KR20210141952A - 표적 엔티티 검출을 위한 시스템, 조성물 및 방법 - Google Patents

표적 엔티티 검출을 위한 시스템, 조성물 및 방법 Download PDF

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조셉 찰스 세들락
로라 테레사 보톨린
다니엘 파커 세일럼
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메르시 바이오애널리틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 표적 엔티티 검출을 위한 기술을 제공한다. 본 개시내용의 일 양상은 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 검출(예를 들어, 초기 검출)을 위한 기술을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 명세서에 제공된 기술은 투여되는 치료제를 선택하고/하거나 이의 효능을 모니터링하고/하거나 평가하는 것을 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 암을 갖거나 암에 민감한 것으로 결정된 대상체에게 투여되는 치료제를 선택하고/하거나 이의 효능을 모니터링하고/하거나 평가하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 예를 들어, 치료제와 함께 종양 부담 및 종양 부담의 변화를 측정함으로써 동반 진단의 발달에 유용하다.

Description

표적 엔티티 검출을 위한 시스템, 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/812,878호(출원일: 2019년 3월 1일) 및 미국 가출원 제62/962,722호(출원일: 2020년 1월 17일)의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본 명세서에 원용된다.
암의 초기 검출은 성공적인 치료 기회를 상당히 증가시킨다. 그러나 많은 암은 여전히 효과적인 스크리닝 권장 사항이 없다. 암-스크리닝 시험의 전형적인 도전은 제한된 감도 및 특이성을 포함한다. 높은 비율의 위양성 결과는 특히 문제가 될 수 있는데, 그 이유는 위양성 결과가 잠재적으로 바람직하지 않은 부작용이 있을 수 있는 항암 요법을 불필요하게 투여하지(또는 제공받지) 않으려는 임상의 및 환자에게 어려운 관리 결정을 초래할 수 있기 때문이다. 이에 반해서, 높은 비율의 위음성 결과는 스크리닝 시험의 목적을 충족하지 못하는데 그 이유는 요법이 필요한 환자가 누락되어, 치료가 지연되고, 그 결과 성공 가능성이 감소하기 때문이다.
본 개시내용은, 다른 것 중에서, 효과적인 암 스크리닝을 달성하기 위한 통찰력 및 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 초기 병기 암의 검출에 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 (예를 들어, 충분히 높은 감도 및/또는 낮은 비율의 위양성 및/또는 위음성 결과로 인해서) 무증상 개체를 포함하거나 이것으로 이루어진 집단에 적용되는 경우에도 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 암 발병의 유전적인 위험이 없는 개체(예를 들어, 무증상 개체)를 포함하거나 이것으로 이루어진 집단에 적용되는 경우에 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은, 본 명세서에 제공된 본 개시내용을 읽는 당업자에게 자명할 바와 같이, 1종 이상의 조성물(예를 들어, 분자 엔티티(entity) 또는 복합체, 시스템, 세포, 수집물, 조합물, 키트 등) 및/또는 방법(예를 들어, 제조 방법, 사용 방법, 평가 방법 등)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 예를 들어, 암 검출 및 진단에 대한 특정 종래의 접근법을 포함하는 특정 선행 기술의 문제의 원인을 식별한다. 예를 들어, 본 개시내용은 예를 들어, 무세포 핵산, 순환 종양 세포, 단백질, 혈청 단백질 및/또는 세포외 소포(extracellular vesicle)의 벌크 분석을 기반으로 하는 많은 종래의 진단 검정이 시간 소모적이고/이거나 고비용이고/이거나 신뢰할 수 있고 포괄적인 진단 평가를 제공하기에 충분한 감도 및/또는 특이성이 부족할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다른 것 중에서, 개별 표적 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티) 상의 분자 또는 에피토프의 상호작용 및/또는 공동 국지화를 기반으로 하는 표적 엔티티 검출 접근법을 개발함으로써, 이러한 문제를 해결하는 기술(시스템, 조성물 및 방법 포함)을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다른 것 중에서, 무증상 개체의 스크리닝, 예를 들어, 발병된 증상(들) 이전 또는 달리는 발병된 증상(들)의 부재 하에서 정기적인 스크리닝이 이로울 수 있고, 심지어는 암의 효과적인 관리(예를 들어, 성공적인 치료)에 중요할 수 있다는 통찰력을 제공한다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 상이한 유형의 암에 대한(예를 들어, 복수의 상이한 암에 대한) 스크리닝(예를 들어, 정기적인 스크리닝)이 이로울 수 있고, 심지어는 암의 효과적인 관리(예를 들어, 성공적인 치료)에 중요할 수 있다는 통찰력을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 예를 들어, 일부 실시형태에서 무증상 개체(예를 들어, 암의 유전적인 위험이 없음)에서, 초기 병기 암을 비롯한 암을 검출하기 위해 구현될 수 있는 암 스크리닝 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 무증상 개체(예를 들어, 암의 유전적인 위험이 없음) 및/또는 다발성 암에 대한 정기적인 스크리닝을 달성하기 위해 구현된다. 본 개시내용은, 예를 들어, 조성물(예를 들어, 시약, 키트, 성분 등), 및 1명 이상의 개체(예를 들어, 무증상 개체)의 정기적인 시험을 포함하는 전략을 포함하여, 이들을 제공하는 방법 및/또는 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 이러한 시스템의 유용성을 정의하고, 이를 구현하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제공된 기술은 제공된 기술을 1회 및/또는 정기적인(예를 들어, 주기적인) 평가에 유용하게 적용할 수 있도록 적절한 감도 및/또는 특이성(예를 들어, 위양성 및/또는 위음성 결과의 비율)을 갖는 암 및/또는 복수의 암의 하나 이상의 특징(예를 들어, 발병률, 진행, 요법에 대한 반응성, 재발 등)의 검출(예를 들어, 무증상 개체(들) 및/또는 집단(들)에서 조기 검출)을 달성한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 개체의 주기적인 신체 검사와 함께 유용하다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 치료 요법(들)과 함께 유용하며; 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 이러한 치료 요법(들)의 하나 이상의 특징(예를 들어, 허용되는 파라미터에 따른 성공률)을 개선할 수 있다.
일부 양상에서, 적어도 2개 이상의 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 또는 화학적 엔티티, 예컨대, 세포, 세포외 소포 또는 분석물 등)를 검출하는 데 사용하기 위한 기술이 제공되는데, 여기서 일부 실시형태에서 이러한 적어도 2개 이상의 표적은 동일할 수 있는 반면, 일부 실시형태에서 이러한 적어도 2개 이상의 표적은 구별될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 각각 이러한 특이적 표적에 대한 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 그 초과)의 검출 프로브를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템은 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 초과)의 검출 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 개별 검출 프로브는 상이한 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 개별 검출 프로브는 동일한 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템은 상이한 표적에 지향되는 2개 이상의 상이한 검출 프로브를 포함하고, 선택적으로 또 다른 검출 프로브가 지향되는 표적에 또한 지향되는 적어도 하나의 추가 검출 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템은 검출 프로브의 복수의 하위세트를 포함하고, 이의 각각의 하위세트는 동일한 표적에 지향되는 2개 이상의 검출 프로브를 포함한다.
전형적으로, 본 명세서에서 제공되고/되거나 이용되는 검출 프로브는 표적 결합 모이어티 및 표적 결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행(overhang)을 포함한다. 다수의 실시형태에서, 단일-가닥 오버행의 적어도 일부는 제2 검출 프로브의 단일-가닥 오버행에 상보적이도록 설계되어, 상보적 단일-가닥 오버행의 혼성화를 통해서 제2 검출 프로브와 이중-가닥 복합체를 형성한다. 다수의 실시형태에서, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은, 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브가 동일한 관심대상 엔티티 상의(예를 들어, 관심대상의 특정 생물학적 엔티티 상의) 각각의 표적에 결합하는 경우, 제1 단일-가닥 오버행과 제2 단일 가닥 오버행이 혼성화를 허용하기에 충분히 가깝게 근접하도록 하는 길이를 갖도록 구성된다.
본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 검출 프로브를 포함하는 일부 실시형태에서, 상응하는 올리고뉴클레오타이드 도메인은 적어도 4 내지 15개 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 오버행은 관심대상의 특이적 핵산 리가제(예를 들어, DNA 리가제, 예컨대, T4 또는 T7 리가제)에 의한 결찰을 위해 우선적으로 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 예를 들어, 이러한 단일-가닥 오버행은 GAGT의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 검출 프로브를 포함하는 일부 실시형태에서, 상응하는 올리고뉴클레오타이드 도메인의 길이는 예를 들어, 관심대상 엔티티(예를 들어, 관심대상 생물학적 엔티티)의 물리적 특징 및/또는 관심대상 엔티티(예를 들어, 관심대상 생물학적 엔티티)에서 표적(예를 들어, 분자 표적)의 선택 및 국지화에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 생물학적 엔티티가 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)이거나 이를 포함하는 경우, 각각의 단일-가닥 오버행이 상응하는 검출 프로브가 동일한 세포외 소포에 결합되는 경우 서로에 어닐링하기에 충분히 가깝게 근접하도록 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 각각 독립적으로, 예를 들어, 약 20㎚ 내지 약 200㎚의 길이를 가질 수 있다.
본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 바와 같은 시스템에서 2개(즉, 적어도 한 쌍)의 검출 프로브의 적어도 하나의 세트를 포함하는 일부 실시형태에서, 이러한 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은, 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브의 단일-가닥 오버행이 서로에 어닐링하여 이중-가닥 복합체를 형성하는 경우, 각각의 각자의 표적 결합 모이어티가 이중-가닥 복합체의 각각의 단부에 위치하도록 구성된다. 이러한 이중-가닥 복합체의 일부 실시형태에서, 이중-가닥 복합체의 두 가닥 모두는 예를 들어, 증폭 및/또는 검출을 위해 핵산 리가제의 존재 하에 결찰 가능하다.
본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 바와 같은 시스템에서 적어도 3개 이상(n>3)의 검출 프로브를 포함하는 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 단일-가닥 오버행이 각각의 각자의 파트너(들)에 어닐링되어 이중-가닥 복합체를 형성하는 경우, 적어도 (n-2)개의 표적 결합 모이어티/모이어티들이 이중-가닥 복합체의 내부 위치(들)에 존재한다. 이러한 이중-가닥 복합체의 일부 실시형태에서, 이중-가닥 복합체의 또 다른 가닥에 임의의 내부 표적 결합 부분이 존재하지 않고, 따라서 예를 들어 증폭 및/또는 검출을 위해 핵산 리가제의 존재 하에 결찰 가능하도록 이중-가닥 복합체의 단일 가닥에 존재하는 내부 표적 결합 모이어티를 갖는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 함께 암(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 암 및/또는 암의 병기)에 특이적인 검출 프로브의 세트(예를 들어, 2개 이상의 검출 프로브)를 이용하지만, 하나 이상의 개체의 이러한 프로브는 그 자체가 암에 특이적이지 않은 표적에 지향될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유용한 검출 프로브의 세트는 관련 암에 특이적인 표적(즉, 암-특이적 표적)에 대해 지향되는 적어도 하나의 검출 프로브를 포함할 수 있고, 관련 암에 대해 반드시 또는 완전히 특이적이지 않은 표적(예를 들어, 암성이 아니고/아니거나 특정 암에 속하지 않고/않거나 관심대상의 특정 병기에 속하지 않은 일부 또는 모든 세포에서도 발견될 수 있음)에 지향되는 적어도 하나의 검출 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 명세서를 읽는 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명에 따라 이용되는 검출 프로브 세트가 함께 관심대상의 관련 표적 생물학적 엔티티(예를 들어, 관심대상 암 세포 또는 암 세포에 의해서 분비되는 세포외 소포)에 특이적인 복수의 개별 검출 프로브이거나 이를 포함하는 한(즉, 검출에 관심이 없는 다른 생물학적 엔티티로부터의 검출을 위해서, 관련 표적 생물학적 엔티티(예를 들어, 관심대상 암 세포 또는 암 세포에 의해서 분비되는 세포외 소포)를 충분히 구별하는 한), 이러한 세트가 본 발명의 특정 실시형태에 따라 유용하다.
이중-가닥 복합체의 가닥이 적어도 하나 이상의 내부 표적 결합 모이어티를 포함하는 일부 실시형태에서, 가닥은 내부 표적 결합 모이어티가 커플링된 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 단부와 또 다른 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 단부 사이에 갭을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 복합체의 가닥 내의 갭의 크기는 가닥이 핵산 리가제의 존재 하에서 결찰 가능하지 않게 되도록 충분히 크다. 일부 실시형태에서, 갭은 적어도 2 내지 8개의 뉴클레오타이드 크기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 갭은 약 6개 뉴클레오타이드 크기이다.
본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 검출 프로브를 포함하는 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 특정 표적(예를 들어, 특정 분자 표적)에 지향되는 항체 작용제(antibody agent)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 특정 표적(예를 들어, 특정 분자 표적)에 대한 압타머이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 표적-결합 모이어티는 암-연관된 표적, 예컨대, 암-연관된 에피토프에 대한 항체 작용제일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 암-연관된 표적은 1종 초과의 암(즉, 적어도 2종 이상 암)과 연관된 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-연관된 표적은 암과 전형적으로 연관된 일반적인 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-연관된 표적은 특정 조직의 암과 연관된 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다 일부 실시형태에서, 암-연관된 표적은 특정 암에 특이적인 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 검출 프로브를 포함하는 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 표적-결합 모이어티는 (예를 들어, 정상적인 건강한 조직 및/또는 병이 걸린 조직, 예컨대, 종양에 존재하는) 조직-특이적 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 대상체의 정상적인 건강한 상태와 특이적으로 연관된 표적에 지향될 수 있다.
본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 검출 프로브를 포함하는 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 공유 부착에 의해서 (예를 들어, 결합 및/또는 링커를 통해) 표적 결합 모이어티에 커플링된다. 올리고뉴클레오타이드를 다양한 작용제, 예를 들어, 펩타이드, 핵산 또는 항체에 공유 커플링시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 도메인을 표적 결합 모이어티에 커플링시켜 본 명세서에 제공되고/되거나 이용되는 바와 같은 검출 프로브를 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기에 적절한 시스템은 (예를 들어, 표적-특이적 검출 프로브에 추가하여) 대조군 프로브를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대조군 프로브는 (예를 들어, 2개 이상의 검출 프로브의 결찰 및/또는 주형, 예컨대, 2개 이상의 검출 프로브의 결찰로부터 초래하는 주형의 증폭을 저해하거나 불가능하게 함으로써) 관심대상 엔티티(예를 들어, 관심대상 생물학적 엔티티)에 대한 결합이 검출 신호의 생성을 저해하거나 불가능하게 하도록 대조군 참조(control reference)에 결합하도록 구성된다.
일부 실시예에서, 본 명세서에 기재된 기술은 다른 것 중에서, 2개 이상의 표적(예를 들어, 일부 실시형태에서 단일 분자 표적, 복합체, 작용제 등의 상이한 부위를 나타낼 수 있거나, 보다 일반적으로 상이한 표적에 존재할 수 있는 분자 표적)과의 상호작용을 통해서, 샘플(예를 들어, 생물학적, 환경적, 또는 다른 샘플)에서 관심대상의 하나 이상의 엔티티(예를 들어, 하나 이상의 생물학적 및/또는 화학적 엔티티)를 검출하는 데 유용하다. 본 개시내용을 읽는 당업자는 제공된 기술이 광범위한 응용 및/또는 목적에 유용하다는 것을 인식할 것이다. 이러한 당업자는 본 명세서에 기재된 소정의 특정 실시형태가 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 그 초과)의 검출 프로브를 사용하는 방법에 관한 것임을 추가로 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플 내의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 본 개시내용에 따라 사용하기에 적절한 검출 프로브의 세트와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 고체 기질 상에 검정될 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 고정시키는 단계를 포함할 수 있다. 예시적인 고체 기질은 비드 또는 표면일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 기질은 예를 들어, 비드, 필터, 매트릭스, 막, 플레이트, 튜브 및/또는 웰을 포함하는, 검정 챔버의 포획 표면(예를 들어, 엔티티 포획 표면)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 검출 프로브가 존재하는 경우 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티) 내의 각각의 표적(예를 들어, 분자 표적)에 결합하여 1개 이상의 이중-가닥 복합체를 형성하도록 (예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 바와 같은) 검출 프로브의 세트가 샘플 내의 1개 이상의 관심대상 엔티티(예를 들어, 1개 이상의 생물학적 엔티티)에 결합하도록 하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 복합체는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 결합된 검출 프로브의 상보적인 단일-가닥 오버행의 직접적인 혼성화 또는 어닐링에 의해 형성된다. 따라서, 적어도 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 간접적으로 연결하기 위해 연결자 올리고뉴클레오타이드가 필요하지 않으며; 일부 실시형태에서, 이러한 연결자 올리고뉴클레오타이드는 이용되지 않는다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)가 복수의 검출 프로브와 접촉된 후, 제1 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 일부와 제2 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 일부를 결합할 수 있는 연결자 올리고뉴클레오타이드를 첨가하는 단계를 포함하지 않는다.
이중-가닥 복합체(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 바와 같이, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 검출 프로브와 접촉시킴으로써 생성됨)는 핵산 리가제와 접촉되어 적어도 제1 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥 및 제2 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 결찰된 주형을 생성할 수 있다. 이러한 결찰된 주형의 검출은 샘플 내의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)가 검출 프로브가 지향되는 표적에 대해 양성인지 음성인지에 대한 정보를 제공한다. 예를 들어, 이러한 결찰된 주형의 검출 가능한 수준(예를 들어, 참조 수준보다 예를 들어, 적어도 10% 이상 높은 수준, 일부 실시형태에서, 참조 수준은 음성 대조군 샘플, 예컨대, 이러한 표적을 포함하는 관심대상 엔티티가 없는 샘플에서 관찰된 수준일 수 있음)은 시험된 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)가 관심대상 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함한다는 것을 나타내는 반면, 이러한 결찰된 주형의 검출 가능하지 않은 수준은 관심대상 표적(예를 들어, 분자 표적) 중 적어도 하나가 시험된 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 존재하지 않음을 나타낸다.
결찰된 주형은 당업계에 공지된 적절한 핵산 검출 방법에 의해서 검출될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 결찰된 주형은 결찰된 주형의 증폭을 수행하고, 선택적으로 그 다음 증폭 산물의 존재를 검출함으로써 검출된다. 예시적인 핵산 검출 방법은 정량적 중합효소 연쇄 반응을 포함한다.
본 명세서에 제공된 기술은 검정될 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 또는 화학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포 및/또는 분석물)를 포함하는 관심대상 샘플에 적용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 샘플은 생물학적 샘플일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 환경 샘플일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 1차 샘플일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 가공된 샘플일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 샘플은 검정될 하나 이상의 관심대상 엔티티를 단리시키도록 가공될 수 있다.
샘플이 생물학적 샘플을 포함하거나 생물학적 샘플인 일부 실시형태에서, 이러한 샘플은 이러한 검정을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 혈장 또는 혈액 샘플로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 이러한 검정을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)로부터의 1차 샘플(예를 들어, 조직 또는 종양 샘플)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 관심대상 비-표적 엔티티로부터 하나 이상의 관심대상 엔티티를 분리시키고/시키거나 하나 이상의 관심대상 엔티티를 농축시키도록 가공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 관심대상 엔티티는 생물학적 엔티티, 예를 들어, 세포 또는 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 생물학적 엔티티는 예를 들어, 생물학적 앤티티에서 검정될 표적을 안정화시키고/시키거나 가교시키고/시키거나 검출 프로브와의 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서 화학 시약으로 처리되거나 화학 시약과 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 예를 들어, 표적(예를 들어, 분자 표적)을 안정화시키고/시키거나 가교시키고/시키거나 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서 화학 시약으로 선택적으로 처리될 수 있는 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 예를 들어, 표적(예를 들어, 분자 표적)을 안정화시키고/시키거나 가교시키고/시키거나 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서 화학 시약으로 선택적으로 처리될 수 있는 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은, 다른 것 중에서, 적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 표면 단백질 바이오마커, 내부 단백질 바이오마커 및 RNA 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 표적 바이오마커를 포함하는 개별 세포외 소포에서 암의 표적 바이오마커 시그니처(target biomarker signature)의 공동 국지화를 검출함으로써, 예를 들어, 무세포 핵산, 혈청 단백질 및/또는 세포외 소포의 벌크 분석을 기반으로 하는, 종래의 암 진단법과 연관된 문제를 해결하는 기술(시스템, 조성물 및 방법 포함)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다른 것 중에서, 개별 세포외 소포에서 적어도 2종 이상의 표적 엔티티(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)의 상호작용 및/또는 공동 국지화를 기반으로 하는 표적 엔티티 검출 접근법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 사용하여 암의 이러한 표적 바이오마커 시그니처를 검출함으로써, 이러한 문제를 해결하는 기술(시스템, 조성물 및 방법 포함)을 제공한다.
일부 양상에서, 대상체(예를 들어, 무증상 대상체)를 암을 갖거나 암에 민감한 것으로서 분류하는 데 사용하기 위한 기술이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체(예를 들어, 무증상 대상체)를 암을 갖거나 암에 민감한 것으로서 분류하기 위한 방법 또는 검정을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 방법 또는 검정은 (a) 검출을 필요로 하는 대상체로부터의 혈액-유래 샘플에서, 암의 표적 바이오마커 시그니처를 발현하는 세포외 소포를 검출하는 단계로서, 표적 바이오마커 시그니처는 적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 표면 단백질 바이오마커, 소포내 단백질 바이오마커, 및 소포내 RNA 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 표적 바이오마커를 포함하는, 상기 검출하는 단계; (b) 혈액-유래 샘플 중의 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 수준을 나타내는 샘플 정보를 참조 역치 수준을 포함하는 참조 정보와 비교하는 단계; 및 (c) 혈액-유래 샘플이 참조 역치 수준에 비해서 증가된 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 수준을 나타내는 경우 대상체를 암을 갖거나 암에 민감한 것으로서 분류하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 사용되고/되거나 기재된 암의 표적 바이오마커 시그니처에 사용하기 위한 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드는 종양-특이적 바이오마커 및/또는 조직-특이적 바이오마커일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드는 비-특이적 마커일 수 있거나 이를 포함할 수 있고, 예를 들어, 그것은 하나 이상의 비-표적 종양 및/또는 하나 이상의 비-표적 조직에 존재한다.
일부 실시형태에서, 암의 표적 바이오마커 시그니처는 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 적어도 1종의 추가 표적 표면 단백질 바이오마커를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 암의 표적 바이오마커 시그니처는 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 적어도 1종의 표적 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 바이오마커를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 암의 표적 바이오마커 시그니처는 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것) 및 적어도 1종의 추가 표적 소포내 단백질 바이오마커를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 제공된 방법 또는 검정에 사용하기 위한 참조 역치 수준은 비-암 대상체의 집단으로부터의 대등한 샘플에서 관찰된 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 수준에 의해서 결정된다.
일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처에 포함된 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드는 항체-기반 작용제를 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드는 항체-기반 작용제를 포함하는 포획 검정을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포외 소포에서 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드의 존재를 검출하기 위한 캡처 검정은 세포외 소포를 포함하는 혈액-유래 샘플을 이러한 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향되는 포획제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 포획제는 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)에 지향되는 결합 모이어티를 포함할 수 있는데, 이것은 선택적으로 고체 기질에 접합될 수 있다. 제한 없이, 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드를 위한 예시적인 포획제는 고체 기질(예를 들어, 자성 비드) 및 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향되는 결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처에 포함된 표적 바이오마커는 당업계에 공지된 적절한 방법을 사용하여 검출될 수 있는데, 이것은 검출될 분석물(예를 들어, 표면 단백질, 소포내 단백질, 소포내 RNA(예를 들어, mRNA))의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용을 읽는 당업자는, 일부 실시형태에서 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커가 항체-기반 작용제를 사용하여 검출될 수 있는 반면, 일부 실시형태에서, 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 바이오마커는 핵산-기반 작용제, 예를 들어, 정량적 역전사 PCR을 사용하여 검출될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
예를 들어, 표적 바이오마커가 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 마커이거나 이를 포함하는 일부 실시형태에서, 이러한 표적 바이오마커는 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에서 사용되고/되거나 기재된 것)를 발현하는 세포외 소포를 캡처하기 위해서, 예를 들어, 포획 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)에 따른 근접 결찰 검정을 포함하는 방법에 의해서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 근접 결찰 검정은 세포외 소포를 포함하는 혈액-유래 샘플을, 각각 표적 바이오마커에 지향되는 검출 프로브의 세트와 접촉시키는 단계를 포함하며, 이러한 세트는 적어도 2개의 구별되는 검출 프로브를 포함하여, 세포외 소포 및 검출 프로브의 세트를 포함하는 조합물이 생성되고, 여기서 2개의 검출 프로브는 각각 (i) 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커에 지향되는 결합 모이어티; 및 (ii) 결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행 부분을 포함할 수 있다. 검출 프로브의 이러한 단일-가닥 오버행 부분은, 검출 프로브가 동일한 세포외 소포에 결합되는 경우 그들이 서로에 혼성화할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이어서, 세포외 소포 및 검출 프로브의 세트를 포함하는 조합물은 검출 프로브가 동일한 세포외 소포에 결합하여 이중-가닥 복합체를 형성할 수 있도록 세포외 소포 상의 각각의 표적에 대한 검출 프로브의 결합을 허용하는 조건 하에서 유지된다. 이러한 이중-가닥 복합체는 이중-가닥 복합체를 핵산 리가제와 접촉시켜 결찰된 주형을 생성시키는 단계; 및 결찰된 주형을 검출하는 단계에 의해서 검출될 수 있다. 이러한 결찰된 주형의 존재는 암의 표적 바이오마커 시그니처에 대해 양성인 세포외 소포의 존재를 나타낸다. 이러한 근접 결찰 검정이 예를 들어, 다른 기존의 근접 결찰 검정보다 더 높은 특이성 및/또는 감도로 더 양호하게 수행될 수 있지만, 본 개시내용을 읽는 당업자는 당업계에 공지된 다른 형태의 근접 결찰 검정이 대신에 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
표적 바이오마커가 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 마커이거나 이를 포함하는 일부 실시형태에서, 이러한 표적 바이오마커는 핵산 검출 검정을 포함하여 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예시적인 핵산 검출 검정은 역전사 PCR일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
표적 바이오마커가 소포내 바이오마커(예를 들어, 소포내 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 바이오마커)이거나 이를 포함하는 일부 실시형태에서, 이러한 표적 바이오마커는 검출 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 근접 결찰 검정) 이전에, 후속 검출을 위해서 소포내 바이오마커(들)를 노출시키기 위한 샘플 처리(예를 들어, 고정 및/또는 투과화)를 포함하여 검출될 수 있다.
본 개시내용은, 다른 것 중에서, 단일 세포외 소포의 분해능이 아닌, 벌크 샘플(예를 들어, 세포외 소포의 벌크 샘플)에 기반한 단일 암-연관된 혈청 단백질 또는 바이오마커 또는 복수의 암-연관된 바이오마커의 검출이 전형적으로 샘플이 얻어진 대상체가 암을 앓고 있거나 암에 민감할 가능성이 있는지를 결정하는 데 있어서 충분한 특이성 및/또는 감도를 제공하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 개시내용은, 다른 것 중에서, 예를 들어, 검출을 위한 개별 표적 엔티티(예를 들어, 개별 생물학적 엔티티, 예컨대, 개별 세포외 소포)가 표적(예를 들어, 분자 표적)의 조합물의 존재를 특징으로 하도록 구체적으로 요구함으로써, 이러한 문제를 해결하는 시스템, 조성물 및/또는 방법을 포함하는 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 표적의 이러한 조합물은 적어도 1종 이상의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 적어도 1종 이상의 표적 바이오마커의 조합물을 포함하는 표적 바이오마커 시그니처일 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은, 이러한 개체 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)가 암 특이적인 표적(예를 들어, 분자 표적)의 조합물(즉, 관련 암의 "표적 바이오마커 시그니처")의 존재(예를 들어, 발현)를 특징으로 하는 반면, 표적화 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)을 포함하지 않는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)는 검출 가능한 신호(예를 들어, 참조 수준을 예를 들어, 적어도 10% 이상만큼 초과하는 수준, 여기서 일부 실시형태에서, 참조 수준은 음성 대조군 샘플, 예컨대, 이러한 표적화 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)을 포함하는 개별 생물학적 엔티티(예를 들어, 개별 세포외 소포)가 존재하지 않는 샘플에서 관찰되는 수준일 수 있음)를 생성시키지 않을 것을 요구하는 기술을 교시한다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체에서 그리고/또는 대상체의 집단에 걸쳐서 암의 발생 또는 재발의 검출에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적의 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)은 암 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적의 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)은 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)은 검출 프로브의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 쌍별 또는 직교 조합물에 의해서 검출될 수 있고, 여기서 검출 프로브의 각각의 쌍은 적어도 1종의 구별되는 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)은 각각 서로에 혼성화하여 선형 복합체를 형성하는 검출 프로브의 세트에 의해서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 조합물은 암 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 조합물은 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 직교 조합물(orthogonal combinations)은 암 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 직교 조합물은 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 표적 바이오마커 시그니처는 암 검출의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 표적 바이오마커 시그니처는 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 인간 대상체 또는 인간 대상체의 집단을 초기 병기 암 또는 암 재발에 대해서 스크리닝하기 위해서 주기적으로(예를 들어, 매년) 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 프로브의 조합물(예를 들어, 세트)은 특정 암의 검출을 위한 시스템 또는 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 조합물(예를 들어, 세트)는 1종 이상의 암의 검출을 위한 시스템 또는 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 조합물(예를 들어, 세트)은 검출 프로브의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 쌍별 또는 직교 조합물을 포함할 수 있고, 여기서 검출 프로브의 각각의 쌍은 적어도 1종의 구별되는 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조합물(예를 들어, 세트) 내의 검출 프로브는 각각 서로에 혼성화하여 선형 복합체를 형성하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술에 의해서 검출될 수 있는 암의 예는 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 암의 발생 또는 재발의 검출을 위해서 본 명세서에 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체는 무증상 인간 대상체 및/또는 무증상 집단일 수 있다. 이러한 무증상 대상체는 암의 가족력을 갖고/갖거나 암에 대해서 이전에 치료된 적이 있고/있거나 암 치료 후에 암 재발의 위험이 있고/있거나 암 치료 후에 관해 중이고/이거나 적어도 1종의 암 바이오마커의 존재에 대해서 이전에 또는 주기적으로 스크리닝된 적이 있는 대상체일 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 무증상 대상체는 암에 대해서 이전에 스크리닝된 적이 없고/없거나 암에 대해서 진단된 적이 없고/없거나 이전에 암 요법을 제공받은 적이 없는 대상체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체 또는 대상체의 집단은 하나 이상의 특징, 예컨대, 연령, 인종, 유전력, 병력, 개인 이력(예를 들어, 흡연, 알코올, 약물, 발암 물질, 식이, 비만, 신체 활동, 태양 노출, 방사선 노출, 바이러스와 같은 감염원에 대한 노출 및/또는 직업상 위험)에 기초하여 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 암을 앓고 있거나 암에 민감한 대상체를 위해서 요법을 선택하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 요법 및/또는 부가 요법은 본 명세서에 제공된 기술에 기초한 소견에 비추어 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체(예를 들어, 암 대상체)에게 투여되는 요법의 효능을 모니터링 및/또는 평가하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 예를 들어, 1명 이상의 개별 대상체에 대해서 그리고/또는 대상체의 집단에 걸쳐서 환자 케어를 관리하기 위한 기술을 제공한다. 몇 가지 예를 들자면, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 스크리닝(예를 들어, 일시적으로 또는 우발적으로 동기부여된 스크리닝 및/또는 비-일시적으로 또는 우발적으로 동기부여된 스크리닝, 예를 들어, 주기적인 스크리닝, 예컨대, 매년, 반년, 격년 또는 일부 다른 빈도)에 이용될 수 있는 기술을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 일시적으로 동기부여된 스크리닝에서 사용하기 위한 제공된 기술은 특정 연령 또는 특정 연령보다 더 나이가 많은 연령 군(예를 들어, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70세 또는 그 초과)을 갖는 1명 이상의 개별 대상체 또는 대상체의 집단(예를 들어, 무증상 대상체)을 스크리닝하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 우발적으로 동기부여된 스크리닝에 사용하기 위한 제공된 기술은 본 명세서에 기재된 바와 같은 암에 대해서 스크리닝을 동기부여하는 사건 또는 이벤트를 경험할 수 있는 개별 대상체를 스크리닝하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 암의 하나 이상의 지표 또는 이에 대한 감수성의 결정과 관련된 부수적인 동기부여는 예를 들어, 가족력에 기초한 사건(예를 들어, 혈액 관련 친척과 같은 가까운 친척이 이전에 암 진단을 받은 적이 있음), 암에 대한 하나 이상의 위험 요소(예를 들어, 흡연, 알코올, 식이, 비만, 직업 위험 등)의 식별 및/또는 유전자 시험(예를 들어, 게놈 서열결정) 및/또는 영상 진단 시험(예를 들어, 초음파, 컴퓨터 단층촬영(CT) 및/또는 자기 공명 영상(MRI) 스캔)으로부터의 사전 부수적인 소견, 암의 특징적인 하나 이상의 징후 또는 증상의 발생(예를 들어, 잠재적으로 폐암을 나타내는 지속적인 기침; 잠재적으로 유방암을 나타내는 유방 조직의 종괴(mass); 위장(GI)암을 잠재적으로 나타내는 위장(GI)관 출혈 또는 잠재적으로 난소암을 나타내는 여성 기간 동안의 비정상적인 출혈 등)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 환자 케어를 관리하기 위한 제공된 기술은 치료 및/또는 지불(예를 들어, 치료에 대한 지원) 결정 및/또는 조치를 알릴 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 개별 대상체가 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 발생 또는 재발의 하나 이상의 지표를 갖고 있는지의 여부에 대한 결정을 제공할 수 있으며, 이에 따라 이러한 소견에 비추어 요법을 시작해야 하는 시기를 의사 및/또는 환자에게 알릴 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어, 특정 반응성 바이오마커(예를 들어, 암 반응성 바이오마커)의 소견에 기초하여 치료 선택을 의사 및/또는 환자에게 알릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)와 연관된 분자 표적의 하나 이상의 수준에서의 변화의 소견에 기초하여, 개별 대상체가 현재 치료에 반응하는지의 여부에 대한 결정을 제공할 수 있으며, 이에 의해서 의사 및/또는 환자에게 이러한 요법의 효능 및/또는 이러한 소견에 비추어 요법을 유지하거나 변경하도록 하는 결정을 알릴 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 기술은 건강 보험 제공자가 예를 들어, (1) 자체적으로 스크리닝(예를 들어, 주기적인/정기적인 스크리닝에 대해서만 이용 가능하거나 일시적 및/또는 우발적으로 동기부여된 스크리닝에 대해서만 이용 가능한 지원)하고/하거나; (2) 제공된 기술에 의한 소견에 비추어 치료를 시작하고/하거나, 유지하고/하거나 변경하는 것에 대해서 지원할 것인 지(지원하지 않을 것은 지)에 관련하여 결정하도록 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 스크리닝의 결과를 제공받고, 또한 스크리닝 및/또는 특정 치료 요법의 지원에 대한 요청을 제공받는 것; (b) 적절한 일정 또는 관련 사건에 대한 반응에 따라 대상체에 대해 수행된 경우 스크리닝의 지원을 승인하고/하거나 제공받은 스크리닝 결과에 비추어 적절한 치료를 나타내는 경우 치료 요법의 지원을 승인하는 것; 및 선택적으로 (c) 지원을 구현하거나 지원이 거부되었다는 통지를 제공하는 것에 관련된 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공받은 스크리닝 결과가 관련 치료 요법에 대해 승인된 바이오마커를 나타내는 바이오마커를 검출하는 경우(예를 들어, 처방 정보 라벨에 그리고/또는 승인된 동반 진단을 통해서 주목될 수 있는 바와 같음) 제공받은 스크리닝 결과에 비추어 치료 요법이 적절하다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스크리닝 결과 및/또는 지원 결정의 보고 및/또는 처리를 허용하거나 촉진하는 보고 시스템(예를 들어, 적절한 전자 장치(들) 및/또는 통신 시스템(들)을 통해 구현됨)을 고려한다.
본 명세서에 제공된 일부 양상은 제공된 기술에서 사용하기 위한 시스템 및 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시스템 또는 키트는 각각 표적에 지향되는(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 사용된 바와 같은) 검출 프로브의 적어도 하나의 세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 또는 키트의 검출 프로브의 세트는 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과)의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 개별 검출 프로브는 상이한 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 개별 검출 프로브는 동일한 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 또는 키트는 상이한 표적에 지향되는 2개 이상의 상이한 검출 프로브를 포함하고, 선택적으로 또 다른 검출 프로브가 지향되는 표적에 또한 지향되는 적어도 하나의 추가 검출 프로브를 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 일부 양상은 바이오마커 검출 및/또는 특성규명과 관련된 제공된 기술에 사용하기 위한 시스템 및 키트에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 시스템 또는 키트는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 표적 바이오마커 시그니처에 대한 검출제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템 또는 키트는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)과 연관된 세포외 소포에 존재하는 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 대한 포획제; 및 (b) 표면 단백질 바이오마커(들), 소포내 단백질 바이오마커(들) 및/또는 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 바이오마커(들)일 수 잇거나 이를 포함할 수 있는 이러한 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커에 지향되는 적어도 1종 이상의 검출제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 시스템 및/또는 키트에 포함된 포획제는 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향되는 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 결합 모이어티는 고체 기질에 접합될 수 있고, 이것은 일부 실시형태에서 고체 기질일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 고체 기질은 자성 비드일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트에 포함된 예시적인 포획제는 고체 기질(예를 들어, 자성 비드) 및 이에 접합된 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향되는 항체 작용제일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
표적 바이오마커가 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커를 포함하는 일부 실시형태에서, 시스템 및/또는 키트는 근접 결찰 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 수행하기 위한 검출제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 근접 결찰 검정을 수행하기 위한 이러한 검출제는 각각 표적 바이오마커 시그니처의 표적 바이오마커에 지향되는 검출 프로브의 세트를 포함할 수 있는데, 이러한 세트는 적어도 2개의 검출 프로브를 포함하고, 여기서 2개의 검출 프로브는 각각 (i) 표적 바이오마커에 지향되는 폴리펩타이드-결합 모이어티; 및 (ii) 결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행 부분을 포함하고, 검출 프로브의 단일-가닥 오버행 부분은, 검출 프로브가 동일한 세포외 소포에 결합되는 경우, 그들이 서로에 혼성화할 수 있다는 것을 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 복수(예를 들어, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 검출 프로브의 세트를 포함할 수 있는데, 이들 각각의 세트는 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 초과)의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 세트는 상이한 질환, 장애 또는 병태에 대한 검출에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 세트는 동일한 질환, 장애 또는 병태에 대한 검출에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 적어도 하나 이상의 세트(예를 들어, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 그 초과)는 암에 대한 검출에 관한 것일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 각각의 세트는 상이한 암(예를 들어, 동일하거나 상이한 조직과 관련된 상이한 암 유형)에 대한 검출에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 세트는 동일한 암의 검출에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 하나의 암의 검출을 위한 검출 프로브의 적어도 하나의 세트 및 상이한 암(예를 들어, 췌장암)의 검출을 위한 검출 프로브의 적어도 하나의 세트를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 검출 프로브는 암의 상이한 하위유형 및/또는 카테고리에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 세트는 상이한 병기의 암의 검출에 관한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 세트는 동일한 병기의 암의 검출에 관한 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 키트 내의 검출 프로브는 용기 내의 단일 혼합물로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 다중 세트가 별도의 용기에 개별 혼합물로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 검출 프로브는 별도의 용기에 개별적으로 제공된다.
표적 바이오마커가 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 바이오마커를 포함하는 일부 실시형태에서, 이러한 시스템 및/또는 키트는 핵산 검출 검정을 수행하기 위한 검출제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템 및/또는 키트는 예를 들어, 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 표적(들)에 지향되는 프라이머를 포함할 수 있는 정량적 역전사 PCR을 수행하기 위한 검출제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 예를 들어, 샘플 및/또는 그 중의 관심대상 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)를 처리하기 위한 적어도 1종의 화학 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 샘플 중의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 관심대상 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 처리하기 위한, 예를 들어, 비제한적으로 고정제, 투과화제 및/또는 차단제를 포함하는 적어도 1종의 화학 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 핵산 리가제 및/또는 핵산 중합효소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 1종 이상의 프라이머 및/또는 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 예를 들어, PCR, 예를 들어, 정량적 PCR(qPCR) 반응을 위한 하나 이상의 쌍의 프라이머를 포함할 수 있다 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 하나 이상의 프로브, 예컨대, 예를 들어, 가수분해 프로브를 포함할 수 있는데, 이것은 일부 실시형태에서 qPCR(예를 들어, TaqMan 프로브)의 특이성을 증가시키도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 예를 들어 동시 또는 병렬 qPCR 반응이 사용되는 경우(예를 들어, 판독을 용이하게 하거나 개선시키기 위해) 유용할 수 있는 바와 같이 하나 이상의 멀티플렉싱 프로브를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 검출(예를 들어, 초기 검출)을 위해서 개체(예를 들어, 무증상 또는 증상이 있는 대상체)를 스크리닝(예를 들어, 정기적인 스크리닝)하고/하거나 다른 평가를 수행하기 위해서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)에 민감한 개체(예를 들어, 알려진 유전적, 환경적 또는 경험적 위험 등을 갖는 개체)의 스크리닝 및/또는 기타 평가를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 이전에 치료되었던 대상체에서 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 재발을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)를 앓고 있는 대상체에 대한 요법과 조합하여 동반 진단으로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)를 앓고 있는 대상체에게 투여된 요법의 효능을 모니터링하거나 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)를 앓고 있는 대상체를 위한 요법을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 시스템 및/또는 키트는 질환 또는 장애(예를 들어, 암)과 연관된 하나 이상의 증상(예를 들어, 비-특이적 증상)을 갖는 대상체에 대한 요법을 결정하고/하거나 선택하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트 또는 시스템에서 제공되고/되거나 이용되는 검출 프로브의 세트는 특정 암(예를 들어, 비제한적으로 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암)의 스크리닝(예를 들어, 정기적인 스크리닝) 또는 진단을 위해 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 키트 또는 시스템은 검출 프로브의 복수의 세트를 포함할 수 있는데, 각각의 세트는 상이한 암의 검출을 위해서 적어도 2종 이상의 검출 프로브를 포함한다. 예를 들어, 이러한 키트는 단일 검정으로 다양한 암(예를 들어, 비제한적으로 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암)에 대해서 대상체 또는 대상체의 집단을 스크리닝(예를 들어, 정기적으로 스크리닝)하기 위해서 사용될 수 있다.
관심대상 엔티티(예를 들어, 화학적 또는 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포 또는 분석물)에 결합된 적어도 2종 이상의 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 바와 같음)에 의해 형성된 이중-가닥 복합체는 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다.
본 명세서에 기재된 방법을 수행하고/하거나 본 명세서에 기재된 시스템 및/또는 키트를 사용하여 형성된 복합체가 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 복합체는 (a) 표적 바이오마커 시그니처를 발현하는 세포외 소포를 포함하는데, 이들 중 적어도 2개는 적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 표면 단백질 바이오마커, 소포내 단백질 바이오마커 및 소포내 RNA 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 표적 바이오마커를 포함하며, 여기서 세포외 소포는 이러한 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향되는 결합 모이어티를 포함하는 고체 기질 상에 고정된다. 이러한 복합체는 세포외 소포에 존재하는 표적 바이오마커 시그니처의 적어도 1종의 표적 바이오마커에 지향되는 적어도 2개의 검출 프로브를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 검출 프로브는 이러한 표적 바이오마커에 결합되고, 각각은 (i) 표적 바이오마커에 지향되는 결합; 및 (ii) 결합 모이어티에 커플링되는 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하는데, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행 부분을 포함하고, 여기서 검출 프로브의 단일-가닥 오버행 부분은 서로에 혼성화된다.
본 개시내용에 포함되는 이들 및 다른 양상은 하기 및 청구범위에서 보다 상세하게 설명된다.
도 1 은 개별 세포외 소포(EV)를 프로파일링하는 예시적인 작업흐름을 예시하는 개략도. 도면은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 특정 막-결합된 단백질 마커를 표시하는 EV의 면역친화성 포획를 사용하여 혈장으로부터 EV를 정제하는 것을 도시하고( 패널 A ); 본 명세서에 기재된 일부 실시형태에 따른 표적 엔티티 검출 검정을 사용하여 포획된 EV 상의 공동 국지화된 표적 마커(예를 들어, 소포내 단백질 또는 표면 단백질)의 검출을 도시한다( 패널 B ).
도 2a 내지 도 2b 는 본 명세서에 기재된 일부 실시형태에 따른 표적 엔티티 검출 검정을 예시하는 개략도. 도 2a는 일부 실시형태에서, 조합물이 암의 검출에 특이적인 검출 프로브의 조합물을 사용하는 표적 엔티티 검출 검정을 도시한다. 일부 실시형태에서, 표적 단백질 1(예를 들어, 암 마커 1)에 대한 제1 검출 프로브 및 표적 단백질 2(예를 들어, 암 마커 2)에 대한 제2 검출 프로브를 포함하는 듀플렉스 시스템이 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 또는 분석물)를 포함하는 샘플에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 각각 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 도메인에 커플링된 표적 결합 모이어티(예를 들어, 표적 단백질에 대한 항체 작용제)를 포함한다. 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브의 구별되는 표적 결합 모이어티(예를 들어, 각각 표적 단백질 1 및 표적 단백질 2에 대한 항체 작용제)가, 상응하는 단일-가닥 오버행이 서로 혼성하여 이의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 결찰이 일어날 수 있도록 가깝게 근접하게 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 또는 분석물)에 국지화되는 경우 검출 신호가 생성된다, 예를 들어, 대조군 엔티티(예를 들어, 건강한 피험자 샘플의 생물학적 엔티티)는 표적 단백질 1(예를 들어, 암 마커 1) 및 표적 단백질 2(예를 들어, 암 마커 2) 중 하나 또는 둘 다를 발현하지 않으므로, 신호의 검출이 생성될 수 없다. 그러나, 암 샘플로부터의 생물학적 엔티티가 표적 단백질 1 및 표적 단백질 2를 발현하고, 표적 단백질이 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)에서 서로 충분히 짧은 거리 내에 존재하는 경우, 검출 신호가 생성된다. 도 2b 는 각각의 단일-가닥 오버행의 직접 혼성화를 통해 서로 연결된 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브를 포함하는 이중-가닥 복합체의 비제한적인 예.
도 3 은 DNA 리가제(예를 들어, T4 또는 T7 리가제)가 있거나 없는 결찰된 주형의 qPCR 검출을 나타낸 그래프.
도 4 는 상이한 세포 샘플(예를 들어, 암 세포 샘플, 예컨대, T84, MeWo, 또는 SK-MEL-1 세포 샘플)에서 결찰된 주형의 qPCR 검출을 도시한 그래프.
도 5a 는 본 명세서에 기재된 일부 실시형태에 따른 표적 엔티티 검출 검정을 예시하는 개략도. 도면은 예시적인 트라이플렉스(triplex) 표적 엔티티 검출 시스템을 나타내며, 여기서 일부 실시형태에서 각각 표적 단백질에 대해서 3개 이상의 검출 프로브가 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)를 포함하는 샘플에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 각각 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 도메인에 커플링된 표적 결합 모이어티(예를 들어, 표적 단백질에 대한 항체 작용제)를 포함한다. 3개 이상의 모든 검출 프로브의 상응하는 단일-가닥 오버행이 서로 혼성화하여 선형 이중-가닥 복합체를 형성하고, 이중-가닥 복합체의 적어도 한 가닥의 결찰이 발생하여, 검출 신호가 생성되고, 이에 따라서 생성된 결찰된 산물이 검출될 수 있다. 도 5b는 각각의 단일-가닥 오버행의 혼성화를 통해 선형 배열로 서로 연결된 4개의 검출 프로브를 포함하는 이중-가닥 복합체의 비제한적 예이다.
도 6 은 3개의 별개의 검출 프로브 모두의 상응하는 올리고뉴클레오타이드 도메인이 존재하는 경우 결찰된 산물의 qPCR 검출을 도시한 그래프.
도 7 은 3개의 검출 프로브 중 2개(예를 들어, 표적 1 및 표적 3의 경우)가 존재하는 경우 결찰된 산물의 qPCR 검출을 도시한 그래프.
도 8 은 3개의 검출 프로브 중 2개(예를 들어, 표적 1 및 표적 2의 경우)가 존재하는 경우 결찰된 산물의 qPCR 검출을 도시한 그래프.
도 9 는 3개의 검출 프로브 중 2개(예를 들어, 표적 2 및 표적 3의 경우)가 존재하는 경우 결찰된 산물의 qPCR 검출을 도시한 그
도 10 은 본 명세서에 기재된 예시적인 실시형태의 표적 엔티티 검출 검정을 예시하는 개략도. 일부 실시형태에서, 각각 구별되는 표적에 대한 복수의 검출 프로브가 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)를 포함하는 샘플에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 각각 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 도메인에 커플링된 표적 결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제)를 포함한다. 상응하는 단일-가닥 오버행이 혼성화하여 선형 이중-가닥 복합체를 형성하고, 생성된 선형 이중-가닥 복합체의 적어도 하나의 가닥의 결찰이 발생하도록 모든 검출 프로브가 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 또는 분석물)에 가깝게 근접하게 국지화되는 경우 검출 신호가 생성되고, 이에 의해서 결찰된 산물이 검출될 수 있다.
도 11 은 본 명세서에 기재된 예시적인 실시형태의 표적 엔티티 검출 검정을 예시하는 개략도. 일부 실시형태에서, 표적 엔티티 검출 검정은 검출 프로브의 조합물을 이용하는데 이러한 조합물은 암(예를 들어, 특정 암, 예를 들어, 흑색종 및/또는 암의 특정 병기 등)의 검출에 특이적이다. 일부 실시형태에서, 이러한 검출 프로브의 조합물은 각각 표적 단백질(일부 실시형태에서 이것은 동일한 표적 단백질일 수 있거나, 일부 실시형태에서 구별되는 단백질일 수 있음)에 지향되는 적어도 2종 이상의 표적-특이적 검출 프로브, 및 적어도 1종 이상의 대조군 프로브, 예를 들어, 결합이 검출 프로브의 결찰을 저해하거나 배제하는 음성 대조군 프로브를 포함하며; 일부 실시형태에서, 대조군 프로브는 예를 들어, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 존재하는 것이 관심대상 엔티티가 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대해서 음성임을 나타내는 것과 같은 암과 관련되지 않은 단백질 또는 펩타이드에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 검출 프로브의 조합물은 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 또는 분석물)를 포함하는 샘플에 첨가된다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 각각 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 도메인에 커플링된 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제 또는 압타머)를 포함한다. 대조군 프로브가 아닌 모든 표적-특이적 검출 프로브(예를 들어, 각각 표적 단백질 1, 표적 단백질 2 및 표적 단백질 3에 지향됨)가 근접하게 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 또는 분석물)에 가깝게 국지화되는 경우 검출 신호가 생성된다. 표적-특이적 검출 프로브의 상응하는 단일-가닥 오버행이 혼성화하여 이중-가닥 복합체를 형성하고, 생성된 이중-가닥 복합체의 적어도 한 가닥의 결찰이 발생하고, 이에 따라서 결찰된 산물이 검출될 수 있다. 예를 들어, 대조군 엔티티(예를 들어, 건강한 대상체 샘플로부터의 생물학적 엔티티)가 3개의 표적 단백질을 모두 발현하는 경우에도, 암과 연관되지 않은 대조군 단백질의 존재로 인해 검출 신호가 생성될 수 없다. 그러나, 암 샘플(예를 들어, 흑색종)로부터의 생물학적 엔티티가 암과 연관이 없는 대조군 단백질의 부재 하에서 3개의 표적 단백질 모두를 발현하고, 표적 단백질이 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 또는 분석물) 내에서 서로 충분히 짧은 거리 내에 존재하는 경우, 검출 신호가 생성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 포함은 위양성을 선택적으로 제거할 수 있고, 이에 의해 검출의 특이성을 개선할 수 있다.
