KR20210143382A - 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체 - Google Patents

탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체 Download PDF

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KR20210143382A
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carbon
complex
carbon fluorescent
fluorescent nanoparticles
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이창수
이경관
김종원
황윤정
박경우
김명군
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한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 골 결함 부위의 국소적 치료나, 바이오 이미징이 가능하도록 개질된 탄소 형광 나노 입자에 관한 것으로, 본 발명은 표면에 포스페이트기(-PO4 3-)가 노출된 탄소 형광 나노 입자; 및 상기 탄소 형광 나노 입자의 포스포네이트기에 결합된 알렌드로네이트;를 포함하는 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체를 제공한다.

Description

탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체{Carbon fluorescence nanoparticle-Alendronate complex}
본 발명은 탄소 형광 나노 입자에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 골 결함 부위의 국소적 치료나, 바이오 이미징이 가능하도록 개질된 탄소 형광 나노 입자에 관한 것이다.
현대 의학의 궁극적 목표는 표적 약물 전달, 국부 질병 치료 및 개인 맞춤형 치료이다. 이러한 발전은 정교한 생화학 기반에 대한 이해와, 관찰 및 추적이 가능한 생화학 활성의 리포터(reporter)를 필요로 한다.
최근 다양한 질병의 치료에 있어서 화학 치료법이 여전히 가장 효과적인 방법으로 고려되고 있으나, 화학 치료법은 대게 치료 표적 세포뿐만 아니라 정상 세포에도 치명적인 파괴력이 있기 때문에 환자에 중요한 부작용을 남기는 것으로도 알려져 있다. 그렇기 때문에 이러한 화학 치료법에서는 신체 내에서 약물 분배를 이해하여 표적 세포에만 선택적으로 약물을 방출하는 시스템을 고안하는 것이 중요한 과제이다. 따라서 표적 세포를 추적함과 동시에, 추적된 표적 세포에서만 선택적으로 약물을 전달하는 기술을 개발하기 위한 노력이 계속되고 있다.
이러한 노력의 일환으로, 최근 바이오이미징(bioimaging), 질병 탐지와 약물 전달이 동시에 가능한 다기능의 나노물질을 개발하는 연구들이 수행되고 있다. 다양한 나노 입자는 금 나노 입자, 산화 철 나노 입자, 반도체 퀀텀 닷, 고분자 나노 입자, 탄소 나노 입자, 그래핀 등에 대한 연구가 계속되고 있으며, 이들은 다양한 기능을 통합하여 발휘할 수 있는 후보 물질들로 분류되고 있다.
특히, 탄소 형광 나노 입자는 10 nm 수준의 작은 크기를 구현할 수 있으며, 우수한 생체 호환성, 세포 독성이 낮거나 거의 없는 특성, 높은 수율, 낮은 비용 및 논-블링킹(non-blinking) 특성을 나타내어, 나노 약물 분야에서 주목 받고 있는 소재이다. 그러나, 방출 조정성, 방출 조절성의 관점에서 탄소 형광 나노 입자는 아직 연구가 더 진행되어야 할 필요가 있는 것으로 보고 되고 있다.
한편, 골다공증은 뼈에 구멍이 생기면서 뼈가 부러지기 쉬운 상태가 되는 질환으로, 골다공증은 대게 증상이 나타나지 않다가 뼈의 골절이 발생한 후에 증상이 나타나는 질환으로 골다공증은 조기에 관리되어야 할 필요성이 큰 질환 중 하나이다.
뼈는 한 번 형성되면 그대로 있는 것이 아니고, 오래된 조직은 파골세포에 의해 흡수되어 제거되고 조골세포에 의해 새로운 뼈 조직이 재형성되는 과정을 반복하는데, 골다공증은 뼈의 형성과 흡수의 균형이 깨져 발생하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라 골다공증의 치료는 골 형성을 증가시키거나, 골 흡수를 감소시키는 약물을 이용하여 이루어지고 있으며, 현재 주로 사용되는 약물로는 에스트로겐, 칼시토닌, 비스포스포네이트 제재, 칼슘, 비타민 D 등이 알려져 있다.
이 중 비스포스포네이트 제재의 생체 이용 가능성을 높이기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
본 발명은 추적 대상의 세포에 대해 바이오이미징이 가능한 신규의 탄소 형광 나노 입자를 제공하고자 하다.
