KR20210134599A - 분석물의 다중화된 형광 검출 - Google Patents

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KR20210134599A
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니콜라이 로마노프
스탠리 에스. 홍
패트릭 맥컬리
샤오하이 리우
다닐로 콘델로
메렉 시우
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일루미나, 인코포레이티드
일루미나 케임브리지 리미티드
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Abstract

제1 태양에서, 방법은 샘플을 제공하는 단계 - 상기 샘플은 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드를 포함함 -; 상기 샘플을 제1 형광 염료 및 제2 형광 염료와 접촉시키는 단계 - 상기 제1 형광 염료는 제1 여기 조명광에 응답하여 제1 파장 대역 내의 제1 방출된 광을 방출하고, 상기 제2 형광 염료는 제2 여기 조명광에 응답하여 제2 파장 대역 내의 제2 방출된 광을 방출함 -; 하나 이상의 이미지 검출기를 사용하여, 상기 제1 방출된 광 및 상기 제2 방출된 광을 포함하는 다중화된 형광(multiplexed fluorescent light)을 동시에 수집하는 단계 - 상기 제1 방출된 광은 상기 제1 파장 대역에 상응하는 제1 색상 채널이고, 상기 제2 방출된 광은 상기 제2 파장 대역에 상응하는 제2 색상 채널임 -; 및 상기 제1 색상 채널의 제1 파장 대역에 기초하여 상기 제1 뉴클레오티드를 확인하고, 상기 제2 색상 채널의 제2 파장 대역에 기초하여 상기 제2 뉴클레오티드를 확인하는 단계를 포함한다.

Description

분석물의 다중화된 형광 검출
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 1일자로 출원된 미국 가출원 제62/812,883호 및 2019년 6월 17일자로 출원된 네덜란드 출원 제2023327호의 이익을 주장한다. 상기 언급된 출원들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
합성에 의한 서열분석(sequencing by synthesis, SBS) 기술은 방출 스펙트럼을 갖는 형광 염료 및 종결자를 포함하는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트(dNTP)를 사용한다. 형광 염료는 dNTP에 공유적으로 부착된다. 광(즉, 형광)에 의한 조사 후의 형광 염료의 출력은 카메라에 의해 검출될 수 있다. 단일 형광 색상이 사용되는 경우, 4개의 염기 각각이 DNA 합성 및 이미징의 별개의 사이클에서 첨가된다. 일부 구현 형태에서, 4개의 염기 각각에 대한 별개의 형광 염료가 이용될 수 있다. 추가의 구현 형태에서, 2-채널 및 4-채널 SBS 기술은 염료-표지된 dNTP의 믹스를 사용할 수 있다. 상이한 파장 대역을 갖는 광원 및 각각의 방출 스펙트럼을 갖는 적절한 형광 염료로부터의 출력을 사용하여 각각의 DNA 클러스터의 이미지를 획득할 수 있다.
본 발명은 2개 이상의 색상 채널을 사용하여 샘플을 동시에 이미징함으로써 SBS 시스템에서 개선된 이미징 처리량을 제공할 수 있는 시스템 또는 방법의 예를 기재한다. 사용되는 염료 및 색상 채널의 특성은 색상 채널들 사이의 낮은 크로스토크(crosstalk) 또는 무 크로스토크를 용이하게 할 수 있으며, 이로써 다중화된 형광(multiplexed fluorescent light)은 뉴클레오티드들을 신속하게, 효율적이게 그리고 신뢰성 있게 확인하는 데 사용될 수 있다. 이는, 이미지들이 순차적으로 캡처될 것 - 이로써 더 낮은 처리량을 제공함 - 을 요구할 수 있는 다른 접근법들에 비해 상당한 개선을 제공할 수 있다. 청색 및 녹색 색상 채널을 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 다수의 색상 채널이 사용될 수 있다. 다중화된 형광에 기초하여 SBS를 수행하는 데 사용될 수 있는 시스템 또는 기법의 예가 기재된다. 다중화된 형광에 기초하여 SBS를 수행하기 위해 샘플을 표지하는 데 사용될 수 있는 염료의 예가 기재된다.
제1 태양에서, 방법은 샘플을 제공하는 단계 - 상기 샘플은 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드를 포함함 -; 상기 샘플을 제1 형광 염료 및 제2 형광 염료와 접촉시키는 단계 - 상기 제1 형광 염료는 제1 여기 조명광에 응답하여 제1 파장 대역 내의 제1 방출된 광을 방출하고, 상기 제2 형광 염료는 제2 여기 조명광에 응답하여 제2 파장 대역 내의 제2 방출된 광을 방출함 -; 하나 이상의 이미지 검출기를 사용하여, 상기 제1 방출된 광 및 상기 제2 방출된 광을 포함하는 다중화된 형광을 동시에 수집하는 단계 - 상기 제1 방출된 광은 상기 제1 파장 대역에 상응하는 제1 색상 채널이고, 상기 제2 방출된 광은 상기 제2 파장 대역에 상응하는 제2 색상 채널임 -; 및 상기 제1 색상 채널의 제1 파장 대역에 기초하여 상기 제1 뉴클레오티드를 확인하고, 상기 제2 색상 채널의 제2 파장 대역에 기초하여 상기 제2 뉴클레오티드를 확인하는 단계를 포함한다.
구현 형태는 하기의 특징들 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다. 제1 파장 대역은 청색 색상에 상응하고, 제2 파장 대역은 녹색 색상에 상응한다. 제1 파장 대역은 약 450 nm 내지 약 525 nm의 범위 내에 포함되고, 제2 파장 대역은 약 525 nm 내지 약 650 nm의 범위 내에 포함된다. 제1 평균 또는 피크 파장이 제1 형광 염료의 제1 방출 스펙트럼에 대해 정의되고, 제2 평균 또는 피크 파장이 제2 형광 염료의 제2 방출 스펙트럼에 대해 정의되고, 제1 평균 또는 피크 파장과 제2 평균 또는 피크 파장은 적어도 서로 미리 정의된 분리를 갖는다. 제1 파장 대역은 제2 파장 대역보다 더 짧은 파장을 가지며, 제2 파장 대역은 제1 파장과 관련되고, 제1 형광 염료와 제2 형광 염료 사이의 파장 방출 분리는 제1 형광 염료의 방출 스펙트럼이, 많아야, 제1 파장이나 그보다 높은 파장에서 미리 정의된 양의 광을 포함하도록 정의된다. 유사하게, 다중화된 형광을 수집하는 단계는 제1 색상 채널에 대하여 제1 광학 서브시스템을 사용하여 제1 방출된 광을 검출하는 단계, 및 제2 색상 채널에 대하여 제2 광학 서브시스템을 사용하여 제2 방출된 광을 검출하는 단계를 포함하며, 방출 이색성 필터가 제1 색상 채널의 제1 방출된 광을 제1 광학 서브시스템으로 그리고 제2 색상 채널의 제2 방출된 광을 제2 광학 서브시스템으로 직행시킨다. 제1 광학 서브시스템 및 제2 광학 서브시스템 중 적어도 하나는 기울어진 광학 경로를 포함한다. 제1 형광 염료의 방출 스펙트럼은 제1 파장 대역 내에 피크를 갖는다. 샘플은 제3 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 방법은 샘플을, 제1 여기 조명광에 응답하여 제1 파장 대역 내의 제3 방출된 광을 방출하고 제2 여기 조명에 응답하여 제2 파장 대역 내의 제4 방출된 광을 방출하는 제3 형광 염료와 접촉시키는 단계 - 다중화된 형광은 제3 방출된 광 및 제4 방출된 광을 추가로 포함함 -; 및 제1 색상 채널의 제1 파장 대역 및 제2 색상 채널의 제2 파장 대역에 기초하여 제3 뉴클레오티드를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 샘플은 제3 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 방법은 샘플을, 제3 여기 조명광에 응답하여 제3 파장 대역 내의 제3 방출된 광을 방출하는 제3 형광 염료와 접촉시키는 단계 - 다중화된 형광은 제3 방출된 광을 추가로 포함함 -; 및 제3 파장 대역에 기초하여 제3 뉴클레오티드를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
제2 태양에서, 장치는 샘플을 수용하는 플로우셀(flow cell) - 상기 샘플은 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제1 뉴클레오티드는 제1 형광 염료에 커플링되고, 상기 제2 뉴클레오티드는 제2 형광 염료에 커플링되고, 상기 제1 형광 염료는 제1 여기 조명광에 응답하여 제1 파장 대역 내의 제1 방출된 광을 방출하고, 상기 제2 형광 염료는 제2 여기 조명광에 응답하여 제2 파장 대역 내의 제2 방출된 광을 방출함 -; 상기 제1 여기 조명광 및 상기 제2 여기 조명광을 상기 플로우셀에 동시에 제공하는 조명 시스템; 및 상기 제1 방출된 광 및 상기 제2 방출된 광을 포함하는 다중화된 형광을 동시에 수집하는 집광 시스템 - 상기 제1 방출된 광은 상기 제1 파장 대역에 상응하는 제1 색상 채널이고, 상기 제2 방출된 광은 상기 제2 파장 대역에 상응하는 제2 색상 채널임 - 을 포함한다.
구현 형태는 하기의 특징들 중 임의의 것 또는 전부를 포함할 수 있다. 제1 파장 대역은 청색 색상에 상응하고, 제2 파장 대역은 녹색 색상에 상응한다. 제1 파장 대역은 약 450 nm 내지 약 525 nm의 범위 내에 포함되고, 제2 파장 대역은 약 525 nm 내지 약 650 nm의 범위 내에 포함된다. 제1 평균 또는 피크 파장이 제1 형광 염료의 제1 방출 스펙트럼에 대해 정의되고, 제2 평균 또는 피크 파장이 제2 형광 염료의 제2 방출 스펙트럼에 대해 정의되고, 제1 평균 또는 피크 파장과 제2 평균 또는 피크 파장은 적어도 서로 미리 정의된 분리를 갖는다. 제1 파장 대역은 제2 파장 대역보다 더 짧은 파장을 가지며, 제2 파장 대역은 제1 파장과 관련되고, 제1 형광 염료와 제2 형광 염료 사이의 파장 방출 분리는 제1 형광 염료의 방출 스펙트럼이, 많아야, 제1 파장이나 그보다 높은 파장에서 미리 정의된 양의 광을 포함하도록 정의된다. 집광 시스템은 제1 방출된 광을 검출하는 제1 색상 채널에 대한 제1 광학 서브시스템, 및 제2 방출된 광을 검출하는 제2 색상 채널에 대한 제2 광학 서브시스템을 포함하며, 방출 이색성 필터가 제1 색상 채널의 제1 방출된 광을 제1 광학 서브시스템으로 그리고 제2 색상 채널의 제2 방출된 광을 제2 광학 서브시스템으로 직행시킨다. 제1 광학 서브시스템 및 제2 광학 서브시스템 중 적어도 하나는 기울어진 광학 경로를 포함한다. 제1 형광 염료의 방출 스펙트럼은 제1 파장 대역 내에 피크를 갖는다. 샘플은 제1 여기 조명광에 응답하여 제1 파장 대역 내의 제3 방출된 광을 방출하고 제2 여기 조명에 응답하여 제2 파장 대역 내의 제4 방출된 광을 방출하는 제3 형광 염료에 커플링된 제3 뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 다중화된 형광은 제3 방출된 광 및 제4 방출된 광을 추가로 포함한다. 샘플은 제3 여기 조명광에 응답하여 제3 파장 대역 내에 제3 방출 광을 방출하는 제3 형광 염료에 커플링된 제3 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 다중화된 형광은 제3 방출된 광을 추가로 포함한다.
구현 형태의 하나 이상의 예의 상세 사항이 첨부 도면 및 이하의 설명에 기재되어 있다. 다른 특징이 상세한 설명 및 도면으로부터 그리고 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 기기, 카트리지, 및 플로우셀을 포함하는 시스템의 다이어그램이다.
도 2는 예시적인 구현 형태에 따른 플로우셀을 포함하는 조명 시스템의 다이어그램이다.
도 3은 예시적인 구현 형태에 따른 적색 및 녹색 염료의 방출 스펙트럼의 플롯을 포함하는 다이어그램이다.
도 4는 도 3의 녹색 및 적색 염료를 사용하여 순차적인 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 5는 도 3의 녹색 및 적색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 6은 도 4 및 도 5의 2-채널 서열분석에 대한 메트릭을 나타낸 다이어그램이다.
도 7은 예시적인 구현 형태에 따른 청색 및 녹색 염료의 방출 스펙트럼의 플롯을 포함하는 다이어그램이다.
도 8은 도 7의 청색 및 녹색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 9는 예시적인 구현 형태에 따른 대안적인 청색 및 녹색 염료의 방출 스펙트럼의 플롯을 포함하는 다른 다이어그램이다.
도 10은 도 9의 청색 및 녹색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 11은 다른 청색 및 녹색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 12는 또 다른 청색 및 녹색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 13은 예시적인 구현 형태에 따른 대안적인 청색 및 녹색 염료의 방출 스펙트럼 및 상응하는 필터 범위의 플롯을 포함하는 다른 다이어그램이다.
도 14는 도 13의 청색 및 녹색 염료를 사용하고 제1 필터 범위를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 15는 도 13의 청색 및 녹색 염료를 사용하고 제2 필터 범위를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 16은 도 9의 청색 및 녹색 염료와 도 13의 제2 필터 범위를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다.
도 17은 도 16의 2-채널 서열분석에 대한 메트릭을 나타낸 다이어그램이다.
도 18은 다중화된 형광 이미지들을 생성하고 분석하는 데 관여할 수 있는 예시적인 순차적 단계들의 타임라인을 나타낸 다이어그램이다.
도 19는 다중화된 형광 이미지들을 생성하고 분석하는 데 관여할 수 있는 예시적인 순차적 단계들의 다른 타임라인을 나타낸 다이어그램이다.
도 20은 SIM 이미징을 이용하여 동시 이미지를 생성하는 데 관여하는 이벤트들의 타임라인을 나타낸 다이어그램이다.
도 21은 예시적인 구현 형태에 따른 샘플을 동시에 이미징하는 방법을 예시한 흐름도이다.
도 22는 서열분석 작업을 수행하는 방법을 예시한 흐름도이다.
도 23은 서열분석 작업을 수행하는 방법을 예시한 다른 흐름도이다.
도 24는 2-채널 서열분석에서 본 명세서에 기재된 염료 I-4로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시한 산포도이다.
도 25는 2-채널 서열분석에서 본 명세서에 기재된 염료 I-5로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시한 산포도이다.
도 26은 2-채널 서열분석에서 본 명세서에 기재된 염료 I-6으로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시한 산포도이다.
본 명세서는 2개 이상의 색상 채널을 사용하여 DNA 클러스터들의 동시 이미징을 사용하여 합성에 의한 서열분석(SBS)의 확고한 결과를 제공할 수 있는 시스템 및 기법의 예를 기재한다. 그러한 시스템/기법은 기존의 접근법에 비해, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 이점을 제공할 수 있다.
I. 개요
SBS를 수행하는 일부 접근법은 상응하는 형광 염료로부터의 방출된 광의 각각의 파장 대역의 순차적인 이미징을 포함한다. 즉, 제1 뉴클레오티드에 상응하는 방출된 광의 제1 파장 대역을 이미징하는 단계, 제2 뉴클레오티드에 상응하는 방출된 광의 제2 파장 대역을 이미징하는 단계, 제3 뉴클레오티드에 상응하는 방출된 광의 제3 파장 대역을 이미징하는 단계, 및 제4 뉴클레오티드에 상응하는 방출된 광의 제4 파장 대역을 이미징하는 단계를 포함한다.
일부 경우에, 그러한 순차적인 이미징 프로세스는 방출된 광의 4개의 상이한 파장 대역을 개별적으로 이미징하기 때문에 데이터의 낮은 처리량으로 이어질 수 있다. 일부 구현 형태에서, 방출된 광의 2개의 파장 대역이 각각의 뉴클레오티드를 확인하는 데 이용되었는데, 이는, 뉴클레오티드 유형을 추론하기 위한 이미지의 수를 2개로 감소시킴으로써 행해졌다(예컨대, 합성에 의한 2-채널 서열분석). 예를 들어, 제1 파장 대역은 2개의 뉴클레오티드, 예컨대 아데닌 및 티민과 관련될 수 있다. 제2 파장 대역은 하나의 중첩 뉴클레오티드 및 제3 뉴클레오티드, 예컨대 아데닌 및 시토신과 관련될 수 있다.
파장 대역들은 여기 광에 응답하여 상응하는 파장 대역 내의 광을 방출하는 형광 염료를 통해 달성될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 하나는 제1 파장 대역을 위한 것이고 하나는 제2 파장 대역을 위한 것인 2개의 염료가 각각 아데닌에 대한 핵산 세그먼트의 상응하는 부분에 커플링할 수 있다. 증폭을 통해 생성된 핵산 단편들의 집단을 고려해 볼 때, 핵산 세그먼트들의 집단의 클러스터의 적어도 일부 부분은 제1 파장 대역에 대한 염료 및 제2 파장 대역에 대한 염료에 커플링할 수 있다. 따라서, 제1 염료가 제1 여기 광에 노출될 때, 클러스터는 제1 파장 대역 내의 광을 방출한다. 제2 염료가 제1 여기 광과 상이한 제2 여기 광에 노출될 때, 클러스터는 제2 파장 대역 내의 광을 방출한다. 유사하게, 제1 파장 대역 내에서 방출하는 염료는 티민에 대한 핵산 세그먼트의 상응하는 부분에 커플링할 수 있고, 제2 파장 대역 내에서 방출하는 염료는 시토신에 대한 핵산 세그먼트의 상응하는 부분에 커플링할 수 있다.
제1 파장 대역이 상응하는 여기 광을 사용하여 이미징될 때, 제1 파장 대역-방출된 광에 대한 이미지가 획득될 수 있다. 제2 파장 대역이 상응하는 여기 광을 사용하여 이미징될 때, 제2 파장 대역-방출된 광에 대한 이미지가 획득될 수 있다. 이들 이미지의 획득은 방출된 광의 제1 파장 대역의 이미지 획득이 방출된 광의 제2 파장 대역과 중첩되지 않도록 시간적으로 분리된다.
두 이미지 모두에서 묘사된 2개의 이미지의 일부분들은 중첩 뉴클레오티드, 예컨대 아데닌에 상응하는 것으로 결정될 수 있다. 단지 제1 이미지에만 묘사된(그리고 제2 이미지에서는 광을 방출하지 않는) 2개의 이미지의 일부분들은 제1 파장 대역 방출 염료와 관련된 비-중첩 뉴클레오티드, 예컨대 티민에 상응하는 것으로 결정될 수 있다. 단지 제2 이미지에만 묘사된(그리고 제1 이미지에서는 광을 방출하지 않는) 2개의 이미지의 일부분들은 제2 파장 대역 방출 염료와 관련된 비-중첩 뉴클레오티드, 예컨대 시토신에 상응하는 것으로 결정될 수 있다. 제1 이미지 또는 제2 이미지 중 어느 것에서도 광을 방출하지 않는 2개의 이미지의 일부분들은 제4 뉴클레오티드, 예컨대 구아닌에 상응하는 것으로 결정될 수 있다.
전술한 시스템에서는, 2개 이상의 순차적(즉, 시간적으로 분리된) 이미지가 상응하는 뉴클레오티드들을 결정하는 데 이용된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 방출된 광의 2개 이상의 상이한 파장 대역들의 동시 캡처가 단일 이미징 단계 동안 달성될 수 있으며, 그럼으로써 일시적으로 분리된 제2 세트의 이미지들을 제거할 수 있으며, 그럼으로써 이미징 단계들을 이미징을 위한 단일 시퀀스로 감소시킴으로써 서열분석 처리량을 개선할 수 있다. 그러나, 방출된 광의 중첩 파장 대역들로 인해 동시적인 2개 이상의 채널-방출된 광 획득을 달성하는 데 어려움이 있을 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 방출된 광의 파장 대역들이 서로 너무 근접해 있을 때(예를 들어, 청색 대역과 녹색 대역), 상이한 형광 염료들의 각각의 방출 스펙트럼이 중첩될 수 있다. 그러한 경우에, 스펙트럼 "크로스토크"가 발생할 수 있으며, 그 결과 상응하는 뉴클레오티드를 결정하기 위한 처리에서 어려움을 초래할 수 있다.
단일 이미징 단계에서 방출된 광의 2개 이상의 파장을 동시에 캡처하고, 이어서 이것은 합성에 의한 서열분석 프로세스를 위한 상응하는 뉴클레오티드들을 결정하도록 처리될 수 있는, 시스템 및 방법이 본 명세서에 기재된다. 특히, 제1 파장 대역은 2개의 뉴클레오티드, 예컨대 아데닌 및 티민과 관련될 수 있다. 제2 파장 대역은 이들 2개의 뉴클레오티드와 중첩하는 하나의 뉴클레오티드 및 제3 뉴클레오티드, 예컨대 아데닌 및 시토신과 관련될 수 있다. 제1 파장 대역은 제1 하부 파장 및 제1 상부 파장을 가질 수 있다. 제2 파장 대역은 제2 하부 파장 및 제2 상부 파장을 가질 수 있다. 일부 구현 형태에서, 제1 하부 파장은 제2 상부 파장으로부터 적어도 50 nm에 있다. 일부 구현 형태에서, 제1 하부 파장 및 제2 상부 파장은 크로스토크가 제1 미리 결정된 값보다 낮은 값이 되도록, 예컨대 20% 미만이 되도록 설정된다.
염료들 사이의 분리는 하나 이상의 다른 방식으로 정의될 수 있다. 이는 파장 대역, 색상 채널, 또는 형광 염료 중 하나 이상에 기초할 수 있다. 파장 대역은 제1 파장과 제2 파장 사이의 모든 주파수(예를 들어, 본질적으로 연속적인 주파수 범위)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 파장은 파장 대역이 청색광, 또는 다른 색상의 광을 포함하도록 선택될 수 있다. 색상 채널은 검출기에 의해 검출되고 있는 주파수 또는 주파수들을 나타낸다. 예를 들어, 색상 채널 내에 있지 않은 방출된 광의 주파수는 검출기에 도달하기 전에 필터링 제거될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 색상 채널은 하나 이상의 파장 대역을 포함할 수 있다. 형광 염료는 그의 화학 구조에 의한 것 및/또는 그의 광학 특성에 의한 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다수의 방식으로 특성화될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 형광 염료는 하나 이상의 파장 대역에서만 형광을 방출하는 것으로 특성화되거나, 또는 소정 주파수에서 또는 파장 대역 내에 평균 또는 피크 파장을 갖는 것으로 특성화될 수 있다.
일부 구현 형태에서, 분리는 미리 정의된 파장 위 또는 아래에 있는 상응하는 염료로부터의 방출된 광의 양에 기초하여 정의될 수 있다. 분리는, 방출된 광의 양이, 많아야, 다른 염료의 파장 대역과 관련된 미리 정의된 파장의 위 또는 아래에서 미리 결정된 백분율이 되도록 정의될 수 있다. 예를 들어, 염료의 형광의 많아야 X%가 다른 염료의 미리 정의된 파장의 위 또는 아래에서 방출된다. 일부 구현 형태에서, 앞서의 예에서의 숫자 X는 임의의 적합한 수, 예컨대 값들의 범위일 수 있다. 예를 들어, 이 범위는 형광의 약 0 내지 10%일 수 있다. 다른 예로서, 이 범위는 형광의 약 0.5 내지 5%일 수 있다. 다른 예로서, 이 범위는 형광의 약 0.1 내지 1%일 수 있다. 일부 구현 형태에서, 염료들 사이의 평균 또는 피크 파장 분리가 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 염료는 그들의 평균 또는 피크 파장이 적어도 미리 결정된 척도(예를 들어, 거리, 또는 어느 파장의 백분율)에 의해 분리되는 경우, 분리 메트릭을 만족시키는 것으로 간주될 수 있다.
하나 이상의 형광 염료가 상기 언급된 파장 대역 내의 광을 방출하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 일부 염료는 청색 색상 채널을 위한 광을 방출하도록 청색 파장 대역 내에 국소화된 방출 스펙트럼을 가질 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 일부 염료는 녹색 색상 채널을 위한 광을 방출하도록 녹색 파장 대역 내에 국소화된 방출 스펙트럼을 가질 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 기재된 일부 염료는 적색 색상 채널을 위한 광을 방출하도록 적색 파장 대역 내에 국재화된 방출 스펙트럼을 가질 수 있다. 예를 들어, 청색 및 녹색 색상 채널이 검출될 수 있다. 다른 예로서, 청색, 녹색 및 적색 색상 채널이 검출될 수 있다. 염료들의 방출 스펙트럼은 각각이 청색 스펙트럼 영역 및 녹색 스펙트럼 영역 내에 각각 충분히 국재화되어 감소된 방출 파장 중첩을 갖도록 선택될 수 있다.
II. 다중화 형광 검출을 위한 예시적인 기기 및 조명 시스템
도 1은 기기(12), 카트리지(14), 및 플로우셀(16)을 포함하는 시스템(10)의 다이어그램이다. 시스템(10)은 생물학적 및/또는 화학적 분석을 위해 사용될 수 있다. 시스템(10)은 본 명세서의 어딘가 다른 곳에 기재된 하나 이상의 다른 예와 함께 사용되거나, 그의 구현 시에 사용될 수 있다.
카트리지(14)는 플로우셀(16)에 의한 것과 같이 하나 이상의 샘플을 위한 캐리어로서의 역할을 할 수 있다. 카트리지(14)는 플로우셀(16)을 유지하고, 플로우셀(16)을 기기(12)와의 직접적인 상호작용 안으로 그리고 밖으로 수송하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 기기(12)는 적어도 샘플로부터 정보를 수집하는 동안 카트리지(14)를 받아들여서 수용하기 위한 용기(18)(예를 들어, 그의 외부 인클로저 내의 개구)를 포함한다. 카트리지(14)는 임의의 적합한 재료(들)로 제조될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 카트리지(14)는 성형 플라스틱 또는 다른 내구성 재료를 포함한다. 예를 들어, 카트리지(14)는 플로우셀(16)을 지지하거나 유지하기 위한 프레임을 형성할 수 있다.
본 명세서에서의 예는 분석 중인 샘플을 언급한다. 그러한 샘플은 유전 물질을 포함할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 샘플은 유전 물질의 하나 이상의 주형 가닥을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 기법 및/또는 시스템을 사용하여, SBS가 하나 이상의 주형 DNA 가닥 상에서 수행될 수 있다.
플로우셀(16)은 기기(12)에 의해 분석하고자 하는 샘플(들)을 유지하도록 구성된 하나 이상의 기재를 포함할 수 있다. 유리, 아크릴, 및/또는 다른 플라스틱 재료를 포함하지만 이로 한정되지 않는 임의의 적합한 재료가 기재에 사용될 수 있다. 플로우셀(14)은 액체 또는 다른 유체가 선택적으로 샘플(들)에 대해 유동될 수 있게 할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 플로우셀(16)은 샘플(들)을 유지할 수 있는 하나 이상의 유동 구조물(flow structure)을 포함한다. 일부 구현 형태에서, 플로우셀(12)은 적어도 하나의 유동 채널을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유동 채널은 유체의 유동을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 유체 포트를 포함할 수 있다.
기기(12)는 적어도 하나의 생물학적 및/또는 화학적 물질에 관한 임의의 정보 또는 데이터를 획득하도록 작동할 수 있다. 작동(들)은 중앙 유닛에 의해 또는 하나 이상의 분산 제어기에 의해 제어될 수 있다. 여기서는, 기기 제어기(20)가 예시된다. 예를 들어, 제어기(20)는 적어도 하나의 프로세서, 기기(12)의 작동을 위한 명령어를 유지하는 적어도 하나의 저장 매체(예를 들어, 메모리 및/또는 드라이브), 및, 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 하나 이상의 다른 구성요소를 사용하여 구현될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 기기(12)는 샘플(들)의 조명 및/또는 이미징을 포함하지만 이로 한정되지 않는 광학적 작동(optical operation)을 수행할 수 있다. 예를 들어, 기기(12)는 하나 이상의 광학 서브시스템(예를 들어, 조명 서브시스템 및/또는 이미징 서브시스템)을 포함할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 기기(12)는 샘플(들)의 열 컨디셔닝을 포함하지만 이로 한정되지 않는 열 처리를 수행할 수 있다. 예를 들어, 기기(12)는 하나 이상의 열 서브시스템(예를 들어, 히터 및/또는 냉각기)을 포함할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 기기(12)는 샘플(들)과 접촉 상태에 있는 유체를 첨가 및/또는 제거하는 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는 유체 관리를 수행할 수 있다. 예를 들어, 기기(12)는 하나 이상의 유체 서브시스템(예를 들어, 펌프 및/또는 저장소)을 포함할 수 있다.
도 2는 예시적인 조명 시스템(100)의 다이어그램이다. 조명 시스템(100)은 광원 조립체(110), 여기 이색성 필터(excitation dichroic filter)(128), 대물 렌즈(134), 플로우셀(136), 방출 이색성 필터(138), 제1 광학 검출 서브시스템(156), 및 제2 광학 검출 서브시스템(158)을 포함한다. 조명 시스템(100)은 2개의 색상 채널의 동시 이미징을 가능하게 한다. 일부 구현 형태에서, 다른 조명 시스템은 2개 초과의 색상 채널, 예를 들어 3개의 색상 채널, 4개의 색상 채널, 또는 그 이상의 동시 이미징을 가능하게 하도록 구성될 수 있다. 다수의 색상 채널의 유사한 동시 이미징을 생성할 수 있는 다른 광학 구성들이 있을 수 있음에 유의한다.
광원 조립체(110)는 플로우셀(136) 상에 입사하는 여기 조명을 생성한다. 이러한 여기 조명은 다시, 하나 이상의 형광 염료로부터의 방출된 조명(emitted illumination), 또는 형광된 조명(fluoresced illumination)을 생성할 것이며, 이들은 투영 렌즈들(142, 148)을 사용하여 수집될 것이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 광원 조립체(110)는 제1 여기 조명원(112) 및 상응하는 수렴 렌즈(114), 제2 여기 조명원(116) 및 상응하는 수렴 렌즈(118), 및 이색성 필터(120)를 포함한다.
제1 여기 조명원(112)과 제2 여기 조명원(116)은 샘플에 대한 (예를 들어, 각각의 색상 채널들에 상응하는) 각각의 여기 조명광들을 동시에 제공할 수 있는 조명 시스템을 예시한다. 일부 구현 형태에서, 제1 여기 조명원(112) 및 제2 여기 조명원(116) 각각은 발광 다이오드(LED)를 포함한다. 일부 구현 형태에서, 제1 여기 조명원(112) 및 제2 여기 조명원(116) 중 적어도 하나는 레이저를 포함한다. 일부 구현 형태에서, 제1 여기 조명원(112)은 녹색광, 즉, 녹색 색상에 상응하는 피크 또는 평균 파장을 갖는 협대역 광(예를 들어, 약 560 nm)을 생성한다. 일부 구현 형태에서, 제2 여기 조명원(116)은 청색광, 즉, 청색 색상에 상응하는 피크 또는 평균 파장을 갖는 협대역 광(예를 들어, 약 490 nm)을 생성한다.
수렴 렌즈들(114, 118)은 각각, 각각의 수렴 렌즈(114/118)로부터 나오는 조명이 시야 조리개(122)에 포커싱되도록 각각의 여기 조명원들(112, 116)로부터 소정 거리에 세팅된다.
이색성 필터(120)는 제1 여기 조명원(112)으로부터의 조명은 반사하고, 제2 여기 조명원(116)으로부터의 조명은 투과시킨다. 일부 구현 형태에서, 제1 여기 조명원(112)이 녹색광을 생성하고 제2 여기 조명원(116)이 청색광을 생성하는 경우, 이색성 필터는 녹색광은 반사하고 청색광은 투과시킨다. 이색성 필터(120)는 본 예에서 청색 및 녹색의 2개의 파장의 믹스를 갖는 혼합된 조명(mixed illumination)을 광학 경로를 통해 전진 출력하여 대물 렌즈(134)에 의해 방출되게 한다.
일부 구현 형태에서, 이색성 필터(120)로부터의 혼합된 여기 조명 출력은 대물 렌즈(134)를 향해 직접 전파될 수 있다. 다른 구현 형태에서, 혼합된 여기 조명은 대물 렌즈(134)로부터의 방출 전에 추가의 개재 광학 구성요소에 의해 추가로 변형 및/또는 제어될 수 있다. 도 1에 도시된 예에서, 혼합된 여기 조명은 시야 조리개(122) 내의 초점을 통해 청색/녹색 필터(124)로 그리고 이어서 색보정 시준 렌즈(color-corrected collimating lens)(126)로 지나간다. 렌즈(126)로부터의 시준된 여기 조명은 미러(128) 상에 입사하고, 거기서 그것은 반사되고 여기/방출 이색성 필터(130) 상에 입사한다. 여기/방출 이색성 필터(130)는, 방출 조명 - 이는 하기에 추가로 설명될 것임 - 이 여기/방출 이색성 필터(130)를 통과하여 하나 이상의 광학 서브시스템들(156, 158)에 의해 수신될 수 있게 하면서, 광원 조립체(110)로부터 방출된 여기 조명을 반사한다. 광학 서브시스템들(156, 158)은 다중화된 형광을 동시에 수집할 수 있는 집광 시스템을 예시한다. 이어서, 여기/방출 이색성 필터(130)로부터 반사된 여기 조명은 미러(132) 상에 입사하고, 그로부터 그것은 플로우셀(136)을 향해 대물 렌즈(134) 상에 입사한다.
대물 렌즈(134)는 미러(132)로부터의 시준된 여기 조명을 플로우셀(136) 상에 포커싱한다. 일부 구현 형태에서, 대물 렌즈(134)는, 예를 들어 1X, 2X, 4X, 5X, 6X, 8X, 10X, 또는 그 이상의 지정된 배율 계수(magnification factor)를 갖는 현미경 대물 렌즈이다. 대물 렌즈(134)는 미러(132)로부터 입사하는 여기 조명을, 배율 계수에 의해 결정된 원추각(a cone of angles) 또는 개구수(numerical aperture)로 플로우셀(136) 상에 포커싱한다. 일부 구현 형태에서, 대물 렌즈(134)는 플로우셀에 수직인 축("z-축") 상에서 이동가능하다. 일부 구현 형태에서, 조명 시스템(100)은 튜브 렌즈(148) 및 튜브 렌즈(142)의 z 위치를 독립적으로 조정한다. 예를 들어, 이것은, 대물 렌즈를 z 방향으로 이동해야 할 필요 없이, 녹색 채널을 검출기(154) 상에 포커싱되게 할 수 있고, 청색 채널을 검출기(146) 상에 완전히 포커싱되게 할 수 있다. 튜브 렌즈들(148, 142)의 z 방향으로의 독립적인 조정은 최초로 기기를 정렬할 때 행해지는 "1회 조정"일 수 있다.
