KR20210137775A

KR20210137775A - 항염, 항산화 내지 콜라겐 증식 효능을 가진 헵타펩타이드 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR20210137775A
Application number: KR1020200056056A
Authority: KR
Inventors: 김종민; 김선명; 김대영
Original assignee: 웰펩 주식회사
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2021-11-18
Also published as: KR102483429B1

Abstract

본 발명은 신규한 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 독성이 없고 항염, 항산화 내지 주름 개선 효능을 가진 Fmoc-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-Gly-His-Lys의 아미노산 서열을 갖는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 이를 유효성분으로 포함하여 주름 개선, 노화 방지 및 피부 진정의 효과를 갖는 조성물을 개시한다.

Description

항염, 항산화 내지 콜라겐 증식 효능을 가진 헵타펩타이드 및 이를 포함하는 조성물{Heptapeptide having Anti-inflammatory, Antioxidant or Collagen proliferation efficacy and Composition comprising the same}

본 발명은 항염, 항산화, 콜라겐 증식 효능을 가진 헵타펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

펩타이드는 바이오의 핵심소재로 단백질의 기능적 최소 단위이며, 아미노산이 2개로부터 50개 이하로 구성된다. 적은 양으로 우수한 효능을 보일 뿐만 아니라 독성이 없어 의약품, 식품 및 화장품의 주요 원료로 많이 활용되고 있다. 특히 인체에 안전하고 효과가 좋은 펩타이드 화장품 소재는 날로 사용량이 늘어날 뿐만 아니라 새로운 소재의 개발은 수입대체 효과 등 당 산업에서 매우 중요하다고 할 수 있다.

화장품 원료로 사용하는 펩타이드의 효능은 주로 콜라겐 증식, 미백 및 항염등의 효능을 단독으로 가지는 소재가 주를 이루고 있으며 비교적 고가 소재이기 때문에 사용량에 제한이 있는 실정이다. 이러한 항산화, 항염, 콜라겐 증식 등 다양한 효능을 하나의 펩타이드를 통해 발현할 수 있을 뿐만 아니라 비교적 짧은 서열로 구성되어 대량 생산을 통해 상업화가 가능하다면 관련 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

관련하여 국내특허 10-2007079호에는 [Cys-Val-Val-Tyr-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Asp-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Phe-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Ser-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Leu-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Lys-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Asn-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Pro-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Gly-Gln]₂, [Cys-Val-Val-Thr-Gln]₂, [Val-Val-Gln-Gln-Cys]₂, [Val-Val-Trp-Gln-Cys]₂, [Val-Val-Ser-Gln-Cys]₂, [Val-Val-Glu-Gln-Cys]₂, [Val-Val-Asn-Gln-Cys]₂, [Val-Val-His-Gln-Cys]₂, [Val-Val-Ala-Gln-Cys]₂, [Val-Val-Ile-Gln-Cys]₂, [Val-Val-Asp-Gln-Cys]₂, [Val-Val-Thr-Gln-Cys]₂ 등의 콜라겐 합성 촉진용 펩타이드와 이를 포함하는 피부주름 예방 및 개선용 조성물을 개시하고 있다.

또한 국내특허 10-1719355호에는 항산화 활성, 콜라겐 생산 증가 및 염증 억제 활성을 갖는 펩타이드와 관련하여 Glu-Ser-Ser-Glu-Lys-Trp-Ile-Cys-Gly, Thr-Glu-Trp-Thr-Ala-Ser-Lys-Ser-Gly 또는 Arg-Ala-Leu-Leu-Val-Asn-Ser-Ser의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 개시하였다.

또한 국내특허 10-1744594호에는 Gly-Ser-Gly-Ala 아미산노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 비오틴(biotin)-Gly-Ser-Gly-Ala를 함유하는 피부주름 개선 또는 피부탄력 개선용 피부 외용제 조성물 및 화장료 조성물을 개시하고 있으며, 이는 피부 노화, 피부 산화 또는 염증을 억제하는 것으로도 기재하고 있다.

또한 국내특허 공개 10-2016-0129119호에는 항산화, 콜라겐 생합성 촉진능을 가지는 복합체를 기재하고 있는데, 구체적으로는 GHK 아미산노산 서열을 가지는 트리펩타이드의 N-말단에 커큐민이 링커 화합물을 통하여 결합되고, GHK 트리펩타이드 C말단은 아세트아마이드인 커큐민-트리펩타이드 복합체와 이를 포함하는 피부주름 개선용 화장료 조성물을 기재하고 있다.

본 발명의 하나의 목적은 항염, 항산화 또는 콜라겐 합성 증진 효과를 갖는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 하나의 목적은 항염, 항산화 또는 콜라겐 합성 증진 효과를 갖는 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 하나의 목적은 주름 개선 및 피부 진정용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 하나의 목적은 주름 개선 및 피부 진정용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되며, Fmoc-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-Gly-His-Lys의 아미노산 서열을 갖는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일례에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 염은 염산 (Hydrochloric acid), 황산 (Sulfuric acid), 질산 (Nitric acid), 인산 (Phosphoric acid), 브롬산 (Bromic acid), 과염소산 (Perchloric acid), 퓨마르산 (Fumaric acid), 말레산 (Maleic acid), 락트산 (Lactic acid), 살리실산 (Salicylic acid), 숙신산 (Succinic acid), p-톨루엔술폰산 (p-Toluenesulfonic acid), 메탄술폰산 (Methanesulfonic acid), 포름산 (Formic acid), 타르타르산 (Tartaric acid), 시트르산 (Citric acid), 아세트산 (Acetic acid), 삼불화아세트산 (Trifluoroacetic acid), 트리클로로아세트산 (Trichloroacetic acid), 벤젠술폰산 (Benzenesulfonic acid), 2-나프틸술폰산 (2-Naphthylsulfonic acid), 벤조산 (Benzoic acid), 말론산 (Malonic acid), 모노클로로아세트산 (Monochloroacetic acid) 및 디클로로아세트산 (Dichloroacetic acid) 중에서 선택된 산의 염(acid salt); 및 나트륨 및 마그네슘으로부터 선택된 알카리금속염 및 탄소수 1 내지 10인 알킬(Alkyl) 또는 아릴 (Aryl) 암모늄염 중에서 선택된 적어도 1종의 것일 수 있다.

구체적인 일례에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 염은 아세트산 (Acetic acid)의 염일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일례에 있어서, 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 항산화 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일례에 있어서, 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 항염 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일례에 있어서, 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 콜라겐 증식 활성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일례는 상기 일례들에 의한 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직한 일례에 의한 조성물은, 주름 개선, 피부 노화 방지 및 피부 진정 중에서 선택된 적어도 1종의 효과를 갖는 것일 수 있다.

