JP2023541546A - 偏りがないプロテオミック試験のためのセンサー、その製造および使用の方法 - Google Patents

偏りがないプロテオミック試験のためのセンサー、その製造および使用の方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2023541546A
JP2023541546A JP2023513090A JP2023513090A JP2023541546A JP 2023541546 A JP2023541546 A JP 2023541546A JP 2023513090 A JP2023513090 A JP 2023513090A JP 2023513090 A JP2023513090 A JP 2023513090A JP 2023541546 A JP2023541546 A JP 2023541546A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
exome
sensor
nanostructures
snp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023513090A
Other languages
English (en)
Inventor
ボイス，ジョン
ワーナー，オードリー
クアン，チーミン
ウィルキンソン，ジョセフ
Original Assignee
ナノモザイク インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ナノモザイク インコーポレイテッド filed Critical ナノモザイク インコーポレイテッド
Publication of JP2023541546A publication Critical patent/JP2023541546A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7773—Reflection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/04—Sandwich assay format
    • G01N2470/06—Second binding partner specifically binding complex of analyte with first binding partner
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2570/00—Omics, e.g. proteomics, glycomics or lipidomics; Methods of analysis focusing on the entire complement of classes of biological molecules or subsets thereof, i.e. focusing on proteomes, glycomes or lipidomes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本発明は一般的に、表現型に寄与する1つ以上のタンパク質の発見、スクリーニングおよび/または定量化のために、プロテオーム、エクソームまたはエクソームコドン配列領域ワイドインテロゲーションを容易にする物(例えばセンサー)および方法に関する。

Description

本願は、その全体の開示がその全体において参照により本明細書に援用される2020年8月26日に出願された米国特許出願第63/070,796号の利益および優先権を主張する。
発明の分野
本発明は一般的に、表現型に寄与するタンパク質の発見、スクリーニングおよび/または定量化のための、プロテオーム、エクソームまたはエクソームコドン配列(CDS)領域ワイドインテロゲーション(interrogation)に関連する物および方法に関する。
背景
いくつかの主要な困難は現在、医学的診断、バイオマーカー発見および薬物発見の分野を妨げている。該困難は、例えば患者試料中に存在する少量のタンパク質からより豊富なタンパク質の範囲のタンパク質の広範囲なダイナミックレンジに質問する(interrogate)ために使用され得る定量的技術の欠如である。
プロテオミック調査の分野は典型的に、分子の経路および生物学的相互作用の演繹的な知識に基づいたインテロゲーションのためのタンパク質の選択を含む。得られたタンパク質パネルは一般的に、質問され得るタンパク質の数およびプロテオームにわたるタンパク質の広さにより制限される。表現型に関するタンパク質の決定におけるさらなる困難は、調査下の条件において役割を果たし得る広範囲のタンパク質にわたる偏りがない(bias-free)アプローチを駆動するために、変化した(affected)タンパク質に対する野生型タンパク質のプロテオームワイドインテロゲーションを容易にするタンパク質のアプローチおよびパネルを提供することである。
現在のタンパク質パネル選択はしばしば、使用される読出し技術により制限され、ここでそれぞれのタンパク質に専用の特有なセンサーの数は、プロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSワイドインテロゲーションに必要とされるバイオマーカーの幅を可能にするために十分な広さのダイナミックレンジをカバーするのに十分ではない。
1つの市販のアプローチは、一対のオリゴヌクレオチド標識抗体(「プローブ」)が、洗浄を必要としない同質のアッセイにおいて、試料中に存在する標的タンパク質にペアワイズ結合することが可能になる近接伸長(proximity extension)アッセイを使用する。2つのプローブが近接する場合、新規のPCR標的配列は、近接依存性DNA重合事象により形成される。その後、得られた標的配列は、標準的なリアルタイムPCR (RT-PCR)を使用して検出および定量化される。このアプローチの制限は、限定されたダイナミックレンジおよびそのために質問され得るタンパク質の数である。
さらに、科学的および医学的な調査者は典型的に、疾患に焦点を当てられる標的を選択することに制限され、これは典型的に、限られた数(例えば500未満)のタンパク質のインテロゲーションを容易にするパネルを生じる。例えば、市販の心臓血管パネルは、約90の心臓血管疾患(CVD)関連タンパク質バイオマーカーの分析のためのマルチプレックスイムノアッセイ(近接伸長アッセイ)を可能にする。別の例において、マルチプレックスイムノアッセイ炎症パネルは、約90の炎症関連タンパク質の分析を容易にする近接ライゲーションアッセイを介して質問され得る。
別のアプローチにおいて、抗体コンジュゲートビーズセットは、多重化サンドイッチイムノアッセイ形式において分析物を検出する。セットにおけるそれぞれのビーズは、2つのアドレッシング色素(addressing dye)の特有の含有量により同定され、第3の色素は、ビオチンコンジュゲート抗体およびストレプトアビジンコンジュゲート第2工程検出器を介して分析物の結合を読み出すために使用される。データは、専用のフローサイトメトリー系プラットフォーム上で取得される。しかしながら、かかるアプローチは、質問され得るマーカーを限定し、そのために真のプロテオームワイドインテロゲーションを容易にしない限られたダイナミックレンジを有する。例えば、例示的なアッセイは、50個のヒトサイトカインおよびケモカインの分析を可能にする50プレックスビーズキットを含む。
今日までなされた努力にかかわらず、依然として、所定の表現型について新規のバイオマーカーを同定するために使用され得る、偏りがない様式でのプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSにわたる多数および少数のタンパク質の有意な数を質問するための新規のアプローチの必要性がある。
概要
本発明は部分的に、偏りがない様式でゲノムにわたりコードされる有意な数のタンパク質(例えば多数および少数のタンパク質)を質問するためのアプローチの開発に基づく。該アプローチは、偏りがないプロテオミック分析を容易にするセンサーおよび読出し技術と組み合わせて使用され得る。
一局面において、本開示は、試験被験体が属するかまたは関連する種の全タンパク質コーディングゲノムから選択される試験タンパク質の組を含む、タンパク質パネルを決定する方法を提供する。該方法は：(a)目的の種の全ゲノム由来のタンパク質コーディング遺伝子(例えば(i)イントロンおよびエクソンの両方、(ii)エクソンまたは(iii)コーディング配列領域)をスプライシングして、タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)を構築する工程；(b)タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)にわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定する工程；および(c)タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)にわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製する工程を含み、それぞれのタンパク質は、タンパク質コーディングゲノム内のそれぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる。
ある態様において、タンパク質コーディング遺伝子は、エクソンおよびイントロンの両方を含み、タンパク質コーディングゲノムはプロテオームである。代替的に、タンパク質コーディング遺伝子はエクソンであり、タンパク質コーディングゲノムはエクソームである。代替的に、タンパク質コーディング遺伝子はコーディング配列(CDS)領域であり、タンパク質コーディングゲノムはエクソームCDSである。
前述の方法のいずれかは、以下の特徴の1つ以上を含み得ることが企図される。例えば、SNPSは、同義SNPS、非同義SNPSまたはそれらの組み合わせであり得る。マーカー位置は、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、互いから約25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ離れて間隔を空けられ得る。
SNPは、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDS内のマーカー位置に対して最も近いSNPであり得る。SNPは、バイオマーカー配置に対して最も近い非同義SNPであり、結合部分は、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。SNPは、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり得、結合部分は、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。
別の局面において、本発明は、試験被験体が属するかまたは関連する種の全タンパク質コーディングゲノムから選択される試験タンパク質の組を含むタンパク質パネルを決定する方法を提供する。該方法は：(a)目的の種の全ゲノム由来のタンパク質コーディング遺伝子(例えば(i)イントロンおよびエクソンの両方、(ii)エクソンまたは(iii)CDS)をスプライシングして、タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)を構築する工程、(b)タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)にわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定する工程；および(c)タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)にわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製する工程を含み、それぞれのタンパク質は、関連のあるマーカーが配置されるゲノムの領域によりコードされるタンパク質である。
ある態様において、タンパク質コーディング遺伝子は、エクソンおよびイントロンの両方を含み、タンパク質コーディングゲノムはプロテオームである。代替的に、タンパク質コーディング遺伝子はエクソンであり、タンパク質コーディングゲノムはエクソームである。代替的に、タンパク質コーディング遺伝子はコーディング配列(CDS)領域であり、タンパク質コーディングゲノムはエクソームCDSである。
マーカー位置は、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、互いから約25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ離れて間隔を空けられ得ることが企図される。
別の局面において、本開示は、試験被験体から採取される試料中の複数のタンパク質の存在を検出またはその量を定量化し、それにより試料に対して偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析(exome-CDS association study)を行うためのセンサーを提供する。該センサーは、複数のアドレス可能なウェルを画定するプレートを含み、それぞれのウェルは、その中に配置されるグリッドを含み、ここで(i)該グリッドは、それぞれのナノ構造アレイが複数のナノ構造を含む複数のナノ構造アレイを含み、(ii)それぞれのナノ構造アレイは、偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を行うために、試験タンパク質の組の1つ以上のタンパク質に結合するための1つ以上の結合部分で機能化される。任意に、試験タンパク質の組は、(a)試験被験体が属するかまたは関連する種のタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定すること；および(b)タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたるそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製することにより以前に決定され、ここでそれぞれのタンパク質は、エクソーム内のそれぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる。
センサーは、種々の異なる方法で構成され得ることが企図される。例えば、SNPSは、同義SNPS、非同義SNPSまたはそれらの組み合わせであり得る。マーカー位置は、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、互いから約25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ離れて間隔を空けられ得る。
センサーは、試験タンパク質の組のそれぞれのメンバーに結合するために、少なくとも20個の異なる結合部分を含み得る。
SNPは、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDS内のマーカー位置に対して最も近いSNPであり得る。SNPは、マーカー位置に対して最も近い非同義SNPであり得、結合部分は、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。SNPは、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり得、結合部分は、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。
SNPは、対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置され得る。全てのSNPは、それぞれの対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置され得る。
ウェル内の全てのナノ構造アレイは、試験タンパク質の組内の特定のタンパク質に結合するために、結合部分(例えば抗体、ナノボディ、アプタマーまたは親和性プローブ)で機能化され得る。ウェル内のナノ構造アレイの一部は、試験タンパク質の組内の特定のタンパク質に結合するために、結合部分で機能化され得る。
それぞれのナノ構造は、ナノニードルを含み得るかまたは本質的にそれからなり得る。ナノ構造(例えばナノニードル)は、平坦な支持体または可撓性基板の少なくとも1つと一体化され得る。
別の局面において、本開示は、試験被験体から採取される試料中の複数のタンパク質の存在を検出またはその量を定量化して、それにより試料に対して偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を行うためのセンサーを作製する方法を提供する。該方法は：(a)試験被験体が属するかまたは関連する種のタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定する工程；(b)タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製する工程、ここでそれぞれのタンパク質は、エクソーム内のそれぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる；および(c)センサーのナノ構造を、複数の異なる結合部分で機能化する工程、ここでそれぞれの結合部分は、試験タンパク質の組内のタンパク質に結合して、それにより試料中に存在する場合に試験タンパク質の存在を検出またはその量を定量化し得る、を含む。
該方法は、以下の特徴の1つ以上を含み得ることが企図される。工程(a)～(c)を反復して、それによりセンサーのシリーズを作製し得、ここで第2のセンサーを作製するために使用されるマーカー位置は、第1のセンサーを作製するために使用されるマーカー位置から所定の距離だけ移動される。マーカー位置は、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、互いから25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ離れて間隔を空けられ得る。
センサーは、試験タンパク質の組に結合するために、少なくとも20個の異なる結合部分を含み得る。該結合部分は、抗体、ナノボディ、アプタマーまたは親和性プローブであり得る。
SNPは、同義SNP、非同義SNPまたはそれらの組み合わせであり得る。状況に応じて、SNPは、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDS内のマーカー位置に対して最も近いSNPであり得る。SNPは、マーカー位置に対して最も近い非同義SNPであり得、結合部分は、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。代替的に、SNPは、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり得、結合部分は、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。SNPは、対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置され得る。ある態様において、SNPは、それぞれの対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置され得る。
本開示はまた、前述の方法のいずれかにより作製されるセンサーを提供する。該センサーは、複数の異なる結合部分で機能化される複数のナノ構造を含み得、それぞれの結合部分は、試験タンパク質の組内のタンパク質に結合して、それにより、試料中に存在する場合に試験タンパク質の存在を検出またはその量を定量化し得る。
別の局面において、本開示は、目的の試料に対して、偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSワイド関連解析を行う方法を提供する。該方法は、(a)試料の少なくとも一部を本明細書に記載されるセンサーのいずれかに適用する工程；(b)センサーのナノ構造から検出可能なシグナルを検出する工程；および(c)検出可能なシグナルから、試料中の試験タンパク質の存在および/または量を決定する工程を含む。
該方法は、以下の特徴の1つ以上を含み得ることが企図される。少なくとも1つのさらなるセンサーを用いて工程(a)～(c)を反復して、目的の試料のタンパク質パネルをスクリーニングし得る。検出可能なシグナルを検出する工程は、ナノ構造の少なくとも一部の特性(例えば光学特性)の変化を検出することを含み得る。試料は、センサーへの適用前に希釈され得るか、または希釈され得ない。状況に応じて、試料は、体液、組織抽出物または細胞上清であり得る。
本開示の他の利点および新規の特徴は、添付の図面に関して考慮される場合、種々の非限定的な態様の以下の詳細な記載から明らかになる。
図面の簡単な説明
図面において、同様の参照記号は一般的に、異なる図面を通じて同じ部分を言及する。また、図面は必ずしも同じ縮尺ではなく、代わりに本開示の原理の説明に一般的に強調が置かれる。以下の記載において、本発明の種々の態様は、以下の図面を参照して説明される。
図1A～1Fは、目的のゲノムおよび関連のあるタンパク質におけるマーカーおよびマーカー位置、センサーおよびかかるセンサーの特徴を同定する方法に関する。図1Aは、本発明の態様による、目的のゲノムにわたり配置されるマーカー位置で均一に間隔を空けられるマーカーを同定するためのアプローチを示す概略図である。図1Bは、少なくとも100塩基対のマーカー位置内のファミリー(1つまたは複数)からの少なくとも1つのメンバーの選択により表されるタンパク質のファミリーの決定を示す概略図である。図1Cは、本発明の態様による、エクソームにわたり均一に間隔を空けられるマーカーヌクレオチドおよびヌクレオチドマーカーから最大で3kb離れた一対のマーカーヌクレオチドの間の少なくとも1つのcSNPの選択を示す概略図である。図1Dは、本発明の態様による、エクソームにわたり均一に間隔を空けられるヌクレオチドおよびヌクレオチドマーカーから最大で10kb離れた一対のマーカーヌクレオチドの間の少なくとも1つのnscSNPの選択を示す概略図である。 図1Eは、本発明の態様による、複数のウェルを有するパネルを示す概略図であり、それぞれのウェルは、ナノ構造アレイのグリッドを含む。 図1Fは、従来技術のアッセイと比較した、本発明の態様による、センサーのダイナミックレンジを示す概略図である。 図2Aは、目的のセンサーにおけるナノ構造のシリーズの異なる形式の概略的表示である。 図2Bは、超低、低、中および高濃度の分析物を測定するための例示的センサーのシリーズを示す概略図である。 図3A～3Cは、大きなダイナミックレンジにわたる分析物の測定における本発明の例示的なセンサーの操作可能性を示す。図3Aは、本発明の態様による、デジタルおよびアナログ(色シフト(color shifting))ナノ構造アレイの両方を含むセンサーを示す概略図である。 図3Bは、デジタル単一分子定量化(左手パネル)およびアナログ定量化(右手パネル)の組合せによる、6対数ダイナミックレンジにわたるタウタンパク質の定量化を示す写真による表示である。 図3Cは、分析物濃度の関数としてのデジタルセンサーの操作可能性を示す画像である。 図4は、図3Bに例示されるセンサーにより作成される例示的なデータのデジタルおよびアナログ測定値を示すグラフである。 図5は、本発明の態様による、デジタルナノ構造のシリーズ(25,600)およびアナログナノ構造の3つのシリーズ(1シリーズ当たり1,000)の両方を含む例示的なケイ素ウェーハー系センサーの写真による表示である。 図6は、本発明の態様による、デジタルナノ構造の複数のシリーズおよびアナログナノ構造の3つのシリーズを含む、別の例示的なケイ素ウェーハー系センサーの写真による表示である。 図7は、本発明の態様による、例示的なナノ構造の断面図を示す概略図である。 図8は、本発明の態様による、2つの異なる材料で構成される例示的なナノ構造の断面図を示す概略図である。 図9A～9Dは、本発明の態様による、フォトレジストパターン形成、現像およびエッチングプロセスによる例示的なナノ構造のシリーズの製作を示す一連の断面概略図である。 図10A～10Gは、本発明の態様による、基板上の層の蒸着、蒸着された層上のフォトレジストのスピンコーティング、レジストのパターン形成および現像、レジスト上の金属の蒸着(evaporating)、溶液中のレジストの除去、基板のエッチング、ならびにフォトレジストの除去による例示的なナノ構造のシリーズの製作を示す一連の断面概略図である。 図11A～11Fは、本発明の態様による、基板上の2つの層のコーティング、上部層レジストのパターン形成、レジストの現像、パターン形成されたレジスト上の材料の蒸着、特定の表面条件を達成するためのさらなる低粘度材料のリフトオフおよびスピンによる例示的なナノ構造のシリーズの製作を示す一連の断面概略図である。 図12A～12Fは、本発明の態様による、酸化物基板上のフォトレジストのパターン形成、レジストの現像、レジスト上のケイ素の蒸着、リフトオフ、パターン形成された基板上にさらなる構造を成長させるためのケイ素の成長による例示的なナノ構造のシリーズの製作を示す一連の断面概略図である。 図13A～13Dは、本発明の態様による、モールドによるフォトレジストのパターン形成を図示する一連の断面概略図である。 図14Aは、複数のシリーズのナノ構造を有するシリコンウェーハーを示す概略図であり、図14Bは、本発明の態様による、単一のシリーズのナノ構造の拡大図を示す概略図である。 図14Cは、本発明の態様の概略図であり、ナノ構造ニードル上で単一抗体非標識(label-free)アッセイを使用する。ナノ構造ニードルに結合した抗体は、試験試料中の特定の分析物を捕捉し、定量化可能なシグナルを生じる。図14Dは、本発明の態様の概略図であり、ナノ構造ニードル上で単一抗体を使用する。ナノ構造ニードルに結合した抗体は、試験試料中の特定の分析物を捕捉し、定量化可能なシグナルを生じ、得られたシグナルは増幅される。 図14Eは、本発明の態様の概略図であり、ナノ構造ニードル上で二重抗体(サンドイッチ)アッセイを使用する。第1の抗体は、ナノ構造ニードルに結合して試験試料中の分析物を捕捉し、定量化可能なシグナルを生じ、第2の抗体は、反応に添加されてサンドイッチを形成し、得られたシグナルは増幅される。 図15A～15Dは、ガスケット系アプローチセンサー設計の概略図である。図15Aは、4プレックスガスケットを示す。図15Bは、センサーの半分をカバーするハイブリッド16プレックスガスケットおよびもう半分をカバーする標準的な96ウェルプレートを示す。 図15Cは、2ガスケット層アプローチを示し、第1の層は、4プレックスガスケットを含み、第2のガスケットは、4プレックスウェルの4つをカバーするように層になる。図15Dは、ハイブリッド4プレックスガスケットを示し、第2のガスケット層は、センサーの半分をカバーする4プレックスウェルの4つをカバーし、標準的な96ウェルプレートは、もう半分をカバーする。 図16Aおよび16Bは、本発明の態様による、ナノ構造のシリーズを組み込んだナノセンサーアセンブリ(消耗品)の斜視図である。 図17Aおよび17Bは、ウェーハー基板、ガスケットおよび保持ベースを含むカートリッジアセンブリの概略的表示(図17A)ならびにカートリッジアセンブリの構成要素を示す分解斜視図(図17B)である。 図18は、本発明の態様による、シングルプレックスカートリッジおよび1,000プレックスカートリッジの概略的表示である。 図19は、本発明の態様による、センサーによる使用のための検出システムの斜視図である。 図20は、本発明の態様による、例示的なセンサーを画像化するための例示的な光学的検出システムを示す概略図である。 図21は、本発明の態様による、センサーのインテロゲーションを示す概略図である。読出しシグナルは、光学的(例えば画像化)、電気的または機械的であり得る。 図22は、デジタルナノ構造を含む例示的センサーの出力のデータ分析を示す概略的表示である。 図23は、本発明の態様による、アルゴリズムを示すフローチャートである。 図24Aおよび24Bは、本発明の態様による、複数の分析物を同時に検出および/または定量化するように構成されるナノ構造のシリーズを示す概略図である。 図25は、本発明の態様による、分析物とナノ構造の間の相互作用を示す概略図である。 図26は、本発明の態様による、左から右に、1、2および5個の分析物を捕捉することによる、ナノ構造の結合能力を示す概略的表示である。 図27は、本発明の態様による、分析物を捕捉し得るナノ構造の数よりも少ない分析物がある非飽和アッセイを示す概略図である。 図28は、本発明の態様による、分析物がアレイにおけるナノ構造の小部分(fraction)により結合される非飽和アッセイ条件下でのアレイにおけるナノ構造のシリーズを示す概略図である。 図29は、例示的な非標識イムノアッセイを示す概略的表示である。 図30は、例示的な標識系イムノアッセイを示す概略的表示である。 図31は、本発明の態様による、抗原に結合する抗体(Ab1およびAb2)のペアを使用した分析物(抗原)の存在および/または量を決定するための例示的な粒子系アッセイの概略図であり、ここで結合は、活性化されたナノ構造による(Ab2)抗体捕捉を介する検出の前に溶液中で起こる。 図32は、本発明の態様による、抗原に結合する抗体(Ab1およびAb2)のペアを使用した分析物(抗原)の存在および/または量を決定するための例示的な粒子系アッセイの概略図であり、ここで結合は、活性化されたナノ構造による(Ab2)抗体捕捉を介する検出の前に溶液中で起こる。 図33は、本発明の態様による、抗原に結合する抗体(Ab1およびAb2)のペアを使用した分析物(抗原)の存在および/または量を決定するための例示的な粒子系アッセイの概略図であり、ここで結合は、活性化されたナノ構造による酵素(HRP)捕捉を介する検出の前に溶液中で起こる。 図34は、本発明の態様による、抗原に結合する抗体(Ab1およびAb2)のペアを使用した分析物(抗原)の存在および/または量を決定するための例示的な粒子系アッセイの概略図であり、ここで結合は、相補的なオリゴヌクレオチドにより機能化されたナノ構造によるオリゴヌクレオチド捕捉を介する検出の前に溶液中で起こる。 図35A～35Cは、例示的なマルチプレックスアッセイにおける使用のための試薬を示す概略図である。 図36A～Hは、IL-1b(図36A)、IL-2(図36B)、IL-10(図36C)、IL-15(図36D)、IL-6(図36E)、IL-8(図36F)、GM-CSF(図36G)およびIP-10(図36H)のそれぞれを含む、ガスケット系設計において試験されたサイトカイン抗体のアレイについて、1pg/ml～10,000pg/mlの濃度範囲にわたる標準的な滴定曲線を示す。 図36A～Hは、IL-1b(図36A)、IL-2(図36B)、IL-10(図36C)、IL-15(図36D)、IL-6(図36E)、IL-8(図36F)、GM-CSF(図36G)およびIP-10(図36H)のそれぞれを含む、ガスケット系設計において試験されたサイトカイン抗体のアレイについて、1pg/ml～10,000pg/mlの濃度範囲にわたる標準的な滴定曲線を示す。