플로우셀(136)은 분석하고자 하는 샘플, 예컨대 뉴클레오티드 서열을 수용한다. 플로우셀(136)은, 샘플 물질을 유지하고, 화학 반응을 촉발하거나 물질을 첨가하거나 제거하는 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는, 샘플 물질과 관련하여 취해질 행동을 용이하게 하도록 구성된 하나 이상의 채널(160)(여기서는 확대 단면도로 개략적으로 예시됨)을 포함할 수 있다. 여기서 파선을 사용하여 개략적으로 예시된 대물 렌즈(134)의 대물면(162)이 플로우셀(136)을 통해 연장된다. 예를 들어, 대물면(162)은 채널(들)(160)에 인접하도록 한정될 수 있다.
대물 렌즈(134)는 시야(field of view)를 한정할 수 있다. 시야는, 이미지 검출기가 대물 렌즈(134)를 사용하여 방출된 광을 캡처하는 플로우셀(136) 상의 영역을 한정할 수 있다. 하나 이상의 이미지 검출기, 예를 들어 검출기들(146, 154)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 여기 조명원(112, 116)이 상이한 파장(또는 상이한 파장 범위)을 갖는 각각의 여기 조명을 발생시킬 때, 조명 시스템(100)은 방출된 광의 각각의 파장(또는 파장 범위)에 대한 별개의 이미지 검출기들(146, 154)을 포함할 수 있다. 이미지 검출기들(146, 154) 중 적어도 하나는 전하-결합 소자(CCD), 예컨대 시간-지연 집적 CCD 카메라, 또는 상보성 금속 산화물 반도체(CMOS) 기술에 기초하여 제조된 센서, 예컨대 화학적으로 민감한 전계 효과 트랜지스터(chemFET), 이온-감응성 전계 효과 트랜지스터(ISFET), 및/또는 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(MOSFET)를 포함할 수 있다.
일부 구현 형태에서, 조명 시스템(100)은 구조화된 조명 현미경(structured illumination microscope, SIM)을 포함할 수 있다. SIM 이미징은 공간적으로 구조화된 조명광 및 재구성에 기초하여, 오로지 대물 렌즈(134)로부터의 확대만을 사용하여 생성된 이미지보다 더 고해상도의 이미지를 생성하게 된다. 예를 들어, 구조물은 조명 여기 광(illuminating excitation light)을 차단하는 패턴 또는 격자(grating)로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 구조물은 프린지(fringe)의 패턴을 포함할 수 있다. 광의 프린지는 회절 격자 상에 광 빔을 충돌시켜 반사 또는 투과 회절이 일어나게 함으로써 발생될 수 있다. 구조화된 광은 샘플 상에 투영되어, 각각의 프린지들에 따라 샘플을 조명할 수 있으며, 이들은 어떠한 주기성에 따라 일어날 수 있다. SIM을 사용하여 이미지를 재구성하기 위하여, 2개 이상의 패턴화된 이미지가 사용되는데, 여기서 여기 조명의 패턴은 서로에 대해 상이한 위상각에 있다. 예를 들어, 샘플의 이미지들이 구조화된 광에서의 프린지들의 상이한 위상들에서 획득될 수 있는데, 이러한 상이한 위상들은 때때로 이미지들의 각각의 패턴 위상들로 지칭된다. 이는 샘플 상의 다양한 위치가 다수의 조명 강도에 노출될 수 있게 할 수 있다. 생성된 방출된 광 이미지들의 세트는 조합되어 더 고해상도의 이미지를 재구성할 수 있다.
플로우셀(136) 내의 샘플 물질은 상응하는 뉴클레오티드에 커플링하는 형광 염료와 접촉된다. 형광 염료는 대물 렌즈(134)로부터 플로우셀(136) 상에 입사하는 상응하는 여기 조명으로 조사될 때 형광 조명을 방출한다. 방출된 조명은 파장 대역들로 확인되며, 이들 각각은 각각의 색상 채널로 카테고리화될 수 있다. 예를 들어, 방출된 조명의 파장 대역들은 청색 색상(예를 들어, 450 nm 내지 525 nm), 녹색 색상(예를 들어, 525 nm 내지 570 nm), 황색 색상(예를 들어, 570 nm 내지 625 nm), 적색 색상(예를 들어, 625 nm 내지 750 nm) 등에 상응할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 파장 대역들은 동시 조명 동안에 존재하는 2개 이상의 광 파장에 기초하여 정의될 수 있다. 예를 들어, 청색 및 녹색 색상만을 분석하고자 하는 경우, 청색 및 녹색 색상에 상응하는 파장 대역은 상기 언급된 범위와는 상이한 파장 대역으로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 청색 파장 대역은 약 450 nm 내지 510 nm, 예컨대 486 nm 내지 506 nm의 방출된 광으로서 설정될 수 있다. 일부 경우에, 청색 파장 대역은 단순히 상한치, 예컨대 약 500 nm 내지 510 nm 또는 약 506 nm를 가질 수 있다. 유사하게, 녹색 파장 대역은 약 525 nm 내지 650 nm, 예컨대 584 nm 내지 637 nm의 방출된 광으로서 설정될 수 있다. 전술한 녹색 파장 대역이 상기 언급된 황색 및 적색 색상 내로 연장되지만, 단지 청색 및 녹색 색상 범위에만 있을 것으로 예상되는 방출된 광을 분석할 때, 파장 대역의 상부 및/또는 하부 단부는 그 색상에 대한 파장의 위 또는 아래에서 방출되는 추가의 방출된 광을 캡처하도록 연장될 수 있다. 일부 경우에, 녹색 파장 대역은 단순히 하한치, 예컨대 약 550 nm 내지 600 nm 또는 약 584 nm를 가질 수 있다.
형광 염료는, 예를 들어 각각의 핵염기들을 함유하는 각각의 뉴클레오티드들과 화학적으로 결합된다. 이러한 방식으로, 형광 염료로 표지된 dNTP가, 이미지 검출기(146, 154)에 의해 검출될 때 상응하는 파장 대역 내에 있는 방출된 광 파장에 기초하여 확인될 수 있다. 즉, 청색 염료로 표지된 제1 dNTP는, 상기에서 논의된 바와 같이, 정의된 청색 파장 대역 내에 있는 방출된 광을 수신하는 이미지 검출기(146, 154)에 응답하여 확인될 수 있다. 유사하게, 녹색 염료로 표지된 다른 뉴클레오티드는, 상기에서 논의된 바와 같이, 정의된 녹색 파장 대역 내에 있는 방출된 광을 수신하는 이미지 검출기(146, 154)에 응답하여 확인될 수 있다. 동시 DNA 클러스터 이미징을 위한 염료-표지된 뉴클레오티드들의 다른 색상 조합이 또한 적절한 조명 광원 및 광학 셋업과 함께 서열분석에 사용될 수 있다(예를 들어, 청색 및 황색; 청색 및 적색; 녹색 및 적색; 황색 및 적색; 청색, 녹색, 및 적색; 청색, 녹색, 및 황색; 청색, 황색, 및 적색; 녹색, 황색, 및 적색; 청색, 녹색, 황색, 및 적색 등).
형광 염료들의 구성은 다양한 염료를 설명하는 하기 섹션 III에서 더 상세히 논의된다. 일부 구현 형태에서, 형광 염료들은, 각각의 뉴클레오티드가 조명 시스템(100)에 의해 가능한 동시 이미징 플랫폼을 사용하여 색상 채널에 의해 확고하게 확인될 수 있도록 구성된다. 염료 방출 스펙트럼 및 필터링의 선택을 통해, 염료들로부터의 다중화된 방출된 광이 구현될 수 있다. 특히, 청색 및 녹색 색상 채널과 같이, 근접해 있거나 유사한 색상들에 대한 파장 대역들이 상대적으로 바로 가까이에 있을 수 있기 때문에, 충분히 작은 중첩을 갖는 상응하는 방출 스펙트럼을 갖는 소정의 형광 염료들의 선택은 뉴클레오티드들의 잠재적인 오인(misidentification) 및 그에 따른 서열분석에 있어서의 오류를 감소시키는 것을 도울 수 있다. 게다가, 파대 필터링(waveband filtering)의 사용은 유사한 색상을 가질 수 있는 소정의 형광 염료들을 구별하는 것을 추가로 도울 수 있다.
일부 구현 형태에서, 4가지 유형의 뉴클레오티드가 2개의 색상 채널을 사용하여 확인될 수 있다. 그러한 경우에, 제1 뉴클레오티드는 단지 제1 색상 채널에만 관련될 수 있고, 제2 뉴클레오티드는 단지 제2 색상 채널에만 관련될 수 있고, 제3 뉴클레오티드는 두 색상 채널 모두와 관련될 수 있고, 제4 뉴클레오티드는 어느 색상 채널과도 관련되지 않을 수 있다.
대물 렌즈(134)는 또한 플로우셀(136) 내의 형광된 염료 분자들에 의해 방출되는 형광을 캡처한다. 이러한 방출된 광을 캡처할 때, 대물 렌즈(134)는 2개의 색상 채널을 포함하는 시준된 광을 수집하고 전달한다. 이어서, 이러한 방출된 광은 원래의 여기 조명이 조명원(110)으로부터 도달된 경로를 따라 다시 전파된다. 방출된 광과 여기 조명 사이의 간섭성(coherence)의 결여로 인해 이 경로를 따라 방출된 조명과 여기 조명 사이에는 예상되는 간섭이 거의 없거나 전혀 없음에 유의한다. 즉, 방출된 광은 별개의 공급원의 결과, 즉 플로우셀(136) 내의 샘플 물질과 접촉 상태에 있는 형광 염료의 결과이다.
방출된 광은 미러(132)에 의한 반사 시에, 여기/방출 이색성 필터(130) 상에 입사한다. 필터(130)는 방출된 광을 청색/녹색 이색성 필터(138)로 투과시킨다.
일부 구현 형태에서, 청색/녹색 이색성 필터(138)는 청색 색상 채널과 관련된 조명은 투과시키고 녹색 색상 채널과 관련된 조명은 반사한다. 일부 구현 형태에서, 청색/녹색 이색성 필터(138)는, 앞서 논의된 바와 같이, 이색성 필터(138)가, 방출된 조명을 정의된 녹색 파장 대역 내에 있는 광학 서브시스템(156)으로 반사하고, 방출된 조명을 정의된 청색 파장 대역 내에 있는 광학 서브시스템(158)으로 투과시키도록 선택된다. 광학 서브시스템(156)은 튜브 렌즈(142), 필터(144), 및 이미지 검출기(146)를 포함한다. 광학 서브시스템(158)은 튜브 렌즈(148), 필터(150), 및 이미지 검출기(154)를 포함한다.
일부 구현 형태에서, 이색성 필터(138)와 이색성 필터(120)는 서로 유사하게 작동한다(예를 들어, 둘 모두는 하나의 색상의 광은 반사하고 다른 색상의 광은 투과시킬 수 있다). 다른 구현 형태에서, 청색/녹색 이색성 필터(138)와 이색성 필터(120)는 서로 상이하게 작동한다(예를 들어, 이색성 필터(138)는 이색성 필터(120)가 반사하는 색상의 광을 투과시킬 수 있고, 역으로도 성립한다).
청색/녹색 이색성 필터(138)가 청색 색상 채널 내에 포함되어 있는 방출된 조명을 투과시킨다고 가정하면, 녹색 색상 채널 내에 포함되어 있는 방출된 조명은 청색/녹색 이색성 필터(138)로부터 광학 서브시스템(156) 내로 반사될 수 있다. 이어서, 미러(140)는 녹색 색상 채널 내에 포함되어 있는 방출된 조명을, 광학 서브시스템(156)의 튜브 렌즈(142) 상에 입사하도록 반사한다. 이때, 광학 서브시스템(156)의 필터(144)는 방출된 조명의 녹색 색상 채널 내의 파장은 투과시키고 모든 다른 파장은 흡수하거나 반사하도록 설계된 녹색 필터이다. 필터(144)는 청색/녹색 이색성 필터(138)에서 이용가능하지 않은 추가의 필터링을 제공할 수 있다. 예를 들어, 청색/녹색 이색성 필터(138)가 녹색광의 상대적으로 넓은 파장 범위를 반사하면, 필터(144)는 그러한 파장 범위를 추가로 제한하여, 단지 녹색광의 상대적으로 더 좁은 파장 범위만이 이미지 검출기(146)에 도달하도록 할 수 있다. 필터(144)는 임의의 누설된 여기 광을 차단할 수 있고/있거나 상대적으로 엄격한 파장 대역을 정의할 수 있다.
동시에, 청색/녹색 이색성 필터(138)는 청색 색상 채널 내에 포함되어 있는 방출된 조명을, 광학 서브시스템(158)의 튜브 렌즈(148) 상에 입사하도록 투과시킨다. 광학 서브시스템(158)의 필터(150)는 방출된 조명의 청색 색상 채널 내의 파장은 투과시키고 모든 다른 파장은 흡수하거나 반사하도록 설계된 청색 필터이다. 필터(150)는 청색/녹색 이색성 필터(138)에서 이용가능하지 않은 추가의 필터링을 제공할 수 있다. 예를 들어, 청색/녹색 이색성 필터(138)가 청색광의 상대적으로 넓은 파장 범위를 투과시키면, 필터(150)는 그러한 파장 범위를 추가로 제한하여, 단지 청색광의 상대적으로 더 좁은 파장 범위만이 이미지 검출기(154)에 도달하도록 할 수 있다. 필터(150)는 임의의 누설된 여기 광을 차단할 수 있고/있거나 상대적으로 엄격한 파장 대역을 정의할 수 있다.
일부 구현 형태에서, 그리고 도 2에 도시된 바와 같이, 청색 색상 채널 내에 포함되어 있는 방출된 조명은 이미지 검출기(154) 앞에서 미러(152)와 접한다. 도시된 예에서, 광학 서브시스템(158)에서의 광학 경로는, 전체적으로 조명 시스템(100)이 공간 또는 부피 요건을 만족시킬 수 있도록 기울어져 있다. 일부 구현 형태에서, 그러한 서브시스템들(156, 158) 둘 모두는 기울어진 광학 경로를 갖는다. 일부 구현 형태에서, 서브시스템(156)에서의 광학 경로 또는 서브시스템(158)에서의 광학 경로 중 어느 것도 기울어져 있지 않다. 그러한 바와 같이, 다수의 광학 서브시스템들 중 하나 이상은 적어도 하나의 기울어진 광학 경로를 가질 수 있다.
각각의 튜브 렌즈(142, 148)는 그것에 입사하는 방출된 조명을 각각의 이미지 검출기들(146, 154) 상에 포커싱한다. 일부 구현 형태에서, 각각의 검출기(146, 154)는 전하 결합 소자(CCD) 어레이를 포함한다. 일부 구현 형태에서, 각각의 이미지 검출기(146, 154)는 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS) 센서를 포함한다.
앞서 언급된 바와 같이, 조명 시스템(100)은 도 2에 도시된 바와 같을 것이 요구되지 않는다. 예를 들어, 미러들(128, 132, 140) 각각은 프리즘, 또는 조명 방향을 변화시키는 일부 다른 광학 디바이스로 대체될 수 있다. 각각의 렌즈는 회절 격자, 회절 광학계, 프레넬 렌즈, 또는 입사 조명으로부터 시준되거나 포커싱된 조명을 생성하는 일부 다른 광학 디바이스로 대체될 수 있다. 더욱이, 조명 시스템(100)은 청색/녹색 이외의 상이한 파장 대역 - 예를 들어, 적색/녹색 또는 청색/적색 - 에 걸친 분리를 위해 설계될 수 있다. 본 명세서에 논의된 몇몇 청색, 녹색, 및 적색 염료는 하기 섹션 III에서의 제목 "예시적인 형광 염료"에서 더 상세히 설명된다.
도 3은 예시적인 구현 형태에 따른 적색 및 녹색 염료의 방출 스펙트럼의 플롯을 포함하는 다이어그램(300)이다. 형광은 수직축에 측정되어 있고, 파장은 수평축 상에 표시되어 있다. 형광은 방출된 광의 강도의 관점에서 측정될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 광 강도를 결정하는 하나 이상의 방식이 사용될 수 있다. 예를 들어, 보정된 벤치마크(calibrated benchmark)에 대한 임의의 강도 단위가 사용될 수 있다. 스펙트럼들(302, 304)은 녹색 염료로서 특징지어질 수 있고, 스펙트럼들(306, 308)은 적색 염료로서 특징지어질 수 있다. 다이어그램(300)은 색상 채널들(310, 312)을 포함한다. 색상 채널(310)은 녹색 방출 필터와 관련될 수 있다. 예를 들어, 색상 채널(310)은 녹색 색상 채널로 간주될 수 있다. 색상 채널(312)은 적색 방출 필터와 관련될 수 있다. 예를 들어, 색상 채널(312)은 적색 색상 채널로 간주될 수 있다.
채널들 사이의 스펙트럼 크로스토크(spectral crosstalk)가 문제가 될 수 있다. 크로스토크는 색상 채널들이 순차적으로 그리고 동시에 조명될 때 이들 둘 모두에서 일어날 수 있다. 일부 구현 형태에서, 더 높은 파장 채널 내로의 더 낮은 파장 채널의 크로스토크가 더 안 좋은 시나리오로 여겨질 수 있다. 예를 들어, 이는 스펙트럼(302 또는 304)이 색상 채널(312) 내로 스필(spill)되는 것을 포함할 수 있다. 여기서, 스펙트럼들(302 내지 308)은 순차적 조명에서 2.4% 크로스토크를, 그리고 동시 조명에서 2.8% 크로스토크를 가질 수 있다. 예를 들어, 이는 동시 획득과 순차적 획득 사이의 상대적으로 최소한의 크로스토크 차이인 것으로 간주될 수 있다.
도 4는 도 3의 녹색 및 적색 염료를 사용하여 순차적인 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도(400)이다. 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 적색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(402)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 적색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(404)은 적색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(406)은 녹색 채널 및 적색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(408)은 녹색 채널 및 적색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 그러한 바와 같이, 방출(908)은 녹색 채널의 파장 대역 내에 있는 실질적인 광을 방출하지 않고 적색 채널의 파장 대역 내에 있는 실질적인 광을 방출하지 않는 형광 염료의 한 예이다.
방출들(402 내지 408) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(402)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(404)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(406)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(408)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 순차적 이미징에서, 방출들(402 내지 408)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
도 5는 도 3의 녹색 및 적색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도이다. 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 적색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(502)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 적색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(504)은 적색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(506)은 녹색 채널 및 적색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(508)은 녹색 채널 및 적색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(502 내지 508) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(502)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(504)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(506)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(508)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(502 내지 508)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
도 6은 도 4 및 도 5의 2-채널 서열분석에 대한 메트릭을 나타낸 다이어그램이다. 메트릭(600)은 순차적 조명에 관한 것이고, 메트릭(602)은 동시 조명에 관한 것이다.
즉, 전술된 예들은 적색/녹색 시스템에서의 크로스토크의 수준이, 심지어 동시 획득에서조차도 비교적 낮을 수 있음을 나타낸다. 그러나, 다른 색상 채널들에 대해서는, 크로스토크의 양이 더 어려운 문제가 될 수 있다.
도 7은 예시적인 구현 형태에 따른 청색 및 녹색 염료의 방출 스펙트럼의 플롯을 포함하는 다이어그램(700)이다. 형광은 수직축에 측정되어 있고, 파장은 수평축 상에 표시되어 있다. 스펙트럼들(702, 704)은 청색 염료로서 특징지어질 수 있고, 스펙트럼들(706, 708)은 녹색 염료로서 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(702)은 청색 조명에서 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(704)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(706)은 녹색 조명에서 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(708)은 티민의 검출에 상응할 수 있다.
다이어그램(700)은 색상 채널들(710, 712)을 포함한다. 색상 채널(710)은 청색 방출 필터와 관련될 수 있다. 예를 들어, 색상 채널(710)은 청색 색상 채널로 간주될 수 있다. 색상 채널(712)은 녹색 방출 필터와 관련될 수 있다. 예를 들어, 색상 채널(712)은 녹색 색상 채널로 간주될 수 있다.
다이어그램(700)은, 시토신 염기를 확인하기 위한 청색 방출에 상응할 수 있는 스펙트럼(704)이 색상 채널(712)에서 상당히 스필링 오버(spilling over)됨을 보여준다. 일부 구현 형태에서, 이는, 녹색 여기 파장과 청색 여기 파장 사이의 분리(이는, 예를 들어 약 70 nm일 수 있음)가 적색 파장과 녹색 파장 사이의 분리(이는, 예를 들어 약 140 nm일 수 있음, 도 3 참조)보다 상대적으로 훨씬 더 작기 때문에 일어날 수 있다. 즉, 청색 염료의 방출 스펙트럼은 녹색 염료의 방출 스펙트럼과 중첩되는 파장 성분을 방출한다. 따라서, 청색/녹색 시나리오(예를 들어, 다이어그램(700))에서의 형광 방출들은 적색/녹색 시나리오(예를 들어, 다이어그램(300))에서보다 훨씬 더 가까울 수 있다. 청색/녹색 조명에 의한 순차적 조명에서, 크로스토크의 양은 상대적으로 최소한이거나 무시할 만할 수 있다. 그러나, 동시 조명에서, 크로스토크는 상대적으로 상당할 수 있다. 예를 들어, 크로스토크는 약 40%일 수 있다.
도 8은 도 7의 청색 및 녹색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도(800)이다. 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(802)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 그러한 바와 같이, 방출(802)은 청색 채널의 파장 대역 내에 있는 실질적인 광을 방출하지 않고 녹색 채널의 파장 대역 내에 있는 실질적인 광을 방출하지 않는 형광 염료의 한 예이다. 방출(804)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(806)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(808)이 산포도(800)에서 퍼져 있으며, 적어도 방출들(802, 806)의 일부와 일치한다. 방출(808)의 중심(808A)이 표시되어 있다. 방출들(802 내지 808) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(802)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(804)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(806)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(808)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(802 내지 808)은 상대적으로 상당한 크로스토크를 갖는다.
도 9는 예시적인 구현 형태에 따른 대안적인 청색 및 녹색 염료의 방출 스펙트럼의 플롯을 포함하는 다른 다이어그램(900)이다. 형광은 수직축에 측정되어 있고, 파장은 수평축 상에 표시되어 있다. 스펙트럼들(902, 904)은 청색 염료로서 특징지어질 수 있고, 스펙트럼(906)은 녹색 염료로서 특징지어질 수 있다. 다이어그램(900)은 색상 채널들(908, 910)을 포함한다. 색상 채널(908)은 청색 방출 필터와 관련될 수 있다. 예를 들어, 색상 채널(908)은 청색 색상 채널로 간주될 수 있다. 색상 채널(910)은 녹색 방출 필터와 관련될 수 있다. 예를 들어, 색상 채널(910)은 녹색 색상 채널로 간주될 수 있다. 스펙트럼들(902 내지 906) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(902)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(904)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(906)은 티민 또는 아데닌의 검출에 상응할 수 있다.
다이어그램(900)에서의 스펙트럼 방출들은 동시 다색 이미징을 지원하는 염료를 나타낸다. 예를 들어, 도 7에서의 다이어그램(700)과 대조적으로, 시토신 염기 서열분석 염료의 청색 방출에 상응하는 스펙트럼(902)의 피크는 상당히 청색-이동되어 있다. 여기서, 스펙트럼(904)은 색상 채널(908) 내에서 피크를 갖는 반면, 스펙트럼(902)의 피크는 스펙트럼(908) 내에 있지 않다. 스펙트럼(906)의 피크는 색상 채널(910)의 하단부 약간 아래에 위치된다. 다이어그램(900)은 순차적 조명에서 상대적으로 최소한이거나 무시할 만한 크로스토크를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 다이어그램(900)은 동시 조명에서 약 12% 크로스토크를 나타낼 수 있다.
다이어그램(900)에서의 상대적으로 낮은 수준의 크로스토크는 각각의 염료들이 서로 충분히 분리되어 있는 것과 상관될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 분리는 방출 스펙트럼의 피크 또는 평균 파장에 기초하여 정의될 수 있다. 피크 파장은 방출된 광의 강도의 국부적 또는 전역적 최대값에 상응할 수 있다. 평균 파장은 방출 스펙트럼 범위 내의 평균 파장에 상응할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 염료들은 그들 각각의 피크 또는 평균 파장이 적어도 서로 미리 정의된 분리를 갖도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(902)의 피크 파장은 스펙트럼(906)의 피크 파장으로부터의 적어도 미리 정의된 분리를 가질 수 있다. 다른 예로서, 스펙트럼(904)의 피크 파장은 스펙트럼(906)의 피크 파장으로부터의 적어도 미리 정의된 분리를 가질 수 있다.
일부 구현 형태에서, 분리는 중첩 파장 범위들에서의 광의 양에 기초하여 정의될 수 있다. 색상 채널(910)의 좌측 에지(910')는 색상 채널(910)의 파장 범위의 특정 파장에 상응할 수 있다. 스펙트럼(902 또는 904)은 색상 채널(910) 내로 상당히 연장되지 않는 것을 보장하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 각각의 형광 염료들 사이의 분리는 스펙트럼(902 또는 904)이, 많아야, 에지(910')에 상응하는 파장이나 그보다 높은 파장에서 미리 정의된 양의 광을 포함하도록 정의될 수 있다. 미리 정의된 양은 절대수로서(예를 들어, 방출된 광의 양, 또는 그의 강도에 대한 상한 역치로서) 또는 상대수로서(예를 들어, 염료에 의해 방출되는 형광의 총량의 비율로서) 정의될 수 있다.
도 9 내지 도 16을 참조하여 기재된 청색 염료 및 이의 변형체는 하기에 더 상세히 설명되어 있다.
도 10은 도 9의 청색 및 녹색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도(1000)이다. 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(1002)은 청색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1004)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1006)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(1008)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(1002 내지 1008) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1002)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1004)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1006)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1008)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(1002 내지 1008)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
도 11은 다른 청색 및 녹색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도(1100)이다. 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(1102)은 청색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1104)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1106)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(1108)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(1102 내지 1108) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1102)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1104)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1106)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1108)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(1102 내지 1108)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
도 12는 또 다른 청색 및 녹색 염료를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도(1200)이다. 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(1202)은 청색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1204)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1206)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(1208)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(1202 내지 1208) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1202)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1204)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1206)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1208)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(1202 내지 1208)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
상이한 컬러 필터들이 사용될 수 있다. 동시 획득을 위한 필터 설계가 선택될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 약 583 내지 660 nm의 녹색 필터 방출 통과대역이 사용될 수 있다. 예를 들어, 이는 550 내지 637 nm와 같은 다른 녹색 통과대역에 비해 이동을 나타낼 수 있다.
도 13은 예시적인 구현 형태에 따른 대안적인 청색 및 녹색 염료의 방출 스펙트럼 및 상응하는 필터 범위의 플롯을 포함하는 다른 다이어그램(1300)이다. 형광은 수직축에 측정되어 있고, 파장은 수평축 상에 표시되어 있다. 스펙트럼들(1302, 1304)은 청색 염료로서 특징지어질 수 있고, 스펙트럼(1306)은 녹색 염료로서 특징지어질 수 있다. 다이어그램(1300)은 색상 채널들(1308, 1310)을 포함한다. 색상 채널(1308)은 청색 방출 필터와 관련될 수 있고, 이전 필터(1308')와 대비될 수 있다. 예를 들어, 색상 채널(1308)은 청색 색상 채널로 간주될 수 있다. 색상 채널(1310)은 녹색 방출 필터와 관련될 수 있다. 예를 들어, 색상 채널(1310)은 녹색 색상 채널로 간주될 수 있다. 스펙트럼들(1302 내지 1306) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(1302)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(1304)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(1306)은 티민 또는 아데닌의 검출에 상응할 수 있다.
도 14는 도 13의 청색 및 녹색 염료를 사용하고 제1 필터 범위를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도(1400)이다. 예를 들어, 제1 필터 범위는 도 13에서의 이전 필터(1308')에 상응할 수 있다. 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(1402)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(1404)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1406)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(1408)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(1402 내지 1408) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1402)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1404)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1406)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1408)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(1402 내지 1408)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
도 15는 도 13의 청색 및 녹색 염료를 사용하고 제2 필터 범위를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도(1500)이다. 예를 들어, 제2 필터 범위는 도 13에서의 색상 채널(1308')에 상응할 수 있다. 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(1502)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(1504)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1506)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(1508)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(1502 내지 1508) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1502)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1504)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1506)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1508)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(1502 내지 1508)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
분리는 하나 이상의 방식으로 정의될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 파장 방출 분리는 색상 채널(1310)과 관련된 파장 아래에 있는 스펙트럼(1304)으로부터 방출된 광의 양에 기초하여 정의될 수 있다. 파장 방출 분리는, 형광 염료들 중 하나의 형광 염료의 방출 스펙트럼이, 많아야, 나머지 다른 형광 염료와 관련된 파장(예를 들어, 최근접 경계 파장, 또는 특징적인 파장) 이상에서 미리 정의된 양의 광을 포함하도록 형광 염료들 사이에 정의될 수 있다. 예를 들어, 그 양은 스펙트럼(1304)의 양 X(예를 들어, 총 형광의 백분율)가 색상 채널(1310)의 더 낮은 파장(예를 들어, 그 색상 채널의 하한) 아래에서 발생한다는 것을 나타낼 수 있다. 일부 구현 형태에서, 앞서의 예에서의 숫자 X는 임의의 적합한 수, 예컨대 값들의 범위일 수 있다. 예를 들어, 이 범위는 형광의 약 0 내지 10%일 수 있다. 다른 예로서, 이 범위는 형광의 약 0.5 내지 5%일 수 있다. 다른 예로서, 이 범위는 형광의 약 0.1 내지 1%일 수 있다. 일부 구현 형태에서, 분리는 스펙트럼(1306)과 스펙트럼(1302) 또는 스펙트럼(1304) 중 어느 하나 사이의 평균 또는 피크 파장 분리에 기초하여 정의될 수 있다. 예를 들어, 스펙트럼(1304)과 스펙트럼(1306)은 스펙트럼(1304)의 평균 파장(예를 들어, 형광 방출들의 평균 파장) 또는 스펙트럼(1304)의 피크 파장(예를 들어, 형광의 강도가 최대인 파장)이 스펙트럼(1306)의 평균 또는 피크 파장으로부터 미리 정의된 양보다 더 많은 양만큼 분리되어 있다면 분리된 것으로 여겨질 수 있다. 미리 정의된 양은 절대값일 수 있다. 예를 들어, 평균 또는 피크 파장들은 적어도 약 50 내지 100 nm만큼, 예컨대 약 70 nm만큼 분리될 수 있다. 미리 정의된 양은 상대값일 수 있다. 예를 들어, 평균 또는 피크 파장들은 평균 또는 피크 파장 중 어느 하나의 적어도 약 5 내지 20%만큼, 예컨대 더 낮거나 더 높은 평균 또는 피크 파장의 약 13%만큼 분리될 수 있다.
결론적으로, 본 명세서에 기재된 개선을 사용하여, 다색 이미지 획득이 달성될 수 있는데, 이러한 달성은 이전에는 극히 어려운 문제인 것으로 여겨졌으며 성공 가능성이 매우 작은 것으로 여겨졌었다. 이제, 개선의 일부 더 많은 예를 설명할 것이다.
도 16은 도 9의 청색 및 녹색 염료와 도 13의 제2 필터 범위를 사용하여 동시 다중화된 이미징을 갖는 2-채널 서열분석을 예시하는 산포도(1600)이다. 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(1602)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1604)은 청색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(1606)은 녹색 채널 및 청색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(1608)은 녹색 채널 및 청색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(1602 내지 1608) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1602)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1604)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1606)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(1608)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(1602 내지 1608)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
상기 방출들(1602 내지 1608) 각각은 시간 경과에 따라 2개의 검출기(146, 154)(도 2) 중 하나에서 수집된 강도의 분포를 나타낸다. 도 13에서의 방출 스펙트럼들의 플롯에 나타낸 바와 같이, "C" 핵염기는 청색 염료와 관련되고, 이에 따라 방출(1604)은 대량의 높은 청색 조명 수준 및 낮은 녹색 조명 수준을 갖는다. 이것이 "C" 핵염기가 확인되는 방법이다. "T" 핵염기는 대량의 녹색 조명 수준 및 낮은 청색 조명 수준을 갖는 방출(1602)을 통해 확인되며; 이것이 "T" 핵염기가 확인되는 방법이다.
방출(1606)에 의해 확인되는 "A" 핵염기는 높은 청색 및 녹색 조명 수준의 혼합을 갖는다. 스펙트럼(1304) 및 스펙트럼(1306)(도 13) 둘 모두가 "A" 핵염기에 상응하였음에 유의한다. 유사하게, "G" 핵염기는 낮은 청색 및 녹색 조명 수준을 갖는 방출(1608)에 의해 확인된다.
방출들(1602 내지 1608)은 각각의 평균값들에 대해 상당한 양의 퍼짐을 갖는 분포를 갖지만, 대부분은 상당한 양의 크로스토크를 나타내지 않는다. 이러한 방식으로, 각각의 핵염기는 용이하게 확인될 수 있다.
도 17은 도 16의 2-채널 서열분석에 대한 메트릭을 나타낸 다이어그램이다. 메트릭(1700)은 실시 요약에 관한 것이다. 메트릭(1702)은 제1 리드(read)에 관한 것이고, 메트릭(1704)은 제2 리드에 관한 것이다.
도 18은 본 명세서에 기재된 개선된 기법의 일부로서 다중화된 형광 이미지들을 생성하고 분석하는 데 관여할 수 있는 예시적인 순차적 단계들의 타임라인(1800)을 나타낸 다이어그램이다. 타임라인(1800)은 본 명세서의 어딘가 다른 곳에 기재된 하나 이상의 예와 함께 사용될 수 있다. 시간의 진행은 수평축에 측정되어 있고, 각각의 작동들은 수직축을 따라 표시되어 있다.
개략적으로 예시된 바와 같은 다색 이미지 캡처(1802)는 하나 이상의 이미징 시간 블록(1804), 및 하나 이상의 카메라-관련 시간 블록(1806)을 포함할 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이미징 시간 블록(1804)은 시스템이 레이저 다이오드의 워밍(warming)을 수행하는 데; 1회 이상의 노출에 대해 배열하는 데; 그리고 노출(들)에 대한 노출 시간에 필요한 시간에 상응할 수 있다. 이미징 시간 블록(1804) 후에, 카메라-관련 시간 블록(1806)이 뒤따를 수 있다. 예를 들어, 카메라-관련 시간 블록(1806)은 오버헤드 시간, 개별 카메라 스냅(들)에 관련된 카메라 응답 시간, 및 데이터 전송을 위한 시간을 포함할 수 있다. 카메라-관련 시간 블록(1806) 후에는, 다른 하나의 이미징 시간 블록(1804)이 뒤따를 수 있다. 그러한 바와 같이, 다색 이미지 캡처(1802)는 이미징 시간 블록(1804)과 카메라-관련 시간 블록(1806) 사이에 교번하는 시퀀스를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 이미지를 위한 염료, 노출 시간, 및 카메라 스냅의 도입을 수반할 수 있다.
