccattta ctatggcttt gtaacaattg 1920 catacccata ttttaaggga caggtgaatt tactactttc taaagtttat tgatacttcc 1980 cttttatgta aaatgtagta gtgataccta tatttccaca ttgtgcattg tgacacactt 2040 gtctagggat gcctggaagt gtataaaatt ggactgcatt tcttagagtg ttttactata 2100 gatcagtctc atgggccatc tcttcctcag atgtaaatga tatctggtta agtgttatat 2160 ggaataaagt ggacatttta aaactagcaa agttaa 2196 <210> 6 <211> 5085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 zeta <400> 6 gacacagatc cgccatgaca aaggaggaga gtcggggact tgagccgtgg ctccgacttg 60 ggcggagcct ggaggggggt ggttgcgata cgcggaccgg agaatttgca ctttaaagtc 120 cgggtctgcc cgttttcgtt tcacagtaac cgacgtctca agtcagaaca tccagtcatg 180 gataaaaatg agctggttca gaaggccaaa ctggccgagc aggctgagcg atatgatgac 240 atggcagcct gcatgaagtc tgtaactgag caaggagctg aattatccaa tgaggagagg 300 aatcttctct cagttgctta taaaaatgtt gtaggagccc gtaggtcatc ttggagggtc 360 gtctcaagta ttgaacaaaa gacggaaggt gctgagaaaa aacagcagat ggctcgagaa 420 tacagagaga aaattgagac ggagctaaga gatatctgca atgatgtact gtctcttttg 480 gaaaagttct tgatccccaa tgcttcacaa gcagagagca aagtcttcta tttgaaaatg 540 aaaggagatt actaccgtta cttggctgag gttgccgctg gtgatgacaa gaaagggatt 600 gtcgatcagt cacaacaagc ataccaagaa gcttttgaaa tcagcaaaaa ggaaatgcaa 660 ccaacacatc ctatcagact gggtctggcc cttaacttct ctgtgttcta ttatgagatt 720 ctgaactccc cagagaaagc ctgctctctt gcaaagacag cttttgatga agccattgct 780 gaacttgata cattaagtga agagtcatac aaagacagca cgctaataat gcaattactg 840 agagacaact tgacattgtg gacatcggat acccaaggag acgaagctga agcaggagaa 900 ggaggggaaa attaaccggc cttccaactt ttgtctgcct cattctaaaa tttacacagt 960 agaccatttg tcatccatgc tgtcccacaa atagtttttt gtttacgatt tatgacaggt 1020 ttatgttact tctatttgaa tttctatatt tcccatgtgg tttttatgtt taatattagg 1080 ggagtagagc cagttaacat ttagggagtt atctgttttc atcttgaggt ggccaatatg 1140 gggatgtgga atttttatac aagttataag tgtttggcat agtacttttg gtacattgtg 1200 gcttcaaaag ggccagtgta aaactgcttc catgtctaag caaagaaaac tgcctacata 1260 ctggtttgtc ctggcgggga ataaaaggga tcattggttc cagtcacagg tgtagtaatt 1320 gtgggtactt taaggtttgg agcacttaca aggctgtggt agaatcatac cccatggata 1380 ccacatatta aaccatgtat atctgtggaa tactcaatgt gtacaccttt gactacagct 1440 gcagaagtgt tcctttagac aaagttgtga cccattttac tctggataag ggcagaaacg 1500 gttcacattc cattatttgt aaagttacct gctgttagct ttcattattt ttgctacact 1560 cattttattt gtatttaaat gttttaggca acctaagaac aaatgtaaaa gtaaagatgc 1620 aggaaaaatg aattgcttgg tattcattac ttcatgtata tcaagcacag cagtaaaaca 1680 aaaacccatg tatttaactt ttttttagga tttttgcttt tgtgattttt ttttttttga 1740 tacttgccta acatgcatgt gctgtaaaaa tagttaacag ggaaataact tgagatgatg 1800 gctagctttg tttaatgtct tatgaaattt tcatgaacaa tccaagcata attgttaaga 1860 acacgtgtat taaattcatg taagtggaat aaaagtttta tgaatggact tttcaactac 1920 tttctctaca gcttttcatg taaattagtc ttggttctga aacttctcta aaggaaattg 1980 tacatttttt gaaatttatt ccttattccc tcttggcagc taatgggctc ttaccaagtt 2040 taaacacaaa atttatcata acaaaaatac tactaatata actactgttt ccatgtccca 2100 tgatcccctc tcttcctccc caccctgaaa aaaatgagtt cctatttttt ctgggagagg 2160 gggggattga ttagaaaaaa atgtagtgtg ttccatttaa aattttggca tatggcattt 2220 tctaacttag gaagccacaa tgttcttggc ccatcatgac attgggtagc attaactgta 2280 agttttgtgc ttccaaatca ctttttggtt tttaagaatt tcttgatact cttatagcct 2340 gccttcaatt ttgatccttt attctttcta tttgtcaggt gcacaagatt accttcctgt 2400 tttagccttc tgtcttgtca ccaaccattc ttacttggtg gccatgtact tggaaaaagg 2460 ccgcatgatc tttctggctc cactcagtgt ctaaggcacc ctgcttcctt tgcttgcatc 2520 ccacagacta tttccctcat cctatttact gcagcaaatc tctccttagt tgatgagact 2580 gtgtttatct ccctttaaaa ccctacctat cctgaatggt ctgtcattgt ctgcctttaa 2640 aatccttcct ctttcttcct cctctattct ctaaataatg atggggctaa gttataccca 2700 aagctcactt tacaaaatat ttcctcagta ctttgcagaa aacaccaaac aaaaatgcca 2760 ttttaaaaaa ggtgtatttt ttcttttaga atgtaagctc ctcaagagca gggacaatgt 2820 