詳細な説明
本開示は部分的に、偏りがない様式で、ゲノムにわたりコードされる有意な数のタンパク質(例えば多数および少数のタンパク質)を質問するためのアプローチの開発に基づく。本開示は、目的の被験体の種(または種に関連のある)の、偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を実行する方法を提供する。特に、目的の種のプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSを通して配置されるマーカー位置で間隔を空けられる対応する核酸マーカーに関連するタンパク質を同定するために方法、かかるタンパク質を質問するセンサーを作製するための方法、プロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS内にコードされるタンパク質のインテロゲーションを行うためのセンサーおよびかかるセンサーを使用する方法が提供される。
本発明の態様は、特定の表現型に関与するタンパク質の存在を検出および/またはその量を定量化するためのタンパク質パネル、センサー、アッセイおよび生化学的プロセスを含む。本発明の態様は、例えば診断、バイオマーカー発見または薬物開発用途に使用され得る。
種のゲノムの特定の領域(例えばタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDS(コーディング配列))を通じて均一に間隔を空けられるヌクレオチドマーカーの近傍においてタンパク質(例えばSNPに対応するタンパク質)を選択することを含む、種の全プロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSから選択されるタンパク質のパネルの調製が本明細書に記載される。ヒトエクソームは、約3000万塩基を含み、ヒトプロテオーム中に存在するタンパク質をコードする。本明細書に記載されるアプローチは、目的の種の全プロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSの偏りがないインテロゲーションを行うためのタンパク質を同定するために使用され得る。
決定されたタンパク質パネルに対応する結合部分で機能化されるナノニードルなどのナノ構造を含むセンサーが本明細書に記載される。
ナノ構造と組み合わせて働く生物学的アッセイ、およびビーズよりも約1000倍小さいナノ構造を使用して、それにより調査者に、標的分子がある場合よりも多くの着地部位(landing site)を使用させ、少なくとも6桁(order)のダイナミックレンジを可能にする方法も提供される。広いダイナミックレンジは、偏りがない分析のためのプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSワイドインテロゲーションパネルの構築を可能にする。タンパク質を選択して、カバー率を最小化し、偏りがない結果を駆動するようにプロテオームをカバーするパネルを構築するため新規のアプローチが提供される。
いくつかの態様において、記載される方法は、少なくとも2:1の比のセンサー(例えばナノ構造を含む)の数 対 インテロゲーション下のタンパク質を有する任意の系に適用され得る。
タンパク質パネルの作製方法
一局面において、本開示は、試験被験体が属するかまたは関連する種の全タンパク質コーディングゲノムから選択される試験タンパク質の組を含むタンパク質パネルを決定する方法を提供する。該方法は：(a)目的の種の全ゲノム由来のタンパク質コーディング遺伝子(例えば(i)イントロンおよびエクソンの両方、(ii)エクソンまたは(iii)コーディング配列領域)をスプライシングして、タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)を構築する工程；(b)タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)、プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)にわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定する工程；および(c)タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)にわたりそれぞれのマーカー位置と関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製する工程を含み、ここでそれぞれのタンパク質は、タンパク質コーディングゲノム内のそれぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる。ある態様において、タンパク質コーディング遺伝子は、エクソンおよびイントロンの両方を含み、タンパク質コーディングゲノムはプロテオームである。代替的に、タンパク質コーディング遺伝子はエクソンであり、タンパク質コーディングゲノムはエクソームである。代替的に、タンパク質コーディング遺伝子はコーディング配列(CDS)領域であり、タンパク質コーディングゲノムはエクソームCDSである。
本明細書で使用する場合、用語「スプライシング」は、ヌクレオチド配列の所定のサブセット(例えばタンパク質コーディング遺伝子、エクソンおよびコーディング配列領域)が所定のゲノムから選択され、次いで得られるヌクレオチド配列が再度連結される(例えばゲノム内で互いに関して同じ空間的関係にある)プロセスをいう。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、タンパク質コーディング遺伝子(例えばエクソンおよびイントロンを含む配列)の選択によりスプライシングされて一緒になり、得られるタンパク質コーディング遺伝子は、再連結されてプロテオームを形成する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、エクソン(例えばコーディング配列領域および非翻訳領域を含む配列)の選択によりスプライシングされて一緒になり、得られるエクソンは、再連結されて、エクソームを形成する。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、コーディング配列領域(CDS)の選択によりスプライシングされて一緒になり、得られるCDSは再連結されて、エクソームCDSを形成する。
本明細書で使用する場合、タンパク質コーディングゲノムの文脈における用語「マーカー」または「マーカーヌクレオチド」等は、所定のマーカー位置でのヌクレオチドまたはヌクレオチドの群を意味するように理解される。本明細書で使用する場合、用語「マーカー位置」は、マーカーまたはマーカーヌクレオチドがタンパク質コーディングゲノム(例えばプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS)内に配置される位置を意味するように理解される。
いくつかの態様において、タンパク質コーディング遺伝子は、タンパク質に関連するヌクレオチド配列をいい、かかるタンパク質のエクソンおよびイントロンを含む。いくつかの態様において、「タンパク質コーディングゲノム」は、ゲノムによりコードされる全てのタンパク質のヌクレオチド配列(例えばエクソンおよびイントロン)をいい、プロテオームとも称され得る。
いくつかの態様において、タンパク質コーディング遺伝子は、タンパク質に関連するヌクレオチド配列をいい、かかるタンパク質のエクソン(例えばコーディング配列領域(CDS)および非翻訳領域(例えば5'および3'UTR))を含む。この態様において、イントロン配列は除去される。いくつかの態様において、「タンパク質コーディングゲノム」は、全てのタンパク質のヌクレオチド配列をいい、ゲノムによりコードされる全てのタンパク質のエクソン(例えばコーディング配列領域(CDS)および非翻訳領域(例えば5'および3'UTR))を含み、エクソームとも称され得る。
いくつかの態様において、タンパク質コーディング遺伝子は、タンパク質に関連するヌクレオチド配列をいい、かかるタンパク質のコーディング配列領域(CDS)を含む。この態様において、イントロンおよびエクソンの非翻訳領域は除去される。いくつかの態様において、「タンパク質コーディングゲノム」は、全てのタンパク質のヌクレオチド配列をいい、ゲノムによりコードされる全てのタンパク質のCDSを含み、エクソームCDSとも称され得る。
別の局面において、本発明は、試験被験体が属するかまたは関連する種の全タンパク質コーディングゲノムから選択される試験タンパク質の組を含むタンパク質パネルを決定する方法を提供する。該方法は：(a)目的の種の全ゲノム由来のタンパク質コーディング遺伝子(例えば(i)イントロンおよびエクソンの両方、(ii)エクソンまたは(iii)CDS)をスプライシングして、タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)を構築する工程、(b)タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)にわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定する工程；および(c)タンパク質コーディングゲノム(例えば(i)プロテオーム、(ii)エクソームまたは(iii)エクソームCDSのそれぞれ)にわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製する工程を含み、ここでそれぞれのタンパク質は、関連のあるマーカーが位置するプロテオームの領域によりコードされるタンパク質である。ある態様において、タンパク質コーディング遺伝子は、エクソンおよびイントロンの両方を含み、タンパク質コーディングゲノムはプロテオームである。代替的に、タンパク質コーディング遺伝子はエクソンであり、タンパク質コーディングゲノムはエクソームである。代替的に、タンパク質コーディング遺伝子はコーディング配列(CDS)領域であり、タンパク質コーディングゲノムはエクソームCDSである。
本明細書に記載されるように、タンパク質パネルは、種の全プロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSからタンパク質の選択により作製され、該タンパク質は、種のゲノム上の特定の領域(例えばタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームコーディング配列(CDS))を通じて均一に間隔を空けられるヌクレオチドマーカーに近接するSNPに対応する。ある態様において、タンパク質パネルは、種の全プロテオームからのタンパク質の選択により作製され、該タンパク質は、種のゲノム上の特定の領域(例えばタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームコーディング配列(CDS))を通じて、すなわちSNPとは独立して、均一に間隔を空けられるヌクレオチドマーカーに対する近接に基づいて選択される。
タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSの構築後、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置に印がつけられ、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質が選択されて、タンパク質パネルが作製される。ある態様において、それぞれのタンパク質は、それぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる。マーカー位置は、エクソームにわたり、25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbなどの選択される距離だけ互いから離れて間隔を空けられ得る。状況に応じて、次いでそれぞれのヌクレオチドマーカーに対して最も近い一塩基多型(SNP)が同定される。いくつかの態様において、SNPの1つまたは全ては、対応するヌクレオチドマーカー位置から1,000塩基未満に配置され得る。
次いで、タンパク質パネルを作製するために、SNPに関連するタンパク質(すなわちSNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質)が同定される。SNPは、同義SNP、非同義SNPまたはそれらの組み合わせであり得る。SNPは、エクソーム内のマーカー位置に対して最も近いSNPであり得る。いくつかの態様において、SNPは、マーカー位置に対して最も近い非同義SNPであり得、結合部分は、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。他の態様において、SNPは、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり、結合部分は、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。いくつかの態様において、結合部分は、抗体、ナノボディ、親和性プローブまたはアプタマーである。
いくつかの態様において、選択されるタンパク質は、市販の抗体を有する。いくつかの態様において、選択されるタンパク質は、市販の抗体を有さず、当該技術分野で公知の技術を使用して新規の抗体が作製される。いくつかの態様において、選択されるタンパク質は、市販の抗体を有さず、例えばヌクレオチドマーカーに2番目に近いSNPが選択され、該2番目に近いSNPを含むタンパク質がセンサーに含まれる。
図1A～1Dに関する方法の例を以下のように記載する。本発明の態様により、図1Aを参照すると、配列1(例えばタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDS)は集合されて整列される。いくつかの態様において、タンパク質コーディングゲノムは、全ゲノムにわたり全てのタンパク質コーディング遺伝子(例えばエクソンおよびイントロンの両方を含むヌクレオチド配列)を連続配列にスプライシングすることにより構築される。いくつかの態様において、エクソームは、全ゲノムにわたり全てのエクソン(例えば非翻訳配列(例えば5'および3'UTR)およびコーディング配列の両方を含む核酸配列)をスプライシングすることにより構築される。いくつかの態様において、エクソームCDSは、全ゲノムにわたりコーディング配列領域のみ(例えば非翻訳領域(例えば5'および3'UTR)を除去したエクソン)をスプライシングすることにより構築される。タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSの集合および整列は、図1B～1Dに関して概略を示される工程の前に起こる。
図1Bを参照すると、一態様において、パネルは、エクソームにわたり均一に間隔を空けられたヌクレオチド(すなわちマーカー2)および該マーカーの両側で100塩基対を選択することにより構築される。したがって、この例において、2つの隣接するマーカー5の間の距離Xは200塩基対である。±100塩基対のこの範囲は、タンパク質を選択するためのエクソームの「領域」とみなされる。エクソームの少なくとも0.1%、1%または10%が選択される。それぞれの領域がコードするタンパク質のファミリー由来の1つのタンパク質が、タンパク質パネルを含むことのために選択される。
図1Cを参照すると、コーディング一塩基多型(cSNP)に焦点を当てた別の態様において、エクソームにわたり均一に間隔を空けられたマーカーXが選択され、マーカーから最大で3キロベース(KB)の距離以内にあるマーカーの隣接するペアの間で、少なくとも1つのcSNPが同定される。±3KBのこれらの範囲のそれぞれが領域とみなされる。エクソームの少なくとも0.1%、1%または10%が選択される。それぞれの領域がコードするタンパク質のファミリー由来の1つのタンパク質が、タンパク質パネルを含むことのために選択される。
図1Dを参照すると、ノンコーディング一塩基多型(nscSNP)に焦点を当てた別の態様において、エクソームにわたり均一に間隔を空けられたマーカーが選択され、マーカーから最大で10キロベースの距離以内のマーカーの隣接するペアの間で、少なくとも1つのnscSNPが同定される。±10キロベースのこれらの範囲のそれぞれが領域とみなされる。エクソームの少なくとも0.1%、1%または10%が選択される。それぞれの領域がコードするタンパク質のファミリー由来の1つのタンパク質が、タンパク質パネルを含むことのために選択される。
センサーの製造方法
別の局面において、本開示は、試験被験体から採取される試料中の複数のタンパク質の存在を検出またはその量を定量化し、それにより試料に対して偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を行うためのセンサーを提供する。該センサーは、複数のアドレス可能なウェルを画定するプレートを含み、それぞれのウェルは、その中に配置されるグリッドを含み、ここで(i)グリッドは、それぞれのナノ構造アレイが複数のナノ構造を含む複数のナノ構造アレイを含み、(ii)それぞれのナノ構造アレイは、偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSワイド関連解析を行うために、試験タンパク質の組の1つ以上のタンパク質に結合するための1つ以上の結合部分で機能化される。プロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSワイド関連解析の文脈における用語「偏りがない(bias-free)」または「偏りがない(unbiased)」は、交換可能に使用され、タンパク質またはペプチドが、特定の疾患、障害または生物学的経路に関係するかどうかを考慮することなく、インテロゲーションのための標的タンパク質(またはバイオマーカータンパク質)が、主に目的の種のゲノム内でタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子の位置に基づいて選択されることを意味するように理解される。任意に、試験タンパク質の組は、(a)試験被験体が属するかまたは関連する種のタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定すること；および(b)タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製することにより前もって決定され、ここでそれぞれのタンパク質は、エクソーム内のそれぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる。
センサーは、試験被験体から採取される試料中の複数のタンパク質(例えば上述のように作製されるタンパク質パネル由来の複数のタンパク質)の存在を検出またはその量を定量化して、試料に対して偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を行うことを可能にする。所定の種のタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のヌクレオチドマーカー位置は、上記のアプローチを使用して決定される。マーカー位置は、エクソームにわたり、25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbなどの選択される距離だけ互いから離れて間隔を空けられ得る。一態様において、エクソームの全域から100個のランダムマーカーが選択され、マーカーは300kb離れて間隔を空けられる。
ある態様において、次いでそれぞれのヌクレオチドマーカーに対して最も近い一塩基多型(SNP)が同定される。いくつかの態様において、ヌクレオチドマーカーは2つ以上のSNPに対して等距離であり、SNPは無作為に選択される。次いでSNPに関連するタンパク質(すなわちSNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質)を同定して、全タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたる無作為に選択された試験タンパク質の組を作製する。SNPは、同義SNP、非同義SNPまたはそれらの組み合わせであり得る。SNPは、エクソーム内のマーカー位置に対して最も近いSNPであり得る。いくつかの態様において、SNPは、マーカー位置に対して最も近い非同義SNPであり得、結合部分は、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。他の態様において、SNPは、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり、結合部分は、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。
いくつかの態様において、タンパク質は、隣接するSNPとは独立して、すなわちヌクレオチドマーカーに対するそれらの距離に基づいて選択される。いくつかの態様において、ヌクレオチドマーカーに対して直接的に最も近いタンパク質が選択される。いくつかの態様において、抗体が市販のものであるヌクレオチドマーカーに対して最も近いタンパク質が選択される。
いくつかの態様において、選択されるタンパク質は、市販の抗体またはアプタマーを有する。いくつかの態様において、選択されるタンパク質は、市販の抗体またはアプタマーを有さず、新規の抗体が作製される。いくつかの態様において、選択されるタンパク質は、市販の抗体またはアプタマーを有さず、例えばヌクレオチドマーカーに対して2番目に近いSNPが選択され、2番目に近いSNPを含むタンパク質がセンサーに含まれる。いくつかの態様において、3番目に近いSNPを含むタンパク質に対して商業的な抗体またはアプタマーが利用可能でなく、選択されるタンパク質について、組換え抗体またはアプタマーが開発される。例えば、組換え抗体またはナノボディは、位相(phase)ディスプレイまたは酵母ディスプレイに対するライブラリーをスクリーニングすることにより開発され得る。
SNPの1つまたは全ては、対応するヌクレオチドマーカー位置から1,000塩基未満に配置され得る。
センサーのナノ構造は、複数の異なる結合部分で機能化され、それぞれの結合部分は、試験タンパク質の組内のタンパク質に結合して、それにより試料中に存在する場合に試験タンパク質の存在を検出またはその量を定量化し得る。センサーは、試験タンパク質の組に結合するために、少なくとも20、25、50、100、150、300、600または1200個の異なる結合部分などの広範囲の異なる結合部分を含み得る。結合部分は、抗体、ナノボディ、親和性プローブまたはアプタマーであり得る。
いくつかの態様において、結合部分、例えば抗体は、タンパク質の存在または非存在についてスクリーニングするために使用される。いくつかの態様において、結合部分、例えば抗体は、タンパク質の総量についてスクリーニングするために使用される。いくつかの態様において、結合部分、例えば抗体は、特定のタンパク質のバリアント、例えばタンパク質の変異体バリアントについてスクリーニングするために使用される。いくつかの態様において、結合部分、例えば抗体は、タンパク質の特定の翻訳後改変、例えばタンパク質のリン酸化またはグリコシル化形態についてスクリーニングするために使用される。
これらの工程を反復して、センサーのシリーズを作製し得、第2のセンサーを作製するために使用されるヌクレオチドマーカー位置は、第1のセンサーを作製するために使用されるマーカー位置から所定の距離だけ移動される。このアプローチを反復して、センサーのシリーズを作製し得、ここでそれぞれのセンサーは、シリーズ中の他のセンサーにより検出されるタンパク質とは別の(off-set)ゲノムの長いヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質を検出し得る。かかる反復のセンサー作製は、ヒトプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり偏りなく選択されるマーカータンパク質のシリーズを作製するために使用され得る。
いくつかの態様において、偏りなく選択されたタンパク質の最初のスクリーニング後、センサーのタンパク質において有意な変化がある。第2の標的化されたタンパク質センサー(例えばファミリーメンバーなどの関連のあるタンパク質を検出し得るセンサー)を使用して、タンパク質レベル、タンパク質シグナル伝達等の変化をさらに調べ得る。
図1Eを参照すると、試料中の複数のタンパク質の存在を検出またはその量を定量化するためのセンサーはプレートを含む。本発明の態様により、プレート3(本明細書においてパネルまたはタンパク質パネルとも称される)は、アドレス可能なウェル、例えば8 x 12(96プレート)、16 x 24(384プレート)、32 x 48(1536プレート)ウェルのアレイを含み得る。例として、96ウェルプレートのそれぞれのウェル4は、その中に配置されるグリッド5、例えば10 x 10グリッドを含み、グリッドのそれぞれのブロック6は、例えば約400ミクロンx400ミクロンであり、異なる結合部分、例えば抗体で機能化される。より具体的に、グリッド5のそれぞれのブロック6は、1つのナノ構造アレイ7を含み、それぞれのナノ構造アレイは、下記のように複数のナノ構造を含む。それぞれのナノ構造アレイは、プロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を実行するために、試験タンパク質の組の1つ以上のタンパク質に結合するための、抗体、ナノボディ、親和性プローブまたはアプタマーなどの1つ以上の結合部分で機能化される。いくつかの態様において、ウェル内の全てのナノ構造アレイは、試験タンパク質の組内の特定のタンパク質に結合するための結合部分で機能化される。他の態様において、ウェル内のナノ構造アレイの一部は、試験タンパク質の組内の特定のタンパク質に結合するための結合部分で機能化される。