또한, 본 발명은 바이오이미징이 가능하면서도, 치료 대상의 표적 세포에 선택적으로 치료 약물을 전달하기 위한 고기능화된 탄소 형광 나노 입자를 제공하고자 한다.
위와 같은 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에서, 본 발명은 표면에 포스페이트기(-PO4 3-)가 노출된 탄소 형광 나노 입자 및 상기 탄소 형광 나노 입자의 포스페이트기에 결합된 알렌드로네이트를 포함하는 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 표면에 포스페이트기를 함유하는 탄소 형광 나노 입자와, 알렌드로네이트를 혼합하는 단계를 포함하는, 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체 및 바이오세라믹스(bioceramics)를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체를 이용하면, 골 관련 질병의 국소적 치료 효과를 제공할 수 있다. 또한, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체를 골 대체제로서 이용 가능한 골 충진재에 접합시켜 이식하는 경우 골 손실을 유발하는 파골세포의 증식을 억제하는 효과를 제공할 수 있다. 동시에, 상기 이식 부위의 바이오 이미징이 가능한 효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 골 충진재로 주로 사용되는 바이오세라믹에 대한 친화력(affinity)이 우수하며, 탄소 형광 나노 입자가 갖는 형광 특성을 유지하기 때문에, 골 충진재가 위치하는 부위에서 골 충진재에 접합함으로써 골 이식 부위의 바이오 이미징이 가능한 효과가 있다.
또한, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 파골세포가 존재하는 조직에서 알렌드로네이트를 방출시켜 파골세포의 활성을 억제하고, 골다공증 등의 골 관련 질병의 치료 및/또는 예방을 동시에 수행할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체를 이용한 바이오 이미징 및 파골세포 증식 억제의 기전의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체의 제조 방법의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)를 다양한 분석법을 통한 구조 분석 결과이다. (a) FT-IR 스펙트럼, (b) XPS 스펙트럼, (c) P-NMR 스펙트럼, (d) TEM 이미지.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD) 의 XPS 구조 분석을 통해 산성 조건에서 화학 결합이 깨지는 포스포아미데이트기를 확인한 결과이다. (a)는 산성 조건에서의 알렌드로네이트의 XPS 분석 결과이며, (b)는 산성 조건에서의 PA-CD의 XPS 분석 결과이다.
도 5는 31P-NMR 분석에 의한 알렌드로네이트, 알렌드로네이트가 결합되지 않은 탄소 형광 나노 입자(P-CD), 본 발명의 일 구현예에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 분석 결과이다.
도 6은 알렌드로네이트가 결합되지 않은 탄소 형광 나노 입자(P-CD) 및 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 UV-vis 및 형광 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 골 충진재 중 하나인 칼슘 결핍 수산화인회석(CDHA)에 대한 친화도를 형광을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 골 충진재 중 하나인 칼슘 결핍 수산화인회석(CDHA)에 대한 친화도를 EDX 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD) 용액을 쥐에 주사한 후 바이오이미징한 결과 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 다양한 바이오세라믹에 대한 흡착 실험을 진행한 결과이다. 바이오세라믹은 인산칼슘계 바이오세라믹(HA, α-TCP, β-TCP, CDHA)과 비-인산칼슘계 바이오세라믹인 실리카(silica)를 사용하였다.
도 11은 알렌드로네이트가 결합하지 않은 탄소 형광 나노 입자(P-CD)와 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 골 친화도를 비교한 결과 사진이다.
도 12는 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 산성 조건에서의 약물(알렌드로네이트) 방출 모식도이다.
도 13은 산성 조건에서 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 약물 방출 특성을 평가한 결과이다. (a) 및 (b)는 각각 pH 7.4 및 pH 5.4에서 5분 및 6시간 후의 31P-NMR 결과이며, (c)는 pH 7.4 및 pH 5.4에서의 시간 별 질량 분석(mass spectroscope)을 통한 결과이다.
도 14는 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 세포 독성 평가 결과이다. 세포 독성 평가를 위해 핵, 세포질 염색 후 (a) 세포 이미징 및 (b) CCK-8 시약을 통한 독성 평가 결과이다.
도 15는 골 충진재로서 칼슘 결핍 수산화인회석(CDHA)의 생체 적합성을 평가한 결과이다. CDHA 상에서 파골세포(Raw 264.7)를 배양한 결과 정상적으로 세포 배양이 가능함을 확인한 결과 사진이다.
