KR20210134692A - 나노센서들 및 그것의 사용 - Google Patents

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KR20210134692A
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치민 콴
조셉 윌킨슨
조슈아 에이. 릿치
존 보이스
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나노모자이크 인크.
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Abstract

관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 그리고/또는 그것의 양을 정량화하기 위한 높은 동적 범위 및 감도를 갖는 나노센서가 제공된다. 나노센서를 포함하는 카트리지, 및 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 그리고/또는 그것의 양을 정량화하기 위한 방법 및 시스템이 또한 제공된다.

Description

나노센서들 및 그것의 사용
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 2월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/811,543호, 2019년 2월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/811,559호, 2019년 2월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/811,579호, 및 2019년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 제62/811,041호의 이익 및 그에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 개시내용들이 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 나노 구조 기반 피분석물 검출 및/또는 정량화 시스템에 관한 것이고, 더 구체적으로는, 큰 동적 범위에 걸쳐 높은 감도로 피분석물들의 정량화를 용이하게 하는 나노 구조 기반 피분석물 검출 및/또는 정량화 시스템들에 관한 것이다.
수년에 걸쳐, 피분석물들의 검출 및 정량화는 수많은 질병들 또는 장애들의 진단 및 치료뿐만 아니라, 새로운 요법들 및 치료 양식들의 개발에서 결정적이었다. 웨스턴 블롯(Western blot)들과 같은 블로팅 기반(blotting-based) 기술들, 효소 결합 면역분석법(enzyme linked immunoassay, ELISA)들, 디지털 ELISA들, 마이크로 유체 기반(micro-fluidic-based) ELISA 기술들, 및 자동화된 비드 기반(automated bead-based) 분석법들과 같은 고체 또는 용액 기반 분석법들을 포함하는, 피분석물 검출 및 정량화 시스템들의 개발에서 상당한 진보가 이루어졌다. 그러나, 도전과제들이 남아 있다.
예를 들어, 특정한 피분석물들이 특정한 질병들 또는 장애들에 대한 바이오마커들로서의 역할을 하지만, 그것들의 농도들은 피험자들 간에 또는 심지어 동일한 피험자로부터 채취된 상이한 표본들, 예를 들어, 조직 또는 유체 표본들 간에 상당히 달라질 수 있다. 또한, 특정 체액들 내의 특정 피분석물의 초저농도들을 측정하기 위한 정량화 시스템의 존재는 바이오마커들을 발견하고 검증하는 노력을 특히 방해하였다. 예를 들어, ELISA와 같은 상업적 분석법들의 정량화 범위는 전형적으로 100pg/mL 이상이다. 그러나, 알츠하이머 질병에서, 예를 들어, 질병에 대한 바이오마커들로서 인식된, 아밀로이드 β(Aβ) 단백질 및 타우 단백질과 같은 다양한 단백질이 전형적으로 혈액-뇌-장벽으로 인해 1pg/mL 이하의 레벨로 말초 혈액에(뇌척수액에 비해) 존재한다. 그 결과, 이들 레벨은 표준 ELISA의 검출 한계보다 한 자릿수 또는 두 자릿수 아래이다. 디지털 ELISA 분석법들이 다양한 바이오마커들의 서브-pg/mL 레벨의 정량화를 용이하게 할 수 있지만, 이들 분석법은 전형적으로 저농도 측정에 최적화되고 큰 동적 범위를 갖지 않는다. 다시 말해서, 디지털 ELISA들은 전형적으로 약 3-4 자릿수의 동적 범위를 나타내는 0.01-0.1pg/mL 내지 10-100pg/mL의 농도들을 측정할 수 있다.
유사하게, 단일 클론 항체(monoclonal antibody) 기반 요법들 및 입양 T 세포(adoptive T cell) 치료(예를 들어, CAR-T 요법들)로 관찰된 전신 염증 반응(systemic inflammatory response)인 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome, CRS)이 주요 문제가 되었다. CRS는 치료를 받은 피험자의 사망을 잠재적으로 야기하는 심각한 전신 반응까지 최소 침습 지지적 관리(minimally invasive supportive care)를 필요로 하는 경미한 반응(mild reaction)으로서 존재할 수 있다. 이들 요법 동안 CRS 반응을 모니터링하는 것은 광범위한 바이오마커 농도들, 작은 표본 체적들, 및 긴 분석 시간들을 고려할 때 어려울 수 있다. 현재의 분석적 방법들은 이들 요구를 해결하지 못하여, CAR-T 요법들의 정밀도 및 그것의 부작용들의 효과적인 관리를 제한한다. 최근 생겨난 연구들은, 투여 요법들을 관리하고 조기 개입에 대한 필요를 식별하기 위해 사용될 수 있는, 예측 바이오마커들(C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP) 및 페리틴, 및 다양한 사이토카인들, 예컨대 IFNγ, IL-6, 및 TNFα를 포함함)의 패널을 식별하였다. 그러나, CRP 및 페리틴은 농도가 10ng/mL에서 10mg/mL까지(6 자릿수) 달라질 수 있는 반면, IL-6, 및 IFNγ은 농도가 1pg/mL에서 0.1μg/mL까지(7 자릿수) 달라질 수 있다. 누적하여, 이들 피분석물은 10 자릿수(10 로그)의 동적 범위를 나타내는 농도 범위(1pg/mL 내지 10mg/mL)에 걸쳐 있을 수 있다. 현재, 어떠한 알려진 검출 및 정량화 시스템도 6 이상의 자릿수의 동적 범위를 제공할 수 없고, 빠른 단일 테스트에서, 상이한 피분석물들을 측정하기 위한 그리고 낮은, 중간 또는 높은 등급의 반응들을 구별할 수 있는 더 낮은 검출 한계 및 높은 다중성(multiplexability)이 필요하다.
따라서, 필요한 감도로 큰 동적 범위에 걸쳐 하나 이상의 피분석물의 정량화를 용이하게 하는 검출 및 정량화 시스템에 대한 지속적인 요구가 있다.
본 발명은 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한 그리고/또는 큰 동적 범위에 걸쳐 높은 감도로 그것의 양을 정량화하기 위한 센서, 하나 이상의 그러한 센서를 포함하는 카트리지, 검출 시스템, 및 그러한 센서, 카트리지 및 시스템을 이용하여 표본 내의 피분석물의 양을 정량화하는 방법들을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 센서를 제공한다. 상기 센서는 제1 영역 및 제2 영역을 포함한다. 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함한다. 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고, 상기 센서는 상기 제1 농도 범위 및 상기 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 양을 정량화할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 센서를 제공한다. 상기 센서는 제1 영역 및 제2 영역을 포함한다. 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 광학적으로 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 하나 이상의 분자를 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다. 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 검출에 의해 결정되고, 상기 센서는 상기 제1 농도 범위 및 상기 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 양을 정량화할 수 있다.
전술한 양태들 각각에서, 상기 제1 농도 범위는 상기 제2 농도 범위보다 더 낮은 검출 가능한 값을 갖고/갖거나 상기 제2 농도 범위는 상기 제1 농도 범위보다 더 높은 검출 가능한 값을 갖는다. 상기 제1 농도 범위가 상기 제2 농도 범위와 겹칠 수 있는 것이 고려된다.
다른 양태에서, 본 발명은 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 센서를 제공한다. 상기 센서는 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하는 제1 영역을 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 광학적으로 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다.
전술한 양태들 각각에서, 상기 센서의 제1 영역은: (i) 적어도 1μm의 인접 나노 구조들의 중심간 간격; (ii) 적어도 10nm의 각각의 나노 구조의 최소 단면 치수 또는 직경; (iii) 200nm 이하의 각각의 나노 구조의 최대 단면 치수 또는 직경; 또는 (iv) 50nm 내지 1000nm 범위의 각각의 나노 구조의 높이 중 하나 이상을 포함한다. 상기 센서는 옵션으로 (i) 기준 마커 또는 (ii) 나노 구조 제조 제어 피처 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 센서를 제공한다. 상기 센서는 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하는 제1 영역을 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제1 영역 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정된다. 상기 제1 영역은: (i) 적어도 1μm의 인접 나노 구조들의 중심간 간격; (ii) 적어도 100nm의 각각의 나노 구조의 최소 단면 치수 또는 직경; (iii) 300nm 이하의 각각의 나노 구조의 최대 단면 치수 또는 직경; 또는 (iv) 50nm 내지 1,000nm 범위의 각각의 나노 구조의 높이 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 센서는 옵션으로 (i) 기준 마커 또는 (ii) 나노 구조 제조 제어 피처 중 하나 이상을 포함하는 제2 영역을 추가로 포함한다.
본 발명의 전술한 양태들 중 임의의 양태의 센서는 다음의 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 상기 센서는 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제3 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 추가의 상이한 나노 구조들의 제3 시리즈를 포함하는 제3 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 센서는 상기 제1, 제2 및/또는 제3 농도 범위들에 걸쳐 상기 표본 내의 상기 피분석물의 양을 정량화할 수 있는 것이 고려된다. 상기 센서는 추가적인 농도 범위들에서 피분석물을 검출 및/또는 정량화하도록 동작하는 나노 구조들의 추가적인 시리즈를 또한 포함할 수 있는 것이 또한 고려된다.
유사하게, 임의의 제2 시리즈 내의 나노 구조들은, 상기 제1 시리즈 내의 나노 구조들보다 큰, (i) 평균 높이, (ii) 평균 체적, (iii) 평균 표면적, (iv) 평균 질량, 및 (v) 평균 피분석물 결합 부위의 수 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 센서가 제3 시리즈를 포함할 때마다, 상기 제3 시리즈의 나노 구조들은, 임의의 제2 시리즈 내의 나노 구조들보다 큰, (i) 평균 높이, (ii) 평균 체적, (iii) 평균 표면적, (iv) 평균 질량, 및 (v) 평균 피분석물 결합 부위의 수 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 제1 시리즈, 그리고 적용가능한 경우, 상기 제2 및 제3 시리즈(및 다른 추가적인 시리즈) 내의 나노 구조들은 상기 피분석물을 결합하는 결합제, 예를 들어, 상기 피분석물을 결합하는 생물학적 결합제로 관능화된다. 상기 생물학적 결합제는, 예를 들어, 항체, 앱타머, 리간드-수용체 쌍의 멤버, 효소, 또는 핵산일 수 있다. 특정 상황들 하에서, 제2, 제3 또는 후속 시리즈에서의 결합제보다 상기 피분석물에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 결합제를 상기 제1 시리즈에서 사용하는 것이 유리할 수 있다.
상기 센서는 표본에서 임의의 관심 피분석물을 검출 및/또는 정량화하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 상기 피분석물은 생물학적 분자, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 당펩티드, 지질, 지단백질, 핵산, 또는 핵단백질일 수 있다. 또한, 주어진 센서 내의 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈는 복수의 상이한 피분석물을 동시에 또는 순차적으로 결합, 검출 및/또는 정량화하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기 센서는 센서 상의 동일한 웰에서 동시에, 다수의 피분석물의 다중 분석을 용이하게 하기 위해 테스트 표본 내의 대응하는 복수의 상이한 피분석물을 검출하기 위한 복수의 상이한 결합제를 포함할 수 있다.
전술한 센서들 중 임의의 것이 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 자릿수(또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 로그)에 걸쳐 있는 농도 범위(동적 범위라고도 지칭됨)에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 농도를 검출할 수 있어, 관심 표본 내의 피분석물들을 희석 또는 농축시킬 필요를 피할 수 있는 것이 이해된다. 특정 실시예들에서, 상기 센서는 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9 자릿수(또는 5, 6, 7, 8 또는 9 로그)에 걸쳐 있는 범위에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 농도를 검출할 수 있다. 상기 센서는 주어진 피분석물의 농도를 1pg/mL 미만 내지 100ng/mL 초과, 0.1pg/mL 미만 내지 1μg/mL 초과, 0.01pg/mL 미만 내지 100μg/mL 초과, 1fg/mL 미만 내지 0.1mg/mL 초과, 또는 0.1fg/mL 미만 내지 1mg/mL 초과의 범위에서 측정하도록 구성될 수 있고, 여기서, 예를 들어, 상기 표본은 상기 센서에 적용되기 전에 희석될 필요가 없다.
상기 센서는 다양한 표본들, 예를 들어, 체액, 조직 추출물(tissue extract), 및/또는 세포 상청액(cell supernatant)에서 상기 피분석물을 검출할 수 있다. 예시적인 체액들은, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 또는 간질액을 포함한다.
상기 센서는 나노 구조들의 적어도 하나의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성(예를 들어, 색, 광 산란, 굴절, 또는 공명(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 전기 공명, 전자기 공명, 및 자기 공명))의 변화를 통해 피분석물의 결합을 검출하도록 구성될 수 있다.
상기 센서들이 다양한 상이한 방식들로 구성될 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 나노 구조들의 상기 제1, 제2 또는 제3 시리즈 중 적어도 하나가 어레이를 포함할 수 있다. 대안적으로, 나노 구조들의 상기 제1, 제2 및 제3 시리즈 각각이 어레이를 포함할 수 있다. 상기 센서는 나노 구조들의 단일 시리즈 또는 나노 구조들의 복수의 시리즈, 예를 들어, 상이한 농도 범위들 내에서 피분석물을 검출하도록 동작하는 나노 구조들의 복수의 시리즈를 포함할 수 있는 것이 고려된다. 상기 센서가 나노 구조들의 복수의 시리즈를 포함할 때, 나노 구조들의 상이한 시리즈는 (i) 동일한 방식으로(예를 들어, 단일 나노 구조들이 검출 및/또는 정량화되는 디지털 검출에 의해, 또는 농도의 함수로서 주어진 시리즈 내의 나노 구조들의 광학적 특성의 실질적으로 균일한 변화가 검출되는 아날로그 검출에 의해) 또는 (ii) 상이한 방식으로, 예를 들어 디지털 검출과 아날로그 검출의 조합에 의해 동작할 수 있다. 또한, 상기 센서는 디지털 검출 및/또는 아날로그 검출에 의해 동작하는 복수의 상이한 시리즈를 포함할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 상기 센서는 동일한 농도 범위 내에서 디지털 검출에 의해 피분석물을 검출하도록 동작하는 복수의 시리즈 및/또는 상이한 농도 범위들에 걸쳐 아날로그 검출에 의해 피분석물을 검출하도록 동작하는 복수의 시리즈를 포함할 수 있다.
예를 들어, 디지털 검출 동안에는, 나노 구조들의 상기 제1 시리즈에서, 피분석물의 단일 분자 또는 상기 피분석물의 미리 결정된 수 미만의 분자들을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 개별 나노 구조들이 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 존재한다면, 상기 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다. 예를 들어, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 예를 들어, (i) 피분석물을 결합하지 않은 개별 나노 구조들의 나머지 수 또는 (ii) 상기 제1 시리즈 내의 나노 구조들의 총수에 대해 상기 피분석물을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수를 디지털 카운팅하는 것에 의해 결정된다.
유사하게, 피분석물의 농도는, 상기 제2 범위 또는 상기 제3 범위 내에 있다면, 예를 들어, (i) 피분석물을 결합하지 않은 적절한 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 나머지 수 또는 (ii) 대응하는 제2 및/또는 제3 시리즈 내의 나노 구조들의 총수에 대해 상기 피분석물을 결합한 상기 제2 및/또는 제3 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수를 디지털 카운팅하는 것에 의해 결정될 수 있다. 다시 말해서, 상기 제1 농도 범위, 상기 제2 농도 범위, 및 옵션의 제3(또는 그 이상의) 농도 범위 모두에 걸친 표본 내의 피분석물의 농도는 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈, 상기 제2 시리즈, 및/또는 옵션의 제3(또는 그 이상의) 시리즈 각각 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다. 상기 센서는 또한 주어진 분석법에 대해 원하는 동적 범위 및/또는 감도에 따라 추가적인 시리즈(예를 들어, 4, 5, 6 시리즈 등)의 나노 구조들을 추가로 포함하는 것이 고려된다.
대안적으로 또는 추가로, 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 또는 옵션의 제3 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 및/또는 상기 제3 영역 내의 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화는 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 내의 상기 제2 시리즈 및/또는 상기 제3 영역 내의 옵션의 제3 시리즈에 의해 생성된 색 변화일 수 있다. 다시 말해서, 상기 제2 농도 범위 및 옵션의 제3(또는 그 이상의) 농도 범위(들) 모두에 걸친 표본 내의 피분석물의 농도는 상기 제2 영역 및/또는 상기 제3 영역 각각 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정된다. 상기 센서는 또한 주어진 분석법에 대해 원하는 동적 범위 및/또는 감도에 따라 추가적인 시리즈(예를 들어, 4, 5, 6 시리즈 등)의 나노 구조들을 추가로 포함하는 것이 고려된다.
주어진 시리즈 내의 나노 구조들은 표면이 평면인 및/또는 표면이 곡면인 나노 구조들일 수 있는 것이 고려된다. 상기 나노 구조들은 평면 지지체 및/또는 가요성 기판 상에 배치될 수 있고, 여기서 상기 나노 구조들은 상기 평면 지지체 및/또는 상기 가요성 기판과 일체일 수 있다. 상기 나노 구조들은 반도전성 재료(예를 들어, 실리콘) 또는 금속으로 제조될 수 있다.
상기 센서는 기준 마커, 예를 들어, 명시야 현미경 및/또는 암시야 현미경에 의해 광학적으로 검출 가능한 기준 마커를 추가로 포함할 수 있는 것이 고려된다. 상기 기준 마커는 검출 시스템에 의한 검출 필드 내의 상기 센서들의 위치를 교정하기 위해 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 카트리지를 제공하고, 상기 카트리지는 전술한 센서들 중 임의의 하나 이상의 센서를 포함하는 적어도 하나의 웰을 정의하는 하우징을 포함한다. 상기 하우징은 복수의 웰을 정의할 수 있고, 각각의 웰은 전술한 센서들 중 임의의 하나 이상의 센서를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 (a) 전술한 센서들 중 임의의 하나 이상의 센서 또는 전술한 카트리지들 중 임의의 하나 이상의 카트리지를 수용하기 위한 수용 챔버; (b) 적어도 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈를 조사(interrogating)하기 위한 에너지 원(예를 들어, 조명하기 위한 광원); (c) 적어도 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈에서의 특성(예를 들어, 광학적 특성)의 변화를 검출하기 위한 검출기; 및 옵션으로 (d) 상기 제1 농도 범위와 임의의 제2 농도 범위 사이의 인터페이스 및 옵션으로 임의의 제2 농도 범위와 옵션으로 임의의 제3 농도 범위 사이의 인터페이스를 식별하는 컴퓨터 알고리즘을 구현하는 컴퓨터 프로세서를 포함한다.
광학적 검출 시스템의 경우, 알고리즘이 디지털 검출과 아날로그 검출 간에 농도 곡선을 전이할지를 결정할 때, 상기 알고리즘은: (a) 테스트될 용액의 도포 시 상기 제1 시리즈 내의 상기 나노 구조들에 대해 하나의 상태에서 다른 상태로 변화한(뒤집힌) 나노 구조들을 측정하는 단계; (b) 테스트될 용액의 도포 시 상기 제2 시리즈 내의 나노 구조들의 색 공간 변화들을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 제2 시리즈의 색 공간 변화가 미리 선택된 임계 값을 초과하면, 단계 (b)에서 식별된 아날로그 측정치들을 이용하고, 상기 제2 시리즈의 색 공간 변화들이 상기 미리 선택된 임계 값 미만이면, 단계 (a)에서 식별된 디지털 측정치들을 이용하는 단계를 포함하는 것이 고려된다.
다른 양태에서, 본 발명은 관심 표본, 예를 들어, 체액, 조직 추출물, 또는 세포 상청액 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은: (a) 상기 표본의 적어도 일부를 전술한 센서들 중 임의의 하나 이상의 센서에 적용하는 단계; 및 (b) 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈의 특성(예를 들어, 광학적 특성)의 변화를 검출하고 이로써 상기 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 하나 이상의 또는 다음의 특징들을 포함할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 상기 방법은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 로그의 농도 범위, 예를 들어, 적어도 5, 6, 7, 8, 또는 9 로그의 농도 범위로 피분석물을 검출할 수 있다. 상기 센서는 1fg/mL 미만 내지 1mg/mL 초과의 농도 범위에서 피분석물을 검출할 수 있다. 그 결과, 상기 표본은 상기 센서에 적용되기 전에 희석될 필요가 없을 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 관심 표본, 예를 들어, 체액, 조직 추출물, 또는 세포 상청액 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 표본의 일부를 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 센서에 적용하는 단계를 포함한다. 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함한다. 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함한다. 상기 영역들은, 예를 들어, 나노 구조들의 상기 제1 및 제2 시리즈로부터 검출 가능한 신호를 검출하기 위해 전자기 방사선을 이용하여 조사되고, 상기 신호들은 상기 표본 내의 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양을 나타낸다. 그 후 검출 가능한 신호들로부터 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양이 결정되고 이로써 제1 농도 범위 및 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하거나, 그것의 양을 정량화할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 관심 표본, 예를 들어, 체액, 조직 추출물, 또는 세포 상청액 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 표본의 일부를 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 센서에 적용하는 단계를 포함한다. 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 광학적으로 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다. 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정된다. 상기 영역들은, 예를 들어, 나노 구조들의 상기 제1 및 제2 시리즈로부터 검출 가능한 신호를 검출하기 위해 전자기 방사선을 이용하여 조사되고, 상기 신호들은 상기 표본 내의 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양을 나타낸다. 그 후 검출 가능한 신호들로부터 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양이 결정되고 이로써 제1 농도 범위 및 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하거나, 그것의 양을 정량화할 수 있다.
전술한 방법들 각각에서는, 임의의 제2 시리즈 내의 나노 구조들은, 상기 제1 시리즈 내의 나노 구조들보다 큰, (i) 평균 높이, (ii) 평균 체적, (iii) 평균 표면적, (iv) 평균 질량, 및 (v) 평균 피분석물 결합 부위의 수 중 하나 이상을 포함하는 것이 고려된다.
첨부 도면들과 함께 고려될 때 본 발명의 다양한 비제한적인 실시예들에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 본 발명의 다른 이점들 및 신규한 특징들이 명백해질 것이다.