도 19는 본 명세서에 기재된 개선된 기법의 일부로서 다중화된 형광 이미지들을 생성하고 분석하는 데 관여할 수 있는 예시적인 순차적 단계들의 타임라인(1900)을 나타낸 다이어그램이다. 도 19에 도시된 바와 같이, 타임라인(1900)은 오토포커스 프로세스(1910), 다색 이미지 세트 획득 프로세스(1920), 및 스테핑 및 세틀링(step and settle) 프로세스(1930)를 포함한다. 수평축은 경과된 시간을 나타낸다. 하기의 일부 예는 또한 단지 예시적인 목적으로 도 2를 참조할 것이다.
오토포커스 프로세스(1910)는 타임라인(1900)을 시작한다. 먼저, 레이저 다이오드를 워밍하고 오토포커스 노출을 발생시킨다. 카메라(즉, 검출기) 스냅 오버헤드, 응답 시간, 및 데이터 전송 시간에 기초하여, 조명의 포커싱된 빔이 플로우셀(136)에 대해 원하는 대물면에 입사되는 대물 렌즈(134)의 위치를 확립하도록 대물 렌즈(134)를 그의 축(즉, "z" 방향)을 따라 이동하도록 결정한다.
대물 렌즈(134)의 이 위치가 설정된 후에, 다색 이미지 세트 획득 프로세스(520)가 시작될 수 있다. 예를 들어, 이것은 청색 및 녹색 색상 채널, 또는 적색 및 녹색 색상 채널, 또는 색상 채널의 다른 선택을 사용하여 이미지(들)를 캡처하는 것을 수반할 수 있다. 청색 및 녹색 이미지 검출기(146, 154) 각각에 대해, 레이저 다이오드가 워밍된 후에, 이어서 샘플을 미리 결정된 시간 동안 조명하여 하나 이상의 염료를 형광시킨다.
다중화된 형광 이미지가 이미지 검출기들(146, 154)에 의해 획득되고, 생성된 데이터가 처리 시스템으로 전송될 수 있다. 도 19에 도시된 바와 같이, 여기서 이 프로세스는 각각의 검출기 상에서 6개의 이미지를 획득하기 위해, 두 검출기 모두에 대해 6회 반복된다. 일부 구현 형태에서, 이미지 세트 획득 프로세스는 여러 회, 예를 들어, 구현 형태에 따라 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12회, 및 그 이상 반복될 수 있다. 전송된 데이터는 DNA 서열의 재구성에 사용될 수 있다. 유전자 서열(예를 들어, DNA 서열)의 재구성 및/또는 결정은 모든 이미지가 캡처되고 뉴클레오티드 염기가 호출된 후에 일어날 수 있다.
다색(예를 들어, 청색 및 녹색) 이미지 및 그들의 데이터가 획득된 후에, 플로우셀(136)의 상이한 부분이 이미징을 위한 위치로 이동된다. 여기서, 플로우셀(136)이 스테이지 상에 있을 때, 스테이지는 타일 - 이는 플로우셀(136)에 대한 한정된 구획일 수 있음 - 에 의해 이동되고, 이어서 스테핑 및 세틀링 프로세스(1930)가 일어나서 플로우셀(136) 및 임의의 다른 기계적 구성요소가 실질적으로 안정된 상태가 될 수 있게 한 후, 다음 이미징 프로세스가 일어난다. 즉, 플로우셀(136)은 스테이지 상에서 전진되고(스테핑되고), 플로우셀(136)을 이동시킨 후에, 플로우셀(136) 내의 액체가 침강되도록 약간의 시간이 허용된다.
도 20은 본 명세서에 기재된 개선된 기법의 일부로서 다중화된 형광 이미지들을 생성하고 분석하는 데 관여할 수 있는 예시적인 순차적 단계들의 타임라인(2000)을 나타낸 다이어그램이다. 도 20에 도시된 바와 같이, 타임라인(2000)은 오토포커스 프로세스(2010), 다색(예를 들어, 청색 및 녹색) 이미지 세트 획득 프로세스(2020), 및 스테핑 및 세틀링 프로세스(2030)를 포함한다. 수평축은 경과된 시간을 나타낸다. 하기의 일부 예는 또한 단지 예시적인 목적으로 도 2를 참조할 것이다.
오토포커스 프로세스(2010)는 타임라인(2000)을 시작한다. 먼저, 레이저 다이오드를 워밍하고 오토포커스 노출을 발생시킨다. 카메라(즉, 검출기) 스냅 오버헤드, 응답 시간, 및 데이터 전송 시간에 기초하여, 조명의 포커싱된 빔이 플로우셀(136)에 대해 원하는 대물면에 입사되는 대물 렌즈(134)의 위치를 확립하도록 대물 렌즈(134)를 그의 축(즉, "z" 방향)을 따라 이동하도록 결정한다.
대물 렌즈(134)의 이 위치가 설정된 후에, 다색 이미지 세트 획득 프로세스(2020)가 시작될 수 있다. 청색 및 녹색 이미지 검출기(146, 154) 각각에 대해, 레이저 다이오드가 워밍된 후에, 이어서 샘플을 미리 결정된 시간 동안 조명하여 하나 이상의 염료를 형광시킨다. 구조화된 조명 현미경법(structured illumination microscopy, SIM)을 이용하는 구현 형태에서는, 격자 또는 다른 SIM 구성요소가 2040에서 하나 이상의 프린지의 위상을 변형시키도록 이동될 수 있다. 하나 이상의 프린지는 어떠한 주기성에 따라 발생할 수 있다. 이들 프린지는 다른 것들에서의 조명을 차단하면서 샘플의 상이한 부분에 조명을 제공하기 위해 이동된다. 다중화된 형광 이미지가 이미지 검출기들(146, 154)에 의해 획득되고, 생성된 데이터가 처리 시스템으로 전송될 수 있다. 도 20에 도시된 바와 같이, 여기서 이 프로세스는 각각의 검출기 상에서 6개의 이미지를 획득하기 위해, 두 검출기 모두에 대해 6회 반복된다. 일부 구현 형태에서, 이미지 세트 획득 프로세스는 여러 회, 예를 들어, 구현 형태에 따라 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12회, 및 그 이상 반복될 수 있다. 이들 노출 및 캡처 동안, 전송된 데이터는 DNA 서열의 재구성에 사용된다.
다색 이미지 및 그들의 데이터가 획득된 후에, 플로우셀(136)의 상이한 부분이 이미징을 위한 위치로 이동된다. 여기서, 플로우셀(136)이 스테이지 상에 있을 때, 스테이지는 타일 - 이는 플로우셀(136)에 대한 한정된 구획일 수 있음 - 에 의해 이동되고, 이어서 스테핑 및 세틀링 프로세스(2030)가 일어나서 플로우셀(136) 및 임의의 다른 기계적 구성요소가 실질적으로 안정된 상태가 될 수 있게 한 후, 다음 이미징 프로세스가 일어난다. 즉, 플로우셀(136)은 스테이지 상에서 전진되고(스테핑되고), 플로우셀(136)을 이동시킨 후에, 플로우셀(136) 내의 액체가 침강되도록 약간의 시간이 허용된다.
도 21은 본 명세서에 기재된 기법들에 따라 서열분석 작업을 수행하는 방법(2100)을 예시한 흐름도이다. 방법(2100)은 본 명세서에 기재된 조명 시스템(100)을 사용하여 수행될 수 있다. 방법(2100)은 나타낸 것보다 더 많거나 더 적은 작업들을 포함할 수 있다. 방법(2100)의 작업들 중 2개 이상은 달리 지시되지 않는 한 상이한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다른 예의 일부 태양이 예시적인 목적으로 참조될 것이다.
2102에서는, 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드를 포함하는 샘플이 제공된다. 예를 들어, 그러한 뉴클레오티드들은 도 2에서의 플로우셀(136) 내의 샘플 물질의 일부일 수 있다.
2104에서는, 샘플을 제1 형광 염료 및 제2 형광 염료와 접촉시킨다. 제1 형광 염료는 제1 여기 조명광에 응답하여 제1 파장 대역 내의 제1 방출된 광을 방출하고, 제2 형광 염료는 제2 여기 조명광에 응답하여 제2 파장 대역 내의 제2 방출된 광을 방출한다. 예를 들어, 제1 형광 염료는 도 13에 나타낸 스펙트럼(1304)을 갖는 청색 염료를 포함할 수 있는 반면, 제2 염료는 도 13에 나타낸 스펙트럼(1306)을 갖는 녹색 염료일 수 있다.
2106에서는, 다중화된 형광이 동시에 수집된다. 다중화된 형광은 적어도 제1 방출된 광 및 제2 방출된 광을 포함한다. 제1 방출된 광은 제1 파장 대역에 상응하는 제1 색상 채널일 수 있고, 제2 방출된 광은 제2 파장 대역에 상응하는 제2 색상 채널일 수 있다. 예를 들어, 청색 및 녹색 색상 채널이 사용될 수 있다. 다른 예로서, 청색, 녹색 및 적색 색상 채널이 사용될 수 있다. 하나의 염료 방출의 피크(예를 들어, 청색 염료의 것)는 다른 염료 방출의 피크(예를 들어, 녹색 염료의 것)로부터 광 스펙트럼에 걸쳐 충분한 분리를 가져서, 더 낮은 파장의 방출된 광(예를 들어, 청색)이 다른(예를 들어, 녹색) 방출 검출 채널에서 스필링 오버되지 않도록 해야 한다. 이는, 때때로 크로스토크로 지칭되는 것을 야기할 것인데, 여기서는 방출된 광(예를 들어, 스펙트럼의 꼬리)이 다른 색상 채널의 검출기에 의해 검출된다. 스펙트럼이 상대적으로 긴 꼬리를 갖는 경우에, 다른 방출 필터의 시작점을 이동하여 크로스토크의 양을 제거하거나 감소시킬 수 있다.
2108에서는, 제1 및 제2 뉴클레오티드가 확인될 수 있다. 제1 뉴클레오티드는 제1 색상 채널의 제1 파장 대역에 기초하여 확인될 수 있고, 제2 뉴클레오티드는 제2 색상 채널의 제2 파장 대역에 기초하여 확인될 수 있다.
도 22는 본 명세서에 기재된 기법들에 따라 서열분석 작업을 수행하는 방법(2200)을 예시한 흐름도이다. 방법(2200)은 본 명세서에 기재된 조명 시스템(100)을 사용하여 수행될 수 있다. 방법(2200)은 나타낸 것보다 더 많거나 더 적은 작업들을 포함할 수 있다. 방법(2200)의 작업들 중 2개 이상은 달리 지시되지 않는 한 상이한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다른 예의 일부 태양이 예시적인 목적으로 참조될 것이다.
2202에서는, 다중화된 형광 이미지가 캡처될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이는 다수의 유형의 조명광에 의한 염료-태깅된 샘플의 동시 조명, 및 하나 초과의 색상 채널(청색 및 녹색 색상 채널을 포함하지만 이로 한정되지 않음) 내의 방출 광으로부터의 이미지들의 캡처에 기초하여 행해질 수 있다. 예를 들어, 도 18에서의 이미징 시간 블록(들)(1804)이 본 작업(들)에 상응할 수 있다.
2204에서는, 이미지 캡처와 관련된 하나 이상의 작업이 수행될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이것은 카메라 응답 시간, 데이터 전송, 및/또는 오버헤드 작업을 포함할 수 있다. 예를 들어, 카메라-관련 시간 블록(1806)이 본 작업(들)에 상응할 수 있다.
2206에서는, 2202 및 2204에서의 작업이 0회 이상의 반복하여 수행될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 2202와 2204에서의 작업은 다회의 사이클에서 교대하면서 수행될 수 있다. 예를 들어, 각각의 검출기 상에서 6개의 이미지를 획득하기 위하여 6회의 수행이 구현될 수 있다(예를 들어, 도 18 참조).
2208에서는, 다중화된 형광 이미지(들)에 기초하여 뉴클레오티드가 확인될 수 있다. 예를 들어, 각각의 뉴클레오티드는 상응하는 색상 채널에 기초하여 확인될 수 있다.
도 23은 본 명세서에 기재된 기법들에 따라 서열분석 작업을 수행하는 방법(2300)을 예시한 흐름도이다. 방법(2300)은 본 명세서에 기재된 조명 시스템(100)을 사용하여 수행될 수 있다. 방법(2300)은 나타낸 것보다 더 많거나 더 적은 작업들을 포함할 수 있다. 방법(2300)의 작업들 중 2개 이상은 달리 지시되지 않는 한 상이한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다른 예의 일부 태양이 예시적인 목적으로 참조될 것이다.
2302에서는, 오토포커스 프로세스가 개시될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 오토포커스 프로세스(2010)(도 20)가 개시된다.
2304에서는, 하나 이상의 레이저 다이오드가 워밍될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이는 오토포커스 프로세스의 일부이다.
2306에서는, 오토포커스 노출이 수행될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이는 오토포커스 프로세스의 일부이다.
2308에서는, 위치가 계산될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이것은 대물 렌즈를 이동시킬지의 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대물 렌즈를 z-방향을 따라 이동시킬지의 여부, 그리고 얼마나 많이 이동시킬지가 결정될 수 있다. 이는 오토포커스 프로세스의 일부일 수 있다.
2310에서는, 대물 렌즈가 이동될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이는 오토포커스 프로세스의 일부일 수 있다.
2312에서는, 다색 이미지 획득이 개시될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이것은 하나 초과의 다중화된 형광 이미지의 획득을 포함할 수 있다.
2314에서는, 하나 이상의 레이저 다이오드가 워밍될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이는 다색 이미지 획득 프로세스의 일부이다.
2316에서는, 노출 횟수에 대한 결정이 이루어질 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이는 다색 이미지 획득 프로세스의 일부이다.
2318에서는, 노출(들)이 캡처될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 이는 다수의 색상 채널 각각에 대해 별개의 검출기를 사용하여 행해질 수 있다. 예를 들어, 이는 다색 이미지 획득 프로세스의 일부이다.
2320에서는, 하나 이상의 프린지가 이동될 수 있다. 일부 구현 형태에서, SIM이 사용되고, 격자 또는 다른 SIM 구성요소가 이동될 수 있다. 예를 들어, 이동은 어떠한 주기성에 따라 행해질 수 있다. 이는 다색 이미지 획득 프로세스의 일부일 수 있다. 이 작업은 SIM을 포함하지 않는 구현 형태에서는 생략될 수 있다.
2322에서는, 스테핑 및 세틀링 프로세스가 개시될 수 있다.
2324에서는, 미세한 z-방향 이동이 이루어질 수 있다. 이는 스테핑 및 세틀링 공정의 일부일 수 있다.
2326에서는, y-방향 이동이 이루어질 수 있다. 이는 스테핑(예를 들어, 카트리지 또는 다른 샘플 캐리어를 이동시키는 것) 및 세틀링(예를 들어, 캐리어 및 그의 내용물이 안착되게 하여, 다음 캡처에 대한 흔들림 효과(motion effect)를 제거하거나 최소화하도록 하는 것)의 개별 작업들을 포함할 수 있다.
2328에서는, 데이터 전송이 수행될 수 있다. 일부 구현 형태에서, 하나 이상의 다중화된 형광 이미지가 분석을 위해 전송될 수 있다. 예를 들어, 분석은 샘플 내의 뉴클레오티드 확인을 위해 행해질 수 있다.
도 24는 2-채널 서열분석에서 본 명세서에 기재된 염료 I-4로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시한 산포도(2400)이다. 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시되고, 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시된다. 방출(2402)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(2404)은 청색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(2406)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(2408)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(2402 내지 2408) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2402)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2404)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2406)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2408)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(2402 내지 2408)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
도 25는 2-채널 서열분석에서 본 명세서에 기재된 염료 I-5로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시한 산포도(2500)이다. 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시되고, 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시된다. 방출(2502)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(2504)은 청색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(2506)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(2508)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(2502 내지 2508) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2502)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2504)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2506)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2508)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(2502 내지 2508)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
도 26은 2-채널 서열분석에서 본 명세서에 기재된 염료 I-6으로 표지된 완전 기능화된 A 뉴클레오티드의 유용성을 예시한 산포도(2600)이다. 녹색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수직축 상에 표시되고, 청색 채널에서 검출되는 방출된 광의 양은 수평축 상에 표시된다. 방출(2602)은 녹색 채널에서의 실질적인 방출 및 청색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(2604)은 청색 채널에서의 실질적인 방출 및 녹색 채널에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출(2606)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 실질적인 방출에 상응한다. 방출(2608)은 청색 채널 및 녹색 채널 둘 모두에서의 거의 또는 전혀 무방출에 상응한다. 방출들(2602 내지 2608) 각각은 상응하는 뉴클레오티드의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2602)은 티민의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2604)은 시토신의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2606)은 아데닌의 검출에 상응할 수 있다. 예를 들어, 방출(2608)은 구아닌의 검출에 상응할 수 있다. 본 예의 동시 이미징에서, 방출들(2602 내지 2608)은 서로 상대적으로 분리되어 최소한의 또는 무시할 만한 크로스토크를 나타낸다.
III. 예시적인 형광 염료
A. 예시적인 청색 염료
적합한 형광 강도, 형상, 및 형광의 파장 최대치와 같은 개선된 형광 특성을 갖는 형광 염료 분자는 핵산 서열분석의 속도 및 정확도를 개선할 수 있다. 강한 형광 신호는 수계 생물학적 완충액 중에서 그리고 더 높은 온도에서 측정이 이루어질 때 특히 중요한데, 그 이유는, 대부분의 염료의 형광 강도는 그러한 조건 하에서 상당히 더 낮기 때문이다. 더욱이, 염료가 부착된 염기의 성질이 또한 형광 최대치, 형광 강도, 및 다른 스펙트럼 염료 특성에 영향을 준다. 핵염기와 형광 염료 사이의 서열-특이적 상호작용은 형광 염료의 특수 설계에 의해 조정될 수 있다. 형광 염료의 구조의 최적화는 뉴클레오티드 도입의 효율을 개선하고, 서열분석 오류의 수준을 감소시키고, 핵산 서열분석에서의 시약의 사용을 감소시키고, 이에 따라 핵산 서열분석의 비용을 감소시킨다.
일부 광학적 및 기술적 개발은 이미 이미지 품질을 크게 개선해 왔지만, 궁극적으로 불량한 광학 해상도에 의해 제한되었다. 일반적으로, 광학 현미경법의 광학 해상도는 사용되는 광의 파장의 대략 절반에서 이격된 물체들로 제한된다. 그러면, 실제적인 관점에서, 단지 매우 멀리 떨어져서(적어도 200 내지 350 nm) 놓여 있는 물체들만이 광학 현미경법에 의해 해상될 수 있다. 이미지 해상도를 개선하고 표면적 단위당 해상가능한 물체들의 수를 증가시키는 한 가지 방법은 더 짧은 파장의 여기 광을 사용하는 것이다. 예를 들어, 동일한 광학계를 사용하여 광 파장이 Δλ가 약 100 nm만큼 단축되는 경우, 해상도는 더 우수할 것이고(약 Δ 50 nm/(약 15%)), 덜 왜곡된 이미지가 기록될 것이고, 인식가능한 영역 상의 물체들의 밀도는 약 35%로 증가될 것이다.
소정의 핵산 서열분석 방법은 레이저 광을 사용하여 염료-표지된 뉴클레오티드를 여기하고 검출한다. 이들 기기는, 660 nm에서 여기가능한 적절한 염료와 함께, 적색 레이저와 같은 더 긴 파장의 광을 사용한다. 유용한 해상도를 유지하면서 더 조밀하게 패킹된 핵산 서열분석 클러스터들을 검출하기 위하여, 더 짧은 파장의 청색 광원(450 내지 460 nm)이 사용될 수 있다. 이 경우에, 광학 해상도는 더 긴 파장의 적색 형광 염료의 방출 파장에 의해서가 아니라, 오히려, 그 다음으로 가장 긴 파장의 광원에 의해, 예를 들어 532 nm의 녹색 레이저 광에 의해 여기가능한 염료의 방출에 의해 제한될 수 있다.
고리외(exocyclic) 아민-치환된 쿠마린 염료
하기는 고리외 아민-치환된 쿠마린 유도체의 예이다. 이들 화합물은 형광 표지로서 유용하며, 특히 핵산 서열분석 응용에서 뉴클레오티드 표지화에 유용할 수 있다. 일부 태양에서, 이들 염료는 단파장 광에서, 최적으로는 450 내지 460 nm의 파장에서 광을 흡수하며, 450 내지 460 nm의 파장을 갖는 청색 파장 여기 광원이 사용되는 상황에서 특히 유리하다. 청색 파장 여기는 형광 방출의 더 짧은 파장으로 인해 단위 면적당 더 높은 밀도의 특징부의 검출 및 해상도를 가능하게 한다. 그러한 염료들이 뉴클레오티드와 접합하여 사용될 때, 핵산 서열분석 방법 동안 획득된 서열분석 리드의 길이, 강도, 정확도, 및 품질에 있어서의 개선을 확인할 수 있다.
본 명세서에서의 일부 예는 형광 검출 및 합성에 의한 서열분석의 방법에 특히 적합한 고리외 아민-치환된 쿠마린 화합물에 관한 것이다. 화학식 (I)의 구조의 염료 및 이의 유도체, 및 이들의 염이 본 명세서에 기재되어 있다.
Figure pct00001
(I)
일부 태양에서, X는 O이다. 일부 태양에서, X는 S이다. 일부 태양에서, X는 Se이다. 일부 태양에서, X는 NRn이며, 여기서 Rn은 H, C1-6 알킬, 또는 C6-10 아릴이고, 일 태양에서 Rn은 H이다. 일부 추가의 구현 형태에서, m이 1이고; R5가 -CO2H이고; 각각의 R, R1, R2, R4가 H이고; 고리 A가
Figure pct00002
일 때, X는 O, Se, 또는 NRn이다. 일부 추가의 구현 형태에서, n이 0이고; 고리 A가
Figure pct00003
,
Figure pct00004
, 또는
Figure pct00005
이고; 각각의 R, R1, R2, R4가 H이고; X가 O일 때, m은 1, 2, 3, 또는 4이다. 일부 태양에서, n이 0일 때, m은 1, 2, 3, 또는 4이고, 적어도 하나의 R5는 -CO2H이다. 일부 다른 태양에서, n이 1이고, R3이 -CO2H일 때, m은 0이거나 R5는 -CO2H가 아니다.
일부 태양에서, R은 H, 할로, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다. 일 태양에서, R은 H이다. 다른 태양에서, R은 할로이다. 일부 태양에서, R은 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 태양에서, R은 -CO2H이다. 일부 태양에서, R은 -SO3H이다. 일부 태양에서, R은 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 일 태양에서, R은 -SO2NH2이다. 일부 태양에서, R은 -CN이 아니다.
일부 태양에서, R1은 H이다. 일부 태양에서, R1은 할로이다. 일부 태양에서, R1은 -CN이다. 일부 태양에서, R1은 C1-6알킬이다. 일부 태양에서, R1은 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 일 태양에서, R1은 -SO2NH2이다. 일부 태양에서, R1은 -CN이 아니다.
일부 태양에서, R2는 H이다. 일부 태양에서, R2는 할로이다. 일부 태양에서, R2는 -SO3H이다. 일부 태양에서, R2는 선택적으로 치환된 알킬, 예를 들어 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R2는 -CO2H 또는 -SO3H로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬이다.
일부 태양에서, R4는 H이다. 일부 태양에서, R4는 -SO3H이다. 일부 태양에서, R4는 선택적으로 치환된 알킬, 예를 들어 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R4는 -CO2H 또는 -SO3H로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬이다.
일부 태양에서, 고리 A는 3원 내지 7원 단일 헤테로사이클릭 고리이다. 일부 추가의 구현 형태에서, 3원 내지 7원 단일 헤테로사이클릭 고리는 하나의 질소 원자를 함유한다. 일부 태양에서, 고리 A는
Figure pct00006
이다. 일 그러한 구현 형태에서, 고리 A는
Figure pct00007
이다. 일부 태양에서, 고리 A는
Figure pct00008
이다. 일 그러한 구현 형태에서, 고리 A는
Figure pct00009
이다. 일부 태양에서, 고리 A는
Figure pct00010
이다. 일 그러한 구현 형태에서, 고리 A는
Figure pct00011
이다. 본 명세서에 기재된 고리 A의 일부 태양에서, n은 0이다. 본 명세서에 기재된 고리 A의 일부 태양에서, n은 1이다. 본 명세서에 기재된 고리 A의 일부 태양에서, n은 2 또는 3이다. 일부 태양에서, 각각의 R3은 독립적으로 -CO2H, -SO3H, -CO2H 또는 -SO3H로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬, -(CH2)p-CO2Rc, 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 태양에서, R3은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 또는 헥실이다. 다른 태양에서, R3은 치환된 C1-4 알킬이다. 일부 태양에서, R3은 -CO2H 또는 -SO3H로 치환된 C1-4 알킬 또는 C2-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, n은 1이고, R3은 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이다. 일부 추가의 구현 형태에서, Rc는 H 또는 C1-4 알킬이다.
화학식 (I)의
Figure pct00012
모이어티의 벤젠 고리는 R5로 나타낸 치환체에 의해 임의의 1, 2, 3, 또는 4개의 위치에서 선택적으로 치환된다. m이 0인 경우, 벤젠 고리는 비치환된다. m이 1보다 큰 경우, 각각의 R5는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 태양에서, m은 0이다. 다른 태양에서, m은 1이다. 다른 태양에서, m은 2이다. 일부 태양에서, m은 1, 2, 또는 3이고, 각각의 R5는 독립적으로 할로, -CN, -CO2Rf, 아미노, -OH, -SO3H, -SO2NRaRb 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며, 여기서 Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R5는 -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, 또는 -CO2H, -SO3H, 또는 -SO2NH2로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R5는 -(CH2)xCOOH이며, 여기서 x는 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현 형태에서, 각각의 R, R1, R2, R4가 H이고; n이 0이고; m이 1일 때,
Figure pct00013
는 하기 위치에서 치환된다:
Figure pct00014
또는
Figure pct00015
. 일 구현 형태에서, R5는 -CO2H이다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 예에는 X가 O, S 또는 NH이고; 각각의 R, R1, R2, 및 R4가 H이고; 고리 A가
Figure pct00016
또는
Figure pct00017
이고; n이 0 또는 1이고; R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이고; p가 1, 2, 3, 또는 4이고; Rc가 H 또는 C1-6 알킬이고; m이 0 또는 1이고; R5가 할로, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb, 또는 -SO3H 또는 -SO2NRaRb로 치환된 C1-6 알킬인 경우가 포함된다. 일부 구현 형태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, m이 0일 때, n은 1이거나; n이 0일 때, m은 1이다. 일 구현 형태에서, m 및 n 둘 모두는 1이다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 예에는 X가 O, S 또는 NH이고; 각각의 R, R1, R2, 및 R4가 H이고; 고리 A가
Figure pct00018
또는
Figure pct00019
이고; n이 0 또는 1이고; R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이고; p가 1, 2, 3, 또는 4이고; Rc가 H 또는 C1-6 알킬이고; m이 0 또는 1이고; R5가 할로, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb, 또는 -SO3H 또는 -SO2NRaRb로 치환된 C1-6 알킬인 경우가 포함된다. 일부 구현 형태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, m이 0일 때, n은 1이거나; n이 0일 때, m은 1이다. 일 구현 형태에서, m 및 n 둘 모두는 1이다.
화학식 (I)의 화합물의 특정 예에는 X가 O, S 또는 NH이고; 각각의 R, R1, R2, 및 R4가 H이고; 고리 A가
Figure pct00020
또는
Figure pct00021
이고; n이 0 또는 1이고; R3이 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2Rc이고; p가 1, 2, 3, 또는 4이고; Rc가 H 또는 C1-6 알킬이고; m이 0 또는 1이고; R5가 할로, -CO2Rf, -SO3H, -SO2NRaRb, 또는 -SO3H 또는 -SO2NRaRb로 치환된 C1-6 알킬인 경우가 포함된다. 일부 구현 형태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, m이 0일 때, n은 1이거나; n이 0일 때, m은 1이다. 일 구현 형태에서, m 및 n 둘 모두는 1이다.
고리외 아민-치환된 쿠마린 염료의 구체적인 예에는 하기가 포함된다:
Figure pct00022
,
Figure pct00023
,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
,
Figure pct00030
,
Figure pct00031
,
Figure pct00032
,
Figure pct00033
,
Figure pct00034
, 및 이들의 염.
특히 유용한 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 염료로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 카르복시 또는 알킬-카르복시 기를 통해 본 명세서에 개시된 염료 화합물에 부착되어 아미드 또는 알킬-아미드를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 염료 화합물은 화학식 (I)의 R3 또는 R5를 통해 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 구현 형태에서, 화학식 (I)의 R3은 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2H이고, 부착은 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성한다. 일부 구현 형태에서, 화학식 (I)의 R5는 -CO2H이고, 부착은 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성한다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 표지는 링커 모이어티(linker moiety)를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린(7-deaza purine) 염기의 C7 위치에 부착되어 있을 수 있다.
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 블록킹 기(blocking group)를 가질 수 있다. 블록킹 기는 리보스 또는 데옥시리보스 당 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 구현 형태에서, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당의 3' OH 위치에 있다.
3차 아민-치환된 쿠마린 염료
형광 검출 및 합성에 의한 서열분석의 방법에 특히 적합한 3차 아민-치환된 쿠마린 화합물이 본 명세서에 또한 개시된다. 3차 아민-치환된 쿠마린 염료의 구현 형태는 물 또는 극성 용매/완충액 중에서 강한 형광을 나타내면서 탁월한 수용해도를 가지며, 이에 따라 수성 환경에서의 뉴클레오티드 표지화 및 서열분석 응용에 적합하다. 본 명세서에 기재된 구현 형태는 화학식 (II)의 구조의 염료 및 이의 유도체, 및 이들의 염에 관한 것이다.
Figure pct00035
(II)
일부 태양에서, X는 O이다. 일부 태양에서, X는 S이다. 일부 태양에서, X는 Se이다. 일부 태양에서, X는 NRn이며, 여기서 Rn은 H, C1-6 알킬, 또는 C6-10 아릴이고, 일 태양에서 Rn은 H 또는 페닐이다. 일부 추가의 구현 형태에서, m이 1, 2, 3 또는 4이고, R6 중 하나가 -CO2H이고; 각각의 R, R1, R2, R5가 H일 때, 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 C1-6 알킬, -(CH2)p-CO2Rc, -(CH2)q-C(O)NRdRe, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)t-SO2NRaRb이며, 여기서 Rc는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다. 다시 말하면, R6이 -CO2H일 때, R3 또는 R4 중 어느 것도 -CO2H 모이어티를 포함하지 않는다. 일부 다른 구현 형태에서, m이 0이거나 R6이 -CO2H가 아니고; 각각의 R, R1, R2, R5가 H일 때, R3 또는 R4 중 적어도 하나는 -CO2H를 포함한다.
일부 태양에서, R은 H, 할로, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다. 일 태양에서, R은 H이다. 다른 태양에서, R은 할로이다. 일부 태양에서, R은 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 태양에서, R은 -CO2H이다. 일부 태양에서, R은 -SO3H이다. 일부 태양에서, R은 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 일 태양에서, R은 -SO2NH2이다. 일부 태양에서, R은 -CN이 아니다.
일부 태양에서, R1은 H이다. 일부 태양에서, R1은 할로이다. 일부 태양에서, R1은 -CN이다. 일부 태양에서, R1은 C1-6알킬이다. 일부 태양에서, R1은 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 H 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이다. 일 태양에서, R1은 -SO2NH2이다. 일부 태양에서, R1은 -CN이 아니다.
일부 태양에서, R2는 H이다. 일부 태양에서, R2는 할로이다. 일부 태양에서, R2는 -SO3H이다. 일부 태양에서, R2는 선택적으로 치환된 알킬, 예를 들어 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R2는 -CO2H 또는 -SO3H로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬이다.
일부 태양에서, R5는 H이다. 일부 태양에서, R5는 할로이다. 일부 태양에서, R5는 -SO3H이다. 일부 태양에서, R2는 선택적으로 치환된 알킬, 예를 들어 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R5는 -CO2H 또는 -SO3H로 선택적으로 치환된 C1-4 알킬이다.
일부 태양에서, R3은 -(CH2)p-CO2Rc이다. 추가의 구현 형태에서, p는 2, 3, 4, 또는 5이다. Rc는 H 또는 C1-6 알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 아이소프로필 또는 t-부틸이다. 일부 태양에서, R3은 C1-6 알킬이다.
일부 태양에서, R4는 -(CH2)n-SO3H이다. 추가의 구현 형태에서, n은 2, 3, 4, 또는 5이다. 일부 태양에서, R4는 C1-6 알킬이다.
일부 태양에서, R3 및 R4 중 적어도 하나는 C1-6 알킬이다. 일부 태양에서, R3 및 R4 둘 모두는 C1-6 알킬이다. 일부 태양에서, R3이 -(CH2)p-CO2Rc일 때, R4는 -(CH2)n-SO3H이다. 일부 태양에서, R3 및 R4 둘 모두는 -(CH2)p-CO2Rc이다.
화학식 (II)의
Figure pct00036
모이어티의 벤젠 고리는 R6으로 나타낸 치환체에 의해 임의의 1, 2, 3, 또는 4개의 위치에서 선택적으로 치환된다. m이 0인 경우, 벤젠 고리는 비치환된다. m이 1보다 큰 경우, 각각의 R6은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 태양에서, m은 0이다. 다른 태양에서, m은 1이다. 다른 태양에서, m은 2이다. 일부 태양에서, m은 1, 2, 또는 3이고, 각각의 R6은 독립적으로 할로, -CN, -CO2Rf, 아미노, -OH, -SO3H, -SO2NRaRb 또는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬이며, 여기서 Rf는 H 또는 C1-4 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R6은 -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, 또는 -CO2H, -SO3H, 또는 -SO2NH2로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R6은 -(CH2)xCOOH이며, 여기서 x는 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 구현 형태에서, 각각의 R, R1, R2, R5가 H이고; R3 및 R4가 독립적으로 C1-6 알킬, -(CH2)p-CO2Rc, -(CH2)q-C(O)NRdRe, -(CH2)n-SO3H, -(CH2)t-SO2NRaRb이며, 여기서 Rc는 선택적으로 치환된 C1-6 알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고(즉, R3 및 R4 중 어느 것도 -CO2H를 포함하지 않음); m이 1일 때,
Figure pct00037
는 하기 위치에서 치환된다:
Figure pct00038
또는
Figure pct00039
. 일 구현 형태에서, R6은 -CO2H이다. 다른 구현 형태에서, R6은 할로, 예컨대 -Cl이다. 또 다른 구현 형태에서, R6은 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다.
