JP2022522076A - 検体の多重化蛍光検出 - Google Patents
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Abstract
第１の態様では、方法は、第１のヌクレオチド及び第２のヌクレオチドを含む試料を提供することとと、試料を第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素と接触させて、第１の蛍光色素には、第１の励起照明光に応答して、第１の波長帯内で第１の放射光を放射させ、第２の蛍光色素には、第２の励起照明光に応答して、第２の波長帯内で第２の放射光を放射させることと、１つ以上の画像検出器を使用して、第１の波長帯に対応する第１の色チャネルである第１の放射光と、第２の波長帯に対応する第２の色チャネルである第２の放射光を含む多重化蛍光光を同時に収集することと、第１の色チャネルの第１の波長帯に基づいて第１のヌクレオチドを同定し、第２の色チャネルの第２の波長帯に基づいて第２のヌクレオチドを同定することとと、を含む。
Description
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年３月１日に出願された米国特許仮出願第６２／８１２，８８３号、及び２０１９年６月１７日に出願されたオランダ特許出願第２０２３３２７号に対する優先権の利益を主張する。上記の出願のそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年３月１日に出願された米国特許仮出願第６２／８１２，８８３号、及び２０１９年６月１７日に出願されたオランダ特許出願第２０２３３２７号に対する優先権の利益を主張する。上記の出願のそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
合成によるシークエンシング（塩基配列決定）（Sequencing by synthesis＝ＳＢＳ）技術は、ターミネーターと発光スペクトルを有する蛍光色素とを含む、修飾デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を使用する。蛍光色素は、ｄＮＴＰに共有結合している。光による照射後の蛍光色素の出力（すなわち、蛍光）は、カメラによって検出することができる。単一の蛍光色が使用される場合、４つの塩基のそれぞれが、ＤＮＡ合成及び撮像（イメージング）の別個のサイクルで添加される。いくつかの実施形態では、４つの塩基のそれぞれについて別個の蛍光色素を利用することができる。更なる実施形態では、２チャネル及び４チャネルのＳＢＳ技術は、複数の色素標識ｄＮＴＰを混合したものを使用することができる。異なる波長帯を有する光源を使用して各ＤＮＡクラスターの画像を撮影し、それぞれの発光スペクトルを有する適切な蛍光色素から出力することができる。
本開示は、２つ以上の色チャネルを使用して単一の試料を同時に撮像することによって、ＳＢＳシステムにおける改善された撮像スループットを提供することができるシステム又は方法の例を開示する。使用される色素及び色チャネルの特性は、色チャネル間の低クロストーク又はゼロクロストークを容易にすることができるので、多重化蛍光光を使用して、迅速に、効率的に、かつ確実にヌクレオチドを識別することができる。上記のアプローチは、画像が逐次的にキャプチャされることを必要とし得るためより低いスループットしか提供できない他のアプローチと比較して、有意な改善を提供することができる。複数の色チャネルの任意のものを使用することができ、それらには青色及び緑色の色チャネルを含むが、それらに限定されるものではない。多重化蛍光光に基づいてＳＢＳを実施するために使用することができるシステム又は技術の例が記載される。多重化蛍光光に基づいてＳＢＳを実施するために、試料を標識するのに使用することができる色素の例が記載される。
第１の態様では、方法は、第１のヌクレオチド及び第２のヌクレオチドを含む試料を提供することと、試料を第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素と接触させて、第１の蛍光色素には、第１の励起照明光に応答して、第１の波長帯内で第１の放射光を放射させ、第２の蛍光色素には、第２の励起照明光に応答して、第２の波長帯内で第２の放射光を放射させることと、１つ以上の画像検出器を使用して、第１の波長帯に対応する第１の色チャネルである第１の放射光と、第２の波長帯に対応する第２の色チャネルである第２の放射光を含む多重化蛍光光を同時に収集することと、第１の色チャネルの第１の波長帯に基づいて第１のヌクレオチドを同定し、第２の色チャネルの第２の波長帯に基づいて第２のヌクレオチドを同定することとと、を含む。
実施形態は、以下の特徴のいずれか又は全てを含むことができる。第１の波長帯は青色に対応し、第２の波長帯は緑色に対応する。第１の波長帯は、約４５０ｎｍ～約５２５ｎｍの範囲内に含まれ、第２の波長帯は、約５２５ｎｍ～約６５０ｎｍの範囲内に含まれる。第１の平均又はピーク波長が、第１の蛍光色素の第１の発光スペクトルについて定義され、第２の平均又はピーク波長が、第２の蛍光色素の第２の発光スペクトルについて定義され、第１の平均波長及び第２の平均波長又はピーク波長は、互いから少なくとも所定の分離を有する。第１の波長帯が、第２の波長帯よりも短い波長を有し、第２の波長帯が第１の波長と関連づけられ、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素との間の波長放射分離は、第１の蛍光色素の発光スペクトルが、第１の波長以上の光を、最大で所定の量含むように定義される。多重化蛍光光を同時に収集することが、第１の色チャネルのための第１の光学サブシステムを使用して第１の放射光を検出することと、第２の色チャネルのための第２の光学サブシステムを使用して第２の放射光を検出することとを含み、発光ダイクロイックフィルタが、第１の色チャネルの第１の放射光を第１の光学サブシステムに方向付け、第２の色チャネルの第２の放射光を第２の光学サブシステムに方向付ける。第１の光学サブシステム及び第２の光学サブシステムのうちの少なくとも１つは、曲がった光路を含む。第１の蛍光色素の発光スペクトルは、第１の波長帯内にピークを有する。試料が、第３のヌクレオチドを更に含み、方法が、試料を、第１の励起照明光に応答して、第１の波長帯内の、多重化蛍光光に更に含まれる第３の放射光を放射し、第２の励起照明光に応答して、第２の波長帯内の、多重化蛍光光に更に含まれる第４の放射光を放射する第３の蛍光色素と接触させることと、第１の色チャネルの第１の波長帯及び第２の色チャネルの第２の波長帯に基づいて、第３のヌクレオチドを識別することと、を更に含む。試料が、第３のヌクレオチドを更に含み、方法が、第３の励起照明光に応答して、第３の波長帯内の、多重化蛍光光に更に含まれる第３の放射光を放射する第３の蛍光色素と接触させることと、第３の波長帯に基づいて第３のヌクレオチドを同定することと、を含む。
第２の態様では、装置が、第１のヌクレオチド及び第２のヌクレオチドを含む試料を含有するフローセルであって、第１のヌクレオチドが第１の蛍光色素に結合され、第２のヌクレオチドが第２の蛍光色素に結合され、第１の蛍光色素が第１の励起照明光に応答して、第１の波長帯内の第１の放射光を放射し、第２の蛍光色素が第２の励起照明光に応答して、第２の波長帯内の第２の放射光を放射する、フローセルと、第１の励起照明光及び第２の励起照明光を、フローセルに同時に提供する照明光システムと、第１の放射光及び第２の放射光を含む多重化蛍光光を同時に集光する集光システムと、を備え、第１の放射光が、第１の波長帯に対応する第１の色チャネルであり、第２の放射光は、第２の波長帯に対応する第２の色チャネルである。
実施形態は、以下の特徴のいずれか又は全てを含むことができる。第１の波長帯は青色に対応し、第２の波長帯は緑色に対応する。第１の波長帯は、約４５０ｎｍ～約５２５ｎｍの範囲内に含まれ、第２の波長帯は、約５２５ｎｍ～約６５０ｎｍの範囲内に含まれる。第１の平均又はピーク波長が、第１の蛍光色素の第１の発光スペクトルについて定義され、第２の平均又はピーク波長が、第２の蛍光色素の第２の発光スペクトルについて定義され、第１の平均波長及び第２の平均波長又はピーク波長は、互いから少なくとも所定の分離を有する。第１の波長帯が、第２の波長帯よりも短い波長を有し、第２の波長帯が第１の波長と関連づけられ、第１の蛍光色素と第２の蛍光色素との間の波長放射分離は、第１の蛍光色素の発光スペクトルが、第１の波長以上の光を、最大で所定の量含むように定義される。光収集システムが、第１の放射光を検出する第１の色チャネルのための第１の光学サブシステムと、第２の放射光を検出する第２の色チャネルのための第２の光学サブシステムと、を含み、発光ダイクロイックフィルタが、第１の色チャネルの第１の放射光を第１の光学サブシステムに方向付け、第２の色チャネルの第２の放射光を第２の光学サブシステムに方向付ける。第１の光学サブシステム及び第２の光学サブシステムのうちの少なくとも１つは、曲がった光路を含む。第１の蛍光色素の発光スペクトルは、第１の波長帯内にピークを有する。試料が、第３の蛍光色素に結合された、第３のヌクレオチドを更に含み、第３の蛍光色素が、第１の励起照明光に応答して第１の波長帯内の第３の放射光を放射し、かつ第２の励起照明光に応答して第２の波長帯内の第４の放射光を放射し、多重化蛍光光が第３の放射光及び第４の放射光を更に含む。試料が、第３の励起照明光に応答して、第３の波長帯内の第３の放射光を放射する第３の蛍光色素に結合された、第３のヌクレオチドを更に含み、多重化蛍光光が、第３の放射光を更に含む。
実施形態の１つ以上の実施例の詳細が、添付の図面及び以下の説明に記載されている。他の特徴が、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
本文書は、２つ以上の色チャネルを使用したＤＮＡクラスターの同時的イメージングを使用した、ロバストな、合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）結果を提供することができるシステム及び技術の例を記載する。このようなシステム／技術は、例えば、本明細書に記載されるように、既存のアプローチよりも１つ以上の利点を提供することができる。
Ｉ．概要
Ｉ．概要
ＳＢＳを実施するためのいくつかのアプローチは、対応する蛍光色素からの放射光の各波長帯を逐次撮像することを伴う。すなわち、第１のヌクレオチドに対応する放射光の第１波長帯を撮像することと、第２のヌクレオチドに対応する放射光の第２の波長帯を撮像することと、第３のヌクレオチドに対応する放射光の第３の波長帯を撮像することと、第４のヌクレオチドに対応する放射光の第４の波長帯を撮像することと、を伴う。
いくつかの例では、このような逐次的イメージングプロセスは、放射光の４つの異なる波長帯を別々に撮像するため、データのスループットを低いものとしてしまう可能性がある。いくつかの実施形態では、放射光の２つの波長帯を利用して、例えば合成による２チャネルシークエンシングなどのように、ヌクレオチドのタイプを推定するための画像の数を２つに減らすことによって、各ヌクレオチドを同定している。例えば、第１の波長帯を、２つのヌクレオチド（例えばアデニン及びチミンなど）と関連づけることができる。第２の波長帯を、１つの重複ヌクレオチド及び第３のヌクレオチド（例えば、アデニン及びシトシンなど）と関連づけることができる。
上記の２つの波長帯は、励起光に応答して対応する波長帯内の光を放射する蛍光色素を介して実現され得る。いくつかの実施形態では、２つの色素（１つの色素は第１の波長帯に対するものであり、別の１つの色素は第２の波長帯に対するものである）はそれぞれ、核酸セグメントのアデニンに対応する部分に結合することができる。核酸セグメントの集団が増幅によって生成されたとすると、その核酸セグメントの集団のクラスターの少なくとも一部は、第１の波長帯の色素及び第２の波長帯の色素に結合し得る。したがって、第１の色素が第１の励起光に露光されると、クラスターは第１の波長帯の光を放射する。第２の色素が、第１の励起光とは異なる第２の励起光に露光されると、クラスターは第２の波長帯の光を放射する。同様に、第１の波長帯内の光を放射する色素は、核酸セグメントのチミンに対応する部分に結合することができ、第２の波長帯内の光を放射する色素は、核酸セグメントのシトシンに対応する部分に結合することができる。
第１の波長帯を、対応する励起光を使用して撮像すると、第１波長帯の放射光の画像を取得することができる。第２の波長帯を、対応する励起光を用いて撮像すると、第２波長帯の放射光の画像を取得することができる。これらの画像の取得どうしは時間的に離間されており、第１の波長帯の放射光の画像の取得は、第２の波長帯の放射光の取得と重ならないようになっている。
２つの画像のうちの、両方共に描かれている部分は、重複ヌクレオチド（例えばアデニン）に対応すると判定することができる。２つの画像のうちの、第１の画像のみに描かれている（そして第２の画像内では光を放射していない）部分は、第１の波長帯の発光色素に関連する非重複ヌクレオチド（例えばチミン）に対応すると判定することができる。２つの画像のうちの、第２の画像のみに描かれている（そして第１の画像内では光を放射していない）部分は、第２の波長帯の発光色素に関連する非重複ヌクレオチド（例えばシトシン）に対応すると判定することができる。２つの画像のうちの、第１又は第２の画像のいずれにおいても光を放射していしない部分は、第４のヌクレオチド（例えばグアニン）に対応すると判定することができる。
前述のシステムでは、２つ以上の逐次的な（すなわち、互いに時間的に間隔の空いた）画像が利用され、対応するヌクレオチドが決定される。本明細書に記載されるように、単一の撮像工程中に、放射光の２つ以上の異なる波長帯を同時にキャプチャすることが実現され得るが、それによって、時間的に離間された第２の画像セットが排除され、複数の撮像工程が、撮像のための単一のシークエンスに低減されて、シークエンシングのスループットが改善されることになる。しかしながら、放射光の波長帯どうしが重複することに起因して、同時に２つ以上のチャネルの放射光の取得を実現するには困難があり得る。例えば、場合によっては、放射光の波長帯どうしが互いに近接しすぎている場合（例えば、青色帯及び緑色帯の場合）には、異なる蛍光色素のそれぞれの発光スペクトルどうしが重複する場合があり得る。そのような場合、スペクトルの「クロストーク」が発生し、対応するヌクレオチドを決定するための処理において困難が生じ得る。
本明細書には、合成によるシークエンシングプロセスの場合に、単一の撮像工程において、対応するヌクレオチドを決定するために処理され得る放射光の２つ以上の波長帯を、同時にキャプチャするシステム及び方法が記載される。具体的には、第１の波長帯を、２つのヌクレオチド（例えばアデニン及びチミンなど）と関連づけることができる。第２の波長帯を、上記２つのヌクレオチドと重複する１つのヌクレオチドと、第３のヌクレオチドとに（例えば、アデニン及びシトシンに）関連づけることができる。第１の波長帯は、第１の下部波長及び第１の上部波長を有することができる。第２の波長帯は、第２の下部波長及び第２の上部波長を有することができる。いくつかの実施形態では、第１の下部波長は、第２の上部波長から少なくとも５０ｎｍ離れている。いくつかの実施形態では、第１の下部波長及び第２の上部波長は、クロストークが、例えば２０％などの第１の所定の値を下回るように設定される。
色素どうしの間の分離は、１つ以上の他の方法で定義することができる。これは、波長帯、色チャネル、又は蛍光色素のうちの１つ以上に基づくことができる。波長帯は、第１の波長と第２の波長との間の全ての周波数（例えば、本質的に連続的な周波数範囲）を含むことができる。例えば、第１の波長及び第２の波長を、波長帯が青色光又は別の色の光を含むように選択することができる。色チャネルは、検出器によって検出されている周波数又は複数の周波数を表す。例えば、放射光のうちの、色チャネル内には存在しない周波数は、検出器に到達する前にフィルタリングによって除外することができる。いくつかの実施形態では、色チャネルは、１つ以上の波長帯を含むことができる。蛍光色素は、複数の方法で特徴付けることができるが、その方法としては、その化学構造及び／又はその光学特性が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、１つの波長帯においてのみ又は２つ以上の波長帯において蛍光光を放射するということ、又はある周波数の、若しくはある波長帯内にある平均波長若しくはピーク波長を有するということで、特徴づけられ得る。
いくつかの実施形態では、分離は、所定の波長を上回る又は下回る、対応する色素から放射される放射光の量に基づいて定義することができる。分離は、他の色素の波長帯に関連づけられる所定の波長を上回る又は下回る、放射光の量が最大でもある所定の割合であるように定義することができる。例えば、色素の蛍光光の最大でＸパーセントが、他の色素の所定の波長の上方又は下方に放射される。いくつかの実施形態では、先に挙げた例における数字Ｘは、任意の好適な数、例えばある値の範囲などであり得る。例えば、この範囲は、蛍光光の約０～１０％であり得る。別の例としては、この範囲は、蛍光光の約０．５～５％であり得る。別の例としては、この範囲は、蛍光光の約０．１～１％であり得る。いくつかの実施形態では、色素間の平均又はピーク波長の分離を使用することができる。例えば、２つの色素は、それらの平均波長又はピーク波長どうしが、少なくとも所定の程度（例えば、距離、又はいずれかの波長の割合）によって分離される場合に、分離メトリックを満たすと見なすことができる。
１つ以上の蛍光色素を利用して、前述の波長帯内の光を放射することができる。例えば、本明細書に記載されるいくつかの色素は、青色波長帯に局在化されて青色の色チャネルのための光を放射する発光スペクトルを有していてもよい。同様に、本明細書に記載されるいくつかの色素は、緑色波長帯に局在化されて緑色の色チャネルのための光を放射する発光スペクトルを有していてもよい。同様に、本明細書に記載されるいくつかの色素は、赤色波長帯に局在化されて赤色の色チャネルのための光を放射する発光スペクトルを有していてもよい。例えば、青色及び緑色の色チャネルを検出することができる。別の例として、青色、緑色、及び赤色の色チャネルを検出することができる。色素の発光スペクトルは、それぞれが青色スペクトル領域及び緑色スペクトル領域にそれぞれ十分に局在して、発光波長の重複が少なくなるように選択することができる。
ＩＩ．多重化蛍光検出のための、例示的な器具及び照明光システム
ＩＩ．多重化蛍光検出のための、例示的な器具及び照明光システム
図１は、器具１２、カートリッジ１４、及びフローセル１６を含むシステム１０の図である。システム１０は、生物学的及び／又は化学的解析のために使用することができる。システム１０は、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の他の実施例と共に又はその実施形態において、使用することができる。
カートリッジ１４は、例えばフローセル１６を介する試料などの、１つ以上の試料のためのキャリアとして機能することができる。カートリッジ１４は、フローセル１６を保持し、フローセル１６を輸送して器具１２と直接的相互作用させたり、それから離脱させたりするように構成され得る。例えば、器具１２は、少なくとも試料からの情報の収集中にカートリッジ１４を受容し収容するレセプタクル１８（例えば、その外側エンクロージャ内の開口部）を含む。カートリッジ１４は、任意の好適な材料で作製することができる。いくつかの実施形態では、カートリッジ１４は、成形プラスチック又は他の耐久性のある材料を含む。例えば、カートリッジ１４は、フローセル１６を支持又は保持するためのフレームを形成し得る。
本明細書の実施例は、解析される試料について言及する。このような試料は、遺伝子材料を含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、遺伝子材料の１つ以上の鋳型鎖を含む。例えば、本明細書に記載される技術及び／又はシステムを使用して、ＳＢＳを１つ以上の鋳型ＤＮＡ鎖に対して実施することができる。
フローセル１６は、器具１２によって分析される試料を保持するように構成された１つ以上の基材を含み得る。任意の好適な材料を基材に使用することができ、その例としては、ガラス、アクリル、及び／又は別のプラスチック材料が挙げられるが、それらに限定されない。フローセル１４は、液体又は他の流体が試料に対して、選択的に流れることを可能にすることができる。いくつかの実施形態では、フローセル１６は、試料を保持することができる１つ以上のフロー構造を含む。いくつかの実施形態では、フローセル１２は、少なくとも１つの流路を含むことができる。例えば、流路は、流体の流れを容易にするための１つ以上の流体ポートを含むことができる。
器具１２は、少なくとも１つの生物学的物質及び／又は化学物質に関連する任意の情報又はデータを得るように動作させることができる。操作（複数可）は、中央ユニットによって、又は１つ以上の分散されたコントローラによって制御され得る。ここでは、器具コントローラ２０が図示されている。例えば、コントローラ２０は、少なくとも１つのプロセッサ、器具１２を操作するための命令を保持する少なくとも１つの記憶媒体（例えば、メモリ及び／又はドライブ）、及び例えば、以下に記載されるような１つ以上の他のコンポーネントを使用して実装することができる。いくつかの実施形態では、器具１２は、光学操作を実行することができるが、その操作としては、試料（複数可）の照明光及び／又は撮像が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、器具１２は、１つ以上の光学サブシステム（例えば、照明光サブシステム及び／又は撮像サブシステム）を含むことができる。いくつかの実施形態では、器具１２は、熱処理を行うことができるが、そのような処理の例としては、試料の熱コンディショニングが挙げられるが、それに限定されない。例えば、器具１２は、１つ以上の熱サブシステム（例えば、ヒータ及び／又は冷却器）を含むことができる。いくつかの実施形態では、器具１２は、流体管理を行うことができるが、その例としては、試料と接触する流体を転嫁すること及び／又は除去することを含むが、これらに限定されない。例えば、器具１２は、１つ以上の流体サブシステム（例えば、ポンプ及び／又はリザーバ）を含むことができる。
図２は、例示的な照明光システム１００の図である。照明光システム１００は、光源アセンブリ１１０と、励起ダイクロイックフィルタ１２８と、対物レンズ１３４と、フローセル１３６と、発光ダイクロイックフィルタ１３８と、第１の光学検出サブシステム１５６と、第２の光学検出サブシステム１５８とを含む。照明光システム１００は、２つの色チャネルの同時的イメージングを可能にする。いくつかの実施形態では、別の照明光システムが、２つを超える色チャネル、例えば、３つの色チャネル、４つの色チャネル、又はそれより多くの色チャネルの、同時的イメージングを可能にするように構成することができる。複数の色チャネルの同様の同時的イメージングを生成することができる他の光学構成が存在し得ることに留意されたい。
光源アセンブリ１１０は、フローセル１３６に入射する励起照明光を生成する。この励起照明光は、投影レンズ１４２及び１４８を使用して収集される、１つ以上の蛍光色素からの放射照明光又は蛍光照明光を生成する。図２に示すように、光源アセンブリ１１０は、第１の励起照明光源１１２と、対応する集光レンズ１１４と、第２の励起照明光源１１６と、対応する集光レンズ１１８と、ダイクロイックフィルタ１２０と、を含む。
第１の励起照明光源１１２及び第２の励起照明光源１１６は、試料に対するそれぞれの励起照明光（例えば、それぞれの色チャネルに対応する）を同時に提供することができる照明光システムの例である。いくつかの実施形態では、第１の励起照明光源１１２及び第２の励起照明光源１１６のそれぞれは、発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む。いくつかの実施形態では、第１の励起照明光源１１２及び第２の励起照明光源１１６のうちの少なくとも１つは、レーザーを含む。いくつかの実施形態では、第１の励起源１１２は緑色光、すなわち、緑色に対応するピーク又は平均波長（例えば、約５６０ｎｍ）を有する狭帯域光を生成する。いくつかの実施形態では、第２の励起源１１６は、青色光、すなわち、青色に対応するピーク又は平均波長（例えば、約４９０ｎｍ）を有する狭帯域光を生成する。
集光レンズ１１４及び１１８はそれぞれ、それぞれの励起照明光源１１２及び１１６からの距離を設定し、それにより、集光レンズ１１４／１１８のそれぞれから出てくる照明光は、視野開口１２２に集束される。
ダイクロイックフィルタ１２０は、第１の励起照明光源１１２からの照明光を反射し、第２の励起照明光源１１６からの照明光を透過させる。第１の励起照明光源１１２が緑色光を生成し、第２の励起照明光源１１６が青色光を生成するいくつかの実施形態では、ダイクロイックフィルタは緑色光を反射し、青色光を透過させる。ダイクロイックフィルタ１２０は、本実施例では２つの波長、青色及び緑色の混合された混合照明光を、光路を通して出力して先に送り、対物レンズ１３４によって放射させる。
いくつかの実施形態では、ダイクロイックフィルタ１２０から出力された混合励起照明光は、対物レンズ１３４に向かって直接伝搬することができる。他の実施形態では、混合励起照明光は、対物レンズ１３４から発光される前に、追加的な介在光学コンポーネントによって、更に修正及び／又は制御され得る。図１に示す例では、混合励起照明光は、フィールド開口１２２内の焦点を通過して、青色／緑色フィルタ１２４に至り、次いで色補正コリメートレンズ１２６に至る。レンズ１２６からのコリメート励起照明光は、ミラー１２８に入射するが、そこで反射されて、励起／発光ダイクロイックフィルタ１３０に入射する。励起／発光ダイクロイックフィルタ１３０は、発光照明光を可能にしながら、光源アセンブリ１１０から放射された励起照明光を反射（これについては以下で更に説明する）し、反射された励起照明光は、励起／発光ダイクロイックフィルタ１３０を通過して１つ以上の光学サブシステム１５６、１５８によって受光される。光学サブシステム１５６及び１５８は、多重化蛍光光を同時に収集することができる集光システムの例である。励起／発光ダイクロイックフィルタ１３０によって反射された励起照明光は、その後ミラー１３２に入射して、そのミラー１３２からは対物レンズ１３４に入射して、その対物レンズ１３４からは、フローセル１３６に向かって進む。
対物レンズ１３４は、ミラー１３２からの、コリメートされた励起照明光を、フローセル１３６上へと集束させる。いくつかの実施形態では、対物レンズ１３４は、例えば、１Ｘ、２Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、８Ｘ、１０Ｘ、又はそれより大きい指定の拡大倍率を有する顕微鏡対物レンズである。対物レンズ１３４は、ミラー１３２から入射する励起照明光を、フローセル１３６上に集束させるが、その場合に、励起照明光は、上記の拡大倍率によって決定される角度の円錐形状又は開口数で収束される。いくつかの実施形態では、対物レンズ１３４は、フローセルに対して垂直な軸線（「ｚ軸」）上で移動可能である。いくつかの実施形態では、照明光システム１００は、管レンズ１４８のｚ方向位置及び管レンズ１４２のｚ方向位置を独立して調整する。例えば、これにより、対物レンズをｚ方向に移動する必要なく、緑色チャネルを検出器１５４に集束させることができ、かつ青色チャネルを検出器１４６に完全に集束させることができる。管レンズ１４８及び１４２の、ｚ方向位置を独立して調節することは、器具を最初に位置合わせするときに行われる「１回限りの調整」であってもよい。
フローセル１３６は、解析される試料（ヌクレオチド配列など）を含有する。フローセル１３６は、試料材料を保持し、試料材料に対して行われるアクションを容易にするように構成された１つ以上のチャネル１６０（この図では、拡大断面図によって概略的に図示されている）を含み得る。このアクションとしては、化学反応の誘発、又は材料の追加若しくは除去が挙げられるが、これらに限定されない。ここでは、破線を用いて模式的に図示される対物レンズ１３４の物体平面１６２は、フローセル１３６を通って延在する。例えば、物体平面１６２は、チャネル（複数可）１６０に隣接するように画定することができる。
対物レンズ１３４は、視野を画定することができる。視野は、画像検出器が対物レンズ１３４を使用して、そこから放射光を捉えるフローセル１３６上の領域を画定することができる。１つ以上の画像検出器、例えば、検出器１４６及び１５４を使用することができる。例えば、第１の励起照明光源１１２及び第２の励起照明光源１１６が異なる波長（又は異なる波長範囲）を有するそれぞれの励起照明光を生成する場合、照明光システム１００は、放射光のそれぞれの波長（又は波長範囲）のための別個の画像検出器１４６及び１５４を含むことができる。画像検出器１４６及び１５４のうちの少なくとも１つは、時間遅延集積ＣＣＤカメラなどの電荷結合素子（ＣＣＤ）、又は相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）技術に基づいて製造されたセンサを含むことができる。後者の例としては、化学感受性電界効果トランジスタ（ｃｈｅｍＦＥＴ）、イオン感受性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）、及び／又は金属酸化物半導体電界効果トランジスタ（ＭＯＳＦＥＴ）などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、照明光システム１００は、構造化照明光顕微鏡（ＳＩＭ）を含むことができる。ＳＩＭ撮像は、空間的に構造化された照明光及び再構成に基づくことにより、対物レンズ１３４から拡大のみを使用して生成された画像よりも高い解像度画像をもたらす。例えば、構造体は、照明光励起光を遮断するパターン又は格子からなるか、又はそれを含むことができる。いくつかの実施形態では、構造体は、縞のパターンを含むことができる。光の縞は、反射又は透過回折が生じるように回折格子上に光ビームを衝突させることによって生成することができる。構造化光は、試料上に投影することができ、何らかの周期性に従って生じ得るそれぞれの縞に従って試料を照明光することができる。ＳＩＭを使用して画像を再構成するために、励起照明光のパターンが互いに異なる位相角にある、２つ以上のパターン画像が使用される。例えば、試料の画像は、画像のそれぞれのパターン位相と呼ばれる場合がある、構造化光中の縞の異なる位相で取得することができる。これにより、試料上の様々な場所が、多数の照明光強度の光によって露光されることを可能にすることができる。結果として生じる放射光画像のセットを組み合わせて、より高い解像度の画像を再構築することができる。