도 1은 종래 기술의 분석법들과 비교하여 본 발명의 실시예에 따른 센서의 동적 범위를 도시하는 개략 예시이다.
도 2a는 관심 센서 내의 나노 구조들의 시리즈의 상이한 포맷들의 개략 표현이다. 도 2b는 초저농도, 저농도, 중간 농도, 및 고농도의 피분석물들을 측정하기 위한 예시적인 센서들의 시리즈를 묘사하는 개략 예시이다.
도 3a 내지 도 3c는 큰 동적 범위에 걸쳐 피분석물을 측정하는 데 있어서 본 발명의 예시적인 센서들의 작동성(operability)을 도시한다. 도 3a는 본 발명의 실시예에 따른, 디지털 및 아날로그(색 시프트) 나노 구조 어레이들 양쪽 모두를 포함하는 센서를 묘사하는 개략 예시이다. 도 3b는 디지털 단일 분자 정량화(좌측 패널) 및 아날로그 정량화(우측 패널)의 조합에 의한 6 로그 동적 범위에 걸친 타우 단백질의 정량화를 묘사하는 그림 표현이다. 도 3c는 피분석물 농도의 함수로서 디지털 센서의 작동성을 묘사하는 이미지이다.
도 4는 도 3b에 예시된 센서에 의해 발생된 예시적인 데이터의 디지털 및 아날로그 측정치들을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른, 디지털 나노 구조들(25,600개)의 시리즈 및 아날로그 나노 구조들의 3개의 시리즈(시리즈 당 1,000개) 양쪽 모두를 포함하는 예시적인 실리콘 웨이퍼 기반 센서의 그림 표현이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른, 디지털 나노 구조들의 복수의 시리즈 및 아날로그 나노 구조들의 3개의 시리즈를 포함하는 다른 예시적인 실리콘 웨이퍼 기반 센서의 그림 표현이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른, 예시적인 나노 구조들의 단면도들을 묘사하는 개략 예시이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른, 2개의 상이한 재료로 구성된 예시적인 나노 구조들의 단면도들을 묘사하는 개략 예시이다.
도 9a 내지 도 9d는 본 발명의 실시예에 따른, 포토레지스트 패터닝, 현상 및 에칭 공정들에 의한 예시적인 나노 구조들의 시리즈의 제조를 예시하는 단면 개략도들의 시리즈이다.
도 10a 내지 도 10g는 본 발명의 실시예에 따른, 기판 상에 층을 퇴적하고, 퇴적된 층 상에 포토레지스트를 스핀 코팅하고, 레지스트를 패터닝 및 현상하고, 레지스트 상에 금속을 증착하고, 용액에서 레지스트를 제거하고, 기판을 에칭하고, 포토레지스트를 제거함으로써 예시적인 나노 구조들의 시리즈를 제조하는 것을 예시하는 단면 개략도들의 시리즈이다.
도 11a 내지 도 11f는 본 발명의 실시예에 따른, 기판 상에 2개의 층을 코팅하고, 상부 층 레지스트를 패터닝하고, 레지스트를 현상하고, 패터닝된 레지스트 상에 재료들을 증착하고, 추가적인 저점도 재료들을 리프트-오프 및 스핀하여 특정 표면 조건을 달성함으로써 예시적인 나노 구조들의 시리즈를 제조하는 것을 예시하는 단면 개략도들의 시리즈이다.
도 12a 내지 도 12f는 본 발명의 실시예에 따른, 산화물 기판 상에 포토레지스트를 패터닝하고, 레지스트를 현상하고, 레지스트 상에 실리콘을 퇴적하고, 리프트-오프하고, 실리콘을 성장시켜 패터닝된 기판 상에 추가적인 구조들을 성장시킴으로써 예시적인 나노 구조들의 시리즈를 제조하는 것을 예시하는 단면 개략도들의 시리즈이다.
도 13a 내지 도 13d는 본 발명의 실시예에 따른, 몰드를 이용한 포토레지스트의 패터닝을 예시하는 단면 개략도들의 시리즈이다.
도 14a는 나노 구조들의 다수의 시리즈를 갖는 실리콘 웨이퍼를 도시하는 개략 예시이고, 도 14b는 본 발명의 실시예에 따른, 나노 구조들의 단일 시리즈의 확대된 이미지를 도시하는 개략 예시이다.
도 15a 및 도 15b는 본 발명의 실시예에 따른 나노 구조들의 시리즈를 포함하는 나노센서 어셈블리(소모성)의 사시도들이다.
도 16a 및 도 16b는 웨이퍼 기판, 개스킷 및 리테이닝 베이스(retaining base)를 포함하는 카트리지 어셈블리의 개략 표현들(도 16a) 및 카트리지 어셈블리의 구성 요소들을 도시하는 분해 사시도(도 16b)이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른, 단일 플렉스 카트리지 및 1,000 플렉스 카트리지의 개략 표현이다.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른, 센서와 함께 사용하기 위한 검출 시스템의 사시도이다.
도 19는 본 발명의 실시예에 따른, 예시적인 센서를 이미징하기 위한 예시적인 광학적 검출 시스템을 묘사하는 개략 예시이다.
도 20은 본 발명의 실시예에 따른 센서의 조사(interrogation)를 묘사하는 개략 예시이다. 판독 신호는 광학적(예를 들어, 이미징), 전기적, 또는 기계적일 수 있다.
도 21은 디지털 나노 구조들을 포함하는 예시적인 센서의 출력의 데이터 분석을 도시하는 개략 표현이다.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른 알고리즘을 예시하는 흐름도이다.
도 23a 및 도 23b는 본 발명의 실시예에 따른, 다수의 피분석물을 동시에 검출 및/또는 정량화하도록 구성된 나노 구조들의 시리즈를 묘사하는 개략 예시들이다.
도 24는 본 발명의 실시예에 따른, 피분석물과 나노 구조 사이의 상호작용을 묘사하는 개략 예시이다.
도 25는 본 발명의 실시예에 따른, 왼쪽에서 오른쪽으로, 1개, 2개 및 5개의 피분석물을 캡처함으로써 나노 구조의 결합 용량을 묘사하는 개략 표현이다.
도 26은 본 발명의 실시예에 따른, 피분석물을 캡처할 수 있는 나노 구조들의 수보다 적은 수의 피분석물이 존재하는 비-포화 분석법을 묘사하는 개략 예시이다.
도 27은 본 발명의 실시예에 따른, 피분석물들이 어레이 내의 나노 구조들의 일부에 의해 결합되는 비-포화 분석법 조건 하의 어레이 내의 나노 구조들의 시리즈를 묘사하는 개략 예시이다.
도 28은 예시적인 무표지(label-free) 면역분석법을 묘사하는 개략 표현이다.
도 29는 예시적인 표지 기반(label-based) 면역분석법을 묘사하는 개략 표현이다.
도 30은 본 발명의 실시예에 따른, 항원을 결합하는 한 쌍의 항체들(Ab1 및 Ab2)을 이용하여 피분석물(항원)의 존재 및/또는 그것의 양을 결정하기 위한 예시적인 입자 기반 분석법의 개략 예시로서, 활성화된 나노 구조에 의한 (Ab2) 항체 캡처를 통한 검출 전에 용액에서 결합이 발생한다.
도 31은 본 발명의 실시예에 따른, 항원을 결합하는 한 쌍의 항체들(Ab1 및 Ab2)을 이용하여 피분석물(항원)의 존재 및/또는 그것의 양을 결정하기 위한 예시적인 입자 기반 분석법의 개략 예시로서, 활성화된 나노 구조에 의한 (Ab2) 항체 캡처를 통한 검출 전에 용액에서 결합이 발생한다.
도 32는 본 발명의 실시예에 따른, 항원을 결합하는 한 쌍의 항체들(Ab1 및 Ab2)을 이용하여 피분석물(항원)의 존재 및/또는 그것의 양을 결정하기 위한 예시적인 입자 기반 분석법의 개략 예시로서, 활성화된 나노 구조에 의한 효소(HRP) 캡처를 통한 검출 전에 용액에서 결합이 발생한다.
도 33은 본 발명의 실시예에 따른, 항원을 결합하는 한 쌍의 항체들(Ab1 및 Ab2)을 이용하여 피분석물(항원)의 존재 및/또는 그것의 양을 결정하기 위한 예시적인 입자 기반 분석법의 개략 예시로서, 상보적 올리고뉴클레오티드로 관능화된 나노 구조에 의한 올리고뉴클레오티드 캡처를 통한 검출 전에 용액에서 결합이 발생한다.
도 34a 내지 도 34c는 예시적인 다중 분석법에서 사용하기 위한 시약들을 묘사하는 개략 예시들이다.
도 35는 타우 단백질의 다양한 농도들에서의 디지털 어레이 내의 나노 구조들의 암시야 이미지들의 그림 표현이다.
도 36은 도 35의 센서에서의 양성률 대 타우 단백질의 농도를 예시하는 그래프로서, 1ng/mL을 초과하는 농도들에서는 센서의 디지털 어레이가 포화된다.
도 37은 타우 단백질의 다양한 농도들에서의 센서의 아날로그 어레이 내의 나노 구조들의 어레이에 의해 생성된 델타 색조(delta hue)의 히스토그램이다.
도 38은 도 35에 도시된 센서의 아날로그 대응물의 타우 농도의 함수로서의 평균 델타 색조의 그래프로서, 1ng/mL 아래에서는 센서가 농도 변화를 검출하지 않는다.
도 39는 본 발명의 예시적인 센서를 이용한 IL-6의 검출 및 정량화를 보여주는 그래프이다.
도 40a, 도 40b, 및 도 40c는 본 발명의 예시적인 센서들을 이용한 혈장 내의 IL-6(도 40a), 혈장 내의 TNF(도 40b), 및 세포 배양 배지(cell culture medium) 내의 C 반응성 단백질(C reactive protein)(도 40c)의 검출을 보여주는 그래프들이다.
본 발명은 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한 그리고/또는 큰 동적 범위에 걸쳐 높은 감도로 그것의 양을 정량화하기 위한 센서, 그러한 센서를 포함하는 카트리지, 검출 시스템, 및 그러한 센서, 카트리지 및 시스템을 이용하여 표본 내의 피분석물의 양을 검출 및/또는 정량화하는 방법들을 생성하는 것이 가능하다는 발견에 부분적으로 기초한다.
도 1은 0.01pg/mL(10fg/mL) 미만과 1μg/mL 이상 사이의 농도 범위(적어도 8 로그) 내에서 표본 내의 피분석물들을 검출할 수 있는 본 발명의 센서로 달성가능한 동적 범위(10)를 예시한다. 일반적으로, 다른 상업적으로 입수 가능한 분석 시스템들(예를 들어, 전형적인 수동 ELISA, 특수 수동 ELISA, 마이크로 유체 기반 ELISA 분석법들, 블로팅 기반 기술들(예를 들어, 웨스턴 블로팅 및 도트 블로팅 기술들) 및 자동화된 비드 기반 기술들)이 관심 표본들 내의 피분석물들을 측정할 수는 있지만 본 명세서에 개시된 센서로 달성가능한 전체 동적 범위에 걸쳐 피분석물들을 측정할 수는 없다. 그 결과, 본 발명의 센서의 사용은 지금까지는 종래 기술의 분석 시스템들의 조합을 이용해서만 달성될 수 있었던 농도 범위에 걸쳐 피분석물의 농도들의 측정을 용이하게 할 수 있다.
I. 센서 고려사항들
(A) 센서 구성들
센서는 다양한 구성들로 나노 구조들을 포함할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 도 2a에 도시된 바와 같이, 센서는 나노 구조들의 제1 시리즈(20d), 예를 들어, 디지털 정량화를 위해 구성된 나노 구조들의 시리즈(도 2a(i)); 나노 구조들의 제2 시리즈(20a), 예를 들어, 아날로그 정량화를 위해 구성된 나노 구조들의 시리즈(도 2a(ii)); 나노 구조들(20d)의 2개의 시리즈(도 2a(iii)); 나노 구조들(20a)의 2개의 시리즈(도 2a(iv)); 20d 중 하나 및 20a 중 하나인 나노 구조들의 2개의 시리즈(도 2a(v)); 20d 중 하나 및 20a 중 2개인 나노 구조들의 3개의 시리즈(도 2a(vi))를 포함할 수 있다. 센서는 검출될 피분석물 및 원하는 동적 범위에 따라 상이한 구성들로 나노 구조들의 다른 시리즈를 포함할 수 있는 것이 고려된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "나노 구조(nanostructure)"는, 적어도 1nm 내지 1,000nm 미만의 범위의 길이를 갖는 적어도 하나의 치수를 갖는 임의의 구조, 예를 들어, 나노센서를 의미하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "디지털 정량화(digital quantification)"는, 하나 이상의 피분석물을 결합할 시 하나의 상태에서 다른 상태로 뒤집히는 나노 구조들의 시리즈 내의 개별 나노 구조들이 검출되는(예를 들어, 광학적으로 검출되는) 정량화 프로세스를 의미하는 것으로 이해된다. "디지털 시리즈(digital series)" 또는 "디지털 어레이(digital array)"는 디지털 정량화를 허용하도록 구성된 나노 구조들의 각각의 시리즈 또는 어레이를 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "아날로그 정량화(analog quantification)"는, 나노 구조들이 복수의 피분석물을 결합할 때, 나노 구조들의 시리즈 내의 나노 구조들의 검출 가능한 특성(예를 들어, 광학적으로 검출 가능한 특성, 예를 들어, 색)의 실질적으로 균일한 변화가 검출되는 정량화 프로세스를 의미하는 것으로 이해된다. 특정 실시예들에서, 검출 가능한 특성의 변화들(예를 들어, 색 변화들)은 검출될 피분석물의 미리 교정된 농도 범위에 걸쳐 관심 표본 내의 피분석물의 농도의 함수로서 발생한다. 용어 "실질적으로 균일한(substantially uniform)"은 나노 구조들 중 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%가 동일한 검출 가능한 특성, 예를 들어, 색을 공유하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. "아날로그 시리즈(analog series)" 또는 "아날로그 어레이(analog array)"는 아날로그 검출을 허용하도록 구성된 나노 구조들의 각각의 시리즈 또는 어레이를 의미하는 것으로 이해된다.
관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 하나의 예시적인 센서에서, 그 센서는 제1 영역 및 제2 영역을 포함한다. 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함한다. 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고, 상기 센서는 상기 제1 농도 범위 및 상기 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 양을 정량화할 수 있다. 상기 제1 농도 범위는 상기 제2 농도 범위보다 더 낮은 검출 가능한 값을 가질 수 있고/있거나 상기 제2 농도 범위는 상기 제1 농도 범위보다 더 높은 검출 가능한 값을 가질 수 있다. 상기 제1 농도 범위가 상기 제2 농도 범위와 겹칠 수 있는 것이 고려된다.
본 명세서에 설명된 센서들은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 자릿수(또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 로그)에 걸쳐 있는 범위(동적 범위라고도 지칭됨)에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 농도를 검출할 수 있는 것이 이해된다. 특정 실시예들에서, 상기 센서는 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9 자릿수(또는 5, 6, 7, 8 또는 9 로그)에 걸쳐 있는 농도 범위에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 농도를 검출할 수 있다. 상기 센서는 주어진 피분석물의 농도를 1pg/mL 미만 내지 100ng/mL 초과, 0.1pg/mL 미만 내지 1μg/mL 초과, 0.01pg/mL 미만 내지 100μg/mL 초과, 또는 1fg/mL 미만 내지 1mg/mL 초과의 범위에서 측정하도록 구성될 수 있고, 여기서, 예를 들어, 상기 표본은 상기 센서에 적용되기 전에 희석될 필요가 없다.
하나의 예시적인 센서에서, 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 검출되고(예를 들어, 광학적으로 검출되고), 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다. 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 내의 상기 나노 구조들의 검출 가능한 특성(예를 들어, 색과 같은, 광학적으로 검출 가능한 특성)의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정되고, 상기 센서는 상기 제1 농도 범위 및 상기 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 양을 정량화할 수 있다.
상기 제1 농도 범위는 상기 제2 농도 범위보다 더 낮은 검출 가능한 값을 갖고/갖거나 상기 제2 농도 범위는 상기 제1 농도 범위보다 더 높은 검출 가능한 값을 갖는다. 상기 제1 농도 범위가 상기 제2 농도 범위와 겹칠 수 있는 것이 고려된다.
전술한 센서들 중 각각에서, 상기 센서의 제1 영역은 옵션으로: (i) 적어도 1μm의 인접 나노 구조들의 중심간 간격; (ii) 적어도 10nm의 각각의 나노 구조의 최소 단면 치수 또는 직경; (iii) 200nm 이하의 각각의 나노 구조의 최대 단면 치수 또는 직경; 또는 (iv) 50nm 내지 1000nm 범위의 각각의 나노 구조의 높이 중 하나 이상을 포함한다. 상기 센서는 옵션으로 (i) 기준 마커 또는 (ii) 나노 구조 제조 제어 피처 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
상기 센서들 중 임의의 센서가 다음의 특징들 중 하나 이상을 포함할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 상기 센서는 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제3 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 추가의 상이한 나노 구조들의 제3 시리즈를 포함하는 제3 영역을 추가로 포함할 수 있고, 상기 센서는 상기 제1, 제2 및/또는 제3 농도 범위들에 걸쳐 상기 표본 내의 상기 피분석물의 양을 정량화할 수 있는 것이 고려된다.
유사하게, 임의의 제2 시리즈 내의 나노 구조들은, 상기 제1 시리즈 내의 나노 구조들보다 큰, (i) 평균 높이, (ii) 평균 체적, (iii) 평균 표면적, (iv) 평균 질량, 및 (v) 평균 피분석물 결합 부위의 수 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 센서가 제3 시리즈를 포함할 때마다, 상기 제3 시리즈의 나노 구조들은, 임의의 제2 시리즈 내의 나노 구조들보다 큰, (i) 평균 높이, (ii) 평균 체적, (iii) 평균 표면적, (iv) 평균 질량, 및 (v) 평균 피분석물 결합 부위의 수 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 제1 시리즈, 그리고 적용가능한 경우, 상기 제2 및 제3 시리즈 내의 나노 구조들은 상기 피분석물을 결합하는 결합제, 예를 들어, 상기 피분석물을 결합하는 결합제, 예를 들어, 생물학적 결합제로 관능화된다. 상기 생물학적 결합제는, 예를 들어, 항체, 앱타머, 리간드-수용체 쌍의 멤버, 효소, 또는 핵산일 수 있다. 특정 상황들 하에서, 제2, 제3 또는 후속 시리즈에서의 결합제보다 상기 피분석물에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 결합제를 상기 제1 시리즈에서 사용하는 것이 유리할 수 있다.
상기 센서는 표본에서 임의의 관심 피분석물을 검출 및/또는 정량화하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 상기 피분석물은 생물학적 분자, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 당펩티드, 지질, 지단백질, 핵산, 또는 핵단백질일 수 있다. 또한, 주어진 센서 내의 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈는 복수의 상이한 피분석물을 동시에 또는 순차적으로 결합, 검출 및/또는 정량화하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기 센서는 테스트 표본 내의 대응하는 복수의 상이한 피분석물을 검출하기 위한 복수의 상이한 결합제를 포함할 수 있다.
상기 센서는 광학적 특성, 전기적 특성, 또는 기계적 특성의 변화를 통해 피분석물의 결합을 검출하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기 센서는 나노 구조들의 적어도 하나의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성(예를 들어, 색, 광 산란, 굴절, 또는 공명(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 전기 공명, 전자기 공명, 및 자기 공명))의 변화를 통해 피분석물의 결합을 검출하도록 구성될 수 있다.
상기 센서들이 다양한 상이한 방식들로 구성될 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 나노 구조들의 상기 제1, 제2 또는 제3 시리즈 중 적어도 하나가 나노 구조들의 어레이를 포함할 수 있다. 대안적으로, 나노 구조들의 상기 제1, 제2 및 제3 시리즈 각각이 나노 구조들의 어레이를 포함할 수 있다. 센서는 나노 구조들의 단일 시리즈 또는 나노 구조들의 복수의 시리즈, 예를 들어, 상이한 농도 범위들 내에서 피분석물을 검출하도록 동작하는 나노 구조들의 복수의 시리즈를 포함할 수 있는 것이 고려된다. 상기 센서가 나노 구조들의 복수의 시리즈를 포함할 때, 나노 구조들의 상이한 시리즈는 (i) 동일한 방식으로(예를 들어, 단일 나노 구조들이 검출 또는 정량화되는 디지털 검출에 의해, 또는 농도의 함수로서 주어진 시리즈 내의 나노 구조들의 광학적 특성의 누적 변화가 검출되는 아날로그 검출에 의해) 또는 (ii) 상이한 방식으로, 예를 들어 디지털 검출과 아날로그 검출의 조합에 의해 동작할 수 있다. 또한, 상기 센서는 디지털 검출 및/또는 아날로그 검출에 의해 동작하는 복수의 상이한 시리즈를 포함할 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 상기 센서는 동일한 농도 범위 내에서 디지털 검출에 의해 피분석물을 검출하도록 동작하는 복수의 시리즈 및/또는 상이한 농도 범위들에 걸쳐 아날로그 검출에 의해 피분석물을 검출하도록 동작하는 복수의 시리즈를 포함할 수 있다.
예를 들어, 디지털 검출 동안에는, 나노 구조들의 상기 제1 시리즈에서, 피분석물의 단일 분자 또는 상기 피분석물의 미리 결정된 수 미만의 분자들을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 개별 나노 구조들이 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 존재한다면, 상기 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다. 예를 들어, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는 (i) 피분석물을 결합하지 않은 개별 나노 구조들의 나머지 수 또는 (ii) 상기 제1 시리즈 내의 나노 구조들의 총수에 대해 상기 피분석물을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수를 디지털 카운팅하는 것에 의해 결정된다.