도 12 는 결찰의 경쟁적 저해를 포함하는 본 명세서에 기재된 예시적인 실시형태의 표적 엔티티 검출 검정을 예시하는 개략도. 도 11에 도시된 바와 같이, 대조군 프로브가 동일한 생물학적 엔티티에 대해 다른 표적-특이적 검출 프로브와 함께 국지화되는 경우, 결찰 산물이 형성될 수 없다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브는 (i) 그것이 2개의 표적-특이적 검출 프로브 사이에 배열되고; (ii) 대조군 프로브의 각각의 단부는 뭉툭한 단부이고, 따라서 다른 검출 프로브와 결찰할 수 없도록 설계된다. 추가로 또는 대안적으로, 대조군 프로브는 결찰 가능하지 않도록 가닥의 하나의 단부에 다이데옥시뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
도 13a 내지 도13b 는 흑색종 세포주(MeWo)-유래 세포외 소포, 결장직장암 세포주(T84)-유래 세포외 소포를 포함하고, 주형이 없는(음성 대조군) 샘플에서 결찰된 주형의 qPCR 검출을 나타낸 그래프. 도 13a는 예시적인 듀플렉스 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)으로부터 얻은 실험 데이터를 나타낸다. 도 13b는 예시적인 트라이플렉스 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같음)으로부터 얻은 실험 데이터를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14d 는 표 4에 표시된 바와 같이 바이오마커의 특정 세트에 지향되는 검출 프로브를 사용하는 예시적인 듀플렉스 검출 검정을 사용하여 알고 있는 양의 암세포주-유래 세포외 소포가 스파이킹된 혈장 샘플에서 세포외 소포를 검정함으로써 얻은 평균 델타 Ct 값(기준선으로서 건강한 환자 샘플 사용)을 나타낸 그래프. 도 14a 는 표적 마커 A 및 표적 마커 B(조합물 1)에 지향되는 검출 프로브의 사용에 기초한 데이터를 나타낸다. 도 14b 는 표적 마커 E 및 표적 마커 F(조합물 2)에 지향되는 검출 프로브의 사용에 기초한 데이터를 나타낸다. 도 14c 는 표적 마커 E 및 표적 마커 A(조합물 3)에 지향되는 검출 프로브의 사용에 기초한 데이터를 나타낸다. 도 14d 는 표적 마커 G 및 표적 마커 F(조합물 4)에 지향되는 검출 프로브의 사용에 기초한 데이터를 나타낸다.
도 15a 내지 도 15c 는 표적 마커 E 및 표적 마커 A의 조합물(표 4에 나타낸 조합물 3)에 지향되는 검출 프로브를 사용한 예시적인 듀프렉스 검출 검정을 사용하여 IV기 폐 선암종 환자 및 정상 건강한 대상체로부터 얻은 혈장 샘플에서 세포외 소포를 검정함으로써 얻은 실험 데이터를 나타낸 그래프. 도 15a 는 평균 델타 Ct 값을 나타낸다(건강한 환자 샘플 A를 기준선으로 사용). 도 15 b는 2델타_Ct로 계산된 정규화된 신호를 나타낸다. 도 15c 는 샘플을 건강한 또는 IV기 폐 선암종으로 분류하는, 평균 건강한 정규화 신호의 역치값 및 3개의 표준 편차와 함께, 수용자 행동 특징(receiver operating characteristic: ROC) 곡선을 나타낸다.
도 16a 내지 도 16c 는 표적 마커 E 및 표적 마커 H의 조합물(표 4에 나타낸 조합물 5)에 지향되는 검출 프로브를 사용한 예시적인 듀프렉스 검출 검정을 사용하여 IV기 폐 선암종 환자 및 정상 건강한 대상체로부터 얻은 혈장 샘플에서 세포외 소포를 검정함으로써 얻은 실험 데이터를 나타낸 그래프. 도 16a는 평균 델타 Ct 값을 나타낸다(건강한 환자 샘플 A를 기준선으로 사용). 도 16b는 2델타_Ct로 계산된 정규화된 신호를 나타낸다. 도 16c는 샘플을 건강한 또는 IV기 폐 선암종으로 분류하는, 평균 건강한 정규화 신호의 역치값 및 3개의 표준 편차와 함께, 수용자 행동 특성(receiver operating characteristic: ROC) 곡선을 나타낸다.
도 17 은 각각 도 15b 및 도 16b에 도시된 바와 같이 조합물 3 마커 및 조합물 5 마커를 사용하여 얻은 정규화된 신호 간의 상관관계를 도시한 도면.
도 18 은 비-특이적 결찰된 주형이 검출 가능한 신호를 생성하여 배경 신호를 감소시키는 것을 감소시키거나 저해하는데 사용될 수 있는 예시적인 저해제 올리고뉴클레오타이드를 나타내는 개략도.
도 19 는 상이한 세포주-유래 세포외 소포 샘플에서, 예를 들어, 도 1 또는 도 2a 내지 도 2b에 예시된 검정을 사용하여 결찰된 샘플의 qPCR 검출로부터의 실험 데이터. 일부 실시형태에서, 표적 엔티티 검출 검정은 암 마커 1("암 마커 1 포획") 및 예시적인 듀플렉스 시스템을 기반으로 하는 세포외 소포를 포획하기 위한 작용제를 포함하는데, 예시적인 듀플렉스 시스템은 예를 들어, 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인("암 마커 2+암 마커 2 항체 프로브")의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함하는, 구별되는 올리고뉴클레오타이드 도메인에 커플링된 암 마커 2(예를 들어, 항암 마커 2 항체)에 지향되는 결합 모이어티를 각각 포함하는 적어도 2개의 검출 프로브를 포함한다. 패널 A 는 바이오마커-음성 암 세포주 EV(음성 세포주)에 비해 바이오마커-양성 암 세포주 EV(양성 세포주)의 검출을 비교하는 qPCR 데이터의 그래프를 도시한다. 패널 B 는 음성 대조군 세포주(예를 들어, 바이오마커-음성 암 세포주)를 기준선으로 사용한 상응하는 평균 델타 Ct 값을 나타낸다.
도 20 은 예시적인 검정에 의해 평가된 환자 코호트에 대한 연령 및 코호트 크기를 나타내는 암 환자 혈장 샘플 연구에 포함된 환자의 인구 통계를 도시한 그래프.
도 21 은 2개의 상이한 컷오프에서, 암 마커 2+암 마커 2 항체 프로브를 사용한 암 마커 1 포획에 기초한 듀플렉스 시스템(예를 들어, 도 1 또는 도 2a 및 도 2b에 기재된 바와 같음)을 포함하는 표적 암의 검출을 위한 예시적인 검정의 성능을 나타낸 그래프. 컷오프 1은 99.8% 특이성과 관련이 있고, 컷오프 2는 98% 특이성과 관련이 있다.
도 22 는 표적 암:혈청 단백질 및/또는 영상화에 대한 현재의 치료 표준과 비교하여 표적 암의 검출을 위한 예시적인 검정의 성능을 나타내는 데이터 세트. 특이성( 패널 A 및 패널 D ), 감도( 패널 B 및 패널 E ) 및 양성 예측값( 패널 C 및 패널 F )을 유전적인 위험이 있는 스크리닝 대상체( 패널 A, 패널 B 및 패널 C ) 및 표적 암에 대한 평균 위험( 패널 D, 패널 E 및 패널 F )에 대해서 비교하였다.
도 23 은 암 세포주 대 음성 대조군 세포주로부터의 EV에서 표적 바이오마커 1 mRNA의 검출을 도시한 그래프의 세트 ( 패널 A ) RT-qPCR을 사용한 벌크 EV에서 표적 바이오마커 1 mRNA의 검출. ( 패널 B ) 벌크의 EV와 비교하여 항-표적 바이오마커 2 작용화된 비드를 사용하여 포획된 EV에서 표적 바이오마커 1 mRNA의 검출.
도 24 는 검정 신호에 대한 올리고뉴클레오타이드 길이의 효과를 예시하는 원시 qPCR 데이터를 도시한 그래프. 세포주 EV는 항-표적 1-작용화 자성 비드를 사용하여 포획되었고, 신호는 본 명세서에 기재된 예시적인 듀플렉스 표적 엔티티 검출 시스템에 대한 항-표적 1 및 항-표적 2 검출 프로브를 사용하여 생성되었다.
도 25 는 표 6에 나타낸 바와 같이 조합물 1에 지향되는 검출 프로브를 사용하여 예시적인 듀플렉스 검출 검정을 사용하여 세포주 EV를 검정함으로써 얻은 평균 델타 Ct 값(기준선으로서 건강한 혈장 샘플 사용)을 도시한 그래프.
도 26 은 본 명세서에 기재된 예시적인 실시형태의 표적 엔티티 검출 검정을 예시하는 개략도. 일부 실시형태에서, 표적 엔티티 검출 검정은 검출 프로브의 조합물을 이용하며, 일부 실시형태에서 이러한 조합물은 예를 들어, 관심대상 조직(도 26에 도시된 바와 같은 조직 A)으로부터의 표적 엔티티의 검출을 위한 표적에 대해 특이적이다. 일부 실시형태에서, 이러한 검출 프로브의 조합물은 각각 관심대상 엔티티(일부 실시형태에서 이것은 동일한 표적 단백질일 수 있거나, 일부 실시형태에서 구별되는 단백질일 수 있음)에 존재하는 표적에 지향되는 적어도 2종 이상의 표적-특이적 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브는 각각 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 도메인에 커플링된 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제 또는 압타머)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 표적 엔티티 검출 검정은 적어도 1종 이상의 대조군 프로브, 예를 들어, 비-표적과의 교차 반응성을 감소시키도록 설계된 저해제 프로브를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 저해제 프로브는 비-표적 엔티티에 대한 이의 결합이 또 다른 프로브, 예를 들어, 검출 프로브와의 결찰을 허용하면서 결찰된 주형의 증폭을 저해하거나 배제하도록 설계된다. 예를 들어, 도 26 에 도시된 바와 같이, 일부 실시형태에서 저해제 프로브는 비-표적, 예를 들어, 표적 조직과 연관되지 않은 마커, 또는 진단될 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)와 연관되지 않은 마커에 지향될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 저해제 프로브는, 검출 프로브 및 저해제 프로브가 가깝게 근접하는 경우 이들의 단일-가닥 오버행이 서로 혼성화하여 결찰이 가능하도록 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출 프로브와 유사하다. 그러나, 본 명세서에 기재된 검출 프로브와 달리, 이러한 저해제 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 하나의 가닥은 프라이머 부위를 갖지 않으므로, 검출 프로브와 저해제 프로브 사이의 상호작용의 결과로 형성될 수 있는 임의의 결찰된 주형의 증폭이 금지된다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브와 저해제 프로브(들)의 조합물은 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 또는 분석물)를 포함하는 샘플에 첨가된다. 저해제 프로브가 아닌 모든 표적-특이적 검출 프로브(예를 들어, 조직 A로부터의 표적 1, 조직 A로부터의 표적 2)가 가깝게 근접하게 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 또는 분석물)에 국지화되는 경우 검출 신호가 생성된다. 표적-특이적 검출 프로브의 상응하는 단일-가닥 오버행이 혼성화하여 이중-가닥 복합체를 형성하고, 생성된 이중-가닥 복합체의 적어도 한 가닥의 결찰이 발생하고, 이에 따라서 결찰된 산물이 검출될 수 있다. 비-표적 엔티티(예를 들어, 다른 조직으로부터의 생물학적 엔티티)에 결합하는 저해제 프로브의 존재 하에서, 저해제 프로브가 주형의 증폭을 저해하기 때문에 검출 신호가 생성될 수 없다. 일부 실시형태에서, 이러한 저해제 프로브의 포함은 위양성을 선택적으로 제거할 수 있고, 이에 의해 검출의 특이성을 개선할 수 있다.
도 27 은 제시된 바와 같은 주형의 13개의 다른 조합물로부터의 원시 qPCR 데이터를 도시한 그래프.
도 28 은 제시된 바와 같은 저해제 프로브가 있거나 없는 용액 중의 결찰된 주형의 qPCR 검출을 도시한 그래프: (1+3) + (2+4) 가닥; (1+3)+(2+4)+1X(1i+3i) 가닥; (1+3)+(2+4)+1X(2i+4i) 가닥; (1+3)+(2+4)+2X(1i+3i) 가닥s; (1+3)+(2+4)+2X(2i+4i) 가닥; 및 (1+3)+(2+4)+1X(1i+3i)+1X(2i+4i) 가닥.
도 29 는 저해제 프로브의 존재 또는 부재 하에서(예를 들어, 도 26에 도시된 바와 같음) 검출 프로브를 사용한 예시적인 듀플렉스 검출 검정을 사용하여 세포주 EV를 검정함으로써 생성된 원시 qPCR 데이터를 도시한 그래프.
특정 정의
투여 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여하는" 또는 "투여"는 전형적으로 표적 부위 또는 치료될 부위에 조성물이거나 이에 포함된 작용제의 전달을 달성하기 위해 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 당업자는 적절한 상황에서 대상체, 예를 들어, 인간에게 투여하기 위해 사용될 수 있는 다양한 경로를 알고 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 투여는 비경구일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 경구일 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 단일 용량 만을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 고정된 수의 용량의 적용을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 간헐적(예를 들어, 시간상 분리된 복수의 용량) 및/또는 주기적(예를 들어, 공통 기간만큼 분리된 개별 용량) 투여인 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안의 연속적인 투여(예를 들어, 관류)를 포함할 수 있다.
증폭: 용어 "증폭" 및 "증폭시키다"는 초기 양 및/또는 수준에 비해 핵산 분자의 양 및/또는 수준이 증가하는 주형-의존적 과정을 지칭한다. 주형-의존적 과정은 일반적으로 프라이머 분자의 주형-의존적 확장을 포함하는 과정이며, 여기서 새로 합성된 핵산 가닥의 서열은 널리 공지된 상보적인 염기쌍 규칙에 의해 결정된다(예를 들어, 문헌[Watson, J. D. et al., In: Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)] 참고).
분석물: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분석물"은 검정될 샘플의 엔티티, 물질, 구성성분 또는 복합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 분석물은 생물학적 분석물일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분석물은 화학적 분석물일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분석물은 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분석물은 핵산일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분석물은 바이러스 또는 이의 단편 또는 산물을 포함하는 세포 또는 미생물(예를 들어, 세포내 분자, 세포 또는 미생물에 의해 분비된 분자, 세포-표면 분자, 세포외 소포-표면 분자 또는 막-결합된 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분석물은 본 명세서에 기재된 기술을 사용하여 검출될 적어도 1종의 표적을 포함하는 엔티티이다(예를 들어, 본 개시내용에 따라서 동일한 표적에 지향되는 적어도 2개의 검출 프로브를 포함함). 일부 실시형태에서, 분석물은 본 명세서에 기재된 기술(예를 들어, 본 개시내용에 따라 상이한 표적에 지향되는 적어도 2종 이상의 검출 프로브 포함)을 사용하여 검출될 적어도 2종 이상의 표적(예를 들어, 적어도 2종, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 그 초과의 표적)을 포함하는 엔티티이다. 일부 실시형태에서, 분석물은 단일 엔티티 또는 2개 이상의 분자 소단위를 포함하는 복합체일 수 있으며, 이것은 서로 공유 결합될 수 있거나 공유 결합되지 않을 수 있고/있거나 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분석물은 단백질 복합체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 이러한 복합체는 동종- 또는 이종-다량체일 수 있다. 분자의 집합체, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 조절 인자, 예컨대, 전사 인자)과 복합체를 형성하거나 응집된 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA)이 또한 표적 분석물일 수 있다.
항체 작용제 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체 작용제"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이 용어는 특이적 결합을 부여하기에 충분한 면역글로불린 구조 요소를 포함하는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 포함한다. 예시적인 항체 작용제는 단클론성 항체 또는 다클론성 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 마우스, 토끼, 영장류, 또는 인간 항체의 특징인 하나 이상의 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 당업계에 공지된 바와 같이 인간화, 영장류화, 키메라 등의 하나 이상의 서열 요소를 포함할 수 있다. 다수의 실시형태에서, 용어 "항체 작용제"는 대안적인 제시에서 항체 구조 및 기능 특징을 이용하기 위한 당업계에 공지되거나 개발된 작제물 또는 포맷 중 하나 이상을 지칭하기 위해 사용된다. 예를 들어, 실시형태에서, 본 발명에 따라서 이용되는 항체 작용제는 비제한적으로 온전한 IgA, IgG, IgE 또는 IgM 항체; 이중- 또는 다중-특이적 항체(예를 들어, Zybodies® 등); 항체 단편, 예컨대, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fd' 단편, Fd 단편 및 이의 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 세트; 단일 쇄 Fv; 폴리펩타이드-Fc 융합체; 단일 도메인 항체(예를 들어, 샤크 단일 도메인 항체, 예컨대, IgNAR 또는 이의 단편); 카멜로이드 항체; 차폐된 항체(예를 들어, Probodies®); Small Modular ImmunoPharmaceuticals("SMIPsTM"); 단일 쇄 또는 탠덤 다이아바디(TandAb®); VHH; Anticalins®; Nanobodies® 미니바디; BiTE®; 안키린 반복 단백질 또는 DARPINs®; Avimers®; DART; TCR-유사 항체; Adnectins®; Affilins®; Trans-bodies®; Affibodies®; TrimerX®; MicroProtein; Fynomers®, Centyrins®; 및 KALBITOR®로부터 선택된 포맷으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 항체는 자연적으로 생성되는 경우 가질 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착)이 결여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 공유 변형(예를 들어, 글리칸의 부착, 페이로드[예를 들어, 검출 가능한 모이어티, 치료 모이어티, 촉매 모이어티 등] 또는 다른 펜던트기[예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 등])을 함유할 수 있다. 다수의 실시형태에서, 항체 작용제는 아미노산 서열이 상보성 결정 영역(CDR)으로서 당업자에 의해서 인식되는 하나 이상의 구조 요소를 포함하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함하고; 일부 실시형태에서 항체 작용제는 아미노산 서열이 참조 항체에서 발견되는 것과 실질적으로 동일한 적어도 하나의 CDR(예를 들어, 적어도 하나의 중쇄 CDR 및/또는 적어도 하나의 경쇄 CDR)을 포함하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다. CDR은 서열이 동일하거나, 참조 CDR과 비교할 때 1 내지 5개의 아미노산 치환을 함유한다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 그것이 참조 CDR과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서 포함된 CDR은 그것이 참조 CDR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 나타낸다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교할 때 결실, 부가 또는 치환되지만, 포함된 CDR이 참조 CDR의 것과 다른 것은 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 1 내지 5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교할 때 결실, 부가 또는 치환되지만, 포함된 CDR이 참조 CDR과 다른 것은 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 하나의 아미노산이 참조 CDR과 비교할 때 치환되지만, 포함된 CDR이 참조 CDR의 것과 다른 것은 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 포함된 CDR은 포함된 CDR 내의 적어도 1 내지 5개의 아미노산이 참조 CDR과 비교할 때 결실, 부가 또는 치환되지만, 포함된 CDR이 참조 CDR과 다른 것은 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 참조 CDR과 실질적으로 동일하다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 아미노산 서열이 면역글로불린 가변 도메인으로서 당업자에 의해 인식되는 구조 요소를 포함하는 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 면역글로불린-결합 도메인과 상동성 또는 대체로 상동성인 결합 도메인을 갖는 폴리펩타이드 단백질이다.
항체 작용제는 당업계에 공지된 방법 및 상업적으로 입수 가능한 서비스 및 키트를 사용하여 당업자에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 단클론성 항체의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 하이브리도마 기술 및 파지 디스플레이 기술을 포함한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 추가 항체는 예를 들어, 하기 간행물에 기재되어 있다: 문헌[Antibodies A Laboratory Manual, Second edition. Edward A. Greenfield. Cold Spring Harbor Laboratory Press (September 30, 2013)]; 문헌[Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, Second Edition. Eds. Gary C. Howard and Matthew R. Kaser. CRC Press (July 29, 2013)]; 문헌[Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology). Patrick Chames. Humana Press (August 21, 2012)]; 문헌[Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Eds. Vincent Ossipow and Nicolas Fischer. Humana Press (February 12, 2014)]; 및 문헌[Human Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Michael Steinitz. Humana Press (September 30, 2013))].
항체는 표준 기술, 예를 들어, 적절한 폴리펩타이드 또는 이의 부분(들)을 사용한 면역화 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 생산될 수 있다. 다클론성 항체가 필요한 경우, 선택된 포유동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)은 원하는 에피토프(들)를 보유하는 면역원성 폴리펩타이드로 면역화되고, 선택적으로 또 다른 폴리펩타이드로 합텐화된다. 숙주 종에 따라, 면역 반응을 증가시키기 위해 다양한 아주반트가 사용될 수 있다. 이러한 보조제는 프로인트, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄 및 표면 활성 물질, 예컨대, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 다이나이트로페놀을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 수집하고, 공지된 절차에 따라 처리한다. 원하는 에피토프에 대한 다클론성 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유하는 경우, 다클론성 항체는 면역친화성 크로마토그래피 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 정제될 수 있다. 다클론성 항혈청을 생산하고 처리하는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.
대략 또는 약 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심대상 값에 적용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 일반적으로, 문맥 내에서 친숙한 당업자는 그 문맥에서 "약" 또는 "대략"에 의해 포함되는 적절한 변동 정도를 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 보다 더 작은 값 내의 값의 범위를 포함할 수 있다.
압타머 : 본 명세서에 사용된 용어 "압타머"는 전형적으로 특정 표적 분자(예를 들어, 에피토프)에 결합하는 핵산 분자 또는 펩타이드 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 핵산 압타머는 뉴클레오타이드 서열에 의해 기재될 수 있고 전형적으로 약 15 내지 60개 뉴클레오타이드 길이이다. 핵산 압타머는 단일 가닥 및/또는 이중-가닥 구조이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 압타머는 DNA일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 압타머는 RNA일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 임의의 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 압타머의 뉴클레오타이드 쇄는 분자를 복잡한 3차원 형태로 접는 분자내 상호작용을 형성하고, 이러한 3차원 형상은 압타머가 이의 표적 분자의 표면에 단단히 결합하도록 한다고 고려된다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 압타머는 단백질 스캐폴드에 의해 표시되는 가변 서열의 하나 이상의 펩타이드 루프를 갖는 것으로 설명될 수 있다. 펩타이드 압타머는 조합 라이브러리로부터 단리될 수 있고, 종종 후속적으로 지향 돌연변이 또는 가변 영역 돌연변이유발 및 선택의 라운드에 의해 개선될 수 있다. 가능한 모든 뉴클레오타이드 및/또는 펩타이드 서열에 광범위하게 존재하는 분자 형상의 놀라운 다양성을 고려할 때, 압타머는 단백질 및 소분자를 포함하는 다양한 분자 표적에 대해 얻어질 수 있다. 높은 특이성 외에도, 압타머는 전형적으로 표적에 대해 매우 높은 친화도를 갖는다(예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드에 대한 피코몰에서 낮은 나노몰 범위의 친화도). 압타머는 전형적으로 합성 분자이기 때문에, 압타머는 다양한 변형이 가능할 수 있고, 이것은 특정 적용에 대해서 이의 기능을 최적화할 수 있다.
와 연관된: 하나의 존재, 수준 및/또는 형태가 다른 것의 존재, 수준 및/또는 형태와 상관관계가 있는 경우, 2개의 사건 또는 엔티티는 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 서로 "연관"된다. 예를 들어, 특정 생물학적 현상(예를 들어, 특정 바이오마커의 발현)은 이의 존재가 (예를 들어, 관련 집단에 걸쳐서) 이러한 질환, 장애 또는 병태의 발생률 및/또는 민감성과 상관관계가 있는 경우, 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암의 특정 유형 및/또는 암 단계)와 연관된다고 간주된다.
생물학적 엔티티: 적절한 상황에서, 당업자에게 문맥 상 명백할 바와 같이, 용어 "생물학적 엔티티"는 예를 들어, 일부 실시형태에서 대상체로부터 유래되거나 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에 존재하는 엔티티 또는 성분을 지칭하기 위해 이용될 수 있는데, 이것은 일부 실시형태에서, 세포 또는 유기체, 예컨대, 동물 또는 인간일 수 있거나 이것을 포함할 수 있거나, 일부 실시형태에서 생물학적 조직 또는 유체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 세포 또는 미생물, 또는 이의 분획, 추출물 또는 성분(예를 들어, 세포 또는 미생물에 의해 분비되는 세포내 성분 및/또는 분자 포함)이거나 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 세포이거나 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 세포외 소포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 생물학적 분석물(예를 들어, 대사산물, 탄수화물, 단백질 또는 폴리펩타이드, 효소, 지질, 세포소기관, 사이토카인, 수용체, 리간드, 및 이들의 임의의 조합물)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 생물학적 엔티티는 천연 상태로 존재한다(예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드는 자연 발생하는 입체배좌 구조로 유지된다). 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 예를 들어, 샘플로부터 단리시키거나 자연 발생 생물학적 엔티티로부터 유래함으로써 처리된다. 예를 들어, 생물학적 엔티티는 본 명세서에 제공된 기술을 이용하여 검출하는 것이 더 바람직하도록 1정 이상의 화학 작용제로 처리될 수 있다. 단지 예로서, 생물학적 엔티티는 고정제(비제한적으로, 메탄올 및/또는 폼알데하이드)와 접촉되어 세포 또는 세포외 소포에 존재하는 단백질 및/또는 펩타이드가 가교를 형성하게 하는 세포 또는 세포외 소포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 단리된 또는 순수한 형태(예를 들어, 혈액 또는 혈장 샘플로부터 단리됨)이다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 복합 매트릭스(예를 들어, 혈액 또는 혈장 샘플)에 존재할 수 있다.
바이오마커 : 용어 "바이오마커"는 전형적으로 존재, 수준, 정도, 유형 및/또는 형태가 특정 생물학적 사건 또는 관심대상 상태와 상관관계가 있어서, 그 사건 또는 상태의 "마커"인 것으로 간주되는 엔티티, 사건 또는 특징을 지칭한다. 몇 가지 예를 들자면, 일부 실시형태에서 바이오마커는 특정 질환 상태에 대한 또는 특정 질환, 장애 또는 병태가 발병, 발생 또는 재발할 가능성에 대한 마커이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 특정 질환 또는 치료 결과 또는 이의 가능성에 대한 마커이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 특정 조직(예를 들어, 비제한적으로 뇌, 유방, 결장, 난소 및/또는 여성 생식기계와 연관된 다른 조직, 췌장, 전립선 및/또는 남성 생식기계와 연관된 다른 조직, 간, 폐 및 피부)에 대한 마커이거나 이를 포함할 수 있다. 특정 조직에 대한 이러한 마커는 일부 실시형태에서 건강한 조직에 대해 특이적일 수 있거나, 병에 걸린 조직에 대해 특이적일 수 있거나, 일부 실시형태에서 정상적인 건강한 조직 및 병에 걸린 조직(예를 들어, 종양)에 존재할 수 있고; 본 개시내용을 읽는 당업자는 각각의 이러한 유형의 바이오마커에 대한 적절한 맥락을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 암-특이적 마커(예를 들어, 특정 암에 특이적인 마커)일 수 잇거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 비-특이적 암 마커(예를 들어, 적어도 2종 이상의 암에 존재하는 마커)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 비-특이적 암 마커는 일부 실시형태에서 암에 대한 일반 마커(예를 들어, 조직 유형에 관계없이 암에 전형적으로 존재하는 마커)이거나, 또는 일부 실시형태에서 특정 조직(예를 들어, 비제한적으로 뇌, 유방, 결장, 난소 및/또는 여성 생식기계와 연관된 다른 조직, 췌장, 전립선 및/또는 남성 생식기계와 연관된 다른 조직, 간, 폐 및 피부)의 암에 대한 마커일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 바이오마커는 예측적이며; 일부 실시형태에서, 바이오마커는 예후적이며; 일부 실시형태에서, 바이오마커는 관련된 생물학적 사건 또는 관심대상 상태의 진단적이다. 바이오마커는 임의의 화학적 부류의 엔티티일 수 있거나 이를 포함할 수 있고, 엔티티의 조합물일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 바이오마커는 핵산, 폴리펩타이드, 지질, 탄수화물, 소분자, 무기 작용제(예를 들어, 금속 또는 이온) 또는 이들의 조합물일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 특정 분자, 복합체 또는 구조의 일부이거나 이를 포함하고; 예를 들어, 일부 실시형태에서, 바이오마커는 에피토프일 수 있거나 에피토프를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)의 표면 마커(예를 들어, 표면 단백질 마커)이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 세포내 마커이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 세포 외부에서 검출되고, 예를 들어, 세포 외부에, 예를 들어, 체액, 예컨대, 혈액, 혈장, 소변, 눈물, 타액, 뇌척수액 등에서 분비되거나 달리 생성되거나 존재한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 소포내이다(예를 들어, 세포외 소포 내에 존재하는 단백질 또는 RNA 마커). 일부 실시형태에서, 바이오마커는 유전적 또는 후성적 시그니처일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 유전자 발현 시그니처일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기에 적절한 "바이오마커"는 표적 마커에 존재하는 분자 엔티티(예를 들어, 에피토프)의 존재, 수준 및/또는 형태를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 분자 엔티티(예를 들어, 에피토프)로서 2개 이상의 "바이오마커"가 동일한 표적 마커(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예를 들어, 세포외 소포에 존재하는 표면 단백질과 같은 마커 단백질) 상에 존재할 수 있다.
혈액-유래 샘플: 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "혈액-유래 샘플"은 이를 필요로 하는 대상체의 혈액 샘플(즉, 전혈 샘플)로부터 유래된 샘플을 지칭한다. 혈액-유래 샘플의 예는 혈장(예를 들어, 신선한 냉동 혈장 포함), 혈청, 혈액 분획, 혈장 분획, 혈청 분획, 적혈구(RBC), 혈소판, 백혈구 등을 포함하는 혈액 분획, 및 이들의 분획을 포함하는 세포 용해물(예를 들어, 세포, 예컨대, 적혈구, 백혈구 등을 수거하고, 이를 용해시켜 세포 용해물을 얻을 수 있음)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법, 시스템 및/또는 키트와 함께 사용되는 혈액-유래 샘플은 혈장 샘플이다.
암 : 용어 "암"은 일반적으로 관심대상 조직의 세포가 상대적으로 비정상적이고/이거나, 통제되지 않고/않거나 자율적인 성장을 나타내어, 이들이 세포 증식의 통제의 상당한 손실을 특징으로 하는 비정상적인 성장 표현형을 나타내는 질환 또는 병태를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 암은 전암성(예를 들어, 양성), 악성, 전-전이성, 전이성 및/또는 비전이성인 세포를 포함할 수 있다. 일 양상에서, 본 개시내용은 암의 검출을 위한 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 암은 고형 종양을 특징으로 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 혈액 종양을 특징으로 할 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 암의 상이한 유형의 예는 예를 들어, 백혈병, 림프종(호지킨 및 비호지킨), 골수종 및 골수증식성 장애를 포함하는 조혈암; 육종, 흑색종, 선종, 고형 조직의 암종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 간암, 비뇨생식기암, 예컨대, 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 자궁암 및 자궁내막암 및 신세포 암종, 골암, 췌장암, 피부암, 피부 또는 안내 흑색종, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 두경부암, 난소암, 유방암, 교모세포종, 결장직장암, 위장관암 및 신경계암, 양성 병변, 예컨대, 유두종 등을 포함한다.
가깝게 근접 : 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "가깝게 근접"은 (예를 들어, 각각의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 통한) 검출 프로브 간의 상호작용이 발생할 가능성이 예상될 정도로 충분히 가까운 2개의 검출 프로브(예를 들어, 한 쌍의 2개의 검출 프로브) 사이의 거리를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 2개의 검출 프로브가 명시된 조건 하에서 서로 충분히 가깝게 근접하는 경우(예를 들어, 검출 프로브가 관심대상 엔티티, 예를 들어, 세포외 소포에서 각각의 표적에 결합되는 경우) 일정 기간에 걸쳐서 (예를 들어, 각각의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 통해서) 이들이 서로와 상호작용할 가능성은 예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과를 포함하여 적어도 50% 또는 그 초과이다. 일부 실시형태에서, 2개의 검출 프로브가 서로 충분히 가깝게 근접하는 경우 이들 사이의 거리는 대략 0.1 내지 1000㎚ 또는 0.5 내지 500㎚ 또는 1 내지 250㎚ 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 검출 프로브가 서로 충분히 가깝게 근접하는 경우 이들 사이의 거리는 대략 0.1 내지 10㎚ 또는 대략 0.5 내지 5㎚ 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 검출 프로브가 서로 충분히 가깝게 근접하는 경우 이들 사이의 거리는 100㎚ 미만 또는 그 미만, 예를 들어 90㎚ 미만, 80㎚ 미만, 70㎚ 미만, 60㎚ 미만, 50㎚ 미만, 40㎚ 미만, 30㎚ 미만, 20㎚ 미만, 10㎚ 미만, 5㎚ 미만, 1㎚ 미만, 또는 더 짧을 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 검출 프로브가 서로 충분히 가깝게 근접하는 경우 이들 사이의 거리는 대략 40 내지 1000㎚ 또는 40 내지 500㎚ 범위일 수 있다.
대등한 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대등한"은 서로 동일하지 않을 수 있지만 당업자가 관찰된 차이점 또는 유사점에 기초하여 결론이 합리적으로 도출될 수 있다는 것을 인식할 것이도록 그들 사이의 비교를 허용하기에 충분히 유사한 2종 이상의 작용제, 엔티티, 상황, 조건의 세트 등을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조건, 상황, 개체 또는 집단의 대등한 세트는 복수의 실질적으로 동일한 특징 및 하나 또는 적은 수의 다양한 특징을 특징으로 한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자라면, 2 이상의 상기 작용제, 엔티티, 상황, 조건의 세트 등이 대등한 것으로 여겨지는 임의의 제시된 상황에서 어떤 정도의 동일성이 요구되는지를 이해할 것이다. 예를 들어, 당업자는 상이한 상황, 개체 또는 집단의 세트에서 또는 이들과 함께 얻어진 결과 또는 관찰되는 현상의 상이성이, 변화된 특징의 차이에 의해 유발되거나 그 차이를 나타낸다는 합리적인 결론을 보장하기에 충분한 수 및 유형의 실질적으로 동일한 특징에 의해 특징규명되는 경우, 상황, 개체 또는 집단의 세트는 서로 대등할 수 있음을 인식할 것이다.
상보적: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상보적"은 염기쌍 규칙에 의해 관련된 올리고뉴클레오타이드 혼성화와 관련하여 사용된다. 예를 들어, 서열 "C-A-G-T"는 서열 "G-T-C-A"와 상보적이다. 상보성은 부분적이거나 전체적일 수 있다. 따라서, 부분 상보성이 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 허용한다면, 임의의 부분 상보성은 용어 "상보적"의 범위 내에 포함되도록 의도된다. 부분 상보성은 하나 이상의 핵산 염기가 염기쌍 규칙에 따라 일치하지 않는 경우이다. 핵산 간의 전체 또는 완전한 상보성은 각각의 모든 핵산 염기가 염기 쌍 규칙에 따라 다른 염기와 일치하는 경우이다.
질환: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질환"은 전형적으로 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 조직 또는 시스템의 정상적인 기능을 손상시키고, 전형적으로 특징적인 징후 및/또는 증상에 의해 나타나는 장애 또는 병태를 지칭한다. 본 개시내용에 따라 검출할 수 있는 질환의 예는 자가면역 질환, 염증성 질환, 골 질환, 대사 질환, 신경계 및 신경퇴행성 질환, 암, 심혈관 질환, 알레르기 및 천식, 알츠하이머병 및 호르몬 관련 질환을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
검출하는: 용어 "검출하는"은 샘플이 본 명세서에 기재되고/이용된 바와 같은 검출 프로브와 접촉된 후 관심대상 엔티티의 존재 또는 부재 또는 관심대상 엔티티(예를 들어, 결찰된 주형)의 임의의 측정 형태를 결정하는 적절한 수단을 포함하도록 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 따라서, "검출"은 어떤 방식으로든 표적 바이오마커 시그니처의 부분에 상응하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 RNA 바이오마커 및/또는 상기에 언급된 관심대상 엔티티를 나타내는 측정 형태, 예를 들어 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커를 나타내는 결찰된 주형 또는 소포내 mRNA를 나타내는 PCR 증폭 산물)의 존재 또는 부재, 수준, 양 및/또는 위치를 결정, 측정, 평가 또는 검정하는 것을 포함할 수 있다. 반정량적인 것을 포함한 정량적 및 정성적 결정, 측정 또는 평가가 포함된다. 이러한 결정, 측정 또는 평가는 예를 들어, 관심대상 엔티티(예를 들어, 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 RNA 바이오마커 및/또는 상기에 언급된 관심대상 엔티티를 나타내는 측정 형태, 예를 들어 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커를 나타내는 결찰된 주형 또는 소포내 mRNA를 나타내는 PCR 증폭 산물)가 대조군 기준에 대해서 상대적으로 검출되려는 경우에는 상대적일 수 있거나 또는 절대적일 수 있다. 이와 같이, 관심대상 엔티티(예를 들어, 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 RNA 바이오마커 및/또는 상기에 언급된 관심대상 엔티티를 나타내는 측정 형태, 예를 들어 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커를 나타내는 결찰된 주형 또는 소포내 mRNA를 나타내는 PCR 증폭 산물)를 정량하는 것과 관련하여 사용되는 경우 용어 "정량하는"은 절대적 정량 또는 상대적 정량을 지칭할 수 있다. 절대적 정량은 관심대상 엔티티(예를 들어, 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 RNA 바이오마커 및/또는 상기에 언급된 관심대상 엔티티를 나타내는 측정 형태, 예를 들어 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커를 나타내는 결찰된 주형 또는 소포내 mRNA를 나타내는 PCR 증폭 산물)의 검출된 수준을, (예를 들어, 표준 곡선의 생성을 통해서) 공지된 대조군 표준품에 대해서 상관시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 상대적 정량은 2개 이상의 상이한 관심대상 엔티티(예를 들어, 상이한 표면 단백질 바이오마커, 및/또는 소포내 단백질 바이오마커, 및/또는 소포내 RNA 바이오마커) 사이의 검출된 수준 또는 양의 비교에 의해 달성되어 2개 이상의 서로 다른 관심대상 엔티티 각각, 즉, 서로에 대해 상대적일 수 있다.
검출 표지: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출 표지"는 검출 가능한 임의의 요소, 분자, 작용기, 화합물, 단편 또는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 검출 표지는 단독으로 제공되거나 이용된다. 일부 실시형태에서, 검출 표지는 또 다른 검출제와 회합되어(예를 들어, 결합되어) 제공 및/또는 이용된다. 검출 표지의 예는 다음을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 다양한 리간드, 방사성 핵종(예를 들어, 3H, 14C, 18F, 19F, 32P, 35S, 135I, 125I, 123I, 64Cu, 187Re, 111In, 90Y, 99mTc, 177Lu, 89Zr 등), 형광 염료, 화학발광제 (예컨대, 아크리디늄 에스터, 안정화된 다이옥세탄 등), 생물발광제, 분광적으로 분해 가능한 무기 형광 반도체 나노결정(즉, 양자점), 금속 나노입자(예를 들어, 금, 은, 구리, 백금 등) 나노클러스터, 상자성 금속 이온, 효소, 비색 표지(예컨대, 염료, 콜로이드성 금 등), 바이오틴, 다이옥시게닌, 합텐 및 항혈청 또는 단클론성 항체가 이용 가능한 단백질.
검출 프로브 : 용어 "검출 프로브"는 전형적으로 특이적 표적의 검출에 지향되는 프로브를 지칭한다. 본 개시내용에 따라서, 검출 프로브는 올리고뉴클레오타이드 도메인에 직접 또는 간접적으로 커플링된 표적 결합 엔티티를 포함하는 조성물을 지칭하며, 여기서 표적 결합 엔티티는 각각의 표적(예를 들어, 분자 표적)에 특이적으로 결합하고, 여기서 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 일부는 구별되는 표적에 대한 또 다른 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 일부와의 혼성화를 허용하도록 설계된다. 다수의 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기에 적절한 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 적어도 하나의 단일 가닥 오버행을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 이중-가닥 부분의 각각의 단부에 단일-가닥 오버행을 포함할 수 있다.
이중-가닥: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 맥락에서 용어 "이중-가닥"은 한 쌍의 올리고뉴클레오타이드가 예를 들어, 핵산, 예컨대, DNA와 전형적으로 회합되는 수소-결합 나선 배열로 존재한다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드의 100% 상보적 형태에 더하여, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "이중-가닥"은 또한 미스매치(예를 들어, 부분적 상보성) 및/또는 돌출부, 루프 또는 헤어핀으로서 구조적 특징을 포함하는 형태를 지칭하도록 의미된다.
이중-가닥 복합체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중-가닥 복합체"는 전형적으로 검출 프로브의 상보적인 단일-가닥 오버행의 혼성화를 통해 선형 배열로 서로 연결되거나 결합된, 각각이 표적(동일한 표적 또는 구별되는 표적일 수 있음)에 지향되는 적어도 2개 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과)의 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에서 제공되고/되거나 이용됨)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 이중-가닥 복합체는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)를 포함할 수 있고, 여기서 검출 프로브의 각각의 표적 결합 모이어티는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)에 동시에 결합된다.
에피토프: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 면역글로불린(예를 들어, 항체 또는 수용체) 결합 성분 또는 압타머에 의해 특이적으로 인식되는 임의의 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 항원 상의 복수의 화학 원자 또는 기로 구성된다. 일부 실시형태에서, 이러한 화학 원자 또는 기는 항원이 관련 3차원 입체배좌를 채택할 때 표면에 노출된다. 일부 실시형태에서, 이러한 화학 원자 또는 기는 항원이 이러한 입체배좌를 채택할 때 공간에서 물리적으로 서로 가깝다. 일부 실시형태에서, 이러한 화학 원자 중 적어도 일부는 항원이 대안적인 입체배좌를 채택할 때(예를 들어, 선형화됨) 서로 물리적으로 분리되는 기이다.
세포외 소포: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포외 소포"는 일반적으로 세포 외부, 예를 들어 세포에 의해 분비되는 소포를 지칭한다. 분비된 소포의 예는 엑소좀, 미세소포, 미세입자, 엑토좀, 온코좀 및 세포자멸체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 엑소좀은 다낭성 엔도좀(multivesicular endosom: MVE)의 제한 막의 내향 버딩(budding)에 의해 형성될 수 있는 세포내이입 기원의 나노미터 크기의 소포(예를 들어, 40㎚ 내지 120㎚)인 반면, 미세소포는 전형적으로 세포 표면으로부터 버딩되고, 그 크기가 50㎚에서 1000㎚ 사이에서 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 엑소좀 및/또는 미세소포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포를 포함하는 샘플은 세포자멸체가 실질적으로 없다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포를 포함하는 샘플은 하나 이상의 조직(예를 들어, 암성 조직 및/또는 비암성 또는 건강한 조직)에서 방출되거나 유래된 세포외 소포를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 중의 세포외 소포는 질환, 장애 또는 병태와 연관된 조직으로부터 유출되거나 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 내의 세포외 소포는 표적 암의 종양으로부터 유출되거나 유래될 수 있고; 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 비-표적 암의 종양으로부터 배출되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 건강한 조직으로부터 유출되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 양성 종양으로부터 유출되거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 암과 연관된 증상(예를 들어, 비-특이적 증상)을 갖는 대상체의 조직으로부터 유출되거나 유래된다.
세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 : 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이러한 용어는 세포외 소포의 막에 존재하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 종양-특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 조직 특이적일 수 있다(예를 들어, 표적 조직, 예컨대, 피부, 폐, 췌장, 생식계 등에 특이적인 조직). 일부 실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 비-특이적일 수 있으며, 예를 들어, 이것은 하나 이상의 비-표적 종양 및/또는 하나 이상의 비-표적 조직에 존재한다.
혼성화: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혼성화하는", "혼성화하다", "혼성화", "어닐링하는" 또는 "어닐링하다"는 핵산의 가닥이 염기 짝지움을 통해 상보적인 가닥과 결합하여 혼성화 복합체를 형성하는 임의의 과정을 사용하는 상보적인 핵산의 짝지움에 대한 언급에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 혼성화 및 혼성화의 강도(예를 들어, 핵산 간의 회합 강도)는 예를 들어, 핵산 간의 상보성 정도, 관련된 조건의 엄격성, 형성된 혼성화 복합체의 용융 온도(T) 및 핵산 내 G:C 비율을 비롯한 다양한 요인에 의해 영향을 받는다.
소포내 단백질 바이오마커: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소포내 단백질 바이오마커"는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포 또는 세포외 소포) 내에 존재하는 폴리펩타이드의 상태(예를 들어, 존재, 수준 및/또는 활성)를 나타내는 마커를 지칭한다. 다수의 실시형태에서, 소포내 단백질 바이오마커는 세포외 소포와 회합되거나 세포외 소포 내에 존재한다.
소포내 RNA 바이오마커: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "소포내 RNA 바이오마커"는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포 또는 세포외 소포) 내에 존재하는 RNA(예를 들어, mRNA)의 상태(예를 들어, 존재 및/또는 수준)를 나타내는 마커를 지칭한다. 다수의 실시형태에서, 소포내 RNA 바이오마커는 세포외 소포와 회합되거나 세포외 소포 내에 존재한다.
리가제: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리가제" 또는 "핵산 리가제"는 핵산을 결찰시키는 데 사용하기 위한 효소를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 리가제는 폴리뉴클레오타이드의 3'-단부를 폴리뉴클레오타이드의 5'-단부에 결찰시키는 데 사용하기 위한 효소이다. 일부 실시형태에서, 리가제는 점착성-단부 결찰을 수행하는 데 사용하기 위한 효소이다. 일부 실시형태에서, 리가제는 뭉툭한-단부 결찰을 수행하는 데 사용하기 위한 효소이다. 일부 실시형태에서, 리가제는 DNA 리가제이거나 이를 포함한다.
결찰: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결찰시키다", "결찰시키는" 또는 "결찰"은 2개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 연결하기 위한 당업계에 공지된 방법 또는 조성물을 지칭한다. 결찰은 점착성-단부 결찰 또는 뭉툭한-단부 결찰일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술에 관련된 결찰은 점착성-단부 결찰이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결찰은 폴리뉴클레오타이드의 3' 단부를 폴리뉴클레오타이드의 5' 단부에 연결하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 결찰은 핵산 리가제의 사용에 의해 촉진된다.
비-암 대상체: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비-암 대상체"는 일반적으로 관심대상 비-양성 암을 갖지 않는 대상체를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 비-암 대상체는 건강한 대상체이다. 일부 실시형태에서, 비-암 대상체는 특정 연령군의 건강한 대상체이다. 일부 실시형태에서, 비-암 대상체는 표적 암과 연관되지 않은 질환, 장애 또는 병태를 갖는 대상체이다. 일부 실시형태에서, 비-암 대상체는 양성 종양을 갖는 대상체이다.
핵산/올리고뉴클레오타이드 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 적어도 10개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 RNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 펩타이드 핵산(PNA)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 단일 가닥 핵산이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 이중-가닥 핵산이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 단일 가닥 부분 및 이중-가닥 부분 둘 다를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 포스포다이에스터 결합을 포함하는 골격을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 포스포다이에스터 및 비-포스포다이에스터 결합 둘 다를 포함하는 골격을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 핵산은 예를 들어 "펩타이드 핵산"에서와 같이, 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 5'-N-포스포르아미다이트 링키지 및/또는 하나 이상의 펩타이드 결합을 포함하는 골격을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 또는 모든 자연 잔기(예를 들어, 아데닌, 사이토신, 데옥시아데노신, 데옥시사이티딘, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 구아닌, 티민, 우라실)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 비-자연 잔기의 하나 이상, 또는 전부를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-자연 잔기는 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸사이티딘, C-5 프로핀일-사이티딘, C-5 프로핀일-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로핀일-우리딘, C5-프로핀일-사이티딘, C5-메틸사이티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, 6-O-메틸구아닌, 2-티오사이티딘, 메틸화 염기, 삽입(intercalated) 염기 및 이들의 조합물)를 포함한다. 일부 실시형태에서 비-자연 잔기는 자연 잔기 내의 것에 비해 하나 이상의 변형된 당 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 RNA 또는 단백질과 같은 기능성 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 핵산은 자연 공급원으로부터의 단리, 효소 합성(예를 들어, 상보적 주형에 기초한 중합, 예를 들어, 생체내 또는 시험관내), 재조합 세포 또는 시스템에서의 번식, 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500 또는 20,000개 또는 그 초과의 잔기 또는 뉴클레오타이드 길이이다.
뉴클레오타이드: 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드"는 당업계에서 인식하는 의미를 지칭한다. 다수의 뉴클레오타이드가 예를 들어 올리고뉴클레오타이드의 크기 표시로서 사용되는 경우, 특정 수의 뉴클레오타이드는 예를 들어 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 상의 뉴클레오타이드의 수를 지칭한다.
환자 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자"는 질환 또는 장애 또는 변태를 앓고 있거나 이의 위험이 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 인간이 아닌 영장류 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시형태에서, 환자는 하나 이상의 질환 또는 장애 또는 병태를 앓고 있거나 이에 민감하다. 일부 실시형태에서, 환자는 질환 또는 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 환자는 하나 이상의 질환 또는 장애 또는 병태로 진단되었다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술을 적용할 수 있는 질환 또는 장애 또는 병태는 암 또는 하나 이상의 종양의 존재이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 질환, 장애 또는 병태를 진단 및/또는 치료하기 위해 특정 요법을 받고 있거나 받은 적이 있다.
폴리펩타이드 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩타이드"는 일반적으로 적어도 3개 이상의 아미노산의 중합체의 당업계에서 인식되는 의미를 갖는다. 당업자는 용어 "폴리펩타이드"가 본 명세서에 인용된 완전한 서열을 갖는 폴리펩타이드뿐만 아니라 이러한 완전한 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 기능적, 생물학적 활성 또는 특징적인 부분 또는 도메인(예를 들어, 적어도 하나의 활성을 보유하는 단편, 부분 또는 도메인)을 나타내는 폴리펩타이드를 포함하도록 충분히 일반적으로 의도됨을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 둘 다를 함유할 수 있고/있거나 당업계에 공지된 임의의 다양한 아미노산 변형 또는 유사체를 함유할 수 있다. 유용한 변형은 예를 들어 말단 아세틸화, 아마이드화, 메틸화 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 자연 아미노산, 비-자연 아미노산, 합성 아미노산, 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다(예를 들어, 펩타이드모방체일 수 있거나 이를 포함할 수 있음).
예방하다 또는 예방: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "예방하다" 또는 "예방"은 질환, 장애 및/또는 병태의 발생과 관련하여 사용될 때, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병 위험을 감소시키고/시키거나 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 특성 또는 증상의 발병을 지연시키는 것을 지칭한다. 질환, 장애 또는 병태의 발병이 미리 정의된 기간 동안 지연되면 예방이 완료된 것으로 간주될 수 있다.
프라이머: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건(예를 들어, 뉴클레오타이드 및 DNA 중합효소와 같은 유도제의 존재 및 적절한 온도 및 pH에서) 하에 존재하는 경우 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 프라이머는 증폭 효율을 최대화하기 위해 단일 가닥인 것이 바람직하다. 프라이머는 유도제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍하기에 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도와 같은 많은 요인에 따라 달라질 수 있다.