フローセル１３６内の試料材料を、対応するヌクレオチドに結合する蛍光色素と接触させる。蛍光色素は、対物レンズ１３４からフローセル１３６に入射する、対応する励起照明光によって照射されると、蛍光照明光を発する。放射照明光は波長帯を用いて同定され、そのそれぞれは、それぞれの色チャネルに分類することができる。例えば、放射照明光の波長帯は、青色（例えば、４５０ｎｍ～５２５ｎｍ）、緑色（例えば、５２５ｎｍ～５７０ｎｍ）、黄色（例えば、５７０ｎｍ～６２５ｎｍ）、赤色（例えば、６２５ｎｍ～７５０ｎｍ）などに対応することができる。いくつかの実施形態では、波長帯は、同時照明光中に存在する２つ以上の光波長に基づいて定義され得る。例えば、青色及び緑色の色のみが解析される場合、青色及び緑色に対応する波長帯は、前述の範囲とは異なる波長帯として定義することができる。例えば、青色波長帯は、約４５０ｎｍ～５１０ｎｍ（例えば４８６ｎｍ～５０６ｎｍ）の放射光として設定することができる。場合によっては、青色波長帯は、上限（例えば約５００ｎｍ～５１０ｎｍ、又は約５０６ｎｍ）のみを有することができる。同様に、緑色波長帯は、約５２５ｎｍ～６５０ｎｍ（例えば５８４ｎｍ～６３７ｎｍ）の放射光として設定することができる。前述の緑色波長帯は、上記の黄色及び赤色の色に延在するが、青色及び緑色の色範囲のみであると予想される放射光を解析すると、波長帯の上端部及び／又は下端部は、その色の波長より上方又は下方に放射される追加的放射光を捕捉するために延長することができる。場合によっては、緑色波長帯は、下限（例えば約５５０ｎｍ～６００ｎｍ、又は約５８４ｎｍ）のみを有することができる。
蛍光色素は、例えばそれぞれの核酸塩基を含有する、それぞれのヌクレオチドと化学的に結合される。このようにして、蛍光色素で標識化されたｄＮＴＰは、画像検出器１４６、１５４によって検出されたときに、対応する波長帯内にある放射光波長に基づいて同定されてもよい。すなわち、青色色素で標識化された第１のｄＮＴＰは、上述したように、画像検出器１４６、１５４が、画定された青色波長帯内の放射光を受光したことに応答して、同定され得る。同様に、緑色色素で標識化された別のヌクレオチドは、上述のように、画像検出器１４６、１５４が、画定された緑色波長帯内の放射光を受光したことに応答して、同定され得る。同時にＤＮＡクラスター撮像用の色素標識化ヌクレオチドの他の色の組み合わせもまた、適切な照明光源及び光学設定と組み合わせることによってシークエンシングのために使用することができる（色の組み合わせの例：青色及び黄色；青色及び赤色；緑色及び赤色；黄色及び赤色；青色、緑色、及び赤色；青色、緑色、及び黄色；青色、黄色、及び赤色；緑色、黄色、及び赤色；青色、緑色、黄色、及び赤色；等）。
蛍光色素の構成については、様々な色素を説明する下記のセクションＩＩＩにおいて、更に詳細に論じられる。いくつかの実施形態では、蛍光色素は、照明光システム１００によって有効化された同時的イメージングプラットフォームを使用して、各ヌクレオチドが色チャネルでロバストに同定され得るように構築される。色素発光スペクトル及びフィルタリングを選択することにより、複数の色素からの多重化された放射光を実現することができる。具体的には、青色の色チャネル及び緑色の色チャネルなどの、互いに近い又は類似の色の波長帯は、比較的近接することができるため、ある特定の複数の蛍光色素を、対応する発光スペクトルどうしが十分に小さい重複しか有しないように選択すれば、ヌクレオチドが誤って同定される潜在的可能性を低減させ、したがって、シークエンシングにおける誤りを低減させる一助とすることができる。加えて、波帯域フィルタリングの使用によって、同様の色を有し得る特定の複数の蛍光色素を区別する際に、更なる一助を提供することができる。
いくつかの実施形態では、２つの色チャネルを使用して、４種類のヌクレオチドを同定することができる。その場合、第１のヌクレオチドは第１の色チャネルのみに関連づけられてもよく、第２のヌクレオチドは第２の色チャネルのみに関連づけられてもよく、第３のヌクレオチドは両方の色チャネルに関連づけられてもよく、第４のヌクレオチドはいずれの色チャネルとも関連づけられていなくてもよい。
対物レンズ１３４はまた、フローセル１３６内の蛍光色素分子によって放射される蛍光光も捕捉する。この放射光を捕捉すると、対物レンズ１３４は、２つの色チャネルを含むコリメートされた光を収集及び伝達する。次いで、この放射光は、元の励起照明光が照明光源１１０からそこに到達して来た経路に沿って伝搬されて戻る。放射光と励起照明光との間には干渉性がないため、この経路に沿っては、放射照明光と励起照明光との間に干渉が予想されないということに留意されたい。すなわち、放射光は、別個の供給源の結果、すなわち、蛍光色素がフローセル１３６内の試料材料と接触したことの結果である。
放射光が、ミラー１３２によって反射されると、励起／発光ダイクロイックフィルタ１３０に入射する。フィルタ１３０は、放射光を透過させて、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８に送る。
いくつかの実施形態では、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８は、青色チャネルに関連づけられた照明光を透過させ、緑色の色チャネルに関連づけられた照明光を反射する。いくつかの実施形態では、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８は、そのダイクロイックフィルタ１３８が、光学サブシステム１５６に対して放射された、画定された緑色波長帯内にある照明光を反射し、光学サブシステム１５８に放射された、画定された青色波長帯内にある照明光を透過させるように選択される。光学サブシステム１５６は、管レンズ１４２、フィルタ１４４、及び画像検出器１４６を含む。光学サブシステム１５８は、管レンズ１４８、フィルタ１５０、及び画像検出器１５４を含む。
いくつかの実施形態では、ダイクロイックフィルタ１３８及びダイクロイックフィルタ１２０は、互いに類似の動作をする（例えば、両方とも１つの色の光を反射し、別の色の光を透過させ得る）。他の実施形態では、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８及びダイクロイックフィルタ１２０は、互いに異なる動作をする（例えば、ダイクロイックフィルタ１３８は、ダイクロイックフィルタ１２０が反射する色の光を透過させ、ダイクロイックフィルタ１２０は、ダイクロイックフィルタ１３８が反射する色の光を透過させ得る）。
青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８が青色チャネルに含まれる放射照明光を透過させると仮定すると、緑色の色チャネルに含まれる放射照明光は、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８から光学サブシステム１５６に反射され得る。次いで、ミラー１４０は、緑色の色チャネルに含まれる放射照明光を反射して、光学サブシステム１５６の管レンズ１４２上に入射させる。光学サブシステム１５６のフィルタ１４４は、放射照明光の緑色の色チャネル内の波長を透過させ、全ての他の波長を吸収又は反射するように設計された緑色フィルタである。フィルタ１４４は、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８では利用可能でない、追加のフィルタリングを提供することができる。例えば、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８が緑色光の比較的広い波長範囲を反射する場合、フィルタ１４４は、上記の波長範囲を更に制限して、緑色光の比較的狭い波長範囲のみが画像検出器１４６に到達するようにすることができる。フィルタ１４４は、漏れた励起光のいかなるものを遮断してもよく、かつ／又は比較的狭い波長帯を画定してもよい。
同時に、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８は、青色の色チャネルに含まれる放射照明光を透過させて、光学サブシステム１５８の管レンズ１４８上に入射させる。光学サブシステム１５８のフィルタ１５０は、放射照明光の青色の色チャネル内の波長を透過させ、全ての他の波長を吸収又は反射するように設計された青色フィルタである。フィルタ１５０は、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８では利用可能でない追加のフィルタリングを提供することができる。例えば、青色／緑色ダイクロイックフィルタ１３８が青色光の比較的広い波長範囲を透過させる場合、フィルタ１５０は、上記の波長範囲を更に制限して、青色光の比較的狭い波長範囲のみが画像検出器１５４に到達するようにすることができる。フィルタ１５０は、漏れた励起光のいかなるものを遮断してもよく、かつ／又は比較的狭い波長帯を画定してもよい。
いくつかの実施形態では、図２に示すように、青色チャネルに含まれる放射照明光は、画像検出器１５４の前にミラー１５２に遭遇する。図示の例では、光学サブシステム１５８内の光路は、照明光システム１００全体が空間又は容積要件を満たし得るように曲がっている。いくつかの実施形態では、このようなサブシステム１５６及び１５８の両方が、曲がった光路を有する。いくつかの実施形態では、サブシステム１５６又は１５８内の光路のいずれも曲がっていない。このように、複数の光学サブシステムのうちの１つ以上は、少なくとも１つの曲がった光路を有することができる。
各管レンズ１４２及び１４８は、自らに入射した放射照明光をそれぞれ対応する画像検出器１４６及び１５４上に集束させる。各検出器１４６及び１５４は、いくつかの実施形態では、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイを含む。いくつかの実施形態では、各画像検出器１４６及び１５４は、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサを含む。
前述したように、照明光システム１００は、図２に示されるようである必要はない。例えば、ミラー１２８、１３２、１４０のそれぞれは、照明光の方向を変えるプリズム又はいくつかの他の光学デバイスと置き換えられてもよい。各レンズは、回折格子、回折光学素子、フレネルレンズ、又は入射照明光からコリメート又は集束された照明光を生成する何らかの他の光学デバイスで置き換えられてもよい。更に、照明光システム１００は、青色／緑色以外の異なる波長帯、例えば、赤色／緑色又は青色／赤色にわたって分離するように設計されてもよい。本明細書で論じられるいくつかの青色色素、緑色色素、及び赤色色素は、以下の「例示的な蛍光色素」という名称のセクションＩＩＩに更に詳述される。
図３は、例示的な一実施形態による赤色色素及び緑色色素の発光スペクトルのプロットを含むダイアグラム３００である。蛍光は縦軸に対して測定され、波長は横軸上に示されている。蛍光は、放射光の強度によって測定することができる。いくつかの実施形態では、光の強度を判定する１つ以上の方法を使用することができる。例えば、較正されたベンチマークに対する任意の強度ユニットを使用することができる。スペクトル３０２及び３０４は、緑色色素として特徴付けることができ、スペクトル３０６及び３０８は赤色色素として特徴付けることができる。ダイアグラム３００は、色チャネル３１０及び３１２を含む。色チャネル３１０は、緑色発光フィルタと関連づけることができる。例えば、色チャネル３１０は緑色の色チャネルと見なすことができる。色チャネル３１２は、赤色発光フィルタと関連づけることができる。例えば、色チャネル３１２は、赤色の色チャネルと見なすことができる。
チャネル間のスペクトルクロストークが問題となる場合があり得る。クロストークは、色チャネルが逐次的に照明される場合及び同時的に照明される場合の両方で生じ得る。いくつかの実施形態では、より高い波長チャネルへのより低い波長チャネルのクロストークは、より悪いシナリオと見なすことができる。例えば、これは、スペクトル３０２又は３０４が色チャネル３１２にはみ出ることを伴い得る。ここで、スペクトル３０２～３０８は、逐次照明において２．４％のクロストーク、及び同時照明において２．８％のクロストークを有してもよい。例えば、これは、同時的取得と逐次的取得との間の相対的に最小限のクロストーク差と見なすことができる。
図４は、図３の緑色色素及び赤色色素を使用した逐次的イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図４００である。緑色チャネルで検出された放射光の量が縦軸に示され、赤色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光４０２は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、赤色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光４０４は、赤色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光４０６は、緑色及び赤色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光４０８は、緑色及び赤色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。このように、発光９０８は、緑色チャネルの波長帯内で実質的に光を放射せず、赤色チャネルの波長帯内でも実質的な光を放射しない蛍光色素の一例である。
発光４０２～４０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光４０２は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光４０４は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光４０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光４０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の逐次的イメージングでは、発光４０２～４０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
図５は、図３の緑色及び赤色色素を用いた同時的多重化イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図である。緑色チャネルで検出された放射光の量が縦軸に示され、赤色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光５０２は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、赤色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光５０４は、赤色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光５０６は、緑色及び赤色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光５０８は、緑色及び赤色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光５０２～５０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光５０２は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光５０４は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光５０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光５０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光５０２～５０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
図６は、図４及び図５の２チャネルシークエンシング解析のメトリックスを示す図である。指標６００は、逐次的照明に関するものであり、メトリック６０２は、同時照明に関する。
すなわち、上記の例は、同時に取得しても、赤色／緑色系におけるクロストークのレベルが比較的低くなり得ることを示している。しかしながら、他の色チャネルでは、クロストークの量はより困難を生じるものであり得る。
図７は、例示的な一実施形態による青色色素及び緑色色素の発光スペクトルのプロットを含むダイアグラム７００である。蛍光は縦軸に対して測定され、波長は横軸上に示されている。スペクトル７０２及び７０４は、青色色素として特徴付けることができ、スペクトル７０６及び７０８は緑色色素として特徴付けることができる。例えば、スペクトル７０２は、青色照明光におけるアデニンの検出に対応することができる。例えば、スペクトル７０４は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、スペクトル７０６は、緑色照明光におけるアデニンの検出に対応することができる。例えば、スペクトル７０８は、チミンの検出に対応することができる。
ダイアグラム７００は、色チャネル７１０及び７１２を含む。色チャネル７１０は、青色発光フィルタと関連づけることができる。例えば、色チャネル７１０は青色の色チャネルと見なすことができる。色チャネル７１２は、緑色発光フィルタと関連づけることができる。例えば、色チャネル７１２は緑色の色チャネルと見なすことができる。
ダイアグラム７００は、シトシン塩基を同定するための青色発光に対応し得るスペクトル７０４が、色チャネル７１２内に、相当量ではみ出していることを示す。いくつかの実施形態では、上記のはみ出しが起こるのは、緑色励起波長と青色励起波長との間の分離（例えば、約７０ｎｍであり得る）は、赤色波長と緑色波長（例えば、約１４０ｎｍであり得る、図３を参照されたい）との間の分離よりも比較的小さいためである。すなわち、青色色素の発光スペクトルは、緑色色素の発光スペクトルと重なる波長成分を発する。したがって、青色／緑色シナリオ（例えば、ダイアグラム７００）における蛍光発光どうしは、赤色／緑色シナリオ（例えば、ダイアグラム３００）における蛍光発光どうしよりもはるかに近い場合がある。青色／緑色照明光による逐次的照明では、クロストークの量は、比較的最小の又は無視できる程度のものであり得る。しかしながら、同時照明では、クロストークは比較的多いものであり得る。例えば、クロストークは約４０％であり得る。
図８は、図７の青色色素及び緑色色素を使用した同時的多重化イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図８００である。青色チャネルで検出された放射光の量が縦軸上に示され、緑色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光８０２は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。このように、発光８０２は青色チャネルの波長帯内で実質的に光を放射せず、緑色チャネルの波長帯内でも実質的な光を放射しない蛍光色素の一例である。発光８０４は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光８０６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光８０８は散布図８００内で広がり、少なくとも発光８０２及び８０６の一部と一致する。発光８０８の重心８０８Ａが示されている。発光８０２～８０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光８０２はグアニンの検出に対応することができる。例えば、発光８０４は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光８０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光８０８は、シトシンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光８０２～８０８は、比較的大きなクロストークを有する。
図９は、例示的な一実施形態による、代替的青色色素及び緑色色素の発光スペクトルのプロットを含む別のダイアグラム９００である。蛍光は縦軸に対して測定され、波長は横軸上に示されている。スペクトル９０２及び９０４は、青色色素として特徴付けることができ、スペクトル９０６は、緑色色素として特徴付けることができる。ダイアグラム９００は、色チャネル９０８及び９１０を含む。色チャネル９０８は、青色発光フィルタと関連づけることができる。例えば、色チャネル９０８は青色の色チャネルと見なすことができる。色チャネル９１０は、緑色発光フィルタと関連づけることができる。例えば、色チャネル９１０は緑色の色チャネルと見なすことができる。スペクトル９０２～９０６のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、スペクトル９０２は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、スペクトル９０４は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、スペクトル９０６は、チミン又はアデニンの検出に対応することができる。
ダイアグラム９００のスペクトル放射は、同時的多色イメージングをサポートする色素を示す。例えば、図７のダイアグラム７００とは対照的に、シトシン塩基シークエンシング色素の青色発光に対応するスペクトル９０２のピークは、かなり青の側に偏って移動している。ここで、スペクトル９０４は、色チャネル９０８内のピークを有し、スペクトル９０２のピークはスペクトル９０８内にはない。スペクトル９０６のピークは、色チャネル９１０の下端のわずかに下方に位置する。ダイアグラム９００は、逐次的照明における比較的最小の又は無視できる程度のクロストークを示し得る。例えば、図９００は、同時的照明において約１２％のクロストークを示し得る。
図９００における比較的低いレベルのクロストークは、それぞれの色素が互いに十分に分離していることと相関し得る。いくつかの実施形態では、分離は、発光スペクトルのピーク又は平均波長に基づいて定義することができる。ピーク波長は、放射光の強度の局所的又は全体的最大値に対応することができる。平均波長は、放射スペクトルの範囲内の平均波長に対応することができる。いくつかの実施形態では、色素は、それらのそれぞれのピーク又は平均波長が、互いに少なくとも所定の分離を有するように選択され得る。例えば、スペクトル９０２のピーク波長は、スペクトル９０６のピーク波長からは、少なくとも所定の分離を有することができる。別の例として、スペクトル９０４のピーク波長は、スペクトル９０６のピーク波長からは、少なくとも所定の分離を有することができる。
いくつかの実施形態では、分離は、重なり合う波長範囲内の光の量に基づいて定義することができる。色チャネル９１０の左縁９１０’は、色チャネル９１０の波長範囲の特定の波長に対応することができる。スペクトル９０２又は９０４が色チャネル９１０内に、著しくは延在していないことを確実にするということが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、それぞれの蛍光色素どうし間の分離は、スペクトル９０２又は９０４が、縁部９１０’に対応する波長又はそれより高い波長に、最大で所定の量の光を含むように定義することができる。上記の所定の量とは、絶対数（例えば、放射光の量又はその強度の上限閾値）として、又は相対数（例えば、色素によって放射される蛍光光の総量の割合として）として定義することができる。
図９～１６を参照して記載されている青色色素及びその変形例は、以下に、より詳細に記載される。
図１０は、図９の青色色素及び緑色色素を使用した同時的多重化イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図１０００である。青色チャネルで検出された放射光の量が縦軸上に示され、緑色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光１００２は、青色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１００４は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１００６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光１００８は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光１００２～１００８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光１００２は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光１００４は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光１００６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光１００８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光１００２～１００８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
図１１は、他の青色色素及び緑色色素を使用した同時的多重化イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図１１００である。青色チャネルで検出された放射光の量が縦軸上に示され、緑色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光１１０２は、青色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１１０４は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１１０６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光１１０８は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光１１０２～１１０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光１１０２は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光１１０４は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光１１０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光１１０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光１１０２～１１０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
図１２は、更に他の青色色素及び緑色色素を使用して同時的多重化イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図１２００である。青色チャネルで検出された放射光の量が縦軸上に示され、緑色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光１２０２は、青色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１２０４は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１２０６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光１２０８は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光１２０２～１２０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光１２０２は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光１２０４は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光１２０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光１２０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光１２０２～１２０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
異なるカラーフィルタを使用することができる。同時的取得のためのフィルタ設計を選択することができる。いくつかの実施形態では、約５８３ｎｍ～６６０ｎｍの緑色フィルタ発光通過帯域を使用することができる。例えば、これは、５５０ｎｍ～６３７ｎｍなどの別の緑色通過帯域と比較してシフトを表すことができる。
図１３は、例示的な一実施形態による、代替的青色色素及び緑色色素の発光スペクトルのプロットと、及び対応するフィルタ範囲とを含む別の図１３００である。蛍光は縦軸に対して測定され、波長は横軸上に示されている。スペクトル１３０２及び１３０４は、青色色素として特徴付けることができ、スペクトル１３０６は、緑色色素として特徴付けることができる。ダイアグラム１３００は、色チャネル１３０８及び１３１０を含む。色チャネル１３０８は、青色発光フィルタと関連づけることができ、従来のフィルタ１３０８’と対比することができる。例えば、色チャネル１３０８は青色の色チャネルと見なすことができる。色チャネル１３１０は、緑色発光フィルタと関連付けることができる。例えば、色チャネル１３１０は緑色の色チャネルと見なすことができる。スペクトル１３０２～１３０６のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、スペクトル１３０２は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、スペクトル１３０４は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、スペクトル１３０６は、チミン又はアデニンの検出に対応することができる。
図１４は、第１のフィルタ範囲を使用し、図１３の青色色素及び緑色色素を使用した同時的多重化イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図１４００である。例えば、第１のフィルタ範囲は、図１３の従来のフィルタ１３０８’に対応することができる。青色チャネルで検出された放射光の量が縦軸上に示され、緑色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光１４０２は、青色チャネル及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光１４０４は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１４０６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光１４０８は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光１４０２～１４０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光１４０２は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光１４０４は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光１４０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光１４０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光１４０２～１４０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