바람직한 일례에 의한 조성물은, 콜라겐 생합성을 촉진할 수 있다.

본 발명의 일례에 의한 조성물은 화장료 조성물이거나 약학 조성물일 수 있다.

본 발명에 따르면 항염, 항산화 내지 콜라겐 증식 효능을 가지는 신규한 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공할 수 있으며, 이러한 신규한 헵타펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 주름 개선, 피부 노화 방지 및 피부 진정 효과가 우수하며, 인체 적용시 피부 자극 등의 부작용이 없이 본래의 기능을 효과적으로 발휘할 수 있어, 화장품 및 외용 의약품 등의 산업 분야에 매우 유용하며, 또한, 본 발명의 헵타펩타이드가 포함된 화장료 및 약학 조성물은 피부 내에서 콜라겐 생합성을 증대시킴으로써 피부 노화를 억제할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 항염, 항산화 및 콜라겐 증식 효능을 가진 헵타펩타이드를 합성하는 개략적인 공정도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 헵타펩타이드의 항산화 효과를 시험한 결과에 대한 자료이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 헵타펩타이드의 항염 효과를 시험한 결과에 대한 자료이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 헵타펩타이드의 콜라겐 증식 효능을 시험한 결과에 대한 자료이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 헵타펩타이드의 세포 독성을 시험한 결과에 대한 자료이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 헵타펩타이드의 분자량을 측정한 결과(TOF-MS)에 대한 자료이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

화학식 1

GHK(Gly-His-Lys)는 인간 혈장에 약 200ng / mL의 농도로 존재하는 아미노산이 3개로 구성된 펩타이드이며, 상처치유나 피부재생 효과가 있다고 알려져 화장품 소재로 많이 사용되고 있는 펩타이드이다.

또한 콩에는 금속을 잘 킬레이션하여 제거할 수 있는 "Phytochelatins"이라고 불리우는 단백질이 존재함이 알려져 있는데 이는 (γ-Glu-Cys)n-Gly의 구조를 가진 단백질이며, 다양한 생리활성 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Plant Physiol. Vol. 123, July 2000, 825-832).

이와 같은 펩타이드의 구조를 기반으로 다양한 종류의 신규 펩타이드의 설계가 가능하며, 또한 구조를 기반으로 다양한 종류의 효능 기대가 가능한 바, 본 발명자들은 신규한 펩타이드를 설계하고 제조하여 그 효능을 확인한 결과 항염, 항산화 및 콜라겐 증식 등 다양한 효능을 나타냄을 알아내어, 본 발명을 완성하게 되었다.

이와 같은 항염, 항산화 및 콜라겐 증식 효능을 가지는 펩타이드는 상기 화학식 1로 표시되는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다.

본 발명의 신규한 헵타펩타이드에 있어서 약학적으로 허용되는 염은 무기산, 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 염산 (Hydrochloric acid), 황산 (Sulfuric acid), 질산 (Nitric acid), 인산 (Phosphoric acid), 브롬산 (Bromic acid), 과염소산 (Perchloric acid), 퓨마르산 (Fumaric acid), 말레산 (Maleic acid), 락트산 (Lactic acid), 살리실산 (Salicylic acid), 숙신산 (Succinic acid), p-톨루엔술폰산 (p-Toluenesulfonic acid), 메탄술폰산 (Methanesulfonic acid), 포름산 (Formic acid), 타르타르산 (Tartaric acid), 시트르산 (Citric acid), 아세트산 (Acetic acid), 삼불화아세트산 (Trifluoroacetic acid), 트리클로로아세트산 (Trichloroacetic acid), 벤젠술폰산 (Benzenesulfonic acid), 2-나프틸술폰산 (2-Naphthylsulfonic acid), 벤조산 (Benzoic acid), 말론산 (Malonic acid), 모노클로로아세트산(Monochloroacetic acid), 디클로로아세트산 (Dichloroacetic acid) 중에서 선택된 산염(acid salt) 일 수 있으며, 염기로부터 유도된 염은 나트륨(Sodium) 또는 마그네슘 등의 알카리 금속염, 및 탄소수 1-10개인 알킬 (Alkyl) 또는 아릴 (Aryl) 암모늄염 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 신규한 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 합성하는 방법은 한정이 있는 것은 아니며, 당 업계에 알려진 기술을 사용하여 제조할 수 있음은 물론이다.

대표적인 합성방법을 아래에 설명하고 있으나, 본 발명이 이러한 예에 제한되는 것은 아니며, 당 업계에 알려진 기술의 범위 내에서 당 업자가 적절히 변형하여 사용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 고체지지체에 Fmoc-Lys(Boc)-OH를 결합하여 화학식 2로 표시되는 Fmoc-Lys(Boc)-O-Resin(2-Chlototrityl)을 얻는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 수득한 레진에 각각의 아미노산(Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-γ-Glu-OtBu 등)을 순차적으로 결합하여 화학식 3으로 표시되는 보호기를 가진 레진에 결합된 펩타이드를 얻는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 수득한 보호화된 펩타이드가 결합된 레진으로부터 탈 보호화 공정을 거쳐 화학식 4로 표시되는 탈보호화된 비정제 헵타펩타이드(crude heptapeptide)의 삼불화아세트산염을 수득하는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서 수득한 비정제된 헵타펩타이드(crude heptapeptide)의 삼불화 아세트산염을 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)로 정제하여 다음 화학식 5로 표시되는 정제된 헵타펩타이드(purified heptapeptide)의 삼불화 아세트산염을 얻는 단계; 및 (e) 상기 단계 (d)에서 수득한 정제된 헵타펩타이드의 삼불화아세트산염을 염치환 및 동결건조 공정을 거쳐 화학식 6으로 표시되는 헵타펩타이드의 염(일례로 아세트산염 등)을 얻는 단계를 포함하는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 펩타이드는 고체상 합성법으로 합성하는 것이 바람직할 수 있다.

