KR20210140819A - 식물에서 유전자 발현의 프로그래밍가능한 후성적 제어 - Google Patents

식물에서 유전자 발현의 프로그래밍가능한 후성적 제어 Download PDF

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KR20210140819A
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케빈 엘. 슈나이더
아덴 키네
제니퍼 아델 샘슨
이트사소 가레이
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사운드 애그리컬쳐 컴퍼니
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Abstract

유기체, 예컨대 식물 또는 종자에서 표적 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시키기 위한 후성적 변형을 가이드하기 위해 인공적으로 합성된 핵산 구축물, 및 그의 제형이 본원에 개시된다. 이러한 핵산 구축물을 식물 또는 종자에 적용하는 방법이 또한 개시된다. 후성적 변형에 의해 수득되는 조작된 종자 및 식물이 또한 개시된다.

Description

식물에서 유전자 발현의 프로그래밍가능한 후성적 제어
상호 참고
본 출원은 2019년 3월 18일에 출원한 미국 가출원 일련 번호 62/820,172를 우선권으로 주장하며, 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
일부 측면에서, 핵산 구축물, 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 본원에 개시된다. 일부 예에서, 본 개시내용은 인공 핵산 구축물을 제공하며, 인공 핵산 구축물은 하기를 포함하고: (a) 2' 또는 3' 위치에서 변형된 리보스, 또는 2' 또는 3' 위치에서 변형된 데옥시리보스, 또는 이들의 조합물; 및 (b) 말단 오버행, 여기서 인공 핵산 구축물은 이중 가닥이고; 인공 핵산 구축물의 적어도 1개의 가닥은 독립적으로 적어도 약 10 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 또는 이들의 조합물을 포함하고; 유기체와 접촉할 때, 인공 핵산 구축물의 적어도 일부분은 다음을 용이하게 하도록 구성된다: i) 유기체의 핵산 서열에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 적어도 하나의 염기의 후성적 변형, ii) 인공 핵산 구축물의 적어도 1개의 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보성인 표적 mRNA 서열의 침묵, iii) 표적 mRNA 서열의 절단, 또는 iv) i), ii) 또는 iii)의 임의의 조합. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 임의의 퓨린 또는 피리미딘 염기에 후성적 변형을 포함하지 않는다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 적어도 부분적으로 DNA 메틸트랜스퍼라제, 그의 생물학적으로 활성인 단편, 또는 그의 유도체를 포함하는 시스템을 통해 후성적 변형을 용이하게 한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 적어도 부분적으로 DNA 아세틸트랜스퍼라제, 그의 생물학적으로 활성인 단편, 또는 그의 유도체를 포함하는 시스템을 통해 후성적 변형을 용이하게 한다. 일부 예에서, 시스템은 RNA 지시된 DNA 메틸화 경로의 적어도 하나의 성분의 적어도 일부분을 포함한다. 일부 예에서, 적어도 하나의 성분은 단백질 또는 그의 일부분을 포함한다. 일부 예에서, 단백질 또는 그의 일부분은 효소 또는 그의 일부분이다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 CRISPR, CRISPR-연관된 단백질 (Cas), 그의 생물학적으로 활성인 단편, 그의 유도체, 그의 융합 단백질, 또는 이들의 임의의 조합물의 부재하에 후성적 변형을 용이하게 할 수 있다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 Cas의 부재하에 후성적 변형을 용이하게 할 수 있다. 일부 예에서, 당의 총 개수에 기초하여 인공 핵산 구축물의 당의 적어도 약 80%는 각각 독립적으로 데옥시리보스, 변형된 데옥시리보스, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 당의 총 개수에 기초하여 인공 핵산 구축물의 당의 약 20% 미만은 각각 독립적으로 리보스, 변형된 리보스, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 RNA 또는 DNA: 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 이들의 조합물에 의해 적어도 부분적으로 코딩된다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 이들의 조합물의 적어도 약 80%는 DNA이다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물의 말단 뉴클레오티드 또는 말단 뉴클레오시드는 RNA: 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 서열에서 다중 뉴클레오티드는 동일한 후성적 변형을 갖는다. 일부 예에서, 핵산 서열에서 적어도 10-12개의 뉴클레오티드는 동일한 후성적 변형을 갖는다. 일부 예에서, 핵산 서열은 적어도 약 100개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 예에서, 핵산 서열은 CpG 섬을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 리보스 또는 변형된 데옥시리보스는 인공 핵산 구축물의 말단 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 있다. 일부 예에서, 변형된 리보스 또는 변형된 데옥시리보스는 2'-O-R 기를 포함한다. 일부 예에서, R 기는 알킬, 아릴, 할로알킬, 아미노, 메틸, 아세틸, 및 할로로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, R 기는 메틸이다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 퓨린 또는 피리미딘 염기 중 적어도 하나에서 변형을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 변형은 복수개의 변형을 포함한다. 일부 예에서, 변형은 인공 핵산 구축물의 안정성을 증가시킨다. 일부 예에서, 변형은 유기체에 의한 인공 핵산 구축물의 흡수를 증가시킨다. 일부 예에서, 변형은 실질적으로 인공 핵산 구축물의 3' 말단에 위치한다. 일부 예에서, 변형은 실질적으로 인공 핵산 구축물의 5' 말단에 위치한다. 일부 예에서, 변형은 메틸 기, 메톡시 기, 에스테르 기, 플루오로 기, 포스포르티오에이트 백본, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 말단 오버행은 3' 말단 오버행이다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 2개의 3' 말단 오버행을 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물의 적어도 1개의 가닥은 독립적으로 약 20 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 적어도 1개의 데옥시리보핵산을 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 적어도 1개의 리보핵산을 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 그의 5' 말단에서 인산화되지 않은 적어도 1개의 가닥을 포함한다. 일부 예에서, 유기체는 식물, 종자, 과일, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 고세균, 박테리아, 진균, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 원생생물, 조류, 선충, 이들의 임의의 일부분, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-62 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 서열식별번호: 63-194 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 서열식별번호: 195-404 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 서열식별번호: 405-584 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 서열식별번호: 585-684 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물은 인공 핵산 구축물의 백본에 위치하는 펩티드 핵산, 모르폴리노, 잠금(locked) 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 후성적 변형은 핵 RNA 폴리머라제 D1 (NRPD1), NRPE1, NRPD2/NRPE2, NRPD4/NRPE4, NRPE5, NRPE9B, NRPB1, RNA-의존성 RNA 폴리머라제 2 (RDR2), 다이서-유사 3 (DCL3), HUA 인핸서 1 (HEN1), 아르고노트 4 (AGO4), AGO6, AGO9, 클래시(Classy) 1 (CLSY1), RNA-지시된 DNA 메틸화 결함 1 (DRD1), 분열조직 침묵 결함 3 (DMS3), RNA-지시된 DNA 메틸화 1 (RDM1), KOW 도메인-함유 전사 인자 1 (KTF1), 데노보 관련 2 (IDN2), IDN2 직렬상동체1 (IDP1), IDP2, DMS4, 도메인 재배열된 메틸트랜스퍼라제 2 (DRM2), SUVH2, SUVH9, SUVR2, 마이크로키디아(Microrchidia) 1 (MORC1), MORC6, 사와디(Sawadee) 호메오도메인 상동체 1 (SHH1), 히스톤 데아세틸라제 6 (HDA6), 주몬지(Jumonji) 14 (JMJ14), 리신-특이적 히스톤 데메틸라제 1 (LDL1), LDL2, 유비퀴틴-특이적 프로테아제 26 (UBP26), RDR2-비의존성 DNA 메틸화에 필요 (NERD), 크로모메틸라제 2 (CMT2), CMT3, 메틸트랜스퍼라제 1 (MET1), SUVH4, 감소된 DNA 메틸화 1 (DDM1), 그의 생물학적으로 활성인 단편, 그와 연관된 조절 요소, 그와 연관된 인트론, 또는 이들의 임의의 조합물 중 1개 이상의 단백질을 적어도 부분적으로 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된다. 일부 예에서, 후성적 변형은 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편에 의해 촉매된다. 일부 예에서, 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편은 유기체에 대해 내인성이다. 일부 예에서, 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편은 TET 패밀리 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다. 일부 예에서, 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편은 메틸트랜스퍼라제 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편을 포함한다. 일부 예에서, 메틸트랜스퍼라제는 크로모메틸트랜스퍼라제 (CMT), 도메인 재배열된 메틸트랜스퍼라제 (DRM), 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 후성적 변형은 적어도 하나의 염기에 화학적 기를 부가한다. 일부 예에서, 후성적 변형은 적어도 하나의 염기에 메틸 기를 부가하고, 메틸 기는 메톡시, 포르밀 또는 카르복실 기, 또는 카르복실산으로 산화된다. 일부 예에서, 적어도 하나의 염기는 시토신이다. 일부 예에서, 후성적 변형은 메틸 기, 히드록시메틸 기, 포르밀 기, 카르복실 기, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 일부 예에서, 후성적 변형은 메틸 기를 포함한다. 일부 예에서, 핵산 서열은 전사 조절 영역을 포함한다. 일부 예에서, 이중 가닥 인공 핵산 구축물의 가닥은 전사 조절 영역의 일부분에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성을 포함한다. 일부 예에서, 전사 조절 영역은 적어도 약 30% 구아닌 시토신 (GC) 함량을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 복수체의 인공 핵산 구축물 (이중 가닥 또는 단일 가닥), 예를 들어 적어도 약 2-100, 2-90, 2-80, 2-70, 2-60, 2-50, 2-40, 2-30, 2-24, 2-12, 4-100, 4-90, 4-80, 4-70, 4-60, 4-50, 4-40, 4-30, 4-24, 4-12, 6-100, 6-90, 6-80, 6-70, 6-60, 2-50, 6-40, 6-30, 6-24, 6-12, 8-100, 8-90, 8-80, 8-70, 8-60, 8-50, 8-40, 8-30, 8-24, 8-12, 10-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 10-30, 10-24, 또는 10-12개의 본원의 인공 핵산 구축물을 제공한다. 일부 예에서, 인공 핵산 구축물의 개수의 적어도 약 10% 내지 약 100%는 복수체에서 상이하다. 일부 예에서, 복수체에서 각각의 인공 핵산 구축물은 상이하다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 2' 또는 3' 위치에서 변형된 리보스, 또는 2' 또는 3' 위치에서 변형된 데옥시리보스, 또는 이들의 조합물을 포함하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 인공 핵산 구축물에 부가하는 것을 포함하는, 본원에 개시된 인공 핵산 구축물을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 인공 핵산 구축물의 2' 또는 3' 위치에서 리보스, 데옥시리보스, 또는 이들의 조합물을 변형시키는 것을 포함하는, 본원에 개시된 인공 핵산 구축물의 제조 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 2개 이상의 본원에 개시된 인공 핵산 구축물을 혼합하는 것을 포함하는, 인공 핵산 구축물의 복수체를 제조하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 인공 핵산 구축물 또는 그의 복수체를 포함하는 단리된 세포를 제공한다. 일부 예에서, 세포는 진핵생물 세포이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 인공 핵산 구축물 또는 그의 복수체를 포함하는 식물, 종자, 용액, 미생물, 비료 또는 토양을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 조성물을 제공한다: (a) 본원에 개시된 인공 핵산 구축물 및 (b) 유기체의 핵산 서열에서 적어도 하나의 염기의 후성적 변형을 수행하는 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하나 이상의 본원의 인공 핵산 구축물 또는 그의 복수체를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 키트를 제공한다: (a) 본원에 개시된 인공 핵산 구축물, 그의 복수체, 또는 그의 조성물; 및 (b) 토양, 비료, 종자, 식물, 액체, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 용기.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 제형을 제공한다: (a) 본원에 개시된 인공 핵산 구축물, 그의 복수체, 또는 그의 조성물; 및 (b) 부형제. 일부 예에서, 부형제는 농업적으로 허용가능한 부형제이다. 일부 예에서, 제형은 비료 또는 토양을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 인공 핵산 구축물, 그의 복수체, 또는 그의 조성물을 부형제와 접촉시켜 제형을 형성하는 것을 포함하는, 제형을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 식물 또는 종자의 적어도 하나의 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시키는 유전성 변형을 포함하고, 임의적으로 인공 핵산 구축물 또는 그의 복수체를 포함하는 조작된 식물 또는 종자를 제공하며, 유전성 변형은 적어도 하나의 유전자의 전사 조절 영역에서 메틸화된 염기를 포함하고, 유전성 변형은 트랜스진을 포함하지 않는다. 일부 예에서, 2개의 유전자가 침묵된다. 일부 예에서, 적어도 하나의 메틸화된 염기는 핵산 서열에서 천연적으로 메틸화되지 않는 것이다. 일부 예에서, 전사 조절 영역은 전사 시작 부위, TATA 박스, 및 상류 활성화 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다. 일부 예에서, 메틸화된 염기는 복수개의 메틸화된 염기를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 조작된 식물 또는 종자의 적어도 하나의 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시키는 가변성 유전자 발현을 포함하고, 임의적으로 본원에 개시된 인공 핵산 구축물 또는 그의 복수체를 포함하는 조작된 식물 또는 종자의 복수체를 제공한다. 일부 예에서, 조작된 식물 또는 종자는 그 안의 적어도 하나의 유전자에서 적어도 하나의 변형된 염기를 포함하고, 이는 유전자에서 천연적으로 메틸화되지 않는다. 일부 예에서, 염기는 알킬, 아릴, 할로알킬, 아미노, 메틸, 아세틸, 할로, 또는 이들의 조합물로 변형된다. 일부 예에서, 조작된 식물 또는 종자는 그 안의 적어도 하나의 유전자에서 적어도 하나의 메틸화된 염기를 포함하다. 일부 예에서, 복수체는 적어도 약 10-20, 20-50, 50-100, 100-1000, 100-900, 100-800, 100-700, 100-600, 100-500, 100-400, 100-300, 100-240, 100-120, 또는 1000-10000개의 조작된 식물 또는 종자를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 농업 대상에게 물질을 적용하는 방법을 제공하고, 농업 대상은 종자, 식물, 식물의 구성성분, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 물질은 본원에 개시된 인공 핵산 구축물 또는 그의 복수체를 포함한다. 일부 예에서, 상기 방법은 농업 대상에서 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시킨다. 일부 예에서, 유전자는 적어도 1 또는 2번의 생식 주기 동안 적어도 부분적으로 침묵된다. 일부 예에서, 농업 대상을 인공 핵산 구축물을 포함하는 물질을 적용하지 않은 대등한 농업 대상과 비교할 때, 상기 적용은 다음 중 하나 이상을 일으킨다: (a) 농업 대상의 효소적 갈변을 예방하거나 또는 감소시키거나 또는 지연시키고; (b) 농업 대상의 성장률, 수율 또는 수명을 증가시키고; (c) 농업 대상의 성장률, 수율 또는 수명을 감소시키고; (d) 농업 대상의 해충 내성, 염 저항성, 열 저항성, 중금속 저항성, 질환 저항성, 또는 가뭄 내성을 증가시키고; (e) 농업 대상에 의해 제조된 분자의 양 또는 생성을 증가시키거나 또는 적어도 부분적으로 감소시키고; (f) 농업 대상의 적어도 일부분의 색상을 변경시키고; (g) 농업 대상의 개화율을 증가시키거나 또는 적어도 부분적으로 감소시키고; (h) 농업 대상의 부피 또는 중량을 증가시키고; (i) 농업 대상의 식용 생성물의 향 또는 질감을 개선시키고; (j) 농업 생성물의 보관 수명을 증가시키고; (k) 농업 생성물의 종자의 수 및 크기를 감소시키고; (j) 농업 대상의 영양분 함량을 증가시킴. 일부 예에서, 농업 대상은 식물배이다. 일부 예에서, 농업 대상은 대두, 옥수수, 벼, 토마토, 알팔파, 밀, 감자, 및 녹조류로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 접촉은 잡초의 성장률, 수율 또는 수명을 감소시킨다. 일부 예에서, 접촉은 농업 대상의 성장률, 수율 또는 수명을 증가시키고, 분자는 향정신성 물질이다. 일부 예에서, 향정신성 물질은 테트라히드로칸나비놀을 포함한다. 일부 예에서, 물질은 액체, 토양, 미생물, 비료, 또는 제초제이다.
참고문헌의 포함
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 본원에 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용의 신규한 특징은 첨부된 청구항에서 자세하게 제시된다. 본 개시내용의 특징 및 이점의 더 나은 이해는 본 개시내용의 원리가 이용되는 예시적인 예를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고하여 얻어질 것이다.
도 1은 비처리 종자를 복수개의 CATS 올리고뉴클레오티드로 처리하는 것을 개략적으로 도시한다.
도 2는 CATS 올리고뉴클레오티드의 설계의 비제한적인 예를 도시한다.
도 3은 CATS 올리고뉴클레오티드로의 처리에 의해 옥수수에서 PDS1 유전자를 침묵시킨 결과를 도시한다. PDS1-CATS 식물은 대조군 옥수수 식물 (하부 잎)과 비교하여 옅은 녹색 잎 표현형 (상부 잎)을 나타낸다.
도 4는 침윤 투여 방법을 이용하여 CATS 올리고뉴클레오티드로의 처리에 의해 옥수수 식물에서 PDS1 유전자를 침묵시킨 결과를 도시한다.
도 5는 CATS-처리된 옥수수 식물에서 PDS1 유전자의 비술파이트 시퀀싱 분석을 도시한다. CATS 올리고뉴클레오티드로의 처리는 PDS1 오픈 리딩 프레임의 상류에서 메틸화된 시토신을 생성한다.
도 6A-6D는 CATS 올리고뉴클레오티드로의 처리에 의해 옥수수에서 LZY1 유전자를 침묵시킨 결과를 도시한다. 도 6A는 야생형 식물에서 싹이 중력의 반대 방향으로 성장하는 것을 도시한다 (중력굴성). 도 6B는 LZY1-CATS 식물이 야생형 식물과 비교하여 중력굴성을 상실함을 도시한다. 도 6C는 야생형 식물에서 싹이 중력의 반대 방향으로 성장하는 것을 도시한다 (중력굴성). 도 6D는 LZY1-CATS 식물이 야생형 식물과 비교하여 중력굴성을 상실함을 도시한다.
도 7A-7C는 감자 식물에서 폴리페놀 옥시다제 (PPO) 유전자를 침묵시킨 결과를 도시한다. 도 7A는 CATS-처리된 감자가 비처리 대조군 감자와 비교하여 더 느린 효소적 갈변을 나타냄을 도시한다. 도 7B는 CATS-처리된 감자 식물에서 PPO mRNA 수준의 RT-PCT 분석을 도시한다. CATS 식물은 비처리 식물에서 대조군 mRNA와 비교하여 mRNA 전사체의 감소된 수준을 갖는다 (도 7C).
도 8은 옥수수에서 BWF1 및 BR2 유전자를 침묵시킨 결과를 도시한다. BWF1 및 BR2를 표적화하는 CATS 올리고뉴클레오티드로의 처리는 비처리 대조군 식물과 비교하여 더 짧은 옥수수 식물을 생성한다.
도 9는 야생형 집단과 비교하여 가변성 집단을 생성하기 위해 후성적 방법을 이용하는 것을 도시한다. 후성적 방법으로 처리된 집단은 야생형 집단과 비교하여 감소된 유전자 발현을 가질 수 있다.
도 10은 토마토 식물에서 올드 골드(old gold) 유전자를 표적화하기 위해 CATS 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 도시한다. 1 kb 처리는 RO 대조군과 비교하여 개별 식물에서 유전자 발현을 감소시킬 수 있다.
도 11은 포스포로티오에이트 변형, 2'O-메틸 변형, 2'-플루오로 변형, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 변형된 백본을 갖는 예시적인 CATS 올리고뉴클레오티드를 도시한다.
서론
상업적 가치가 있는 원하는 표현형을 유도하기 위해 식물에서 특이적인 표적 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시키기 위한 분자 기술이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 이 기술은 코팅 적용된 전사 침묵 (Coat Applied Transcriptional Silencing, CATS)으로 지칭되며, 질소 염기 변형 (예를 들어, 시토신 메틸화) 및 표적 유전자의 후성적 침묵을 유도하기 위해 특이적으로 조작된 DNA 올리고뉴클레오티드 구축물을 사용한다. 본원에 개시된 방법은 트랜스제닉 접근법에 필요한 수개월 또는 수년과 비교하여 수일의 설계 및 구축 작업흐름으로 식물 유전자 발현의 특이적이고 다중적인 조작을 가능하게 한다.