tttctgtatg ttctattgtg cctagtacac tgtaaatgct caataaatat tgatgatggg 2880 aggcagtgag tcttgatgat aagggtgaga aactgaaatc ccaaacactg ttttgttgct 2940 tgttttatta tgacctcaga ttaaattggg aaatattggc ccttttgaat aattgtccca 3000 aatattacat tcaaataaaa gtgcaatgga gaccttgggg tctttatttc caggagaaaa 3060 gataccttct gcatctaggg caacaatcct tttccctcgc agctctttct tttacctcac 3120 ttactgattt ctcctgaccc ccaagccaag gaggtaaaat aattatatat atatatatat 3180 atatatatat atatatataa agtaattata ttttatagct agactgaaga ggtgggaatt 3240 tttttgttgt tttttttttt tttggagaca agagtcttgc tctgtcaccc aggcttgagt 3300 gcagtggtgc gatctcggct gagtgcaacc tccgcctgct gggttcaagc gattctcctg 3360 cctcagcctc ccaagtagct gggattacag gtgcccgcca ccacacctgg ctaatttttg 3420 tgtttttagt agagacaggg tttcaccatg ttgtccaggc tggtcttgaa ttcccgacct 3480 caggcaatcc gcccatctca acctcccaaa gtgctgggat tacaggcata agccaccgcg 3540 cccagtagag atgtgatatt attcaagtaa ataaaacctg aaacttggca catttgccta 3600 tttaatgtgc atcagtcatc tgaactaggt tgatcctgga ataatgaaaa cacttcacta 3660 gtattaacta atgttttcta catagtagtt cccaatagat taaggaaaat ttccaacctg 3720 agattctttg ttttggaatt tgaataatgt gtttgtaact attccttgat tgtcccaaat 3780 ccaggcttta cgtctgcttt tgtcaatgta acatcctagt gccaggaaat tggaaaatcc 3840 aatgactttt tgtgtgtaaa gtactggaat ttttttgttc gtttgttttt aagacggagt 3900 gtcaactctc gcccaggctg gggtgcagtg gcctgatctc ggctcactgc aaccttctcc 3960 tcccaggctg aagtgattct cctgcctcag cctcgcaagt agctgggact gcaggcatgt 4020 gccaccactc ctggctaatt atttgtattt ttagtagaga gagggtttca ccgtgttagc 4080 catgatggtc tcattctcct gaccttgtga tccgcccacc tcggcctccc aaagtgctgg 4140 gattacaggc gtgagccact gtgcccaccc tggtatgttt tttttaaatt ggccacttaa 4200 gagttgtcct tcagaaagtg gagcagcagt gtgattagta aaaacgatgg gctttcctgc 4260 agctctggct tatggtcttt gtttttccag ttaacagctg ttacttcatg ctgttatagg 4320 gggtgggggg agaaagagaa agaatatgtc tagtggctta attttggggc tcaatttgtt 4380 tattatgttt ttcctgcaaa agagtcacca gtcttgtcat ggctcaatgc atattttaaa 4440 atgagtcaaa gccaatttgg aagctgctat cttaggttat ttgtagtcag gcttcaaatg 4500 gagagtgaaa ctttgacttt gaaaactggt gctctatgct caatgatggt cttacacatt 4560 cctctaggga aaggtcaaga aataaatttg gcttgattgt attctctcat ttaccatata 4620 ggaaatacta tggtagaact gaaaatatgt acaatagtaa agtggtggct gagactgggc 4680 acttggaaaa tagacttgga ttcttttcta agtgtgaaac taattaaata cttttatgtg 4740 actggtagta gtcacagtct ccttgattga ttctagttcc ttttcaaagt ggagagacct 4800 gaatatagat tgtaacagga tgtccaacct tgccagacaa gcaggcatat atgtctctgg 4860 gatgcagaag cagttacaag ttaatatatt taagcataat gttagccaat cctaggtgat 4920 accagagatg tgaatatttg atcatatttg agttcattcc ttgaaagtcc aaacctaact 4980 ggtcttaatt gattacttct tagtattccg aattttagaa tttaaaaccc tatgaatttt 5040 cagtttgtgc ttacattttc taacattgga tgtttgcttt ggcca 5085 <210> 7 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 beta <400> 7 Met Thr Met Asp Lys Ser Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu 1 5 10 15 Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Ala Val Thr 20 25 30 Glu Gln Gly His Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val 35 40 45 Ala Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile 50 55 60 Ser Ser Ile Glu Gln Lys Thr Glu Arg Asn Glu Lys Lys Gln Gln Met 65 70 75 80 Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Cys 85 90 95 Asn Asp Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Pro Asn Ala Thr 100 105 110 Gln Pro Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe 115 120 125 Arg Tyr Leu Ser Glu Val Ala Ser Gly Asp Asn Lys Gln Thr Thr Val 130 135 140 Ser Asn Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys 145 150 155 160 Glu Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe 165 170 175 Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser 180 185 190 Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu 195 200 205 Asn Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg 210 215 220 Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Glu Asn Gln Gly Asp Glu Gly Asp 225 230 235 240 Ala Gly Glu Gly Glu Asn 245 <210> 8 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 epsilon <400> 8 Met Asp Asp Arg Glu Asp Leu Val Tyr Gln Ala Lys Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Glu Met Val Glu Ser Met Lys Lys Val Ala Gly 20 25 30 Met Asp Val Glu Leu Thr Val Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Ile Gly Ala Arg Arg Ala Ser Trp Arg Ile Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Glu Glu Asn Lys Gly Gly Glu Asp Lys Leu Lys 65 70 75 80 Met Ile Arg Glu Tyr Arg Gln Met Val Glu Thr Glu Leu Lys Leu Ile 85 90 95 Cys Cys Asp Ile Leu Asp Val Leu Asp Lys His Leu Ile Pro Ala Ala 100 105 110 Asn Thr Gly Glu Ser Lys Val Phe Tyr Tyr Lys Met Lys Gly Asp Tyr 115 120 125 His Arg Tyr Leu Ala Glu Phe Ala Thr Gly Asn Asp Arg Lys Glu Ala 130 135 140 Ala Glu Asn Ser Leu Val Ala Tyr Lys Ala Ala Ser Asp Ile Ala Met 145 150 155 160 Thr Glu Leu Pro Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn 165 170 175 Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Asp Arg Ala Cys 180 185 190 Arg Leu Ala Lys Ala Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr 195 200 205 Leu Ser Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu 210 215 220 Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Met Gln Gly Asp Gly Glu 225 230 235 240 Glu Gln Asn Lys Glu Ala Leu Gln Asp Val Glu Asp Glu Asn Gln 245 250 255 <210> 9 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 gamma <400> 9 Met Val Asp Arg Glu Gln Leu Val Gln Lys Ala Arg Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Ala Met Lys Asn Val Thr Glu 20 25 30 Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Thr Ser Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Ile Glu 65 70 75 80 Met Val Arg Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Ala Val 85 90 95 Cys Gln Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Asn Tyr Leu Ile Lys Asn Cys 100 105 110 Ser Glu Thr Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly 115 120 125 Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Thr Gly Glu Lys Arg Ala 130 135 140 Thr Val Val Glu Ser Ser Glu Lys Ala Tyr Ser Glu Ala His Glu Ile 145 150 155 160 Ser Lys Glu His Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala 165 170 175 Leu Asn Tyr Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Cys His Leu Ala Lys Thr Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Asp 225 230 235 240 Asp Gly Gly Glu Gly Asn Asn 245 <210> 10 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 eta <400> 10 Met Gly Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala Glu Gln 1 5 10 15 Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ser Ala Met Lys Ala Val Thr Glu 20 25 30 Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Asp Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala 35 40 45 Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser 50 55 60 Ser Ile Glu Gln Lys Thr Met Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Leu Glu 65 70 75 80 Lys Val Lys Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Thr Val 85 90 95 Cys Asn Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Cys 100 105 110 Asn Asp Phe Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly 115 120 125 Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Ser Gly Glu Lys Lys Asn 130 135 140 Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Phe Glu Ile 145 150 155 160 Ser Lys Glu Gln Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala 165 170 175 Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln 180 185 190 Ala Cys Leu Leu Ala Lys Gln Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu 195 200 205 Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Glu 