センサーは、試験タンパク質の組のそれぞれのメンバーに結合するために、約25、50、100、150、300、600または1200個の異なる結合部分を含み得る。
試験タンパク質の組は、試験被験体が属するかまたは関連する種のタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を最初に決定することにより決定される。マーカー位置は、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、約25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ互いから離れて間隔を空けられ得る。
次いで、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製する。それぞれのタンパク質は、エクソーム内のそれぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる。SNPは、同義SNP、非同義SNPまたはそれらの組み合わせであり得る。SNPは、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにおいてマーカー位置に対して最も近いSNPであり得る。いくつかの態様において、SNPは、マーカー位置に対して最も近い非同義SNPであり、結合部分は、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。他の態様において、SNPは、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり、結合部分は、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る。SNPまたは全てのSNPは、対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置され得る。
使用方法
偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSワイド関連解析は、以下のように目的の試料に対して実行され得る。試料は、例えば体液(例えば血液、血清、血漿、唾液等)、組織抽出物または細胞上清であり得る。試料の一部は、上述のセンサーの任意の態様に適用され得る。状況に応じて、試料は、センサーへの適用前に希釈され得るかまたは希釈される必要はない。
次いでセンサーのナノ構造からの検出可能なシグナルを定量化する。例えばナノ構造の少なくとも一部の特性、例えば光学特性、例えば蛍光の変化が検出され得る。試料中の試験タンパク質の存在および/または量は、検出可能なシグナルから決定される。これらの工程は、少なくとも1つのさらなるセンサーを用いて反復されて、目的の試料のプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSがスクリーニングされ得る。
本明細書で使用する場合、用語「被験体」は、本発明の方法および組成物により試験される生物をいう。かかる生物としては、好ましくは哺乳動物(例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたは非ヒト霊長類、例えばサル、チンパンジー、ヒヒおよびアカゲザル)およびより好ましくはヒトが挙げられる。
本願に記載されるセンサーの適用としては、限定されることなくバイオマーカー同定、診断(例えば疾患もしくは障害を有する被験体を同定するための診断またはコンパニオン診断)、患者層化プロトコルおよび薬物開発が挙げられる。バイオマーカー同定適用としては、限定されることなく、目的の所定の表現型(例えば薬物または治療薬に対する寛容、薬物または治療薬に対する抵抗性、代謝感度等)または特定の疾患状態(例えば心臓血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、心理的状態、神経変性疾患、癌等)についてのバイオマーカーの同定が挙げられる。かかるバイオマーカーは、被験体における表現型および/または疾患状態の存在と関連し得るか、または一般的な集団に対する被験体の表現型および/または疾患状態の発症のリスクの上昇を示し得る。診断適用としては、限定されることなく、罹患した被験体における被験体の特定の疾患状態(例えば心臓血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、心理的状態、神経変性疾患、癌等)のリスク評価および/または同定、被験体が薬物に対して応答性であり得るかまたは非応答性であり得るかを同定するためのコンパニオン診断が挙げられる。患者層化適用としては、限定されることなく、臨床研究のための患者の同定、または所定の薬物に応答する可能性がある患者を同定することが挙げられる。薬物開発適用としては、限定されることなく、所望の応答についてのタンパク質パネルにわたる、特定の疾患状態(例えば心臓血管疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、心理的状態、神経変性疾患、癌等)についての既知もしくは新規の治療薬および/または生物製剤のスクリーニングが挙げられる。
BMC Res Notes (2019) 12:315において、Piovesanらは、NCBI Gene Webからヒトタンパク質コーディング遺伝子の情報を抽出した。一態様において、Piovesan's Gene Tableに基づいて、遺伝子ID、遺伝子記号、染色体受託番号、全てのタンパク質コーディング遺伝子の開始および終了位置を、染色体1から染色体XおよびYまでのヒトゲノム内のそれらの位置の順序で示す。次いで、1,255,970,826bpの全長についてタンパク質コーディングゲノムの連続番号付けのために、全てのタンパク質コーディング遺伝子をスプライシングして一緒になる。
一態様において、偏りがない様式の100プレックスタンパク質パネルを構築するために、100個のヌクレオチド位置マーカーをスプライシングされた遺伝子に沿って配置し、それぞれは12,559,708*iに配置され、ここでiは、マーカーの配列である。マーカーの間隔は12,559,708である。i番目のマーカーについて、一塩基多型データベース(dbSNP)を使用して、マーカーiの位置に最も近いSNPを配置する。次いで、同定されたSNPを含む遺伝子を配置して、i番目のタンパク質としてパネルに含める。上述の手順に従ってタンパク質リストをコンパイルし、以下の実施例1にさらに記載する。
一態様において、偏りがない様式の100プレックスタンパク質パネルを構築するために、タンパク質パネルをエクソーム(例えばタンパク質コーディング遺伝子からイントロンを排除するヌクレオチド配列)から構築する。タンパク質の1つのアイソフォームはPiovesan's Gene Table(上述)から選択され得、3'UTR、CDSおよび5'UTRの開始終了位置を記録して、エクソンを同定する。次いで全てのエクソンをスプライシングして一緒になり得、これは62,184,186bpの総エクソーム長さを生じる。
100個の位置マーカーをスプライシングされた遺伝子に沿って配置することにより、上記のエクソームから偏りがない様式の100プレックスタンパク質パネルを作製し得、それぞれの位置マーカーは、621,842*iに配置され、ここでiはマーカーの配列である。マーカーの間隔は、621,842bpである。i番目のマーカーについて、一塩基多型データベース(dbSNP)を使用して、位置マーカーiの最も近くにあったSNPを配置し得る。次いで、同定されたSNPを含む遺伝子を配置し、i番目のタンパク質としてパネルに含める。上述のプロトコルから作製された得られたタンパク質リストを表5に示す。
タンパク質を同定した後、該タンパク質に特異的な検出可能部分(例えば抗体、ナノボディ、親和性プローブまたはアプタマー)を、センサーの表面上で一体化する。いくつかの態様において、種々のディスプレイ技術(例えば位相(phase)ディスプレイまたは酵母ディスプレイ)を用いて組換え抗体またはナノボディを開発し得る。いくつかの態様において、SELECT技術を用いてアプタマーを開発し得る。一例において、標的のそれぞれについて単一抗体または二重抗体ペアを開発し得る。一例において、標的のそれぞれについて二重抗体ペアを開発し得る。次いで、100個のタンパク質のパネルについて、それぞれのタンパク質に特異的な100個の異なる親和性プローブを、インクジェットまたは圧電性プリントなどのプリント技術を用いて、それぞれのグリッド上にスポットする。例えば以下に記載される方法を使用して、タンパク質の濃度を測定し得る。
センサー構造、操作および製作ならびにナノ構造の機能化およびアッセイに関するさらなる詳細を以下に提供する。
I. センサー考察
本明細書に開示されるセンサーは、大きなダイナミックレンジにわたり高い感度で、目的の試料中のタンパク質またはペプチドの量の検出および/または定量化を容易にする。プロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を容易にするために、試料中のタンパク質またはペプチドの量を検出および/または定量化するためのかかるセンサーを組み込むカートリッジ、検出システムならびにかかるセンサー、カートリッジおよびシステムの使用方法も本明細書に開示される。
図1Fは、0.01pg/mL未満(10fg/mL)～1μg/mL以上の濃度範囲(少なくとも8対数)内の試料中の分析物を検出し得る、本明細書に記載されるセンサーを用いて達成可能なダイナミックレンジ10を示す。一般的に、他の市販のアッセイシステム(例えば典型的な手動ELISA、特殊な手動ELISA、微小流体系ELISAアッセイ、ブロッティング系技術(例えばウエスタンブロッティングおよびドットブロッティング技術)および自動ビーズ系技術)は、目的の試料中の分析物を測定し得るが、本明細書に開示されるセンサーにより達成可能な全ダイナミックレンジにわたり分析物を測定できない。結果的に、本明細書に記載されるセンサーの使用は、これまでに従来技術アッセイシステムの組合せを使用した場合にのみ達成し得た濃度範囲にわたり、分析物の濃度の測定を容易にし得る。
(A) センサー構成
センサーは種々の構成のナノ構造を含み得ることが企図される。例えば、図2Aに示されるように、センサーは、ナノ構造20dの第1のシリーズ、例えばデジタル定量化のために構成されるナノ構造のシリーズ(図2A(i))；ナノ構造20aの第2のシリーズ、例えばアナログ定量化のために構成されるナノ構造のシリーズ(図2A(ii))；ナノ構造20dの2つのシリーズ(図2A(iii))；ナノ構造20aの2つのシリーズ(図2A(iv))；20dの1つおよび20aの1つのナノ構造の2つのシリーズ(図2A(v))；ならびに20dの1つおよび20aの2つのナノ構造の3つのシリーズ(図2A(vi))を含み得る。センサーは、検出される分析物(例えばタンパク質またはペプチド)および望まれるダイナミックレンジに応じて、異なる構成のナノ構造の他のシリーズを含み得ることが企図される。
本明細書で使用する場合、用語「ナノ構造」は、少なくとも1nm～1,000nm未満の範囲の長さを有する少なくとも1つの寸法を有する任意の構造、例えばナノセンサーを意味することが理解される。本明細書で使用する場合、用語「デジタル定量化」は、1つ以上の分析物への結合の際に1つの状態から別のものに裏返る、ナノ構造のシリーズ中の個々のナノ構造が検出される(例えば光学的に検出される)定量化プロセスを意味することが理解される。「デジタルシリーズ」または「デジタルアレイ」は、デジタル定量化を可能にするように構成されるナノ構造のそれぞれのシリーズまたはアレイを意味することが理解される。
本明細書で使用する場合、用語「アナログ定量化」は、ナノ構造が複数の分析物に結合する場合に、ナノ構造のシリーズ中のナノ構造の検出可能な特性(例えば光学的に検出可能な特性、例えば色)の実質的に均一な変化が検出される、定量化プロセスを意味することが理解される。ある態様において、検出可能な特性の変化(例えば色変化)は、検出される分析物の前もって較正された濃度範囲にわたる目的の試料中の分析物の濃度の関数として起こる。用語「実質的に均一」は、ナノ構造の少なくとも60%、70%、80%、90%または95%が、同じ検出可能な特性、例えば色を共有することを意味することが理解される。「アナログシリーズ」または「アナログアレイ」は、アナログ検出を可能にするように構成されるナノ構造のそれぞれのシリーズまたはアレイを意味することが理解される。
目的の試料中の分析物の存在を検出するためまたはその量を定量化するための1つの例示的なセンサーにおいて、センサーは第1の領域および第2の領域を含む。第1の領域は、分析物に結合し得、第1の濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得るナノ構造の第1のシリーズを含む。第2の領域は、分析物に結合し得、第2の異なる濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得る異なるナノ構造の第2のシリーズを含み、ここで該センサーは、第1の濃度範囲および第2の濃度範囲の両方にわたり、試料中の分析物の量を定量化し得る。第1の濃度範囲は、第2の濃度範囲のものよりも低い検出可能な値を有し得、および/または第2の濃度範囲は、第1の濃度範囲のものよりも高い検出可能な値を有し得る。第1の濃度範囲は第2の濃度範囲と重複し得ることが企図される。
本明細書に記載されるセンサーは、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11または12桁(または3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12対数)に及ぶ範囲(ダイナミックレンジとも称される)にわたる試料中の分析物の濃度を検出し得ることが理解される。ある態様において、センサーは、少なくとも5、6、7、8または9桁(または5、6、7、8もしくは9対数)に及ぶ濃度範囲にわたる試料中の分析物の濃度を検出し得る。センサーは、1pg/mL未満～100ng/mLより高い、0.1pg/mL未満～1μg/mLより高い、または0.01pg/mL未満～100μg/mLより高い、または1fg/mL未満～1mg/mLより高い範囲の所定の分析物の濃度を測定するように構成され得、ここで例えば、試料は、センサーへの適用の前に希釈される必要はない。
1つの例示的なセンサーにおいて、第1の領域は、分析物に結合し得、第1の濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得るナノ構造の第1のシリーズを含み、ここで分析物に結合する第1のシリーズの個々のナノ構造は、分析物への結合の際に検出され(例えば光学的に検出され)、その際に、試料中の分析物の濃度は、第1の濃度範囲内にある場合に、分析物の分子に結合した第1のシリーズ中の個々のナノ構造の数から決定される。第2の領域は、分析物に結合し得、第2の異なる濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得る異なるナノ構造の第2のシリーズを含み、ここで試料中の分析物の濃度は、第2の濃度範囲内にある場合に、分析物の濃度の関数として、第2の領域中のナノ構造の検出可能な特性(例えば光学的に検出可能な特性、例えば色)における実質的に均一な変化のアナログ検出により決定され、ここでセンサーは、第1の濃度範囲および第2の濃度範囲の両方にわたる試料中の分析物の量を定量化し得る。
第1の濃度範囲は、第2の濃度範囲のものよりも低い検出可能な値を有し、および/または第2の濃度範囲は第1の濃度範囲のものよりも高い検出可能な値を有する。第1の濃度範囲は第2の濃度範囲と重複し得ることが企図される。
前述のセンサーのそれぞれにおいて、センサーの第1の領域は任意に、(i)少なくとも1μmの隣接するナノ構造の中心-対-中心の間隔；(ii)少なくとも10nmのそれぞれのナノ構造の最小断面寸法もしくは直径；(iii)200nm以下のそれぞれのナノ構造の最大断面寸法もしくは直径；または(iv)50nm～1000nmの範囲のそれぞれのナノ構造の高さの1つ以上を含む。該センサーは任意に、(i)基準マーカーまたは(ii)ナノ構造製作対照特徴の1つ以上をさらに含む。
センサーのいずれかは、以下の特徴の1つ以上を含み得ることが企図される。例えば、センサーは、分析物に結合し得、第3の濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得るさらに異なるナノ構造の第3のシリーズを含む第3の領域をさらに含み得、ここで該センサーは、第1、第2および/または第3の濃度範囲にわたり試料中の分析物の量を定量化し得ることが企図される。
同様に、任意の第2のシリーズ中のナノ構造は、第1のシリーズ中のナノ構造のものよりも大きい(i)平均高さ、(ii)平均体積、(iii)平均表面積、(iv)平均質量および(v)分析物結合部位の平均数の1つ以上を含み得る。
さらに、センサーが第3のシリーズを含む時はいつでも、第3のシリーズのナノ構造は、任意の第2のシリーズ中のナノ構造のものよりも大きい(i)平均高さ、(ii)平均体積、(iii)平均表面積、(iv)平均質量および(v)分析物結合部位の平均数の1つ以上を含み得る。
第1のシリーズ、ならびに適用可能な場合は第2および第3のシリーズ中のナノ構造は、分析物に結合する結合剤、例えば結合剤、例えば分析物に結合する生物学的結合剤により機能化される。生物学的結合剤は、例えば抗体、アプタマー、リガンド-受容体ペアのメンバー、酵素または核酸であり得る。特定の状況下で、分析物について、第2、第3またはそれ以降のシリーズにおける結合剤よりも高い結合親和性を有する第1のシリーズにおける結合剤を使用することが有利であり得る。
センサーは、試料中の任意の目的の分析物を検出および/または定量化するように設計され得る。例えば、分析物は、生物学的分子、例えばタンパク質、例えばタンパク質、糖蛋白、リポ蛋白、核蛋白および前述のタンパク質のペプチド断片を含むペプチドなどであり得る。さらに、所定のセンサー中のナノ構造またはナノ構造のシリーズは、同時にまたは連続的に、複数の異なる分析物に結合、それを検出および/または定量化するように構成され得る。例えばセンサーは、試験試料中の対応する複数の異なる分析物を検出するための複数の異なる結合剤を含み得る。
センサーは、光学的特性、電気的特性または機械的特性における変化により分析物の結合を検出するように構成され得る。例えば、センサーは、ナノ構造の少なくとも1つのシリーズの光学的に検出可能な特性(例えば色、光散乱、屈折または共鳴(例えば表面プラスモン共鳴、電気的共鳴、電磁的共鳴および磁気的共鳴))における変化により分析物の結合を検出するように構成され得る。
センサーは、種々の異なる方法で構成され得ることが企図される。例えば、ナノ構造の第1、第2または第3のシリーズの少なくとも1つは、ナノ構造のアレイを含み得る。代替的に、ナノ構造の第1、第2および第3のシリーズのそれぞれは、ナノ構造のアレイを含み得る。センサーは、ナノ構造の単一のシリーズまたはナノ構造の複数のシリーズ、例えば異なる濃度範囲内の分析物を検出するように適切に作用するナノ構造の複数のシリーズを含み得ることが企図される。センサーがナノ構造の複数のシリーズを含む場合、ナノ構造の異なるシリーズは、(i)同じ様式で(例えば単一のナノ構造が検出もしくは定量化されるデジタル検出を介して、または所定のシリーズ中のナノ構造の光学的特性における累積変化が濃度の関数として検出されるアナログ検出を介して)または(ii)異なる様式で、例えばデジタル検出とアナログ検出の組合せにより作動し得る。さらに、センサーは、デジタル検出および/またはアナログ検出により作動する複数の異なるシリーズを含み得ることが企図される。例えば、センサーは、同じ濃度範囲内のデジタル検出により分析物を検出するように作動する複数のシリーズおよび/または異なる濃度範囲にわたるアナログ検出により分析物を検出するように作動する複数のシリーズを含み得る。
例えば、デジタル検出の間、ナノ構造の第1のシリーズにおいて、分析物に結合する個々のナノ構造は、分析物の単一の分子または分析物の所定の数未満の分子のいずれかに結合する際に検出され、その際に、試料中の分析物の濃度は、第1の濃度範囲内に存在する場合に、分析物の分子に結合した第1のシリーズ中の個々のナノ構造の数から決定される。例えば、試料中の分析物の濃度は、(i)分析物に結合しなかった個々のナノ構造の残りの数または(ii)第1のシリーズ中のナノ構造の総数のいずれかに対して、分析物に結合した第1のシリーズ中の個々のナノ構造の数のデジタル計数により決定される。
このアプローチにおいて、多くのナノ構造は典型的に、センサーの領域において高密度にパターン形成される。ナノ構造の数が、検出される分析物の数よりも大きい場合、それぞれのナノ構造は典型的に、例えば質量移動およびポワゾン分布効果に基づいて、多くとも1つの分析物を捕捉する。それぞれのナノ構造は、分析物が結合するかまたはしないかに応じて、2つの状態(例えば1または0と示される)の1つを有し得る。したがって、分析物を有する試料への暴露後に、状態1を有するナノ構造の数は、分析物の数と等しくあり得る。ある態様において、それぞれの個々のナノ構造は、1つまたはいくつか(例えば10未満)の分析物、例えばタンパク質またはペプチドを捕捉するための限定された数の結合部位のみを有し得る。それぞれのナノ構造は、1～いくつか(<10)の対応するシグナルスケールを有し、したがって分子の数の計数は、それぞれのナノ構造の別個のシグナルの計数と同等であり得る。ナノ構造のシリーズの異なるシグナルレベルは、検出され得るナノモザイクパターンを形成する。
同様に、分析物の濃度は、図2A(iii)に示されるように第2の範囲内、または第3の範囲内にある場合に、(i)分析物に結合していない適切なシリーズ中の個々のナノ構造の残りの数または(ii)対応する第2および/または第3のシリーズ中のナノ構造の総数のいずれかに対して、分析物に結合した第2および/または第3のシリーズ中の個々のナノ構造の数のデジタル計数により決定され得る。すなわち、第1の濃度範囲、第2の濃度範囲および任意の第3(またはそれ以上)の濃度範囲の全てにわたる試料中の分析物の濃度は、分析物の分子に結合した第1のシリーズ、第2のシリーズおよび/または任意の第3(またはそれ以上)のシリーズのそれぞれ中の個々のナノ構造の数から決定される。
代替的または付加的に、分析物の濃度は、第2の濃度範囲または任意の第3の濃度範囲内にある場合に、分析物の濃度の関数として、第2の領域および/または第3の領域中のナノ構造の光学的に検出可能な特性における実質的に均一な変化のアナログ検出により決定され得る。例えば、光学的に検出可能な特性の変化は、分析物の濃度の関数として、第2のシリーズおよび/または任意の第3のシリーズにより生成される実質的に均一な色変化であり得る。すなわち、第2の濃度範囲および任意の第3(またはそれ以上)の濃度範囲(1つまたは複数)の全てにわたる試料中の分析物の濃度は、第2の領域および/または第3の領域のそれぞれ中のナノ構造の光学的に検出可能な特性における実質的に均一な変化のアナログ検出により決定される。
ナノ構造のそれぞれの個々のシリーズ(または領域)は、目的の分析物の10,000分子までの結合部位を含み得る。それぞれの領域は、領域により捕捉されるタンパク質の数に関連する予め較正された連続シグナルスケール(アナログスケール)を有する。それぞれの領域についてのアナログスケールは、読出しのための物理的シグナルの漸進的な変化に対応する。異なるスケールは、例えば検出器(例えば光学的検出器)下のそれぞれの領域由来の異なる色に対応し得る。該領域は、分析物濃度の関数としての特性変化(例えば色変化)の連続体(continuum)を有するナノモザイクを画定する。光学的検出の場合、例えば異なるスケールは、(i)濃度の関数としての強度変化の連続体を有する顕微鏡下の領域の光強度または(ii)濃度の関数としての電流もしくは電圧シグナルの連続体を有するそれぞれの領域の電子的測定値、例えば電流もしくは電圧シグナルの1つ以上に関連し得る。
所定のシリーズ中のナノ構造は、平坦な面および/または湾曲した面のナノ構造であり得ることが企図される。ナノ構造は、平坦な支持体および/または可撓性の基板上に配置され得、ここでナノ構造は、平坦な支持体および/または可撓性の基板と一体化し得る。ナノ構造は、半導電性材料(例えばケイ素)または金属で作製され得る。
センサーはさらに、基準マーカー、例えば明視野顕微鏡検査および/または暗視野顕微鏡検査により光学的に検出可能な基準マーカーを含み得ることが企図される。基準マーカーは、検出システムによる検出の視野内のセンサーの位置を較正するために使用され得る。センサーはまた、例えば作製されたナノ構造がナノ構造の直径の関数として色の変化を示すことを示す、1つ以上のナノ構造製作対照を含み得る。
図2A(i)に示される別の例示的なセンサーにおいて、センサーは、分析物に結合し得、第1の濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得るナノ構造の第1のシリーズを含む第1の領域を含み、ここで分析物に結合する第1のシリーズの個々のナノ構造は、分析物に結合する際に光学的に検出され、その際に、試料中の分析物の濃度は、第1の濃度範囲内にある場合に、分析物の分子に結合した第1のシリーズ中の個々のナノ構造の数から決定される。センサーの第1の領域は任意に、(i)少なくとも1μmの隣接するナノ構造の中心-対-中心の間隔；(ii)少なくとも10nmのそれぞれのナノ構造の最小断面寸法もしくは直径；(iii)200nm以下のそれぞれのナノ構造の最大断面寸法もしくは直径；または(iv)50nm～1000nmの範囲のそれぞれのナノ構造の高さの1つ以上を含む。センサーは任意に、(i)基準マーカーまたは(ii)ナノ構造製作対照特徴の1つ以上を含む第2の領域をさらに含む。
図2A(ii)に示される別の例示的なセンサーにおいて、センサーは、分析物に結合し得、第1の濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得るナノ構造の第1のシリーズを含む第1の領域を含み、ここで試料中の分析物の濃度は、第1の濃度範囲内にある場合に、分析物の濃度の関数として第1の領域中のナノ構造の光学的に検出可能な特性における実質的に均一な変化のアナログ検出により決定される。第1の領域はさらに、(i)少なくとも1μmの隣接するナノ構造の中心-対-中心の間隔；(ii)少なくとも100nmのそれぞれのナノ構造の最小断面寸法もしくは直径；(iii)300nm以下のそれぞれのナノ構造の最大断面寸法もしくは直径；または(iv)50nm～1000nmの範囲のそれぞれのナノ構造の高さの1つ以上を含む。センサーは任意に、(i)基準マーカーまたは(ii)ナノ構造製作対照特徴の1つ以上を含む第2の領域をさらに含む。
開示されるセンサーの検知領域は、生物学的分析物と相互作用する物理的スポットである。ある態様において、検知領域は異なる部分に分割され、それぞれの部分は特定の濃度範囲を標的化する。非常に低い濃度では、単一分子ナノ構造のアレイが使用され得る。分析物が単一分子センサーにより捕捉される場合、センサーは、デジタルの「はい」のシグナルを生じるので、分子の濃度は、デジタルセンサーの計数に関連し得る。低～中の濃度範囲で、アナログシグナルを生じるために特定のダイナミックレンジを有するより大きいナノ構造を使用して、分析物の濃度を測定する。読出しシグナルは、ナノ構造に関連する共鳴スペクトル、または散乱強度等であり得る。検出精度を向上するために、これらのセンサーのアレイを使用して、統計学的な平均を達成し得る。