이 접근법에서는, 많은 수의 나노 구조들이 전형적으로 센서의 영역에 조밀하게 패터닝된다. 나노 구조들의 수가 검출될 피분석물들의 수를 초과할 때, 각각의 나노 구조는 전형적으로, 예를 들어, 물질 전달(mass transfer) 및 푸아송 분포(Poisson distribution) 효과들에 기초하여 기껏해야 단일 피분석물을 캡처한다. 각각의 나노 구조는 피분석물이 결합되는지 여부에 따라 2개의 상태(예를 들어, 1 또는 0으로 나타내어짐) 중 하나를 가질 수 있다. 따라서, 피분석물들을 갖는 표본에 노출된 후 상태 1을 갖는 나노 구조들의 수는 피분석물들의 수와 동등할 수 있다. 특정 실시예들에서, 각각의 개별 나노 구조는 하나 또는 몇 개(예를 들어, 10개 미만)의 피분석물, 예를 들어, 단백질을 캡처하기 위해 제한된 수의 결합 부위만을 가질 수 있다. 각각의 나노 구조는 1에서 몇(<10)까지의 대응하는 신호 스케일을 갖고, 따라서 분자들의 수를 카운팅하는 것은 각각의 나노 구조의 이산 신호들을 카운팅하는 것에 상당할 수 있다. 나노 구조들의 시리즈의 상이한 신호 레벨은, 검출될 수 있는, 나노모자이크 패턴을 형성한다.
유사하게, 피분석물의 농도는, 도 2a(iii)에 묘사된 바와 같이, 상기 제2 범위, 또는 상기 제3 범위 내에 있다면, 예를 들어, (i) 피분석물을 결합하지 않은 적절한 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 나머지 수 또는 (ii) 대응하는 제2 및/또는 제3 시리즈 내의 나노 구조들의 총수에 대해 상기 피분석물을 결합한 상기 제2 및/또는 제3 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수를 디지털 카운팅하는 것에 의해 결정될 수 있다. 다시 말해서, 상기 제1 농도 범위, 상기 제2 농도 범위, 및 옵션의 제3(또는 그 이상의) 농도 범위 모두에 걸친 표본 내의 피분석물의 농도는 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈, 상기 제2 시리즈, 및/또는 옵션의 제3(또는 그 이상의) 시리즈 각각 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다.
대안적으로 또는 추가로, 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 또는 옵션의 제3 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 및/또는 상기 제3 영역 내의 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화는 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 시리즈 및/또는 옵션의 제3 시리즈에 의해 생성된 실질적으로 균일한 색 변화일 수 있다. 다시 말해서, 상기 제2 농도 범위 및 옵션의 제3(또는 그 이상의) 농도 범위(들) 모두에 걸친 표본 내의 피분석물의 농도는 상기 제2 영역 및/또는 상기 제3 영역 각각 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정된다.
나노 구조들의 각각의 개별 시리즈(또는 영역)는 상기 관심 피분석물의 10,000개까지의 분자들에 대한 결합 부위들을 포함할 수 있다. 각각의 영역은 그 영역에 의해 캡처된 단백질들의 수와 관련된 미리 교정된 연속적인 신호 스케일(아날로그 스케일)을 갖는다. 각각의 영역에 대한 아날로그 스케일은 판독을 위한 물리적 신호의 점진적 변화에 대응한다. 상이한 스케일들은, 예를 들어, 검출기(예를 들어, 광학적 검출기) 아래의 각각의 영역으로부터의 상이한 색들에 대응할 수 있다. 영역은 피분석물 농도의 함수로서 특성 변화(예를 들어, 색 변화)의 연속체를 갖는 나노모자이크를 정의한다. 광학적 검출의 경우, 예를 들어, 상이한 스케일들은 (i) 농도의 함수로서 강도 변화의 연속체를 갖는 현미경 아래의 영역의 광 강도; 또는 (ii) 전자 측정치, 예를 들어, 농도의 함수로서 전류 또는 전압 신호의 연속체를 갖는, 각각의 영역의 전류 또는 전압 신호 중 하나 이상과 관련될 수 있다.
주어진 시리즈 내의 나노 구조들은 표면이 평면인 및/또는 표면이 곡면인 나노 구조들일 수 있는 것이 고려된다. 상기 나노 구조들은 평면 지지체 및/또는 가요성 기판 상에 배치될 수 있고, 여기서 상기 나노 구조들은 상기 평면 지지체 및/또는 상기 가요성 기판과 일체일 수 있다. 상기 나노 구조들은 반도전성 재료(예를 들어, 실리콘) 또는 금속으로 제조될 수 있다.
상기 센서는 기준 마커, 예를 들어, 명시야 현미경 및/또는 암시야 현미경에 의해 광학적으로 검출 가능한 기준 마커를 추가로 포함할 수 있는 것이 고려된다. 상기 기준 마커는 검출 시스템에 의한 검출 필드 내의 상기 센서들의 위치를 교정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 센서는, 예를 들어, 제조된 나노 구조들이 나노 구조들의 직경의 함수로서 색의 변화를 나타내는 것을 입증하는 하나 이상의 나노 구조 제조 제어부를 또한 포함할 수 있다.
다른 예시적인 센서에서, 도 2a(i)에 묘사된 바와 같이, 상기 센서는 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하는 제1 영역을 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 광학적으로 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다. 상기 센서의 제1 영역은 옵션으로: (i) 적어도 1μm의 인접 나노 구조들의 중심간 간격; (ii) 적어도 10nm의 각각의 나노 구조의 최소 단면 치수 또는 직경; (iii) 200nm 이하의 각각의 나노 구조의 최대 단면 치수 또는 직경; 또는 (iv) 50nm 내지 1000nm 범위의 각각의 나노 구조의 높이 중 하나 이상을 포함한다. 상기 센서는 옵션으로 (i) 기준 마커 또는 (ii) 나노 구조 제조 제어 피처 중 하나 이상을 포함하는 제2 영역을 추가로 포함한다.
다른 예시적인 센서에서, 도 2a(ii)에 묘사된 바와 같이, 상기 센서는 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하는 제1 영역을 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제1 영역 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정된다. 상기 제1 영역은: (i) 적어도 1μm의 인접 나노 구조들의 중심간 간격; (ii) 적어도 100nm의 각각의 나노 구조의 최소 단면 치수 또는 직경; (iii) 300nm 이하의 각각의 나노 구조의 최대 단면 치수 또는 직경; 또는 (iv) 50nm 내지 1000nm 범위의 각각의 나노 구조의 높이 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 상기 센서는 옵션으로 (i) 기준 마커 또는 (ii) 나노 구조 제조 제어 피처 중 하나 이상을 포함하는 제2 영역을 추가로 포함한다.
개시된 센서들의 감지 영역은 생물학적 피분석물들과 상호작용하는 물리적 스폿이다. 특정 실시예들에서, 상기 감지 영역은 상이한 부분들로 분할되고, 각각의 부분은 특정 농도 범위를 타깃으로 한다. 매우 낮은 농도들에서는, 단일 분자 나노 구조들의 어레이가 사용될 수 있다. 피분석물들이 단일 분자 센서에 의해 캡처되면, 센서는 디지털 "예(yes)" 신호를 생성하고, 따라서, 분자들의 농도는 디지털 센서들의 카운트들과 관련될 수 있다. 저농도 내지 중간 농도 범위들에서는, 아날로그 신호를 생성하기 위한 특정 동적 범위를 갖는 더 큰 나노 구조가 피분석물들의 농도를 측정하기 위해 사용된다. 판독 신호는 나노 구조와 연관된 공명 스펙트럼, 또는 산란 강도 등일 수 있다. 검출 정확도를 개선하기 위해, 이들 센서의 어레이가 통계적 평균을 달성하기 위해 사용될 수 있다.
비제한적인 예로서, 센서의 감지 영역은 다수의 영역으로 분할될 수 있다. 예로서, 도 2b는 4개의 센서 영역(32, 34, 36, 38)을 갖는 센서(30)의 개략 예시이다. 각각의 영역은 나노 구조들(20)의 시리즈를 포함한다. 일 실시예에서, 초저농도 센서 영역(32)의 나노 구조들(20d)의 시리즈는 단일 분자 감도를 정의한다. 그 결과, 피분석물의 농도는 검출 가능한 신호, 예를 들어, "예(yes)" 디지털 신호를 생성하도록 뒤집히는 단일 분자 나노 구조들(20d)의 수와 상관된다. 저농도, 중간 농도 및 고농도 센서 영역들(34, 36, 38)의 나노 구조들(20a)은 증가하는 크기를 갖고, 따라서, 더 낮은 감도들을 갖지만 점점 더 큰 동적 범위들을 갖는다. 영역들(32, 34, 36, 38) 각각은 특정 동적 범위에 대해 최적화된다. 각각의 영역으로부터 획득된 결과들을 함께 집계하여 영역들(32, 34, 36, 38)에 의해 달성가능한 동적 범위들의 집계의 결과로 생기는 동적 범위를 제공할 수 있다.
도 3a는 예시적인 센서의 개략 표현 및 그러한 센서를 이용하여 달성되는 관심 피분석물의 정량화를 묘사한다. 이 센서(30)는 디지털 정량화를 위해 구성된 나노 구조들(20d)의 시리즈를 갖는 제1 영역(50) 및 아날로그 정량화를 위해 구성된 나노 구조들(20a)의 시리즈를 갖는 제2 영역(60)을 포함하고, 여기서 색의 시프트들은 상이한 농도들을 지시한다. 이 예에서, 디지털 정량화(70)는 pg/mL 내지 ng/mL 범위의 피분석물 농도들에 대해 수행되고, 아날로그 정량화(80)는 ng/mL 내지 μg/mL 범위의 피분석물 농도들에 대해 수행된다. 피분석물의 농도가 pg/mL 내지 ng/mL의 범위에 있을 때, 피분석물 농도는 상태를 변화시키는(예를 들어, 하나의 상태에서 다른 상태로 뒤집히는) 영역(50) 내의 시리즈 내의 나노 구조들의 수에 기초하여 측정될 수 있다. 그러나, 피분석물의 농도가 검출 가능한 범위의 상한에 도달함에 따라, 영역(50) 내의 센서는 포화되고 센서는 피분석물의 더 높은 농도들을 정량화할 수 없다. 제1 시리즈의 포화는 결합 부위들 중 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상이 피분석물을 결합했을 때 발생할 수 있다. 그 결과, 이 센서(30)는 표본 내의 피분석물의 농도가 나노 구조들의 주어진 시리즈에 의해 검출 가능한 피분석물 농도의 범위 내에 있을 때 그들의 광학적 특성들을 변화시키는 (예를 들어, 색 변화로서 검출되는) 나노 구조들의 복수의 시리즈를 또한 포함한다. 이 실시예에서, 영역(60) 내의 나노 구조들의 시리즈는 인접한 또는 겹치는 농도 범위들에서 그들의 광학적 특성들(예를 들어, 색)을 변화시키기 위해 교정된다.
도 3b에서, 센서(40)는 디지털 검출/정량화(70)를 위한 나노 구조들의 시리즈 및 아날로그 검출/정량화(80)를 위한 나노 구조들의 시리즈를 포함한다. 특히, 디지털 검출(70)을 위한 나노 구조들의 시리즈는 어레이의 형태로 나노 구조들(20d)을 포함한다. 피분석물(예를 들어, 타우 단백질)의 농도가 1.2pg/mL에서 10ng/mL로 증가함에 따라, 각각의 패널(90) 아래의 비율에 의해 지시된 바와 같이, 하나의 상태에서 다른 상태로 뒤집힌 나노 구조들의 수가 증가한다. 10ng/mL 이상의 피분석물 농도에서, 나노 구조들의 전부 또는 실질적으로 전부(예를 들어, 결합 부위들 중 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%가 피분석물들을 결합함)가 하나의 상태에서 다른 상태로 뒤집힘에 따라, 나노 구조들의 시리즈가 포화된다. 우측 박스는 아날로그 검출(80)을 위해 구성된 나노 구조들(20a)의 시리즈에서의 광학적 특성들의 변화(예를 들어, 비색(colorimetric) 변화)를 예시한다. 예를 들어, 피분석물의 농도가 10ng/mL까지 증가함에 따라, 나노 구조들의 시리즈의 광학적 특성(예를 들어, 색조)의 변화는 시프트하지 않는다. 그러나, 피분석물의 농도가 10ng/mL을 초과함에 따라, 나노 구조들의 시리즈의 광학적 특성의 변화는, 예를 들어, 피분석물 농도의 함수로서 색의 변화로서 검출 가능하게 된다. 다른 농도 범위들에서 피분석물을 검출하고 정량화하기 위해 교정된 나노 구조들의 추가적인 시리즈(예를 들어, 디지털 어레이들 및/또는 아날로그 어레이들)을 센서에 포함시킴으로써 더 큰 동적 범위들이 달성될 수 있다.
도 3c는 본 발명의 실시예에 따른 센서(100)에 의해 수행되는 디지털 정량화를 예시한다. 예시된 바와 같이, 센서는 농도 50fg/mL에서 피분석물 분자들(타우 단백질의 분자들)을 검출할 수 있고, 2046개 중 96개의 디지털 나노 구조들(20d)이 하나의 광학적 특성에서 검출기에 의해 검출 가능한 다른 광학적 특성으로 뒤집힌다. 이 특정 실시예에서, 센서(100)는, 나노 구조의 전부 또는 실질적으로 전부가 하나의 광학 상태에서 다른 광학 상태로 뒤집힐 때, 약 50pg/mL의 분자 농도들에서 포화된다.
도 4는 도 3b의 예시적인 센서(40)에 의해 획득된 측정치들로부터 컴파일된 데이터를 묘사하는 그래프이다. 1pg/mL 내지 1ng/mL의 피분석물 농도 범위에서, 디지털 정량화 모드(70)는 높은 감도 및 3 로그의 동적 범위를 제공한다. 1ng/mL 내지 1μg/mL의 피분석물 농도 범위에서, 아날로그 비색 측정(80)은 검출 가능한 농도 범위를 추가적인 3 로그만큼 확장한다. 전체 동적 범위에 걸쳐 있는 연속적인 곡선을 형성하기 위한 디지털 정량화 측정치들과 아날로그 정량화 측정치들 사이의 전이는 본 명세서에 설명된 유형의 알고리즘을 이용하여 자동화될 수 있다. 이 예에서, 디지털 정량화를 위해 구성된 나노 구조들의 시리즈와 아날로그 정량화를 위해 구성된 나노 구조들의 시리즈의 조합을 이용하여 6 로그 동적 범위가 달성된다. 본 발명의 실시예들의 센서들은 작은 체적의 표본(예를 들어, 100μL, 50μL, 25μL, 10μL 또는 5μL 미만)을 이용하여 높은 감도(예를 들어, 50fg/mL)로 큰 동적 범위들(예를 들어, 6 로그 이상)을 달성할 수 있다는 것이 발견되었다.
나노 구조는 임의의 적합한 형상 및/또는 크기를 가질 수 있다. 일부 경우들에서, 예를 들어, 나노 구조는 나노니들, 나노와이어, 나노로드, 나노콘 등일 수 있다. 다른 형상들, 예를 들어, 나노리본들, 나노필라멘트들, 나노튜브들 등이 또한 가능하다. 특정 실시예들에서, 나노 구조들은 수직으로 정렬되지만, 다른 각도들 또는 정렬들도 가능하다. 나노니들들, 나노도트들, 나노디스크들, 나노 기둥들 등과 같은 나노 구조들은 표면 폴라리톤들에의 결합을 통해 전자기 에너지를 구속하는 그들의 능력으로 인해 단일 분자 레벨 감도를 갖는다.
센서의 물리적 형태는 바텀업(bottom-up) 및/또는 톱다운(top-down) 방법들에 의해 표면 상에 제조된 나노 구조들, 예를 들어, 나노니들들, 나노와이어들, 나노 기둥들, 나노도트들 등의 어레이 또는 매트릭스일 수 있다. 표면은 웨이퍼의 상부 표면과 같은 평평한 표면일 수 있다. 대안적으로, 표면은 또한 곡면 또는 가요성일 수 있거나, 섬유 또는 와이어 등과 같은 3차원 구조의 일부일 수 있다.
센서의 기능적 형태는 나노-광학적 구조들, 나노-기계적 구조들 또는 나노-전기적 구조들을 포함할 수 있다. 따라서, 판독 신호는 광학적 신호들, 전기적 신호들 및 기계적 신호들을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 피분석물의 농도는 나노 구조들의 광학적, 전기적 또는 나노기계적 특성들의 변화에 의해 결정될 수 있다. 광학적 특징들은, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 나노포토닉 공명, 전기 공명, 자기 공명, 산란, 흡수, 형광, 색 변화 등을 포함한다. 전기적 특징들은, 예를 들어, 저항, 커패시턴스, 전류, 전압 등을 포함한다. 나노기계적 특징들은, 예를 들어, 진동 공명, 진동 크기, 기계적 질량 등을 포함한다.
전술한 구조들은 또한 그들의 광학적 특성들, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명들, 산란 강도들, 또는 흡수들의 변화들을 관찰함으로써 고농도의 피분석물들을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이들 구조의 감도 및 검출 범위들은 구조들의 크기들과 밀접하게 관련된다. 평면 제조 기술은 하나의 디바이스 내의 상이한 크기 및 형상의 나노 구조들의 스케일링 가능하고 유연한 통합을 가능하게 한다. 본 발명의 실시예들은 생물학적 표본 내의 분자들 및 피분석물들의 결정을 위해 높은 감도 및 높은 동적 범위를 달성하기 위해 상이한 나노 구조들을 사용하는 것과 관련된다.
특정 실시예들에서, 상이한 구조들의 표면 특성들은, 나노 구조들의 제1 시리즈 내의 나노 구조들이 나노 구조들의 제2 및/또는 제3 시리즈보다 피분석물을 결합하기 위한 더 높은 결합 친화도들을 가질 수 있도록 설계될 수 있다. 이는 주어진 피분석물에 대해 상이한 결합 친화도들을 갖는 결합제들을 이용하여 달성될 수 있다. 그 결과, 저농도들에서는, 피분석물들이 단일 분자 나노 구조들에 의해 우선적으로 캡처되고 검출된다. 농도가 증가함에 따라, 제1 시리즈의 나노 구조들은 포화하고 나노 구조들의 다른 시리즈로부터의 신호들이 동적 범위를 확장하기 위해 이용될 수 있다.
도 5는 나노 구조들의 다수의 시리즈를 포함하는 예시적인 센서(예를 들어, 나노모자이크 칩)(150)의 그림 표현이다. 센서(150)의 좌측의 컬럼에서, 분리된 영역들은 나노 구조들의 직경이 증가함에 따라 나노 구조들이 색을 변화시킨다는 것을 입증하는 제조 제어 구조들(155)을 나타낸다. 중간 영역(160)은, 피분석물들의 초저농도 레벨들을 측정하기 위한 디지털 정량화를 위해 구성된 나노 구조들의 대응하는 시리즈(각각이 단일 분자 나노 구조들을 정의하는 25,600개의 나노 구조를 집합적으로 포함함)를 각각 정의하는 다수의 별개의 어레이(즉, 16개의 어레이)를 나타낸다. 우측의 영역은 아날로그 정량화를 위해 영역들(165, 170, 175)로서 묘사된 나노 구조들의 3개의 시리즈(예를 들어, 나노 구조들의 제2, 제3, 및 제4 시리즈)를 포함한다. 영역들(165, 170, 175) 각각은 3개의 별개의 인접한 또는 겹치는 농도 범위들 내에서 피분석물 농도들을 측정하기 위해 교정된다. 특정 실시예들에서, 3개의 영역은 각각 1,000개의 나노 구조를 포함할 수 있다.
대안적인 실시예에서, 도 6에 그림으로 도시된 바와 같이, 다른 예시적인 센서(예를 들어, 나노모자이크 칩)(150)가 나노 구조들의 다수의 시리즈(영역들)를 포함한다. 중앙에, 센서를 광학적 검출 시스템과 정렬시키는 것을 돕기 위해 기준 마커(200)가 위치한다. 기준 마커는 임의의 원하는 설계일 수 있다. 예를 들어, 도 6에 도시된 바와 같이, 기준 마커(200)는 위치 및 회전 배향 정보를 제공하기 위해 회전 대칭을 갖지 않는 방식으로 배열된 다이아몬드 패턴 및 3개의 삼각형 패턴을 포함한다. 그 결과, 기준 마커는 (i) 센서 위치를 찾고, (ii) 나노 구조들의 수평 및 수직 평면들을 정렬시키기 위해 사용될 수 있다. 기준 주위에 제조 제어 구조들(155)이 배치된다. 디지털 단일 분자 나노 구조들(20d)의 어레이가 센서의 좌측 및 우측 영역들에 배치되고, 아날로그 분자 나노 구조들(20a)의 어레이가 기준 및 제조 제어 구조들을 둘러싸는 중앙 행에 배치된다. 도 6에 도시된 제조 제어부는 직경이 80nm 내지 150nm 범위인 나노 구조들(예를 들어, 나노니들)의 8개의 블록을 포함한다. 직경이 증가함에 따라 암시야 이미징 하의 나노 구조들(나노니들들)의 색은 변화한다.
위의 내용은 본 발명의 특정 실시예들의 다양한 비제한적인 예들을 나타낸다. 그러나, 다른 실시예들도 가능하다.
특정 실시예들에서, 나노 구조는 기판과의 부착 지점 또는 단부로부터 결정된, 약 500nm, 450nm, 350nm, 300nm, 250nm, 200nm, 150nm, 100nm, 50nm, 30 nm, 20nm, 10nm, 5nm, 3nm, 또는 2nm 미만의 길이를 갖는다. 특정 실시예들에서, 나노 구조의 길이는 적어도 약 2nm, 3nm, 4nm, 5nm, 6nm, 7nm, 8nm, 9nm, 10nm, 20nm, 30nm, 40nm, 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm, 100nm, 150nm, 200nm, 250nm, 300nm, 350nm, 400nm, 450nm, 또는 500nm일 수 있다.