상기 화학식 2 내지 3에서 R₁은 당 업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 아민 보호기일 수 있다. 상기 아민 보호기는 아세트아미노메틸 (Acetaminomethyl)기, 벤질옥시카보닐 (Benzyloxycarbonyl)기, 터트-부틸옥시카르보닐 (tert-Butyloxycarbonyl)기, 아세틸 (acetyl)기, 벤조일 (Benzoyl)기, 파라-니트로벤조일 (para-Nitrobenzoyl)기, 파라-메톡시벤조일기 (para-Methoxybenzoyl) 등을 예시할 수 있으며, 벤질옥시카보닐 (Benzyloxycarbonyl)기 또는 터트-부틸옥시카르보닐 (tert-Butyloxycarbonyl)기가 바람직하고, 터트-부틸옥시카르보닐 (tert-Butyloxycarbonyl)기인 것이 가장 바람직하지만 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 화학식 2 내지 3에서 R₂는 당 업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 방향족 아민 보호기일 수 있다. 상기 아민 보호기는 메톡시메틸 (Methoxymethyl)기, 벤질옥시메틸 (Benzyloxymethyl)기, 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기, 터트-부틸디메틸실릴 (tert-Butyldimethylsilyl)기, 트리페닐실릴 (Triphenylsilyl)기, 트리이소프로필실릴 (Triisopropylsilyl)기, 파라-메톡시벤질 (para-Methyloxybenzyl)기, 테트라히드로피란 (Tetrahydropyran)기, 테트라히드로퓨란 (Tetrahydrofuran)기, 터트-부틸 (tert-Butyl)기, 디페닐메틸 (Diphenylmethyl)기, 2-클로로트리틸 (2-Chlorotrityl)기, 벤질 (Benzyl)기, 4-메톡시벤질 (4-Methoxybenzyl)기, 알릴 (Allyl)기, 터트-부틸옥시카르보닐 (tert-Butyloxycarbonyl)기, 아세틸 (Acetyl)기, 벤조일 (Benzoyl)기 등을 들 수 있으며, 2-클로로트리틸 (2-Chlorotrityl)기, 메톡시메틸 (Methoxymethyl)기, 벤질옥시메틸 (Benzyloxymethyl)기, 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기, 터트-부틸디메틸실릴 (tert-Butyldimethylsilyl)기, 트리페닐실릴 (Triphenylsilyl)기 또는 트리이소프로필실릴 (Triisopropylsilyl)기인 것이 바람직하고, 2-클로로트리틸 (2-Chlorotrityl)기 또는 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기인 것이 보다 바람직하며, 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기인 것이 가장 바람직하지만 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 화학식 2 내지 3에서 R₃은 당 업계에서 통상적으로 이용하는 티올 보호기일 수 있다. 상기 티올 보호기는 메톡시메틸 (Methoxymethyl)기, 벤질옥시메틸 (Benzyloxymethyl)기, 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기, 터트-부틸디메틸실릴 (tert-Butyldimethylsilyl)기, 트리페닐실릴 (Triphenylsilyl)기, 트리이소프로필실릴 (Triisopropylsilyl)기, 파라-메톡시벤질 (para-Methyloxybenzyl)기, 테트라히드로피란 (Tetrahydropyran)기, 테트라히드로퓨란 (Tetrahydrofuran)기, 터트-부틸 (tert-Butyl)기, 디페닐메틸 (Diphenylmethyl)기, 2-클로로트리틸 (2-Chlorotrityl)기, 벤질 (Benzyl)기, 4-메톡시벤질 (4-Methoxybenzyl)기, 알릴 (Allyl)기, 터트-부틸옥시카르보닐 (tert-Butyloxycarbonyl)기, 아세틸 (Acetyl)기, 벤조일 (Benzoyl)기 등을 예시할 수 있으며, 메톡시메틸 (Methoxymethyl)기, 벤질옥시메틸 (Benzyloxymethyl)기, 2-클로로트리틸 (2-Chlorotrityl)기, 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기, 터트-부틸디메틸실릴 (tert-Butyldimethylsilyl)기, 트리페닐실릴 (Triphenylsilyl)기 또는 트리이소프로필실릴 (Triisopropylsilyl)기인 것이 바람직할 수 있고, 2-클로로트리틸 (2-Chlorotrityl)기 또는 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기인 것이 보다 바람직하며, 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기인 것이 가장 바람직하지만 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 화학식 2 내지 3에서 R₄은 당 업계에서 통상적으로 이용하는 카르복시산의 수산기 보호기일 수 있다. 상기 카르복시산의 수산기 보호기는 메톡시메틸 (Methoxymethyl)기, 벤질옥시메틸 (Benzyloxymethyl)기, 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기, 터트-부틸디메틸실릴 (tert-Butyldimethylsilyl)기, 트리페닐실릴 (Triphenylsilyl)기, 트리이소프로필실릴 (Triisopropylsilyl)기, 파라-메톡시벤질 (para-Methyloxybenzyl)기, 테트라히드로피란 (Tetrahydropyran)기, 테트라히드로퓨란 (Tetrahydrofuran)기, 터트-부틸 (tert-Butyl)기, 디페닐메틸 (Diphenylmethyl)기, 2-클로로트리틸 (2-Chlorotrityl)기, 벤질 (Benzyl)기, 4-메톡시벤질 (4-Methoxybenzyl)기, 알릴 (Allyl)기, 터트-부틸옥시카르보닐 (tert-Butyloxycarbonyl)기, 아세틸 (Acetyl)기, 벤조일 (Benzoyl)기 등을 예시할 수 있으며, 메톡시메틸 (Methoxymethyl)기, 벤질옥시메틸 (Benzyloxymethyl)기, 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기, 터트-부틸디메틸실릴 (tert-Butyldimethylsilyl)기, 트리페닐실릴 (Triphenylsilyl)기 또는 트리이소프로필실릴 (Triisopropylsilyl)기인 것이 바람직하고, 터트-부틸 (tert-Butyl)기 또는 트리페닐메틸 (Triphenylmethyl)기인 것이 보다 바람직하며, 터트-부틸 (tert-Butyl)기인 것이 가장 바람직하지만 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 및 이하의 기재에서 작용기에 대한 보호기는 "Protecting Groups in Organic Synthesis (Greene and Wuts, John Wiley & Sons, 1991)"에 상세히 기재되어 있다.

이하, 상기 합성 방법을 도 1의 공정도를 참조하여 단계별로 좀 더 상세히 설명한다.