본원에 기재된 조작된 DNA 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 경로에 존재하는 핵산 서열을 모방하도록 제조될 수 있다. 일부 경우에, RNA 간섭 경로는 유기체 (예를 들어 식물, 진균, 박테리아, 또는 동물)에 천연적으로 존재하는 경로일 수 있다. 예를 들어, 조작된 DNA 올리고뉴클레오티드는 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster), 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans), 또는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) RNA 간섭 경로에 존재하는 핵산 서열을 모방하도록 제조될 수 있다. 예시적인 RNA 간섭 경로에는 아라비돕시스 탈리아나 RNA 간섭 경로가 포함될 수 있다. 예시적인 아라비돕시스 탈리아나 RNA 간섭 경로에서, 제1 RNA 핵산은 폴리머라제 IV 효소를 이용하여 전사를 통해 제조된다. 폴리머라제 IV로부터 전사된 제1 RNA 핵산은 단일 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 RNA 핵산으로 전환될 수 있다. 생성된 이중 가닥 핵산은 다이서 효소 (예를 들어, 다이서-유사 3 (DCL3) 효소)에 의해 가공되어, 더 작은 이중 가닥 RNA 핵산 단편을 생성할 수 있다. 이러한 RNA 핵산 단편은 HUA 인핸서 1 (HEN1) 효소 또는 그의 생물학적 등가물에 의해 RNA 핵산 단편 상에 존재하는 리보스 당에 존재하는 2' 또는 3' 히드록실 기에서 메틸화될 수 있다. 메틸화된 이중 가닥 RNA 가닥은 아르고노트 4 (AGO4) 효소 또는 그의 생물학적 등가물에 의해 가공되어, 단일 가닥의 메틸화된 RNA 핵산을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 메틸화된 RNA 핵산은 다중 경로를 통해 유기체에서 유전자의 발현 (유전자에 의해 코딩된 mRNA 또는 mRNA에 의해 코딩된 폴리펩티드의 수준 포함)을 조절할 수 있다. 예를 들어, 메틸화된 RNA 핵산은 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 서열에 직접적으로 결합하여, 침묵 RNA 핵산으로서 작용할 수 있다. 추가로, 메틸화된 RNA 핵산이 mRNA 서열과 회합할 때, 메틸화된 RNA 핵산은 mRNA의 절단을 유도할 수 있는 효소, 예컨대 AGO4를 동원할 수 있다. 추가로, 메틸화된 mRNA 핵산은 mRNA 서열을 코딩하는 게놈 DNA의 데노보 메틸화를 촉매하기 위해 DNA 메틸화 효소, 예컨대 도메인 재배열된 메틸트랜스퍼라제 2 (DRM2)와 회합할 수 있다. 일부 경우에, 메틸화된 RNA 핵산은 임의의 1가지, 임의의 2가지 또는 3가지 모든 이들 작용을 통해 유기체에서 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
따라서, 조작된 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭 경로에 존재하는 핵산을 모방하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 조작된 올리고뉴클레오티드는 메틸화된 RNA 핵산, 예컨대 HEN1 효소를 사용하여 메틸화된 RNA 핵산을 모방하도록 조작될 수 있다. 따라서, 이러한 조작된 올리고뉴클레오티드는 상기 언급된 작용의 임의의 조합을 통해 유기체에서 유전자의 발현 (유전자에 의해 코딩되는 mRNA 또는 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 수준 포함)을 조절할 수 있다. 예를 들어, 조작된 올리고뉴클레오티드는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 서열에 직접적으로 결합하여, 침묵 핵산으로서 작용할 수 있다. 추가로, 조작된 올리고뉴클레오티드가 mRNA 서열과 회합할 때, 조작된 올리고뉴클레오티드는 mRNA의 절단을 유도할 수 있는 효소, 예컨대 AGO4를 동원할 수 있다. 추가로, 조작된 올리고뉴클레오티드는 mRNA 서열을 코딩하는 게놈 DNA의 데노보 메틸화를 촉매하기 위해 DNA 메틸화 효소, 예컨대 도메인 재배열된 메틸트랜스퍼라제 2 (DRM2)와 회합할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 올리고뉴클레오티드는 임의의 1가지, 임의의 2가지 또는 3가지 모든 이들 작용을 통해 유기체에서 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
추가로, 조작된 올리고뉴클레오티드는 원하는 표적 mRNA 서열에 대해 적어도 부분적으로 상보성이도록 설계될 수 있다. 일부 경우에, 원하는 표적 mRNA 서열은 RNA 간섭 경로에서 천연 메틸화된 RNA 핵산의 표적인 mRNA일 수 있다. 일부 경우에, 원하는 표적 mRNA는 RNA 간섭 경로에서 천연 메틸화된 RNA 핵산의 임의의 표적과 별개이며 그로부터 떨어져 있는 mRNA일 수 있다. 따라서, 고도로 특이적인 유전자 조절은 관심 표적 mRNA 핵산과 회합할 수 있는 조작된 올리고뉴클레오티드를 생성함으로써 달성될 수 있다.
일부 예에서, 조작된 핵산 구축물은 표적 유전자의 오픈 리딩 프레임의 상류에 있는 전사 조절 영역과 높은 서열 상동성을 갖도록 설계된다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 적어도 1개의 말단 오버행을 갖는 이중 가닥 DNA 구축물일 수 있으며, 따라서 DNA 구축물은 식물의 내인성 DNA 메틸화 기구에 의해 인식되는 이중 가닥 RNA를 모방하여, 전사 조절 영역에 대한 내인성 DNA 메틸화를 지시한다. 일부 예에서, 유전자의 전사 조절 영역에서 시토신의 메틸화는 적어도 부분적으로 유전자를 침묵시킨다.
본원에 기재된 핵산 구축물의 사용은 몇몇 이점을 갖는다. 특이적으로 설계된 올리고뉴클레오티드는 전사체 발현 수준을 제어할 수 있는 식물 게놈의 정의된 영역에서 시토신 메틸화를 도입시킨다. 핵산 구축물은 식물의 종자 코팅 또는 성장하는 뿌리에 적용하여 도입되어, 맞춤형 유전자 발현 프로파일을 갖는 식물의 신속한 구축을 가능하게 한다. 일부 예에서, 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화된 시토신)는 유전성이며, 원하는 발현 프로파일을 갖는 모 재배 계통의 생성을 가능하게 한다. 메틸화 및 변경된 전사체 수준은 미래의 자손 세대를 통해 전파될 수 있다. 추가로, 식물에 핵산 구축물의 적용은 유전자 및/또는 다중 유전자의 다중 전사 조절 영역이 동시에 표적화될 수 있도록 독특한 표적화 서열을 갖는 핵산 구축물의 혼합물을 적용하여 다중화될 수 있다.
수율 동인은 후성적 메카니즘에 의해 조절될 수 있다. 수율 동인의 예는 잡종 강세, 광합성 및 종자 크기이다. 스트레스 내성은 후성적 메카니즘에 의해 조절될 수 있다. 스트레스 내성의 예는 질환 내성, 가뭄 저항성, 염 저항성, 열 저항성 및 중금속 스트레스이다. CATs 뉴클레오티드의 적용은 광범위할 수 있고, 표현형에 영향을 미치는 여러 유전자 조절인자 네트워크를 잠재적으로 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 구축물은 농산물과 같은 유기체의 하나 이상의 유전자에 대해 하나 이상의 후성적 변형을 제공할 수 있다. 이러한 후성적 변형의 도입은 농산물의 하나 이상의 특징을 변형시킬 수 있다. 이러한 특징에는 다음 중 하나 이상이 포함될 수 있다: 광합성, 이종화, 영양분 효율, 에너지 효율, 종자 크기, 식물 바이오매스, 일주기 리듬, 개화 시기, 종자 발달, 뿌리 발달, 질환 내성, 가뭄 저항성, 염 저항성, 열 저항성, 중금속 스트레스, 또는 이들의 임의의 조합. 하나 이상의 특징은 향, 색상, 질감, 보관 수명, 씨 없는 품종, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 유전자에 대한 후성적 변형은 특징을 변형시킬 수 있다. 유전자에 대한 후성적 변형은 복수체의 특징을 변형시킬 수 있다. 복수체의 후성적 변형은 특징을 변형시킬 수 있다. 복수체의 후성적 변형은 복수체의 특징을 변형시킬 수 있다.
추가로, 본원에 기재된 구축물을 이용하여 유기체, 예컨대 농산물의 다양한 풀을 생성할 수 있다. 구축물은 유기체의 하나 이상의 유전자에 하나 이상의 후성적 변형을 도입시킬 수 있다. 하나 이상의 후성적 변형의 도입은 하나 이상의 유전자의 적어도 부분적인 침묵 또는 적어도 부분적인 활성화를 일으킬 수 있다. 유기체에서 하나 이상의 유전자의 침묵 또는 도입 또는 이들의 조합은 종의 다양화를 일으킬 수 있다. 유기체의 하나 이상의 유전자에 후성적 변형의 도입은 자손의 다양한 풀을 생성할 수 있다. 이러한 하류 적용에는 재배 선택, 예컨대 유리한 특징에 대한 선택이 포함될 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본원의 제형 또는 단위 용량의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 일부 방법 및 물질이 이제 기재된다. 달리 언급되지 않는다면, 본원에서 사용되거나 또는 고려되는 기술은 표준 방법이다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며, 제한하는 것이 아니다.
하나 이상의 본 발명의 예 또는 측면의 세부사항이 본원에 첨부된 도면, 청구항 및 설명에서 제시된다. 본원에 개시되고 고려된 본 발명의 예 또는 측면의 다른 특징, 목적 및 이점은 달리 명백하게 배제되지 않는다면 임의의 다른 예 또는 측면과 조합될 수 있다.
개방형 용어, 예를 들어 "함유하다", "함유하는", "포함하다", "포함하는" 등은 포함하는 것을 의미한다.
단수 형태는 문맥상 명백히 달리 해석되지 않는다면 복수 형태를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다.
달리 나타내지 않는다면, 본원의 일부 예는 수치 범위를 고려한다. 수치 범위가 제공되는 경우, 달리 나타내지 않는다면, 범위는 범위 종점을 포함할 수 있다. 달리 나타내지 않는다면, 수치 범위는 명시적으로 작성된 것과 같이 그 안의 모든 수치 및 하위 범위를 포함할 수 있다.
참고 수치 범위와 관련하여 용어 "약"은 해당 값으로부터 + 또는 - 10% 값의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 10"의 양은 9, 10 및 11의 참고 숫자를 비롯하여 9 내지 11의 양을 포함한다. 참고 수치 값과 관련하여 용어 "약"은 또한 해당 값으로부터 + 또는 - 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 값의 범위를 포함할 수 있다.
용어 "용이하게 하다"는 본원에서 i) 구축물이 후성적 변형을 위한 적절한 분자 시스템을 갖는 유기체에 도입될 때, 그것이 유기체에서 핵산 서열을 후성적으로 변형시키기 위해 유기체가 분자 시스템의 적어도 일부분을 사용하는 것을 용이하게 하거나 또는 가능하게 하는 기구, 또는 ii) 인공 핵산 구축물의 적어도 1개의 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보성인 표적 mRNA 서열의 침묵, iii) 표적 mRNA 서열의 절단, 또는 iv) i), ii) 또는 iii)의 임의의 조합을 지칭할 수 있다.
용어 "화합물"은 본원에 개시된 일반 화학식, 이들 일반 화학식의 임의의 아속, 및 이들 일반 또는 아속 화학식 내의 임의의 구체적인 화합물에 포함되는 화합물을 지칭할 수 있다. 화합물은 그들의 화학 구조 및/또는 화학 명칭에 의해 확인되는 구체적인 종, 아속 또는 더 큰 속일 수 있다. 추가로, 화합물은 또한 본원에 제시된 이러한 임의의 종, 아속 또는 속의 치환 또는 변형을 포함할 수 있다. 화학 구조 및 화학 명칭이 상충되는 경우, 화학 구조가 화합물의 정체를 결정할 수 있다. 화합물은 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 결합을 함유할 수 있고, 따라서 입체이성질체, 이성질체, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 따라서, 명세서의 범위 내의 화학 구조는 입체이성질체적으로 순수한 형태 (예를 들어, 기하학적으로 순수한, 거울상이성질체적으로 순수한, 또는 또는 부분입체이성질체적으로 순수한), 및 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물을 비롯하여 예시된 화합물의 모든 가능한 거울상이성질체 및 입체이성질체를 포함한다. 추가로, 화합물의 부분 구조가 예시되는 경우, 별표는 부분 구조가 분자의 나머지에 부착하는 지점을 나타낸다. 거울상이성질체 및 입체이성질체 혼합물은 숙련된 기술자에게 널리 공지된 분리 기술 또는 키랄 합성 기술을 이용하여 그들의 성분 거울상이성질체 또는 입체이성질체로 분할될 수 있다. 화합물에는 화합물의 임의의 염 또는 용매화물 형태가 포함될 수 있다. 화합물에는 화합물의 임의의 유도체가 포함될 수 있다.
용어 "유도체"는 용어 "유사체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 화합물 A의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 원자가 또 다른 원자 또는 관능기 (예를 들어, 아미노, 할로, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬)로 대체되어 화합물 B를 형성하는 경우, 화합물 A는 화합물 B의 유도체 또는 유사체일 수 있다. 용어 "유도체"는 또한 서로 구조적으로 유사하지만 (한 원자를 상이한 원소의 원자로 대체한 것에서, 또는 특정한 관능기의 존재에서와 같이) 조성에서 약간 차이가 있는 화학적 화합물을 지칭할 수 있다.
용어 "용매화물"은 화합물의 활성 및/또는 성질 중 하나 이상을 유지하지만 바람직하지 않은 것이 아닌 용매화물이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 용매화물의 예에는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산, 에탄올아민, 또는 이들의 조합물과 조합된 화합물이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "염"에는 유리 산 및 염기의 활성 및 성질 중 하나 이상을 유지하고 바람직하지 않은 것이 아닌 염이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 염의 예시적인 예에는 술페이트, 피로술페이트, 비술페이트, 술파이트, 비술파이트, 포스페이트, 인산일수소, 인산이수소, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포르메이트, 이소부티레이트, 카프로에이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 부틴-l,4-디오에이트, 헥신-l,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 술포네이트, 크실렌술포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, y-히드록시부티레이트, 글리콜레이트, 타르트레이트, 메탄술포네이트, 프로판술포네이트, 나프탈렌-l-술포네이트, 나프탈렌-2-술포네이트, 및 만델레이트가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
달리 나타내지 않는다면, 화학 구조는 화학 구조를 갖는 임의의 화합물을 지칭할 수 있다.
달리 나타내지 않는다면, 본원에서 제형은 분말, 펠렛 또는 비드일 수 있거나, 또는 액체일 수 있다.
달리 나타내지 않는다면, 본원에서 제형은 제형의 중량을 기준으로 하여 약 0% 내지 약 15% w/w, 예를 들어 약 0-10%, 0-5%, 또는 0-1% w/w; 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 99% w/w 미만의 양으로 물을 함유할 수 있다.
달리 나타내지 않는다면, 본원에 개시되거나 또는 예시된 구조에 입체중심이 있는 경우에는 언제나, 각각의 경우에 입체중심이 R 또는 S일 수 있다.
달리 나타내지 않는다면, 본원에서 분자 구조의 일부로서 사용될 때 기호
Figure pct00001
이 있는 경우에는 언제나, 단일 결합을 지칭할 수 있다.
용어 "아미노"는 고립 쌍을 갖는 염기성 질소 원자를 함유하는 관능기를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 아미노에는 라디칼
Figure pct00002
가 포함될 수 있으며, 여기서 각각의 R'는 독립적으로 H, 할로, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬이다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘 또는 그의 라디칼을 지칭할 수 있다.
용어 "알킬"은 모 알칸, 알켄 또는 알킨의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유래되는 포화 또는 불포화, 분지형, 직쇄 또는 시클릭 1가 탄화수소 기를 지칭할 수 있다. 전형적인 알킬 기에는 메틸; 에틸, 예컨대 에타닐, 에테닐, 에티닐; 폴리올, 예컨대 프로판-1-일, 프로판-2-일, 시클로프로판-1-일, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일 (알릴), 시클로프로프-1-엔-1-일; 시클로프로프-2-엔-1-일, 프로프-1-인-1-일, 프로프-2-인-1-일; 부틸, 예컨대 부탄-1-일, 부탄-2-일, 2-메틸-프로판-1-일, 2-메틸-프로판-2-일, 시클로부탄-1-일, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 시클로부트-1-엔-1-일, 시클로부트-1-엔-3-일, 시클로부타-1,3-디엔-1-일, 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "아릴"은 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유래되는 1가 방향족 탄화수소 기를 지칭할 수 있다. 전형적인 아릴 기에는 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페난트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 코로넨, 플루오란텐, 플루오렌, 헥사센, 헥사펜, 헥살렌, as-인다센, s-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 옥타센, 옥타펜, 옥탈렌, 오발렌, 펜타-2,4-디엔, 펜타센, 펜탈렌, 펜타펜, 페릴렌, 페날렌, 페난트렌, 피센, 플레이아덴, 피렌, 피란트렌, 루비센, 트리페닐렌, 트리나프탈렌 등으로부터 유래된 기가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정 예에서, 아릴 기는 6 내지 20개의 탄소 원자를 지칭한다.
용어 "헤테로알킬, 헤테로알카닐, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐"은 탄소 원자 (및 임의의 회합된 수소 원자) 중 1개 이상이 각각 독립적으로 동일한 또는 상이한 헤테로원자 기로 대체된 것인 알킬, 알카닐, 알케닐 및 알키닐 기를 각각 지칭할 수 있다. 전형적인 헤테로원자 기에는 -O-, -S-, -O-O', -S-S-, -O-S-, -NR'-, =N-N=, -N=N-, -N=N-NR'-, -PH-, -P(O)2-, -O-P(O)2-, -S(O)-, -S(O)2-, -SnH2- 등이 포함되나 이로 제한되지 않고, 여기서 R'는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴 또는 치환된 아릴이다.
용어 "헤테로아릴"은 모 헤테로방향족 고리계의 단일 원자로부터 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유래된 1가 헤테로방향족 기를 지칭할 수 있다. 전형적인 헤테로아릴 기에는 아크리딘, 아르신돌, 카르바졸, β-카르볼린, 크로만, 크로멘, 신놀린, 푸란, 이미다졸, 인다졸, 인돌, 인돌린, 인돌리진, 이소벤조푸란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이속사졸, 나프티리딘, 옥사디아졸, 옥사졸, 페리미딘, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진, 프탈라진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피라졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피롤, 피롤리진, 퀴나졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀴녹살린, 테트라졸, 티아디아졸, 티아졸, 티오펜, 트리아졸, 크산텐 등으로부터 유래된 기가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정 예에서, 헤테로아릴 기는 5-20원 헤테로아릴이고, 다른 예에서 5-10원 헤테로아릴이다. 특정 예에서 헤테로아릴 기는 티오펜, 피롤, 벤조티오펜, 벤조푸란, 인돌, 피리딘, 퀴놀린, 이미다졸, 옥사졸 및 피라진으로부터 유래된 것들이다.
용어 "아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 아릴 기로 대체된 것인 아시클릭 알킬 기를 지칭할 수 있다. 전형적인 아릴알킬 기에는 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 구체적인 알킬 모이어티가 의도되는 경우, 명명법 아릴알카닐, 아릴알케닐 및/또는 아릴알키닐이 사용된다. 특정 예에서, 아릴알킬 기는 (C6-C30) 아릴알킬이고, 예를 들어 아릴알킬 기의 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 모이어티는 (C1-C10)이고, 아릴 모이어티는 (C6-C20)이다.
용어 "헤테로아릴알킬"은 탄소 원자, 전형적으로 말단 또는 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자 중 하나가 헤테로아릴 기로 대체된 것인 아시클릭 알킬 기를 지칭할 수 있다. 구체적인 알킬 모이어티가 의도되는 경우, 명명법 헤테로아릴알카닐, 헤테로아릴알케닐 및/또는 헤테로아릴알키닐이 사용된다. 특정 예에서, 헤테로아릴알킬 기는 6-30원 헤테로아릴알킬이고, 예를 들어 헤테로아릴알킬의 알카닐, 알케닐 또는 알키닐 모이어티는 1-10원이고, 헤테로아릴 모이어티는 5-20원 헤테로아릴이다.
용어 "시클로알킬"은 포화 또는 불포화 시클릭 알킬 기를 지칭할 수 있다. 구체적인 포화 수준이 의도되는 경우, 명명법 "시클로알카닐" 또는 "시클로알케닐"이 사용된다. 전형적인 시클로알킬 기에는 시클로프로판, 시클로부탄, 시클로펜탄, 시클로헥산 등으로부터 유래된 기가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정 예에서, 시클로알킬 기는 (C3-C10) 시클로알킬이거나, 또는 특정 예에서 (C3-C6) 시클로알킬이다.
용어 "헤테로시클로알킬"은 1개 이상의 탄소 원자 (및 임의의 회합된 수소 원자)가 독립적으로 동일한 또는 상이한 헤테로원자로 대체된 것인 포화 또는 불포화 시클릭 알킬 기를 지칭할 수 있다. 탄소 원자(들)을 대체하기 위한 전형적인 헤테로원자에는 N, P, O, S 및 Si가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 전형적인 헤테로시클로알킬 기에는 에폭시드, 이미다졸리딘, 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 피라졸리딘, 피롤리딘, 퀴누클리딘 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "부분입체이성질체 과량" (DE)은 2가지 부분입체이성질체의 상대적인 존재비로부터의 차이를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 2가지 부분입체이성질체가 있고, 그들의 몰 또는 중량 백분율이 A 및 B인 경우, DE는 다음과 같이 계산될 수 있다: DE = [(A-B)/(A+B)] * 100%. 예를 들어, 혼합물이 75%의 한 부분입체이성질체 및 25%의 다른 부분입체이성질체를 함유하는 경우, 부분입체이성질체 과량은 50%이다. 또 다른 예에서, 95%의 한 부분입체이성질체인 혼합물의 경우, 부분입체이성질체 과량은 90%이다.
용어 "거울상이성질체 과량" (EE)은 2가지 거울상이성질체의 상대적인 존재비로부터의 차이를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 2가지 거울상이성질체가 있고, 그들의 몰 또는 중량 백분율이 A 및 B인 경우, EE는 다음과 같이 계산될 수 있다: EE = [(A-B)/(A+B)] * 100%. 예를 들어, 혼합물이 75%의 한 거울상이성질체 및 25%의 다른 거울상이성질체를 함유하는 경우, 거울상이성질체 과량은 50%이다. 또 다른 예에서, 95%의 한 거울상이성질체인 혼합물의 경우, 거울상이성질체 과량은 90%이다.
용어 "치환된"은 1개 이상의 수소 원자가 각각 독립적으로 동일한 또는 상이한 치환기(들)로 대체된 것인 기를 지칭할 수 있다. 전형적인 치환기에는 할로, 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 시클로알킬, 및 헤테로시클로알킬이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
달리 나타내지 않는다면, "처리된"은 "접촉된"을 지칭할 수 있다. 유사하게, "비처리"는 "비접촉"을 지칭할 수 있다.
용어 "실질적으로 대등한 식물"은 이전에 언급된 식물과 동일한 종의 식물을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 대등하지만 달리 접촉되지 않은 식물은 접촉된 식물과 동일한 종에 속한다. 실질적으로 대등하지만 달리 접촉되지 않은 식물은 (주변 토양으로부터 식물의 가장 높은 지점까지 측정하였을 때) 접촉된 식물의 약 80% 내지 120% 높이를 가질 수 있고/거나 접촉된 식물의 약 80% 내지 120%의 질량을 가질 수 있다.
용어 "가뭄"은 지난 12 개월 내에 20 인치, 15 인치, 10 인치, 또는 5 인치 미만의 강우량을 갖는 상태를 의미할 수 있다. 용어 "가뭄"은 또한 -1.0 미만의 팔머(Palmer) 가뭄 심도 지수 (PDSI)를 갖는 상태를 의미할 수 있다. 용어 "적절하게 관개된 상태"는 지난 12 개월 내에 20 인치 초과의 강우량을 갖는 상태를 의미할 수 있다. 용어 "적절하게 관개된 상태"는 -1.0 초과의 PDSI를 갖는 상태를 의미할 수 있다.
용어 "식물"은 용어 "작물"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 식품, 의류, 가축 사료, 바이오 연료, 의약 또는 다른 용도를 위해 수확될 수 있는 임의의 작물, 재배 식물, 진균 또는 조류가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 식물에는 밭 및 온실 작물, 예컨대 비제한적으로 평원 작물, 과일 및 채소, 다년생 나무 작물, 및 관상용 식물이 포함된다. 식물에는 사탕수수, 호박, 옥수수 (콘), 밀, 벼, 카사바, 대두, 건초, 감자, 목화, 토마토, 알팔파, 및 녹조류가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 식물에는 또한 임의의 채소, 예컨대 양배추, 순무, 당근, 파스닙, 비트, 상추, 콩, 잠두, 완두콩, 감자, 가지, 토마토, 오이, 호박, 스쿼시, 양파, 마늘, 리크, 후추, 시금치, 참마, 고구마 및 카사바가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 일부 예에서, 식물에는 또한 과일, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 식물배, 또는 이들의 임의의 조합물이 포함될 수 있다.