참조: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "참조"는 비교가 수행되는 표준품 또는 대조군을 설명한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 관심대상 작용제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값은 참조 또는 대조군 작용제, 동물, 개체, 집단, 샘플, 서열 또는 값과 비교된다. 일부 실시형태에서, 참조 또는 대조군은 관심대상의 시험 또는 결정과 실질적으로 동시에 시험 및/또는 결정된다. 일부 실시형태에서, 참조 또는 대조군은 선택적으로 실존하는 매체에서 구체화된 역사적 참조 또는 대조군이다. 일부 실시형태에서, 표적의 참조 수준과 관련하여 참조 또는 대조군은 정상적인 건강한 대상체 또는 정상 건강한 대상체의 집단에서 표적의 수준을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표적의 참조 수준과 관련하여 참조 또는 대조군은 치료 전 대상체의 표적 수준을 지칭한다. 전형적으로, 당업자가 이해하는 바와 같이, 참조 또는 대조군은 평가 중인 것들과 대등한 조건 또는 상황에서 결정되거나 특징규명된다. 당업자는 특별한 가능한 참조 또는 대조군에 대한 의존 및/또는 비교를 정당화하기에 충분한 유사성이 존재하는 경우를 이해할 것이다.
위험 : 문맥으로부터 이해될 바와 같이, 질환, 장애 및/또는 병태의 "위험"은 특정 개체가 질환, 장애 및/또는 병태를 발달시킬 가능성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 위험은 백분율로 표현된다. 일부 실시형태에서, 위험은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 내지 100%이다. 일부 실시형태에서, 위험은 참조 샘플 또는 참조 샘플 군과 연관된 위험에 대한 위험으로 표현된다. 일부 실시형태에서, 참조 샘플 또는 참조 샘플의 군은 질환, 장애, 병태 및/또는 사건의 알려진 위험을 갖는다. 일부 실시형태에서, 참조 샘플 또는 참조 샘플의 군은 특정 개체에 대등한 개인으로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 상대 위험은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과이다.
샘플 : 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 전형적으로 관심대상 공급원으로부터 얻거나 유래된 물질의 분취물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 관심대상 환경 공급원(예를 들어, 토양, 물, 공기, 접촉 표면 등을 포함)으로부터 얻어지거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 관심대상 생물학적 공급원(예를 들어, 조직 또는 유기체 또는 세포 배양물)으로부터 얻어지거나 유래된다. 일부 실시형태에서, 관심대상 공급원은 동물 또는 인간과 같은 유기체 또는 세포이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심대상 공급원은 생물학적 조직 또는 유체이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 조직 또는 유체는 양수, 방수, 복수, 담즙, 골수, 혈액, 모유, 뇌척수액, 귀지, 유미, 차임, 사정액, 내림프, 삼출물, 대변, 위산, 위액, 림프액, 점액, 심낭액, 외림프액, 복막액, 흉수, 고름, 류머티즘, 타액, 피지, 정액, 혈청, 태지, 가래, 활액, 땀, 눈물, 소변, 질분비물, 유리체액, 구토 및/또는 이들의 조합물 또는 성분이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 유체는 세포내 유체, 세포외 유체, 소포내 유체(혈장), 간질 유체, 림프액 및/또는 체강액(transcellular fluid)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 조직 또는 샘플은 예를 들어 흡인물, 생검(예를 들어, 가는 바늘 또는 조직 생검), 면봉(예를 들어, 구강, 비강, 피부 또는 질 면봉), 긁기, 수술, 세정 또는 세척(예를 들어, 기관지, 관, 비강, 안구, 구강, 자궁, 질, 또는 기타 세정 또는 세척)에 의해 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 액체 생검이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 얻은 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 임의의 적절한 수단에 의해 관심대상 공급원으로부터 직접 얻은 "1차 샘플"이다. 일부 실시형태에서, 문맥으로부터 명백할 바와 같이, 용어 "샘플"은 1차 샘플을 처리함으로써(예를 들어, 1차 샘플의 1종 이상의 성분을 제거하고/하거나 1종 이상의 작용제를 이에 추가함으로써) 얻어지는 제제를 지칭한다. 예를 들어, 샘플은 반투성막 또는 항체-기반 방법과 같은 친화도-기반 방법을 사용하여 처리하여 관심대상 생물학적 엔티티를 다른 비-표적 엔티티로부터 분리하는 제제이다. 이러한 "처리된 샘플"은 예를 들어, 일부 실시형태에서 세포외 소포를 포함할 수 있는 반면, 일부 실시형태에서는 샘플로부터 추출된 핵산 및/또는 단백질 등을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 처리된 샘플은 1차 샘플에 핵산의 증폭 또는 역전사, 특정 성분의 단리 및/또는 정제 등과 같은 하나 이상의 기술을 적용하여 얻을 수 있다.
선택적 또는 특이적: 활성을 갖는 작용제와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 경우 용어 "선택적" 또는 "특이적"은 작용제가 잠재적인 표적 엔티티, 상태 또는 세포를 구별함을 의미하는 것으로 당업자에 의해 이해된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 작용제는 하나 이상의 경쟁적인 대체 표적의 존재 하에서 표적과 우선적으로 결합하는 경우 표적에 "특이적으로" 결합한다고 한다. 다수의 실시형태에서, 특이적 상호작용은 표적 엔티티의 특정 구조적 특징(예를 들어, 에피토프, 틈, 결합 부위)의 존재에 의존한다. 특이성은 절대적일 필요는 없음을 이해해야 한다. 일부 실시형태에서, 특이성은 하나 이상의 다른 잠재적인 표적 엔티티(예를 들어, 경쟁자)에 대한 표적-결합 모이어티의 특이성에 대해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특이성은 참조 특이적 결합 모이어티의 특이성에 대해 평가된다. 일부 실시형태에서, 특이성은 참조 비-특이적 결합 모이어티의 특이성에 대해 평가된다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 이의 표적 엔티티에 대한 결합 조건 하에서 경쟁적인 대체 표적에 검출 가능하게 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 경쟁적인 대체 표적(들)과 비교할 때 이의 표적 엔티티에 대해 더 높은 온-레이트, 더 낮은 오프-레이트, 증가된 친화도, 감소된 해리 및/또는 증가된 안정성으로 결합한다.
소분자: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "소분자"는 저분자량 유기 및/또는 무기 화합물을 의미한다. 일반적으로 "소분자"는 크기가 약 5 킬로달톤(kD) 미만인 분자이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 약 4 kD, 3 kD, 약 2 kD, 또는 약 1 kD 미만이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 약 800달톤(D), 약 600 D, 약 500D, 약 400D, 약 300D, 약 200D, 또는 약 100D 미만이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 약 2000g/mol 미만, 약 1500g/mol 미만, 약 1000g/mol 미만, 약 800g/mol 미만, 또는 약 500g/mol 미만이다. 일부 실시형태에서, 소분자는 중합체가 아니다. 일부 실시형태에서, 소분자는 중합체 모이어티를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 소분자는 단백질 또는 폴리펩타이드가 아니다(예를 들어, 올리고펩타이드 또는 펩타이드가 아니다). 일부 실시형태에서, 소분자는 폴리뉴클레오타이드가 아니다(예를 들어, 올리고뉴클레오타이드가 아니다). 일부 실시형태에서, 소분자는 다당류가 아니다. 일부 실시형태에서, 소분자는 다당류를 포함하지 않는다(예를 들어, 당단백질, 프로테오글리칸, 당지질 등이 아니다). 일부 실시형태에서, 소분자는 지질이 아니다. 일부 실시형태에서, 소분자는 생물학적으로 활성이다. 일부 실시형태에서, 적합한 소분자는 화합물의 큰 라이브러리를 스크리닝하는 것과 같은 방법(문헌[Beck-Sickinger & Weber (2001) Combinational Strategies in Biology and Chemistry (John Wiley & Sons, Chichester, Sussex)]); 핵 자기 공명에 의한 구조-활성도 관계(문헌[Shuker et al. (1996) "Discovering high-affinity ligands for proteins: SAR by NMR." Science 274: 1531-1534]), 암호화된 자가-조립 화학 라이브러리(문헌[Melkko et al. (2004) "Encoded self-assembling chemical libraries." Nature Biotechnol. 22: 568-574]), DNA-주형 화학(문헌[Gartner et al. (2004) "DNA-templated organic synthesis and selection of a library of macrocycles." Science 305: 1601-1605]), 동적 조합 화학(문헌[Ramstrom & Lehn (2002) "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries." Nature Rev. Drug Discov. 1: 26-36]), 테더링(문헌[Arkin & Wells (2004) "Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream." Nature Rev. Drug Discov. 3: 301-317]); 및 스피드 스크린(문헌[Muckenschnabel et al. (2004) "SpeedScreen: label-free liquid chromatography-mass spectrometry-based high-throughput screening for the discovery of orphan protein ligands." Anal. Biochem. 324: 241-249]에 의해서 식별될 수 있다. 일부 실시형태에서, 소분자는 나노몰 범위의 표적에 대한 해리 상수를 가질 수 있다.
특이적 결합: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 결합이 일어나야 하는 환경에서 가능한 결합 파트너를 구별하는 능력을 지칭한다. 다른 잠재적인 표적이 존재할 때 하나의 특정 표적과 상호작용하는 표적-결합 모이어티는 그것이 상호작용하는 표적에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 표적-결합 모이어티와 이의 파트너 사이의 회합 정도를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 표적-결합 모이어티-파트너 복합체의 해리 정도를 검출하거나 결정함으로써 평가되고; 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 이의 파트너와 다른 엔티티 사이의 대안적인 상호작용을 경쟁하는 표적-결합 모이어티의 능력을 검출하거나 결정함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 일정 농도 범위에 걸쳐 이러한 검출 또는 결정을 수행함으로써 평가된다.
암의 병기: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암의 병기"는 암의 진행 수준에 대한 정성적 또는 정량적 평가를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 암의 병기를 결정하기 위해 사용된 기준은 암이 신체 내 위치하는 장소, 종양 크기, 암이 림프절로 퍼졌는지의 여부, 암이 신체의 하나 이상의 상이한 부분으로 퍼졌는지의 여부 등 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 암은 AJCC 병기결정 시스템을 사용하여 병기결정될 수 있다. AJCC 병기결정 시스템은 암 환자의 질환 진행 정도를 설명하기 위해 미국 암 합동 위원회(American Joint Committee on Cancer)에서 개발한 분류 시스템이며, 이것은 TNM 점수 시스템(종양 크기, 영향을 받는 림프절, 전이(Tumor size, Lymph Nodes affected, Metastases))을 부분적으로 활용한다. 일부 실시형태에서, 암은 부분적으로 TNM 점수 시스템을 포함하는 분류 시스템을 사용하여 병기결정될 수 있으며, 이에 따라 T는 일반적으로 원발성 종양으로 지칭되는 주요 종양의 크기 및 범위를 나타내고; N은 암을 갖는 주변 림프절의 수를 지칭하고; M은 암이 전이되었는지 여부를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 암은 0기(비정상 세포가 존재하지만 주변 조직으로 퍼지지 않았으며, 동소(in situ) 암종 또는 CIS라고도 함; CIS는 암이 아니지만 암이 될 수 있음), 1기 내지 III기(암이 존재; 숫자가 높을수록 종양이 더 크고 주변 조직으로 더 많이 퍼짐) 또는 IV기(암이 신체의 먼 부분으로 퍼짐)로서 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 병기에 할당될 수 있다: 동소(비정상 세포가 존재하지만 주변 조직으로 퍼지지 않음); 국소화됨(암은 퍼졌다는 징후 없이, 시작된 장소에 제한됨); 지역(암이 가까운 림프절, 조직 또는 장기로 퍼짐): 원거리(암이 신체의 먼 부분으로 퍼짐); 및 알 수 없음(병기를 파악하기 위한 정보가 충분하지 않음).
대상체 : 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 예를 들어 실험, 진단, 예방 및/또는 치료 목적을 위해 샘플이 얻어지는 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상체는 동물(예를 들어, 포유동물, 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 인간이 아닌 영장류, 애완 동물 등) 및 인간을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)를 앓고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 민감하다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 증상 또는 특징을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 상태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 비특이적 증상을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 임의의 증상 또는 특징을 나타내지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 민감성 또는 위험에 대한 특징적인 하나 이상의 특징을 갖는 사람이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 환자이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 진단 및/또는 요법이 투여되고/되거나 투여된 개체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 양성 종양 또는 종괴를 갖는 것으로 결정된 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 무증상 대상체이다. 이러한 증상이 있는 대상은 평균 집단 위험이 있거나 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 특정 암)에 대한 유전적 위험이 있는 대상체일 수 있다. 예를 들어, 이러한 무증상 대상체는 암의 가족력을 갖고/갖거나 암에 대해서 이전에 치료된 적이 있고/있거나 암 치료 후에 암 재발의 위험이 있고/있거나 암 치료 후에 관해 중이고/이거나 적어도 1종의 암 바이오마커의 존재에 대해서 이전에 또는 주기적으로 스크리닝된 적이 있는 대상체일 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 무증상 대상체는 암에 대해서 이전에 스크리닝된 적이 없고/없거나 암에 대해서 진단된 적이 없고/없거나 이전에 암 요법을 제공받은 적이 없는 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체는 하나 이상의 특징, 예컨대, 연령, 인종, 유전력, 병력, 개인 이력(예를 들어, 흡연, 알코올, 약물, 발암 물질, 식이, 비만, 신체 활동, 태양 노출, 방사선 노출, 바이러스와 같은 감염원에 대한 노출 및/또는 직업상 위험)에 기초하여 선택된 개체이다.
를 앓고 있는: 질환, 장애 및/또는 병태를 "앓고 있는" 개체는 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상으로 진단되었고/되었거나 이를 나타낸다.
표면 폴리펩타이드 또는 표면 단백질: 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 바와 같이, 용어 "표면 폴리펩타이드", "표면 단백질" 및 "막-결합된 폴리펩타이드"는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포, 세포외 소포 등)의 막의 표면 내에 그리고/또는 표면 상에 존재하는 하나 이상의 도메인 또는 영역을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표면 단백질은 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포, 세포외 소포 등)의 원형질막에 걸쳐 있고/있거나 이와 회합된 하나 이상의 도메인 또는 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 단백질은 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포, 세포외 소포 등)의 원형질막에 걸쳐 있고/있거나 이와 회합되고, 또한 세포내 및/또는 소포내 공간으로 도출된 하나 이상의 도메인 또는 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 단백질은 예를 들어, 하나 이상의 비-펩타이드 링키지를 통해서 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포, 세포외 소포 등)의 원형질막과 회합된 하나 이상의 도메인 또는 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 단백질은 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포, 세포외 소포 등)의 원형질막의 하나의 측면에 고정된 하나 이상의 도메인 또는 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 단백질은 세포외 소포와 회합되거나 세포외 소포 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 표면 폴리펩타이드 또는 막-결합된 폴리펩타이드는 대상체로부터의 세포외 소포(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암))을 앓고 있거나 이에 민감한 혈액 또는 혈액-유래 샘플로부터 얻어지거나 유래된 세포외 소포) 내에 존재하거나 이와 회합될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 세포외 소포 상의/내의 표면 폴리펩타이드 또는 표면 단백질의 적어도 일부의 존재의 검출은 대상체로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액 또는 혈액 유래 샘플)로부터의 세포외 소포의 분리 및/또는 단리를 용이하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 폴리펩타이드 또는 표면 단백질의 존재의 검출은 이러한 표면 폴리펩타이드 또는 표면 단백질의 소포내 부분(예를 들어, 소포내 에피토프)의 검출이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 폴리펩타이드 또는 표면 단백질의 존재의 검출은 이러한 표면 폴리펩타이드 또는 표면 단백질의 막-스패닝 부분의 검출이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 폴리펩타이드 또는 표면 단백질의 존재의 검출은 이러한 표면 폴리펩타이드 또는 표면 단백질의 소포외 부분의 검출이거나 이를 포함할 수 있다.
표면 단백질 바이오마커: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표면 단백질 바이오마커"는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포 또는 세포외 소포)의 표면 단백질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 상태(예를 들어, 존재, 수준 및/또는 활성)를 나타내는 마커를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표면 단백질은 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포 또는 세포외 소포)의 막의 표면 내에 또는 표면 상에 위치된 하나 이상의 도메인 또는 영역을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표면 단백질 바이오마커는 막의 내부 측면(소포내) 또는 외부 측면(소포외)에 존재하는 에피토프이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 단백질 바이오마커는 세포외 소포와 회합되거나 세포외 소포 내에 존재한다.
에 민감한: 질환, 장애 및/또는 병태에 "민감한" 개체는 일반 대중의 구성원보다 질환, 장애 및/또는 병태가 발생할 위험이 더 높은 사람이다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 민감한 개체는 질환, 장애 및/또는 병태로 진단되지 않았을 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 민감한 개체는 질환, 장애 및/또는 병태의 증상을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 민감한 개체는 질환, 장애 및/또는 병태의 증상을 나타내지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 민감한 개체는 질환, 장애 및/또는 병태가 발병할 것이다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 및/또는 병태에 민감한 개체는 질환, 장애 및/또는 병태가 발병하지 않을 것이다.
표적-결합 모이어티 : 일반적으로, 용어 "표적-결합 모이어티" 및 "결합 모이어티"는 관심대상 표적(예를 들어, 관심대상 분자 표적, 예컨대, 바이오마커 또는 에피토프)에 결합하는 임의의 엔티티 또는 모이어티를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 다수의 실시형태에서, 관심 표적-결합 모이어티는 특정 상호작용 맥락에서 다른 잠재적인 결합 파트너로부터 이의 표적을 구별한다는 점에서 이의 표적(예를 들어, 표적 바이오마커)과 특이적으로 결합하는 것이다. 일반적으로, 표적-결합 모이어티는 임의의 화학적 부류(예를 들어, 중합체, 비중합체, 소분자, 폴리펩타이드, 탄수화물, 지질, 핵산 등)의 엔티티 또는 모이어티이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 단일 화학 엔티티이다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 비공유 상호작용에 의해 관련 조건 하에 서로 회합된 2개 이상의 별개의 화학적 엔티티의 복합체이다. 예를 들어, 당업자는 일부 실시형태에서 표적-결합 모이어티가 "일반" 결합 모이어티(예를 들어, 바이오틴/아비딘/스트렙타비딘 및/또는 클래스-특이적 항체 중 하나) 및 일반 결합 모이어티의 파트너에 연결된 "특이적" 결합 모이어티(예를 들어, 특정 분자 표적을 갖는 항체 또는 압타머)를 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시형태에서, 이러한 접근법은 상이한 특이적 결합 모이어티와 일반 결합 모이어티 파트너의 링키지를 통해 다중 표적 결합 모이어티의 모듈식 조립을 허용할 수 있다.
표적 바이오마커 시그니처: 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "표적 바이오마커 시그니처"는 (예를 들어, 예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30개 또는 그 초과를 비롯한 적어도 2개 이상)의 바이오마커의 조합물을 지칭하고, 이 조합물은 관심대상의 특정 생물학적 사건 또는 상태와 상관관계가 있어서, 당업자는 이것이 그 사건 또는 상태의 "시그니처"인 것으로 적절하게 간주될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 몇 가지 예를 들자면, 일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처는 특정 질환 또는 질환 상태 및/또는 특정 질환, 장애 또는 병태가 발병, 발생 또는 재발할 가능성과 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처는 특정 질환 또는 치료 결과 또는 이의 가능성과 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처는 특정 암 및/또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형과 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처는 특정 암 또는 이의 하위유형 및/또는 이의 병기에 함께 특이적인 (예를 들어, 예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30개 또는 그 초과를 비롯한 적어도 2개 이상)의 바이오마커의 조합물을 포함하지만, 이러한 조합물에서 하나 이상의 바이오마커는 암에 특이적이지 않은 표적(예를 들어, 표면 단백질 바이오마커, 소포내 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 RNA)에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처를 구성하는 바이오마커의 조합물은 검출 프로브의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 쌍별 또는 직교 조합물에 의해서 검출될 수 있고, 여기서 검출 프로브의 각각의 쌍은 적어도 1종의 구별되는 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처를 구성하는 바이오마커의 조합물은 각각 서로에 혼성화하여 선형 복합체를 형성하는 검출 프로브의 세트에 의해서 검출될 수 있다(예를 들어, 도 5a 및 도 5b 및 도 10 에 도시된 것 참고). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처는 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 하위유형(즉, 암-특이적 표적)에 특이적인 적어도 1종의 바이오마커를 포함할 수 있고, 반드시 필요한 것은 아니거나 또는 암에 대해 완전히 특이적인 바이오마커를 추가로 포함할 수 있다(예를 들어, 이것은 일부 또는 모든 생물학적 엔티티, 예를 들어, 세포, 세포외 소포 등에서 또한 발견될 수 있는데, 이는 암성이 아니고/아니거나 관련 암을 갖지 않고/않거나 특정 병기를 갖지 않고 않거나 관심대상의 하위유형을 갖지 않음) 즉, 본 명세서를 읽는 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 표적 바이오마커 시그니처에 이용되는 바이오마커의 조합물이 함께 관심대상의 관련 표적 생물학적 엔티티(예를 들어, 관심대상 암 세포 또는 암 세포에 의해서 분비되는 세포외 소포)에 특이적인 복수의 바이오마커이거나 이를 포함하는 한(즉, 검출에 관심이 없는 다른 생물학적 엔티티로부터의 검출을 위해서, 관련 표적 생물학적 엔티티(예를 들어, 관심대상 암 세포 또는 암 세포에 의해서 분비되는 세포외 소포)를 충분히 구별하는 한), 이러한 바이오마커의 조합물이 본 개시내용의 특정 실시형태에 따라서 유용한 표적 바이오마커 시그니처이다.
치료제: 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 바와 같이, 구 "치료제" 또는 "요법"은 대상체 또는 환자에게 투여될 때 치료 효과를 갖고/갖거나 목적하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유도하는 작용제 또는 개입을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료제 또는 요법은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 완화, 개선, 경감, 저해, 예방, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발병률 감소에 사용될 수 있는 임의의 물질이다. 일부 실시형태에서, 치료제 또는 요법은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 완화, 경감, 저해, 제공, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발병률 감소를 위해 수행될 수 있는 의학적 개입(예를 들어, 수술, 방사선, 광요법)이다.
역치 수준(예를 들어, 컷오프) : 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "역치 수준"은 측정 결과, 예를 들어, 검정에서 달성된 측정 결과에 대한 정보를 획득하고/하거나 분류하기 위한 기준으로 사용되는 수준을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 역치 수준(예를 들어, 컷오프)은 집단의 2개의 하위세트(예를 들어, 정상 및/또는 비-암 대 관심대상 암) 사이의 구분선을 정의하는 검정에서 측정된 값을 의미한다. 따라서 역치 수준 이상인 값은 집단의 하나의 하위세트를 정의하고, 역치 수준보다 낮은 값은 집단의 다른 하위세트를 정의한다. 역치 수준은 하나 이상의 대조군 샘플에 기초하여 또는 대조군 샘플의 집단에 걸쳐 결정될 수 있다. 역치 수준은 관심대상 측정이 수행되기 전, 동시에 또는 후에 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 역치 수준은 값의 범위일 수 있다.
치료하다: 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 부분적 또는 완전한 완화, 개선, 경감, 저해, 예방, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발병률 감소에 사용되는 임의의 방법을 지칭한다. 치료는 질환, 장애 및/또는 병태의 징후를 나타내지 않는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 예를 들어, 질환, 장애 및/또는 병태와 연관된 병리학이 발병할 위험을 감소시킬 목적으로 질환, 장애 및/또는 병태의 초기 징후만을 나타내는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 질환, 장애 및/또는 병태의 후기 단계에서 대상체에게 투여될 수 있다.
표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 사양에 따라 또는 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 기술 및 절차는 일반적으로 당업계에 널리 공지된 종래의 방법에 따라 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다(예를 들어, 임의의 목적을 위해서 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 참고).
특정 실시형태의 상세한 설명
본 개시내용은 다른 것 중에서 관심대상 개체 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티) 상의 또는 내의 분자 또는 에피토프의 상호작용 및/또는 공동 국지화에 기반한 표적 엔티티 검출 접근법과 관련된 기술을 제공한다. 이러한 기술은 다양한 적용 및/또는 목적을 위해 다양한 유형의 샘플에서 관심 엔티티를 검출하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용은, 다른 것 중에서, 질환 또는 장애(예를 들어, 암)의 효과적인 스크리닝을 달성하기 위한 통찰력 및 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 초기 병기 암의 검출에 효과적이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 초기 병기 암에 대한 유전적 및 평균 위험이 있는 대상체를 스크리닝하기 위한 기술을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 (예를 들어, 충분히 높은 감도 및/또는 낮은 비율의 위양성 및/또는 위음성 결과로 인해서) 무증상 또는 증상이 있는 개체를 포함하거나 이것으로 이루어진 집단에 적용되는 경우에도 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 암 발병의 유전적인 위험이 없는 개체(예를 들어, 무증상 또는 증상이 있는 개체)를 포함하거나 이것으로 이루어진 집단에 적용되는 경우에 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 암 발병의 유전적인 위험을 갖는 개체(예를 들어, 무증상 또는 증상이 있는 개체)를 포함하거나 이것으로 이루어진 집단에 적용되는 경우에 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 암에 민감한 개체(예를 들어, 알려진 유전적, 환경적 또는 실험적 위험 등을 갖는 개체)를 포함하거나 이들로 이루어진 집단에 적용되는 경우 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은, 본 명세서에 제공된 본 개시내용을 읽는 당업자에게 자명할 바와 같이, 1종 이상의 조성물(예를 들어, 분자 엔티티 또는 복합체, 시스템, 세포, 수집물, 조합물, 키트 등) 및/또는 방법(예를 들어, 제조 방법, 사용 방법, 평가 방법 등)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어, 암 검출 및 진단에 대한 특정 종래의 접근법을 비롯한 특정 선행 기술보다 기술적인 이점을 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 예를 들어, 무세포 핵산, 순환 종양 세포, 단백질, 혈청 단백질 및/또는 세포외 소포의 벌크 분석을 기반으로 하는 많은 종래의 진단 검정이 시간 소모적이고/이거나 고비용이고/이거나 신뢰할 수 있고 포괄적인 진단 평가를 제공하기에 충분한 감도 및/또는 특이성이 부족할 수 있다. 구체적으로, 본 개시내용은, 다른 것 중에서, 단일 생물학적 엔티티의 분해능이 아닌, 벌크 샘플에 기반한 복수의 암-연관된 바이오마커 또는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포) 내의 단일 암-연관된 바이오마커의 검출이 전형적으로 생물학적 엔티티가 얻어진 대상체가 암을 앓고 있거나 암에 민감할 가능성이 있는지를 결정하는 데 있어서 충분한 특이성 및/또는 감도를 제공하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 개시내용은, 다른 것 중에서, 예를 들어, 검출을 위한 개체 엔티티가 표적(예를 들어, 분자 표적)의 조합물의 존재를 특징으로 하도록 구체적으로 요구함으로써, 이러한 문제를 해결하는 시스템, 조성물 및 방법을 포함하는 기술을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 이러한 개체 엔티티가 암 특이적인 분자 표적의 조합물(예를 들어, 세트)(즉, 관련 암의 "표적 바이오마커 시그니처")의 존재(예를 들어, 발현)를 특징으로 하는 반면, 표적화 조합물을 포함하지 않는 생물학적 엔티티는 검출 가능한 신호를 생성시키지 않을 것을 요구하는 기술을 교시한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다른 것 중에서, 무증상 개체의 스크리닝, 예를 들어, 발병된 증상(들) 이전 또는 달리는 발병된 증상(들)의 부재 하에서 정기적인 스크리닝이 이로울 수 있고, 심지어는 암의 효과적인 관리(예를 들어, 성공적인 치료)에 중요할 수 있다는 통찰력을 제공한다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 상이한 유형의 암에 대한(예를 들어, 복수의 상이한 암에 대한) 스크리닝(예를 들어, 정기적인 스크리닝)이 이로울 수 있고, 심지어는 암의 효과적인 관리(예를 들어, 성공적인 치료)에 중요할 수 있다는 통찰력을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 예를 들어, 일부 실시형태에서 무증상 개체(예를 들어, 암의 유전적인 위험이 없음)에서, 초기 병기 암을 비롯한 암을 검출하기 위해 구현될 수 있는 암 스크리닝 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 무증상 개체(예를 들어, 암의 유전적인 위험(들)을 갖거나 갖지 않음) 및/또는 다발성 암에 대한 정기적인 스크리닝을 달성하기 위해 구현된다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 증상이 있는 개체(예를 들어, 암의 유전적인 위험(들)을 갖거나 갖지 않음)에 대한 정기적인 스크리닝을 달성하기 위해 구현된다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 제공된 기술을 1회 및/또는 정기적인(예를 들어, 주기적인) 평가에 유용하게 적용할 수 있도록 적절한 감도 및/또는 특이성(예를 들어, 위양성 및/또는 위음성 결과의 비율)을 갖는 암(예를 들어, 특정 암 및/또는 복수의 암)의 하나 이상의 특징(예를 들어, 발병률, 진행, 요법에 대한 반응성, 재발 등)의 검출(예를 들어, 무증상 개체(들) 및/또는 집단(들)에서 조기 검출)을 달성한다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 개체의 주기적인 신체 검사와 함께 유용하다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 치료 요법(들)과 함께 유용하며; 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 이러한 치료 요법(들)의 하나 이상의 특징(예를 들어, 허용되는 파라미터에 따른 성공률)을 개선할 수 있다. 본 개시내용은, 예를 들어, 조성물(예를 들어, 시약, 키트, 성분 등), 및 1명 이상의 개체(예를 들어, 무증상 개체 및/또는 질환 또는 장애, 예컨대, 암을 앓고 있거나 이에 민감한 개체)의 시험(예를 들어, 정기적인 시험)을 포함하는 전략을 포함하여, 이들을 제공하는 방법 및/또는 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 이러한 시스템의 유용성을 정의하고, 이를 구현하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
I. 제공된 표적 엔티티 검출 시스템
본 개시내용은 샘플에서(예를 들어, 생물학적, 환경적 또는 다른 샘플에서), 일부 실시형태에서 단일 엔티티 수준에서, 적어도 2종 이상 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 관심대상 생물학적 또는 화학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포 또는 분석물)를 검출하기 위한 표적 엔티티 검출 시스템을 제공한다. 본 개시내용을 읽는 당업자는 제공된 표적 엔티티 검출 시스템이 광범위한 응용 및/또는 목적에 유용하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 의학적 적용 및/또는 목적에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 질환 또는 병태(예를 들어, 암)에 대해 개체(예를 들어, 무증상 개체)를 스크리닝(예를 들어, 정기적으로 스크리닝)하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 상이한 유형의 암(예를 들어, 복수의 상이한 암)에 대해 개체(예를 들어, 무증상 개체)를 스크리닝(예를 들어, 정기적으로 스크리닝)하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 (예를 들어, 충분히 높은 감도 및/또는 낮은 비율의 위양성 및/또는 위음성 결과로 인해서) 무증상 개체를 포함하거나 이것으로 이루어진 집단에 적용되는 경우에도 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 표적 개체 검출 시스템은 질환 치료와 함께 동반 진단으로서 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 엔티티 검출 시스템은 각각 특정 표적(예를 들어, 분자 표적 또는 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 대한 복수의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 각각 특정 표적(예를 들어, 분자 표적 또는 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 대해서 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50종 또 그 초과의 검출 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 각각 특정 표적(예를 들어, 분자 표적 또는 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 대한 2 내지 50개의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 각각 특정 표적(예를 들어, 분자 표적 또는 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 대한 2 내지 30개의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 각각 특정 표적(예를 들어, 분자 표적 또는 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 대한 2 내지 25개의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 각각 특정 표적(예를 들어, 분자 표적 또는 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 대한 5 내지 30개의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 시스템은 각각 특정 표적(예를 들어, 분자 표적 또는 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 대한 5 내지 25개의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세트 내의 이러한 검출 프로브 중 적어도 2개는 동일한 표적(예를 들어, 동일한 분자 표적 또는 동일한 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세트 내의 이러한 검출 프로브 중 적어도 2개는 동일한 표적(예를 들어, 동일한 분자 표적 또는 동일한 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)의 동일한 에피토프에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세트 내의 이러한 검출 프로브 중 적어도 2개는 동일한 표적(예를 들어, 동일한 분자 표적 또는 동일한 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)의 상이한 에피토프에 지향될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템에서 사용하기에 적절한 검출 프로브는 단일 질환 또는 병태, 예를 들어, 특정 암의 검출을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템에서 사용하기에 적절한 검출 프로브는 적어도 2종 이상의 질환 또는 병태, 예를 들어, 상이한 유형의 암(예를 들어, 피부암 대 난소암), 또는 특정 암의 상이한 하위유형; 및/또는 특정 암의 상이한 병기의 검출을 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템에서 사용하기에 적절한 검출 프로브는 특정 하위유형의 특정 암의 검출을 허용할 수 있다. 단지 예로서, 난소암 검출을 위한 일부 실시형태에서, 표적 엔티티 검출 시스템에 사용하기에 적절한 검출 프로브는 예를 들어, 비제한적으로 고 등급 장액성 난소 암, 자궁내막양 난소암, 투명 세포 난소암, 저 등급 장액성 난소암, 및/또는 점액성 난소암을 비롯한 난소암의 하나 이상의 하위유형의 검출을 허용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템에서 사용하기에 적절한 검출 프로브는 예를 들어, I기, II기, III기 및/또는 IVR기를 비롯한 특정 하위유형의 특정 암의 검출을 허용할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템에서 사용하기에 적절한 검출 프로브는 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10 또는 그 초과)의 검출 프로브의 세트를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 세트는 상이한 질환 또는 상이한 유형의 질환 또는 병태의 검출에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템에서 사용하기에 적절한 검출 프로브는 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10 또는 그 초과)의 검출 프로브의 세트를 포함할 수 있고, 여기서 일부 실시형태에서 각각의 세트는 암의 상이한 유형의 검출에 관한 것이거나, 또는 일부 실시형태에서, 각각의 세트는 동일한 암의 다양한 하위유형 및/또는 병기의 검출에 관한 것이다.
검출 프로브
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공되고/되거나 이용되는 바와 같은 검출 프로브는 표적-결합 모이어티 및 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 각각의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함할 수 있다.
A. 표적-결합 모이어티
올리고뉴클레오타이드 도메인에 커플링되는 표적-결합 모이어티는 표적(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 분자 표적 또는 바이오마커)에 특이적으로 결합하는 엔티티 또는 작용제이다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 표적(예를 들어, 분자 표적)에 대한 결합 친화도(예를 들어, 해리 상수로 측정 시)가 적어도 약 10-4M, 적어도 약 10-5M, 적어도 약 10-6M, 적어도 약 10-7M, 적어도 약 10-8M, 적어도 약 10-9M 또는 그 미만일 수 있다. 당업자는 일부 경우에 결합 친화도(예를 들어, 해리 상수에 의해 측정됨)가 두 분자 간의 비공유 분자간 상호작용, 예컨대, 수소 결합, 정전기 상호작용, 소수성 및 반데르발스 힘에 의해 영향을 받을 수 있음을 이해할 것이다. 대안적으로 또는 추가로, 리간드와 이의 표적 분자 사이의 결합 친화도는 다른 분자의 존재에 의해 영향을 받을 수 있다. 당업자는 본 개시내용에 따라 결합 친화도 및/또는 해리 상수를 측정하기 위한 다양한 기술, 예를 들어, 비제한적으로 ELISA, 겔-이동 검정, 풀-다운 검정, 평형 투석, 분석용 초원심분리, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 생물층 간섭계, 격자 결합 간섭계 및 분광 검정에 친숙할 것이다.
일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 예를 들어, 탄수화물, 핵산, 지질, 금속, 폴리펩타이드, 소분자 등 및/또는 이들의 조합물과 같은 임의의 화학적 부류의 작용제이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 항체 작용제 및/또는 압타머이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 항체 작용제, 예를 들어, 표적 또는 이의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 작용제, 예를 들어 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커 또는 이의 에피토프이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 압타머, 예를 들어, 표적 또는 이의 에피토프에 특이적으로 결합하는 압타머, 예를 들어 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커 또는 이의 에피토프이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적은 암과 연관된 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 이러한 실시형태에서, 암-연관된 표적은 1종 초과의 암(즉, 적어도 2종 이상 암)과 연관된 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-연관된 표적은 암과 전형적으로 연관된 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-연관된 표적은 특정 조직의 암과 연관된 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다 일부 실시형태에서, 암-연관된 표적은 특정 암에 특이적인 표적일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포 및/또는 세포외 소포를 포함하지만 이들로 제한되지 않음)에 존재하는 표적을 인식하고 이에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 종양-연관된 항원 또는 이의 에피토프를 인식할 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양-연관된 항원은 암, 예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암(예를 들어, 교모세포종 포함), 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암과 연관된 항원일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 피부암(예를 들어, 흑색종)과 연관된 종양 항원을 인식하고 이에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암)과 연관된 종양 항원을 인식할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 유방암과 연관된 종양 항원을 인식할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 난소암(예를 들어, 고 등급 장액성 난소암과 같은 상피 기원의 난소암)과 연관된 종양 항원을 인식할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 세포내 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 소포내 표적, 예를 들어, 소포내 단백질 또는 RNA(예를 들어, mRNA)에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 표면 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 세포 표면 상에/내에 존재하는 표면 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 세포외 소포 상에/내 존재하는 표면 표적, 예를 들어 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)와 연관된 세포외 소포 상에/내에 존재하는 막-결합된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 특정 병태 또는 질환(예를 들어, 암)에 대한 바이오마커에 대해 지향되며, 이 바이오마커는 예를 들어, 집단 또는 라이브러리(예를 들어, 수 십, 수 백, 수 천, 수 만, 수 십 만, 또는 그 초과)의 환자 생검 및/또는 이러한 바이오마커(예를 들어, 예측 바이오마커)를 식별하기 위한 환자 데이터를 분석함으로써 결정되거나 결정되었다.
일부 실시형태에서, 관련 바이오마커는 예를 들어, 데이터 분석을 통해 식별 및/또는 특징규명된 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다양한 데이터의 세트(예를 들어, 일부 실시형태에서 벌크 RNA 서열결정, 단일 세포 RNA(scRNA) 서열결정, 질량 분석, 조직학, 번역후 변형 데이터, 시험관 내 및 /또는 생체내 실험 데이터 중 하나 이상을 포함함)는 기계 학습 및/또는 컴퓨터 모델링을 통해 분석되어 질환 또는 병태(예를 들어, 암)에 매우 특이적인 바이오마커(예를 들어, 예측 마커)를 식별할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 조직-특이적 표적, 예를 들어, 뇌, 유방, 결장, 난소 및/또는 여성 생식기계와 연관된 다른 조직, 췌장, 전립선 및/또는 남성 생식기계와 연관된 다른 조직, 간, 폐 및 피부와 연관된 표적에 지향된다. 일부 실시형태에서, 이러한 조직-특이적 표적은 정상적인 건강한 조직 및/또는 병이 걸린 조직, 예컨대, 종양과 연관될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 대상체의 정상적인 건강한 상태와 특이적으로 연관된 표적에 지향된다.
일부 실시형태에서, 복수의 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)에서 사용되는 개체 표적-결합 모이어티는 상이한 표적에 지향된다. 일부 실시형태에서, 이러한 상이한 표적은 상이한 마커 단백질 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 상이한 표적은 동일한 마커 단백질 또는 폴리펩타이드의 상이한 에피토프를 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)에서 이용되는 2개 이상의 개체 표적 결합 모이어티는 동일한 표적에 지향될 수 있다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 검출을 위해서 복수의 검출 프로브에서 이용되는 개체 표적-결합 모이어티는 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 특정 암)를 위한 표적 바이오마커 시그니처의 상이한 표적 바이오마커에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 검출을 위해서 복수의 검출 프로브에서 이용되는 개체 표적-결합 모이어티는 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 특정 암)를 위한 표적 바이오마커 시그니처의 동일한 표적 바이오마커에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 표적 결합 모이어티는 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 특정 암)을 위한 이러한 표적 바이오마커 시그니처의 동일한 표적 바이오마커의 동일하거나 상이한 에피토프에 지향된다.
B. 올리고뉴클레오타이드 도메인
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따라서 사용하기 위한(예를 들어, 표적-결합 모이어티에 커플링될 수 있는) 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나 또는 두 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 도메인이 각각의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함하는 일부 실시형태에서, 단일-가닥 오버행은 이중-가닥 부분의 상이한 가닥으로부터 연장된다. 올리고뉴클레오타이드 도메인이 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함하는 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 다른 말단은 뭉툭한 단부일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하는 일부 실시형태에서, 이중-가닥 부분의 적어도 하나의 가닥은 증폭을 위한 프라이머 부위를 포함한다. 이러한 일부 실시형태에서, 이러한 프라이머 부위는 이중-가닥 부분의 단부 부분에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 왓슨 크릭 유형 또는 유사한 염기쌍 상호작용에 참여할 수 있는 합성 뉴클레오타이드 잔기 및 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 DNA이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 펩타이드 핵산(PNA)이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 예를 들어, 검출될 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예를 들어, 세포외 소포)의 물리적 특징 및/또는 검출될 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예를 들어 세포외 소포)에서 분자 표적의 선택 및 국지화에 의해 적어도 부분적으로 결정되는 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은, 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브가 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)에 결합하는 경우, 제1 단일-가닥 오버행과 제2 단일 가닥 오버행이 단일-가닥 오버행 간의 상호작용(예를 들어, 혼성화)을 허용하기에 충분히 가깝게 근접하도록 하는 길이를 갖도록 구성된다. 예를 들어, 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)가 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)인 경우, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 각각 독립적으로 각각의 단일-가닥 오버행이 상응하는 검출 프로브가 동일한 세포외 소포에 결합되는 경우 서로와 어닐링하거나 상호작용하기에 충분히 가깝게 근접하도록 하는 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)를 검출하는 데 사용하기 위한 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 각각 독립적으로 약 20㎚ 내지 약 200㎚, 약 40㎚ 내지 약 500㎚, 약 40㎚ 내지 약 300㎚ 또는 약 50㎚ 내지 약 150㎚의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)를 검출하는 데 사용하기 위한 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 각각 독립적으로 약 20㎚ 내지 약 200㎚의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 세트 내의 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 길이는 그들이 동일한 관심대상 엔티티에 동시에 결합하는 경우 서로를 찾을 확률을 증가시키고/거나 최대화하도록 각각 독립적으로 달라질 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 30개 내지 최대 약 1000개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 30 내지 약 500개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 250개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 200개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 150 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 150개 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 125개 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 약 50 내지 약 90개 뉴클레오타이드, 약 50 내지 약 80개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 예를 들어, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 250개, 적어도 500개, 적어도 750개, 적어도 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함하는, 적어도 30개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 예를 들어, 900개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 70개 이하, 60개 이하, 50개 이하, 40개 이하 또는 그보다 더 적은 뉴클레오타이드를 포함하는, 1000개 이하 또는 그보다 더 적은 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 50개 내지 최대 약 90개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 30개 내지 최대 약 50개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 10개 내지 최대 약 30개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 20㎚ 내지 약 500㎚의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 20㎚ 내지 약 400㎚, 약 30㎚ 내지 약 200㎚, 약 50㎚ 내지 약 100㎚, 약 30㎚ 내지 약 70㎚ 또는 약 40㎚ 내지 약 60㎚의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 예를 들어, 적어도 약 30㎚, 적어도 약 40㎚, 적어도 약 50㎚, 적어도 약 60㎚, 적어도 약 70㎚, 적어도 약 80㎚, 적어도 약 90㎚, 적어도 약 100㎚, 적어도 약 200㎚, 적어도 약 300㎚, 적어도 약 400㎚ 또는 그 초과를 포함하는, 적어도 약 20㎚ 이상의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 예를 들어, 900㎚ 이하, 800㎚ 이하, 700㎚ 이하, 600㎚ 이하, 500㎚ 이하, 400㎚ 이하, 300㎚ 이하, 200㎚ 이하, 100㎚ 이하 또는 그보다 더 짧은 길이를 포함하는, 1000㎚ 이하 또는 그보다 더 짧은 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 약 30개 내지 최대 약 1000개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 약 30 내지 약 500개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 250개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 200개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 150 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 150개 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 125개 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 약 50 내지 약 90개 뉴클레오타이드, 약 50 내지 약 80개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 예를 들어, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100개, 적어도 250개, 적어도 500개, 적어도 750개, 적어도 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함하는, 적어도 30개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 예를 들어, 900개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하, 100개 이하, 90개 이하, 80개 이하, 70개 이하, 60개 이하, 50개 이하, 40개 이하 또는 그보다 더 적은 뉴클레오타이드를 포함하는, 1000개 이하 또는 그보다 더 적은 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 약 50개 내지 최대 약 90개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 약 30개 내지 최대 약 50개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 약 10개 내지 최대 약 30개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 약 20㎚ 내지 약 500㎚의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 약 20㎚ 내지 약 400㎚, 약 30㎚ 내지 약 200㎚, 약 50㎚ 내지 약 100㎚, 약 30㎚ 내지 약 70㎚ 또는 약 40㎚ 내지 약 60㎚의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 예를 들어, 적어도 약 30㎚, 적어도 약 40㎚, 적어도 약 50㎚, 적어도 약 60㎚, 적어도 약 70㎚, 적어도 약 80㎚, 적어도 약 90㎚, 적어도 약 100㎚, 적어도 약 200㎚, 적어도 약 300㎚, 적어도 약 400㎚ 또는 그 초과를 포함하는, 적어도 약 20㎚ 이상의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 예를 들어, 900㎚ 이하, 800㎚ 이하, 700㎚ 이하, 600㎚ 이하, 500㎚ 이하, 400㎚ 이하, 300㎚ 이하, 200㎚ 이하, 100㎚ 이하 또는 그보다 더 짧은 길이를 포함하는, 1000㎚ 이하 또는 그보다 더 짧은 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 검출 프로브가 각각의 상보적 단일-가닥 오버행의 혼성화를 통해 서로 연결되는 경우(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음), 각각의 올리고뉴클레오타이드 도메인(존재하는 경우 표적-결합 모이어티를 올리고뉴클레오타이드 도메인에 연결하는 링커 포함)의 조합된 길이는 각각의 표적 결합 엔티티가 관심대상 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)의 전체 특징적인 길이(예를 들어, 직경)에 실질적으로 걸쳐있는 것을 허용하기에 충분히 길다. 예를 들어, 세포외 소포가 관심대상 엔티티인 일부 실시형태에서, 검출 프로브가 서로에 완전히 연결되는 경우, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인(존재하는 경우 표적-결합 모이어티를 올리고뉴클레오타이드 도메인에 연결하는 링커 포함)의 조합된 길이는 대략 50 내지 200㎚일 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 프라이머에 대한 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머에 대한 이러한 결합 부위는 미스-프라이밍 또는 프라이머 이량체의 가능성을 줄이거나 최소화하도록 설계된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 특징은 검출의 하한을 감소시킬 수 있고, 따라서 본 명세서에 제공된 시스템의 감도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 프라이머의 결합 부위는 또 다른 프라이머 결합 부위와 유사한 어닐링 온도를 갖도록 설계된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 전형적으로 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 게놈 및/또는 유전자 전사체(예를 들어, 게놈 DNA 및/또는 RNA, 예컨대, 유전자의 mRNA)와 회합된 핵산 서열(예를 DNA 및/또는 RNA 서열)과의 중첩을 감소 또는 최소화하도록 설계된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 특징은 검출 동안 샘플에 (예를 들어, 오염 물질로서) 존재할 수 있는 대상체의 임의의 게놈 DNA 및/또는 mRNA 전사체의 간섭을 감소시키거나 최소화할 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중-가닥 부분은 자가-이량체, 동종이량체 또는 이종이량체의 형성을 감소시키거나 최소화하도록 설계된 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 약 2 내지 약 20개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 약 2 내지 약 15개 뉴클레오타이드, 약 2 내지 약 10개 뉴클레오타이드, 약 3 내지 약 20개 뉴클레오타이드, 약 3 내지 약 15개 뉴클레오타이드, 약 3 내지 약 10개 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 오버행은 적어도 1 내지 5개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 20개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드를 포함하는, 적어도 2개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 예를 들어, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하 또는 그보다 더 적은 뉴클레오타이드를 포함하는, 20개 이하 또는 그보다 적은 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 약 1㎚ 내지 약 10㎚의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 약 1㎚ 내지 약 5㎚의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 예를 들어, 적어도 약 1㎚, 적어도 약 1.5㎚, 적어도 약 2㎚, 적어도 약 3㎚, 적어도 약 4㎚, 적어도 약 5㎚, 적어도 약 6㎚, 적어도 약 7㎚, 적어도 약 8㎚, 적어도 약 9㎚, 적어도 약 10㎚ 또는 그 초과를 포함하는, 적어도 약 0.5㎚ 이상의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 예를 들어, 9㎚ 이하, 8㎚ 이하, 7㎚ 이하, 6㎚ 이하, 5㎚ 이하, 4㎚ 이하, 3㎚ 이하, 2㎚ 이하, 1㎚ 이하 또는 그 보다 짧은 길이를 포함하는, 10㎚ 이하 또는 그보다 더 짧은 길이를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 도메인의 단일-가닥 오버행은 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브를 포함하는 이중-가닥 복합체가 상보적 단일-가닥 오버행의 혼성화를 통해 형성될 수 있도록 제2 검출 프로브의 단일-가닥 오버행의 적어도 일부와 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 상보적 단일-가닥 오버행의 뉴클레오타이드 서열은 적절한 핵산 리가제의 존재 하에 최적의 결찰 효율을 위해 선택된다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 오버행은 관심대상의 특이적 핵산 리가제(예를 들어, DNA 리가제, 예컨대, T4 또는 T7 리가제)에 의한 효율적인 결찰을 위해 우선적으로 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 예를 들어, 이러한 단일-가닥 오버행은 예를 들어, 문헌[Song et al., "Enzyme-guided DNA sewing architecture" Scientific Reports 5: 17722 (2015)]에 기재된 바와 같은 GAGT의 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
2개의 검출 프로브가 각각의 상보적 단일-가닥 오버행의 혼성화를 통해 함께 커플링되는 경우, 혼성화된 단일-가닥 오버행을 포함하는 이들 각각의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 일부 실시형태에서 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)의 특징적인 길이의 약 90% 내지 110% 또는 약 95% 내지 105%의 조합된 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티가 엑소좀인 경우, 조합된 길이는 약 50㎚ 내지 약 200㎚ 또는 약 75㎚ 내지 약 150㎚, 또는 약 80㎚ 내지 약 120㎚일 수 있다.
C. 표적-결합 모이어티와 올리고뉴클레오타이드 도메인 간의 커플링
올리고뉴클레오타이드 도메인 및 표적-결합 모이어티는 공유 링키지에 의해서 그리고/또는 비-공유 회합(예를 들어, 단백질-단백질 상호작용, 예컨대, 스트렙타비딘-바이오틴 상호작용 및/또는 이온 상호작용)에 의해 검출 프로브에서 함께 커플링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 사용하기에 적절한 검출 프로브는 표적-결합 모이어티 및 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하는 접합체 분자이고, 여기서 2개의 성분은 전형적으로 예를 들어, 결합을 통해 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 간접적으로 서로 공유 커플링된다. 일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티는 공유 링키지에 의해(예를 들어, 결합을 통해 직접적으로 또는 하나 이상의 링커를 통해 간접적으로) 그리고/또는 비-공유 회합(예를 들어, 단백질-단백질 상호작용, 예컨대, 스트렙타비딘-바이오틴 상호작용 및/또는 이온 상호작용)에 의해서 올리고뉴클레오타이드 도메인의 2개의 가닥 중 하나에 커플링된다.