고체상 펩타이드 합성방법은;

(1) 레진을 Swelling하고 첫 번째 아미노산인 보호화된 아미노산을 레진에 붙이는 단계;

(2) 아미노산 보호기(N-말단의 아미노기)를 염기로 처리하여 제거하고 레진을 세척하는 단계;

(3) 시약과 함께 보호화된 아미노산을 세척된 레진에 반응하여 결합하는 단계;

(4) 상기 (2) 및 (3)의 단계를 반복하여 정해진 서열대로 합성하는 단계;

(5) 레진 및 구성 아미노산들의 보호기를 동시에 제거하는 단계;

(6) 펩타이드를 고체화하여 얻은 다음 정제하는 단계; 및

(7) 정제된 펩타이드를 염 치환하고 동결건조하여 펩타이드를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

단계 (1)에 있어서, 사용할 수 있는 레진으로는 2-클로로트리틸클로라이드 레진 (2-Chlorotritylchloride Resin), 왕 레진 (Wang Resin), 디에이치피피 레진 (DHPP Resin, 4-(1',1'-dimethyl-1'-hydroxypropyl)phenoxyacetyl alanyl aminomethyl polystyrene), 피디디엠 레진 (PDDM Resin, Diphenyldiazomethane Resin), 사스린 레진 (SASRIN Resin, 2-Methoxy-4-alkoxybenzyl alcohol Resin)으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 것을 들 수 있다.

단계 (1)에 있어서, 사용되는 용매로는 디클로로메탄 (Dichloromethane), N,N-디메틸포름아마이드 (N,N-Dimethylformamide), N,N-디메틸아세트아마이드 (N,N-Dimethylacetamide), N-메틸피롤리돈 (N-Methylpyrrolidone), 디메틸설폭시드 (Dimethylsulfoxide), 클로로포름 (Chloroform), 1,2-디클로로에탄 (1,2-Dichloroethane), 테트라히드로퓨란 (Tetrahydrofurane), 1,4-디옥산 (1,4-Dioxane), 메탄올 (Methanol), 에탄올 (Ethanol), 이소프로판올 (Isopropanol), 에틸렌 글리콜 (Ethylene glycol), 메틸 아세테이트 (Methyl acetate), 에틸 아세테이트 (Ethyl acetate) 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 것을 들 수 있다.

단계 (2)에 있어서, 사용되는 보호기를 제거하는 염기로는 피페리딘 (Piperidine), 피롤리딘 (Pyrrolidine), 피페라진 (Piperazine), 하이드라진 하이드레이트(Hydrazine hydrate), DBU, 4-메틸피페리딘 (4-Methylpiperidine), 1-메틸-3-부틸이미다졸리윰 테트라플로오로보란 (1-methyl-3-butyl imidazolium BF4), 에탄올아민 (Ethanolamine), 시클로헥실아민 (Cyclohexylamine), 트리스(2-아미노에틸)아민 (Tris(2-aminoethyl)amine), 1,3-디시클로헥산비스-(메틸아민) (1,3-Dicyclohexanebis-(methylamine)), 1,4-비스-(3-아미노프로필)피페라진 (1,4-Bis-(3-aminopropyl)piperazine), 디에틸아민 (Diethylamine), 4-디메틸아미노피리딘 (4-Dimethylaminopyridine) 등의 유기 염기 및 수산화 리튬 (Lithium hydroxide), 수산화 나트륨 (Sodium Hydroxide), 수산화 칼슘 (Calcium Hydroxide), 수산화 칼륨 (Potassium Hydroxide) 등의 무기염기로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 것을 들 수 있다.

단계 (3)에 있어서, 보호화된 아미노산이 결합할 때 사용하는 시약으로는 DCC (N,N-Dicyclohexylcarbodiimide), DIC (N,N-Diisopropylcarbodiimide), BOP (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate), PyBOP (Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate), PyBrOP (Bromo-tripyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate), PyAOP (7-Aza-benzotriazol-1-yloxy-tripyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate), PyOxim (Ethyl cyano(hydooxyimino)acetato-O2)-tri-(1-pyrrolidinyl)-phosphonium hexafluorophosphate), HBTU (O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate), HCTU (2-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N',-tetramethylaminium hexafluorophosphate), HDMC (N-[(5-chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-dimethylamino-morpholino]-uronium hexafluorophosphate N-oxide), TBTU (O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborate), HATU (2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphatemethanaminium), TATU (2-(1H-7-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumtetrafluoroboratemethanaminium), CDI (carbonyldiimidazole), COMU (1-[1-(Cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene-aminooxy)-dimethylamino-morpholino]-uronium hexafluorophosphate), TOTT (2-(1-Oxy-pyridin-2-yl)-1,1,3,3-tetramethyl-isothiouronium tetrafluoroborate), EDC·Cl (N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiimide hydrochloride), TFFH (Tetramethylfluoroformamidinium hexafluorophosphate), EEDQ (N-Ethoxycarbony-2-ethoxy-1,2-dihydro-quinoline), T3P (2-Propanephosphonic acid anhydride), DEPBT (3-(Diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one), Oxyma (Ethyl cyanohydroxyiminoacetate), HOBt (1-Hydroxybenzotriazole), HOOBt(HODhbt, Hydroxy-3,4-dihydro-4-ox-1,2,3-benzo-triazine), BTC (bis-Trichloromethylcarbonate or Triphosgene), CDI (1,1'-Carbonyldiimidazole), 6-ClHOBt (1-Hydroxy-6-chloro-benzotriazole), HOAt (1-Hydroxyazabenzotriazole), HOSu (N-Hydroxysuccinimide) 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 것을 들 수 있다.

단계 (5)에 있어서, 레진 및 아미노산의 보호기를 동시에 제거하는 과정은 산성 용액의 존재 하에서 수행할 수 있다. 상기 산성 용액은 TFA/phenol/water/TIPS (88/5/5/2), TFA/phenol/water/thioanisole/EDT (82.5/5/5/5/2.5), TFA/phenol/water/thioanisole/1-decanethiol (82.5/5/5/5/2.5), TFA/DTT/water/TIPS (88/5/5/2), TFA/phenol (95/5), TFA/phenol/Methanesulfonic acid (95/2.5/2.5), TFA/thioanisole/EDT/anisole (90/5/3/2), TFA/TES (95/5), TFA/water (95/5), TFA/DCM/indole (70/28/2), TFA/TIPS/water (95/2.5/2.5) 등의 용액을 예시할 수 있다.

단계 (6)에 있어서, Crude 펩타이드를 정제할 때 사용하는 용매로는 메탄올 (Methanol), 에탄올 (Ethanol), 이소프로판올 (Isopropanol), 아세토니트릴 (Acetonitrile) 및 정제수의 혼합용액이며, 이때 사용하는 산으로는 삼불화아세트산 (Trifluoroacetic acid), 아세트산 (Acetic acid), 포름산 (Formic acid)을 0.1% 내지 5% 이내로 사용하여 정제할 수 있다.