화학식 (II)의 화합물의 특정 예에는 X가 O, S 또는 NH이고; 각각의 R, R1, R2, 및 R5가 H이고; R3이 -(CH2)p-CO2Rc 또는 C1-6 알킬이고; R4가 C1-6 알킬 또는 -(CH2)n-SO3H이고; m이 0 또는 1이고; R6이 -SO3H, -SO2NRaRb, 할로, -CO2H, 또는 -CO2H, -SO3H 또는 -SO2NRaRb로 치환된 C1-6 알킬인 경우가 포함된다. 일부 구현 형태에서, Ra 및 Rb 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R3이 -(CH2)p-CO2Rc일 때, R4는 -(CH2)n-SO3H 또는 C1-6 알킬이다. 일부 추가의 구현 형태에서, R3 및 R4 둘 모두는 C1-6 알킬이다. m이 1일 때,
Figure pct00040
는 하기 위치에서 치환된다:
Figure pct00041
또는
Figure pct00042
. 일 구현 형태에서, R6은 -CO2H이다. 다른 구현 형태에서, R6은 할로, 예컨대 클로로이다. 또 다른 구현 형태에서, R6은 -SO2NRaRb이며, 여기서 Ra 및 Rb 중 적어도 하나 또는 둘 모두는 H 또는 C1-6 알킬이다.
3차 아민-치환된 쿠마린 염료의 구체적인 예에는 하기가 포함된다:
Figure pct00043
,
Figure pct00044
,
Figure pct00045
,
Figure pct00046
,
Figure pct00047
,
Figure pct00048
,
Figure pct00049
,
Figure pct00050
,
Figure pct00051
,
Figure pct00052
,
Figure pct00053
,
Figure pct00054
,
Figure pct00055
,
Figure pct00056
,
Figure pct00057
, 및
Figure pct00058
, 및 이들의 염.
2차 아민 치환을 갖는 추가의 쿠마린 염료에는 하기가 포함된다:
Figure pct00059
,
Figure pct00060
,
Figure pct00061
,
Figure pct00062
,
및
Figure pct00063
, 및 이들의 염.
특히 유용한 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 염료로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 카르복시 또는 알킬-카르복시 기를 통해 본 명세서에 개시된 염료 화합물에 부착되어 아미드 또는 알킬-아미드를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 염료 화합물은 화학식 (II)의 R3, R4 또는 R6을 통해 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착된다. 일부 구현 형태에서, 화학식 (II)의 R3 또는 R4는 -CO2H 또는 -(CH2)p-CO2H이고, 부착은 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성한다. 일부 구현 형태에서, 화학식 (II)의 R6은 -CO2H이고, 부착은 -CO2H 기를 사용하여 아미드를 형성한다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 표지는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치에 부착되어 있을 수 있다.
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 블록킹 기를 가질 수 있다. 블록킹 기는 리보스 또는 데옥시리보스 당 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 구현 형태에서, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당의 3' OH 위치에 있다.
본 명세서에 개시된 화합물은 전형적으로 500 nm 미만의 영역에 있는 광을 흡수한다. 본 명세서에 기재된 화합물 또는 뉴클레오티드는 생물학적 시스템(예를 들어, 이의 프로세스 또는 성분을 포함함)을 검출, 측정, 또는 확인하는 데 사용될 수 있다. 이들 화합물 또는 뉴클레오티드를 사용할 수 있는 일부 기법에는 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 세포 검정(예를 들어, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 검정(예를 들어, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)이 포함된다. 이러한 사용은 자동화 서열분석 기기와 같은 특정 기법을 수행하기 위한 자동화 기기 상에서 행해질 수 있다. 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2개의 레이저를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물을 합성하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 발명에 따른 염료는 다양한 각종 적합한 출발 물질로부터 합성될 수 있다. 쿠마린 염료를 제조하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "공유적으로 부착된" 또는 "공유 결합된"은 원자들 사이에 전자쌍을 공유하는 것을 특징으로 하는 화학 결합의 형성을 지칭한다. 예를 들어, 공유적으로 부착된 중합체 코팅은, 다른 수단, 예를 들어 접착 또는 정전기 상호작용을 통한 표면에 대한 부착과 비교하여, 기재의 작용화된 표면과 화학 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다. 표면에 공유적으로 부착된 중합체는 또한 공유 부착 이외의 수단을 통해 결합될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 원소 주기율표의 7열의 방사선-안정성(radio-stable) 원자, 예를 들어 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 중 임의의 하나를 의미하며, 불소 및 염소가 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알킬"은 완전 포화된(즉, 이중 또는 삼중 결합을 함유하지 않는) 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알킬 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다(본 명세서에 나타날 때마다, "1 내지 20"과 같은 수치 범위는 주어진 범위 내의 각각의 정수를 지칭하며; 예를 들어, "1 내지 20개의 탄소 원자"는 알킬 기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자 등, 종점을 포함하여 최대 20개의 탄소 원자로 이루어질 수 있음을 의미하지만, 본 정의는 또한 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 경우도 포함한다). 알킬 기는 또한 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알킬일 수 있다. 알킬 기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬일 수 있다. 알킬 기는 "C1-4알킬" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C1-6알킬"은 알킬 사슬 내에 1 내지 6개의 탄소 원자가 있음을 나타내는데, 즉 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소-부틸, sec-부틸, 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알킬 기는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함하지만 결코 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알콕시"는 화학식 -OR(여기서, R은 상기에 정의된 바와 같은 알킬임)을 지칭하는 것으로, 이는, 예를 들어 "C1-9 알콕시"이며, 이에는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시(아이소프로폭시), n-부톡시, 아이소-부톡시, sec-부톡시, 및 tert-부톡시 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알케닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알케닐"의 경우를 또한 포함한다. 알케닐 기는 또한 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알케닐일 수 있다. 알케닐 기는 또한 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알케닐일 수 있다. 알케닐 기는 "C2-6알케닐" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C2-6알케닐"은 알케닐 사슬 내에 2 내지 6개의 탄소 원자가 존재함을 나타내며, 즉, 알케닐 사슬은 에테닐, 프로펜-1-일, 프로펜-2-일, 프로펜-3-일, 부텐-1-일, 부텐-2-일, 부텐-3-일, 부텐-4-일, 1-메틸-프로펜-1-일, 2-메틸-프로펜-1-일, 1-에틸-에텐-1-일, 2-메틸-프로펜-3-일, 부타-1,3-다이에닐, 부타-1,2,-다이에닐, 및 부타-1,2-다이엔-4-일로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알케닐 기에는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 및 헥세닐 등이 포함되지만 결코 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알키닐 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알키닐"의 경우를 또한 포함한다. 알키닐 기는 또한 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 알키닐일 수 있다. 알키닐 기는 또한 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알키닐일 수 있다. 알키닐 기는 "C2-6알키닐" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 단지 예로서, "C2-6알키닐"은 알키닐 사슬 내에 2 내지 6개의 탄소 원자가 있음을 나타내는데, 즉 알키닐 사슬은 에티닐, 프로핀-1-일, 프로핀-2-일, 부틴-1-일, 부틴-3-일, 부틴-4-일, 및 2-부티닐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 전형적인 알키닐 기에는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 및 헥시닐 등이 포함되지만 결코 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로알킬"은 사슬 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이로 한정되지 않는 탄소 이외의 원소를 함유하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 사슬을 지칭한다. 헤테로알킬 기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로알킬"의 경우를 또한 포함한다. 헤테로알킬 기는 또한 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 헤테로알킬일 수 있다. 헤테로알킬 기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 헤테로알킬일 수 있다. 헤테로알킬 기는 "C1-6헤테로알킬" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 헤테로알킬 기는 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 단지 예로서, "C4-6헤테로알킬"은 헤테로알킬 사슬 내에 4 내지 6개의 탄소 원자, 그리고 추가적으로 사슬의 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자가 존재함을 나타낸다.
용어 "방향족"은 컨쥬게이트된 파이 전자 시스템을 갖는 고리 또는 고리 시스템을 지칭하며, 카르보사이클릭 방향족 기(예를 들어, 페닐) 및 헤테로사이클릭 방향족 기(예를 들어, 피리딘) 둘 모두를 포함한다. 이 용어는, 전체 고리 시스템이 방향족이라면, 모노사이클릭 또는 융합-고리 폴리사이클릭(즉, 인접한 원자쌍을 공유하는 고리) 기를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "아릴"은 고리 골격 내에 탄소만을 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 아릴이 고리 시스템일 때, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 아릴 기는 6 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "아릴"의 경우를 또한 포함한다. 일부 구현 형태에서, 아릴 기는 6 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 아릴 기는 "C6-10 아릴", "C6 또는 C10 아릴", 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 아릴 기의 예에는 페닐, 나프틸, 아줄레닐, 및 안트라세닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
"아르알킬" 또는 "아릴알킬"은, 치환체로서, 알킬렌 기를 통해 연결된 아릴 기로서, 이는, 예를 들어 "C7-14 아르알킬" 등이며, 이에는 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 및 나프틸알킬이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 경우에, 알킬렌 기는 저급 알킬렌 기(즉, C1-6 알킬렌 기)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로아릴"은 고리 골격 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이로 한정되지 않는 탄소 이외의 원소를 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 헤테로아릴이 고리 시스템일 때, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴 기는 5 내지 18개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로아릴"의 경우를 또한 포함한다. 일부 구현 형태에서, 헤테로아릴 기는 5 내지 10개의 고리 구성원 또는 5 내지 7개의 고리 구성원을 갖는다. 헤테로아릴 기는 "5원 내지 7원 헤테로아릴", "5원 내지 10원 헤테로아릴", 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 헤테로아릴 고리의 예에는 푸릴, 티에닐, 프탈라지닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 아이소옥사졸릴, 아이소티아졸릴, 트라이아졸릴, 티아다이아졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 트라이아지닐, 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤조티아졸릴, 인돌릴, 아이소인돌릴, 및 벤조티에닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
"헤테로아르알킬" 또는 "헤테로아릴알킬"은, 치환체로서, 알킬렌 기를 통해 연결된 헤테로아릴 기이다. 예에는 2-티에닐메틸, 3-티에닐메틸, 푸릴메틸, 티에닐에틸, 피롤릴알킬, 피리딜알킬, 아이소옥사졸릴알킬, 및 이미다졸릴알킬이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 경우에, 알킬렌 기는 저급 알킬렌 기(즉, C1-6 알킬렌 기)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "카르보사이클릴"은 고리 시스템 골격 내에 단지 탄소 원자만을 함유하는 비방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 카르보사이클릴이 고리 시스템인 경우에는, 2개 이상의 고리가 융합된, 가교된 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 카르보사이클릴은 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니면 임의의 포화도를 가질 수 있다. 따라서, 카르보사이클릴에는 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 사이클로알키닐이 포함된다. 카르보사이클릴 기는 3 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "카르보사이클릴"의 경우를 또한 포함한다. 카르보사이클릴 기는 또한 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 중간 크기 카르보사이클릴일 수 있다. 카르보사이클릴 기는 또한 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 카르보사이클릴일 수 있다. 카르보사이클릴 기는 "C3-6카르보사이클릴" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 카르보사이클릴 고리의 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 2,3-다이하이드로-인덴, 바이사이클[2.2.2]옥타닐, 아다만틸, 및 스피로 [2.2]노나닐이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "사이클로알킬"은 완전 포화 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 예에는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 고리 골격 내에 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 비방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 헤테로사이클릴은 융합된, 가교된 또는 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 헤테로사이클릴은 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리가 방향족이 아니면 임의의 포화도를 가질 수 있다. 헤테로원자(들)는 고리 시스템 내의 비방향족 또는 방향족 고리 중 어느 하나에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 3 내지 20개의 고리 구성원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "헤테로사이클릴"의 경우를 또한 포함한다. 헤테로사이클릴 기는 또한 3 내지 10개의 고리 구성원을 갖는 중간 크기 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 또한 3 내지 6개의 고리 구성원을 갖는 헤테로사이클릴일 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 "3원 내지 6원 헤테로사이클릴" 또는 유사한 명칭으로 지정될 수 있다. 바람직한 6원 모노사이클릭 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는 O, N 또는 S 중 1개 내지 최대 3개로부터 선택되며, 바람직한 5원 모노사이클릭 헤테로사이클릴에서, 헤테로원자(들)는 O, N, 또는 S로부터 선택되는 1개 또는 2개의 헤테로원자로부터 선택된다. 헤테로사이클릴 고리의 예에는 아제피닐, 아크리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 다이옥솔라닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 모르폴리닐, 옥시라닐, 옥세파닐, 티에파닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 다이옥소피페라지닐, 피롤리디닐, 피롤리도닐, 피롤리디오닐, 4-피페리도닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 1,3-다이옥시닐, 1,3-다이옥사닐, 1,4-다이옥시닐, 1,4-다이옥사닐, 1,3-옥사티아닐, 1,4-옥사티이닐, 1,4-옥사티아닐, 2H-1,2-옥사지닐, 트라이옥사닐, 헥사하이드로-1,3,5-트라이아지닐, 1,3-다이옥솔릴, 1,3-다이옥솔라닐, 1,3-다이티올릴, 1,3-다이티올라닐, 아이소옥사졸리닐, 아이소옥사졸리디닐, 옥사졸리닐, 옥사졸리디닐, 옥사졸리디노일, 티아졸리닐, 티아졸리디닐, 1,3-옥사티올라닐, 인돌리닐, 아이소인돌리닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로-1,4-티아지닐, 티아모르폴리닐, 다이하이드로벤조푸라닐, 벤즈이미다졸리디닐, 및 테트라하이드로퀴놀린이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
"O-카르복시" 기는 "-OC(=O)R" 기를 지칭하며, 여기서 R은 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"C-카르복시" 기는 "-C(=O)OR" 기를 지칭하며, 여기서 R은 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 비제한적인 예에는 카르복실(즉, -C(=O)OH)이 포함된다.
"설포닐" 기는 "-SO2R" 기를 지칭하며, 여기서 R은 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"설피노" 기는 "-S(=O)OH" 기를 지칭한다.
"S-설폰아미도" 기는 "-SO2NRARB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"N-설폰아미도" 기는 "-N(RA)SO2RB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 Rb는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"C-아미도" 기는 "-C(=O)NRARB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"N-아미도" 기는 "-N(RA)C(=O)RB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다.
"아미노" 기는 "-NRARB" 기를 지칭하며, 여기서 RA 및 RB는 각각 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 및 3원 내지 10원 헤테로사이클릴로부터 선택되며, 이는 본 명세서에 정의된 바와 같다. 비제한적인 예에는 유리 아미노(즉, -NH2)가 포함된다.
"아미노알킬" 기는 알킬렌 기를 통해 연결된 아미노 기를 지칭한다.
"알콕시알킬" 기는 알킬렌 기를 통해 연결된 알콕시 기를 지칭하는 것으로, 이는, 예를 들어 "C2-8 알콕시알킬" 등이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 치환된 기는 비치환된 모 기(parent group) 내의 하나 이상의 수소 원자를 다른 원자 또는 기로 교환한 것으로부터 유도된다. 달리 지시되지 않는 한, 기가 "치환된" 것으로 간주될 때, 그 기는 C1-C6 알킬, C1-C6 알케닐, C1-C6 알키닐, C1-C6 헤테로알킬, C3-C7 카르보사이클릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), C3-C7-카르보사이클릴-C1-C6-알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 3원 내지 10원 헤테로사이클릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 3원 내지 10원 헤테로사이클릴-C1-C6-알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 아릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 아릴(C1-C6)알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 5원 내지 10원 헤테로아릴(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 5원 내지 10원 헤테로아릴(C1-C6)알킬(할로, C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, C1-C6 할로알킬, 및 C1-C6 할로알콕시로 선택적으로 치환됨), 할로, -CN, 하이드록시, C1-C6 알콕시, C1-C6 알콕시(C1-C6)알킬(즉, 에테르), 아릴옥시, 설피드릴(메르캅토), 할로(C1-C6)알킬(예를 들어, -CF3), 할로(C1-C6)알콕시(예를 들어, -OCF3), C1-C6 알킬티오, 아릴티오, 아미노, 아미노(C1-C6)알킬, 니트로, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카르복시, O-카르복시, 아실, 시아네이토, 아이소시아네이토, 티오시아네이토, 아이소티오시아네이토, 설피닐, 설포닐, -SO3H, 설피노, -OSO2C1-4알킬, 및 옥소(=O)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환된 것으로 의미된다. 기가 "선택적으로 치환된"으로 기재되어 있는 경우에는 언제든지, 그 기는 상기 치환체로 치환될 수 있다.
일부 구현 형태에서, 치환된 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 기는 할로, -CN, SO3 -, -SO3H, -SRA, -ORA, -NRBRC, oxo, -CONRBRC, -SO2NRBRC, -COOH, 및 -COORB로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체로 치환되며, 여기서 RA, RB 및 RC는 각각 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 및 치환된 아릴로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 화합물은 몇몇 메소머 형태(mesomeric form)로 나타낼 수 있다. 단일 구조가 그려져 있는 경우, 관련 메소머 형태들 중 임의의 것이 의도된다. 본 명세서에 기재된 쿠마린 화합물은 단일 구조로 나타내지만, 관련된 메소머 형태들 중 임의의 것으로 동일하게 나타낼 수 있다. 일부 메소머 구조가 화학식 (I)에 대해 하기에 나타나 있다:
Figure pct00064
일부 메소머 구조가 화학식 (II)에 대해 하기에 나타나 있다:
Figure pct00065
본 명세서에 기재된 화합물의 단일 메소머 형태가 나타나 있는 각각의 경우에, 대안적인 메소머 형태가 동일하게 고려된다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 명세서에 기재된 화합물은 이온화된 형태, 예를 들어 -CO2 - 또는 -SO3 -로 존재할 수 있다. 화합물이 양으로 또는 음으로 하전된 치환기, 예를 들어 SO3 -를 함유하는 경우, 그것은 또한, 화합물이 전체적으로 중성이 되게 하는 음으로 또는 양으로 하전된 반대이온을 함유할 수 있다. 다른 태양에서, 화합물은 염 형태로 존재할 수 있으며, 여기서는 반대이온이 짝산 또는 짝염기에 의해 제공된다.
소정의 라디칼 명명 규약은 문맥에 따라 모노-라디칼 또는 다이-라디칼 중 어느 하나를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 치환체가 분자의 나머지 부분에 대한 것으로 2개의 부착점을 필요로 하는 경우, 치환체는 다이-라디칼인 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 부착점을 필요로 하는 알킬로 확인되는 치환체는 다이-라디칼, 예컨대 -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- 등을 포함한다. 다른 라디칼 명명 규약은 라디칼이 "알킬렌" 또는 "알케닐렌"과 같은 다이-라디칼임을 명확하게 나타낸다.
2개의 "인접한" R 기가 "이들이 부착되어 있는 원자와 함께" 고리를 형성하는 것으로 언급되어 있을 때, 이는 원자들의 집합적 단위, 개재 결합, 및 2개의 R 기가 언급된 고리임을 의미한다. 예를 들어, 하기 하위구조가 존재하고:
Figure pct00066
R1 및 R2는 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 것으로 정의되거나, R1과 R2 는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 아릴 또는 카르보사이클릴을 형성하는 경우, 이는, R1 및 R2는 수소 또는 알킬로부터 선택될 수 있거나, 또는 대안적으로, 이 하위구조가 하기 구조를 가짐을 의미한다:
Figure pct00067
(상기 식에서, A는 표현된 이중 결합을 함유하는 아릴 고리 또는 카르보사이클릴임).
표지된 뉴클레오티드
본 발명의 일 태양에 따르면, 기질 모이어티(substrate moiety)에 부착하기에 적합한, 특히 기질 모이어티에 대한 부착을 가능하게 하는 링커 기를 포함하는 염료 화합물이 제공된다. 기질 모이어티는 사실상 본 발명의 염료가 접합될 수 있는 임의의 분자 또는 물질일 수 있으며, 비제한적인 예로서, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 리간드, 입자, 고체 표면, 유기 및 무기 중합체, 염색체, 핵, 살아있는 세포, 및 이들의 조합 또는 집합체를 포함할 수 있다. 염료는 소수성 인력, 이온성 인력, 및 공유 부착을 포함하는 다양한 수단에 의해 선택적인 링커에 의해 접합될 수 있다. 일부 태양에서, 염료는 공유 부착에 의해 기질에 접합된다. 더 특히, 공유 부착은 링커 기에 의한 것이다. 일부 경우에, 그러한 표지된 뉴클레오티드는 "변형된 뉴클레오티드"로도 지칭된다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 염료들 중 하나 이상으로 표지된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 접합체(변형된 뉴클레오티드)를 추가로 제공한다. 표지된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는, 비제한적인 예로서, PCR 증폭, 등온 증폭, 고체상 증폭, 폴리뉴클레오티드 서열분석(예를 들어, 고체상 서열분석), 닉 번역(nick translation) 반응 등에서와 같이 효소적 합성에 의해 형성된 폴리뉴클레오티드를 표지화하는 데 유용하다.
생체분자에 대한 부착은 화학식 (I)의 화합물의 R, R1, R2, R3, R4, R5, 또는 X 위치를 통해 이루어질 수 있다. 일부 태양에서, 연결은 화학식 (I)의 R3 또는 R5 기를 통해 이루어진다. 생체분자에 대한 부착은 화학식 (II)의 화합물의 R, R1, R2, R3, R4, R5, R6, 또는 X 위치를 통해 이루어질 수 있다. 일부 태양에서, 연결은 화학식 (II)의 R3, R4 또는 R6 기를 통해 이루어진다. 일부 구현 형태에서, 치환기는 카르복실 또는 치환된 알킬이며, 예를 들어 -CO2H, 또는 카르복실 기의 활성화된 형태, 예를 들어 아미드 또는 에스테르 - 이것은 생체분자의 아미노 또는 하이드록실 기에 대한 부착에 사용될 수 있음 - 로 치환된 알킬이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화된 에스테르"는 온화한 조건에서, 예를 들어 아미노 기를 함유하는 화합물과 반응할 수 있는 카르복실 기 유도체를 지칭한다. 활성화된 에스테르의 비제한적인 예에는 p-니트로페닐, 펜타플루오로페닐 및 석신이미도 에스테르가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 구현 형태에서, 염료 화합물은 뉴클레오티드 염기를 통해 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 표지는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치에 부착되어 있을 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 3'-OH 블록킹 기를 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 형광 염료의 특히 유용한 용도는 생체분자, 예를 들어 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 표지화하기 위한 것이다. 본 출원의 일부 구현 형태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 형광 화합물로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
링커
본 명세서에 개시된 바와 같은 염료 화합물은 기질 또는 다른 분자에 대한 이 화합물의 공유 부착을 위한 치환체 위치들 중 하나에 반응성 링커 기를 포함할 수 있다. 반응성 연결기는 결합(예를 들어, 공유 결합 또는 비공유 결합), 특히 공유 결합을 형성할 수 있는 모이어티이다. 특정 구현 형태에서, 링커는 절단가능한 링커일 수 있다. 용어 "절단가능한 링커"의 사용은 전체 링커가 제거될 것이 요구되는 것을 내포하는 것으로 의미되지 않는다. 절단 부위는 링커의 일부가 절단 후 염료 및/또는 기질 모이어티에 부착된 채로 남아 있는 것을 보장하는 링커 상의 위치에 위치될 수 있다. 절단가능한 링커는, 비제한적인 예로서, 친전자적으로 절단가능한 링커, 친핵적으로 절단가능한 링커, 광절단성 링커일 수 있으며, 이들은 환원성 조건(예를 들어, 다이설파이드 또는 아지드 함유 링커), 산화성 조건 하에서 절단가능하고, 안전성-캐치 링커(safety-catch linker)의 사용을 통해 절단가능하고, 제거 기전에 의해 절단가능하다. 염료 화합물을 기질 모이어티에 부착하기 위한 절단가능한 링커의 사용은 표지를, 필요하다면, 검출 후에 제거하여, 하류 단계들에서 어떠한 간섭 신호도 피할 수 있음을 보장한다.
유용한 링커 기가 국제 특허 출원 공개 WO 2004/018493호(본 명세서에 참고로 포함됨)에서 찾아질 수 있으며, 이의 예에는 전이 금속 및 적어도 부분적으로 수용성인 리간드로부터 형성된 수용성 전이 금속 촉매 또는 수용성 포스핀을 사용하여 절단될 수 있는 링커를 포함한다. 수용액 중에서, 후자는 적어도 부분적으로 수용성인 전이 금속 착물을 형성한다. 그러한 절단가능한 링커는 본 명세서에 기재된 염료와 같은 표지에 뉴클레오티드의 염기를 연결하는 데 사용될 수 있다.
특정 링커는 국제 특허 출원 공개 WO 2004/018493호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것들, 예컨대 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들을 포함한다:
Figure pct00068
Figure pct00069
(상기 식에서, X는 O, S, NH 및 NQ를 포함하는 군으로부터 선택되며, 여기서 Q는 C1-10 치환 또는 비치환된 알킬 기이고, Y는 O, S, NH 및 N(알릴)을 포함하는 군으로부터 선택되고, T는 수소 또는 C1-C10 치환 또는 비치환된 알킬 기이고, *는 모이어티가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 나머지 부분에 연결되는 경우를 나타냄). 일부 태양에서, 링커는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 염료 화합물과 같은 표지에 뉴클레오티드의 염기를 연결한다.
링커의 추가의 예에는 미국 특허 출원 공개 제2016/0040225호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것들, 예컨대 하기 화학식의 모이어티를 포함하는 것들이 포함된다:
Figure pct00070
Figure pct00071
(상기 식에서, *는 모이어티가 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 나머지 부분에 연결되는 경우를 나타냄). 본 명세서에 예시된 링커 모이어티는 뉴클레오티드/뉴클레오시드와 표지 사이의 전체 또는 부분 링커 구조를 포함할 수 있다.
특정 구현 형태에서, 형광 염료(형광단)와 구아닌 염기 사이의 링커의 길이는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 스페이서 기를 도입함으로써 변경될 수 있으며, 그럼으로써 당업계에 알려진 다른 결합을 통해 구아닌 염기에 부착된 동일한 형광단과 비교하여 형광 강도를 증가시킬 수 있다. 일부 링커 및 그의 특성은 국제 특허 출원 공개 WO 2007/020457호(본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 링커의 설계, 특히 그의 증가된 길이는, DNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 때, 구아노신 뉴클레오티드의 구아닌 염기에 부착된 형광단의 밝기의 개선을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 이러한 염료가 구아닌-함유 뉴클레오티드에 부착된 형광 염료 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 분석 방법에 사용하기 위한 것일 때, 링커는 화학식 -((CH2)2O)n-(여기서, n은 2 내지 50의 정수임)의 스페이서 기를 포함하는 경우에 유리하며, 이는 국제 특허 출원 공개 제2007/020457호에 기재된 바와 같다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 당 또는 핵염기 상의 부위에 표지될 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, "뉴클레오티드"는 질소성 염기(nitrogenous base), 당, 및 하나 이상의 포스페이트 기로 이루어진다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉 리보스에 존재하는 하이드록실 기가 결여되어 있는 당이다. 질소성 염기는 퓨린 또는 피리미딘의 유도체이다. 퓨린은 아데닌(A) 및 구아닌(G)이고, 피리미딘은 시토신(C) 및 티민(T), 또는 RNA와 관련해서는, 우라실(U)이다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다. 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오시드의 포스페이트 에스테르이며, 이때 에스테르화는 당의 C-3 또는 C-5에 부착된 하이드록실 기 상에서 발생한다. 뉴클레오티드는 통상 모노, 다이 또는 트라이포스페이트이다.
"뉴클레오시드"는 뉴클레오티드와 구조적으로 유사하지만 포스페이트 모이어티가 누락되어 있다. 뉴클레오시드 유사체의 한 예는 표지가 염기에 연결되어 있고 당 분자에 부착된 포스페이트 기가 없는 것일 것이다.
염기는 통상 퓨린 또는 피리미딘으로 지칭되지만, 당업자는 왓슨-크릭 염기쌍 형성(Watson-Crick base pairing)을 거치는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 능력을 변경시키지 않는 유도체 및 유사체가 이용가능하다는 것을 인식할 것이다. "유도체" 또는 "유사체"는, 코어 구조가 모 화합물의 코어 구조와 동일하거나 근접하게 유사하지만, 예를 들어 유도체 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 다른 분자에 연결될 수 있게 하는 상이한 또는 추가적인 측기와 같은 화학적 또는 물리적 변형을 갖는 화합물 또는 분자를 의미한다. 예를 들어, 염기는 데아자퓨린일 수 있다. 특정 구현 형태에서, 유도체는 왓슨-크릭 쌍형성을 거칠 수 있어야 한다. "유도체" 및 "유사체"는 또한, 예를 들어, 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 갖는 합성 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유도체를 포함한다. 그러한 유도체 및 유사체는, 예를 들어 문헌[Scheit, Nucleotide analogs (John Wiley & Son, 1980) 및 Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에 논의되어 있다. 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 결합 등을 포함한 변형된 포스포다이에스테르 결합을 포함할 수 있다.
염료는, 예를 들어 링커를 통해 뉴클레오티드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 구현 형태에서, 왓슨-크릭 염기쌍 형성은 생성된 유사체에 대해 여전히 수행될 수 있다. 특정 핵염기 표지화 부위는 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치를 포함한다. 전술된 바와 같이, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드에 염료를 공유적으로 부착하는 데 링커 기가 사용될 수 있다.
특정 구현 형태에서, 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 효소적으로 도입가능하고 효소적으로 신장가능할 수 있다. 따라서, 링커 모이어티는, 화합물이 핵산 복제 효소에 의한 뉴클레오티드의 전체적인 결합 및 인식을 크게 방해하지 않도록 뉴클레오티드를 화합물에 연결하기에 충분한 길이를 가질 수 있다. 따라서, 링커는 또한 스페이서 단위를 포함할 수 있다. 스페이서는, 예를 들어 절단 부위 또는 표지로부터 뉴클레오티드 염기를 이격시킨다.
본 명세서에 기재된 염료로 표지된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00072
상기 식에서, Dye는 염료 화합물이고; B는 핵염기, 예컨대 우라실, 티민, 시토신, 아데닌, 구아닌 등이고; L은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 선택적인 링커 기이고; R'은 H, 모노포스페이트, 다이포스페이트, 트라이포스페이트, 티오포스페이트, 포스페이트 에스테르 유사체, 반응성 인-함유 기에 부착된 -O-, 또는 블록킹 기에 의해 보호된 -O-일 수 있고; R"은 H, OH, 포스포르아미다이트, 또는 3'-OH 블록킹 기일 수 있고, R"'은 H 또는 OH이다. R"이 포스포르아미다이트인 경우, R'은 산-절단가능한 하이드록실 보호기이며, 이는 자동화 합성 조건 하에서 후속 단량체 커플링을 가능하게 한다.
특정 구현 형태에서, 이러한 블록킹 기는 염료 화합물과 분리되어 있고 독립적이며, 즉 그것에 부착되어 있지 않다. 대안적으로, 염료는 3'-OH 블록킹 기의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 따라서, R"은 염료 화합물을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있는 3'-OH 블록킹 기일 수 있다.
또 다른 대안적인 구현 형태에서, 펜토스 당의 3' 탄소 상에는 블록킹 기가 없으며, 염기에 부착된 염료(또는 염료 및 링커 작제물)는, 예를 들어, 추가의 뉴클레오티드의 도입에 대한 블록으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조를 가질 수 있다. 따라서, 이러한 블록은, 염료가 당의 3' 위치에 부착되어 있든 그렇지 않든 간에, 입체 장애로 인한 것일 수 있거나 크기, 전하 및 구조의 조합으로 인한 것일 수 있다.
또 다른 대안적인 구현 형태에서, 블록킹 기는 펜토스 당의 2' 또는 4' 탄소 상에 존재하며, 추가의 뉴클레오티드의 도입에 대한 블록으로서 작용하기에 충분한 크기 또는 구조를 가질 수 있다.
블록킹 기의 사용은 중합이 제어될 수 있게 하는데, 이는, 예를 들어 변형된 뉴클레오티드가 도입될 때 신장을 정지시킴으로써 이루어진다. 블록킹 효과가, 예를 들어, 비제한적인 예로서, 화학적 조건을 변화시킴으로써 또는 화학적 블록의 제거에 의해 가역적인 경우, 신장이 소정의 지점에서는 정지되고, 이어서 계속되게 할 수 있다.
다른 특정 구현 형태에서, 3'-OH 블록킹 기는 국제 특허 출원 공개 WO 2004/018497호 및 WO 2014/139596호에 개시된 모이어티를 포함할 것이며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 예를 들어, 블록킹 기는 아지도메틸(-CH2N3) 또는 치환된 아지도메틸(예를 들어, -CH(CHF2)N3 또는 CH(CH2F)N3), 또는 알릴일 수 있다.
특정 구현 형태에서, 링커(염료와 뉴클레오티드 사이에 존재함) 및 블록킹 기 둘 모두가 존재하며, 별개의 모이어티이다. 특정 구현 형태에서, 링커 및 블록킹 기는 둘 모두 실질적으로 유사한 조건 하에서 절단가능하다. 따라서, 염료 화합물 및 블록킹 기 둘 모두를 제거하는 데 단지 단일 처리만이 요구될 것이기 때문에 탈보호 및 탈블록킹 공정이 더 효율적일 수 있다. 그러나, 일부 구현 형태에서 링커 및 블록킹 기는 유사한 조건 하에서 절단가능할 필요가 없으며, 대신에 별개의 조건 하에서 개별적으로 절단가능하다.
본 발명은 또한 염료 화합물을 도입시킨 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 포스포다이에스테르 결합으로 연결된 데옥시리보뉴클레오티드들 또는 리보뉴클레오티드들로 각각 구성된 DNA 또는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 변형된(예를 들어, 염료 화합물로 표지된) 뉴클레오티드와 조합된, 본 명세서에 기재된 표지된 뉴클레오티드 이외의 천연 발생 뉴클레오티드, 천연 비발생(또는 변형된) 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한 비천연 골격 결합 및/또는 비-뉴클레오티드 화학적 변형을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 표지된 뉴클레오티드를 포함하는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드의 혼합물로 구성된 키메라 구조가 또한 고려된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비제한적인 표지된 뉴클레오티드는 하기를 포함한다:
Figure pct00073
Figure pct00074
(상기 식에서, L은 링커를 나타내고, R은 전술된 바와 같은 당 잔기를 나타냄).
일부 구현 형태에서, 비제한적인 형광 염료 접합체가 하기에 나타나 있다:
Figure pct00075
Figure pct00076
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키트
본 발명은 또한 염료로 표지된 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 그러한 키트는 일반적으로 적어도 하나의 추가의 성분과 함께 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 것이다. 추가의 성분(들)은 본 명세서에 기재된 방법에서 또는 하기 실시예 섹션에서 확인된 성분들 중 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 키트 내로 조합될 수 있는 성분들의 일부 비제한적인 예가 하기에 기재된다.
특정 구현 형태에서, 키트는 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드와 함께 본 명세서에 기재된 임의의 염료로 표지된 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 비표지 또는 천연 뉴클레오티드 및/또는 형광 표지된 뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합과 조합되어 공급될 수 있다. 따라서, 키트는 본 발명에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 및 다른, 예를 들어 종래 기술의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드들의 조합은 별개의 개별 성분들(예를 들어, 베셀(vessel) 또는 튜브당 하나의 뉴클레오티드 유형)로서 또는 뉴클레오티드 혼합물(예를 들어, 동일한 베셀 또는 튜브 내에서 혼합된 2개 이상의 뉴클레오티드)로서 제공될 수 있다.