핵산 구축물
유기체에서 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시키기 위한 핵산 구축물이 본원에 개시되며, 핵산 구축물은 유기체에서 유전자의 적어도 하나의 염기의 내인성 변형 (예를 들어, 메틸화)을 가이드하도록 구성된다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
일부 예에서, 핵산 구축물은 1) 변형된 리보스 또는 변형된 데옥시리보스 또는 이들의 조합물 및 2) 말단 오버행을 포함하는 인공 이중 가닥 핵산 구축물일 수 있으며, 핵산 구축물이 유기체의 핵산 서열과 회합할 때, 효소는 유기체의 핵산 서열에서 적어도 하나의 염기의 후성적 변형을 수행한다. 일부 예에서, 변형된 리보스 또는 변형된 데옥시리보스는 핵산 구축물의 말단 뉴클레오티드에 포함된다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 핵산 서열과 회합한 아르고노트 단백질과 회합한다.
일부 예에서, 핵산 구축물은 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 또는 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 적어도 1개의 데옥시리보핵산을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 100개의 데옥시리보핵산을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 적어도 1개의 리보핵산을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 100개의 리보핵산을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 유전자의 염기는 시토신일 수 있다. 일부 예에서, 유전자의 염기는 아데닌, 구아닌 또는 티민일 수 있다.
일부 예에서, 핵산 구축물은 이중 가닥 DNA 구축물일 수 있다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 동일한 길이를 갖는 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 상이한 길이를 갖는 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 적어도 1개의 말단 오버행을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 말단 오버행은 단일 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 말단 오버행은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 DNA 구축물의 각각의 말단에서 말단 오버행을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 DNA 구축물의 각각의 말단에서 말단 오버행을 포함할 수 있고, 말단 오버행은 동일한 길이를 갖는다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 DNA 구축물의 각각의 말단에서 1개-뉴클레오티드 말단 오버행을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 3'-말단 오버행을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 5'-말단 오버행을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이중 가닥 DNA 구축물은 DNA 구축물의 각각의 말단에서 1개-뉴클레오티드 3'-말단 오버행을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 핵산 구축물은 예를 들어 2' 위치 및/또는 3' 위치에서 변형된 적어도 1개의 변형된 당을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 당의 넘버링은 관련 기술분야의 위치 넘버링의 일반적인 관례를 따르는 것으로 이해되어야 한다. 구체적으로, 뉴클레오티드 당에서 탄소 넘버링은 하기 도시된 리보스 당에 의해 예시된다:
Figure pct00003
일부 예에서, 변형된 당은 2'-R, 2'-O-R, 3'-R, 또는 3'-O-R 기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, R 기는 알킬, 아릴, 할로알킬, 아미노, 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 예에서, R 기는 플루오로- (F)일 수 있다. 일부 예에서, R 기는 메톡시에틸일 수 있다. 일부 예에서, R 기는 메틸일 수 있다. 일부 예에서, R은 -(C=O)n-R1일 수 있거나, 또는 리보스 변형은 하기에 의해 표현되는 구조를 포함한다:
Figure pct00004
일부 예에서, R1은 알킬, 알케닐, 알키닐 아릴, 치환된 알킬, 치환된 알케닐, 치환된 알키닐, 또는 치환된 아릴일 수 있다.
일부 예에서, 변형된 당은 핵산 구축물의 적어도 1개의 가닥의 말단 뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 일부 예에서, 변형된 당은 핵산 구축물의 적어도 1개의 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 이중 가닥 DNA 구축물일 수 있고, DNA 구축물의 각각의 가닥은 적어도 1개의 변형된 당을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 이중 가닥 DNA 구축물일 수 있고, DNA 구축물의 각각의 가닥은 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드에서 적어도 1개의 변형된 당을 포함한다.
일부 경우에, 당은 리보스의 유도체일 수 있다. 일부 예에서, 당은 아라비노스일 수 있다. 일부 예에서, 당은 2'-데옥시-2'-플루오로-아라비노 (FANA)일 수 있다. 일부 예에서, 당은 헥소스의 유도체 (예를 들어 HNA; 헥소스 핵산)일 수 있다. 일부 예에서, 당은 트레오스의 유도체 (예를 들어 TNA; 트레오스 핵산)일 수 있다. 일부 예에서, 당은 모르폴리노 기로 대체될 수 있고, 백본은 포스포르아미데이트 연결 (예를 들어 PMO; 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머)로 구성될 수 있으며, 일부 예에서, 당은 가교 당 (예를 들어 BNA; 가교 핵산)일 수 있다. 일부 예에서, 2' 및 4' 위치 사이의 가교 탄소는 메틸렌 기일 수 있다 (예를 들어 LNA; 잠금 핵산). 일부 예에서, 2' 및 4' 위치 사이의 가교 탄소는 에틸 기일 수 있다. 일부 예에서, 2',4'-속박된 에틸 당 유도체는 S 입체화학 배열 (예를 들어 (S)-cET)일 수 있다. 일부 예에서, 당은 아시클릭일 수 있다. 일부 예에서, 당은 2' 및 3'-결합이 결여된 유도체 또는 리보스 (예를 들어 UNA; 비잠금 핵산)일 수 있다. 일부 예에서, 당은 트레오니놀의 유도체 (예를 들어 aTNA; 트레오니놀 핵산)일 수 있다. 일부 예에서, 당은 세리놀의 유도체 (예를 들어 SNA; 세리놀 핵산)일 수 있다. 일부 예에서, 당은 글리콜의 유도체 (예를 들어 GNA; 글리콜 핵산)일 수 있다.
일부 경우에, 각각의 가닥 내의 당은 가교 포스포디에스테르 연결에 의해 3'에서 5'으로 연결된다. 일부 예에서, 포스포디에스테르 연결 내의 1개의 산소는 황에 의해 대체되어 포스포르티오에이트를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 포스포디에스테르 연결 내의 2개의 산소는 황에 의해 대체되어 포스포로디티오에이트 연결을 형성한다. 일부 예에서, 3' - 5' 포스포디에스테르는 비-가교 산소 상에 추가의 에스테르 기를 함유한다. 일부 예에서, 당 가교 포스페이트는 포스포트리에스테르일 수 있다. 일부 예에서, 포스포트리에스테르는 안정할 수 있다. 일부 예에서, 포스포트리에스테르는 생체내 가역성일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 핵산은 리포솜과 회합되거나 또는 그 안에 캡슐화된다. 일부 예에서, 리포솜은 양이온성 펩티드 (예를 들어 DOTAP)로 구성될 수 있다. 일부 예에서, 리포솜은 이온화가능한 지질 (예를 들어 DLinDMA 또는 KC2-DMA)로 구성될 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 핵산은 나노 또는 마이크로입자와 회합되거나 또는 그 안에 캡슐화될 수 있다. 일부 예에서, 나노 또는 마이크로입자는 폴리 락티드-코-글리콜산 (PLGA)으로 구성될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 나노입자에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 나노입자는 리포솜일 수 있다. 일부 예에서, 나노입자는 미셀일 수 있다. 일부 예에서, 나노입자는 실리카를 포함한다. 일부 예에서, 나노입자는 미네랄 또는 미네랄 유도체를 포함한다. 일부 예에서, 핵산은 금으로 구성된 나노입자에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 나노입자는 양자 점일 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 DNA 또는 다른 핵산으로 구성된 나노입자에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 마이크로입자에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 마이크로입자는 실리카를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 마이크로입자는 점토를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 1개 이상의 핵산 서열은 흡수, 수송, 세포질 또는 핵 전달을 증강시키기 위해 리간드 또는 다른 모이어티에 직접적으로 접합될 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵산 듀플렉스의 5' 말단에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵산 듀플렉스의 3' 말단에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵산 듀플렉스의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵산 듀플렉스 내의 위치에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵염기 중 하나의 비-왓슨-크릭(Watson-Crick) 면에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 우라실의 5-위치에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵산 상의 다중 위치에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 1개 초과의 리간드가 부착될 수 있다. 일부 예에서, 동일한 리간드의 다중 카피가 부착된다. 일부 예에서, 다중의 상이한 리간드가 부착된다.
일부 예에서, 리간드는 당 또는 다당류일 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 GalNAc일 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵산 상의 단일 위치에 부착된 2개의 GalNAc 모이어티일 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵산 상의 단일 위치에 부착된 3개의 GalNAc 모이어티일 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 핵산 상의 단일 위치에 부착된 3개 초과의 GalNAc 모이어티일 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 키틴 또는 그의 유도체일 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 만노스 또는 그의 유도체일 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 시알산 또는 그의 유도체일 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 핵산은 펩티드 또는 그의 유도체에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 핵산 흡수를 증강시킬 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 엔도솜 탈출을 증강시킬 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 흡수 및 엔도솜 탈출 둘 다를 증강시킬 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 혈관 조직으로의 전달 및 장거리 수송을 증강시킬 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 양이온성일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 바이러스 단백질의 유도체일 수 있다. 일부 예에서, 리간드는 아르기닌 풍부 펩티드 (예를 들어 TAT)일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 히스티딘 풍부 펩티드 (예를 들어 엔도포터)일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 용해성 펩티드 (예를 들어 멜리틴)일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 산성 조건에 노출시 활성화될 수 있는 차폐된 펩티드일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 pH 민감성일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 박테리아 단백질의 유도체일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 플라겔린의 유도체일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 EF-Tu의 유도체일 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 핵산은 스테롤 또는 스테롤 유도체에 접합될 수 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 지질에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 단일 쇄 지질에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 1 내지 22개의 탄소를 함유하는 단일 쇄 지질에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 포화인 단일 쇄 지질에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 적어도 1개의 불포화 위치로 구성될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 디아실 지질에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 1 내지 22개의 탄소를 함유하는 디아실 지질에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 포화인 디아실 지질에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 적어도 1개의 불포화 위치를 포함한다. 일부 예에서, 핵산은 비타민 또는 비타민 유도체에 접합될 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 토코페롤에 접합될 수 있다.
일부 예에서, 핵산 구축물은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 2 내지 약 100개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 약 10 내지 약 100개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 약 10 내지 약 50개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 약 10 내지 약 40개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 약 10 내지 약 30개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 약 20 내지 약 30개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 약 (4, 6, 8 또는 10) 내지 약 24개의 염기 쌍, 예를 들어 약 10 내지 약 24개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 23개의 염기 쌍을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 24개의 염기 쌍을 포함한다.
일부 예에서, 핵산 구축물은 유전자의 전사 조절 영역에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 포함한다.
일부 예에서, 전사 조절 영역은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 구아닌-시토신 함량 (G-C 함량)을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% G-C 함량을 갖는 적어도 1개의 뉴클레오티드 가닥을 포함한다.
일부 예에서, 핵산 구축물은 폴리뉴클레오티드 가닥의 말단 뉴클레오티드에서 인산화되지 않을 수 있는 적어도 1개의 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 폴리뉴클레오티드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드에서 인산화되지 않을 수 있는 적어도 1개의 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 폴리뉴클레오티드 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드에서 인산화되지 않을 수 있는 적어도 1개의 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함하는 이중 가닥 핵산 구축물일 수 있으며, 각각의 폴리뉴클레오티드 가닥은 폴리뉴클레오티드 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드에서 인산화되지 않을 수 있다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함하는 이중 가닥 DNA 구축물일 수 있으며, 각각의 폴리뉴클레오티드 가닥은 폴리뉴클레오티드 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드에서 인산화되지 않을 수 있다.
일부 예에서, 유전자는 적어도 1번의 생식 주기 동안에 적어도 부분적으로 침묵된다. 적어도 부분적인 유전자 침묵은 변형되지 않은 유전자에 비해 감소된 수준으로 유전자가 전사되는 것을 의미함을 이해해야 한다. 일부 예에서, 변형되지 않은 유전자는 야생형 유전자이다. 유전자 전사의 측정은 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 임의의 방법, 예컨대 mRNA 전사체 수준의 측정에 의해 수행될 수 있다. 일부 예에서, 유전자는 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 30번의 생식 주기 동안에 적어도 부분적으로 침묵된다. 일부 예에서, 유전자는 유전자의 상응하는 mRNA 전사체 수준의 측정에 의해 결정시 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 침묵될 수 있다.
일부 예에서, 내인성 후성적 변형 효소 또는 그의 단편을 후성적 변형을 위해 표적화된 핵산 서열의 일부로 동원하도록 구성된 핵산 구축물이 본원에 개시된다. "내인성"은 유전자를 함유하는 유기체 내에서 천연적으로 발생하는 것을 의미함을 이해해야 한다. 따라서, "내인성" 후성적 변형 효소는 유전자를 함유하는 유기체에 천연적으로 존재하는 변형 효소를 의미함을 이해해야 한다.
일부 예에서, 핵산 구축물은 임의의 하나의 서열식별번호: 1-664의 핵산 서열에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 핵산 구축물은 임의의 하나의 서열식별번호: 1-664의 핵산 서열을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 효소 또는 그의 단편은 핵산 서열, 예컨대 유전자의 일부분 또는 유전자의 전사 조절 영역의 적어도 하나의 염기에 메틸 기를 전달하는 것을 촉매할 수 있다. 일부 경우에, 효소 또는 그의 단편은 메틸트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 효소 또는 그의 단편은 메틸트랜스퍼라제 (MET), 크로모메틸트랜스퍼라제 (CMT), 도메인 재배열된 메틸트랜스퍼라제 (DRM), 이들의 임의의 촉매적으로 활성인 단편, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 효소는 Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3L, DRM1, DRM2, NtDRM1, Zmet3, Fmu, Dnmt1, MET1, DIM2, DRM2, CMT1, CMT3, 이들의 임의의 촉매적으로 활성인 단편, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. CMT 효소는 OsCMT3, ZCMT3, OsCMT1, NtCMT1, CMT3, 이들의 임의의 촉매적으로 활성인 단편 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. MET 효소는 NtMET1, OsMET1-2, ZMET1, OsMET1-1, MET1, 이들의 임의의 촉매적으로 활성인 단편, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. DRM 효소는 OsDRM3, OsDRM2, OsDRM1a, OsDRM1b, ZMET3, NtDRM1, DRM1, DRM2, 이들의 임의의 촉매적으로 활성인 단편, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. DNMT2 효소는 OsDNMT2, ZMET4, OsCMT2, 이들의 임의의 촉매적으로 활성인 단편, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 핵산 서열을 상기 임의의 효소 또는 그의 단편과 접촉시켜, 핵산 서열 (예컨대 관심 유전자)에서 적어도 하나의 염기의 후성적 변형을 수득할 수 있다. 핵산 구축물을 비롯하여 본원에 기재된 조성물은 내인성 효소 또는 그의 단편을 핵산 서열에서 관심 염기로 가이드할 수 있고, 이로써 효소 또는 그의 단편과 관심 염기를 접촉시켜, 효소 또는 그의 단편이 관심 염기의 후성적 변형을 수행하도록 한다.
본원에 기재된 방법은 핵산 서열 (예컨대 유전자의 일부분 또는 유전자의 전사 조절 영역)의 1개 이상의 염기의 메틸화를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 핵산 서열, 예컨대 유전자의 일부분 또는 유전자의 전사 조절 영역의 1개 이상의 염기를 산화시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 핵산 서열의 적어도 하나의 염기를 후성적으로 변형시키는 것을 포함할 수 있고, 상기 후성적 변형은 식물 자손에게 유전될 수 있다.
일부 경우에, 효소 또는 그의 단편은 핵산 서열 (예컨대 유전자의 일부분 또는 유전자의 전사 조절 영역)의 적어도 하나의 염기의 후성적 변형에서의 변화를 촉매할 수 있다. 후성적 변형에서의 변화는 메틸화된 염기에서 히드록시메틸화된 염기, 카르복실화된 염기, 포르밀화된 염기, 또는 이들의 임의의 조합으로의 전환을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 효소는 디옥시게나제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 효소는 10-11 전위 (TET) 패밀리 효소를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 효소는 TET1, TET2, TET3, CXXC 핑거 단백질 4 (CXXC4), 이들의 임의의 촉매적으로 활성인 단편, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.
후성적 변형은 임의의 염기, 예컨대 시토신, 티민, 우라실, 아데닌, 구아닌, 또는 이들의 임의의 조합물에서 발생할 수 있다. 후성적 변형은 유전성 후성적 변형, 예컨대 유기체의 적어도 하나의 자손에게 계대되는 후성적 변형일 수 있다. 후성적 변형은 조작된 후성적 변형, 예컨대 본래의 유기체의 핵산 서열의 특정한 염기에서 천연 발생하지 않지만 본원에 기재된 방법을 이용하여 유기체 또는 유기체의 조상에게 도입되는 것인 후성적 변형일 수 있다. 유기체는 적어도 1번의 생식 주기 동안에 유지되는 모 유기체 또는 조상 유기체에 이전에 도입되었을 수 있는 유전성 후성적 변형을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 후성적 변형은 산화 또는 환원을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 1개 이상의 후성적으로 변형된 염기를 포함할 수 있다. 후성적으로 변형된 염기는 임의의 염기, 예컨대 시토신, 우라실, 티민, 아데닌, 또는 구아닌을 포함할 수 있다. 후성적으로 변형된 염기는 메틸화된 염기, 히드록시메틸화된 염기, 포르밀화된 염기, 또는 염기를 함유하는 카르복실산 또는 그의 염을 포함할 수 있다. 후성적으로 변형된 염기는 5-메틸화된 염기, 예컨대 5-메틸화된 시토신 (5-mC)을 포함할 수 있다. 후성적으로 변형된 염기는 5-히드록시메틸화된 염기, 예컨대 5-히드록시메틸화된 시토신 (5-hmC)을 포함할 수 있다. 후성적으로 변형된 염기는 5-포르밀화된 염기, 예컨대 5-포르밀화된 시토신 (5-fC)을 포함할 수 있다. 후성적으로 변형된 염기는 5-카르복실화된 염기 또는 그의 염, 예컨대 5-카르복실화된 시토신 (5-caC)을 포함할 수 있다.
구축물은 1개 이상의 변형, 예컨대 화학적 변형을 포함할 수 있다. 구축물은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35개의 변형 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 구축물은 약 1 내지 약 10개의 변형을 포함할 수 있다. 구축물은 약 1 내지 약 20개의 변형을 포함할 수 있다. 구축물은 약 5 내지 약 20개의 변형을 포함할 수 있다. 변형은 예컨대 생체내에서 전달될 때 구축물의 안정성을 증강시키기 위해 구축물에 부가될 수 있다. 변형은 예컨대 생체내에서 전달될 때 구축물의 흡수를 증강시키기 위해 구축물에 부가될 수 있다. 구축물의 염기의 일부분, 예컨대 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%의 염기 또는 그 초과는 변형을 포함할 수 있다. 변형은 메틸 기, 플루오로 기, 포스포르티오에이트 백본, 또는 이들의 임의의 조합물의 부가를 포함할 수 있다.
구축물은 이중 가닥일 수 있다. 이중 가닥 구축물은 약 10 염기 쌍 (bp) 내지 약 100 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 10 bp 내지 약 20 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 10 bp 내지 약 30 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 10 bp 내지 약 40 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 10 bp 내지 약 50 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 10 bp 내지 약 60 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 10 bp 내지 약 70 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 10 bp 내지 약 80 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 10 bp 내지 약 90 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 15 bp 내지 약 40 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 15 bp 내지 약 35 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 15 bp 내지 약 60 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 5 bp 내지 약 30 bp의 길이를 포함할 수 있다. 구축물은 약 5 bp 내지 약 25 bp의 길이를 포함할 수 있다.
후성적 변형의 검출
일부 측면에서, 본원에 개시된 후성적 변형, 예컨대 DNA 메틸화가 검출될 수 있다. 일부 예에서, 변형, 예를 들어 메틸화된 뉴클레오티드는 비술파이트 시퀀싱에 의해 검출될 수 있다. 비술파이트 처리는 시토신 염기를 우라실로 전환시킬 수 있고, 메틸화된 시토신은 전환되지 않은 채 남겨 둘 수 있다. 비술파이트 처리는 샘플의 일부에 적용될 수 있고, 샘플의 제2 부분은 비처리로 남겨 둘 수 있다. 비술파이트 처리는 시퀀싱 이전에 또는 시퀀싱 이후에 샘플에 대해 수행될 수 있다. 비술파이트 처리는 단독으로, 또는 핵산 서열에서 후성적 변형의 존재, 패턴 또는 수준, 예컨대 서열에서 메틸화의 존재, 패턴 또는 수준을 결정하는 추가의 기술과 조합되어 이용될 수 있다. 비술파이트 시퀀싱은 핵산 서열에서 후성적 변형의 존재, 패턴 또는 수준을 결정할 수 있다. 비술파이트-무함유 시퀀싱은 핵산 서열에서 후성적 변형의 존재, 패턴 또는 수준을 결정할 수 있다. 비술파이트 처리된 서열을 비술파이트로 처리되지 않은 대등한 서열과 비교하여, 핵산 서열에서 후성적 변형의 존재, 패턴 또는 수준을 결정할 수 있다.
시퀀싱 (예컨대 비술파이트-무함유 시퀀싱)은 단독으로, 또는 핵산 서열에서 후성적 변형의 존재, 패턴 또는 수준, 예컨대 서열에서 메틸화의 존재, 패턴 또는 수준을 결정하는 추가의 기술과 조합되어 이용될 수 있다. 시퀀싱 (예컨대 비술파이트-무함유 시퀀싱)은 핵산 서열에서 후성적 변형의 존재, 패턴 또는 수준을 결정할 수 있다. 시퀀싱은 핵산 서열에서 후성적 변형의 존재, 패턴 또는 수준을 결정할 수 있다. 처리된 서열 (예컨대, 후성적 변형에 부가된 표지를 갖는 서열)을 처리되지 않은 대등한 서열과 비교하여, 핵산 서열에서 후성적 변형의 존재, 패턴 또는 수준을 결정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시퀀싱"은 비술파이트-무함유 시퀀싱, 비술파이트 시퀀싱, TET-보조된 비술파이트 (TAB) 시퀀싱, ACE-시퀀싱, 고처리량 시퀀싱, 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 대량 병렬 시그니처 시퀀싱, 폴로니(Polony) 시퀀싱, 454 파이로시퀀싱, 생어(Sanger) 시퀀싱, 일루미나(Illumina) 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱, 이온 토렌트 반도체 시퀀싱, DNA 나노볼 시퀀싱, 헬리스코프(Heliscope) 단일 분자 시퀀싱, 단일 분자 실시간 (SMRT) 시퀀싱, 나노공극 DNA 시퀀싱, 샷 건 시퀀싱, RNA 시퀀싱, 에니그마(Enigma) 시퀀싱, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 상기 방법은 시퀀싱을 포함할 수 있다. 시퀀싱에는 비술파이트 시퀀싱 또는 비술파이트-무함유 시퀀싱이 포함될 수 있다.