図１５は、第２のフィルタ範囲を使用し、図１３の青色色素及び緑色色素を使用した同時的多重化イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図１５００である。例えば、第２のフィルタ範囲は、図１３の色チャネル１３０８’に対応することができる。青色チャネルで検出された放射光の量が縦軸上に示され、緑色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光１５０２は、青色チャネル及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光１５０４は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１５０６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光１５０８は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光１５０２～１５０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光１５０２は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光１５０４は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光１５０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光１５０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光１５０２～１５０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
分離は、１つ以上の方法で定義することができる。いくつかの実施形態では、波長放射分離は、スペクトル１３０４からの放射光の、色チャネル１３１０と関連づけられた波長よりも低い光量に基づいて定義することができる。波長発光分離は、蛍光色素のうちの一方の発光スペクトルが、他方の蛍光色素に関連づけられた波長（例えば、最も近い境界波長、又は特性波長）以上の光を最大で含むように、蛍光色素間に画定することができる。例えば、この量は、スペクトル１３０４の量Ｘ（例えば、全蛍光のパーセンテージ）が、色チャネル１３１０のより低い波長（例えば、その色チャネルの下限）を下回る波長で発生することを示し得る。いくつかの実施形態では、先に挙げた例における数字Ｘは、任意の好適な数、例えばある値の範囲などであり得る。例えば、この範囲は、蛍光光の約０～１０％であり得る。別の例としては、この範囲は、蛍光光の約０．５～５％であり得る。別の例としては、この範囲は、蛍光光の約０．１～１％であり得る。いくつかの実施形態では、分離は、スペクトル１３０６とスペクトル１３０２又は１３０４のいずれかとの間の平均又はピーク波長分離に基づいて画定することができる。例えば、スペクトル１３０４の平均波長（例えば、蛍光発光の平均波長）又はスペクトル１３０４のピーク波長（例えば、蛍光光の強度が最大である波長）が、スペクトル１３０６の平均波長又はピーク波長から既定量を超えて分離される場合、スペクトル１３０４及び１３０６は分離していると見なすことができる。上記の既定量は、絶対値であり得る。例えば、平均波長又はピーク波長は、少なくとも約５０～１００ｎｍ、例えば約７０ｎｍで分離され得る。上記の既定量は、相対値であり得る。例えば、平均波長又はピーク波長どうしは、平均波長又はピーク波長のいずれかの少なくとも約５～２０パーセント、例えば、より低い又はより高い平均波長又はピーク波長のいずれかの約１３パーセントの量で分離され得る。
結論として、本明細書に記載される改善を使用して、多色画像の取得を実現することができるが、これは、以前は極めて困難と考えられ、成功の可能性が非常に小さいと考えられていたものである。次に、改善のいくつかのより多くの実施例を説明する。
図１６は、図１３の第２のフィルタ範囲を使用し、図９の青色色素及び緑色色素を使用した同時的多重化イメージングを有する２チャネルシークエンシング解析を示す散布図１６００である。緑色チャネルで検出された放射光の量が縦軸に示され、青色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光１６０２は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１６０４は、青色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光１６０６は、緑色及び青色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光１６０８は、緑色及び青色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光１６０２～１６０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光１６０２は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光１６０４は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光１６０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光１６０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光１６０２～１６０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
上記の発光１６０２～１６０８のそれぞれは、２つの検出器１４６及び１５４（図２）のうちの１つにおいて、ある時間にわたって収集された強度の分布を表す。図１３の発光スペクトルのプロットに示されるように、「Ｃ」核酸塩基は青色色素に関連づけられており、したがって発光１６０４は、大量の高青色照明光レベル及び低緑色照明光レベルを有する。これによって、「Ｃ」核酸塩基が同定される。「Ｔ」核酸塩基は、大量の緑色照明光レベル及び低青色照明光レベルを有する発光１６０２を介して同定される。これによって、「Ｔ」核酸塩基が同定される。
発光１６０６によって同定される「Ａ」核酸塩基は、高青色照明光レベル及び緑色照明光レベルの混合物を有する。スペクトル１３０４及び１３０６（図１３）は両方とも「Ａ」核酸塩基に対応することに留意されたい。同様に、「Ｇ」核酸塩基は、低レベルの青色照明光及び緑色照明光を有する発光１６０８によって同定される。
発光１６０２～１６０８は、それぞれの平均値の周りに、相当量の広がり量を有する分布を有するが、相当な量のクロストークを概ね呈すものではない。このようにして、核塩基のそれぞれを容易に同定し得る。
図１７は、図１６の２チャネルシークエンシング解析のメトリックスを示す図である。メトリック１７００は、運転概要に関するものである。メトリック１７０２は、第１のリードに関連し、メトリック１７０４は第２のリードに関連する。
図１８は、本明細書に記載される改善された技術の一部として、多重化蛍光画像を生成及び解析することに関与し得る、例示的な逐次的工程のタイムライン１８００を表す図である。タイムライン１８００は、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の実施例と共に使用することができる。時間の経過は、横軸に対して測定され、それぞれの操作は縦軸に沿って示される。
概略的に例示されるマルチカラー画像キャプチャ１８０２は、１つ以上の撮像時間ブロック１８０４及び１つ以上のカメラ関連時間ブロック１８０６を含むことができる。いくつかの実施形態では、撮像時間ブロック１８０４は、システムがレーザーダイオードのウォーミングアップを実行するために必要とされる時間、１つ以上の露光のための手配、及び露光（複数回も可）の露光時間に対応し得る。撮像時間ブロック１８０４の後には、カメラ関連時間ブロック１８０６が続き得る。例えば、カメラ関連時間ブロック１８０６は、個々のカメラスナップに関連するオーバーヘッド時間及びカメラ応答時間、並びにデータ転送の時間を含むことができる。カメラ関連時間ブロック１８０６の後には、撮像時間ブロック１８０４の別の１つが続き得る。したがって、マルチカラー画像キャプチャ１８０２は、撮像時間ブロック１８０４とカメラ関連時間ブロック１８０６との間を交互に行き来するシークエンスを含むことができる。例えば、これは、色素の導入、露光時間、及び画像取得のためのカメラスナップを伴い得る。
図１９は、本明細書に記載される改善された技術の一部として、多重化蛍光画像を生成及び解析することに関与し得る、例示的な逐次的工程のタイムライン１９００を表す図である。図１９に示すように、タイムライン１９００は、オートフォーカスプロセス１９１０、マルチカラー画像セット取得プロセス１９２０、並びに進行及び静止プロセス１９３０を含む。横軸は経過時間を表す。以下のいくつかの実施例はまた、あくまでも例示目的ではあるが図２を参照する。
オートフォーカスプロセス１９１０で、タイムライン１９００が開始される。まず、レーザーダイオードのウォーミングアップがなされ、自動焦点露光が生成される。カメラ（すなわち、検出器）スナップオーバーヘッド時間、カメラ応答時間、及びデータ転送時間に基づいて判定が行われて、対物レンズ１３４をその軸（すなわち、「ｚ」方向）に沿って移動させて、対物レンズ１３４の位置を、集束した照明光ビームがフローセル１３６に対して所望の物体平面に入射するように確立する。
対物レンズ１３４のこの位置が設定された後、マルチカラー画像セット取得処理５２０が開始されてもよい。例えば、これは、青色の色チャネル及び緑色の色チャネル、又は赤色の色チャネル及び緑色の色チャネル、又は別の選択された色チャネルを使用して画像をキャプチャすることを伴い得る。レーザーダイオードのウォーミングアップが終わった後の青色画像検出器１４６及び緑色画像検出器１５４のそれぞれについて、試料に所定の時間光を照射して、１つ以上の色素を蛍光発光させる。
多重化蛍光画像が、画像検出器１４６及び１５４によって取得され、得られたデータが処理システムに転送され得る。図１９に示すように、このプロセスは、ここでは、各検出器上で６つの画像を取得するために６回、検出器の両方についてそれぞれ繰り返される。いくつかの実施形態では、画像セット取得プロセスは、実施形態に応じて、例えば、２回、３回、４回、５回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、及びそれよりも多い回数繰り返されてもよい。転送されたデータは、ＤＮＡ配列の再構築に使用することができる。遺伝子配列（例えば、ＤＮＡ配列）の再構築及び／又は決定は、全ての画像がキャプチャされ、ヌクレオチド塩基が呼び出された後に生じ得る。
多色（例えば、青色及び緑色）画像及びそれらのデータが取得された後、フローセル１３６の異なる部分が、撮像のための位置に移動される。ここで、フローセル１３６がステージ上にあるとき、ステージはタイル分だけ移動されるが、これはフローセル１３６の画定された下位区画であり得る。次いで、進行及び静止プロセス１９３０が遂行され、フローセル１３６及び任意の他の機械的コンポーネントが、次の撮像プロセスが起こる前に、実質的に静止することを可能にする。すなわち、フローセル１３６は、ステージ上で前進（進行）され、フローセル１３６を移動させた後、ある程度の時間が、フローセル１３６内の液体を鎮めるために使われる。
図２０は、本明細書に記載される改善された技術の一部として、多重化蛍光画像を生成及び解析することに関与し得る、例示的な逐次的工程のタイムライン２０００を表す図である。図２０に示すように、タイムライン２０００は、オートフォーカスプロセス２０１０、マルチカラー（例えば、青色及び緑色）画像セット取得プロセス２０２０、並びに進行及び静止プロセス２０３０を含む。横軸は経過時間を表す。以下のいくつかの実施例はまた、あくまでも例示目的ではあるが図２を参照する。
オートフォーカスプロセス２０１０で、タイムライン２０００が開始される。まず、レーザーダイオードのウォーミングアップがなされ、自動焦点露光が生成される。カメラ（すなわち、検出器）スナップオーバーヘッド時間、カメラ応答時間、及びデータ転送時間に基づいて判定が行われて、対物レンズ１３４をその軸（すなわち、「ｚ」方向）に沿って移動させて、対物レンズ１３４の位置を、集束した照明光ビームがフローセル１３６に対して所望の物体平面に入射するように確立する。
対物レンズ１３４のこの位置が設定された後、マルチカラー画像セット取得処理２０２０が開始されてもよい。レーザーダイオードのウォーミングアップが終わった後の青色画像検出器１４６及び緑色画像検出器１５４のそれぞれについて、試料に所定の時間光を照射して、１つ以上の色素を蛍光発光させる。構造化照明光顕微鏡（ＳＩＭ）を利用する実施形態では、格子又は他のＳＩＭコンポーネントを移動させて、工程２０４０で１つ以上の縞の位相を変更することができる。上記の１つ以上の縞は、何らかの周期性に従って生じ得る。これらの縞は、試料の異なる部分に照明光を提供しつつ、他の部分への照明光を遮断するために移動される。多重化蛍光画像が、画像検出器１４６及び１５４によって取得され、得られたデータが処理システムに転送され得る。図２０に示すように、このプロセスは、ここでは、各検出器上で６つの画像を取得するために６回、検出器の両方についてそれぞれ繰り返される。いくつかの実施形態では、画像セット取得プロセスは、実施形態に応じて、例えば、２回、３回、４回、５回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、及びそれよりも多い回数繰り返されてもよい。これらの露光及びキャプチャの間、転送されたデータは、ＤＮＡ配列の再構築に使用される。
多色画像及びそれらのデータが取得された後、フローセル１３６の異なる部分が、撮像のために位置に移動される。ここで、フローセル１３６がステージ上にあるとき、ステージはタイル分だけ移動されるが、これはフローセル１３６の画定された下位区画であり得る。次いで、進行及び静止プロセス２０３０が遂行され、フローセル１３６及び任意の他の機械的コンポーネントが、次の撮像プロセスが起こる前に、実質的に静止することを可能にする。すなわち、フローセル１３６は、ステージ上で前進（進行）され、フローセル１３６を移動させた後、ある程度の時間が、フローセル１３６内の液体を鎮めるために使われる。
図２１は、本明細書に記載される技術による、シークエンシング操作を実行する方法２１００を示すフローチャートである。方法２１００は、本明細書に記載される照明光システム１００を使用して実行することができる。方法２１００は、示されるよりも多い又は少ない操作を含むことができる。方法２１００の操作のうちの２つ以上は、別途記載のない限り、異なる順序で実行することができる。本明細書に記載される他の実施例のいくつかの態様が、例示目的のために参照されるであろう。
工程２１０２では、第１のヌクレオチド及び第２のヌクレオチドを含む試料が提供される。例えば、このようなヌクレオチドは、図２のフローセル１３６内の試料材料の一部であってもよい。
工程２１０４では、試料を第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素と接触させる。第１の蛍光色素は、第１の励起照明光に応答して第１の波長帯内で第１の放射光を放射し、第２の蛍光色素は、第２の励起照明光に応答して第２の波長帯内で第２の放射光を放射する。例えば、第１の蛍光色素は、図１３に示すスペクトル１３０４を有する青色色素を含んでもよく、第２の色素は、図１３に示すスペクトル１３０６を有する緑色色素であってもよい。
工程２１０６では、多重化蛍光光を同時に収集する。多重化蛍光光は、少なくとも第１の放射光及び第２の放射光を含む。第１の放射光は、第１の波長帯に対応する第１の色チャネルであってもよく、第２の放射光は、第２の波長帯に対応する第２の色チャネルであり得る。例えば、青色の色チャネル及び緑色の色チャネルを使用することができる。別の例として、青色の色チャネル、緑色の色チャネル、及び赤色の色チャネルを使用することができる。１つの色素発光のピーク（例えば、青色色素のピーク）は、別の色素発光のピーク（例えば、緑色色素のピーク）から、光スペクトルにわたって十分な分離を有するべきであり、その結果として、より低い波長の放射光（例えば、青色）が、他方の（例えば、緑色）発光検出チャネル内にはみ出ないようになる。上記のはみ出しは、放射光（例えば、スペクトルのテール）が他の色チャネルの検出器によって検出されるクロストークと呼ばれるものを引き起こす場合がある。スペクトルが比較的長いテールを有する場合、他の発光フィルタの開始点を移動させて、クロストークを除去又はその量を低減することができる。
工程２１０８では、第１のヌクレオチド及び第２のヌクレオチドを同定することができる。第１のヌクレオチドは、第１の色チャネルの第１の波長帯に基づいて同定することができ、第２のヌクレオチドは、第２の色チャネルの第２の波長帯に基づいて同定することができる。
図２２は、本明細書に記載される技術による、シークエンシング操作を実行する方法２２００を示すフローチャートである。方法２２００は、本明細書に記載される照明光システム１００を使用して実行することができる。方法２２００は、示されるよりも多い又は少ない操作を含むことができる。方法２２００の操作のうちの２つ以上は、別途記載のない限り、異なる順序で実行することができる。本明細書に記載される他の実施例のいくつかの態様が、例示目的のために参照されるであろう。
工程２２０２では、多重化蛍光画像をキャプチャすることができる。いくつかの実施形態では、これは、複数種類の照明光を有する色素タグ付き試料の同時照明に基づいて行うことができ、１つを超える色チャネル（青色の色チャネル及び緑色の色チャネルを含むがこれらに限定されない）での放射光からの画像の取り込みに基づいて行うことができる。例えば、図１８の撮像時間ブロック（複数可）１８０４は、現在の操作（複数可）に対応することができる。
工程２２０４では、画像キャプチャに関連づけられた１つ以上の操作を実行することができる。いくつかの実施形態では、これは、カメラ応答時間、データ転送操作、及び／又はオーバーヘッド操作を含むことができる。例えば、カメラ関連時間ブロック１８０６は、現在の操作（複数可）に対応することができる。
工程２２０６では、工程２２０２及び工程２２０４における操作を、０回以上繰り返すことが実行され得る。いくつかの実施形態では、工程２２０２及び工程２２０４における操作は交互に、複数のサイクルで実行することができる。例えば、６回の実行することで、各検出器で６つの画像を取得することができる（例えば、図１８を参照）。
工程２２０８では，ヌクレオチドを、多重化蛍光画像（複数可）に基づいて同定することができる。例えば、各ヌクレオチドは、対応する色チャネルに基づいて同定することができる。
図２３は、本明細書に記載される技術による、シークエンシング動作を実行する方法２３００を示すフローチャートである。方法２３００は、本明細書に記載される照明光システム１００を使用して実行することができる。方法２３００は、示されるよりも多い又は少ない操作を含むことができる。方法２３００の動作のうちの２つ以上は、別途記載のない限り、異なる順序で実行することができる。本明細書に記載される他の実施例のいくつかの態様が、例示目的のために参照されるであろう。
工程２３０２では、オートフォーカスプロセスを開始することができる。いくつかの実施形態では、オートフォーカスプロセス２０１０（図２０）が開始される。
工程２３０４では、１つ以上のレーザーダイオードをウォーミングアップすることができる。いくつかの実施形態では、これはオートフォーカスプロセスの一部である。
工程２３０６では、オートフォーカス露光を実行することができる。いくつかの実施形態では、これはオートフォーカスプロセスの一部である。
工程２３０８では、位置を計算することができる。いくつかの実施形態では、これは、対物レンズを動かすかどうかの判定を含むことができる。例えば、ｚ方向に沿って対物レンズを移動させるかどうかを、またどの程度移動させるかを、判定することができる。これは、オートフォーカスプロセスの一部であり得る。
工程２３１０では、対物レンズを動かすことができる。いくつかの実施形態では、このことは、オートフォーカスプロセスの一部であり得る。
工程２３１２では、マルチカラー画像の取得を開始することができる。いくつかの実施形態では、これは、２つ以上の多重化蛍光画像の獲得を伴うことができる。
工程２３１４では、１つ以上のレーザーダイオードをウォーミングアップすることができる。いくつかの実施形態では、これは、マルチカラー画像の取得プロセスの一部である。
工程２３１６では、露光回数に対する判定を行うことができる。いくつかの実施形態では、これは、マルチカラー画像の取得プロセスの一部である。
工程２３１８では、露光（複数可）を捕捉することができる。いくつかの実施形態では、これは、複数の色チャネルのそれぞれについて別個の検出器を使用して行うことができる。例えば、これは、マルチカラー画像の取得プロセスの一部である。
工程２３２０では、１つ以上の縞を移動させることができる。いくつかの実施形態では、ＳＩＭが使用され、格子又は他のＳＩＭコンポーネントが移動され得る。例えば、移動は、何らかの周期性に従って行うことができる。これは、マルチカラー画像の取得プロセスの一部であり得る。この操作は、ＳＩＭを伴わない実施形態においては省略することができる。
工程２３２２では、進行及び静止プロセスを開始することができる。
工程２３２４では、微細なｚ方向移動を行うことができる。これは、進行及び静止プロセスの一部であり得る。
工程２３２６では、ｙ方向移動を行うことができる。これは、進行の個々の操作（例えば、カートリッジ又は他の試料キャリアを移動させる）、及び静止（例えば、次のキャプチャに対する動きの影響を排除又は最小化するために、キャリア及びその内容物を静止させることを可能にすること）を伴い得る。
工程２３２８では、データ転送を行うことができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の多重化蛍光画像を解析のために転送することができる。例えば、解析は、試料中のヌクレオチドの同定のために行うことができる。
図２４は、本明細書に記載の色素Ｉ－４で標識化された完全官能化されたＡヌクレオチドが、２チャネルシークエンシング解析において使用可能であることを示す散布図２４００である。青色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示され、緑色チャネルで検出された放射光の量が縦軸上に示されている。発光２４０２は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光２４０４は、青色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光２４０６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光２４０８は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光２４０２～２４０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光２４０２は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光２４０４は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光２４０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光２４０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光２４０２～２４０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
図２５は、本明細書に記載の色素Ｉ－５で標識化された完全官能化されたＡヌクレオチドが、２チャネルシークエンシング解析において使用可能であることを示す散布図２５００である。青色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示され、緑色チャネルで検出された放射光の量が縦軸上に示されている。発光２５０２は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光２５０４は、青色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光２５０６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光２５０８は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光２５０２～２５０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光２５０２は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光２５０４は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光２５０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光２５０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光２５０２～２５０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
図２６は、本明細書に記載の色素Ｉ－６で標識化された完全官能化されたＡヌクレオチドが、２チャネルシークエンシング解析において使用可能であることを示す散布図２６００である。緑色チャネルで検出された放射光の量が縦軸に示され、青色チャネルで検出された放射光の量が横軸上に示されている。発光２６０２は、緑色チャネル内の相当多量の発光に対応し、青色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光２６０４は、青色チャネル内の相当多量の発光に対応し、緑色チャネル内の発光はほとんど又は全く見られない。発光２６０６は、青色及び緑色チャネルの両方における相当多量の発光に対応する。発光２６０８は、青色及び緑色チャネルの両方において発光がほとんど又は全く見られないことに対応する。発光２６０２～２６０８のそれぞれは、対応するヌクレオチドの検出に対応することができる。例えば、発光２６０２は、チミンの検出に対応することができる。例えば、発光２６０４は、シトシンの検出に対応することができる。例えば、発光２６０６は、アデニンの検出に対応することができる。例えば、発光２６０８はグアニンの検出に対応することができる。本実施例の同時的イメージングでは、発光２６０２～２６０８は、互いから比較的分離しており、最小の又は無視できるクロストークを示す。
ＩＩＩ．蛍光色素の例
Ａ．青色色素の例
ＩＩＩ．蛍光色素の例
Ａ．青色色素の例
蛍光の好適な蛍光強度、形状、及び波長最大値のような蛍光特性を改善した蛍光色素分子は、核酸シークエンシングの速度及び精度を改善することができる。蛍光シグナルが強いことは、測定が、水性の生物学的緩衝液中かつ高温下で行われる場合には、大部分の色素の蛍光強度がそのような条件下で著しく低いため、特に重要である。更に、色素が付着している塩基の性質はまた、蛍光最大値、蛍光強度、及び色素の他のスペクトル特性に影響を及ぼす。核酸塩基と蛍光色素との間の、配列特異的相互作用は、蛍光色素の具体的な設計によって調整することができる。蛍光色素の構造を最適化することにより、ヌクレオチドの組み込み効率を改善し、シークエンシングエラーのレベルを低減させ、核酸シークエンシングにおける試薬の使用量を減少させ、その結果、核酸シークエンシングのコストを低減させることができる。
いくつかの光学的及び技術的開発は、既に、画質を大幅に向上させてきたが、最終的には、不十分な光学解像度によって制限された。一般に、光学顕微鏡の光学解像度は、使用される光の波長のおよそ半分の距離で離間した物体どうしを見分けるレベルに限定される。実際的な用語では、互いに非常に遠く離れた（少なくとも２００～３５０ｎｍ）物体どうしのみが、光学顕微鏡法によって見分けることができる。画像解像度を改善し、単位表面積当たりで見分けることができるオブジェクトの数を増加させる１つの方法は、より短い波長の励起光を使用することである。例えば、同じ光学系を用いて、波長がΔλ約１００ｎｍだけ短縮されると、解像度がより良好になり（約Δ５０ｎｍ／（約１５％））、歪みの少ない画像が記録され、認識可能な領域上の物体の密度が約３５％増加する。
特定の核酸シークエンシング法は、色素標識化されたヌクレオチドを励起及び検出するためにレーザー光を用いる。これらの器具は、６６０ｎｍで励起可能な適切な色素と共に、赤色レーザーなどのより長い波長の光を使用する。有用な解像度を維持しながら、より密集した核酸シークエンシングクラスターを検出するためには、より短波長の青色光源（４５０～４６０ｎｍ）を使用することができる。この場合、光学解像度は、長波長赤色蛍光色素の発光波長によって限定されなくてもよく、むしろ、次の最長波長光源、例えば、緑色レーザー光（５３２ｎｍ）によって励起可能な色素の発光によって制限され得る。
環外アミン置換クマリン色素
環外アミン置換クマリン色素
以下は、環外アミン置換クマリン誘導体の例である。それらの化合物は、蛍光標識、特に核酸シークエンシング用途におけるヌクレオチド標識化に有用であり得る。いくつかの態様では、それらの色素は短波長光、最適には４５０～４６０ｎｍの波長の光を吸収し、４５０～４６０ｎｍの波長を有する青色波長励起源が使用される状況において特に有利である。青色波長光による励起は、蛍光発光の波長がより短くなるため、単位面積当たりで、より高密度の特徴部を検出し、見分けることを可能にする。このような色素がヌクレオチドとのコンジュゲートで使用される場合、核酸シークエンシング法の実行中に得られるシークエンシングリードの長さ、強度、精度、及び品質の改善を見ることができる。
本明細書のいくつかの例は、合成による蛍光検出及びシークエンシングの方法に特に好適な、環外アミン置換クマリン化合物に関する。以下に記載されるのは、式（Ｉ）の構造の色素及び誘導体、並びにその塩である。
いくつかの態様では、ＸはＯである。いくつかの態様では、ＸはＳである。いくつかの態様では、ＸはＳｅである。いくつかの態様では、ＸはＮＲｎであり、ここで、Ｒｎは、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、又はＣ６～１０アリールであり、一態様では、Ｒｎは、Ｈである。いくつかの更なる実施形態においては、ｍが１であり、Ｒ５が、－ＣＯ２Ｈであり、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４のそれぞれがＨであり、環Ａが