단계 (7)에 있어서, 펩타이드 염치환시 사용하는 buffer 또는 염기로는 암모니아수 (Ammonium hydroxide), 암모늄아세테이트 (Ammonium acetate), 피리딘 (Pyridine), N,N-디이소프로필에틸아민 (N,N-Diisopropylethylamine), 트리에틸아민 (Triethylamine), 디에틸아민 (Diethylamine) 등으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 것을 들 수 있다.

본 발명에 따른 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 피부 섬유아세포 (fibroblast)에 대한 세포 독성과 같은 부작용이 없으며 (도 5 결과 참조), 피부 섬유아세포에서 강력한 콜라겐 생합성 촉진능력 (도 4 결과 참조)을 보여준다.

또한, 본 발명에 따른 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 MTT Assay를 통한 항염증 시험결과 (도 3 결과 참조), 강력한 항염증 효과가 있음을 보여준다.

또한, 본 발명에 따른 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 아스코르빅산 (Ascorbic acid, Vitamin C) 과의 비교를 통한 항산화 효과를 시험한 결과(도 2 결과 참조), 강력한 항산화 효과가 있음을 보여준다.

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 주름 개선 및 피부 노화 방지, 피부 진정을 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 주름 개선, 피부 노화 및 피부 진정을 위한 조성물은 용도 및 소망하는 효과에 따라서 화장료 조성물 또는 약학적 조성물을 모두 포함할 수 있다.

바람직한 양태로서 본 발명은 본 발명의 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 주름 개선, 피부 노화 및 피부 진정용 화장료 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

주름 개선, 피부 노화 및 피부 진정을 위한 화장료 및 약학적 조성물로 사용하는 경우, 상기 조성물을 피부, 두피 등에 사용할 수 있고, 피부 노화 방지, 주름 개선 및 피부 진정 효과를 위하여 사용할 수 있다.

본 발명의 주름 개선, 피부 노화 및 피부 진정을 위한 조성물을 포함하는 헵타펩타이드의 함량은 용도, 적용 형태, 사용 목적 및 소망하는 효과에 따라서 적절히 조절 가능하며, 함량 대비 효과를 고려하여, 예컨대 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 99.9 중량% 이내에서 사용할 수 있다.

본 발명의 주름 개선, 피부 노화 및 피부 진정을 위한 조성물은 경구 및 비경구로 투여할 수 있으며, 경구, 경피, 피하, 정맥투여가 가능하며, 또한 경피 부여와 도포에 의한 국부 투여 (Topical application) 방식으로 적용될 수 있다.

상기 조성물은 피부 및 두피에 경피적으로 적용되고, 기초 화장품, 가슴 및 둔부 전용 크림, 메이크업 화장품, 바디 제품, 면도용 제품, 모발 제품 등을 포함한 모든 화장품 제품의 제조에 사용 가능한 조성물을 의미하는 것으로, 경구제, 스프레이, 현탁액, 유액, 크림, 젤, 폼 등의 형태로 제제화된 것일 수 있으나 그 형태에 특별한 제한이 없다.

또한, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양 크림, 마사지크림, 아이크림, 아이 에센스, 에센스, 클렌징크림, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디 크림, 보디 에센스, 보디 세정제, 자외선 차단 크림, 염모제, 샴푸, 린스, 치약, 구강 청정제, 로션, 연고, 젤, 크림, 패치 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것을 포함한다.

또한, 상기 본 발명의 화장료 조성물 및 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상의 제품화 및 제제화에 사용 가능한 모든 종류의 성분, 예컨대 향료, 색소, 살균제, 산화 방지제, 방부제, 보습제, 점증제, 부형제, 희석제, 무기염류 및 합성 고분자 물질 등을 추가로 포함할 수 있으며, 그 종류와 함량은 최종 산물의 용도 및 사용 목적에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 적용되는 형태에 통상적으로 포함되는 용매를 포함하는 것일 수 있으며, 사용 가능한 용매로는 에탄올 (Ethanol), 글리세린 (Glycerin), 부틸렌 글리콜 (Butylene glycol), 올레일알코올 (Oleyl alcohol), 세틸 알코올 (Cetyl alcohol), 스테아릴 알코올 (Stearyl alcohol), 아이소스테아릴 알코올 (Isostearyl alcohol), 이소프로필 미르스테이트 (Isopropyl myristate), 옥틸도데실 미르스테이트 (Octyldodecyl myristate), 프로필렌 글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜 (Polyethylene glycol), 1,2,4-부탄 트리올 (1,2,4-Butanetriol), 소르비톨 에스테르 (Sorbitol ester), 1,2,6-헥산 트리올 (1,2,6-Hexanetriol), 벤질알코올 (Benzyl alcohol), 아이소프로판올 (Isopropanol), 부탄다이올 (Butanediol), 다이에틸렌 글리콜 모노에틸에스테르 (Diethylene glycol monoethylester), 디메틸이소소르비드 (Dimethylisosorbide), 프로필렌카보네이트 (Propylene carbonate), 메틸글루세스-26 (Methyl gluceth-26), 메틸 글루세스-20 (Methyl gluceth-20), 이소세틸 미리스테이트 (Isocetyl myristate), 이소세틸 옥타노에이트 (Isocetyl octanoate), 옥틸 도데칸올 (Octyl dodecanol), 이소스테아릴 이소스테아레이트 (Isostearyl isostearate), 세틸 옥타노에이트 (Cetyl octanoate), 네오펜틸 글리콜 디카프릴레이트 (Neopentyl glycol dicaprylate), 세틸에틸 헥사노에이트 (Cetylethyl hexanoate), 글리세레스-3 (Glycereth-3), 글리세레스-7 (Glycereth-7), 글리세레스-8 (Glycereth-8), 글리세레스-12 (Glycereth-12), 글리세레스-18 (Glycereth-18), 글리세레스-20 (Glycereth-20), 글리세레스-26 (Glycereth-26), 글리세레스-31 (Glycereth-31) 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 이러한 용매를 사용하여 본 발명의 조성물을 제조하는 경우 화합물의 종류에 따라 또는 용매의 혼합비에 따라 용매에 대한 화합물의 용해도가 조금씩 다를 수 있으나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당 업자라면 제품의 특성에 따라 용매의 종류 및 사용량을 알맞게 선택하여 적용할 수 있다.

상기 및 이하의 기재에서 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회 (Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다 (Biochemistry, 11:1726-1732(1972); Pure & Appl. Chem., Vol. 56, No. 5, pp. 595-624, 1984).