도 16은 CDHA 상에서 파골세포(Raw 264.7)를 배양한 후의 SEM 및 EDX 분석 결과이다.
도 17은 알렌드로네이트가 결합하지 않은 탄소 형광 나노 입자(P-CD)와 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 파골세포 증식 억제를 평가한 MTT 분석 결과이다.
도 18은 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체와 골 충진재의 결합 후 바이오이미징 효과를 확인하기 위한 동물 실험 설계 사진이다. 실험은 칼슘 결핍 수산화인회석(CDHA), 알렌드로네이트가 결합하지 않은 탄소 형광 나노 입자가 처리된 칼슘 결핍 수산화인회석(P-CDHA), 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체가 처리된 칼슘 결핍 수산화인회석(PA-CDHA) 각각에 대하여 수행하였다.
도 19는 CDHA, P-CDHA 및 PA-CDHA 각각이 삽입된 쥐의 형광 이미징을 평가한 결과이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 표면에 포스페이트기(-PO4 3-)가 노출된 탄소 형광 나노 입자; 및 상기 탄소 형광 나노 입자의 포스포네이트기에 결합된 알렌드로네이트(alendronate);를 포함하는 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄소 형광 나노 입자는 상기 알렌드로네이트와 포스포아미데이트 결합에 의해 결합할 수 있도록 표면에 포스포네이트기를 함유하고 있는 것이라면, 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 상기 탄소 형광 나노 입자는 피트산(Phytic acid)으로부터 형성되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 탄소 형광 나노 입자는 피트산 및 에틸렌디아민을 포함하는 전구체(예컨대 전구 용액)로부터 형성되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 탄소 형광 나노 입자는 상기 피트산 및 에틸렌디아민을 포함하는 전구체를 이용하여 수열 반응에 의해 형성되는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 탄소 형광 나노 입자는 피트산을 원료로 하여 이를 에틸렌디아민과 혼합한 후 180℃ 내지 250℃, 예컨대 200℃의 온도를 유지하며 수열 반응을 통해 형성되는 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 탄소 형광 나노 입자가 피트산 및 에틸렌디아민을 이용한 수열 반응에 의해 바텀-업(bottom-up) 방식으로 제조됨으로써 표면에 피트산으로부터 유래한 포스페이트기와 에틸렌디아민으로부터 유래한 아민기를 나타낼 수 있다. 본 발명의 발명자들은 FT-IR 및 XPS 분석을 통해 피트산 및 에틸렌디아민의 수열 반응에 의해 제조되는 탄소 형과 나노 입자에 포스페이트기와 아민기가 존재하는 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 알렌드로네이트는 파골 세포-매개된(osteoclast-mediated) 뼈 흡수의 특이적 억제제로 작용하는 비스포스포네이트이다. 상기 알렌드로네이트는 이와 동일한 작용·효능을 나타낼 수 있는 화합물, 예컨대 알렌드로네이트의 유도체 및 알렌드로네이트의 염 등 제한되지 않고 본 발명에서 사용할 수 있다.
상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 상기 탄소 형광 나노 입자 표면의 포스페이트기에 알렌드로네이트가 결합된 구조를 가지며 구체적으로 상기 포스페이트기가 알렌드로네이트와 공유 결합된 구조를 가진다. 보다 구체적으로, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 상기 탄소 형광 나노 입자의 표면에 존재하는 포스페이트기와 알렌드로네이트의 1차 아민의 EDC 반응에 의해 형성되는 포스포아미데이트(phosphoramidate) 결합 구조를 포함한다.
상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 SEM 을 통해 확인되는 복합체 입자의 크기가 예를 들어 5 nm 내지 20 nm일 수 있으며, 구체적으로 8 내지 15 nm일 수 있으며, 보다 구체적으로 9.5 내지 10.5 nm일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 약제학적으로 허용 가능한 투여 제형으로 제제화된 조성물의 형태로 바이오이미징 대상 및/또는 골 관련 질환, 예컨대 골다공증의 치료가 필요한 대상에 투여될 수 있다.
한편, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 탄소 형광 나노 입자의 형광 특성과 알렌드로네이트의 파골 세포-매개된 뼈 흡수의 특이적 억제 특성을 유지하여 이 둘의 특성을 모두 나타낼 수 있다. 특히, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 형광을 나타낼 수 있기 때문에 종래 알렌드로네이트 약물 단독으로서 달성할 수 없던 바이오이미징이 가능해지는 효과가 있다.