非限定的な例として、センサーの検知領域は、複数の領域に分割され得る。例として、図2Bは、4つのセンサー領域32、34、36、38を有するセンサー30の概略図である。それぞれの領域は、ナノ構造20のシリーズを含む。一態様において、超低濃度センサー領域32のナノ構造20dのシリーズは、単一分子感度を画定する。結果的に、分析物の濃度は、検出可能なシグナル、例えば「はい」のデジタルシグナルを生じるように裏返る単一分子ナノ構造20dの数に相関する。低、中および高濃度センサー領域34、36、38のナノ構造20aは、増加するサイズ、およびそのためにより低い感度であるがだんだん大きくなるダイナミックレンジを有する。領域32、34 36、38のそれぞれは、特定のダイナミックレンジについて最適化される。合わせると、それぞれの領域から得られた結果は集合されて、領域32、34、36、38により達成可能なダイナミックレンジの集合から生じるダイナミックレンジを提供し得る。
図3Aは、例示的なセンサーおよびかかるセンサーを使用して達成される目的の分析物の定量化の概略的表示を示す。このセンサー30は、デジタル定量化のために構成されるナノ構造20dのシリーズを有する第1の領域50およびアナログ定量化のために構成されるナノ構造20aのシリーズを有する第2の領域60を含み、ここで色のシフトは異なる濃度を示す。この例において、デジタル定量化70は、pg/mLからng/mLまでの範囲の分析物濃度について実施され、アナログ定量化80は、ng/mLからμg/mLまでの範囲の分析物濃度について実施される。分析物の濃度がpg/mL～ng/mLの範囲にある場合、分析物濃度は、状態を変化する(例えば1つの状態から別のものに裏返る)領域50中のシリーズにおけるナノ構造の数に基づいて測定され得る。しかしながら、分析物の濃度は検出可能な範囲の上限に達するので、領域50中のセンサーは飽和され、センサーはより高濃度の分析物を定量化できない。第1のシリーズの飽和は、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%またはそれ以上の結合部位が分析物に結合した場合に起こり得る。結果的に、このセンサー30はまた、試料中の分析物の濃度がナノ構造の所定のシリーズにより検出可能である分析物濃度の範囲内に含まれる場合に、その光学的特性を変化する(例えば色変化として検出される)ナノ構造の複数のシリーズを含む。この態様において、領域60中のナノ構造のシリーズは、隣接または重複する濃度範囲においてそれらの光学的特性(例えば色)を変化するように較正される。
図3Bにおいて、センサー40は、デジタル検出/定量化70のためのナノ構造のシリーズおよびアナログ検出/定量化80のためのナノ構造のシリーズを含む。特に、デジタル検出70のためのナノ構造のシリーズは、アレイの形態のナノ構造20dを含む。分析物(例えばタウタンパク質)の濃度が1.2pg/mLから10ng/mLへと増加する場合、1つの状態から別のものに裏返ったナノ構造の数は、それぞれのパネル90下の割合(ration)により示されるように増加する。10ng/mL以上の分析物濃度で、ナノ構造のシリーズは、ナノ構造の全てまたは実質的に全て(例えば結合部位の少なくとも60%、70%、80%、90%、95%が分析物に結合した)が1つの状態から他のものへと裏返る場合に飽和する。右手側のボックスは、アナログ検出80について構成されるナノ構造20aのシリーズにおける光学的特性の変化(例えば比色定量的変化)を示す。例えば、分析物の濃度が10ng/mLまで増加する場合、ナノ構造のシリーズの光学的特性(例えば色相(color hue))の変化はシフトしない。しかしながら、分析物の濃度が10ng/mLより大きい場合、ナノ構造のシリーズの光学的特性の変化は、例えば分析物濃度の関数としての色の変化として検出可能になる。センサー中に、他の濃度範囲の分析物を検出および定量化するように較正されるナノ構造のさらなるシリーズ(例えばデジタルアレイおよび/またはアナログアレイ)を含むことにより、より大きなダイナミックレンジが達成され得る。
図3Cは、本明細書に記載されるセンサー100により実施されるデジタル定量化を図示する。図示されるように、センサーは、濃度50fg/mLで分析物分子(タウタンパク質の分子)を検出し得、2046のデジタルナノ構造(20d)中96が、1つの光学的特性から検出器により検出可能である別のものに裏返る。この特定の例において、ナノ構造の全てまたは実質的に全てが1つの光学的状態から他のものに裏返る場合、センサー100は約50pg/mLの分子濃度で飽和される。
図4は、図3Bの例示的センサー40により得られた測定値からコンパイル(compile)されたデータを示すグラフである。1pg/mL～1ng/mLの分析物濃度範囲において、デジタル定量化モード70は、高い感度および3対数のダイナミックレンジを提供する。1ng/mL～1μg/mLの分析物濃度範囲において、アナログ比色定量測定値80は、さらに3対数だけ検出可能な濃度範囲を広げる。全ダイナミックレンジにわたる連続曲線を形成するデジタル定量化測定値とアナログ定量化測定値の間の移行は、本明細書に記載される種類のアルゴリズムを使用して自動化され得る。この例において、デジタル定量化のために構成されたナノ構造のシリーズとアナログ定量化のために構成されたナノ構造のシリーズの組合せを使用して、6対数ダイナミックレンジが達成される。本明細書に記載されるセンサーは、小さい体積の試料(例えば100μL、50μL、25μL、10μLまたは5μL未満)を使用して、高い感度で(例えば50fg/mL)、大きなダイナミックレンジ(例えば6対数以上)を達成し得ることが発見された。
ナノ構造は、任意の適切な形状および/またはサイズを有し得る。いくつかの場合、例えばナノ構造はナノニードル、ナノワイヤ、ナノロッド、ナノコーン等であり得る。例えばナノリボン、ナノフィラメント、ナノチューブ等の他の形状も可能である。ある態様において、ナノ構造は、垂直に整列されるが、他の角度または整列も可能である。例えばナノニードル、ナノドット、ナノディスク、ナノピラー等のナノ構造は、表面ポラリトンへのカップリングを介して電磁エネルギーを閉じ込めるそれらの能力のために単一分子レベル感度を有する。
センサーの物理的形態は、ボトムアップおよび/またはトップダウン法により表面上に作製されるナノ構造、例えばナノニードル、ナノワイヤ、ナノピラー、ナノドット等のアレイまたはマトリックスであり得る。表面は、ウェーハーの上部表面などの平坦な表面であり得る。代替的に、表面はまた、湾曲もしくは可撓性であり得るか、または例えば線維もしくはワイヤ等の三次元構造の一部であり得る。
センサーの機能的形態は、ナノ光学構造、ナノ機械構造またはナノ電気構造を含み得る。したがって、読出しシグナルとしては、限定されないが、光学的シグナル、電気的シグナル、および機械的シグナルが挙げられる。したがって、分析物の濃度は、ナノ構造の光学的、電気的またはナノ機械的特性の変化により決定され得る。光学的特性としては、例えば表面プラスモン共鳴、ナノ光子共鳴、電気的共鳴、磁気的共鳴、散乱、吸収、蛍光、色変化等が挙げられる。電気的特徴としては、例えば、抵抗、キャパシタンス、電流、電圧等が挙げられる。ナノ機械的特徴としては、例えば振動共鳴、振動大きさ、機械的質量等が挙げられる。
前述の構造はまた、それらの光学的特性、例えば表面プラスモン共鳴、散乱強度または吸収の変化を観察することにより高い分析物の濃度を検出するために使用され得る。これらの構造の感度および検出範囲は、構造のサイズと密接に関連する。平面製作技術は、1つのデバイス中の異なるサイズおよび形状のナノ構造の測定可能かつ柔軟な組み込みを可能にする。異なるナノ構造を使用して、生物学的試料中の分子および分析物の決定のための高感度および高いダイナミックレンジを達成し得る。
ある態様において、異なる構造の表面特性は、ナノ構造の第1のシリーズ中のナノ構造が、分析物の結合について、ナノ構造の第2および/または第3のシリーズのものよりも高い結合親和性を有し得るように設計され得る。これは、所定の分析物に対して異なる結合親和性を有する結合剤を使用することにより達成され得る。結果的に、低濃度で、分析物は、単一分子ナノ構造により優先的に捕捉および検出される。濃度が増加するにつれて、第1のシリーズのナノ構造は飽和して、ダイナミックレンジを広げるためにナノ構造の他のシリーズからのシグナルが使用され得る。
図5は、ナノ構造の複数のシリーズを含む例示的なセンサー(例えばナノモザイクチップ)150の写真による表示である。センサー150の左手側の列において、分かれた領域は、ナノ構造の直径が増加するにつれてナノ構造が色を変えることを示す、製作対照構造155を示す。中央の領域160は、複数の別々のアレイ(すなわち16アレイ)を示し、それぞれは、超低濃度レベルの分析物を測定するための、デジタル定量化について構成されたナノ構造の対応するシリーズ(集合的に、25,600のナノ構造を含み、それぞれが単一分子ナノ構造を画定する)を画定する。右手側の領域は、アナログ定量化のための、領域165、170、175と示されるナノ構造の3つのシリーズ(例えばナノ構造の第2、第3および第4のシリーズ)を含む。領域165、170、175のそれぞれは、3つの別々の隣接するまたは重複する濃度範囲内の分析物濃度を測定するように較正される。ある態様において、3つの領域はそれぞれ、1,000のナノ構造を含み得る。
図6において写真により示される代替的な態様において、別の例示的なセンサー(例えばナノモザイクチップ)150は、ナノ構造の多くのシリーズ(領域)を含む。中心に、センサーと光学的検出システムの整列を補助するための基準マーカー200が配置される。基準マーカーは、任意の望ましい設計であり得る。例えば、図6に示されるように、基準マーカー200は、回転対称を有さない方法で配列されるひし形パターンおよび3つの三角形パターンを含み、位置および回転方向の情報を提供する。結果的に、基準マーカーは、(i)センサーの位置を示し、(ii)ナノ構造の水平および垂直面を整列させるために使用され得る。作製制御構造155は、基準の周囲に配置される。デジタル単一分子ナノ構造20dのアレイは、センサーの左および右の領域に配置され、アナログ分子ナノ構造20aのアレイは、基準および製作対照構造の周囲の中心の列に配置される。図6に示される製作対照は、その直径が80nm～150nmの範囲であるナノ構造(例えばナノニードル)の8つのブロックを含む。暗視野画像下でのナノ構造(ナノニードル)の色は、直径が増加するにつれて変化する。
ある態様において、ナノ構造は、約500nm、450nm、350nm、300nm、250nm、200nm、150nm、100nm、50nm、30nm、20nm、10nm、5nm、3nmまたは2nm未満の基板との結合の末端または点から決定される長さを有する。ある態様において、ナノ構造の長さは、少なくとも約2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nmまたは500nmであり得る。
ナノ構造は、任意の適切な断面形状、例えば正方形、円形、三角形、長円、多角形、星形、不規則な形状等を有し得る。ナノ構造は、その長さを通じて同じ断面形状を維持し得るか、またはナノ構造の異なる部分で異なる断面形状を有し得る。また、ナノ構造は、任意の適切な断面直径を有し得る。断面直径は一定であり得る(例えばナノニードルまたはナノロッドにおいてと同様)か、または異なり得る(例えばナノコーンにおいてと同様)。平均断面直径は、例えば約1,000nm、750nm、500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、40nm、30nm、20nmまたは10nm未満であり得る。ある態様において、断面直径は、少なくとも約10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、75nm、100nm、125nm 150nm、175nm、200nm、300nm、400nm、500nm、750nmまたは1,000nmであり得る。種々の態様において組合せも可能である。例えば、ナノ構造の平均直径は、50nm～300nm、75nm～250nmまたは100nm～200nmであり得る。
(B)製作考察
ナノ構造は、任意の適切な材料で形成され得、それが配置される基板と同じまたは異なり得る。ある態様において、ナノ構造(例えばナノニードル)は、ケイ素および/または他の適切な半導電性材料(例えばゲルマニウム)で形成され得る。材料のさらなる非限定的な例としては、金属(例えばニッケルまたは銅)、シリカ、ガラス等が挙げられる。
ある態様において、ナノ構造(例えばナノニードル)は、基板上に配置され得、一元の材料で形成され得る。すなわち、ナノ構造(例えばナノニードル)および下にある基板(例えば平面基板)は、一元であり得、同じ材料で形成され得る。他のアプローチにおいて、ナノ構造(例えばナノニードル)は、下にある基板(例えば平面基板)に結合または接着され得、それらは同じ材料または異なる材料で形成され得る。
本明細書に記載されるセンサーは、いくつかの異なるアプローチにより、例えば半導体製造アプローチを使用して作製され得ることが企図される。上述のようにおよび以下により詳細に記載されるように、本明細書に記載されるセンサーの作製に有用なナノ構造のシリーズを形成するために、任意の適切な方法が使用され得る。例としては、限定されないが、例えばeビームリトグラフィー、フォトリトグラフィー、X線リトグラフィー、極端紫外線リトグラフィー、イオンプロジェクションリトグラフィー等のリトグラフィー技術が挙げられる。代替的にまたは付加的に、ナノ構造は、適切な腐食液によりエッチングされやすい1つ以上の材料により形成され得る。
例えば、ある態様において、ナノ構造は、適切な腐食液によりエッチングされやすい1つ以上の材料から形成され得る。例えば、ナノ構造は、HF(フッ化水素酸)またはBOE(緩衝化酸化物腐食液)を使用してエッチングされ得るシリカまたはガラスなどの材料を含み得る。別の例として、ナノ構造は、HCl(塩酸)、HNO3(硝酸)、硫酸(H2SO4)などの酸を使用してエッチングされ得る銅、鉄、ニッケルおよび/または鋼鉄などの金属および/または塩化第二鉄(FeCl3)もしくは硫酸銅(CuSO4)などの他のエッチング化合物を含み得る。さらに別の例として、ナノ構造は、EDP(エチレンジアミンおよびピロカテコールの溶液)、KOH(水酸化カリウム)および/またはTMAH(テトラメチルアンモニウムヒドロキシド)などの腐食液を使用してエッチングされ得るケイ素または他の半導体材料を含み得る。ナノ構造はまた、いくつかの場合において、KOH(水酸化カリウム)および/または本明細書に記載されるものなどの他の酸を使用してエッチングされ得るプラスチックまたはポリマー、例えばポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリパーフルオロブテニルビニルエーテル等を含み得る。
(i) ナノ構造製作
本明細書に記載されるセンサーは、従来の半導体製造技術、例えば経済的な様式でハイスループットおよび高い収率で高い製造能力(manufacturing capability)をもたらすCMOS技術により製作され得ることが企図される。かかるアプローチを使用して、基板上に配置されるかまたは基板と一体化されるナノ構造、例えばナノニードル、ナノドット、ナノディスク、ナノワイヤおよびナノピラーの1つ以上のシリーズを含むセンサーを作製することが可能である。例示的なナノ構造は図7および8に概略的に示される。非限定的な例として、図7は、現在のナノ作製技術、例えば電子ビームリトグラフィー、フォトリトグラフィー、ナノインプリンティング等により基板上に直接形成され得るいくつかのナノ構造20を示す。例えば、ナノ構造20は、ナノピラー(不均一なナノニードル)、ナノディスク、円錐形状のナノニードルまたはナノドットであり得る。また、図8は、2つ以上の材料、例えば第1および第2の材料300および305それぞれで製作されるナノ構造20(例えばナノニードル)を示す。それぞれの材料の組成物は、以下に議論されるように、分析物に結合するためのナノ構造の結合容量を制御するため、または特定の光学的、電気的もしくは磁気的特性を達成するために使用され得る。
ナノ構造の製作は、同等の大規模化能力によりウェーハースケールまたはチップスケールのいずれかで実施され得る。この種類のアプローチにおいて、設計されるナノ構造についてマスクが最初に作製される。ある態様において、マスク上のパターンとして設計構造と逆のものが使用される。例えば、フォトレジストは、例えばスピンコーティングまたはディップコーティングプロセスを使用して、ウェーハーまたはチップ上にコーティングされる。次いでフォトレジストはマスクを通してフォトレジストまで電磁放射線に暴露され得る。その後、暴露されたフォトレジストが現像される。ある態様において、フォトレジスト上のパターンはまた、レーザービームまたは電子ビームにより直接書かれ得る。次いでフォトレジスト上のパターンは、所望の材料の熱蒸着、電子ビーム蒸着、スパッタもしくは化学蒸着、または原子層堆積などの物理的気相成長法により基板に転写され得る。
ある態様において、フォトレジスト上のパターンは、反応性イオンエッチング、スパッタエッチングおよび/または気相エッチングなどのウェットエッチング、ドライエッチングを含むトップダウンエッチングプロセスを使用して、基板に転写され得る。パターン形成、蒸着、エッチングおよび機能化プロセスは、複数サイクルの間に反復され得る。ある態様において、ナノニードル、ナノピラー、ナノドットおよび/またはナノワイヤのアレイは、半導体製造プロセスを使用して作製され得る。他の態様において、ナノニードル、ナノピラー、ナノドットおよび/またはナノワイヤのアレイは、モールドスタンピング(mold-stamping)プロセスを使用して作製され得る。
図9A～9Dに示される断面図に例示的な製作アプローチを示す。図9Aを参照すると、より具体的に、eビームレジストまたはフォトレジスト310の層は、ケイ素基板などの半導体基板320上にコーティングされる。図9Bを参照すると、次いでレジスト層は電子ビーム暴露または電磁放射線暴露によりパターン形成され、例えばElionixまたはRaithの電子ビームリトグラフィーシステムを使用して、レジスト層特徴325が形成される。図9Cを参照すると、レジストは、レジスト現像剤中で現像され、その部分が除去され、レジスト特徴325のみが残される。図9Dを参照すると、次いでマスクとして働くパターン形成されたレジストによりエッチングプロセスが実施される。エッチングプロセスは、例えばウェットまたはドライ腐食液であり得る。適切なウェット腐食液は、例えばエチレンジアミンピロカテコール(EDP)、水酸化カリウム(KOH)またはテトラメチルアンモニウムヒドロキシド(TMAH)の溶液であり得る。結果的に、ケイ素ナノニードル330は、ナノニードルの上部表面上に配置されたレジスト325により作製される。ナノニードルの高さは2nm～1000nmの範囲であり得る。ナノニードルの直径は10nm～1000nmの範囲であり得る。レジスト特徴325は、従来のウェットエッチングバッファ(示さず)を使用して除去され得る。
エッチングされた構造の表面は、化学蒸着法もしくは原子層堆積または両方のハイブリッドを使用して化学的に活性化され得る。この活性化プロセスは、ウェット溶液中でも実施され得る。次いで、化学的に活性化された構造は、例えば化学吸着(例えば共有結合)または物理吸着を介して生物学的材料、本明細書に記載される結合剤に結合する準備がされる。
適切なケイ素基板は、例えば丸い12”ケイ素ウェーハーであり得る。Society of Biomolecular Screening (SBS)に推奨されるマイクロプレート仕様を満たすために、丸いウェーハーを矩形にさいの目に切る。さいの目に切る工程は、上述の製作プロセスの終了時に実施し得る。代替的に、ウェーハーの半分の深さにさいの目に切ることを製作プロセスの開始時に実施し得；次いで全ての製作工程(スピンコーティング、パターン形成、蒸着およびエッチングを含む)の完了後、ウェーハーはSBS形式に容易に切断され得る。
図10A～10Gに示される断面図に別の製作アプローチを示す。図10Aを参照すると、二酸化ケイ素層335を、化学蒸着法、原子層堆積または両方の組合せを使用してケイ素基板320の上部表面に形成する。層の厚さは2nm～100nmの範囲であり得る。例えばポリメチルメタクリレートを含むレジスト層310は、二酸化ケイ素層335にスピンコーティングされる。図10Bおよび10Cを参照すると、レジスト層310は、電子ビームまたは電磁放射線によりパターン形成され、次いでレジスト現像液中で現像されて、レジスト特徴325を形成する。図10Dを参照すると、アルミニウム層340は、例えば熱蒸着(または電子蒸着)により、例えばSharon熱エバポレーターまたはDenton eビームエバポレーターを用いてパターン形成されたレジスト層特徴325上に蒸着される。アルミニウム層340は好ましくは20nm～100nmの厚さである。図10Eを参照すると、リフトオフプロセスを実行して、レジスト層特徴325を除去し、二酸化ケイ素層335の上にアルミニウムマスクが残される。図10Fを参照すると、STS ICP RIEシステムまたはOxfordプラズマRIEシステムを用いた反応性イオンエッチングなどのエッチングプロセスを実施して、酸化ケイ素ナノニードル335をエッチングする。RIEエッチングはさらに、ケイ素層320まで進行して、二層のSiO2-Siナノ構造を生じ得る。図10Gを参照すると、アルミニウムマスク340は、アルミニウム腐食液バッファ、例えば1～5% HNO3、H3PO4およびCH3COOHの混合物中でケイ素ナノニードル342の上部からエッチング除去され得る。
図11A～11Fに示される断面図にさらに別の製作アプローチを示す。図11Aを参照すると、二酸化ケイ素層335は、ケイ素基板320の上部表面上で成長される。レジスト層310は、二酸化ケイ素層335上にスピンコーティングされる。図11Bおよび11Cを参照すると、レジスト層310は、電子ビームまたは電磁放射線によりパターン形成され、次いでレジスト現像液中で現像され、レジスト特徴325を形成する。図11Dを参照すると、アルミニウム層340などの金属層が、例えば熱蒸着(または電子蒸着)プロセスにより、パターン形成されたレジスト層310上に蒸着される。図11Eを参照すると、次いでリフトオフプロセスが実施されて、レジスト層310が除去され、基板上の酸化物層上に配置されるアルミニウムナノニードルが残される。図11Fを参照すると、コーティング層345は、スピンコーティングされて、基板の表面特性を改変し得る。コーティング層は、TEFLONまたはポリエチレングリコール分子の層などの疎水性材料であり得る。コーティング層の厚さは、アルミニウムナノニードルの高さより小さい。
図12A～12Fに示される断面図に別の製作アプローチを示す。図12Aを参照すると、レジスト層310は、酸化物基板350上にスピンコーティングされる。酸化物層は、熱により成長される酸化ケイ素であり得るかまたは化学蒸着法により形成され得る。いくつかの態様において、基板350は、ガラススライドであり得る。図12Bおよび12Cを参照すると、電磁放射線を使用して、レジスト層310中の特徴をパターン形成し得、次いでこれはレジスト現像液中で現像されて、レジスト特徴325を形成する。図12Dを参照すると、ケイ素層355は、例えば化学蒸着法を使用して、パターン形成されたレジスト層310上に蒸着される。図12Eを参照すると、リフトオフプロセスが実施され、パターン形成されたレジスト層310が除去され、酸化物基板上にケイ素ナノドット構造360が生じる。図12Fを参照すると、例えばVLS(上記-液体-固体)法により、種(seed)としてケイ素ナノドット360を使用して、ケイ素ナノニードル構造365がエピタキシャルに成長され得る。
フォトレジスト層がモールドを使用してパターン形成され得る図13A～13Dに示される断面図に別の製作アプローチを示す。図13Aを参照すると、モールド370は、例えばSiまたは石英で作製される。モールドは、eビームリトグラフィーなどの高分解能パターン形成技術により作製され得る。モールドは、複製される標的ナノ構造のものと同様の特徴サイズを有する。図13Bを参照すると、レジスト層310は、ケイ素基板320上にスピンコーティングされる。図13Cを参照すると、次いでモールド370中の特徴は、ナノインプリンティングまたはナノスタンピングによりレジスト中にスタンプされ、次いで例えばUVまたは熱により架橋される。図13Dを参照すると、インプリンティングされたフォトレジストは、その後のエッチングプロセスのためのマスクとして使用され、ケイ素ナノ構造が得られ得る。
図14Aおよび14Bを参照すると、上述の製作工程を反復することにより、ウェーハー320上に製作される複数のセンサー375を作製して、例えばそれぞれのウェーハー320上に配置されるセンサーの10x10アレイが作製されることが可能である。図14Bに示されるように、それぞれのセンサーは、ナノ構造、例えばケイ素基板上に配置されるナノニードル330のアレイを含む。
図10～14に示されるナノ構造は、1～999nm、1～750nm、1～500nm、1～400nm、1～300nm、1～200nm、1～100nm、10～999nm、10～750nm、10～500nm、10～400nm、10～300nm、10～200nm、10～100nm、20～999nm、20～750nm、20～500nm、20～400nm、20～300nm、20～200nm、20～100nm、30～999nm、30～750nm、30～500nm、30～400nm、30～300nm、30～200nm、30～100nm、40～999nm、40～750nm、40～500nm、40～400nm、40～300nm、40～200nm、40～100nm、50～999nm、50～750nm、50～500nm、50～400nm、50～300nm、50～200nmまたは50～100nmの範囲の少なくとも1つの寸法を有することが注意されるべきである。例えば図14B中のナノ構造の間のピッチ、すなわち中心-対-中心の距離は、典型的に1～100μm、例えば少なくとも1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μmまたは90μmである。構造のピッチについて他の寸法が使用され得る。図14Bにおけるナノ構造のアレイは、その全体において、図14Aに示されるようにアレイ形式でも配列され得る。例えば、図14Aに示されるナノ構造の2つのアレイの間のピッチは、100μm未満から数センチメートルより大きい範囲であり得る。さらに、ナノ構造のピッチおよびサイズは、チップの異なる部分またはナノ構造のそれぞれのシリーズ内で異なり得ることが企図される。これらのいずれかの組合せも、種々の態様において可能である。
さらに、周期的構造におけるナノ構造の間の距離またはピッチは、例えばナノ構造がメタサーフェスを形成するように制御され得る。例えば、ピッチは、入射光の波長よりも小さく設定され得る。例えば、ピッチは、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、25nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm 3nmもしくは2nm未満、および/または1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm 10nm、25nm、50nm、100nm 200nm、300nm、400nm、500nm、600nmもしくは700nmより大きくあり得る。例えば、特定の状況下で、ピッチは400nm～500nmであり得る。ナノ構造は、本明細書において提供される寸法のいずれかを有し得る。特定の状況下で、ナノ構造の平均断面直径または最小もしくは最大断面寸法は、入射光の波長より小さい。特定の状況下で、個々のナノ構造は、光学的に解像可能であるように構成され、ここで、例えばピッチは、100μm未満、10μm未満、5μm未満および/または1μmより大きくもしくは5μmより大きくあり得る。
表1は、光学的読出しについての本明細書に記載されるナノ構造の例示的パラメータを記載する。
Figure 2023541546000002
表2は、機械的読出しについての本明細書に記載されるナノ構造の例示的パラメータを記載する。
Figure 2023541546000003
表3は、電気的読出しについての本明細書に記載されるナノ構造の例示的パラメータを記載する。
Figure 2023541546000004
(ii) ナノ構造機能化