본 명세서에서 사용한 보호기 및 아미노산의 약어는 다음과 같다:

AcOH: 아세트 산 (Acetic acid)

NH₄OAc: 암모늄아세테이트 (Ammonium acetate)

Cys: 시스테인 (Cysteine)

DCM: 디클로로메탄 (Dichloromethane)

DMF: N,N-디메틸포름아마이드 (N,N-Dimethylformamide)

DMAc: N,N-디메틸아세트아마이드 (N,N-Dimethylacetamide)

DMSO: 디메틸설폭시드 (Dimethylsulfoxide)

DTT: 디티올쓰레이톨 (Dithiolthreitol)

EDT: 1,2-에탄디티올 (1,2-Ethanedithiol)

Gly: 글라이신 (Glycine)

γ-Glu: 감마-글루타믹 산 (γ-Glutamic acid)

His: 히스티딘 (Histidine)

HPLC: 고성능액체크로마토그래피 (High Performance Liquid Chromatography)

Lys: 라이신 (Lysine)

Boc: 터트-부틸옥시카르보닐기 (tert-Butyloxycarbonyl)

OtBu: O-터트-부틸(O-tert-Butyl)

t-Bu: 터트-부틸 (tert-Butyl)

Fmoc: 9-플루오레닐옥시카보닐 (9-Fluorenyloxycarbonyl)

Trt: 트리페닐메틸 (또는 트리틸) (Triphenylmethyl or Trityl)

Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸-디히드로벤조퓨란-5-설포닐 (2,2,4,6,7-Pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl)

Pmc: 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl)

Mtr: 4-메톡시-2,3,6-트리메틸페닐-설포닐 (4-Methoxy-2,3,6-trimethylphenyl-sulfonyl)

Tos: 파라-톨루엔설포닐 (para-Toluenesulfonyl)

TES: 트라이에틸실란 (Triethylsilane)

TFA: 트라이플루오로아세틱 엑시드 (Trifluoroacetic acid)

TIPS: 트리이소프로필실란 (Triisopropylsilane)

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예>

본 명세서 전체에 거쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 한 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1 : H-Lys(Boc)-O-Resin(2-Chlorotrityl)의 제조

여과막이 장착된 고체상 (solid-phase) 합성 반응기에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진 (치환율 = 1.41 mmol/g의 레진, 200 mmole) 및 디클로로메탄 (1000 ml, 이하 DCM)를 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. Fmoc-Lys(Boc)-OH (분자량 = 468.5 g/mol) (140.55 g, 300 mmol, 4.0 당량)이 포함된 DCM (1000 ml)을 넣고, 이어서 DIPEA (분자량 = 129.25 g/mol) (96.94 g, 750 mmol, 2.5 당량)를 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진에 DCM : 메탄올 : DIPEA = 17 : 2 : 1 (1000 ml)을 넣고 20분간 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 동일하게 1회 더 처리하였다. 레진을 DMF 1000 ml으로 2회 세척한 후, 20% 피페리딘/DMF 용액 1000 ml를 더하고 15분 동안 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 동일하게 1회 더 처리하였다. DMF 1000 ml으로 총 6회 레진을 세척하여 상기 화학식 7로 표시되는 H-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)을 수득하였다 (치환율: 0.48 mmol/g, 수율 >98%).

실시예 2 : H-His(Trt)-Lys(Boc)-O-Resin(2-Chlorotrityl)의 제조

H-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)(100 mmole)이 들어있는 반응기에 Fmoc-His(Trt)-OH (분자량 = 619.7 g/mol, 185.91 g, 300 mmole)과 HOBt (분자량 = 135.12 g/mol, 44.6 g, 330 mmole)을 DMF 1000 ml에 용해한 다음 투입하였다. 혼합된 반응액에 DIC (분자량 = 126.2 g/mol, 41.7 g, 330 mmole)을 적가한 다음 상온에서 5시간 동안 서서히 교반하였다. 레진을 DMF 1000 ml으로 2회 세척한 후, 20% 피페리딘/DMF 용액 1000 ml를 더하고 15분 동안 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 동일하게 1회 더 처리하였다. DMF 1000 ml으로 총 6회 레진을 세척하여 상기 화학식 8로 표시되는 H-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)을 수득하였다 (수율 >98%).

실시예 3 : H-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-Resin(2-Chlorotrityl)의 제조

H-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)(100 mmole)이 들어있는 반응기에 Fmoc-Gly-OH (분자량 = 297.3 g/mol, 89.19 g, 300 mmole)과 HOBt (분자량 = 135.12 g/mol, 44.6 g, 330 mmole)을 DMF 1000 ml에 용해한 다음 투입하였다. 혼합된 반응액에 DIC (분자량 = 126.2 g/mol, 41.7 g, 330 mmole)을 적가한 다음 상온에서 5시간 동안 서서히 교반시켰다. 레진을 DMF 1000 ml으로 2회 세척한 후, 20% 피페리딘/DMF 용액 1000 ml를 더하고 15분 동안 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 동일하게 1회 더 처리하였다. DMF 1000 ml으로 총 6회 레진을 세척하여 상기 화학식 9로 표시되는 H-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)을 수득하였다 (수율 >98%).

실시예 4 : H-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-Resin(2-Chlorotrityl)의 제조

H-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)(100 mmole)이 들어있는 반응기에 Fmoc-Cys(Trt)-OH (분자량 = 585.7 g/mol, 175.71 g, 300 mmole)과 HOBt (분자량 = 135.12 g/mol, 44.6 g, 330 mmole)을 DMF 1000 ml에 용해한 다음 투입하였다. 혼합된 반응액에 DIC (분자량 = 126.2 g/mol, 41.7 g, 330 mmole)을 적가한 다음 상온에서 5시간 동안 서서히 교반시켰다. 레진을 DMF 1000 ml으로 2회 세척한 후, 20% 피페리딘/DMF 용액 1000 ml를 더하고 15분 동안 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 동일하게 1회 더 처리하였다. DMF 1000 ml으로 총 6회 레진을 세척하여 상기 화학식 10으로 표시되는 H-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)을 수득하였다 (수율 >98%).

실시예 5 : H-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-Resin (2-Chlorotrityl)의 제조

H-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)(100 mmole)이 들어있는 반응기에 Fmoc-γ-Glu-(OtBu) (분자량 = 425.5 g/mol, 127.65 g, 300 mmole)과 HOBt (분자량 = 135.12 g/mol, 44.6 g, 330 mmole)을 DMF 1000 ml에 용해한 다음 투입하였다. 혼합된 반응액에 DIC (분자량 = 126.2 g/mol, 41.7 g, 330 mmole)을 적가한 다음 상온에서 5시간 동안 서서히 교반시켰다. 레진을 DMF 1000 ml으로 2회 세척한 후, 20% 피페리딘/DMF 용액 1000 ml를 더하고 15분 동안 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 동일하게 1회 더 처리하였다. DMF 1000 ml으로 총 6회 레진을 세척하여 상기 화학식 11로 표시되는 H-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)을 수득하였다 (수율 >98%).