또한, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 뼈 조직에 대한 흡착성이 있어 바이오이미징 중에서도 뼈 조직에 대해 선택적인 바이오이미징이 가능한 효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 이에 포함되는 비스포스포네이트(bisphosphonate, R2C(PO3 2-)2)의 칼슘에 대한 높은 흡착 특성을 나타낼 수 있으며, 보다 구체적으로 포스페이트(phosphate, PO4 3-)의 칼슘에 대한 흡착 특성보다 훨씬 높은 흡착 특성을 나타낼 수 있다.
나아가, 일 구현예에서 상기 공유 결합은 탄소 형광 나노 입자 표면의 포스포네이트기와 알렌드로네이트의 1차 아민 사이의 포스포아미데이트(phosphoramidate) 결합일 수 있으며, 상기 탄소 형광 나노 입자와 알렌드로네이트 사이의 포스포아미데이트 결합은 산성 조건, 보다 구체적으로는 pH 5.5 미만의 산성 조건에서는 화학 결합이 해리되는 특성을 나타내는 결합일 수 있다. 이로 인해, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 파골 세포가 증식하는 산성 조건에서 알렌드로네이트가 해리됨으로써 파골 세포 증식을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다. 파골 세포의 증식을 억제함으로써 파골 세포 매개된 뼈 흡수를 억제하게 되고, 이에 따라 골다 공증과 같은 골 관련 질환의 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 표면에 포스포네이트기를 함유하는 탄소 형광나노입자와, 알렌드로네이트를 혼합하는 단계를 포함하는 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체의 제조 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 EDC/NHS 시약에 의한 커플링 반응에 의해 형성되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 상기 탄소 형광 나노 입자 표면의 포스포네이트기와 알렌드로네이트의 1차 아민 사이의 포스포아미데이트 결합에 의해 결합되는 것일 수 있다. 이때, 포스포아미데이트 결합은 산성 조건, 예컨대 pH 5.5 미만의 산성 조건에서 해리될 수 있으므로, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체 제조를 위한 혼합은 pH 5.5 이상의 조건, 예컨대 pH 5.5 내지 pH 6.5 에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체 및 바이오세라믹을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 바이오세라믹은 생체 적합성이 있는 세라믹 물질로서, 인공 뼈, 인공 치아 등에 이용되는 의료용 재료를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 바이오이미징용 조성물이다.
다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 골 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물이다.
상술한 바와 같이, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 뼈 조직에 대한 흡착능이 우수하 때문에, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체와 골 충진재로 이용될 수 있는 바이오세라믹을 함께 포함하는 조성물은 체내에 이식 또는 주입되어 바이오이미징, 골 관련 질환, 예컨대 골다공증의 치료 등에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체는 특히 칼슘에 대한 선택성이 우수한 바, 상기 바이오세라믹은 인산칼슘계 바이오세라믹을 포함하는 것일 일 수 있다. 상기 인산칼슘계 바이오세라믹은 예를 들어, MCPM, MCPA, CMP, DCPD(Brushite), DCP(Monetite), CPP, OCP, α-TCP, β-TCP, CDHA, HA, FA, TTCP, ACP 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 인산칼슘계 바이오세라믹의 Ca/P 비(ratio)와 함께 각각의 물질의 명칭과 25℃ 용해도를 하기 표 1에 함께 나타내었다.