である場合、Ｘは、Ｏ、Ｓｅ、又はＮＲｎである。いくつかの更なる実施形態では、ｎが０であり、環Ａが
であり、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４のそれぞれがＨであり、ＸがＯである場合、Ｍは、１、２、３、又は４である。いくつかの態様では、ｎが０である場合、ｍは１、２、３、又は４であり、少なくとも１つのＲ５は－ＣＯ２Ｈである。いくつかの他の態様では、ｎが１であり、Ｒ３が－ＣＯ２Ｈである場合、ｍが０であるか、又はＲ５が－ＣＯ２Ｈではないかである。
いくつかの態様では、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換若しくは無置換のアルキル、置換若しくは無置換のアルケニル、置換若しくは無置換のアルキニル、置換若しくは無置換のアルコキシ、置換若しくは無置換のアミノアルキル、置換若しくは無置換のカルボシクリル、置換若しくは無置換のヘテロシクリル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールである。一態様では、Ｒは、Ｈである。別の態様では、Ｒはハロゲンである。いくつかの態様では、Ｒは、置換又は無置換のＣ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒは、－ＣＯ２Ｈである。いくつかの態様では、Ｒは、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒは、－ＳＯ２ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルキルである。一態様では、Ｒは、－ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒは－ＣＮではない。
いくつかの態様では、Ｒ１は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ１は、ハロゲンである。いくつかの態様では、Ｒ１は－ＣＮである。いくつかの態様では、Ｒ１は、Ｃ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ１は、－ＳＯ２ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルキルである。一態様では、Ｒ１は、－ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ１は－ＣＮではない。
いくつかの態様では、Ｒ２は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２は、ハロゲンである。いくつかの態様では、Ｒ２は、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２は、置換又は無置換のアルキル、例えばＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒ２は、－ＣＯ２Ｈ又は－ＳＯ３Ｈで置換若しくは無置換のＣ１～４アルキルである。
いくつかの態様では、Ｒ４は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ４は、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ４は、置換又は無置換のアルキル、例えばＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒ４は、－ＣＯ２Ｈ又は－ＳＯ３Ｈで置換若しくは無置換のＣ１～４アルキルである。
いくつかの態様では、環Ａは、３～７員の単環式複素環である。いくつかの更なる実施形態では、３～７員の単環式複素環は、１個の窒素原子を含有する。いくつかの態様では、環Ａは、
である。そのような一実施形態では、環Ａは、
である。いくつかの態様では、環Ａは
である。そのような一実施形態では、環Ａは、
である。いくつかの態様では、環Ａは、
である。そのような一実施形態では、環Ａは、
である。本明細書に記載の環Ａのいくつかの態様では、ｎは０である。本明細書に記載の環Ａのいくつかの態様では、ｎは１である。本明細書に記載の環Ａのいくつかの態様では、ｎは２又は３である。いくつかの態様では、各Ｒ３は、独立して、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、任意に－ＣＯ２Ｈ若しくは－ＳＯ３Ｈで置換されたＣ１～４アルキル、－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃ、又は置換若しくｋは無置換のＣ１～６アルキルである。一部の態様では、Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、又はヘキシルである。他の態様では、Ｒ３は、置換されたＣ１～４アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ３は、－ＣＯ２Ｈ又は－ＳＯ３Ｈで置換されたＣ１～４アルキル又はＣ２～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、ｎは１であり、Ｒ３は－ＣＯ２Ｈ又は－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃである。いくつかの更なる実施形態では、ＲＣは、Ｈ又はＣ１～４アルキルである。
式（Ｉ）の
部分のベンゼン環は、Ｒ５として示される置換基によって任意の１、２、３、又は４つの位置で任意に置換される。式中、ｍはゼロであり、ベンゼン環は無置換である。式中、ｍは１より大きく、各Ｒ５は同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様では、ｍは０である。他の態様では、ｍは１である。他の態様では、ｍは２である。いくつかの態様では、ｍは１、２、又は３であり、各Ｒ５は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｒｆ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＲａＲｂ、又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルキルであり、式中、ＲｆはＨ又はＣ１～４アルキルである。いくつかの更なる実施形態において、Ｒ５は、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、又は－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、若しくは－ＳＯ２ＮＨ２で置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒ５は、－（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨであり、式中、ｘは２、３、４、５、又は６である。いくつかの実施形態では、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４のそれぞれがＨであり、ｎが０であり、ｍが１である場合、
は、以下の位置
で置換される。一実施形態では、Ｒ５は、－ＣＯ２Ｈである。
式（Ｉ）の化合物の具体例としては、ＸがＯ、Ｓ又はＮＨであり、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４がＨであり、環Ａが、
であり、ｎが０又は１であり、Ｒ３が、－ＣＯ２Ｈ又は－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃであり、ｐは、１、２、３、又は４であり、Ｒｃが、Ｈ又はＣ１～６アルキルであり、ｍが０又は１であり、Ｒ５が、ハロゲン、－ＣＯ２Ｒｆ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＲａＲｂ、又は－ＳＯ３Ｈ若しくは－ＳＯ２ＮＲａＲｂで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒａ及びＲｂのうちの少なくとも一方又は両方が、Ｈ又はＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒｆが、Ｈ又はＣ１～４アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、ｍが０である場合、ｎは１であり、又はｎが０である場合、ｍは１である。一実施形態では、ｍ及びｎの両方は１である。
式（Ｉ）の化合物の具体例としては、ＸがＯ、Ｓ又はＮＨであり、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４がＨであり、環Ａが、
であり、ｎが０又は１であり、Ｒ３が、－ＣＯ２Ｈ又は－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃであり、ｐは、１、２、３、又は４であり、Ｒｃが、Ｈ又はＣ１～６アルキルであり、ｍが０又は１であり、Ｒ５が、ハロゲン、－ＣＯ２Ｒｆ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＲａＲｂ、又は－ＳＯ３Ｈ若しくは－ＳＯ２ＮＲａＲｂで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒａ及びＲｂのうちの少なくとも一方又は両方が、Ｈ又はＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒｆが、Ｈ又はＣ１～４アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、ｍが０である場合、ｎは１であり、又はｎが０である場合、ｍは１である。一実施形態では、ｍ及びｎの両方は１である。
式（Ｉ）の化合物の具体例としては、ＸがＯ、Ｓ又はＮＨであり、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４がＨであり、環Ａが、
であり、ｎが０又は１であり、Ｒ３が、－ＣＯ２Ｈ又は－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃであり、ｐは、１、２、３、又は４であり、Ｒｃが、Ｈ又はＣ１～６アルキルであり、ｍが０又は１であり、Ｒ５が、ハロゲン、－ＣＯ２Ｒｆ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＲａＲｂ、又は－ＳＯ３Ｈ若しくは－ＳＯ２ＮＲａＲｂで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒａ及びＲｂのうちの少なくとも一方又は両方が、Ｈ又はＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒｆが、Ｈ又はＣ１～４アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、ｍが０である場合、ｎは１であり、又はｎが０である場合、ｍは１である。一実施形態では、ｍ及びｎの両方は１である。
環外アミン置換クマリン色素の具体例としては、以下が挙げられる：
及びその塩が挙げられる。
特に有用な化合物は、本明細書に記載の色素で標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、カルボキシ基又はアルキル－カルボキシ基を介して本明細書に開示される色素化合物に結合して、アミド又はアルキル－アミドを形成してもよい。例えば、本明細書に開示される色素化合物は、式（Ｉ）のＲ３又はＲ５を介してヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のＲ３は、－ＣＯ２Ｈ又は－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｈであり、その結合は、－ＣＯ２Ｈ基を使用してアミドを形成する。いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のＲ５は－ＣＯ２Ｈであり、その結合は、－ＣＯ２Ｈ基を使用してアミドを形成する。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置に取り付けられた標識、又は７デアザプリン塩基のＣ７位置にリンカー部分を介して取り付けられた標識を有してもよい。
標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖に共有結合したブロッキング基を有してもよい。ブロッキング基は、リボース糖又はデオキシリボース糖上の任意の位置に付着されてもよい。特定の実施形態では、ブロッキング基は、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖の３’ＯＨ位置にある。
第３級アミン置換クマリン色素
第３級アミン置換クマリン色素
本明細書には、合成による蛍光検出及びシークエンシングの方法に特に好適な第３級アミン置換クマリン化合物も開示される。第３級アミン置換クマリン色素の実施形態は、優れた水溶性を有する一方で、水又は極性溶媒／緩衝液中で強力な蛍光を呈するので、水性環境におけるヌクレオチド標識化及びシークエンシング用途に好適である。以下に記載される実施形態は、式（ＩＩ）の構造の色素及び誘導体、並びにその塩である。
いくつかの態様では、ＸはＯである。いくつかの態様では、ＸはＳである。いくつかの態様では、ＸはＳｅである。いくつかの態様では、ＸがＮＲｎであり、ここで、Ｒｎが、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、又はＣ６～１０アリールであり、一態様では、Ｒｎは、Ｈ又はフェニルである。いくつかの更なる実施形態では、ｍが１、２、３、又は４であり、Ｒ６のうちの１つが－ＣＯ２Ｈであり、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５のそれぞれがＨである場合、Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、独立して、Ｃ１～６アルキル、－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃ、－（ＣＨ２）ｑ－Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＲｅ、－（ＣＨ２）ｎ－ＳＯ３Ｈ、－（ＣＨ２）ｔ－ＳＯ２ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒｃは、置換若しくは無置換のＣ１～６アルキル、置換若しくは無置換のカルボシクリル、置換若しくは無置換のヘテロシクリル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールである。換言すれば、Ｒ６が－ＣＯ２Ｈである場合、Ｒ３及びＲ４はいずれも－ＣＯ２Ｈ部分を含まない。いくつかの他の実施形態では、ｍが０であるか、又はＲ６が－ＣＯ２Ｈではなく、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５のそれぞれがＨである場合、Ｒ３又はＲ４のうちの少なくとも１つは、－ＣＯ２Ｈを含む。
いくつかの態様では、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換若しくは無置換のアルキル、置換若しくは無置換のアルケニル、置換若しくは無置換のアルキニル、置換若しくは無置換のアルコキシ、置換若しくは無置換のアミノアルキル、置換若しくは無置換のカルボシクリル、置換若しくは無置換のヘテロシクリル、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールである。一態様では、Ｒは、Ｈである。別の態様では、Ｒはハロゲンである。いくつかの態様では、Ｒは、置換又は無置換のＣ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒは、－ＣＯ２Ｈである。いくつかの態様では、Ｒは、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒは、－ＳＯ２ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルキルである。一態様では、Ｒは、－ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒは－ＣＮではない。
いくつかの態様では、Ｒ１は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ１は、ハロゲンである。いくつかの態様では、Ｒ１は－ＣＮである。いくつかの態様では、Ｒ１は、Ｃ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ１は、－ＳＯ２ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒａ及びＲｂは、独立して、Ｈ又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルキルである。一態様では、Ｒ１は、－ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ１は－ＣＮではない。
いくつかの態様では、Ｒ２は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２は、ハロゲンである。いくつかの態様では、Ｒ２は、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２は、置換又は無置換のアルキル、例えばＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒ２は、－ＣＯ２Ｈ又は－ＳＯ３Ｈで置換若しくは無置換のＣ１～４アルキルである。
いくつかの態様では、Ｒ５は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ５は、ハロゲンである。いくつかの態様では、Ｒ５は、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２は、置換又は無置換のアルキル、例えばＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒ５は、－ＣＯ２Ｈ又は－ＳＯ３Ｈで置換若しくは無置換のＣ１～４アルキルである。
いくつかの態様では、Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃである。更なる実施形態では、Ｐは、２、３、４、又は５である。Ｒｃは、Ｈ又はＣ１～６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、又はｔ－ブチルである。いくつかの態様では、Ｒ３は、Ｃ１～６アルキルである。
いくつかの態様では、Ｒ４は、－（ＣＨ２）ｎ－ＳＯ３Ｈである。更なる実施形態では、ｎは、２、３、４、又は５である。いくつかの態様では、Ｒ４は、Ｃ１～６アルキルである。
いくつかの態様では、Ｒ３及びＲ４のうちの少なくとも１つは、Ｃ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ３及びＲ４の両方が、Ｃ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ３が－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃである場合、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎ－ＳＯ３Ｈである。一部の態様では、Ｒ３及びＲ４の両方が、－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃである。
式（ＩＩ）の
部分のベンゼン環は、Ｒ６として示される置換基によって任意の１、２、３、又は４つの位置で任意に置換される。式中、ｍはゼロであり、ベンゼン環は無置換である。式中、ｍは１より大きく、各Ｒ６は同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様では、ｍは０である。他の態様では、ｍは１である。他の態様では、ｍは２である。いくつかの態様では、ｍは１、２、又は３であり、各Ｒ６は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｒｆ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＲａＲｂ、又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルキルであり、式中、ＲｆはＨ又はＣ１～４アルキルである。いくつかの更なる実施形態において、Ｒ６は、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、又は－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、若しくは－ＳＯ２ＮＨ２で置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒ６は、－（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨであり、式中、ｘは２、３、４、５、又は６である。いくつかの実施形態では、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５のそれぞれがＨであり、Ｒ３及びＲ４のそれぞれは、独立して、Ｃ１～６アルキル、－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃ、－（ＣＨ２）ｑ－Ｃ（Ｏ）ＮＲｄＲｅ、－（ＣＨ２）ｎ－ＳＯ３Ｈ、－（ＣＨ２）ｔ－ＳＯ２ＮＲａＲｂであり、式中、Ｒｃは、置換若しくは無置換のＣ１～６アルキル、置換若しくは無置換のカルボシクリル、置換若しくは無置換のヘテロシクリル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールであり（すなわち、Ｒ３及びＲ４のいずれもが、－ＣＯ２Ｈ）を含まず）、ｍが１である場合、
は、以下の位置
で置換される。一実施形態では、Ｒ６は、－ＣＯ２Ｈである。別の実施形態では、Ｒ６は、ハロゲン（例えば、－Ｃｌ）である。更に別の実施形態では、Ｒ６は、－ＳＯ２ＮＲａＲｂであり、Ｒａ及びＲｂのうちの少なくとも一方又は両方が。Ｈ又はＣ１～６アルキルである。
式（ＩＩ）の化合物の具体例としては、ＸがＯ、Ｓ又はＮＨであり、各Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ５がＨであり、Ｒ３が、－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃ、又はＣ１～６アルキルであり、Ｒ４は、Ｃ１～６アルキル又は－（ＣＨ２）ｎ－ＳＯ３Ｈであり、ｍが０又は１であり、Ｒ６が、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＲａＲｂ、ハロ、－ＣＯ２Ｈ、又は－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、若しくは－ＳＯ２ＮＲａＲｂで置換されているＣ１～６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒａ及びＲｂのうちの少なくとも一方又は両方が、Ｈ又はＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒ３が－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｒｃである場合、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎ－ＳＯ３Ｈ又はＣ１～６アルキルである。いくつかの更なる実施形態では、Ｒ３及びＲ４の両方が、Ｃ１～６アルキルである。ｍが１である場合、
は、以下の位置
で置換される。一実施形態では、Ｒ６は、－ＣＯ２Ｈである。別の実施形態では、Ｒ６は、塩素などのハロゲンである。更に別の実施形態では、Ｒ６は、－ＳＯ２ＮＲａＲｂであり、Ｒａ及びＲｂのうちの少なくとも一方又は両方が。Ｈ又はＣ１～６アルキルである。
第三級アミン置換クマリン色素の具体例としては、以下が挙げられる：
並びにそれらの塩。
二級アミン置換を有する追加的クマリン色素としては、以下が挙げられる：
並びにそれらの塩。
特に有用な化合物は、本明細書に記載の色素で標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、カルボキシ基又はアルキル－カルボキシ基を介して本明細書に開示される色素化合物に結合して、アミド又はアルキル－アミドを形成してもよい。例えば、本明細書に開示される色素化合物は、式（ＩＩ）のＲ３、Ｒ４、又はＲ６を介してヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のＲ３又はＲ４は、－ＣＯ２Ｈ又は－（ＣＨ２）ｐ－ＣＯ２Ｈであり、その結合は、－ＣＯ２Ｈ基を使用してアミドを形成する。いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）のＲ６は－ＣＯ２Ｈであり、その結合は、－ＣＯ２Ｈ基を使用してアミドを形成する。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置に取り付けられた標識、又は７デアザプリン塩基のＣ７位置にリンカー部分を介して取り付けられた標識を有してもよい。
標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖に共有結合したブロッキング基を有してもよい。ブロッキング基は、リボース糖又はデオキシリボース糖上の任意の位置に付着されてもよい。特定の実施形態では、ブロッキング基は、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖の３’ＯＨ位置にある。
本明細書に開示される化合物は、典型的には、５００ｎｍ未満の領域の光を吸収する。本明細書に記載される化合物又はヌクレオチドは、生物学系（例えば、プロセス又はそのコンポーネントを含む）を検出、測定、又は同定するために使用されてもよい。化合物又はヌクレオチドを用いることができるいくつかの技術としては、シークエンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合又は細胞機能解析）、又はタンパク質アッセイ（例えば、タンパク質結合アッセイ又はタンパク質活性アッセイ）が挙げられる。その使用は、自動シークエンシング器具などの特定の技術を実行するための自動化器具であってもよい。シークエンシング器具は、異なる波長で動作する２つのレーザーを含んでもよい。
以下に開示されるのは、本開示の化合物の合成方法である。本開示による色素は、様々な異なる好適な出発物質から合成することができる。クマリン色素を調製するための方法は、当該技術分野において周知である。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用するとき、用語「共有結合した（「ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ」又は「ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｎｄｅｄ」）」は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる化学結合の形成を指す。例えば、共有結合したポリマーコーティングとは、他の手段、例えば、接着又は静電相互作用による表面への付着と比較して、基材の官能化表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合したポリマーは、共有結合に加えて、手段によって結合され得ることが理解されるであろう。
本明細書で使用するとき、用語「ハロゲン」又は「ハロ」は、元素周期表の７族の、例えばフッ素、塩素、臭素、又はヨウ素のいずれか１つを意味し、フッ素及び塩素が好ましい。
本明細書で使用するとき、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合又は三重結合を含有しない）直鎖又は分枝鎖炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有してもよい（本明細書に示されるときはいつでも、「１～２０」などの数値範囲は、所与の範囲内の各整数を指す。例えば、「１～２０個の炭素原子」は、アルキル基が、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、最大で２０個の炭素原子からなり得るが、本定義はまた、用語「アルキル」（数値範囲が指定されていない）の発生もカバーすることを意味する。アルキル基はまた、１～９個の炭素原子を有する中規模のアルキルであってもよい。アルキル基は、１～６個の炭素原子を有する低級アルキルであってもよい。アルキル基は、「Ｃ１～４アルキル」又は同様の表記として指定されてもよい。一例にすぎないが、「Ｃ１～６アルキル」は、アルキル鎖中に１～６個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖が、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、及びｔ－ブチルからなる群から選択されるということを示す。典型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「アルコキシ」は、例えば「Ｃ１～９アルコキシ」のような、式－ＯＲを指し、式中、Ｒは上に定義されるアルキルである。そのようなアルキルの例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、１－メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ－ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、及びｔｅｒｔ－ブトキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「アルケニル」は、１つ以上の二重結合を含有する直鎖又は分枝鎖炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「アルケニル」の発生もカバーする。アルケニル基はまた、２～９個の炭素原子を有する中規模のアルケニルであってもよい。アルケニル基は、２～６個の炭素原子を有する低級アルケニルであってもよい。アルケニル基は、「Ｃ２～６アルケニル」又は類似の表記で指定されてもよい。一例にすぎないが、「Ｃ２～６アルケニル」とは、アルケニル鎖中に２～６個の炭素原子が存在することを示し、すなわち、アルケニル鎖は、エテニル、プロペン－１－イル、プロペン－２－イル、プロペン－３－イル、ブテン－１－イル、ブテン－２－イル、ブテン－３－イル、ブテン－４－イル、１－メチル－プロペン－１－イル、２－メチル－プロペン－１－イル、１－エチル－エテン－１－イル、２－メチル－プロペン－３－イル、ブタ－１，３－ジエニル、ブタ－１，２－ジエニル、及びブタ－１，２－ジエン－４－イルからなる群から選択される。典型的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、及びヘキセニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「アルキニル」は、１つ以上の三重結合を含有する直鎖又は分枝鎖炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「アルキニル」の発生もカバーする。アルキニル基はまた、２～９個の炭素原子を有する中規模のアルキニルであってもよい。アルキニル基は、２～６個の炭素原子を有する低級アルキニルであってもよい。アルキニル基は、「Ｃ２～６アルキニル」又は類似の表記で指定されてもよい。一例にすぎないが、「Ｃ２～６アルキニル」は、アルキニル鎖中に２～６個の炭素原子が存在することを示し、すなわち、そのアルキニル鎖は、エチニル、プロピン－１－イル、プロピン－２－イル、ブチン－１－イル、ブチン－３－イル、ブチン－４－イル、及び２－ブチニルからなる群から選択される。典型的なアルキニル基としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、及びヘキシニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「ヘテロアルキル」は、１個以上のヘテロ原子を含有する直鎖又は分枝鎖炭化水素鎖を指し、ヘテロ原子としては、鎖主鎖中に炭素以外の原子を含み、その原子としては窒素、酸素、及び硫黄が挙げられるが、それらに限定されない。ヘテロアルキル基は、１～２０個の炭素原子を有してもよいが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアルキル」の発生もカバーする。ヘテロアルキル基はまた、１～９個の炭素原子を有する中規模のヘテロアルキルであってもよい。ヘテロアルキル基は、１～６個の炭素原子を有する低級ヘテロアルキルであってもよい。ヘテロアルキル基は、「Ｃ１～６ヘテロアルキル」又は類似の表記で指定されてもよい。ヘテロアルキル基は、１個以上のヘテロ原子を含有してもよい。あくまで一例として、「Ｃ４～６ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキル鎖中に４～６個の炭素原子が存在し、更に鎖主鎖に１個以上のヘテロ原子が存在することを示す。