링커가 사용되는 경우, 일부 실시형태에서, 링커는 선택된 링커를 통해 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 가닥 또는 두 가닥 다에 대한 표적-결합 모이어티의 공유 부착을 제공하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 링커는, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 가닥 또는 두 가닥 다에 대한 표적-결합 모이어티의 생성된 공유 부착이 이의 표적에 대한 표적-결합 모이어티의 목적하는 결합 친화도를 유지하도록 선택된다. 일부 실시형태에서, 링커는 이의 표적에 대한 표적-결합 모이어티의 결합 특이성을 향상시키도록 선택된다. 관심대상 링커 및/또는 접합 방법은 표적-결합 모이어티, 예를 들어, 이의 크기 및/또는 전하에 따라 상당히 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 생물학적으로 불활성이다.
표적-결합 모이어티를 올리고뉴클레오타이드에 커플링시키기 위한 다양한 링커 및/또는 방법이 당업자에게 공지되어 있고, 본 개시내용에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커는 표적-결합 모이어티에 공유 부착할 수 있는 반응성 작용기와 함께 양쪽 단부에 스페이서기를 포함할 수 있다. 링커에 사용될 수 있는 스페이서기의 예는 지방족 및 불포화 탄화수소 쇄(예를 들어, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20 또는 그 초과 포함), 헤테로원자, 예컨대, 산소(예를 들어, 에터, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜) 또는 질소(폴리아민)를 함유하는 스페이서, 펩타이드, 탄수화물, 헤테로원자를 함유할 수 있는 환식 또는 비환식 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 공유 부착을 용이하게 하기 위한 반응성 작용기의 비제한적 예는 친핵성 작용기(예를 들어, 아민, 알코올, 티올, 하이드라지드), 친전자성 작용기(예를 들어, 알데하이드, 에스터, 바이닐 케톤, 에폭사이드, 아이소사이아네이트, 말레이미드), 고리화 첨가 반응, 이황화 결합 또는 금속에 대한 결합이 가능할 수 있는 작용기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 예시적인 반응성 작용기는 1차 및 2차 아민, 하이드록삼산, N-하이드록시석신이미딜(NHS) 에스터, 다이벤조사이클로옥틴(DBCO)-NHS 에스터, 아지도-NHS 에스터, 아지도아세트산 NHS 에스터, 프로파길-NHS 에스터, 트랜스-사이클로옥텐-NHS 에스터, N-하이드록시석신이미딜 카보네이트, 옥시카보닐이미다졸, 나이트로페닐에스터, 트라이플루오로에틸 에스터, 글리시딜 에터, 바이닐설폰, 말레이미드, 아지도벤조일 하이드라자이드, N-[4-(p-아지도살리실아미노)부틸]-3'-[2'-피리딜다이티오]프로피온아마이드), 비스-설포석신이미딜 수버레이트, 다이메틸아디프이미데이터, 다이석신이미딜타트레이트, N-말레이미도부티릴옥시석신이미드 에스터, N-하이드록시 설포석신이미딜-4-아지도벤조에이트, N-석신이미딜 [4-아지도페닐]-1,3'-다이티오프로피온에이트, N-석신이미딜 [4-아이오도아세틸]아미노벤조에이트, 글루타르알데하이드 및 석신이미딜 4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카르복실레이트, 3-(2-피리딜다이티오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터(SPDP), 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실산 N-하이드록시석신이미드 에스터(SMCC) 및 이들의 임의의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 결합 항체 작용제)는 N-하이드로시석신이미드(NHS) 에스터 화학을 사용하여 올리고뉴클레오타이드 도메인 중 하나의 가닥 또는 두 가닥 다에 커플링되거나 접합된다. NHS 에스터는 자유 1차 아민과 반응하여, 안정적인 공유 결합을 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 1차 아미노기는 스페이서기, 예를 들어, 비제한적으로, 지방족 및 불포화 탄화수소쇄(예를 들어, C6 또는 C12 스페이서기)와 함께 말단 단부에 위치될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 결합 항체 작용제)는 당업계에 예를 들어, 접합된 표적-결합 모이어티(예를 들어, 접합된 표적 결합 항체 작용제)의 결합 특이성을 향상시키기 위해서, 공지된 부위-특이적 접합 방법을 사용하여, 올리고뉴클레오타이드 도메인 중 하나의 가닥 또는 두 가닥 다에 커플링되거나 접합될 수 있다. 부위-특이적 접합 방법의 예는 이황화 결합, C-말단, 탄수화물 잔기 또는 글리칸 및/또는 비자연 아미노산 표지를 통한 커플링 또는 접합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 표적-결합 모이어티가 항체 작용제 또는 펩타이드 압타머이거나 이를 포함하는 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적-결합 모이어티에 존재하는 적어도 하나 이상의 유리 아민 기를 통해 표적-결합 모이어티에 커플링되거나 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적-결합 모이어티에 존재하는 적어도 하나 이상의 반응성 티올기를 통해 항체 작용제 또는 펩타이드 압타머이거나 이를 포함하는 표적-결합 모이어티에 커플링되거나 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 표적-결합 모이어티에 존재하는 적어도 하나 이상의 탄수화물 잔기를 통해 항체 작용제 또는 펩타이드 압타머이거나 이를 포함하는 표적-결합 모이어티에 커플링되거나 접합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수의 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10개 또는 그 초과)가 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 결합 항체 작용제)에 커플링되거나 접합될 수 있다.
예시적인 듀플렉스 표적 엔티티 검출 시스템
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 의해서 제공된 바와 같은 (그리고 예를 들어, 적어도 1종 이상의 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 관심대상 엔티티)를 단일 엔티티 수준에서 검출하기 위해서 유용한) 표적 엔티티 검출 시스템은 제1 표적(예를 들어, 제1 표적 바이오마커)을 위한 제1 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)의 제1 집단 및 제2 표적(예를 들어, 제2 표적 바이오마커)을 위한 제2 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)의 제2 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브가 각각 지향되는 제1 표적(예를 들어, 제1 표적 바이오마커) 및 제2 표적(예를 들어, 제2 표적 바이오마커)은 동일한 표적(예를 들어, 동일한 표적 바이오마커)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브가 각각 지향되는 제1 표적(예를 들어, 제1 표적 바이오마커) 및 제2 표적(예를 들어, 제2 표적 바이오마커)은 상이한 표적(예를 들어, 상이한 표적 바이오마커)이다.
도 2a 내지 도 2b 는 단일 엔티티 수준에서, (i) 동일한 표적의 2개의 분자가 가깝게 근접하게 발견되도록 발현 수준이 충분히 높은 적어도 1종의 표적(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암을 위한 표적 바이오마커 시그니처의 표적 바이오마커) 또는 (ii) 적어도 2종 이상 구별되는 표적(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암을 위한 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 검출하기 위한 예시적인 듀플렉스 표적 엔티티 검출 시스템을 도시한다. 제1 검출 프로브는 제1 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 1, 예컨대, 표적 암 마커 1에 지향됨) 및 상기 제1 표적-결합 모이어티에 커플링된 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제1 이중-가닥 부분 및 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제1 단일-가닥 오버행을 포함한다. 도 2a 에 도시된 바와 같이, 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 더 긴 가닥(가닥 3)과 더 짧은 가닥(가닥 1)의 혼성화로부터 초래되어, 하나의 단부에 이중-가닥 부분 및 단일-가닥 오버행을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 1, 예컨대, 표적 암 마커 1에 지향됨)는 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 가닥 1)의 가닥의 5' 단부 또는 3' 단부에 커플링(예를 들어, 공유 커플링)된다. 일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티에 커플링된 가닥의 5' 단부 또는 3' 단부는 링커(예를 들어, 스페이서를 갖거나 갖지 않는 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 또 다른 가닥(예를 들어, 가닥 3)의 5' 단부는 유리 포스페이트기를 갖는다.
도 2a 에 도시된 실시형태에서, 제2 검출 프로브는 제2 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 2, 예컨대, 표적 암 마커 2에 지향됨) 및 상기 제2 표적-결합 모이어티에 커플링된 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제2 이중-가닥 부분 및 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제2 단일-가닥 오버행을 포함한다. 도 2a 에 도시된 바와 같이, 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 더 긴 가닥(가닥 4)과 더 짧은 가닥(가닥 2)의 혼성화로부터 초래되어, 하나의 단부에 이중-가닥 부분 및 단일-가닥 오버행을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 2, 예컨대, 표적 암 마커 2에 지향됨)는 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 가닥 2)의 가닥의 5' 단부에 커플링(예를 들어, 공유 커플링)된다. 일부 실시형태에서, 제2 표적-결합 모이어티에 커플링된 가닥의 5' 단부는 링커(예를 들어, 스페이서를 갖거나 갖지 않는 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 또 다른 가닥(예를 들어, 가닥 4)의 5' 단부는 유리 포스페이트기를 갖는다.
제1 단일-가닥 오버행 및 제2 단일-가닥 오버행의 적어도 일부는, 이들이 충분히 가깝게 근접하는 경우, 예를 들어, 제1 검출 프로브와 제2 검출 프로브가 동일한 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)에 동시에 결합하는 경우, 이들이 혼성화하여 이중-가닥 복합체를 형성할 수 있도록 서로와 상보성이다. 일부 실시형태에서, 제1 단일-가닥 오버행 및 제2 단일-가닥 오버행은, 이들이 혼성화하여 이중-가닥 복합체를 형성하는 경우, 이들 각각의 올리고뉴클레오타이드 도메인 사이에 갭(결찰될 닉(nick)이 아님)이 존재하지 않고, 각각의 각자의 표적-결합 모이어티가 이중-가닥 복합체의 반대 단부에 위치되도록, 동일한 길이를 갖는다. 예를 들어, 도 2b 에 도시된 실시형태에서, 결찰이 일어나기 전에 이중-가닥 복합체가 형성되는데, 여기서 이중-가닥 복합체는 이들 각각의 단일-가닥 오버행(예를 들어, 4개 뉴클레오타이드 길이를 가짐)의 직접 혼성화를 통해서 서로에 커플링된 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브를 포함하며, 각각의 각자의 표적-결합 모이어티(예를 들어, 각각 표적 1 및 표적 2에 지향됨)는 이중-가닥 복합체의 반대 단부에 존재한다. 이러한 실시형태, 이중-가닥 복합체(각각의 올리고뉴클레오타이드 도메인 사이에 닉을 함유함)의 두 가닥은 예를 들어, 증폭 및 검출을 위해서 결찰 가능하다. 도 2b 가 제1 검출 프로브와 제2 검출 프로브의 혼성화를 도시하고, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)에 대한 이러한 검출 프로브의 결합을 나타내지 않지만, 일부 실시형태에서, 이중-가닥 복합체(예를 들어, 결찰이 일어나기 전에)는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 포함할 수 있고, 여기서 제1 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 1, 예컨대, 표적 암 마커 1에 지향됨) 및 제2 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 2, 예컨대, 표적 암 마커 2에 지향됨)는 관심대상 엔티티에 동시에 결합된다.
일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티는 정상적인 건강한 세포 및/또는 조직(예를 들어, 이것으로부터 암 세포가 유래됨)과 특이적으로 연관된 바이오마커에 지향될 수 있고, 제2 표적-결합 모이어티는 하나 초과의 암과 연관된 (그러나 정상적인 건강한 세포 및/또는 조직에 존재하지 않는) 바이오마커에 지향될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제2 표적-결합 모이어티는 (조직 유형에 관계없이) 암에 대한 일반적인 바이오마커에 지향될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티는 조직-특이적 암 바이오마커(예를 들어, 특정 조직의 암과 전형적으로 연관된 바이오마커)에 지향될 수 있고, 제2 표적-결합 모이어티는 암의 동일한 조직과 특이적으로 연관되지만 정상적인 건강한 상태에 존재하는 바이오마커에 지향될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티 및 제2 표적-결합 모이어티는 각각 구별되는 암-연관된 바이오마커에 지향될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티 및 제2 표적-결합 모이어티는 상이한 암(예를 들어, 동일한 조직 또는 상이한 조직과 연관된 암)과 연관된 바이오마커에 각각 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티 및 제2 표적-결합 모이어티는 동일한 암과 연관된 바이오마커에 각각 지향될 수 있다.
질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 검출을 위한 듀플렉스 표적 엔티티 검출 시스템의 일부 실시형태에서, 제1 검출 프로브의 제1 표적-결합 모이어티는 제1 표적 표면 단백질 바이오마커에 지향될 수 있는 반면, 제2 검출 프로브의 제2 표적-결합 모이어티는 제2 표적 표면 단백질 바이오마커에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 프로브의 제1 표적-결합 모이어티는 제1 표적 소포내 단백질 바이오마커에 지향될 수 있는 반면, 제2 검출 프로브의 제2 표적-결합 모이어티는 제2 표적 소포내 단백질 바이오마커에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티 및 제2 표적-결합 모이어티는 동일한 표적 표면 단백질 바이오마커 또는 동일한 표적 소포내 단백질 바이오마커의 동일한 또는 상이한 에피토프에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티 및 제2 표적-결합 모이어티는 상이한 표적 표면 단백질 바이오마커 또는 상이한 표적 소포내 단백질 바이오마커에 지향될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인 및 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중 가닥 부분은 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인 및 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 이중 가닥 부분은 상이할 수 있다.
예시적인 트라이플렉스 또는 멀티플렉스(n≥3) 표적 엔티티 검출 시스템
일부 실시형태에서, 본 개시내용에 의해서 제공된 바와 같은(그리고, 예를 들어, 단일 엔티티 수준에서, 예를 들어, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 관심대상 엔티티)를 검출하는 데 유용한) 표적 엔티티 검출 시스템은 구별되는 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)의 n개의 집단을 포함할 수 있고, 여기서 n은 3 이상(예를 들어, n= 3, 4, 5 또는 그 초과)이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 n=3인 경우, 표적 엔티티 검출 시스템은 제1 표적을 위한 제1 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음), 제2 표적을 위한 제2 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)의 집단 및 제3 표적을 위한 제3 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)의 집단을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 표적, 제2 표적 및 제3 표적은 동일한 표적이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적, 제2 표적 및 제3 표적은 구별되는 표적이다. 일부 실시형태에서, 제1 표적, 제2 표적 및 제3 표적 중 적어도 2개는 구별되는 표적이다.
도 5a 는 단일 엔티티 수준에서, 적어도 1종 이상의 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 검출하기 위한 예시적인 트라이플렉스 표적 엔티티 검출 시스템을 도시한다. 제1 검출 프로브는 제1 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항-표적 1 항체 작용제, 예컨대, 항암 마커 1 항체 작용제) 및 제1 표적-결합 모이어티에 커플링된 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제1 이중-가닥 부분 및 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제1 단일-가닥 오버행을 포함한다. 도 5a 에 도시된 바와 같이, 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 더 긴 가닥(가닥 8)과 더 짧은 가닥(가닥 1)의 혼성화로부터 초래되어, 하나의 단부에 이중-가닥 부분 및 단일-가닥 오버행을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항-표적 1 항체 작용제, 예컨대, 항암 마커 1 항체 작용제)는 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 가닥 1)의 가닥의 5' 단부에 커플링(예를 들어, 공유 커플링)된다. 일부 실시형태에서, 제1 표적-결합 모이어티에 커플링된 가닥의 5' 단부는 링커(예를 들어, 스페이서를 갖거나 갖지 않는 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 또 다른 가닥(예를 들어, 가닥 8)의 5' 단부는 유리 포스페이트기를 갖는다.
도 5a 에 도시된 실시형태에서, 제2 검출 프로브는 제2 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항-표적 3 항체 작용제, 예컨대, 항암 마커 3 항체 작용제) 및 제2 표적-결합 모이어티에 커플링된 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제2 이중-가닥 부분 및 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제2 단일-가닥 오버행을 포함한다. 도 5a 에 도시된 바와 같이, 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 더 긴 가닥(가닥 4)과 더 짧은 가닥(가닥 2)의 혼성화로부터 초래되어, 하나의 단부에 이중-가닥 부분 및 단일-가닥 오버행을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항-표적 3 항체 작용제, 예컨대, 항암 마커 3 항체 작용제)는 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 가닥 2)의 가닥의 5' 단부에 커플링(예를 들어, 공유 커플링)된다. 일부 실시형태에서, 제2 표적-결합 모이어티에 커플링된 가닥의 5' 단부는 링커(예를 들어, 스페이서를 갖거나 갖지 않는 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 또 다른 가닥(예를 들어, 가닥 4)의 5' 단부는 유리 포스페이트기를 갖지 않는다.
제3 검출 프로브는 제3 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항-표적 2 항체 작용제, 예컨대, 항암 마커 2 항체 작용제) 및 제3 표적-결합 모이어티에 커플링된 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제3 이중-가닥 부분 및 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인의 각각의 단부로부터 연장된 제3 단일-가닥 오버행을 포함한다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행은 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인의 가닥의 하나의 단부로부터 연장되는 반면, 또 다른 단일-가닥 오버행은 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인의 상이한 가닥의 반대 단부로부터 연장된다. 도 5a 에 도시된 바와 같이, 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인은 2개의 가닥(예를 들어, 가닥 9 및 10)의 부분의 혼성화로부터 유래되어, 각각의 단부에 이중-가닥 부분 및 단일-가닥 오버행을 형성할 수 있다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행(3A)은 제3 검출 프로브의 가닥 9의 5' 단부에서 형성되며, 여기서 가닥 9의 '5 단부는 유리 포스페이트기를 갖는다. 추가로, 단일-가닥 오버행(3B)이 동일한 제3 검출 프로브의 가닥 10의 5' 단부에 형성되고, 제3 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항-표적 2 항체 작용제, 예컨대, 항암 마커 2 항체 작용제)가 또한 가닥 10의 5' 단부에 커플링된다(예를 들어, 공유 커플링된다). 일부 실시형태에서, 제3 표적-결합 모이어티에 커플링된 가닥(예를 들어, 가닥 10)의 5' 단부는 링커(예를 들어, 스페이서를 갖거나 갖지 않는 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)로 변형될 수 있다.
3개의 모든 검출 프로브가 충분히 가깝게 근접하게 존재하는 경우, 예를 들어, 3개의 모든 검출 프로브가 동일한 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 동시에 결합하는 경우, (i) 제3 검출 프로브의 단일-가닥 오버행(예를 들어, 3A)의 적어도 일부는 제2 검출 프로브의 단일-가닥 오버행의 상응하는 상보성 부분에 혼성화되고, (ii) 제3 검출 프로브의 또 다른 단일-가닥 오버행(예를 들어, 3B)의 적어도 일부는 제1 검출 프로브의 단일-가닥 오버행의 상응하는 상보성 부분에 혼성화된다. 그 결과, 선형 배열로 서로 커플링된 3개의 모든 검출 프로브를 포함하는 이중-가닥 복합체가 상응하는 단일-가닥 오버행의 직접 혼성화에 의해 형성된다. 예를 들어, 도 5a 를 참고하기 바란다.
제공된 기술에서 적어도 3개 이상(n>3)의 검출 프로브의 사용을 포함하는 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 단일-가닥 오버행이 각각의 각자의 파트너(들)에 어닐링되어 이중-가닥 복합체를 형성하는 경우, 적어도 (n-2)개의 표적 결합 모이어티/모이어티들이 이중-가닥 복합체의 내부 위치(들)에 존재한다. 이러한 실시형태에서, 이중-가닥 복합체의 또 다른 가닥에 임의의 내부 표적 결합 부분이 존재하지 않고, 따라서 예를 들어, 결찰 가능하여 예를 들어, 증폭 및 검출을 위해 결찰된 주형을 형성하도록 이중-가닥 복합체의 단일 가닥에 존재하는 내부 표적 결합 모이어티를 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 도 5a (3개의 검출 프로브 사용), 도 5b (4개의 검출 프로브 사용) 및 도 10 (n개의 검출 프로브 사용)을 참고하기 바란다.
이중-가닥 복합체의 가닥이 적어도 하나 이상의 내부 표적 결합 모이어티를 포함하는 일부 실시형태에서, 가닥은 내부 표적 결합 모이어티가 커플링된 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 단부와 또 다른 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 단부 사이에 갭을 포함한다. 갭의 크기는 가닥이 핵산 리가제의 존재 하에서 결찰 가능하지 않게 되도록 충분히 크다. 일부 실시형태에서, 갭은 2 내지 8개 뉴클레오타이드 크기 또는 2 내지 6개 뉴클레오타이드 크기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 갭은 6개 뉴클레오타이드 크기이다. 일부 실시형태에서, 중첩부(단일-가닥 오버행 사이의 혼성화 영역)는 2 내지 15개 뉴클레오타이드 길이 또는 4 내지 10개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중첩부(단일-가닥 오버행 사이의 혼성화 영역)는 8개 뉴클레오타이드 길이이다. 갭 및/또는 혼성화 영역의 크기는 결찰된 주형(내부 표적 결합 부분을 포함하지 않음) 및 비-결찰된 주형(적어도 하나의 내부 표적-결합 모이어티를 포함함)으로부터 최적의 신호 분리를 제공하도록 선택된다. 도 5a 및 도 5b 및 도 10 은 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 대한 검출 프로브의 결합을 나타내지 않지만, 이중-가닥 복합체(예를 들어, 결찰이 발생하기 전)는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 포함할 수 있고, 여기서 적어도 3개 이상의 표적 결합 모이어티가 동시에 관심대상 엔티티에 결합된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 듀플렉스, 트라이플렉스 또는 멀티플렉스 표적 엔티티 검출 시스템)에 사용하기 위한 검출 프로브(예를 들어, 다수의 검출 프로브 및/또는 특이적 바이오마커)의 조합물(예를 들어, 세트)의 선택은 예를 들어, 적용에 최적인 것으로 간주되는 목적하는 특이성 및/또는 목적하는 감도를 기반으로 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 조합물은 그것이 예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.7%, 적어도 99.8% 또는 그 초과를 포함하는, 적어도 95% 또는 그 초과의 특이성을 제공하도록 암의 검출(예를 들어, I, II, III 또는 IV기의 경우)을 위해서 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 조합물은, 그것이 예를 들어, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 초과를 포함하는 적어도 30% 이상의 감도를 제공하도록 암의 검출(예를 들어, I, II, III 또는 IV기의 경우)을 위해서 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 조합물은, 그것이 예를 들어, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 그 초과를 포함하는 적어도 8% 이상의 예측 값을 제공하도록 암의 검출(예를 들어, I, II, III 또는 IV기의 경우)을 위해서 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 조합물은, 그것이 예를 들어, 7×106 EV/㎖ 샘플 미만, 6×106 EV/㎖ 샘플 미만, 5×106 EV/㎖ 샘플 미만, 4×106 EV/㎖ 샘플 미만, 3×106 EV/㎖ 샘플 미만, 2×106 EV/㎖ 샘플 미만, 1×106 EV/㎖ 샘플 미만 또는 그보다 더 낮은 것을 포함하는, 1×107 EV/㎖ 샘플 미만 또는 그보다 더 낮은 검출 한계(LOD)를 제공하도록 암(예를 들어, I, II, III 또는 IV기)의 검출을 위해 선택된다. 일부 실시형태에서, 이러한 암 검출 검정은 상이한 암, 또는 특정 암의 하위유형 및/또는 병기를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 검출 검정을 사용하여 검출될 수 있는 하나 이상의 암은 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암(예를 들어, 교모세포종 포함), 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 사용하여 피부암(예를 들어, 흑색종)을 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 사용하여 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암)을 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 사용하여 유방암을 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 사용하여 상피 기원의 난소암, 예컨대, 고 등급 장액성 난소암을 검출할 수 있다.
일부 실시형태에서, 개별 검출 프로브보다 검출 프로브의 조합물(예를 들어, 세트)은 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정 암 및/또는 암의 병기)의 검출에 특이성을 부여하고, 예를 들어, 하나 이상의 개별 프로브는 그 자체가 이러한 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 특이적이지 않은 표적에 지향될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 듀플렉스, 트라이플렉스 또는 멀티플렉스 표적 엔티티 검출 시스템)에서 검출 프로브의 유용한 조합물은 관련 질환, 장애 또는 병태에 특이적인 표적(즉, 관련 질환, 장애 또는 병태에 특이적인 표적)에 지향되는 적어도 하나의 검출 프로브를 포함할 수 있고, 관련 질환, 장애 또는 병태에 반드시 또는 완전히 특이적이지는 않은(예를 들어, 건강한, 특정 질환, 장애 또는 병태를 갖지 않는 그리고/또는 관심대상 특정 질환 병기를 갖지 않는 일부 또는 모든 세포에서 또한 발견될 수 있는) 표적에 지향되는 적어도 1종의 검출 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 명세서를 읽는 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명에 따라 이용되는 검출 프로브 세트가 함께 관련 질환, 장애 또는 병태의 검출에 특이적인(즉, 관련 질환, 장애 또는 병태와 연관된 검출을 위한 생물학적 엔티티를 검출을 위한 관심대상이 아닌 다른 생물학적 엔티티로부터 충분히 구별하는) 복수의 개별 검출 프로브이거나 이를 포함하는 한, 이러한 세트가 본 발명의 특정 실시형태에 따라 유용하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 듀플렉스, 트라이플렉스 또는 멀티플렉스 표적 엔티티 검출 시스템)에서 유용한 검출 프로브는 하기 검출 프로브 중 적어도 하나 이상의 유형을 포함할 수 있다:
a. 정상적인 건강한 세포, 세포외 소포 및/또는 조직(예를 들어, 정상 건강한 세포, 세포외 소포, 및/또는 병에 걸린 세포, 예를 들어, 암 세포가 유래된 조직)과 특이적으로 연관된 바이오마커에 지향되는 검출 프로브;
b. 하나 초과의 질환, 예를 들어, 하나 초과의 암(정상적인 건강한 세포, 세포외 소포 및/또는 조직에 존재하지 않음)과 연관된 바이오마커에 지향되는, 예를 들어, 암(조직 유형에 무관함)에 대한 일반적인 바이오마커에 지향되는 검출 프로브; 및
c. 조직-특이적 질환 바이오마커(예를 들어, 조직-특이적 암 바이오마커, 예를 들어, 특정 조직, 예를 들어, 비제한적으로 뇌, 유방, 결장, 난소 및/또는 여성 생식기계와 연관된 다른 조직, 췌장, 전립선 및/또는 남성 생식기계와 연관된 다른 조직, 간, 폐 및 피부에 대한 암과 특이적으로 연관된 바이오마커)에 지향되는 검출 프로브.
일부 실시형태에서, 암의 검출을 위한 검출 프로브의 유용한 조합물(예를 들어, 세트)은 정상적인 건강한 세포, 세포외 소포 및/또는 조직(예를 들어, 이것으로부터 암 세포가 유래됨)과 특이적으로 연관된 바이오마커에 지향되는 제1 검출 프로브 및 하나 초과의 암과 연관된 (그러나 정상적인 건강한 세포, 세포외 소포 및/또는 조직에 존재하지 않는) 바이오마커에 지향되는 제2 검출 프로브를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 제2 검출 프로브는 (조직 유형에 관계없이) 암에 대한 일반적인 바이오마커에 지향될 수 있다.
일부 실시형태에서, 암의 검출을 위한 검출 프로브의 조합물은 조직-특이적 암 바이오마커(예를 들어, 특정 조직에 대한 암과 전형적으로 연관된 바이오마커)에 지향되는 제1 검출 프로브 및 암의 동일한 조직과 특이적으로 연관되지만 정상적인 건강한 상태에 존재하는 바이오마커에 지향되는 제2 검출 프로브를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 암의 검출을 위한 검출 프로브의 조합물은 구별되는 암-연관된 바이오마커에 각각 지향되는 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 검출 프로브및 제2 검출 프로브는 상이한 암(예를 들어, 동일한 조직 또는 상이한 조직과 연관된 암)과 연관된 바이오마커에 각각 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브는 동일한 암과 연관된 바이오마커에 각각 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브는 상이한 병기의 동일한 암과 연관된 바이오마커에 각각 지향될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 듀플렉스, 트라이플렉스 또는 멀티플렉스 표적 엔티티 검출 시스템)은 적어도 1종 이상(예를 들어, 적어도 2종 이상)의 대조군 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 표적-특이적 검출 프로브, 예를 들어, 일부 실시형태에서 질환-특이적 바이오마커, 예컨대, 암-특이적 바이오마커 및/또는 조직-특이적 바이오마커를 인식하기 위함)를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브는, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 대한 결합이 검출 신호의 생성을 용이하게 할 수 있도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브는, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 대한 결합이 검출 신호의 생성을 (완전히 또는 부분적으로) 저해하도록 설계된다("저해제 프로브"). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대조군 프로브는 비-표적 엔티티에서 일어나는 결찰을 저해하도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브는 비-표적 엔티티로부터의 결찰된 주형의 증폭을 저해하도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대조군 프로브는 대조군 결합 모이어티 및 대조군 결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)을 포함하고, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함한다. 대조군 결합 모이어티는 대조군 참조에 결합되는 엔티티 또는 모이어티이다. 일부 실시형태에서, 대조군 참조는 정상적인 건강한 세포 또는 세포외 소포와 우선적으로 연관되는 바이오마커일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 참조는 비-표적 조직과 우선적으로 연관되는 바이오마커일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 포함은 위양성(예를 들어, 선택적으로 검출될 하나 이상의 표적과 조합하여, 대조군 참조를 포함하는 관심대상 엔티티)으로부터 생성된 검출 가능한 신호를 선택적으로 제거하거나 최소화할 수 있다.
예를 들어, 도 11 및 도 12 에 도시된 바와 같이, 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)은 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 그 초과)의 표적-특이적 검출 프로브 및 (예를 들어, 정상적인 건강한 세포 또는 세포외 소포 및/또는 비특이적 조직으로부터의 세포 또는 세포외 소포를 인식하기 위한) 적어도 1종의 대조군 프로브를 포함할 수 있다. 표적-특이적 검출 프로브 및 대조군 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은, 대조군 프로브가 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 생물학적 개체)에 결합할 때 동일한 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포) 내의 표적-특이적 검출 프로브 중 적어도 하나 또는 모두의 결합이 결찰된 주형의 형성으로 반드시 이어지는 것은 아니도록 설계되고 결정될 수 있다. 동일한 관심대상 엔티티에 대한 대조군 결합의 부재 하에서 단일 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)에 대한 모든 표적-특이적 검출 프로브의 결합은 결찰된 주형의 우선적 형성 따라서 검출 가능한 신호를 초래한다. 단지 예시의 목적으로, 도 12 는 결찰의 경쟁적 저해제로 작용하는 대조군 프로브의 예시적인 사용을 도시한다. 예를 들어, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 개체)에 대한 (예를 들어, 정상적인 건강한 세포 또는 세포외 소포 및/또는 비특이적 조직으로부터의 세포 또는 세포외 소포를 인식하기 위한) 대조군 프로브 결합의 부재 하에서, 동일한 관심대상 엔티티에 대한 제1 표적-특이적 검출 프로브 및 제2 표적-특이적 프로브의 결합은 이들이 올리고뉴클레오타이드 도메인의 각각의 단일-가닥 오버행의 직접 혼성화를 통해 서로 상호작용하기에 충분히 가깝게 근접할 수 있게 하여 결찰 주형을 형성한다. 대조군 프로브는 각각의 표적 결합 파트너에 대한 표적-특이적 검출 프로브 중 적어도 하나와 경쟁함으로써 표적-특이적 검출 프로브 사이의 이러한 혼성화를 방지하도록 설계될 수 있다. 단지 예로서 그리고 예시 목적으로만, 도 12 는 대조군 프로브의 하나의 단부가 표적-특이적 검출 프로브(예를 들어, 표적-특이적 검출 프로브 2)에 결합하도록 설계된 반면, 대조군 프로브의 다른 단부는 대조군 프로브의 부재 하에서 전자(예를 들어, 표적-특이적 검출 프로브 2)에 결합하지 않았을 또 다른 표적-특이적 검출 프로브(예를 들어, 표적-특이적 검출 프로브 1)와 상호작용할 수 없도록 설계된 것을 도시한다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 하나의 단부는, 그것이 또 다른 검출 프로브의 단일-가닥 오버행과 혼성화할 수 없도록 뭉툭한 단부가 되도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥(예를 들어, 도 12 에 도시된 바와 같은 대조군 프로브의 가닥 9)의 3' 단부는 결찰이 허용되지 않도록 다이데옥시뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 대조군 프로브는 비-표적 엔티티로부터의 결찰된 주형의 증폭을 저해하도록 설계될 수 있다. 단지 예시의 목적을 위해서, 도 26 은 비-표적 엔티티에 대한 이의 결합이 또 다른 프로브, 예를 들어, 검출 프로브와의 결찰을 허용하면서, 비-표적 엔티티로부터의 결찰된 주형의 증폭을 저해하도록 설계된, 예시적인 저해제 프로브를 도시한다. 일부 실시형태에서 저해제 프로브는 비-표적, 예를 들어, 표적 조직과 연관되지 않은 마커, 또는 진단될 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)와 연관되지 않은 마커에 지향될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 저해제 프로브는, 검출 프로브 및 저해제 프로브가 가깝게 근접하는 경우 이들의 단일-가닥 오버행이 서로 혼성화하여 결찰이 가능하도록 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 것)와 유사할 수 있다. 그러나, 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)와 달리, 이러한 저해제 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 하나의 가닥은 프라이머 부위를 갖지 않으므로, 검출 프로브와 비-표적 엔티티에 존재하는 저해제 프로브 사이의 상호작용의 결과로 형성될 수 있는 임의의 결찰된 주형의 증폭이 금지된다. 비-표적 엔티티(예를 들어, 다른 조직으로부터의 생물학적 엔티티)에 결합하는 저해제 프로브의 존재 하에서, 프라이머 부위 없이 저해제 프로브가 주형의 증폭을 허용하지 않기 때문에 검출 신호가 생성될 수 없다. 일부 실시형태에서, 이러한 저해제 프로브의 포함은 위양성을 선택적으로 제거할 수 있고, 이에 의해 검출의 특이성을 개선할 수 있다.
본 명세서에 기재된 대조군 프로브(들)를 포함하는 일부 실시형태에서, 이러한 대조군 프로브(들)에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드 도메인의 길이는 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)에서 사용되는 올리고뉴클레오타이드 도메인의 길이와 대등하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 30 내지 약 1000개 뉴클레오타이드의 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 30 내지 약 500개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 250개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 200개 뉴클레오타이드, 약 30 내지 약 150 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 150개 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 125개 뉴클레오타이드, 약 40 내지 약 100개 뉴클레오타이드, 약 50 내지 약 90개 뉴클레오타이드, 약 50 내지 약 80개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 50개 내지 최대 약 90개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 30개 내지 최대 약 50개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 10개 내지 최대 약 30개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 가질 수 있다. 본 개시내용을 읽는 당업자는, 올리고뉴클레오타이드 도메인의 길이가 검출 검정에서 대조군 프로브의 성능을 개선시키도록 조정될 수 있을 것이라는 것을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 다른 것 중에서 본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 바와 같은 검출 프로브가 고체 기질 표면에 비특이적으로 결합할 수 있고, 이들 중 일부는 임의의 과량의 또는 결합되지 않은 검출 프로브를 제거하기 위한 수 회의 세척 후에도 검정 샘플에서 유지될 수 있고; 이러한 비-특이적으로 결합된 검출 프로브가 고체 기질 표면으로부터 떨어져 나와서, 결찰 반응에서 자유롭게 부유하게 됨으로써, 그들이 서로와 상호작용하여 바람직하지 않은 배경 신호를 생성시키는 비특이적인 결찰된 주형을 생성시킬 수 있다는 통찰력을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 듀플렉스, 트라이플렉스 또는 멀티플렉스 표적 엔티티 검출)은 관심대상 엔티티에 결합하지 않고, 결찰 반응에서 자유로운 작용제로서 남아있는 잔류하는 검출 프로브를 포획하도록 설계된 적어도 1종 이상(예를 들어, 적어도 2종 이상)의 저해제 올리고뉴클레오타이드를 포함함으로써, 이러한 자유롭게 부유하는 검출 프로브가 다른 자유롭게 부유하는 상보성 검출 프로브와 상호작용하여 바람직하지 않은 배경 신호를 생성시키는 것을 방지할 수 있다. 일부 실시형태에서, 저해제 올리고뉴클레오타이드는 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되거나 이용됨)의 단일-가닥 오버행에 대한 결합 도메인을 포함하는 단일-가닥 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드이거나 이를 포함할 수 있으며, 여기서 저해제 올리고뉴클레오타이드는 프라이머 결합 부위를 포함하지 않는다. 저해제 올리고뉴클레오타이드에서 이러한 프라이머 결합 부위의 부재는 프라이머가 저해제 올리고뉴클레오타이드에 대한 검출 가능한 프로브의 결찰로부터 야기되는 비특이적인 결찰된 주형에 결합하는 것을 방지함으로써, 비특이적인 결찰된 주형이 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응에 의해서 증폭 및/또는 검출되는 것을 감소시키거나 저해한다.
일부 실시형태에서, 저해제 올리고뉴클레오타이드는 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기술되거나 이용됨)의 단일-가닥 오버행에 대한 결합 도메인을 포함하고, 여기서 결합 도메인은 상보성 단일-가닥 오버행을 갖는 자유로운 결합되지 않은 검출 프로브가 저해제 올리고뉴클레오타이드의 결합 도메인에 결합할 수 있도록 검출 프로브의 단일-가닥 오버행과 실질적으로 상보성인 뉴클레오타이드 서열이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 저해제 올리고뉴클레오타이드는 하나의 단부에 헤어핀을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 저해제 올리고뉴클레오타이드는 하나의 단부에 검출 프로브의 단일-가닥 오버행에 대한 결합 도메인을 포함하는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드일 수 있으며, 여기서 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 일부는 예를 들어, 도 18 에 도시된 바와 같이, 자가-혼성화되어 또 다른 단부에 헤어핀을 형성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 듀플렉스, 트라이플렉스 또는 멀티플렉스 표적 엔티티 검출 시스템)은 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 또 다른 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인과 회합시키는 연결자 올리고뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 연결자 올리고뉴클레오타이드는, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인이 관심대상 엔티티에 결합하는 경우 서로와 상호작용하지 않았을 임의의 2개의 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 브리징하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 연결자 올리고뉴클레오타이드는 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 일부 및 또 다른 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 일부와 혼성화하도록 설계된다. 연결자 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥, 이중-가닥 또는 이들의 조합물일 수 있다. 연결자 올리고뉴클레오타이드는 어떠한 표적-결합 모이어티(예를 들어, 본 명세서에 기술되고/되거나 이용됨) 또는 대조군 결합 모이어티도 존재하지 않는다. 적어도 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 간접적으로 연결하기 위한 연결자 올리고뉴클레오타이드가 필요하지 않으며; 일부 실시형태에서, 이러한 연결자 올리고뉴클레오타이드는 사용되지 않는데, 이는 부분적으로 본 명세서에서 제공되고/되거나 이용되는 바와 같은 검출 프로브가 그들의 각각의 올리고뉴클레오타이드 도메인이 충분히 가깝게 근접하는 경우, 예를 들어, 검출 프로브가 관심 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)에 동시에 결합하는 경우, 서로에 도달하여 서로와 상호작용하기에 충분한 길이를 갖도록 설계되기 때문이다.
일부 실시형태에서, 표적 엔티티 검출 시스템은 (i) 각각 특정 표적(예를 들어, 분자 표적 또는 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커)에 대한 복수의 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 것); 및 (ii) 관심대상 표적 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포체)를 포획하기 위한 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 포획제는 접합된 표적-포획 모이어티를 포함하는 고체 기질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 같은 것, 예를 들어, 일부 실시형태에서 자기 비드)이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적-포획 모이어티는 관심대상 표적 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티. 예컨대, 세포외 소포)에 지향되는 항체 작용제이거나 이를 포함할 수 있다.
II. 제공된 표적 엔티티 검출 시스템을 사용하는 예시적인 방법
제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 예를 들어, 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암) 또는 복수의 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 복수의 암)의 검출과 연관된 일부 실시형태에서, 다양한 적용 및/또는 목적을 위해 샘플(예를 들어, 생물학적, 환경적 또는 다른 샘플)에서 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 검출하는 데 유용하다. 따라서, 본 명세서에 제공된 일부 양상은 본 개시내용에 따라 사용하기에 적절한 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 그 초과)의 검출 프로브를 사용하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플(예를 들어, 인간 대상체로부터의 혈액 또는 혈액-유래 샘플) 내의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 적어도 2개 이상(예를 들어, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20개 또는 그 초과 포함)의 검출 프로브 검출 프로브의 세트와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 포함하는 샘플을 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같음)에 적용하는 단계를 포함한다. 복수의 검출 프로브(예를 들어, 적어도 2개 이상)가 동시에 또는 상이한 시간에(예를 들어, 순차적으로) 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 개체, 예컨대 세포외 소포)를 포함하는 샘플에 첨가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 검출에 특이적인 검출 프로브의 세트가 단일 검정 챔버에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 복수의 암)의 검출에 특이적인 검출 프로브 세트가 단일 분석 챔버에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 세트는 복수의 하위세트(예를 들어, 구별되는 질환 또는 병태의 검출에 지향되는 각각의 하위세트)로 분할될 수 있고, 이들의 각각의 하위세트가 동일한 샘플로부터의 분취물에 첨가될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 샘플은 검출 프로브의 상이한 세트(예를 들어, 각각이 구별되는 질환 또는 병태의 검출에 지향됨)가 상이한 분취물에 첨가될 수 있도록 분취물로 분할될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 제공된 기술은 한 번에 하나의 분취물 또는 한 번에 여러 분취물로 구현될 수 있다(예를 들어, 처리량을 증가시키기 위한 병렬 검정의 경우).
일부 실시형태에서, 샘플에 첨가되는 검출 프로브의 양은, 검출 프로브가 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 대한 결합의 부재 하에서 적어도 임의의 상당한 또한 실질적인 정도가 아닌 서로와 가깝게 무작위적으로 근접하지 않을 것을 보장하도록 혼합물 중의 검출 프로브의 충분히 낮은 농도를 제공한다. 이와 같이, 다수의 실시형태에서, 검출 프로브가 검출 프로브의 각각의 표적화 결합 모이어티와 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)의 결합 부위 간의 결합 상호작용을 통해서 관심대상의 동일한 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 동시에 결합하는 경우, 검출 프로브는 서로 충분히 가깝게 근접하여 이중-가닥 복합체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 형성한다. 일부 실시형태에서, 샘플과 조합한 후 혼합물 중의 검출 프로브의 농도는 약 1pM 내지 약 100nM을 포함하는 약 1pM 내지 약 1nM과 같은 약 1fM 내지 1μM의 범위일 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플 중의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)의 농도는, 하나의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 결합하는 검출 프로브가 동일한 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 결합하는 각각의 검출 프로브의 부재 하에서, 적어도 임의의 상당한 또한 실질적인 정도가 아니게, 또 다른 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 결합하는 또 다른 검출 프로브와 가깝게 무작위적으로 근접하지 않도록 충분히 낮다. 단지 예로서, 샘플 중의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)의 농도는, 관심대상 비-표적 엔티티(예를 들어, 비암성 생물학적 엔티티, 예컨대, 제1 표적을 포함하는 세포외 소포)에 결합하는 제1 표적 검출 프로브가 위양성의 검출 가능한 신호를 생성시키도록 적어도 임의의 상당한 또는 실질적인 정도가 아니게, 관심대상의 또 다른 비-표적 엔티티(예를 들어, 비암성 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)에 결합되는 또 다른 상이한 표적 검출 프로브와 가깝게 무작위적으로 근접하지 않을 것이도록 충분히 낮다.
일부 실시형태에서, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)는 관심대상 엔티티를 본 개시내용에 따라 사용하기에 적절한 검출 프로브와 접촉시키기 전에 고체 기질 상에 포획되거나 고정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심대상 엔티티는 예를 들어, 흡착을 비롯한 비특이적 상호작용에 의해 고체 기질 표면 상에 포획될 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심대상 엔티티는 고체 기질 표면 상에 선택적으로 포획될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 기질 표면은 관심대상 엔티티에 특이적으로 결합하는 작용제(예를 들어, 관심대상 엔티티, 예컨대 세포외 소포 또는 암-연관된 세포외 소포를 특이적으로 표적화하는 항체 작용제)로 코팅될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 기질 표면은 친화성 결합 쌍의 구성원으로 코팅될 수 있고, 포획될 관심대상 엔티티는 친화성 결합 쌍의 상보적 구성원에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예시적인 친화성 결합 쌍은 예를 들어, 바이오틴 및 아비딘-유사 분자, 예컨대, 스트렙타비딘을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 적절한 친화성 결합 쌍이 또한 고체 기질 표면에 대한 관심대상 엔티티의 포획을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)는 예를 들어, 문헌[Ibsen et al. ACS Nano., 11: 6641-6651 (2017) 및 Lewis et al. ACS Nano., 12: 3311-3320 (2018)]에 기재된 바와 같은, 전류의 인가에 의해서 고체 기질 표면 상에서 포획될 수 있고, 이들 둘 다는 비희석된 인간 혈액 또는 혈장 샘플로부터 세포외 소포를 단리시키기 위한 교류 동전기 마이크로어레이 칩 장치의 사용을 기재한다.
고체 기질은 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)를 포획하기에 적합하고, 하류 취급, 처리 및/또는 검출을 방해하지 않는 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 기질은 비드(예를 들어, 자성 비드)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 기질은 표면일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 표면은 검정 챔버(예를 들어, 튜브, 웰, 마이크로웰, 플레이트, 필터, 막, 매트릭스 등 포함)의 포획 표면일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 복수의 검출 프로브와 접촉시키기 전에, 관심대상 엔티티를 고체 기질 상에 포획 또는 고정화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 관심대상 엔티티를 포함하는 샘플은 고체 기질 표면 상에서 관심대상 엔티티를 포획하기 전에, 예를 들어, 목적하지 않은 엔티티, 예컨대, 세포 파편 또는 세포를 제거하기 위해서, 처리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 샘플은 원심분리를 거쳐, 예를 들어, 세포 파편, 세포 및/또는 다른 미립자를 제거할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시형태에서 이러한 샘플은 크기 배제 기반 정제 또는 여과에 적용될 수 있다. 다양한 크기 배제 기반 정제 또는 여과가 당업계에 공지되어 있으며, 당업자는 일부 경우에 샘플이 특정 분자량 또는 입자 크기 컷오프를 기반으로 하는 스핀 칼럼 정제에 적용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 정제 목적을 위한 적절한 분자량 또는 입자 크기 컷오프가, 예를 들어, 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포)의 크기에 기초하여 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 크기-배제 분리 방법은 특정 크기(예를 들어, 30㎚ 내지 1000㎚)인 세포외 소포의 분획을 단리시키기 위해 세포외 소포를 포함하는 샘플에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 크기-배제 분리 방법은 70㎚ 초과 내지 200㎚ 이하인 세포외 소포의 분획을 단리시키기 위해 세포외 소포를 포함하는 샘플에 적용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플 중의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 개체)는 관심대상 엔티티를 본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 복수의 검출 프로브와 접촉시키기 전에 처리될 수 있다. 예를 들어, 검출될 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 개체)에서 표적(예를 들어, 분자 표적)을 안정화시키고/시키거나 검출 프로브에 대한 표적(예를 들어, 분자 표적, 예컨대, 세포내 표적)의 노출을 용이하게 하고/하거나 검출 프로브의 비특이적 결합을 감소시키기 위해서, 상이한 샘플 처리 및/또는 준비가 수행될 수 있다. 이러한 샘플 처리 및/또는 준비의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 분자 표적의 가교(예를 들어, 고정), 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포 또는 세포외 소포)의 투과화 및/또는 비특이적 결합 부위의 차단을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
샘플 중의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 검출 프로브의 세트와 접촉시킨 후, 이러한 혼합물은 검출 프로브가 존재하는 경우 관심대상 엔티티 중의 상응하는 표적(예를 들어, 분자 표적)에 결합하여 이중-가닥 복합체(예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 형성하기에 충분한 시간 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 혼합물은 약 30분 내지 약 2시간을 포함하는 약 5분 내지 약 5시간 범위의 시간 기간 동안 20℃ 내지 약 37℃를 포함하는 약 10 내지 약 50℃ 범위의 온도에서 인큐베이션된다.
이중-가닥 복합체(관심대상 엔티티, 예컨대, 생물학적 엔티티를 검출 프로브와 접촉시킴으로써 생성됨)는 이후에 핵산 리가제와 접촉되어 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 유리 3' 단부 하이드록실 및 5' 단부 포스페이트 단부의 핵산 결찰을 수행함으로써, 적어도 2종 이상의 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 가닥을 포함하는 결찰된 주형을 생성시킨다. 일부 실시형태에서, 이중-가닥 복합체를 포함하는 검정 샘플을 핵산 리가제와 접촉시키기 전에, 저해제 올리고뉴클레오타이드가 결찰 반응 동안 서로 상호작용하지 않았을 수 있는 임의의 잔류하는 자유롭게 부유하는 검출 프로브를 포획할 수 있도록 적어도 1종 이상의 저해제 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)가 검정 샘플에 첨가될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 리가제는 바로 인접한 2개의 핵산이 이들이 상보적인 제3 핵산 서열에 어닐링되거나 혼성화되는 경우 이들의 병치된 3'-하이드록실과 5'-포스페이트 말단 사이의 포스포다이에스터 결합 형성을 촉매한다. 온도 민감성 및/또는 열안정성 리가제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 공지된 핵산 리가제(예를 들어, DNA 리가제)가 사용될 수 있다. 온도 민감성 리가제의 비제한적인 예는 박테리오파지 T4 DNA 리가제, 박테리오파지 T7 리가제 및 이. 콜라이(E. coli) 리가제를 포함한다. 열안정성 리가제의 비제한적인 예는 Taq 리가제, Tth 리가제, 및 Pfu 리가제를 포함한다. 열안정성 리가제는 원핵생물, 진핵생물 또는 원시생물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 호열성(thermophilic) 또는 호고열성(hyperthermophilic) 유기체로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 리가제는 DNA 리가제이다. 일부 실시형태에서, 핵산 리가제는 RNA 리가제일 수 있다.
일부 실시형태에서, 결찰 단계에서, 적합한 핵산 리가제(예를 들어, DNA 리가제) 및 필요하고/하거나 바람직한 임의의 시약이 반응 혼합물과 조합되고, 혼성화된 결찰 올리고뉴클레오타이드의 결찰이 일어나기에 충분한 조건 하에서 유지된다. 결찰 반응 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 결찰 동안, 일부 실시형태에서, 반응 혼합물은 약 20℃ 내지 약 45℃ 범위의 온도, 예컨대, 약 25℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 약 5분 내지 약 16시간, 예컨대, 약 1시간 내지 약 4시간 범위의 시간 기간 동안 유지될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 반응 혼합물은 약 35℃ 내지 약 45℃, 예컨대, 약 37℃ 내지 약 42℃ 범위의 온도, 예를 들어, 38℃, 39℃, 40℃ 또는 41℃에서 또는 그 근처에서 약 2 내지 약 8시간을 포함하는 약 5분 내지 약 16시간, 예컨대, 약 1시간 내지 약 10시간 범위의 시간 기간 동안 유지될 수 있다.