Ca/P 화학식 명명 약칭 25℃ 용해도 - log(Ks)
0.5 Ca(H2PO4)2·H2O monocalcium phosphate monohydrate MCPM 1.17
0.5 Ca(H2PO4)2 monocalcium phosphate anhydrous MCPA 1.14
0.5 [Ca(PO3)2]n calcium metaphosphate CMP -
1.0 CaHPO4 ·2H2O dicalcium phosphate dihydrate DCPD, Brushite 6.59
1.0 CaHPO4 dicalcium phosphate anhydrous DCP, Monetite 6.90
1.0 Ca2P2O7 calcium pyrophosphate CPP -
1.33 Ca8H2(PO4)6·5H2O octacalcium phosphate OCP 96.6
1.5 α-Ca3(PO4)2 α-tricalcium phosphate α-TCP 25.5
1.5 β-Ca3(PO4)2 β-tricalcium phosphate β-TCP 28.9
1.5~1.67 Ca10-x(HPO4)x(PO4)6-x(OH)2-x(0<x<1) calcium deficient hydroxyapatite CDHA 85.1
1.67 Ca10(PO4)6(OH)2 hydroxyapatite HA 116.8
7 Ca10(PO4)6F2 flurapatite FA 120.0
2 Ca4P2O9 tetracalcium phosphate TTCP 39-44
1.2~2.2 CaxHy(PO4)znH2O
n=3~4.5, 15-20% H2O		 amorphous calcium phosphate ACP -
일 구현예에서, 상기 바이오세라믹은 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체와 흡착능이 우수한 칼슘 결핍 수산화인회석(CDH)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물 내에서 바이오세라믹 상에 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체가 흡착되어 있는 구조를 포함할 수 있으며, 이에 따라 상기 조성물이 동물의 체내에 이식되는 경우 이식 부위를 형광 이미지를 통해 확인할 수 있다. 또한, 골 충진재인 바이오세라믹이 이식된 부위에서 파골 세포가 증식하는 경우, 파골 세포의 증식에 따라 주위 환경이 산성 조건, 예컨대 pH 5.5 미만의 조건이 형성되는 경우 바이오세라믹에 흡착되어 있던 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체에서 알렌드로네이트가 방출되면서 파골 세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명을 도면 및 실시예를 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
도 1에는 본 발명의 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체를 이용한 바이오 이미징 및 파골세포 증식 억제의 기전의 모식도가 기재되어 있다.
본 발명의 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)를 골 충진재에 흡착시킨 후 파골 세포 증식을 억제하는 효과와 바이오 이미징이 가능한 효과가 있음을 이하의 실시예들과 같이 확인하였다.
실시예 1. 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)의 제조
피트산(phytic acid) 6mL (50%)와 에틸렌디아민(ethylenediamine) 2mL를 32mL의 3차 증류수에 넣고 교반하였다. 이후 50mL 테프론 재질의 수열(hydrothermal) 반응 용기에서 200℃온도로 12시간 동안 반응을 수행한 후, 투석을 통해 정제하여 중간 생성물인 탄소 형광 나노 입자(Pytic acid based carbon dot, P-CD)를 수득하였다.
이후, EDC/NHS 반응을 통하여 알렌드로네이트의 1차 아민과 P-CD의 포스페이트와의 포스포아미데이트(Phosphoramidate) 결합을 시켜 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)를 제조하였다(도 2).
[PA-CD의 구조 분석 1]
상기에서 제조한 PA-CD의 구조를 분석하고, 탄소 형광 나노 입자에 알렌드로네이트기의 결합 유무를 확인하기 위하여 (a) FT-IR, (b) XPS, (C) 31P-NMR 및 (d) TEM 분석을 수행하였다(도 3).
도 3의 분석 결과에 따르면, PA-CD의 표면에는 골 조직에 높은 친화도를 갖는 알렌드로네이트의 관능기인 비스포스포네이트(bisphosphonate)기가 확인되었으며, PA-CD는 약 10nm 크기의 나노 입자로 형성됨을 확인하였다.
[PA-CD의 구조 분석 2]
상기에서 제조한 PA-CD의 구조를 확인하기 위해 도 4를 통해 알렌드로네이트의 XPS 결과(a)와 PA-CD의 XPS 결과(b)를 비교하였다.
도 4의 분석 결과에 따르면, 알렌드로네이트에서는 발견되지 않는 134.5 eV의 결합에너지가 PA-CD 에서 발견되었고, 이는 인-질소(P-N) 결합에 의한 것임을 확인하였다.
이를 통해 상기 PA-CD는 산성 조건에서는 화학 결합이 깨지는 포스포아미데이트 결합에 의해 탄소 형광 나노 입자와 알렌드로네이트가 결합된 구조를 갖는 것임을 확인하였다.
[PA-CD의 구조 분석 3]
상기에서 제조한 PA-CD의 표면 작용기를 확인하기 위해 31P-NMR을 수행하였다(도 5).