第1のシリーズおよび適用可能な場合は第2および第3のシリーズにおけるナノ構造は、分析物に結合する結合剤、例えば結合剤、例えば分析物に結合する生物学的結合剤で機能化される。生物学的結合剤は、例えば抗体、アプタマー、リガンド-受容体ペアのメンバー、酵素または核酸であり得る。特定の状況下、例えば第1のシリーズを使用して、非常に低い濃度の分析物を測定する場合、分析物について、第2、第3またはそれ以降のシリーズにおける結合剤よりも高い結合親和性を有する第1のシリーズにおける結合剤を使用することが有利であり得る。
所定のナノ構造に適用される結合剤の数は、所望のアッセイ、例えば必要とされるダイナミックレンジ、検出される分析物の数等に応じて変化し得る。例えば、特定の状況下で、ナノ構造は、1、5、10、20、25、50、75、100またはそれ以上の結合剤により機能化され得る。これらの値はナノ構造当たり、1～1,000、1～500、1～250、1～100、1～50、1～25、1～10または1～5の結合剤の範囲であり得る。
センサーは、試料中の任意の目的の分析物を検出および/または定量化するように設計され得る。さらに、所定のセンサー中のナノ構造またはナノ構造のシリーズは、同時または連続的に、複数の異なる分析物に結合、それを検出および/または定量化するように構成され得る。例えば、センサーは、試験試料中の対応する複数の異なる分析物を検出するために、複数の異なる結合剤を含み得る。
分析物は、種々の試料中で検出および/または定量化され得る。試料は、分析物の測定を可能にする任意の形態であり得る。すなわち、試料は、薄い切片の調製物などの、分析物の検出を可能にするために分析物の抽出または処理を許容しなければならない。したがって、試料は、新鮮であり得るか、適切な極低温技術により保存され得るか、または非極低温技術により保存され得る。ある態様において、試料は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液または間質液試料などの体液試料である。ある態様において、試料は、例えば従来の生検機器および手順を使用して得られる生検試料から得られる組織抽出物である。内視鏡的生検、切除生検、切開生検、微細針生検、パンチ生検、薄片生検および皮膚生検は、組織試料を得るために当業者が使用し得る、認識される医学的手順の例である。その後の分析のための組織調製のための適切な技術は、当業者に周知である。ある態様において、試料は細胞試料または細胞上清試料である。
分析物としては、生物学的分子、例えばタンパク質、糖タンパク質、リポ蛋白、核蛋白および前述のタンパク質のいずれか1つのペプチドなどのペプチドを含むタンパク質が挙げられる。例示的なタンパク質系分析物としては、例えば限定されることなく、サイトカイン、抗体、酵素、成長因子、ホルモン、構造タンパク質、輸送タンパク質、受容体、DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、免疫系タンパク質、シャペロンタンパク質等が挙げられる。
ある態様において、分析物は、サイトカイン、例えばインターフェロン(例えばIFNα、IFNβおよびIFNγ)、インターロイキン(例えばIL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17およびIL-20)、腫瘍壊死因子(例えばTNFαおよびTNFβ)、エリスロポイエチン(EPO)、FLT-3リガンド、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、ランテス、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、ならびに前述のいずれかの機能性断片である。
ある態様において、分析物は抗体である。抗体の例としては、限定されないが、抗EGFR、抗HER2、抗PD1、抗PIK3CA、抗-抗Tau、抗RhoA、抗βアクチン、抗αチューブリン、抗βチューブリン、抗YAP、抗TAZ、抗NRF2、抗SIRT1、抗SIRT2、抗GIRK2、抗IL-6、抗IL-9、抗FLT3、抗BCMA、抗グレリン、抗オキシトシン、抗プロラクチンおよび抗レラキシンが挙げられる。
ある態様において、分析物は酵素である。酵素の例としては、限定されないが、亜硝酸レダクターゼ、硝酸レダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、チオレドキシンレダクターゼ、亜硫酸オキシダーゼ、シトクロームp450オキシダーゼ、一酸化窒素ジオキシゲナーゼ、チアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、システイン脱硫酵素、リポイルシンターゼ、ホスホリパーゼA、アセチルコリンエステラーゼ、コリンエステラーゼ、ホスホリパーゼC、フルクトースビスホスファターゼ、ホスホリパーゼD、アミラーゼ、スクラーゼ、キチナーゼ(chinitase)、リゾチーム、マルターゼ、ラクターゼ、βガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ヘリカーゼ、ATPaseおよびDNAポリメラーゼが挙げられる
ある態様において、分析物は成長因子である。成長因子の例としては、限定されないが、コロニー刺激因子(CSF)、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、トランスホーミング成長因子(TGF)および血管内皮成長因子(VEGF)が挙げられる。
ある態様において、分析物はホルモンである。ホルモンの例としては、限定されないが、エピネフリン、メラトニン、ノルエピネフリン、トリヨードサイロニン、チロキシン、ドーパミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アミリン(または島アミロイドポリペプチド)、抗ミュラー管ホルモン(またはミュラー管阻害因子またはホルモン)、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン(またはコルチコトロピン)、アンギオテンシノゲンおよびアンギオテンシン、抗利尿ホルモン(またはバソプレシン、アルギニンバソプレシン)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(またはアトリオペプチン)、脳ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、コルチスタチン、エンケファリン、エンドセリン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガラニン、胃抑制性ポリペプチド、ガストリン、グレリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド-1、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヘプシジン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤ラクトゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子(またはソマトメジン)、レプチン、リポトロピン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、モチリン、オレキシン、オステオカルシン、オキシトシン、膵臓ポリペプチド、副甲状腺ホルモン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、レラキシン、レニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン(またはサイロトロピン)、サイロトロピン放出ホルモン、血管作動性腸管ペプチド、グアニリン、ウログアニリン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、アルドステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、コルチゾール、プロゲステロン、カルシトリオール(1,25-ジヒドロキシビタミンD3)およびカルシジオール(25-ヒドロキシビタミンD3)が挙げられる。
ある態様において、分析物は構造タンパク質である。構造タンパク質の例としては、限定されないが、アクチン、ミオシン、カテニン、ケラチン、プラキン、コラーゲン、フィブリリン、フィラグリン、ゼラチン、クローディン、ラミニン、エラスチン、タイチンおよびスクレロチンが挙げられる。
ある態様において、分析物は輸送タンパク質である。輸送タンパク質の例としては、限定されないが、EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4、EAAT5、グルコース輸送因子、ドーパミン輸送因子、ノルエピネフリン輸送因子、セロトニン輸送因子、小胞モノアミン輸送因子、ATP結合カセット輸送因子、V型ATPase、P型ATPase、F型ATPaseおよびロドプシンが挙げられる。
ある態様において、分析物は受容体である。受容体の例としては、限定されないが、Gプロテイン共役受容体、アドレナリン作動性受容体、嗅覚受容体、受容体チロシンキナーゼ、上皮成長因子受容体(EGFR)、インスリン受容体、線維芽細胞成長因子受容体、高親和性神経栄養物質受容体、エフリン受容体、インテグリン、低親和性神経成長因子受容体およびNMDA受容体が挙げられる。
ある態様において、分析物はDNA結合タンパク質である。DNA結合タンパク質の例としては、限定されないが、H1/H5、H2、H3、H4、プロタミンおよび転写因子(例えばc-myc、FOXP2、FOXP3、MyoD、p53等)が挙げられる。
ある態様において、分析物はRNA結合タンパク質である。RNA結合タンパク質の例としては、限定されないが、鋸歯状RNAエフェクター分子ホモログ(SRRT)、TAP/NXF1、ZBP1、GLD-1、GLD-3、DAZ-1、PGL-1、OMA-1、OMA-2、Pumilio、Nanos、FMRP、CPEBおよびStaufenが挙げられる。
ある態様において、分析物は免疫系タンパク質である。免疫系タンパク質の例としては、限定されないが、CD34、CD31、CD117、CD45、CD11B、CD15、CD24、CD44、CD114、CD182、CD4、CD8、CD3、CD16、CD91、CD25、CD56、CD30、CD31、CD38、CD47、CD135およびFOXP3が挙げられる。
ある態様において、分析物はシャペロンタンパク質である。シャペロンタンパク質の例としては、限定されないが、GRP78/BIP、GRP94、GRP170、カルネキシン、カルレティキュリン、HSP47、ERp29、プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)、プロリルイソメラーゼ、ERp57、HSP70、HSP90およびHSP100が挙げられる。
ナノ構造は、当該技術分野で公知の標準化学を使用して機能化され得る。最初の事項として、ナノ構造の表面は、標準リンカー化学などの標準化学を使用して、結合剤への結合について活性化され得る。
結合剤は、直接または化学リンカーを介してのいずれかで、(例えばナノ構造の表面上またはその表面に存在するシラノール基を介して)ナノ構造の表面と反応し得る官能基を含み得るかまたはそれを含むように作り変えられ得る。
一アプローチにおいて、ナノ構造の表面シラノール基は、反応性基(例えば第1級アミン)を有するアルコキシシラン、クロロシランまたは代替的なシランモダリティなどの1つ以上の活性化剤により活性化され得る。反応性基を有する例示的なアルコキシシランとしては、例えばアミノシラン(例えば(3-アミノプロピル)-トリメトキシシラン(APTMS)、(3-アミノプロピル)-トリエトキシシラン(APTES)、(3-アミノプロピル)-ジエトキシ-メチルシラン(APDEMS)、3-(2-アミノエチルアミノプロピル(aminoethyaminopropyl))トリメトキシシラン(AEAPTM))、グリシドキシシラン(例えば(3-グリシドキシプロピル)-ジメチル-エトキシシラン(GPMES))またはメルカプトシラン(例えば(3-メルカプトプロピル)-トリメトキシシラン(MPTMS)もしくは(3-メルカプトプロピル)-メチル-ジメトキシシラン(MPDMS)が挙げられ得る。反応性基を有する例示的なクロロシランとしては、3-(トリクロロシリル)プロピルメタクリレート(TPM)および10-イソシアナトデシルトリクロロシラン(isocyanatodecyltrichlorosilane)が挙げられる。
その後、結合剤上の官能基、例えばリジン残基上の側鎖上の第1級アミンは、種々の架橋剤を使用して、ナノ構造の表面に付加された反応性基に結合され得る。例示的な架橋剤としては、例えばホモ二官能性架橋剤(例えばグルタルアルデヒド、ビスマレイミドヘキサン、ビス(2-[スクシンイミドオキシカルボニルオキシ]エチル)スルホン(BSOCOES)、[ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート](BS3)、(1,4-ジ-(3'-[2ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ブタン)(DPDPB)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ジスクシンイミジルタートレート(DST)、スルホジスクシンイミジルタートレート(スルホDST)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート(DSP)、3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、ビス(β-[4-アジドサリチルアミド]-エチル)ジスルフィドヨード化可能物(iodinatable) (BASED)、ホモ二官能性NHS架橋試薬(例えばビスN-スクシンイミジル-[ペンタエチレングリコール]エステル(ビス(NHS)PEO-5)およびPEGまたはデキストランポリマーのホモ二官能性イソチオシアネート誘導体)およびヘテロ二官能性架橋剤(例えばスクシンイミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、スクシンイミジル-4-(Nマレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ(6-アミドカプロエート)(LC-SMCC)、Nマレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、スクシンイミド4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)、N-ヒドロキシ-スクシンイミドおよびN-エチル-‘(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(NHS/EDC)、(N-ε-マレイミド-カプロン酸)ヒドラジド(スルホEMCS)、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)、モノフルオロシクロオクチン(MFCO)、ビシクロ[6.1.0]ノニン(BCN)、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオプロピオネート(SATP)、マレイミドおよびジベンゾシクロオクチンエステル(DBCOエステル)、ならびに1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロライド(EDC))が挙げられ得る。
例により、本明細書に記載されるナノ構造は、表面シラノール基の遊離ヒドロキシル基を改変して反応性基(例えば第1級アミン)を生成するように、アルコキシシラン(例えばAPTMS)を介して活性化され得る。次いで、ナノ構造上で生成された反応性基(例えば第1級アミン)は、例えばタンパク質、例えば目的の抗体中のリジンアミノ酸の側鎖中に存在する遊離アミン基と共有結合を形成する架橋剤、例えばグルタルアルデヒドと反応し得る。
当該技術分野で公知の他の活性化およびコンジュゲーションケミストリーを使用して、1つ以上の結合剤を本明細書に記載されるナノ構造の表面に共有結合し得ることが企図される。
所定のナノ構造またはナノ構造のシリーズは、目的の分析物に結合する結合剤により機能化され得ることが企図される。用語「結合剤」は、本明細書で使用する場合、目的の分析物に特異的に結合する剤をいう。用語「優先的に結合する」または「特異的に結合する」は、結合剤に関して使用する場合、標的分析物以外の分子と結合するよりも(i)より安定に、(ii)より迅速に、(iii)より強い親和性で、(iv)より大きな持続時間でまたは(v) (i)～(iv)のいずれか2つ以上の組合せで、特定の標的分析物と結合および/または会合する剤をいう。例えば、標的分析物に特異的または優先的に結合する結合剤は、異なる分析物に結合するよりも、例えばより強い親和性で、アビディティで、より容易におよび/またはより大きい持続時間で標的分析物に結合する結合ドメインである。表面プラスモン共鳴により決定される場合、結合剤は、分析物について、約100nM、50nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nMもしくは0.01nM、またはより強い親和性であり得る。例えば、結合剤は、分析物について、約0.01nM～約100nM、約0.1nM～約100nMまたは約1nM～約100nMの範囲内の親和性を有し得る。第1の標的分析物に優先的に結合する結合剤は、第2の標的分析物に優先的に結合してもしなくてもよいことが理解される。このように「優先的な結合」は、排他的な結合を(含み得るが)必ずしも必要としない。
例示的な結合剤としては、(例えば基質および阻害剤に結合する)酵素、(例えば抗原に結合する)抗体、(例えば標的抗体に結合する)抗原、(例えばリガンドに結合する)受容体、(例えば受容体に結合する)リガンド、(例えば核酸分子に結合して、例えばDNA-DNA、RNA-RNAまたはDNA-RNA二本鎖を形成する)核酸一本鎖ポリマー、および標的分析物と結合する合成分子が挙げられる。天然、合成、半合成および遺伝子的に改変されたマクロ分子が結合剤として使用され得る。結合剤としては、生物学的結合剤、例えば抗体、アプタマー、受容体、酵素または核酸が挙げられる。
本明細書で使用する場合、そうではないと示されない限り、用語「抗体」は、改変された、遺伝子工学で作り変えられたまたは化学的にコンジュゲートされたインタクトな抗体または抗原結合断片を含む、インタクトな抗体(例えばインタクトなモノクローナル抗体)または抗体の抗原結合断片(例えばモノクローナル抗体の抗原結合断片)を意味することが理解される。改変または遺伝子工学で作り変えられた抗体の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体および多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)が挙げられる。抗原結合断片の例としては、Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、一本鎖抗体(例えばscFv)、ミニボディおよびダイアボディが挙げられる。
ある態様において、抗体は、約300pM、250pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、150pM、140pM、130pM、120pM、110pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM、40pM、30pM、20pMもしくは10pMまたはそれ未満のKDでその標的に結合する。抗体は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4またはIgEアイソタイプを有し得る。
抗体および他のタンパク質結合剤を作製するための方法は当該技術分野で公知である。例えば、タンパク質結合剤は、天然の供給源から精製され得るか、または組み換えDNA技術を使用して作製され得る。例えば、タンパク質結合剤をコードするDNA分子は、例えば化学的にまたは組み換えDNA法により合成され得る。所望のタンパク質系結合剤をコードする得られた核酸は発現ベクターに組み込まれ(ライゲーションされ)得、これは従来のトランスフェクションまたは形質転換技術により宿主細胞に導入され得る。形質転換された宿主細胞は、宿主細胞が、目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現する条件下で増殖され得る。特定の発現および精製の条件は、使用される発現系に応じて変化する。例えば、遺伝子が大腸菌で発現される場合、遺伝子は、最初に、遺伝子工学で作り変えられた遺伝子を適切な細菌性プロモーター、例えばTrpまたはTacおよび原核生物シグナル配列の下流に配置することにより、発現ベクターにクローニングされる。発現された分泌タンパク質は、屈折体または封入体に蓄積し、フレンチプレスまたは超音波処理による細胞の破壊の後に採取され得る。次いで、屈折体を可溶化して、当該技術分野で公知の方法によりタンパク質をリフォールドおよび切断する。遺伝子工学で作り変えられた遺伝子が、真核生物宿主細胞、例えばCHO細胞中で発現される場合、遺伝子は最初に、適切な真核生物プロモーター、分泌シグナル、ポリA配列および停止コドンを含む発現ベクターに挿入される。遺伝子構築物は、従来技術を使用して、真核宿主細胞に導入され得る。その後、宿主細胞を、タンパク質系結合剤の発現を可能にする条件下で培養する。発現後、例えばグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)またはヒスチジンタグなどのアフィニティタグを含む当該技術分野で公知の技術を使用して、ポリペプチドを採取および精製または単離し得る。
例示的な核酸系結合剤は、アプタマーおよびシュピーゲルマー(spiegelmer)を含む。アプタマーは、特定の標的分子に対して強力な結合活性を有する核酸系配列である。シュピーゲルマーは、結合親和性および機能に関してはアプタマーと同様であるが、天然に存在するヌクレアーゼ感受性D-オリゴヌクレオチドではなくヌクレアーゼ耐性L-オリゴヌクレオチドを使用することにより達成される、酵素的分解を防ぐ構造を有する。
アプタマーは、高い親和性および特異性で標的分子に結合する特異的核酸配列であり、例えば米国特許第5,475,096号および同5,270,163号に記載されるようにSelective Evolution of Ligands by Evolution (SELEX)として一般的に公知である方法により同定される。それぞれのSELEXで同定された核酸リガンドは、所定の標的化合物または分子の特異的なリガンドである。SELEXプロセスは、核酸が、種々の二次元および三次元構造を形成するのに十分な能力、ならびにモノマー性またはポリマー性のいずれにせよ実質的に任意の化合物と共にリガンドとして働く(特異的結合ペアを形成する)ためにそれらのモノマー内で利用可能な十分な化学的多用途性(versatility)を有するという観察に基づく。任意のサイズの分子または組成物が標的として働き得る。
高親和性結合の用途に適用されるSELEX法は、同じ一般的な選択スキームを使用して結合親和性および選択性の実質的に任意の所望の基準を達成するための、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択ならびに結合、分割および増幅の段階的な反復を含む。好ましくはランダム化された配列の部分を含む核酸の混合物から開始して、SELEX法は、該混合物と標的を、結合に好ましい条件下で接触させる工程、標的分子に特異的に結合した核酸から未結合核酸を分割させる工程、核酸-標的複合体を解離させる工程、核酸-標的複合体から解離された核酸を増幅して核酸のリガンド富化混合物を得る工程、次いで結合、分割、解離および増幅の工程を、標的分子に対して高度に特異的な高親和性核酸リガンドを生じるのに望ましいだけ多くのサイクルを通じて反復する工程を含む。したがって、この方法は、所定の標的分子への結合などの特定の機能性について、核酸分子の大きなランダムプールのスクリーニングを可能にする。
SELEX法はまた、向上されたインビボ安定性およびプロテアーゼ耐性などの、リガンドに向上された特性を付与する改変されたヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を含む。かかる改変の例としては、リボースおよび/またはリン酸および/または塩基の位置での化学的置換が挙げられる。改変されたヌクレオチドを含むSELEXプロセスにより同定された核酸リガンドは、米国特許第5,660,985号および同5,580,737号に記載され、2'位で、例えば2'-アミノ、2'-フルオロおよび/または2'-O-メチル部分により改変された1つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを含む。
ヌクレアーゼ活性に対してより抵抗性になるためのさらなる改変を必要とし得るアプタマーを使用する代わりに、L-リボースまたはL-2'デオキシリボース単位で構成される鏡像アプタマーであるシュピーゲルマー(米国特許第8,841,431号、同8,691,784号、同8367,629号、同8,193,159号および同8,314,223号参照)を本発明の実施に使用し得ることが企図される。シュピーゲルマーにおけるキラル反転(chiral inversion)は、天然のD-オリゴヌクレオチドアプタマーと比較して向上された血漿安定性を生じる。L-核酸は、ヌクレアーゼの広範囲の存在のために水溶液中および生物学的試料中で非常に安定でない天然に存在するD-核酸のエナンチオマーである。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞由来のヌクレアーゼは、L-核酸を分解し得ない。
インビトロ選択を使用して、標的分子の合成エナンチオマー、例えばD-ペプチドに結合するオリゴヌクレオチドを選択し得る。次いで、得られたアプタマーを、L-配置で再合成して、鏡像標的に対して元のアプタマーと同じ親和性および特異性で生理学的標的に結合するシュピーゲルマー(鏡についてのドイツ語の「シュピーゲル(spiegel)」に由来する)を作製する。このアプローチは、例えばヘプシジン(米国特許第8,841,431号参照)、MCP-1(米国特許第8,691,784号、同8367,629号および同8,193,159号参照)およびSDF-1(米国特許第8,314,223号参照)に結合するシュピーゲルマーを合成するために使用されている。
例示的なアッセイにおいて、ウェルの1つのブロック内の1つのナノ構造アレイは、目的の分析物に結合する結合剤(例えば抗体)で機能化される。ウェルのそれぞれのブロック内のそれぞれのナノ構造アレイは、異なる結合剤(例えば抗体)で機能化される。機能化後、試料(例えば血漿/血清試料)を、分析物が試料中に存在する場合に結合剤が結合剤-分析物複合体を形成する条件下で、ウェルに添加する。抗体に対する分析物の結合は、ナノ構造アレイの光学的に検出可能な特性、例えば蛍光の変化を生じる。
プリント技術を使用して、抗体などの異なる結合部分を、ウェル内に配置されるナノ構造アレイのグリッド中の異なるナノ構造に配置し得る。プリントとしては、例えば抗体の接触プリント(Gesim microcontact printer, Arrayit NanoPrint)、インクジェットプリント(ArrayJet, Fujifilm)または圧電性分配(Perkin Elmer Piezorray, Biodot piezoelectric dispenser, Gesim NanoPlotter)が挙げられ得る。
特定のアッセイ、例えば非標識アッセイについて、結合剤-分析物複合体(例えば抗体379-分析物380複合体)の形成は単独で、ナノ構造またはナノ構造のアレイ、例えばナノニードル381の光学的に検出可能な特性の変化を生じることがさらに企図される(図14C)。他のアッセイ、例えば標識系アッセイについて、試料中の分析物は、機能性基(例えばビオチン)と一般的に結合し得る。第2の結合剤(例えばストレプトアビジン、ストレプトアビジン-HRPまたはストレプトアビジン-AP)を使用して、分析物と共に複合体を形成する機能性基(例えばビオチン)に対してさらに反応させ得、ナノ構造またはナノ構造のアレイの光学的に検出可能な特性の変化を生じるかまたはその変化を増加する(例えば色変化382)(図14D)。第3の化学的試薬(例えば3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB))は、第2の結合剤との化学的反応を有して、ナノ構造の光学的に検出可能な特性、例えば蛍光の変化をさらに増加するさらなる物質を、ナノ構造上に形成し得ることも企図される。