키트가 염료 화합물로 표지된 복수의, 특히 2개, 또는 3개, 또는 더 특히는 4개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 이들 상이한 뉴클레오티드들은 상이한 염료 화합물들로 표지될 수 있거나, 하나는 염료 화합물을 함유하지 않아서 암색(dark)일 수 있다. 상이한 뉴클레오티드들이 상이한 염료 화합물들로 표지되는 경우, 이러한 염료 화합물들은 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료라는 것이 상기 키트의 특징이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료"는 2개 이상의 그러한 염료가 하나의 샘플 내에 존재할 때 형광 검출 장비(예를 들어, 시판 모세관-기반 DNA 서열분석 플랫폼)에 의해 구별될 수 있는 파장에서 형광 에너지를 방출하는 형광 염료를 지칭한다. 형광 염료 화합물들로 표지된 2개의 변형된 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급될 때, 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료들이, 예를 들어 동일한 레이저에 의해 동일한 파장에서 여기될 수 있다는 것이 일부 구현 형태의 특징이다. 형광 염료 화합물들로 표지된 4개의 변형된 뉴클레오티드가 키트 형태로 공급될 때, 스펙트럼적으로 구별가능한 형광 염료들 중 2개가 모두 하나의 파장에서 여기될 수 있고, 나머지 다른 2개의 스펙트럼적으로 구별가능한 염료가 모두 다른 파장에서 여기될 수 있다는 것이 일부 구현 형태의 특징이다. 특정 여기 파장은 488 nm 및 532 nm일 수 있다.
일 구현 형태에서, 키트는 본 발명의 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드 및 제2 염료로 표지된 제2 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 이들 염료는 적어도 10 nm, 특히 20 nm 내지 50 nm의 흡광도 최대치의 차이를 갖는다. 더 특히는, 이들 2개의 염료 화합물은 15 내지 40 nm의 스토크스 이동(Stokes shift)을 가지며, 여기서 "스토크스 이동"은 피크 흡수 파장과 피크 방출 파장 사이의 거리이다.
추가의 구현 형태에서, 키트는 형광 염료들로 표지된 2개의 다른 변형된 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 염료는 532 nm에서 동일한 레이저에 의해 여기된다. 이들 염료는 흡광도 최대치의 차이가 적어도 10 nm, 특히 20 nm 내지 50 nm일 수 있다. 더 특히, 이들 2개의 염료 화합물은 20 내지 40 nm의 스토크스 이동을 가질 수 있다. 본 발명의 염료와 스펙트럼적으로 구별가능하고 상기 기준을 충족시키는 특정 염료는 미국 특허 제5,268,486호(예를 들어, Cy3) 또는 국제 특허 출원 공개 WO 2002/026891호(Alexa 532; Molecular Probes A20106)에 기재된 바와 같은 폴리메틴 유사체 또는 미국 특허 제6,924,372호에 개시된 바와 같은 비대칭 폴리메틴이며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 대안적인 염료는 로다민 유사체, 예를 들어 테트라메틸 로다민 및 이의 유사체를 포함한다.
대안적인 구현 형태에서, 본 발명의 키트는 동일한 염기가 2개의 상이한 화합물로 표지된 뉴클레오티드들을 함유할 수 있다. 제1 뉴클레오티드는 본 발명의 화합물로 표지될 수 있다. 제2 뉴클레오티드는 스펙트럼적으로 구별되는 화합물, 예를 들어 600 nm 미만에서 흡수하는 '녹색' 염료로 표지될 수 있다. 제3 뉴클레오티드는 본 발명의 화합물 및 스펙트럼적으로 구별되는 화합물의 혼합물로 표지될 수 있고, 제4 뉴클레오티드는 '암색'이고 표지를 함유하지 않을 수 있다. 따라서, 간단히 말하면, 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 4는 '청색', '녹색', '청색/녹색', 및 암색으로 표지될 수 있다. 계측을 더 단순화하기 위하여, 4개의 뉴클레오티드가 단일 레이저로 여기되는 2개의 염료로 표지될 수 있으며, 이에 따라 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 4의 표지화는 '청색 1', '청색 2', '청색 1/청색 2', 및 암색일 수 있다.
뉴클레오티드들은 본 발명의 2개의 염료를 함유할 수 있다. 키트는 본 발명의 염료들로 표지된 2개 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 키트는 추가의 뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 상기 뉴클레오티드는 520 nm 내지 560 nm의 영역에서 흡수하는 염료로 표지된다. 키트는 비표지된 뉴클레오티드를 추가로 수용할 수 있다.
키트가 상이한 염료 화합물들로 표지된 상이한 뉴클레오티드들을 갖는 구성들에 관하여 본 명세서에서 예시되어 있지만, 키트는 동일한 염료 화합물을 갖는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 상이한 뉴클레오티드들을 포함할 수 있음이 이해될 것이다.
특정 구현 형태에서, 키트는 폴리뉴클레오티드 내로의 변형된 뉴클레오티드의 도입을 촉매할 수 있는 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. 그러한 키트에 포함될 다른 성분은 완충액 등을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드, 및 상이한 뉴클레오티드들의 혼합물을 포함한 다른 임의의 뉴클레오티드 성분이 사용 전에 희석되도록 농축된 형태로 키트에 제공될 수 있다. 그러한 구현 형태에서, 적합한 희석 완충액이 또한 포함될 수 있다. 역시, 본 명세서에 기재된 방법에서 확인된 성분들 중 하나 이상이 본 발명의 키트에 포함될 수 있다.
서열분석 방법
본 발명에 따른 염료 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오티드(또는 뉴클레오시드)는 단독으로의 것이든, 더 큰 분자 구조 또는 접합체 내로 도입되거나 그와 회합된 것이든 어느 것이든 간에, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드에 부착된 형광 표지의 검출을 포함하는 방법과 같은 임의의 분석 방법에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "폴리뉴클레오티드 내로 도입된"은 5' 포스페이트가, 자체가 더 긴 폴리뉴클레오티드 사슬의 일부를 형성할 수 있는 제2(변형된 또는 비변형된) 뉴클레오티드의 3' 하이드록실 기에 포스포다이에스테르 결합으로 연결된 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오티드의 3' 말단은 추가의(변형된 또는 비변형된) 뉴클레오티드의 5' 포스페이트에 포스포다이에스테르 결합으로 연결될 수 있거나 연결되지 않을 수 있다. 따라서, 일 비제한적인 구현 형태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 내로 도입되는 변형된 뉴클레오티드를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 본 발명의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키는 단계, 및 (b) 상기 변형된 뉴클레오티드(들)에 부착된 상기 염료 화합물로부터의 형광 신호를 검출함으로써 상기 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 상기 변형된 뉴클레오티드(들)를 검출하는 단계를 포함한다.
이 방법은, 본 발명에 따른 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키는 합성 단계(a) 및 상기 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드(들)를 그들의 형광을 검출하거나 정량적으로 측정함으로써 검출하는 검출 단계(b)를 포함할 수 있다.
본 출원의 일부 구현 형태는 서열분석 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 표지된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 도입시키는 단계, 및 (b) 상기 변형된 뉴클레오티드(들)에 부착된 상기 형광 염료로부터의 형광 신호를 검출함으로써 상기 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 상기 표지된 뉴클레오티드(들)를 검출하는 단계를 포함한다.
일 구현 형태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 폴리머라제 효소의 작용에 의해 합성 단계에서 폴리뉴클레오티드 내로 도입된다. 그러나, 예를 들어 화학적 올리고뉴클레오티드 합성 또는 비표지된 올리고뉴클레오티드에 대한 표지된 올리고뉴클레오티드의 라이게이션과 같은 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 연결하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 용어 "도입시키는"은 화학적 방법뿐만 아니라 효소적 방법에 의한 폴리뉴클레오티드 합성을 포함할 수 있다.
특정 구현 형태에서, 합성 단계가 수행되며, 선택적으로 주형 폴리뉴클레오티드 가닥을 본 발명의 형광 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 반응 혼합물과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리머라제는 또한, 주형 폴리뉴클레오티드 가닥에 어닐링된 폴리뉴클레오티드 가닥 상의 유리 3' 하이드록실 기와 변형된 뉴클레오티드 상의 5' 포스페이트 기 사이의 포스포다이에스테르 결합의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 제공될 수 있다. 따라서, 합성 단계는 주형 가닥에 대한 뉴클레오티드의 상보적 염기쌍 형성에 의해 유도된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 가닥의 형성을 포함할 수 있다.
상기 방법의 모든 구현 형태에서, 검출 단계는 표지된 뉴클레오티드가 도입된 폴리뉴클레오티드 가닥이 주형 가닥에 어닐링되는 동안에, 또는 2개의 가닥이 분리되는 변성 단계 후에 수행될 수 있다. 추가의 단계, 예를 들어 화학적 또는 효소적 반응 단계 또는 정제 단계가 합성 단계와 검출 단계 사이에 포함될 수 있다. 특히, 표지된 뉴클레오티드(들)를 도입시킨 표적 가닥은 단리되거나 정제되고, 이어서 추가로 처리되거나 후속 분석에 사용될 수 있다. 예로서, 후속으로, 합성 단계에서의 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드(들)로 표지된 표적 폴리뉴클레오티드는 표지된 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 다른 구현 형태에서, 본 명세서에 기재된 합성 단계의 산물은 추가의 반응 단계를 거칠 수 있으며, 필요하다면, 이들 후속 단계의 산물은 정제되거나 단리될 수 있다.
합성 단계에 적합한 조건은 표준 분자 생물학 기법에 익숙한 자들에게 잘 알려져 있을 것이다. 일 구현 형태에서, 합성 단계는 적합한 폴리머라제 효소의 존재 하에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함한 뉴클레오티드 전구체를 사용하여 주형 가닥에 상보적인 신장된 표적 가닥을 형성하는 표준 프라이머 신장 반응과 유사할 수 있다. 다른 구현 형태에서, 합성 단계는 그 자체로서, 표적 폴리뉴클레오티드 가닥 및 주형 폴리뉴클레오티드 가닥의 카피로부터 유도되는 어닐링된 상보적 가닥들로 구성된 표지된 이중-가닥 증폭 산물을 생성하는 증폭 반응의 일부를 형성할 수 있다. 다른 합성 단계에는 닉 번역, 가닥 치환 중합, 랜덤 프라이밍된 DNA 표지화 등이 포함된다. 합성 단계에 특히 유용한 폴리머라제 효소는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드의 도입을 촉매할 수 있는 것이다. 다양한 천연 발생 또는 변형된 폴리머라제가 사용될 수 있다. 예로서, 열안정성 폴리머라제가 열사이클링 조건을 사용하여 수행되는 합성 반응에는 사용될 수 있는 반면, 열안정성 폴리머라제는 등온 프라이머 신장 반응에 있어서는 요구되지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 변형된 뉴클레오티드를 도입시킬 수 있는 적합한 열안정성 폴리머라제에는 국제 특허 출원 공개 WO 2005/024010호 또는 WO 2006/120433호에 기재된 것들이 포함되며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 37℃와 같은 더 낮은 온도에서 수행되는 합성 반응에서, 폴리머라제 효소는 반드시 열안정성 폴리머라제일 필요는 없으며, 이에 따라 폴리머라제의 선택은 반응 온도, pH, 가닥-치환 활성 등과 같은 다수의 인자에 좌우될 것이다.
구체적인 비제한적인 구현 형태에서, 본 발명은 핵산 서열분석 방법, 재서열분석 방법, 전체 게놈 서열분석 방법, 단일 뉴클레오티드 다형 점수화 방법, 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 때 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드의 검출을 수반하는 임의의 다른 응용을 포함한다. 형광 염료를 포함하는 변형된 뉴클레오티드로 표지된 폴리뉴클레오티드의 사용으로 이익을 얻는 임의의 다양한 다른 응용이 본 명세서에 기재된 염료를 갖는 변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드를 사용할 수 있다.
특정 구현 형태에서, 본 발명은 합성에 의한 폴리뉴클레오티드 서열분석 반응에 있어서의 본 발명에 따른 염료 화합물을 포함하는 변형된 뉴클레오티드의 사용을 제공한다. 합성에 의한 서열분석은 일반적으로, 서열분석하고자 하는 주형 핵산에 상보적인 신장된 폴리뉴클레오티드 사슬을 형성하기 위하여 폴리머라제 또는 리가제를 사용하여 5'에서 3' 방향으로 성장하는 폴리뉴클레오티드 사슬에 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 순차적으로 부가하는 것을 수반한다. 부가된 뉴클레오티드(들) 중 하나 이상에 존재하는 염기의 정체(identity)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 검출 또는 "이미징" 단계에서 결정될 수 있다. 부가된 염기의 정체는 각각의 뉴클레오티드 도입 단계 후에 결정될 수 있다. 이어서, 주형의 서열은 통상적인 왓슨-크릭 염기쌍 형성 규칙을 사용하여 추론될 수 있다. 단일 염기의 정체의 결정을 위해 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 변형된 뉴클레오티드의 사용은, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형의 점수화에 유용할 수 있으며, 그러한 단일 염기 신장 반응은 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명의 일 구현 형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드의 서열은 서열분석하고자 하는 주형 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생(nascent) 가닥 내로의 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입을, 그러한 도입된 뉴클레오티드(들)에 부착된 형광 표지(들)의 검출을 통해 검출함으로써 결정된다. 주형 폴리뉴클레오티드의 서열분석은 적합한 프라이머를 사용하여 프라이밍될 수 있고(또는 헤어핀의 일부로서 프라이머를 함유할 헤어핀 작제물로서 제조될 수 있고), 신생 사슬은 폴리머라제-촉매 반응에서 프라이머의 3' 말단에 대한 뉴클레오티드의 부가에 의해 단계적으로 신장된다.
특정 구현 형태에서, 상이한 뉴클레오티드 트라이포스페이트들(A, T, G 및 C) 각각은 특유의 형광단으로 표지될 수 있으며, 또한 제어되지 않은 중합을 방지하기 위해 3' 위치에 블록킹 기를 포함한다. 대안적으로, 4개의 뉴클레오티드 중 하나는 비표지될 수 있다(암색). 폴리머라제 효소는 주형 폴리뉴클레오티드에 상보적인 신생 사슬 내로 뉴클레오티드를 도입시키며, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 추가 도입을 방지한다. 임의의 도입되지 않은 뉴클레오티드는 세척될 수 있고, 각각의 도입된 뉴클레오티드로부터의 형광 신호는 적합한 방출 필터 및 레이저 여기를 사용하는 전하 결합 장치와 같은 적합한 수단에 의해 광학적으로 "리드" 될 수 있다. 이어서, 3'-블록킹 기 및 형광 염료 화합물을 (동시에 또는 순차적으로) 제거하여(탈보호하여) 추가의 뉴클레오티드 도입을 위해 신생 사슬을 노출시킬 수 있다. 전형적으로, 도입된 뉴클레오티드의 정체는 각각의 도입 단계 후에 결정되겠지만, 이는 엄격히 필수적인 것은 아니다. 유사하게, 개시 내용이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,302,509호는 고체 지지체 상에 고정화된 폴리뉴클레오티드를 서열분석하는 방법을 개시한다.
상기에 예시된 바와 같이, 이 방법은 DNA 폴리머라제의 존재 하에서, 고정화된 폴리뉴클레오티드에 상보적인 성장 가닥 내로의 형광 표지된 3'-블록킹된 뉴클레오티드 A, G, C, 및 T의 도입을 이용한다. 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인 염기를 도입시키지만, 3'-블록킹 기에 의해 추가의 부가로부터 방지된다. 이어서, 도입된 뉴클레오티드의 표지를 결정할 수 있으며, 블록킹 기를 화학적 절단에 의해 제거하여 추가의 중합이 일어날 수 있게 할 수 있다. 합성에 의한 서열분석 반응에서 서열분석하고자 하는 핵산 주형은 서열분석이 요구되는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 서열분석 반응을 위한 핵산 주형은 전형적으로 서열분석 반응에서 추가의 뉴클레오티드의 부가를 위한 프라이머 또는 개시점으로서의 역할을 하는 유리 3' 하이드록실 기를 갖는 이중-가닥 영역을 포함할 것이다. 서열분석하고자 하는 주형의 영역은 상보적 가닥 상의 이러한 유리 3' 하이드록실 기를 오버행(overhang)할 것이다. 서열분석하고자 하는 주형의 오버행 영역은 단일-가닥일 수 있지만, 서열분석하고자 하는 주형 가닥에 상보적인 가닥 상에 "닉이 존재하여" 서열분석 반응의 개시를 위한 유리 3' OH 기를 제공한다면 이중-가닥일 수 있다. 그러한 구현 형태에서, 서열분석은 가닥 치환에 의해 진행될 수 있다. 소정 구현 형태에서, 유리 3' 하이드록실 기를 갖는 프라이머가 서열분석하고자 하는 주형의 단일-가닥 영역에 혼성화되는 별개의 성분(예를 들어, 짧은 올리고뉴클레오티드)으로서 첨가될 수 있다. 대안적으로, 프라이머 및 서열분석하고자 하는 주형 가닥은 각각, 예를 들어 헤어핀 루프 구조와 같은 분자내 이중체를 형성할 수 있는 부분적으로 자가-상보적인 핵산 가닥의 일부를 형성할 수 있다. 헤어핀 폴리뉴클레오티드 및 이들이 고체 지지체에 부착될 수 있는 방법이 국제 특허 출원 공개 WO 2001/057248호 및 WO 2005/047301호에 개시되어 있으며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 뉴클레오티드를 성장하는 프라이머에 연속적으로 첨가할 수 있으며, 그 결과 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오티드 사슬이 합성될 수 있다. 첨가된 염기의 성질은 각각의 뉴클레오티드 첨가 후에 - 특히 그러나 반드시 그러한 것은 아님 - 결정되며, 이로써 핵산 주형에 대한 서열 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 핵산 가닥(또는 폴리뉴클레오티드) 내로의 뉴클레오티드의 도입이, 뉴클레오티드의 5' 포스페이트 기와의 포스포다이에스테르 결합의 형성을 통해 핵산 가닥의 유리 3' 하이드록실 기에 뉴클레오티드를 연결함으로써 행해진다.
서열분석하고자 하는 핵산 주형은 DNA 또는 RNA, 또는 심지어 데옥시뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드로 구성된 하이브리드 분자일 수 있다. 핵산 주형은, 서열분석 반응에서 주형의 카피를 방해하지 않는 한, 천연 발생 및/또는 천연 비발생 뉴클레오티드 및 천연 또는 비천연 골격 결합을 포함할 수 있다.
소정의 구현 형태에서, 서열화하고자 하는 핵산 주형은 당업계에 알려진 임의의 적합한 결합 방법을 통해, 예를 들어 공유 부착을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 소정의 구현 형태에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 고체 지지체(예를 들어, 실리카-기반 지지체)에 직접 부착될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 구현 형태에서, 고체 지지체의 표면은 주형 폴리뉴클레오티드의 직접 공유 부착을 가능하게 하거나, 그 자체가 고체 지지체에 비공유적으로 부착될 수 있는 하이드로겔 또는 다가전해질 다층을 통해 주형 폴리뉴클레오티드를 고정화하도록 하는 어떠한 방식으로 개질될 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 실리카-기반 지지체에 직접 부착된 어레이는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 2000/006770호에 개시된 것들이며, 이의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되며, 여기서는 폴리뉴클레오티드가 유리 상의 펜던트 에폭사이드 기와 폴리뉴클레오티드 상의 내부 아미노 기 사이의 반응에 의해 유리 지지체 상에 고정화된다. 게다가, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 2005/047301호에 기재된 바와 같이, 황-기반 친핵체와 고체 지지체의 반응에 의해 고체 지지체에 부착될 수 있으며, 이의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 고체-지지된 주형 폴리뉴클레오티드의 또 다른 추가의 예는 주형 폴리뉴클레오티드가 실리카-기반 또는 다른 고체 지지체 상에 지지된 하이드로겔에 부착되어 있는 경우로서, 이는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 2000/31148호, WO 2001/01143호, WO 2002/12566호, WO 2003/014392호, 및 WO 2000/53812호 및 미국 특허 제6,465,178호에 기재되어 있으며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
주형 폴리뉴클레오티드가 고정화될 수 있는 특정 표면은 폴리아크릴아미드 하이드로겔이다. 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 상기에 인용된 참고문헌에 그리고 국제 특허 출원 공개 WO 2005/065814호에 기재되어 있으며, 이의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 사용될 수 있는 구체적인 하이드로겔은 국제 특허 출원 공개 WO 2005/065814호 및 미국 특허 제2014/0079923호에 기재된 것들을 포함하며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 일 구현 형태에서, 하이드로겔은 PAZAM(폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드))이다.
DNA 주형 분자는, 예를 들어 미국 특허 제6,172,218호에 기재된 바와 같이 비드 또는 마이크로입자에 부착될 수 있으며, 이의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 비드 또는 마이크로입자에 대한 부착은 서열분석 응용에 유용할 수 있다. 비드 라이브러리가 제조될 수 있으며, 여기서는 각각의 비드가 상이한 DNA 서열을 함유한다. 일부 라이브러리 및 그들의 생성 방법이 문헌[Nature, 437, 376-380 (2005); Science, 309, 5741, 1728-1732 (2005)]에 기재되어 있으며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 기재된 뉴클레오티드를 사용하는 그러한 비드들의 어레이의 서열분석은 본 발명의 범주 내에 있다.
서열분석하고자 하는 주형(들)은 고체 지지체 상의 "어레이"의 일부를 형성할 수 있으며, 이 경우에 어레이는 임의의 편리한 형태를 취할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 단일-분자 어레이, 클러스터링된 어레이, 및 비드 어레이를 포함한 모든 유형의 고밀도 어레이에 적용가능하다. 본 발명의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는, 고체 지지체 상에의 핵산 분자의 고정화에 의해 형성된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는 본질적으로 임의의 유형의 어레이 상의 주형을 서열분석하는 데 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 클러스터링된 어레이의 서열분석과 관련하여 특히 유리하다. 클러스터링된 어레이에서, 어레이 상의 별개의 영역(종종 부위 또는 특징부로 지칭됨)들은 다수의 폴리뉴클레오티드 주형 분자를 포함한다. 일반적으로, 이러한 다수의 폴리뉴클레오티드 분자는 광학적 수단에 의해 개별적으로 해상가능하지 않고 대신에 앙상블(ensemble)로서 검출된다. 어레이가 어떻게 형성되는지에 따라, 어레이 상의 각각의 부위는 하나의 개별 폴리뉴클레오티드 분자의 다수의 카피(예를 들어, 그 부위는 특정 단일- 또는 이중-가닥 핵산 종에 대해 균질함) 또는 심지어 소수의 상이한 폴리뉴클레오티드 분자들의 다수의 카피(예를 들어, 2개의 상이한 핵산 종의 다수의 카피)를 포함할 수 있다. 핵산 분자들의 클러스터링된 어레이는 당업계에서 일반적으로 알려진 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예로서, 각각의 개시 내용이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 1998/44151호 및 WO 2000/18957호는 핵산의 증폭 방법을 기재하는데, 여기서는 고정화된 핵산 분자들의 클러스터들 또는 "콜로니"들로 구성된 어레이를 형성하기 위하여, 주형 및 증폭 산물이 고체 지지체 상에 고정화된 채로 남아 있다. 이들 방법에 따라 제조된 클러스터링된 어레이 상에 존재하는 핵산 분자들은 본 발명의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 서열분석하기에 적합한 주형이다.
본 발명의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 또한 단일 분자 어레이 상의 주형의 서열분석에 유용하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 분자 어레이" 또는 "SMA"는 고체 지지체 위에 분포된(또는 배열된) 폴리뉴클레오티드 분자들의 집단을 지칭하며, 여기서 집단의 모든 다른 것들로부터 임의의 개별 폴리뉴클레오티드의 간격은 개별 폴리뉴클레오티드 분자들을 개별적으로 해상하는 것이 가능하도록 하는 것이다. 따라서, 고체 지지체의 표면 상에 고정화된 표적 핵산 분자는 일부 구현 형태에서 광학적 수단에 의해 해상될 수 있다. 이는, 각각의 신호가 하나의 폴리뉴클레오티드를 나타내는 하나 이상의 별개의 신호가, 사용되는 특정 이미징 장치의 해상가능한 영역 내에서 발생할 것임을 의미한다.
어레이 상의 인접한 폴리뉴클레오티드 분자들 사이의 간격이 적어도 100 nm, 더 특히 적어도 250 nm, 훨씬 더 특히 적어도 300 nm, 더욱 더 특히 적어도 350 nm인 단일 분자 검출이 달성될 수 있다. 따라서, 각각의 분자는 개별적으로 해상가능하고 단일 분자 형광점으로서 검출가능하고, 상기 단일 분자 형광점으로부터의 형광은 또한 단일 단계 광표백을 나타낸다.
용어 "개별적으로 해상된" 및 "개별 해상도"는, 시각화될 때, 어레이 상의 하나의 분자를 그의 이웃하는 분자와 구별하는 것이 가능함을 명시하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 어레이 상의 개별 분자들 사이의 분리는 개별 분자들을 해상하는 데 사용되는 특정 기법에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 단일 분자 어레이의 일반적인 특징은 국제 특허 출원 공개 WO 2000/06770호 및 WO 2001/57248호를 참조함으로써 이해될 것이며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명의 변형된 뉴클레오티드의 한 가지 용도가 합성에 의한 서열분석 반응에 사용되는 것이지만, 변형된 뉴클레오티드의 유용성은 그러한 방법으로 제한되지 않는다. 실제로, 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 내로 도입된 뉴클레오티드에 부착된 형광 표지의 검출을 필요로 하는 임의의 서열분석 방법에서 유리하게 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드는 자동화 형광 서열분석 프로토콜, 특히 Sanger 및 그 동료들의 사슬 종결 서열분석 방법에 기초한 형광 염료-종결자 사이클 서열분석에 사용될 수 있다. 그러한 방법은 일반적으로 효소, 및 프라이머 신장 서열분석 반응에서 형광 표지된 다이데옥시뉴클레오티드를 도입시키는 사이클 서열분석을 사용한다. 이른바 Sanger 서열분석 방법, 및 관련 프로토콜(Sanger-유형)은 표지된 다이데옥시뉴클레오티드를 갖는 랜덤화된 사슬 종결을 이용한다.
따라서, 본 발명은 또한 3' 및 2' 위치 둘 모두에서 하이드록실 기가 결여된 다이데옥시뉴클레오티드인 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드를 포함하며, 그러한 변형된 다이데옥시뉴클레오티드는 Sanger 유형 서열분석 방법 등에 사용하기에 적합하다.
3' 블록킹 기를 도입시킨 본 발명의 염료 화합물로 표지된 변형된 뉴클레오티드 - 이것은 인식될 것임 - 가 또한 Sanger 방법 및 관련 프로토콜에 이용될 수 있는데, 그 이유는, 변형된 다이데옥시 뉴클레오티드를 사용함으로써 달성되는 것과 동일한 효과가 3'-OH 블록킹 기를 갖는 변형된 뉴클레오티드를 사용함으로써 달성될 수 있기 때문이다: 둘 모두는 후속 뉴클레오티드의 도입을 방지한다. 본 발명에 따르고 3' 블록킹 기를 갖는 뉴클레오티드가 Sanger-유형 서열분석 방법에서 사용되는 경우, 뉴클레오티드에 부착된 염료 화합물 또는 검출가능한 표지는 절단가능한 링커를 통해 연결될 필요가 없음이 이해될 것인데, 그 이유는, 본 발명의 표지된 뉴클레오티드가 도입되는 각각의 경우에, 뉴클레오티드는 후속으로 도입될 필요가 없으며, 이에 따라 표지는 뉴클레오티드로부터 제거될 필요가 없기 때문이다.
실시예
추가의 구현 형태가 하기의 실시예에서 더 상세히 개시되며, 이러한 실시예는 결코 본 발명의 범주를 제한하고자 의도되지 않는다.
실시예 1: 화합물 I-1: 7-(3-카르복시아제티디닐-1)-3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00077
3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.32 g, 1 mmol) 및 3-카르복시아제티딘(0.2 g, 2 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 120℃에서 7시간 동안 교반하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 혼합물을 물(15 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.25 g(63%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 396.05. 실측치 m/z: (+) 397 (M+1)+; (-) 395 (M-1)-.
실시예 2. 화합물 I-2: 7-(3-카르복시아제티딘-1-일)-3-(벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00078
3-(벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.56 g, 2 mmol) 및 3-카르복시아제티딘(0.3 g, 3 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가한다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 125℃에서 9시간 동안 교반하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.41 g(56%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 362.09. 실측치 m/z: (+) 363 (M+1)+.
실시예 3. 화합물 I-3: 7-(3-카르복시아제티딘-1-일)-3-(벤즈이미다졸-2-일)쿠마린
Figure pct00079
3-(벤즈이미다졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(FC-2, 0.56 g, 2 mmol, 1 eq.) 및 3-카르복시아제티딘(AC-C4, 0.3 g, 3 mmol, 1.5 eq)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 120℃에서 9시간 동안 교반한다. 3-카르복시아제티딘(0.3 g, 3 mmol) 및 DIPEA(0.26 g, 2 mmol)의 추가 분량을 첨가하였다. 120℃에서 추가 3시간 동안 교반하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.26 g(36%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 361.11. 실측치 m/z: (+) 362 (M+1)+; (-) 360 (M-1)- .
실시예 4. 화합물 I-4: 7-(3-카르복시아제티딘-1-일)-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00080
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.30 g, 1 mmol) 및 3-카르복시아제티딘(0.2 g, 2 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 120℃에서 8시간 동안 교반하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집한다. 수율 0.28 g(75%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 378.07. 실측치 m/z: (+) 379 (M+1)+; (-) 377 (M-1)-.
실시예 5. 화합물 I-5: 7-(3-카르복시피롤리딘-일-1)-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00081
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.30 g, 1 mmol) 및 3-카르복시피롤리딘(0.23 g, 2 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 120℃에서 6시간 동안 교반하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 반응 혼합물을 물(20 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.31 g(80%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 392.08. 실측치 m/z: (+) 393 (M+1)+; (-) 391 (M-1)-.
실시예 6. 화합물 I-6: 7-(4-카르복시피페리딘-1-일)-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00082
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.30 g, 1 mmol) 및 아이소니페코트산(0.26 g, 2 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 120℃에서 6시간 동안 교반하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 반응 혼합물을 물(20 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.34 g(83%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 406.10 실측치 m/z: (+) 407 (M+1)+; (-) 405 (M-1)-.
실시예 7. 화합물 I-7: 7-(3-카르복시아제티딘-1-일)-3-(6-설포-벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00083
7-(3-카르복시아제티딘-1-일)-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린(0.38 g, 1 mmol)을 약 -5℃에서 20% 발연 황산(0.5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 냉각시키면서 수시간 동안 교반하고, 이어서 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 80℃에서 1시간 동안 교반하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 반응 혼합물을 무수 다이에틸 에테르(10 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집한다. 생성물을 HPLC로 정제하였다. 수율 0.1 g(22%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 458.02. 실측치 m/z: (+) 459 (M+1)+.
실시예 8. 화합물 I-8: 7-(3-카르복시아제티딘-1-일)-3-(6-설파미도-벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00084
3-(6-설파미도-벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.36 g, 1 mmol) 및 3-카르복시아제티딘(0.3 g, 3 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가한다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 125℃에서 9시간 동안 교반하고, 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.26 g(60%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 441.06. 실측치 m/z: (+) 442 (M+1)+.
실시예 9. 형광 강도의 비교
(최대 여기 파장 450 nm에서의) 일부 염료 용액의 형광 강도를 동일한 스펙트럼 영역에 대한 표준 염료와 비교하였다. 결과가 표 1에 나타나 있으며, 형광 기반 분석 응용을 위한 염료의 상당한 이점을 입증한다.
[표 1]
Figure pct00085
실시예 10. 완전 기능성 뉴클레오티드 접합체의 합성을 위한 일반적인 절차
본 명세서에 개시된 쿠마린 형광 염료를, 하기 아데닌 반응도식에 따라 적절한 시약을 사용하여 염료의 카르복실 기를 활성화시킨 후에, 적절한 아미노-치환된 아데닌(A) 및 시토신(C) 뉴클레오티드 유도체 A-LN3-NH2 또는 C-LN3-NH2와 커플링하였다:
Figure pct00086
Figure pct00087
Figure pct00088
아데닌 커플링에 대한 일반적인 생성물은 하기에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00089
ffA-LN3-Dye는 본 명세서에 개시된 쿠마린 염료로 표지되고 LN3 링커를 갖는 완전 기능화된 A 뉴클레오티드를 지칭한다. 각각의 구조 내의 R 기는 접합 후 쿠마린 염료 모이어티를 지칭한다.
염료(10 μmol)를 5 mL 둥근바닥 플라스크 내로 넣어서 건조시키고, 무수 다이메틸포름아미드(DMF, 1 mL) 중에 용해시키고, 이어서 용매를 진공 중에서 증류시킨다. 이 절차를 2회 반복한다. 건조된 염료를 실온에서 무수 N,N-다이메틸아세트아미드(DMA, 0.2 mL) 중에 용해시킨다. N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU, 1.5 eq., 15 μmol, 4.5 mg)를 염료 용액에 첨가하고, 이어서 DIPEA(3 eq., 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL)를 마이크로피펫을 통해 이 용액에 첨가한다. 반응 플라스크를 질소 가스 하에서 밀봉한다. 반응 진행을 TLC(용리제 아세토니트릴-물 1:9) 및 HPLC에 의해 모니터링한다. 한편, 적절한 아미노-치환된 뉴클레오티드 유도체의 용액(A-LN3-NH2, 20 mM, 1.5 eq, 15 μmol, 0.75 mL)을 진공 중에서 농축시키고, 이어서 물(20 μL) 중에 재용해시킨다. DMA 중 활성화된 염료의 용액을 N-LN3-NH2의 용액이 담긴 플라스크에 옮긴다. 추가의 DIPEA(3 eq, 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL)를 트라이에틸아민(1 μL)과 함께 첨가한다. 커플링의 진행을 TLC, HPLC, 및 LCMS에 의해 매시간마다 모니터링한다. 반응이 완료될 때, 트라이에틸아민 바이카르보네이트 완충액(TEAB, 0.05 M, 약 3 mL)을 피펫을 통해 반응 혼합물에 첨가한다. 켄칭된(quenched) 반응 혼합물을 DEAE-Sephadex® 컬럼을 통해 이동시켜 잔존하는 미반응 염료의 대부분을 제거함으로써 완전 작용화된 뉴클레오티드의 초기 정제를 수행한다. 예를 들어, Sephadex를 빈 25 g Biotage 카트리지, 용매 시스템 TEAB/MeCN에 붓는다. Sephadex 컬럼으로부터의 용액을 진공 중에서 농축시킨다. 잔존 물질을 최소 부피의 물 및 아세토니트릴 중에 재용해시킨 후, 20 μm 나일론 필터를 통해 여과한다. 여과된 용액을 분취용-HPLC로 정제한다. 제조된 화합물의 조성은 LCMS에 의해 확인한다.
시토신 커플링에 대한 일반적인 생성물은 전술된 것과 유사한 절차에 따라 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00090
ffC-LN3-Dye는 본 명세서에 개시된 쿠마린 염료로 표지되고 LN3 링커를 갖는 완전 기능화된 C 뉴클레오티드를 지칭한다. 각각의 구조 내의 R 기는 접합 후 쿠마린 염료 모이어티를 지칭한다.