PA-CD의 구조 비교를 위해서, 분석은 (a) 알렌드로네이트, (b) 알렌드로네이트 결합 전의 P-CD, (c) PA-CD 에 대하여 수행하였다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 알렌드로네이트 및 PA-CD의 비스포스포네이트 작용기는 17.89 ppm, 17.81 ppm 영역에서 각각 관찰된 반면, 알렌드로네이트 결합 전의 P-CD는 해당 영역에서 피크가 확인되지 않았다. 이를 통해 상기 PA-CD는 알렌드로네이트가 결합된 구조를 갖는 것을 확인하였다.
[PA-CD의 물성 확인 1 - 형광 특성의 확인]
상기에서 제조한 P-CD와 PA-CD 각각에 대하여 UV-vis((a) P-CD, (b) PA-CD) 및 형광 특성((c) P-CD, (d) PA-CD)을 평가하였다(도 6).
P-CD 와 PA-CD 모두 열수 반응을 통해 합성된 탄소 기반의 나노 입자이며, 중심에 벤젠과 같은 고리 구조를 갖는 화합물로서, 300 nm 와 400 nm 사이의 흡광도가 가장 높게 나타나는 것을 확인하였으며, 형광 특성 역시 300 nm 와 400 nm 에서 여기 상태가 되어 빛을 방출하는 것을 확인하였다.
[PA-CD의 물성 확인 2 - 골 충진재에 대한 친화도 확인
골 충진재 중 하나인 칼슘 결핍 수산화인회석(CDHA)에 대한 PA-CD의 친화도를 다음과 같이 평가하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
P-CD 용액과 PA-CD 용액 각각과 칼슘 결핍 수산화인회석(CDHA)을 상온에서 반응시킨 후 세척하는 방식으로 CDHA 상에 P-CD 또는 PA-CD를 흡착시킨 후 이들의 형광도를 측정하였다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, (a) CDHA에 대해 P-CD와 PA-CD의 친화도는 PA-CD가 더 높게 나타나는 것으로 확인되었으며, (b) CDHA에 처리된 PA-CD의 농도가 높아질수록 형광의 세기가 증가하는 것을 확인하였다.
형광 이미지 장비의 신뢰도를 높이기 위해 실제 용액 상의 PA-CD 농도가 증가할수록 측정 장비의 형광 세기도 증가하는 것을 확인하였으며, 그 형광 세기를 PA-CD의 농도로써 정량화하여 표현하였다(도 7 (c), (d)).
[PA-CD의 물성 확인 2 - 골 충진재에 대한 친화도 확인]
CDHA에 대한 PA-CD의 흡착을 확인하기 위해 SEM 및 EDX 분석을 수행하였다(도 8).
구체적으로, 500μg·mL-1 농도의 PA-CD를 CDHA에 담가 처리한 후 SEM, EDX 분석을 통하여 실제 PA-CD 가 CDHA 상에 흡착이 되었는지 원소 분석을 실시하였다.
도 8의 결과에 따르면, CDHA의 주 성분은 산소, 인, 칼슘이지만, PA-CD 를 처리한 CDHA의 경우 탄소, 질소와 같은 유기물이 추가적으로 확인되어, PA-CD가 CDHA 상에 흡착되었음을 확인하였다.
[PA-CD의 물성 확인 3 - 골 조직에 대한 친화도 확인]
동물 실험을 통해 PA-CD가 실제 골 조직에 흡착력을 갖는지 여부를 확인하였다(도 9).
구체적으로, 300μg·mL-1의 농도의 PA-CD 용액을 쥐에 정맥주사에 의해 100μL 주사한 후, 1시간, 3시간, 6시간, 24시간 후의 형광이미지를 통해 형광 이미지 변화를 관찰하였다.
도 9와 같이 시간이 흐름에 따라 다리와 꼬리뼈에서 지속적인 형광이미지를 관찰하였으며, 이를 통해 주사된 PA-CD가 다리뼈와 꼬리뼈에 흡착된 결과임을 확인하였다.
[PA-CD의 물성 확인 4 - 칼슘에 대한 선택적 친화도 확인]
상기에서 제조한 P-CD와 PA-CD의 칼슘에 대한 선택성을 확인하기 위해, 인산칼슘계 바이오세라믹(HA, α-TCP, β-TCP, CDHA) 뿐만 아니라 비교예로서 Eh 다른 바이오세라믹인 실리카(silica)에 대한 흡착 평가를 실시하였다(도 10).