例示的なサンドイッチイムノアッセイにおいて、ウェルの1つのブロック内の1つのナノ構造アレイは、目的の分析物に結合する結合剤(例えば抗体)で機能化される。ウェルのそれぞれのブロック内のそれぞれのナノ構造アレイは異なる結合剤(例えば抗体)で機能化される。機能化後、標的分析物の存在および/または量について分析される試料(例えば血漿/血清試料)は、分析物が試料中に存在する場合に第1の結合剤が、第1の結合剤-分析物複合体を形成する条件下で、ウェルに添加される。次いで、目的の分析物に結合する結合剤の第2の群(例えば二次抗体の混合物、例えば二次抗体383)は、第2の結合剤が、第2の結合剤-分析物複合体を形成する条件下で、ナノ構造またはナノ構造のシリーズに添加される。第1および第2の結合剤に対する分析物の結合は、「サンドイッチ」配置の複合体を生じる。サンドイッチ複合体の形成は、ナノ構造またはナノ構造のアレイの光学的に検出可能な特性の変化(例えば色変化382)を生じ得る。第2の抗体は機能性基(例えばビオチン)で標識されるので、第3の結合剤(例えばストレプトアビジン)は、第2の結合剤にさらに結合して、ナノ構造の光学的に検出可能な特性の変化をさらに増加するさらなる物質をナノ構造上で形成し得ることも企図される(図14E)。
結合剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ナノボディ、抗体の画分等であり得る。結合剤はまた、アプタマーであり得る。アプタマーは、高い親和性および特異性で標的分子に結合する特定の核酸配列であり、例えば米国特許第5,475,096号および第5,270,163号に記載されるSelective Evolution of Ligands by Evolution (SELEX)として一般的に知られる方法により同定される。それぞれのSELEXで同定される核酸リガンドは、所定の標的化合物または分子の特異的リガンドである。SELEXプロセスは、核酸が、種々の二および三次元構造を形成するのに十分な能力、ならびに単量体であろうと多量体であろうと、事実上任意の化合物と共にリガンドとして作用する(特定の結合ペアを形成する)のに十分な、それらのモノマー内の利用可能な化学的多用途性を有することの観察に基づく。任意のサイズまたは組成の分子は標的として働き得る。
ナノ構造は、当該技術分野で公知の標準的な化学を使用して機能化され得る。開始材料として、ナノ構造の表面は、標準リンカー化学などの標準的な化学を使用して、結合剤に結合するために活性化され得る。
結合剤は、直接的または化学リンカーを介するかのいずれかでナノ構造(例えばナノ構造の表面上またはそこに存在するシラノール基を介して)の表面と反応し得る機能性基を含み得るかまたはそれを含むように工学的に作り変えられ得る。
一アプローチにおいて、ナノ構造の表面シラノール基は、アルコキシシラン、クロロシランまたは反応性基(例えば第1級アミン)を有する代替的なシランモダリティなどの1つ以上の活性化剤で活性化され得る。反応性基を有する例示的なアルコキシシランとしては、例えばアミノシラン(例えば(3-アミノプロピル)-トリメトキシシラン(APTMS)、(3-アミノプロピル)-トリエトキシシラン(APTES)、(3-アミノプロピル)-ジエトキシ-メチルシラン(APDEMS)、3-(2-アミノエチルアミノプロピル(aminoethyaminopropyl))トリメトキシシラン(AEAPTM))、グリシドキシシラン(例えば(3-グリシドキシプロピル)-ジメチル-エトキシシラン(GPMES))またはメルカプトシラン(例えば(3-メルカプトプロピル)-トリメトキシシラン(MPTMS)または(3-メルカプトプロピル)-メチル-ジメトキシシラン(MPDMS)が挙げられ得る。反応性基を有する例示的なクロロシランとしては、3-(トリクロロシリル)プロピルメタクリレート(TPM)および10-イソシアナトデシルトリクロロシランが挙げられる。
その後、結合剤上の機能性基、例えばリジン残基上の側鎖上の第1級アミンは、種々の架橋剤を使用して、ナノ構造の表面に付加される反応性基に結合され得る。例示的な架橋剤としては、例えばホモ二官能性架橋剤(例えばグルタルアルデヒド、ビスマレイミドヘキサン、ビス(2-[スクシンイミドオキシカルボニルルオキシ]エチル)スルホン(BSOCOES)、[ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート](BS3)、(1,4-ジ-(3'-[2ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ブタン)(DPDPB)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ジスクシンイミジルタートレート(DST)、スルホジスクシンイミジルタートレート(スルホDST)、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート(DSP)、3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート(DTSSP)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、ビス(β-[4-アジドサリチルアミド]-エチル)ジスルフィドヨード化可能物(BASED)、ホモ二官能性NHS架橋試薬(例えばビスN-スクシンイミジル-[ペンタエチレングリコール]エステル(ビス(NHS)PEO-5)およびPEGまたはデキストランポリマーのホモ二官能性イソチオシアネート誘導体)およびヘテロ二官能性架橋剤(例えばスクシンイミジル4-(Nマレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、スクシンイミジル-4-(Nマレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ(6-アミドカプロエート)(LC-SMCC)、Nマレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、スクシンイミド4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート(SMPB)、N-ヒドロキシ-スクシンイミドおよびN-エチル-‘(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(NHS/EDC)、(N-ε-マレイミド-カプロン酸)ヒドラジド(スルホEMCS)、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)、モノフルオロシクロオクチン(MFCO)、ビシクロ[6.1.0]ノニン(BCN)、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオプロピオネート(SATP)、マレイミドおよびジベンゾシクロオクチンエステル(DBCOエステル)、ならびに1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロライド(EDC))が挙げられ得る。
いくつかの態様において、カスタマイズ可能なガスケットに基づくアプローチを使用して、チップの領域を被覆し得、例えば抗体、アプタマーまたは他の結合試薬を、チップ上の示される位置で機能化し得る。例えば、図15Aは、SBS 96プレート配置と適合する4プレックスガスケット385を示す。ガスケットは、SBS 96単一ウェル387の寸法の内部(inside the dimension)に4つの小さなウェル386を有する。溶液は、それぞれにウェルに、手動でピペッティングされ得るかまたは液体ハンドラーを用いてスポットされ得る。小さなウェルの数は、全96ウェルプレートにわたり異なり得る。この態様の改変において、図15Bを参照して、プレートの半分は、SBS 96単一ウェル内の16個の小さなウェル(16プレックス388)を有し、プレートのもう半分はSBS 96単一ウェルの内部に1つのみのウェルを有する。プレートの画分(例えばプレートの1/4または1/2)は1つのサイズのガスケットを含み得、他の画分(1つまたは複数)は、別のサイズのガスケットを含み得るかまたはガスケットを含み得ないことが本明細書において企図される。
いくつかの態様において、ガスケットは、粗い寸法のためにビニル切断を使用して作製される。ある態様において、前記粗い寸法は、約1mmかまたはそれを超える。いくつかの態様において、レーザー切断を使用して、約25μmかまたはそれを超える特徴サイズを達成し得る。いくつかの態様において、ソフトリトグラフィーパターン形成を使用して、約0.5μmかまたはそれを超える特徴サイズを達成し得る。いくつかの態様において、ソフトリトグラフィーパターン形成を使用して、約0.5μmかまたはそれを超える特徴サイズを達成し得る。
いくつかの態様において、試料をチップに負荷し、第2のガスケット層の下で異なるウェルの群を被覆する。かかる態様を図15Cに示し、ここで第1の層ガスケットは、単一のSBS 96ウェル内部に4つの小さなウェルを有する。小さなウェルのそれぞれの表面上で、別々に異なる結合試薬を機能化する。次いで、SBS 96ウェルの4つを被覆する(そのために16の小さなウェルを被覆する)第2のガスケット層は、チップの表面を覆うように作製される。最終的に、試料は、(図15Cにおいて破線で示される)大きなウェル389に負荷される。第1の層と同様に、第2の層内のウェルは、同じ寸法である必要はない。この態様の例を図15Dに示し、ここで第2のガスケット層の左半分上のウェルは、SBS 96単一ウェルの4つを被覆する寸法を有し、右半分上のウェルは、1つのSBS 96単一ウェルのみを被覆する。
II. カートリッジ
本明細書に記載されるセンサーは、一旦製作されると、検出システムにおける使用のためのカートリッジに含まれ得るかまたはそうでなければカートリッジに集合され得る。カートリッジは、目的の試料中の分析物の存在を検出するためまたはその量を定量化するために使用され得る。カートリッジは、前述のセンサーの任意の1つ以上を含む少なくとも1つのウェルを画定するハウジングを含む。ハウジングは複数のウェルを画定し得、それぞれのウェルは、前述のセンサーの任意の1つ以上を含む。ウェルは、基板により画定(例えば一体化)され得るか、または基板上に配置されるガスケット中に形成されるホールにより画定され得る。
図16A、16B、17Aおよび17Bを参照すると、本明細書に記載されるセンサーは、カートリッジアセンブリ(消耗品アセンブリ)400に一体化され得る。カートリッジアセンブリは、ハウジングまたはベース410、ナノ構造のシリーズが配置されるウェーハー基板420およびガスケット430を含み得る。ガスケット430は、ウェーハー基板420上に配置される場合、ウェルを画定し得、ここでそれぞれのウェルのベースは、1つ以上のセンサーを含み得る。ウェーハー基板は、ハウジングまたはベース410に相互に適合し(interfit)、これは基板を保持し、検出システムに容易に挿入可能であるように構成される。ハウジングまたはベースは、種々の異なる材料、例えばアルミニウムなどの金属、およびプラスチックまたはゴムで作製され得る。ハウジングまたはベースは、それの、センサーシステムへの配置を容易にするためおよび/または方向づけを確認するために角度がつけられた角などの特徴を有し得る。
ガスケット430は、例えばウェーハー基板上またはその中に配置されるセンサーを含むウェーハー基板を有するウェルを作製するような寸法の開口440を有するウェーハー基板上に配置されるようなサイズおよび形状のシリコーンまたはプラスチックで製作され得る。ウェルを画定する開口440は、分析される試料の少なくとも一部、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、20または50μLを含むような寸法であり得る。典型的に、ウェルは、ガスケット430により画定される壁およびウェーハー基板420により画定される底部部分を含み、センサーは、ウェル中の基板上に配置される。ウェルの直径は、600μm～90mm(例えば1mm～80mm)の範囲であり得、1mmの厚さを有し得る。いくつかの態様において、ウェルは、製作プロセスの間に、基板と一体化して形成され得る。
図18は、シングルプレックス消耗品カートリッジ400および1,000プレックス消耗品カートリッジ400'の斜視図を示す。これらの態様において、シングルプレックスカートリッジのためのセンサーは、単一の分析物を検出および/または定量化するように構成され、1,000プレックスカートリッジは、1,000までの異なる分析物を同時に検出および/または定量化するように構成される。また、ガスケット430中のウェル440の寸法および配置は、単一のウェルに含まれるセンサーの数を収容できるように調整される。本明細書に記載される技術は大規模化可能であり、カートリッジは、広範囲の形状およびサイズで作製され得ることが理解される。ある態様において、カートリッジは、マイクロプレート、例えば標準96ウェルマイクロプレートについてのSociety for Biomolecular Screening (SBS)の寸法標準を満たすように構成される。したがって、ウェーハー基板とベースの両方は、長方形の形状であり得、ベースは、128mmの長さおよび86mmの幅を有し、種々の液体処理システムとの交流(interface)および種々の液体処理プラットフォーム上の移動性の容易さを容易にする。
III. システム考察
目的の試料中の分析物の存在を検出するためまたはその量を定量化するためのシステムも本明細書に記載される。システムは、(a)前述のセンサーのいずれか1つ以上、前述のカートリッジのいずれか1つ以上を受けるための受容チャンバ；(b)ナノ構造の少なくとも第1のシリーズおよび/または任意の第2のシリーズおよび/または任意の第3のシリーズを照射するための光源；ならびに(c)ナノ構造の少なくとも第1のシリーズおよび/または任意の第2のシリーズおよび/または任意の第3のシリーズにおける光学的特性の変化を検出するための検出器；ならびに任意に(d)第1の濃度範囲と選択的に任意の第2の濃度範囲の間の中間面(interface)および選択的に任意の第2の濃度範囲と任意の第3の濃度範囲の間の中間面を同定するコンピューターアルゴリズムを実行するコンピュータープロセッサを含む。
図19および20を参照すると、例示的なセンサーシステム500は、目的の試料中の分析物の検出またはその量の定量化を容易にするように構成される。センサーシステム500は、タッチスクリーンインターフェース520および例えばデータポート530を有するシステムハウジング510を含み得る。ハウジング中のロード/アンロードドア540は、カートリッジ400を、光学的検出システム570に対してカートリッジを保持および配置するための例えばX-Yステージ560を含むセンサーシステムの受容チャンバ550に導入することを可能にするサイズであり得そのように構成され得る。光源580は、カメラ/検出器590を通じて光を伝達するように構成される。カメラは、使用の間にカートリッジ上に配置されるように、ならびにカートリッジ中に配置される基板420上のナノ構造の少なくとも第1、第2および/または第3のシリーズにおける光学的特性の変化を検出するように構成される。光源580は、ナノ構造、例えばカートリッジのウェーハー基板上に配置されるナノ構造を照射するように構成される。システムは、第1の濃度範囲および/または第2の濃度範囲および/または第3の濃度範囲の間の中間面を同定するため、ならびに試料中の分析物を定量化するためのアルゴリズムを実行するためのコンピュータープロセッサを含むコンピューター600を含み得る。センサーシステムはまた該システムを制御するための制御プラットフォーム610を含み得る。したがって、該システムは、3つの主要なサブアセンブリ：制御システム、画像化システムおよびカートリッジ処理システムを含む。これらのサブアセンブリは、サプライチェーンの複雑さを最小化するためおよび集合時間を低減するために市販の構成要素を使用し得る。
画像化システムは、光源580が、光を、照射アセンブリ620および対物レンズ630を通して方向づけ、センサーの基板上に配置される複数のナノ構造上に衝突させるように構成される光学的検出システム570を含む。センサーと相互作用した後、反射した光は、対物レンズ630を通過して、検出器590に捕捉される。対物レンズ630の上に絞り640が配置される。絞りは、照射が基板にどのように到達するかおよび画像が検出器にどのように伝達されるかを含む照射を制御する暗視野光絞りである。顕微鏡システムの機械管の長さはL1で示され、10mm～300mmの範囲であり得る。対物レンズの作動距離は、L2で示され、約2mm～約5mmの範囲であり得る。ある態様において、L1はL2より大きい。
図21に示されるように、測定は、光学的測定であり得る。例えば光源580は、ナノ構造20およびその上に配置される分析物650を有する基板320を照射するために使用され得、1つ以上の検出器590は、基板に衝突する光を検出するように配置される。基板から偏向される光は、光源の同じ方向に、光源に対して反対の方向で、直交する方向でまたはある角度であり得る。光学的検出システムの使用により得られる画像に存在するデータは、試料中に存在する分析物の濃度を提供するように処理され得る。
図22は、センサーおよび関連のあるシステムの種々の態様に関連するインフォマティクスについての一アプローチを示す。概して、所定の領域中のナノ構造の全ては、実質的に同じ構成のものであり、実質的に同様の量または数の分析物結合部位を統計学的に有する。したがって、試料中の分析物の所定の濃度について、該領域中のそれぞれのナノ構造は同じ数の分子に結合することが予想され得る。センサーが広いダイナミックレンジを有するようにするために、種々の構成のナノ構造を有する複数のデジタルおよびアナログ領域が提供され得る。
センサーのデジタル領域において試料中の分析物の濃度は最低の検出可能な濃度～最高の検出可能な濃度の範囲にあるので、該システムは、(例えば1つの状態から別のものに裏返すことにより)閾値より高い分析物の結合に対応する単離された色変化を明示するナノ構造の量または数を検出するように構成される。検出可能な色変化を示すかまたは裏返った別個のナノ構造のパーセンテージが高いほど、結合した分析物の数は多くなり、したがって試料中の分析物の濃度は高くなる。図22に示されるように、この裏返る挙動は、データクラスタリングを示す散布図、データ分布を示すヒストグラム等を含む種々の形式で視覚的に表示され得る。試料への暴露前および暴露後のセンサーの特定の領域を示すそれぞれの領域の比較上の画像も提供され得る。より高い明確性を伴って裏返りの決定の結果を示す第3の注釈がつけられた画像が提供され得る。有利なことに、裏返ったナノ構造および正当な(valid)ナノ構造の絶対数、および正当なナノ構造に対する裏返ったナノ構造の関連のある割合の値を示す、数的データも示される。特に、「裏返ったニードル」は、閾値を超えて陽性として計数されるセンサーの数を示す。「合計の正当なニードル」は、全集団の一部として計数されるセンサーの数を示す。予想されるパラメータの外側でふるまうセンサーは廃棄され、その後の分析には含まれない。残ったセンサーのみが「正当」とみなされる。裏返った割合は、裏返ったニードルを合計の正当なニードルで割った計算値である。拒絶割合、すなわちプレ画像から廃棄されるニードルのパーセンテージも示され得る。これは、センサーの質/健常さ(health)の基準として使用される。約10%以上の拒絶割合値を有するセンサーは、質が不十分とみなされ、一般的に信頼できるデータを提供しない。
しかしながらいくつかのより高い閾値濃度で、デジタル領域ナノ構造の全ては分析物に結合している。センサーのデジタル領域は有効に飽和されている。全てのナノ構造は裏返っており、局所的な色変化は容易には明らかにならない。この点で、注意はより多くの結合部位を有するより大きなナノ構造を一般的に有するアナログ領域にシフトする。
所定のナノ構造の色変化の程度は、ナノ構造の総質量に対する結合した分子の総質量の割合に関連し得る。100未満の分子のみに結合でき得るより小さなアナログ領域ナノ構造(例えばナノニードル)は、最初に寒色の色相(例えば青色/緑色の範囲内)を明示し得る。数百の分子に結合でき得るより大きなアナログ領域ナノ構造(例えばナノニードル)は、最初により暖色の色相(例えば黄色/橙色の範囲内)を明示し得る。アナログ領域中のより高い検出可能な濃度では、より多くの分析物が所定のナノ構造に結合するので、検出可能な色相はより暖かくシフトする。したがって、暴露されない青色のナノ構造は、試料中の特定の分析物濃度に結合した後に、より緑がかった色相を示す。試料中のより高い分析物濃度では、色相はより黄色がかった色へとシフトし得る。同様に、より高い濃度を検出するように構成されたより大きなナノ構造およびより多くの結合部位を有するアナログ領域において、初期の暴露されない黄色のナノ構造は、試料中の特定の分析物濃度に結合した後に、より橙色の色相を示す。試料中のより高い分析物濃度では、色相はより赤味がかった色へとシフトし得る。
色シフトは、ただ、単一のアナログナノ構造により検出可能であるが、同様のサイズのナノ構造のシリーズまたはアレイの領域が有利に使用される。同様のサイズのナノ構造の大きな分布を提供することにより、アナログ領域色シフトおよびしたがって検出された分析物濃度をより信頼性高く検出するための平均読出しが提供され得る。
より具体的に、図23は、システムレベルで、センサーの一態様の種々のデジタルおよびアナログ領域の検出された出力を集めて、センサーの全ダイナミックレンジにわたり分析物濃度を信頼性高く検出するための一アプローチのフローチャートを示す。ハイブリッドインフォマティックエンジンアルゴリズムのこの形態の使用により、デジタル領域からの不正確なより高い濃度データおよびアナログ領域からの不正確なより低い濃度データを信頼性高く拒絶するための別個のデジタルおよびアナログ領域の使用が可能になる。
図23の工程1において、クリーンセンサーの種々のデジタルおよびアナログ領域は、センサーの全体的な画像の一部として光学的に画像化され、特定のセンサーについてのそれぞれの領域およびその関連のあるナノ構造の画像状態の信頼性のあるベースライン記録(例えば存在または非存在、初期色相等)を提供する。工程2において、センサーを試料に暴露して、試料中の任意の分析物は、ナノ構造上の関連のある部位に結合し、続いてセンサーはその後の画像化のために従来のように調製される。工程3において、システムは、センサーの暴露後の画像を捕捉し、これは、工程1の画像と比較して、デジタル領域における裏返りおよびアナログ領域における任意の色相変化を検出するために使用される。工程4において、アルゴリズムは、センサーの異なる検出領域(すなわち1つ以上のデジタル領域および1つ以上のアナログ領域)およびセンサーの基準マーカーに対するそれらの配置を同定する。これは、システムが、前および後の画像を関連付けて整列させ、それぞれの画像中の対応するナノ構造を同定することを可能にする。工程5および6は、それぞれの対応する領域におけるナノ構造ごとの基準に対する前および後の画像データの個々の別々の分析を伴う。デジタル領域について、工程7Aは、閾値を超える局所的な画像中の十分に大きいシフトを確認して、分析物に結合したそれぞれのナノ構造を同定することにより、分析物と結合したナノ構造を定量化およびその数を計数する。アナログ領域について、工程7Bは、局所的におよびアナログ領域にわたり色相変化を検出し、ナノ構造が局所的および集合的に分析物に結合したと思われる前の画像の色を超える局所的な画像中の十分に大きいシフトを明示する。工程8において、アナログ領域中の色変化が所定の閾値を超えると仮定すると、アナログ領域は、その検出可能な範囲内の分析物の濃度を検出したと思われる。色変化に対応する実際の分析物の濃度は、既知の濃度の対照試料により作成されたシステムメモリ中に記憶される標準曲線に対する検出された色変化の比較により決定される。しかしながら、アナログ領域中の色変化が所定の閾値を超えない場合、分析物の濃度は、アナログ領域により信頼性高く検出可能であるもの未満であると思われる。より低い濃度で構成されたアナログ領域が利用可能である場合、同様の分析が実施され得る。そうでなければ、システムはセンサーのデジタル領域中の裏返ったナノ構造のデジタル計数に頼る。裏返ったナノ構造の量または数に対応する分析物の実際の濃度は、既知の濃度の対照試料により作成されたシステムメモリ中に記憶される標準曲線に対する裏返ったデジタルナノ構造の数の比較により決定される。
別の態様において、デジタル定量化測定とアナログの間の移行を決定するための例示的なアルゴリズムは、(a)試験される溶液の適用の際に第1のシリーズ中のナノ構造に対して1つの状態から別のものに変化した(裏返った)ナノ構造を測定する工程；(b)試験される溶液の適用の際に第2のシリーズ中のナノ構造の色空間変化を測定する工程；および(c)第2のシリーズの色空間変化が前もって選択された閾値よりも大きい場合に、工程(b)において同定されたアナログ測定値を使用し、第2のシリーズの色空間変化が前もって選択された閾値よりも小さい場合に、工程(a)で同定されたデジタル測定を使用する工程を含む。
ナノ構造(例えばナノニードル)および結合剤および他の試薬の選択に基づいて、複数の分析物を同時に検出および/または定量化することが可能であることが企図される。例えば図24Aに示されるように、センサーは、その上に配置された、2つの別々の異なる分析物に結合し得るナノ構造700の第1のシリーズおよびナノ構造710の第2のシリーズを有する基板420を含み得る。基板は、検出される分析物の数に応じて、ナノ構造のいくつかのシリーズを含み得ることが企図される。同様に、図24Bに示されるように、センサーは、その上に配置された、2つの別々の異なる分析物に結合する2つの異なるナノ構造700、710のシリーズを有する基板を含み得る。ナノ構造のシリーズはさらなる分析物に結合するナノ構造を含み得ることが企図される。
IV. アッセイ
目的の試料中の分析物、例えばタンパク質の存在を検出するまたはその量を定量化する方法も本明細書に記載される。該方法は、(a)試料の少なくとも一部を、前述のセンサーのいずれか1つ以上に適用する工程；および(b)ナノ構造の第1のシリーズおよび/または任意の第2のシリーズおよび/または任意の第3のシリーズの光学的特性の変化を検出して、それにより試料中の分析物の存在を検出またはその量を定量化する工程を含む。
該センサーは、種々の試料、例えば体液、組織抽出物および/または細胞上清である分析物を検出し得る。例示的な体液としては、例えば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液または間質液が挙げられる。
該方法は、少なくとも一部の試料と、本明細書に記載される構造、センサー、カートリッジまたはシステムを合わせる工程、ならびに該構造、センサー、カートリッジまたはシステムへの分析物の結合の存在を検出および/またはその量を定量化する工程を含む。例えば、分析物の、本明細書に記載されるナノ構造またはナノ構造のシリーズへの結合後、分析物の結合は、ナノ構造またはナノ構造のシリーズの光学的に検出可能な特性の変化により検出され得る。ある態様において、光学的に検出可能な特性は、色、光散乱、屈折または共鳴(例えば表面プラスモン共鳴、電気的共鳴、電磁的共鳴および磁気的共鳴)である。ある態様において、電磁放射線がナノ構造またはナノ構造のシリーズに適用され得、適用される電磁放射線は、ナノ構造またはナノ構造のシリーズが、分析物を含むことが疑われる試料と相互作用する場合に変化し得る。例えば、分析物の存在は、強度、色または蛍光の変化を生じ得る。
別の態様において、該方法は、試料の一部を、第1の領域および第2の領域を含むセンサーに適用することを含む。第1の領域は、分析物に結合し得、第1の濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得るナノ構造の第1のシリーズを含む。第2の領域は、分析物に結合し得、第2の異なる濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得る異なるナノ構造の第2のシリーズを含む。該領域は、例えば電磁放射線を使用して質問され、ナノ構造の第1および第2のシリーズから検出可能なシグナルを検出し、該シグナルは、試料中の分析物の存在および/または量を示す。次いで、分析物の存在および/または量は、検出可能なシグナルから決定され得、それにより第1の濃度範囲と第2の濃度範囲の両方にわたり、試料中の分析物の存在を検出またはその量を定量化し得る。