일부 예에서, 상기 방법은 샘플을 수득한 후 소정 시간, 예컨대 수초, 수분, 수시간, 수일, 수주, 수개월, 수년 또는 그 초과 동안 및 샘플을 분석하기 전에 샘플을 보관하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 대상체로부터 수득된 샘플을 보관 또는 추가 분석 전에 세분하여, 샘플의 상이한 부분이 상이한 하류 방법 또는 가공, 예컨대 비제한적으로 본원에 기재된 방법들의 임의의 조합, 보관, 비술파이트 처리, 증폭, 시퀀싱, 표지화, 세포학적 분석, 적합성 검사, 핵산 추출, 분자 프로파일링 또는 이들의 조합에 적용된다.
일부 경우에, 샘플의 또 다른 부분을 추가로 조작하는 동안에 상기 샘플의 일부를 보관할 수 있다. 이러한 조작에는 본원에 기재된 임의의 방법; 비술파이트 처리; 시퀀싱; 증폭; 표지화; 분자 프로파일링; 세포학적 염색; 핵산 (RNA 또는 DNA) 추출, 검출, 또는 정량화; 유전자 발현 생성물 (RNA 또는 단백질) 추출, 검출, 또는 정량화; 고정화; 및 실험이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
일부 예에서, 메틸화된 뉴클레오티드는 나노공극 시퀀싱에 의해 검출될 수 있다. 나노공극을 이용하여 개체의 샘플, 소량 부분 (예컨대 하나의 완전한 유전자 또는 한 유전자의 일부분), 실질적인 부분 (예컨대 다중 유전자 또는 다중 염색체), 또는 전체 게놈 서열을 시퀀싱할 수 있다. 나노공극 시퀀싱 기술은 시퀘놈(Sequenom) (캘리포니아주 샌디에고), 일루미나 (캘리포니아주 샌디에고), 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈(Oxford Nanopore Technologies) LTD (영국 키들링턴), 및 애질런트 래버러토리즈(Agilent Laboratories) (캘리포니아주 산타 클라라)로부터 상업적으로 입수가능하거나 또는 개발 중에 있다. 나노공극 시퀀싱 방법 및 장치는 관련 기술분야에 기재되었고, 예를 들어 미국 특허 번호 5,795,782에 제공되어 있으며, 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
나노공극 시퀀싱은 전기영동을 이용하여 공극을 통해 샘플을 수송할 수 있다. 나노공극 시스템은 일정한 전기장이 인가될 때, 시스템에서 전류가 관찰될 수 있도록 전해질 용액을 함유할 수 있다. 나노공극 표면을 가로지르는 전류 밀도의 크기는 나노공극의 치수 및 나노공극을 점유한 샘플의 조성에 따라 좌우될 수 있다. 나노공극 시퀀싱 동안에, 샘플이 나노공극에 접근하고/거나 그를 통과할 때, 샘플은 나노공극 표면을 가로질러 전류 밀도에서의 특징적인 변화를 유발하고, 전류에서 이들 특징적인 변화는 샘플의 확인을 가능하게 한다. 본원에서 사용된 나노공극은 고체-상태 나노공극, 단백질 나노공극, 또는 단백질 나노공극 또는 유기 나노튜브, 예컨대 고체-상태 막 등의 프레임워크로 구성된 탄소 또는 그래핀 나노튜브를 포함하는 하이브리드 나노공극일 수 있다. 일부 예에서, 나노공극 시퀀싱은 생물학적, 고체 상태 나노공극 또는 하이브리드 생물학적/고체 상태 나노공극일 수 있다.
일부 예에서, 생물학적 나노공극은 지질 막에 매립될 수 있는 막횡단 단백질을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 나노공극은 알파 용혈소를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 나노공극은 마이코박테리움 스메그마티스 포린을 포함할 수 있다.
고체 상태 나노공극은 그들의 시스템에 단백질을 혼입시키지 않는다. 대신에, 고체 상태 나노공극 기술은 샘플이 통과할 수 있는 나노미터 크기의 공극을 갖는 다양한 금속 또는 금속 합금 기질을 사용한다. 고체 상태 나노공극은 질화규소 (Si3N4), 이산화규소 (Si02) 등을 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 물질로 제작될 수 있다. 일부 예에서, 나노공극 시퀀싱은 터널링 전류의 사용을 포함할 수 있고, 샘플 (ssDNA)이 나노공극을 통해 전위함에 따라 염기를 통한 전자 터널링의 측정이 수득된다. 일부 예에서, 나노공극 시스템은 공극의 직경을 가로질러 단일 벽 탄소 나노튜브를 갖는 고체 상태 공극을 가질 수 있다. 일부 예에서, 나노전극이 본원에 기재된 나노공극 시스템에서 사용될 수 있다. 일부 예에서, 형광이 나노공극과 함께 사용될 수 있고, 예를 들어 고체 상태 나노공극 및 형광이다. 예를 들어, 이러한 시스템에서 형광 시퀀싱 방법은 샘플의 각각의 염기를 형광 프로브 가닥-형성 dsDNA (샘플이 DNA를 포함함)에 결합하는 다중 뉴클레오티드의 특징적인 제시로 전환시킨다. 2-색상 시스템이 사용되는 경우, 각각의 염기는 2가지 별도의 형광에 의해 확인되고, 따라서 2가지 특정한 서열로 전환될 것이다. 프로브는 각각의 서열의 시작 및 말단에서 각각 형광단 및 소광제로 이루어질 수 있다. 각각의 형광단은 이전 서열의 말단에서 소광제에 의해 소광될 수 있다. dsDNA가 고체 상태 나노공극을 통해 전위될 때, 프로브 가닥이 벗겨질 수 있고, 상류 형광단이 형광을 나타낼 것이다.
일부 예에서, 피분석물, 예컨대 단일 가닥 DNA가 전위하도록 유도되는 고체 기질, 일반적으로 평면 기질, 예컨대 막을 통해 1-100 nm 채널 또는 천공이 형성될 수 있다. 다른 예에서, 2-50 nm 채널 또는 천공이 기질을 통해 형성되고; 여전히 다른 예에서, 기질을 통해 형성되는 경우 2-30 nm, 또는 2-20 nm, 또는 3-30 nm, 또는 3-20 nm, 또는 3-10 nm 채널 또는 천공이 형성된다.
일부 예에서, 본원에서 유용한 방법 및 기기와 관련하여 사용되는 나노공극은 평면 표면 상에서 규칙적으로 배치될 수 있는 어레이, 예컨대 나노공극의 클러스터의 어레이의 형태로 제공된다. 일부 예에서, 상이한 클러스터의 나노공극으로부터의 광학 신호가 사용된 광학 검출 시스템에 의해 구별되도록 클러스터 각각이 별도의 해상도 제한 영역에 있지만, 동일한 클러스터 내의 나노공극으로부터의 광학 신호가 사용된 광학 검출 시스템에 의해 이러한 클러스터 내의 특정한 나노공극에 반드시 할당될 수 있는 것은 아니다.
서열 동일성
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상동성인", "상동성" 또는 "% 상동성"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 기준 서열 사이의 서열 유사성 정도를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상동성"은 용어 "동일성"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 서열 유사성 정도는 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 약 100%일 수 있다. 일부 예에서, % 서열 상동성은 칼린(Karlin) 및 알트슐(Altschul) ([Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993]에서 변형됨])에 의해 기재된 식을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 식은 [Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)]의 BLAST (basic local alignment search tool) 프로그램에 포함되어 있다. 서열의 % 상동성은 본 출원의 출원일 이래로 가장 최근 버전의 BLAST를 이용하여 결정될 수 있다. 일부 예에서, 서열의 % 상동성은 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. [Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489]
% 상동성은 연속 서열에 대해 계산될 수 있고, 즉, 한 서열을 다른 서열에 대해 정렬시키고, 한 서열에서 각각의 아미노산을 다른 서열에서 상응하는 아미노산에 대해 한번에 1 잔기씩 직접 비교한다. 이는 "갭이 없는" 정렬이라고 한다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 비교적 짧은 개수의 잔기에 걸쳐서만 수행된다. 더 긴 서열에 대한 대부분의 서열 비교 방법은 전반적인 상동성 점수에 대해 과도한 패널티없이 가능한 삽입 및 결실을 고려한 최적의 정렬을 생성하도록 설계된다. 이는 국소 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬에서 "갭"을 삽입함으로써 달성된다. 이들 더 복잡한 방법은 정렬에서 발생한 각각의 갭에 "갭 패널티"를 할당하여, 동일한 개수를 갖는 동일한 아미노산의 경우 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬 (비교하는 두 서열 사이에 더 높은 관련성을 반영함)이 여러 갭을 갖는 것에 비해 더 높은 점수를 달성하도록 한다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 코스트를 부과하고 갭에서 각각의 후속적인 잔기에 대해 더 적은 패널티를 부과하는 "아핀 갭 코스트"가 전형적으로 이용된다. 이는 일반적으로 이용되는 갭 평점 시스템이다. 높은 갭 패널티는 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 수정될 수 있게 한다. 전형적으로, 서열 비교를 위해 이러한 소프트웨어를 사용할 경우에는 디폴트 값이 이용된다. 따라서, 최대 % 상동성의 계산은 먼저 갭 패널티를 고려하여 최적의 정렬을 생성하는 것을 필요로 한다. 최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있지만, 정렬 과정 자체는 전형적으로 전부 또는 전무 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신에, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 하는 각각의 쌍별 비교에 점수를 할당하는 스케일링된 유사성 점수 매트릭스가 일반적으로 이용된다. 일반적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스 (BLAST 프로그램 제품군을 위한 디폴트 매트릭스)이다. 일부 예에서, 정렬은 12의 갭 개방 패널티, 2의 갭 연장 패널티 및 62의 블록 치환 매트릭스 (BLOSUM)를 갖는 아핀 갭 검색을 이용하여 스미스-워터맨 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다.
제형
하기를 포함하는 제형 또한 본원에 개시된다: 1종 이상의 핵산 구축물, 1종 이상의 식물 또는 종자, 1종 이상의 식물 성장 조절인자, 또는 이들의 임의의 염 또는 용매화물, 또는 이들의 임의의 조합물. 제형은 다양한 품종의 작물의 생산성을 개선시키거나 또는 표현형을 변경시키기 위해 종자 처리, 토양 관주, 과립 제형, 또는 엽면 스프레이일 수 있다.
본원에 기재된 1종 이상의 핵산 구축물을 포함하는 제형이 본원에 추가로 개시된다. 1종 이상의 핵산 구축물, 염 또는 용매화물은 식물 또는 종자 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시킬 수 있다. 1종 이상의 핵산 구축물은 식물 또는 종자에서 유전자의 표현형을 변경시킬 수 있다.
1종 이상의 핵산 구축물, 식물 또는 종자를 포함하는 제형은 1종 이상의 스트리고락톤, 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 제형은 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 제형은 아브시스산 (ABA) 생합성의 1종 이상의 억제제, 또는 그의 임의의 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 제형은 1종 이상의 스트리고락톤, 염 또는 용매화물, 및 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 제형은 1종 이상의 스트리고락톤, 염 또는 용매화물, 및 아브시스산 (ABA) 생합성의 1종 이상의 억제제, 또는 그의 임의의 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 제형은 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물, 및 아브시스산 (ABA) 생합성의 1종 이상의 억제제, 또는 그의 임의의 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 개시된 제형은 핵산 전달을 용이하게 하기 위해 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 첨가제는 저분자량 또는 고분자량 폴리아민일 수 있다. 일부 예에서, 첨가제는 폴리에틸렌이민 (PEI)일 수 있다. 일부 예에서, 첨가제는 폴리아미도아민 (PAMAM) 덴드리머일 수 있다. 일부 예에서, 펩티드는 바이러스 단백질의 유도체일 수 있다. 일부 예에서, 첨가제는 양이온성 펩티드일 수 있다. 일부 예에서, 첨가제는 아르기닌 풍부 펩티드 (예를 들어 TAT)일 수 있다. 일부 예에서, 첨가제는 히스티딘 풍부 펩티드 (예를 들어 엔도포터)일 수 있다. 일부 예에서, 첨가제는 용해성 펩티드 (예를 들어 멜리틴)일 수 있다.
제형은 적어도 약 0.1% (w/w)의 핵산 구축물, 식물 또는 종자, 예를 들어 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 핵산 구축물, 식물 또는 종자를 포함할 수 있다.
제형은 약 95% (w/w) 미만의 핵산 구축물, 식물 또는 종자, 예를 들어 약 0.1% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.5% 미만, 약 1% 미만, 약 2% 미만, 약 3% 미만, 약 4% 미만, 약 5% 미만, 약 6% 미만, 약 7% 미만, 약 8% 미만, 약 9% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만, 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 또는 약 95% 미만의 핵산 구축물, 식물 또는 종자를 포함할 수 있다.
제형은 약 0.1%-100% (w/w)의 핵산 구축물, 식물 또는 종자, 예를 들어 약 0.1%-1%, 0.1%-5%, 약 0.1-10%, 약 0.1%-20%, 약 0.5%-1%, 약 0.5%-5%, 약 0.5%-10%, 약 0.5%-20%, 약 1%-5%, 약 1%-10%, 약 1%-20%, 약 5%-10%, 약 5%-20%, 약 10%-20%, 약 10%-30%, 약 20%-30%, 약 20%-40%, 약 30%-40%, 약 30%-50%, 약 40%-50%, 약 40%-60%, 약 50%-60%, 약 50%-70%, 약 60%-70%, 약 60%-80%, 약 70%-80%, 약 70%-90%, 약 80%-90%, 약 80%-95%, 약 90%-95%, 약 90%-99%, 약 90%-100%, 약 95%-99%, 또는 약 99%-100%의 핵산 구축물, 식물 또는 종자를 포함할 수 있다.
식물 성장 조절인자 (PGR)
제형은 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 포함할 수 있다. PGR은 식물 세포, 조직 또는 기관의 성장 및/또는 분화에 영향을 미칠 수 있는 수많은 화학 물질일 수 있다. 식물 성장 조절인자는 세포간 소통을 위한 화학적 메신저로서 기능할 수 있다. PGR에는 옥신, 지베렐린, 시토카인, 아브시스산 (ABA) 및 에틸렌, 브라시노스테로이드, 및 폴리아민이 포함될 수 있다. 이들은 세포의 성장 및/또는 발달을 함께 조화시키면서 작용할 수 있다. PGR은 식물의 수력학적 증강을 유도할 수 있다. PGR은 식물의 수확 수율을 증가시킬 수 있다. 옥신은 인돌-3-아세트산 (IAA) 또는 그의 유도체 또는 화학적 유사체를 포함할 수 있다.
1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 포함하는 제형은 1종 이상의 핵산 구축물 또는 변형된 식물 또는 종자를 추가로 포함할 수 있다. 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 포함하는 제형은 1종 이상의 스트리고락톤, 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 포함하는 제형은 아브시스산 (ABA) 생합성의 1종 이상의 억제제, 또는 그의 임의의 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 포함하는 제형은 1종 이상의 핵산 구축물 및 1종 이상의 스트리고락톤, 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 포함하는 제형은 1종 이상의 핵산 구축물 및 아브시스산 (ABA) 생합성의 1종 이상의 억제제, 또는 그의 임의의 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다. 1종 이상의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물을 포함하는 제형은 1종 이상의 스트리고락톤, 염 또는 용매화물 및 아브시스산 (ABA) 생합성의 1종 이상의 억제제, 또는 그의 임의의 염 또는 용매화물을 추가로 포함할 수 있다.
제형은 적어도 약 0.1% (w/w)의 식물 성장 조절인자 (PGR), 염 또는 용매화물, 예를 들어 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 PGR, 염 또는 용매화물을 포함할 수 있다.
제형은 약 95% (w/w) 미만의 PGR, 염 또는 용매화물, 예를 들어 약 0.1% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.5% 미만, 약 1% 미만, 약 2% 미만, 약 3% 미만, 약 4% 미만, 약 5% 미만, 약 6% 미만, 약 7% 미만, 약 8% 미만, 약 9% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만, 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 또는 약 95% 미만의 PGR, 염 또는 용매화물을 포함할 수 있다.
제형은 약 0.1%-100% (w/w)의 PGR, 염 또는 용매화물, 예를 들어 약 0.1%-1%, 0.1%-5%, 약 0.1-10%, 약 0.1%-20%, 약 0.5%-1%, 약 0.5%-5%, 약 0.5%-10%, 약 0.5%-20%, 약 1%-5%, 약 1%-10%, 약 1%-20%, 약 5%-10%, 약 5%-20%, 약 10%-20%, 약 10%-30%, 약 20%-30%, 약 20%-40%, 약 30%-40%, 약 30%-50%, 약 40%-50%, 약 40%-60%, 약 50%-60%, 약 50%-70%, 약 60%-70%, 약 60%-80%, 약 70%-80%, 약 70%-90%, 약 80%-90%, 약 80%-95%, 약 90%-95%, 약 90%-99%, 약 90%-100%, 약 95%-99%, 또는 약 99%-100%의 PGR, 염 또는 용매화물을 포함할 수 있다.
옥신 (예를 들어, IAA)
제형은 적어도 약 0.1% (w/w)의 옥신 (예를 들어, IAA), 예를 들어 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 옥신 (예를 들어, IAA)을 포함할 수 있다.
제형은 약 95% (w/w) 미만의 옥신 (예를 들어, IAA), 예를 들어 약 0.1% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.5% 미만, 약 1% 미만, 약 2% 미만, 약 3% 미만, 약 4% 미만, 약 5% 미만, 약 6% 미만, 약 7% 미만, 약 8% 미만, 약 9% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만, 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 또는 약 95% 미만의 옥신 (예를 들어, IAA)을 포함할 수 있다.
제형은 약 0.1%-100% (w/w)의 옥신 (예를 들어, IAA), 예를 들어 약 0.1%-1%, 0.1%-5%, 약 0.1-10%, 약 0.1%-20%, 약 0.5%-1%, 약 0.5%-5%, 약 0.5%-10%, 약 0.5%-20%, 약 1%-5%, 약 1%-10%, 약 1%-20%, 약 5%-10%, 약 5%-20%, 약 10%-20%, 약 10%-30%, 약 20%-30%, 약 20%-40%, 약 30%-40%, 약 30%-50%, 약 40%-50%, 약 40%-60%, 약 50%-60%, 약 50%-70%, 약 60%-70%, 약 60%-80%, 약 70%-80%, 약 70%-90%, 약 80%-90%, 약 80%-95%, 약 90%-95%, 약 90%-99%, 약 90%-100%, 약 95%-99%, 또는 약 99%-100%의 옥신 (예를 들어, IAA)을 포함할 수 있다.
지베렐린
제형은 1종 이상의 지베렐린, 예컨대 GA1, GA3, GA4, GA7, GA0, ent-지베렐란, ent-카우렌, 이들의 유도체 및 화학적 유사체를 포함할 수 있다. 제형은 약 0.1% (w/w)의 지베렐린, 예를 들어 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 지베렐린을 포함할 수 있다.
제형은 약 95% (w/w) 미만의 지베렐린, 예를 들어 약 0.1% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.5% 미만, 약 1% 미만, 약 2% 미만, 약 3% 미만, 약 4% 미만, 약 5% 미만, 약 6% 미만, 약 7% 미만, 약 8% 미만, 약 9% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만, 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 또는 약 95% 미만의 지베렐린을 포함할 수 있다.
제형은 약 0.1%-100% (w/w)의 지베렐린, 예를 들어 약 0.1%-1%, 0.1%-5%, 약 0.1-10%, 약 0.1%-20%, 약 0.5%-1%, 약 0.5%-5%, 약 0.5%-10%, 약 0.5%-20%, 약 1%-5%, 약 1%-10%, 약 1%-20%, 약 5%-10%, 약 5%-20%, 약 10%-20%, 약 10%-30%, 약 20%-30%, 약 20%-40%, 약 30%-40%, 약 30%-50%, 약 40%-50%, 약 40%-60%, 약 50%-60%, 약 50%-70%, 약 60%-70%, 약 60%-80%, 약 70%-80%, 약 70%-90%, 약 80%-90%, 약 80%-95%, 약 90%-95%, 약 90%-99%, 약 90%-100%, 약 95%-99%, 또는 약 99%-100%의 지베렐린을 포함할 수 있다.
시토카인
제형은 1종 이상의 시토카인, 예컨대 키네틴, 제아틴, 6-벤질아미노퓨린, 디페닐우레아, 티디아주론, 이들의 유도체 및 화학적 유사체를 포함할 수 있다. 제형은 적어도 약 0.1% (w/w)의 시토카인, 예를 들어 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 6%, 적어도 약 7%, 적어도 약 8%, 적어도 약 9%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%의 시토카인을 포함할 수 있다.
제형은 약 95% (w/w) 미만의 시토카인, 예를 들어 약 0.1% 미만, 약 0.2% 미만, 약 0.3% 미만, 약 0.4% 미만, 약 0.5% 미만, 약 1% 미만, 약 2% 미만, 약 3% 미만, 약 4% 미만, 약 5% 미만, 약 6% 미만, 약 7% 미만, 약 8% 미만, 약 9% 미만, 약 10% 미만, 약 15% 미만, 약 20% 미만, 약 25% 미만, 약 30% 미만, 약 35% 미만, 약 40% 미만, 약 45% 미만, 약 50% 미만, 약 55% 미만, 약 60% 미만, 약 65% 미만, 약 70% 미만, 약 75% 미만, 약 80% 미만, 약 85% 미만, 약 90% 미만, 또는 약 95% 미만의 시토카인을 포함할 수 있다.
제형은 약 0.1%-100% (w/w)의 시토카인, 예를 들어 약 0.1%-1%, 0.1%-5%, 약 0.1-10%, 약 0.1%-20%, 약 0.5%-1%, 약 0.5%-5%, 약 0.5%-10%, 약 0.5%-20%, 약 1%-5%, 약 1%-10%, 약 1%-20%, 약 5%-10%, 약 5%-20%, 약 10%-20%, 약 10%-30%, 약 20%-30%, 약 20%-40%, 약 30%-40%, 약 30%-50%, 약 40%-50%, 약 40%-60%, 약 50%-60%, 약 50%-70%, 약 60%-70%, 약 60%-80%, 약 70%-80%, 약 70%-90%, 약 80%-90%, 약 80%-95%, 약 90%-95%, 약 90%-99%, 약 90%-100%, 약 95%-99%, 또는 약 99%-100%의 시토카인을 포함할 수 있다.
부형제
본원에 개시된 제형은 1종 이상의 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 1종 이상의 부형제는 1종 이상의 농약, 1종 이상의 안정화제, 1종 이상의 첨가제, 1종 이상의 담체, 1종 이상의 분산제, 1종 이상의 비료, 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 한 예에서, 1종 이상의 부형제는 아세톤을 포함한다.