실험은 각각 증류수를 이용하여 500 μg/mL의 농도로 제조한 P-CD 및 PA-CD 용액을 이용하여 수행하였다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, PA-CD는 인산칼슘계 바이오세라믹에 대하여 선택적인 흡착능이 있음을 확인하였으며, 흡착능 및 형광 감도의 측면에서 P-CD 대비 PA-CD의 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
[PA-CD의 물성 확인 5 - 뼈에 대한 친화도 평가]
상기에서 제조한 P-CD와 PA-CD의 뼈 조직에 대한 친화도를 비교하기 위해 상기 [물성 확인 3]와 같은 방법으로 P-CD 및 PA-CD를 쥐에 주입한 후 형광 이미지를 촬영하였다(도 11).
형광 이미지는 혈관 주입 후 24 시간 후에 (a) 정면 및 (b) 측면의 이미지와, (c) 다리뼈 및 (d) 장기(폐, 심장, 간, 비장, 신장)의 이미지를 촬영하여 비교하였다.
도 11과 같이, PA-CD가 주입된 쥐의 다리뼈에서는 강한 형광 신호가 나오는 것을 확인하였으며(도 11(c)), 쥐의 해부 결과 쥐의 뼈에 흡착능이 우수한 PA-CD 대비 그렇지 않은 P-CD가 신장 및 간에서 형광 신호가 높게 나오는 것을 확인하였다. 이를 통해 PA-CD가 P-CD 대비 높은 뼈에 대한 친화도를 갖는 형광 나노 입자임을 확인하였다.
[PA-CD의 물성 확인 6 - 산성 조건에서의 약물 방출 특성 평가]
P-CD에 포스포아미데이트 결합에 의해 알렌드로네이트가 부착된 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체(PA-CD)는 산성 조건, 예컨대 pH 5.4의 조건에서 포스포아미데이트 결합이 해리되며 알렌드로네이트를 방출한다(도 12).
이에 따라, 상기에서 제조한 PA-CD의 산성 조건 하에서의 알렌드로네이트 방출 능력을 다음과 같이 평가하여 그 결과를 도 13에 나타내었다((a, b) 31P-NMR, (c) mass spectroscope).
동결 건조된 PA-CD를 중수(D2O) 및 염화듀테륨(DCl)으로부터 조절된 pH 7.4, 및 pH 5.4 조건에서 1mg·mL-1의 농도로 증류수에 용해시킨 후, MWCO 100-500Da 멤브래인을(membrane) 이용하여 상온에서 삼투시켜 시간에 따라 삼투되지 않은 용액을 31P-NMR로 분석하였으며, 삼투된 용액은 질량 분석하였다.
도 13과 같이, pH 7.4 조건에서는 PA-CD의 비스포스포네이트 영역인 17.5 내지 18 ppm 부근의 피크가 유지되지만 pH 5.4 조건에서는 포스포아미데이트 결합의 가수분해로 인해, 17.5 내지 18 ppm 부근의 피크가 감소되면서 포스페이트 영역인 0 내지 1ppm 영역의 피크가 증가하는 것을 통해, pH 7.4 조건에서는 PA-CD의 알렌드로네이트가 방출되지 않으나, pH 5.4 조건에서는 PA-CD의 포스포아미데이트 결합의 가수분해로 인한 알렌드로네이트가 방출되며 기존 P-CD의 포스페이트 작용기가 나타남을 확인하였다.
[PA-CD의 물성 확인 7 - 세포 독성 평가]
골 형성과 관련 있는 조골세포의 전구세포(precursor cell), MC3T3-E1 세포를 이용한 PA-CD의 세포독성평가는 PA-CD를 0부터 500 μg·mL-1 의 농도까지 배양배지용액(α-MEM)에 녹이고 24시간 처리한 후 CCK-8 시약을 통해 450nm의 영역에서 흡광도를 이용하여 30분 내외로 측정하는 방법에 따라 수행하였다.
PA-CD의 자체적인 세포 독성을 확인하기 위하여 핵, 세포질 염색을 통한 (a) 세포 이미징 및 CCK-8 시약을 통한 (b) 독성평가를 수행하여 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14와 같이, 500μg·mL-1 농도까지의 PA-CD의 세포 독성은 무해함을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 이후 확인한 PA-CD의 파골 세포의 증식 억제 효과가 PA-CD 나노 입자 자체와는 무관한 것이며, PA-CD 로부터 방출되는 약물(알렌드로네이트)에 의한 것임을 입증한 것이다.