用語「芳香族」は、共役π電子系を有し、炭素環芳香族（例えば、フェニル）及び複素環式芳香族基（例えば、ピリジン）の両方を含む環又は環系を指す。この用語は、環系全体が芳香族である限り、単環式又は縮合多環式（すなわち、隣接する原子対を共有する環）基を含む。
本明細書で使用するとき、「アリール」は、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環又は環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。アリールが環系である場合、系内の全ての環は芳香環である。アリール基は６～１８個の炭素原子を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「アリール」の発生もカバーする。いくつかの実施形態では、アリール基は、６～１０個の炭素原子を有する。アリール基は、「Ｃ６～１０アリール」、「Ｃ６若しくはＣ１０アリール」、又は類似の表記で指定されてもよい。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アズレニル、及びアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
「アラルキル」又は「アリールアルキル」は、「Ｃ７～１４アラルキル」などの、アルキレン基を介して置換基として結合されたアリール基であり、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、及びナフチルアルキルを含むがこれらに限定されない。いくつかの場合において、アルキレン基は、より低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１～６アルキレン基）である。
本明細書で使用するとき、「ヘテロアリール」は、環骨格中に窒素、酸素、及び硫黄を含むがこれらに限定されない、１個以上のヘテロ原子、すなわち炭素以外の元素を含有する芳香環又は環系（すなわち、２つの隣接する原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系である場合、系内の全ての環は芳香環である。ヘテロアリール基は、５～１８個の環員（すなわち、炭素原子及びヘテロ原子を含む、環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアリール」の発生もカバーする。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、５～１０個の環員又は５～７個の環員を有する。ヘテロアリール基は、「５～７員ヘテロアリール」、「５～１０員ヘテロアリール」、又は類似の表記で指定され得る。ヘテロアリール環の例としては、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、及びベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロアラルキル」又は「ヘテロアリールアルキル」は、アルキレン基を介して置換基として結合されたヘテロアリール基である。例としては、２－チエニルメチル、３－チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソオキサゾリリルアルキル、及びイミダゾリルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、アルキレン基は、より低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１～６アルキレン基）である。
本明細書で使用するとき、「カルボシクリル」は、環系骨格中に炭素原子のみを含有する非芳香族環又は環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２つ以上の環が、縮合、架橋、又はスピロ結合方式で一体に結合され得る。カルボシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないことを条件として、任意の飽和度を有してもよい。したがって、カルボシクリルとしては、シクロアルキル、シクロアルケニル、及びシクロアルキニルが挙げられる。カルボシクリル基は、３～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「カルボシクリル」の発生もカバーする。カルボシクリル基はまた、３～１０個の炭素原子を有する中規模のカルボシクリルであってもよい。カルボシクリル基はまた、３～６個の炭素原子を有するカルボシクリルであってもよい。カルボシクリル基は、「Ｃ３～６カルボシクリル」又は同様の表記で指定されてもよい。カルボシクリル環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、ビシクル［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、及びスピロ［４．４］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「シクロアルキル」は、完全飽和カルボシクリル環又は環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。
本明細書で使用するとき、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を含有する非芳香族環又は環系を意味する。ヘテロシクリルどうしは、縮合、架橋、又はスピロ結合式に、一体に接合されてもよい。ヘテロシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないことを条件として、任意の飽和度を有してもよい。ヘテロ原子は、環系中の非芳香環又は芳香環のいずれかに存在してよい。ヘテロシクリル基は、３～２０個の環員（すなわち、炭素原子及びヘテロ原子を含む、環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロシクリル」の発生もカバーする。ヘテロシクリル基はまた、３～１０個の環員を有する中規模のヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル基は、３～６個の環員を有するヘテロシクリルであってもよい。ヘテロシクリル基は、「３～６員ヘテロシクリル」又は類似の表記で指定されてもよい。好ましい６員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ又はＳのうちの１つから３つまで選択される。好ましい５員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、又はＳから選択される１個又は２個のヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例としては、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チアパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキサピペラジニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピロリジオニル、４－ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，３－ジオキシニル、１，３－ジオキサニル、１，４－ジオキシニル、１，４－ジオキサニル、１，３－オキサチニル、１，４－オキサチニル、１，４－オキサチアニル、２Ｈ－１，２－オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ－１，３，５－トリアジニル、１，３－ジオキソリル、１，３－ジオキソラニル、１，３－ジチオリル、１，３－ジチオラニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、１，３－オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ－１，４－チアジニル、チアモルフォリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンズイミダゾリジニル、及びテトラヒドロキノリンが挙げられるが、それらに限定されない。
「Ｏ－カルボキシ」基は、「－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ」基を指し、式中、Ｒは、水素、並びに本明細書で定義するような、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び３～１０員ヘテロシクリルから選択される。
「Ｃ－カルボキシ」基は、「－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ」基を指し、式中、Ｒは、水素と、本明細書で定義するような、Ｃ１～６アルキルと、Ｃ２～６アルケニルと、Ｃ２～６アルキニルと、Ｃ３～７カルボシクリルと、Ｃ６～１０アリールと、５～１０員ヘテロアリールと、３～１０員ヘテロシクリルとからなる群から選択される。非限定的な例としては、カルボキシル（すなわち、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が挙げられる。
「スルホニル」基は、「－ＳＯ２Ｒ」基を指し、式中、Ｒは、水素、並びに本明細書で定義するような、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び３～１０員ヘテロシクリルから選択される。
「スルフィノ」基は、「－Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ」基を指す。
「Ｓ－スルホンアミド」基は、「－ＳＯ２ＮＲＡＲＢ」基を指し、ＲＡ及びＲＢは、水素、本明細書で定義するようなＣ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び３～１０員ヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｎ－スルホンアミド」基は、「－Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２ＲＢ基を指し、式中、ＲＡ及びＲＢは、水素、本明細書に定義されるような、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び３～１０員ヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｃ－アミド」基は、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＡＲＢ基を指し、式中、ＲＡ及びＲＢは、水素、本明細書に定義されるような、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び３～１０員ヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「Ｎ－アミド」基は、－Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ基を指し、式中、ＲＡ及びＲＢは、水素、本明細書に定義されるような、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び３～１０員ヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。
「アミノ」基は「－ＮＲＡＲＢ」を指し、式中、ＲＡ及びＲＢは、水素、本明細書に定義されるような、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、及び３～１０員ヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される。非限定的な例としては、遊離アミノ（すなわち、－ＮＨ２）が挙げられる。
「アミノアルキル」基は、アルキレン基を介して連結されたアミノ基を指す。
「アルコキシアルキル」基は、アルキレン基を介して結合したアルコキシ基を指し、例としては、「Ｃ２～８アルコキシアルキル」などが挙げられる。
本明細書で使用するとき、置換基は、１つ以上の水素原子が別の原子又は基に対して交換されている非置換親基から誘導される。別途記載のない限り、基が「置換されている」と見なされる場合、その基は、以下から独立して選択される１つ以上の置換基で置換されることを意味する：
Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、Ｃ３～Ｃ７－カルボシクリル－Ｃ１～Ｃ６－アルキル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、３～１０員ヘテロシクリル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、３～１０員ヘテロシクリル－Ｃ１～Ｃ６－アルキル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、アリール（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、アリール（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、５～１０員ヘテロアリール（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、５～１０員ヘテロアリール（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、ハロゲン、－ＣＮ、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（例えば－ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ（例えば、－ＯＣＦ３）、Ｃ１～Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、－ＳＯ３Ｈ、スルフィン、－ＯＳＯ２Ｃ１～４アルキル、及びオキソ（＝Ｏ）。ある基が「置換又は無置換の」と記載されている場合には、その基が置換される場合には、上記置換基で置換され得る。
Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルケニル、Ｃ１～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、Ｃ３～Ｃ７－カルボシクリル－Ｃ１～Ｃ６－アルキル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、３～１０員ヘテロシクリル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、３～１０員ヘテロシクリル－Ｃ１～Ｃ６－アルキル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、アリール（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、アリール（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、５～１０員ヘテロアリール（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、５～１０員ヘテロアリール（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（場合によりハロ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルコキシで置換されていてもよい）、ハロゲン、－ＣＮ、ヒドロキシ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル（例えば－ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１～Ｃ６）アルコキシ（例えば、－ＯＣＦ３）、Ｃ１～Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１～Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ－カルバミル、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、－ＳＯ３Ｈ、スルフィン、－ＯＳＯ２Ｃ１～４アルキル、及びオキソ（＝Ｏ）。ある基が「置換又は無置換の」と記載されている場合には、その基が置換される場合には、上記置換基で置換され得る。
いくつかの実施形態では、置換アルキル基、アルケニル基、又はアルキニル基は、ハロゲン、－ＣＮ、ＳＯ３－、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＲＡ、－ＯＲＡ、－ＮＲＢＲＣ、オキソ、－ＣＯＮＲＢＲＣ、－ＳＯ２ＮＲＢＲＣ、－ＣＯＯＨ、及び－ＣＯＯＲＢ（式中、ＲＡ、ＲＢ及びＲＣは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、及び置換アリールから選択される）からなる群から選択される、１つ以上の置換基で置換される。
本明細書に記載の化合物は、いくつかのメソメリー形態として表すことができる。単一の構造が描かれている場合、関連するメソメリー形態のいずれかが意図される。本明細書に記載のクマリン化合物は、単一の構造によって表されるが、関連するメソメリー形態のいずれかとして同様に示され得る。いくつかのメソメリー構造は、下記式（Ｉ）で示される。
いくつかのメソメリー構造は、下記式（ＩＩ）で示される。
本明細書に記載される化合物の単一のメソメリー形態が示されている各事例においては、代替のメソメリー形態も同様に企図される。
当業者には理解されるように、本明細書に記載の化合物は、イオン化形態、例えば、－ＣＯ２
－又は－ＳＯ３
－で存在してもよい。化合物が、正又は負に帯電した置換基、例えば、ＳＯ３
－を含有する場合、化合物が全体として中性であるように、負又は正に帯電した対イオンを含有してもよい。他の態様では、化合物は塩形態で存在してもよく、対イオンは、共役酸又は塩基によって提供される。
特定のラジカル命名法は、文脈に応じてモノラジカル又はジラジカルのいずれかを含むことができることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残りの部分への２つの結合点を必要とする場合、置換基はジラジカルであることが理解される。例えば、２つの付着点を必要とするアルキルとして特定される置換基としては、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－などのジ－ラジカルが挙げられる。他のラジカル命名法は、ラジカルが「アルキレン」又は「アルケニレン」などのジラジカルであることを明確に示す。
２つの「隣接する」Ｒ基が、それらが結合している原子と共に環を形成すると言われる場合、原子の集合単位、介在する結合、及び２つのＲ基が列挙された環であることを意味する。例えば、以下のサブ構造が存在する場合、
Ｒ１及びＲ２は、水素及びアルキルからなる群から選択されるものとして定義されるか、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合している原子と共にアリール若しくはカルボシクリルを形成するが、Ｒ１及びＲ２は、水素若しくはアルキルから選択することができる、あるいは、サブ構造が、以下の構造を有することを意味する：
式中、Ａは、アリール環又は示された二重結合を含有するカルボシクリルである。
標識ヌクレオチド
標識ヌクレオチド
本開示の一態様によれば、基材部分、特に基材部分への付着を可能にするリンカー基を含む、基材部分への付着に好適な色素化合物が提供される。基材部分は、本開示の色素をコンジュゲートさせることができる実質上任意の分子又は物質であってもよく、非限定的な例として、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、リガンド、粒子、固体表面、有機及び無機ポリマー、染色体、核、生細胞、並びにこれらの組み合わせ又は集合体が挙げられる。色素は、疎水性誘引、イオン誘引、及び共有結合を含む様々な手段によって、任意のリンカーによってコンジュゲートさせることができる。いくつかの態様では、色素は、共有結合によって基材にコンジュゲートされる。より具体的には、共有結合は、リンカー基によるものである。場合によっては、このような標識ヌクレオチドは、「修飾ヌクレオチド」とも称される。
本開示は、本明細書に記載される色素（修飾ヌクレオチド）のうちの１つ以上で標識化されたヌクレオシド及びヌクレオチドのコンジュゲートを更に提供する。標識ヌクレオシド及びヌクレオチドは、酵素合成によって形成されるポリヌクレオチドの標識に有用であるが、当該合成の非限定的な例としては、ＰＣＲ増幅、等温増幅、固相増幅、ポリヌクレオチドシークエンシング（例えば、固相シークエンシング）、ニックトランスレーション反応などが挙げられる。
生体分子への付着は、式（Ｉ）の化合物のＲ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、又はＸ位置を介してもよい。いくつかの態様では、接続は、式（Ｉ）のＲ３又はＲ５基を介している。生体分子への付着は、式（ＩＩ）の化合物の、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、又はＸ位置を介してもよい。いくつかの態様では、接続は、式（ＩＩ）のＲ３、Ｒ４、又はＲ６基を介している。いくつかの実施形態では、置換基は、カルボキシル又は置換アルキル、例えば、－ＣＯ２Ｈ又はカルボキシル基の活性化形態、例えば、アミド又はエステルであるが、それらは生体分子のアミノ基又はヒドロキシル基への結合に使用され得る。本明細書で使用するとき、用語「活性化エステル」は、例えばアミノ基を含有する化合物と、穏和な条件下で反応することができるカルボキシル基誘導体を指す。活性化エステルの非限定的な例としては、ｐ－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、及びスクシンイミドエステルが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、色素化合物は、ヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチド又はヌクレオチドに共有結合してもよい。例えば、標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置に取り付けられた標識、又は７デアザプリン塩基のＣ７位置にリンカー部分を介して取り付けられた標識を有してもよい。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖に共有結合した３’－ＯＨブロッキング基を有してもよい。
本明細書に記載される蛍光色素の特定の有用な用途は、生体分子、例えば、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを標識することである。本出願のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の蛍光化合物で標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを対象とする。
リンカー
リンカー
本明細書に開示される色素化合物は、基材又は別の分子へ化合物が共有結合するための置換位置の１つに、反応性リンカー基を含んでもよい。反応性リンカ－基は、結合（例えば、共有結合又は非共有結合）、特に共有結合を形成することができる部分である。特定の実施形態では、リンカーは、開裂可能なリンカーであってもよい。用語「開裂可能なリンカー」の使用は、リンカー全体を除去する必要があることを意味するものではない。開裂部位は、リンカーの一部が、開裂後に色素及び／又は基質部分に付着したままであることを確実にするリンカー上の位置に配置され得る。開裂可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に開裂可能なリンカー、求核的に開裂可能なリンカー、光開裂可能リンカー、還元条件下で開裂可能なリンカー（例えば、ジスルフィド又はアジド含有リンカー）、酸化的条件で開裂可能なリンカ－、安全装置リンカーの使用によって開裂可能なリンカー、除去機構によって開裂可能であるリンカーであり得る。色素化合物を基質部分に付着させるために開裂可能なリンカーを使用することにより、必要に応じて、検出後にラベルを除去することができ、下流の工程においていかなる干渉シグナルも回避することができる。
有用なリンカー基は、国際公開第２００４／０１８４９３号（参照により本明細書において組み込まれる）に記載されており、その例としては、遷移金属及び少なくとも部分的に水溶性リガンドから形成された水溶性ホスフィン又は水溶性遷移金属触媒を使用して開裂され得るリンカーが挙げられる。水溶液中で、後者は、少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体を形成する。このような開裂可能なリンカーは、ヌクレオチドの塩基を、本明細書に記載される色素などの標識に接続するために使用することができる。
特定のリンカーとしては、国際公開第２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものが挙げられ、例えば、以下の式の部分を含むものである：
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＱを含む群から選択されるが、Ｑは、Ｃ１～１０の置換又は無置換アルキル基であり、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、及びＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは水素又はＣ１～Ｃ１０置換若しくは無置換アルキル基であり、「＊」は、その部分がヌクレオチド又はヌクレオシドの残りの部分に接続される場所を示す）。
いくつかの態様では、リンカーは、ヌクレオチドの塩基を、例えば、本明細書に記載される色素化合物などの標識に接続する。
いくつかの態様では、リンカーは、ヌクレオチドの塩基を、例えば、本明細書に記載される色素化合物などの標識に接続する。
リンカーの更なる例としては、米国特許出願公開第２０１６／００４０２２５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものが挙げられ、その例は、以下の式で表される部分を含む：
（式中、「＊」は、その部分がヌクレオチド又はヌクレオシドの残りの部分に接続される場所を示す）。ここに示されるリンカー部分は、ヌクレオチド／ヌクレオチドと標識との間の全体又は部分的リンカー構造を含んでもよい。
特定の実施形態では、蛍光色素（フルオロフォア）とグアニン塩基との間のリンカーの長さは、例えば、ポリエチレングリコールスペーサー基を導入することによって変更することができ、それにより、当該技術分野において既知の他の結合を介してグアニン塩基に結合した同じフルオロフォアと比較して、蛍光強度を増加させることができる。いくつかのリンカー及びその特性は、国際公開第２００７／０２０４５７号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。リンカーのこのような設計、特にそれらの長さが増加したことは、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドに組み込まれたとき、グアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合したフルオロフォアの輝度の改善を可能にすることができる。したがって、色素がグアニン含有ヌクレオチドに付着した蛍光色素標識の検出を必要とする任意の解析方法で使用される場合、リンカーが、式－（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎ－（国際公開第２００７／０２０４５７号に記載されるように、式中、ｎは２～５０の整数である）のスペーサー基を含むならば、有利である。