본원에 개시된 제형은 1종 이상의 농약을 추가로 포함할 수 있다. 농약은 생물농약일 수 있다. 생물농약은 미생물 또는 천연 생성물을 기반으로 할 수 있는 농약의 형태일 수 있다. 생물농약에는 해충을 방제하는 천연 발생 물질 (생화학적 농약), 해충을 방제하는 미생물 (미생물 농약), 및 부가된 유전 물질을 함유하는 식물에 의해 생성된 농약 물질 (식물-포함된 보호제) 또는 PIP가 포함될 수 있다. 생물농약의 예에는 글루코시놀레이트, 키토산, 스피노사드, 알칼로이드, 테르페노이드, 페놀류, 피레트로이드, 로테노이드, 니코티노이드, 스트리크닌, 실리로시드, 카놀라유 및 베이킹 소다가 포함될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 농약은 유기인산염 농약, 카르바메이트 농약, 유기염소 살충제, 피레트로이드 농약, 술포닐우레아 농약, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 농약은 제초제, 살조제, 아비디시드, 살박테리아제, 살진균제, 살충제, 살진드기제, 살연체동물제, 살선충제, 살서제, 살바이러스제, 또는 이들의 조합물일 수 있다.
제형은 1종 이상의 안정화제 및/또는 다른 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 안정화제 및/또는 첨가제에는 침투제, 접착제, 고화 방지제, 염료, 분산제, 습윤제, 유화제, 소포제, 항미생물제, 동결 방지제, 안료, 착색제, 완충제, 및 담체가 포함될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 제형은 계면활성제 및/또는 아주반트를 추가로 포함할 수 있다.
제형은 1종 이상의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 담체의 예에는 고체 담체, 스폰지, 직물, 및 합성 물질이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 합성 물질은 다공성 합성 물질일 수 있다. 추가의 담체에는 유기 담체, 예컨대 왁스, 리놀린, 파라핀, 덱스트로스 과립, 수크로스 과립 및 말토스-덱스트로스 과립이 포함될 수 있다. 대안적으로, 담체는 무기 담체, 예컨대 천연 점토, 카올린, 납석, 벤토나이트, 알루미나, 몬모릴로나이트, 키젤규어, 백악, 규조토, 인산칼슘, 탄산칼슘 및 탄산마그네슘, 황, 석회, 밀가루 또는 활석일 수 있다. 제형은 담체에 흡착될 수 있다. 담체는 화합물, 염, 용매화물, 또는 제형의 방출을 가능하게 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
제형은 1종 이상의 분산제를 추가로 포함할 수 있다. 분산제는 음으로 하전된 음이온 분산제일 수 있다. 분산제는 비이온성 분산제일 수 있다.
제형은 비료를 추가로 포함할 수 있다. 비료는 화학 비료일 수 있다. 비료는 유기 비료일 수 있다. 비료는 무기 비료일 수 있다. 비료는 과립화된 또는 분말화된 비료일 수 있다. 비료는 액체 비료일 수 있다. 비료는 느린 방출 비료일 수 있다.
본원에 개시된 제형은 건조 분무가능한 제형으로 제형화될 수 있다. 건조 분무가능한 제형의 예에는 습윤가능한 분말 및 수분산성 과립이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 습윤가능한 분말은 분말 형태로 미분화된 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 습윤가능한 분말은 물에 분산시킨 후에 현탁된 입자로서 적용될 수 있다. 수분산성 과립은 물에 붕해 또는 분산시킨 후에 적용되는 과립으로 이루어질 수 있다. 수분산성 과립은 0.2 내지 4mm 범위 이내의 입자를 포함할 수 있다. 수분산성 과립은 응집, 분무 건조, 또는 압출 기술에 의해 형성될 수 있다.
제형은 액체 분무가능한 제형으로 제형화될 수 있다. 액체 분무가능한 제형의 예에는 가용성 농축물, 현탁액 농축물, 유화가능한 농축물, 마이크로에멀젼, 오일 분산액, 및 마이크로캡슐화된 입자가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 현탁액 농축물은 사용하기 전에 물로 희석하는 것으로 일반적으로 의도되는 유체 중의 화합물, 염, 용매화물 또는 제형의 안정한 현탁액을 포함할 수 있다. 유화가능한 농축물은 물에 첨가될 때 에멀젼을 형성하는 수불용성 유기 용매화물 중의 유화제와 함께 화합물, 염, 용매화물 또는 제형을 포함할 수 있다. 마이크로에멀젼은 물에 첨가될 때 용액/에멀젼을 형성하는 수불용성 유기 용매화물 중의 유화제와 함께 화합물, 염, 용매화물 또는 제형을 포함할 수 있다.
제형은 건조 확산가능성 과립 제형으로 제형화될 수 있다. 건조 확산가능성 과립 제형은 비활성 또는 비료 담체 상에 토양 적용된 과립을 포함할 수 있다.
제형은 종자 처리 또는 종자 드레싱으로서 제형화될 수 있다.
제형은 신속 방출을 위해 제형화될 수 있다. 제형은 느린 방출을 위해 제형화될 수 있다.
방법
유기체, 예를 들어 식물 또는 종자에서 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키는 방법 또한 본원에 개시된다. 상기 방법은 유기체와 본원에 개시된 핵산 구축물을 접촉시키거나, 예를 들어 유기체, 예컨대 종자와 핵산 구축물 용액을 접촉시키거나, 또는 유기체, 예컨대 식물의 잎에 핵산 구축물을 직접 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 핵산 구축물, 식물, 종자 및 제형은 농업에서 사용될 수 있다. 핵산 구축물, 식물, 종자 및 제형은 식물 성장을 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 핵산 구축물 및 제형은 식물에서 싹 안정성을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산 구축물, 식물, 종자 및 제형은 식물에서 수송 능력을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산 구축물, 식물, 종자 및 제형은 식물의 가뭄 저항성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
핵산 구축물을 포함하는 제형을 식물 또는 종자에 적용하여, 농업을 개선시키는 것을 포함하는, 농업을 개선시키는 방법이 본원에 추가로 개시된다. 농업의 개선은 식물 성장을 촉진시키는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 식물에서 싹 안정성을 증강시키는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 식물에서 수송 능력을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 가뭄 저항성을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 1종 이상의 농약의 적용을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 1종 이상의 농약의 적용을 중단시키는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 식물에게 적용되는 살수량을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 식물로의 살수 빈도를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 식물병원성 진균을 방제하는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 원치않는 식물 성장을 제어하는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 원치않는 곤충 또는 진드기 침입을 제어하는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 식물의 성장을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 농업의 개선은 1종 이상의 진균에서 활성을 촉진시키거나 또는 자극하는 것을 포함할 수 있다.
식물병원성 진균 및/또는 원치않는 식물 성장 및/또는 원치않는 곤충 또는 진드기 침입을 제어하기 위한 및/또는 식물의 성장을 조절하기 위한 방법 또한 본원에 개시된다. 상기 방법은 본원에 개시된 핵산 구축물을 포함하는 제형을 각각의 해충, 그들의 서식지 또는 각각의 해충으로부터 보호하기 위한 식물에 대해, 토양에 대해 및/또는 원치않는 식물 및/또는 작물 식물 및/또는 그들의 서식지에 대해 작용하도록 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 5% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 10% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 15% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 20% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 25% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 30% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 50% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 그 초과 증가시킬 수 있다.
핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50배 또는 그 초과 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 1.5배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 2배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 3배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 5배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물 성장을 적어도 약 10배 이상 증가시킬 수 있다. 식물 성장은 이차 식물 성장을 포함할 수 있다.
핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 5% 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 10% 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 15% 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 20% 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 25% 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 30% 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 50% 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 그 초과 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50배 또는 그 초과 증강시킬 수 있다.
핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 1.5배 이상 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 2배 이상 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 3배 이상 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 5배 이상 증강시킬 수 있다. 핵산 구축물은 싹 성장을 적어도 약 10배 이상 증강시킬 수 있다.
핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 5% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 10% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 15% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 20% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 25% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 30% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 50% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 그 초과 증가시킬 수 있다.
핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50배 또는 그 초과 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 1.5배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 2배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 3배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 5배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 수송 능력을 적어도 약 10배 이상 증가시킬 수 있다.
핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 5% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 10% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 15% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 20% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 25% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 30% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 50% 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 또는 그 초과 증가시킬 수 있다.
핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50배 또는 그 초과 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 1.5배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 2배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 3배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 5배 이상 증가시킬 수 있다. 핵산 구축물은 식물에서 가뭄 저항성을 적어도 약 10배 이상 증가시킬 수 있다.
핵산 구축물은 1종 이상의 농약의 적용을 감소시킬 수 있다. 1종 이상의 농약의 적용을 감소시키는 것은 식물에 적용되는 1종 이상의 농약의 양을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 식물에 적용되는 1종 이상의 농약의 양은 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 감소될 수 있다. 식물에 적용되는 1종 이상의 농약의 양은 적어도 약 10% 감소될 수 있다. 식물에 적용되는 1종 이상의 농약의 양은 적어도 약 20% 감소될 수 있다. 식물에 적용되는 1종 이상의 농약의 양은 적어도 약 30% 감소될 수 있다. 식물에 적용되는 1종 이상의 농약의 양은 적어도 약 50% 감소될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, 1종 이상의 농약의 적용을 감소시키는 것은 1종 이상의 농약을 식물에 적용하는 빈도를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 1종 이상의 농약을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 감소될 수 있다. 1종 이상의 농약을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 10% 감소될 수 있다. 1종 이상의 농약을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 20% 감소될 수 있다. 1종 이상의 농약을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 30% 감소될 수 있다. 1종 이상의 농약을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 40% 감소될 수 있다. 1종 이상의 농약을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 50% 감소될 수 있다.
핵산 구축물의 사용은 식물에 적용되는 물의 양을 감소시킬 수 있다. 식물에 적용되는 물의 양은 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 감소될 수 있다. 식물에 적용되는 물의 양은 적어도 약 10% 감소될 수 있다. 식물에 적용되는 물의 양은 적어도 약 20% 감소될 수 있다. 식물에 적용되는 물의 양은 적어도 약 30% 감소될 수 있다. 식물에 적용되는 물의 양은 적어도 약 50% 감소될 수 있다.
핵산 구축물의 사용은 물을 식물에 적용하는 빈도를 감소시킬 수 있다. 물을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 감소될 수 있다. 물을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 10% 감소될 수 있다. 물을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 20% 감소될 수 있다. 물을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 30% 감소될 수 있다. 물을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 40% 감소될 수 있다. 물을 식물에 적용하는 빈도는 적어도 약 50% 감소될 수 있다.
본원에 개시된 화합물, 염, 용매화물, 제형은 식물병원성 진균을 방제하기 위해 사용될 수 있다. 농업의 개선은 원치않는 식물 성장을 제어하는 것을 포함할 수 있다. 원치않는 식물 성장의 제어는 원치않는 식물의 발아 활성을 자극하는 것을 포함할 수 있다. 원치않는 식물은 기생 식물일 수 있다. 원치않는 식물은 뿌리 기생 식물일 수 있다. 기생 식물의 예에는 독각금 (스트리가(Striga) 종), 브룸레이프 (오로반케(Orobanche) 종, 펠리판케(Phelipanche) 종), 알렉트라(Alectra), 새삼, 및 겨우살이가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 원치않는 식물은 오로반카세아에(Orobanchaceae) 과에 속할 수 있다. 원치않는 식물은 독각금일 수 있다. 원치않는 식물의 예에는 메꽃, 유독 옻나무, 호장근, 바랭이, 민들레, 질경이 식물, 돼지풀 식물, 연전초, 쐐기풀, 조뱅이, 덩굴 옻나무, 노박 덩굴, 쑥국화, 등나무, 금창초, 스위트 오텀 클레마티스, 매자나무, 란타나, 부들레야, 쥐똥나무, 칡 또는 서양 담쟁이가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 원치않는 식물은 오로반케 종일 수 있다. 화합물, 염, 용매화물 또는 제형은 원치않는 식물에 직접적으로 적용될 수 있다. 화합물, 염, 용매화물 또는 제형은 원치않는 식물에 간접적으로 적용될 수 있다.
본원에 개시된 핵산 구축물 또는 제형은 원치않는 곤충 또는 진드기 침입을 제어하기 위해 사용될 수 있다. 곤충 및 진드기의 예에는 거미, 각다귀, 가루깍지벌레, 가루이, 포식자 진드기, 거미 진드기 및 진딧물이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
본원에 개시된 핵산 구축물 또는 제형은 식물의 성장을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 식물 성장의 조절은 식물 재배를 조절하는 것을 포함한다. 식물 성장의 조절은 싹 분지를 억제하는 것을 포함할 수 있다. 식물 성장의 조절은 1종 이상의 식물 생성물을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 식물 성장의 조절은 뿌리 발달을 억제하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 핵산 구축물 또는 제형은 진균에서 활성을 촉진시키거나 또는 자극하기 위해 사용될 수 있다. 화합물, 염, 용매화물 또는 제형은 1종 이상의 진균의 균사 분지 활성을 자극할 수 있다. 화합물, 염, 용매화물 또는 제형은 1종 이상의 진균의 포자 발아를 유도할 수 있다. 1종 이상의 진균은 수지상 근균 (AM) 진균일 수 있다.
식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키는 방법이 본원에 추가로 개시된다. 일반적으로, 상기 방법은 식물을 본원에 개시된 핵산 구축물 또는 제형과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
핵산 구축물 또는 제형은 절단 식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 절단 식물은 꽃일 수 있다. 절단 식물은 나무일 수 있다. 절단 식물은 덤불 또는 관목일 수 있다. 절단 식물은 채소일 수 있다. 화합물, 염, 용매화물 또는 제형은 절단되지 않은 식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 절단되지 않은 식물은 꽃일 수 있다. 절단되지 않은 식물은 나무일 수 있다. 절단되지 않은 식물은 덤불 또는 관목일 수 있다. 절단되지 않은 식물은 채소일 수 있다. 화합물, 염, 용매화물 또는 제형은 분재 식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 분재 식물은 꽃일 수 있다. 분재 식물은 나무일 수 있다. 분재 식물은 덤불 또는 관목일 수 있다. 분재 식물은 채소일 수 있다.
핵산 구축물 또는 제형은 꽃의 수명을 보존하거나 또는 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 꽃의 예에는 백합, 데이지, 장미, 금잔화, 엔젤 트럼펫, 플록스, 일일초, 금어초, 해란초, 난초, 양치식물, 블랙-아이 수잔, 혈화, 블루 로벨리아, 나팔꽃, 양귀비, 금잔화, 제라늄, 봉선화, 란타나, 라크스퍼, 칼라 백합, 히아신스, 아잘레아, 포인세티아, 및 베고니아가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
핵산 구축물 또는 제형은 덤불 또는 관목의 수명을 보존하거나 또는 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 덤불 및 관목의 예에는 개나리, 푸크시아, 히비스커스, 커런트, 라일락, 장미, 수국, 버드나무, 목련, 백리향, 스노우베리, 층층나무 및 홀리가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다.
핵산 구축물 또는 제형은 나무의 수명을 보존하거나 또는 연장시키기 위해 사용될 수 있다. 나무의 예에는 사이프러스, 포인세티아, 야자수, 전나무, 소나무, 가문비나무, 삼나무, 오크, 뽕나무, 밤나무, 산사나무, 포플러, 및 단풍나무가 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 나무는 전나무일 수 있다. 전나무는 더글라스(Douglas), 발삼(Balsam) 또는 프레이저(Fraser) 전나무일 수 있다. 나무는 소나무일 수 있다. 소나무는 스카치(Scotch) 또는 화이트(White) 소나무일 수 있다. 나무는 가문비나무일 수 있다. 가문비나무는 화이트, 노르웨이(Norway) 또는 블루(Blue) 가문비나무일 수 있다. 나무는 삼나무일 수 있다. 삼나무는 데오다라(Deodara) 또는 이스턴 레드(Eastern red) 삼나무일 수 있다. 나무는 사이프러스 나무일 수 있다. 사이프러스 나무는 아리조나(Arizona) 또는 레랜드(Leland) 사이프러스 나무일 수 있다.
식물을 본원에 개시된 핵산 구축물 또는 제형과 접촉시켜, 식물의 수명을 연장시키거나 또는 보존할 수 있다. 식물과 핵산 구축물 또는 제형의 접촉은 핵산 구축물 또는 제형을 스프레이로서 투여하는 것을 포함할 수 있다. 식물과 핵산 구축물 또는 제형의 접촉은 핵산을 식물에 주사하는 것을 포함할 수 있다. 식물과 핵산 구축물 또는 제형의 접촉은 식물 성장 물질을 식물의 관개용수에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 식물과 핵산 구축물 또는 제형의 접촉은 핵산 구축물 또는 제형을 식물의 서식지에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 식물과 핵산 구축물 또는 제형의 접촉은 핵산 구축물 또는 제형을 식물 용기 (예를 들어, 꽃병)에 첨가하고, 식물 용기에 식물을 놓는 것을 포함할 수 있다. 식물과 핵산 구축물 또는 제형의 접촉은 핵산 구축물 또는 제형을 토양에 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 20% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 30% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 40% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 50% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 55% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 60% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 65% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 70% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 75% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 80% 연장될 수 있다. 식물의 수명은 식물의 종자를 처음 심은 때부터 식물의 사망까지의 성장 시간을 측정함으로써 결정될 수 있다.
식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 6, 12, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114 또는 120 시간 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 24 시간 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 36 시간 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 48 시간 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 72 시간 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 96 시간 연장될 수 있다.
식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5 또는 7 일 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 일 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 1 일 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 2 일 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 2.5 일 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 3 일 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 3.5 일 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 4 일 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 4.5 일 연장될 수 있다.
식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5 또는 7 주 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 주 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5 또는 7 개월 연장될 수 있다. 식물의 수명은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개월 연장될 수 있다.
식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키는 것은 식물의 시들음을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 식물의 시들음을 감소시키는 것은 식물의 꽃 또는 잎 말림을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 감소될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 10% 감소될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 30% 감소될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 50% 감소될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 70% 감소될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 80% 감소될 수 있다.
식물 스트레스의 징후에는 식물의 시들음이 포함될 수 있다. 예를 들어, 스트레스 받은 식물은 말린 잎 또는 꽃잎을 가질 수 있다. 본원에 개시된 식물 성장 물질은 식물의 시들음을 감소시킴으로써 식물의 수명을 촉진시킬 수 있다. 식물의 시들음을 감소시키는 것은 비처리 식물과 비교하여 식물의 시들음을 지연시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비처리 절단 식물은 절단 36 시간 내에 시들음의 징후를 나타낼 수 있지만, 식물 성장 물질로 처리된 절단 식물은 시들음이 지연될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 지연될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 12 시간 지연될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 24 시간 지연될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 36 시간 지연될 수 있다. 식물의 시들음은 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 48 시간 지연될 수 있다.
식물 스트레스의 추가의 징후에는 감소된 팽만성이 포함될 수 있다. 팽만성은 세포 외부의 낮은 용질 농도 영역으로부터 세포 세포의 액포로 물의 삼투성 흐름에 의해 유발되는 압력을 지칭할 수 있다. 팽만성은 강성을 유지하기 위해 식물에 의해 이용될 수 있다. 종종, 건강한 식물은 팽만성인 반면에, 건강하지 않은 식물은 덜 팽만성이다. 식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키는 것은 식물의 팽만성을 연장시키거나 또는 유지하는 것을 포함할 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 클 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 클 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 적어도 약 10% 클 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 적어도 약 15% 클 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 적어도 약 25% 클 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 적어도 약 35% 클 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 적어도 약 45% 클 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 적어도 약 60% 클 수 있다. 식물의 팽만성은 비처리 식물의 팽만성보다 적어도 약 75% 클 수 있다.
스트레스 받은 식물은 또한 팽만성 상태의 감소를 나타낼 수 있다. 팽만성 상태는 식물이 그의 강성을 유지하는 기간을 지칭할 수 있다. 식물의 강성은 식물의 줄기의 강성을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 절단 식물이 죽으면, 식물의 줄기가 덜 강성이어서, 절단 식물이 넘어지거나 또는 구부러질 수 있다. 스트레스 받은 식물은 스스로 똑바로 서지 못할 수 있다. 식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키는 것은 식물의 팽만성 상태를 연장시키는 것을 포함할 수 있다. 식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 증가될 수 있다. 식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 20% 증가될 수 있다. 식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 30% 증가될 수 있다. 식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 40% 증가될 수 있다. 식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 50% 증가될 수 있다.
식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 증가될 수 있다. 식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 6 시간 증가될 수 있다. 식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 12 시간 증가될 수 있다. 식물의 팽만성 상태는 비처리 식물과 비교하여 적어도 약 24 시간 증가될 수 있다.
스트레스 받은 식물은 잎 또는 꽃잎을 손실할 수 있다. 식물과 식물 성장 물질의 접촉은 식물의 1개 이상의 꽃잎 또는 잎의 손실을 감소시키거나 또는 지연시킬 수 있다. 예를 들어, 비처리 식물의 그의 잎 또는 꽃잎의 50%를 손실할 수 있는 반면에, 처리된 식물은 그의 잎 또는 꽃잎의 10-25%를 손실할 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 감소될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 10% 감소될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 20% 감소될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 35% 감소될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 50% 감소될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 60% 감소될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 70% 감소될 수 있다.
식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 6 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 12 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 18 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 36 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 48 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 60 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 72 시간 지연될 수 있다. 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실은 비처리 식물의 1개 이상의 꽃잎의 손실과 비교하여 적어도 약 96 시간 지연될 수 있다.
스트레스 받은 식물은 변색의 징후를 나타낼 수 있다. 스트레스 받은 식물은 갈색으로 보일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 스트레스 받은 식물은 녹색 잎의 출현에서의 감소를 나타낸다. 스트레스 받은 식물의 클로로필 함량 또한 감소될 수 있다. 식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키는 것은 식물의 클로로필 함량을 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비처리 식물의 클로로필 함량에서의 감소는 절단 48 시간 내에 나타날 수 있다. 그러나, 처리된 식물의 클로로필 함량에서의 감소는 절단 60 시간 이후에 나타날 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안 유지될 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 적어도 약 6 시간 동안 유지될 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 적어도 약 12 시간 동안 유지될 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 적어도 약 24 시간 동안 유지될 수 있다. 변색, 예컨대 잎 발화 (조기 황변)는 불량한 영양분 이용성으로 인해 발생할 수 있고, 불량한 식물 건강의 지표일 수 있다. 예를 들어, 잎 발화는 질소 결핍의 결과일 수 있다.