나노 구조는 임의의 적합한 단면 형상, 예를 들어, 정사각형, 원형, 삼각형, 타원형, 다각형, 별, 불규칙한 형상 등을 가질 수 있다. 나노 구조는 그것의 길이 전체에 걸쳐 동일한 단면 형상을 유지할 수 있거나, 나노 구조의 상이한 부분들에서 상이한 단면 형상들을 가질 수 있다. 또한, 나노 구조들은 임의의 적합한 단면 직경을 가질 수 있다. 단면 직경은 일정하거나(예를 들어, 나노니들 또는 나노로드에서와 같이), 변화할 수 있다(예를 들어, 나노콘에서와 같이). 평균 단면 직경은, 예를 들어, 약 1,000nm, 750nm, 500nm, 400nm, 300nm, 200nm, 175nm, 150nm, 125nm, 100nm, 75nm, 50nm, 40nm, 30nm, 20nm, 또는 10nm 미만일 수 있다. 특정 실시예들에서, 단면 직경은 적어도 약 10nm, 20nm, 30nm, 40nm, 50nm, 75nm, 100nm, 125nm, 150nm, 175nm, 200nm, 300nm, 400nm, 500nm, 750nm, 또는 1,000nm일 수 있다. 다양한 실시예들에서 조합들도 가능하다. 예를 들어, 나노 구조들의 평균 직경은 50nm 내지 300nm, 75nm 내지 250nm, 또는 100nm 내지 200nm일 수 있다.
(B) 제조 고려사항들
나노 구조는 임의의 적합한 재료로 형성될 수 있고, 그것이 배치되는 기판과 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 실시예들에서, 나노 구조들은 실리콘 및/또는 다른 적합한 반도전성 재료들(예를 들어, 게르마늄)로 형성될 수 있다. 재료들의 추가적인, 비제한적인 예들은 금속들(예를 들어, 니켈 또는 구리), 실리카, 유리 등을 포함한다. 특정 실시예들에서, 나노 구조(기판 상에 배치될 수 있음)는 단일 재료로 형성될 수 있다.
본 발명의 센서들은 다수의 상이한 접근법에 의해, 예를 들어, 반도체 제조 접근법들을 이용하여 제조될 수 있는 것이 고려된다. 위에 논의되고 아래에 더 상세히 논의되는 바와 같이, 본 명세서에 설명된 센서들을 생성하는 데 유용한 나노 구조들의 시리즈를 형성하기 위해 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있다. 예들은, 전자 빔 리소그래피, 포토리소그래피, X-선 리소그래피, 극자외선 리소그래피, 이온 프로젝션 리소그래피 등과 같은 리소그래피 기법들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 대안적으로 또는 추가로, 나노 구조는 적합한 에칭제를 이용한 에칭에 민감한 하나 이상의 재료로 형성될 수 있다.
예를 들어, 특정 실시예들에서, 나노 구조는 적합한 에칭제를 이용한 에칭에 민감한 하나 이상의 재료로 형성될 수 있다. 예를 들어, 나노 구조는 HF(불화수소산) 또는 BOE(버퍼링된 산화물 에칭)를 이용하여 에칭될 수 있는 실리카 또는 유리와 같은 재료를 포함할 수 있다. 다른 예로서, 나노 구조들은 HCl(염산), HNO3(질산), 황산(H2SO4)과 같은 산들, 및/또는 염화 제2철(FeCl3) 또는 황산 구리(CuSO4)와 같은 다른 에칭 화합물들을 이용하여 에칭될 수 있는 구리, 철, 니켈, 및/또는 강철과 같은 금속을 포함할 수 있다. 또 다른 예로서, 나노 구조들은 에칭제, 예컨대 EDP(에틸렌 디아민과 피로카테콜의 용액), KOH(수산화칼륨) 및/또는 TMAH(테트라메틸암모늄 수산화물)를 이용하여 에칭될 수 있는 실리콘 또는 다른 반도체 재료들을 포함할 수 있다. 나노 구조들은, 일부 경우들에서, KOH(수산화칼륨), 및/또는 본 명세서에 설명된 것들과 같은 다른 산들을 이용하여 에칭될 수 있는 플라스틱 또는 중합체, 예를 들어, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 폴리퍼플루오로부테닐비닐에테르 등을 또한 포함할 수 있다.
(i) 나노 구조 제조
본 발명의 센서들은 비용-효과적인 방식으로 높은 처리량 및 수율로 높은 제조 용량으로 이어진, 종래의 반도체 제조 기술들, 예를 들어, CMOS 기술들에 의해 제조될 수 있는 것이 고려된다. 그러한 접근법들을 이용하여, 기판 상에 배치된 또는 그와 일체인 나노 구조들, 예를 들어, 나노니들들, 나노도트들, 나노디스크들, 나노와이어들, 및 나노 기둥들의 하나 이상의 시리즈를 포함하는 센서들을 만드는 것이 가능하다. 예시적인 나노 구조들이 도 7 및 도 8에 개략적으로 묘사되어 있다. 비제한적인 예로서, 도 7은 전자 빔 리소그래피, 포토리소그래피, 나노임프린팅 등을 포함하는 현재의 나노 제조 기술들로 기판 상에 직접 형성될 수 있는 몇몇 나노 구조들(20)을 예시한다. 예를 들어, 나노 구조(20)는 나노 기둥, 나노디스크, 나노니들, 또는 나노도트일 수 있다. 또한, 도 8은 2개 이상의 재료, 예를 들어, 제1 및 제2 재료(각각, 300 및 305)로 제조된 나노 구조들(20)을 묘사한다. 각각의 재료의 구성들은, 아래에 논의되는 바와 같이, 피분석물을 결합하기 위한 나노 구조들의 결합 용량을 제어하기 위해 또는 특정 광학적, 전기적, 또는 자기적 특성들을 달성하기 위해 이용될 수 있다.
나노 구조들의 제조는 웨이퍼 스케일에서 또는 등가의 스케일링 능력을 갖는 칩 스케일에서 수행될 수 있다. 이러한 유형의 접근법에서는, 설계된 나노 구조를 위한 마스크가 먼저 만들어진다. 특정 실시예들에서, 설계 구조에 대한 역이 마스크 상의 패턴으로서 사용된다. 예를 들어, 포토레지스트가, 예를 들어, 스핀-코팅 또는 딥-코팅 공정을 이용하여 웨이퍼 상에 또는 칩 상에 코팅된다. 그 후 포토레지스트는 마스크를 통해 포토레지스트에 전자기 방사선에 노출될 수 있다. 그 후, 노출된 포토레지스트가 현상된다. 특정 실시예들에서, 포토레지스트 상의 패턴은 또한 레이저 빔 또는 전자 빔에 의해 직접 기록될 수 있다. 그 후 포토레지스트 상의 패턴은 열 증착, 전자 빔 증착, 스퍼터 또는 화학적 퇴적, 또는 원하는 재료의 원자 층 퇴적을 포함한, 물리적 기상 퇴적에 의해 기판에 전사될 수 있다.
특정 실시예들에서, 포토레지스트 상의 패턴은, 습식 에칭, 반응성 이온 에칭과 같은 건식 에칭, 스퍼터 에칭, 및/또는 기상 에칭을 포함한, 톱 다운 에칭 공정을 이용하여 기판에 전사될 수 있다. 패터닝, 퇴적, 에칭, 및 관능화 공정들은 다수의 사이클 동안 반복될 수 있다. 특정 실시예들에서, 반도체 제조 공정들을 이용하여 나노니들들, 나노도트들, 나노 기둥들, 및/또는 나노와이어들의 어레이들이 제조될 수 있다. 다른 실시예들에서, 몰드-스탬핑 공정을 이용하여 나노니들들, 나노도트들, 나노 기둥들, 및/또는 나노와이어들의 어레이들이 제조될 수 있다.
예시적인 제조 접근법이 도 9a 내지 도 9d에 도시된 단면도들에 묘사되어 있다. 도 9a를 참조하면, 더 구체적으로, 전자 빔 레지스트 또는 포토레지스트(310)의 층을 실리콘 기판과 같은 반도체 기판(320) 상에 코팅한다. 도 9b를 참조하면, 그 후, 예를 들어, Elionix 또는 Raith 전자 빔 리소그래피 시스템을 이용하여, 레지스트 층을 전자 빔 노광 또는 전자기 방사선 노광에 의해 패터닝하여 레지스트 층 피처들(325)을 형성한다. 도 9c를 참조하면, 레지스트를 레지스트 현상기에서 현상하여, 그것의 부분들을 제거하고 레지스트 피처들(325)만을 남긴다. 도 9d를 참조하면, 그 후 마스크로서의 역할을 하는 패터닝된 레지스트를 이용하여 에칭 공정을 수행한다. 에칭 공정은, 예를 들어, 습식 또는 건식 에칭일 수 있다. 적합한 습식 에칭은, 예를 들어, 에틸렌디아민 피로카테콜(EDP), 수산화칼륨(KOH), 또는 테트라메틸암모늄 수산화물(TMAH)의 용액일 수 있다. 그 결과, 나노니들들의 상부 표면 상에 배치된 레지스트(325)를 이용하여 실리콘 나노니들들(330)이 생성된다. 나노니들들의 높이는 2nm 내지 1000nm의 범위일 수 있다. 나노니들들의 직경은 10nm 내지 1000nm의 범위일 수 있다. 레지스트 피처들(325)은 종래의 습식 에칭 버퍼(도시되지 않음)를 이용하여 제거될 수 있다.
에칭된 구조의 표면은 화학 기상 퇴적 또는 원자 층 퇴적 또는 양쪽 모두의 하이브리드를 이용하여 화학적으로 활성화될 수 있다. 이 활성화 공정도 습식 용액에서 수행될 수 있다. 화학적으로 활성화된 구조는 그 후, 예를 들어, 화학흡착(예를 들어, 공유 결합) 또는 물리흡착을 통해, 생물학적 재료, 본 명세서에 설명된 결합제를 결합할 준비가 된다.
적합한 실리콘 기판은, 예를 들어, 원형 12" 실리콘 웨이퍼일 수 있다. SBS(Society of Biomolecular Screening) 권장 마이크로플레이트 사양을 준수하기 위해, 원형 웨이퍼는 직사각형 형상으로 다이싱된다. 다이싱 단계는 위에 설명된 바와 같은 제조 공정의 말미에 수행될 수 있다. 대안적으로, 웨이퍼의 깊이의 절반으로의 다이싱이 제조 공정의 시작에서 수행될 수 있고; 그 후, (스핀 코팅, 패터닝, 퇴적 및 에칭을 포함하는) 모든 제조 단계들의 완료 후에, 웨이퍼들은 SBS 포맷으로 쉽게 벽개(cleave)될 수 있다.
다른 제조 접근법이 도 10a 내지 도 10g에 도시된 단면도들에 묘사되어 있다. 도 10a를 참조하면, 화학 기상 퇴적, 원자 층 퇴적 또는 양쪽 모두의 조합을 이용하여 실리콘 기판(320)의 상부 표면 상에 실리콘 이산화물 층(335)이 형성된다. 층의 두께는 2nm 내지 100nm의 범위일 수 있다. 실리콘 이산화물 층(335) 상에, 예를 들어, 폴리메틸 메타크릴레이트를 포함하는 레지스트 층(310)이 스핀 코팅된다. 도 10b 및 도 10c를 참조하면, 레지스트 층(310)을 전자 빔 또는 전자기 방사선에 의해 패터닝하고, 그 후 레지스트 현상기에서 현상하여 레지스트 피처들(325)을 형성한다. 도 10d를 참조하면, 예를 들어, Sharon 열 증착기 또는 덴톤(Denton) 전자 빔 증착기를 이용하여, 예를 들어, 열 증착(또는 전자 증착)에 의해 패터닝된 레지스트 층 피처들(325) 위에 알루미늄 층(340)이 퇴적된다. 알루미늄 층(340)은 바람직하게는 20nm 내지 100nm 두께이다. 도 10e를 참조하면, 리프트-오프 공정을 수행하여 레지스트 층 피처들(325)을 제거하여, 실리콘 이산화물 층(335) 위에 알루미늄 마스크를 남긴다. 도 10f를 참조하면, STS ICP RIE 시스템 또는 Oxford 플라즈마 RIE 시스템을 이용한 반응성 이온 에칭과 같은 에칭 공정을 수행하여 실리콘 산화물 나노니들들(335)을 에칭한다. RIE 에칭은 실리콘 층(320) 내로 더 진행하여, 2층 SiO2-Si 나노 구조들을 야기할 수 있다. 도 10g를 참조하면, 알루미늄 에칭제 버퍼, 예를 들어, 1-5% HNO3, H3PO4 및 CH3COOH의 혼합물들에서 실리콘 나노니들들(342)의 상부들로부터 알루미늄 마스크(340)가 에칭될 수 있다.
또 다른 제조 접근법이 도 11a 내지 도 11f에 도시된 단면도들에 묘사되어 있다. 도 11a를 참조하면, 실리콘 기판(320)의 상부 표면 상에 실리콘 이산화물 층(335)이 성장된다. 실리콘 이산화물 층(335) 상에 레지스트 층(310)이 스핀 코팅된다. 도 11b 및 도 11c를 참조하면, 레지스트 층(310)을 전자 빔 또는 전자기 방사선에 의해 패터닝하고, 그 후 레지스트 현상기에서 현상하여 레지스트 피처들(325)을 형성한다. 도 11d를 참조하면, 예를 들어, 열 증착(또는 전자 증착) 공정에 의해 패터닝된 레지스트 층(310) 위에 알루미늄 층(340)과 같은 금속 층이 퇴적된다. 도 11e를 참조하면, 그 후 리프트-오프 공정을 수행하여 레지스트 층(310)을 제거하여, 기판 위의 산화물 층 위에 배치된 알루미늄 나노니들들을 남긴다. 도 11f를 참조하면, 코팅 층(345)을 스핀 코팅하여 기판의 표면 특성들을 변형할 수 있다. 코팅 층은 TEFLON과 같은 소수성 재료, 또는 폴리에틸렌 글리콜 분자들의 층일 수 있다. 코팅 층의 두께는 알루미늄 나노니들들의 높이보다 작다.
다른 제조 접근법이 도 12a 내지 도 12f에 도시된 단면도들에 묘사되어 있다. 도 12a를 참조하면, 산화물 기판(350) 상에 레지스트 층(310)이 스핀 코팅된다. 산화물 층은 열적으로 성장된 실리콘 산화물일 수 있거나, 화학 기상 퇴적에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 기판(350)은 유리 슬라이드일 수 있다. 도 12b 및 도 12c를 참조하면, 전자기 방사선을 이용하여 레지스트 층(310)에 피처들을 패터닝하고, 그 후 이를 레지스트 현상기에서 현상하여 레지스트 피처들(325)을 형성한다. 도 12d를 참조하면, 예를 들어, 화학 기상 퇴적을 이용하여 패터닝된 레지스트 층(310) 위에 실리콘 층(355)이 퇴적된다. 도 12e를 참조하면, 리프트-오프 공정을 수행하여 패터닝된 레지스트 층(310)을 제거하고, 이는 산화물 기판 상에 실리콘 나노도트(360) 구조를 야기한다. 도 12f를 참조하면, 예를 들어, VLS(vapor-liquid-solid) 방법에 의해, 실리콘 나노도트들(360)을 시드들로서 이용하여 실리콘 나노니들 구조들(365)이 에피택셜 성장될 수 있다.
다른 제조 접근법이 도 13a 내지 도 13d에 도시된 단면도들에 묘사되어 있고, 여기서는 포토레지스트 층이 몰드를 이용하여 패터닝될 수 있다. 도 13a를 참조하면, 예를 들어, Si 또는 석영으로 몰드(370)가 만들어진다. 몰드는 전자 빔 리소그래피와 같은 고해상도 패터닝 기술에 의해 만들어질 수 있다. 몰드는 복제될 타깃 나노 구조들과 유사한 피처 크기들을 갖는다. 도 13b를 참조하면, 실리콘 기판(320) 상에 레지스트 층(310)이 스핀 코팅된다. 도 13c를 참조하면, 그 후 몰드(370) 내의 피처들이 나노임프린팅 또는 나노스탬핑에 의해 레지스트 내에 스탬핑되고, 그 후, 예를 들어, UV 또는 열에 의해 교차결합된다. 도 13d를 참조하면, 임프린팅된 포토레지스트를 후속 에칭 공정을 위한 마스크로서 이용하여 실리콘 나노 구조들을 획득할 수 있다.
도 14a 및 도 14b를 참조하면, 위에서 설명된 제조 단계들을 복제함으로써, 웨이퍼(320) 상에 제조된 복수의 센서(375)를 생성하여, 예를 들어, 각각의 웨이퍼(320) 상에 배치된 센서들의 10x10 어레이를 생성하는 것이 가능하다. 도 14b에 도시된 바와 같이, 각각의 센서는 실리콘 기판 상에 배치된 나노 구조들, 예를 들어, 나노니들들(330)의 어레이를 포함한다.
도 10 내지 도 14에 묘사된 나노 구조들은 1-999nm, 1-750nm, 1-500nm, 1-400nm, 1-300nm, 1-200nm, 1-100nm, 10-999nm, 10-750nm, 10-500nm, 10-400nm, 10-300nm, 10-200nm, 10-100nm, 20-999nm, 20-750nm, 20-500nm, 20-400nm, 20-300nm, 20-200nm, 20-100nm, 30-999nm, 30-750nm, 30-500nm, 30-400nm, 30-300nm, 30-200nm, 30-100nm, 40-999nm, 40-750nm, 40-500nm, 40-400nm, 40-300nm, 40-200nm, 40-100nm, 50-999nm, 50-750nm, 50-500nm, 50-400nm, 50-300nm, 50-200nm, 또는 50-100nm 범위의 적어도 하나의 치수를 갖는다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어 도 14b에서 나노 구조들 사이의 피치, 즉, 중심간 거리는 전형적으로 1-100μm, 예를 들어, 적어도 1.5μm, 2μm, 3μm, 4μm, 5μm, 6μm, 7μm, 8μm, 9μm, 10μm, 20μm, 30μm, 40μm, 50μm, 60μm, 70μm, 80μm, 또는 90μm이다. 구조들의 피치들에 대해 다른 치수들이 사용될 수도 있다. 도 14b의 나노 구조들의 어레이는, 그 전체가, 도 14a에 도시된 바와 같이, 어레이 포맷으로 배열될 수도 있다. 예를 들어, 도 14a에 도시된 나노 구조들의 2개의 어레이 사이의 피치는 100μm 미만 내지 수 센티미터 초과의 범위일 수 있다. 또한, 나노 구조들의 피치 및 크기는 칩의 상이한 부분들에서, 또는 나노 구조들의 각각의 시리즈 내에서 상이할 수 있는 것이 고려된다. 다양한 실시예들에서 이들 중 임의의 것의 조합들도 가능하다.
또한, 주기적인 구조의 나노 구조들 사이의 거리 또는 피치는, 예를 들어, 나노 구조들이 메타-표면을 형성하도록 제어될 수 있다. 예를 들어, 피치는 입사광의 파장 미만으로 설정될 수 있다. 예를 들어, 피치는 700nm, 600nm, 500nm, 400nm, 300nm, 200nm, 100nm, 50nm, 25nm, 10nm, 9nm, 8nm, 7nm, 6nm, 5nm, 4nm, 3nm 또는 2nm 미만, 및/또는 1nm, 2nm, 3nm, 4nm, 5nm, 6nm, 7nm, 8nm, 9nm, 10nm, 25nm, 50nm, 100nm, 200nm, 300nm, 400nm, 500nm, 600nm 또는 700nm 초과일 수 있다. 예를 들어, 특정 상황들 하에서, 피치는 400nm 내지 500nm일 수 있다. 나노 구조들은 본 명세서에서 제공된 치수들 중 임의의 치수를 가질 수 있다. 특정 상황들 하에서, 나노 구조의 평균 단면 직경 또는 최소 또는 최대 단면 치수는 입사광의 파장 미만이다. 특정 상황들 하에서, 개별 나노 구조들은 광학적으로 분해 가능하도록 구성되고, 여기서, 예를 들어, 피치는 100μm 미만, 10μm 미만, 5μm 미만, 및/또는 1μm 초과, 또는 5μm 초과일 수 있다.
표 1은 광학적 판독을 위해 본 명세서에 설명된 나노 구조들의 예시적인 파라미터들을 기술한다.
Figure pct00001
표 2는 기계적 판독을 위해 본 명세서에 설명된 나노 구조들의 예시적인 파라미터들을 기술한다.
Figure pct00002
표 3은 전기적 판독을 위해 본 명세서에 설명된 나노 구조들의 예시적인 파라미터들을 기술한다.
Figure pct00003
(ii) 나노 구조 관능화
상기 제1 시리즈, 그리고 적용가능한 경우, 상기 제2 및 제3 시리즈 내의 나노 구조들은 상기 피분석물을 결합하는 결합제, 예를 들어, 상기 피분석물을 결합하는 결합제, 예를 들어, 생물학적 결합제로 관능화된다. 상기 생물학적 결합제는, 예를 들어, 항체, 앱타머, 리간드-수용체 쌍의 멤버, 효소, 또는 핵산일 수 있다. 특정 상황들 하에서, 예를 들어, 제1 시리즈가 매우 낮은 농도의 피분석물을 측정하기 위해 사용될 때, 제2, 제3 또는 후속 시리즈에서의 결합제보다 상기 피분석물에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는 결합제를 상기 제1 시리즈에서 사용하는 것이 유리할 수 있다.
주어진 나노 구조에 적용된 결합제들의 수는 원하는 분석법, 예를 들어, 필요한 동적 범위, 검출될 피분석물들의 수 등에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 특정 상황들 하에서, 나노 구조는 1, 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100개 이상의 결합제로 관능화될 수 있다. 이들 값은 나노 구조 당 1-1,000, 1-500, 1-250, 1-100, 1-50, 1-25, 1-10 또는 1-5개의 결합제의 범위일 수 있다.
상기 센서는 표본에서 임의의 관심 피분석물을 검출 및/또는 정량화하도록 설계될 수 있다. 또한, 주어진 센서 내의 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈는 복수의 상이한 피분석물을 동시에 또는 순차적으로 결합, 검출 및/또는 정량화하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 상기 센서는 테스트 표본 내의 대응하는 복수의 상이한 피분석물을 검출하기 위한 복수의 상이한 결합제를 포함할 수 있다.