ヌクレオシド及びヌクレオチドは、糖又は核塩基上の部位で標識されてもよい。当該技術分野において既知のように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖、及び１つ以上のリン酸基からなる。ＲＮＡ中では、糖はリボースであるが、ＤＮＡ中では、糖はデオキシリボース、すなわち、リボース中に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。窒素塩基は、プリン又はピリミジンの誘導体である。プリンはアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）であり、ピリミジンはシトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）であるか、又はＲＮＡの文脈では、ウラシル（Ｕ）である。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１又はプリンのＮ－９に結合される。ヌクレオチドもまたヌクレオシドのリン酸エステルであり、糖のＣ－３又はＣ－５に結合したヒドロキシル基にエステル化が生じる。ヌクレオシドは、通常、モノ、ジ、又はトリホスフェートである。
「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造的に類似しているが、リン酸部分を欠いている。ヌクレオチド類似体の例は、標識が塩基に連結され、糖分子に結合したリン酸基が存在しないものである。
塩基は通常、プリン又はピリミジンと呼ばれるが、当業者は、ヌクレオチド又はヌクレオシドの能力を変化させてワトソン・クリック塩基対合を起こすことのない誘導体及び類似体が利用可能であることを理解するであろう。「誘導体」又は「類似体」は、コア構造が親化合物と同じであるか、又は密接に類似しているが、例えば、異なる又は追加の側基（誘導体ヌクレオチド又はヌクレオシドが他の分子と連結されるのを可能にする）などの化学的又は物理的変更が加えられた化合物又は分子を意味する。例えば、塩基は、デアザプリンであってもよい。特定の実施形態では、誘導体は、ワトソン・クリック対合を受けることができるべきである。「誘導体」及び「類似体」はまた、例えば、修飾塩基部分及び／又は修飾糖部分を有する合成ヌクレオチド又はヌクレオシド誘導体を含む。そのような誘導体及び類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔによる、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，１９８０）や、Ｕｈｌｍａｎらによる、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３－５８４，１９９０に論じられている。ヌクレオチド類似体はまた、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキル－ホスホン酸塩、ホスホアニリデート、ホスホラミデートリンケージなどを含む修飾ホスホジエステルリンケージを含み得る。
色素は、例えばリンカーを介してヌクレオチド塩基上の任意の位置に取り付けられてもよい。特定の実施形態では、ワトソン・クリック塩基対合が、得られた類似体に対して依然として実行され得る。特定の核塩基標識部位としては、ピリミジン塩基のＣ５位置、又は７－デアザプリン塩基のＣ７位置が挙げられる。上記のように、リンカー基を使用して、ヌクレオシド又はヌクレオチドに色素を共有結合させることができる。
特定の実施形態では、標識ヌクレオシド又はヌクレオチドは、酵素的に組み込み可能であり、酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部分は、ヌクレオチドを化合物に接続するのに十分な長さであってもよく、その結果、化合物は、核酸複製酵素によるヌクレオチドの全体的な結合及び認知と有意なほどには干渉しない。したがって、リンカーはスペーサー単位も含み得る。スペーサーは、例えば、開裂部位又は標識からヌクレオチド塩基を遠ざける。
本明細書に記載の色素で標識化されたヌクレオシド又はヌクレオチドは、以下の式を有し得る：
式中、色素（Dye）は色素化合物であり、Ｂは、例えばウラシル、チミン、シトシン、アデニン、グアニンなどの核酸塩基であり、Ｌは、存在しても存在しなくてもよい任意のリンカー基であり、Ｒ’は、Ｈ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、又はブロッキング基によって保護された－Ｏ－であってよく、Ｒ”は、Ｈ、ＯＨ、ホスホラミダイト、又は３’－ＯＨブロッキング基であってよく、Ｒ”はＨ又はＯＨである。式中、Ｒ”はホスホラミダイトであり、Ｒ’は、自動合成条件下で続くモノマーカップリングを可能にする酸開裂可能なヒドロキシル保護基である。
特定の実施形態では、ブロッキング基は、色素化合物とは別個かつ独立しており、すなわち、色素化合物には付着していない。あるいは、色素は、３’－ＯＨブロッキング基の全て又は一部を含んでもよい。したがって、Ｒ”は、色素化合物を含んでも含まなくてもよい３’－ＯＨブロッキング基であり得る。
更に別の代替的実施形態では、ペントース糖の３’炭素上にブロッキング基は存在せず、例えば、塩基に付着した色素（又は色素及びリンカー構造物）が、更なるヌクレオチドの組み込みに対するブロックとして作用するのに十分なサイズ又は構造であり得る。したがって、色素が糖の３’位置に付着されているかどうかに関わらず、ブロックは立体的妨害物に起因し得るか、又は、サイズ、電荷、及び構造の組み合わせに起因し得る。
更に別の代替的実施形態では、ブロッキング基はペントース糖の２’又は４’炭素上に存在し、更なるヌクレオチドの組み込みのブロックとして作用するのに十分なサイズ又は構造であり得る。
ブロッキング基の使用により、例えば、修飾ヌクレオチドが組み込まれるときに伸長を停止することなどによって、重合を制御することができる。ブロッキング効果が可逆的である場合、例えば、化学的条件を変更することによって、又は化学ブロックを除去することによって可逆的である場合（ただし例はこれらの場合に限られない）、特定の点で伸長を一旦停止してから、継続を可能とすることができる。
別の特定の実施形態では、３’－ＯＨブロッキング基は、国際公開第２００４／０１８４９７号及び同第２０１４／１３９５９６号に開示されている部分を含む。なお、それぞれの開示内容はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ブロッキング基は、アジドメチル（－ＣＨ２Ｎ３）若しくは置換アジドメチル（例えば、－ＣＨ（ＣＨＦ２）Ｎ３若しくはＣＨ（ＣＨ２Ｆ）Ｎ３）、又はアリルであってもよい。
特定の実施形態では、リンカー（色素とヌクレオチドとの間のリンカ－）及びブロッキング基が両方とも存在し、互いに別個の部分である。特定の実施形態では、リンカー及びブロッキング基は、両方とも実質的に同様の条件下で開裂可能である。したがって、脱保護及び脱ブロッキングプロセスは、色素化合物及びブロッキング基の両方を除去するために単一の処理のみが必要となるため、より効率的であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、リンカー及びブロッキング基は、互いに別個の条件下で個別に開裂可能である代わりに、同様の条件下で開裂可能である必要はない。
本開示はまた、色素化合物を組み込むポリヌクレオチドも包含する。このようなポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で接合されたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドからそれぞれなるＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドは、自然由来のヌクレオチド、本明細書に記載される標識化されたヌクレオチド以外の非自然由来（又は修飾）ヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせを、本明細書に記載されるような少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば、色素化合物で標識化されたもの）と組み合わせて含むことができる。本開示によるポリヌクレオチドは、非自然由来の骨格結合及び／又は非ヌクレオチド化学修飾も含み得る。少なくとも１つの標識ヌクレオチドを含むリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの混合物からなるキメラ構造も想到される。
本明細書に記載される非限定的な標識ヌクレオチドとしては、以下のものが挙げられる：
（式中、Ｌはリンカーを表し、Ｒは、上述の糖残基を表す。）
いくつかの実施形態における、非限定的な蛍光色素コンジュゲートを以下に示す：
キット
本開示はまた、色素で標識化された修飾ヌクレオシド及び／又はヌクレオチドを含むキットも提供する。このようなキットは、概して、本明細書に記載される色素で標識化された少なくとも１つの修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドを、少なくとも１つの更なる成分と共に含む。更なる成分は、本明細書に記載される方法又は以下の実施例のセクションで特定される成分のうちの１つ以上であってもよい。本開示のキットに組み合わせることができる成分のいくつかの非限定的な例を以下に記載する。
特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載される色素のいずれかで標識化された少なくとも１つの修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドを、修飾又は非修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドと共に含むことができる。例えば、本開示による色素で標識化された修飾ヌクレオチドを、標識化されていない若しくは天然のヌクレオチドと組み合わせて、かつ／若しくは蛍光標識化されたヌクレオチド、又はこれらの任意の組み合わせと組み合わせて供給されてもよい。したがって、キットは、本開示による色素で標識化された修飾ヌクレオチド、及び他の、例えば先行技術の色素化合物で標識化された修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドの組み合わせは、別個の個々のコンポーネント（例えば、容器又はチューブ当たり１つのヌクレオチド型）として、又はヌクレオチド混合物（例えば、同じ容器又はチューブ内で混合された２つ以上のヌクレオチド）として提供され得る。
キットが、色素化合物で標識化された複数の、特に２つ、又は３つ、又はより具体的には４つの修飾ヌクレオチドを含む場合、異なるヌクレオチドは、異なる色素化合物で標識化されてもよく、又は色素化合物を含まない、暗色であってもよい。異なるヌクレオチドが異なる色素化合物で標識されている場合、色素化合物が分光的に区別可能な蛍光色素であるというのが本キットの特徴である。本明細書で使用するとき、用語「分光的に区別可能な蛍光色素」とは、２つ以上の色素が１つの試料に存在する場合、蛍光検出装置（例えば、市販の毛管ベースのＤＮＡシークエンシングプラットホーム）によって区別され得る波長で、蛍光エネルギーを放射する蛍光色素を指す。蛍光色素化合物で標識化された２つの修飾ヌクレオチドがキット形態で供給される場合、分光的に区別可能な蛍光色素は、例えば同じレーザーなど、同じ波長で励起され得るというのが、いくつかの実施形態の特徴である。蛍光色素化合物で標識化された４つの修飾ヌクレオチドがキット形態で供給される場合、分光的に区別可能な蛍光色素のうちの２つが１つの波長で励起され得、他の２つの分光的に区別可能な色素は両方とも別の１つの波長で励起され得るというのがいくつかの実施形態の特徴である。具体的な励起波長は、４８８ｎｍ及び５３２ｎｍであり得る。
一実施形態では、キットは、本開示の化合物で標識化された修飾ヌクレオチドと、第２の色素で標識化された第２の修飾ヌクレオチドとを含み、それらの色素は、少なくとも１０ｎｍ、特に２０ｎｍ～５０ｎｍの吸光度最大値の差を有する。より具体的には、２つの色素化合物は、１５～４０ｎｍのストークスシフトを有する。なお、「ストークスシフト」は、ピーク吸収波長とピーク放射波長との間の距離である。
更なる実施形態では、キットは、蛍光色素で標識化された２つの他の修飾ヌクレオチドを更に含むことができ、それらの色素は、５３２ｎｍの同じレーザー光によって励起される。それらの色素は、少なくとも１０ｎｍ、特に２０ｎｍ～５０ｎｍの吸光度最大値の差を有し得る。より具体的には、２つの色素化合物は、２０～４０ｎｍの間のストークスシフトを有し得る。本開示の色素から分光的に区別可能であり、上記基準を満たす具体的な色素は、米国特許第５，２６８，４８６号（例えば、Ｃｙ３）又は国際公開第２００２／０２６８９１号（Ａｌｅｘａ ５３２；分子プローブＡ２０１０６）に開示されているポリメチン類似体であり、あるいは、米国特許第６，９２４，３７２号に開示されているような非対称ポリメチンである。なお、これらの文献の各々の開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。代替的な色素としては、ローダミン類似体、例えば、テトラメチルローダミン及びその類似体が挙げられる。
代替的な実施形態では、本開示のキットは、同じ塩基が２つの異なる化合物で標識化されるヌクレオチドを含有してもよい。第１のヌクレオチドは、本開示の化合物で標識されてもよい。第２のヌクレオチドは、スペクトル的に異なる化合物、例えば、６００ｎｍ未満で吸収される「緑色」色素で標識されてもよい。第３のヌクレオチドは、本開示の化合物と、それとは分光的に区別可能な化合物との混合物として標識化されてもよく、第４のヌクレオチドは「暗色」で、標識を含有しなくてもよい。したがって、簡便に言えば、ヌクレオチド１～４は、「青色」、「緑色」、「青色／緑色」、及び暗色（ダーク）と標識化され得る。器具類を更に単純化するために、４つのヌクレオチドは、単一のレーザーで励起される２つの色素で標識化されることができ、ヌクレオチド１～４の標識は、「青色１」、「青色２」、「青色１／青色２」，及び暗色となり得る。
ヌクレオチドは、本開示の２つの色素を含んでもよい。キットは、本開示の色素で標識化された２つ以上のヌクレオチドを含んでもよい。キットは、５２０ｎｍ～５６０ｎｍの領域で吸光される色素で標識化される更なるヌクレオチドを含んでもよい。キットは、未標識化ヌクレオチドを更に含んでもよい。
異なる色素化合物で標識化された異なるヌクレオチドを有する構成に関して、キットが本明細書に例示されるが、キットは、同じ色素化合物を有する２、３、４個以上の異なるヌクレオチドを含み得ることが理解されるであろう。
特定の実施形態では、キットは、修飾ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの組み込みを触媒することができるポリメラーゼ酵素を含んでもよい。このようなキットに含まれる他の構成成分としては、緩衝剤などが挙げられる。本開示による色素で標識化された修飾ヌクレオチド、及び異なるヌクレオチドの混合物を含む他の任意のヌクレオチド成分は、使用前に希釈される濃縮形態でキットに提供されてもよい。このような実施形態では、好適な希釈緩衝液も含まれ得る。ここでも、本明細書に記載される方法で特定された成分のうちの１つ以上を、本開示のキットに含めることができる。
シークエンシングの方法
シークエンシングの方法
本開示による色素化合物を含む修飾ヌクレオチド（又はヌクレオシド）は、ヌクレオチド又はヌクレオシドに結合した蛍光標識の検出を含む任意の解析方法で使用することができるが、ヌクレオチド又はヌクレオシドをそれ自体で解析するか、又はヌクレオチド又はヌクレオシドがより大きい分子構造若しくはコンジュゲートに組み込まれるか若しくはそれに関連づけられている状態で解析するかは問題ではない。この文脈において、用語「ポリヌクレオチドに組み込まれる」は、それ自体がより長いポリヌクレオチド鎖の一部を形成し得る、第２の（修飾された又は修飾されていない）ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基に、５’リン酸がリン酸ジエステル結合されることを意味し得る。本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの３’末端は、更なる（修飾又は非修飾）ヌクレオチドの５’リン酸に、リン酸ジエステル結合されてもよく、又はされなくてもよい。したがって、非限定的な一実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチドに組み込まれた修飾ヌクレオチドを検出する方法であって、（ａ）本開示の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むことと、（ｂ）修飾ヌクレオチドに結合させた色素化合物からの蛍光シグナルを検出することによって、ポリヌクレオチドに組み込まれた修飾ヌクレオチドを検出することと、を含む方法を提供する。
本方法は、（ａ）本開示による１つ以上の修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれる合成工程と、（ｂ）ポリヌクレオチドに組み込まれた１つ以上の修飾ヌクレオチドが、それらの蛍光を検出又は定量的に測定することによって検出される検出工程と、を含み得る。
本出願のいくつかの実施形態は、（ａ）本明細書に記載されるような少なくとも１つの標識化ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むことと、（ｂ）修飾ヌクレオチドに結合した蛍光色素からの蛍光シグナルを検出することによって、ポリヌクレオチドに組み込まれた標識化ヌクレオチドを検出することと、を含む、シークエンシング方法を対象とする。
一実施形態では、合成工程で、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、ポリメラーゼ酵素の作用によってポリヌクレオチドに組み込まれる。しかしながら、修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに接合する他の方法、例えば、標識化オリゴヌクレオチドの非標識化オリゴヌクレオチドへの化学的オリゴヌクレオチド合成又はリゲーションを使用することができる。したがって、ヌクレオチド及びポリヌクレオチドに関して用語「組み込む」が使用されるときには、化学的方法及び酵素法によるポリヌクレオチド合成を包含することができる。
特定の実施形態では、合成工程が実行され、かつ任意に、本開示の蛍光標識化修飾ヌクレオチドを含む反応混合物で、鋳型ポリヌクレオチド鎖をインキュベートする工程を含んでもよい。ポリメラーゼはまた、鋳型ポリヌクレオチド鎖にアニーリングされたポリヌクレオチド鎖上の遊離３’ヒドロキシル基と修飾ヌクレオチド上の５’リン酸基との間のリン酸ジエステル結合の形成を可能にする条件下で提供されることもできる。したがって、合成工程が、ヌクレオチドの鋳型鎖への相補的塩基対形成によって実現されるポリヌクレオチド鎖の形成を含むことができる。
本方法の全ての実施形態では、検出工程は、標識化されたヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチド鎖が鋳型鎖にアニーリングされている間、又は２つの鎖が分離される変性工程の後に実施されてもよい。合成工程と検出工程との間に、例えば化学的又は酵素的反応工程又は精製工程といった更なる工程が含まれてもよい。具体的には、標識化されたヌクレオチドを組み込む標的鎖は、単離されても精製されてもよく、その後、更に処理されるか、又はその後の解析に使用されてもよい。例として、合成工程において本明細書に記載される修飾ヌクレオチド（複数可）で標識化された標的ポリヌクレオチドは、その後、標識化プローブ又はプライマーとして使用され得る。他の実施形態では、本明細書に記載される合成工程の生成物は、更なる反応工程に供されてもよく、所望であれば、これらの後続工程の生成物を精製又は単離してもよい。
合成工程に好適な条件は、標準的な分子生物学的技術に精通しているものにはよく知られている。一実施形態では、合成工程は、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使用する標準的なプライマー伸長反応と類似し、好適なポリメラーゼ酵素の存在下で鋳型鎖に相補的な伸長標的鎖を形成してもよい。他の実施形態では、合成工程は、それ自体が、標的及び鋳型のポリヌクレオチド鎖をコピーすることに由来するアニーリングされた相補鎖からなる、標識化された二本鎖増幅産物を生成する増幅反応の一部をなしてもよい。他の合成工程としては、ニックトランスレーション、鎖置換重合、ランダムプライミングＤＮＡ標識化などが挙げられる。合成工程に特に有用なポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの組み込みを触媒することができるものである。様々な天然由来の又は修飾されたポリメラーゼを使用することができる。例として、熱安定性ポリメラーゼは、熱サイクリング条件を使用して実施される合成反応に使用することができるが、熱安定性ポリメラーゼは、等温プライマー伸長反応には望ましくない場合がある。本開示による修飾ヌクレオチドを組み込むことができる好適な熱安定性ポリメラーゼとしては、国際公開第２００５／０２４０１０号及び同第２００６／１２０４３３号に記載のものが挙げられる。なお、各々の文献の開示内容はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。例えば３７℃などの低温下で実施される合成反応では、ポリメラーゼ酵素は必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はなく、したがって、ポリメラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ、鎖置換活性などの多くの要因による。
特定の非限定的な実施形態では、本開示は、核酸シークエンシング、再シークエンシング、全ゲノムシークエンシング、単一ヌクレオチド多型性スコアリングの方法に加えて、ポリヌクレオチドに組み込まれたときに本明細書に記載される色素で標識化された修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの検出を伴う任意の他の用途の方法を含む。蛍光色素を含む修飾されたヌクレオチドで標識化されたポリヌクレオチドの使用に有益な様々な他の用途の任意のものにも、本明細書に記載される色素を有する修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドを使用することができる。
特定の実施形態では、本開示は、本開示による色素化合物を含む修飾ヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの合成によるシークエンシング反応に使用することを提供する。合成によるシークエンシングは、一般に、配列決定される鋳型核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチド鎖を形成するために、ポリメラーゼ又はリガーゼを使用して、成長しつつあるポリヌクレオチド鎖に対し、５’～３’方向に１つ以上のヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを逐次的に付加することを含む。添加されたヌクレオチドのうちの１つ以上に存在する塩基が何であるかは、本明細書に記載されるような検出又は「イメージング（撮像）」工程で決定することができる。添加された塩基が何であるかは、各ヌクレオチド組み込み工程後に決定され得る。次いで、鋳型の配列は、従来式のワトソン・クリック塩基ペアリングルールを使用して推測され得る。単一の塩基が何であるかを決定するために本明細書に記載される色素で標識化された修飾ヌクレオチドを使用することは、例えば、単一ヌクレオチド多型性のスコアリングにおいて有用であり得るが、そのような単一塩基伸長反応は、本開示の範囲内である。
本開示の一実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドの配列は、組み込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識（複数可）の検出を通して配列決定される鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への、１つ以上のヌクレオチドの組み込みを検出することによって決定される。鋳型ポリヌクレオチドのシークエンシングは、好適なプライマー（又は、ヘアピンの一部としてプライマーを含有するヘアピン構造体として調製されたプライマー）でプライミングすることができ、新生鎖は、ポリマー触媒反応において、プライマーの３’末端にヌクレオチドを付加することにより、段階的に伸長される。
特定の実施形態では、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、及びＣ）のそれぞれは、固有のフルオロフォアで標識化されてもよく、また３’位置にブロッキング基を含み、制御不可能な重合を防止することができる。あるいは、４つのヌクレオチドのうちの１つは、標識されていなくてもよい（暗色（ダーク））。ポリメラーゼ酵素は、鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌクレオチドを組み込むが、ブロッキング基は、ヌクレオチドの更なる組み込みを防止する。任意の組み込まれていないヌクレオチドを洗い流すことができ、各組み込まれたヌクレオチドからの蛍光シグナルは、レーザー励起及び好適な発光フィルタを使用する電荷結合素子などの好適な手段によって、光学的に「読み取る」ことができる。次いで、３’－ブロッキング基及び蛍光色素化合物を除去（脱保護）して（同時に又は逐次的に）、更なるヌクレオチドの組み込みのに新生鎖をかけることができる。典型的には、組み込まれたヌクレオチドが何であるかは、各組み込み工程後に決定されるが、これは厳密に必須というわけではない。同様に、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，３０２，５０９号は、固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドを配列決定する方法を開示している。
上記に例示したようなその方法は、蛍光標識化された３’ブロックされたヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、及びＴを、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、固定化されたポリヌクレオチドに相補的な成長鎖に組み込む。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を組み込むが、３’－ブロッキング基によって、更なる付加が防止される。次いで、組み込まれたヌクレオチドの標識を判定し、その後、更なる重合を可能にするために、化学的開裂によってブロッキング基が除去され得る。合成によるシークエンシング反応において配列決定される核酸鋳型は、配列決定が所望される任意のポリヌクレオチドであってもよい。シークエンシング反応用の核酸鋳型は、典型的には、シークエンシング反応における更なるヌクレオチドの付加のためのプライマー又は開始点として機能する遊離３’ヒドロキシル基を有する二本鎖領域を含む。配列決定される鋳型の領域は、この遊離３’ヒドロキシル基を相補鎖上にオーバーハングする。配列決定される鋳型のオーバーハング領域は、一本鎖であってもよいが、配列決定される鋳型鎖に相補的な鎖上に「切れ目が存在」して、シークエンシング反応を開始するための遊離３’ＯＨ基を提供する限りにおいて、二本鎖であることも可能である。このような実施形態では、シークエンシングは、鎖置換によって進行し得る。特定の実施形態では、遊離３’ヒドロキシル基を有するプライマーが、配列決定される鋳型の一本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として添加されてもよい。あるいは、配列決定されるプライマー及び鋳型鎖はそれぞれ、例えばヘアピンループ構造などの分子内二重鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部を形成してもよい。ヘアピンポリヌクレオチド及びこれらを固体支持体に取り付けることができる方法は、国際公開第２００１／０５７２４８号及び同第２００５／０４７３０１号に開示されている。なお、それぞれの開示内容はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレオチドは、成長するプライマーに連続的に添加され、５’～３’方向にポリヌクレオチド鎖を合成することができる。添加された塩基の性質は、特に各ヌクレオチド添加後に判定されてよいが、必ずしもそうでなくてもよい。その判定によって、核酸鋳型についての配列情報が提供される。したがって、ヌクレオチドは、ヌクレオチドの５’リン酸基とのリン酸ジエステル結合の形成を介して、核酸鎖の遊離３’ヒドロキシル基にヌクレオチドを結合することにより、核酸鎖（又はポリヌクレオチド）に組み込まれる。
配列決定される核酸鋳型は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又は更にはデオキシヌクレオチド及びリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子であってもよい。核酸鋳型は、配列決定反応における鋳型のコピーを防止しない限り、天然由来のヌクレオチド及び／又は非天然由来のヌクレオチドと、天然由来又は非天然由来の骨格リンケージを含んでよい。
特定の実施形態では、配列決定される核酸鋳型は、当該技術分野において既知の任意の好適な結合方法、例えば共有結合を介して、固体支持体に結合され得る。特定の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、固体支持体（例えば、シリカ系支持体）に直接取り付けられてもよい。しかしながら、本開示の他の実施形態では、固体支持体の表面は、鋳型ポリヌクレオチドの直接的共有結合、又は鋳型ポリヌクレオチドのヒドロゲル又は多電解質層（それ自体は固体支持体に共有結合以外の方法で付着される）を通しての不動化のいずれかを可能にするように、何らかの方法で修飾されてもよい。
ポリヌクレオチドがシリカ系支持体に直接取り付けられているアレイとしては、例えば、国際公開第２０００／００６７７０号に開示されているものがある（その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。その開示においては、ポリヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基と、ポリヌクレオチド上の内部アミノ基との間の反応によって、ガラス支持体上に固定化されている。加えて、ポリヌクレオチドは、例えば、国際公開第２００５／０４７３０１号に記載されているように、イオウ系求核試薬と固体担体との反応によって固体支持体に結合することができる。なおこの開示内容はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。固体支持型鋳型ポリヌクレオチドのまた更なる例として、鋳型ポリヌクレオチドが、シリカ系又は他の固体担体上に支持されたヒドロゲルに取り付けられるものが挙げられる。その例が、例えば、国際公開第２０００／３１１４８号、同第２００１／０１１４３号、同第２００２／１２５６６号、同第２００３／０１４３９２号、及び同第２０００／５３８１２号、並びに米国特許第６，４６５，１７８号に記載されている。なお、それぞれの開示内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