실시예 11. 화학식 (I)의 화합물의 아미드 유도체의 제조
본 명세서에 기재된 일부 추가의 구현 형태는 화학식 (I)의 화합물의 아미드 유도체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 화학식 (Ia)의 화합물을 카르복실산 활성화를 통해 화학식 (Ia')의 화합물로 전환시키는 단계:
Figure pct00091
및 화학식 (Ia')의 화합물을 화학식 (Am)의 1차 또는 2차 아민과 반응시켜 화학식 (Ib)의 아미드 유도체에 도달하는 단계를 포함한다:
Figure pct00092
(상기 식에서, 변수 X, R, R1, R2, R3, R4, 및 n은 본 명세서에서 정의되어 있으며; R'은 카르복실 활성화제(예컨대, N-하이드록시석신이미드, 니트로페놀, 펜타플루오로페놀, HOBt, BOP, PyBOP, DCC 등)의 잔류 모이어티이고; 각각의 RA 및 RB는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 3원 내지 10원 헤테로사이클릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 또는 (헤테로사이클릴)알킬임).
화학식 (Ib)의 화합물의 제조를 위한 일반적인 절차
적절한 화학식 (Ia)의 염료(0.001 mol)를 적합한 무수 유기 용매(DMF, 1.5 mL) 중에 용해시킨다. 이 용액에, 카르복실 활성화 시약, 예컨대 TSTU, BOP 또는 PyBOP를 첨가한다. 이 반응 혼합물을 실온에서 약 20분 동안 교반하고, 이어서 적절한 아민 유도체를 첨가한다. 반응 혼합물을 하룻밤 교반하고, 여과하고, 과량의 활성화 시약을 물 중 0.1 M TEAB 용액으로 켄칭한다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 TEAB 용액 중에 재용해시키고 HPLC로 정제한다.
실시예 12. 2-채널 서열분석 응용
본 명세서에서 서열분석 응용에서 기재된 염료로 표지된 A 뉴클레오티드의 효율을 본 명세서에 기재된 바와 같은 2-채널 검출 방법에서 입증하였다. 본 명세서에 기재된 2-채널 방법과 관련하여, 본 명세서에 그리고/또는 미국 특허 출원 공개 제2013/0079232호에 기재된 방법 및 시스템을 이용하여 핵산이 서열분석될 수 있으며, 이의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
2-채널 검출에서는, 제1 채널에서 검출되는 제1 뉴클레오티드 유형, 제2 채널에서 검출되는 제2 뉴클레오티드 유형, 제1 채널 및 제2 채널 둘 모두에서 검출되는 제3 뉴클레오티드 유형, 및 어느 채널에서도 검출되지 않거나 최소한으로 검출되는, 표지가 결여되어 있는 제4 뉴클레오티드 유형을 제공함으로써 핵산이 서열분석될 수 있다. 실험의 RTA2.0.93 분석에 의해 산포도를 생성하였다. 도 23 내지 도 25에 예시된 산포도는 26회 사이클 실시(cycle run) 각각마다 사이클 5에서의 것이었다.
도 23은 Pol812를 함유하는 도입 완충액 중에 A-I-4(0.5 μM), A-NR550S0(1.5 μM), C-NR440(2 μM), 암색 G(2 μM) 및 T-AF550POPOS0(2 μM)을 함유하는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN) 혼합물의 산포도를 예시한다. 청색 노출(채널 1) 500 ms, 녹색 노출(채널 2) 1000 ms; 스캐닝 믹스 중에서 스캐닝됨.
도 24는 Pol812를 함유하는 도입 완충액 중에 A-I-5(1 μM), A-NR550S0(1 μM), C-NR440(2 μM), 암색 G(2 μM) 및 T-AF550POPOS0(2 μM)을 함유하는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN) 혼합물의 산포도를 예시한다. 청색 노출(채널 1) 500 ms, 녹색 노출(채널 2) 1000 ms; 스캐닝 믹스 중에서 스캐닝됨.
도 25는 Pol812를 함유하는 도입 완충액 중에 A-I-6(1 μM), A-NR550S0(1 μM), C-NR440(2 μM), 암색 G(2 μM) 및 T-AF550POPOS0(2 μM)을 함유하는 완전 작용화된 뉴클레오티드(ffN) 혼합물의 산포도를 예시한다. 청색 노출(채널 1) 500 ms, 녹색 노출(채널 2) 1000 ms; 스캐닝 믹스 중에서 스캐닝됨.
각각의 도 23 내지 도 25에서, "G" 뉴클레오티드는 비표지되어 있고 좌측 하단 구름("암색 G")으로서 도시되어 있다. 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 "A" 뉴클레오티드와 녹색 염료(NR550S0)의 혼합물로부터의 신호는 도 23 내지 도 25 각각에서 우측 상단 구름으로서 도시되어 있다. 염료 AF550POPOS0으로 표지된 "T" 뉴클레오티드로부터의 신호는 좌측 상단 구름으로 표시되어 있고, 염료 NR440에 의해 표지된 "C" 뉴클레오티드로부터의 신호는 우측 하단 구름으로 표시되어 있다. X-축은 하나의(청색) 채널에 대한 신호 강도를 나타내고, Y-축은 다른(녹색) 채널에 대한 신호 강도를 나타낸다. NR440, AF550POPOS0, 및 NR550S0의 화학 구조는 국제 특허 출원 공개 WO 2018/060482호, WO 2017/051201호, 및 WO 2014/135221호에 각각 개시되어 있으며, 각각의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
도 23 내지 도 25는 각각 본 명세서에 기재된 염료로 표지된 완전 기능성 A-뉴클레오티드 접합체가 충분한 신호 강도 및 큰 구름 분리를 제공함을 보여준다.
실시예 13. 화합물 II-1: 7-비스(2-카르복시에틸)아미노-3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00093
3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.32 g, 1 mmol) 및 비스이미노프로피온산(0.32 g, 2 mmol)을 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 130℃에서 6시간 동안 교반하였다. 실온에서 약 1시간 동안 정치시킨 후에, 담황색 반응 혼합물을 물(15 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율: 0.40 g(88%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 456.07. 실측치 m/z: (+) 427 (M+1).
실시예 14. 화합물 II-2: 7-다이에틸아미노-3-(5-카르복시-벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00094
3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.33 g, 1 mmol) 및 다이에틸아민(0.29 g, 4 mmol)을 무수 DMSO(15 mL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 115℃에서 12시간 동안 콘덴서로 교반하였다. 다이에틸아민(0.14 g, 2 mmol) 및 DIPEA(0.26 g, 2 mmol)의 추가 분량을 첨가하고, 115℃에서 5시간 동안 계속 교반하였다. 이어서, 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하고, 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 정치시켰다. 생성된 혼합물을 물(15 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 수율 0.24 g(62%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 378.12. 실측치 m/z: (+) 379 (M+1)+; (-) 377 (M-1)-.
대안적인 합성
Figure pct00095
에틸 (5-카르복시벤족사졸-2-일)아세테이트(0.25 g, 1 mmol), 다이에틸아미노살리실산 알데하이드(0.19 g, 1 mmol), 피페리딘(3 방울), 및 아세트산(3 방울)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 에탄올(EtOH, 5 mL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 6시간 동안, 그리고 이어서 60 내지 65℃에서 12시간 동안 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 수율: 0.27 g(72%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 378.12. 실측치 m/z: (+) 379 (M+1)+; (-) 377 (M-1)-.
실시예 15. 화합물 II-3: 7-다이에틸아미노-3-(5-카르복시-벤즈이미다졸-2-일)쿠마린
Figure pct00096
3-(5-카르복시벤즈이미다졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.32 g, 1 mmol) 및 다이에틸아민(0.29 g, 4 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 15 mL)에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 115℃에서 12시간 동안 콘덴서로 교반하였다. 다이에틸아민(0.14 g, 2 mmol) 및 DIPEA(0.26 g, 2 mmol)의 추가 분량을 첨가하고, 혼합물을 115℃에서 추가 8시간 동안 가열하였다. 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 실온에서 약 1시간 동안 정치시킨 후에, 혼합물을 물(15 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 수율: 0.17 g(44%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 377.14. 실측치 m/z: (+) 378 (M+1)+; (-) 376 (M-1)-.
대안적인 합성
Figure pct00097
에틸(5-카르복시벤즈이미다졸-2-일)아세테이트(0.25 g, 1 mmol), 다이에틸아미노살리실산 알데하이드(0.19 g, 1 mmol), 피페리딘(3 방울), 및 아세트산(3 방울)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 에탄올(EtOH, 5 mL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 75℃에서 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 수율: 0.26 g(70%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 377.14. 실측치 m/z: (+) 378 (M+1)+; (-) 376 (M-1)-.
실시예 16. 화합물 II-4: 7-[N-(3-카르복시프로필)-N-메틸]아미노-3-(벤즈티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00098
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.30 g, 1 mmol) 및 4-(메틸아미노)부탄산(0.23 g, 2 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 약 120℃에서 8시간 동안, 그리고 이어서 실온에서 약 1시간 동안 교반하였다. 담황색 혼합물을 물(15 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율: 0.19 g(48%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 456.07. 실측치 m/z: (+) 427 (M+1).
실시예 17. 화합물 II-5: 7-[N-(3-카르복시프로필)-N-(3-설포프로필)아미노]-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린(트라이에틸암모늄 염)
Figure pct00099
단계 1: 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-(3-설포프로필]}아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린(화합물 II-5tBu)의 제조
Figure pct00100
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.3 g, 1 mmol) 및 t-부틸 4-[N-(3-설포)프로필]-아미노부타노에이트(0.56 g, 2 mmol)를 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 DMSO(3 mL)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.65 g, 5 mmol)를 이 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 120℃에서 3시간 동안 교반하였다. 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 정치시키고, 생성된 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 트라이에틸암모늄 염으로서 생성물 화합물 II-5tBu를 단리하였다. 수율 0.5 g(76%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 558.15. 실측치 m/z: (+) 559 (M+1).
단계 2: 트라이플루오로아세트산(3 mL)을 무수 다이클로로메탄(25 mL) 중 트라이에틸암모니오 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-[(3-설포네이토프로필]}아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린(0.66 g, 1 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 아세토니트릴-물 혼합물(1:1,10 mL) 중에 용해시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 화합물 II-5 트라이에틸암모늄 염으로서 생성물을 단리하였다. 수율: 0.6 g(97%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 502.09. 실측치 m/z: (+) 503 (M+1)+; (-), 501 (M-1)-.
실시예 18. 화합물 II-6: 7-[N-(3-카르복시프로필)-N-(3-설포프로필)아미노]-3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)쿠마린(트라이에틸암모늄 염)
Figure pct00101
단계 1. 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-(3-설포프로필]}아미노-3-[5-클로로벤족사졸-2-일)쿠마린(화합물 II-6tBu)의 제조
Figure pct00102
3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.32 g, 1 mmol) 및 t-부틸 4-[N-(3-설포)프로필]-아미노부타노에이트(0.56 g, 2 mmol)를 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.65 g, 5 mmol)를 이 혼합물에 첨가하였다. 125℃에서 5시간 동안 교반한 후에, 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 정치시키고, 이어서 물-아세토니트릴 1:1 혼합물(10 mL)로 희석시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 트라이에틸암모늄 염으로서 생성물 화합물 II-6tBu를 단리하였다. 수율: 0.38 g(56%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 576.13. 실측치 m/z: (+) 577 (M+1).
단계 2. 무수 다이클로로메탄(25 mL) 중 트라이에틸암모니오 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-[(3-설포네이토프로필]}아미노-3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)쿠마린(0.68 g, 1 mmol)의 혼합물을 트라이플루오로아세트산(3 mL)으로 처리하고, 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류 제거하고, 잔류물을 아세토니트릴-물 1:1 혼합물(10 mL) 중에 용해시켰으며, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 화합물 II-6 트라이에틸암모늄 염으로서 생성물을 단리한다. 수율: 0.6 g(96%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 520.07. 실측치 m/z: (+) 521 (M+1)+; (-), 519 (M-1)-.
실시예 18. 화합물 II-7: 7-[N-(3-카르복시프로필)-N-(3-설포프로필)아미노]-3-(벤족사졸-2-일)쿠마린(트라이에틸암모늄 염으로서 단리됨)
Figure pct00103
단계 1. 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-(3-설포프로필]}아미노-3-(벤족사졸-2-일)쿠마린(화합물 II-7tBu)의 제조
Figure pct00104
3-(벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.28 g, 1 mmol) 및 t-부틸 4-[N-(3-설포)프로필]-아미노부타노에이트(0.56 g, 2 mmol)를 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.65 g, 5 mmol)를 이 혼합물에 첨가하였다. 120℃에서 8시간 동안 교반한 후에, 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 정치시키고, 이어서 물-아세토니트릴 1:1 혼합물(10 mL)로 희석시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 생성물 화합물 II-7tBu를 단리하였다. 수율: 0.15 g(27%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 542.17. 실측치 m/z: (+) 543 (M+1).
단계 2. 무수 다이클로로메탄(15 mL) 중 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-[(3-설포네이토프로필]}아미노-3-(벤족사졸-2-일)쿠마린(0.27 g, 0.5 mmol)의 혼합물을 트라이플루오로아세트산(2 mL)으로 처리하고, 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류 제거하고, 잔류물을 아세토니트릴-물 1:1 혼합물(10 mL) 중에 용해시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 트라이에틸암모늄 염으로서 생성물을 단리하였다. 수율: 87%.
실시예 19. 화합물 II-8: 7-[N-(3-카르복시프로필)-N-(3-설포프로필)아미노]-3-[6-(아미노설포닐)벤족사졸-2-일]쿠마린
Figure pct00105
단계 1. 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-(3-설포프로필]}아미노-3-[6-(아미노설포닐)벤족사졸-2-일]쿠마린(화합물 II-8tBu)의 제조
Figure pct00106
3-[6-(아미노설포닐)벤족사졸-2-일]-7-플루오로-쿠마린(0.18 g, 0.5 mmol) 및 t-부틸 4-[N-(3-설포)프로필]-아미노부타노에이트(0.28 g, 1 mmol)를 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 DMSO(3 mL)와 혼합하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.65 g, 5 mmol)를 첨가하였다. 120℃에서 7시간 동안 교반한 후에, 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 정치시키고, 이어서 물-아세토니트릴 1:1 혼합물(10 mL)로 희석시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 생성물 화합물 II-8tBu를 단리하였다. 용매를 증발시킨 후에, 황색 침전물을 여과하였다. 수율: 0.31 g(50%). 염료의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 621.15. 실측치 m/z: (+) 622 (M+1).
단계 2. 무수 다이클로로메탄(15 mL) 중 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-[(3-설포네이토프로필]}아미노-3-[6-(아미노설포닐)벤족사졸-2-일]쿠마린(0.31 g, 0.5 mmol)의 혼합물에 트라이플루오로아세트산(2 mL)을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류 제거하고, 잔류물을 아세토니트릴-물 1:1 혼합물(10 mL) 중에 용해시키고, 용매를 다시 증류 제거하였다. 화합물 II-8을 여과 제거하고, 아세토니트릴로 세척하였다. 수율: 0.25 g(87%).
실시예 20. 화합물 II-9: 7-[N-(3-카르복시프로필)-N-(3-설포프로필)아미노]-3-(5-클로로-벤즈이미다졸릴-2-일)쿠마린
Figure pct00107
단계 1. 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-(3-설포프로필]}아미노-3-[(5-클로로벤즈이미다졸릴-2-일)쿠마린(화합물 II-9tBu)의 제조
Figure pct00108
3-(5-클로로벤즈이미다졸릴-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.32 g, 1 mmol) 및 t-부틸 4-(N-3-설포프로필)아미노부타노에이트(0.56 g, 2 mmol)를 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.65 g, 5 mmol)를 이 혼합물에 첨가하였다. 120℃에서 15시간 동안 교반한 후에, 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 정치시키고, 이어서 물-아세토니트릴 1:1 혼합물(10 mL)로 희석시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 트라이에틸암모늄 염으로서 생성물 화합물 II-9tBu를 단리하였다.
단계 2. 이전 단계로부터의 트라이에틸암모니오 7-{N-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]-N-(3-설포네이토프로필)}아미노-3-(5-클로로벤즈이미다졸릴-2-일)쿠마린을 무수 다이클로로메탄(25 mL) 중에 용해시키고, 트라이플루오로아세트산(5 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류 제거하고, 잔류물을 아세토니트릴-물 1:1 혼합물(10 mL) 중에 용해시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 생성물을 단리하였다. 수율: 0.2 g(35%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 519.09. 실측치 m/z: (+) 520 (M+1)+; (-), 518 (M-1)-.
실시예 21. 화합물 II-10tBu: 7-[N-(3-카르복시프로필)-N-(3-설포프로필)아미노]-3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00109
3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.17 g, 0.5 mmol) 및 t-부틸 4-(N-3-설포프로필)아미노부타노에이트(0.28 g, 1 mmol)를 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 DMSO(5 mL)와 혼합하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.65 g, 5 mmol)를 첨가하였다. 110℃에서 17시간 동안 교반한 후에, 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 정치시키고, 이어서 물-아세토니트릴 1:1 혼합물(10 mL)로 희석시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 생성물 화합물 II-10tBu를 단리하였다. 용매를 증발시킨 후에, 황색 침전물을 여과하였다. 수율: 0.23 g(80%). 염료의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 586.16. 실측치 m/z: (+) 587 (M+1).
실시예 21. 화합물 II-11tBu: 7-[N-(3-카르복시프로필)-N-(3-설포프로필)아미노]-3-(6-카르복시벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00110
3-(6-카르복시벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.65 g, 2 mmol) 및 t-부틸 4-(N-3-설포프로필)아미노부타노에이트(1.13 g, 4 mmol) 및 무수 DMSO(15 mL)를 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(1.3 g, 10 mmol)를 첨가하였다. 120℃에서 15시간 동안 교반한 후에, 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반되게 두고, 이어서 물-아세토니트릴 1:1 혼합물(10 mL)로 희석시키고, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 생성물 화합물 II-11tBu를 단리하였다. 용매를 증발시킨 후에, 황색 침전물을 여과하였다. 수율: 0.66 g(56%). 염료의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 586.16. 실측치 m/z: (+) 587 (M+1).
실시예 22. 화합물 II-12: 7-다이에틸아미노-3-(5-카르복시-벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00111
에틸 (5-카르복시벤즈티아졸-2-일)아세테이트(0.27 g, 1 mmol), 다이에틸아미노 살리실산 알데하이드(0.21 g, 1.1 mmol), 피페리딘(5 방울), 및 아세트산(5 방울)을 무수 에탄올(5 mL)에 첨가하고, 생성된 혼합물을 60 내지 65℃에서 7시간 교반하고, 이어서 실온에서 하룻밤 그대로 두었다. 생성된 주황색 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 수율: 0.28 g(72%).
대안적인 합성
Figure pct00112
7-다이에틸아미노-3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)쿠마린(0.84 g, 2 mmol) 및 진한 황산(5 mL)을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 용액을 150℃에서 2시간 동안 가열하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반되게 두고, 빙수(50 g)로 희석시키고, 반응 혼합물을 하룻밤 교반되게 두었다. 황색 침전물을 여과하였다. 수율: 0.51 g(65%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 394.10. 실측치 m/z: (+) 395 (M+1)+; (-) 393 (M-1)-.
실시예 23. 화합물 II-13: 7-다이에틸아미노-3-(5-카르복시-1-페닐벤즈이미다졸-2-일)쿠마린
Figure pct00113
에틸 (5-카르복시-1-페닐벤즈이미다졸-2-일)아세테이트(0.16 g, 1 mmol) 및 다이에틸아미노 살리실산 알데하이드(0.21 g, 1.1 mmol)를 무수 에탄올(7 mL) 중에 용해시켰다. 피페리딘(5 방울), 그리고 아세트산(5 방울)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 80℃에서 5시간 교반하고, 이어서 실온에서 하룻밤 그대로 두었다. 생성된 주황색 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하였다. 수율: 0.16 g(70%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 453.17. 실측치 m/z: (+) 454 (M+1)+; (-) 452 (M-1)-.
실시예 24. 화합물 II-14: 3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)-7-[3-(에틸옥시카르보닐)프로필]아미노-쿠마린.
Figure pct00114
3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.65 g, 2 mmol) 및 에틸 4-아미노부타노에이트 하이드로클로라이드(0.5 g, 3 mmol)를 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 다이아이소프로필에틸아민(0.65 g, 5 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 110℃의 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 황색 반고체 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하면서 그대로 두었다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.5 g(58%). 염료의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 436.13. 실측치 m/z: (+) 437 (M+1)+; (-) 435 (M-1)-.
실시예 25. 화합물 II-15: 3-(6-카르복시벤족사졸-2-일)-7-[3-(에틸옥시카르보닐)프로필]아미노-쿠마린
Figure pct00115
3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.32 g, 1 mmol) 및 에틸 4-아미노부타노에이트 하이드로클로라이드(0.5 g, 3 mmol)를 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 다이아이소프로필에틸아민(0.39 g, 3 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 120℃의 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 황색 반고체 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 아세트산(1 mL)으로 산성화하고, 하룻밤 교반하면서 그대로 두었다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.21 g(48%). 염료의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 436.13. 실측치 m/z: (+) 437 (M+1)+; (-) 435 (M-1)-.
실시예 26. 화합물 II-16: 7-(3-카르복시프로필)아미노-3-(5-클로로벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00116
3-(5-클로로벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.32 g, 1 mmol) 및 4-아미노부탄산(0.21 g, 2 mmol)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 다이아이소프로필에틸아민(0.52 g, 4 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 135℃의 온도에서 7시간 동안 교반하였다. 4-아미노부탄산(0.1 g, 1 mmol) 및 다이아이소프로필에틸아민(0.26 g, 2 mmol)의 추가 분량을 첨가하고, 135℃에서 5시간 동안 가열을 계속하였다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 담황색 반응 혼합물을 물(15 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.12 g(30%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 398.07. 실측치 m/z: (+) 399 (M+1)+.
실시예 27. 화합물 II-17: 7-(3-카르복시프로필)아미노-3-(5-벤족사졸-2-일)쿠마린.
Figure pct00117
3-(벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.28 g, 1 mmol) 및 4-아미노부탄산(0.21 g, 2 mmol)을 무수 DMSO(5 mL) 중에 용해시키고, 이어서 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 다이아이소프로필에틸아민(0.26 g, 2 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 125℃의 온도에서 7시간 동안 교반하였다. 4-아미노부탄산(0.1 g, 1 mmol) 및 다이아이소프로필에틸아민(0.13 g, 1 mmol)의 추가 분량을 첨가하고, 125℃에서 3시간 동안 가열을 계속하였다. 담황색 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.08 g(23%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 364.11. 실측치 m/z: (+) 365 (M+1)+.
실시예 28. 화합물 II-18: 3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)-7-(3-설포프로필)아미노-쿠마린
Figure pct00118
3-(5-카르복시벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(0.33 g, 1 mmol) 및 3-아미노프로판설폰산(0.42 g, 3 mmol)을 무수 DMSO(5 mL)에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 다이아이소프로필에틸아민(0.39 g, 3 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 125℃의 온도에서 7시간 동안 교반하였다. 용매 부피의 절반을 진공 하에서 증류 제거하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반되게 두고, 이어서 물-아세토니트릴 1:1 혼합물(10 mL)로 희석시켰으며, 용리제로서 아세토니트릴-TEAB 혼합물을 사용하는 분취용 HPLC에 의해 생성물을 단리한다. 용매를 증발시킨 후에, 황색 침전물을 아세토니트릴(3 mL)로 분쇄(triturate)하고 여과하였다. 수율: 0.06 g(14%). 염료의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 444.06. 실측치 m/z: (+) 445 (M+1).
실시예 29. 형광 강도의 비교
염료 용액(EtOH-물 1:1; 최대 여기 파장 450 nm에서)의 형광 강도를 동일한 스펙트럼 영역에 대한 표준 염료와 비교하였다. 결과가 표 2에 나타나 있으며, 형광 기반 분석 응용을 위한 염료의 상당한 이점을 입증한다.
[표 2]
Figure pct00119
실시예 30. 완전 기능성 뉴클레오티드 접합체의 합성을 위한 일반적인 절차
본 명세서에 개시된 쿠마린 형광 염료를, 하기 아데닌 반응도식에 따라 적절한 시약을 사용하여 염료의 카르복실 기를 활성화시킨 후에, 적절한 아미노-치환된 아데닌(A) 및 시토신(C) 뉴클레오티드 유도체 A-LN3-NH2 또는 C-LN3-NH2와 커플링하였다:
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
아데닌 커플링에 대한 일반적인 생성물은 하기에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00123
ffA-LN3-Dye는 본 명세서에 개시된 쿠마린 염료로 표지되고 LN3 링커를 갖는 완전 기능화된 A 뉴클레오티드를 지칭한다. 각각의 구조 내의 R 기는 접합 후 쿠마린 염료 모이어티를 지칭한다.
염료(10 μmol)를 5 mL 둥근바닥 플라스크 내로 넣어서 건조시키고, 무수 다이메틸포름아미드(DMF, 1 mL) 중에 용해시키고, 이어서 용매를 진공 중에서 증류시킨다. 이 절차를 2회 반복한다. 건조된 염료를 실온에서 무수 N,N-다이메틸아세트아미드(DMA, 0.2 mL) 중에 용해시킨다. N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU, 1.5 eq., 15 μmol, 4.5 mg)를 염료 용액에 첨가하고, 이어서 DIPEA(3 eq., 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL)를 마이크로피펫을 통해 이 용액에 첨가한다. 반응 플라스크를 질소 가스 하에서 밀봉한다. 반응 진행을 TLC(용리제 아세토니트릴-물 1:9) 및 HPLC에 의해 모니터링한다. 한편, 적절한 아미노-치환된 뉴클레오티드 유도체의 용액(A-LN3-NH2, 20 mM, 1.5 eq, 15 μmol, 0.75 mL)을 진공 중에서 농축시키고, 이어서 물(20 μL) 중에 재용해시킨다. DMA 중 활성화된 염료의 용액을 N-LN3-NH2의 용액이 담긴 플라스크에 옮긴다. 추가의 DIPEA(3 eq, 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL)를 트라이에틸아민(1 μL)과 함께 첨가한다. 커플링의 진행을 TLC, HPLC, 및 LCMS에 의해 매시간마다 모니터링한다. 반응이 완료될 때, 트라이에틸아민 바이카르보네이트 완충액(TEAB, 0.05 M, 약 3 mL)을 피펫을 통해 반응 혼합물에 첨가한다. 켄칭된 반응 혼합물을 DEAE-Sephadex® 컬럼을 통해 이동시켜 잔존하는 미반응 염료의 대부분을 제거함으로써 완전 작용화된 뉴클레오티드의 초기 정제를 수행한다. 예를 들어, Sephadex를 빈 25 g Biotage 카트리지, 용매 시스템 TEAB/MeCN에 붓는다. Sephadex 컬럼으로부터의 용액을 진공 중에서 농축시킨다. 잔존 물질을 최소 부피의 물 및 아세토니트릴 중에 재용해시킨 후, 20 μm 나일론 필터를 통해 여과한다. 여과된 용액을 분취용-HPLC로 정제한다. 제조된 화합물의 조성은 LCMS에 의해 확인한다.
시토신 커플링에 대한 일반적인 생성물은 전술된 것과 유사한 절차에 따라 하기에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00124
ffC-LN3-Dye는 본 명세서에 개시된 쿠마린 염료로 표지되고 LN3 링커를 갖는 완전 기능화된 C 뉴클레오티드를 지칭한다. 각각의 구조 내의 R 기는 접합 후 쿠마린 염료 모이어티를 지칭한다.
실시예 31. 화학식 (II)의 화합물의 아미드 유도체의 제조
본 명세서에 기재된 일부 추가의 구현 형태는 화학식 (II)의 화합물의 아미드 유도체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 화학식 (IIa)의 화합물을 카르복실산 활성화를 통해 화학식 (IIa')의 화합물로 전환시키는 단계:
Figure pct00125
및 화학식 (IIa')의 화합물을 화학식 (Am)의 1차 또는 2차 아민과 반응시켜 화학식 (IIb)의 아미드 유도체에 도달하는 단계를 포함한다:
Figure pct00126
(상기 식에서, 변수 X, R, R1, R2, R3, R4, 및 R5는 본 명세서에서 정의되어 있으며; R'은 카르복실 활성화제(예컨대, N-하이드록시석신이미드, 니트로페놀, 펜타플루오로페놀, HOBt, BOP, PyBOP, DCC 등)의 잔류 모이어티이고; 각각의 RA 및 RB는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5원 내지 10원 헤테로아릴, 3원 내지 10원 헤테로사이클릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, 또는 (헤테로사이클릴)알킬임).
화학식 (IIb)의 화합물의 제조를 위한 일반적인 절차
적절한 화학식 (IIa)의 염료(0.001 mol)를 적합한 무수 유기 용매(DMF, 1.5 mL) 중에 용해시킨다. 이 용액에, 카르복실 활성화 시약, 예컨대 TSTU, BOP 또는 PyBOP를 첨가한다. 이 반응 혼합물을 실온에서 약 20분 동안 교반하고, 이어서 적절한 아민 유도체를 첨가한다. 반응 혼합물을 하룻밤 교반하고, 여과하고, 과량의 활성화 시약을 물 중 0.1 M TEAB 용액으로 켄칭한다. 용매를 진공 중에서 증발시키고, 잔류물을 TEAB 용액 중에 재용해시키고 HPLC로 정제한다.
예를 들어, 화합물 II-2의 1차 및 2차 아미드 유도체를 제조하였다:
Figure pct00127
실시예 32. 2-채널 서열분석 응용
본 명세서에서 서열분석 응용에서 기재된 염료로 표지된 A 뉴클레오티드의 효율을 2-채널 검출 방법에서 입증하였다. 본 명세서에 기재된 2-채널 방법과 관련하여, 미국 특허 출원 공개 제2013/0079232호에 기재된 방법 및 시스템을 이용하여 핵산이 서열분석될 수 있으며, 이의 개시 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
2-채널 검출에서는, 제1 채널에서 검출되는 제1 뉴클레오티드 유형, 제2 채널에서 검출되는 제2 뉴클레오티드 유형, 제1 채널 및 제2 채널 둘 모두에서 검출되는 제3 뉴클레오티드 유형, 및 어느 채널에서도 검출되지 않거나 최소한으로 검출되는, 표지가 결여되어 있는 제4 뉴클레오티드 유형을 제공함으로써 핵산이 서열분석될 수 있다. 실험의 RTA2.0.93 분석에 의해 산포도를 생성하였다. 하기의 도면에 예시된 산포도는 26회 사이클 실시 각각마다 사이클 5에서의 것이었다.
서열분석 조건:
CCL FC(cluster chemical linearization, 클러스터 화학적 선형화), PhiX 상에서의 60C, Pol1671에서의 스캐닝
세트 3을 제외하고는 하기와 같은 녹색 염료: ffA-BL-NR550S0/ffT-AF550POPOS0
Figure pct00128
산포도 도면
Figure pct00129
일부 구현 형태에서, 2차 아민-치환된 쿠마린 화합물이 형광 검출 및 합성에 의한 서열분석의 방법에 특히 적합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 구현 형태는 화학식 (III)의 구조의 염료 및 이의 유도체, 또는 이들의 염에 관한 것이다:
Figure pct00130
(III)
(상기 식에서,
X는 O, S, Se 또는 NRn이며, 여기서 Rn은 H 또는 C1-6알킬이고;
R 및 R1은 각각 독립적으로 H, 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
R2 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이거나; 또는 R2 및 R4 중 하나는 R3에 연결되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R3은 H, C1-6알킬, 치환된 C2-6알킬, 선택적으로 치환된 C2-6알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6알키닐, 또는 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴이거나, 또는 R3은 R2 또는 R4에 연결되어 선택적으로 치환된 고리를 형성하고;
여기서 R이 -CN인 경우, R3은 C1-6알킬이 아니고;
각각의 R5는 독립적으로 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;
m은 0, 1, 2, 3, 또는 4임).
일부 태양에서, R은 -CN이 아니며, 이로써 R은 H, 할로, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다.
다른 태양에는, 화학식 (IV)의 화합물 또는 이의 염이 있다:
Figure pct00131
(IV)
(상기 식에서,
X'은 O, S, 및 NRp로부터 선택되며, 여기서 Rp는 H 또는 C1-6알킬이고;
R6은 H 또는 C1-4알킬이고;
R7은 H, 할로, -CN, -OH, 선택적으로 치환된 C1-4알킬, 선택적으로 치환된 C1-4알케닐, 선택적으로 치환된 C2-4알키닐, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), -SO2N(C1-4알킬)2, 및 선택적으로 치환된 C1-4알콕시이고;
R8 및 R10은 각각 독립적으로 H, 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), -SO2N(C1-4알킬)2, 선택적으로 치환된 C1-6알킬, 선택적으로 치환된 C1-6알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6알키닐, 또는 선택적으로 치환된 C1-6알콕시이거나; 또는
R8 및 R10 중 하나는 H, 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), -SO2N(C1-4알킬)2, 선택적으로 치환된 C1-6알킬, 선택적으로 치환된 C1-6알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6알키닐, 또는 선택적으로 치환된 C1-6알콕시이고, R8 및 R10 중 다른 하나는 R9와 함께 결합되어 선택적으로 치환된 4원 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R9는 -CO2H, -CO2C1-4알킬, -CONH2, -CONH(C1-4알킬), -CON(C1-4알킬)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), 또는 -SO2N(C1-4알킬)2로 치환된 C2-6알킬 또는 C1-6알킬이고;
각각의 R11은 독립적으로 할로, -CN, 카르복시, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, 니트로, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), -SO2N(C1-4알킬)2, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 및 선택적으로 치환된 C1-6알콕시이고;
q는 0, 1, 또는 2임).
화학식 (III)의 화합물 또는 이의 염에 관하여, 다양한 치환체에 대한 특정 구현 형태가 하기에 나타나 있다. 각각의 단일 기는 달리 명시되지 않는 한 임의의 다른 개별 제한과 조합될 수 있다.
수계 용액 중에서의 바이오마커 및 특히 이의 바이오접합체의 형광 특성을 개선하기 위하여, 화학식 (III)의 화합물은
i) R2는 -SO3H이고/이거나;
ii) R4는 -SO3H이고/이거나;
iii) R5는 -SO3H 또는 -SO2NH2인 화합물이다.
일부 태양에서, X는 O 또는 S이다. 일부 태양에서, X는 O이다. 일부 태양에서, X는 S이다. 일부 태양에서, X는 NRn이며, 여기서 Rn은 H 또는 C1-6알킬이고, 일부 태양에서 Rn은 H이다.
일부 태양에서, R3은 H이다. 일부 태양에서, R3은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 또는 헥실이다. 다른 태양에서, R3은 에틸이다. 다른 태양에서, R3은 치환된 C2-6 알킬이다. 다른 태양에서, R3은 -CO2H로 치환된 C2-6알킬이다. 다른 태양에서, R3은 선택적으로 치환된 C2-6알케닐 또는 선택적으로 치환된 C2-6알키닐이다. 일부 태양에서, R3은 R2 또는 R4에 연결되어 선택적으로 치환된 고리를 형성한다.