다양한 표본들에서 피분석물들이 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 표본은 피분석물의 측정을 허용하는 임의의 형태일 수 있다. 다시 말해서, 표본은, 얇은 섹션들의 준비와 같은, 피분석물의 검출을 허용하게 하기 위해 피분석물 추출 또는 처리를 허용해야만 한다. 따라서, 표본은 신선하거나, 적합한 극저온 기법들 통해 보존되거나, 비-극저온 기법들을 통해 보존될 수 있다. 특정 실시예들에서, 표본은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 또는 간질액 표본과 같은, 체액 표본이다. 특정 실시예들에서, 표본은, 예를 들어, 종래의 생체 검사 기구들 및 절차들을 이용하여 획득된 생체 검사 표본으로부터 획득된 조직 추출물이다. 내시경 생체 검사, 절제 생체 검사, 절개 생체 검사, 미세 바늘 생체 검사, 펀치 생체 검사, 면도 생체 검사 및 피부 생체 검사가 조직 표본들을 획득하기 위해 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있는 인식된 의료 절차들의 예들이다. 후속 분석을 위한 조직 준비를 위한 적합한 기법들이 본 기술분야의 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있다. 특정 실시예들에서, 표본은 세포 표본 또는 세포 상청액 표본이다.
피분석물들은 생물학적 분자들, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 당펩티드, 지질, 지단백질, 핵산, 또는 핵단백질을 포함한다. 예시적인 피분석물들은, 예를 들어, 세포들, 항체들, 항원들, 바이러스 입자들, 병원성 박테리아, 이온들, 포자들, 효모균들, 곰팡이들, 세포 대사물들, 효소들, 효소 억제제들, 수용체 리간드들, 펩티드들, 단백질들, 지방산들, 스테로이드들, 호르몬들, 효소들, 및 핵산들을 포함한다. 검출될 수 있는 다른 비-생물학적 피분석물들은, 예를 들어, 유기 화합물들, 합성 분자들, 금속들, 금속 복합체들, 약물들, 신경 작용제들, 및 마취성 작용제들을 포함할 수 있다.
특정 실시예들에서, 피분석물은 사이토카인, 예를 들어, 인터페론(예를 들어, IFNα, IFNβ, 및 IFNγ), 인터류킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17 및 IL-20), 종양 괴사 인자들(tumor necrosis factors)(예를 들어, TNFα 및 TNFβ), 에리트로포이에틴(EPO), FLT-3 리간드, gIp10, TCA-3, MCP-1, MIF, MIP-1α, MIP-1β, 란테(Rante)들, 대식 세포 집락 자극 인자(macrophage colony stimulating factor)(M-CSF), 과립구 집락 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF), 및 과립구-대식 세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 뿐만 아니라 전술한 것들 중 임의의 것의 관능적 단편들(functional fragments)이다.
특정 실시예들에서, 피분석물은 호르몬이다. 호르몬들의 예들은 에피네프린, 멜라토닌, 노르에피네프린, 트리요도티로닌, 티록신, 도파민, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 프로스타시클린, 트롬복산, 아밀린(또는 췌도 아밀로이드 폴리펩티드(islet amyloid polypeptide)), 항뮐러관 호르몬(
Figure pct00004
)(또는 뮐러관 억제 인자 또는 호르몬), 아디포넥틴, 부신 피질 자극 호르몬(adrenocorticotropic hormone)(또는 피질 자극), 안지오텐시노겐 및 안지오텐신, 항이뇨 호르몬(또는 바소프레신, 아르기닌 바소프레신), 심방-나트륨 이뇨 펩티드(atrial-natriuretic peptide)(또는 아트리오펩틴), 뇌 나트륨 이뇨 펩티드, 칼시토닌, 콜레시스토키닌, 피질 자극-방출 호르몬, 코티스타틴(cortistatin), 엔케팔린, 엔도텔린, 에리트로포이에틴, 난포 자극 호르몬, 갈라닌, 위 억제 폴리펩티드, 가스트린, 그렐린, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드-1, 고나도트로핀-방출 호르몬, 성장 호르몬-방출 호르몬, 헵시딘, 인간 융모성 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin), 인간 태반 락토겐(human placental lactogen), 성장 호르몬, 인히빈, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(또는 소마토메딘), 렙틴, 리포트로핀, 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone), 멜라닌 세포 자극 호르몬, 모틸린, 오렉신, 오스테오칼신, 옥시토신, 췌장 폴리펩티드, 부갑상선 호르몬, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제(pituitary adenylate cyclase)-활성화 펩티드, 프로락틴, 프로락틴 방출 호르몬, 릴랙신, 레닌, 세크레틴, 소마토스타틴, 트롬보포이에틴, 갑상선 자극 호르몬(또는 타이로트로핀), 타이로트로핀-방출 호르몬, 혈관작용장 펩티드(vasoactive intestinal peptide), 구아닐린, 요구아닐린(uroguanylin), 테스토스테론, 디히드로에피안드로스테론, 안드로스테네디온, 디히드로테스토스테론, 알도스테론, 에스트라디올, 에스트론, 에스트리올, 코티솔, 프로게스테론, 칼시트리올(1,25-디히드록시비타민 D3), 및 칼시디올(25-히드록시비타민 D3)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
나노 구조들은 본 기술분야에 알려진 표준 화학 물질들을 이용하여 관능화될 수 있다. 초기 문제로서, 나노 구조들의 표면들은 표준 링커 화학 물질들을 포함하는 표준 화학 물질들을 이용하여 결합제를 결합시키기 위해 활성화될 수 있다.
결합제는, 직접적으로 또는 화학적 링커를 통해, (예를 들어, 나노 구조의 표면 상에 또는 표면에 존재하는 실라놀 기들을 통해) 나노 구조의 표면과 반응할 수 있는 관능기를 포함하거나 포함하도록 조작될 수 있다.
하나의 접근법에서, 나노 구조의 표면 실라놀 기들은 반응성 기(예를 들어, 일차 아민)를 갖는 하나 이상의 활성화 작용제, 예컨대 알콕시 실란, 클로로실란, 또는 대안적인 실란 양식으로 활성화될 수 있다. 반응성 기를 갖는 예시적인 알콕시 실란들은, 예를 들어, 아미노실란(예를 들어, (3-아미노프로필)-트리메톡시실란(APTMS), (3-아미노프로필)-트리에톡시실란(APTES), (3-아미노프로필)-디에톡시-메틸실란(APDEMS), 3-(2-아미노에틸아미노프로필)트리메톡시실란(AEAPTM)), 글리시독시실란(예를 들어, (3-글리시독시프로필)-디메틸-에톡시실란(GPMES)), 또는 메르캅토실란(예를 들어, (3-메르캅토프로필)-트리메톡시실란(MPTMS) 또는 (3-메르캅토프로필)-메틸-디메톡시실란(MPDMS))을 포함할 수 있다. 반응성 기를 갖는 예시적인 클로로실란들은 3-(트리클로로실릴)프로필 메타크릴레이트(TPM) 및 10-이소시아나토데실클로로실란을 포함한다.
그 후, 결합제 상의 관능기, 예를 들어, 리신 잔기 상의 측쇄 상의 일차 아민을 다양한 가교제들을 이용하여 나노 구조의 표면에 부가된 반응성 기에 부착시킬 수 있다. 예시적인 가교제들은, 예를 들어, 동종이관능성(homobifunctional) 가교제들(예를 들어, 글루타르알데히드, 비스말레이미도헥산, 비스(2[숙신이미도옥시카르보닐옥시]에틸) 술폰(BSOCOES), [비스(술포숙신이미딜)수베레이트](BS3), (1,4-디-(3'-[2피리딜디티오]-프로피온아미도)부탄(DPDPB), 디숙신이미딜 수베레이트(DSS), 디숙신이미딜 타르트레이트(DST), 술포디숙신이미딜 타르트레이트(술포 DST), 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트(DSP)), 3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜 프로피오네이트(DTSSP), 에틸렌 글리콜 비스(숙신이미딜 숙시네이트)(EGS), 비스(β-[4-(아지도살리실아미도]-에틸)디설파이드 요오드화 가능(BASED), 동종이관능성 NHS 가교 시약들(예를 들어, 비스 N-숙신이미딜-[펜타에틸렌 글리콜] 에스테르(비스(NHS)PEO-5), 및 PEG 또는 덱스트란 중합체들의 동종이관능성 이소티오시아네이트 유도체) 및 이종이관능성(heterobifunctional) 가교제들(예를 들어, 숙신이미딜 4-(N 말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 숙신이미딜-4-(N 말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복시(6-아미도카프로에이트)(LC-SMCC), N 말레이미도벤질-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS), 숙신이미드 4-(p-말레이미도페닐) 부티레이트(SMPB), N-히드록시-숙신이미드 및 N-에틸-'(디메틸아미노프로필)카르보디이미드(NHS/EDC), (
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말레이미도-카프로산)히드라지드(술포EMCS), N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA), 모노플루오로 시클로옥틴(MFCO), 비시클로[6.1.0]노닌(BCN), N숙시이미딜-S-아세틸티오프로피오네이트(SATP), 말레이미도 및 디벤조시클로옥틴 에스테르(DBCO 에스테르), 및 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC))를 포함할 수 있다.
예로서, 본 명세서에 설명된 나노 구조들을 알콕시 실란(예를 들어, APTMS)을 통해 활성화하여 표면 실라놀 기들의 유리 히드록실 기(free hydroxyl group)들을 변형하여 반응성 기(예를 들어, 일차 아민)를 생성할 수 있다. 그 후 나노 구조 상에 생성된 반응성 기(예를 들어, 일차 아민)를, 예를 들어, 단백질, 예를 들어 관심 항체 내의 리신 아미노산의 측쇄에 존재하는 유리 아민 기(free amine group)와 공유 결합을 형성하는 가교제, 예를 들어, 글루타르알데히드와 반응시킬 수 있다.
하나 이상의 결합제를 본 명세서에 설명된 나노 구조들의 표면에 공유 결합으로 결합시키기 위해 본 기술분야에 알려진 다른 활성화 및 접합 화학 물질들이 사용될 수 있는 것이 고려된다.
주어진 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈가 관심 피분석물을 결합하는 결합제로 관능화될 수 있는 것이 고려된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "결합제(binding agent)"는 관심 피분석물에 특이적으로 결합하는 작용제를 지칭한다. 결합제와 관련하여 사용된 용어들 "우선적으로 결합(bind preferentially)" 또는 "특이적으로 결합(binds specifically)"은 그것이 타깃 피분석물 이외의 분자와 하는 것보다 특정 타깃 피분석물과 (i) 더 안정적으로, (ii) 더 빠르게, (iii) 더 강한 친화도로, (iv) 더 긴 지속기간으로, 또는 (v) (i)-(iv) 중 임의의 2개 이상의 조합으로 결합하는 그리고/또는 연관되는 작용제를 지칭한다. 예를 들어, 타깃 피분석물을 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 결합제는, 예를 들어, 그것이 상이한 피분석물을 결합하는 것보다 더 강한 친화도, 결합력(avidity)으로, 더 쉽게, 그리고/또는 더 큰 지속기간으로, 타깃 피분석물을 결합하는 결합 도메인이다. 결합제는, 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 약 100nM, 50nM, 20nM, 15nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1nM, 0.5nM, 0.1nM, 또는 0.01nM, 또는 더 강한 피분석물에 대한 친화도일 수 있다. 예를 들어, 결합제는 약 0.01nM 내지 약 100nM, 약 0.1nM 내지 약 100nM, 또는 약 1nM 내지 약 100nM 범위 내의 피분석물에 대한 친화도를 가질 수 있다. 제1 타깃 피분석물에 우선적으로 결합하는 결합제는 제2 타깃 피분석물에 우선적으로 결합할 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 것이 이해된다. 그에 따라, "우선적 결합"은 배타적 결합을 반드시 요구하지는 않는다(포함할 수는 있지만).
예시적인 결합제들은 효소들(예를 들어, 기판들 및 억제제들을 결합하는), 항체들(예를 들어, 항원들을 결합하는), 항원들(예를 들어, 타깃 항체들을 결합하는), 수용체들(예를 들어, 리간드들을 결합하는), 리간드들(예를 들어, 수용체들을 결합하는), 핵산 단일-가닥 중합체들(예를 들어, 핵산 분자들을 결합하여, 예를 들어 DNA-DNA, RNA-RNA 또는 DNA-RNA 이중 가닥들을 형성하는), 및 타깃 피분석물들과 결합하는 합성 분자들을 포함한다. 천연, 합성, 반합성, 및 유전자 변경된 거대 분자들이 결합제들로서 이용될 수 있다. 결합제들은 생물학적 결합제들, 예를 들어, 항체, 앱타머, 수용체, 효소, 또는 핵산을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된, 용어 "항체"는, 변형된, 조작된, 또는 화학적으로 접합된 온전한 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하여, 온전한 항체(예를 들어, 온전한 단일 클론 항체) 또는 항체의 항원-결합 단편(예를 들어, 단일 클론 항체의 항원-결합 단편)을 의미하는 것으로 이해된다. 변형된 또는 조작된 항체들의 예들은 키메라 항체들, 인간화된 항체들, 및 다중 특이 항체들(예를 들어, 이중 특이 항체들)을 포함한다. 항원-결합 단편들의 예들은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 단일쇄 항체들(예를 들어, scFv), 미니바디들(minibodies), 및 다이어바디들(diabodies)을 포함한다.
특정 실시예들에서, 항체는 약 300pM, 250pM, 200pM, 190pM, 180pM, 170pM, 160pM, 150pM, 140pM, 130pM, 120pM, 110pM, 100pM, 90pM, 80pM, 70pM, 60pM, 50pM, 40pM, 30pM, 20pM, 또는 10pM, 또는 그 미만의 KD로 그것의 타깃에 결합한다. 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 IgE 아이소타입을 가질 수 있다.
항체들뿐만 아니라 다른 단백질 결합제들을 생성하기 위한 방법들이 본 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 단백질 결합제들은 천연 소스들로부터 정제되거나 재조합 DNA 기술들을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 단백질 결합제를 인코딩하는 DNA 분자들이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법들에 의해 합성될 수 있다. 원하는 단백질 기반 결합제들을 인코딩하는 결과적인 핵산들은, 종래의 트랜스펙션 또는 형질 전환(transformation) 기법들을 통해 숙주 세포들 내로 도입될 수 있는, 발현 벡터(expression vector)들에 혼입(결찰(ligate))될 수 있다. 형질 전환된 숙주 세포들은 숙주 세포들이 관심 단백질들을 인코딩하는 유전자들을 발현하도록 허용하는 조건들 하에서 성장될 수 있다. 구체적인 발현 및 정제 조건들은 이용된 발현 시스템에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 유전자가 E. coli에서 발현되어야 한다면, 그것은 먼저 적합한 박테리아 프로모터, 예를 들어, Trp 또는 Tac, 및 원핵(prokaryotic) 신호 서열로부터 하류에 조작된 유전자를 위치시킴으로써 발현 벡터 내로 복제된다. 발현된 분비된 단백질은 굴절체 또는 봉입체에 축적되고, 프랑스 프레스 또는 초음파 처리에 의한 세포들의 파괴 후에 채취될 수 있다. 그 후 굴절체들은 가용성으로 되고, 단백질들은 본 기술분야에 알려진 방법들에 의해 재접힘되고 벽개된다. 조작된 유전자가 진핵 숙주 세포들, 예를 들어, CHO 세포들에서 발현되어야 한다면, 그것은 먼저 적합한 진핵 프로모터, 분비 신호, 폴리 A 서열, 및 정지 코돈(stop codon)을 포함하는 발현 벡터에 삽입된다. 유전자 구조체는 종래의 기법들을 이용하여 진핵 숙주 세포들 내로 도입될 수 있다. 그 후, 숙주 세포들을 단백질 기반 결합제의 발현을 허용하는 조건들 하에 배양한다. 발현 후에, 폴리펩티드는, 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 또는 히스티딘 태그들과 같은 친화도 태그들을 포함하는 본 기술분야에 알려진 기법들을 이용하여 채취 및 정제 또는 단리될 수 있다.
예시적인 핵산 기반 결합제들은 앱타머(aptamer)들 및 스피에겔머(spiegelmer)들을 포함한다. 앱타머들은 특정 타깃 분자에 대해 강한 결합 활성도를 갖는 핵산 기반 서열들이다. 스피에겔머들은 결합 친화도들 및 기능성과 관련하여 앱타머들과 유사하지만, 자연적으로 발생하는 뉴클레아제 민감성 D-올리고뉴클레오티드들보다는 뉴클레아제 저항성 L-올리고뉴클레오티드들을 이용하여 달성되는, 효소 분해(enzymatic degradation)를 방지하는 구조를 갖는다.
앱타머들은 고친화도 및 특이성으로 타깃 분자들에 결합하는 특정 핵산 서열들이고, 예를 들어, 미국 특허 제5,475,096호 및 제5,270,163호에 기재된 바와 같이, SELEX(Selective Evolution of Ligands by Evolution)로서 흔히 알려진 방법들에 의해 식별된다. 각각의 SELEX-식별된 핵산 리간드는 주어진 타깃 화합물 또는 분자의 특이성 리간드(specific ligand)이다. SELEX 프로세스는, 핵산들이, 다양한 2차원 및 3차원 구조들을 형성하기 위한 충분한 용량과, 단량체이든 중합체이든, 사실상 임의의 화학적 화합물과의 리간드들로서의 역할을 하는 (특이적 결합 쌍들을 형성하는) 그들의 단량체 내에서 이용 가능한 충분한 화학적 다기능성(chemical versatility)을 갖는다는 관찰에 기초한다. 임의의 크기 또는 구성의 분자들이 타깃으로서 역할을 할 수 있다.
고친화도 결합의 적용에 적용되는 SELEX 방법은, 결합 친화도 및 선택도의 사실상 임의의 원하는 기준을 달성하기 위해, 동일한 일반적 선택 방식을 이용하여, 후보 올리고뉴클레오티드들의 혼합물로부터의 선택과 결합, 분할 및 증폭의 단계적 반복들을 수반한다. 바람직하게는 랜덤화된 서열의 절편을 포함하는 핵산들의 혼합물로부터 시작하여, SELEX 방법은 상기 혼합물을 결합에 유리한 조건들 하에서 타깃과 접촉시키는 단계, 타깃 분자들에 특이적으로 결합한 핵산들로부터 미결합 핵산들을 분할하는 단계, 핵산-타깃 복합체들을 해리하는 단계, 핵산-타깃 복합체들로부터 해리된 핵산들을 증폭하여 핵산들의 리간드 강화된 혼합물을 수득하는 단계, 그 후 원하는 만큼 많은 사이클들을 통해 결합, 분할, 해리, 및 증폭 단계들을 반복하여 타깃 분자에 대해 고도로 특이적인 고친화도의 핵산 리간드들을 수득하는 단계를 포함한다. 따라서, 이 방법은, 주어진 타깃 분자에 대한 결합과 같은, 특정 기능성에 대해 핵산 분자들의 큰 랜덤 풀들의 스크리닝을 허용한다.
이 SELEX 방법은 또한, 개선된 생체내 안정성 및 프로테아제 내성과 같은, 리간드에 대한 개선된 특성들을 부여하는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 고친화도 핵산 리간드들의 식별을 포함한다. 그러한 변형들의 예들은 리보스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드들을 포함하는 SELEX 프로세스-식별된 핵산 리간드들은 미국 특허 제5,660,985호 및 제5,580,737호에 기재되어 있고, 이는, 예를 들어, 2'-아미노, 2'-플루오로, 및/또는 2'-O-메틸 모이어티로 2' 위치에서 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 고도로 특이적인 핵산 리간드들을 포함한다.
뉴클레아제 활성도에 대해 더 내성이 있도록 하기 위해 추가적인 변형들을 필요로 할 수 있는, 앱타머들을 사용하는 대신에, L-리보스 또는 L-2'디옥시리보스 단위들로 구성된 스피에겔머들, 미러 이미지 앱타머들(미국 특허 제8,841,431호, 제8,691,784호, 제8367,629호, 제8,193,159호 및 제8,314,223호 참조)이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있는 것이 고려된다. 스피에겔머들에서의 키랄 반전(chiral inversion)은 천연 D-올리고뉴클레오티드 앱타머들과 비교하여 개선된 혈장 안정성을 야기한다. L-핵산들은 뉴클레아제들의 광범위한 존재로 인해 수용액들에서 그리고 생물학적 표본들에서 그다지 안정적이지 않은 자연적으로 발생하는 D-핵산들의 거울상체(enantiomer)들이다. 자연적으로 발생하는 뉴클레아제들, 특히 동물 세포들로부터의 뉴클레아제들은 L-핵산들을 분해할 수 없다.
체외 선택을 이용하여, 타깃 분자, 예를 들어, D-펩티드의 합성 거울상체에 결합하는 올리고뉴클레오티드가 선택될 수 있다. 그 후 결과적인 앱타머를 L-구성에서 재합성하여 원래의 앱타머와 동일한 친화도 및 특이성을 갖는 생리학적 타깃을 미러-이미지 타깃에 결합하는 (미러에 대한 독일 "스피에겔"로부터의) 스피에겔머를 생성한다. 이 접근법은, 예를 들어, 헵시딘(미국 특허 제8,841,431호 참조), MCP-1(미국 특허 제8,691,784호, 제8367,629호 및 제8,193,159호 참조) 및 SDF-1(미국 특허 제8,314,223호 참조)을 결합하는 스피에겔머들을 합성하기 위해 사용되었다.
(III) 카트리지
본 명세서에 설명된 센서들은, 일단 제조되면, 검출 시스템 내에서 사용하기 위해 카트리지에 포함되거나 달리 그 안에 조립될 수 있다. 본 발명은 또한 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 카트리지를 제공한다. 상기 카트리지는 전술한 센서들 중 임의의 하나 이상의 센서를 포함하는 적어도 하나의 웰을 정의하는 하우징을 포함한다. 상기 하우징은 복수의 웰을 정의할 수 있고, 각각의 웰은 전술한 센서들 중 임의의 하나 이상의 센서를 포함한다. 상기 웰들은 기판에 의해 정의될 수 있거나(예를 들어, 그와 일체일 수 있거나) 기판 상에 배치된 개스킷에 형성된 구멍에 의해 정의될 수 있다.