225 230 235 240 Glu Ala Gly Glu Gly Asn 245 <210> 11 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 theta <400> 11 Met Glu Lys Thr Glu Leu Ile Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Thr Cys Met Lys Ala Val Thr Glu Gln 20 25 30 Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr 35 40 45 Lys Asn Val Val Gly Gly Arg Arg Ser Ala Trp Arg Val Ile Ser Ser 50 55 60 Ile Glu Gln Lys Thr Asp Thr Ser Asp Lys Lys Leu Gln Leu Ile Lys 65 70 75 80 Asp Tyr Arg Glu Lys Val Glu Ser Glu Leu Arg Ser Ile Cys Thr Thr 85 90 95 Val Leu Glu Leu Leu Asp Lys Tyr Leu Ile Ala Asn Ala Thr Asn Pro 100 105 110 Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Phe Arg Tyr 115 120 125 Leu Ala Glu Val Ala Cys Gly Asp Asp Arg Lys Gln Thr Ile Asp Asn 130 135 140 Ser Gln Gly Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Asp Ile Ser Lys Lys Glu Met 145 150 155 160 Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val 165 170 175 Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Asn Pro Glu Leu Ala Cys Thr Leu Ala 180 185 190 Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Asn Glu 195 200 205 Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn 210 215 220 Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Ser Ala Gly Glu Glu Cys Asp Ala Ala 225 230 235 240 Glu Gly Ala Glu Asn 245 <210> 12 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 zeta <400> 12 Met Asp Lys Asn Glu Leu Val Gln Lys Ala Lys Leu Ala Glu Gln Ala 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ala Cys Met Lys Ser Val Thr Glu Gln 20 25 30 Gly Ala Glu Leu Ser Asn Glu Glu Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr 35 40 45 Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Val Ser Ser 50 55 60 Ile Glu Gln Lys Thr Glu Gly Ala Glu Lys Lys Gln Gln Met Ala Arg 65 70 75 80 Glu Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Thr Glu Leu Arg Asp Ile Cys Asn Asp 85 90 95 Val Leu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Leu Ile Pro Asn Ala Ser Gln Ala 100 105 110 Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr 115 120 125 Leu Ala Glu Val Ala Ala Gly Asp Asp Lys Lys Gly Ile Val Asp Gln 130 135 140 Ser Gln Gln Ala Tyr Gln Glu Ala Phe Glu Ile Ser Lys Lys Glu Met 145 150 155 160 Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val 165 170 175 Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Pro Glu Lys Ala Cys Ser Leu Ala 180 185 190 Lys Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu 195 200 205 Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn 210 215 220 Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Thr Gln Gly Asp Glu Ala Glu Ala Gly 225 230 235 240 Glu Gly Gly Glu Asn 245 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 beta fragment <400> 13 Glu Lys Ile Glu Ala Glu Leu Gln Asp Ile Cys Asn Asp Val Leu Glu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Lys 20 <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 epsilon fragment <400> 14 Ala Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu Glu 1 5 10 15 Ser Tyr Lys <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 gamma fragment <400> 15 Glu Leu Glu Ala Val Cys Gln Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Asn Tyr 1 5 10 15 Leu Ile Lys <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 eta fragment <400> 16 Gln Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Asn Glu Asp 1 5 10 15 Ser Tyr Lys <210> 17 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 theta fragment <400> 17 Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Asn Glu Asp 1 5 10 15 Ser Tyr Lys <210> 18 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 14-3-3 zeta fragment <400> 18 Thr Ala Phe Asp Glu Ala Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Ser Glu Glu 1 5 10 15 Ser Tyr Lys