실시예 2. 탄소 형광 나노 입자-알렌드로 복합체 및 칼슘 결핍 수산화인회석을 포함하는 조성물의 파골 세포 증식 억제 효과의 확인
[CDHA의 생체 적합성 평가]
골 충진재로서 칼슘 결합 수산화인회석(CDHA)의 생체 적합성을 평가하기 위하여 파골 세포(raw 264.7)를 3.0 x 103 세포/cm2의 농도로 DMEM, FBS 10% P/S 1%의 조건에서 CDHA 상에 배양하였다.
배양 세포의 세포질 염색을 통해 세포가 배양이 되는 것을 확인하였고(도 15), SEM 이미지와 EDX 분석을 통해 상기 CDHA 상에 배양된 세포를 확인하였다(도 16). 이를 통해 골 충진재로서 CDHA의 생체 적합성을 확인하였다.
[PA-CD가 결합된 CDHA의 파골 세포 억제 평가]
MTT 분석을 통하여 상기에서 제조한 P-CD와 PA-CD가 각각 결합된 CDHA에서 파골 세포의 증식 억제 평가를 7일 동안 수행하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17과 같이, P-CD가 결합된 CDHA(이하 'P-CDHA'라고도 함)에서의 파골 세포의 증식은 7일간 크게 차이가 없으나, PA-CD가 결합된 CDHA(이하 'PA-CDHA'라고도 함)에서의 파골 세포의 증식은 처리된 PA-CD의 농도가 높아질수록 50% 이하로 크게 감소하는 것을 확인하였다.
[PA-CDHA의 바이오이미징 평가]
골 충진재에 PA-CD를 결합하여 체내에 이식하는 경우 바이오이미징 가능성을 확인하기 위해 다음과 같이 동물 실험을 설계하였다(도 18).
쥐에 이식할 골 충진재로서 CDHA를 준비하였으며, 대조군으로는 CDHA만을 이식하였으며, 비교군으로는 P-CD 500mg·mL-1를 처리하여 P-CD가 결합된 CDHA(P-CDHA)와 실험군으로는 PA-CD 500mg·mL-1를 처리하여 PA-CD가 결합된 CDHA(PA-CDHA)를 준비하였다.
준비된 각각의 CDHA 시편을 쥐의 피부 아래로 삽입한 후 형광 이미지를 촬영하였다(도 19).
도 19와 같이, PA-CD가 결합된 CDHA에서는 형광 신호가 검출된 반면, 형광 나노 입자를 처리하지 않은 CDHA 자체나, P-CD를 처리한 CDHA에서는 유의미한 형광 신호를 검출하지 못하였다. 이는 표면에 비스포스포네이트기를 갖는 PA-CD가 P-CD보다 골 충진재에 높은 흡착력을 가지고 있기 때문이며, 이로 인해 PA-CD가 흡착된 골 충진재를 체내에 삽입할 경우 생체 이미징이 가능함을 확인하였다.

Claims (11)

  1. 표면에 포스페이트기(phosphate, -PO4 3-)가 노출된 탄소 형광 나노 입자; 및
    상기 탄소 형광 나노 입자의 포스포네이트기에 결합된 알렌드로네이트;를 포함하는 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 탄소 형광 나노 입자는 피트산(Phytic acid) 및 에틸렌디아민을 포함하는 전구체로부터 형성되는 것인 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 탄소 형광 나노 입자는 상기 전구체를 이용하여 수열 반응에 의해 형성되는 것인 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 알렌드로네이트는 상기 탄소 형광 나노 입자 표면의 포스페이트기와 공유 결합된 것인 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체.
  5. 표면에 포스페이트기를 함유하는 탄소 형광 나노 입자;와 알렌드로네이트;를 혼합하는 단계를 포함하는, 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체의 제조 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 혼합은 pH 5.5 내지 6.5에서 수행되는 것인 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체의 제조 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 따른 탄소 형광 나노 입자-알렌드로네이트 복합체; 및 바이오세라믹(Bioceramics);을 포함하는 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 바이오세라믹은 인산칼슘계 바이오세라믹을 포함하는 것인 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 인산칼슘계 바이오세라믹은 칼슘 결핍 수산화인회석(Calcium deficient hydroxyapatite, CDHA)을 포함하는 것인 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서,
    바이오이미징용 조성물인 것인, 조성물.
  11. 청구항 7에 있어서,
    골 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물인 것인, 조성물.
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