이러한 결찰된 주형의 검출은 샘플 내의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)가 검출 프로브가 지향되는 표적에 대해 양성인지 음성인지에 대한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 이러한 결찰된 주형의 검출 가능한 수준은 관심대상 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상의 시험된 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 수준은 참조 수준을, 예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 초과를 포함하는, 예를 들어, 적어도 10%만큼 초과하는 수준이다. 일부 실시형태에서, 참조 수준은 이러한 표적을 포함하는 관심대상 엔티티가 없는 샘플과 같은 음성 대조군 샘플에서 관찰된 수준일 수 있다. 반대로, 이러한 결찰된 주형의 검출 가능하지 않은 수준(예를 들어, 검출 가능한 수준의 역치보다 작은 수준)은 관심대상 표적(예를 들어, 분자 표적) 중 적어도 하나가 시험된 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)로부터 존재하지 않음을 나타낸다. 당업자는, 검출 가능한 수준을 검출 가능하지 않은 수준으로부터 분리하는 역치가 예를 들어, 각각의 응용 및/또는 목적을 위해서 최적인 것으로 간주되는 바람직한 감도 수준 및/또는 바람직한 특이성 수준에 기초하여 결정될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 99.7%의 특이성은, 예를 들어, 참조 수준(예를 들어, 음성 대조군 샘플에서 관찰된 수준, 예를 들어, 1명 이상의 정상적인 건강한 개체로부터 유래된 샘플)보다 3 표준 편차를 초과하는 역치를 설정함으로써 본 명세서에 제공된 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 당업자는 검출 가능한 수준의 역치(예를 들어, 검출 신호 강도에 의해 반영되는 바와 같음)가 참조 수준보다 1 내지 100배 높을 수 있음을 이해할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 결찰 후, 예를 들어, 샘플에서 관심대상 엔티티의 존재 및/또는 양의 척도로서 결찰된 주형을 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 결찰된 주형의 검출은 정성적 또는 정량적일 수 있다. 이와 같이, 검출이 정성적인 일부 실시형태에서, 방법은 적어도 2종 이상의 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)가 검정될 샘플에 존재하는지의 여부의 판독 또는 평가, 예를 들어, 평가방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 방법은 적어도 2종 이상의 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)가 검정될 샘플에 존재하는지 여부에 대한 정량적 검출, 예를 들어, 검정될 샘플에서 적어도 2종 이상의 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)의 실제 양의 평가 또는 평가방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 정량적 검출은 절대적 또는 상대적일 수 있다.
본 명세서에 제공된 기술을 사용하여 형성된 결찰된 주형은 당업계에 공지된 적절한 방법에 의해 검출될 수 있다. 당업자는 적절한 검출 방법이 예를 들어, 바람직한 감도 수준 및/또는 방법이 실행되고 있는 응용에 기초하여 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 실시형태에서, 결찰된 주형은 임의의 증폭 없이 직접 검출될 수 있는 반면, 다른 실시형태에서, 결찰된 주형은 예를 들어, 특정 검정의 감도를 향상시키기 위해, 결찰된 주형의 카피 수가 증가하도록 증폭될 수 있다. 증폭 없는 검출이 실시 가능한 경우, 결찰된 주형은 다수의 상이한 방식으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기술되고/되거나 이용된 바와 같음)은 직접 표지, 예를 들어, 형광 또는 방사성 동위원소 표지될 수 있어서, 결찰된 주형은 직접 표지된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기술되고/되거나 이용된 바와 같음)은 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 검출 가능한 표지는 분광, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출 가능한 조성물일 수 있다. 이러한 표지는 표지된 스트렙타비딘 접합체로 염색하기 위한 바이오틴, 자성 비드(예를 들어, Dynabeads®), 형광 염료(예를 들어, 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 녹색 형광 단백질 등), 방사성 표지(예를 들어, 3H, 125I, 34S, 14C 또는 32P), 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 ELISA에서 일반적으로 사용되는 다른 것), 및 열량계 표지, 예컨대, 콜로이드성 금 또는 유색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 직접 표지된 결찰된 주형은 결찰된 주형을 검출하기 위해 결찰되지 않은 직접 표지된 결찰 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 반응 혼합물의 나머지로부터 크기가 분리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 결찰된 주형의 검출은 증폭 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 결찰된 핵산의 카피 수는 예를 들어, 검정의 감도를 향상시키기 위해 증가된다. 증폭은 바람직한 경우, 선형 또는 지수적일 수 있으며, 여기서 증폭은 중합효소 연쇄 반응(PCR); 정량적 PCR, 등온 증폭, 핵산 서열 기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 디지털 액적 PCR 등을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
PCR 증폭을 달성하기 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있으며; 당업자는 PCR 기술의 다양한 실시형태에 대해 상당히 친숙할 것이고, 본 명세서에 제공된 기술을 사용하여 생성된 결찰된 주형을 증폭시키기에 적합한 것을 쉽게 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 결찰된 주형을 포함하는 반응 혼합물은 프라이머 연장 반응에 사용되는 하나 이상의 프라이머, 예를 들어, PCR 프라이머(예를 들어, 기하(또는 지수) 증폭에 사용되는 정방향 및 역방향 프라이머 또는 선형 증폭에 사용되는 단일 프라이머)와 조합된다. 하나 이상의 결찰된 주형이 접촉되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 적절한 어닐링 조건에서 상보적 주형 DNA에 대한 혼성화를 제공하기에 충분한 길이를 가져야 한다. 프라이머는 전형적으로 예를 들어, 적어도 15bp 길이, 적어도 20bp 길이, 적어도 25bp 길이, 적어도 30bp 길이를 포함하는, 적어도 10bp 길이이다. 일부 실시형태에서, 프라이머의 길이는 전형적으로 약 15 내지 50bp 길이, 약 18 내지 30bp 또는 약 20 내지 35bp 길이의 범위일 수 있다. 결합된 주형은 주형 DNA의 프라이머 확장, 선형 또는 지수적 증폭이 바람직한지의 여부에 따라, 단일 프라이머 또는 2개의 프라이머 세트(정방향 및 역방향 프라이머)와 접촉될 수 있다.
상기 성분에 더하여, 결찰된 주형을 포함하는 반응 혼합물은 전형적으로 중합효소 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트라이포스페이트(dNTP)를 포함한다. 목적하는 중합효소 활성은 하나 이상의 구별되는 중합효소 효소에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 결찰된 주형의 증폭을 위한 반응 혼합물의 제조 시에, 다양한 구성 성분이 임의의 편리한 순서로 조합될 수 있다. 예를 들어, 적절한 완충액을 하나 이상의 프라이머, 하나 이상의 중합효소 및 검출될 결찰된 주형과 조합하거나, 다양한 구성 성분 모두를 동시에 조합하여 반응 혼합물을 생성할 수 있다.
III. 개별 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)의 표적 조합물(들)(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처(들))의 검출
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술(예를 들어, 시스템, 조성물 및 방법 포함)은 개별 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)에서 하나 이상의 표적 조합물(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암에 대한 하나 이상의 표적 바이오마커 시그니처)의 검출에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 개별 세포외 소포에서 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 표적 조합물(예를 들어, 1종 이상의 표적 바이오마커 시그니처)의 공동 국지화를 검출함으로써 예를 들어, 무세포 핵산, 혈청 단백질 및/또는 세포외 소포의 벌크 분석을 기반으로 하는 다수의 종래의 진단 검정의 문제를 해결하는 기술(시스템, 조성물 및 방법 포함)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용에 따라 검출될 표적 바이오마커 시그니처는 적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 표면 단백질 바이오마커, 내부 단백질 바이오마커 및 이러한 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)와 연관된 세포외 소포에 존재하는 RNA 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 표적 바이오마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 표적 바이오마커 시그니처는 생물정보학 분석에 의해 식별될 수 있다.
일 양상에서, 본 개시내용은 다른 것 중에서, 개별 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)에서 1종 이상의 바이오마커 시그니처의 검출을 위한 조성물(예를 들어, 시스템 및 키트) 및 방법을 제공한다. 다수의 실시형태에서, 이러한 표적 바이오마커 시그니처는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암에 대해 특이적이다. 일부 실시형태에서, 이러한 표적 바이오마커 시그니처는 다방면 생물정보학 분석(multi-pronged bioinformatics analysis) 및 생물학적 접근법에 의해 식별될 수 있으며, 이는 예를 들어, 일부 실시형태에서 예를 들어, 서열결정 데이터, 발현 데이터, 질량 분석, 조직학, 번역 후 변형 데이터 및/또는 기계 학습 및/또는 컴퓨터 모델링을 통한 시험관내 및/또는 생체내 실험 데이터 중 하나 이상을 포함하는 일부 실시형태에서 다양한 데이터의 세트의 컴퓨터 분석을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이오마커의 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)은 검출 프로브의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 쌍별 또는 직교 조합물에 의해서 검출될 수 있고, 여기서 검출 프로브의 각각의 쌍은 적어도 1종의 구별되는 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)은 각각 서로에 혼성화하여 선형 복합체를 형성하는 검출 프로브의 세트에 의해서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 조합물은 암 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 조합물은 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 직교 조합물은 암 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 직교 조합물은 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 표적 바이오마커 시그니처는 암 검출의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의(예를 들어, 적어도 2개 이상의) 표적 바이오마커 시그니처는 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해서 선택될 수 있다. 단지 예로서, 일부 실시형태에서, 적어도 바이오마커 조합물 A 및 바이오마커 조합물 B는 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해 선택될 수 있으며, 여기서 바이오마커 조합물 A는 표적 1 및 표적 2일 수 있거나 이를 포함할 수 있고; 바이오마커 조합물 B는 표적 1 및 표적 3일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 바이오마커 조합물 A 및 바이오마커 조합물 B는 특정 암 또는 이의 병기 및/또는 이의 하위유형의 검출을 위해 선택될 수 있으며, 여기서 바이오마커 조합물 A는 표적 1 및 표적 2일 수 있거나 이를 포함할 수 있고; 바이오마커 조합물 B는 표적 3 및 표적 4일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처는 적어도 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 초과)의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)와 연관된 세포외 소포에 존재하는 표면 폴리펩타이드 및 적어도 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 초과)의 표면 단백질 바이오마커(들), 소포내 단백질 바이오마커(들) 및 소포내 RNA 바이오마커(들)로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 바이오마커를 포함하여, 이러한 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(들) 및 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 표적 바이오마커 시그니처에 존재하는 이러한 표적 바이오마커(들)는, 본 명세서에 제공된 기술(예를 들어, 본 명세서에 기재된 표적 엔티티 검출 시스템)을 사용하여 검출되는 경우 (a) 위양성의 수를 최소화하는 높은 특이성(예를 들어, 99% 초과 또는 그 초과, 예컨대, 99.5% 초과), 및 (b) 진단될 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 예후가 가장 바람직한 경우 암 또는 초기 병기 암)에 대한 높은 감도(예를 들어, 40% 초과)를 제공한다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 표적 바이오마커 시그니처는 적어도 하나의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)와 연관된 세포외 소포에 존재하는 표면 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 표면 단백질 바이오마커(들), 소포내 단백질 바이오마커(들) 및 소포내 RNA 바이오마커(들)로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 바이오마커를 포함하여, 이러한 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(들) 및 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 표적 바이오마커 시그니처에 존재하는 이러한 표적 바이오마커(들)는, 본 명세서에 제공된 기술(예를 들어, 본 명세서에 기재된 표적 엔티티 검출 시스템)을 사용하여 검출되는 경우 적어도 15% 또는 그 초과를 포함하는, 적어도 10% 또는 그 초과의 양상 예측 값(positive predictive value: PPV)을 제공한다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처는 적어도 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 초과)의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 초과)의 표면 단백질 바이오마커를 포함하며, 여기서 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(들) 및 표면 단백질 바이오마커(들)는 구별된다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처는 적어도 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 초과)의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것) 및 적어도 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 초과)의 소포내 단백질 바이오마커(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(들) 및 소포내 단백질 바이오마커(들)는 동일한 유전자에 의해 암호화될 수 있는 반면, 전자는 세포외 소포의 막에서 발현되고, 후자는 세포외 소포 내에서 발현된다. 일부 이러한 실시형태에서, 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(들) 및 소포내 단백질 바이오마커(들)는 상이한 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처는 적어도 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 초과)의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 적어도 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 초과)의 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 바이오마커를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(들) 및 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 바이오마커(들)는 동일한 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 일부 이러한 실시형태에서, 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드(들) 및 소포내 RNA(예를 들어, mRNA) 바이오마커(들)는 상이한 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
IV. 표적 바이오마커 시그니처(들)의 예시적인 검출 방법
일반적으로, 본 개시내용은 표적 바이오마커 시그니처가 이를 필요로 하는 대상체로부터의 세포외 소포를 포함하는 혈액-유래 샘플에서 분석 및/또는 평가되고; 일부 실시형태에서, 이러한 분석 및/또는 평가를 기반으로 진단 또는 치료 결정이 이루어진다. 본 개시내용을 읽는 당업자는 본 명세서에 기재된 검출 방법의 다양한 조합이 샘플에서 하나 이상의 표적 바이오마커 시그니처를 검출하는 데 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 벌크 EV 분석과 단일 EV 프로파일링 분석의 조합을 사용하여 샘플에서 하나 이상의 표적 바이오마커 시그니처를 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 것)을 포함하는 단일-EV 프로파일링 분석은 표적 바이오마커 시그니처의 하나 이상의 단백질- 및/또는 핵산-기반 바이오마커를 검출하기 위한 하나 이상의 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)과 조합하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포를 포함하는 샘플은 본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 상이한 검출 기술을 사용하여 단일 샘플에서 표적 바이오마커 시그니처의 복수(예를 들어, 적어도 2개 이상)의 바이오마커의 검출을 허용할 수 있는 복수의 분취물로 분할될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커를 검출하는 방법은 단백질로서 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 마커를 검출하는 방법을 포함할 수 있다. 1조 이상의 마커를 검출하는 예시적인 단백질-기반 방법은 근접 결찰 검정, 질량 분석(MS) 및 면역검정, 예컨대, 면역침전; 웨스턴 블롯; ELISA; 면역조직화학; 면역세포화학; 유세포 분석; 및 면역-PCR을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 면역검정은 화학발광 면역검정일 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역검정은 고속대량처리(high throughput) 및/또는 자동화된 면역검정 플랫폼일 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플에서 단백질로서 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 마커를 검출하는 방법은 샘플을 이러한 1종 이상의 관심대상 마커에 지향되는 1종 이상의 항체 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 또한 이러한 샘플을 1종 이상의 검출 표지와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 1종 이상의 검출 표지로 표지된다.
일부 실시형태에서, 관심대상 바이오마커와 관심대상 바이오마커에 대한 항체 작용제 사이의 결합을 검출하는 것은 하나 이상의 검출 작용제에 대한 흡광도 값 또는 방출 값을 결정하는 것을 포함한다. 예를 들어, 흡광도 값 또는 방출 값은 세포외 소포에 의해 발현되는 관심대상 바이오마커의 양 및/또는 농도를 나타낸다(예를 들어, 더 높은 흡광도는 세포외 소포에 의해 발현되는 관심대상 바이오마커의 더 높은 수준을 나타냄). 일부 실시형태에서, 검출제에 대한 흡광도 값 또는 방출 값은 역치 값 초과이다. 일부 실시형태에서, 검출제에 대한 흡광도 값 또는 방출 값은 역치 값보다 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.5, 적어도 3.0, 적어도 3.5배 또는 그 초과이다. 일부 실시형태에서, 역치 값은 대조군 또는 참조군(예를 들어, 암 검출의 맥락에서 건강한 대상체 또는 비-암 대상체)의 집단에 걸쳐 결정된다.
일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커를 검출하는 방법은 핵산으로서 1종 이상의 마커를 검출하는 방법을 포함할 수 있다. 1종 이상의 마커를 검출하는 예시적인 핵산 기반-방법은 핵산 증폭 방법, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 전사-매개 증폭(TMA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 가닥 치환 증폭(SDA) 및 핵산 서열 기반 증폭(NASBA)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 마커를 검출하는 핵산-기반 방법은 관심대상 바이오마커를 암호화하는 1종 이상의 핵산 프로브와 하나 이상의 뉴클레오타이드 사이의 혼성화를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 프로브는 각각 관심대상 바이오마커를 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드 중 하나의 적어도 일부에 상보적이다. 일부 실시형태에서, 관심대상 바이오마커를 암호화하는 뉴클레오타이드는 DNA(예를 들어, cDNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 관심대상 바이오마커를 암호화하는 뉴클레오타이드는 RNA(예를 들어, mRNA)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커를 검출하는 방법은 근접-결찰-면역 정량적 중합효소 연쇄 반응(pliq-PCR)을 포함할 수 있다. Pliq-PCR은 EV를 프로파일링하기 위한 다른 기술에 비해 특정 이점을 가질 수 있다. 예를 들어, pliq-PCR은 다른 표준 면역검정, 예컨대, ELISA보다 세 자릿수 더 큰 감도를 가질 수 있다(문헌[Darmanis et al., 2010]). 일부 실시형태에서, pliq-PCR 반응은 극도로 낮은 LOD를 갖도록 설계될 수 있으며, 이는 종양-유래 EV를 미량 수준으로, 예를 들어 ㎖당 1000 EV까지 검출할 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커를 검출하는 방법은 예를 들어, 나노플라즈믹 엑소좀(Nanoplasmic Exosome: nPLEX) 센서(문헌[Im et al., 2014]) 및 통합 자성 -전기화학 엑소좀(Integrated Magnetic-Electrochemical Exosome: iMEX) 센서(문헌[Jeong et al., 2016])를 포함할 수 있고, 이것은 각각 약 103 및 내지 약 104개의 EV의 LOD로 보고되어 있다(문헌[Shao et al., 2018] 참고).
일부 실시형태에서, 세포외 소포에서 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커를 검출하는 방법은 벌크 EV 샘플 분석을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포외 소포에서 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커를 검출하는 방법은 개별 EV 프로파일링(예를 들어, 단일-EV 프로파일링 검정)에 기초할 수 있으며, 이는 하기 "개별 세포외 소포(EV)의 프로파일링을 위해 제공된 방법"라는 제목의 섹션에 추가로 논의되어 있다.
일부 실시형태에서, 샘플 중의 세포외 소포는 본 개시내용에 따른 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커를 검출하기 전에 고체 기질 상에 포획되거나 고정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 예를 들어, 흡착을 비롯한 비특이적 상호작용에 의해 고체 기질 표면 상에 포획될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 고체 기질 표면 상에 선택적으로 포획될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 기질 표면은 세포외 소포에 특이적으로 결합하는 작용제(예를 들어, 세포외 소포를 특이적으로 표적화하는 항체 작용제, 예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 암과 연관됨)로 코팅될 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 기질 표면은 친화성 결합 쌍의 구성원으로 코팅될 수 있고, 포획될 관심대상 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)는 친화성 결합 쌍의 상보적 구성원에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 예시적인 친화성 결합 쌍은 예를 들어, 바이오틴 및 아비딘-유사 분자, 예컨대, 스트렙타비딘을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다른 적절한 친화성 결합 쌍이 또한 고체 기질 표면에 대한 관심대상 엔티티의 포획을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 관심대상 엔티티는 예를 들어, 문헌[Ibsen et al. ACS Nano., 11: 6641-6651 (2017) 및 Lewis et al. ACS Nano., 12: 3311-3320 (2018)]에 기재된 바와 같은, 전류의 인가에 의해서 고체 기질 표면 상에서 포획될 수 있고, 이들 둘 다는 비희석된 인간 혈액 또는 혈장 샘플로부터 세포외 소포를 단리시키기 위한 교류 동전기 마이크로어레이 칩 장치의 사용을 기재한다.
고체 기질은 세포외 소포를 포획하기에 적합하고, 하류 취급, 처리 및/또는 검출을 방해하지 않는 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 기질은 비드(예를 들어, 자성 비드)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 기질은 표면일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 표면은 검정 챔버(예를 들어, 튜브, 웰, 마이크로웰, 플레이트, 필터, 막, 매트릭스 등 포함)의 포획 표면일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 샘플에서 제공된 바이오마커를 검출하기 전에, 세포외 소포 고체 기질 상에 포획하거나 고정시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플은 고체 기질 표면 상에서 세포외 소포를 포획하기 전에, 예를 들어, 목적하지 않은 엔티티, 예컨대, 세포 파편 또는 세포를 제거하기 위해서, 처리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 샘플은 원심분리를 거쳐, 예를 들어, 세포 파편, 세포 및/또는 다른 미립자를 제거할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 일부 실시형태에서 이러한 샘플은 크기 배제 기반 정제 또는 여과에 적용될 수 있다. 다양한 크기 배제 기반 정제 또는 여과가 당업계에 공지되어 있으며, 당업자는 일부 경우에 샘플이 특정 분자량 또는 입자 크기 컷오프를 기반으로 하는 스핀 칼럼 정제에 적용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 당업자는 또한 정제 목적을 위한 적절한 분자량 또는 입자 크기 컷오프가, 예를 들어, 세포외 소포의 크기에 기초하여 선택될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 크기-배제 분리 방법은 특정 크기(예를 들어, 30㎚ 초과 내지 1000㎚ 이하 또는 70㎚ 초과 내지 200㎚ 이하)인 세포외 소포의 분획을 단리시키기 위해 세포외 소포를 포함하는 샘플에 적용될 수 있다. 전형적으로, 세포외 소포는 30㎚ 내지 수 마이크로미터의 직경 범위일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chuo et al., "Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods" Journal of Biomedical Sciences 25: 91 (2018)]을 참고하기 바라며, 이것은 상이한 세포외 소포(EV) 하위유형에 대한 크기의 정보를 제공한다: 마이그래좀(migrasome)(0.5 내지 3pm), 마이크로소포(0.1 내지 1pm), 온코좀(oncosome)(1 내지 10pm), 엑소머(exomere)(50㎚ 미만), 작은 엑소좀(60 내지 80㎚) 및 큰 엑소좀(90 내지 120㎚). 일부 실시형태에서, 크기-배제 분리 방법은 특정 EV 하위유형(들)을 단리시키기 위해서 세포외 소포를 포함하는 샘플에 적용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플 중의 세포외 소포는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커를 검출하기 전에 가공될 수 있다. 예를 들어, 검출될 세포외 소포 중에서 표적(예를 들어, 표적 바이오마커)을 안정화시키기 위해서 그리고/또는 검출 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)에 대한 표적(예를 들어, 소포내 단백질 및/또는 RNA, 예컨대, mRNA)의 노출을 용이하게 하기 위해서 그리고/또는 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서, 상이한 샘플 가공 및/또는 준비가 수행될 수 있다. 이러한 샘플 처리 및/또는 준비의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 분자 표적의 가교(예를 들어, 고정), 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포 또는 세포외 소포)의 투과화 및/또는 비특이적 결합 부위의 차단을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일 양상에서, 본 개시내용은 일부 실시형태에서 세포외 소포를 포함하는 혈액-유래 샘플일 수 있는, 검출을 필요로 하는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암의 표적 바이오마커 시그니처가 존재하는지 존재하지 않는지를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 (a) 대상체로부터의 생물학적 샘플, 예컨대, 혈액-유래 샘플(예를 들어, 혈장 샘플)에서 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암의 표적 바이오마커 시그니처를 발현하는 관심대상 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포 포함)를 검출하는 단계; 및 (b) 생물학적 샘플(예를 들어, 혈액-유래 샘플)에서 관심대상 표적 바이오마커 시그니처-발현 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)의 수준을 나타내는 샘플 정보를 참조 역치 수준을 포함하는 참조 정보와 비교하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 참조 역치 수준은 참조 대상체, 예를 들어, 비-암 대상체의 집단으로부터의 대등한 샘플에서 이러한 표적 바이오마커 시그니처를 발현하는 관심대상 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)의 수준에 상응한다. 일부 실시형태에서, 예시적인 비-암 대상체는 건강한 대상체 (예를 들어, 특정 연령 범위의 건강한 대상체, 예를 들어, 20 내지 30세, 또는 30 내지 40세, 또는 40 내지 50세, 또는 50 내지 60세, 또는 60 내지 70세 또는 70세 초과 또는 그 초과), 비-암 관련 건강 질환, 장애 또는 병태가 있는 대상체(예를 들어, 염증성 장 질환 또는 장애의 증상을 갖는 대상체 포함), 양성 종양 또는 종괴를 갖는 대상체, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플은, 그것이 참조 역치 수준(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)에 비해 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 상승된 수준을 나타낼 때 표적 바이오마커 시그니처(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)를 발현하는 세포외 소포를 갖는 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 이의 수준이 예를 들어, 참조 역치 수준과 비교하여 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 초과를 포함하여, 적어도 30% 또는 그 초과인 경우 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포에 대해서 양성인 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 이의 수준이 예를 들어, 참조 역치 수준과 비교하여 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 750배, 적어도 1000배, 적어도 2500배, 적어도 5000배 또는 그 초과를 포함하여, 적어도 2배 또는 그 초과인 경우표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포에 대해서 양성인 것으로 결정된다.
일부 실시형태에서, 샘플이 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포에 대해 양성인지 여부를 결정하기 위해 이원 분류 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 샘플의 수준이 참조 역치 수준, 예를 들어, 컷오프 값 이상인 경우 샘플은 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포에 대해 양성인 것으로 결정된다. 일부 실시형태에서, 이러한 참조 역치 수준(예를 들어, 컷오프 값)은, 예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 예컨대, 특정 암의 유병률에 기초하여, 관심대상 특이성(예를 들어, 적어도 95% 또는 그 초과의 특이성[예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 특이성 포함], 예컨대, 일부 실시형태에서 적어도 99.8% 특이성)을 달성하는 데 필요한 표준 편차(SD)의 수(예를 들어, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2, 적어도 2.1, 적어도 2.2, 적어도 2.3, 적어도 2.4, 적어도 2.5, 적어도 2.6, 적어도 2.7, 적어도 2.8, 적어도 2.9, 적어도 3, 적어도 3.1, 적어도 3.2, 적어도 3.3, 적어도 3.4, 적어도 3.5, 적어도 3.6 또는 그 초과의 SD)의 선택 및 건강한 대상체(예를 들어, 특정 연령 범위) 주변의 로그-정류 분포에 기초하여 결정될 수 있다.
본 개시내용은, 다른 것 중에서, 대상체가 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암을 갖거나 이에 민감한지를 결정하기 위한 기술을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체로부터의 혈액-유래 샘플이 참조 역치 수준, 예를 들어, 컷오프 값 이상인 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 수준을 나타내는 경우, 이 대상체는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암을 갖거나 이에 민감한 것으로 분류된다. 일부 이러한 실시형태에서, 참조 역치 수준(예를 들어, 컷오프 값)은, 예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 예컨대, 특정 암의 유병률에 기초하여, 관심대상 특이성(예를 들어, 적어도 95% 또는 그 초과의 특이성[예를 들어, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 특이성 포함], 예컨대, 일부 실시형태에서 적어도 99.8% 특이성)을 달성하는 데 필요한 표준 편차(SD)의 수(예를 들어, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2, 적어도 2.1, 적어도 2.2, 적어도 2.3, 적어도 2.4, 적어도 2.5, 적어도 2.6, 적어도 2.7, 적어도 2.8, 적어도 2.9, 적어도 3, 적어도 3.1, 적어도 3.2, 적어도 3.3, 적어도 3.4, 적어도 3.5, 적어도 3.6 또는 그 초과의 SD)의 선택 및 건강한 대상체(예를 들어, 특정 연령 범위) 주변의 로그-정류 분포에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체로부터의 혈액-유래 샘플이 참조 역치 수준에 비해서 증가된 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 수준을 나타내는 경우, 이 대상체는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암을 갖거나 이에 민감한 것으로 분류된다. 일부 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체는, 이러한 대상체의 혈액-유래 샘플이 참조 역치 수준과 비교할 때 예를 들어, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 초과를 포함하여 적어도 30% 또는 그 초과인 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 수준을 나타내는 경우 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암을 갖거나 이에 민감한 것으로 분류된다. 일부 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체는, 이러한 대상체의 혈액-유래 샘플이 참조 역치 수준과 비교할 때 예를 들어, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 적어도 250배, 적어도 500배, 적어도 750배, 적어도 1000배 또는 그 초과를 포함하여, 적어도 2배 또는 그 초과인 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 수준을 나타내는 경우, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암을 갖거나 이에 민감한 것으로 분류된다. 이를 필요로 하는 대상체로부터의 혈액-유래 샘플이 참조 역치 수준과 대등한 수준(예를 들어, 10 내지 20% 이내)을 나타내는 경우, 대상체는 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어 암을 가질 가능성이 없거나, 이에 민감할 가능성이 없는 것으로 분류된다. 일부 이러한 실시형태에서, 참조 역치 수준은 참조 대상체, 예를 들어, 비-암 대상체의 집단으로부터의 대등한 샘플에서 표적 바이오마커 시그니처를 발현하는 예를 들어, 세포외 소포의 수준에 상응한다. 일부 실시형태에서, 예시적인 비-암 대상체는 건강한 대상체 (예를 들어, 특정 연령 범위, 예를 들어, 20세 미만(예를 들어, 유아 포함), 예를 들어, 20 내지 30세, 또는 30 내지 40세, 또는 40 내지 50세, 또는 50 내지 60세, 또는 60 내지 70세 또는 70세 초과 또는 그 초과), 비-암 관련 건강 질환, 장애 또는 병태가 있는 대상체(예를 들어, 염증성 장 질환 또는 장애의 증상을 갖는 대상체 포함), 양성 종양 또는 종괴를 갖는 대상체, 및 이들의 조합물을 포함한다.
V. 개별 세포외 소포(EV)를 프로파일링하기 위한 제공된 방법
일부 실시형태에서, 개별 세포외 소포를 프로파일링하기 위한 검정(예를 들어, 단일 EV 프로파일링 검정)을 사용하여 1종 이상의 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 1종 이상의 표적 바이오마커 시그니처를 검출할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 검정은 (i) 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 마커의 표적화를 통한 포획 검정 및 (ii) 이러한 표적 바이오마커 시그니처의 적어도 1종 이상의 추가로 제공된 마커에 대한 1종 이상의 검출 검정을 포함할 수 있고, 여기서 이러한 포획 검정은 이러한 검출 검정 전에 수행된다.
일부 실시형태에서, 포획 검정은 이를 필요로 하는 대상체의 혈액 또는 혈액-유래 샘플(예를 들어, 혈장 샘플)로부터 세포외 소포체를 선택적으로 포획하기 위해 수행된다. 일부 실시형태에서, 포획 검정은 특정 크기 범위 및/또는 특정 특징(들)의 세포외 소포, 예를 들어, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)와 연관된 세포외 소포를 선택적으로 포획하기 위해 수행된다. 이러한 일부 실시형태에서, 포획 검정 이전에, 혈액 또는 혈액-유래 샘플은 예를 들어, 가용성 단백질 및 간섭 엔티티, 예를 들어, 세포 파편을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비-세포외 소포를 제거하기 위해 전처리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 대상체의 혈액 또는 혈액-유래 샘플로부터 정제된다. 이러한 일부 실시형태에서, 세포외 소포는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 혈액 또는 혈액-유래 샘플로부터 직접 정제될 수 있으며, 이는 일부 실시형태에서 가용성 단백질 및 다른 간섭제, 예를 들어, 세포 파편의 적어도 90% 또는 그 초과(예를 들어, 적어도 93%, 95%, 97%, 99% 또는 그 초과 포함)를 제거할 수 있다.
일부 실시형태에서, 포획 검정은 혈액 또는 혈액-유래 샘플을 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 적어도 하나의 바이오마커에 결합하는 표적-포획 모이어티를 포함하는 적어도 1종의 포획제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 검정은 멀티플렉싱될 수 있으며, 이것은 혈액 또는 혈액-유래 샘플을 포획제의 세트와 접촉시키는 단계를 포함하고, 각각의 포획제는 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 구별되는 바이오마커에 결합하는 표적-포획 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적-포획 모이어티는 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향된다.
일부 실시형태에서, 이러한 표적-포획 모이어티는 고체 기질 상에 고정될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 포획 검정에 사용되는 포획제는 이에 접합된 적어도 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과)의 표적-포획 모이어티를 포함하는 고체 기질이거나 이를 포함하며, 각각의 표적-포획 모이어티는 세포외 소포-연관 막-결합 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같은 것)에 지향된다. 고체 기질은 세포외 소포를 포획하기에 적합하고, 하류 취급, 처리 및/또는 검출을 방해하지 않는 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 고체 기질은 비드(예를 들어, 자성 비드)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 기질은 표면일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 이러한 표면은 검정 챔버(예를 들어, 튜브, 웰, 마이크로웰, 플레이트, 필터, 막, 매트릭스 등 포함)의 포획 표면일 수 있다. 일부 실시형태에서, 포획제는 이에 접합된 표적-포획 모이어티를 포함하는 자성 비드이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 검출 검정은 포획 검정(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같음)에 의해서 포획된 세포외 소포에서 표적 바이오마커 시그니처(예를 들어, 포획 검정에서 표적화된 것과 상이한 것)의 1종 이상의 바이오마커를 검출하도록 수행된다. 일부 실시형태에서, 검출 검정은 면역-PCR을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역-PCR은 표적 바이오마커 시그니처의 단일 바이오마커를 표적화하는 적어도 하나의 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역-PCR은 표적 바이오마커 시그니처의 동일한 바이오마커의 상이한 에피토프에 지향되는 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 그 초과)의 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역-PCR은 각각 표적 바이오마커 시그니처의 상이한 바이오마커에 지향되는 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 그 초과)의 프로브를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 검정은 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RT-PCR은 표적 바이오마커 시그니처의 단일 바이오마커를 표적화하는 적어도 하나의 프라이머/프로브 세트를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RT-PCR은 각각의 세트가 표적 바이오마커 시그니처의 상이한 바이오마커에 지향되는 복수(예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 그 초과)의 프라이머/프로브 세트를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 검정은 예를 들어, 세포외 소포(예를 들어, 적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드를 발현하는 포획된 세포외 소포) 내의 표적 바이오마커 시그니처의 바이오마커 단백질의 공동-국지화를 결정하기 위한, 근접-결찰-면역 정량적 중합효소 연쇄 반응(pliq-PCR)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 검출 검정은 개별 세포외 소포 내의 표적 바이오마커 시그니처의 상호작용 및/또는 공동 국지화에 부분적으로 기초한 본 명세서에 기재된("제공된 표적 개체 검출 시스템"이라는 제목의 섹션에 기재된 바와 같음) 표적 엔티티 검출 시스템을 사용한다. 예를 들어, 이러한 표적 엔티티 검출 시스템은 샘플에서(예를 들어, 생물학적, 환경적 또는 다른 샘플에서), 일부 실시형태에서 단일 엔티티 수준에서, 적어도 1종 이상(예를 들어, 적어도 2종 이상 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 관심대상 생물학적 또는 화학적 엔티티, 예컨대, 세포외 소포 또는 분석물)를 검출할 수 있다. 본 개시내용을 읽는 당업자는 제공된 표적 엔티티 검출 시스템이 예를 들어, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)를 검출하기 위한 것을 포함하여, 광범위한 응용 및/또는 목적에 유용하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 의학적 적용 및/또는 목적에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 질환 또는 병태(예를 들어, 암)에 대해 개체(예를 들어, 무증상 개체)를 스크리닝(예를 들어, 정기적으로 스크리닝)하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 상이한 유형의 암에 대해 개체(예를 들어, 무증상 개체)를 스크리닝(예를 들어, 정기적으로 스크리닝)하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 표적 엔티티 검출 시스템은 (예를 들어, 충분히 높은 감도 및/또는 낮은 비율의 위양성 및/또는 위음성 결과로 인해서) 무증상 개체를 포함하거나 이것으로 이루어진 집단에 적용되는 경우에도 효과적이다. 일부 실시형태에서, 제공된 표적 개체 검출 시스템은 질환 치료(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암의 치료)와 함께 동반 진단으로서 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수(예를 들어, 적어도 2종 이상)의 검출 검정은 세포외 소포, 예를 들어, 포획 검정(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같음)에 의해서 포획된 것에서 1종 이상의 표적 바이오마커 시그니처(예를 들어, 포획 검정에서 표적화된 것과 상이한 것)의 복수의 바이오마커(예를 들어, 적어도 2종 이상)를 검출하도록 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 검출 검정은 (i) 제공된 표적 엔티티 검출 시스템 또는 본 명세서에 기재된 시스템(예를 들어, "제공된 표적 개체 검출 시스템"이라는 제목의 섹션에 기재된 바와 같음); 및 (ii) 면역-PCR을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 복수의 검출 검정은 (i) 제공된 표적 엔티티 검출 시스템 또는 본 명세서에 기재된 시스템(예를 들어, "제공된 표적 개체 검출 시스템"이라는 제목의 섹션에 기재된 바와 같음); 및 (ii) RT-PCR을 포함할 수 있다.
VI. 용도
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 검정될 생물학적 엔티티를 포함하는 관심대상 샘플에 적용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 기술은 표적의 조합물(예를 들어, 세트)의 존재 또는 부재에 대해 샘플을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 제공된 기술은 다양한 연구 및/또는 의료 응용 분야에서 사용될 수 있다. 이러한 적용의 예는 복합체 내 분자(예를 들어, 단백질, 전사 인자 및/또는 핵산 분자)의 상호작용 연구, 특정 질환 또는 병태에 대한 환자 스크리닝, 질환 또는 병태의 재발 및/또는 진행의 모니터링, 질환 또는 병태를 앓고 있는 환자를 위한 요법의 선택 및/또는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된 치료의 효능 평가 및/또는 모니터링을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 기술에 의해서 검출되거나 스크리닝될 수 있는 질환의 예는 자가면역 질환, 염증성 질환, 골 질환, 대사 질환, 신경계 및 신경퇴행성 질환, 암, 심혈관 질환, 알레르기 및 천식, 알츠하이머병 및 호르몬 관련 질환을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 1종 이상의 표적 바이오마커 시그니처는 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출 및/또는 검정을 사용하여 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포, 순환 종양 세포, 무세포 DNA, 세포외 소포 등 포함)를 포함하는 샘플에서 검출될 수 있다. 일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 1종 이상의 표적 바이오마커 시그니처는 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출 및/또는 검정을 사용하여 세포외 소포를 포함하는 샘플에서 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, 샘플은 생물학적 샘플일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 이러한 검정을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)의 혈액 또는 혈액-유래 샘플로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 이러한 검정을 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 대상체)로부터의 1차 샘플(예를 들어, 조직 또는 종양 샘플)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 관심대상 비-표적 엔티티로부터 하나 이상의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 분리시키고/시키거나 하나 이상의 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 농축시키도록 가공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플에 존재하는 관심대상 엔티티는 생물학적 엔티티, 예를 들어, 세포 또는 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)는 예를 들어, 생물학적 앤티티에서 검정될 표적(예를 들어, 제공된 표적 바이오마커)을 안정화시키고/시키거나 가교시키고/시키거나 검출 프로브와의 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서 화학 시약으로 처리되거나 화학 시약과 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 예를 들어, 표적(예를 들어, 분자 표적)을 안정화시키고/시키거나 가교시키고/시키거나 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서 화학 시약으로 선택적으로 처리될 수 있는 세포이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 엔티티는 예를 들어, 표적(예를 들어, 분자 표적)을 안정화시키고/시키거나 가교시키고/시키거나 비-특이적 결합을 감소시키기 위해서 화학 시약으로 선택적으로 처리될 수 있는 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)이거나 이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 예를 들어, 1명 이상의 개별 대상체에 대해서 그리고/또는 대상체의 집단에 걸쳐서 환자 케어를 관리하기에 유용할 수 있다. 단지 예의 방식으로, 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어, 년 기준, 반년 기준, 격년 기준으로 또는 당업자가 적절하다고 간주하는 다른 빈도로 주기적으로 수행될 수 있는 스크리닝에 이용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 스크리닝은 일시적으로 동기부여되거나 우발적으로 동기부여될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 특정 연령보다 더 나이가 많은(예를 들어, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80세 또는 그 초과) 1명 이상의 개별 대상체에서 또는 대상체의 집단(예를 들어, 무증상 대상체)을 일시적으로 동기부여된 스크리닝하기 위해서 이용될 수 있다. 당업자가 인식할 바와 같이, 일부 실시형태에서, 스크리닝 연령 및/또는 빈도는 예를 들어, 비제한적으로 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 유병률에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 스크리닝을 동기부여하는 사고 또는 사건을 경험할 수 있는 개별 대상체를 우발적으로 동기부여된 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 하나 이상의 지표 또는 이에 대한 감수성의 결정과 관련된 부수적인 동기부여는 예를 들어, 가족력에 기초한 사건(예를 들어, 혈액 관련 친척과 같은 가까운 친척이 이전에 질환, 장애 또는 병태, 예컨대 암 진단을 받은 적이 있음), 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 하나 이상의 위험 요소의 식별 및/또는 유전자 시험(예를 들어, 게놈 서열결정) 및/또는 영상 진단 시험(예를 들어, 초음파, 컴퓨터 단층촬영(CT) 및/또는 자기 공명 영상(MRI) 스캔)으로부터의 사전 부수적인 소견, 특정 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 특징적인 하나 이상의 징후 또는 증상의 발생(예를 들어, 잠재적으로 폐암을 나타내는 지속적인 기침; 잠재적으로 유방암을 나타내는 유방 조직의 종괴; 위장(GI)암을 잠재적으로 나타내는 위장(GI)관 출혈; 잠재적으로 난소암을 나타내는 여성 기간 동안의 비정상적인 출혈 등) 및/또는 당업자에게 인지될 바와 같은 다른 사고 또는 사건일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 환자 케어를 관리하기 위한 제공된 기술은 치료 및/또는 지불(예를 들어, 치료에 대한 지원) 결정 및/또는 조치를 알릴 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 개별 대상체가 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 위험, 발생 또는 재발의 하나 이상의 지표를 갖고 있는지의 여부에 대한 결정을 제공할 수 있으며, 이에 따라 이러한 소견에 비추어 치료적 또는 예방적 권고를 제공하고/제공받을 시기 및/또는 이러한 요법을 시작해야 하는 시기를 의사 및/또는 환자에게 알릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 개별 대상체는 무증상 대상체일 수 있으며, 이들은 정기적인 빈도(예를 들어, 년 기준, 반년 기준, 격년 기준으로 또는 당업자가 적절하다고 간주하는 다른 빈도)로 일시적으로 동기부여되거나 우발적으로 동기부여된 스크리닝이 수행될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어, 특정 반응성 바이오마커(예를 들어, 암 반응성 바이오마커)의 소견에 기초하여 치료 선택을 의사 및/또는 환자에게 알릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어, 질환과 연관된 분자 표적의 하나 이상의 수준에서의 변화의 소견에 기초하여, 개별 대상체가 현재 치료에 반응하는지의 여부에 대한 결정을 제공할 수 있으며, 이에 의해서 의사 및/또는 환자에게 이러한 요법의 효능 및/또는 이러한 소견에 비추어 요법을 유지하거나 변경하도록 하는 결정을 알릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 기술은 예를 들어, 개별 대상체에 대한 권고된 치료의 치료적 효과를 예측하는 분자 표적(예를 들어, 질환, 장애 또는 병태에 대한 표적 바이오마커 시그니처)의 소견에 기초하여, 개별 대상체가 제안된 치료에 반응성일 가능성이 있는지의 여부에 대한 결정을 제공할 수 있으며, 이에 의해서 의사 및/또는 환자에게 이러한 요법의 잠재적인 효능 및/또는 이러한 소견에 비추어 요법을 투여하거나 변경하도록 하는 결정을 알릴 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 기술은 건강 보험 제공자가 예를 들어, (1) 자체적으로 스크리닝(예를 들어, 주기적인/정기적인 스크리닝에 대해서만 이용 가능하거나 일시적 및/또는 우발적으로 동기부여된 스크리닝에 대해서만 이용 가능한 지원)하고/하거나; (2) 제공된 기술에 의한 소견에 비추어 치료를 시작하고/하거나, 유지하고/하거나 변경하는 것에 대해서 지원할 것인 지(지원하지 않을 것은 지)에 관련하여 결정하도록 할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 제공된 기술을 사용하는 스크리닝의 결과를 제공받고, 또한 스크리닝 및/또는 특정 치료 요법의 지원에 대한 요청을 제공받는 것; (b) 적절한 일정(예를 들어, 스크리닝 연령, 예컨대, 특정 연령을 초과하는 연령, 예를 들어, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80세 또는 그 초과의 연령 또는 스크리닝 빈도, 예컨대, 3개월마다, 6개월마다, 매년, 2년마다, 3년마다 또는 일부 다른 빈도에 기초하여) 또는 관련 사건에 대한 반응에 따라 대상체에 대해 수행된 경우 스크리닝의 지원을 승인하고/하거나 제공받은 스크리닝 결과에 비추어 적절한 치료를 나타내는 경우 치료 요법의 지원을 승인하는 것; 및 선택적으로 (c) 지원을 구현하거나 지원이 거부되었다는 통지를 제공하는 것에 관련된 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제공받은 스크리닝 결과가 관련 치료 요법에 대해 승인된 바이오마커를 나타내는 바이오마커를 검출하는 경우(예를 들어, 처방 정보 라벨에 그리고/또는 승인된 동반 진단을 통해서 주목될 수 있는 바와 같음) 제공받은 스크리닝 결과에 비추어 치료 요법이 적절하다.
대안적으로 또는 추가로, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 스크리닝 결과(예를 들어, 본 개시내용에 따라서 생성되는 바와 같음) 및/또는 지원 결정의 보고 및/또는 처리를 허용하거나 촉진하는 보고 시스템(예를 들어, 적절한 전자 장치(들) 및/또는 통신 시스템(들)을 통해 구현됨)을 고려한다. 다양한 보고 시스템이 당업계에 공지되어 있고; 당업자는 이러한 다양한 실시형태에 상당히 친숙할 것이며, 구현에 적합한 것을 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
예시적인 사용
A. 암 발생 또는 재발의 검출
본 개시내용은, 다른 것 중에서, 단일 생물학적 엔티티(예를 들어, 개별 세포외 소포)의 분해능이 아닌, 벌크 샘플에 기반한 복수의 암-연관된 바이오마커 또는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포) 내의 단일 암-연관된 바이오마커의 검출이 전형적으로 생물학적 엔티티가 얻어진 대상체가 암을 앓고 있거나 암에 민감할 가능성이 있는지를 결정하는 데 있어서 충분한 특이성 및/또는 감도를 제공하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본 개시내용은, 다른 것 중에서, 예를 들어, 검출을 위한 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)가 표적의 조합물의 존재를 특징으로 하도록 구체적으로 요구함으로써, 이러한 문제를 해결하는 조성물 및/또는 방법을 포함하는 기술을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 적어도 2종 이상의 표적의 조합 물에 존재 하에서 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)의 특징규명에 유용하다. 예를 들어, 일부 이러한 실시형태에서, 제공된 표적 엔티티 검출 시스템을 포함하는 적어도 2종 이상의 표적이 검출될 수 있다. 대안적으로, 이러한 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 표적은 포획 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)에 의해 검출될 수 있는 반면, 적어도 하나의 또 다른 표적은 예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 예를 들어, 표적 엔티티 검출 시스템을 포함하는 검출 검정에 의해서 검출될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 이러한 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)가 암에 특이적인 분자 표적의 조합물(즉, 관련 암, 예를 들어, 암의 "표적 바이오마커 시그니처")의 존재(예를 들어, 발현)를 특징으로 하는 반면, 표적화 조합물(예를 들어, 표적 바이오마커 시그니처)을 포함하지 않는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)는 검출 가능한 신호를 생성시키지 않을 것을 요구하는 기술을 교시한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체에서 암의 위험, 발생 및/또는 재발의 검출에 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 적어도 1종 이상의 표적(예를 들어, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종, 적어도 9종, 적어도 10종, 적어도 15종, 적어도 20종 또는 그 초과의 표적)에 지향되는 2종 이상의 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)의 조합물이 특정 암 또는 다양한 암의 검출을 위해서 선택된다. 일부 실시형태에서, 암(들)의 검출을 위한 표적 바이오마커 시그니처의 적어도 1종 이상의 표적(예를 들어, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종, 적어도 6종, 적어도 7종, 적어도 8종, 적어도 9종, 적어도 10종, 적어도 15종, 적어도 20종 또는 그 초과의 표적)에 지향되는 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)의 특정 조합물이 이러한 예측 조합물을 식별하기 위해서 암 환자 생검 및/또는 환자 데이터의 집단 또는 라이브러리(예를 들어, 수 십, 수 백, 수 천, 수 만, 수 십만 또는 그 초과)를 분석함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 관련 바이오마커의 조합물은 예를 들어, 데이터 분석을 통해 식별 및/또는 특징규명된 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 다양한 암-연관된 데이터의 세트(예를 들어, 일부 실시형태에서 벌크 RNA 서열결정, 단일 세포 RNA(scRNA) 서열결정, 질량 분석, 조직학, 번역후 변형 데이터, 시험관 내 및 /또는 생체내 실험 데이터 중 하나 이상을 포함함)는 기계 학습 및/또는 컴퓨터 모델링을 통해 분석되어 암에 매우 특이적인 예측 마커의 조합물을 식별할 수 있다. 일부 실시형태에서, 암의 병기를 구별하기 위한 예측 마커의 조합은 암의 상이한 병기에 관련된 광범위한 데이터(예를 들어, 일부 실시형태에서 벌크 RNA 서열결정, scRNA 서열결정, 질량 분광법, 조직학, 번역후 변형 데이터, 시험관내 및/또는 생체내 실험 데이터 포함)의 비교 및 분석에 기초하여 인 실리코로 결정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 예를 들어, 건강한 대상체, 양성 종양 또는 종괴로 진단된 대상체 및 비-암-관련 질환, 장애 및/또는 병태를 갖는 대상체(예를 들어, 염증성 장 질환 또는 장애를 갖는 대상체)를 비롯한, 비-암 대상체로부터 암 대상체를 구별하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 암의 조기 검출, 예를 들어, I기 또는 II기의 암의 검출에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 흑색종 병기 I, II, III 및 IV를 서로 그리고 건강한 환자와 구별하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 폐 선암종 I, II, III 및 IV기를 서로 및 건강한 환자와 구별하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 결장직장암 I, II, III 및 IV기를 서로 및 건강한 환자와 구별하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 난소암 I, II, III 및 IV기를 서로 및 건강한 환자와 구별하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 하나 이상의 암 하위유형의 검출에 유용할 수 있다. 단지 예로서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 예를 들어, 고 등급 장액성 난소암, 자궁내막양(endometrioid) 난소암, 투명 세포 난소암, 저 등급 장액성 난소암 또는 점액성 난소암을 비롯한 하나 이상의 난소암 하위유형의 검출에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 조기 암에 대한 유전적 위험 또는 평균 위험이 있는 대상체를 스크리닝하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체를 단일 검정에서 특정 암의 위험, 발생 및/또는 재발에 대해서 스크리닝하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체를 유방암의 위험, 발생 및/또는 재발에 대해서 스크리닝하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체를 폐암(예를 들어, 비제한적으로 비소세포 폐암)의 위험, 발생 및/또는 재발에 대해서 스크리닝하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 피부암(예를 들어, 비제한적으로 흑색종)의 위험, 발생 또는 재발에 대해서 스크리닝하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체를 난소암의 위험, 발생 및/또는 재발에 대해서 스크리닝하는 데 유용하다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체를 단일 검정에서 특정 암 또는 복수의(예를 들어, 적어도 2, 적어도 3종 또는 그 초과의) 암의 위험 또는 발생에 대해서 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 대상체를 단일 검정에서 복수의 암에 대해서 스크리닝하는 데 사용될 수 있고, 여기서 일부 실시형태에서, 스크리닝될 암은 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암(예를 들어, 교모세포종), 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제공된 기술은 암(예를 들어, 초기 병기의 암) 또는 암 재발에 대해 인간 대상체를 스크리닝하기 위해 주기적으로(예를 들어, 매년, 2년마다, 3년마다 등) 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 스크리닝이 가능한 인간 대상은 유아, 어린이, 성인 또는 노인 개체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 스크리닝이 가능한 인간 대상체는 약 2세 내지 80세, 또는 약 12세 내지 약 70세, 또는 약 18세 내지 약 65세의 연령을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 스크리닝이 가능한 인간 대상체는 예를 들어, 65세 초과, 70세 초과, 75세 초과, 80세 초과 또는 그 초과의 노인 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 스크리닝이 가능한 인간 대상체는 약 50세 초과의 연령을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 스크리닝이 가능한 인간 대상체는 50세 이하의 연령을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 스크리닝이 가능한 인간 대상체는 35세 초과의 연령을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 암의 발생 또는 재발의 검출을 위해서 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체는 무증상 인간 대상체 및/또는 무증상 집단일 수 있다. 이러한 무증상 대상체 및/또는 증상이 있는 집단은 암의 가족력(예를 들어, 암의 가족력을 갖는 1명 이상의 1촌 친척을 갖는 대상체)을 갖고/갖거나 암에 대해서 이전에 치료된 적이 있고/있거나 암 치료 후에 암 재발의 위험이 있고/있거나 암 치료 후에 관해 중이고/이거나 예를 들어, 적어도 1종의 암 바이오마커의 존재에 대해서 스크리닝함으로써 암에 대해서 이전에 또는 주기적으로 스크리닝된 적이 있는 대상체(들)일 수 있다. 대안적으로, 일부 실시형태에서, 무증상 대상체는 암에 대해서 이전에 스크리닝된 적이 없고/없거나 암에 대해서 진단된 적이 없고/없거나 이전에 암 요법을 제공받은 적이 없는 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 무증상 대상체는 양성 종양 또는 조직 종괴를 갖는 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 무증상 대상체는 암에 민감한 대상체일 수 있다(예를 들어, 평균 집단 위험에서 또는 암에 대한 유전적인 위험을 가짐).