식물의 수명을 보존하거나 또는 연장시키는 것은 식물의 클로로필 함량의 손실을 감소시키거나 또는 지연시키는 것을 포함할 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 클로로필 함량보다 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 20% 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 30% 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 40% 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 50% 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 60% 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 8, 9, 또는 10배 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100배 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 2배 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 3배 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 4배 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 5배 높을 수 있다. 식물의 클로로필 함량은 비처리 식물의 함량보다 적어도 약 10배 높을 수 있다.
식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 지연될 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 시간 지연될 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 6 시간 지연될 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 12 시간 지연될 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 24 시간 지연될 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 36 시간 지연될 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 48 시간 지연될 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 60 시간 지연될 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실과 비교하여 적어도 약 72 시간 지연될 수 있다.
식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60% 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 65%, 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% 또는 97% 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 5% 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 10% 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 20% 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 30% 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 40% 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 50% 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 60% 적을 수 있다.
식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10배 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손보다 적어도 약 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100배 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 2배 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 3배 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 5배 적을 수 있다. 식물의 클로로필 함량의 손실은 비처리 식물의 클로로필 함량의 손실보다 적어도 약 10배 적을 수 있다.
핵산 구축물 또는 제형은 식물에 직접적으로 적용될 수 있다. 핵산 구축물 또는 제형은 식물의 하나 이상의 부분에 적용될 수 있다. 식물의 하나 이상의 부분은 끝눈, 꽃, 곁눈, 엽편, 엽액, 마디, 마디사이, 엽병, 주근, 측근, 근모, 근관, 또는 이들의 조합물에 적용될 수 있다. 제형은 식물의 엽편에 적용될 수 있다. 제형은 식물의 뿌리에 적용될 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, 핵산 구축물 또는 제형은 토양에 적용될 수 있다. 제형은 식물 주변 영역에 적용될 수 있다. 식물 주변 영역은 토양을 포함할 수 있다. 식물 주변 영역은 인접 식물을 포함할 수 있다. 제형은 토양에 식물 또는 종자를 놓기 전에 토양에 적용될 수 있다. 제형은 토양에 존재하는 박테리아 결집체에 적용될 수 있다. 제형은 토양에서 천연 박테리아 결집체를 보완하기 위해 추가의 박테리아와 함께 적용될 수 있다.
핵산 구축물 또는 제형은 기생 잡초에 민감한 식물에 적용될 수 있다. 식물의 예에는 옥수수, 벼, 수수, 기장, 및 사탕수수가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 식물은 옥수수일 수 있다. 식물은 담배일 수 있다. 식물은 벼일 수 있다.
핵산 구축물 또는 제형은 식물의 식용 생성물의 맛 또는 질감을 개선시킬 수 있다. 비제한적인 예에서, 표적화된 유전자는 당 및/또는 전분 생합성 또는 보관을 제어할 수 있다. 표적화된 유전자는 탄닌 생합성을 제어할 수 있다. 표적화된 유전자는 안토시아닌 생합성을 제어할 수 있다. 표적 유전자는 대사물 생합성을 제어할 수 있다.
핵산 구축물은 예를 들어 식물의 식용 생성물의 당, 전분, 단백질 및/또는 지방 함량을 증가시키거나 또는 감소시키고, 식물에서 비타민 및/또는 미네랄 축적을 증강시킴으로써 식물의 영양분 함량을 개선시킬 수 있다. 표적화된 유전자는 당 생합성, 탄수화물 생합성 및/또는 보관, 단백질 생합성 및/또는 분해, 및/또는 이차 대사물 생합성을 제어할 수 있다.
핵산 구축물은 예를 들어 식물에서 에틸렌 생합성을 감소시킴으로써 식물의 식용 생성물의 보관 수명을 증가시킬 수 있다. 표적화된 유전자는 에틸렌 생합성을 제어할 수 있다.
핵산 구축물 또는 제형은 종자 코팅으로서 적용될 수 있다. 핵산 구축물 또는 제형은 종자 처리로서 적용될 수 있다. 핵산 구축물 또는 제형은 종자 드레싱으로서 적용될 수 있다. 핵산 구축물 또는 제형은 스프레이로서 적용될 수 있다. 핵산 구축물 또는 제형은 엽면 스프레이로서 적용될 수 있다. 핵산 구축물 또는 제형은 분말로서 적용될 수 있다. 분말은 습윤가능한 분말일 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 측정은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40℃의 온도에서 이루어질 수 있다.
키트
상기 언급된 바와 같이 대상 방법을 실시하는데 사용되는 키트 또한 제공된다. 키트는 본원에 기재된 조성물 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 키트는 적어도 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 키트는 적어도 하나의 조작된 식물 또는 종자를 포함할 수 있다.
키트는 식물 또는 종자에 핵산 구축물의 투여를 수행하기 위한 1종 이상의 시약 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 완충제, 양이온 등) 등을 포함할 수 있다. 키트 성분에 의해 실시되는 프로토콜에서 바람직한 추가의 시약이 존재할 수 있다. 이러한 추가의 시약에는 다음 중 하나 이상이 포함되나 이로 제한되지 않는다: 효소 또는 효소 조합물, 예컨대 폴리머라제, 역전사 효소, 닉카제, 제한 엔도뉴클레아제, 우라실-DNA 글리코실라제 효소, DNA를 메틸화하거나 또는 탈메틸화하는 효소, 엔도뉴클레아제, 리가제 등.
키트 성분이 별도의 용기에 존재할 수 있거나, 또는 하나 이상의 성분이 동일한 용기에 존재할 수 있으며, 용기는 보관 용기 및/또는 키트가 설계된 검정 동안에 사용되는 용기일 수 있다.
상기 성분 외에도, 대상 키트는 대상 방법을 실시하는 것에 대한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 이들 지침서는 다양한 형태로, 예컨대 적합한 매체 또는 기판 상에 인쇄된 정보 (예를 들어, 정보가 인쇄된 종이 조각 또는 조각들), 키트의 포장지, 포장 삽입물 등으로 대상 키트에 존재할 수 있다. 여전히 또 다른 수단은 정보가 기록된 컴퓨터 판독가능한 매체 (예를 들어, 디스켓, CD 등)일 것이다. 존재할 수 있는 여전히 또 다른 수단은 제거된 사이트에서 정보에 접근하기 위해 인터넷을 통해 이용될 수 있는 웹사이트 주소이다.
결과 연락
본 개시내용은 예를 들어 검정 결과 또는 진단 또는 이들 둘 다를 기술자, 의사 또는 대상체에게 연락하는 것을 제공한다. 특정 예에서, 컴퓨터를 이용하여 본원의 방법의 결과를 이해 당사자, 예를 들어 소비자, 기술자, 의사 및 그들의 대상체 등에게 연락할 것이다. 일부 예에서, 결과를 연락하는 국가 또는 관할구역과 상이한 국가 또는 관할구역에서 방법을 수행하거나 또는 결과를 분석할 수 있다. 일부 예에서, 결과는 진단된 후에 가능한 한 빨리 대상체에게 연락될 수 있다. 결과는 이메일로 대상체에게 전송될 수 있거나 또는 전화로 대상체에게 연락될 수 있다. 컴퓨터를 이용하여 결과를 이메일 또는 전화로 연락할 수 있다. 특정 예에서, 전자통신 분야의 기술자에게 친숙한 컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어의 조합을 이용하여 결과를 포함하는 메세지를 생성하여 대상체에게 자동으로 전달할 수 있다. 특정 예에서 식물 및 종자의 제조 및 검정 결과의 연락을 비롯한 일부 방법 단계는 다양한 (예를 들어, 외국) 관할구역에서 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직화의 목적을 위한 것이며, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 기재된 방법 및 조성물이 본원에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 구축물 및 시약으로 제한되지 않으며, 따라서 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 방법론이 단지 특정한 예를 기재하기 위한 목적이고, 본원에 기재된 방법 및 조성물의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 하며, 상기 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이다. 본 개시내용의 바람직한 예가 본원에서 도시되고 기재되었지만, 이러한 예가 단지 예시적으로 제공된다는 것이 관련 기술분야의 기술자에게 명백할 것이다. 이제 수많은 변형, 변화 및 치환이 본 개시내용을 벗어나지 않고 관련 기술분야의 기술자에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 개시내용의 예에 대한 다양한 대안이 본 개시내용의 실시에서 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 청구항이 본 개시내용의 범위를 정의하고, 이들 청구항 및 그들의 등가물의 범위 내에 있는 방법 및 구조가 포함되는 것으로 의도된다.
몇몇 측면이 예시를 위해 실시예 적용을 참고하여 기재된다. 달리 나타내지 않는다면, 임의의 예는 임의의 다른 예와 조합될 수 있다. 수많은 구체적인 세부사항, 관계 및 방법이 본원에 기재된 특징의 충분한 이해를 제공하기 위해 제시됨을 이해해야 한다. 그러나, 숙련된 기술자는 본원에 기재된 특징이 하나 이상의 구체적인 세부사항없이 또는 다른 방법으로 실시될 수 있음을 이미 인지할 것이다. 본원에 기재된 특징은 예시된 작동 또는 사건 순서로 제한되지 않으며, 일부 작동이 상이한 순서로 및/또는 다른 작동 또는 사건과 동시에 일어날 수 있기 때문이다. 추가로, 본원에 기재된 특징에 따라 방법론을 실시하기 위해 모든 예시된 작동 또는 사건이 필요하지는 않다.
실시예
실시예 1 - CATS 올리고뉴클레오티드 핵산 구축물 용액의 제조
올리고뉴클레오티드는 맞춤식으로 합성되었다. 96 웰 올리고 플레이트를 수득하였다; 각각의 관심 유전자좌에 대해 하나의 플레이트. 각각의 올리고 플레이트에 대해 풀링된 스톡은 해당 플레이트의 각각의 웰로부터 20 uL의 400 uM 스톡을 취하고 이들을 2 mL 튜브에서 합함으로써 제조되었다. 그 후, 각각의 풀링된 스톡을 12 mL 멸균 팔콘 튜브에서 합하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 간단히 원심분리하여, 모든 내용물을 수집하였다. 이어서, 이 풀링된 올리고 믹스를 2개의 8-웰 PCT 스트립 튜브에 피펫팅하고 회전시켰다. 튜브를 95도에서 1 분 동안 PTC-200 열 순환기에 두어서 내용물을 변성시킨 다음, 실온에서 10 분 동안 냉각시켰다. 스트립 튜브의 내용물을 새로운 멸균 12 mL 팔콘 튜브에서 다시 합하고, 피펫팅에 의해 혼합하고, 간단히 원심분리하여, 내용물을 수집하였다. 이러한 전체-강도 올리고 믹스의 계열 희석액의 적용을 식물에 적용하였다. 올리고뉴클레오티드의 대표적인 서열은 서열식별번호 1-664에 제시된다.
실시예 2 - 식물 및 종자에 CATS 뉴클레오티드의 적용
옥수수에서 진공 처리 방법
5개의 20 mL 투명 유리 섬광 바이알을 입수하였고, 6개의 B73 옥수수 종자를 각각의 바이알에 넣고, 평평하게 놓았다. 바이알 1-4의 종자에 900 uL의 올리고 처리 (각각 전체 강도, 1/10, 1/100, 및 1/1000)를 제공하였고, 바이알 5의 종자에 900 uL의 물을 제공하였다. 20 분 동안 인큐베이션한 후에, 5개의 모든 바이알로부터 캡을 제거한 다음, 기밀 챔버에 놓고, 400mbar에서 18 시간 동안 진공시켰다. 18 시간 후에, 바이알을 진공으로부터 꺼내고, 습윤된 선샤인(Sunshine) 믹스 번호 4로 충전된 100 mm2 플라스틱 화분에 각각의 종자를 심었다. 긴 낮 조건으로 설정된 다음 조명 Veg 8 LED 패널하에 종자를 발아되도록 두었다.
용액 방법에서 발아 및 성장
5개의 20 mL 투명 유리 섬광 바이알을 입수하였고, 6개의 B73 옥수수 종자를 각각의 바이알에 넣고, 평평하게 놓았다. 바이알 1-4의 종자에 900 uL의 올리고 처리 (각각 전체 강도, 1/10, 1/100, 및 1/1000)를 제공하였고, 바이알 5의 종자에 900 uL의 물을 제공하였다. 바이알을 캡을 씌운 채 어두운 곳에 놓았고, 4 일 동안 종자가 발아되도록 두었다. 상배축이 출현하였을 때, 바이알을 어두운 곳으로부터 꺼내고, 배아를 처리 용액으로부터 제거하고, 습윤된 선샤인 믹스 번호 4로 충전된 100 mm2 플라스틱 화분에 각각을 심었다.
시린지 침윤 방법
올리고뉴클레오티드를 식물의 특정 위치에 국소적으로 전달하기 위해, 상기 기재된 CATS 올리고뉴클레오티드 용액을 시린지에 의해 식물 조직에 직접 투여할 수 있다.
실시예 3 - 옥수수에서 파이토엔 불포화 효소 (PDS1)의 표적화
식물에서 카로테노이드 합성에 관여하는 효소인 파이토엔 불포화 효소를 표적화하기 위해, CATS 올리고뉴클레오티드를 구축하였다. 이 유전자의 돌연변이 또는 녹아웃은 알비노 표현형을 생성한다.
옥수수 식물에서 PDS1 유전자 오픈 리딩 프레임의 상류에 있는 전사 조절 영역을 표적화하는 총 62개의 올리고뉴클레오티드 (31개의 올리고뉴클레오티드 쌍, 서열식별번호:1-62에 제시됨)를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 옥수수 종자 및 종자로부터 성장한 묘목에 적용하였다. PDS1-CATS 식물은 비접촉 대조군 식물과 비교하여 옅은 녹색 잎 표현형을 나타내었다 (도 3).
시린지 침윤에 의해 옥수수 잎에 CATS 올리고뉴클레오티드의 직접 투여는 색소 침착의 국소적인 손실을 일으킨다 (도 4).
비술파이트 시퀀싱에 의한 DNA 메틸화의 확인
멸균 가위로부터 잎 조직을 절단하고, 하나의 중간 유리 비드를 갖는 냉각된 (LN2) 밀폐 캡 튜브에 넣었다. 잎 조직을 1800 RPN에서 1:30 동안 비드로 두들겼다. 퓨어링크(PureLink) 식물 총 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출로부터 총 20 μL의 DNA를 자이모 리서치 코퍼레이션 이지(Zymo Research Corp Easy) DNA 메틸화 키트와 함께 사용하였다. 키트가 작동하는지 확인하기 위해 인간 표준을 이용하였다. 메트프라이머(MethPrimer)2 (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer2/MethPrimer.cgi)를 사용하여 프라이머를 설계하였고, 필요한 경우 프라이머에서 축퇴를 허용하였다. 키트로부터 비술파이트 처리된 DNA를 이용하여, 12.5 μL 자이모택(Zymotaq), 1 μL 프라이머-F, 1 μL 프라이머-R, 4 μL BS 처리된 DNA 및 7.5 μL 물을 사용하는 PCR 반응을 수행하였다. BS-PCR 프라이머의 첫번째 세트를 50℃에서 증폭시켰고, GC 섬을 커버하였다. 앰플리콘을 서열 클로닝하여 확인하였다. 시퀀싱된 데이터의 초기 분석은 일부 시토신이 메틸화되었음을 나타낸다 (도 5).
실시예 4 - 옥수수에서 LZY1 중력굴성 조절인자의 표적화
식물 조절인자 Lazy1 (LZY1)은 식물의 싹 중력굴성을 제어하는 것으로 공지되어 있다. 야생형 식물에서, 싹은 중력 반대 방향으로 성장하고, 이 방향성을 유지하기 위해 구부러짐으로써 배향 변화에 대해 반응한다. 대조적으로, LZY1 발현에서의 돌연변이체는 배향 변화에 대해 반응하지 않는다. CATS 올리고는 LZY1 조절인자를 표적화하도록 설계되었다. 옥수수 식물에서 LZY1 유전자 오픈 리딩 프레임의 상류에 있는 전사 조절 영역을 표적화하는 총 132개의 올리고뉴클레오티드 (67개의 올리고뉴클레오티드 쌍, 서열식별번호: 63-194에 제시됨)를 합성하였다. 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 옥수수 종자 및 종자로부터 성장한 묘목에 적용하였다.
도 6B 및 6D에 도시된 바와 같이, CATS::LZY1 묘목은 변형되지 않은 식물과 비교하여 (도 6A 및 6C) 옆으로 돌렸을 때 중력굴성의 감소 또는 부재를 나타내고, 대조군 식물은 강한 중력굴성 반응을 나타낸다.
실시예 5 - 감자에서 폴리페놀 옥시다제의 표적화
식물에서 폴리페놀 효소 옥시다제 (PPO) 효소는 식물의 절단 또는 상처 후에 발생하는 효소적 갈변 표현형을 담당한다. 비-갈변 작물이 소비자 수용 및 음식물 쓰레기 관점에서 바람직하다. 비-갈변 감자를 달성하기 위해, CATS 올리고를 감자 (솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum))에서 7개의 PPO 대립유전자를 동시에 표적화하도록 설계하였다. 총 210개의 개별 올리고 (105개의 올리고 쌍, 서열식별번호: 195-404에 제시됨)를 상기 '용액에서 성장' 방법을 이용하여 종자 감자에 적용하였다. 식물을 온실 조건에서 성장시켰고, 심은지 대략 3 개월 후에 괴경을 수확하였다. PPO mRNA 수준의 RT-PCT 분석은 CATS 식물이 전사체 수준을 감소시켰음을 나타내고 (도 7B), 표현형 분석은 CATS 식물로부터의 괴경이 변형되지 않은 대조군 식물의 감자와 비교하여 절단시 효소적 갈변을 크게 감소시켰음을 나타낸다 (도 7A).
실시예 4 - 단신 옥수수의 생성
CATS 올리고를 브라시노스테로이드의 생합성에 관여하고 지베렐린-브라시노스테로이드 균형에 관여하는 유전자 (BWF1 및 BR2)를 표적화하도록 설계하였다. 총 180개의 개별 올리고 (90개의 올리고 쌍, 서열식별번호: 405-584에 제시됨)를 옥수수 종자에 적용하였다. 접촉 종자로부터 성장한 식물은 CATS 올리고와 접촉하지 않은 대조군 식물보다 짧았다 (도 8).
실시예 5 - 토마토 식물의 집단에서 올드 골드 유전자의 표적화
올리고 처리 및 식물 성장 조건
올리고를 마이크로톰(microTom) 게놈 (올드 골드 번역 시작 부위의 ~500 bp 상류 및 하류, 서열식별번호: 585-684에 제시됨)을 표적화하도록 설계하였고, 이 ~1kb 영역에 걸쳐 비중첩 올리고를 사용하였다. 상보성 올리고를 95℃에서 10 분 동안 인큐베이션하고 실온으로 서서히 냉각시킴으로써 어닐링한 다음, 어닐링된 올리고 쌍을 각각의 처리에 대해 풀링하였다. 종자를 올드 골드를 표적화하는 250 μM 농도 (0.5x TE 완충제)의 900ul의 올리고와 함께 (처리) 또는 대조군으로서 무작위 올리고와 함께 (비처리) 인큐베이션하였다. 종자를 선샤인 믹스 토양 #4에 심기 전에 실온에서 어두운 곳에서 3 일 동안 인큐베이션하였고, 2개의 진정한 잎이 확립될 때까지 (~ 2 주) 16 시간 광주기하에 성장시켰다. 출현한 50-100mg의 진정한 잎 조직을 각각의 샘플로부터 수확하였고, 이후 분석을 위해 -80에서 보관하기 전에 액체 질소에서 냉동시켰다.
RNA 단리
퓨어링크 프로 96 총 RNA 정제 키트 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))를 사용하여 제조자의 지침에 따라 출발 물질로부터 총 RNA 단리물을 수집하였다. 총 RNA를 RNase 무함유 물에 용리시켰다. 단리될 수 없는 조직을 갖는 샘플은 폐기하였다. 스펙트라맥스(SpectraMax) iD3 플레이트 판독기 상에서 형광을 사용하는 콴트-잇(Quant-iT)™ RNA 검정 키트, 광범위 (써모피셔 사이언티픽)를 이용하여 총 RNA를 정량화하였다. 정량화된 총 RNA를 RNase 무함유 물을 사용하여 1ng으로 희석하였다. 1ng/uL 미만의 RNA는 폐기하였다. 단리 및 정량화를 완료한 후에, 1 KB 처리의 40개 샘플; 2.5 KB의 45개 샘플; RO (무작위 올리고뉴클레오티드) 대조군의 44개 샘플; 및 물 대조군의 11개 샘플의 집단 크기가 있었다.
정량적인 실시간 PCR 조건
콴트스튜디오스(Quantstudios) 6 플렉스 실시간 PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 사용하여 96-웰 광학 플레이트에서 RT-qPCR을 수행하였다. 루나 유니버셜 원-스텝(Luna Universal One-Step) RT-qPCR 키트를 사용하여 반응을 수행하였으며, 이는 20 μL의 최종 부피에서 루나 웜스타트(Luna WarmStart) 역전사 효소 및 SYBR 그린 I (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)); 10 μM의 각각의 프라이머; RNase 무함유 물; 및 1 μL의 희석된 RNA (1 ng/uL)를 사용한다. 하기 열 순환 조건을 모든 증폭에 대해 이용하였다 (루나 유니버셜 원-스텝 RT-qPCR 키트 매뉴얼을 따름): 역전사의 경우 10 분 동안 55℃, 변성의 경우 1 분 동안 95℃, 10 초 동안 95℃ 및 1 분 동안 60℃의 40회 증폭 주기, 및 60-95℃의 다양한 단계의 용융 곡선. 모든 샘플을 각각의 qPCR 플레이트에 대해 기술적 삼중으로 및 RNase 무함유 물의 3개의 비 주형 대조군으로 제조하였다.
데이터 분석
역치 주기 (Ct) 값을 RT-qPCR 동안에 각각의 샘플의 3개의 기술적 복제물로부터 평균하였고, 이를 사용하여 ΔCt 값 (올드 골드 표적 - GAPDH 하우스킵핑 기준)을 계산하였다. 처리 (올드 골드) 대 비처리 (무작위 올리고) 집단에 대한 유전자 발현에서의 변화를 빈도 히스토그램으로 나타낸다 (도 10). 각각의 샘플에 대한 ΔCt 값은 2 d.p.로 반올림하였고, 0 내지 -4.5 ΔCt (log2)의 범위에서 0.1의 클래스 폭을 갖는 그룹으로 분류하였으며, 더 음수인 ΔCt 값은 GAPDH 기준 유전자와 비교하여 올드 골드 표적 유전자의 더 큰 하향조절을 나타내었다.
실시예 6 - 올리고뉴클레오티드에 대한 서열 변형의 예
본원에 개시된 핵산 구축물, 예를 들어 CATs 올리고뉴클레오티드는 개별 또는 다중 위치에서 다양한 변형을 가질 수 있다. 이들 변형에는 포스포로티오에이트 변형, 2'O-메틸 변형, 2'플루오로 변형, 또는 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 도 11에 예가 도시된다. 본원의 구축물, 예컨대 CATs 올리고뉴클레오티드를 사용하는 후성적 변형은 가변적인 유전자 발현 수준을 갖는 집단을 생성할 수 있다 (도 9).