鋳型ポリヌクレオチドが固定され得る具体的な表面としては、ポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられる。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、上記の参考文献及び国際公開第２００５／０６５８１４号に記載されており、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。使用され得る具体的なヒドロゲルとしては、国際公開第２００５／０６５８１４号及び米国特許出願公開第２０１４／００７９９２３号に記載されているものが挙げられる。これらはそれぞれその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、ヒドロゲルは、ＰＡＺＡＭ（ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－ｃｏ－アクリルアミド））である。
ＤＮＡ鋳型分子は、例えば、米国特許第６，１７２，２１８号に記載されているように、ビーズ又は微小粒子に付着させることができる。なお、この開示はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。ビーズ又は微小粒子への付着は、シークエンシング用途に有用であり得る。各ビーズが異なるＤＮＡ配列を含むビーズライブラリを調製することができる。いくつかのライブラリ及びそれらの作成のための方法は、Ｎａｔｕｒｅ，４３７、３７６～３８０頁（２００５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９、５７４１、１７２８～１７３２頁（２００５）に記載されており、それぞれの開示はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるヌクレオチドを使用したかかるビーズのアレイのシークエンシングは、本開示の範囲内である。
配列決定される鋳型は、固体支持体上に「アレイ」の一部を形成してもよく、この場合、アレイは任意の便利な形態をとることができる。したがって、本開示の方法は、単一分子アレイ、クラスター化アレイ、及びビーズアレイを含む全ての種類の高密度アレイに適用可能である。本開示の色素化合物で標識化された修飾ヌクレオチドは、基本的に任意の種類のアレイ上で鋳型をシークエンシングするために使用されてもよく、そのようなアレイには、固体支持体上の核酸分子の固定化によって形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
しかしながら、本開示の色素化合物で標識化された修飾ヌクレオチドは、クラスター化アレイのシークエンシングの文脈において特に有利である。クラスター化アレイでは、アレイ上の別個の領域（多くの場合、部位又は特徴部と呼ばれる）は、複数のポリヌクレオチド鋳型分子を含む。一般に、複数のポリヌクレオチド分子は、光学的手段によって個別に分解可能ではなく、代わりに、アンサンブル（集合体）として検出される。アレイがどのように形成されるかに応じて、アレイ上の各部位は、１つの個々のポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、部位は、特定の一本鎖若しくは二本鎖核酸種に対して均質である）、又は更には少数の異なるポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、２つの異なる核酸種の複数のコピー）を含んでもよい。核酸分子のクラスター化アレイは、当該技術分野において一般的に知られている技術を使用して生成され得る。例として、国際公開第１９９８／４４１５１号及び国際公開第２０００／１８９５７号（それぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、核酸の増幅方法を開示しており、鋳型及び増幅産物の両方が、固体の支持体上に固定化されたまま、固定化された核酸分子のクラスター又は「コロニー」からなるアレイが形成される。これらの方法に従って調製されたクラスター化アレイ上に存在する核酸分子は、本開示の色素化合物で標識化された修飾ヌクレオチドを使用するシークエンシングに好適な鋳型である。
本開示の色素化合物で標識化された修飾ヌクレオチドは、単一分子アレイ上の鋳型のシークエンシングにも有用である。本明細書で使用するとき、用語「単一分子アレイ」又は「ＳＭＡ」は、固体支持体の上に分布（又は配列）されたポリヌクレオチド分子の集団を指し、いかなる個々のポリヌクレオチドの、集団の全ての他のポリヌクレオチドからの離間距離は、個々のポリヌクレオチド分子を個々に見分けることが可能であるようになっている。したがって、固体支持体の表面上に固定化された標的核酸分子は、いくつかの実施形態では、光学的手段によって見分けることができる。これは、１つのポリヌクレオチドをそれぞれ表す１つ以上の別個のシグナルが、使用される特定の撮像装置が、見分けることができるエリア内で発生することを意味する。
アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が、少なくとも１００ｎｍ、より具体的には少なくとも２５０ｎｍ、更により具体的には少なくとも３００ｎｍ、更により具体的には少なくとも３５０ｎｍである、単一分子検出が達成され得る。したがって、各分子は個別に分解可能（見分けることが可能）であり、単一分子蛍光点として検出可能であり、この単一分子蛍光点からの蛍光はまた、単一工程でのフォトブリーチを呈する。
用語「個々に分解された」及び「個々の解像度」は、本明細書では、可視化されたときに、１つの分子をその隣接する分子と区別することが可能であることを指定するために使用される。アレイ上の個々の分子間の分離は、個々の分子を分解するために使用される特定の技術によって、部分的に決定される。単一分子アレイの一般的な特徴は、国際公開第２０００／０６７７０号及び同第２００１／５７２４８号を参照することによって理解されるであろう。なお、それぞれの開示内容はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。本開示の修飾ヌクレオチドの１つの用途は合成によるシークエンシング反応であるが、修飾ヌクレオチドの有用性は、そのような方法に限定されない。実際に、このヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出を必要とする任意のシークエンシング方法において有利に使用され得る。
具体的には、本開示の色素化合物で標識化された修飾ヌクレオチドは、自動蛍光シークエンシングプロトコル、特に、サンガー及び共同研究者の、チェーンターミネーションシークエンシング法に基づく、蛍光色素ターミネーターサイクルシークエンシングに使用することができる。このような方法は、一般に、酵素及びサイクルシークエンシングを使用して、プライマー伸長シークエンシング反応において蛍光標識化されたジデオキシヌクレオチドを組み込む。いわゆるサンガーシークエンシング法、及び関連するプロトコル（サンガー型）は、標識化されたジデオキシヌクレオチドでランダム化された鎖終端を利用する。
したがって、本開示はまた、３’位置及び２’位置の両方においてヒドロキシル基を含まないジデオキシヌクレオチドである色素化合物で標識化された修飾ヌクレオチドも包含し、このような修飾デオキシヌクレオチドは、サンガー型シークエンシング法などでの使用に好適である。
３’ブロッキング基を組み込んだ本開示の色素化合物で標識化された修飾ヌクレオチドは、サンガー法及び関連するプロトコルで有用であるということが認識されるであろう。それは、修飾されたジデオキシ塩基を使用することによって達成される効果と同じ効果が、３’－ＯＨブロッキング基を有する修飾ヌクレオチドを使用することによって得られる（両者とも後続のヌクレオチドの組み込みを防止できる）ためである。本開示によるヌクレオチドであって、３’ブロッキング基を有するヌクレオチドをサンガー型のシークエンシング方法で使用する場合、ヌクレオチドに結合した色素化合物又は検出可能な標識は開裂可能なリンカーを介して連結される必要がないということが理解されるであろう。というのは、本開示の標識ヌクレオチドが組み込まれる各事例においては、ヌクレオチドが、続いて組み込まれる必要はなく、したがって、ラベルをヌクレオチドから除去する必要がないためである。
追加的実施形態が、以下の実施例において更に詳細に開示されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。
実施例１：化合物Ｉ－１：７－（３－カルボキシアゼチジニル－１）－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例１：化合物Ｉ－１：７－（３－カルボキシアゼチジニル－１）－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ）及び３－カルボキシアゼチジン（０．２ｇ、２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。１２０℃で７時間撹拌し、室温で１時間静置した後、混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．２５ｇ（６３％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３９６．０５。実測値ｍ／ｚ：（＋）３９７（Ｍ＋１）＋；（－）３９５（Ｍ－１）－。
実施例２．化合物Ｉ－２：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例２．化合物Ｉ－２：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．５６ｇ、２ｍｍｏｌ）及び３－カルボキシアゼチジン（０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加する。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。１２５℃で９時間撹拌し、室温で１時間静置した後、反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．４１ｇ（５６％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３６２．０９。実測値ｍ／ｚ：（＋）３６３（Ｍ＋１）＋。
実施例３．化合物Ｉ－３：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（ベンズイミダゾール－２－イル）クマリン
実施例３．化合物Ｉ－３：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（ベンズイミダゾール－２－イル）クマリン
３－（ベンズイミダゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（ＦＣ－２、０．５６ｇ、２ｍｍｏｌ、１当量）及び３－カルボキシアゼチジン（ＡＣ－Ｃ４、０．３ｇ、３ｍｍｏｌ、１．５当量）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１２０℃で９時間撹拌した。３－カルボキシアゼチジン（０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ）の追加部分を添加した。１２０℃で更に３時間撹拌し、室温で１時間静置した後、反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．２６ｇ（３６％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３６１．１１。実測値ｍ／ｚ：（＋）３６２（Ｍ＋１）＋；（－）３６０（Ｍ－１）－。
実施例４．化合物Ｉ－４：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例４．化合物Ｉ－４：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３０ｇ、１ｍｍｏｌ）及び３－カルボキシアゼチジン（０．２ｇ、２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。１２０℃で８時間撹拌し、室温で１時間静置した後、反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．２８ｇ（７５％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３７８．０７。実測値ｍ／ｚ：（＋）３７９（Ｍ＋１）＋；（－）３７７（Ｍ－１）－。
実施例５．化合物Ｉ－５：７－（３－カルボキシピロリジン－イル－１）－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例５．化合物Ｉ－５：７－（３－カルボキシピロリジン－イル－１）－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３０ｇ、１ｍｍｏｌ）及び３－カルボキシピロリジン（０．２３ｇ、２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。１２０℃で６時間撹拌し、室温で１時間静置した後、反応混合物を水（２０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．３１ｇ（８０％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３９２．０８。実測値ｍ／ｚ：（＋）３９３（Ｍ＋１）＋；（－）３９１（Ｍ－１）－。
実施例６．化合物Ｉ－６：７－（４－カルボキシピペリジン－１－イル）－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例６．化合物Ｉ－６：７－（４－カルボキシピペリジン－１－イル）－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３０ｇ、１ｍｍｏｌ）及びイソニペコチン酸（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。１２０℃で６時間撹拌し、室温で１時間静置した後、反応混合物を水（２０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．３４ｇ（８３％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算４０６．１０。実測値ｍ／ｚ：（＋）４０７（Ｍ＋１）＋；（－）４０５（Ｍ－１）－。
実施例７．化合物Ｉ－７：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（６－スルホ－ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例７．化合物Ｉ－７：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（６－スルホ－ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン（０．３８ｇ、１ｍｍｏｌ）を約－５℃で、２０％の発煙硫酸（０．５ｍＬ）に添加した。混合物を冷却しながら数時間撹拌した後、室温で３時間撹拌した。８０℃で１時間撹拌し、室温で１時間静置した後、反応混合物を無水ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。生成物をＨＰＬＣにより精製した。収率０．１ｇ（２２％）。生成物の純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４５８．０２。実測値ｍ／ｚ：（＋）４５９（Ｍ＋１）＋。
実施例８．化合物Ｉ－８：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（６－スルフィド－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例８．化合物Ｉ－８：７－（３－カルボキシアゼチジン－１－イル）－３－（６－スルフィド－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（６－スルフィド－ベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３６ｇ、１ｍｍｏｌ）及び３－カルボキシアゼチジン（０．３ｇ、３ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。１２５℃で９時間撹拌し、室温で１時間静置した後、反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．２６ｇ（６０％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４４１．０６。実測値ｍ／ｚ：（＋）４４２（Ｍ＋１）＋。
実施例９．蛍光強度の比較
実施例９．蛍光強度の比較
いくつかの色素溶液（最大励起波長４５０ｎｍにおける）の蛍光強度を、同じスペクトル領域の標準色素と比較した。結果を表１に示す。これらの色素が、蛍光ベースの解析用で、有意な利点を有していることが示されている。
実施例１０．完全官能化ヌクレオシドコンジュゲートの合成のための一般手順
本明細書に開示されるクマリン蛍光色素が、適切なアミノ置換アデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ）ヌクレオチド誘導体Ａ－ＬＮ３－ＮＨ２又はＣ－ＬＮ３－ＮＨ２と結合された：
以下のアデニンスキームに従って適切な試薬を用いて色素のカルボン酸基を活性化した後：
アデニン結合の一般的な生成物は、以下に示される通りである：
ｆｆＡ－ＬＮ３－Ｄｙｅは、ＬＮ３リンカーを有する完全に機能化されたＡヌクレオチドを指し、本明細書に開示されるクマリン色素で標識化されている。各構造中のＲ基は、コンジュゲーション後のクマリン色素部分を指す。
色素（１０μｍｏｌ）を５ｍＬ丸底フラスコに入れて乾燥させ、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍＬ）に溶解させ、次いで溶媒を減圧下で留去する。この手順を２回繰り返す。乾燥した色素を無水Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、０．２ｍＬ）に室温で溶解させる。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、１．５当量、１５μｍｏｌ、４．５ｍｇ）を色素溶液に添加し、次いで、ＤＩＰＥＡ（３当量、３０μｍｏｌ、３．８ｍｇ、５．２μＬ）をマイクロピペットを介してこの溶液に加える。反応フラスコを窒素ガス下で密封する。反応の進行を、ＴＬＣ（溶離剤アセトニトリル：水＝１：９）及びＨＰＬＣによって監視する。一方、適切なアミノ置換ヌクレオチド誘導体（Ａ－ＬＮ３－ＮＨ２、２０ｍＭ、１．５当量、１５μｍｏｌ、０．７５ｍＬ）の溶液を減圧下で濃縮した後、水（２０μＬ）に再溶解させる。活性化色素のＤＭＡ溶液を、Ｎ－ＬＮ３－ＮＨ２の溶液を入れたフラスコに移す。更にＤＩＰＥＡ（３当量、３０μｍｏｌ、３．８ｍｇ、５．２μＬ）をトリエチルアミン（１μＬ）と共に添加する。カップリングの進行を、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、及びＬＣＭＳにより毎時モニタリングする。反応が完了したら、トリエチルアミン重炭酸塩緩衝液（ＴＥＡＢ、０．０５Ｍ、約３ｍＬ）をピペットを介して反応混合物に添加する。完全に官能化されたヌクレオチドの初期精製は、クエンチ反応混合物を、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムを通して、残っている未反応色素の大部分を除去することによって行われる。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘが、空の２５ｇのＢｉｏｔａｇｅカートリッジ、溶媒系ＴＥＡＢ／ＭｅＣＮに注がれる。Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムからの溶液を減圧下で濃縮する。残りの材料を、最小体積の水及びアセトニトリルに再溶解させ、その後で、２０μｍのナイロンフィルターを通して濾過する。濾過溶液を、分取ＨＰＬＣによって精製する。調製された化合物の組成をＬＣＭＳにより確認する。
シトシンカップリングの一般的な生成物は、上述のものと同様の手順に従い、以下に示す。
ｆｆＣ－ＬＮ３－Ｄｙｅは、ＬＮ３リンカーを有する完全に官能化されたＣヌクレオチドを指し、本明細書に開示されるクマリン色素で標識化されている。各構造中のＲ基は、コンジュゲーション後のクマリン色素部分を指す。
実施例１１．式（Ｉ）の化合物のアミド誘導体の調製
実施例１１．式（Ｉ）の化合物のアミド誘導体の調製
本明細書に記載されるいくつかの追加的実施形態は、式（Ｉ）の化合物のアミド誘導体及びその調製方法に関連し、この方法は、式（Ｉａ）の化合物を、カルボン酸活性化により式（Ｉａ’）の化合物に変換することと、
式（Ｉａ’）の化合物を、式（Ａｍ）の一級アミン又は二級アミンと反応させて、式（Ｉｂ）のアミド誘導体に到達させることと、を含み、
変数Ｘ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びｎが本明細書で定義され、Ｒ’は、カルボキシル活性化剤（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、ＨＯＢｔ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＤＣＣなど）の残留部分であり、ＲＡ及びＲＢのそれぞれは、独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、又は（ヘテロシクリル）アルキルである。
式（Ｉｂ）の化合物の調製のための一般的手順
式（Ｉｂ）の化合物の調製のための一般的手順
式（Ｉａ）（０．００１モル）の適切な色素を、好適な無水有機溶媒（ＤＭＦ、１．５ｍＬ）に溶解させる。この溶液に、ＴＳＴＵ、ＢＯＰ、又はＰｙＢＯＰなどのカルボキシル活性化試薬が添加される。この反応混合物を室温で約２０分間撹拌した後、適切なアミン誘導体を添加する。反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、余分な活性化試薬を０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液でクエンチする。溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をＴＥＡＢ溶液に再溶解させ、ＨＰＬＣにより精製する。
実施例１２．２チャネルシークエンシング用途
実施例１２．２チャネルシークエンシング用途
本明細書に記載の色素で標識化されたＡヌクレオチドの、シークエンシング用途における効率を、本明細書に記載の２チャネル検出法において実証した。本明細書に記載の２チャネル法に関して、核酸は、本明細書及び／又は米国特許出願公開第第２０１３／００７９２３２号に記載された方法及びシステムにより配列決定した。なお、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２チャネル検出では、第１のチャネルで検出される第１のヌクレオチド型、第２のチャネルで検出される第２のヌクレオチド型、第１及び第２のチャネルの両方で検出される第３のヌクレオチド型、及びいずれのチャネルにおいても検出されない又は最小限しか検出されない、ラベルを欠いた第４のヌクレオチド型を提供することによって、核酸を配列決定することができる。実験のＲＴＡ２．０．９３解析によって散布図を生成した。図２３～図２５に示される散布図は、２６サイクルの運転のそれぞれのサイクル５に対するものであった。
図２３は、Ｐｏｌ８１２を有する組み込み用緩衝液中の、Ａ－Ｉ－４（０．５μＭ）、Ａ－ＮＲ５５０Ｓ０（１．５μＭ）、Ｃ－ＮＲ４４０（２μＭ）、暗色（ダーク）Ｇ（２μＭ）、及びＴ－ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０（２μＭ）を含有する、完全に官能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）混合物の散布図を示す。青色露光（チャネル１）５００ｍｓ、緑色露光（チャネル２）１０００ｍｓ、スキャン用混合物中でスキャンした）。
図２４は、Ｐｏｌ８１２を有する組み込み緩衝液中の、Ａ－Ｉ－５（１μＭ）、Ａ－ＮＲ５５０Ｓ０（１μＭ）、Ｃ－ＮＲ４４０（２μＭ）、暗（ダーク）Ｇ（２μＭ）、及びＴ－ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０（２μＭ）を含有する、完全に官能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）混合物の散布図を示す。青色露光（チャネル１）５００ｍｓ、緑色露光（チャネル２）１０００ｍｓ、スキャン用混合物中でスキャンした。
図２５は、Ｐｏｌ８１２を有する組み込み緩衝液中の、Ａ－Ｉ－６（１μＭ）、Ａ－ＮＲ５５０Ｓ０（１μＭ）、Ｃ－ＮＲ４４０（２μＭ）、暗（ダーク）Ｇ（２μＭ）、及びＴ－ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０（２μＭ）を含有する、完全に官能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）混合物の散布図を示す。青色露光（チャネル１）５００ｍｓ、緑色露光（チャネル２）１０００ｍｓ、スキャン用混合物中でスキャンした。
図２３～図２５のそれぞれにおいて、「Ｇ」ヌクレオチドは、標識化されておらず、左下の雲状イメージ（「暗色（ダーク）Ｇ」）として示される。本明細書に記載の色素によって標識化された「Ａ」ヌクレオチドと緑色色素（ＮＲ５５０Ｓ０）との混合物からのシグナルを、図２３～図２５のそれぞれにおいて右上の雲状イメージとして示す。色素ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０で標識化された「Ｔ」ヌクレオチドからのシグナルは、左上の雲状イメージによって示され、色素ＮＲ４４０によって標識化された「Ｃ」ヌクレオチドからのシグナルは、右下の雲状イメージによって示される。Ｘ軸は、一方の（青色）チャネルに対する信号強度を示し、Ｙ軸は、他方の（緑色）チャネルに対する信号強度を示す。ＮＲ４４０、ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０、及びＮＲ５５０Ｓ０の化学構造は、国際公開第２０１８／０６０４８２号、同第２０１７／０５１２０１号、及び同第２０１４／１３５２２１号にそれぞれ開示されている。なお、それぞれの開示内容はその全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
図２３～図２５はそれぞれ、本明細書に記載の色素で標識化された完全官能化Ａ－ヌクレオチドコンジュゲートが、十分なシグナル強度及び大きな雲状イメージ分離を提供することを示す。
実施例１３．化合物ＩＩ－１：７－ビス（２－カルボキシエチル）アミノ－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例１３．化合物ＩＩ－１：７－ビス（２－カルボキシエチル）アミノ－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ）及びビシミノプロピオン酸（０．３２ｇ、２ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。得られた混合物を室温で数分間撹拌し、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１３０℃で６時間撹拌した。室温で約１時間静置した後、淡黄色反応混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収量：０．４０ｇ（８８％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４５６．０７。実測値ｍ／ｚ：（＋）４２７（Ｍ＋１）。
実施例１４．化合物ＩＩ－２：７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例１４．化合物ＩＩ－２：７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３３ｇ、１ｍｍｏｌ）及びジエチルアミン（０．２９ｇ、４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＳＯ（１５ｍＬ）に添加した。得られた混合物を室温で数分間撹拌し、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を凝縮器を用いて、１１５℃で１２時間撹拌した。ジエチルアミン（０．１４ｇ、２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ）の追加の部分を添加し、１１５℃で５時間撹拌した。次いで、真空下で溶媒の体積の半分を留去し、得られた混合物を室温で１時間静置した。得られた混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収し、水で洗浄した。収率０．２４ｇ（６２％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３７８．１２。実測値ｍ／ｚ：（＋）３７９（Ｍ＋１）＋；（－）３７７（Ｍ－１）－。
代替的合成法
代替的合成法
エチル（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）アセテート（０．２５ｇ、１ｍｍｏｌ）、ジエチルアミノサリシルアルデヒド（０．１９ｇ、１ｍｍｏｌ）、ピペリジン（３滴）、及び酢酸（３滴）を、丸底フラスコ内の無水エタノール（ＥｔＯＨ、５ｍＬ）に添加した。得られた混合物を室温で６時間撹拌した後、６０～６５℃で１２時間撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収し、水で洗浄した。収率：０．２７ｇ（７２％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３７８．１２。実測値ｍ／ｚ：（＋）３７９（Ｍ＋１）＋；（－）３７７（Ｍ－１）－。
実施例１５．化合物ＩＩ－３：７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシ－ベンゾイミダゾール－２－イル）クマリン