일부 실시형태에서, 암의 검출에 대해서 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체 또는 대상체의 집단은 하나 이상의 특징, 예컨대, 연령, 인종, 유전력, 병력, 개인 이력(예를 들어, 흡연, 알코올, 약물, 발암 물질, 식이, 비만, 신체 활동, 태양 노출, 방사선 노출, 바이러스와 같은 감염원에 대한 노출 및/또는 직업상 위험)에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 암의 검출을 위해 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체 또는 대상체의 집단은 대상체(예를 들어, 인간 대상체) 또는 예를 들어, 비제한적으로 BRCA1, BRCA2 및 TP53 및 이들의 조합물을 비롯한, 하나 이상의 암-연관된 유전자에서의 하나 이상의 생식세포계열 돌연변이를 갖는 것으로 결정된 대상체의 집단일 수 있다.
일부 실시형태에서, 암의 검출을 위해 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체 또는 대상체의 집단은 영상-확인 조직 종괴로 진단된 대상체 또는 대상체의 집단일 수 있다.
일부 실시형태에서, 암의 검출을 위해 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체 또는 대상체의 집단은 위험-감소 외과적 개입을 받기 전에 암에 대한 유전적 위험이 있는 대상체 또는 대상체의 집단일 수 있다.
일부 실시형태에서, 암의 검출을 위해 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체 또는 대상체의 집단은 암의 하나 이상의 비특이적 증상을 갖는 대상체 또는 대상체의 집단일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암의 예시적인 비특이적 증상은 예를 들어, 기침, 연하 곤란, 피로, 식욕 상실, 복통, 체중 감소 등을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 암의 검출을 위해 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체 또는 대상체의 집단은 아시아인, 아프리카계 미국인, 백인, 하와이 원주민 또는 다른 태평양 제도인, 히스패닉계 또는 라틴계, 아메리칸 인디언 또는 알래스카 원주민, 비히스패닉계 흑인 또는 비히스패닉계 백인의 대상체 또는 대상체 집단일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암의 검출을 위해 제공된 기술에 적용될 수 있는 대상체 또는 대상체의 집단은 임의의 인종 및/또는 임의의 민족의 대상체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 예를 들어, (i) 개체의 연간 신체 검사, (ii) 순환 종양 DNA 및/또는 암과 관련된 단백질 바이오마커에서의 유전자 돌연변이에 대해 혈장을 스크리닝하기 위한 유전자 검정; (iii) 세포 표현형 및 마커 발현을 식별하기 위한 면역형광 염색을 포함하는 검정, 그 다음 차세대 서열결정에 의한 증폭 및 분석; 및 (iv) 생식세포계열 및 체세포 돌연변이 검정(예를 들어, BRCA1 및/또는 BRCA2) 또는 무세포 종양 DNA, 액체 생검, 혈청 단백질 및 무세포 DNA 및/또는 순환 종양 세포를 포함하는 검정을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다른 진단 검정과 조합하여 사용될 수 있다.
B. 요법(예를 들어, 암 요법)의 선택
일부 실시형태에서, 제공된 기술은 환자(예를 들어, 암을 앓고 있거나 암에 민감한 환자)에 대한 적절한 치료를 선택하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 일부 실시형태는 본 명세서에 제공된 기술을 사용하여 계층화 및/또는 반응성 바이오마커의 선택된 조합의 환자 샘플(예를 들어, 환자, 예를 들어, 암 환자로부터의 혈액 또는 혈액-유래 샘플)에서의 평가를 포함하는 요법에 대한 환자의 분류를 위한 동반 진단 검정에 관한 것이다. 이러한 검정 결과에 기초하여, 요법(예를 들어, 암 요법 및/또는 부가 요법)에 반응할 가능성이 더 높은 것으로 결정된 환자는 이러한 요법이 투여될 수 있거나, 또는 특정 이러한 요법에 비반응성인 것으로 결정된 환자는 상이한 요법이 투여될 수 있다.
C. 치료 효능(예를 들어, 암 치료 효능)의 평가
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 기술은 환자(예를 들어, 암 환자)에게 투여되는 요법의 효능을 모니터링 및/또는 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈액 또는 혈액-유래 샘플을 첫 번째 시점에서 요법(예를 들어, 항암 요법)을 제공받기 전에 또는 제공받고 있는 환자(예를 들어, 암 환자)로부터 수집하여 환자의 질환, 장애 또는 병태에 특이적인 바이오마커의 조합물을 검출하거나 측정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액 또는 혈액-유래 샘플을 첫 번째 시점에서 항암요법을 제공받기 전에 또는 제공받고 있는 암 환자로부터 수집하여, 예를 들어, 암 검출에 특이적인 바이오마커의 선택된 조합물을 포함하는 세포외 소포의 존재 또는 양을 검출함으로써 종양 부담을 검출하거나 측정할 수 있다. 치료 기간 후, 제2 혈액 또는 혈액-유래 샘플을 동일한 환자로부터 수집하여 이러한 질환-특이적 바이오마커(들)에서 변화를 검출할 수 있다. 예를 들어, 일부 이러한 실시형태에서, 제2 혈액 또는 혈액-유래 샘플을 동일한 암 환자로부터 치료 기간 후에 수집하여 예를 들어, 암의 검출에 특이적인 바이오마커의 선택된 조합물을 포함하는 세포외 소포의 존재 또는 이의 양의 감소를 검출함으로써, 종양 부담의 변화를 검출할 수 있다. 치료 과정에 걸쳐 질환-특이적 바이오마커 및/또는 종양 부담의 수준 및/또는 변화를 모니터링함으로써, 적절한 작용 과정, 예를 들어, 치료제의 용량을 증가 또는 감소시키는 것 및/또는 상이한 치료제를 투여하는 것이 수행될 수 있다.
VII. 키트
또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 기술을 실시하는 데 사용되는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 복수의 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용된 바와 같음)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제공된 키트는 2개 이상(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 초과)의 검출 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 개별 검출 프로브는 상이한 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 개별 검출 프로브는 동일한 표적에 지향될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 키트는 상이한 표적에 지향되는 2개 이상의 상이한 검출 프로브를 포함하고, 선택적으로 또 다른 검출 프로브가 지향되는 표적에 또한 지향되는 적어도 하나의 추가 검출 프로브를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 제공된 키트는 검출 프로브의 복수의 하위세트를 포함하고, 이들 각각은 동일한 표적에 지향되는 2개 이상의 검출 프로브를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 검출 프로브는 용기 내의 혼합물로서 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 다중 하위세트가 별도의 용기에 개별 혼합물로 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 검출 프로브는 별도의 용기에 개별적으로 제공된다.
일부 실시형태에서, 암 검출을 위한 키트는 (a) 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향되는 표적-포획 모이어티를 포함하는 포획제; 및 (b) 검출 프로브의 세트로서, 이 세트는 각각 암에 대한 표적 바이오마커 시그니처에 지향되는 적어도 2개의 검출 프로브를 포함하는, 상기 검출 프로브의 세트를 포함하고, 여기서 검출 프로브는 각각 (i) 암에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 표적 바이오마커에 지향되는 표적 결합 모이어티; 및 (ii) 표적 결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하며, 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행 부분을 포함하고, 적어도 2개의 검출 프로브의 단일-가닥 오버행 부분은, 검출 프로브가 동일한 세포외 소포에 결합되는 경우, 그들이 서로에 혼성화할 수 있다는 것을 특징으로 한다. 이들 실시형태에서, 암에 대한 이러한 표적 바이오마커 시그니처는 적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및 표면 단백질 바이오마커, 소포내 단백질 바이오마커 및 소포내 RNA 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 표적 바이오마커를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 바이오마커가 표면 단백질 바이오마커 중 하나 이상으로부터 선택되는 경우, 선택된 표면 단백질 바이오마커(들)와 적어도 하나의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드는 상이하다.
일부 실시형태에서, 키트에 제공된 적어도 2종의 검출 프로브의 표적 결합 모이어티는 각각 표적 바이오마커 시그니처의 동일한 표적 바이오마커에 지향된다. 일부 이러한 실시형태에서, 이러한 적어도 2개의 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인은 상이하다.
일부 실시형태에서, 키트에 제공된 적어도 2종의 검출 프로브의 표적 결합 모이어티는 각각 표적 바이오마커 시그니처의 구별되는 표적 바이오마커에 지향된다.
일부 실시형태에서, 키트는 적어도 1종의 화학 시약, 예컨대, 고정제, 투과화제 및/또는 차단제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 1종 이상의 핵산 결찰 시약(예를 들어, 핵산 리가제, 예컨대, DNA 리가제 및/또는 완충 용액)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 적어도 1종 이상의 증폭 시약, 예컨대, PCR 증폭 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 1종 이상의 핵산 중합효소(예를 들어, DNA 중합효소), 하나 이상의 쌍의 프라이머, 뉴클레오타이드 및/또는 완충 용액을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)를 포획하기 위한 고체 기질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 고체 기질은 비드(예를 들어, 자성 비드)이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 고체 기질은 표면일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면은 검정 챔버, 예를 들어, 필터, 매트릭스, 막, 플레이트, 튜브, 웰(예를 들어, 비제한적으로 마이크로웰)의 포획 표면(예를 들어, 엔티티 포획 표면)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 고체 기질의 표면(예를 들어, 포획 표면)은 관심대상 엔티티(예를 들어, 생물학적 엔티티)에 대한 포획제(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 항체 작용제)로 코팅될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트에 제공된 검출 프로브의 세트는 특정 암(예를 들어, 비제한적으로 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암)의 진단을 위해서 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 검출 프로브의 복수의 세트를 포함할 수 있는데, 여기서 검출 프로브의 각각의 세트는 특정 암의 검출을 위해서 지향되고, 적어도 2종 이상의 검출 프로브를 포함한다. 예를 들어, 이러한 키트는 단일 검정으로 다양한 암(예를 들어, 비제한적으로 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암)에 대해서 대상체를 스크리닝하기 위해서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 키트는 본 명세서에 기재된 방법을 실시하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 이러한 설명서는 다양한 형태로 키트에 존재할 수 있는데, 이들 중 하나 이상은 키트에 존재할 수 있다. 이들 설명서의 하나의 형태는 적합한 매체 또는 기재 상에 인쇄된 정보, 예를 들어, 포장 삽입물 내의 키트의 포장재에 정보가 인쇄된 종이 조각 또는 조각들 등으로서 존재할 수 있다. 추가의 또 다른 수단은 설명 정보가 기록된 컴퓨터 판독 가능 매체, 예를 들어 디스켓, CD, USB 드라이브 등일 수 있다. 존재할 수 있는 추가의 또 다른 수단은 설명 정보에 접근하기 위해 인터넷을 통해 사용될 수 있는 웹사이트 주소이다. 편리한 수단이 키트에 존재할 수 있다.
키트가 동반 진단으로 사용하기 위한 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 치료제에 반응할 가능성이 있는 환자를 식별(예를 들어, 치료제에 대한 환자 반응성을 나타내는 바이오마커의 식별)하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 키트는 동반 진단 시험과 함께 사용하기 위한 치료제를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징은 본 발명의 예시를 위해 제공되고 본 발명을 제한하려는 의도가 아닌 예시적인 실시예의 다음 설명 과정에서 명백해질 것이다.
실시예
실시예 1: 단일 생물학적 엔티티에 존재하는 2종 이상의 표적(예를 들어, 분자 표적)의 검출
본 실시예는 표적-결합 모이어티 및 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인(이중-가닥 부분 및 단일 가닥 오버행 포함)을 각각 포함하는 상이한 표적에 대한 검출 프로브의 합성을 기재한다. 본 실시예는 2개 이상의 표적(이 표적은 동일하거나 구별될 수 있음)을 포함하는 생물학적 엔티티의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 이러한 검출 프로브의 사용을 추가로 입증한다.
일부 실시형태에서, 검출 프로브는 하나의 단부에 표적 단백질에 특이적인 항체 작용제 및 또 다른 단부에 단일 가닥 오버행을 갖는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 2개 이상의 검출 프로브가 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포 또는 세포외 소포)에 결합되는 경우, 검출 프로브의 단일-가닥 오버행은, 이들이 서로 혼성화하여 이중-가닥 복합체를 형성하고, 그 다음 검출을 위해서 결찰되고 증폭될 수 있도록 가깝게 근접하게 존재할 수 있다.
본 연구에서는 각각 특이적 표적(예를 들어, 분자 표적)에 대해 2개의 검출 프로브를 사용하였지만, 각각 특이적 표적(예를 들어, 분자 표적)에 대해 3개 이상의 검출 프로브가 사용될 수도 있다. 또한, 본 실시예에 기재된 조성물 및 방법은 본 실시예에서 모델 생물학적 엔티티로 사용된 생물학적 세포 이외의 상이한 생물학적 샘플(예를 들어, 세포외 소포를 포함함)에서의 적용으로 확장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 엔티티 검출 검정은 각각 표적을 인식하는 2개의 검출 프로브를 이용한다(예를 들어, 일부 실시형태에서 각각은 구별되는 암-특이적 에피토프를 인식하거나, 일부 실시형태에서는 정상 세포 및/또는 조직과 특이적으로 회합되는 바이오마커를 인식하고, 또 다른 것은 암에 대한 일반 바이오마커를 인식하거나, 또는 다른 실시형예에서 둘 다 동일한 표적을 인식함). 예를 들어, 짝을 이룬 이중-가닥 주형 DNA가 이용되며, 이들 각각은 파트너 상의 5' 오버행에 상보적인 특이적 단일-가닥 5' 오버행(예를 들어, 4-염기 5' 오버행)을 갖는다. 표적 에피토프(예를 들어, 암 에피토프)에 특이적인 각각의 항체 작용제는 2개의 이중-가닥 DNA 주형 중 하나에 접합된다. 항체가 이의 표적 에피토프에 결합하는 경우, 각각의 DNA 주형의 끈적한 단부(예를 들어, 단일 가닥 오버행)이 혼성화할 수 있다. 이어서 이러한 끈적한 단부는 PCR 증폭 전에 DNA 리가제(예를 들어, T7 리가제)에 의해 함께 결찰된다. 두 DNA 주형 간에 혼성화가 일어나게 하기 위해서, 두 항체는 서로 가깝게 근접할 필요가 있다(예를 들어, DNA 링커와 항체 작용제의 길이가 50 내지 60㎚ 이내). 결합하지만 비혼성화/결찰되어 유지되는 임의의 주형은 도 2a 에서와 같이 PCR 산물을 생성하지 않을 것이다.
본 실시예에서, 도 2a 에 도시된 2개의 항체 및 2개의 프라이머(표지 프로브로서 EvaGreen 형광 염료 사용)의 듀플렉스 시스템을 사용하였다. 형광 염료가 본 실시예에서 표지 프로브로 사용되었지만, 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드를 표지하는 것으로 공지된 다른 검출 가능한 표지도 사용될 수 있다. 표적 1(예를 들어, 표적 단백질 1) 및 표적 2(예를 들어, 표적 단백질 2)는, 이들이 일반적으로 임의의 다른 세포 유형에서는 공동 발현되지 않지만, 특정 암, 예를 들어 흑색종 세포에서는 공동-발현되도록 선택되었지만, 암(예를 들어, 흑색종) 지문에 제3 표적(예를 들어, 제3 표적 단백질)을 첨가함으로써 설명될 수 있는 예외가 존재할 수 있다. 듀플렉스 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 평가하기 위해서, 2개의 흑색종 세포주, SK-MEL-1 및 MeWo 및 1개의 음성 대조군 결장직장암 세포주, T84에 대해 실험을 수행하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, T84는 표적 단백질 1 및 표적 단백질 2를 매우 낮은 수준으로 발현하는 결장직장 세포주이다. 반대로 SK-MEL-1 및 MeWo는 표적 단백질 1과 표적 단백질 2를 높은 수준으로 발현하는 흑색종 세포주이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "백 만 개당 전사체" 또는 "TPM"은 RNA-서열결정에 대한 정규화를 지칭한다는 것을 주목해야 하는데, 이것은 "RNA-서열결정 샘플 중의 1,000,000개 RNA 분자에 대한 것(x는 명시된 바와 같은 유전자 전사체임)"을 의미한다.
Figure pct00001
예시적인 방법:
올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열 구조 및 변형을 가질 수 있다:
가닥 1:
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2:
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGACTTCGTAGGTCTGGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 5:
CAGTCTGACTCACCACTCGT
가닥 6:
CACCAGACCTACGAAGTCCA
Poly T:
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
결찰 및 증폭의 검증
DNA 주형이 결찰되고 PCR에 의해 증폭될 수 있는지 검증하기 위해서, 가닥 1과 3의 쌍 및 가닥 2와 4의 쌍을 혼성화하였다. 이어서, 혼성화된 가닥 1+3 및 2+4를 DNA 리가제(예를 들어, T7 또는 T4 리가제)를 사용하여 결찰시키고, EvaGreen 형광 염료 및 가닥 5 및 6을 프라이머로 사용하여 qPCR을 수행하였다.
DNA를 혼성화시키기 위해, 500pM, 동일한 부피의 가닥 1과 3 및 가닥 2와 4를 열순환기에서 예를 들어, 다음 프로토콜을 사용하여 용융시켰다: 10초 동안 95℃, 30초 동안 65℃, 4℃에서 유지. DNA 이중-가닥을 제조한 후, 예를 들어, 20uL 반응물 중의 9uL의 혼성화된 250pM DNA를 사용하여 DNA 결찰(예를 들어, T4 및 T7 리가제 사용)을 수행하였다. 음성 대조군은 리가제를 제공받지 않았지만 동일한 완충제를 함유하였다. 결찰을 예를 들어, 25℃에서 20분 동안 열순환기에서 수행하였다. 결찰 후 산물(및 리가제가 없는 샘플)을 예를 들어, 역전사효소(RT)가 없는 Luna 마스터 믹스를 사용하여 qPCR시켰다. 모든 qPCR 반응을 3회 수행하였고, 수동 참조(예를 들어, ROX)를 사용하여 qPCR 신호를 정규화하였다. 이어서, 데이터를 분석하고 그래프로 표시하였다.
항체 작용제-DNA 접합
올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 혼성화된 가닥 1과 3 및 혼성화된 가닥 2와 4)를 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 단백질에 대한 항체 작용제)에 접합시키기 위해서, 단일 가닥의 쌍을 혼성화시켜 하나의 단부에 단일-가닥 오버행을 갖는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드를 형성하였고, 그 다음 예를 들어, 상업용 DNA-올리고뉴클레오타이드 접합 키트(예를 들어, 압캠사, ab218260)를 사용하여, 표적-결합 모이어티(예를 들어, 표적 단백질에 대한 항체 작용제)를 또 다른 단부에서 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드에 접합시켰다.
2개의 단일-가닥 DNA를 혼성화시켜 이중-가닥 DNA를 형성하기 위해서, 50uL의 100uM 등몰 및 부피 DNA를 예를 들어, 다음 프로토콜을 사용하여 열 순환에 적용하였다: 1. 95℃까지 가열하고, 2분 동안 온도를 유지시킨다. 2. 25℃까지 3분마다 5℃씩 떨어뜨려 45분에 걸쳐 25℃까지 냉각시킨다. 3. 4℃에서 유지시킨다. 50uM 이중-가닥 DNA 산물을 사용하여, 복수의 이중-가닥 DNA(예를 들어, 이중-가닥 DNA의 5개 가닥)를 각각의 항체 작용제 어닐링시켰다.
세포 배양
세포를 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 배양할 수 있다. 예를 들어, T84 세포를 1:1 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle Medium: DMEM): 5% 엑소좀 무함유 소 태아 혈청(FBS) 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Ham의 F12 배지에서 성장시켰다. SK-MEL-1과 MeWo 세포를 모두 10% 엑소좀 무함유 FBS 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 이글 최소 필수 배지(Eagle's minimum essential medium: EMEM)에서 성장시켰다. 모든 세포주를 5% CO2 및 37℃에서 유지시켰고, 계대 수는 15 미만이었다.
세포 고정 및 차단
세포를 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 고정시키고, 투과화시키고, 차단시킬 수 있다. 예를 들어, 고정 전에, 접착성 T84 및 MeWo 세포를 예를 들어, TrypLE 프로테아제를 사용하여 이의 기질로부터 탈락시켰다. SK-MEL-1은 약간 접착성이었고, 예를 들어, 플라스크를 진탕함으로써 플라스크 기질로부터 해방될 수 있다. 용액이 되면, 세포를 실온에서 300rcf에서 5분 동안 펠릿화시켰다. 세포를 10㎖ 1× PBS 중에서 1회 세척하고, 상기와 같이 펠릿화시켰다. 그 다음 각각의 세포주를 고정시키고, 투과화시켰다. 예를 들어, 세포를 얼음 냉각된 메탄올 중에서 동시에 고정시키고, 투과화시킬 수 있고, -25℃에서 적어도 20분 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 차단 전에, 먼저 1000rcf에서 2분 동안 펠릿화시킴으로써 세포를 재수화시키고(일단 고정되면, 더 큰 g-힘을 견딜 수 있음), 그 다음 1× PBS에서 1회 세척하였다. 이어서 세척 및 재수화된 펠릿을 차단 완충액에 재현탁시켰다.
항체 작용제-DNA 접합체 표지 및 세포주의 세척
DNA-접합된 항체를 첨가하기 전에, 3개의 메탄올-고정 세포주(SK-MEL-1, MeWo 및 T84) 각각을 1㎖의 차단 완충액 중의 1.5㎖ Protein Lo Bind Eppendorf 튜브에서 3개의 분취량으로 나누어 비-특이적 결합을 차단시켰다. 3개의 세포주 각각에 대해, 3개의 튜브를 항체 작용제를 함유하지 않는 것, 1ug/㎖에서 DNA-접합된 항체를 함유하는 것(표적 단백질 1에 대한 것 및 표적 단백질 2에 대한 또 다른 것) 및 10ng/m에서 DNA-접합된 항체를 함유하는 것(표적 단백질 1에 대한 것 및 표적 단백질 2에 대한 또 다른 것)으로 고안하였다. 1㎖의 차단된 세포에 첨가하기 전에 항체를 차단 완충액에서 미리 희석시키고, 항체 작용제-DNA 접합체를 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 항체 인큐베이션 후, 세포를 실온에서 2분 동안 1,000rcf에서 원심분리시킴으로써, 예를 들어, 1㎖의 1×PBS에서 4회 세척하였다.
표지된 세포의 결찰 및 qPCR
차단, 표지 및 세척된 세포의 DNA 결찰(예를 들어, T7 결찰)을 다음 프로토콜을 사용하여 수행하였다: 1. DNA 리가제 마스터 믹스를 제조하여 50uL 부피 중에서의 최종 세척 후 세포를 재현탁시켰다. DNA 리가제 마스터 믹스는 예를 들어, 5% (v/v) T7 리가제, 50% (v/v) 2X T7 리가제 완충액 및 45% (v/v) 뉴클레아제-무함유 물을 함유하였다. 2. 세포주 각각을 50uL의 DNA 리가제 마스터 믹스에 재현탁시킨 후, 세포-리가제 믹스를 열순환기에 넣었다(예를 들어 25℃에서 20분 동안). 3. 예를 들어, 500nM 농도의 프라이머(예를 들어, 가닥 5 및 6), 1X EvaGreen 형광 염료 및 Luna qPCR 마스터 믹스를 사용하여 qPCR 마스터 믹스를 제조하여 25uL의 최종 반응 부피를 달성하였다. 4. 약 8uL의 세포-리가제 산물을 25uL qPCR 반응 각각에 첨가하였다. 5. 예를 들어, 다음 PCR 프로토콜을 사용하여 96웰 플레이트에서 qPCR을 수행하였다: 95℃에서 1분 동안 유지, 95℃에서 10초 동안 및 60℃에서 30초 동안의 50회 주기 수행 및 표준 용융 곡선. 온도 변화율은 표준이도록 선택하였다(예를 들어, 초당 2℃). 모든 qPCR 반응을 3회 수행하였고, 수동 참조(예를 들어, ROX)를 사용하여 qPCR 신호를 정규화하였다. 이어서, 데이터를 분석하고 그래프로 표시하였다.
결과:
qPCR 플롯의 해석
qPCR 플롯은 이중-가닥 DNA와 삽입되는 EvaGreen의 형광 신호가 배경을 넘어 증가하는 Ct(주기 역치)를 식별한다. 임의의 유형의 이중-가닥 DNA에 대한 비-특이적 염료가 사용되었기 때문에, 프라이머 이량체의 증폭으로부터 대략 35주기 후에 주형 대조군(NTC)이 나타나지 않을 것이다. 또한, PCR 반응에 들어가는 임의의 소량의 주형은 예측 Ct 값보다 낮은 Ct 값으로 이어질 것이며, 이는 NTC가 30 미만의 Ct 값을 갖는 경우 발생하는 것이다(NTC의 경우 30보다 낮은 Ct 값이 도 4 에서 나타남). 이러한 오염은 예를 들어, 혼성화 프로브로 증폭을 수행하여 주형이 증폭되는 경우(또는 표지 프로브 또는 검출 프로브가 가수분해될 수 있는 경우)에만 형광을 생성함으로써 제어될 수 있다.
리가제는 증폭에 필요하다
도 3 에 도시된 바와 같이, 프라이머-이량체 배경을 초과하는 qPCR 신호를 달성하기 위해서는 리가제의 존재가 필요하다. 또한, T7 및 T4 리가제는 유사한 Ct 값과 일관된 결과를 생성시켰다.
qPCR 결과는 일관된다
도 4 에 도시된 바와 같이, 어떠한 항체 작용제도 없는 군은 세포주에 걸쳐 높은 Ct 값(약 33+)을 가졌다. 반대로, 1ug/㎖의 항체 작용제 표지된 군은 18만큼 낮은 Ct 값을 가졌다. 가장 강한 신호를 갖는 세포주는 MeWo였고, 그 다음 SK-MEL-1 및 T84 세포주였다. 이러한 관찰 결과는, 표적 단백질 1과 표적 단백질 2를 가장 많이 발현하는 MeWo, 표적 단백질 1과 표적 단백질 2를 두 번째로 많이 발현하는 SK-MEL-1, 표적 단백질 1과 표적 단백질 2를 가장 적게 발현하는 T84 세포주와 일관된다. 마지막으로, 더 낮은 농도의 항체 작용제(10ng/㎖)는 항체 작용제가 없는 대조군과 유사한, 훨씬 더 높은 Ct 값을 갖는다.
논의:
듀플렉스 시스템(예를 들어, 상기에 기재된 것)은, 세포주에서 공동 국지화된 표적 단백질 1 및 표적 단백질 2를 식별하는 것으로 입증되었다. 먼저, 도 3 과 같이 주형이 결찰되고, 증폭 가능하다. 두 번째로, 이러한 DNA 주형이 2개의 상이한 항체에 접합하고, 세포주를 염색한 후, 발현-의존적 신호가 관찰되었다. 즉, MeWo 세포주는 표적 단백질 1과 표적 단백질 2를 가장 높은 수준으로 발현하며(표 1), 그에 상응하여 표적 단백질 1과 표적 단백질 2 신호가 가장 강하며, SK-MEL-1 세포주는 표적 단백질 1과 표적 단백질 2를 MeWo보다 약 4.4배 더 낮게 발현하고, 더 약한 신호를 갖고, T84 세포주는 표적 단백질 1과 표적 단백질 2를 발현하지 않거나 매우 낮게 발현하고, 가장 약한 신호를 갖는다. 음성 T84 세포는 또한 비특이적 배경과 일치하는 높은 Ct 값을 갖는다. 그러나, 1ug/㎖의 항체 작용제에서 T84는 여전히 23만큼 낮은 하나의 Ct 값을 갖는다. 이 Ct 값은 27의 다른 두 Ct 값에 대한 이상값(outlier)이며, 세포의 덩어리 또는 다른 비-특이적 프라이밍 상호작용 또는 오염으로 인한 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 가장 강한 신호와 가장 약한 신호 간의 차이는 보다 철저한 세척을 수행함으로써 증가될 수 있다.
듀플렉스 시스템(예를 들어, 상기에 기재된 것)이 표적 단백질 1 및 표적 단백질 2를 발현하는 세포를 정확하게 식별하는 것으로 본 명세서에서 입증되지만, 이러한 시스템은 또한 표적 단백질 1 및 표적 단백질 2를 포함하는 다른 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)를 식별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포외 소포는 고정 및 하류 처리 전에 고체 기질(예를 들어, 실리카 비드) 상에 포획될 수 있다.
실시예 2: 단일 생물학적 엔티티에 존재하는 3종 이상의 표적(예를 들어, 분자 표적)의 검출
본 실시예는 표적-결합 모이어티 및 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인(이중-가닥 부분 및 단일 가닥 오버행 포함)을 각각 포함하는 3종의 표적에 대한 검출 프로브의 합성을 기재한다. 본 실시예는 3개의 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드(각각 단일-가닥 오버행을 가짐)를 혼합물에서 사용하여 결찰 및 증폭될 수 있음을 추가로 입증하는데, 이는 이러한 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드가 항체에 접합되는 경우, 예를 들어, 도 5a 에 도시된 바와 같이, 트라이플렉스 시스템을 수행하여 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 개별 세포외 소포)에 모두 국지화된 3종의 표적(예를 들어, 분자 표적)을 식별할 수 있다는 것을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 이러한 3종의 표적은 동일한 표적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 3종의 표적은 구별되는 표적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 3종의 표적 중 적어도 2종은 동일한 표적일 수 있다.
예시적인 방법:
올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열 구조 및 변형을 가질 수 있다:
가닥 1:
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2:
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 4(5' 포스페이트 없음):
/5'ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGACTTCGTAGGTCTGGTG
가닥 5:
CAGTCTGACTCACCACTCGT
가닥 6:
CACCAGACCTACGAAGTCCA
가닥 8:
/5Phos/TTCCAACTAT/CCAACTAT/CTAT/+TTTTTT/TT+ACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 9:
/5Phos/GAGTGTGAGGATGTCAGTGTGTCTC/TT/CCAA, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 10:
/5AmMC12/ATAGTTGGAAGAGACACACTGACATCCTCAC, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
주석: "/"는 주어진 DNA 가닥의 변이체를 나타낸다. 가닥 8 내에 2개의 상이한 갭을 갖는 가닥 8 및 9의 3개의 상이한 길이를 선택하였다.
결찰 및 증폭의 검증
DNA 주형이 결찰되고 PCR에 의해 증폭될 수 있는지 검증하기 위해서, 가닥 1과 8의 쌍, 가닥 9와 10의 쌍 및 가닥 2와 4의 쌍을 혼성화하였다. 이어서, 혼성화된 가닥 1+8, 9+10 및 2+4를 DNA 리가제(예를 들어, T7 또는 T4 리가제)를 사용하여 결찰시키고, EvaGreen 형광 염료 및 가닥 5 및 6을 프라이머로 사용하여 qPCR을 수행하였다.
DNA를 혼성화시키기 위해, 1 uM, 동일한 부피의 가닥 1과 8, 가닥 9와 10 및 가닥 2와 4를 열순환기에서 예를 들어, 다음 프로토콜을 사용하여 용융시켰다: 10초 동안 95℃, 30초 동안 65℃, 4℃에서 유지. DNA 이중-가닥을 제조한 후, 예를 들어, 20uL 반응물 중의 9uL의 혼성화된 100nM DNA를 사용하여 DNA 결찰(예를 들어, T4 및 T7 리가제 사용)을 수행하였다. 음성 대조군은 리가제를 제공받지 않았지만 동일한 완충제를 함유하였다. 결찰을 예를 들어, 25℃에서 20분 동안 열순환기에서 수행하였다. 그 다음 결찰 후 산물(또는 리가제 없음)을 예를 들어, TaqMan Fast Advanced 마스터 믹스를 사용하여 qPCR시켰다. 예를 들어, 다음 PCR 프로토콜을 사용하여 96웰 플레이트에서 qPCR을 수행하였다: 50℃에서 2분 동안 유지, 95℃에서 2분 동안 유지, 95℃에서 5초 동안 및 60℃에서 15초 동안의 55회 주기 수행 및 표준 용융 곡선 수행. 모든 qPCR 반응을 3회 수행하였고, 수동 참조(예를 들어, ROX)를 사용하여 qPCR 신호를 정규화하였다. 이어서, 데이터를 분석하고 그래프로 표시하였다.
결과:
리가제는 강력한 Ct 값에 필요하다
리가제의 존재는 도 6 에 도시된 바와 같이 강력한 Ct 값을 생성시키는 데 필요하다.
3개의 주형 모두가 강한 신호에 필요하다
3개의 주형 DNA의 각각의 쌍을 도 7 내지 도 9 에 도시된 바와 같이 반응에서 결찰시켰다. 3개의 가닥 중 2개만 사용하는 경우, 신호는 대략 13 내지 14 Ct 값이 더 약하다. 이러한 발견은, 강력한 신호에 필요한 3개의 가닥 모두를 사용하여 트라이플렉스 DNA 시스템이 증폭될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3: 단일 세포외 소포에 존재하는 2종 이상의 표적의 검출
본 실시예는, 각각 실시예 1 및 실시에 2에 기재된 바와 같은 듀플렉스 시스템 및 트라이플렉스 시스템이 조합물(예를 들어, 세트)의 존재에 대해 상이한 유형의 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)를 검출하는 데 유용하고, 표적 중 적어도 하나가 누락된 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)에서는 그렇지 않음을 입증한다. 본 실시예는 또한 표적-결합 모이어티 및 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인(이중-가닥 부분 및 단일 가닥 오버행 포함)을 각각 포함하는 개별 표적에 대한 검출 프로브의 합성을 기재한다.
2개의 표적(예를 들어, 분자 표적)을 포함하는 세포외 소포에 대한 검출에서 듀플렉스 시스템의 성능을 평가하기 위해, 일부 실시형태에서, 실시예 1에 기재된 것과 상이한 표적 바이오마커의 조합물을 사용하였다. 일부 실시형태에서, 실시예 1에서 사용된 EvaGreen 형광 염료와 같은 검출 가능한 프로브를 가수분해 프로브로 대체하였다. 일부 실시형태에서, 표적 마커 A는 세포외 소포에 대한 일반 마커였다. 일부 실시형태에서, 표적 마커 B는 정상 피부 및 흑색종에서만 발현되지만 다른 암에서는 발현되지 않는다. 표 2에 나타낸 바와 같이, T84는 (본 검정의 조건 하에서) 검출 능하게 표적 마커 B를 발현하지 않지만 MeWo 세포보다 낮은 수준에서 표적 마커 A를 발현하는 결장직장 세포주이다. 반대로, MeWo 흑색종 세포주는 표적 마커 A와 표적 마커 B를 모두 높은 수준으로 발현한다.
Figure pct00002
3종의 표적 바이오마커를 포함하는 세포외 소포에 대한 검출에서 트라이플렉스 시스템의 성능을 평가하기 위해서, 3종의 표적 마커를 이용하였는데, 이들 각각은 T84 세포보다 MeWo 세포에서 더 높은 수준으로 발현되거나, MeWo에서는 높게 발현되고 T84에서는 전혀 그렇지 않다. 본 실시예에서, 표적 마커 중 적어도 하나가 T84 세포외 소포에서 (본 검정의 조건 하에서) 검출 가능하게 발현되지 않도록 3종의 표적 마커의 조합물을 선택하였다.
Figure pct00003
예시적인 방법:
올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열 구조 및 변형을 가질 수 있다. 하기의 가닥 번호는 도 2a 및 도 5a에 도시된 가닥과 연관된 수치에 상응함이 주목된다.
가닥 1:
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2:
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGACTTCGTAGGTCTGGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4(트라이플렉스 시스템에서 사용되는 경우 5' 포스페이트 없음): /5'ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGACTTCGTAGGTCTGGTG
가닥 5:
CAGTCTGACTCACCACTCGT
가닥 6:
CACCAGACCTACGAAGTCCA
Poly T:
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
가닥 8:
/5Phos/CCAACTATTTTTTTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 9:
/5Phos/GAGTGTGAGGATGTCAGTGTGTCTCTT, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 10:
/5AmMC12/ATAGTTGGAAGAGACACACTGACATCCTCAC, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
항체-DNA 접합
듀플렉스 시스템의 경우, 일부 실시형태에서, 가닥 1 및 3을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 표적 마커 A에 특이적인 표적-결합 모이어티에 접합시킨 반면, 가닥 2 및 4를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 표적 마커 B에 특이적인 표적-결합 모이어티에 접합시켰다. 일부 실시형태에서, 실시예 1에 기재된 바와 같이 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제)를 올리고뉴클레오타이드에 접합시키는 방법을 사용하여 이중-가닥 DNA의 대략 2개의 가닥을 각각의 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제)에 어닐링시켰다.
트라이플렉스 시스템의 경우, 일부 실시형태에서, 가닥 1 및 8을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 표적 마커 C에 특이적인 표적-결합 모이어티에 접합시키고; 가닥 10 및 9를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 표적 마커 A에 특이적인 표적-결합 모이어티에 접합시키고; 가닥 2 및 4를 포함하는 올리고뉴클레오타이드(여기서 가닥 4는 유리 5' 포스페이트를 갖지 않음)를 표적 마커 D에 특이적인 표적-결합 모이어티에 접합시켰다. 일부 실시형태에서, 실시예 1에 기재된 바와 같이 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제)를 올리고뉴클레오타이드에 접합시키는 방법을 사용하여 이중-가닥 DNA의 대략 2개의 가닥을 각각의 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제)에 어닐링시켰다.
세포 배양
T84 세포를 1:1 둘베코 변형 이글 배지(DMEM): 5% 엑소좀 무함유 소 태아 혈청(FBS) 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Ham의 F12 배지에서 성장시켰다. MeWo 세포를 모두 10% 엑소좀 무함유 FBS 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 이글 최소 필수 배지(EMEM)에서 성장시켰다. 모든 세포주를 5% CO2 및 37℃에서 유지시켰고, 계대 수는 20 미만이었다.
세포 배양 배지로부터의 세포외 소포의 정제
일부 실시형태에서, MeWo 및 T84 세포를 약 80% 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 각각의 배지에서 성장시켰다. 세포 배양 배지를 수집하고, 실온(RT)에서 5분 동안 300×rcf에서 회전시켜 세포 및 파편을 제거하였다. 그런 다음 상청액을 수집하고, -80℃에서 동결시켰다.
사용 전에, -80℃에 저장된 냉동 상청액을 해동시키고, 이어서 세포 및 큰(예를 들어, 직경 1마이크론 초과) 세포 단편을 정화시켰다. 해동된 상청액은 원심분리를 사용하여 정화시켰다.
일부 실시형태에서, 정화된 폐배지(예를 들어, 약 500uL)를 크기 배제 정제 칼럼에 통과시켰다. 약 65㎚ 내지 약 200㎚의 크기 범위를 갖는 나노입자를 각각의 샘플에 대해 수집하였다.
세포외 소포 바이오티닐화
일부 실시형태에서, 예를 들어, 제조사의 지침에 따라 NanoDrop을 사용하여 정제된 세포외 소포의 단백질 농도를 측정하였다. 이 측정치를 사용하여 각각의 샘플에 추가할 비오틴의 양을 계산하였다. 제조사의 지침에 따라, 예를 들어, EZ-link Micro NHS-PEG4-바이오티닐화 키트를 사용하여 세포외 소포를 바이오티닐화시켰다. 바이오틴을 샘플에 첨가한 후, 45분 동안 진탕시켰다. 2회의 연속 5㎖, 40kDa MWCO 칼럼 스핀을 사용하여 과량의 바이오틴을 제거하였다(예를 들어, ZebaTM).
입자 계수치
예를 들어, 예를 들어, TS400 칩을 사용하는 SpectroDyne 입자 계수 기기를 사용하여 입자 계수치를 얻어서 65 내지 200㎚의 나노입자 범위를 측정하였다.
스트렙타비딘 코팅된 96웰 플레이트 상의 바이오티닐화된 세포외 소포의 포획 또는 고정
일부 실시형태에서, 동일한 수의 바이오티닐화된 세포외 소포를 스트렙타비딘-코팅된 포획 표면(예를 들어, 96-웰 플레이트의 웰)에, 예를 들어, 검정된 각각의 샘플 조건에 대해 삼중으로 첨가하였다. 플레이트를 인큐베이션시키고, 일정 기간 동안 실온에서 진탕시켰다.
세포외 소포 고정
일부 실시형태에서, (1× PBS 중의) 적절한 농도의 폼알데하이드를 스트렙타비딘-코팅된 표면 상에 포획된 세포외 소포에 첨가하였다. 이어서 고정된 세포외 소포를 다음 단계에서 사용하기 위해 세척하였다.
샘플 차단 및 세포외 소포 투과화
고정된 세포외 소포를 포함하는 샘플을 차단 완충액과 혼합하였다. 일부 실시형태에서, 차단 완충액은 완충 용액, 예컨대, 인산염 무함유 완충액(예를 들어, 캔도 바이오사이언스사(Candor Bioscience)로부터의 LowCross-Buffer®)에 적절한 농도의 Triton X-100 또는 사포닌 및 연어 정자 DNA를 포함할 수 있다.
검출 프로브 결합
검출 프로브(예를 들어, 항체 작용제의 양을 기준으로 약 0.5ug/㎖ 내지 약 3.5 ug/㎖의 농도에서)를 세포외 소포(예를 들어, 고정되고, 차단되고, 선택적으로 투과화된 온전한 세포외 소포)를 포함하는 샘플에 첨가하였다. 그 다음, 혼합물을 검출 프로브가 표적 바이오마커를 포함하는 세포외 소포에 결합하도록 하는 조건 하에 인큐베이션시킨다.
결합 후 세척
일부 실시형태에서, 샘플을 적절한 완충액에서 세척하였다.
결찰
결합되지 않은 검출 프로브를 제거하기 위한 세척 후, 검출 프로브-결합된 세포외 소포(고체 기질 표면에 포획됨)를 결찰 믹스와 접촉시켰다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다.
PCR
결찰 후, 검출 프로브-결합된 세포외 소포(고체 기질 표면에 포획됨)를 PCR 믹스와 접촉시켰다. PCR을 예를 들어, Quant Studio 3에서 하기 예시적인 PCR 프로토콜로 수행하였다: 95℃에서 1분 동안 유지, 95℃에서 5초 동안 및 62℃에서 15초 동안의 50회 주기 수행 및 표준 용융 곡선. 온도 변화율은 표준이도록 선택하였다(초당 2℃). 모든 qPCR을 2회 또는 3회 수행하였고, ROX를 수동 참조로서 사용하여 qPCR 신호를 정규화하였다. 이어서 데이터를 Quant Studio 3 기계로부터 다운로딩하고, Python 3.7로 분석하고, 플로팅하였다.
결과:
도 13a 및 도 13b 에 나타낸 qPCR의 결과는, 표적 바이오마커 시그니처(예를 들어, 단백질-발현 패턴)를 함유하는 세포외 소포가 본 명세서에 기재된 시스템(예를 들어, 듀플렉스 및/또는 트라이플렉스 시스템)을 사용하여 검출 가능하고, 이러한 표적 바이오마커 시그니처를 갖지 않는 세포외 소포와 구별 가능함을 입증한다. 모 세포주의 차등적 유전자 발현은 본 명세서에 기재된 시스템(예를 들어, 듀플렉스 및/또는 트라이플렉스 시스템)을 사용하여 각각의 세포주-유래 세포외 소포에서 쉽게 식별할 수 있었다. MeWo 세포 및 이로부터 유래된 세포외 소포는 T84 세포 및 이로부터 유래된 세포외 소포보다 표적 마커 각각(듀플렉스 시스템의 경우 표적 마커 A 및 표적 마커 B; 트라이플렉스 시스템의 경우 표적 마커 A, 표적 마커 C 및 표적 마커 D)을 더 높은 수준으로 발현한다. 따라서, MeWo 세포외 소포는 본 실시예에서 수행된 듀플렉스 및 트라이플렉스 검정 모두에서 T84 세포외 소포로부터 얻어진 것보다 후속적으로 더 낮은 Ct(약 6 Ct 더 낮음)를 가졌다. 이러한 결과는, 표 2 및 표 3 에 나타난 바와 같이 각각의 세포주에서 mRNA 발현과 일치한다.
논의:
본 실시예는, 공동 국지화된 표적 마커 A 및 표적 마커 B를 식별하기 위한 듀플렉스 시스템이 발현-의존적 신호가 관찰되는 세포외 소포를 표지하는 수준에서 작동함을 나타낸다. 구체적으로, MeWo 세포 및 이로부터 유래된 세포외 소포는 T84 세포 및 이로부터 유래된 세포외 소포에 비해 표적 마커 A 및 표적 마커 B 둘 다를 더 높은 수준으로 발현하기 때문에( 표 2 ), MeWo 세포외 소포를 함유하는 샘플에서 더 강한 신호가 생성되었다.
본 실시예는, 또한 표적 마커 A, 표적 마커 C 및 표적 마커 D의 조합물을 식별하기 위한 트라이플렉스 시스템이 발현-의존적 신호가 관찰되는 세포외 소포의 수준에서 작동함을 나타낸다. MeWo 세포 및 이로부터 유래된 세포외 소포는 T84 세포 및 이로부터 유래된 세포외 소포에서 발현되는 것과 비교하여 3종의 모든 마커의 더 높은 수준을 발현한다. 특히, 표적 마커 중 하나(표적 마커 A)는 T84 세포 및 이로부터 유래된 세포외 소포에서 발현되지 않았다. 이들 3종의 마커의 MeWo 세포외 소포에서의 이러한 더 큰 발현은 T84 세포외 소포와 비교하여 실질적으로 더 강한 신호를 초래한다(26은 약 64배 더 강함).
이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 일부 실시형태에서, 검출 프로브의 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제)의 비-특이적 결합은 T84 샘플에서 검출된 노이즈 신호에 기여할 수 있다(주형이 없는 음성 대조군과 비교하여). 따라서, 일부 실시형태에서, 세포외 소포를 포함하는 샘플을 처리하여 검출 프로브의 비-특이적 결합을 감소 또는 최소화할 수 있다.
실시예 4: 환자 혈장 샘플에서 암-연관된 세포외 소포를 검출하기 위한 예시적인 시스템을 사용한 암 검출
본 실시예는 본 명세서에 기재된 시스템이 복잡한 샘플 매트릭스(예를 들어, 대상체로부터의 혈장 샘플)에서 표적 생물학적 엔티티를 검출하는 데 유용할 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 표적 생물학적 엔티티(예를 들어, 암-연관된 세포외 소포)를 혈장 샘플(예를 들어, 인간 대상체로부터)에 스파이킹하고, 결찰된 주형의 신호를 농도 의존적 방식으로 표적 생물학적 엔티티를 포함하는 샘플에서 검출하였다.
본 실시예는 또한 본 명세서에 기재된 시스템이 암 검출에 유용할 수 있음을 입증한다. 구체적으로, 본 실시예는 본 명세서에 기재된 시스템이 정상적인 건강한 대상체의 세포외 소포로부터 암 환자의 세포외 소포를 구별하는 데 유용하다는 것을 나타낸다. 또한, 본 실시예는 이러한 암 검출 검정이 높은 감도 및/또는 특이성을 제공함을 나타낸다.
본 실시예는 암-연관된 세포외 소포를 검출하는 본 명세서에 기술된 시스템의 능력을 입증하기 위해 폐 선암종 환자로부터 얻은 샘플(예를 들어, 혈장 샘플)을 사용하였지만, 본 개시내용을 읽는 당업자는 본 명세서에 기재된 이러한 시스템이 적어도 2종 이상의 표적 마커의 상이한 적절한 조합물을 사용하여 다른 유형의 암을 검출하는 데 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 본 개시내용을 읽는 당업자는 본 명세서에 기재된 이러한 시스템이 적어도 2종 이상의 표적 마커의 적절한 세트를 사용하여 암의 상이한 병기를 진단하는 데에도 유용할 수 있음을 이해할 것이다.
본 실시예에서 입증된 바와 같은 능력은 본 실시예에서 평가된 듀플렉스 시스템(즉, 표적 생물학적 엔티티에 특이적인 2개의 구별되는 검출 프로브 세트를 포함함)으로 제한되지 않는다. 본 개시내용을 읽는 당업자에게는 본 명세서에 기재된 다른 시스템(예를 들어, 3개 이상의 구별되는 검출 프로브의 세트를 포함하는 트라이플렉스 또는 n-플렉스 시스템)이 또한 예를 들어, 암 검출을 위한 복합체 샘플 매트릭스에서 표적 생물학적 엔티티를 검출하는 데 유용할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 본 개시내용을 읽는 당업자는 또한 일부 실시형태에서 상이한 표적에 대한 추가 검출 프로브의 포함이 검출 검정의 특이성 및/또는 감도를 증가시킬 것임을 이해할 것이다.
스파이크-인 실험 : 일 양상에서, 복잡한 샘플 매트릭스에서 세포외 소포를 검출하는 듀플렉스 시스템의 능력을 평가하였다. 예를 들어, 암-연관된 세포외 소포(EV)를 대사에(예를 들어, 인간 대상체)의 혈장 샘플에 스파이킹하였다. 이어서, 스파이킹된 플라즈마 샘플을 정제시켜 EV를 단리시켰다. 단리되거나 정제된 EV는 듀플렉스 시스템 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)을 수행하기 전에 고체 기질 표면(예를 들어, PCR 플레이트)에 포획되거나 흡착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 암-연관된 세포외 소포를 폐 선암종 세포주인 HCC-4006으로부터 얻었다. 일부 실시형태에서, 암 관련 세포외 소포를 흑색종 세포주인 SK-MEL1로부터 얻었다.
이러한 스파이크-인 실험에서, 바이오마커의 4개의 예시적인 상이한 조합물을 듀플렉스 시스템 검정에서 평가하였다. 또한, 가수분해 프로브를 검출 가능한 형광단 표지 SYBR 그린 대신 대체하였다. 4종의 예시적인 다른 조합물을 하기에 나타낸다:
Figure pct00004
표적 마커 A + 표적 마커 B(흑색종-연관된 세포외 소포의 검출을 위해서 본 검정에서 이용된 조합물 마커)
Figure pct00005
표적 마커 E + 표적 마커 F(폐 선암종-연관된 세포외 소포의 검출을 위해서 본 검정에서 이용된 조합물 마커)
Figure pct00006
표적 마커 E + 표적 마커 A(폐 선암종-연관된 세포외 소포의 검출을 위해서 본 검정에서 이용된 조합물 마커)
Figure pct00007
표적 마커 G + 표적 마커 F(폐 선암종-연관된 세포외 소포의 검출을 위해서 본 검정에서 이용된 조합물 마커)
하기 표 4는 상이한 암-연관된 세포외 소포에서 다양한 표적 마커의 발현을 요약한다. 표 4 에서 조합물 5는 스파이크-인 실험에서 평가되지 않았지만 환자 샘플을 스크리닝하기 위한 실험(하기에 기재된 바와 같음)에서 사용되었음을 주목한다.