Claims (22)

14-3-3 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 14-3-3 단백질은 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 14-3-3 감마, 14-3-3 에타, 14-3-3 세타 및 14-3-3 제타로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 심혈관 질환 진단용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 14-3-3 단백질은 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 및 14-3-3 제타로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 심혈관 질환 진단용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 심혈관 질환은 심근 비대 세포에 의해 유발되는 질환인 것인, 심혈관 질환 진단용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 심혈관 질환은 안지오텐신 II(angiotensin II; Ang II) 또는 엔도텔린-1(endothelin-1; ET-1)에 의해 유발되는 질환인 것인, 심혈관 질환 진단용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 심혈관 질환은 심근비대증(비대성 심근병증, hypertrophic cardiomyopathy), 심근조직 괴사(심근 경색증, myocardial infarction), 고혈압(hypertension), 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis), 관동맥성 심장병(coronary heart disease), 재발협착증(restenosis), 심부전(heart failure), 전신성 고혈압(systemic hypertension), 폐동맥 고혈압(pulmonary hypertension), 관상동맥질환(coronary artery disease), 신부전증(renal failure), 만성 심부전증(chronic heart failure), 및 허혈(ischaemia)/재관류(reperfusion) 손상으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 심혈관 질환 진단용 조성물.

제1항에 있어서,
상기 14-3-3 단백질의 수준을 측정하는 제제는 이에 특이적으로 결합하는 단백질, 항체, 앱타머, 수용체 또는 리간드를 포함하는 것인, 심혈관 질환 진단용 조성물.