서열
PDS1 유전자를 침묵시키기 위한 CATS 올리고뉴클레오티드 서열 (mC=2'-O-메틸 시토신, mG=2'-O-메틸 구아닌, mA=2'-O-메틸 아데닌, mT=2'-O-메틸 티민, mU=2'-O-메틸 우라실)
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
LZY1 유전자를 침묵시키기 위한 CATS 올리고뉴클레오티드 서열 (mC=2'-O-메틸 시토신, mG=2'-O-메틸 구아닌, mA=2'-O-메틸 아데닌, mT=2'-O-메틸 티민, mU=2'-O-메틸 우라실)
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
PPO 유전자를 침묵시키기 위한 CATS 올리고뉴클레오티드 서열 (mC=2'-O-메틸 시토신, mG=2'-O-메틸 구아닌, mA=2'-O-메틸 아데닌, mT=2'-O-메틸 티민, mU=2'-O-메틸 우라실)
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
DWF1 및 BR2 유전자를 침묵시키기 위한 CATS 올리고뉴클레오티드 서열 (mC=2'-O-메틸 시토신, mG=2'-O-메틸 구아닌, mA=2'-O-메틸 아데닌, mT=2'-O-메틸 티민, mU=2'-O-메틸 우라실)
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
올드 골드 유전자를 침묵시키기 위한 CATS 올리고뉴클레오티드 서열 (mC=2'-O-메틸 시토신, mG=2'-O-메틸 구아닌, mA=2'-O-메틸 아데닌, mT=2'-O-메틸 티민, mU=2'-O-메틸 우라실)
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
SEQUENCE LISTING <110> SOUND AGRICULTURE COMPANY <120> PROGRAMMABLE EPIGENETIC CONTROL OF GENE EXPRESSION IN PLANTS <130> 45697-711.601 <140> PCT/US2020/023391 <141> 2020-03-18 <150> 62/820,172 <151> 2019-03-18 <160> 674 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 tggctactat gtattgatgt taac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 ttaacatcaa tacatagtag ccag 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ccattaagat gtactcgctc tgta 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 acagagcgag tacatcttaa tgga 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Synthetic oligonucleotide <400> 31 gtctcaaaag gaggtgagct ggga 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 cccagctcac ctccttttga gacg 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 tttagccgac taattttaga tgag 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 34 tcatctaaaa ttagtcggct aaau 24 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 taatctttag ttccgtgccc ccgc 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 36 cgggggcacg gaactaaaga ttau 24 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 tgcaggctca ccccgacgtg cccc 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 gggcacgtcg gggtgagcct gcac 24 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 39 gccctccgcg cgcgatgccc ccau 24 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 tgggggcatc gcgcgcggag ggca 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 caccgacgca gagctcgccc atgc 24 <210> 42 <211> 24 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Synthetic oligonucleotide <400> 58 aaaacagggt attgggtaca tgcu 24 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 59 tgaccttggg tactattata gcac 24 <210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 60 tgctataata gtacccaagg tcaa 24 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 61 tttcagttcg agtgttagac cctg 24 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 62 agggtctaac actcgaactg aaac 24 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 63 ctttttggaa ttcttctgac cagg 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Synthetic oligonucleotide <400> 74 tttcgatttt gagtatcccg gctg 24 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 75 actcggtcca taggttaata ctca 24 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 76 gagtattaac ctatggaccg agtc 24 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 77 tcatatttta catctaaacg ttcg 24 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 78 gaacgtttag atgtaaaata tgag 24 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 79 tggaagcaaa caccccctta gacg 24 <210> 80 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 80 gtctaagggg gtgtttgctt ccac 24 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 81 ccacctcttg tcgaccattt gtag 24 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 82 tacaaatggt cgacaagagg tggu 24 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 83 catgttccgt tctgccgact gatg 24 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 84 atcagtcggc agaacggaac atga 24 <210> 85 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 85 cctgcagctg cagctgcagt gcgu 24 <210> 86 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 86 cgcactgcag ctgcagctgc agga 24 <210> 87 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 87 actccatcgt ctattaatgg ctcg 24 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 88 gagccattaa tagacgatgg agta 24 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 89 ccagcgctcg gcttagacaa gccu 24 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ggcttgtcta agccgagcgc tgga 24 <210> 91 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 gaaaataggt ggattagaaa gaac 24 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 97 gcgactcact ctcgtagttg gtgu 24 <210> 98 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 caccaactac gagagtgagt cgcc 24 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 99 tcatgacctc ctcctcaagc tcgg 24 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 100 cgagcttgag gaggaggtca tgaa 24 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 ctcatatttg aagcctcctt gttc 24 <210> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 gtaatggttt caatccaaac aaga 24 <210> 113 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 atatattgga cttgtattcc aagc 24 <210> 114 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 cttggaatac aagtccaata tata 24 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gtccttatag atttggacac ttau 24 <210> 116 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 116 taagtgtcca aatctataag gacu 24 <210> 117 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 117 caaatcttct tgcctaagca aatu 24 <210> 118 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 118 atttgcttag gcaagaagat ttgu 24 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 ctaaactcta ttttatactc cctc 24 <210> 120 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 120 agggagtata aaatagagtt tagu 24 <210> 121 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 121 agtgttcatt ttggctcctc attu 24 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 aatgaggagc caaaatgaac acta 24 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 tcagatggat gaaaatgaat ctag 24 <210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 tagattcatt ttcatccatc tgaa 24 <210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 tgaatccact gatatgttaa aacg 24 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gttttaacat atcagtggat tcau 24 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gggacggaga gagtatattc caag 24 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 ttggaatata ctctctccgt ccca 24 <210> 129 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 129 ctatctttgg gttttcatct tttu 24 <210> 130 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 aaaagatgaa aacccaaaga tagc 24 <210> 131 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 131 gaccaggagg gactctattt atau 24 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 tataaataga gtccctcctg gtca 24 <210> 133 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gataataaag actctgacta atag 24 <210> 134 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 tattagtcag agtctttatt atcg 24 <210> 135 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 agactctgac taataggacc gagc 24 <210> 136 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 136 ctcggtccta ttagtcagag tctu 24 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 actaatagga ccgagcaact cgga 24 <210> 138 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 ccgagttgct cggtcctatt agtc 24 <210> 139 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 gaccgagcaa ctcggattcg gtgg 24 <210> 140 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 caccgaatcc gagttgctcg gtcc 24 <210> 141 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 aactcggatt cggtggagtg actc 24 <210> 142 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 agtcactcca ccgaatccga gttg 24 <210> 143 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 ttcggtggag tgactcggac ttgg 24 <210> 144 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 144 caagtccgag tcactccacc gaau 24 <210> 145 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 agtgactcgg acttggactg tgca 24 <210> 146 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 gcacagtcca agtccgagtc actc 24 <210> 147 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 147 ggacttggac tgtgcaactc ggau 24 <210> 148 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 148 tccgagttgc acagtccaag tccg 24 <210> 149 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 actgtgcaac tcggattcag ccgg 24 <210> 150 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 cggctgaatc cgagttgcac agtc 24 <210> 151 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 actcggattc agccgggata ctca 24 <210> 152 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 152 gagtatcccg gctgaatccg agtu 24 <210> 153 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 tcagccggga tactcaaaat cgaa 24 <210> 154 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 tcgattttga gtatcccggc tgaa 24 <210> 155 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 gatactcaaa atcgaaatcc aagg 24 <210> 156 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 cttggatttc gattttgagt atcc 24 <210> 157 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 157 aaatcgaaat ccaagggact cggu 24 <210> 158 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 158 ccgagtccct tggatttcga tttu 24 <210> 159 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 159 atccaaggga ctcggtccat aggu 24 <210> 160 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 160 cctatggacc gagtcccttg gatu 24 <210> 161 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 gactcggtcc ataggttaat actc 24 <210> 162 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 agtattaacc tatggaccga gtcc 24 <210> 163 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 tcatatttta catctaaacg ttcg 24 <210> 164 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 gaacgtttag atgtaaaata tgag 24 <210> 165 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 165 tacatctaaa cgttcgatgt gcgu 24 <210> 166 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 cgcacatcga acgtttagat gtaa 24 <210> 167 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 aacgttcgat gtgcgtggaa gcaa 24 <210> 168 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 168 tgcttccacg cacatcgaac gttu 24 <210> 169 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 atgtgcgtgg aagcaaacac cccc 24 <210> 170 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 ggggtgtttg cttccacgca catc 24 <210> 171 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 171 ggaagcaaac acccccttag acgu 24 <210> 172 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 cgtctaaggg ggtgtttgct tcca 24 <210> 173 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 acaccccctt agacgtggga cacc 24 <210> 174 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 174 gtgtcccacg tctaaggggg tgtu 24 <210> 175 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 ttagacgtgg gacaccacct cttg 24 <210> 176 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 aagaggtggt gtcccacgtc taag 24 <210> 177 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 177 gggacaccac ctcttgtcga ccau 24 <210> 178 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 tggtcgacaa gaggtggtgt ccca 24 <210> 179 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 acctcttgtc gaccatttgt agcc 24 <210> 180 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 gctacaaatg gtcgacaaga ggtg 24 <210> 181 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 181 tcgaccattt gtagccttct tcau 24 <210> 182 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 tgaagaaggc tacaaatggt cgac 24 <210> 183 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 183 ttgtagcctt cttcatgttc cgtu 24 <210> 184 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 acggaacatg aagaaggcta caaa 24 <210> 185 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 ttcttcatgt tccgttctgc cgac 24 <210> 186 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 tcggcagaac ggaacatgaa gaag 24 <210> 187 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 187 gttccgttct gccgactgat ggau 24 <210> 188 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 tccatcagtc ggcagaacgg aaca 24 <210> 189 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 ctgccgactg atggatcact cctg 24 <210> 190 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 aggagtgatc catcagtcgg caga 24 <210> 191 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 tgatggatca ctcctgcagc tgca 24 <210> 192 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 gcagctgcag gagtgatcca tcag 24 <210> 193 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 193 cactcctgca gctgcagctg cagu 24 <210> 194 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 ctgcagctgc agctgcagga gtga 24 <210> 195 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 atgaagcaaa actctaaagt tgac 24 <210> 196 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 tcaactttag agttttgctt cata 24 <210> 197 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 aacccagttt ttcagctctc acta 24 <210> 198 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 agtgagagct gaaaaactgg gttg 24 <210> 199 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 attaccaatt gatcatcatc ttgc 24 <210> 200 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 200 caagatgatg atcaattggt aatu 24 <210> 201 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 attacaactt tccagctatt ttgc 24 <210> 202 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 caaaatagct ggaaagttgt aata 24 <210> 203 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 cactttataa tcctaatcct acac 24 <210> 204 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 204 tgtaggatta ggattataaa gtgu 24 <210> 205 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 aagctcattc aacaacacaa ttag 24 <210> 206 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 206 taattgtgtt gttgaatgag cttu 24 <210> 207 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 tcaaacacaa aatagagtta tggc 24 <210> 208 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 208 ccataactct attttgtgtt tgau 24 <210> 209 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 ttaacttcat gtactaccat ttcc 24 <210> 210 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 gaaatggtag tacatgaagt taaa 24 <210> 211 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 catccaaaat tttcgtccgt ccaa 24 <210> 212 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 tggacggacg aaaattttgg atgg 24 <210> 213 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 cgataacttt aaggtgaatt gtga 24 <210> 214 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 cacaattcac cttaaagtta tcga 24 <210> 215 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 taatgaagga aaatcttttc cagg 24 <210> 216 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 216 ctggaaaaga ttttccttca ttau 24 <210> 217 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 217 gatagacgaa atgtcctcct tggu 24 <210> 218 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 ccaaggagga catttcgtct atca 24 <210> 219 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 ggctctatgg agcatctaat ctta 24 <210> 220 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 aagattagat gctccataga gccc 24 <210> 221 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 aaccaacgag ccatttgccc tagg 24 <210> 222 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 ctagggcaaa tggctcgttg gtta 24 <210> 223 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 gtaccacccc cagacttctc aaca 24 <210> 224 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 gttgagaagt ctgggggtgg tacc 24 <210> 225 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 tctgtcaacc gacccaaccg accc 24 <210> 226 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 ggtcggttgg gtcggttgac agaa 24 <210> 227 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 tccagactgt aagttatttt tctg 24 <210> 228 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 228 agaaaaataa cttacagtct ggau 24 <210> 229 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 229 cagagcttct aagaacaaaa actu 24 <210> 230 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 230 agtttttgtt cttagaagct ctgu 24 <210> 231 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 gtatggctgc tatacaaaat tccc 24 <210> 232 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 ggaattttgt atagcagcca taca 24 <210> 233 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 cgcttcctgg aataattgat atgg 24 <210> 234 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 catatcaatt attccaggaa gcgg 24 <210> 235 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 tattatataa ggcaaggtat agcc 24 <210> 236 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 gctatacctt gccttatata ataa 24 <210> 237 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 tcattcaaaa cctagcaata atgg 24 <210> 238 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 cattattgct aggttttgaa tgaa 24 <210> 239 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 gtagtaatac atctctcaaa actc 24 <210> 240 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 240 agttttgaga gatgtattac tacu 24 <210> 241 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 ttcttcctcc acttctttat cttc 24 <210> 242 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 aagataaaga 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taccaataat aacggtgacc aaaa 24 <210> 248 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 248 tttggtcacc gttattattg gtaa 24 <210> 249 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 249 gttgaaacga attctgttga tcga 24 <210> 250 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 250 cgatcaacag aattcgtttc aacg 24 <210> 251 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 251 ttcttcttgg cttaggtggt cttu 24 <210> 252 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 252 aagaccacct aagccaagaa gaac 24 <210> 253 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial 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oligonucleotide <400> 258 gtaggtgagg aaatttttta acaa 24 <210> 259 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 259 gaattgttcg atatgagatc gagc 24 <210> 260 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 260 ctcgatctca tatcgaacaa ttcg 24 <210> 261 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 261 tggagtaata ttttatttgg ctcc 24 <210> 262 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 262 gagccaaata aaatattact ccau 24 <210> 263 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 263 tatataaggc aatgtatagc ccta 24 <210> 264 <211> 24 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oligonucleotide <400> 305 caaatgttca aagtttcatg caag 24 <210> 306 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 306 ttgcatgaaa ctttgaacat ttgg 24 <210> 307 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 307 ataataacgg tgaccaaaac gttg 24 <210> 308 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 308 aacgttttgg tcaccgttat tatu 24 <210> 309 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 309 ttctgttgat cgaagaaatg ttcu 24 <210> 310 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 310 gaacatttct tcgatcaaca gaau 24 <210> 311 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 311 ttaggaggtc tatatggtgt tgcu 24 <210> 312 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 312 gcaacaccat atagacctcc taaa 24 <210> 313 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 taccattagc tgcatccgct gctc 24 <210> 314 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 314 agcagcggat gcagctaatg gtau 24 <210> 315 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 gatcaaagga tggctaaatt tttc 24 <210> 316 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 aaaaatttag ccatcctttg atca 24 <210> 317 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 ttgaacttga ggatcaatat ttcc 24 <210> 318 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 gaaatattga tcctcaagtt caaa 24 <210> 319 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 319 gagagtgagt aattactcca agau 24 <210> 320 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 320 tcttggagta attactcact ctcu 24 <210> 321 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 acaattatca ccaacgtgtt acac 24 <210> 322 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 tgtaacacgt tggtgataat tgta 24 <210> 323 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 gctacatata ccttcaccat tttg 24 <210> 324 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 aaaatggtga aggtatatgt agca 24 <210> 325 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 325 gcaactcttc taacaaaaaa tcac 24 <210> 326 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 tgattttttg ttagaagagt tgca 24 <210> 327 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 327 aacacaatgt cttcttctag tacu 24 <210> 328 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 328 gtactagaag aagacattgt gttg 24 <210> 329 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 ttccattatg caccaacaaa tccc 24 <210> 330 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 ggatttgttg gtgcataatg gaag 24 <210> 331 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 ttccttcacc accaacaact catc 24 <210> 332 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 atgagttgtt ggtggtgaag gaag 24 <210> 333 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 tcaaaaccct ctcaactttt cctc 24 <210> 334 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 334 aggaaaagtt gagagggttt tgau 24 <210> 335 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 335 gacgtaatca aagtttcaag gttu 24 <210> 336 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 336 aaccttgaaa ctttgattac gtcu 24 <210> 337 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 337 cgtcaacaat aatgttggcg agca 24 <210> 338 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 338 gctcgccaac attattgttg acgu 24 <210> 339 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 339 aaccttgacg ctgttgatag gcga 24 <210> 340 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 340 cgcctatcaa cagcgtcaag gttu 24 <210> 341 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 341 ttttagggtt aggaggtctt tatg 24 <210> 342 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 342 ataaagacct cctaacccta aaag 24 <210> 343 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 taatcttgca ccattagcct ctgc 24 <210> 344 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 344 cagaggctaa tggtgcaaga ttag 24 <210> 345 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 345 tgcaaaagaa aataggatct gcau 24 <210> 346 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 346 tgcagatcct attttctttt gcau 24 <210> 347 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 347 atacaaaacc atttcaaaac tgcg 24 <210> 348 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 348 gcagttttga aatggttttg tatu 24 <210> 349 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 349 cgtttgtact aggtacatga attu 24 <210> 350 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 350 aattcatgta cctagtacaa acgu 24 <210> 351 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 351 aaatactgat gaaacgctgc aaag 24 <210> 352 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 tttgcagcgt ttcatcagta ttta 24 <210> 353 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 353 actcatccca gcaatggctt cttc 24 <210> 354 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 354 aagaagccat tgctgggatg agtg 24 <210> 355 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 355 cctttgtgca ctaccaatat tccc 24 <210> 356 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 356 ggaatattgg tagtgcacaa aggu 24 <210> 357 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 357 tctccaataa taccaactca tctu 24 <210> 358 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 agatgagttg gtattattgg agaa 24 <210> 359 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 aaaaccctct cagcttttcc tcca 24 <210> 360 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 ggaggaaaag ctgagagggt tttg 24 <210> 361 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 cgtagtcaaa gtttcaaggt ttca 24 <210> 362 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 362 gaaaccttga aactttgact acgc 24 <210> 363 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 atagcgagca tgacaaaaat aacc 24 <210> 364 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 364 gttatttttg tcatgctcgc tata 24 <210> 365 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 365 cgatgctgtt gataggagaa atgu 24 <210> 366 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 366 catttctcct atcaacagca tcgu 24 <210> 367 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 367 gggttaggag gtctttatgg tgcu 24 <210> 368 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 368 gcaccataaa gacctcctaa cccu 24 <210> 369 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 ttgcaccatt agccactgct gctc 24 <210> 370 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 agcagcagtg gctaatggtg caag 24 <210> 371 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 accacctgat ttgaaaactt gtag 24 <210> 372 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 tacaagtttt caaatcaggt ggtg 24 <210> 373 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 actgtaactc ctggtggtcc agca 24 <210> 374 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 gctggaccac caggagttac agtg 24 <210> 375 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 tatgtgctca cgtggacaca ttac 24 <210> 376 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 taatgtgtcc acgtgagcac atag 24 <210> 377 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 gatgcaatat ttatgatgtt cacg 24 <210> 378 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 gtgaacatca taaatattgc atca 24 <210> 379 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 attatattct cgacaagttg aacg 24 <210> 380 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 380 gttcaacttg tcgagaatat aatu 24 <210> 381 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 381 ggaaatgatg gagattatta tggu 24 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Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 387 tgctagccct agatgttcat gaau 24 <210> 388 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 388 ttcatgaaca tctagggcta gcau 24 <210> 389 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 caagcaaaaa aatgtcttcc attc 24 <210> 390 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 390 aatggaagac atttttttgc ttgu 24 <210> 391 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 cactaccaat 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 397 agcataatgt ccatcgtaat ttcc 24 <210> 398 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 398 gaaattacga tggacattat gctu 24 <210> 399 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 399 gcaaaaccat agatgataat agtc 