링커 또는 뉴클레오티드에 대한 커플링이 R3을 통해 이루어지는 경우, R3은 그에 부착된 작용기에 대한 커플링을 가능하게 하기에 충분한 길이를 가져야 한다. 일부 태양에서, R3은 -CH2COOH 또는 -CH2COO-가 아니다.
선택적으로, R3은 -(CH2)nCOOH이며, 여기서 n은 2 내지 6이다. 일부 태양에서, n은 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 다른 태양에서, n은 2 또는 5이다. 일부 태양에서, n은 2이다. 일부 태양에서, n은 5이다.
선택적으로, R3은 -(CH2)nSO3H이며, 여기서 n은 2 내지 6이다. 일부 태양에서, n은 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 다른 태양에서, n은 2 또는 5이다. 일부 태양에서, n은 2이다. 일부 태양에서, n은 5이다.
인돌 모이어티의 벤젠 고리는 R5로 나타낸 치환체에 의해 임의의 1, 2, 3, 또는 4개의 위치에서 선택적으로 치환된다. m이 0인 경우, 벤젠 고리는 비치환된다. m이 1보다 큰 경우, 각각의 R5는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 태양에서, m은 0이다. 다른 태양에서, m은 1이다. 다른 태양에서, m은 2이다. 일부 태양에서, m은 1, 2, 또는 3이고, 각각의 R5는 독립적으로 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, -SO3H, 또는 -SO2NH2이다. 일부 태양에서, R5는 -(CH2)xCOOH이며, 여기서 x는 2 내지 6이다. 일부 태양에서, x는 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 다른 태양에서, x는 2 또는 5이다. 일부 태양에서, x는 2이다. 일부 태양에서, x는 5이다.
일부 태양에서, R5는 할로, -CN, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, 또는 선택적으로 치환된 C1-6알킬이다. 일부 태양에서, R5는 할로, -CO2H, -SO3H, 또는 -SO2NH2이다. 일부 태양에서, R5는 -CO2H, -SO3H, 또는 -SO2NH2로 치환된 C2-6알킬이다. 일부 태양에서, 각각의 R5는 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-6알킬, 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, -SO3H, 또는 -SO2NH2이다.
일부 태양에서, R1은 H이다. 일부 태양에서, R1은 할로이다. 일부 태양에서, R1은 Cl이다. 일부 태양에서, R1은 C1-6알킬이다. 일부 태양에서, R1은 메틸이다.
일부 태양에서, R은 H이다. 일부 태양에서, R은 할로이다. 일부 태양에서, R은 Cl이다. 일부 태양에서, R은 C1-6알킬이다. 일부 태양에서, R은 메틸이다. 일부 태양에서, R은 -CN이 아니다. 일부 태양에서, R은 H, 할로, -CO2H, 아미노, -OH, C-아미도, N-아미도, -NO2, -SO3H, -SO2NH2, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 아미노알킬, 선택적으로 치환된 카르보사이클릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴, 선택적으로 치환된 아릴, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다.
일부 태양에서, R2는 H이다. 일부 태양에서, R2는 선택적으로 치환된 알킬이다. 일부 태양에서, R2는 -CO2H 또는 -SO3H로 선택적으로 치환된 C1-4알킬이다. 일부 태양에서, R2는 -SO3H이다. 일부 태양에서, R2는 R3에 연결되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리, 예컨대 하나 이상의 알킬 기로 선택적으로 치환된 피롤리딘 또는 피페리딘을 형성한다. 일부 태양에서, R2는 H, 선택적으로 치환된 알킬, -CO2H 또는 -SO3H로 선택적으로 치환된 C1-4알킬, 또는 -SO3H이다. 일부 태양에서, R2는 H 또는 -SO3H이다.
일부 태양에서, R4는 H이다. 일부 태양에서, R4는 선택적으로 치환된 알킬이다. 일부 태양에서, R4는 -CO2H 또는 -SO3H로 선택적으로 치환된 C1-4알킬이다. 일부 태양에서, R4는 -SO3H이다. 일부 태양에서, R4는 R3에 연결되어 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리, 예컨대 하나 이상의 알킬 기로 선택적으로 치환된 피롤리딘 또는 피페리딘을 형성한다.
화학식 (III)의 화합물의 특정 예에는 X가 O 또는 S이고; R이 H이고; R1이 H이고; R3이 -(CH2)nCOOH이며, 여기서 n은 2 내지 6이고; R5가 H, -SO3H, 또는 -SO2NH2이고; R2가 H 또는 -SO3H이고; R4가 H 또는 -SO3H인 경우가 포함된다.
화학식 (III)의 화합물의 특정 예에는 X가 O 또는 S이고; R이 H이고; R1이 H이고; R3이 -(CH2)2COOH이고; R5가 H, -SO3H, 또는 -SO2NH2이고; R2가 H 또는 -SO3H이고; R4가 H 또는 -SO3H인 경우가 포함된다.
화학식 (III)의 화합물의 특정 예에는 X가 O 또는 S이고; R이 H이고; R1이 H이고; R3이 -(CH2)5COOH이고; R5가 H, -SO3H, 또는 -SO2NH2이고; R2가 H 또는 -SO3H이고; R4가 H 또는 -SO3H인 경우가 포함된다.
화학식 (IV)의 일부 태양에서, X'은 O이다. 일부 태양에서, X'은 S이다. 일부 태양에서, X'은 NRp이며, 여기서 Rp는 H 또는 C1-6알킬이다. 일부 태양에서, X'은 NRp이며, 여기서 Rp는 H이다.
일부 태양에서, R6은 H이다. 일부 태양에서, R6은 C1-4알킬이다.
일부 태양에서, R7은 H이다. 일부 태양에서, R7은 선택적으로 치환된 C1-4알킬, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), 또는 -SO2N(C1-4알킬)2이다. 일부 태양에서, R7은 -CO2H로 선택적으로 치환된 C1-4알킬이다.
일부 태양에서, R8은 H이다. 일부 태양에서, R8은 -CO2H, -SO3H, 또는 -SO2NH2이다. 일부 태양에서, R8은 -SO3H이다.
일부 태양에서, R10은 H이다. 일부 태양에서, R10은 -CO2H, -SO3H, 또는 -SO2NH2이다. 일부 태양에서, R10은 -SO3H이다. 일부 태양에서, R8은 H이고, R10은 -SO3H이다. 일부 태양에서, R8은 -SO3H이고, R10은 H이다.
일부 실시 형태에서, R8 및 R10 중 하나는 H, 할로, -CN, -CO2H, 아미노, -OH, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), -SO2N(C1-4알킬)2, 선택적으로 치환된 C1-6알킬, 선택적으로 치환된 C1-6알케닐, 선택적으로 치환된 C2-6알키닐, 또는 선택적으로 치환된 C1-6알콕시이고, R8 및 R10 중 다른 하나는 R9와 함께 결합되어 선택적으로 치환된 4원 내지 7원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
일부 태양에서, R9는 C2-6알킬이다. 일부 태양에서, R9는 -CO2H, -CO2C1-4알킬, -CONH2, -CONH(C1-4알킬), -CON(C1-4알킬)2, -CN, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), 또는 -SO2N(C1-4알킬)2로 치환된 C1-6알킬이다. 일부 태양에서, R9는 -CO2H로 치환된 C1-6알킬이다. 일부 태양에서, R9는 -(CH2)y-CO2H이며, 여기서 y는 2, 3, 4, 또는 5이다.
일부 태양에서, 각각의 R11은 독립적으로 할로, -CO2H, -SO3H, -SO2NH2, -SO2NH(C1-4알킬), -SO2N(C1-4알킬)2, 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 다른 태양에서, 각각의 R11은 독립적으로 할로, -CO2H, -SO3H, 또는 -SO2NH2이다.
일부 태양에서, q는 0이다. 다른 태양에서, q는 1이다. 또 다른 태양에서, q는 2이다.
2차 아민-치환된 쿠마린 염료의 구체적인 예에는 하기가 포함된다:
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
및 이의 염.
특히 유용한 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 염료로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 표지는 알킬-카르복시 기를 통해 쿠마린 분자의 질소 원자에 부착되어 알킬-아미드를 형성할 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 표지는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치에 부착되어 있을 수 있다.
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 블록킹 기를 가질 수 있다. 블록킹 기는 리보스 또는 데옥시리보스 당 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 구현 형태에서, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당의 3' OH 위치에 있다.
본 명세서에는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오티드는 본 발명의 화합물로 표지된 뉴클레오티드이다. 키트는 2개 이상의 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오티드는 2개 이상의 형광 표지로 표지될 수 있다. 이들 표지 중 2개 이상이 단일 여기 공급원 - 이는 레이저일 수 있음 - 을 사용하여 여기될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 표지에 대한 여기 대역들은 적어도 부분적으로 중첩될 수 있으며, 이로써 스펙트럼의 중첩 영역 내의 여기는 두 표지 모두로부터의 형광 방출을 야기시킨다. 특정 구현 형태에서, 2개 이상의 표지로부터의 방출은 스펙트럼의 상이한 영역에서 일어날 것이며, 이로써 이들 표지 중 적어도 하나의 존재는 방출을 광학적으로 구별함으로써 결정될 수 있게 된다.
키트는 4개의 표지된 뉴클레오티드를 수용할 수 있으며, 여기서 4개의 뉴클레오티드 중 첫 번째 것은 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물로 표지된다. 그러한 키트에서, 4개의 뉴클레오티드 각각은 나머지 다른 3개의 뉴클레오티드 상의 표지와 동일하거나 상이한 화합물로 표지될 수 있다. 따라서, 이들 화합물 중 하나 이상은 그러한 화합물(들)이 다른 화합물과 구별될 수 있도록 하는 별개의 흡광도 최대치 및/또는 방출 최대치를 가질 수 있다. 예를 들어, 각각의 화합물은 별개의 흡광도 최대치 및/또는 방출 최대치를 가질 수 있으며, 이로써 이들 화합물 각각은 나머지 다른 3개의 화합물과 구별가능하게 된다. 최대치 이외에 흡광도 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼의 일부는 상이할 수 있으며, 이들 차이는 이들 화합물을 구별하는 데 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 키트는 이들 화합물 중 2개 이상이 별개의 흡광도 최대치를 갖도록 할 수 있다. 이들 화합물은 500 nm 미만의 영역에서 광을 흡수할 수 있다.
본 명세서에 기재된 화합물, 뉴클레오티드, 또는 키트는 생물학적 시스템(예를 들어, 이의 프로세스 또는 성분을 포함함)을 검출, 측정, 또는 확인하는 데 사용될 수 있다. 이들 화합물, 뉴클레오티드 또는 키트를 사용할 수 있는 일부 기법에는 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 세포 검정(예를 들어, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 검정(예를 들어, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)이 포함된다. 이러한 사용은 자동화 서열분석 기기와 같은 특정 기법을 수행하기 위한 자동화 기기 상에서 행해질 수 있다. 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2개의 레이저를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물을 합성하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 발명에 따른 염료는 다양한 각종 적합한 출발 물질로부터 합성될 수 있다. 쿠마린 염료를 제조하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서에 기재된 화합물은 몇몇 메소머 형태로 나타낼 수 있다. 단일 구조가 그려져 있는 경우, 관련 메소머 형태들 중 임의의 것이 의도된다. 본 명세서에 기재된 쿠마린 화합물은 단일 구조로 나타내지만, 관련된 메소머 형태들 중 임의의 것으로 동일하게 나타낼 수 있다. 일부 메소머 구조가 화학식 (III)에 대해 하기에 나타나 있다:
Figure pct00138
(III)
본 명세서에 기재된 화합물의 단일 메소머 형태가 나타나 있는 각각의 경우에, 대안적인 메소머 형태가 동일하게 고려된다.
생체분자에 대한 부착은 화학식 (III)의 화합물의 R, R1, R2, R3, R4, R5, 또는 X 위치를 통해 이루어질 수 있다. 일부 태양에서, 연결은 화학식 (III)의 R3 또는 R5 기를 통해 이루어진다. 화학식 (IV)의 경우, 부착은 임의의 위치 R6 내지 R11 또는 X'에서 이루어질 수 있다. 일부 구현 형태에서, 치환기는 치환된 알킬이며, 예를 들어 -CO2H, 또는 카르복실 기의 활성화된 형태, 예를 들어 아미드 또는 에스테르 - 이것은 생체분자의 아미노 또는 하이드록실 기에 대한 부착에 사용될 수 있음 - 로 치환된 알킬이다. 일 구현 형태에서, 화학식 (III)의 R, R1, R2, R3, R4, R5, 또는 X 기 또는 화학식 (IV)의 R6 내지 R11 또는 X' 기는 추가의 아미드/펩티드 결합 형성에 가장 적합한 활성화된 에스테르 또는 아미드 잔기를 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화된 에스테르"는 온화한 조건에서, 예를 들어 아미노 기를 함유하는 화합물과 반응할 수 있는 카르복실 기 유도체를 지칭한다. 활성화된 에스테르의 비제한적인 예에는 p-니트로페닐, 펜타플루오로페닐 및 석신이미도 에스테르가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
일부 구현 형태에서, 염료 화합물은 뉴클레오티드 염기를 통해 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드에 공유적으로 부착될 수 있다. 예를 들어, 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 표지는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치에 부착되어 있을 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 3'-OH 블록킹 기를 가질 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 형광 염료의 특히 유용한 용도는 생체분자, 예를 들어 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 표지화하기 위한 것이다. 본 출원의 일부 구현 형태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 형광 화합물로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
추가의 구현 형태가 하기의 실시예에서 더 상세히 개시되며, 이러한 실시예는 결코 본 발명의 범주를 제한하고자 의도되지 않는다.
추가의 구현 형태가 하기의 실시예에서 더 상세히 개시되며, 이러한 실시예는 결코 본 발명의 범주를 제한하고자 의도되지 않는다. 표 3은 실시예에 개시된 쿠마린 형광 염료의 스펙트럼 특성을 요약한다. 표 4는 본 명세서에 개시된 염료로 표지된 다양한 뉴클레오티드의 구조 및 스펙트럼 특성을 요약한다.
실시예 33: 화합물 III-1-1: 7-(5-카르복시펜틸)아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
Figure pct00139
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린 유도체(FC-1, 0.4 g, 1.345 mmol, 1 eq) 및 6-아미노헥산산(AC-C5, 0.25 g, 1.906 mmol, 1.417 eq)을 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 3 mL)에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 N,N-다이아이소프로필-N-에틸아민(DIPEA, 0.25 g, 2 mmol, 2 eq)을 이 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 120℃에서 3시간 동안 교반하였다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 황색 반고체 반응 혼합물을 물(5 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.36 g(65.5%). MS (DUIS): MW 계산치 408.47. 실측치 m/z: (+) 409 (M+1)+; (-) 407 (M-1)-. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6) δ: 12.03 (m, 2H), 9.00 (s, 1H), 8.12 (d, J = 7.9 ㎐, 1H), 7.99 (d, J = 8.1 ㎐, 1H), 6.73 (dd, J = 8.8, 2.1 ㎐, 1H), 6.54 (d, J = 2.0 ㎐, 1H), 3.18 (q, J = 6.5 ㎐, 2H), 2.23 (t, J = 7.3 ㎐, 2H), 1.57 (dp, J = 14.7, 7.2 ㎐, 4H), 1.39 (dq, J = 9.2, 4.5, 3.5 ㎐, 2H).
실시예 34: 화합물 III-1-2: 7-(5-카르복시펜틸)아미노-3-(벤즈이미다졸-2-일)쿠마린
Figure pct00140
3-(벤즈이미다졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(FC-2, 0.28 g, 1 mmol, 1 eq) 및 6-아미노헥산산(AC-C5, 0.13 g, 1 mmol, 1 eq)을 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 2 mL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.25 g, 2 mmol, 2 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 130℃의 온도에서 4시간 동안 교반하였다. 6-아미노헥산산(AC-1, 0.13 g, 1 mmol, 1 eq) 및 DIPEA(0.26 g, 2 mmol, 2 eq)의 추가 분량을 반응 혼합물에 첨가하고, 130℃에서 5시간 동안 가열을 계속하였다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 담황색 반응 혼합물을 물(5 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.26 g(68.5%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 391.15. 실측치 m/z: (+) 392 (M+1)+; (-) 390 (M-1)-, 781 (2M-1) -.
실시예 35: 화합물 III-1-3: 7-(2-카르복시에틸)아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
단계 A: 7-[2-(t-부틸옥시카르보닐)에틸]아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린.
Figure pct00141
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(FC-1, 0.3 g, 1.01 mmol, 1 eq) 및 t-부틸 3-아미노프로피오네이트 하이드로클로라이드(AC-C2, 0.2 g, 1.1 mmol, 1.09 eq)를 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 2 mL)에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.26 g, 2 mmol, 2 eq)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 교반하였다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 황색 반응 혼합물을 물(7 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.38 g(69%). MS (DUIS): MW 계산치 422.13. 실측치 m/z: (+) 423 (M+1)+; (-) 421 (M-1)-. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6) δ: 9.28 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.27 - 8.16 (m, 1H), 8.10 (tt, J = 8.3, 0.9 ㎐, 2H), 8.05 - 7.92 (m, 1H), 7.72 (d, J = 8.8 ㎐, 1H), 7.66 - 7.55 (m, 1H), 7.51 (dddd, J = 11.4, 8.2, 7.1, 1.3 ㎐, 2H), 7.46 - 7.32 (m, 2H), 6.74 (dd, J = 8.7, 2.1 ㎐, 1H), 6.58 (d, J = 2.1 ㎐, 1H), 3.41 (q, J = 6.3 ㎐, 2H), 2.55 (t, J = 6.4 ㎐, 2H), 1.41 (s, 9H).
단계 B.
Figure pct00142
무수 다이클로로메탄(20 mL) 중 7-[2-(t-부틸옥시카르보닐)에틸]아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린(III-1-3tBu, 0.2 g, 0.473 mmol)의 용액을 트라이플루오로아세트산(0.5 mL)으로 처리하고, 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류 제거하고, 잔류물을 물(10 mL)로 분쇄하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.15 g(86%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 366.39. 실측치 m/z: (+) 367 (M+1)+; (-) 365 (M-1)-.
실시예 36: 화합물 III-1-4: 7-(3-카르복시프로필)아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린
단계 A: 7-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린.
Figure pct00143
3-(벤조티아졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(FC-1, 0.6 g, 2.02 mmol, 1 eq) 및 t-부틸 4-아미노부타노에이트 하이드로클로라이드(AC-C3, 0.5 g, 2.56 mmol, 1.27 eq)를 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.65 g, 5 mmol, 4 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃의 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 황색 반고체 반응 혼합물을 물(10 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하면서 그대로 두었다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.7 g(79%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 436.53. 실측치 m/z: (+) 437 (M+1)+; (-) 435 (M-1)-.
단계 B.
Figure pct00144
무수 다이클로로메탄(25 mL) 중 7-[3-(t-부틸옥시카르보닐)프로필]아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린(III-1-4tBu, 0.7 g, 1.604 mmol)의 용액을 트라이플루오로아세트산(1 mL)으로 처리하고, 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 용매를 증류 제거하고, 잔류물을 물(10 mL)로 분쇄하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.59 g(97%). 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 366.39. 실측치 m/z: (+) 381 (M+1)+; (-) 379 (M-1)-. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d 6) δ: 12.17 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.12 (d, J = 8.0 ㎐, 1H), 7.99 (d, J = 8.1 ㎐, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 ㎐, 1H), 7.48 - 7.30 (m, 2H), 6.73 (dd, J = 8.8, 2.1 ㎐, 1H), 6.57 (d, J = 2.1 ㎐, 1H), 3.21 (q, J = 6.6 ㎐, 2H), 2.36 (d, J = 7.3 ㎐, 2H), 1.80 (p, J = 7.3 ㎐, 2H).
실시예 37: 화합물 III-1-5: 7-(5-카르복시펜틸)아미노-3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)쿠마린
Figure pct00145
3-(5-클로로-벤족사졸-2-일)-7-플루오로-쿠마린(FC-3, 0.32 g, 1 mmol, 1 eq) 및 6-아미노헥산산(AC-C5, 0.26 g, 2 mmol, 2 eq)을 둥근바닥 플라스크 내에서 무수 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 5 mL)에 첨가하였다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 실온에서 수분 동안 교반하고, 이어서 DIPEA(0.52 g, 4 mmol, 2 eq)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 135℃의 온도에서 7시간 동안 교반하였다. 6-아미노헥산산(AC-1, 0.13 g, 1 mmol, 1 eq) 및 DIPEA(0.26 g, 2 mmol, 2 eq)의 추가 분량을 첨가하고, 135℃에서 5시간 동안 가열을 계속하였다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 담황색 반응 혼합물을 물(15 mL)로 희석시키고, 하룻밤 교반하였다. 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 0.09 g(21%). 생성물의 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 426.10. 실측치 m/z: (+) 427 (M+1)+; (-) 425 (M-1)-, 851 (2M-1) -.
실시예 38: 화합물 III-2A 7-(5-카르복시펜틸)아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린-6-설폰산 및 화합물 III-2B 7-(5-카르복시펜틸)아미노-3-(벤조티아졸-2-일)쿠마린-8-설폰산
Figure pct00146
화합물 III-1-1(0.1 g, 0.245 mmol)을 교반하면서 20% 발연 황산(1 mL)에 소량씩 첨가하였으며, 이때 20% 발연 황산은 드라이아이스/아세톤 욕 중에서 냉각시켰다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 실온으로 가온하고, 이어서 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 무수 에테르(25 mL)에 부었다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 78 mg(65%). 1H NMR (d6-DMSO)은 화합물 2A + 소량(약 4%)의 화합물 2B를 보여주었다.
Figure pct00147
실시예 화합물 III-2A, 나트륨 염: 상기로부터의 침전물을 물(2 mL) 중에 재현탁시키고, 5 M NaOH 용액을 첨가함으로써 현탁액의 pH를 약 5로 조정하였다. 생성된 혼합물을 10 mL의 메탄올에 붓고 현탁액을 여과하였다. 여과액을 증발 건조시켜 나트륨 염(III-2A-Na)으로서 염료를 얻었다. 순도, 구조 및 조성을 HPLC, NMR 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 488.07. 실측치 m/z: (+) 489 (M+1)+; (-) 243 (M-1)2-, 487 (M-1)-.
화합물 III-2A 및 화합물 III-2B의 트라이에틸암모늄 염의 제조: 화합물 III-1-1(0.41 g, 1 mmol)을 교반하면서 20% 발연 황산(5 mL)에 소량씩 첨가하였으며, 이때 20% 발연 황산은 드라이아이스/아세톤 욕 중에서 냉각시켰다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 실온으로 가온하고, 이어서 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 무수 에테르(50 mL)에 부었다. 실온에서 1시간 동안 정치시킨 후에, 유기 용매 층을 가만히 따라내고 반고체 하부 층을 아세토니트릴-물(1:1, 10 mL) 중에 용해시켰다. 물 중 2 M TEAB 용액을 첨가함으로써 용액의 pH를 약 7.0으로 조정하였다. 생성된 용액을 20 μm 나일론 필터를 통해 여과하고, 이성질체들을 분취용 HPLC에 의해 분리하였다. 이성질체들의 용액을 진공 중에서 농축시키고, 이어서 물(20 μL) 중에 재용해시키고, 용매를 진공 중에서 제거하여 건조시켜, 트라이에틸암모늄 염으로서 염료를 얻었다. 순도 및 조성을 HPLC 및 LCMS에 의해 확인하였다.
실시예 39: 화합물 III-3 7-(5-카르복시펜틸)아미노-3-[5-설포네이토(벤조티아졸-2-일)-쿠마린-6-설포네이트 트라이에틸암모늄 염
Figure pct00148
화합물 III-1-1(0.08 g, 0.2 mmol)을 교반하면서 20% 발연 황산(2 mL)에 소량씩 첨가하였으며, 이때 20% 발연 황산은 드라이아이스/아세톤 욕 중에서 냉각시켰다. 첨가가 완료된 후에, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하고, 실온으로 가온하고, 이어서 70℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 용액을 무수 에테르(30 mL)에 부었다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후에, 생성된 침전물을 흡인 여과에 의해 수집하였다. 수율 43 mg(38%).
침전물을 물(2 mL) 중에 재현탁시키고, 물 중의 2 M TEAB 용액을 첨가함으로써 현탁액의 pH를 약 7.5로 조정하였다. 생성된 혼합물을 20 μm 나일론 필터를 통해 여과하고, 분취용 HPLC에 의해 정제하였다. 염료 분획을 진공 중에서 농축시키고, 이어서 물(20 μL) 중에 재용해시키고, 용매를 진공 중에서 제거하여 건조시켜, 비스-트라이에틸암모늄 염으로서 염료를 얻었다. 순도 및 조성을 HPLC 및 LCMS에 의해 확인하였다. MS (DUIS): MW 계산치 568.03. 실측치 m/z: (+) 569 (M+1)+.
염료 용액의 형광 강도를 동일한 스펙트럼 영역에 대한 시판 염료와 비교하였다. 결과가 표 3에 나타나 있으며, 형광 기반 분석 응용을 위한 염료의 상당한 이점을 입증한다.
[표 3]
Figure pct00149
실시예 40: 형광 염료와의 완전 기능성 뉴클레오티드 접합체의 합성을 위한 일반적인 절차
본 명세서에 개시된 쿠마린 형광 염료를, 하기 아데닌 반응도식에 따라 적절한 시약을 사용하여 염료의 카르복실 기를 활성화시킨 후에, 적절한 아미노-치환된 아데닌(A) 및 시토신(C) 뉴클레오티드 유도체 A-LN3-NH2 또는 C-LN3-NH2와 커플링하였다:
Figure pct00150
Figure pct00151
Figure pct00152
아데닌 커플링에 대한 일반적인 생성물은 하기에 나타낸 바와 같다:
Figure pct00153
ffA-LN3-Dye는 본 명세서에 개시된 쿠마린 염료로 표지되고 LN3 링커를 갖는 완전 기능화된 A 뉴클레오티드를 지칭한다. 각각의 구조 내의 R 기는 접합 후 쿠마린 염료 모이어티를 지칭한다.
염료(10 μmol)를 5 mL 둥근바닥 플라스크 내로 넣어서 건조시키고, 무수 다이메틸포름아미드(DMF, 1 mL) 중에 용해시키고, 이어서 용매를 진공 중에서 증류시킨다. 이 절차를 2회 반복한다. 건조된 염료를 실온에서 무수 N,N-다이메틸아세트아미드(DMA, 0.2 mL) 중에 용해시킨다. N,N,N',N'-테트라메틸-O-(N-석신이미딜)우로늄 테트라플루오로보레이트(TSTU, 1.5 eq., 15 μmol, 4.5 mg)를 염료 용액에 첨가하고, 이어서 DIPEA(3 eq., 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL)를 마이크로피펫을 통해 이 용액에 첨가한다. 반응 플라스크를 질소 가스 하에서 밀봉한다. 반응 진행을 TLC(용리제 아세토니트릴-물 1:9) 및 HPLC에 의해 모니터링한다. 한편, 적절한 아미노-치환된 뉴클레오티드 유도체의 용액(A-LN3-NH2, 20 mM, 1.5 eq, 15 μmol, 0.75 mL)을 진공 중에서 농축시키고, 이어서 물(20 μL) 중에 재용해시킨다. DMA 중 활성화된 염료의 용액을 N-LN3-NH2의 용액이 담긴 플라스크에 옮긴다. 추가의 DIPEA(3 eq, 30 μmol, 3.8 mg, 5.2 μL)를 트라이에틸아민(1 μL)과 함께 첨가한다. 커플링의 진행을 TLC, HPLC, 및 LCMS에 의해 매시간마다 모니터링한다. 반응이 완료될 때, 트라이에틸아민 바이카르보네이트 완충액(TEAB, 0.05 M, 약 3 mL)을 피펫을 통해 반응 혼합물에 첨가한다. 켄칭된 반응 혼합물을 DEAE-Sephadex® 컬럼을 통해 이동시켜 잔존하는 미반응 염료의 대부분을 제거함으로써 완전 작용화된 뉴클레오티드의 초기 정제를 수행한다. 예를 들어, Sephadex를 빈 25 g Biotage 카트리지, 용매 시스템 TEAB/MeCN에 붓는다. Sephadex 컬럼으로부터의 용액을 진공 중에서 농축시킨다. 잔존 물질을 최소 부피의 물 및 아세토니트릴 중에 재용해시킨 후, 20 μm 나일론 필터를 통해 여과한다. 여과된 용액을 분취용-HPLC로 정제한다. 제조된 화합물의 조성을 LCMS에 의해 확인하였다.
[표 4]
Figure pct00154
본 명세서에 개시된 염료로 표지된 뉴클레오티드의 용액에서의 형광 강도와, 동일한 스펙트럼 영역에 대한 시판 염료(AttoTec GmbH로부터의 Atto465)로 표지된 뉴클레오티드에 대한 적절한 데이터의 비교는 형광 기반 분석 응용에 사용하기 위하여 생체분자의 표지화하는 데 있어서의 본 명세서에 기재된 염료들의 이점을 입증한다.
A. 예시적인 적색 및 녹색 염료
본 발명의 일부 태양은 화학식 (V)의 화합물 또는 이의 메소머 형태를 제공한다:
Figure pct00155
(V)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 또는 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 선택적으로 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬임).
일부 태양에서, 각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이며, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, 또는 Ra1 또는 Ra2는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이며, 추가의 고리는 SO3 -를 갖거나, 또는 Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이다. 일부 태양에서, 각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이며, 여기서는 n이 0일 때, Y는 S 또는 O이다. 일부 태양에서, 각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이며, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, 또는 Ra1 또는 Ra2는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이며, 추가의 고리는 SO3 -를 갖거나, 또는 Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이며, 여기서는 n이 0일 때, Y는 S 또는 O이다.
이들 분자는 위치 Ra에서 하나 이상의 설폰아미드 또는 SO3 - 모이어티를 함유할 수 있다. Ra1 및/또는 Ra2는 SO3 - 또는 설폰아미드일 수 있다. 다른 하나의 Ra(Ra1 또는 Ra2)는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리일 수 있다. Ra1 또는 Ra2는 H일 수 있다. Ra1 또는 Ra2는 SO3 -일 수 있다. Ra1은 Ra2와 상이할 수 있으며, 예를 들어 이 구조는 Ra1에서 단일 설폰아미드 기를, 그리고 Ra2에서 H를 가질 수 있다. Ra1 및 Ra2는 둘 모두 설폰아미드일 수 있다. 설폰아미드는 SO2NH2 또는 SO2NHR일 수 있으며, 여기서 R은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴 기이다. Ra1 또는 Ra2 어느 것도 SO3 - 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리가 아닌 경우, Rc1 또는 Rc2는 알킬설폰산 기여야 한다.
Ra1 또는 Ra2는 인돌 고리의 인접한 탄소에 융합된 추가의 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 고리일 수 있다. 예를 들어, 그러한 경우에, 방향족 고리가 융합될 때, 염료 말단 기는 하기 유형의 구조를 나타낼 수 있다:
Figure pct00156
(상기 식에서, Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카르복시, 설폰아미드, 또는 설폰산일 수 있음).
따라서, 본 발명의 일부 염료는 화학식 (VC) 또는 화학식 (VD) 또는 이들의 메소머 형태로 기재될 수 있다:
Figure pct00157
(VC)
Figure pct00158
(VD)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 또는 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 선택적으로 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카르복시, 설폰아미드, 또는 설폰산임).
일부 태양에서, Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카르복시, 설폰아미드, 또는 설폰산이며, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, 또는 Rd는 SO3 -이거나, 또는 Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이다. 일부 태양에서, Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카르복시, 설폰아미드, 또는 설폰산이며, 여기서는 n이 0일 때, Y는 S 또는 O이다. 일부 태양에서, Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카르복시, 설폰아미드, 또는 설폰산이며, 여기서 Ra1 또는 Ra2 중 적어도 하나는 SO3 -이거나, 또는 Rd는 SO3 -이거나, 또는 Rc1 또는 Rc2는 알킬 설폰산 기이며, 여기서는 n이 0일 때, Y는 S 또는 O이다.
화학식 (VC) 또는 화학식 (VD)에서, 인돌 고리의 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리는, 예를 들어 설폰산 또는 설폰아미드로 선택적으로 치환될 수 있다.
C(=O)-X 카르복시 기 또는 이의 유도체는 길이 q의 알킬 사슬에 의해 인돌 질소 원자에 부착되며, 여기서 q는 1 내지 5개의 탄소 또는 헤테로원자이다. 이 사슬은 (CH2)q일 수 있으며, 여기서 q는 1 내지 5이다. 이 기는 (CH2)5COOH일 수 있다.
이들 분자는 위치 Rc에서 하나 이상의 알킬-설포네이트 모이어티를 함유할 수 있다. Rc1 및/또는 Rc2는 어느 것도 알킬-SO3 -일 수 있다. 다른 하나의 Rc(Rc1 또는 Rc2)는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 (CH2)tSO3H일 수 있으며, 여기서 t는 1 내지 6이다. t는 1 내지 4일 수 있다. t는 4일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 치환된 알킬 기일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 COOH 또는 -SO3H 모이어티 또는 이들의 에스테르 또는 아미드 유도체를 함유할 수 있다.
소정의 구현 형태에서, Ra1 또는 Ra2 중 하나가 SO3 -이고 Ra1 또는 Ra2 중 다른 하나가 H 또는 SO3 -일 때, Rc1 또는 Rc2 중 어느 것도 또한 알킬 설폰산 기일 수 있다.
C(=O)-X로 나타낸 COOH 기는 추가의 부착을 위한 연결 모이어티로서 작용할 수 있거나 추가의 분자에 연결되어 있다. 일단 접합이 일어났으면, COOH 또는 COO-는 아미드 또는 에스테르로 전환된다.
화합물의 예에는 화학식 (VI) 또는 화학식 (VIa)에 따른 구조 또는 이들의 메소머 형태가 포함된다:
Figure pct00159
(VI)
Figure pct00160
(VIa)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 또는 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 선택적으로 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬임).
일부 태양에서, 각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이며, 여기서는 n이 0일 때, Y는 S 또는 O이다.
화합물의 추가의 예에는 화학식 (VIIa) 또는 화학식 (VIIb)에 따른 구조가 포함된다:
Figure pct00161
(VIIa)
Figure pct00162
(VIIb)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
p는 1 또는 2의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 선택적으로 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
t는 1 내지 6의 정수이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬임).
일부 태양에서, 각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이며, 여기서는 n이 0일 때, Y는 S 또는 O이다.
화합물의 추가의 예에는 화학식 (VIIIa) 내지 화학식 (VIIId)에 따른 구조가 포함된다:
Figure pct00163
(VIIIa)
Figure pct00164
(VIIIb)
Figure pct00165
(VIIIc)
Figure pct00166
(VIIId)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 선택적으로 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체이고;
Ra1은 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
Rc1은 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Rd는 H, 알킬, 치환된 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 할로겐, 카르복시, 설폰아미드, 또는 설폰산임).