정상 심근 세포 및 심근 비대 세포의 용해물 또는 이의 분비물에 포함된 일련의 단백질을 분리하는 제1단계;
분리된 단백질 중 정상 심근 세포에 비해 심근 비대 세포에서 보다 많이 발현되는 단백질을 선별하는 제2단계; 및
단백질체학 데이터베이스 검색 엔진(proteomics database search engine)을 이용하여 상기 제2단계로부터 선택된 단백질을 동정하는 제3단계를 포함하는,
심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법.

제8항에 있어서,
상기 심근 비대 세포는 정상 심근 세포에 안지오텐신 II 또는 엔도텔린-1을 처리하여 준비된 것인, 심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법.

제8항에 있어서,
상기 제1단계는 전기영동(electrophoresis), 웨스턴블롯(western blot) 또는 둘 모두에 의해 수행되는 것인, 심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법.

제8항에 있어서,
제2단계로부터 수득한 단백질을 액체 크로마토그래피-질량분석을 통해 분리분석하는 제2-1단계를 추가로 포함하는 것인, 심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법.

제11항에 있어서,
제2-1단계에 앞서 제2단계로부터 수득한 단백질을 분해하는 제2-0단계를 추가로 포함하는 것인, 심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법.

제8항에 있어서,
상기 제3단계는 Mascot 또는 Sequest 엔진을 사용하여 수행되는 것인, 심혈관 질환 진단용 바이오마커의 선별방법.

제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 심혈관 질환 진단용 키트.

제14항에 있어서,
상기 키트는 마이크로어레이, 앱타머 칩 키트, 엘라이자(ELISA, enzyme linked immunosorbent assay) 키트, RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzymelinked immunosorbent assay) 키트, 블랏팅(blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트, 단백질 칩 키트, MRM(Multiple reaction monitoring) 키트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 심혈관 질환 진단용 키트.

심혈관 질환 발병이 의심되는 개체로부터 분리된 생체 시료를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물과 반응시켜 상기 시료 중의 14-3-3 단백질의 수준을 측정하는 제1단계; 및
상기 제1단계로부터 측정된 14-3-3 단백질의 수준이 정상 개체에 대해 측정된 14-3-3 단백질의 수준과 비교하여 상기 제1단계로부터 측정된 14-3-3 단백질의 수준이 더 높은 경우 개체에 심혈관 질환이 발병한 것으로 판단하는 제2단계를 포함하는,
심혈관 질환 진단을 위한 정보제공방법.

제16항에 있어서,
상기 생체 시료는 세포, 세포 용해물, 세포 분비물 또는 혈액, 혈청 또는 소변으로부터 분리된 엑소좀을 포함하는 것인, 심혈관 질환 진단을 위한 정보제공방법.

14-3-3 단백질 억제제를 유효성분으로 포함하는, 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

제18항에 있어서,
상기 14-3-3 단백질 억제제는 14-3-3 단백질의 활성을 저해하거나, 14-3-3 단백질을 코딩하는 유전자에 작용하여 14-3-3 단백질의 발현을 저해하는 물질인 것인, 약학적 조성물.

심혈관 질환 치료용 후보물질을 14-3-3 단백질을 과발현하는 세포에 처리하는 제1단계;
상기 심혈관 질환 치료용 후보물질을 처리 전과 후 14-3-3 단백질을 과발현하는 세포의 14-3-3 단백질 수준을 측정하여 비교하는 제2단계; 및
상기 심혈관 질환 치료용 후보물질 처리 후 세포에서 측정된 14-3-3 단백질 수준이 심혈관 질환 치료용 후보물질 처리 전 세포에 비해 감소된 경우 심혈관 질환 치료 효과를 갖는 것으로 판단하는 제3단계를 포함하는,
혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법.

제20항에 있어서,
상기 14-3-3 단백질은 14-3-3 베타, 14-3-3 입실론, 및 14-3-3 제타로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 심혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법.

제20항에 있어서,
상기 14-3-3 단백질을 과발현하는 세포는 정상 심근 세포에 안지오텐신 II, 엔도텔린-1 또는 둘 모두를 처리하여 준비한 심근 비대 세포인 것인, 심혈관 질환 치료제의 스크리닝 방법.

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