Figure pct00008
표적 마커 E, 표적 마커 F, 표적 마커 G 및 표적 마커 H는 다른 조직보다 폐 선암종에서 더 높게 발현된다. 표적 마커 E는 건강한 조직의 다른 곳에서도 발현되지만 일반적으로 LUAD보다 낮은 수준으로 발현된다는 점에 주목해야 한다. 실시예 3에서 논의된 바와 같이, 표적 마커 B는 흑색종-연관된 세포외 소포에 대한 양성 대조군으로서 본 발명의 실시예에서 사용된 다른 조직에서보다 흑색종에서 더 높게 발현된다. 실시예 3에서 논의된 바와 같이 표적 마커 A는 다수의 유형의 세포외 소포에 존재하기 때문에 세포외 소포에 대한 일반적인 마커이다.
건강한 혈장 대 IV기 폐 선암종(LUAD) 혈장 실험: 또 다른 양상에서, 건강한 환자 및 IV기 LUAD 환자의 혈장 샘플에서 세포외 소포를 구별하는 듀플렉스 시스템의 능력을 평가하였다. 예를 들어, 세포외 소포를 IV기 LUAD 환자 및 연령 및 성별 매칭된 건강한 대상체의 혈장 샘플로부터 정제시키거나, 단리시킨 다음, 이를 예를 들어, 상기 표 4 에 제시된 바와 같은 조합물 3 또는 조합물 5에 지향되는 적어도 2개 이상의 검출 프로브 세트를 사용하여 프로파일링하였다.
예시적인 방법:
올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열 구조 및 변형을 가질 수 있다. 하기의 가닥 번호는 도 2a에 도시된 가닥과 연관된 수치에 상응함이 주목된다.
가닥 1:
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2:
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGACTTCGTAGGTCTGGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 5:
CAGTCTGACTCACCACTCGT
가닥 6:
CACCAGACCTACGAAGTCCA
항체 작용제-DNA 접합
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드에 대한 항체 작용제의 접합을 수행하여 항체 작용제의 항원 결합 부분에서 변형을 최소화하거나 회피한다. 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 혼성화된 가닥 1 및 3 또는 혼성화된 가닥 2 및 4이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 항체 작용제의 유리 아민기를 통해서 올리고뉴클레오타이드에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 항체 작용제의 반응성 티올기를 통해서 올리고뉴클레오타이드에 접합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 작용제는 항체 작용제에 존재하는 탄수화물 잔기를 통해서 올리고뉴클레오타이드에 접합될 수 있다.
세포 배양
SK-MEL-1 세포를 10% 엑소좀 무함유 FBS 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 이글 최소 필수 배지(EMEM)에서 성장시켰다. HCC-4006 세포를 10% 엑소좀 무함유 FBS 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI 1640)에서 성장시켰다. 모든 세포주를 5% CO2 및 37℃에서 유지시켰고, 계대 수는 20 미만이었다.
세포 배양 배지로부터의 세포외 소포의 정제
일부 실시형태에서, SK-MEL-1 및 HCC4006 세포를 약 80% 컨플루언시(confluency)에 도달할 때까지 각각의 배지에서 성장시켰다. 세포 배양 배지를 수집하고, 실온(RT)에서 5분 동안 300×rcf에서 회전시켜 세포 및 파편을 제거하였다. 그런 다음 상청액을 수집하고, -80℃에서 동결시켰다.
사용 전에, -80℃에 저장된 냉동 상청액을 해동시키고, 이어서 세포 및 큰(예를 들어, 직경 1마이크론 초과) 세포 단편을 정화시켰다.
일부 실시형태에서, 정화된 폐배지(예를 들어, 약 500uL)를 크기 배제 정제 칼럼에 통과시켰다. 약 65㎚ 내지 약 200㎚의 크기 범위를 갖는 나노입자를 각각의 샘플에 대해 수집하였다.
정상 혈장 샘플에 대한 세포주-유래 세포외 소포의 첨가
스파이크-인 연구의 경우, 예를 들어, SpectraDyne nCS1 TS400 카트리지에서 측정된 바와 같은, ㎖당 직경이 80㎚보다 큰 대략 3e10개의 나노입자의 동일한 농도에서 정제된 SK-MEL-1 및 HCC-4006 세포외 소포의 상이한 부피(예를 들어, 50, 100 및 400uL)를 건강한 환자 BL3("BL3 혈장")로부터의 스파이킹하였다. 500uL의 BL3 혈장으로 시작하여, 상이한 부피(예를 들어, 0uL, 50uL, 100uL 또는 400uL)의 정제된 세포주-유래 세포외 소포를 첨가하였다. 이어서, 완충 용액, 예를 들어, PBS를 세포외 소포의 정제 전에 각각의 샘플이 900uL의 부피에 도달하도록 첨가하였다. 혈장 샘플로부터의 세포외 소포 정제를 위한 예시적인 프로토콜은, 크기 배제 칼럼 정제 후 세포외 소포를 희석된 400uL까지 농축시키고, ELISA 포획 완충액에서 직경이 80㎚ 초과인 ㎖당 약 3e9개의 나노입자까지 희석시키고, 30uL에서 PCR 플레이트에 플레이팅하였다는 것을 제외하고는, 하기 "건강한 혈장 및 IV기 혈장으로부터의 세포외 소포 정제" 섹션에 기재되어 있다.
건강한 혈장 및 IV기 혈장으로부터의 세포외 소포 정제
일부 실시형태에서, 혈장 세포외 소포를 정화시키고, 그 후 즉시 크기 배제 정제 칼럼에 로딩하였다. 약 65㎚ 내지 약 200㎚의 크기 범위를 갖는 나노입자를 각각의 샘플에 대해 수집하였다.
입자 계수치
실시예 3에 기재된 바와 같이 입자 계수를 수행하였다.
PCR 플레이트 웰에 대한 세포외 소포의 포획 또는 고정
일부 실시형태에서, 세포외 소포를 PCR 플레이트 상에 포획하였다. 예를 들어, 암 세포외 소포를 표적으로 하는 항체로 코팅된 표면을 사용하여 암 세포외 소포체를 선택적으로 포획할 수 있다. 또 다른 예는 세포외 소포의 바이오티닐화 스트렙타비딘(예를 들어, BioTez 제품) 코팅된 PCR 웰에서의 포획이다.
세포외 소포 고정
일부 실시형태에서, (1× PBS 중의) 적절한 농도의 폼알데하이드를 PCR 플레이트 표면 상에 흡착된 세포외 소포에 첨가하였다. 이어서 고정된 세포외 소포를 다음 단계에서 사용하기 위해 세척하였다.
샘플 차단 및 세포외 소포 투과화
고정된 세포외 소포를 포함하는 샘플을 차단 완충액과 혼합하였다. 일부 실시형태에서, 차단 완충액은 완충 용액, 예컨대, 인산염 무함유 완충액(예를 들어, 캔도 바이오사이언스사(Candor Bioscience)로부터의 LowCross-Buffer®)에 적절한 농도의 Triton X-100 또는 연어 정자 DNA를 포함한다.
검출 프로브 결합
검출 프로브(예를 들어, 항체 작용제의 양을 기준으로 약 1 ug/㎖의 농도에서)를 세포외 소포(예를 들어, 고정되고, 차단되고, 선택적으로 투과화된 온전한 세포외 소포)를 포함하는 샘플에 첨가하였다. 그 다음, 혼합물을 검출 프로브가 표적 바이오마커를 포함하는 세포외 소포에 결합하도록 하는 조건 하에 인큐베이션시킨다.
결합 후 세척
일부 실시형태에서, 샘플을 적절한 완충액에서 예를 들어, 수 회 세척하였다.
결찰
결합되지 않은 검출 프로브를 제거하기 위한 세척 후, 검출 프로브-결합된 세포외 소포(고체 기질 표면에 포획됨)를 결찰 믹스와 접촉시켰다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다.
PCR
결찰 후, 검출 프로브-결합된 세포외 소포(고체 기질 표면에 포획됨)를 PCR 믹스와 접촉시켰다. PCR을 예를 들어, Quant Studio 3에서 하기 예시적인 PCR 프로토콜로 수행하였다: 95℃에서 1분 동안 유지, 95℃에서 5초 동안 및 62℃에서 15초 동안의 50회 주기 수행 및 표준 용융 곡선. 온도 변화율은 표준이도록 선택하였다(초당 2℃). 모든 qPCR을 2회 또는 3회 수행하였고, ROX를 수동 참조로서 사용하여 qPCR 신호를 정규화하였다. 이어서 데이터를 Quant Studio 3 기계로부터 다운로딩하고, Python 3.7로 분석하고, 플로팅하였다.
결과 및 논의
스파이크-인 실험:
검출 프로브의 4종의 상이한 조합물(표 4에 나타낸 바와 같은 표적 마커의 상이한 조합물에 지향됨) 각각에 대한 원시 qPCR 플롯을 얻은 다음(데이터 나타내지 않음), 분석하여 델타 Ct 플롯을 생성시켰고( 도 14a 내지 도 14d 에 도시된 바와 같음), BL3 혈장 샘플(건강한 혈장 샘플)을 0 기준선으로 취하였다.
조합물 1(표 4에 나타냄)은 모든 SK-MEL-1 세포외 소포 농도에 대해 가장 큰 델타 Ct(도 14a)를 생성시켰는데, 그 이유는 조합물 1의 표적 마커 B가 대부분 SK-MEL-1에서 발현되지만, 폐 선암종, 예컨대, HCC4006에서는 발현되지 않기 때문이다. SK-MEL-1 세포외 소포 혈장 샘플에 대한 델타 Ct 값은 HCC4006 세포외 소포 혈장 샘플의 값보다 높았는데, 따라서 이는 이러한 조합물 마커에 지향되는 검출 프로브를 사용하는 시스템이 흑색종을 검출하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 조합물 2(표 4에 나타냄)는 더 높은 농도(100uL 및 400uL)의 HCC4006 세포외 소포에 대해 더 큰 델타 Ct( 도 14b )를 생성시켰다. 조합물 3(표 4에 나타냄)은 폐 선암종 세포외 소포 HCC4006을 함유하는 혈장 샘플에 대해 가장 큰 델타 Ct( 도 14c )를 생성시켰다. HCC4006 세포외 소포 혈장 샘플에 대한 델타 Ct 값은 SK-MEL-1 세포외 소포 혈장 샘플의 값보다 높았는데, 따라서 이는 이러한 조합물 마커에 지향되는 검출 프로브를 사용하는 시스템이 폐 선암종을 검출하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 조합물 4(표 4에 나타냄)는 모든 수준의 HCC4006 세포외 소포에 대해 강한 신호를 나타내지 않았다( 도 14d ).
스파이크-인 실험은 흑색종 및 폐 선암종 환자 혈장 샘플을 모의실험하여 암 스크리닝을 위한 바이오마커의 상이한 조합물의 유용성을 평가하였다. 상기에 논의된 바와 같이, 조합물 1은 도 14a 에 도시된 바와 같이 SK-MEL-1 세포외 소포 스파이킹된 혈장의 모든 수준과 시험된 다른 모든 샘플 사이를 구별할 수 있었다. 조합물 1이 SK-MEL-1 스파이킹된 샘플에 대한 가장 강한 신호를 제공하였다는 것을 고려할 때, 본 개시내용을 읽는 당업자는 예를 들어, 조합물 1에서 표적 마커에 지향되는 검출 프로브를 갖는 본 명세서에 기재된 시스템이 환자 샘플을 스크리닝하는 경우 흑색종에 대해서 민감하고, 특이적일 수 있음을 인식할 것이다. 상기에 논의된 바와 같이, 조합물 3은 HCC4006 스파이크 인의 3종의 농도 모두에 대해 가장 강한 신호(도 14c)를 가졌으며, 이는 조합물 3을 폐 선암종 환자 샘플에 대해 시험하기에 가장 좋은 후보로 만들었다.
건강한 대조군 및 폐 선암종(LUAD) 환자 혈장 샘플에서 조합물 3 및 조합물 5
조합물 3을 사용하여 HCC4006 세포외 소포 스파이크-인 혈장 샘플에서 검출된 강한 신호의 관점에서, 조합물 3을 선택하여 LUAD 환자 혈장 샘플을 평가하였다. 도 15a 내지 도 15c 에 도시된 바와 같이, 조합물 3은 매우 높은 민감도 및 특이성으로 LUAD 환자 샘플(STIV 샘플)과 건강한 대조군(HC 샘플)을 구별할 수 있었다. 도 15c 는 일부 실시형태에서 이러한 검정이 100% 감도 및 100% 특이성을 제공할 수 있음을 나타낸다.
조합물 3에 더하여, 조합물 5(표 4에 나타낸 바와 같음)를 또한 선택하여 LUAD 환자 혈장 샘플을 평가하였다. 도 16a 내지 도 16c 에 도시된 바와 같이, 조합물 5는 매우 높은 민감도 및 특이성으로 LUAD 환자 샘플(STIV 샘플)과 건강한 대조군(HC 샘플)을 구별할 수 있었다. 도 16c 는 일부 실시형태에서 이러한 검정이 100% 감도 및 100% 특이성을 제공할 수 있음을 나타낸다.
흥미롭게도, 도 17 에 도시된 바와 같이 조합물 3과 조합물 5에 대한 정규화된 신호 사이에 매우 높은 상관관계(r2 = 0.99)가 존재하였는데, 이는 본 명세서에 제시된 결과의 일관성을 나타낸다. 예를 들어, 샘플 STIV A에서의 신호 강도는 다른 LUAD 샘플 신호 중에서 일관되게 가장 높았으며, 이는 치료 반응을 예고하는 데 예후적 가치를 제공할 수 있다.
본 명세서에 제공된 발견은, 바이오마커의 적절한 조합물에 지향되는 검출 프로브(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 포함하는 시스템 및 방법이 상이한 유형의 암 환자(예를 들어, 폐 선암종 환자 대 흑색종 환자)를 구별하거나, 정상적인 건강한 대상체와 암 환자를 구별하는 데 유용하다는 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법을 사용하여 암의 병기(예를 들어, I기, II기, III기 및 IV기)를 식별할 수 있다.
실시예 5: 암과 연관된 개별 세포외 소포의 검출
본 실시예는 표적-결합 모이어티 및 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인(이중-가닥 부분 및 단일 가닥 오버행 포함)을 각각 포함하는 표적(예를 들어, 표적 바이오마커(들))에 대한 검출 프로브의 합성을 기재한다. 본 실시예는 2개 이상의 구별되는 표적을 포함하는 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 이러한 검출 프로브의 사용을 추가로 입증한다.
일부 실시형태에서, 검출 프로브는 하나의 단부에 표적 암 바이오마커에 특이적인 항체 작용제 및 또 다른 단부에 단일 가닥 오버행을 갖는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 2개 이상의 검출 프로브가 동일한 생물학적 엔티티(예를 들어, 세포외 소포)에 결합되는 경우, 검출 프로브의 단일-가닥 오버행은, 이들이 서로 혼성화하여 이중-가닥 복합체를 형성하고, 그 다음 검출을 위해서 결찰되고 증폭될 수 있도록 가깝게 근접하게 존재할 수 있다.
본 연구는 각각 동일한 표적 바이오마커에 지향되는 2종의 검출 프로브를 사용했지만, 본 개시내용을 읽는 당업자는 2종의 검출 프로브가 상이한 표적 바이오마커에 지향되는 경우 또는 각각 구별되는 표적 단백질에 대한 3종 이상의 검출 프로브가 사용되는 경우를 이해할 것이다. 또한, 본 실시예에 기재된 조성물 및 방법은 상이한 생물학적 샘플(예를 들어, 세포외 소포를 포함함)에서의 적용으로 확장될 수 있다.
본 실시예는, 본 명세서에 제공된 기술이 암에 대한 표적 바이오마커 조합물(암 마커 1 및 암 마커 2, 예를 들어, 일부 실시형태에서, 암 마커 2에 지향되는 검출 프로브와 함께 포획 표적으로서 암 마커 1을 사용함)을 사용하여 환자 샘플에서 암(예를 들어, 난소 낭선암종)을 검출할 수 있다는 것을 입증한 특정 실험으로부터의 실험 데이터를 나타낸다. 첫 번째 실험은 본 명세서에 기재된 듀플렉스 시스템 검정을 사용하여 PBS에서 2개의 상이한 암세포주-유래-세포외 소포(CLD-EV)의 검출을 입증하였다. 예를 들어 도 19 를 참고하기 바란다.
CLD-EV를 검출할 수 있는 이러한 듀플렉스 시스템 검정으로, 각각의 병기(I기 내지 IV기) 및/또는 하위유형의 암 및 다양한 대조군(예를 들어, 건강한 대상체, 양성 종양을 갖는 대상체 및 비-표적 암을 갖는 대상체)으로부터의 환자 샘플을 함유하는 연구를 수행하였다. 암(예를 들어, 난소암)의 검출을 위한 예시적인 듀플렉스 시스템 검정의 성능을 나타낸 실시예 6 및 도 21 내지 도 22 를 참고하기 바란다.
예시적인 검정의 개요
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 표적 엔티티 검출 시스템은 듀플렉스 시스템이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, 도 2A a 도시된 바와 같은, 이러한 듀플렉스 시스템은 각각 상이한 에피토프를 인식하는 2개의 항체를 이용한다. 짝을 이룬 이중-가닥 주형 DNA가 또한 qPCR에서 이용되며, 이들 각각은 이의 파트너 상에 5' 오버행에 상보적인 특이적 4-염기 5' 오버행을 갖는다. 각각의 항체는 2개의 이중-가닥 DNA 주형 중 하나와 접합된다. 항체가 이의 표적 에피토프에 결합하는 경우, 각각의 주형의 끈적한 단부가 혼성화할 수 있다. 이어서 이러한 끈적한 단부는 PCR 증폭 전에 T7 리가제에 의해 함께 결찰된다. 두 DNA 주형 간의 혼성화가 일어나게 하기 위해서, 두 항체는 서로 충분히 가깝게 결합할 필요가 있다(DNA 링커와 항체의 길이가 50 내지 60㎚ 이내). 결합하지만 비결찰되어 유지되는 임의의 주형은 도 2a 에 도시된 바와 같이 PCR 산물을 생산하지 않을 것이다.
건강한 대조군 대 I기, II기, III기 및 IV기 암 환자 혈장:
건강한 대조군 및 암 환자(예를 들어, 난소암 환자)로부터의 혈장 샘플을 처리하여 정제된 세포외 소포를 수득하고, 이를 하기에 기재된 예시적인 검정을 사용하여 조사하였다.
항-암 마커 1 항체와 공유 접합된 자성 비드를 사용하여 정제된 EV를 포획하였다. 비드에 의해 포획된 EV를 각각 암 마커 2에 지향되는 항체 및 구별되는 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)을 포함하는 2개의 검출 프로브의 세트를 사용하여 프로파일링하였다.
암 마커 1과 암 마커 2의 바이오마커 조합물은 건강한-조직-유래 세포외 소포와의 교차 반응성을 최소화하기 위해 신중하게 선택되었다. 건강한 조직과의 이러한 바이오마커 조합물의 교차 반응성은 부분적으로 표적 암, 예를 들어, 난소 낭선암종에서 차등적으로 발현된 mRNA의 히트맵을 사용함으로써 생물정보학적으로 예측되었다. 따라서, 마커의 상이한 조합물은 건강한 조직의 세포외 소포의 표면보다 암-연관된 세포외 소포 표면에 훨씬 더 풍부할 것으로 예측될 수 있다.
Figure pct00009
예시적인 방법:
올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열 구조 및 변형을 가질 수 있다. 하기의 가닥 번호는 도 2a에 도시된 가닥과 연관된 수치에 상응함이 주목된다.
가닥 1 v1:
/5AzideN/CAGTCTGACACAGCAGTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AzideN/은 NHS 에스터 링커를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아자이드기를 지칭함
/5AmMC12/CAGTCTGACACAGCAGTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함, 또는
/5티올MC6/CAGTCTGACACAGCAGTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5티올MC6/은 6-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 티올을 지칭함
가닥 2 v1:
/5AzideN/GACCTGACCTACAGTGACCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AzideN/은 NHS 에스터 링커를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아자이드기를 지칭함, 또는
/5AmMC12/GACCTGACCTACAGTGACCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC1/은 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함, 또는
/5티올MC6/GACCTGACCTACAGTGACCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5티올MC6/은 6-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 티올을 지칭함
가닥 3 v1:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGACTGCTGTGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4 v1:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGTCACTGTAGGTCAGGTC, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 5 v1:
CAGTCTGACACAGCAGTCGT
가닥 6 v1:
GACCTGACCTACAGTGACCA
가닥 7 (프로브) v1:
/56-FAM/TGGCTAGAC/ZEN/AGAGGTGTACTCCTAGTGAGA/3IABkFQ/, 여기서 /56-FAM/은 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에서의 플루오레세인(예를 들어, 6-FAM)을 지칭하고; /3IABkFQ/는 3' 올리고뉴클레오타이드 말단에서의 플루오레세인 소광제를 지칭함
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열 구조 및 변형을 가질 수 있다. 하기의 가닥 번호는 도 2a에 도시된 가닥과 연관된 수치에 상응함이 주목된다.
가닥 1 v2:
/5AzideN/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AzideN/은 NHS 에스터 링커를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아자이드기를 지칭함 또는
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함 또는
/5티올MC6/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5티올MC6/은 6-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 티올을 지칭함
가닥 2 v2:
/5AzideN/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AzideN/은 NHS 에스터 링커를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아자이드기를 지칭함, 또는
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC1/은 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함 또는
/5티올MC6/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5티올MC6/은 6-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 티올을 지칭함
가닥 3 v2:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4 v2:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGACTTCGTAGGTCTGGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 5 v2:
CAGTCTGACTCACCACTCGT
가닥 6 v2:
CACCAGACCTACGAAGTCCA
가닥 7 (프로브) v2:
/56-FAM/TGGCTAGAC/ZEN/AGAGGTGTACTCCTAGTGAGA/3IABkFQ/, 여기서 /56-FAM/은 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에서의 플루오레세인(예를 들어, 6-FAM)을 지칭하고; /3IABkFQ/는 3' 올리고뉴클레오타이드 말단에서의 플루오레세인 소광제를 지칭함
항체-올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 항체-DNA) 접합:
표적 마커(예를 들어, 암 마커 2)에 지향되는 항체 60ug 분취물을 예를 들어, 구리-무함유 클릭 화학을 사용하여, 혼성화된 가닥 1+3 및 2+4와 접합시켰다. 첫 번째 단계는 아자이드-변형된 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, DNA 도메인)과의 접합 반응에 참여하기 위해 DBCO 기능화된 항체를 준비하는 것이었다. 이것은 항체를 DBCO-PEG5-NHS 이종이작용성 가교제와 반응시키는 것으로 시작되었다. NHS 에스터와 이용 가능한 라이신기 사이의 반응을 실온에서 2시간 동안 일어나도록 한 후, 원심 한외여과를 사용하여 미반응 가교제를 제거하였다. 접합을 완료하기 위해, 아자이드-변형된 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, DNA 도메인) 및 DBCO-작용화된 항체를 실온에서 밤새 반응시켰다.
세포 배양
음성 대조군 세포(예를 들어, 비-표적 암 세포, 예컨대, 흑색종 세포 또는 건강한 세포)를 10% 엑소좀 무함유 FBS 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 이글 최소 필수 배지(EMEM)에서 성장시켰다. 암 세포(예를 들어, 난소암 세포)를 10% 엑소좀 무함유 FBS 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI 1640)에서 성장시켰다. 암의 검출을 위한 검정의 개발에 유용할 수 있는 예시적인 암 세포주(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)는 A2780, Caov-3, COV413A, ES2, OVCAR-3, OV90, PA-1, SK-OV-3, SW 626, TOV-112 및 문헌[Ince et al., "Characterization of twenty-five ovarian tumor cell lines that phenocopy primary tumours" Nature Communications 6: 7419 (2015)]에 기재된 세포주를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다 모든 세포주를 5% CO2 및 37℃에서 유지시켰고, 계대 수는 20 미만이었다.
세포 배양 배지로부터의 세포외 소포의 정제
일부 실시형태에서, 암 세포(예를 들어, 난소암 세포) 및 음성 대조군 세포를 약 80% 컨플루언시에 도달할 때까지 각각의 배지에서 성장시켰다. 세포 배양 배지를 수집하고, 실온(RT)에서 5분 동안 300×rcf에서 회전시켜 세포 및 파편을 제거하였다. 그런 다음 상청액을 수집하고, -80℃에서 동결시켰다.
사용 전에, -80℃에 저장된 냉동 상청액을 해동시키고, 이어서 세포 및 큰(예를 들어, 직경 1마이크론 초과) 세포 단편을 정화시켰다. 해동된 상청액은 원심분리를 사용하여 정화시켰다.
일부 실시형태에서, 정화된 세포 배양 배지(예를 들어, 약 500uL)를 크기 배제 정제 칼럼에 통과시켰다. 약 65㎚ 내지 약 1000㎚의 크기 범위를 갖는 나노입자를 각각의 샘플에 대해 수집하였다. 일부 실시형태에서, 더 작은 입자 범위가 바람직할 수 있다.
입자 계수:
예를 들어, 예를 들어, TS400 칩을 사용하는 SpectroDyne 입자 계수 기기를 사용하여 입자 계수치를 얻어서 65 내지 1000㎚의 나노입자 범위를 측정하였다. 일부 실시형태에서, 더 작은 입자 범위가 바람직할 수 있다.
전체-혈장 정화:
EV 정제 전에, 샘플은 샘플 취급에 참여하지 않을 작업자에 의해 샘플을 맹검되었다. 환자-식별 정보는 데이터 분석이 가능하도록 실험이 완료된 후에 공개되었다. 전체 혈장의 1㎖ 분취물을 -80℃에서 저장에서 제거하고, 3회의 정화 스핀에 적용하여 세포, 혈소판 및 부스러기를 제거하였다.
정화된 혈장으로부터의 EV의 크기-배제 크로마토그래피 정제:
각각의 정화된 혈장 샘플을 일회용 크기-배제 정제 칼럼을 통해 전개시켜 EV를 단리시켰다. 약 65㎚ 내지 약 1000㎚의 크기 범위를 갖는 나노입자를 각각의 샘플에 대해 수집하였다. 일부 실시형태에서, 더 작은 입자 범위가 바람직할 수 있다.
자성-포획 비드에 대한 포획-항체 접합:
항체를 자성 비드에 접합시켰다. 간략하면, 비드를 멸균 환경에서 칭량하고, 완충액에 재현탁시켰다. 항체를 작용화된 비드와 혼합하고, 접합 반응이 종단 간 혼합으로 발생하였다. 비드를 접합 키트에 의해서 제공된 세척 완충액을 사용하여 수 회 세척하고, 제공된 저장 완충액에 4℃에서 저장하였다.
항체-접합된 자성 비드를 사용한 정제된 혈장 EV의 직접 포획:
EV 포획을 위해서, 정제된 혈장 EV의 희석된 샘플을 EV 표적(예를 들어, 암 마커 1)에 지향되는 항체와 접합된 자기 비드와 함께 적절한 시간 동안, 예를 들어 실온에서 인큐베이션시켰다.
자성 포획 비드에 결합된 EV에 대한 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체의 결합:
EV 포획 검정(예를 들어, 상기에 기재된 것)에서 사용된 것과 상이한 EV 표적(예를 들어, 암 마커 2)에 지향되는 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체("항체 프로브")를 최적 농도의 적절한 완충액에서 희석시켰다. 항체 프로브를 자성 포획 비드에 결합된 EV를 포함하는 샘플과 상호작용하도록 하였다.
결합 후 세척:
일부 실시형태에서, 샘플을 적절한 완충액에서 예를 들어, 수 회 세척하였다.
결찰:
결합되지 않은 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 세포외 소포 및 결합된 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체가 있는 비드를 결찰 믹스와 접촉시켰다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다.
PCR:
결찰 후, 결합된 세포외 소포 및 결합된 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 갖는 비드를 PCR 믹스와 접촉시켰다. PCR을 예를 들어, Quant Studio 3에서 하기 예시적인 PCR 프로토콜에 따라서 96-웰 플레이트에서 수행하였다: 95℃에서 1분 동안 유지, 95℃에서 5초 동안 및 62℃에서 15초 동안의 50회 주기 수행. 온도 변화율은 표준이도록 선택하였다(초당 2℃). 각각의 실험 복제에 대해 단일 qPCR 반응을 수행하였고, ROX를 qPCR 신호를 정규화하기 위한 수동 기준으로 사용하였다. 이어서 데이터를 Quant Studio 3 기계로부터 다운로딩하고, Python 3.7로 분석하고, 플로팅하였다.
데이터 분석:
일부 실시형태에서, 이진 분류 시스템을 데이터 분석을 위해 사용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 검정으로부터의 신호를 참조 신호에 기초하여 정규화시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 참조 샘플을 선택함으로써 단일 항체 듀플렉스에 대한 정규화된 신호를 계산되었다. 일부 실시형태에서, 임의의 샘플 i에 대한 정규화된 신호를 계산하는 데 사용되는 방정식을 하기에 제공하며, 식 중, 여기서 신호max는 최고 농도의 세포주 EV 표준품으로부터의 신호이다.
Figure pct00010
대표적인 결과:
시험관내 세포주 실험
정제된 세포주 EV를 적절한 완충액에서 최적 농도로 희석시키고, 암 마커 1-작용화 비드(1㎖ 복제품)를 사용하여 포획하였다. 포획된 EV를 각각 암 마커 2에 지향되는 한 쌍의 항체 프로브를 사용하여 분석하였다. 대표적인 qPCR 데이터 및 ACt 값을 도 19에 제공한다. 이 데이터는, 시험된 바이오마커 조합물(예를 들어, 본 실시예에 기재되고 도 1 내지 도 2b 에 도시된 바와 같은 예시적인 검정과 조합됨)이 두 마커의 발현과 양호하게 상관되는 신호 강도로, 음성 대조군 세포주로부터 암-유래 EV를 구별할 수 있다는 것을 나타낸다(표 5 참고).
파일럿 암 환자 혈장 연구
파일럿 연구에 포함된 암 환자(예를 들어, 난소암 환자)의 인구 통계를 도 20 에 제공한다. 상이한 샘플 코호트에 걸쳐 연령 및 성별을 가능한 한 가깝게 일치시키도록 주의를 기울였다.
1밀리리터의 환자 샘플 혈장을 상기에 기재된 바와 같이 정화시키고, EV를 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제시켰다. EV는 항암 마커 1 자기 비드를 사용하여 포획되었다. 항암 마커 1 자성 비드에 의해 포획된 EV를 암 마커 2에 지향되는 항체 프로브를 사용하여 프로파일링하였다. 암(예를 들어, 난소암)의 검출을 위한 예시적인 듀플렉스 시스템 검정의 성능을 나타낸 실시예 6 및 도 21 내지 도 22 를 참고하기 바란다.
논의:
본 실시예는, 제2 표적 바이오마커에 지향되는 (예를 들어, 본 실시예에 기재되고, 도 1 내지 도 2b 에 예시된 바와 같은) 듀플렉스 검출 검정과 조합하여, 제1 표적 바이오마커에 지향되는 포획 검정(예를 들어, 본 명세서에 이용되고/되거나 기재됨)이 제1 표적 바이오마커와 제2 표적 바이오마커의 조합물이 표적 암의 검출에 특이적이고, 초기 병기 암(예를 들어, 난소 낭선암종)을 99.5% 초과의 특이성으로 검출할 수 있다는 것을 입증한다.
일부 실시형태에서, 항체당 최대 16개 가닥의 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, DNA)을 추가할 수 있는 덴드론을 항체당 1 또는 2개 DNA 가닥 대신에 사용하여 예를 들어, 신호-대-노이즈를 향상시킬 수 있다.
실시예 6: 암 액체 생검 검정의 개발
본 실시예는 예를 들어, 유전적- 및 평균-위험 대상체를 스크리닝하기 위한 암 액체 생검 검정의 개발을 기재한다. 모든 암 중에서 여성의 다섯 번째로 큰 사망 원인이었음에도 불구하고(문헌[Howlader et al., 2019]), 현재 평균-위험 여성을 위한 권장되는 난소암 검진 도구는 없다. 이것은 부분적으로 제안된 난소암 스크리닝 기술의 열악한 성능 때문이다. 평균-위험 여성에서의 난소암 발병률을 감안할 때, 부적절한 시험 특이성(99.5% 미만)이 진양성보다 10배 초과하게 많은 위양성 결과를 초래한다. 이는 의료 시스템에 상당한 부담을 주고, 위양성 결과로서 스크리닝된 여성은 추가 검사, 불필요한 수술 및 정서적/신체적 고통으로 이어진다(문헌[Buys et al., 2011]). 결과적으로, 임상적 유용성을 제공하기 위해 두 가지 특징을 나타낼 수 있는 난소암 스크리닝 시험을 개발하는 것이 바람직할 수 있다: (1) 위양성의 수를 최소화하기 위한 초고 특이성(99.5% 초과), 및 (2) 예후가 가장 양호한 경우 I기 및 II기 난소암에 대해서 높은 감도(40% 초과). 이러한 시험의 개발은 매년 수 만명의 생명을 구할 가능성을 갖는다.
순환 종양 DNA(ctDNA), 순환 종양 세포(CTC), 벌크 단백질 및 세포외 소포(EV)를 포함하는 난소암 액체 생검 검정을 위해 몇몇 상이한 바이오마커 부류가 연구되어 왔다. EV는 ctDNA 및 CTC에 비해 혈류에서의 풍부함 및 안정성으로 인해 특히 유망하며, 이는 초기 암에 대한 감도가 향상되었음을 시사한다. 또한 EV는 동일한 세포에서 유래한 카고(예를 들어, 단백질, RNA, 대사산물)을 함유하여, 벌크 단백질 측정보다 우수한 특이성을 제공한다. 진단 유틸리티 EV가 연구되는 동안, 이러한 작업의 대부분은 벌크 EV 측정 또는 낮은 처리량의 단일 EV 분석과 관련이 있다.
본 실시예는 본 명세서에 기재되고/되거나 이용되는 기술을 사용하여 인간 혈장에서 개별 세포외 소포(EV)의 프로파일링을 통한 초기 병기 암 검출을 위한 예시적인 접근법의 일 양상을 기재한다. 엑소좀 및 미세소포를 포함한 EV는 공동 국지화된 단백질, RNA, 대사산물 및 기원 세포를 나타내는 다른 화합물을 함유한다(문헌[Kosaka et al., 2019]). 단일 EV 내에서 공동 국지화된 마커의 검출은 정상 조직에서 암세포를 구별하는 능력을 포함하여, 초고 특이성을 갖는 세포 유형의 식별을 가능하게 할 수 있다. 바이오마커가 혈액(즉, cfDNA)에 들어가기 위해 세포 사멸에 의존하는 다른 암 진단 접근법과 달리, EV는 기능하는 세포에 의해 높은 속도로 방출된다. 단일 세포는 시험관내에서 하루에 최대 10,000개의 EV를 방출하는 것으로 나타났다(문헌[Balaj et al., 2011]). 또한 암세포가 건강한 세포보다 더 빠른 속도로 EV를 방출한다는 것이 널리 받아들여지고 있다(문헌[Bebelman et al. 2018]).
일 양상에서, 검출 검정에 사용하기 위한 암-연관된 바이오마커(예를 들어, 본 명세서에 기재되고/되거나 이용됨)는 건강한 조직에 비해 암에서 상향조절되는 유전자를 포함하며, 이는 예를 들어, 본 출원인의 독점 생물정보학 바이오마커 발견 과정을 사용하여 식별될 수 있다. 예시적인 개별 EV 검정(예를 들어, 도 1 또는 도 2a 및 도 2b 에 도시되고/되거나 본 명세서에 기재된 것 참고)을 사용하여, 개별 소포 상의 이러한 바이오마커의 공동 국지화 검출되는데, 이는 바이오마커의 군화가 동일한 세포로부터 유래되었음을 나타낸다. 이것은 다수의 상향 조절된 암 바이오마커가 하나 이상의 건강한 조직에 의해 발현된다는 점을 고려할 때, 벌크 EV 검정을 포함한 벌크 바이오마커 측정에 우수한 특이성을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 예를 들어, 질환의 유병률이 낮고, 높은 양성 예측 값(10% 초과)이 요구되는 난소암을 위한 암을 위한 암 스크리닝 시험으로서 특히 도움이 되는 초고 특이성을 갖는 기술을 제공한다(문헌[Seltzer et al., 1995]).
바이오마커 발견
일부 실시형태에서, 바이오마커 발견 과정은 대규모 데이터베이스의 생물정보학적 분석 및 암(예를 들어, 난소암) 및 세포외 소포의 생물학에 대한 이해를 활용한다.
개별 세포외 소포 분석
혈액에서 종양-유래 EV의 검출은 다양한 범위의 건강한 조직으로부터의 100억개의 EV의 배경에서 혈장 밀리리터당 비교적 적은 종양-유래 EV를 검출하기에 충분한 선택성 및 감도를 갖는 검정을 필요로 한다. 본 개시내용은 다른 것 중에서 이러한 과제를 해결하는 기술을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 개별 세포외 소포 분석을 위한 검정이 도 1에 예시되어 있으며, 이는 하기에 요약된 세 가지 주요 단계로 수행된다:
1. EV를 가용성 단백질 및 다른 간섭 화합물을 99%를 초과하게 제거한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 환자 혈장으로부터 정제한다.
2. 종양-특이적 EV를 막-결합된 단백질에 특이적인 항체-작용화된 자성 비드를 사용하여 포획한다.
3. 변형된 버전의 근접-결찰 면역 정량적 중합효소 연쇄 반응(pliq-PCR)을 수행하여 포획된 EV 상에 또는 그 내에 함유된 추가 단백질 바이오마커의 공동 국지화를 결정한다.
pliq-PCR 검정의 변형된 버전의 많은 실시형태에서, 2개 이상의 상이한 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 항체-작용화된 자성 비드에 의해 포획된 EV에 첨가하고, 항체는 후속적으로 이의 단백질 표적에 결합한다. 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 단일-가닥 오버행을 갖는 dsDNA로 구성되며, 따라서 가깝게 근접할 때(즉, 상응하는 단백질 표적이 동일한 EV 상에 위치할 때) 혼성화할 수 있다. 결합되지 않은 항체-올리고뉴클레오타이드 종을 세척한 후, 인접하게 결합된 항체-올리고뉴클레오타이드 종을 표준 DNA 리가제 반응을 사용하여 결찰시킨다. 결찰된 주형 가닥의 후속 qPCR은 공동 국지화된 단백질 종의 검출 및 상대적 정량을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 2 내지 20개의 구별되는 항체-올리고뉴클레오타이드 프로브가, 예를 들어, 제공된 표적 엔티티 검출 시스템을 포함하는 이러한 검정에 혼입될 수 있다.
pliq-PCR은 EV를 프로파일링하는 다른 기술에 비해 많은 장점이 있다. 예를 들어, pliq-PCR은 다른 표준 면역검정, 예컨대, ELISA보다 세 자릿수 더 큰 감도를 갖는다(문헌[Darmanis et al., 2010]). 양호하게 최적화된 pliq-PCR 반응의 초저 LOD는 종양 유래 EV의 미량 수준을 ㎖당 천 개의 EV까지 검출할 수 있다. 이는 각각 약 103 및 내지 약 104개의 EV의 LOD를 보고한 나노플라즈믹 엑소좀(nPLEX) 센서(문헌[Im et al., 2014]) 및 통합 자성 -전기화학 엑소좀(iMEX) 센서(문헌[Jeong et al., 2016])를 포함하는 다른 출현하는 EV 분석 기술과 유리하게 비교된다(문헌[Shao et al., 2018] 참고). 더욱이, 일부 실시형태에서, pliq-PCR 접근법의 변형된 버전은 복잡한 장비를 필요로 하지 않으며, 개별 EV에서 다중 바이오마커의 공동 국지화를 고유하게 검출할 수 있다.
일부 실시형태에서, 개별 EV 프로파일링 검정의 감도 및 특이성을 추가로 개선시키기 위해, EV 바이오마커의 다른 부류는 mRNA를 포함하고, (EV 표면 단백질에 추가하여) 소포내 단백질이 검정에서, 식별되고 포함될 수 있다.
예비 작업
예비 연구를 통해, 바이오마커 후보물질이 EV에 존재하고 상업적으로 이용 가능한 항체 또는 mRNA 프라이머-프로브 세트에 의해 검출될 수 있는 것으로 검증되는 작업흐름이 개발된다. 주어진 관심대상 바이오마커에 대해, 관심대상 바이오마커를 발현하는 하나 이상의 세포주(양성 대조군) 및 이를 발현하지 않는 하나 이상의 세포주(음성 대조군)를 배양하여 세포 배양 배지를 농축시키고, 정제를 수행하여 관심대상 크기 범위를 갖는 나노입자를 단리(예를 들어, SEC 사용)시킴으로써 EV를 수거할 수 있다. 전형적으로, 세포외 소포는 30㎚ 내지 수 마이크로미터의 직경 범위일 수 있다. 예를 들어, 문헌[Chuo et al., "Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods" Journal of Biomedical Sciences 25: 91 (2018)]을 참고하기 바라며, 이것은 상이한 세포외 소포(EV) 하위유형에 대한 크기의 정보를 제공한다: 마이그래좀(migrasome)(0.5 내지 3pm), 마이크로소포(0.1 내지 1pm), 온코좀(oncosome)(1 내지 10pm), 엑소머(exomere)(50㎚ 미만), 작은 엑소좀(60 내지 80㎚) 및 큰 엑소좀(90 내지 120㎚). 일부 실시형태에서, 약 30㎚ 내지 1000㎚의 크기 범위를 갖는 나노입자가 검출 검정을 위해 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 EV 하위유형(들)이 검출 검정을 위해 단리될 수 있다.
독점적인 바이오마커 발견 과정을 통해, 건강한 조직에 비해 암(예를 들어, 난소암)에서 상향조절되는 2개의 막-결합 단백질 바이오마커를 식별하고, 세포주 EV 및 암 환자 샘플의 개념 증명 실험에 사용하였다.
조합물이 암(예를 들어, 난소암)의 특이적 검출인 공동 국지화된 암 마커 1 및 암 마커 2를 함유하는 EV로부터의 검정 신호를 검출하기 위해서, 일부 실시형태에서, 암 마커 1에 지향되는 면역친화성 포획 및 암 마커 2에 지향되는 2개의 구별되는 항체-올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는 검정 구성을 개발하였다.
항암 마커 1-작용화된 자성 비드를 사용하여 정제된 세포주 EV를 포획하였다. 도 19(패널 A) 는 예를 들어, 2개의 양성 대조군 세포주 및 1개의 음성 대조군 세포주에 대한 대표적인 qPCR 추적을 제공한다. 이 데이터는, 검정 신호에 대한 유전자 발현의 영향을 입증하는데, 여기서 더 높은 발현 세포주는 더 낮은 발현 세포주에 비해 신호에서 36배 증가(25.2)를 나타냈다. 이러한 결과는, 일부 실시형태에서 단일 EV 프로파일링 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것)이 매우 높은 감도로 단일 EV에서 공동 국지화된 막-결합된 단백질 마커를 검출할 수 있음을 입증한다.
암 세포주 EV를 사용한 포획 검정 및 검출 검정(예를 들어, 도 1 및 도 2a 및 도 2b에 예시되거나 본 명세서에 기재된 바와 같음)의 조합을 포함하는 암 검출 검정의 검증 이후에, 파일럿 연구(결국 320개의 환자 샘플로 확장됨)를 최적화되고 작업자-맹검 검정 프로토콜을 사용하여 암 환자 혈장 샘플(예를 들어, 난소암 환자 혈장 샘플)에 대해 수행하였다. 모든 혈장 샘플은 동일한 공급원에서 구입하였고, 동일한 혈액 수집 프로토콜에 따라 처리되었으며, 환자 샘플은 임의의 치료를 시작하기 전에 수집되었다(즉, 치료 미경험). 환자 코호트는 도 20 에 기재된 바와 같은 본 실시예의 연구에 포함되었다.
이러한 임상 파일럿 연구의 결과를 도 21 에 제공한다. 특이성은 모든 건강한 대조군(n=172)에 대한 로그-정규 분포를 가정하고, 99.8% 특이성에 대해서 평균 위의 2.879 표준 편차에서 컷오프(컷오프 1) 및 98% 특이성에 대해서 평균 위의 2.055 표준 편차에서 컷오프(컷오프 2)를 설정함으로써 결정하였다. 단지 예로서, 난소암의 맥락에서 99.8%의 특이성을 10,000명의 여성당 5.7의 유병률이 사용된 평균-위험 여성을 스크리닝하기 위한 PPV를 평가하는 데 사용하였다. 98% 특이성 컷오프를 사용하여 유병률이 여성 100명당 약 1명인 유전적인-위험 여성을 스크리닝하기 위한 PPV를 계산하였다. 이러한 개별 컷오프는 상이한 환자 집단에서 위양성 내성 차이를 설명하기 위해 설정되었다. 이러한 결과는 일부 실시형태에서 단일 EV 프로파일링 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)이 암 스크리닝 시험으로서 사용될 가능성이 크다는 것을 입증한다. 일부 실시형태에서, 이러한 검정의 감도는 예를 들어, 추가 바이오마커(들)에 지향되는 하나 이상의 검출 프로브 세트(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음)를 포함시킴으로써 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 바이오마커(들)는 예를 들어, 막-결합된 단백질 및 소포내 mRNA/단백질을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 표적 암과 연관된 전사체의 검출을 위해 도 23(패널 A)에 도시된 바와 같이 벌크에서 정제된 세포주 EV를 사용한 EV-mRNA 검출의 가능성이 입증되었다. 막 결합 단백질 마커의 면역친화성 포획을 통해서, 이러한 접근법은 2의 공동 국지화된 바이오마커의 검출을 가능하게 한다. 또한, 면역친화성 포획 직후에 RT-qPCR을 수행할 수 있기 때문에 EV-mRNA 검출은 더 간단한 프로토콜이 필요하다. EV를 사용한 mRNA 검출은 도 23(패널 B) 에서 입증되었는데, 여기서 항-EV 마커 1 변형된 자성 비드를 사용하여 먼저 EV를 포획하였고, EV 마커 2 mRNA를 검출하였다. 양성 세포주와 음성 세포주 둘 다 EV 마커 2를 발현하지만, 양성 세포주만 EV 마커 1을 발현한다. 양성 세포주의 선택적 검출은, 이러한 감출 시스템을 사용하여 한 자릿수 정도 더 높은 농도의 음성 세포주에서도 입증되었다.
일부 실시형태에서, 개별 EV에서 표적 바이오마커 시그니처(복수의 표적 바이오마커 포함)의 검출을 위한 암 액체 생검 검정은 (a) 적어도 1종 이상의 표적 바이오마커("포획 바이오마커(들)")에 지향되는 면역친화성 포획 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음); 및 (b) 포획 바이오마커(들)와 구별되는 표적 바이오마커 시그니처의 적어도 1종 이상의 표적 바이오마커에 지향되는 (예를 들어, 도 2a에 도시된 바와 같음) 본 명세서에 기재된 표적 엔티티 검출 시스템을 포함하는 검출 검정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 검출 검정은 이러한 표적 바이오마커 시그니처의 1종 이상의 표적 바이오마커에 지향되는 EV-mRNA 검출 검정(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같음)을 추가로 포함할 수 있다.
실시예 7: 검정 신호에 대한 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 길이의 효과
본 실시예는 표적-결합 모이어티 및 표적-결합 모이어티에 커플링된 다양한 길이의 올리고뉴클레오타이드 도메인(이중-가닥 부분 및 단일 가닥 오버행 포함)을 각각 포함하는 표적(예를 들어, 표적 바이오마커(들))에 대한 검출 프로브의 합성을 기재한다. 본 실시예는 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인의 길이가 표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것) 및/또는 이를 사용하는 방법의 성능에 영향을 미칠 수 있음을 추가로 입증한다.
표적 엔티티 검출 시스템(예를 들어, 본 명세서에 기재된 듀플렉스 표적 엔티티 검출 시스템)의 성능(예를 들어, 검정 신호)에 대한 올리고뉴클레오타이드 도메인 길이의 효과를 평가하기 위해서, 3개의 상이한 길이의 올리고뉴클레오타이드 도메인에 접합된 항체 작용제(하기에 기재됨)를 갖는 검출 프로브를 합성하였다:
Figure pct00011
길이 1("긴"): 69 내지 73개 뉴클레오타이드(4개 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는 69-뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥 부분)
Figure pct00012
길이 2("중간"): 40 내지 44개 뉴클레오타이드(4개 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는 40-뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥 부분)
Figure pct00013
길이 3("짧은"): 20 내지 24개 뉴클레오타이드(4개 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는 20-뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥 부분)
2개의 세포주 세포외 비히클(EV)을 본 실험에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. HCC4006 및 T84. 본 실험에 대한 음성 대조군은 EV가 없는 포획 비드였다. 항-표적 1-작용화 자성 비드를 사용하여 EV를 포획하였고, 항-표적 1 및 항-표적 2 검출 프로브를 사용하여 검정 신호를 생성시켰다. 표 6은 세포주 EV에서 이러한 단백질의 발현을 요약한다.
Figure pct00014
예시적인 방법:
올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열 구조 및 변형을 가질 수 있다. 하기의 가닥 번호는 도 2a에 도시된 가닥과 연관된 수치에 상응함이 주목된다. 올리고뉴클레오타이드 작용화는 하나의 작용기에서 또 다른 작용기로(예를 들어, 아민에서 아자이드로, 티올로 등) 전환될 수 있음이 또한 주목된다.
일부 실시형태에서, 하기는 길이 1("긴")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1v1:
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함; 또는
가닥 2v1:
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3v1:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4v1:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGACTTCGTAGGTCTGGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
일부 실시형태에서, 하기는 길이 1("긴")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1v2:
/5AmMC12/CAGTCTGACACAGCAGTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함; 또는
가닥 2v2:
/5AmMC12/GACCTGACCTACAGTGACCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함, 또는
가닥 3v2:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGACTGCTGTGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4v2:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGTCACTGTAGGTCAGGTC, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
일부 실시형태에서, 하기는 길이 2("중간")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1v1-중간:
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함, 또는
가닥 2v1-중간:
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCATTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3v1-중간:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4v1-중간:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAATGGACTTCGTAGGTCTGGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
일부 실시형태에서, 하기는 길이 2("중간")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1v2-중간:
/5AmMC12/CAGTCTGACACAGCAGTCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2v2-중간:
/5AmMC12/GACCTGACCTACAGTGACCATTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3v2-중간:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGACTGCTGTGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4v2-중간:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAATGGTCACTGTAGGTCAGGTC, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
일부 실시형태에서, 하기는 길이 3("짧은")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1v1-짧은:
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2v1-짧은:
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCA, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3v1-짧은:
/5Phos/GAGTACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4v1-짧은:
/5Phos/ACTCTGGACTTCGTAGGTCTGGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
일부 실시형태에서, 하기는 길이 3("짧은")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1v2-짧은:
/5AmMC12/CAGTCTGACACAGCAGTCGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2v2-짧은:
/5AmMC12/GACCTGACCTACAGTGACCA, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3v2-짧은:
/5Phos/GAGTACGACTGCTGTGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4v2-짧은:
/5Phos/ACTCTGGTCACTGTAGGTCAGGTC, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 5v1:
CAGTCTGACACAGCAGTCGT
가닥 6v1:
GACCTGACCTACAGTGACCA
가닥 5v2:
CAGTCTGACTCACCACTCGT
가닥 6v2:
CACCAGACCTACGAAGTCCA
항체-올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 항체-DNA) 접합:
바람직한 표적에 지향되는 항체를 이전 실시예에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드에 접합시켰다. 당업자는 다른 공지된 접합 방법을 사용하여 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 형성시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다.