도 15a, 도 15b, 도 16a 및 도 16b를 참조하면, 본 명세서에 설명된 센서들은 카트리지 어셈블리(소모성 어셈블리)(400)에 통합될 수 있다. 카트리지 어셈블리는 하우징 또는 베이스(410), 나노 구조들의 시리즈가 배치되는 웨이퍼 기판(420), 및 개스킷(430)을 포함할 수 있다. 개스킷(430)은, 웨이퍼 기판(420) 위에 배치될 때, 웰들을 정의할 수 있고, 각각의 웰의 베이스는 하나 이상의 센서를 포함할 수 있다. 웨이퍼 기판은, 기판을 유지하고 검출 시스템 내로 쉽게 삽입 가능하도록 구성되는, 하우징 또는 베이스(410) 내로 끼워진다. 하우징 또는 베이스는 다양한 상이한 재료들, 예를 들어, 알루미늄과 같은 금속뿐만 아니라 플라스틱 또는 고무로 만들어질 수 있다. 하우징 또는 베이스는 센서 시스템 내로의 그것의 배치를 용이하게 하기 위해 그리고/또는 배향을 확인하기 위해, 각진 코너와 같은 피처를 가질 수 있다.
개스킷(430)은, 예를 들어, 실리콘 또는 플라스틱으로 제조될 수 있고 웨이퍼 기판 위에 놓이도록 형상화되고, 개구들(440)은 웨이퍼 기판 상에 또는 그 내부에 배치된 센서들을 포함하는 웨이퍼 기판과 웰들을 생성하도록 치수화된다. 웰들을 정의하는 개구들(440)은 분석될 표본의 적어도 일부, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 또는 50μL을 포함하도록 치수화될 수 있다. 전형적으로, 웰들은 개스킷(430)에 의해 정의되는 벽들 및 웨이퍼 기판(420)에 의해 정의된 바닥 부분을 포함하고, 센서가 웰 내에 기판 상에 배치된다. 웰의 직경은 600μm 내지 90mm(예를 들어, 1mm 내지 80mm)의 범위일 수 있고, 1mm의 두께를 가질 수 있다. 일부 실시예들에서, 웰들은 제조 공정 동안 기판과 일체로 형성될 수 있다.
도 17은 본 발명의 실시예들에 따른, 단일 플렉스 소모성 카트리지(400) 및 1,000 플렉스 소모성 카트리지(400')의 사시도를 도시한다. 이들 실시예에서, 단일 플렉스 카트리지에 대한 센서는 단일 피분석물을 검출 및/또는 정량화하도록 구성되는 반면, 1,000 플렉스 카트리지는 1,000개까지의 상이한 피분석물들을 동시에 검출 및/또는 정량화하도록 구성된다. 또한, 개스킷(430) 내의 웰들(440)의 치수들 및 배치는 단일 웰에 포함될 센서들의 수를 수용하도록 조정된다. 본 명세서에 설명된 기술들이 스케일링 가능하고 카트리지가 광범위한 형상들 및 크기들로 제조될 수 있다는 것이 이해된다. 특정 실시예들에서, 카트리지는 마이크로플레이트들에 대한 SBS(Society for Biomolecular Screening) 치수 표준들, 예를 들어, 표준 96 웰 마이크로플레이트들을 충족시키도록 구성된다. 따라서, 웨이퍼 기판 및 베이스 양쪽 모두는 형상이 직사각형일 수 있고, 베이스는 128mm의 길이 및 86mm의 폭을 갖고, 이는 다양한 액체 핸들링 시스템들과의 인터페이싱 및 다양한 액체 핸들링 플랫폼들 상의 휴대성의 편의를 용이하게 한다.
III. 시스템 고려사항들
본 발명은 또한 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 (a) 전술한 센서들 중 임의의 하나 이상의 센서 또는 전술한 카트리지들 중 임의의 하나 이상의 카트리지를 수용하기 위한 수용 챔버; (b) 적어도 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈를 조명하기 위한 광원; 및 (c) 적어도 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈에서의 광학적 특성의 변화를 검출하기 위한 검출기; 및 옵션으로 (d) 상기 제1 농도 범위와 옵션으로 임의의 제2 농도 범위 사이의 인터페이스 및 옵션으로 임의의 제2 농도 범위와 임의의 제3 농도 범위 사이의 인터페이스를 식별하는 컴퓨터 알고리즘을 구현하는 컴퓨터 프로세서를 포함한다.
도 18 및 도 19를 참조하면, 예시적인 센서 시스템(500)은 관심 표본 내의 피분석물의 검출, 또는 그것의 양의 정량화를 용이하게 하도록 구성된다. 센서 시스템(500)은 터치 스크린 인터페이스(520) 및, 예를 들어, 데이터 포트(530)를 갖는 시스템 하우징(510)을 포함할 수 있다. 하우징 내의 로드/언로드 도어(540)는, 예를 들어, 광학적 검출 시스템(570)에 대해 카트리지를 유지하고 위치시키기 위한 X-Y 스테이지(560)를 포함하는 센서 시스템의 수용 챔버(550) 내로 카트리지(400)의 도입을 가능하게 하도록 크기 설정되고 구성될 수 있다. 광원(580)은 카메라/검출기(590)를 통해 광을 송신하도록 구성된다. 카메라는 사용 동안 카트리지 위에 위치하고, 카트리지에 배치된 기판(420) 상의 적어도 나노 구조들의 제1, 제2, 및/또는 제3 시리즈에서의 광학적 특성의 변화를 검출하도록 구성된다. 광원(580)은 나노 구조들, 예를 들어, 카트리지의 웨이퍼 기판 상에 배치된 나노 구조들을 조명하도록 구성된다. 시스템은 제1 농도 범위들 및/또는 제2 농도 범위들 및/또는 제3 농도 범위들 사이의 인터페이스를 식별하기 위한, 그리고 표본들 내의 피분석물들을 정량화하기 위한 알고리즘을 구현하기 위한 컴퓨터 프로세서를 포함하는 컴퓨터(600)를 포함할 수 있다. 센서 시스템은 시스템을 제어하기 위한 제어 플랫폼(610)을 또한 포함할 수 있다. 따라서, 시스템은 3개의 주요 서브-어셈블리들: 제어 시스템, 이미징 시스템, 및 카트리지 핸들링 시스템을 포함한다. 이들 서브-어셈블리는 공급 체인 복잡성을 최소화하고 조립 시간을 감소시키기 위해 상업적으로 입수 가능한 구성 요소들을 이용할 수 있다.
이미징 시스템은 광학적 검출 시스템(570)을 포함하고, 여기서 광원(580)은 센서의 기판 상에 배치된 복수의 나노 구조에 충돌하도록 조명기 어셈블리(620) 및 대물렌즈(630)를 통해 광을 지향시키도록 구성된다. 센서와 상호작용한 후에, 반사된 광은 대물렌즈(630)를 통과하여 검출기(590)에 의해 캡처된다. 대물렌즈(630) 위에 스톱(640)이 배치된다. 이 스톱은, 조명이 기판에 도달하는 방법 및 이미지가 검출기에 송신되는 방법을 포함하여, 조명을 제어하는 암시야 광 스톱이다. 현미경 시스템의 기계적 튜브 길이는 L1로 지시되고, 10mm 내지 300mm의 범위일 수 있다. 대물렌즈의 작동 거리는 L2로 지정되고, 약 2mm 내지 약 5mm의 범위일 수 있다. 특정 실시예들에서, L1은 L2보다 크다.
도 20에 예시된 바와 같이, 측정은 광학적 측정일 수 있다. 예를 들어, 광원(580)은 나노 구조들(20) 및 피분석물들(650)이 위에 배치된 기판(320)을 조사하기 위해 사용될 수 있고, 하나 이상의 검출기(590)가 기판에 충돌하는 광을 검출하도록 위치된다. 기판으로부터 편향되는 광은 광원의 동일한 방향으로, 반대 방향으로, 직교 방향으로 또는 광원에 대해 비스듬히 있을 수 있다. 광학적 검출 시스템의 사용에 의해 획득된 이미지들에 존재하는 데이터는 표본에 존재하는 피분석물의 농도를 제공하도록 처리될 수 있다.
도 21은 센서 및 관련 시스템의 다양한 실시예들과 관련된 정보 과학에 대한 하나의 접근법을 도시한다. 평균적으로, 주어진 영역 내의 모든 나노 구조들은 실질적으로 동일한 구성이고 통계적으로 실질적으로 유사한 양 또는 수의 피분석물 결합 부위를 갖는다. 따라서, 표본 내의 피분석물의 주어진 농도에 대해, 해당 영역 내의 각각의 나노 구조는 동일한 수의 분자들을 결합할 것으로 예상될 수 있다. 센서가 넓은 동적 범위를 갖기 위해, 다양한 구성들의 나노 구조들을 갖는 복수의 디지털 및 아날로그 영역이 제공될 수 있다.
표본 내의 피분석물의 농도는 센서의 디지털 영역들에서 검출 가능한 최저 농도 내지 검출 가능한 최고 농도의 범위이므로, 시스템은 (예를 들어, 하나의 상태에서 다른 상태로 뒤집힘으로써) 임계 값 위의 피분석물의 결합에 대응하는 분리된 색 변화를 입증하는 나노 구조들의 양 또는 수를 검출하도록 구성된다. 검출 가능한 색 변화를 나타내는 또는 뒤집힌 이산 나노 구조들의 백분율이 높을수록, 결합된 피분석물의 수가 많아지고, 따라서, 표본 내의 피분석물의 농도가 높아진다. 도 21에 묘사된 바와 같이, 이 뒤집힘 거동은, 데이터 클러스터링을 보여주는 산포도들, 데이터 분포를 보여주는 히스토그램들 등을 포함하여, 다양한 포맷들로 시각적으로 제시될 수 있다. 표본에의 노출 전뿐만 아니라 노출 후의 센서의 특정 영역을 보여주는, 각각의 영역의 비교 이미지들이 또한 제공될 수 있다. 뒤집힘 결정의 결과들을 더 명확하게 묘사하는 제3 주석된 이미지가 제공될 수 있다. 뒤집힌 나노 구조들 및 유효 나노 구조들의 절대 수뿐만 아니라 뒤집힌 나노 구조들 대 유효 나노 구조들의 연관된 비율 값을 지시하는 수치 데이터가 또한 유리하게 제시된다. 특히, "뒤집힌 니들들(flipped needles)"은 임계 값을 초과하고 양성으로서 카운팅되는 센서들의 수를 나타낸다. "총 유효 니들들(Total valid needles)"은 총 모집단의 일부로서 카운팅되는 센서들의 수를 나타낸다. 예상된 파라미터들의 외부에서 거동하는 센서들은 폐기되고 후속 분석에 포함되지 않는다. 남은 센서들만이 "유효"한 것으로 간주된다. 뒤집힌 비율은 뒤집힌 니들들을 총 유효 니들들로 나눈 계산된 값이다. 거부율, 즉, 전 이미지(pre-image)로부터 폐기되는 니들들의 백분율이 또한 묘사될 수 있다. 이는 센서 품질/건강의 척도로서 사용된다. 약 10% 이상의 거부율 값들을 갖는 센서들은 불량한 품질로 간주되고 일반적으로 신뢰할 만한 데이터를 제공하지 않는다.
그러나, 일부 더 높은 임계 농도에서는, 모든 디지털 영역 나노 구조들이 피분석물을 결합하였다. 센서의 디지털 영역들은 사실상 포화되었다. 모든 나노 구조들이 뒤집혔고 국부적인 색 변화가 쉽게 명백하지 않다. 이 시점에서, 일반적으로 더 많은 수의 결합 부위들을 갖는 더 큰 나노 구조들을 갖는 아날로그 영역들로 주의가 이동된다.
주어진 나노 구조의 색 변화의 정도는 결합된 분자들의 총 질량 대 해당 나노 구조의 총 질량의 비율과 관련될 수 있다. 단지 100개 미만의 분자를 결합할 수 있는 더 작은 아날로그 영역 나노 구조들이 초기에(예를 들어, 청색/녹색 범위에서) 차가운 색조를 입증할 수 있다. 수백 개의 분자를 결합할 수 있는 더 큰 아날로그 영역 나노 구조들이 초기에(예를 들어, 황색/오렌지색 범위에서) 더 따뜻한 색조를 입증할 수 있다. 아날로그 영역들 내의 더 높은 검출 가능한 농도들에서는, 더 많은 피분석물들이 주어진 나노 구조에 결합함에 따라, 검출 가능한 색조는 더 따뜻하게 시프트한다. 따라서, 노출되지 않은 청색 나노 구조는 표본 내의 특정 피분석물 농도에 대해 결합 후에 더 녹색을 띤 색조를 나타낸다. 표본 내의 더 높은 피분석물 농도들에서는, 색조는 더 누르스름하게 시프트할 수 있다. 유사하게, 더 큰 나노 구조들 및 더 높은 농도들을 검출하도록 구성된 더 많은 결합 부위들을 갖는 아날로그 영역에서, 초기 노출되지 않은 황색 나노 구조는 표본 내의 특정 피분석물 농도에 대해 결합 후에 더 오렌지색의 색조를 나타낸다. 표본 내의 더 높은 피분석물 농도들에서는, 색조는 더 불그스름하게 시프트할 수 있다.
색 시프트는 단일 아날로그 나노 구조만으로 검출 가능하지만, 유사한 크기의 나노 구조들의 시리즈 또는 어레이의 영역들이 유리하게 이용된다. 유사한 크기의 나노 구조들의 큰 분포를 제공함으로써, 아날로그 영역 색 시프트 및 따라서 검출된 피분석물 농도를 더 신뢰성 있게 검출하기 위해 평균 판독이 제공될 수 있다.
더 구체적으로, 도 22는 센서의 전체 동적 범위에 걸쳐 피분석물 농도를 신뢰성 있게 검출하기 위해, 시스템 레벨에서, 센서의 일 실시예의 다양한 디지털 및 아날로그 영역들의 검출된 출력을 집계하기 위한 하나의 접근법의 흐름도를 도시한다. 이러한 형식의 하이브리드 정보 엔진 알고리즘의 사용은 이산 디지털 및 아날로그 영역들의 사용이 디지털 영역들로부터의 부정확한 더 높은 농도 데이터 및 아날로그 영역들로부터의 부정확한 더 낮은 농도 데이터를 신뢰성 있게 거부하는 것을 허용한다.
도 22의 단계 1에서는, 깨끗한 센서의 다양한 디지털 및 아날로그 영역들은 센서의 전체 이미지의 일부로서 광학적으로 이미징되어, 특정 센서에 대한 각각의 영역의 이미지 상태 및 그와 연관된 나노 구조들(예를 들어, 존재 또는 부재, 초기 색조 등)의 신뢰할 만한 베이스라인 기록을 제공한다. 단계 2에서는, 센서는 표본에 노출되고, 표본 내의 임의의 피분석물이 나노 구조들 상의 연관된 부위들에 결합하고, 센서는 후속하여 후속 이미징을 위해 통상적으로 준비된다. 단계 3에서는, 시스템은 센서의 노출 후 이미지를 캡처하고, 이는 디지털 영역들에서의 뒤집힘 및 아날로그 영역들에서의 임의의 색조 변화를 검출하기 위해 단계 1의 이미지와 비교하기 위해 사용될 것이다. 단계 4에서는, 알고리즘은 센서의 상이한 검출 영역들(즉, 하나 이상의 디지털 영역 및 하나 이상의 아날로그 영역) 및 센서의 기준 마크에 대한 그들의 레이아웃을 식별한다. 이는 시스템이 전 이미지 및 후 이미지(post image)를 상관 및 정렬하여 각각의 이미지에서 대응하는 나노 구조들을 식별하는 것을 허용한다. 단계 5 및 단계 6은 각각의 대응하는 영역에서 나노 구조별로 전 이미지 및 후 이미지 데이터의 개별 이산 분석을 수반한다. 디지털 영역들에 대해, 단계 7A는, 피분석물을 결합한 각각의 나노 구조를 식별하기 위해 임계 값 위의 국부적 이미지에서의 충분히 큰 시프트를 확인함으로써 결합된 피분석물을 갖는 나노 구조들의 수를 정량화하고 카운팅한다. 아날로그 영역들에 대해, 단계 7B는 국부적으로 및 아날로그 영역에 걸쳐 색조 변화들을 검출하여, 국부적으로 및 집합적으로 나노 구조들이 피분석물을 결합한 것으로 간주하기 위해 전 이미지 색 위의 국부적 이미지에서의 충분히 큰 시프트를 입증한다. 단계 8에서는, 아날로그 영역에서의 색 변화가 미리 결정된 임계 값을 초과한다고 가정하여, 아날로그 영역은 그것의 검출 가능한 범위 내에서 피분석물의 농도를 검출한 것으로 간주된다. 색 변화에 대응하는 피분석물의 실제 농도는 알려진 농도 제어 표본들로 전개된 시스템 메모리에 저장된 표준 곡선과 검출된 색 변화의 비교에 의해 결정된다. 그러나, 아날로그 영역에서의 색 변화가 미리 결정된 임계 값을 초과하지 못하면, 피분석물의 농도는 해당 아날로그 영역에 의해 신뢰성 있게 검출 가능한 것보다 아래인 것으로 간주된다. 더 낮은 농도 구성 아날로그 영역이 이용 가능하다면, 유사한 분석이 수행될 수 있다. 그렇지 않으면, 시스템은 센서의 디지털 영역들에서의 뒤집힌 나노 구조들의 디지털 카운트에 의존한다. 뒤집힌 나노 구조의 양 또는 수에 대응하는 피분석물의 실제 농도는 뒤집힌 디지털 나노 구조의 수를 알려진 농도 제어 표본들로 전개된 시스템 메모리에 저장된 표준 곡선과 비교하는 것에 의해 결정된다.
다른 실시예에서, 디지털 정량화 측정과 아날로그 사이의 전이를 결정하기 위한 예시적인 알고리즘은 (a) 테스트될 용액의 도포 시 상기 제1 시리즈 내의 상기 나노 구조들에 대해 하나의 상태에서 다른 상태로 변화한(뒤집힌) 나노 구조들을 측정하는 단계; (b) 테스트될 용액의 도포 시 상기 제2 시리즈 내의 나노 구조들의 색 공간 변화들을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 제2 시리즈의 색 공간 변화가 미리 선택된 임계 값을 초과하면, 단계 (b)에서 식별된 아날로그 측정치들을 이용하고, 상기 제2 시리즈의 색 공간 변화들이 상기 미리 선택된 임계 값 미만이면, 단계 (a)에서 식별된 디지털 측정치들을 이용하는 단계를 포함한다.
나노 구조 및 결합제 및 다른 시약들의 선택에 기초하여, 다수의 피분석물을 동시에 검출 및/또는 정량화하는 것이 가능하다는 것이 고려된다. 예를 들어, 도 23a에 도시된 바와 같이, 센서는 나노 구조들의 제1 시리즈(700) 및 2개의 분리된 그리고 별개의 피분석물을 결합할 수 있는 나노 구조들의 제2 시리즈(710)가 위에 배치된 기판(420)을 포함할 수 있다. 기판은 검출될 피분석물들의 수에 따라, 나노 구조들의 다수의 시리즈를 포함할 수 있는 것이 고려된다. 유사하게, 도 23b에 도시된 바와 같이, 센서는 2개의 분리된 그리고 별개의 피분석물을 결합하는 2개의 상이한 나노 구조들(700, 710)의 시리즈가 위에 배치된 기판을 포함할 수 있다. 나노 구조들의 시리즈는 추가적인 피분석물들에 결합하는 나노 구조들을 포함할 수 있는 것이 고려된다.
IV. 분석법들
본 발명은 또한 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은: (a) 상기 표본의 적어도 일부를 전술한 센서들 중 임의의 하나 이상의 센서에 적용하는 단계; 및 (b) 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈의 광학적 특성의 변화를 검출하고 이로써 상기 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 단계를 포함한다.
상기 센서는 다양한 표본들, 예를 들어, 체액, 조직 추출물, 및/또는 세포 상청액에서 상기 피분석물을 검출할 수 있다. 예시적인 체액들은, 예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 또는 간질액을 포함한다.
방법은 적어도 일부 표본을 본 명세서에 설명된 구조, 센서, 카트리지, 또는 시스템과 조합하는 단계, 및 피분석물의 존재를 검출하는 그리고/또는 그것을 상기 구조, 센서, 카트리지, 또는 시스템에 결합하는 양을 정량화하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 피분석물을 본 명세서에 설명된 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 결합한 후에, 상기 피분석물의 결합은 상기 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화에 의해 검출될 수 있다. 특정 실시예들에서, 광학적으로 검출 가능한 특성은 색, 광 산란, 굴절, 또는 공명(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 전기 공명, 전자기 공명, 및 자기 공명)이다. 특정 실시예들에서, 전자기 방사선이 상기 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 인가될 수 있고, 인가된 전자기 방사선은 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈가 피분석물을 포함하는 것으로 의심되는 표본들과 상호작용함에 따라 변경될 수 있다. 예를 들어, 피분석물의 존재는 강도, 색, 또는 형광의 변화를 야기할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 표본의 일부를 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 센서에 적용하는 단계를 포함한다. 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함한다. 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함한다. 상기 영역들은, 예를 들어, 나노 구조들의 상기 제1 및 제2 시리즈로부터 검출 가능한 신호를 검출하기 위해 전자기 방사선을 이용하여 조사되고, 상기 신호들은 상기 표본 내의 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양을 나타낸다. 그 후 검출 가능한 신호들로부터 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양이 결정되고 이로써 제1 농도 범위 및 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하거나, 그것의 양을 정량화할 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 방법은 상기 표본의 일부를 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 센서에 적용하는 단계를 포함한다. 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 광학적으로 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정된다. 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정된다. 상기 영역들은, 예를 들어, 나노 구조들의 상기 제1 및 제2 시리즈로부터 검출 가능한 신호를 검출하기 위해 전자기 방사선을 이용하여 조사되고, 상기 신호들은 상기 표본 내의 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양을 나타낸다. 그 후 검출 가능한 신호들로부터 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양이 결정되고 이로써 제1 농도 범위 및 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하거나, 그것의 양을 정량화할 수 있다.