실시예 6 : H-Cys(Trt)-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-Resin(2-Chlorotrityl)의 제조

H-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)(100 mmole)이 들어있는 반응기에 Fmoc-Cys(Trt)-OH (분자량 = 585.7 g/mol, 175.71 g, 300 mmole)과 HOBt (분자량 = 135.12 g/mol, 44.6 g, 330 mmole)을 DMF 1000 ml에 용해한 다음 투입하였다. 혼합된 반응액에 DIC (분자량 = 126.2 g/mol, 41.7 g, 330 mmole)을 적가한 다음 상온에서 5시간 동안 서서히 교반시켰다. 레진을 DMF 1000 ml으로 2회 세척한 후, 20% 피페리딘/DMF 용액 1000 ml를 더하고 15분 동안 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고, 레진을 동일하게 1회 더 처리한다. DMF 1000 ml으로 총 6회 레진을 세척하여 상기 화학식 12로 표시되는 H-Cys(Trt)-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)을 수득하였다 (수율 >98%).

실시예 7 : Fmoc-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-Resin (2-Chlorotrityl)의 제조

H-Cys(Trt)-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)(100 mmole)이 들어있는 반응기에 Fmoc-γ-Glu-(OtBu) (분자량 = 425.5 g/mol, 127.65 g, 300 mmole)과 HOBt (분자량 = 135.12 g/mol, 44.6 g, 330 mmole)을 DMF 1000 ml에 용해한 다음 투입하였다. 혼합된 반응액에 DIC (분자량 = 126.2 g/mol, 41.7 g, 330 mmole)을 적가한 다음 상온에서 5시간 동안 서서히 교반시켰다. 레진을 DMF 1000 ml으로 총 3회 레진을 세척하여 상기 화학식 13으로 표시되는 Fmoc-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)을 수득하였다 (수율 >98%).

실시예 8 : Crude Fmoc-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-Gly-His-Lys-OH·FA salt의 제조

화학식 4

Fmoc-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-γ-Glu-(OtBu)-Cys(Trt)-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-O-레진(2-클로로트리틸)을 반응기에 투입하고 냉각된 TFA/TIPS/phenol/water (92.5/2.5/2.5/2.5) 용액 3 L를 서서히 부어 넣은 다음 상온에서 4시간 동안 교반시켰다. 반응액을 받아낸 다음 냉각된 디에틸에테르 12 L에 반응액을 서서히 적가하여 펩타이드를 석출시켰다. 실온에서 30분 동안 교반한 다음 여과하여 펩타이드를 회수하였다. 최대한 용매를 감압 제거한 다음 진공 건조기에서 5시간 동안 건조시켰다. 그 결과 거의 백색의 화학식 4로 표시되는 Crude Heptapeptide 119.05 g을 수득하였다(분자량 1026.14g/mol, C₄₆H₅₉N₉O₁₄S₂, Crude Heptapeptide 순도 69.8%, 수율 116.0%).

실시예 9 : Purified Fmoc-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-Gly-His-Lys-OH ·FA salt의 제조

화학식 5

상기 실시예 8에서 수득한 Crude Heptapeptide 119.05 g을 정제수에 용해한 다음 0.46μm membrane 여과하였다. 여과액을 산업용 HPLC (220 nm, 10 ml/분, 10 미크론 C18 컬럼에서 20분 내에 0.1% TFA 내 아세토니트릴 초기농도 15%에서 35%로 증가)로 반복 주입한 후 분리 정제하여 상기 화학식 5로 표시되는 정제된 Heptapeptide TFA salt, 78.1 g (수율: 65.6%, 순도: 98.4%)을 수득하였다.

실시예 10 : Fmoc-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-Gly-His-Lys-OH·cOH salt의 제조

정제된 Heptapeptide TFA 염 78.1 g을 정제수 2 L에 용해한 다음 0.46μm membrane 여과하였다. 여과액을 산업용 HPLC(유속 500mL/min, 컬럼 ID 150mm, 컬럼 length 2500mm)에 펌프를 작동시켜 서서히 주입하였다. 제품액을 완전히 주입한 다음 정제수로 30분 동안 세척해 주었다. 100 mM 농도의 초산암모늄 buffer 용액을 조제한 다음 pH를 4.0으로 조정하고 이 액을 컬럼에 1시간 동안 흘려 주었다. 완료 후 정제수로 다시 한 번 30분 동안 흘려주어 세척한 다음 5% 초산 수용액/아세토니트릴 용액으로 제품을 용출시켰다. 용출된 제품액을 감압 농축하여 아세토니트릴을 최대한 농축하여 제거한 후 동결건조하여 상기 화학식 14로 표시되는 Heptapeptide·cOH 염 62.48 g을 수득하였다(수율 80%, 순도 98.3%, TFA 잔량 불검출, AcOH 함량 7.8%; 분자량 측정(TOF-MS, 도 6 참조) 1027.4Da (이론 분자량: 1026.14Da)).

실험예 11 : Heptapeptide의 항산화능 평가 (ABTS 라디칼 소거 활성 평가)

상기 실시예 10으로부터 얻어진 화학식 14로 표시되는 헵타펩타이드의 아세트산염 소재의 항산화 활성평가를 위하여 ABTS (2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)를 Potassium persulfate와 반응시켜 ABTS를 라디칼 상태로 산화시켜, 짙은 청색을 형성시켰다.

이후 항산화 소재와의 반응시키면 색을 잃어 투명해지는 원리를 이용하여 well plate reader 상에서 흡광도를 측정하여 항산화력을 측정하였다.

우선 ABTS와 potassium persulfate를 증류수에 녹여 각각 14 mM과 4.9 mM의 농도로 준비하고 1:1로 혼합하고 알루미늄 호일로 빛을 차단한 상태로 상온에서 12시간 동안 반응시켰다.

해당 용액을 1X PBS로 약 50배 희석하여 흡광광도계로 734 nm에서의 흡광도를 측정했을 때 값이 0.7(ㅁ0.02)이 되도록 하여 ABTS 라디칼 용액을 준비하고, 96 well plate에 여러 농도의 시료 10 μL와 ABTS 라디칼 용액 190μL을 넣고 알루미늄 호일로 차광하여 상온에서 5분간 방치한 후 734 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과는 도 2로 도시한 것과 같이, 본 발명에 따른 헵타펩타이드의 아세트산염은 아스코르빅산 (Ascorbic acid, Vitamin C) 과의 비교를 통한 항산화 효과를 시험한 결과 강력한 항산화 효과가 있음을 보여주었다.