화합물의 추가의 예에는 화학식 (IXa) 내지 화학식 (IXd)에 따른 구조가 포함된다:
Figure pct00167
(IXa)
Figure pct00168
(IXb)
Figure pct00169
(IXc)
Figure pct00170
(IXd)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 선택적으로 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체임).
화합물의 추가의 예에는 화학식 (Xa) 내지 화학식 (Xd)에 따른 구조가 포함된다:
Figure pct00171
(Xa)
Figure pct00172
(Xb)
Figure pct00173
(Xc)
Figure pct00174
(Xd)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
alk는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 선택적으로 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 사슬이고;
t는 1 내지 6의 정수이고;
Y는 S, O 또는 CH2이고;
Z는 OH이고;
n은 0 내지 3의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체임).
상기 구현 형태에서, alk는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 선택적으로 함유하는 1 내지 5개의 탄소 원자의 알킬, 알케닐 또는 알키닐 사슬이다. alk는 기 (CH2)r일 수 있으며, 여기서 r은 1 내지 5이다. alk는 (CH2)3일 수 있다. 대안적으로, 탄소 사슬은 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 함유할 수 있다. 이러한 사슬은, 선택적으로 추가의 CH2 기와 함께, 결합 -CH2-CH=CH-CH2-를 함유할 수 있다. 이러한 사슬은, 선택적으로 추가의 CH2 기와 함께, 결합 -CH2-C≡C-CH2-를 함유할 수 있다.
화학식 V 내지 화학식 XII에 주어진 임의의 예에서, q는 5일 수 있다. 화학식 VII, 화학식 X 또는 화학식 XI에 주어진 임의의 예에서, t는 4일 수 있다. 화학식 V 내지 화학식 X에 주어진 임의의 예에서, n은 1 내지 3일 수 있다. 화학식 V 내지 화학식 X에 주어진 임의의 예에서, n은 1일 수 있다. 화학식 V 내지 화학식 X에 주어진 임의의 예에서, n은 정수 0 또는 1일 수 있다. n이 1인 경우, OH 기는 고리 상의 임의의 위치에 있을 수 있다. OH 기는 4 위치에 있을 수 있다. n이 2 또는 3인 경우, OH 기는 페닐 고리 상의 임의의 위치에 있을 수 있다. 화학식 V 내지 화학식 X에 주어진 임의의 예에서, n이 0일 때, Y는 O 또는 S일 수 있고 CH2는 아닐 수 있다. 화학식 V 내지 화학식 X에 주어진 임의의 예에서, Y는 O일 수 있다. 화학식 V 내지 화학식 X에 주어진 임의의 예에서, Y는 O일 수 있다. Y가 O인 경우, n은 0 내지 3일 수 있다. Y가 CH2인 경우, n은 1 내지 3일 수 있다.
화합물의 추가의 예에는 화학식 (XIa) 내지 화학식 (XId)에 따른 구조가 포함된다:
Figure pct00175
(XIa)
Figure pct00176
(XIb)
Figure pct00177
(XIc)
Figure pct00178
(XId)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
r은 1 내지 5의 정수이고;
t는 1 내지 6의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체임).
화합물의 추가의 예에는 화학식 (XIIa) 내지 화학식 (XIId)에 따른 구조가 포함된다:
Figure pct00179
(XIIa)
Figure pct00180
(XIIb)
Figure pct00181
(XIIc)
Figure pct00182
(XIId)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
q는 1 내지 5의 정수이고;
r은 1 내지 5의 정수이고;
X는 OH 또는 O- 또는 이의 아미드 또는 에스테르 접합체임).
화학식 XI 또는 화학식 XII에 주어진 임의의 예에서, r은 3일 수 있다.
특히 유용한 화합물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 염료로 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 표지는 알킬-카르복시 기를 통해 인돌의 질소 원자에 부착되어 아미드를 형성할 수 있다. 표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 표지는 링커 모이어티를 통해 피리미딘 염기의 C5 위치 또는 7-데아자퓨린 염기의 C7 위치에 부착되어 있을 수 있다.
표지된 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당에 공유적으로 부착된 블록킹 기를 가질 수 있다. 블록킹 기는 리보스 또는 데옥시리보스 당 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 특정 구현 형태에서, 블록킹 기는 뉴클레오티드의 리보스 또는 데옥시리보스 당의 3' OH 위치에 있다.
본 명세서에는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 적어도 하나의 뉴클레오티드는 본 발명의 화합물로 표지된 뉴클레오티드이다. 키트는 2개 이상의 표지된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이들 뉴클레오티드는 2개 이상의 형광 표지로 표지될 수 있다. 이들 표지 중 2개 이상이 단일 여기 공급원 - 이는 레이저일 수 있음 - 을 사용하여 여기될 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 표지에 대한 여기 대역들은 적어도 부분적으로 중첩될 수 있으며, 이로써 스펙트럼의 중첩 영역 내의 여기는 두 표지 모두로부터의 형광 방출을 야기시킨다. 특정 구현 형태에서, 2개 이상의 표지로부터의 방출은 스펙트럼의 상이한 영역에서 일어날 것이며, 이로써 이들 표지 중 적어도 하나의 존재는 방출을 광학적으로 구별함으로써 결정될 수 있게 된다.
키트는 4개의 표지된 뉴클레오티드를 수용할 수 있으며, 여기서 4개의 뉴클레오티드 중 첫 번째 것은 본 명세서에 개시된 바와 같은 화합물로 표지된다. 그러한 키트에서, 제2, 제3, 및 제4 뉴클레오티드는 각각, 선택적으로 제1 뉴클레오티드 상의 표지와 상이하고 선택적으로 서로 상의 표지와 상이한 화합물로 표지될 수 있다. 따라서, 이들 화합물 중 하나 이상은 그러한 화합물(들)이 다른 화합물과 구별될 수 있도록 하는 별개의 흡광도 최대치 및/또는 방출 최대치를 가질 수 있다. 예를 들어, 각각의 화합물은 별개의 흡광도 최대치 및/또는 방출 최대치를 가질 수 있으며, 이로써 이들 화합물 각각은 나머지 다른 3개의 화합물과 구별가능하게 된다. 최대치 이외에 흡광도 스펙트럼 및/또는 방출 스펙트럼의 일부는 상이할 수 있으며, 이들 차이는 이들 화합물을 구별하는 데 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 키트는 이들 화합물 중 2개 이상이 600 nm를 초과하는 별개의 흡광도 최대치를 갖도록 할 수 있다. 이들 화합물은 640 nm 초과의 영역에서 광을 흡수할 수 있다. 키트는 본 명세서에 기재된 적색, 녹색, 또는 청색 파장 발광 화합물들 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 화합물, 뉴클레오티드 또는 키트는 생물학적 시스템(예를 들어, 이의 프로세스 또는 성분을 포함함)을 검출, 측정 또는 확인하는 데 사용될 수 있다. 이들 화합물, 뉴클레오티드 또는 키트를 사용할 수 있는 일부 기법에는 서열분석, 발현 분석, 혼성화 분석, 유전자 분석, RNA 분석, 세포 검정(예를 들어, 세포 결합 또는 세포 기능 분석), 또는 단백질 검정(예를 들어, 단백질 결합 검정 또는 단백질 활성 검정)이 포함된다. 이러한 사용은 자동화 서열분석 기기와 같은 특정 기법을 수행하기 위한 자동화 기기 상에서 행해질 수 있다. 서열분석 기기는 상이한 파장에서 작동하는 2개의 레이저를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물을 합성하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 화학식 (XIII) 및/또는 화학식 (XIII-1), 화학식 (XIII-2), 화학식 (XIII-3) 또는 화학식 (XIII-4)의 화합물 또는 이의 염은 대칭 또는 비대칭 폴리메틴 염료의 합성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다:
Figure pct00183
(XIII)
Figure pct00184
(XIII-1)
Figure pct00185
(XIII-2)
Figure pct00186
(XIII-3)
Figure pct00187
(XIII-4)
또는 이의 염(상기 식에서, Ra1은 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고; Rc1은 알킬 또는 치환된 알킬이고; Ar은 방향족 기이고, R은 알킬 기임). 4-하이드록시페닐의 구체적인 예가 나타나 있지만, n이 1보다 큰 경우에 추가의 하이드록실 기가 또한 고리 상에서 치환될 수 있다. r은 3일 수 있다.
본 발명의 화합물을 합성하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 화학식 (XIII-5)의 화합물 또는 이의 염은 대칭 또는 비대칭 폴리메틴 염료의 합성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다:
Figure pct00188
(XIII-5)
본 발명의 추가의 태양은 화학식 (XIV)의 폴리메틴 염료 화합물 또는 이의 메소머 형태를 제공한다:
Figure pct00189
(XIV)
(상기 식에서,
mCat+ 또는 mAn-는 유기 또는 무기의 양으로/음으로 하전된 반대이온이고,
m은 0 내지 3의 정수이고;
각각의 Ra1 및 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
Rb는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Rb 또는 Rc1 또는 Rc2 중 하나 어느 것도 추가의 부착을 위한 연결 모이어티를 함유하거나 추가의 분자에 연결됨).
각각의 Ra1 또는 Ra2는 독립적으로 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리일 수 있다. Ra1 또는 Ra2는 H일 수 있다. Ra1 또는 Ra2는 SO3 -일 수 있다. Ra1은 Ra2와 상이할 수 있으며, 예를 들어 이 구조는 Ra1에서 단일 설폰산 기를, 그리고 Ra2에서 H를 가질 수 있다. Ra1 또는 Ra2는 설폰아미드일 수 있다. 설폰아미드는 SO2NH2 또는 SO2NHR일 수 있으며, 여기서 R은 알킬, 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴 기이다.
Ra1 또는 Ra2는 인돌 고리의 인접한 탄소에 융합된 추가의 지방족, 방향족 또는 헤테로사이클릭 고리일 수 있다. 예를 들어, 그러한 경우에, 방향족 고리가 융합될 때, 염료 말단 기는 하기 유형의 구조를 나타낼 수 있다:
Figure pct00190
.
따라서, 본 발명의 염료는 화학식 (XIVA), 화학식 (XIVB) 또는 화학식 (XIVC)로 기재될 수 있다:
Figure pct00191
(XIVA)
Figure pct00192
(XIVB)
Figure pct00193
(XIVC)
화학식 (XIVA), 화학식 (XIVB) 및 화학식 (XIVC)에서, 인돌 고리의 인접한 탄소 원자에 융합된 하나 또는 둘 모두의 추가의 고리는, 예를 들어 설폰산 또는 설폰아미드로 선택적으로 치환될 수 있다.
이 화합물은 Ra 기들 중 하나가 화학식 (XV)의 구조를 형성하는 추가의 융합된 고리인 경우에 해당될 수 있다:
Figure pct00194
(XV)
(상기 식에서,
Ra3은 H, SO3 -, 설폰아미드 또는 할로겐이고;
Rc1은 알킬 또는 치환된 알킬임).
Rb는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 알킬일 수 있다. Rb는 알킬일 수 있다. Rb는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실일 수 있다. 알킬 사슬은, 예를 들어 카르복시 또는 설폰산 기로 추가로 치환될 수 있다. Rb는 추가의 접합을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, Rb가 COOH 모이어티를 함유하는 경우, 이것은 표지에 부착하기 위하여 추가의 분자와 접합될 수 있다. 생체분자, 단백질, DNA 표지화 등의 경우에, 접합은 Rb를 통해 수행될 수 있다. 일단 접합이 일어났으면 Rb는 아미드 또는 에스테르 유도체를 형성할 수 있다. 이 화합물은 Rb를 통해 뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
Rb는 아릴 또는 치환된 아릴일 수 있다. Rb는 페닐일 수 있다.
각각의 Rc1 및 Rc2는 독립적으로 알킬 또는 치환된 알킬일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 또는 (CH2)qSO3H일 수 있으며, 여기서 q는 1 내지 6이다. q는 1 내지 3일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 치환된 알킬 기일 수 있다. Rc1 및 Rc2는 COOH 또는 -SO3H 모이어티 또는 이들의 에스테르 또는 아미드 유도체를 함유할 수 있다.
Rb 또는 Rc1 또는 Rc2 어느 것도 추가의 부착을 위한 연결 모이어티를 함유하거나 추가의 분자에 연결된다. Rb 또는 Rc1 또는 Rc2는 카르복시 또는 카르복실레이트(COOH 또는 COO-) 모이어티를 함유할 수 있다. 일단 접합이 일어났으면, Rb 또는 Rc1 또는 Rc2는 아미드 또는 에스테르를 함유할 수 있다.
화합물의 예에는 하기가 포함된다:
Figure pct00195
Figure pct00196
Figure pct00197
Figure pct00198
또는 이의 염.
본 발명의 화합물을 합성하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 화학식 (XVI) 및/또는 화학식 (XVI1), 화학식 (XVI2)의 화합물 또는 이의 염은 대칭 또는 비대칭 폴리메틴 염료의 합성을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다:
Figure pct00199
(XVI)
Figure pct00200
(XVI1)
Figure pct00201
(XVI2)
(상기 식에서,
Ra는 H, SO3 -, 설폰아미드, 할로겐, 또는 인접한 탄소 원자에 융합된 추가의 고리이고;
Rb는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
Rc는 알킬 또는 치환된 알킬임).
특정 여기 파장은 532 nm, 630 nm 내지 700 nm, 특히 660 nm일 수 있다.
실시예 41: 화합물 XVII 2,3,3-트라이메틸-1-페닐-3H-인돌륨-5-설포네이트
Figure pct00202
2-메틸렌-3,3-트라이메틸-1-페닐-2,3-다이하이드로-1H-인돌(1 g, 4.25 mmol)을 5℃ 미만의 온도에서 1 ml의 황산 중에 용해시키고, 1 ml의 발연 황산(20%)을 교반하면서 첨가하였다. 용액을 실온에서 1시간 교반하고, 이어서 60℃에서 3시간 동안 가열하였다. 생성물을 다이에틸 에테르로 침전시키고, 아세톤 및 에탄올로 세척하였다. 수율 0.7 g(52%). 구조를 NMR에 의해 확인하였다.
실시예 42: 화합물 XVIII 2-(2-아닐리노비닐-1)-3,3-트라이메틸-1-페닐-3H-인돌륨-5-설포네이트
Figure pct00203
반응도식:
Figure pct00204
2,3,3-트라이메틸-1-페닐-3H-인돌륨-5-설포네이트(0.63 g) 및 에틸 N-페닐포름이미데이트(0.5 g)의 혼합물을 70℃에서 30분 동안 가열하였다. 주황색 용융물이 형성되었다. 생성물을 다이에틸 에테르로 분쇄하고 여과하였다. 수율 0.7 g(84%).
실시예 43: 화합물 XIX 2-(2-아세트아닐리도비닐-1)-3,3-트라이메틸-1-페닐-3H-인돌륨-5-설포네이트
Figure pct00205
반응도식:
Figure pct00206
2,3,3-트라이메틸-1-페닐-3H-인돌륨-5-설포네이트(0.63 g), N,N'-다이페닐포름이미딘(0.5 g), 아세트산(1 ml) 및 아세트산 무수물(2 ml)의 혼합물을 70℃에서 3시간 동안 그리고 이어서 50℃에서 하룻밤 가열하였다. 황색 용액이 형성되었다. 생성물을 여과하고, 다이에틸 에테르로 세척하였다. 수율 0.69 g(75%).
실시예 44: 화합물 XX 1,2-다이메틸-1-(4-설포네이토부틸)-3-페닐-1H-벤조[e]인돌륨
Figure pct00207
반응도식:
Figure pct00208
무수 에탄올(30 ml) 중 N-(2-나프틸),N-페닐하이드라진 하이드로클로라이드(19.51 mmol, 5.28 g), 5-메틸-6-옥소헵탄설폰산(17.18 mmol, 3.70 g) 및 무수 ZnCl2(17.18 mmol, 2.34 g)를 실온에서 30분 동안, 이어서 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC(CH3CN 중 10% H2O)에 의해 확인하였다. 완료 후에, 반응물을 냉각시키고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 DCM 중에 용해시키고, 실리카-겔 상에서의 플래시 컬럼으로 정제하였다. 수율: 3.06 g, 42%.
양성자 NMR: (MeOH-D4) : 8.28 (0.5H, d, J = 8 ㎐); 8.05-8.02 (1H, m); 7.89 (0.5H, d, J = 8 ㎐); 7.75-7.66 (3H, m); 7.65-7.60 (1H, m); 1.49-1.43 (1.5H, m); 7.31-7.25 (2H, m); 7.16 (.5H, d, J = 9 ㎐); 7.07 (.5H, appt, J = 7.4 ㎐); 6.61 (0.5H, d, J = 8 ㎐); 2.85-2.35 (4H, m); 1.88 (3H, appd, J = 9 ㎐); 1.75-1.4 (5H, m); 1.35-1.25 (0.5H, m); 1.1-0.95 (0.5H, m); 0.8-0.65 (0.5H, m); 0.58-0.45 (0.5H, m).
실시예 45: 화합물 XXI 1,2-다이메틸-1-(3-설포네이토프로필)-3-페닐-1H-벤조[e]인돌륨
Figure pct00209
반응도식:
Figure pct00210
N-(2-나프틸)-N-페닐하이드라진 하이드로클로라이드 및 4-메틸-5-옥소펜탄설폰산으로부터 이전 화합물로서 표제 화합물을 제조하였다. 생성물을 실리카 상에서의 플래시 컬럼으로 정제하였다. 수율: 40%. 구조를 NMR 스펙트럼에 의해 확인하였다.
실시예 46: 화합물 XXII 2,3-다이메틸-3-(4-설포네이토부틸)-1-페닐-3H-인돌륨
Figure pct00211
반응도식:
Figure pct00212
빙초산(20 ml) 중 N,N-다이페닐하이드라진 하이드로클로라이드(0.01 mol, 2.2 g), 5-메틸-6-옥소헵탄설폰산(0.017 mol, 3.0 g)을 실온(약 20℃)에서 1시간 동안, 이어서 100℃에서 3시간 동안 교반하였다(TLC 확인). 반응 혼합물을 냉각시키고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 다이에틸 에테르로 세척하고, 실리카 겔 상에서의 플래시 컬럼으로 정제하였다. 수율: 2 g(56%). 구조를 NMR 스펙트럼에 의해 확인하였다.
실시예 47: 화합물 XXIII 인도카르보시아닌
Figure pct00213
화학명: 2-{(5-[1-페닐-3,3-다이메틸)-1,2-다이하이드로-3H-인돌-2-일리덴]-1-프로펜-1-일}-3,3-다이메틸-1-(5-카르복시펜틸)-인돌륨-5-설포네이트.
반응도식:
Figure pct00214
아세트산 무수물(2 ml) 및 아세트산(1 ml)의 혼합물 중 3,3-다이메틸-1-(5-카르복시펜틸-2-(4-아닐리노비닐)-3H-인돌륨-5-설포네이트(0.46 g) 및 2,3,3-트라이메틸-1-페닐-3H-인돌륨 퍼클로레이트(0.34 g)를 실온(약 25℃)에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 이 용액에 피리딘(0.5 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 완료를 TLC(CH3CN 중 20% H2O)에 의해 그리고 UV 측정에 의해 확인하였다. 일단 반응이 완료되면, 적색 혼합물을 냉각시키고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 C18 플래시 컬럼(물 및 아세토니트릴 중 0.1 M TEAB)에 의해 정제하였다. 수율: 0.33 g(55%).
실시예 48: 화합물 XXIV 인도카르보시아닌
Figure pct00215
화학명: 트라이에틸암모늄 2-{(5-[(4-설포네이토부틸)-1-페닐-3-메틸)-1,2-다이하이드로-3H-인돌-2-일리덴]-1-프로펜-1-일}-3,3-다이메틸-1-(5-카르복시펜틸)-인돌륨-5-설포네이트.
반응도식:
Figure pct00216
아세트산 무수물(2 ml) 및 아세트산(1 ml)의 혼합물 중 3,3-다이메틸-1-(5-카르복시펜틸-2-(4-아닐리노비닐)-3H-인돌륨-5-설포네이트(0.46 g) 및 2,3-다이메틸-3-(4-설포네이토부틸)-1-페닐-3H-인돌륨(0.36 g)을 실온(약 25℃)에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 이 용액에 피리딘(1 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응의 완료를 TLC(CH3CN 중 20% H2O)에 의해 그리고 UV 측정에 의해 확인하였다. 일단 반응이 완료되면, 적색 반응 혼합물을 냉각시키고, 용매의 대부분을 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 C18 플래시 컬럼(물 및 아세토니트릴 중 0.1 M TEAB)에 의해 정제하였다. 수율: 0.29 g(35%).
실시예 49: 화합물 XXV 인도카르보시아닌
Figure pct00217
화학명: 2-{(5-[(3-페닐-1,1-다이메틸)-2,3-다이하이드로-1H-벤조[e]인돌-2-일리덴]-1-프로펜-1-일}-3,3-다이메틸-1-(5-카르복시펜틸)-인돌륨-5-설포네이트.
반응도식:
Figure pct00218
아세트산 무수물(1 ml) 및 아세트산(1 ml)의 혼합물 중 3,3-다이메틸-1-(5-카르복시펜틸-2-(4-아닐리도비닐)-3H-인돌륨-5-설포네이트(0.46 g) 및 1,1,2-트라이메틸-3-페닐-3H-인돌륨 퍼클로레이트(0.39 g)를 실온(약 25℃)에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이어서, 이 용액에 피리딘(1 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC(CH3CN 중 20% H2O)에 의해 그리고 UV 측정에 의해 확인하였다. 일단 반응이 완료되면, 적색 반응 혼합물을 냉각시키고, 용매의 대부분을 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 C18 플래시 컬럼(물 및 아세토니트릴 중 0.1 M TEAB)에 의해 정제하였다. 수율: 0.38 g(54%).
실시예 50: 화합물 XXVI 염료 접합체 pppT-I-2
반응도식:
Figure pct00219
제조: 무수 DMA(5 mL) 및 후니그 염기(Hunig's Base)(0.06 mL)를 염료(화합물 XXIII)의 건조된 샘플(60 mg)에 첨가하였다. 이어서, 5 mL의 건성 DMA 중 TSTU(0.25 g)의 용액을 이것에 첨가하였다. 활성화된 에스테르의 적색이 발현되었다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(CH3CN 중 20% H2O)에 따르면, 활성화가 완료되었다. 활성화가 완료된 후에, 이 용액을 물(7 mL) 중 pppT-LN3(0.23 g)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 커플링 진행을 TLC(아세토니트릴 중 20% H2O)로 확인하였다. 반응 혼합물을 빙조(ice-bath)를 사용하여 약 4℃로 냉각시키고, 이어서 물 중 0.1 M TEAB의 용액(5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 중 0.05 M TEAB 용액 중의 약 50 g의 DEAE Sephadex 수지 현탁액과 함께 컬럼에 적용하고, TEAB(0.1 M에서 0.5 M까지의 농도 구배)로 세척하였다. 착색된 분획들을 수집하고 증발시키고, 이어서 다시 물과 동시증발시켜 더 많은 TEAB를 제거하고, 진공 건조시켰다. 이어서, 잔류물을 0.1 M TEAB 중에 재용해시켰다. 이 용액을 0.2 nm 기공 크기의 시린지 필터를 통해 코닝 플라스크 내로 여과하고 냉동기 내에 저장하였다. 생성물을 아세토니트릴-0.1 M TEAB를 갖는 C18 역상 컬럼을 사용하여 HPLC에 의해 정제하였다. 수율: 67%.
실시예 51: 화합물 XXVII 염료 접합체 pppT-I-4
반응도식:
Figure pct00220
제조: 무수 DMA(5 mL) 및 후니그 염기(0.06 mL)를 염료(화합물 XXIII)의 건조된 샘플(82 mg)에 첨가하였다. 이어서, 5 mL의 건성 DMA 중 TSTU(0.25 g)의 용액을 이것에 첨가하였다. 활성화된 에스테르의 적색이 곧바로 발현되었다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 활성화가 완료된 후에(TLC: CH3CN 중 15% H2O), 이 용액을 물(7 mL) 중 pppT-LN3(0.23 g)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 빙조를 사용하여 약 4℃로 냉각시키고, 이어서 물 중 0.1 M TEAB의 용액(5 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 중 0.05 M TEAB 용액 중의 약 75 g의 DEAE Sephadex 수지 현탁액과 함께 컬럼에 적용하고, TEAB(0.10 M에서 0.75 M까지의 농도 구배)로 세척하였다. 적색 분획들을 수집하고, 용매를 증발시키고, 이어서 잔류물을 다시 물과 동시증발시켜 더 많은 TEAB를 제거하고, 진공 건조시켰다. 이어서, 염료를 0.1 M TEAB 중에 재용해시켰다. 이 용액을 0.2 nm 기공 크기의 시린지 필터를 통해 여과하고, 생성물을 아세토니트릴-0.1 M TEAB를 갖는 C18 역상 컬럼을 사용하여 HPLC에 의해 정제하였다. 수율 70%.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "실질적으로" 및 "약"은, 예를 들어 처리에 있어서의 변동으로 인한 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 이들은 ±5% 이하, 예컨대 ±2% 이하, 예컨대 ±1% 이하, 예컨대 ±0.5% 이하, 예컨대 ±0.2% 이하, 예컨대 ±0.1% 이하, 예컨대 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용되는 경우, "a" 또는 "an"과 같은 부정관사는 "적어도 하나"를 의미한다.
하기에 더 상세히 논의되는 전술한 개념들 및 추가의 개념들의 모든 조합은 (그러한 개념들이 상호 불일치하지 않는다면) 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려됨이 이해되어야 한다. 특히, 본 명세서의 끝부분에 나타나는 청구된 발명 요지의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 발명 요지의 일부인 것으로 고려된다.
다수의 구현 형태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 본 명세서의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변형들이 이루어질 수 있다는 것은 이해될 것이다.
더욱이, 도면들에 묘사된 논리 흐름들은 바람직한 결과들을 달성하기 위해 도시된 특정 순서, 또는 순차적 순서를 요구하지 않는다. 더욱이, 다른 프로세스들이 제공될 수 있거나, 설명된 흐름들로부터 프로세스들이 제거될 수 있고, 다른 구성요소들이 설명된 시스템들에 추가되거나 그로부터 제거될 수 있다. 따라서, 다른 구현 형태들이 하기의 청구범위의 범주 내에 있다.
기재된 구현 형태들의 소정 특징들이 본 명세서에 기재된 바와 같이 예시되어 있지만, 많은 변형, 치환, 변경 및 등가물이 이제 당업자에게 가능할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 구현 형태들의 범주 내에 속하는 바와 같은 모든 그러한 변형 및 변경을 포함하도록 의도됨이 이해되어야 한다. 이들은 제한이 아닌 단지 예로서 제시되어 있으며, 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변경이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 본 명세서에 기재된 장치 및/또는 방법의 임의의 일부분은 상호 배타적인 조합을 제외하고는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 구현 형태들은 기재된 상이한 구현 형태들의 기능들, 구성요소들 및/또는 특징들의 다양한 조합 및/또는 하위조합을 포함할 수 있다.

Claims (20)

  1. 방법으로서,
    샘플을 제공하는 단계 - 상기 샘플은 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드를 포함함 -;
    상기 샘플을 제1 형광 염료 및 제2 형광 염료와 접촉시키는 단계 - 상기 제1 형광 염료는 제1 여기 조명광에 응답하여 제1 파장 대역 내의 제1 방출된 광을 방출하고, 상기 제2 형광 염료는 제2 여기 조명광에 응답하여 제2 파장 대역 내의 제2 방출된 광을 방출함 -;
    하나 이상의 이미지 검출기를 사용하여, 상기 제1 방출된 광 및 상기 제2 방출된 광을 포함하는 다중화된 형광(multiplexed fluorescent light)을 동시에 수집하는 단계 - 상기 제1 방출된 광은 상기 제1 파장 대역에 상응하는 제1 색상 채널이고, 상기 제2 방출된 광은 상기 제2 파장 대역에 상응하는 제2 색상 채널임 -; 및
    상기 제1 색상 채널의 제1 파장 대역에 기초하여 상기 제1 뉴클레오티드를 확인하고, 상기 제2 색상 채널의 제2 파장 대역에 기초하여 상기 제2 뉴클레오티드를 확인하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 파장 대역은 청색 색상에 상응하고, 상기 제2 파장 대역은 녹색 색상에 상응하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 파장 대역은 약 450 nm 내지 약 525 nm의 범위 내에 포함되고, 상기 제2 파장 대역은 약 525 nm 내지 약 650 nm의 범위 내에 포함되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 평균 또는 피크 파장이 상기 제1 형광 염료의 제1 방출 스펙트럼에 대해 정의되고, 제2 평균 또는 피크 파장이 상기 제2 형광 염료의 제2 방출 스펙트럼에 대해 정의되고, 상기 제1 평균 또는 피크 파장과 상기 제2 평균 또는 피크 파장은 적어도 서로 미리 정의된 분리를 갖는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 파장 대역은 상기 제2 파장 대역보다 더 짧은 파장을 가지며, 상기 제2 파장 대역은 제1 파장과 관련되고, 상기 제1 형광 염료와 상기 제2 형광 염료 사이의 파장 방출 분리는 상기 제1 형광 염료의 방출 스펙트럼이, 많아야, 상기 제1 파장이나 그보다 높은 파장에서 미리 정의된 양의 광을 포함하도록 정의되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중화된 형광을 동시에 수집하는 단계는
    상기 제1 색상 채널에 대하여 제1 광학 서브시스템을 사용하여 상기 제1 방출된 광을 검출하는 단계, 및
    상기 제2 색상 채널에 대하여 제2 광학 서브시스템을 사용하여 상기 제2 방출된 광을 검출하는 단계를 포함하며,
    방출 이색성 필터(emission dichroic filter)가 상기 제1 색상 채널의 제1 방출된 광을 상기 제1 광학 서브시스템으로 그리고 상기 제2 색상 채널의 제2 방출된 광을 상기 제2 광학 서브시스템으로 직행시키는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 광학 서브시스템 및 상기 제2 광학 서브시스템 중 적어도 하나는 기울어진 광학 경로를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 형광 염료의 방출 스펙트럼은 상기 제1 파장 대역 내에 피크를 갖는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 제3 뉴클레오티드를 추가로 포함하며,
    상기 방법은,
    상기 샘플을, 상기 제1 여기 조명광에 응답하여 상기 제1 파장 대역 내의 제3 방출된 광을 방출하고 상기 제2 여기 조명에 응답하여 상기 제2 파장 대역 내의 제4 방출된 광을 방출하는 제3 형광 염료와 접촉시키는 단계 - 상기 다중화된 형광은 상기 제3 방출된 광 및 상기 제4 방출된 광을 추가로 포함함 -; 및
    상기 제1 색상 채널의 제1 파장 대역 및 상기 제2 색상 채널의 제2 파장 대역에 기초하여 상기 제3 뉴클레오티드를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 제3 뉴클레오티드를 추가로 포함하며,
    상기 방법은,
    상기 샘플을, 제3 여기 조명광에 응답하여 제3 파장 대역 내의 제3 방출된 광을 방출하는 제3 형광 염료와 접촉시키는 단계 - 상기 다중화된 형광은 상기 제3 방출된 광을 추가로 포함함 -; 및
    상기 제3 파장 대역에 기초하여 상기 제3 뉴클레오티드를 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 장치로서,
    샘플을 수용하는 플로우셀(flow cell) - 상기 샘플은 제1 뉴클레오티드 및 제2 뉴클레오티드를 포함하며, 상기 제1 뉴클레오티드는 제1 형광 염료에 커플링되고, 상기 제2 뉴클레오티드는 제2 형광 염료에 커플링되고, 상기 제1 형광 염료는 제1 여기 조명광에 응답하여 제1 파장 대역 내의 제1 방출된 광을 방출하고, 상기 제2 형광 염료는 제2 여기 조명광에 응답하여 제2 파장 대역 내의 제2 방출된 광을 방출함 -;
    상기 제1 여기 조명광 및 상기 제2 여기 조명광을 상기 플로우셀에 동시에 제공하는 조명 시스템; 및
    상기 제1 방출된 광 및 상기 제2 방출된 광을 포함하는 다중화된 형광을 동시에 수집하는 집광 시스템 - 상기 제1 방출된 광은 상기 제1 파장 대역에 상응하는 제1 색상 채널이고, 상기 제2 방출된 광은 상기 제2 파장 대역에 상응하는 제2 색상 채널임 - 을 포함하는, 장치.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 파장 대역은 청색 색상에 상응하고, 상기 제2 파장 대역은 녹색 색상에 상응하는, 장치.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 제1 파장 대역은 약 450 nm 내지 약 525 nm의 범위 내에 포함되고, 상기 제2 파장 대역은 약 525 nm 내지 약 650 nm의 범위 내에 포함되는, 장치.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 평균 또는 피크 파장이 상기 제1 형광 염료의 제1 방출 스펙트럼에 대해 정의되고, 제2 평균 또는 피크 파장이 상기 제2 형광 염료의 제2 방출 스펙트럼에 대해 정의되고, 상기 제1 평균 또는 피크 파장과 상기 제2 평균 또는 피크 파장은 적어도 서로 미리 정의된 분리를 갖는, 장치.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 파장 대역은 상기 제2 파장 대역보다 더 짧은 파장을 가지며, 상기 제2 파장 대역은 제1 파장과 관련되고, 상기 제1 형광 염료와 상기 제2 형광 염료 사이의 파장 방출 분리는 상기 제1 형광 염료의 방출 스펙트럼이, 많아야, 상기 제1 파장이나 그보다 높은 파장에서 미리 정의된 양의 광을 포함하도록 정의되는, 장치.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 집광 시스템은
    상기 제1 방출된 광을 검출하는 상기 제1 색상 채널에 대한 제1 광학 서브시스템, 및
    상기 제2 방출된 광을 검출하는 상기 제2 색상 채널에 대한 제2 광학 서브시스템을 포함하며,
    방출 이색성 필터가 상기 제1 색상 채널의 제1 방출된 광을 상기 제1 광학 서브시스템으로 그리고 상기 제2 색상 채널의 제2 방출된 광을 상기 제2 광학 서브시스템으로 직행시키는, 장치.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 광학 서브시스템 및 상기 제2 광학 서브시스템 중 적어도 하나는 기울어진 광학 경로를 포함하는, 장치.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 형광 염료의 방출 스펙트럼은 상기 제1 파장 대역 내에 피크를 갖는, 장치.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 여기 조명광에 응답하여 상기 제1 파장 대역 내의 제3 방출된 광을 방출하고 상기 제2 여기 조명에 응답하여 상기 제2 파장 대역 내의 제4 방출된 광을 방출하는 제3 형광 염료에 커플링된 제3 뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 상기 다중화된 형광은 상기 제3 방출된 광 및 상기 제4 방출된 광을 추가로 포함하는, 장치.
  20. 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은, 제3 여기 조명광에 응답하여 제3 파장 대역 내의 제3 방출된 광을 방출하는 제3 형광 염료에 커플링된 제3 뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 다중화된 형광은 상기 제3 방출된 광을 추가로 포함하는, 장치.
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