別の態様において、方法は、試料の一部を、第1の領域および第2の領域を含むセンサーに適用することを含む。第1の領域は、分析物に結合し得、第1の濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得るナノ構造の第1のシリーズを含み、ここで分析物に結合する第1のシリーズの個々のナノ構造は、分析物に結合する際に光学的に検出され、その際に、試料中の分析物の濃度は、第1の濃度範囲内にある場合に、分析物の分子に結合した第1のシリーズ中の個々のナノ構造の数から決定される。第2の領域は、分析物に結合し得、第2の異なる濃度範囲内の試料中の分析物の濃度を示す検出可能なシグナルを生じ得る異なるナノ構造の第2のシリーズを含み、ここで試料中の分析物の濃度は、第2の濃度範囲内にある場合に、分析物の濃度の関数として、第2の領域中のナノ構造の光学的に検出可能な特性における実質的に均一な変化のアナログ検出により決定される。該領域は、例えば電磁放射線を使用することにより質問され、ナノ構造の第1および第2のシリーズから検出可能なシグナルを検出し、該シグナルは、試料中の分析物の存在および/または量を示す。次いで、分析物の存在および/または量は、検出可能なシグナルから決定されて、それにより第1の濃度範囲と第2の濃度範囲の両方にわたり、試料中の分析物の存在を検出またはその量を定量化し得る。
例示的なアッセイにおいて、ナノ構造またはナノ構造のシリーズは、目的の分析物に結合する結合剤(例えば抗体)により機能化される。機能化後、標的分析物を含む試料(例えば流体試料)は、試料中に分析物が存在する場合に結合剤が、結合剤-分析物複合体を形成することを許容する条件下で、ナノ構造またはナノ構造のシリーズに添加される。抗体への分析物の結合により、ナノ構造またはナノ構造のシリーズの光学的に検出可能な特性の変化が生じる。特定のアッセイ、例えば非標識アッセイについて、結合剤-分析物複合体の形成は単独で、ナノ構造またはナノ構造のシリーズの光学的に検出可能な特性の変化を生じることが企図される。他のアッセイ、例えば標識系アッセイについて、分析物と複合体を形成する第2の結合剤も、該複合体において直接または間接的に、ナノ構造またはナノ構造のシリーズの光学的に検出可能な特性の変化を生じるかまたは変化を増加させる標識を含み得る。ナノ構造は、粒子もしくはビーズをナノ構造に結合させるかまたはそうでなければ会合させることなく、分析物の存在および/または量を検出し得ることが企図される。
例示的なサンドイッチイムノアッセイにおいて、ナノ構造またはナノ構造のシリーズは、目的の分析物に結合する第1の結合剤(例えば第1の抗体)で機能化される。機能化後、標的分析物の存在および/または量について分析される試料(例えば流体試料)は、試料中に分析物が存在する場合に第1の結合剤が第1の結合剤-分析物複合体を形成することを許容する条件下で、ナノ構造またはナノ構造のシリーズに添加される。次いで、目的の分析物に結合する第2の結合剤(例えば第2の抗体)は、第2の結合剤が第2の結合剤-分析物複合体を形成することを許容する条件下で、ナノ構造またはナノ構造のシリーズに添加される。分析物の第1および第2の結合剤への結合により、「サンドイッチ」配置の複合体が生じる。サンドイッチ複合体の形成は、ナノ構造またはナノ構造のシリーズの光学的に検出可能な特性の変化を生じ得る。しかしながら、特定のアッセイ、例えば非標識アッセイについて、サンドイッチ複合体の形成は単独で、ナノ構造またはナノ構造のシリーズの光学的に検出可能な特性の変化を生じることが企図される。他のアッセイ、例えば標識系アッセイについて、サンドイッチ複合体中の第2の結合剤は、直接または間接的のいずれかでナノ構造またはナノ構造のシリーズの光学的に検出可能な特性の変化を生じるかまたは増加させる標識を含み得る。
図25は、分析物650が、ナノ構造20上に固定された結合剤750と相互作用する例示的なアッセイを示す。ナノ構造の捕捉容量は、ナノ構造と利用可能な捕捉剤の間の寸法の関係の両方により決定される。図26は、ナノ構造20と結合した分析物650の間に1:1の比(左のパネル)、ナノ構造と結合した分析物の間に1:2の比(真ん中のパネル)およびナノ構造と結合した分析物の間に1:5の比(右のパネル)がある例示的なアッセイを示す。図27は、ナノ構造20が分析物650に数で勝る例示的なアッセイを示し、この場合、それぞれのナノ構造は、多くとも1つの分析物を捕捉する可能性がある。ナノ構造20は、上述のように、ナノ製作技術により基板上に直接製作され得る。図28は、ケイ素基板320上に配置されるナノ製作されたナノ構造20を示し、分析物650はナノ構造の一部に結合される。分析物とナノ構造の間の結合は固体中間面上で起こる。ナノ構造を測定して、その表面上の結合した分析物の数を決定し得る。図25～28は、単一の結合剤(例えば抗体またはアプタマー)を使用して標的分析物を結合する非標識イムノアッセイの例を示す。この方法を使用して、結合親和性、結合動力学(オン速度およびオフ速度(on and off rate))等を測定またはそうでなければ定量化し得る。
図29は、例示的な非標識イムノアッセイを示し、ここで複数の第1の抗体(Ab1)はナノ構造20の流体暴露された表面に固定される。その後、検出および/または定量化される分析物(0)を含む試料を、単独で、または好ましくは第2の異なるエピトープを介して分析物に結合する第2の抗体(Ab1)と組み合わせてのいずれかで、ナノ構造と接触させる。第2の抗体(Ab2)は、分析物の後に添加され得る。2つの抗体(Ab1およびAb2)および存在する場合には分析物(0)は、ナノ構造20の表面上に固定される複合体を形成する。複合体のナノ構造への結合は、検出システムにより検出され得るナノ構造の特性の変化を引き起こし得る。図30は、この態様において第2の抗体が標識されること以外は、本質的に、図29に関して上述されるように実施される例示的な標識系イムノアッセイを示す。複合体のナノ構造20への結合は、直接(例えば金標識を介して)または間接的に(例えばさらなる生成物を生じる酵素を介して)のいずれかで、検出システムにより検出され得るナノ構造の特性の変化を生じるように、標識760を介して検出され得る。
代替的なアッセイにおいて、標的分析物の存在および/または量について分析される試料(例えば流体試料)を、(i)試料中に分析物が存在する場合に第1の結合剤が第1の結合剤-分析物複合体を形成することを許容する条件下で第1の結合剤(例えば抗体)、および(ii)第2の結合剤が第2の結合剤-分析物複合体を形成することを許容する条件下で、目的の分析物に結合する第2の結合剤(例えば第2の抗体)とインキュベートする。分析物の第1および第2の結合剤への結合により、溶液中で自由に生じる「サンドイッチ」配置の複合体が生じる。次いで、該アッセイに応じて、複合体化するかまたは複合体化しないかいずれかの第1の結合剤、第2の結合剤および/または分析物は、複合体またはその構成要素がナノ構造またはナノ構造のシリーズにより結合されて、ナノ構造またはナノ構造のシリーズの特性(例えば光学的に検出可能な特性)の変化を生じるような条件下で、ナノ構造またはナノ構造のシリーズに添加される。ある態様において、抗体の1つまたは両方は、ビオチンにより標識され、サンドイッチ複合体は、例えばアビジンまたはビオチンで機能化された任意のナノ構造またはナノ構造のシリーズの表面上に固定され得る。
典型的に、結合剤が抗体である場合、次いでそれぞれのアッセイ工程の間で、分析物に結合したナノ構造を、穏やかな界面活性剤溶液で洗浄し得る。典型的なプロトコルはまた、タンパク質試薬のナノ構造への望ましくない非特異的な結合を阻害または低減するようなウシ血清アルブミンまたはカゼインなどの非特異的に結合するタンパク質の使用を含む、1つ以上のブロッキング工程を含む。
標識系アッセイにおける使用のための例示的な標識としては、放射性標識、蛍光標識、視覚的標識、酵素標識または診断もしくは予後アッセイにおいて有用な他の従来の検出可能な標識、例えばラテックスもしくは金粒子などまたはラテックスもしくは金ゾル粒子などの粒子が挙げられる。例示的な酵素標識としては、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、β-ガラクトシダーゼ(β-Gal)およびグルコースオキシダーゼ(GO)が挙げられる。標識が酵素である場合、アッセイは、ナノ構造またはナノ構造のシリーズの光学的に検出可能な特性の変化を生じるシグナルを生じる適切な酵素基質の添加を含む。該基質は、例えば色原体基質または蛍光発生性基質であり得る。HRPについての例示的な基質としては、OPD(HRPとの反応後に琥珀色に変わるo-フェニレンジアミンジヒドロクロライド)、TMB(HRPとの反応後に青色に変わる3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)、ABTS(HRPとの反応後に緑色に変わる2,2'-アジノ-ビス[3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸]-ジアンモニウム塩)、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS)；3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)；3,3'ジアミノベンジジン(DAB)；StayYellow (AbCam TM製品)；および4-クロロ-1-ナフトール(4-CNまたはCN)が挙げられる。アルカリホスファターゼについての例示的な基質としては、PNPP(アルカリホスファターゼとの反応後に黄色に変わるp-ニトロフェニルホスフェート、二ナトリウム塩)、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート(BCIP)およびp-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド(NBT)；Stay Green (AbCam TM製品)；および4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウム(Fast Redとして公知)が挙げられる。β-Galについての例示的な基質としては、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-B-D-ガラクトピラノシド(X-Gal)が挙げられる。GOについての例示的な基質としては、2,2',5-5'-テトラ-p-ニトロフェニル-3,3'-(3,3'-ジメトキシ-4,4'-ビフェニレン)-ジテトラゾリウムクロライド(t-NBT)が挙げられる。好ましい酵素は、速く定常的代謝回転速度を有する。
望ましい場合、標識および結合剤は、リンカー、例えば切断可能リンカー、例えば光切断可能リンカー、酵素切断可能リンカーにより結合、例えば共有結合され得る。光切断可能リンカーは、電磁放射線(例えば可視光、UV光または赤外光)への暴露により切断され得るリンカーである。リンカーを光切断するために必要な光の波長は、使用される光切断可能リンカーの構造に依存する。例示的な光切断可能リンカーとしては、限定されないが、o-ニトロベンジル部分、p-ニトロベンジル部分、m-ニトロベンジル部分、ニトインドリン(nitoindoline)部分、ブロモヒドロキシクマリン部分、ブロモヒドロキシキノリン部分、ヒドロキシフェナシル部分、ジメトジベンゾイン(dimethozybenzoin)部分またはそれらの任意の組合せを含む化学分子が挙げられる。例示的な酵素切断可能リンカーとしては、限定されないが、DNA、RNA、ペプチドリンカー、β-グルクロニドリンカーまたはそれらの任意の組合せが挙げられる。
図31は、ビオチンで標識される第1の抗体(Ab1)およびHRPで標識される第2の抗体(Ab2)を含む例示的な分析物定量化アッセイを示す。いずれの抗体も、この段階ではナノ構造上に固定されない。それぞれの抗体は、例えば分析物上の別のエピトーブを介して標的分析物に結合する。第1の抗体、第2の抗体および分析物のインキュベーションは、サンドイッチ複合体(工程1参照)の形成を生じる。次いでサンドイッチ複合体は、Ab1にコンジュゲートしたビオチンに結合するアビジンまたはストレプトアビジンコーティング表面(例えばストレプトアビジンコーティングビーズ)により捕捉される(工程2参照)。この捕捉戦略は、そうでなければ固体表面上に予め固定された(例えばコーティングされた)抗体により分析物を直接捕捉することにより捕捉されるものよりも多くの分析物を捕捉することが企図される。洗浄工程後、所望の場合は、Ab2は、溶液条件を変えることにより(例えばpH、塩濃度または温度を変えることにより)ストレプトアビジン表面から溶出され(工程3参照)、次いで活性化された(が機能化はされない)ナノ構造または活性化されたナノ構造のシリーズに適用され(工程4参照)、その際に、溶出されたAb2分子は、活性化されたナノ構造により捕捉される。HRP基質(例えばTMB)は次いで、ナノ構造またはナノ構造のシリーズに適用され、これは次いでナノ構造またはナノ構造のシリーズ上で形成される生成物(例えば沈殿)に触媒的に変換され、検出可能なシグナルを生じ(工程5参照)、次いでシステムにより検出され得る(工程6参照)。
図32は、ビオチンで標識される第1の抗体(Ab1)およびHRPで標識される第2の抗体(Ab2)を含む別の例示的な分析物定量化アッセイを示す。Ab1は、光切断可能リンカーを介してビオチンに共有結合する。それぞれの抗体は、標的分析物に結合する。第1の抗体、第2の抗体および分析物のインキュベーションは、サンドイッチ複合体の形成を生じる(工程1参照)。次いでサンドイッチ複合体は、Ab1上のビオチンに結合するアビジンまたはストレプトアビジンコーティング表面(例えばストレプトアビジンコーティングビーズ)により捕捉される(工程2参照)。富化および洗浄後、所望の場合は、次いで光切断可能リンカーを切断し、ストレプトアビジン表面からサンドイッチ複合体を除去し(工程3参照)、複合体を活性化されたナノ構造または活性化されたナノ構造のシリーズに適用し(工程4参照)、その際に、Ab2またはAb2含有複合体は、活性化されたナノ構造(1つまたは複数)により捕捉される。次いでHRP基質(例えばTMB)をナノ構造またはナノ構造のシリーズに適用し、次いでナノ構造またはナノ構造のシリーズ上で形成される生成物(例えば沈殿)に触媒的に変換され、検出可能なシグナルを生じ(工程5参照)、次いでシステムにより検出され得る(工程6参照)。
図33は、ビオチンで標識される第1の抗体(Ab1)およびビオチンで標識される第2の抗体(Ab2)を含む別の例示的な分析物定量化アッセイを示す。それぞれの抗体は、標的分析物に結合する。第1の抗体、第2の抗体および分析物のインキュベーションは、サンドイッチ複合体の形成を生じる(工程1参照)。次いでサンドイッチ複合体は、Ab1またはAb2上のビオチンに結合するアビジンまたはストレプトアビジンコーティング表面(例えばストレプトアビジンコーティングビーズ)により捕捉される(工程2参照)。次いで光切断可能リンカーを介してストレプトアビジンに共有結合したHRPを添加し(工程3)、これはAb1またはAb2上の遊離ビオチンに結合する。富化および洗浄の後、適切な場合は、光切断可能リンカーは切断されてHRPを放出し、次いで活性化されたナノ構造または活性化されたナノ構造のシリーズに適用され、それにより捕捉される(工程4参照)。HRP基質の添加によりナノ構造またはナノ構造のシリーズの表面上で生成物(例えば沈殿)が生じ、検出可能なシグナルを生じ(工程5参照)、次いでシステムにより検出され得る(工程6参照)。
図34は、ビオチンで標識される(例えば共有結合される)第1の抗体およびオリゴヌクレオチドで標識される(例えば共有結合される)第2の抗体を含む別の例示的な分析物定量化アッセイを示す。オリゴヌクレオチドは、例えばフルオロフォアまたは酵素の1つの末端に配置される切断可能リンカーにより抗体に結合される)。切断可能リンカーは、オリゴヌクレオチドの1つの末端で挿入されるウラシルまたは複数のウラシルであり得る。オリゴヌクレオチドは、工程1における標的分析物についてのバーコードとして働き得る。これは、マルチプレックス反応を容易にするために異なる分析物に結合する抗体を用いて実施され得る。それぞれの抗体は、試料中に存在する場合は標的分析物に結合する。第1の抗体、第2の抗体および分析物のインキュベーションは、サンドイッチ複合体の形成を生じる(工程1参照)。並行して、ナノ構造またはナノ構造のシリーズは、検出されるそれぞれの分析物についてのバーコードとして働くオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドで機能化され得る(工程1'参照)。次いで、サンドイッチ複合体は、第1の抗体上のビオチンに結合するストレプトアビジンコーティング表面(例えばストレプトアビジンコーティングビーズ)により捕捉される(工程2参照)。富化および洗浄の後、適切な場合は、それぞれの複合体中のオリゴヌクレオチドは、切断可能リンカーの切断により放出され得(工程3参照)、これはナノ構造またはナノ構造のシリーズに結合された相補的なオリゴヌクレオチドに適用され、それにより捕捉され(工程4参照)、次いでシステムにより検出される(工程5)。分析物の同一性および/または濃度は、ナノ構造の表面上に配置された相補的なオリゴヌクレオチドにより捕捉されるバーコードオリゴヌクレオチドから決定され得る。
図35は、例示的なマルチプレックス検出アッセイについての試薬を示す。例えば、複数の個々のビーズは、対応する複数の標的分析物に結合する対応する複数の捕捉抗体Ab1、Ab2、Ab3等でコーティングされる(図35A)。対応する複数の検出抗体は、切断可能(例えば光切断可能)リンカーを介して、オリゴヌクレオチド(分析物についてのバーコード)で標識され(図35B参照)、次いで粒子と合わされる。図35Cは、2x5ナノ構造アレイを有するセンサー765を示し、ここで異なる領域は、対応するバーコードオリゴヌクレオチドに相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを含む。ビーズは、試料と合わされて混合される。サンドイッチ複合体を形成させる後、ビーズは洗浄され、オリゴヌクレオチドは、切断可能リンカーの切断により放出される。放出されたバーコードオリゴヌクレオチド(標識有りまたなしのいずれか)は、次いで捕捉オリゴヌクレオチドの領域を有するセンサーに適用され(図35D参照)、捕捉され、適切な場合は検出される。抗体コーティングビーズの数、オリゴヌクレオチド標識抗体の数およびオリゴヌクレオチドがプリントされた領域の数は、実施される所望のアッセイに応じて、大規模化され得る。
構成物(例えばセンサー、カートリッジまたはシステム)が、特定の構成要素を有する(having)、含む(including)もしくは含む(comprising)と記載される、またはプロセスおよび方法が、特定の工程を有する、含むもしくは含むと記載される記載を通じて、さらに、記載される構成要素から本質的になるかまたはそれからなる本発明の構成物があること、ならびに記載される処理工程から本質的になるかまたはそれからなる本発明のプロセスおよび方法があることが企図される。
本願において、要素または構成要素が記載される要素もしくは構成要素のリストに含まれるおよび/またはそれから選択されるといわれる場合、要素もしくは構成要素は、記載される要素もしくは構成要素のいずれか1つであり得るか、または要素もしくは構成要素は、記載される要素もしくは構成要素の2つ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。
さらに、本明細書に記載される構成物(例えばセンサー、カートリッジまたはシステム)または方法の要素および/または特徴は、本明細書において明示的であるか黙示的であるかのいずれにせよ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の方法で組み合され得ることが理解されるべきである。例えば、特定の特徴について参照がなされる場合、特徴は、文脈からそうではないと理解されない限り、本発明の構成物および/または本発明の方法の種々の態様において使用され得る。すなわち、本願において、態様は、明確および簡潔な適用を記載および図示し得る方法で記載されて示されているが、態様は、本教示および発明(1つまたは複数)から逸脱することなく種々に組み合され得るかまたは分離され得ることが意図され、理解される。例えば、本明細書に記載および示される全ての特徴は、本明細書に記載および示される発明(1つまたは複数)の全ての局面に適用可能であり得ることが理解される。
表現「少なくとも1つの」は、文脈および用途からそうではないと理解されない限り、該表現の後に記載されるもののそれぞれを個々におよび記載されるものの2つ以上の種々の組合せを含むことが理解されるべきである。3つ以上の記載されるものに関して、表現「および/または」は、文脈からそうではないと理解されない限り、同じ意味を有すると理解されるべきである。
用語「含む(include)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(have)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」または「含む(containing)」の使用は、その文法的な同等物を含めて、文脈にそうではないと具体的に記されないかまたは文脈からそうではないと具体的に理解されない限り、例えば記載されていないさらなる要素または工程を排除することなく、一般的に、開放型および非限定として理解されるべきである。
用語「約」の使用が量的値の前にある場合、本発明は、そうではないと具体的に記載されない限り、具体的な量的値自体も含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、そうではないと示されないかまたは推測されない限り、名目上の値から±10%の変動をいう。
工程の順序または特定の行為を実行するための順序は、本発明が実施可能なままである限りは重要ではないことが理解されるべきである。さらに、2つ以上の工程または行為は同時に実施されてもよい。
本明細書における任意および全ての例または例示的な用語、例えば「など(such as)」または「含む(including)」の使用は、単に本発明をよりよく説明するために意図され、特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を与えない。本明細書における用語は、本発明の実施に必須のものとして、任意の特許請求されない要素を示すように解釈されるべきではない。
実施例
以下の実施例は単なる説明であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することは意図しない。
実施例1-連続ヒトタンパク質コーディングゲノムの構築およびセンサーについての100プレックスタンパク質パネルの偏りがない選択
この実施例には、ヒトタンパク質コーディングゲノムにわたる偏りがない100タンパク質パネルの作製が記載される。
ヒトタンパク質コーディングゲノムの確立のために、Piovesan's Gene Table (参照により本明細書に援用されるBMC Res Notes (2019) 12:315, Piovesan et. al.)に基づいて、遺伝子ID、遺伝子記号、染色体受託番号、全てのタンパク質コーディング遺伝子の開始および終了位置を記録し、染色体1から染色体XおよびYまでのヒトゲノム内のそれらの位置の順序において示した。次いで、全てのタンパク質コーディング遺伝子を、エクソームの連続番号付けのためにスプライシングして一緒になり、これは1,255,970,826bpの総長さを生じた。得られたタンパク質コーディングゲノムの試料を表4に示す。
Figure 2023541546000005
Figure 2023541546000006
Figure 2023541546000007
偏りがない様式の100プレックスタンパク質パネルを構築するために、100個の位置マーカーを、12,559,708bpで開始するスプライシングされた遺伝子に沿って配置し、それぞれのマーカーは12,559,708*iで配置され、ここでiはマーカーの配列(sequence)である。マーカーの間隔は12,559,708bpであった。i番目のマーカーについて、一塩基多型データベース(dbSNP)を使用して、位置マーカーIに最も近いSNPを配置した。次いで、同定されたSNPを含む遺伝子を配置して、i番目のタンパク質としてパネルに含めた。100個のタンパク質のパネルを表5に列挙する。
Figure 2023541546000008
Figure 2023541546000009
Figure 2023541546000010
Figure 2023541546000011
Figure 2023541546000012
Figure 2023541546000013
実施例2-センサーについての100プレックスタンパク質パネルを使用した患者試料のタンパク質分析
この実施例には、ヒトタンパク質コーディングゲノムの偏りがない100タンパク質パネルの患者試料の試験が記載される。
例示的な100プレックスタンパク質パネル(例えば表5)を示し、それぞれのタンパク質に特異的な抗体を選択する。センサープレート配置を図1Eに示す。ウェルをSBS-96形式で配置して、それぞれのウェルは、10×10グリッドを含む。それぞれのグリッドはナノ構造アレイを有する。全てのウェルは、グルタルアルデヒドおよび(3-アミノプロピル)-トリメトキシシラン(APTMS)で活性化される。次いで、100プレックスパネル内のそれぞれのタンパク質に特異的な抗体を、プリント技術を使用して、それぞれのグリッド中のそれぞれのセンサーアレイ上で機能化する。それぞれの96プレートは96ウェルを含み、これは二連で48個の試料を走らせ得る。試験群、例えば表現型に対するタンパク質関連について質問される被験体の群(例えば疾患群)および対照群由来の血漿または血清試料をウェルに添加する。センサーアレイのそれぞれ由来のデジタルおよびアナログのシグナルを分析して、タンパク質濃度の大きなダイナミックレンジをカバーする。対照および試験群由来のタンパク質濃度を比較する。そのため、バイオマーカーの組を同定し、対照群から試験群を最良に区別する。
実施例3-イントロンを排除する連続ヒトエクソームの構築およびセンサーについての100プレックスタンパク質パネルの偏りがない選択
この実施例には、ヒトエクソーム(イントロン配列を排除する)にわたる偏りがない100タンパク質パネルの作製が記載される。
エクソーム(すなわちタンパク質コーディング遺伝子からイントロンを排除する)からタンパク質パネルを構築した。Piovesan's Gene Table (上述)からタンパク質の1つのアイソフォームを選択し、3'UTR3、CDSおよび5'UTRの開始および終了位置に注釈をつけ、エクソンに印をつけた。次いで、全てのエクソンをスプライシングして一緒になり、これは62,184,186bpの総エクソーム長さを生じた。得られたエクソームの試料を表6に示す。
Figure 2023541546000014
Figure 2023541546000015
Figure 2023541546000016
Figure 2023541546000017
Figure 2023541546000018
100位置マーカーをスプライシングされた遺伝子に沿って配置し、621,842bpで開始させることにより、上述のエクソームから100プレックスタンパク質パネルを偏りがない様式で作製し、それぞれのマーカーは621,842*Iで配置され、ここでIはマーカーの配列である。マーカーの間隔は621,842bpであった。i番目のマーカーについて、一塩基多型データベース(dbSNP)を使用して、位置マーカーiに最も近いSNPを配置した。次いで、同定されたSNPを含む遺伝子を配置して、i番目のタンパク質としてパネルに含めた。上述のプロトコルから作製された得られたタンパク質リストを表7に示す。
Figure 2023541546000019