실험예 12 : Heptapeptide의 세포내 콜라겐 단백질 합성능 평가

상기 실시예 10으로부터 얻어진 화학식 14로 표시되는 헵타펩타이드의 아세트산염 소재에 의한 Procollagen 단백질 발현량 분석은 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 기반의 Procollagen Type I C-peptide (PIP) EIA Kit (Takara)을 이용하여 수행하였다.

인간유래 피부각질형성세포주인 HaCaT cell을 6 well plate에 2×10⁵개씩 분주하여 배양하고, 24시간 후 배지를 제거하고 무혈청 배지에서 시료를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.

이후 배양 배지를 원심 분리하여 상등액만 얻어내고 이를 ELISA well-plate에 처리하여 450 nm에서의 흡광도를 측정해 Procollagen을 정량하여, 시료가 처리되지 않은 상태에서 발현된 procollagen의 양을 비교 대조군으로 설정하여 백분율로 나타내었다.

그 결과를 도 4로 도시하였는바, 본 발명에 따른 헵타펩타이드의 아세트산염은 피부 섬유아세포에서 강력한 콜라겐 생합성 촉진능력을 보여주었다.

실험예 13 : Heptapeptide의 항염 활성평가(소재에 의한 iNOS mRNA 발현 억제능 분석)

상기 실시예 10으로부터 얻어진 화학식 14로 표시되는 헵타펩타이드의 아세트산염 소재의 항염 활성을 평가하기 위하여 인간유래 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포주에 LPS (lipopolysaccharides)를 처리하여 유도하는 iNOS의 mRNA 발현량을 RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) 기법을 이용하여 분석하였다. 또한, 이에 LPS에 의해 HaCat 세포주에서 증가된 iNOS가 소재에 의한 억제능을 평가하였다. 우선 HaCaT cell을 6 well plate에 1×10⁵개씩 분주하여 초도배양 하였으며, 24시간 후 배지를 제거하고 시료를 2시간 동안 전처리하고, 여기에 1μg/ml LPS를 처리하여 22시간 배양하였다. 이후 세포를 수거한 후 RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. 그중 1μg의 RNA를 PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara)를 이용하여 cDNA로 합성하였으며, RT-PCR을 통해 cDNA를 증폭시켰다. PCR 반응에 의해 증폭된 DNA는 agarose gel 기반의 전기영동을 통하여 분석하였으며, 얻은 gel 이미지에서 band의 intensity 값을 image J software를 통해 수치한 후 Origin 9.0 소프트웨어를 통하여 그래프화 하였다.

그 결과를 도 3으로 도시하였는바, 본 발명에 따른 헵타펩타이드의 아세트산염은 MTT Assay를 통한 항염증 시험결과 강력한 iNOS mRNA 발현 억제능을 보이는바, 항염증 효과가 우수함을 보여주었다.

실험예 14 : Heptapeptide의 피부세포 안전성 평가

상기 실시예 10으로부터 얻어진 화학식 14로 표시되는 헵타펩타이드의 아세트산염 소재가 가지는 세포 독성을 평가하기 위하여 가장 보편적인 세포 독성 분석기법 중 하나인 MTT assay를 활용하였다.

이는 대사 과정이 온전한 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 청자색을 띠는 비수용성의 MTT formazan 결정으로 환원되는 원리를 가진다. 이를 위하여 인간유래 피부각질형성세포주인 HaCaT 세포를 10% Fetal bovine serum (FBS)과 1% antibiotics가 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배양액에서 37℃, 5% 이산화탄소 조건 하에 배양하였다. 이후 96 well plate에 HaCaT 세포를 1.0×10⁴개씩 분주하여 24시간 동안 배양한 후 시료를 여러 농도로 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 이후 5mg/ml의 MTT를 각 well에 10μL씩 넣고 4시간 동안 배양한 후 multipipet을 이용하여 96 well plate의 배지를 제거하고 DMSO를 200μL씩 넣어 생성된 formazan이 잘 녹을 수 있도록 37℃의 shaking incubator에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 흡광도의 최댓값이 1.0이 넘지 않을 만큼 희석한 다음 흡광광도계를 이용하여 560nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 5로써 나타내었는바, 본 발명에 따른 헵타펩타이드의 아세트산염은 피부 섬유아세포 (fibroblast)에 대한 세포 독성과 같은 부작용이 없음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되며,
Fmoc-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-Gly-His-Lys의 아미노산 서열을 갖는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염;
화학식 1
제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 염은 염산 (Hydrochloric acid), 황산 (Sulfuric acid), 질산 (Nitric acid), 인산 (Phosphoric acid), 브롬산 (Bromic acid), 과염소산 (Perchloric acid), 퓨마르산 (Fumaric acid), 말레산 (Maleic acid), 락트산 (Lactic acid), 살리실산 (Salicylic acid), 숙신산 (Succinic acid), p-톨루엔술폰산 (p-Toluenesulfonic acid), 메탄술폰산 (Methanesulfonic acid), 포름산 (Formic acid), 타르타르산 (Tartaric acid), 시트르산 (Citric acid), 아세트산 (Acetic acid), 삼불화아세트산 (Trifluoroacetic acid), 트리클로로아세트산 (Trichloroacetic acid), 벤젠술폰산 (Benzenesulfonic acid), 2-나프틸술폰산 (2-Naphthylsulfonic acid), 벤조산 (Benzoic acid), 말론산 (Malonic acid), 모노클로로아세트산 (Monochloroacetic acid) 및 디클로로아세트산 (Dichloroacetic acid) 중에서 선택된 산의 염(acid salt); 및 나트륨 및 마그네슘으로부터 선택된 알카리금속염 및 탄소수 1 내지 10인 알킬(Alkyl) 또는 아릴 (Aryl) 암모늄염 중에서 선택된 적어도 1종의 것임을 특징으로 하는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 염은 아세트산 (Acetic acid)의 염인 것임을 특징으로 하는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1 항에 있어서, 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1 항에 있어서, 항염 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1 항에 있어서, 콜라겐 증식 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제 1 항의 헵타펩타이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 주름 개선, 피부 노화 방지 및 피부 진정 중에서 선택된 적어도 1종의 효과를 갖는 것인 조성물.
제 7 항에 있어서, 콜라겐 생합성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 조성물은 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.