24 <210> 400 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 400 actattatca tctatggttt tgca 24 <210> 401 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 401 caataactca cccatcgaca tttc 24 <210> 402 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 402 aaatgtcgat gggtgagtta ttgu 24 <210> 403 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 403 acaatatgat cgatagaaga aacg 24 <210> 404 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 404 gtttcttcta tcgatcatat tgtu 24 <210> 405 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 405 tcggcctgcc gagcctagac aata 24 <210> 406 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 406 attgtctagg ctcggcaggc cgac 24 <210> 407 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 407 tctcctctcg atggggtctc tccc 24 <210> 408 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 408 ggagagaccc catcgagagg agag 24 <210> 409 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 409 atccaggcgc cgccggtgac cttc 24 <210> 410 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 410 aaggtcaccg gcggcgcctg gatc 24 <210> 411 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 411 gcgcacgcgc ggatcattcg tccc 24 <210> 412 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 412 ggacgaatga tccgcgcgtg cgca 24 <210> 413 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 413 acagtctgac acgttagata gaga 24 <210> 414 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 414 ctctatctaa cgtgtcagac tgtc 24 <210> 415 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 415 atgcgccagg tcgtggaccg tccc 24 <210> 416 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 416 ggacggtcca cgacctggcg catg 24 <210> 417 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 417 agagaacact gccgtcggtt ttta 24 <210> 418 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 418 aaaaaccgac ggcagtgttc tctg 24 <210> 419 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 ttgacgttcg aaaagatgtc aaca 24 <210> 420 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 420 gttgacatct tttcgaacgt caau 24 <210> 421 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 421 agttttttta tacaactgag agag 24 <210> 422 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 422 tctctcagtt gtataaaaaa actc 24 <210> 423 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 423 gagtgagtta aatggcaaca aaca 24 <210> 424 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 424 gtttgttgcc 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Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 450 ctgccgccat gcacgaaaga tccu 24 <210> 451 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 451 cccccccccc cccccccccc cccc 24 <210> 452 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 gggggggggg gggggggggg gggg 24 <210> 453 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 cgtgtatacg agttttctct aggc 24 <210> 454 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 454 cctagagaaa actcgtatac acgg 24 <210> 455 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 455 catgttggat tggattgcgc tagu 24 <210> 456 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 456 ctagcgcaat ccaatccaac atgc 24 <210> 457 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 457 gaggtgccgg ccgtacccat cctc 24 <210> 458 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 458 aggatgggta cggccggcac ctcu 24 <210> 459 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 459 agaaaaaagg cccagtcatt tttg 24 <210> 460 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 460 aaaaatgact gggccttttt tctg 24 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 494 accaagtagt ccgctaagac cttc 24 <210> 495 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 495 cttcgtggcc cttccaatat ctgc 24 <210> 496 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 496 cagatattgg aagggccacg aaga 24 <210> 497 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 497 tggtgaacac gtggtccgcc atga 24 <210> 498 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 498 catggcggac cacgtgttca ccag 24 <210> 499 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 499 gaacaccagg agaacgtaga gggu 24 <210> 500 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 500 ccctctacgt tctcctggtg ttcc 24 <210> 501 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 501 atccgaagag ggacggcctc gtcu 24 <210> 502 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 502 gacgaggccg tccctcttcg gatc 24 <210> 503 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 503 gtcgtgggca tgcgcaacgt ggac 24 <210> 504 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 504 tccacgttgc gcatgcccac gacc 24 <210> 505 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 505 ggtcgacctc tccgcgttga ggaa 24 <210> 506 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 506 tcctcaacgc ggagaggtcg accu 24 <210> 507 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 507 ggatggtcgc cagggtggag cctc 24 <210> 508 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 508 aggctccacc ctggcgacca tccu 24 <210> 509 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 509 aaggctacct gccccatgaa cctc 24 <210> 510 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 510 aggttcatgg ggcaggtagc cttg 24 <210> 511 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 511 ggacgacctt accgtcggtg gtcu 24 <210> 512 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 512 gaccaccgac ggtaaggtcg tcca 24 <210> 513 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 513 ggagctctca cgtctacggc ctcu 24 <210> 514 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 514 gaggccgtag acgtgagagc tccc 24 <210> 515 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 515 gaggtcgttc ttgcggatgg gcag 24 <210> 516 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 516 tgcccatccg caagaacgac ctcc 24 <210> 517 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 517 cgagcactcc gacctcttct atgg 24 <210> 518 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 518 catagaagag gtcggagtgc tcgu 24 <210> 519 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 519 tcgggctcct ggtttcggct gaga 24 <210> 520 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 520 ctcagccgaa accaggagcc cgau 24 <210> 521 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 521 tacatgaggc tcacgtacac tccu 24 <210> 522 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 522 ggagtgtacg tgagcctcat gtac 24 <210> 523 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 523 cgcggaggct tatgctgatt cgtu 24 <210> 524 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 524 acgaatcagc ataagcctcc gcga 24 <210> 525 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 525 cacatgaacc cgtatcgcga gatg 24 <210> 526 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 526 atctcgcgat acgggttcat gtgu 24 <210> 527 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 527 tctttatcac agtggatgca tatg 24 <210> 528 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 528 atatgcatcc actgtgataa agaa 24 <210> 529 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 529 acagatggtt agcgagtgac agta 24 <210> 530 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 530 actgtcactc gctaaccatc tgtu 24 <210> 531 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 531 agttgtccga cacttcatcg gtaa 24 <210> 532 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 532 taccgatgaa gtgtcggaca actu 24 <210> 533 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 533 accgagtgaa tggaagaaaa acga 24 <210> 534 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 534 cgtttttctt ccattcactc ggtu 24 <210> 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555 acattcagtc tctctcacta gttg 24 <210> 556 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 556 aactagtgag agagactgaa tgta 24 <210> 557 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 557 ctacaaagac atgagctgcc ggga 24 <210> 558 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 558 cccggcagct catgtctttg tagc 24 <210> 559 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 559 gagcgagcga gcctgacggt ctca 24 <210> 560 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 560 gagaccgtca ggctcgctcg ctcc 24 <210> 561 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 561 actcccaagc caattattat aaga 24 <210> 562 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 562 cttataataa ttggcttggg agtg 24 <210> 563 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 563 actccagctc ttaaccaatc cacu 24 <210> 564 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 564 gtggattggt taagagctgg agtu 24 <210> 565 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 565 cacctcctct gctttgctct gcca 24 <210> 566 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 566 ggcagagcaa agcagaggag gtgg 24 <210> 567 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 567 gggggcagag gagctccccc tccc 24 <210> 568 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 568 ggagggggag ctcctctgcc cccc 24 <210> 569 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 569 tcgccatgtc tagcagcgac ccgg 24 <210> 570 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 570 cgggtcgctg ctagacatgg cgag 24 <210> 571 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 571 gcgcgtcgtc gttctcggtt cgcc 24 <210> 572 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 572 gcgaaccgag aacgacgacg cgcg 24 <210> 573 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 573 ggcgacgagt gggcccggcc cgag 24 <210> 574 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 574 tcgggccggg cccactcgtc gccg 24 <210> 575 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 575 atctgccgtc tcccgcccac cagc 24 <210> 576 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 576 ctggtgggcg ggagacggca gatg 24 <210> 577 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 577 agccgggcaa ccggaagcag caga 24 <210> 578 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 578 ctgctgcttc cggttgcccg gcta 24 <210> 579 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 579 cctgctcctg ctggccgcag cagc 24 <210> 580 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 580 ctgctgcggc cagcaggagc aggg 24 <210> 581 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 581 cgcctactac atctgccggt ggcg 24 <210> 582 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 582 gccaccggca gatgtagtag gcgu 24 <210> 583 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 583 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tatttaaaga tgaaaatgga aagg 24 <210> 593 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 593 acaatttttt tttgggctaa aatg 24 <210> 594 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 594 attttagccc aaaaaaaaat tgtg 24 <210> 595 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 595 tggtggagtt atgaccacat attg 24 <210> 596 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 596 aatatgtggt cataactcca ccau 24 <210> 597 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 597 agtgctcaaa aggagagtct actg 24 <210> 598 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 598 agtagactct ccttttgagc actu 24 <210> 599 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 599 ccaccacaag tactatgcaa caaa 24 <210> 600 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 600 ttgttgcata gtacttgtgg tgga 24 <210> 601 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 601 aagaaaatgg aaacttttct ctcu 24 <210> 602 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 602 gagagaaaag tttccatttt cttg 24 <210> 603 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 603 cactagctgt ttacatggtg agca 24 <210> 604 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 604 gctcaccatg taaacagcta gtga 24 <210> 605 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 605 agaaatactt agtatatatc tata 24 <210> 606 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 606 atagatatat actaagtatt tcta 24 <210> 607 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 607 acttttcatt ctgtaattct ttaa 24 <210> 608 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 608 taaagaatta cagaatgaaa agtg 24 <210> 609 <211> 24 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 614 tggattcaag aaagttcccc aatu 24 <210> 615 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 615 catttgaagt tttcttgaaa caaa 24 <210> 616 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 616 ttgtttcaag aaaacttcaa atgg 24 <210> 617 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 617 cattaccctg ttggaaaaag atgg 24 <210> 618 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 618 catctttttc caacagggta atga 24 <210> 619 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 619 tactttgttg aaaaccccaa ataa 24 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 624 ggtactagct ttaacagcaa aacc 24 <210> 625 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 625 ggttctagga agttttgtga aacu 24 <210> 626 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 626 gtttcacaaa acttcctaga acca 24 <210> 627 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 627 tgggtagaag tgtttgtgtt aagg 24 <210> 628 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 628 cttaacacaa acacttctac ccaa 24 <210> 629 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 629 tagtagtagt gctcttttag agcu 24 <210> 630 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 630 gctctaaaag agcactacta ctac 24 <210> 631 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 631 gtacctgaga ccaaaaagga gaau 24 <210> 632 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 632 ttctcctttt tggtctcagg taca 24 <210> 633 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 633 ttgattttga gcttcctatg tatg 24 <210> 634 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 634 atacatagga 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 645 ttgttagatt gtctagatgc tacc 24 <210> 646 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 646 gtagcatcta gacaatctaa caag 24 <210> 647 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 647 ggtctggtgc agcagtgtac attg 24 <210> 648 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 648 aatgtacact gctgcaccag acca 24 <210> 649 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 649 tgataatacg gctaaagatc ttca 24 <210> 650 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 661 attcaggcaa cggtggtgct cgau 24 <210> 662 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 662 tcgagcacca ccgttgcctg aata 24 <210> 663 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 663 caactggctt ctctagatct cttg 24 <210> 664 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 664 aagagatcta gagaagccag ttgc 24 <210> 665 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 665 tcaaaaacct cccacctacc gcgu 24 <210> 666 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of 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Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 671 tcaaaaacct cccacctacc gcgu 24 <210> 672 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 672 cgcggtaggt gggaggtttt tgaa 24 <210> 673 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 673 tcaaaaacct cccacctacc gcgu 24 <210> 674 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 674 cgcggtaggt gggaggtttt tgaa 24

Claims (90)

  1. 하기를 포함하는 인공 핵산 구축물이며:
    (a) 2' 또는 3' 위치에서 변형된 리보스, 또는 2' 또는 3' 위치에서 변형된 데옥시리보스, 또는 이들의 조합물; 및
    (b) 말단 오버행,
    여기서,
    인공 핵산 구축물은 이중 가닥이고;
    인공 핵산 구축물의 적어도 1개의 가닥은 독립적으로 적어도 약 10 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 또는 이들의 조합물을 포함하고;
    유기체와 접촉할 때, 인공 핵산 구축물의 적어도 일부분은 유기체의 핵산 서열에서 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 적어도 하나의 염기의 후성적 변형을 용이하게 하도록 구성되는 것인 인공 핵산 구축물.
  2. 제1항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 임의의 퓨린 또는 피리미딘 염기에 후성적 변형을 포함하지 않는 것인 인공 핵산 구축물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 적어도 부분적으로 DNA 메틸트랜스퍼라제, 그의 생물학적으로 활성인 단편, 또는 그의 유도체를 포함하는 시스템을 통해 후성적 변형을 용이하게 하는 것인 인공 핵산 구축물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 적어도 부분적으로 DNA 아세틸트랜스퍼라제, 그의 생물학적으로 활성인 단편, 또는 그의 유도체를 포함하는 시스템을 통해 후성적 변형을 용이하게 하는 것인 인공 핵산 구축물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 시스템이 RNA 지시된 DNA 메틸화 경로의 적어도 하나의 성분의 적어도 일부분을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  6. 제5항에 있어서, 적어도 하나의 성분이 단백질 또는 그의 일부분을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  7. 제6항에 있어서, 단백질 또는 그의 일부분이 효소 또는 그의 일부분인 인공 핵산 구축물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 CRISPR, CRISPR-연관된 단백질 (Cas), 그의 생물학적으로 활성인 단편, 그의 유도체, 그의 융합 단백질, 또는 이들의 임의의 조합물의 부재하에 후성적 변형을 용이하게 할 수 있는 것인 인공 핵산 구축물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 Cas의 부재하에 후성적 변형을 용이하게 할 수 있는 것인 인공 핵산 구축물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 당의 총 개수에 기초하여 인공 핵산 구축물의 당의 적어도 약 80%가 각각 독립적으로 데옥시리보스, 변형된 데옥시리보스, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 당의 총 개수에 기초하여 인공 핵산 구축물의 당의 약 20% 미만이 각각 독립적으로 리보스, 변형된 리보스, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 RNA 또는 DNA: 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 이들의 조합물에 의해 적어도 부분적으로 코딩되는 것인 인공 핵산 구축물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 또는 이들의 조합물의 적어도 약 80%가 DNA인 인공 핵산 구축물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물의 말단 뉴클레오티드 또는 말단 뉴클레오시드가 RNA: 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드, 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열에서 다중 뉴클레오티드가 동일한 후성적 변형을 갖는 것인 인공 핵산 구축물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열에서 적어도 10-12개의 뉴클레오티드가 동일한 후성적 변형을 갖는 것인 인공 핵산 구축물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 적어도 약 100개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 CpG 섬을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 리보스 또는 변형된 데옥시리보스가 인공 핵산 구축물의 말단 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 있는 것인 인공 핵산 구축물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 리보스 또는 변형된 데옥시리보스가 2'-O-R 기를 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  21. 제20항에 있어서, R 기가 알킬, 아릴, 할로알킬, 아미노, 메틸, 아세틸, 및 할로로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 인공 핵산 구축물.
  22. 제21항에 있어서, R 기가 메틸인 인공 핵산 구축물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 퓨린 또는 피리미딘 염기 중 적어도 하나에서 변형을 추가로 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 복수개의 변형을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 인공 핵산 구축물의 안정성을 증가시키는 것인 인공 핵산 구축물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 유기체에 의한 인공 핵산 구축물의 흡수를 증가시키는 것인 인공 핵산 구축물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 실질적으로 인공 핵산 구축물의 3' 말단에 위치하는 것인 인공 핵산 구축물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 실질적으로 인공 핵산 구축물의 5' 말단에 위치하는 것인 인공 핵산 구축물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 메틸 기, 메톡시 기, 에스테르 기, 플루오로 기, 포스포르티오에이트 백본, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 말단 오버행이 3' 말단 오버행인 인공 핵산 구축물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 2개의 3' 말단 오버행을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물의 적어도 1개의 가닥이 독립적으로 약 20 내지 약 30개 길이의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 적어도 1개의 데옥시리보핵산을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 적어도 1개의 리보핵산을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 그의 5' 말단에서 인산화되지 않은 적어도 1개의 가닥을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 유기체가 식물, 종자, 과일, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 고세균, 박테리아, 진균, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 원생생물, 조류, 선충, 이들의 임의의 일부분, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 서열식별번호: 1-62 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 서열식별번호: 63-194 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 서열식별번호: 195-404 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 서열식별번호: 405-584 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 서열식별번호: 585-684 중 하나 이상에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성 또는 그의 적어도 10개의 연속 염기를 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물이 인공 핵산 구축물의 백본에 위치한 펩티드 핵산, 모르폴리노, 잠금 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 후성적 변형이 핵 RNA 폴리머라제 D1 (NRPD1), NRPE1, NRPD2/NRPE2, NRPD4/NRPE4, NRPE5, NRPE9B, NRPB1, RNA-의존성 RNA 폴리머라제 2 (RDR2), 다이서-유사 3 (DCL3), HUA 인핸서 1 (HEN1), 아르고노트 4 (AGO4), AGO6, AGO9, 클래시 1 (CLSY1), RNA-지시된 DNA 메틸화 결함 1 (DRD1), 분열조직 침묵 결함 3 (DMS3), RNA-지시된 DNA 메틸화 1 (RDM1), KOW 도메인-함유 전사 인자 1 (KTF1), 데노보 관련 2 (IDN2), IDN2 직렬상동체1 (IDP1), IDP2, DMS4, 도메인 재배열된 메틸트랜스퍼라제 2 (DRM2), SUVH2, SUVH9, SUVR2, 마이크로키디아 1 (MORC1), MORC6, 사와디 호메오도메인 상동체 1 (SHH1), 히스톤 데아세틸라제 6 (HDA6), 주몬지 14 (JMJ14), 리신-특이적 히스톤 데메틸라제 1 (LDL1), LDL2, 유비퀴틴-특이적 프로테아제 26 (UBP26), RDR2-비의존성 DNA 메틸화에 필요 (NERD), 크로모메틸라제 2 (CMT2), CMT3, 메틸트랜스퍼라제 1 (MET1), SUVH4, 감소된 DNA 메틸화 1 (DDM1), 그의 생물학적으로 활성인 단편, 그와 연관된 조절 요소, 그와 연관된 인트론, 또는 이들의 임의의 조합물 중 1개 이상의 단백질을 적어도 부분적으로 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 포함된 것인 인공 핵산 구축물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 후성적 변형이 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편에 의해 촉매되는 것인 인공 핵산 구축물.
  45. 제44항에 있어서, 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편이 유기체에 대해 내인성인 인공 핵산 구축물.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편이 TET 패밀리 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편이 메틸트랜스퍼라제 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  48. 제47항에 있어서, 메틸트랜스퍼라제가 크로모메틸트랜스퍼라제 (CMT), 도메인 재배열된 메틸트랜스퍼라제 (DRM), 또는 이들의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 후성적 변형이 적어도 하나의 염기에 화학적 기를 부가하는 것인 인공 핵산 구축물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 후성적 변형이 적어도 하나의 염기에 메틸 기를 부가하고, 메틸 기가 메톡시, 포르밀 또는 카르복실 기, 또는 카르복실산으로 산화되는 것인 인공 핵산 구축물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 염기가 시토신인 인공 핵산 구축물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 후성적 변형이 메틸 기, 히드록시메틸 기, 포르밀 기, 카르복실 기, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  53. 제52항에 있어서, 후성적 변형이 메틸 기를 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 전사 조절 영역을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 가닥 인공 핵산 구축물의 가닥이 전사 조절 영역의 일부분에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%; 또는 약 100% 서열 동일성을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  56. 제54항에 있어서, 전사 조절 영역이 적어도 약 30% 구아닌 시토신 (GC) 함량을 포함하는 것인 인공 핵산 구축물.
  57. 적어도 약 2-100개의 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물의 복수체.
  58. 적어도 약 2-50개의 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물의 복수체.
  59. 적어도 약 2-20개의 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물의 복수체.
  60. 제57항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 핵산 구축물의 개수의 적어도 약 10% 내지 약 100%가 복수체에서 상이한 것인 복수체.
  61. 제60항에 있어서, 복수체에서 각각의 인공 핵산 구축물이 상이한 것인 복수체.
  62. 인공 핵산 구축물에 2' 또는 3' 위치에서 변형된 리보스, 또는 2' 또는 3' 위치에서 변형된 데옥시리보스, 또는 이들의 조합물을 포함하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 부가하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물을 제조하는 방법.
  63. 인공 핵산 구축물의 2' 또는 3' 위치에서 리보스, 데옥시리보스, 또는 이들의 조합물을 변형시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물을 제조하는 방법.
  64. 2개 이상의 인공 핵산 구축물을 혼합하는 것을 포함하는, 제57항 내지 61항 중 어느 한 항의 복수체를 제조하는 방법.
  65. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물 또는 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체를 포함하는 단리된 세포.
  66. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물 또는 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체를 포함하는 단리된 진핵생물 세포.
  67. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물 또는 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체를 포함하는 식물, 종자, 용액, 미생물, 비료, 또는 토양.
  68. (a) 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물 및 (b) 유기체의 핵산 서열에서 적어도 하나의 염기의 후성적 변형을 수행하는 효소 또는 그의 촉매적으로 또는 생물학적으로 활성인 단편을 포함하는 조성물.
  69. 하나 이상의 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물 또는 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물.
  70. (a) 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물, 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체, 또는 제68항 또는 제69항의 조성물; 및 (b) 토양, 비료, 종자, 식물, 액체, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하는 용기를 포함하는 키트.
  71. (a) 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물, 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체, 또는 제68항 또는 제69항의 조성물; 및 (b) 부형제를 포함하는 제형.
  72. 제71항에 있어서, 부형제가 농업적으로 허용가능한 부형제인 제형.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 비료 또는 토양을 추가로 포함하는 제형.
  74. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물, 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체, 또는 제68항 또는 제69항의 조성물을 부형제와 접촉시켜 제형을 형성하는 것을 포함하는, 제형을 제조하는 방법.
  75. 조작된 식물 또는 종자의 적어도 하나의 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시키는 유전성 변형을 포함하고, 임의적으로 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물 또는 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체를 포함하는 조작된 식물 또는 종자이며, 유전성 변형이 적어도 하나의 유전자의 전사 조절 영역에서 메틸화된 염기를 포함하고, 유전성 변형이 트랜스진을 포함하지 않는 것인 조작된 식물 또는 종자.
  76. 제75항에 있어서, 2개의 유전자가 침묵된 것인 조작된 식물 또는 종자.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 적어도 하나의 메틸화된 염기가 핵산 서열에서 천연적으로 메틸화되지 않는 것인 조작된 식물 또는 종자.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 전사 조절 영역이 전사 시작 부위, TATA 박스, 및 상류 활성화 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 포함하는 것인 조작된 식물 또는 종자.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 메틸화된 염기가 복수개의 메틸화된 염기를 포함하는 것인 조작된 식물 또는 종자.
  80. 조작된 식물 또는 종자의 적어도 하나의 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시키는 가변성 유전자 발현을 포함하고, 임의적으로 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물 또는 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체를 포함하는 조작된 식물 또는 종자의 복수체.
  81. 제80항에 있어서, 조작된 식물 또는 종자가 그 안의 적어도 하나의 유전자에서 적어도 하나의 변형된 염기를 포함하고, 이는 유전자에서 천연적으로 메틸화되지 않는 것인 조작된 식물 또는 종자의 복수체.
  82. 제81항에 있어서, 염기가 알킬, 아릴, 할로알킬, 아미노, 메틸, 아세틸, 할로, 또는 이들의 조합물로 변형된 것인 조작된 식물 또는 종자의 복수체.
  83. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 식물 또는 종자가 그 안의 적어도 하나의 유전자에서 적어도 하나의 메틸화된 염기를 포함하는 것인 조작된 식물 또는 종자의 복수체.
  84. 물질을 농업 대상에 적용하는 것을 포함하는 방법이며, 농업 대상은 종자, 식물, 식물의 구성성분, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함하고, 물질은 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 인공 핵산 구축물 또는 제57항 내지 제61항 중 어느 한 항의 복수체를 포함하는 것인 방법.
  85. 제80항에 있어서, 농업 대상에서 유전자를 적어도 부분적으로 침묵시키거나 또는 활성화시키는 방법.
  86. 제85항에 있어서, 유전자가 적어도 1 또는 2번의 생식 주기 동안 적어도 부분적으로 침묵되는 것인 방법.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 농업 대상을 인공 핵산 구축물을 포함하는 물질을 적용하지 않은 대등한 농업 대상과 비교할 때, 적용이 다음 중 하나 이상을 일으키는 것인 방법: (a) 농업 대상의 효소적 갈변을 예방하거나 또는 감소시키거나 또는 지연시키고; (b) 농업 대상의 성장률, 수율 또는 수명을 증가시키고; (c) 농업 대상의 성장률, 수율 또는 수명을 감소시키고; (d) 농업 대상의 해충 내성, 염 저항성, 열 저항성, 중금속 저항성, 질환 저항성, 또는 가뭄 내성을 증가시키고; (e) 농업 대상에 의해 제조된 분자의 양 또는 생성을 증가시키거나 또는 적어도 부분적으로 감소시키고; (f) 농업 대상의 적어도 일부분의 색상을 변경시키고; (g) 농업 대상의 개화율을 증가시키거나 또는 적어도 부분적으로 감소시키고; (h) 농업 대상의 부피 또는 중량을 증가시키고; (i) 농업 대상의 식용 생성물의 향 또는 질감을 개선시키고; (j) 농업 생성물의 보관 수명을 증가시키고; (k) 농업 생성물의 종자의 수 및 크기를 감소시키고; (j) 농업 대상의 영양분 함량을 증가시킴.
  88. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 농업 대상이 식물배인 방법.
  89. 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 농업 대상이 대두, 옥수수, 벼, 토마토, 알팔파, 밀, 감자, 및 녹조류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  90. 제80항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 물질이 액체, 토양, 미생물, 비료, 또는 제초제인 방법.
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