예시적인 분석법에서는, 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈가 관심 피분석물을 결합하는 결합제(예를 들어, 항체)로 관능화된다. 관능화 후에, 타깃 피분석물을 포함하는 표본(예를 들어, 유체 표본)을, 그 표본에 피분석물이 존재한다면, 결합제가 결합제-피분석물 복합체를 형성하는 것을 허용하는 조건들 하에서 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 부가한다. 상기 항체에의 상기 피분석물의 결합은 상기 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화를 야기한다. 특정 분석법들, 예를 들어 무표지 분석법에 대해, 결합제-피분석물 복합체의 단독 형성은 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화를 야기하는 것이 고려된다. 다른 분석법들, 예를 들어, 표지 기반 분석법들에 대해, 피분석물과 복합체를 형성하는 제2 결합제는 복합체에서 직접적으로 또는 간접적으로 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화를 야기하거나 이를 증가시키는 표지를 또한 포함할 수 있다. 나노 구조들은 나노 구조에 부착된 또는 달리 그것과 연관된 입자 또는 비드 없이 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양을 검출할 수 있는 것이 고려된다.
예시적인 샌드위치 면역분석법에서는, 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈가 관심 피분석물을 결합하는 제1 결합제(예를 들어, 제1 항체)로 관능화된다. 관능화 후에, 타깃 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양에 대해 분석될 표본(예를 들어, 유체 표본)을, 그 표본에 피분석물이 존재한다면, 제1 결합제가 제1 결합제-피분석물 복합체를 형성하는 것을 허용하는 조건들 하에서 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 부가한다. 그 후 관심 피분석물을 결합하는 제2 결합제(예를 들어, 제2 항체)가, 그 제2 결합제가 제2 결합제-피분석물 복합체를 형성하는 것을 허용하는 조건들 하에서 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 부가된다. 제1 및 제2 결합제들에의 피분석물의 결합은 "샌드위치" 구성의 복합체를 야기한다. 샌드위치 복합체의 형성은 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화를 야기할 수 있다. 그러나, 특정 분석법들, 예를 들어 무표지 분석법들에 대해, 샌드위치 복합체의 단독 형성은 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화를 야기하는 것이 고려된다. 다른 분석법들, 예를 들어, 표지 기반 분석법들에 대해, 샌드위치 복합체에서의 제2 결합제는 직접적으로 또는 간접적으로 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화를 야기하거나 이를 증가시키는 표지를 포함할 수 있다.
도 24는 피분석물(650)이 나노 구조(20) 상에 고정된 결합제(750)와 상호작용하는 예시적인 분석법을 묘사한다. 나노 구조의 캡처 용량은 나노 구조와 이용 가능한 캡처 작용제 사이의 치수 관계 양쪽 모두에 의해 결정된다. 도 25는 나노 구조(20)와 결합된 피분석물(650) 사이에 1:1 비율(좌측 패널), 나노 구조와 결합된 피분석물 사이에 1:2 비율(중앙 패널), 및 나노 구조와 결합된 피분석물 사이에 1:5 비율(우측 패널)이 존재하는 예시적인 분석법을 묘사한다. 도 26은 나노 구조들(20)이 피분석물들(650)보다 수가 많은 예시적인 분석법을 묘사하는 것으로, 이 경우, 각각의 나노 구조는 기껏해야 하나의 피분석물을 캡처할 가능성이 있다. 나노 구조들(20)은, 위에 논의된 바와 같이, 기판 상에 나노제조 기술들로 직접 제조될 수 있다. 도 27은 피분석물들(650)이 나노 구조의 일부에 결합된, 실리콘 기판(320) 상에 배치된 나노 제조된 나노 구조들(20)을 묘사한다. 피분석물들과 나노 구조들 사이의 결합은 고체 인터페이스 상에서 발생한다. 나노 구조들은 그것의 표면 상의 결합 피분석물들의 수를 결정하기 위해 측정될 수 있다. 도 24 내지 도 27은 단일 결합제(예를 들어, 항체 또는 앱타머)가 타깃 피분석물을 결합하기 위해 사용되는 무표지 면역분석법의 예들을 묘사한다. 이 방법은 결합 친화도들, 결합 역학(온 및 오프 비율) 등을 측정하거나 달리 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
도 28은 복수의 제1 항체(Ab1)가 나노 구조(20)의 유체 노출된 표면 상에 고정되는 예시적인 무표지 면역분석법을 묘사한다. 그 후, 검출 및/또는 정량화될 피분석물(0)을 포함하는 표본을, 바람직하게는 상이한 제2 에피토프를 통해, 단독으로 또는 피분석물을 결합하는 제2 항체(Ab1)와 조합하여 나노 구조들과 접촉시킨다. 제2 항체(Ab2)는 피분석물 뒤에 부가될 수 있다. 2개의 항체(Ab1 및 Ab2) 및 피분석물(0)은, 존재한다면, 나노 구조(20)의 표면 상에 고정되는 복합체를 형성한다. 나노 구조에의 복합체의 결합은 검출 시스템으로 검출될 수 있는 나노 구조들의 특성의 변화를 야기할 수 있다. 도 29는 본질적으로 도 28과 관련하여 위에 설명된 바와 같이 수행되는 예시적인 표지 기반 면역분석법을 묘사하는데, 다만, 이 실시예에서는, 제2 항체가 표지된다. 나노 구조(20)에의 복합체의 결합은 표지(760)를 통해 직접적으로(예를 들어, 금 표지를 통해) 또는 간접적으로(예를 들어, 추가 생성물을 생성하는 효소를 통해) 검출되어 검출 시스템으로 검출될 수 있는 나노 구조들의 특성의 변화를 야기할 수 있다.
대안적인 분석법에서는, 타깃 피분석물의 존재 및/또는 그것의 양에 대해 분석될 표본(예를 들어, 유체 표본)을, (i) 그 표본에 피분석물이 존재한다면, 제1 결합제가 제1 결합제-피분석물 복합체를 형성하는 것을 허용하는 조건들 하에서 제1 결합제(예를 들어, 항체), 및 (ii) 제2 결합제가 제2 결합제-피분석물 복합체를 형성하는 것을 허용하는 조건들 하에서 관심 피분석물을 결합하는 제2 결합제(예를 들어, 제2 항체)와 배양한다. 제1 및 제2 결합제들에의 피분석물의 결합은 "샌드위치" 구성의 복합체를 야기하고, 이는 용액에서 자유롭게 발생한다. 그 후, 분석법에 따라서는, 제1 결합제, 제2 결합제, 및/또는 피분석물을, 복합체이든 또는 비복합체이든, 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 특성(예를 들어, 광학적으로 검출 가능한 특성)의 변화를 생성하기 위해 그 복합체 또는 그것의 구성 요소가 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 의해 결합되도록 하는 조건들 하에서, 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 부가한다. 특정 실시예들에서, 항체들 중 하나 또는 양쪽 모두가 비오틴으로 표지되고, 샌드위치 복합체는, 예를 들어, 아비딘 또는 비오틴으로 관능화된 임의의 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈가 있다면 표면 상에 고정될 수 있다.
전형적으로, 결합제가 항체일 때, 그 후 각각의 분석법 단계 사이에, 결합된 피분석물을 갖는 나노 구조는 약한 세제 용액으로 세척될 수 있다. 전형적인 프로토콜들은 하나 이상의 차단 단계들을 또한 포함하는데, 이는 나노 구조에의 단백질 시약들의 바람직하지 않은 비-특이적 결합을 차단하거나 감소시키기 위해 비-특이적으로 결합하는 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민 또는 카세인의 사용을 수반한다.
표지 기반 분석법들에 사용하기 위한 예시적인 표지들은 방사성 표지, 형광 표지, 시각적 표지, 효소 표지, 또는 진단 또는 예후 분석법들에 유용한 다른 종래의 검출 가능한 표지들, 예를 들어, 입자들, 예컨대 라텍스 또는 금 입자들, 또는 예컨대 라텍스 또는 금 졸 입자들을 포함한다. 예시적인 효소 표지들은, 예를 들어, 서양고추냉이 페록시다아제(HRP), 알칼리 포스파타아제(AP),β-갈락토시다아제(β-Gal), 및 글루코스 옥시다아제(GO)를 포함한다. 표지가 효소일 때, 분석법은 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화를 야기하는 신호를 생성하는 적절한 효소 기판의 부가를 포함한다. 기판은, 예를 들어, 발색성 기판 또는 형광성 기판일 수 있다. HRP를 위한 예시적인 기판들은 OPD(o-페닐렌디아민 디클로라이드; 이는 HRP와의 반응 후 호박색으로 변함), TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘; 이는 HRP와의 반응 후에 청색으로 변함), ABTS(2,2'-아지노-비스[3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염; 이는 HRP와의 반응 후에 녹색으로 변함), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산(ABTS); 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC); 3,3'디아미노벤지딘(DAB); StayYellow(AbCam TM 제품); 및 4-클로로-1-나프톨(4-CN, 또는 CN)을 포함한다. 알칼리 포스파타아제를 위한 예시적인 기판들은 PNPP(p-니트로페닐 포스페이트, 이나트륨 염(Disodium Salt)); 이는 알칼리 포스파타아제와의 반응 후에 황색으로 변함), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP) 및 p-니트로블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT); Stay Green(AbCam TM 제품); 및 4-클로로-2-메틸 벤젠디아조늄(일명 Fast Red)을 포함한다. β-Gal을 위한 예시적인 기판들은 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드(ONPG) 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-B-D-갈락토피라노시드(X-Gal)를 포함한다. GO를 위한 예시적인 기판들은 2,2',5-5'-테트라-p-니트로페닐-3,3'-(3,3'-디메톡시-4,4'-비페닐렌)-디 테트라졸륨 클로라이드(t-NBT)를 포함한다. 바람직한 효소는 빠르고 안정된 회전율(turnover rate)을 갖는다.
바람직할 경우, 표지 및 결합제는 링커, 예를 들어, 벽개성 링커(cleavable linker), 예를 들어, 광벽개성 링커(photocleavable linker), 효소 벽개성 링커(enzyme cleavable linker)에 의해 링크, 예를 들어, 공유 결합으로 연관될 수 있다. 광벽개성 링커는 전자기 방사선(예를 들어, 가시광, UV 광 또는 적외선 광)에 대한 노출에 의해 벽개될 수 있는 링커이다. 링커를 광벽개하기 위해 필요한 광의 파장은 사용된 광벽개성 링커의 구조에 따라 달라진다. 예시적인 광벽개성 링커는 o-니트로벤질 모이어티, p-니트로벤질 모이어티, m-니트로벤질 모이어티, 니토인돌린 모이어티, 브로모 히드록시쿠마린 모이어티, 브로모 히드록시퀴놀린 모이어티, 히드록시페나실 모이어티, 디메토지벤조인 모이어티, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함하는 화학적 분자들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 효소 벽개성 링커들은 DNA, RNA, 펩티드 링커들, β-글루쿠로니드 링커들, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 30은 비오틴(Ab1)으로 표지된 제1 항체 및 HRP(Ab2)로 표지된 제2 항체를 포함하는 예시적인 피분석물 정량화 분석법을 예시한다. 어떠한 항체도 이 스테이지에서 나노 구조 상에 고정되지 않는다. 각각의 항체는, 예를 들어, 피분석물 상의 별개의 에피토프들을 통해 타깃 피분석물에 결합한다. 상기 제1 항체, 제2 항체, 및 피분석물의 배양은 샌드위치 복합체의 형성을 야기한다(단계 1 참조). 그 후 Ab1에 접합된 비오틴에 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 표면(예를 들어, 스트렙타비딘 코팅된 비드들)에 의해 샌드위치 복합체를 캡처한다(단계 2 참조). 이러한 캡처 전략은 고체 표면 상에 미리 고정된(예를 들어, 코팅된) 항체로 피분석물을 직접 캡처함으로써 달리 캡처되는 것보다 더 많은 피분석물을 캡처하는 것이 고려된다. 세척 단계 후에, 원하는 경우, 용액 조건들을 변화시킴으로써(예를 들어, pH, 염 농도 또는 온도를 변화시킴으로써) Ab2를 스트렙타비딘 표면으로부터 용리시키고(단계 3 참조), 그 후 활성화된(그러나 관능화되지 않은) 나노 구조 또는 활성화된 나노 구조들의 시리즈에 적용하고(단계 4 참조), 그 결과 용리된 Ab2 분자들은 활성화된 나노 구조에 의해 캡처된다. 그 후 HRP 기판(예를 들어, TMB)을 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 적용하고, 그 후 이를 촉매 작용에 의해 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈 상에 형성된 생성물(예를 들어, 침전물)로 전환하여 검출 가능한 신호를 생성하고(단계 5 참조), 그 후 이를 시스템에 의해 검출할 수 있다(단계 6 참조).
도 31은 비오틴(Ab1)으로 표지된 제1 항체 및 HRP(Ab2)로 표지된 제2 항체를 포함하는 다른 예시적인 피분석물 정량화 분석법을 예시한다. Ab1은 광벽개성 링커를 통해 비오틴에 공유 결합으로 링크된다. 각각의 항체가 타깃 피분석물에 결합한다. 상기 제1 항체, 제2 항체, 및 피분석물의 배양은 샌드위치 복합체의 형성을 야기한다(단계 1 참조). 그 후 Ab1 상의 비오틴에 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 표면(예를 들어, 스트렙타비딘 코팅된 비드)에 의해 샌드위치 복합체를 캡처한다(단계 2 참조). 농축 및 세척 후, 원하는 경우, 그 후 광벽개성 링커를 벽개하여, 스트렙타비딘 표면으로부터 샌드위치 복합체를 제거하고(단계 3 참조), 복합체를 활성화된 나노 구조 또는 활성화된 나노 구조들의 시리즈에 적용하고(단계 4 참조), 그 결과 Ab2 또는 Ab2 포함 복합체들이 활성화된 나노 구조(들)에 의해 캡처된다. 그 후 HRP 기판(예를 들어, TMB)을 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 적용하고, 그 후 이를 촉매 작용에 의해 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈 상에 형성된 생성물(예를 들어, 침전물)로 전환하여 검출 가능한 신호를 생성하고(단계 5 참조), 그 후 이를 시스템에 의해 검출할 수 있다(단계 6 참조).
도 32는 비오틴(Ab1)으로 표지된 제1 항체 및 비오틴(Ab2)으로 표지된 제2 항체를 포함하는 다른 예시적인 피분석물 정량화 분석법을 예시한다. 각각의 항체가 타깃 피분석물에 결합한다. 상기 제1 항체, 제2 항체, 및 피분석물의 배양은 샌드위치 복합체의 형성을 야기한다(단계 1 참조). 그 후 Ab1 또는 Ab2 상의 비오틴에 결합하는 아비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 표면(예를 들어, 스트렙타비딘 코팅된 비드)에 의해 샌드위치 복합체를 캡처한다(단계 2 참조). 그 후, 광벽개성 링커를 통해 스트렙타비딘에 공유 결합으로 링크된 HRP를 부가하고(단계 3), 이는 Ab1 또는 Ab2 상의 유리 비오틴에 결합한다. 농축 및 세척 후, 적절한 경우, 광벽개성 링커를 벽개하여 HRP를 방출하고, 그 후 이를 활성화된 나노 구조 또는 활성화된 나노 구조들의 시리즈에 적용하고 그에 의해 캡처한다(단계 4 참조). HRP 기판의 부가는 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈의 표면 상에 생성물(예를 들어, 침전물)을 생성하여 검출 가능한 신호를 생성하고(단계 5 참조), 그 후 이를 시스템에 의해 검출할 수 있다(단계 6 참조).
도 33은 비오틴으로 표지된(예를 들어, 그것에 공유 결합으로 결합된) 제1 항체 및 올리고뉴클레오티드로 표지된(예를 들어, 그것에 공유 결합으로 결합된) 제2 항체를 포함하는 다른 예시적인 피분석물 정량화 분석법을 예시한다. 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 일 단부에 위치한 벽개성 링커에 의해 항체에 링크되고, 다른 단부는 옵션으로 검출 가능한 표지(예를 들어, 형광단 또는 효소)를 포함한다. 벽개성 링커는 올리고뉴클레오티드의 일 단부에 삽입된 우라실 또는 복수의 우라실일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 단계 1에서 타깃 피분석물에 대한 바코드로서 역할을 할 수 있다. 이는 다중화 반응을 용이하게 하기 위해 상이한 피분석물들에 결합하는 항체들로 수행될 수 있다. 각각의 항체가 타깃 피분석물(표본 내에 존재한다면)에 결합한다. 상기 제1 항체, 제2 항체, 및 피분석물의 배양은 샌드위치 복합체의 형성을 야기한다(단계 1 참조). 병행하여, 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈를 검출될 각각의 피분석물에 대한 바코드로서 역할을 하는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드들로 관능화시킬 수 있다(단계 1' 참조). 그 후 제1 항체 상의 비오틴에 결합하는 스트렙타비딘 코팅된 표면(예를 들어, 스트렙타비딘 코팅된 비드)에 의해 샌드위치 복합체를 캡처한다(단계 2 참조). 농축 및 세척 후, 적절한 경우, 벽개성 링커들의 벽개에 의해 각각의 복합체 내의 올리고뉴클레오티드들을 방출시킬 수 있고(단계 3 참조), 이를 나노 구조 또는 나노 구조들의 시리즈에 부착된 상보적인 올리고뉴클레오티드들에 적용하고 그에 의해 캡처하고(단계 4 참조), 그 후 이를 시스템에 의해 검출한다(단계 5). 피분석물의 정체 및/또는 농도는 나노 구조의 표면 상에 배치된 상보적인 올리고뉴클레오티드들에 의해 캡처된 바코드 올리고뉴클레오티드들로부터 결정될 수 있다.
도 34는 예시적인 다중 검출 분석법에 대한 시약들을 예시한다. 예를 들어, 복수의 개별 비드가 대응하는 복수의 타깃 피분석물에 결합하는 대응하는 복수의 캡처 항체 Ab1, Ab2, Ab3 등으로 코팅된다(도 34a). 올리고뉴클레오티드(피분석물에 대한 바코드)로 표지된 대응하는 복수의 검출 항체가 벽개성(예를 들어, 광벽개성) 링커를 통해 링크되고(도 34b 참조) 그 후 입자들과 조합된다. 도 34c는 2x5 나노 구조 어레이를 갖는 센서를 나타내고, 여기서 상이한 영역들은 대응하는 바코드 올리고뉴클레오티드들에 상보적인 캡처 올리고뉴클레오티드들을 포함한다. 비드들은 표본과 조합되고 혼합된다. 샌드위치 복합체들이 형성되도록 허용된 후에, 비드들이 세척되고 벽개성 링커의 벽개에 의해 올리고뉴클레오티드들이 방출된다. 그 후 방출된 바코드 올리고뉴클레오티드들(표지가 있거나 없음)은 캡처 올리고뉴클레오티드들의 영역들을 갖는 센서에 적용되고(도 34d 참조), 이들은 적절하게 캡처 및 검출된다. 항체 코팅된 비드들의 수, 올리고뉴클레오티드 표지된 항체들의 수 및 올리고뉴클레오티드 프린팅된 영역들의 수는 수행될 원하는 분석법에 따라 스케일링될 수 있다.
이 설명의 전체에 걸쳐, 구성들(예를 들어, 센서들, 카트리지들 또는 시스템들)이 특정 구성 요소들을 갖거나, 포함하거나, 또는 포함하는 것으로 기술되는 경우, 또는, 프로세스들 및 방법들이 특정 단계들을 갖거나, 포함하거나, 또는 포함하는 것으로 기술되는 경우, 추가로, 언급된 구성 요소들로 본질적으로 구성되는, 또는 그것들로 구성되는 본 발명의 구성들이 존재하는 것, 그리고 언급된 처리 단계들로 본질적으로 구성되는, 또는 그것들로 구성되는 본 발명에 따른 프로세스들 및 방법들이 존재하는 것이 고려된다.
본 출원에서, 요소 또는 구성 요소가 언급된 요소들 또는 구성 요소들의 리스트에 포함되고/되거나 그로부터 선택된다고 하는 경우, 그 요소 또는 구성 요소는 언급된 요소들 또는 구성 요소들 중 어느 하나일 수 있거나, 또는 그 요소 또는 구성 요소는 언급된 요소들 또는 구성 요소들 중 2개 이상으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
또한, 본 명세서에 설명된 구성(예를 들어, 센서, 카트리지 또는 시스템) 또는 방법의 요소들 및/또는 특징들은, 본 명세서에서 명시적이든 암시적이든 간에, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 방식으로 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 특정 특징이 언급되는 경우, 해당 특징은, 문맥으로부터 달리 이해되지 않는 한, 본 발명의 구성들의 다양한 실시예들에서 그리고/또는 본 발명의 방법들에서 사용될 수 있다. 다시 말해서, 본 출원 내에서는, 실시예들이 명확하고 간결한 응용이 작성되고 그려질 수 있게 하는 방식으로 기술되고 묘사되었지만, 실시예들이 본 교시내용들 및 발명(들)을 벗어나지 않고 다양하게 조합되거나 분리될 수 있다는 것을 의도하고 이를 잘 알 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 설명되고 묘사된 도시된 모든 특징들이 본 명세서에 설명되고 묘사된 본 발명(들)의 모든 양태들에 적용가능할 수 있다는 것을 잘 알 것이다.
"~중 적어도 하나"라는 표현은, 문맥 및 사용으로부터 달리 이해되지 않는 한, 그 표현 앞의 언급된 대상들 각각 및 언급된 대상들 중 2개 이상의 다양한 조합들을 개별적으로 포함한다는 것을 이해해야 한다. 3개 이상의 언급된 대상들과 관련된 표현 "및/또는"은 문맥으로부터 달리 이해되지 않는 한 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "포함하다(include)", "포함하다(includes)", "포함하는 (including)", "갖다(have)", "갖다(has)", "갖는(having)", "포함하다(contain)", "포함하다(contains)", 또는 "포함하는(containing)"의 사용은, 이들의 문법적 균등물들을 포함하여, 문맥으로부터 달리 구체적으로 언급되거나 이해되지 않는 한, 일반적으로 확장 가능한(open-ended) 그리고 비제한적인 것으로서, 예를 들어, 추가적인 언급되지 않은 요소들 또는 단계들을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약"의 사용이 정량적 값의 앞에 있는 경우, 본 발명은, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 그 특정 정량적 값 자체를 또한 포함한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "약"은 달리 지시되거나 추론되지 않는 한 공칭 값으로부터의 ±10% 변화를 지칭한다.