Figure 2023541546000020
Figure 2023541546000021
実施例4-センサーについて100プレックスタンパク質パネルを使用した患者試料のタンパク質分析
この実施例には、ヒトエクソームの偏りがない100タンパク質パネルの患者試料の試験が記載される。
例示的な100プレックスタンパク質パネル(たとえは表7)を設計し、それぞれのタンパク質に特異的な抗体を選択する。センサープレート配置を図1Eに示す。ウェルをSBS-96形式で配置し、それぞれのウェルは10×10のグリッドを含む。それぞれのグリッドはナノ構造アレイを有する。全てのウェルは、グルタルアルデヒドおよび(3-アミノプロピル)-トリメトキシシラン(APTMS)で活性化される。次いで、100プレックスパネル内のタンパク質のそれぞれに特異的な抗体を、プリント技術を使用して、それぞれのグリッド内のそれぞれのセンサーアレイ上で機能化する。それぞれの96プレートは96ウェルを含み、これは二連で48個の試料を走らせ得る。試験群、例えば表現型に対するタンパク質関連について質問される被験体の群(例えば疾患群)および対照群由来の血漿または血清試料をウェルに添加する。センサーアレイのそれぞれ由来のデジタルおよびアナログのシグナルを分析して、タンパク質濃度の大きなダイナミックレンジをカバーする。対照および試験群由来のタンパク質濃度を比較する。したがってバイオマーカーの組を同定し、対照群から試験群を最良に区別する。
実施例5-センサーについて100プレックスタンパク質パネルを使用した患者試料のタンパク質分析
この実施例には、サンドイッチイムノアッセイを使用した偏りがない100タンパク質パネルの患者試料の試験が記載される。
例示的な100プレックスタンパク質パネル(例えば表5または表7)を設計し、それぞれのタンパク質に特異的な第1の抗体を選択する。センサープレート配置を図1Eに示す。
試験群、例えば表現型に対するタンパク質関連について質問される被験体の群(例えば疾患群)および対照群由来の血漿または血清試料をウェルに添加して、標的分析物の存在および/またはその量について分析する。分析物が試料中に存在する場合に第1の抗体が第1の抗体-分析物複合体を形成する条件下で、試料をウェルに添加する。次いで、目的の分析物に結合する抗体の第2の群(二次抗体)を、第2の抗体が第2の抗体-分析物複合体を形成する条件下で、添加する。第1および第2の抗体に対する分析物の結合は、「サンドイッチ」配置の複合体を生じる(図14E)。センサーアレイのそれぞれ由来のデジタルおよびアナログのシグナルを分析して、タンパク質濃度の大きなダイナミックレンジをカバーする。対照および試験群由来のタンパク質濃度を比較する。したがってバイオマーカーの組を同定し、対照群から試験群を最良に区別する。
実施例6-センサーについてのガスケットアプローチタンパク質パネルの設計
この実施例には、タンパク質レベルの決定のためのガスケットアプローチを使用した例示的なセンサーが記載される。
96ウェルプレート(「SBS 96」)内で図15Aに示される配置に従い、ガスケットアプローチを使用した。第1のガスケットを使用してプレートのそれぞれのウェルを4つの小さなウェルに分け、単一抗体をそれぞれの小さなウェルにスポットして、カスタマイズされたマルチプレックスアッセイ(例えば合計384ウェルについて4つの小さなウェル/96ウェルプレートのウェル)を作製した。図15Aに関して、IL-1β、IL-2、IL-6およびIL-8に特異的な抗体を、プレートの位置A1、A3、A5、A7、A9およびA11内の4つの小さなウェルのそれぞれに配置し；IL-10、IL-15、GM-CSFおよびIP-10に特異的な抗体を、プレートのA2、A4、A6、A8、A10およびA12内の4つの小さなウェルのそれぞれに配置した。行B～Hについて同じパターンを反復した。それぞれのウェル中の抗体溶液を、5μg/mLの濃度で2時間インキュベートした。次いで、第1のガスケット層を剥がして除去し、チップを窒素ガスで乾燥させ、さらなる使用のために4℃で保管した。試験試料を適用する前に、2つの隣接するSBS 96単一ウェル(例えばA1およびA2、したがって第1のガスケット層由来の8個の小さなウェル)をカバーする第2のガスケット層をチップに適用した。
それぞれ10ng/mLの濃度のIL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、GM-CSFおよびIP-10の組換えタンパク質の混合物を、合計12の希釈点について3xで連続希釈したバッファにスパイクし、第2のガスケットの異なるウェルに適用した。インキュベーションの2時間後、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、GM-CSFおよびIP-10に対するビオチニル化検出抗体のカクテル溶液を、0.5μg/mLの濃度で、第2のガスケットのそれぞれのウェルに適用した。通常の洗浄工程の後、0.5μg/mlストレプトアビジン-HRP溶液を、第2のガスケットのそれぞれのウェルに適用し、0.5時間インキュベートした。次いで、再度調製されたTMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)溶液を、第2のガスケットのそれぞれのウェルに適用して、それぞれのウェル内のナノニードルセンサー上で不溶性沈殿物を作製した。暗視野画像化装置を使用して、ナノニードルの全ての画像を捕捉した。色変化を示したニードルを計数し、ナノニードルの総数に対する割合を使用して、図36において「ナノ単位」と示されるパーセンテージを決定した。図36A～36Hは、IL-1b(図36A)、IL-2(図36B)、IL-10(図36C)、IL-15(図36D)、IL-6(図36E)、IL-8(図36F)、GM-CSF(図36G)およびIP-10(図36H)の検出を示すグラフである。全体として、図36は、色変化出力を有するナノニードルの数が、タンパク質の濃度の増加に伴って増加することを示す。
参照による援用
本明細書で言及される特許文献および科学文書のそれぞれの全開示は、全ての目的で参照により援用される。
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で実現され得る。そのため、前述の態様は、全ての点において、本明細書に記載される発明の限定ではなく、例示としてみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の同等物の意味および範囲に入る全ての変更が本発明に包含されることが意図される。

Claims (45)

  1. 試験被験体が属するかまたは関連する種の全タンパク質コーディングゲノムから選択される試験タンパク質の組を含むタンパク質パネルを決定する方法であって、
    (a)全ゲノム由来のタンパク質コーディング遺伝子をスプライシングして、タンパク質コーディングゲノムを構築する工程；
    (b)タンパク質コーディングゲノムにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定する工程；および
    (c)タンパク質コーディングゲノムにわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製する工程、ここでそれぞれのタンパク質は、タンパク質コーディングゲノム中のそれぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる、
    を含む、方法。
  2. タンパク質コーディング遺伝子がエクソンであり、タンパク質コーディングゲノムがエクソームである、請求項１記載の方法。
  3. タンパク質コーディング遺伝子がコーディング配列(CDS)領域であり、タンパク質コーディングゲノムがエクソームCDSである、請求項１または２記載の方法。
  4. SNPSが、同義SNPS、非同義SNPSまたはそれらの組み合わせである、請求項１～３いずれか記載の方法。
  5. マーカー位置が、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、互いから約25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ離れて間隔を空けられる、請求項４記載の方法。
  6. SNPが、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDS中のマーカー位置に対して最も近いSNPである、請求項１～５いずれか記載の方法。
  7. SNPが、マーカー位置に対して最も近い非同義SNPであり、結合部分が、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る、請求項６記載の方法。
  8. SNPが、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり、結合部分が、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る、請求項６記載の方法。
  9. 試験被験体が属するかまたは関連する種の全タンパク質コーディングゲノムから選択される試験タンパク質の組を含むタンパク質パネルを決定する方法であって、
    (a)全ゲノム由来のタンパク質コーディング遺伝子をスプライシングして、タンパク質コーディングゲノムを構築する工程；
    (b)タンパク質コーディングゲノムにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定する工程；および
    (c)タンパク質コーディングゲノムにわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定し、試験タンパク質の組を作製する工程、ここでそれぞれのタンパク質は、関連するマーカーが位置するタンパク質コーディングゲノムの領域によりコードされるタンパク質である、
    を含む、方法。
  10. タンパク質コーディング遺伝子がエクソンであり、タンパク質コーディングゲノムがエクソームである、請求項９記載の方法。
  11. タンパク質コーディング遺伝子がコーディング配列(CDS)領域であり、タンパク質コーディングゲノムがエクソームCDSである、請求項９または１０記載の方法。
  12. マーカー位置が、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、互いから、例えば約25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ離れて間隔を空けられる、請求項９～１１いずれか記載の方法。
  13. 試験被験体から採取された試料中の複数のタンパク質の存在を検出するかまたはその量を定量化し、それにより試料に対して、偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を行うためのセンサーであって、該センサーが、
    複数のアドレス可能なウェルを画定するプレートを含み、ここでそれぞれのウェルは、その中に配置されるグリッドを含み、(i)該グリッドは、複数のナノ構造アレイを含み、それぞれのナノ構造アレイは、複数のナノ構造を含み、(ii)それぞれのナノ構造アレイは、偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を行うために試験タンパク質の組の1つ以上のタンパク質に結合するための1つ以上の結合部分により機能化され、
    任意に試験タンパク質の組は、
    (a)試験被験体が属するかまたは関連する種のタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定すること；および
    (b)タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたりそれぞれのマーカー位置に関連するタンパク質を同定して試験タンパク質の組を作製することにより前もって決定されており、それぞれのタンパク質は、エクソーム中のそれぞれのマーカー位置の近くに配置される一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる、センサー。
  14. SNPSが同義SNPS、非同義SNPSまたはそれらの組み合わせである、請求項１３記載のセンサー。
  15. マーカー位置が、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、互いから約25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ離れて間隔を空けられる、請求項１３記載のセンサー。
  16. センサーが、試験タンパク質の組のそれぞれのメンバーに結合するために少なくとも20個の異なる結合部分を含む、請求項１３～１５いずれか記載のセンサー。
  17. SNPが、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDS中のマーカー位置に対して最も近いSNPである、請求項１３～１６いずれか記載のセンサー。
  18. SNPが、マーカー位置に対して最も近い非同義SNPであり、結合部分が、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る、請求項１７記載のセンサー。
  19. SNPが、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり、結合部分が、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る、請求項１７記載のセンサー。
  20. SNPが、対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置される、請求項１３～１９いずれか記載のセンサー。
  21. 全てのSNPが、それぞれの対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置される、請求項１３～２０いずれか記載のセンサー。
  22. ウェル内の全てのナノ構造アレイが、試験タンパク質の組内の特定のタンパク質に結合するために結合部分により機能化される、請求項１３～２１いずれか記載のセンサー。
  23. ウェル内のナノ構造アレイの一部が、試験タンパク質の組内の特定のタンパク質に結合するために結合部分により機能化される、請求項１３～２２いずれか記載のセンサー。
  24. 結合部分が、抗体、ナノボディ、アプタマーまたは親和性プローブである、請求項１３～２３いずれか記載のセンサー。
  25. それぞれのナノ構造が、ナノニードルを含む、請求項１３～２４いずれか記載のセンサー。
  26. ナノ構造が、平坦な支持体または可撓性基板の少なくとも1つと一体化される、請求項１３～２５いずれか記載のセンサー。
  27. 試験被験体から採取された試料中の複数のタンパク質の存在を検出するかまたはその量を定量化し、それにより試料に対して、偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDS関連解析を行うためのセンサーを作製する方法であって、
    (a)試験被験体が属するかまたは関連する種のタンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり実質的に均一に間隔を空けられる複数のマーカー位置を決定する工程；
    (b)タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたりそれぞれのマーカー位置と関連するタンパク質を同定して、試験タンパク質の組を作製する工程、ここでそれぞれのタンパク質は、エクソーム内のそれぞれのマーカー位置の近くに位置する一塩基多型(SNP)を含む遺伝子によりコードされる；および
    (c)センサーのナノ構造を、複数の異なる結合部分で機能化する工程、ここでそれぞれの結合部分は、試験タンパク質の組内のタンパク質に結合して、それにより試料中に存在する場合に試験タンパク質の存在を検出し得るかまたはその量を定量化し得る、
    を含む、方法。
  28. 工程(a)-(c)を反復し、それによりセンサーのシリーズを作製することを含む方法であって、第2のセンサーを作製するために使用されるマーカー位置が、第1のセンサーを作製するために使用されるマーカー位置から所定の距離だけ移動される、請求項２７記載の方法。
  29. SNPSが、同義SNPS、非同義SNPSまたはそれらの組み合わせである、請求項２７または２８記載の方法。
  30. マーカー位置が、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDSにわたり、互いから25kb、50kb、100kb、200kb、300kb、600kb、1,200kb、6,000kbまたは12,000kbだけ離れて間隔を空けられる、請求項２７～２９いずれか記載の方法。
  31. センサーが、試験タンパク質の組に結合するために少なくとも20個の異なる結合部分を含む、請求項２７～２９いずれか記載の方法。
  32. SNPが、タンパク質コーディングゲノム、エクソームまたはエクソームCDS中のマーカー位置に対して最も近いSNPである、請求項２７～３１いずれか記載の方法。
  33. SNPが、マーカー位置に対して最も近い非同義SNPであり、結合部分が、非同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る、請求項３２記載の方法。
  34. SNPが、マーカー位置に対して最も近い同義SNPであり、結合部分が、同義SNPを含む遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合し得る、請求項３３記載の方法。
  35. SNPが、対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置される、請求項２７～３４いずれか記載の方法。
  36. 全てのSNPが、それぞれの対応するマーカー位置から1,000塩基未満に配置される、請求項２７～３４いずれか記載の方法。
  37. 結合部分が、抗体、ナノボディ、アプタマーまたは親和性プローブである、請求項２７～３６いずれか記載の方法。
  38. 請求項２７～３７いずれか記載の方法により作製されるセンサー。
  39. センサーが、複数の異なる結合部分により機能化される複数のナノ構造を含み、それぞれの結合部分が、試験タンパク質の組内のタンパク質に結合して、それにより試料中に存在する場合に試験タンパク質の存在を検出し得るかまたはその量を定量化し得る、請求項３８記載のセンサー。
  40. 目的の試料に対して、偏りがないプロテオーム、エクソームまたはエクソームCDSワイド関連解析を行う方法であって、
    (a)試料の一部を請求項１３～３７いずれかに記載のセンサーに適用する工程；
    (b)センサーのナノ構造から検出可能なシグナルを検出する工程；および
    (c)検出可能なシグナルから、試料中の試験タンパク質の存在および/またはその量を決定する工程
    を含む、方法。
  41. 少なくとも1つのさらなるセンサーを用いて工程(a)～(c)を反復し、目的の試料のタンパク質パネルをスクリーニングする工程をさらに含む、請求項４０記載の方法。
  42. 検出可能なシグナルを検出する工程が、ナノ構造の少なくとも一部の特性の変化を検出することを含む、請求項４０記載の方法。
  43. 該特性が光学特性である、請求項４２記載の方法。
  44. 試料が、センサーへの適用前に希釈されない、請求項４０～４３いずれか記載の方法。
  45. 試料が、体液、組織抽出物または細胞上清である、請求項４０～４４いずれか記載の方法。
JP2023513090A 2020-08-26 2021-08-26 偏りがないプロテオミック試験のためのセンサー、その製造および使用の方法 Pending JP2023541546A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063070796P 2020-08-26 2020-08-26
US63/070,796 2020-08-26
PCT/US2021/047830 WO2022047085A1 (en) 2020-08-26 2021-08-26 Sensors for unbiased proteomic studies, method of manufacture and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023541546A true JP2023541546A (ja) 2023-10-03

Family

ID=80355768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023513090A Pending JP2023541546A (ja) 2020-08-26 2021-08-26 偏りがないプロテオミック試験のためのセンサー、その製造および使用の方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230417756A1 (ja)
EP (1) EP4204354A1 (ja)
JP (1) JP2023541546A (ja)
CN (1) CN116762002A (ja)
AU (1) AU2021331334A1 (ja)
CA (1) CA3192926A1 (ja)
WO (1) WO2022047085A1 (ja)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0115194D0 (en) * 2001-06-21 2001-08-15 Leuven K U Res & Dev Novel technology for genetic mapping
US20030190652A1 (en) * 2002-01-25 2003-10-09 De La Vega Francisco M. Methods of validating SNPs and compiling libraries of assays
EP3773165A1 (en) * 2018-03-27 2021-02-17 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Plasmonic biosensor
US20220128446A1 (en) * 2019-02-27 2022-04-28 Nanomosaic Llc Nanosensors and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20230417756A1 (en) 2023-12-28
EP4204354A1 (en) 2023-07-05
WO2022047085A1 (en) 2022-03-03
WO2022047085A8 (en) 2022-05-05
CN116762002A (zh) 2023-09-15
CA3192926A1 (en) 2022-03-03
AU2021331334A1 (en) 2023-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220128446A1 (en) Nanosensors and use thereof
Bally et al. Optical microarray biosensing techniques
JP5410464B2 (ja) 標的分析物検出および溶液中の標的分析物濃度の決定のための方法およびアレイ
US8222047B2 (en) Ultra-sensitive detection of molecules on single molecule arrays
US20160018331A1 (en) Biosensors including metallic nanocavities
US20230213508A1 (en) Apparatus and methods for detecting molecules and binding energy
US20100075355A1 (en) Ultra-sensitive detection of enzymes by capture-and-release followed by quantification
JP7410912B2 (ja) Ｇｍｒによるバイオマーカの検出における被検物質の検知のためのシステムおよび方法
EP3783352A1 (en) Multiwell electrode-based biosensor
WO2013160836A1 (en) Enhancing surface plasmon resonance imaging signal
WO2008128352A1 (en) Methods and compositions for signal amplification
Lambert et al. Ultrasensitive detection of bacterial protein toxins on patterned microarray via surface plasmon resonance imaging with signal amplification by conjugate nanoparticle clusters
Song et al. Nanoimprinted thrombin aptasensor with picomolar sensitivity based on plasmon excited quantum dots
JP2023541546A (ja) 偏りがないプロテオミック試験のためのセンサー、その製造および使用の方法
Grunwald A brief introduction to the streptavidin-biotin system and its usage in modern surface based assays
Rafique et al. Reusable, Noninvasive, and Sensitive Fluorescence Enhanced ZnO-Nanorod-Based Microarrays for Quantitative Detection of AFP in Human Serum
US20220365029A1 (en) Systems and Methods for Rapid Measurement of Magnetic Nanoparticles in Magnetic Biosensors
US20230123746A1 (en) Methods and Systems of Enhancing Electromagnetic Radiation Signals from Extracellular Vesicles
WO2024026314A1 (en) Methods and systems of enhancing electromagnetic radiation signals from extracellular vesicles
Kanik Development of Single-Particle Counting Assays with Interferometric Reflectance Imaging
Ekiz Kanik Development of single-particle counting assays with interferometric reflectance imaging
Zeidan Ultra-sensitive and Multiplex Detection of Clinical Biomarkers Using a SPRi-based Sensor
Farka of Thesis: Bioelectronic Interfaces Studied with Scanning
Jia et al. Nanoparticle-based immunoassays and their applications in nervous system biomarker detection
Xu Giant magnetoresistive sensor for biomolecule detection and cancer diagnosis