세포 배양
HCC-4006 세포를 10% 엑소좀 무함유 FBS 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Roswell Park Memorial Institute(RPMI 1640)에서 성장시켰다. T84 세포를 1:1 둘베코 변형 이글 배지(DMEM): 5% 엑소좀 무함유 소 태아 혈청(FBS) 및 ㎖당 50단위의 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Ham의 F12 배지에서 성장시켰다. 모든 세포주를 5% CO2 및 37℃에서 유지시켰고, 계대 수는 20 미만이었다.
세포 배양 배지로부터의 세포외 소포의 정제
일부 실시형태에서, 세포를 약 80% 컨플루언스에 도달할 때까지 각각의 배지에서 성장시켰다. 세포 배양 배지를 수집하고, 실온(RT)에서 5분 동안 300×rcf에서 회전시켜 세포 및 파편을 제거하였다. 그런 다음 상청액을 수집하고, -80℃에서 동결시켰다.
사용 전에, -80℃에 저장된 냉동 상청액을 해동시키고, 이어서 세포 및 큰(예를 들어, 직경 1마이크론 초과) 세포 단편을 정화시켰다. 해동된 상청액은 원심분리를 사용하여 정화시켰다.
일부 실시형태에서, 정화된 세포 배양 배지(예를 들어, 약 500uL)를 크기 배제 정제 칼럼에 통과시켰다. 약 65㎚ 내지 약 1000㎚의 크기 범위를 갖는 나노입자를 각각의 샘플에 대해 수집하였다. 일부 실시형태에서, 더 작은 입자 범위가 바람직할 수 있다.
입자 계수;
예를 들어, 예를 들어, TS400 칩을 사용하는 SpectroDyne 입자 계수 기기를 사용하여 입자 계수치를 얻어서 65 내지 1000㎚의 나노입자 범위를 측정하였다. 일부 실시형태에서, 더 작은 입자 범위, 예를 들어, 65 내지 200㎚가 바람직할 수 있다.
자성-포획 비드에 대한 포획-항체 접합:
항체를 자성 비드에 접합시켰다. 간략하면, 비드를 멸균 환경에서 칭량하고, 완충액에 재현탁시켰다. 항체를 작용화된 비드와 혼합하고, 접합 반응이 종단 간 혼합으로 발생하였다. 비드를 접합 키트에 의해서 제공된 세척 완충액을 사용하여 수 회 세척하고, 제공된 저장 완충액에 4℃에서 저장하였다.
항체-접합된 자성 비드를 사용한 정제된 혈장 EV의 직접 포획:
EV 포획을 위해서, 세포주 EV의 희석된 샘플을 EV 표적(예를 들어, 표적 1)에 지향되는 항체와 접합된 자기 비드와 함께 적절한 시간 동안, 예를 들어 실온에서 인큐베이션시켰다.
자성 포획 비드에 결합된 EV에 대한 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체의 결합:
EV 포획 검정(예를 들어, 상기에 기재된 것)에서 사용된 것과 상이한 EV 표적(예를 들어, 표적 2)에 지향되는 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체("항체 프로브")를 최적 농도의 적절한 완충액에서 희석시켰다. 항체 프로브를 자성 포획 비드에 결합된 EV를 포함하는 샘플과 상호작용하도록 하였다.
결합 후 세척:
일부 실시형태에서, 샘플을 적절한 완충액에서 예를 들어, 수 회 세척하였다.
결찰:
결합되지 않은 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 세포외 소포 및 결합된 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체가 있는 비드를 결찰 믹스와 접촉시켰다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다.
PCR:
결찰 후, 결합된 세포외 소포 및 결합된 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 갖는 비드를 PCR 믹스와 접촉시켰다. PCR을 예를 들어, Quant Studio 3에서 하기 예시적인 PCR 프로토콜에 따라서 96-웰 플레이트에서 수행하였다: 95℃에서 1분 동안 유지, 95℃에서 5초 동안 및 62℃에서 15초 동안의 50회 주기 수행. 온도 변화율은 표준이도록 선택하였다(초당 2℃). 각각의 실험 복제에 대해 단일 qPCR 반응을 수행하였고, ROX를 qPCR 신호를 정규화하기 위한 수동 기준으로 사용하였다. 이어서 데이터를 Quant Studio 3 기계로부터 다운로딩하고, Python 3.7로 분석하고, 플로팅하였다.
대표적인 결과:
올리고뉴클레오타이드 도메인 길이 실험에 대한 원시 qPCR 플롯을 도 24 에 제공하고, 상응하는 델타 Ct 데이터를 도 25 에 제공한다. 이러한 데이터는, 이러한 바이오마커 조합물의 경우, 올리고뉴클레오타이드 길이의 감소가 더 강한 검정 신호를 초래한다는 것을 입증한다. 69 내지 73개 뉴클레오타이드에서 20 내지 24개 뉴클레오타이드로 DNA 길이를 감소시키면 약 2.5Ct의 신호 증가가 초래되었다. 더욱이, 더 짧은 DNA 길이는 검정 배경 신호(EV 데이터 없음)를 유의하게 증가시키지 않아서, 배경에서 1Ct 미만의 증가를 유발하였다.
논의:
본 실험에서, 올리고뉴클레오타이드 길이의 감소는 면역친화성-포획된 EV로부터 검정 신호가 증가하였다. 짧은 올리고뉴클레오타이드는 긴 올리고뉴클레오타이드보다 약 2.5Ct 더 강한 신호를 유발하였으며, 검정 배경에서만 약간 증가하였다(1Ct 미만) 그러나, 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 이러한 관찰은 특정 바이오마커 조합물에 적용되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 1 및 표적 2가 서로 상호작용하여 동종이량체 및/또는 이종이량체를 형성할 수 있고/있거나 EV의 막에 가깝게 근접하여 존재하는 경우에는 더 짧은 DNA 길이가 더 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 1 및 표적 2가 서로 상호작용하지 않고/않거나 EV의 막에서 드물게 존재하는 경우에는 더 긴 DNA 길이가 더 바람직할 수 있다. 따라서, 이들 결과는 올리고뉴클레오타이드 길이가 본 명세서에 기재된 표적 엔티티 검출 시스템 및/또는 검정의 성능을 개선시키도록 구성될 수 있음을 입증한다.
실시예 8: 표적 엔티티 검출 시스템에서 검출 프로브와 조합한 저해제 프로브(들)의 사용
본 실시예는 표적-결합 모이어티 및 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인(이중-가닥 부분 및 단일 가닥 오버행 포함)을 각각 포함하는 표적(예를 들어, 표적 바이오마커(들))에 대한 검출 프로브의 합성을 기재한다. 본 실시예는 또한 비-표적(예를 들어, 표적 엔티티와 연관되지 않고/않거나 질환, 장애 또는 병태와 연관되지 않은 것)에 대한 저해제 프로브의 합성을 기재한다. 본 실시예는 프라이머 부위 없이 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 이중-가닥 DNA 부분을 포함함)을 추가하는 것이 비표적-엔티티로부터 생성된 결찰된 주형의 증폭을 방지할 수 있음을 입증한다. 본 실시예는 또한 이러한 올리고뉴클레오타이드 도메인(프라이머 부위 없음)을 비표적 엔티티(예를 들어, 교차 반응성 표적)에 지향되는 표적-결합 엔티티에 접합시키는 것이 비-표적 엔티티로부터의 배경 신호를 감소시킬 수 있고, 이에 의해 본 명세서에 기재된 표적 엔티티 검출 검정의 신호-대-노이즈 비를 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다. 일부 실시형태에서, 본 실시예는 이러한 올리고뉴클레오타이드 도메인(프라이머 부위 없이 이중-가닥 DNA 부분을 포함함, 예를 들어, 도 26 에 도시된 바와 같음)을 비표적 엔티티(예를 들어, 교차 반응성 표적)에 지향되는 표적-결합 엔티티(예를 들어, 항체 작용제)에 접합시키는 것이 비-표적 엔티티(예를 들어, 비-표적 조직으로부터의 세포외 소포)로부터의 배경 신호를 감소시킬 수 있고, 이에 의해 본 명세서에 기재된 표적 엔티티 검출 검정의 신호-대-노이즈 비를 증가시켜 표적 엔티티(예를 들어, 표적 조직으로부터의 세포외 소포)를 검출할 수 있다는 것을 입증한다. 일부 이러한 실시형태에서, 표적-특이적 검출 프로브와 조합된 이러한 저해제 프로브의 사용은 암-특이적 세포외 소포의 검출에 유용할 수 있다.
실험 1: 용액 중의 표적-결합 모이어티가 없는 저해제 프로브의 평가: 먼저, 다음 DNA 용액의 600pM 농도(또는 2× 저해제 가닥의 경우 1200pM)에 의해 생성된 결찰 주형의 상대적인 수를 평가하였다. 아래의 숫자는 도 26 에 도시된 가닥과 연관된 수치에 상응하는 가닥 번호를 지칭한다는 것이 주목된다. "i"는 저해제 프로브의 가닥을 지정한다. 올리고뉴클레오타이드 작용화는 하나의 작용기에서 또 다른 작용기로(예를 들어, 아민에서 아자이드로, 티올로 등) 전환될 수 있음이 또한 주목된다.
Figure pct00015
예시적인 DNA 가닥 서열을 하기 예시적인 방법 섹션에서 제공한다. 적절한 단일 가닥 서열을 함께 어닐링하여 이중 가닥 DNA(예를 들어, (1+3), (2+4) 등)를 제조하였다.
각각의 이중-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA의 조합물을 30pL의 T4 리가제 용액에서 600pM 농도로 제조사에서 권장된 시간 및 실온에서 20분의 온도에서 인큐베이션시켰다. 결찰 후, 5㎕의 리가제 믹스를 TaqMan Advanced Master Mix(써모사(Thermo)), 프라이머, EvaGreen, DMSO 및 물을 포함하는 25㎕의 PCR 믹스로 이중으로 옮겼다. PCR 믹스를 표준 qPCR 프로토콜에 의해 분석하였고, 증폭 가능한 전사체의 상대적인 풍부도를 측정하였다.
예시적인 방법:
올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하기 서열 구조 및 변형을 가질 수 있다. 상기에 주목된 바와 같이, 하기의 가닥 번호는 도 26에 도시된 가닥과 연관된 수치에 상응한다. 올리고뉴클레오타이드 작용화는 하나의 작용기에서 또 다른 작용기로(예를 들어, 아민에서 아자이드로, 티올로 등) 전환될 수 있다.
I. 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인에 대한 올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 하기에 제공한다.
가닥 1:
/5AmMC12/CAGTCTGACTCACCACTCGTTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2:
/5AmMC12/CACCAGACCTACGAAGTCCATAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTAACGAGTGGTGAGTCAGACTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTATGGACTTCGTAGGTCTGGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 5:
CAGTCTGACTCACCACTCGT
가닥 6:
CACCAGACCTACGAAGTCCA
일부 실시형태에서, 실시예 7에 기재된 바와 같은 다양한 임의의 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 사용하여 검출 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성할 수 있다.
II. 저해제 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인에 대한 올리고뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 상이한 길이의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 갖는 저해제 프로브(프라이머 부위 없음)(하기에 기재됨)를 합성할 수 있다:
Figure pct00016
길이 1("긴"): 69 내지 73개 뉴클레오타이드(4개 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는 69-뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥 부분)
Figure pct00017
길이 2("중간"): 40 내지 44개 뉴클레오타이드(4개 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는 40-뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥 부분)
Figure pct00018
길이 3("짧은"): 20 내지 24개 뉴클레오타이드(4개 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는 20-뉴클레오타이드 길이의 이중-가닥 부분)
일부 실시형태에서, 하기는 저해제 프로브를 위해서 길이 1("긴")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1i:
/5AmMC12/GCACACACCTCATCGTCTTGTAATCGTCGCTGCTACCCTTGACATCCGTGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2i:
/5AmMC12/CACAATCTCGACCACGCAAGTAGCCTTGCCTGATTAGCCACTGTCCAGTTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3i:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCACGGATGTCAAGGGTAGCAGCGACGATTACAAGACGATGAGGTGTGTGC, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4i:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAAACTGGACAGTGGCTAATCAGGCAAGGCTACTTGCGTGGTCGAGATTGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
일부 실시형태에서, 하기는 저해제 프로브를 위해서 길이 2("중간")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1i-중간:
/5AmMC12/GCACACACCTCATCGTCTTGGACTGGCTAGACAGAGGTGT, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2i-중간:
/5AmMC12/CACAATCTCGACCACGCAAGTTGGCTCCTGGTCTCACTAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3i-중간:
/5Phos/GAGTACACCTCTGTCTAGCCAGTCCAAGACGATGAGGTGTGTGC, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4i-중간:
/5Phos/ACTCCTAGTGAGACCAGGAGCCAACTTGCGTGGTCGAGATTGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
일부 실시형태에서, 하기는 저해제 프로브를 위한 길이 3("짧은")의 올리고뉴클레오타이드 도메인을 형성하기 위한 예시적인 올리고뉴클레오타이드 세트를 제공한다:
가닥 1i-짧은:
/5AmMC12/GCACACACCTCATCGTCTTG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 2i-짧은:
/5AmMC12/CACAATCTCGACCACGCAAG, 여기서 /5AmMC12/는 12-탄소 스페이서를 통해서 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 아민기(예를 들어, 1차 아미노기)를 지칭함
가닥 3i-짧은:
/5Phos/GAGTCAAGACGATGAGGTGTGTGC, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
가닥 4i-짧은:
/5Phos/ACTCCTTGCGTGGTCGAGATTGTG, 여기서 /5Phos/는 5' 올리고뉴클레오타이드 말단에 연결된 포스페이트기를 지칭함
실험 2: 세포주 EV에서 저해제 프로브의 평가: 본 실험을 위해서, 세포주 EV를 EV 포획제, 예를 들어, EV의 표면 단백질(마커 1)에 지향되는 항체에 접합된 자성 비드를 사용하여 포획하였다. 비-표적에 지향되는 저해제 프로브(마커 3)를 첨가하거나 첨가하지 않으면서, 각각 표적(마커 2(이것은 두 프로브에 대한 동일한 표적일 수 있거나 각각의 프로브에 대한 상이한 표적일 수 있음))에 지향되는 2개의 검출 프로브를 포함하는 듀플렉스 표적 엔티티 검출 시스템을 사용하여 검정 신호를 생성시켰다.
Figure pct00019
항체-올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 항체-DNA) 접합:
바람직한 표적에 지향되는 항체를 이전 실시예에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드에 접합시켰다. 당업자는 다른 공지된 접합 방법을 사용하여 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 형성시킬 수 있다는 것을 인지할 것이다.
자성-포획 비드에 대한 포획-항체 접합:
항체를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 자성 비드에 접합시켰다.
항체-접합된 자성 비드를 사용한 정제된 세포주 EV의 직접 포획:
EV 포획을 위해서, 세포주 EV의 희석된 샘플을 EV 표적(예를 들어, 표적 1)에 지향되는 항체와 접합된 자기 비드와 함께 적절한 시간 동안, 예를 들어 실온에서 인큐베이션시켰다.
자성 포획 비드에 결합된 EV에 대한 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체의 결합:
EV 포획 검정(예를 들어, 상기에 기재된 것)에서 사용된 것과 상이한 EV 표적(예를 들어, 표적 2)에 지향되는 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체("마커 2+ 마커 2 프로브"; "항체 프로브"라고도 알려짐)를 최적 농도의 적절한 완충액에서 희석시켰다. 항체 프로브를 자성 포획 비드에 결합된 EV를 포함하는 샘플과 상호작용하도록 하였다. 또한, 저해제 프로브를 또한 혼합물에 첨가하여, 자성 포획 비드 상에 결합된 EV를 포함하는 샘플과 상호작용하게 하였다.
결합 후 세척:
일부 실시형태에서, 샘플을 적절한 완충액에서 예를 들어, 수 회 세척하였다.
결찰:
결합되지 않은 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 제거하기 위한 세척 후, 결합된 세포외 소포 및 결합된 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체가 있는 비드를 결찰 믹스와 접촉시켰다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다.
PCR:
결찰 후, 결합된 세포외 소포 및 결합된 항체-올리고뉴클레오타이드 접합체를 갖는 비드를 PCR 믹스와 접촉시켰다. PCR을 예를 들어, Quant Studio 3에서 하기 예시적인 PCR 프로토콜에 따라서 96-웰 플레이트에서 수행하였다: 95℃에서 1분 동안 유지, 95℃에서 5초 동안 및 62℃에서 15초 동안의 50회 주기 수행. 온도 변화율은 표준이도록 선택하였다(초당 2℃). 각각의 실험 복제에 대해 단일 qPCR 반응을 수행하였고, ROX를 qPCR 신호를 정규화하기 위한 수동 기준으로 사용하였다. 이어서 데이터를 Quant Studio 3 기계로부터 다운로딩하고, Python 3.7로 분석하고, 플로팅하였다.
대표적인 결과 및 논의:
실험 1: 용액 중의 저해제 프로브(표적-결합 모이어티 없음)의 평가: 원시 qPCR 데이터를 도 27 에 도시한다. 도 28 에 나타낸 바와 같이, 각각의 저해제 프로브(표적-결합 모이어티 없음)에서 Ct 값에서 농도 의존적 증가가 존재하였다. 동일한 농도(600pM)의 저해제 프로브의 첨가는 대략 1Ct의 신호 감소를 초래하였다. 저해제 프로브(표적-결합 모이어티 없음)의 추가 첨가는 신호를 1 이상의 Ct만큼 감소시켰다. 두 저해제 프로브(각각 표적-결합 모이어티 없음)를 동시에 첨가하면 2× 농도에서 단일 저해제 프로브(표적-결합 모이어티 없음)에 비해 효과가 약간 감소한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 이는 가닥이 증폭 반응을 저해하는 것을 방지하는 저해제 프로브의 가닥 사이에서 발생하는 결찰 때문일 가능성이 있다. 이러한 데이터는 저해제 프로브의 올리고뉴클레오타이드 도메인이 결찰 시 증폭을 성공적으로 방지할 수 있음을 입증한다.
실험 2: 세포주 EV에서 저해제 프로브의 평가: 도 29의 세포주 데이터는, 프라이머 부위가 없는 올리고뉴클레오타이드 도메인(예를 들어, 프라이머 부위가 없는 이중 가닥 DNA 부분을 포함함)에 접합된 표적-결합 모이어티(예를 들어, 항체 작용제)를 포함하는 저해제 프로브의 첨가가 검정 신호를 성공적으로 그리고 선택적으로 감쇠시킬 수 있다는 것을 입증한다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 신호의 적당한 감소는 표적 2의 동종이량체 본성의 결과일 가능성이 있다. 검정 신호의 많은 부분이 표적 2 이량체(본질적으로 가깝게 근접함)에서 유래될 수 있다는 것을 고려할 때, 표적 3에 대한 저해제 프로브의 효과가 감소될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 데이터는 저해제 프로브를 배치함으로써 표적 엔티티 검출 검정(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같음) 내의 교차-반응 조직으로부터 신호를 선택적으로 감소 및/또는 제거할 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 이를 하기 표 8의 예에 요약한다.
Figure pct00020
인용된 참고 문헌
Figure pct00021
등가물
당업자는 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 달리 제시되지 않거나 모순이나 불일치가 발생할 것이라는 것이 당업자에게 명백하지 않는 한, 본 발명은 열거된 청구범위 중 하나 이상으로부터의 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 설명 용어 등이 동일한 기준 청구범위(또는 관련되는 경우 다른 청구범위)에 종속된 또 다른 청구범위에 도입되는 모든 변형, 조합 및 순열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 임의의 실시형태 또는 양상은 본 명세서에서 특정 배제가 인용되는지 여부에 관계없이 청구범위에서 명시적으로 배제될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 범주는 상기 설명으로 제한되도록 의도되지 않고, 오히려 하기 청구범위에 기재된 바와 같다.
SEQUENCE LISTING <110> MERCY BIOANALYTICS, INC. <120> SYSTEMS, COMPOSITIONS, AND METHODS FOR TARGET ENTITY DETECTION <130> WO/2020/180741 <140> PCT/US2020/020529 <141> 2020-02-28 <150> US 62/962,722 <151> 2020-01-17 <150> US 62/812,878 <151> 2019-03-01 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 cagtctgact caccactcgt taatcgtcgc tgctaccctt gacatccgtg actggctaga 60 cagaggtgt 69 <210> 2 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 caccagacct acgaagtcca tagccttgcc tgattagcca ctgtccagtt tggctcctgg 60 tctcactag 69 <210> 3 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 gagtacacct ctgtctagcc agtcacggat gtcaagggta gcagcgacga ttaacgagtg 60 gtgagtcaga ctg 73 <210> 4 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Synthetic oligonucleotide <400> 9 ccaactattt ttttacacct ctgtctagcc agtcacggat gtcaagggta gcagcgacga 60 ttaacgagtg gtgagtcaga ctg 83 <210> 10 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 ctattttttt acacctctgt ctagccagtc acggatgtca agggtagcag cgacgattaa 60 cgagtggtga gtcagactg 79 <210> 11 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 ttccaactat ttacacctct gtctagccag tcacggatgt caagggtagc agcgacgatt 60 aacgagtggt gagtcagact g 81 <210> 12 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 ccaactattt acacctctgt ctagccagtc acggatgtca agggtagcag cgacgattaa 60 cgagtggtga gtcagactg 79 <210> 13 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 ctatttacac ctctgtctag ccagtcacgg 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Claims (119)

  1. 방법으로서,
    (a) 관심대상 생물학적 엔티티(entity)를 포함할 수 있는 샘플을, 각각 표적에 지향되는 검출 프로브의 적어도 하나의 세트와 접촉시키는 단계로서, 세트는 적어도 제1 표적을 위한 제1 검출 프로브 및 제2 표적을 위한 제2 검출 프로브를 포함하여, 상기 관심대상 엔티티 및 상기 검출 프로브의 세트를 포함하는 조합물이 생성되고,
    상기 제1 검출 프로브는 제1 표적-결합 모이어티 및 상기 제1 표적-결합 모이어티에 커플링된 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제1 이중-가닥 부분 및 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제1 단일-가닥 오버행(overhang)을 포함하고;
    상기 제2 검출 프로브는 제2 표적-결합 모이어티 및 상기 제2 표적-결합 모이어티에 커플링된 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제2 이중-가닥 부분 및 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제2 단일-가닥 오버행을 포함하고; 상기 제2 단일-가닥 오버행은 상기 제1 단일-가닥 오버행의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함함으로써, 상기 제1 단일-가닥 오버행에 혼성화할 수 있고;
    상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인 및 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 조합된 길이를 가져서, 상기 제1 표적 및 제2 표적이 상기 관심대상 엔티티 상에 동시에 존재하고, 상기 검출 프로브의 세트의 상기 프로브가 상기 관심대상 엔티티 상의 각각의 표적에 결합되는 경우, 상기 제1 단일-가닥 오버행 및 상기 제2 단일-가닥 오버행은 함께 혼성화할 수 있는, 상기 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 조합물을 상기 관심대상 엔티티 상의 각각의 표적에 대한 상기 검출 프로브의 세트의 결합을 허용하는 조건 하에서 유지시켜, 상기 관심대상 엔티티가 상기 제1 표적 및 상기 제2 표적을 포함하는 경우, 상기 제1 검출 프로브 및 상기 제2 검출 프로브가 상기 관심대상 엔티티에 결합하여 이중-가닥 복합체를 형성하는 단계;
    (c) 상기 이중-가닥 복합체를 핵산 리가제와 접촉시켜 상기 제1 이중-가닥 부분의 가닥 및 상기 제2 이중-가닥 부분의 가닥을 포함하는 결찰된 주형을 생성시키는 단계; 및
    (d) 상기 결찰된 주형을 검출하는 단계로서, 상기 결찰된 주형의 존재는 상기 제1 표적 및 상기 제2 표적을 포함하는 상기 관심대상 엔티티의 상기 샘플의 존재를 나타내는, 상기 검출하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 검출은 상기 결찰된 주형의 증폭을 수행하고, 상기 증폭 산물의 상기 존재를 검출하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 증폭은 정량적 중합효소 연쇄 반응이거나 이를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 단일-가닥 오버행 및/또는 상기 제2 단일-가닥 오버행은 4개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 단일-가닥 오버행 또는 상기 제2 단일-가닥 오버행은 GAGT의 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조합된 길이는 200㎚ 이하인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심대상 엔티티는 고체 기질 상에 고정된, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 고체 기질은 비드이거나 이를 포함하는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 고체 기질은 표면이거나 이를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표면은 필터, 매트릭스, 막, 플레이트, 튜브 및/또는 웰의 포획 표면인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)의 접촉 이전에, 상기 이중-가닥 복합체를, 제1 올리고뉴클레오타이드를 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인과 회합시키는 연결자 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하지 않는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 연결자 올리고뉴클레오타이드는 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 일부 및 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 일부에 혼성화하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적-결합 모이어티 및/또는 상기 제2 표적-결합 모이어티는 항체 작용제(antibody agent)를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 프로브의 세트는 제3 표적을 위한 추가 검출 프로브를 더 포함하되, 상기 추가 검출 프로브는 제3 표적-결합 모이어티 및 상기 제3 표적-결합 모이어티에 커플링된 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 상기 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 상기 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인의 각각의 단부로부터 연장된 제3 단일-가닥 오버행을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 프로브의 세트는 각각 특이적 표적을 위한 2 내지 20개의 검출 프로브를 포함하되, 상기 검출 프로브 각각은 표적-결합 모이어티 및 상기 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 검출 프로브의 세트는 2개의 구별되는 검출 프로브를 함유하고; (ii) 상기 이중-가닥 복합체는 상기 이중-가닥 복합체의 각각의 가닥이 핵산 리가제의 존재 하에서 결찰 가능한 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제14항에 있어서, (i) 상기 검출 프로브의 세트는 적어도 3개 이상의 구별되는 검출 프로브를 함유하고; (ii) 상기 이중-가닥 복합체는, 상기 이중-가닥 복합체의 하나의 가닥이 핵산 리가제의 존재 하에서 결찰 가능한 반면, 상기 이중-가닥 복합체의 또 다른 가닥은 핵산 리가제의 존재 하에서 결찰 가능하지 않은 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 이중-가닥 복합체의 상기 결찰 가능하지 않은 가닥은 갭을 포함하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 프로브의 세트는 대조군 프로브를 더 포함하되, 상기 대조군 프로브는 상기 관심대상 엔티티에 대한 상기 대조군 프로브의 결합이 결찰된 주형의 생성을 저해하고/하거나 비-표적 생물학적 엔티티로부터의 결찰된 주형의 증폭을 저해하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 대조군 프로브는 대조군 참조(control reference)에 결합하도록 구성된, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 리가제는 DNA 리가제(예를 들어, T4 또는 T7 DNA 리가제)이거나 이를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 대상체의 혈액-유래 샘플(예를 들어, 혈장 또는 혈액 샘플)인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심대상 엔티티는 온전한 세포 또는 이의 단편이거나 이를 포함하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심대상 엔티티는 세포외 소포(extracellular vesicle)이거나 이를 포함하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 공유 수단에 의해서 상기 표적-결합 모이어티에 커플링되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 인간 대상체로부터 유래되는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 검출 프로브의 세트는 암-특이적이고; 상기 결찰된 주형의 상기 존재는 인간 대상체가 암을 앓고 있거나 암의 발병 위험이 있다는 것을 나타내는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 암은 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 암은 결장직장암인, 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 암은 폐암인, 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 암은 유방암인, 방법.
  32. 제27항에 있어서, 상기 암은 난소암인, 방법.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 무증상(asymptomatic) 인간 대상체인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 암의 가족력을 갖는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 암에 대해서 이전에 치료된, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 암 치료 후 암 재발의 위험이 있는, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 암 치료 후 관해 중인, 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 적어도 1종의 암 바이오마커의 존재에 대해서 이전에 또는 주기적으로 스크리닝된, 방법.
  39. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 암에 대해서 이전에 스크리닝되는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 인간 대상체는 암을 앓고 있거나 암에 민감한 것으로 이전에 진단된, 방법.
  41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법을 주기적으로 수행하여 무증상 인간 대상체를 초기 병기 암 또는 암 재발에 대해서 스크리닝하는, 방법.
  42. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 암을 앓고 있는 것으로 결정된 인간 대상체인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 인간 대상체가 상기 결찰된 주형의 존재 및/또는 양에 기초하여 요법에 반응성일 가능성이 있는지의 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 결찰된 주형의 존재 및/또는 양에 기초하여 상기 인간 대상체에 대한 투여를 위해서 요법을 선택하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  45. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 대상체는 요법을 제공받고 있는 인간 대상체인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 인간 대상체가 일정 기간 동안 치료된 후 상기 인간 대상체로부터의 제2 샘플을 사용하여 상기 방법의 상기 단계 (a) 내지 (d)를 반복하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 결찰된 주형의 양의 변화에 기초하여 상기 인간 대상체가 제공받은 상기 요법의 효능을 평가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  48. 각각 표적에 지향되는 검출 프로브의 적어도 하나의 세트를 포함하는 키트로서, 이 세트는,
    a. 제1 표적을 위한 제1 검출 프로브로서, 상기 제1 검출 프로브는 제1 표적-결합 모이어티 및 상기 제1 표적-결합 모이어티에 커플링된 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제1 이중-가닥 부분 및 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제1 단일-가닥 오버행을 포함하는, 상기 제1 검출 프로브; 및
    b. 제2 표적을 위한 제2 검출 프로브로서, 상기 제2 검출 프로브는 제2 표적-결합 모이어티 및 상기 제2 표적-결합 모이어티에 커플링된 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제2 이중-가닥 부분 및 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제2 단일-가닥 오버행을 포함하고; 상기 제2 단일-가닥 오버행은 상기 제1 단일-가닥 오버행의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함함으로써, 상기 제1 단일-가닥 오버행에 혼성화할 수 있는, 상기 제2 검출 프로브
    를 포함하되;
    상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인 및 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 조합된 길이를 가져서, 상기 제1 표적 및 상기 제2 표적이 관심대상 엔티티(예를 들어, 관심대상 생물학적 엔티티) 상에 동시에 존재하고, 상기 검출 프로브의 세트의 상기 프로브가 상기 관심대상 엔티티 상의 각각의 표적에 결합되는 경우, 상기 제1 단일-가닥 오버행 및 상기 제2 단일-가닥 오버행은 함께 혼성화할 수 있는, 키트.
  49. 제48항에 있어서, 상기 검출 프로브의 세트는 각각 구별되는 표적을 위한 2 내지 20개의 검출 프로브를 포함하되, 상기 검출 프로브 각각은 표적-결합 모이어티 및 상기 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함하는, 키트.
  50. 제48항에 있어서, 검출 프로브의 복수의 세트를 포함하되, 상기 검출 프로브의 복수의 세트는,
    (a) 각각의 세트가 동일한 암에 대한 적어도 1종의 구별되는 바이오마커를 인식하거나; 또는
    (b) 각각의 세트가 상이한 암에 대한 적어도 1종의 구별되는 바이오마커를 인식하거나; 또는
    (c) 각각의 세트가 동일한 암에 대한 (예를 들어, 적어도 2종의) 바이오마커의 구별되는 조합물을 인식하거나; 또는
    (d) 각각의 세트가 상이한 암에 대한 (예를 들어, 적어도 2종의) 바이오마커의 구별되는 조합물을 인식하는 것을 특징으로 하고;
    (a), (b), (c) 또는 (d)의 각각의 세트는 적어도 2종 이상의 검출 프로브를 포함하되, 상기 검출 프로브 각각은 표적-결합 모이어티 및 상기 표적-결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행을 포함하는, 키트.
  51. 제50항에 있어서, 상기 암은 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 관심대상 엔티티를 포획하기 위한 고체 기질을 더 포함하는, 키트.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 고정제(fixation agent)를 더 포함하는, 키트.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 투과화제(permeabilization agent)를 더 포함하는, 키트.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 차단제(blocking agent)를 더 포함하는, 키트.
  56. 제48항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 리가제를 더 포함하는, 키트.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭될 주형을 위한 하나 이상의 쌍의 프라이머를 더 포함하는, 키트.
  58. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 병기 암에 대해서 대상체를 스크리닝하는 데 사용하기 위한, 키트.
  59. 제58항에 있어서, 상기 대상체는 무증상 인간 대상체인, 키트.
  60. 제59항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 암의 가족력을 갖는, 키트.
  61. 제59항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 암에 대해서 이전에 치료된, 키트.
  62. 제59항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 암 치료 후 암 재발의 위험이 있는, 키트.
  63. 제59항에 있어서, 상기 무증상 인간 대상체는 암 치료 후 관해 중인, 키트.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 암에 대해서 이전에 스크리닝되는, 키트.
  65. 제64항에 있어서, 상기 인간 대상체는 암을 앓고 있거나 암에 민감한 것으로 이전에 진단된, 키트.
  66. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 암에 대해서 치료되었던 대상체에서 종양 재발을 모니터링하는 데 사용하기 위한, 키트.
  67. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료와 조합하여 동반 진단(companion diagnostic)으로서 사용하기 위한, 키트.
  68. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 요법의 효능을 모니터링하거나 평가하는 것을 필요로 하는 대상체에게 투여되는 요법의 효능을 모니터링하거나 평가하는 데 사용하기 위한, 키트.
  69. 제48항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 요법의 선택을 필요로 하는 대상체에 대해서 요법을 선택하는 데 사용하기 위한, 키트.
  70. 이중-가닥 복합체로서,
    (a) 제1 표적 및 제2 표적을 포함하는 관심대상 엔티티(예를 들어, 관심대상 생물학적 엔티티);
    (b) 제1 표적-결합 모이어티를 통해서 상기 제1 표적에 결합된 제1 검출 프로브로서, 상기 제1 검출 프로브는 상기 제1 표적-결합 모이어티 및 상기 제1 표적-결합 모이어티에 커플링된 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제1 이중-가닥 부분 및 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제1 단일-가닥 오버행을 포함하는, 상기 제1 검출 프로브; 및
    (c) 제2 표적-결합 모이어티를 통해서 상기 제2 표적에 결합된 제2 검출 프로브로서, 상기 제2 검출 프로브는 상기 제2 표적-결합 모이어티 및 상기 제2 표적-결합 모이어티에 커플링된 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제2 이중-가닥 부분 및 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제2 단일-가닥 오버행을 포함하는, 상기 제2 검출 프로브
    를 포함하되;
    상기 제1 단일-가닥 오버행은 상기 제2 단일-가닥 오버행에 혼성화되는, 이중-가닥 복합체.
  71. 제70항에 있어서, 제3 표적-결합 모이어티를 통해서 상기 관심대상 엔티티 상에 존재하는 제3 표적에 결합된 제3 검출 프로브를 더 포함하되, 상기 제3 검출 프로브는 상기 제3 표적-결합 모이어티 및 상기 제3 표적-결합 모이어티에 커플링된 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하고, 상기 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제3 이중-가닥 부분 및 상기 제3 올리고뉴클레오타이드 도메인의 적어도 하나의 단부로부터 연장된 제3 단일-가닥 오버행을 포함하고,
    상기 제3 단일-가닥 오버행은 상기 제1 단일-가닥 오버행 및/또는 상기 제2 단일-가닥 오버행에 혼성화되고;
    상기 올리고뉴클레오타이드 도메인의 가닥을 포함하는 상기 이중-가닥 복합체의 하나의 가닥은 핵산 리가제의 존재 하에서 결찰 가능한 반면, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인의 가닥을 포함하는 상기 이중-가닥 복합체의 또 다른 가닥은 핵산 리가제의 존재 하에서 결찰 가능하지 않은, 이중-가닥 복합체.
  72. 제71항에 있어서, 상기 결찰 가능하지 않은 가닥은 갭을 포함하는, 이중-가닥 복합체.
  73. 제72항에 있어서, 상기 갭은 적어도 2 내지 8개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 이중-가닥 복합체.
  74. 제72항에 있어서, 상기 갭은 적어도 6개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 이중-가닥 복합체.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오버행은 8개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는, 이중-가닥 복합체.
  76. 관심대상 엔티티(예를 들어, 관심대상 생물학적 엔티티)에서 적어도 2개의 표적을 검출하기 위한 검출 프로브의 세트를 제공하는 방법으로서,
    a. 제1 표적을 위한 제1 후보 검출 프로브를 제공하는 단계로서, 상기 제1 후보 검출 프로브는 제1 표적-결합 모이어티 및 상기 제1 표적-결합 모이어티에 커플링된 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제1 이중-가닥 부분 및 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제1 단일-가닥 오버행을 포함하고, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 20㎚ 내지 약 500㎚의 길이를 갖는, 상기 제1 후보 검출 프로브를 제공하는 단계;
    b. 제2 표적을 위한 제2 후보 검출 프로브를 제공하는 단계로서, 상기 제2 후보 검출 프로브는 제2 표적-결합 모이어티 및 상기 제2 표적-결합 모이어티에 커플링된 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인을 포함하되, 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 제2 이중-가닥 부분 및 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 제2 단일-가닥 오버행을 포함하고; 상기 제2 단일-가닥 오버행은 상기 제1 단일-가닥 오버행의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함함으로써, 상기 제1 단일-가닥 오버행에 혼성화할 수 있고; 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 20㎚ 내지 약 500㎚의 길이를 갖는, 상기 제2 후보 검출 프로브를 제공하는 단계;
    c. 상기 제1 표적 및 상기 제2 표적을 포함하는 관심대상 엔티티를 상기 제1 후보 검출 프로브 및 상기 제2 후보 검출 프로브와 접촉시키는 단계; 및
    d. 상기 관심대상 엔티티, 상기 관심대상 엔티티에 결합된 상기 제1 후보 검출 프로브 및 상기 관심대상 엔티티에 결합된 상기 제2 후보 검출 프로브를 포함하는 이중-가닥 복합체의 형성을 검출하는 단계로서, 상기 제1 단일-가닥 오버행은 상기 이중-가닥 복합체 내의 상기 제2 단일-가닥 오버행에 혼성화되는, 상기 검출하는 단계
    를 포함함으로써,
    상기 이중-가닥 복합체의 존재에 기초하여, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인 및 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인의 상기 길이를 선택하여 제1 표적을 위한 제1 검출 프로브 및 제2 표적을 위한 제2 검출 프로브를 포함하는 검출 프로브의 세트를 제공하는, 검출 프로브의 세트를 제공하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인을 상기 제1 표적-결합 모이어티에 커플링시키는 단계를 더 포함하는, 검출 프로브의 세트를 제공하는 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인을 상기 제2 표적-결합 모이어티에 커플링시키는 단계를 더 포함하는, 검출 프로브의 세트를 제공하는 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심대상 엔티티는 세포외 소포이거나 이를 포함하는, 검출 프로브의 세트를 제공하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 20㎚ 내지 약 100㎚의 길이를 갖고; 상기 제2 올리고뉴클레오타이드 도메인은 약 20㎚ 내지 약 100㎚의 길이를 갖는, 검출 프로브의 세트를 제공하는 방법.
  81. 방법으로서,
    (A) 대상체로부터 혈액-유래 샘플을 제공하거나 얻는 단계;
    (B) 상기 혈액-유래 샘플에서, 질환, 장애 또는 병태에 대한 표적 바이오마커 시그니처(target biomarker signature)를 발현하는 세포외 소포("표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포")를 검출하는 단계로서,
    상기 검출 단계는 검출 검정을 포함하되, 상기 검출 검정은,
    (a) 상기 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포를, 각각 상기 표적 바이오마커 시그니처의 표적 바이오마커에 지향되는 검출 프로브의 세트와 접촉시키는 단계로서, 세트는 적어도 2개의 검출 프로브를 포함하여, 상기 세포외 소포 및 상기 검출 프로브의 세트를 포함하는 조합물이 생성되고,
    상기 세트 내의 상기 적어도 2개의 검출 프로브 각각은,
    (i) 상기 표적 바이오마커 시그니처의 표적 바이오마커에 지향되는 표적 결합 모이어티; 및
    (ii) 상기 표적 결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인으로서, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행 부분을 포함하는, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인
    을 포함하고,
    상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 단일-가닥 오버행 부분은, 상기 적어도 2개의 검출 프로브가 동일한 세포외 소포에 결합되는 경우 그들이 서로에 혼성화할 수 있는 것을 특징으로 하는, 상기 접촉시키는 단계,
    (b) 상기 적어도 2개의 검출 프로브가 상기 표적 바이오마커 시그니처를 발현하는 동일한 세포외 소포에 결합하여 이중-가닥 복합체를 형성할 수 있도록 상기 세포외 소포 상의 각각의 표적에 대한 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 결합을 허용하는 조건 하에서 상기 조합물을 유지시키는 단계;
    (c) 상기 이중-가닥 복합체를 핵산 리가제와 접촉시켜 결찰된 주형을 생성시키는 단계; 및
    (d) 상기 결찰된 주형을 검출/측정하는 단계로서, 상기 결찰된 주형의 존재는 상기 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 상기 혈액-유래 샘플 중의 존재 및/또는 수준을 나타내는, 상기 검출/측정하는 단계
    를 포함하는, 상기 검출하는 단계;
    (C) 상기 검출 검정으로부터 얻은 샘플 정보를 참조 역치 수준을 포함하는 참조 정보와 비교하는 단계;
    (D) 상기 혈액-유래 샘플이 상기 참조 역치 수준에 비해서 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 증가된 수준을 나타내는 경우 상기 대상체를 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이에 민감한 것으로 분류하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 검출 검정은 상기 핵산 리가제와 접촉시키기 전에, 상기 이중-가닥 복합체를 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인과 회합하는 연결자 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계를 포함하지 않는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 연결자 올리고뉴클레오타이드는 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인 각각의 적어도 일부에 혼성화하는, 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세트는 각각 상기 표적 바이오마커 시그니처의 표적 바이오마커에 지향되는, 적어도 3개의 검출 프로브를 포함하는, 방법.
  85. 제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세트는 각각 상기 표적 바이오마커 시그니처의 표적 바이오마커에 지향되는, 2 내지 50개의 검출 프로브 또는 3 내지 50개의 검출 프로브를 포함하는, 방법.
  86. 제81항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 역치 수준은 참조 대상체의 집단으로부터의 대등한 샘플에서 관찰된 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포의 수준에 의해서 결정되는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 참조 대상체의 집단은 다음 대상체 집단: 건강한 대상체, 양성 종양 또는 종괴(mass)를 갖는 것으로 진단된 대상체 및 관련되지 않은 질환, 장애 및/또는 병태를 갖는 대상체 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  88. 제81항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 바이오마커 시그니처는 (1) 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드를 포함하는 제1 표적 바이오마커; 및 (2) 표면 단백질 바이오마커, 소포내 단백질 바이오마커 및 소포내 RNA 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 바이오마커를 포함하는 제2 표적 바이오마커를 포함하되, 상기 제2 표적 바이오마커가 상기 표면 단백질 바이오마커 중 하나 이상으로부터 선택되는 경우, 상기 선택된 표면 단백질 바이오마커(들)와 상기 제1 표적 바이오마커의 상기 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드는 상이한, 방법.
  89. 제81항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혈액-유래 샘플은 세포외 소포를 포함하는 관심대상 크기 범위를 갖는 나노입자를 (예를 들어, 상기 혈액-유래 샘플로부터 직접) 단리시키기 위해서 크기 배제 크로마토그래피가 수행된, 방법.
  90. 제81항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 단계는 포획 검정을 더 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 포획 검정은 상기 검출 검정 이전에 수행되는, 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 포획 검정은 상기 혈액-유래 샘플을, 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드를 포함하는 상기 제1 표적 바이오마커에 결합하는 표적-포획 모이어티를 포함하는 포획제와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 포획제는 포획제에 접합된 표적-포획 모이어티를 포함하는 고체 기질이거나 이를 포함하는, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 고체 기질은 자석 비드를 포함하는, 방법.
  95. 제92항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적-포획 모이어티는 항체 작용제이거나 이를 포함하는, 방법.
  96. 제88항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 프로브의 상기 표적 결합 모이어티는 상기 제2 표적 바이오마커에 지향되는, 방법.
  97. 제88항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 프로브의 상기 표적 결합 모이어티는 상기 제2 표적 바이오마커에 지향되는 적어도 1종의 항체 작용제이거나 이를 포함하는, 방법.
  98. 제81항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 표적 결합 모이어티는 상기 표적 바이오마커 시그니처의 동일한 표적 바이오마커에 지향되는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 상이한, 방법.
  100. 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 바이오마커 시그니처가 적어도 1종의 소포내 RNA 바이오마커를 포함하는 경우, 상기 검출 검정은 역전사 PCR을 더 포함하는, 방법.
  101. 제88항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 바이오마커 시그니처가 적어도 1종의 소포내 단백질 바이오마커를 포함하는 경우, 상기 표적 바이오마커 시그니처-발현 세포외 소포는 상기 검출 검정 이전에 고정 및/또는 투과화를 포함하는 처리에 적용되는, 방법.
  102. 제88항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 바이오마커 시그니처가 적어도 1종의 표면 단백질 바이오마커 및/또는 소포내 단백질 바이오마커를 포함하는 경우, 상기 검출 검정은 면역검정(예를 들어, 면역-PCR 및/또는 근접 결찰 검정(proximity ligation assay))을 더 포함하는, 방법.
  103. 제81항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 바이오마커 시그니처가 특이적인 상기 질환, 장애 또는 병태는 암인, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에서 초기 병기 암, 후기 병기 암 또는 재발된 암에 대한 스크리닝을 위해서 수행되는, 방법.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, 상기 암은 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 담관암, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장직장암, 자궁내막암, 식도암, 위장관암, 호지킨 림프종, 신장암, 간암, 폐암, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 피부암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 하기 특징 중 적어도 하나 이상을 갖는, 방법:
    (i) (예를 들어, 암에 대한 평균 집단 위험(즉, 유전적인 위험 없음)으로 또는 유전적인 위험을 갖는) 암에 민감한 무증상 대상체;
    (ii) 암의 가족력을 갖는 대상체(예를 들어, 암의 이력을 갖는 1명 이상의 1촌 친척을 갖는 대상체);
    (iii) 하나 이상의 암-연관된 유전자에서 하나 이상의 생식세포계열 돌연변이를 갖는 것으로 결정된 대상체;
    (iv) 노인 대상체, 예를 들어, 65세 이상;
    (v) 암의 하나 이상의 비-특이적 증상을 갖는 대상체; 및
    (vi) 주기적인 암 스크리닝이 권고된 대상체;
    (vii) 영상-확인된 종괴를 갖는 것으로 진단된 대상체;
    (viii) 위험-감소 외과적 개입(surgical intervention)을 받기 전에 암에 대한 유전적인 위험이 있는 대상체;
    (ix) 양성 종양을 갖는 대상체; 및
    (x) 암에 대해서 이전에 치료된 적이 있는 대상체.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하기 진단 검정 중 하나 이상과 조합하여 사용되는, 방법:
    (i) 상기 대상체의 연간 신체 검사;
    (ii) 암 스크리닝 시험;
    (iii) 암과 관련된 순환 종양 DNA 및/또는 단백질 바이오마커에서의 유전자 돌연변이에 대해서 혈액 혈장을 스크리닝하기 위한 유전자 검정;
    (iv) 세포 표현형 및 마커 발현을 식별하기 위한 면역형광 염색, 그 다음 증폭 및 차세대 서열결정에 의한 분석을 포함하는 검정; 및
    (v) 생식세포계열 및 체세포 돌연변이 검정 또는 무세포 종양 DNA, 액체 생검, 혈청 단백질 및 무세포(cell-free) DNA 및/또는 순환 종양 세포를 포함하는 검정.
  108. 제103항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법을 수행하여 항암 요법의 치료에 대한 반응 및/또는 암 재발/전이에 대해서 암 환자를 모니터링하는, 방법.
  109. 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)의 검출을 위한 키트로서,
    (a) 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향되는 표적-포획 모이어티를 포함하는 포획제; 및
    (b) 검출 프로브의 세트로서, 세트는 각각 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처의 표적 바이오마커에 지향되는 적어도 2개의 검출 프로브를 포함하되, 상기 적어도 2개의 검출 프로브 각각은,
    (i) 상기 표적 바이오마커 시그니처의 상기 표적 바이오마커에 지향되는 표적 결합 모이어티; 및
    (ii) 상기 표적 결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인으로서, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행 부분
    을 포함하는, 상기 검출 프로브의 세트
    를 포함하되,
    상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 단일-가닥 오버행 부분은, 상기 적어도 2개의 검출 프로브가 동일한 세포외 소포에 결합되는 경우 그들이 서로에 혼성화할 수 있는 것을 특징으로 하고,
    질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 상기 표적 바이오마커 시그니처는,
    적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드 및
    표면 단백질 바이오마커, 소포내 단백질 바이오마커 및 소포내 RNA 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 표적 바이오마커
    를 포함하며,
    상기 적어도 하나의 바이오마커가 상기 표면 단백질 바이오마커 중 하나 이상으로부터 선택되는 경우, 상기 선택된 표면 단백질 바이오마커(들)와 상기 적어도 하나의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드는 상이한, 키트.
  110. 제109항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 표적 결합 모이어티는 각각 상기 표적 바이오마커 시그니처의 동일한 표적 바이오마커에 지향되는, 키트.
  111. 제110항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 상이한, 키트.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 표적 결합 모이어티는 각각 상기 표적 바이오마커 시그니처의 구별되는 표적 바이오마커에 지향되는, 키트.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 추가 시약(예를 들어, 리가제, 고정제 및/또는 투과화제)을 더 포함하는, 키트.
  114. 복합체로서,
    (a) 질환, 장애 또는 병태(예를 들어, 암)에 대한 표적 바이오마커 시그니처를 발현하는 세포외 소포로서, 상기 표적 바이오마커 시그니처는, (1) 적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드를 포함하는 제1 표적 바이오마커; 및 (2) 표면 단백질 바이오마커, 소포내 단백질 바이오마커 및 소포내 RNA 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 표적 바이오마커를 포함하는 제2 표적 바이오마커를 포함하되,
    상기 제2 표적 바이오마커가 상기 표면 단백질 바이오마커 중 하나 이상으로부터 선택되는 경우, 상기 제2 표적 바이오마커의 상기 선택된 표면 단백질 바이오마커(들)와 상기 제1 표적 바이오마커의 상기 적어도 1종의 세포외 소포-연관된 막-결합된 단백질은 상이하고;
    상기 세포외 소포는 상기 세포외 소포-연관된 막-결합된 폴리펩타이드에 지향되는 표적-포획 모이어티를 포함하는 고체 기질 상에 고정되는, 상기 세포외 소포;
    (b) 각각 상기 세포외 소포에 결합된 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브로서, 상기 제1 검출 프로브 및 상기 제2 검출 프로브 각각은,
    (i) 상기 표적 바이오마커 시그니처의 제2 표적 바이오마커에 지향되는 표적 결합 모이어티; 및
    (ii) 상기 표적 결합 모이어티에 커플링된 올리고뉴클레오타이드 도메인으로서, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 이중-가닥 부분 및 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인의 하나의 단부로부터 연장된 단일-가닥 오버행 부분을 포함하는, 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인
    을 포함하는, 상기 제1 검출 프로브 및 제2 검출 프로브
    를 포함하되,
    상기 제1 검출 프로브 및 상기 제2 검출 프로브의 상기 단일-가닥 오버행 부분은 서로에 혼성화되는, 복합체.
  115. 제114항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 표적 결합 모이어티는 각각 상기 표적 바이오마커 시그니처의 동일한 표적 바이오마커에 지향되는, 복합체.
  116. 제115항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 올리고뉴클레오타이드 도메인은 상이한, 복합체.
  117. 제114항에 있어서, 상기 적어도 2개의 검출 프로브의 상기 표적 결합 모이어티는 각각 상기 표적 바이오마커 시그니처의 구별되는 표적 바이오마커에 지향되는, 복합체.
  118. 제114항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고체 기질은 자석 비드를 포함하는, 복합체.
  119. 제114항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적-포획 모이어티는 항체 작용제이거나 이를 포함하는, 복합체.
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