단계들의 순서 또는 특정 액션들을 수행하기 위한 순서는 본 발명이 동작가능하게 유지되는 한 중요하지 않다는 것을 이해해야 한다. 또한, 2개 이상의 단계들 또는 액션들이 동시에 수행될 수 있다.
임의의 그리고 모든 예들, 또는 본 명세서에서의 예시적인 표현, 예를 들어, "~와 같은" 또는 "포함하는"의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하려고 의도된 것이고, 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위에 대한 제한을 제기하지 않는다. 본 명세서에서의 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 지시하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
예들
다음의 예들은 단지 예시적인 것이고 본 발명의 범위 또는 내용을 어떤 식으로든 제한하려는 것이 아니다.
예 1 - 타우 단백질을 결합하기 위한 예시적인 센서의 생성 및 테스트
이 예는 농도가 약 6 로그인 동적 범위에 걸쳐 표본 내의 타우 단백질을 정량화하는 데 유용한 센서의 생성을 설명한다.
실리콘 웨이퍼가 세정되고 탈수되었다. 화학 기상 퇴적을 이용하여 실리콘 웨이퍼 상에 SiO2(25nm)의 두꺼운 층을 퇴적하였다. 폴리메틸메타크릴레이트 950 A2(PMMA 950 A2)를 SiO2 층 상에 45초 동안 3,000rpm으로 스핀 코팅하였다. 웨이퍼를 180℃에서 90초 동안 가열하였다. 전자 빔 리소그래피를 이용하여 PMMA 층 상에 나노 구조 단면들을 기록하였다. PMMA를 메틸 이소부틸 케톤/이소프로필 알콜(MIBK/IPA)로 현상하였다. 열 증착기를 이용하여 PMMA 상에 알루미늄의 얇은 층(30nm)을 코팅하였다. 그 후 알루미늄 층의 리프트-오프를 위해 웨이퍼를 밤새 아세톤에 담갔다. 알루미늄을 하드 마스크로서 이용하여, 반응성 이온 에칭을 이용하여 먼저 SiO2 층(25nm)을 에칭하고 그 후 약 150nm에 대해 실리콘 내로 에칭하여 나노 구조들을 형성하였다. 각각의 나노 구조 사이의 피치는 약 2μm였다. 디지털 나노 구조들의 직경은 약 95nm였다. 3개의 크기로 그룹화된 아날로그 나노 구조들의 직경은 약 110nm, 120nm, 및 130nm였다.
나노 구조들을 항체들로 관능화하기 위해, 나노 구조들을 락킹 플랫폼(rocking platform) 상에서 30분 동안 에탄올 중의 5%의 (3-아미노프로필)트리에톡시실란(APTMS)에 담갔다. 추가적인 에탄올을 이용하여 칩을 철저하게 헹구어 칩 상의 과도한 ATPMS를 씻어내었다. 칩을 6 시간 동안 핫 플레이트 상에서 경화시켰다. 나노 구조들의 암시야 광학 이미지들을 광 현미경을 이용하여 캡처하였고 이들 이미지를 전 이미지들로서 할당하였다.
APTMS-변형된 센서 표면을 활성화시키기 위해, PBS(phosphate buffered saline) 중의 5% 글루타르알데히드를 1 시간 동안 부가하였다. 탈이온수에서 헹군 후에, PBS 중의 5μg/mL 타우 항체를 2 시간 동안 센서 표면 상에 코팅하였다. 그 후 PBS 중의 3% 소 혈청 알부민 및 1% 카세인을 1 시간 동안 적용하여 표면에 대한 비-특이적 결합을 차단하였다. 그 후 상이한 농도의 재조합 타우 단백질을 2 시간 동안 센서에 적용하였다. 1μg/mL의 비오틴이 부착된 타우-항체(Biotinylated Tau-antibody)를 센서에 1 시간 동안 적용하여 재조합 타우 단백질들과 샌드위치를 형성하였다. 그 후, 0.5μg/mL 스트렙타비딘-HRP를 부가하고 타우 항체 상에서 30분 동안 비오틴 기와 연관되도록 허용하였다. 테트라메틸벤지딘(TMB)을 이용하여 샌드위치 상에 비-용해성 질량을 형성하였다. 질량의 변화는 타우 단백질이 결합된 나노 구조의 색 변화를 유도하였다.
칩을 헹군 후에, 나노 구조의 암시야 이미지들을 촬영하였고, 이들을 후 이미지들로서 할당하였다. 결과적인 센서들(및 데이터 출력들)의 이미지들이 도 3b, 도 35 및 도 37에 도시되어 있다.
디지털 섹션 내의 나노 구조들의 후 이미지들의 시리즈가 상이한 타우 농도들에서 도 35에 도시되어 있다. 하나의 상태에서 다른 상태로 뒤집힌 나노 구조들의 백분율에 의해 양성률(positive rate)이 정의된다. 농도가 증가함에 따라, 양성률도 증가하였다(도 36 참조). 농도가 약 1ng/mL에 도달했을 때, 대부분의 나노 구조들이 색 뒤집힘을 겪었고, 따라서 피분석물들의 증가하는 농도들은 더 이상 양성률을 변화시키지 않았다(도 36에 도시된 바와 같이).
아날로그 섹션 내의 나노 구조들의 색조 값들을 전 이미지와 후 이미지 간에 비교하였다. 델타 색조의 히스토그램이 도 37에 제시되어 있다. 피분석물의 농도가 낮을 때(예를 들어, 1ng/mL 미만), 델타 색조는 0에 가까웠다. 이들 농도 범위에서, 도 36으로부터의 양성 뒤집힘(positive flip)을 피분석물 농도에 대한 지시자로서 사용하였다. 도 36에서 농도가 1ng/mL 위로 증가함에 따라, 도 38에 도시된 바와 같이 델타 색조가 증가하기 시작했다. 따라서, 디지털 및 아날로그 분석 양쪽 모두를 조합함으로써, 타우 단백질 농도가 1pg/mL 내지 1μg/mL의 큰 동적 범위(약 6 자릿수)에서 측정될 수 있다. 이 분석법에서는, 타우 단백질을 1pg/mL까지 검출하였다.
예 2 - IL-6을 결합하기 위한 예시적인 센서의 생성 및 테스트
이 예는 IL-6을 결합하는 나노 구조들의 생성 및 테스트를 설명한다.
본질적으로 예 1에서 설명된 바와 같이 센서가 생성되었다. 그러나, 나노 구조들은 타우 항체들보다는 IL-6 항체들로 관능화되었다. HRP로 표지된 제2의 IL-6 항체(제1 항체와는 상이한 에피토프를 타깃으로 함)를 이용하여 샌드위치를 형성하였다. 본질적으로 예 1에서 설명된 바와 같이 반응들을 수행하였고 결과들이 도 39에 도시되어 있다.
도 39에 도시된 바와 같이, 디지털 및 아날로그 검출 방법들의 조합은 7pg/mL 내지 1μg/mL 범위의 IL-6 단백질의 정량화를 허용한다.
회수율 분석(recovery analysis)을 위해, 7pg/mL, 25pg/mL, 50pg/mL, 75pg/mL 및 125pg/mL의 IL-6 농도들을 준비하여 버퍼 용액에 첨가(spike)하였다. 도 39에 도시된 표준 곡선을 이용하여 검출된 IL-6의 분자들을 정량화하였다. 첨가 회수율(spike recovery rate)은 적어도 95%인 것으로 밝혀졌다.
예 3 - 상이한 배지에서 IL-6, TNF 및 C 반응성 단백질(CRP)을 검출하기 위한 예시적인 센서들의 사용
이 예는 예시적인 나노 구조들이 혈장에서 IL-6 및 TNF를 검출하고, 세포 배양 배지(cell culture media)에서 CRP를 검출하기 위해 사용될 수 있음을 입증한다.
관능화된 나노 구조들을 갖는 센서들은 본질적으로 예 1 및 예 2에서 설명된 바와 같이 생성되었고, 다만 캡처 및 검출 항체들은 주어진 타깃 피분석물에 대해 선택되었다. 결과들은 도 40a, 도 40b 및 도 40c에 제시되어 있는데, 이는 나노 구조들이 피분석물 농도의 함수로서 각각의 표준 곡선의 우수한 선형성으로 IL-6(혈장 중), TNF(혈장 중) 및 CRP(세포 배양 배지 중)를 검출할 수 있음을 보여준다.
인용에 의한 포함
본 명세서에서 언급되는 특허 및 과학 문헌들 각각의 전체 개시내용은 모든 면에서 인용에 의해 포함된다.
균등물들
본 발명은 그 사상 또는 본질적인 특성들을 벗어나지 않고 다른 특정 형태들로 구현될 수 있다. 따라서, 전술한 실시예들은 모든 면에서 본 명세서에 설명된 발명을 제한하기보다는 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 전술한 설명보다는 첨부된 청구항들에 의해 지시되고, 청구항들의 의미 및 균등 범위 내에 있는 모든 변경들을 그 안에 포함하려고 한다.

Claims (57)

  1. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 센서로서, 이 센서는:
    제1 영역 및 제2 영역을 포함하고,
    상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하고,
    상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고,
    상기 센서는 상기 제1 농도 범위 및 상기 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 양을 정량화할 수 있는, 센서.
  2. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 센서로서, 이 센서는:
    제1 영역 및 제2 영역을 포함하고,
    상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 광학적으로 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정되고,
    상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정되고,
    상기 센서는 상기 제1 농도 범위 및 상기 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 양을 정량화할 수 있는, 센서.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1 농도 범위는 상기 제2 농도 범위보다 더 낮은 검출 가능한 값을 갖는, 센서.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 농도 범위는 상기 제1 농도 범위보다 더 높은 검출 가능한 값을 갖는, 센서.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 농도 범위는 상기 제2 농도 범위와 겹치는, 센서.
  6. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 센서로서, 이 센서는:
    상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하는 제1 영역을 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 광학적으로 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정되는, 센서.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 영역은:
    (i) 적어도 1μm의 인접 나노 구조들의 중심간 간격;
    (ii) 적어도 10nm의 각각의 나노 구조의 최소 단면 치수 또는 직경;
    (iii) 200nm 이하의 각각의 나노 구조의 최대 단면 치수 또는 직경; 또는
    (iv) 50nm 내지 1000nm 범위의 각각의 나노 구조의 높이
    중 하나 이상을 포함하고;
    옵션으로, 상기 센서는 제2 영역을 추가로 포함하고, 상기 제2 영역은:
    (v) 기준 마커; 또는
    (vi) 나노 구조 제조 제어 피처
    중 하나 이상을 포함하는, 센서.
  8. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 센서로서, 이 센서는:
    상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하는 제1 영역을 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제1 영역 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정되고, 상기 제1 영역은:
    (i) 적어도 1μm의 인접 나노 구조들의 중심간 간격;
    (ii) 적어도 100nm의 각각의 나노 구조의 최소 단면 치수 또는 직경;
    (iii) 300nm 이하의 각각의 나노 구조의 최대 단면 치수 또는 직경; 또는
    (iv) 50nm 내지 1000nm 범위의 각각의 나노 구조의 높이
    중 하나 이상을 포함하고;
    옵션으로, 상기 센서는 제2 영역을 추가로 포함하고, 상기 제2 영역은:
    (v) 기준 마커; 또는
    (vi) 나노 구조 제조 제어 피처
    중 하나 이상을 포함하는, 센서.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피분석물을 결합할 수 있고 제3 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 추가의 상이한 나노 구조들의 제3 시리즈를 포함하는 제3 영역을 추가로 포함하고, 상기 센서는 상기 제1, 제2 및/또는 제3 농도 범위들에 걸쳐 상기 표본 내의 상기 피분석물의 양을 정량화할 수 있는, 센서.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    임의의 제2 시리즈 내의 나노 구조들은, 상기 제1 시리즈 내의 나노 구조들보다 큰, (i) 평균 높이, (ii) 평균 체적, (iii) 평균 표면적, (iv) 평균 질량, 및 (v) 평균 피분석물 결합 부위의 수 중 하나 이상을 포함하는, 센서.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    임의의 제3 시리즈 내의 나노 구조들은, 임의의 제2 시리즈 내의 나노 구조들보다 큰, (i) 평균 높이, (ii) 평균 체적, (iii) 평균 표면적, (iv) 평균 질량, 및 (v) 평균 피분석물 결합 부위의 수 중 하나 이상을 포함하는, 센서.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및 임의의 제2 나노 구조들은 상기 피분석물을 결합하는 결합제로 관능화되는, 센서.
  13. 제9항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제3 나노 구조들은 상기 피분석물을 결합하는 결합제로 관능화되는, 센서.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 결합제는 생물학적 결합제인, 센서.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 생물학적 결합제는 항체, 앱타머, 수용체, 효소, 또는 핵산인, 센서.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 시리즈 내의 결합제는 임의의 제2 시리즈 내의 결합제보다 상기 피분석물에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는, 센서.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피분석물은 생물학적 분자인, 센서.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 생물학적 분자는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 당단백질, 당펩티드, 지질, 지단백질, 핵산, 또는 핵단백질인, 센서.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 센서는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 자릿수에 걸쳐 있는 범위에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 농도를 검출할 수 있는, 센서.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 센서는 적어도 5, 6, 7, 8, 또는 9 자릿수에 걸쳐 있는 범위에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 농도를 검출할 수 있는, 센서.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 센서는 피분석물의 농도를 1pg/mL 미만 내지 100ng/mL 초과, 0.1pg/mL 미만 내지 1μg/mL 초과, 0.01pg/mL 미만 내지 100μg/mL 초과, 또는 1fg/mL 미만 내지 1mg/mL 초과의 범위에서 측정할 수 있는, 센서.
  22. 제19항, 제20항 또는 제21항에 있어서,
    상기 표본은 상기 센서에 적용되기 전에 희석될 필요가 없는, 센서.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표본은 체액, 조직 추출물, 및/또는 세포 상청액인, 센서.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 체액 표본은 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 뇌척수액, 또는 간질액을 포함하고/하거나 상기 조직 표본은 생체 검사 표본을 포함하는, 센서.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피분석물의 결합은 나노 구조들의 적어도 하나의 시리즈의 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화에 의해 검출되는, 센서.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 광학적으로 검출 가능한 특성은 색, 광 산란, 굴절, 또는 공명(예를 들어, 표면 플라즈몬 공명, 전기 공명, 전자기 공명, 및 자기 공명)인, 센서.
  27. 제1항 내지 제5항 및 제9항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 구조들의 상기 제1 시리즈에서, 피분석물의 단일 분자 또는 상기 피분석물의 미리 결정된 수 미만의 분자들을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 개별 나노 구조들이 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 존재한다면, 상기 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정되는, 센서.
  28. 제6항, 제7항, 또는 제27항에 있어서,
    상기 표본 내의 피분석물의 농도는 (i) 피분석물을 결합하지 않은 개별 나노 구조들의 나머지 수 또는 (ii) 상기 제1 시리즈 내의 나노 구조들의 총수에 대해 상기 피분석물을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수를 디지털 카운팅하는 것에 의해 결정되는, 센서.
  29. 제1항 내지 제5항 및 제9항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 또는 상기 제3 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 및/또는 상기 제3 영역 내의 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정되는, 센서.
  30. 제8항 또는 제29항에 있어서,
    상기 광학적으로 검출 가능한 특성의 변화는 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 시리즈 및/또는 상기 제3 시리즈에 의해 생성된 색 변화인, 센서.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노 구조들은 표면이 평면인 및/또는 표면이 곡면인 나노 구조들인, 센서.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노 구조들은 평면 지지체 및/또는 가요성 기판 상에 배치되는, 센서.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 나노 구조들은 상기 평면 지지체 및/또는 상기 가요성 기판과 일체인, 센서.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노 구조들은 반도전성 재료 또는 금속으로 제조되는, 센서.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 반도전성 재료는 실리콘을 포함하는, 센서.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 센서는 기준 마커를 추가로 포함하는, 센서.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 기준 마커는 명시야 현미경 및/또는 암시야 현미경에 의해 광학적으로 검출 가능한, 센서.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 센서는 테스트 표본 내의 대응하는 복수의 상이한 피분석물을 검출하기 위한 복수의 상이한 결합제를 포함하는, 센서.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 구조들의 상기 제1, 제2 또는 제3 시리즈 중 적어도 하나가 어레이를 포함하는, 센서.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 구조들의 상기 제1, 제2 및 제3 시리즈 각각이 어레이를 포함하는, 센서.
  41. 제1항, 제3항 내지 제7항 및 제9항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 농도 범위 및 임의의 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸친 표본 내의 피분석물의 농도는 상기 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 및/또는 상기 제2 시리즈 각각 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정되는, 센서.
  42. 제1항, 제3항 내지 제5항, 및 제8항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 농도 범위 및 임의의 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸친 표본 내의 피분석물의 농도는 상기 제1 영역 및/또는 상기 제2 영역 각각 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정되는, 센서.
  43. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 카트리지로서, 이 카트리지는 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 센서를 포함하는 적어도 하나의 웰을 한정하는 하우징을 포함하는, 카트리지.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 하우징은 복수의 웰을 정의하고, 각각의 웰은 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 센서를 포함하는, 카트리지.
  45. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하기 위한, 또는 그것의 양을 정량화하기 위한 시스템으로서, 이 시스템은:
    (a) 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 센서 또는 제43항 및 제44항 중 어느 한 항의 카트리지를 수용하기 위한 수용 챔버;
    (b) 적어도 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈를 조명하기 위한 광원;
    (c) 적어도 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈에서의 광학적 특성의 변화를 검출하기 위한 검출기; 및
    (d) 상기 제1 농도 범위와 옵션으로 임의의 제2 농도 범위 사이의 인터페이스 및 옵션으로 임의의 제2 농도 범위와 옵션으로 임의의 제3 농도 범위 사이의 인터페이스를 식별하는 컴퓨터 알고리즘을 구현하는 옵션의 컴퓨터 프로세서를 포함하는, 시스템.
  46. 제45항에 있어서,
    상기 알고리즘은 (a) 테스트될 용액의 도포 시 상기 제1 시리즈 내의 상기 나노 구조들의 수에 대해 하나의 상태에서 다른 상태로 변화한 나노 구조들의 수를 측정하는 단계; (b) 테스트될 용액의 도포 시 나노 구조들의 상기 제2 시리즈 내의 나노 구조들의 색 공간 변화들을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 제2 시리즈의 색 공간 변화가 미리 선택된 임계 값을 초과하면, 단계 (b)에서 수집된 아날로그 측정치들을 이용하고, 상기 제2 시리즈의 색 공간 변화들이 상기 미리 선택된 임계 값 미만이면, 단계 (a)에서 수집된 디지털 측정치들을 이용하는 단계를 포함하는, 시스템.
  47. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 방법으로서,
    이 방법은:
    (a) 상기 표본의 일부를 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 센서에 적용하는 단계; 및
    (b) 나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및/또는 임의의 제2 시리즈 및/또는 임의의 제3 시리즈의 특성의 변화를 검출하고 이로써 상기 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    단계 (b)에서, 상기 특성은 광학적 특성인, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    상기 방법은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 로그의 농도 범위에서 피분석물을 검출할 수 있는, 방법.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 방법은 적어도 5, 6, 7, 8, 또는 9 로그의 농도 범위에서 피분석물을 검출할 수 있는, 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 나노센서는 1fg/mL 미만 내지 1mg/mL 초과의 농도 범위에서 피분석물을 검출할 수 있는, 방법.
  52. 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표본은 상기 센서에 적용되기 전에 희석되지 않는, 방법.
  53. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표본은 체액, 조직 추출물, 또는 세포 상청액인, 방법.
  54. 제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노 구조들의 상기 제1 시리즈 및 나노 구조들의 상기 제2 시리즈의 농도 범위에 걸쳐, 동일한 웰에 배치된 나노 구조들의 양쪽 시리즈에 표본이 동시에 적용될 때, 피분석물들이 동시에 검출될 수 있는, 방법.
  55. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 방법으로서,
    이 방법은:
    (a) 상기 표본의 일부를 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 센서에 적용하는 단계 -
    (i) 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하고,
    (ii) 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함함 -;
    (b) 나노 구조들의 상기 제1 및 제2 시리즈로부터 상기 검출 가능한 신호들을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 검출 가능한 신호들로부터 상기 제1 농도 범위 및 상기 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 관심 표본 내의 피분석물의 존재를 검출하는, 또는 그것의 양을 정량화하는 방법으로서,
    이 방법은:
    (a) 상기 표본의 일부를 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 센서에 적용하는 단계 -
    (i) 상기 제1 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제1 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 나노 구조들의 제1 시리즈를 포함하고, 상기 피분석물을 결합할 시 상기 피분석물을 결합하는 상기 제1 시리즈의 개별 나노 구조들이 광학적으로 검출되고, 그 결과 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제1 농도 범위 내에 있다면, 피분석물의 분자들을 결합한 상기 제1 시리즈 내의 개별 나노 구조들의 수로부터 결정되고,
    (ii) 상기 제2 영역은 상기 피분석물을 결합할 수 있고 제2의 상이한 농도 범위 내의 상기 표본 내의 상기 피분석물의 농도를 나타내는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 상이한 나노 구조들의 제2 시리즈를 포함하고, 상기 표본 내의 피분석물의 농도는, 상기 제2 농도 범위 내에 있다면, 상기 피분석물의 농도의 함수로서 상기 제2 영역 내의 상기 나노 구조들의 광학적으로 검출 가능한 특성의 실질적으로 균일한 변화의 아날로그 검출에 의해 결정됨 -,
    (b) 나노 구조들의 상기 제1 및 제2 시리즈로부터 상기 검출 가능한 신호들을 검출하는 단계; 및
    (c) 상기 검출 가능한 신호들로부터 상기 제1 농도 범위 및 상기 제2 농도 범위 양쪽 모두에 걸쳐 상기 표본 내의 피분석물의 농도를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서,
    상기 제2 시리즈 내의 나노 구조들은, 상기 제1 시리즈 내의 나노 구조들보다 큰, (i) 평균 높이, (ii) 평균 체적, (iii) 평균 표면적, (iv) 평균 질량, 및 (v) 평균 피분석물 결합 부위의 수 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
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