実施例１５．化合物ＩＩ－３：７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシ－ベンゾイミダゾール－２－イル）クマリン
３－（５－カルボキシベンズイミダゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ）及びジエチルアミン（０．２９ｇ、４ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、１５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を凝縮器を用いて、１１５℃で１２時間撹拌した。ジエチルアミン（０．１４ｇ、２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ）の追加の部分を添加し、混合物を１１５℃で更に８時間加熱した。真空下で溶媒の体積の半分を留去した。室温で１時間静置した後、混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収し、水で洗浄した。収量：０．１７ｇ（４４％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３７７．１４。実測値ｍ／ｚ：（＋）３７８（Ｍ＋１）＋；（－）３７６（Ｍ－１）－。
代替的合成法
代替的合成法
エチル（５－カルボキシベンズイミダゾール－２－イル）アセテート（０．２５ｇ、１ｍｍｏｌ）、ジエチルアミノサリシルアルデヒド（０．１９ｇ、１ｍｍｏｌ）、ピペリジン（３滴）、及び酢酸（３滴）を、丸底フラスコ内の無水エタノール（ＥｔＯＨ、５ｍＬ）に添加した。得られた混合物を７５℃で一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収し、水で洗浄した。収量：０．２６ｇ（７０％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３７７．１４。実測値ｍ／ｚ：（＋）３７８（Ｍ＋１）＋；（－）３７６（Ｍ－１）－。
実施例１６．化合物ＩＩ－４：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－メチル］アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例１６．化合物ＩＩ－４：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－メチル］アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３０ｇ、１ｍｍｏｌ）及び４－（メチルアミノ）ブタン酸（０．２３ｇ、２ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ内の無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を約１２０℃で８時間撹拌した後、室温で約１時間攪拌した。淡黄色混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収量：０．１９ｇ（４８％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４５６．０７。実測値ｍ／ｚ：（＋）４２７（Ｍ＋１）。
実施例１７．化合物ＩＩ－５：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン（トリエチルアンモニウム塩）
工程１：７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－（３－スルホプロピル］｝アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン（化合物ＩＩ－５ｔＢｕ）の調製
実施例１７．化合物ＩＩ－５：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン（トリエチルアンモニウム塩）
３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３ｇ、１ｍｍｏｌ）及びｔ－ブチル４－［Ｎ－（３－スルホ）プロピル］－アミノブタノエート（０．５６ｇ、２ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ内の無水ＤＭＳＯ（３ｍＬ）に添加した。混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）をこの混合物に添加した。反応混合物を１２０℃で３時間撹拌した。溶媒の体積の半分を真空下で留去した。混合物を室温で１時間静置し、得られた混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより、生成化合物ＩＩ－５ｔＢｕをトリエチルアンモニウム塩として単離した。収率０．５ｇ（７６％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５５８．１５。実測値ｍ／ｚ：（＋）５５９（Ｍ＋１）。
工程２：トリフルオロ酢酸（３ｍＬ）を、無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）中のトリエチルアンモニオ７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－［（３－スルホナトポピル］｝アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン（０．６６ｇ、１ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を蒸留により除去した。残留物をアセトニトリルと水との混合物（１：１、１０ｍＬ）に溶解し、生成物を、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより、化合物ＩＩ－５トリエチルアンモニウム塩として単離した。収量：０．６ｇ（９７％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５０２．０９。実測値ｍ／ｚ：（＋）５０３（Ｍ＋１）＋；（－）５０１（Ｍ－１）－。
実施例１８．化合物ＩＩ－６：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（トリエチルアンモニウム塩）
実施例１８．化合物ＩＩ－６：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（トリエチルアンモニウム塩）
工程１。７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－（３－スルホプロピル］｝アミノ－３－［５－クロロベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（化合物ＩＩ－６ｔＢｕ）の調製
３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ）及びｔ－ブチル４－［Ｎ－（３－スルホ）プロピル］－アミノブタノエート（０．５６ｇ、２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。得られた混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）をこの混合物に添加した。１２５℃で５時間撹拌した後、溶媒の体積の半分を真空下で留去した。混合物を室温で１時間静置した後、水とアセトニトリルとの１：１混合物（１０ｍＬ）で希釈し、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣによって、生成化合物ＩＩ－６ｔＢｕを、トリエチルアンモニウム塩として単離した。収量：０．３８ｇ（５６％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５７６．１３。実測値ｍ／ｚ：（＋）５７７（Ｍ＋１）。
工程２。無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）中のトリエチルアンモニオ７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－［（３－スルホナトポピル］｝アミノ－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（０．６８ｇ、１ｍｍｏｌ）の混合物を、トリフルオロ酢酸（３ｍＬ）で処理し、得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を留去し、残留物をアセトニトリルと水との１：１混合物（１０ｍＬ）に溶解させ、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより、生成物を、化合物ＩＩ－６トリエチルアンモニウム塩として単離した。収量：０．６ｇ（９６％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５２０．０７。実測値ｍ／ｚ：（＋）５２１（Ｍ＋１）＋；（－）５１９（Ｍ－１）－。
実施例１８．化合物ＩＩ－７：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（トリエチルアンモニウム塩として単離されたもの）
実施例１８．化合物ＩＩ－７：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（トリエチルアンモニウム塩として単離されたもの）
工程１。７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－（３－スルホプロピル］｝アミノ－３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（化合物ＩＩ－７ｔＢｕ）の調製
３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．２８ｇ、１ｍｍｏｌ）及びｔ－ブチル４－［Ｎ－（３－スルホ）プロピル］－アミノブタノエート（０．５６ｇ、２ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ内の無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。得られた混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）をこの混合物に添加した。１２０℃で８時間撹拌した後、溶媒の体積の半分を真空下で留去した。混合物を室温で１時間静置した後、水とアセトニトリルとの１：１混合物（１０ｍＬ）で希釈し、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣによって、生成化合物ＩＩ－７ｔＢｕを単離した。収量：０．１５ｇ（２７％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５４２．１７。実測値ｍ／ｚ：（＋）５４３（Ｍ＋１）。
工程２。無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－［（３－スルホナトポピル］｝アミノ－３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（０．２７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の混合物を、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）で処理し、得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を留去し、残留物をアセトニトリルと水との１：１混合物（１０ｍＬ）に溶解させ、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより、生成物を、トリエチルアンモニウム塩として単離した。収量：８７％。
実施例１９．化合物ＩＩ－８：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－［６－（アミノスルホニル）ベンゾオキサゾール－２－イル］クマリン
実施例１９．化合物ＩＩ－８：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－［６－（アミノスルホニル）ベンゾオキサゾール－２－イル］クマリン
工程１。７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－（３－スルホプロピル］｝アミノ－３－［６－（アミノスルホニル）ベンゾオキサゾール－２－イル］クマリン（化合物ＩＩ－８ｔＢｕ）の調製
３－［６－（アミノスルホニル）ベンゾオキサゾール－２－イル］－７－フルオロ－クマリン（０．１８ｇ、０．５ｍｍｏｌ）及びｔ－ブチル４－［Ｎ－（３－スルホ）プロピル］－アミノブタノエート（０．２８ｇ、１ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内で無水ＤＭＳＯ（３ｍＬ）と混合した。得られた混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）を添加した。１２０℃で７時間撹拌した後、溶媒の体積の半分を真空下で留去した。混合物を室温で１時間静置した後、水とアセトニトリルとの１：１混合物（１０ｍＬ）で希釈し、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより、生成化合物ＩＩ－８ｔＢｕを単離した。溶媒を蒸発させた後、黄色沈殿物を濾過した。収量：０．３１ｇ（５０％）。ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳによって、色素の純度、構造及び組成を確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値６２１．１５。実測値ｍ／ｚ：（＋）６２２（Ｍ＋１）。
工程２。無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の、７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－［（３－スルホナトポピル］｝アミノ－３－［６－（アミノスルホニル）ベンゾオキサゾール－２－イル］クマリン（０．３１ｇ、０．５ｍｍｏｌ）の混合物に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加し、得られた溶液を室温で２４時間撹拌した。溶媒を留去し、残留物をアセトニトリルと水との１：１混合物（１０ｍＬ）に溶解させ、溶媒を再び留去した。化合物ＩＩ－８を濾過し、アセトニトリルで洗浄した。収率０．２５ｇ（８７％）。
実施例２０．化合物ＩＩ－９：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（５－クロロ－ベンゾイミダゾリル－２－イル）クマリン
実施例２０．化合物ＩＩ－９：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（５－クロロ－ベンゾイミダゾリル－２－イル）クマリン
工程１。７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－（３－スルホプロピル］｝アミノ－３－［（５－クロロベンゾイミダゾリル－２－イル）クマリン（化合物ＩＩ－９ｔＢｕ）の調製
３－（５－クロロベンゾイミダゾリル－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ）及びｔ－ブチル４－（Ｎ－３－スルホプロピル）アミノブタノエート（０．５６ｇ、２ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ内の無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。得られた混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）をこの混合物に添加した。１２０℃で１５時間撹拌した後、溶媒の体積の半分を真空下で留去した。混合物を室温で１時間静置した後、水とアセトニトリルとの１：１混合物（１０ｍＬ）で希釈し、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣによって、生成化合物ＩＩ－９ｔＢｕを、トリエチルアンモニウム塩として単離した。
工程２。先の工程からのトリエチルアンモニオ７－｛Ｎ－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］－Ｎ－（３－スルホナトポピル）｝アミノ－３－（５－クロロベンゾイミダゾリル－２－イル）クマリンを、無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を留去し、残留物をアセトニトリルと水との１：１混合物（１０ｍＬ）に溶解し、生成物を、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより単離した。収量：０．２ｇ（３５％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５１９．０９。実測値ｍ／ｚ：（＋）５２０（Ｍ＋１）＋；（－）５１８（Ｍ－１）－。
実施例２１．化合物ＩＩ－１０ｔＢｕ：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例２１．化合物ＩＩ－１０ｔＢｕ：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．１７ｇ、０．５ｍｍｏｌ）及びｔ－ブチル４－（Ｎ－３－スルホプロピル）アミノブタノエート（０．２８ｇ、１ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内で無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）と混合した。得られた混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）を添加した。１１０℃で１７時間撹拌した後、溶媒の体積の半分を真空下で留去した。混合物を室温で１時間静置した後、水とアセトニトリルとの１：１混合物（１０ｍＬ）で希釈し、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより、生成化合物ＩＩ－１０ｔＢｕを単離した。溶媒を蒸発させた後、黄色沈殿物を濾過した。収率：０．２３ｇ（８０％）。ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳによって、色素の純度、構造及び組成を確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５８６．１６。実測値ｍ／ｚ：（＋）５８７（Ｍ＋１）。
実施例２１．化合物ＩＩ－１１ｔＢｕ：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（６－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例２１．化合物ＩＩ－１１ｔＢｕ：７－［Ｎ－（３－カルボキシプロピル）－Ｎ－（３－スルホプロピル）アミノ］－３－（６－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（６－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．６５ｇ、２ｍｍｏｌ）及びｔ－ブチル４－（Ｎ－３－スルホプロピル）アミノブタノエート（１．１３ｇ、４ｍｍｏｌ）及び無水ＤＭＳＯ（１５ｍＬ）を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（１．３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。１２０℃で１５時間撹拌した後、溶媒の体積の半分を真空下で留去した。混合物を室温で１時間攪拌した後、水とアセトニトリルとの１：１混合物（１０ｍＬ）で希釈し、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより、生成化合物ＩＩ－１１ｔＢｕを単離した。溶媒を蒸発させた後、黄色沈殿物を濾過した。収量：０．６６ｇ（５６％）。ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳによって、色素の純度、構造及び組成を確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５８６．１６。実測値ｍ／ｚ：（＋）５８７（Ｍ＋１）。
実施例２２．化合物ＩＩ－１２：７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシ－ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例２２．化合物ＩＩ－１２：７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシ－ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
エチル（５－カルボキシベンゾチアゾール－２－イル）アセテート（０．２７ｇ、１ｍｍｏｌ）、ジエチルアミノサリチル酸アルデヒド（０．２１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ピペリジン（５滴）、及び酢酸（５滴）を無水エタノール（５ｍＬ）に添加し、得られた混合物を６０～６５℃で７時間撹拌した後、室温で一晩静置した。得られた橙色沈殿物を吸引濾過により回収し、水で洗浄した。収率：０．２８ｇ（７２％）。
代替的合成法
代替的合成法
７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン（０．８４ｇ、２ｍｍｏｌ）及び濃硫酸（５ｍＬ）を室温で数分撹拌した後、１５０℃で２時間溶液を加熱した。混合物を室温で１時間撹拌した後、氷水（５０ｇ）で希釈し、反応混合物を一晩撹拌した。黄色の沈殿物を濾過した。収量：０．５１ｇ（６５％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３９４．１０。実測値ｍ／ｚ：（＋）３９５（Ｍ＋１）＋；（－）３９３（Ｍ－１）－。
実施例２３．化合物ＩＩ－１３：７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシ－１－フェニルベンゾイミダゾール－２－イル）クマリン
実施例２３．化合物ＩＩ－１３：７－ジエチルアミノ－３－（５－カルボキシ－１－フェニルベンゾイミダゾール－２－イル）クマリン
エチル（５－カルボキシ－１－フェニルベンゾイミダゾール－２－イル）アセテート（０．１６ｇ、１ｍｍｏｌ）及びジエチルアミノサリチル酸アルデヒド（０．２１ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を、無水エタノール（７ｍＬ）に溶解させた。ピペリジン（５滴）及び酢酸（５滴）を加え、得られた混合物を８０℃で５時間撹拌した後、室温で一晩静置した。得られた橙色沈殿物を吸引濾過により回収し、水で洗浄した。収量：０．１６ｇ（７０％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４５３．１７。実測値ｍ／ｚ：（＋）４５４（Ｍ＋１）＋；（－）４５２（Ｍ－１）－。
実施例２４．化合物ＩＩ－１４：３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－［３－（エチルオキシカルボニル）プロピル］アミノ－クマリン。
実施例２４．化合物ＩＩ－１４：３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－［３－（エチルオキシカルボニル）プロピル］アミノ－クマリン。
３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．６５ｇ、２ｍｍｏｌ）及びエチル４－アミノブタノエートヒドロクロリド（０．５ｇ、３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌した後、ジイソプロピルエチルアミン（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、温度１１０℃で３時間撹拌した。室温で１時間静置した後、黄色の半固体反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．５ｇ（５８％）。ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳによって、色素の純度、構造及び組成を確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４３６．１３。実測値ｍ／ｚ：（＋）４３７（Ｍ＋１）＋；（－）４３５（Ｍ－１）－。
実施例２５．化合物ＩＩ－１５：３－（６－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－［３－（エチルオキシカルボニル）プロピル］アミノ－クマリン
実施例２５．化合物ＩＩ－１５：３－（６－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－［３－（エチルオキシカルボニル）プロピル］アミノ－クマリン
３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ）及びエチル４－アミノブタノエートヒドロクロリド（０．５ｇ、３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌した後、ジイソプロピルエチルアミン（０．３９ｇ、３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、温度１２０℃で３時間撹拌した。室温で１時間静置した後、黄色の半固体反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、酢酸（１ｍＬ）で酸性化し、一晩攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．２１ｇ（４８％）。ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳによって、色素の純度、構造及び組成を確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４３６．１３。実測値ｍ／ｚ：（＋）４３７（Ｍ＋１）＋；（－）４３５（Ｍ－１）－。
実施例２６．化合物ＩＩ－１６：７－（３－カルボキシプロピル）アミノ－３－（５－クロロベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例２６．化合物ＩＩ－１６：７－（３－カルボキシプロピル）アミノ－３－（５－クロロベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（５－クロロベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ）及び４－アミノブタン酸（０．２１ｇ、２ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ内の無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌した後、ジイソプロピルエチルアミン（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を温度１３５℃で７時間撹拌した。４－アミノブタン酸（０．１ｇ、１ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ）の追加の部分を加え、加熱を１３５℃で５時間継続した。室温で１時間静置した後、淡黄色反応混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．１２ｇ（３０％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３９８．０７。実測値ｍ／ｚ：（＋）３９９（Ｍ＋１）＋。
実施例２７．化合物ＩＩ－１７：７－（３－カルボキシプロピル）アミノ－３－（５－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン。
実施例２７．化合物ＩＩ－１７：７－（３－カルボキシプロピル）アミノ－３－（５－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン。
３－（ベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．２８ｇ、１ｍｍｏｌ）及び４－アミノブタン酸（０．２１ｇ、２ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させた後、室温で数分間撹拌し、ジイソプロピルエチルアミン（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、温度１２５℃で７時間撹拌した。４－アミノブタン酸（０．１ｇ、１ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．１３ｇ、１ｍｍｏｌ）の追加の部分を添加し、１２５℃で３時間加熱を続けた。淡黄色反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．０８ｇ（２３％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３６４．１１。実測値ｍ／ｚ：（＋）３６５（Ｍ＋１）＋。
実施例２８．化合物ＩＩ－１８：３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－（３－スルホプロピル）アミノ－クマリン
実施例２８．化合物ＩＩ－１８：３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－（３－スルホプロピル）アミノ－クマリン
３－（５－カルボキシベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（０．３３ｇ、１ｍｍｏｌ）及び３－アミノプロパンスルホン酸（０．４２ｇ、３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌した後、ジイソプロピルエチルアミン（０．３９ｇ、３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、温度１２５℃で７時間撹拌した。溶媒の体積の半分を真空下で留去した。混合物を室温で１時間攪拌した後、水とアセトニトリルとの１：１混合物（１０ｍＬ）で希釈し、アセトニトリルとＴＥＡＢとの混合物を溶離剤として用いる分取ＨＰＬＣにより、生成物を単離した。溶媒を蒸発させた後、黄色沈殿物をアセトニトリル（３ｍＬ）で粉砕し、濾過した。収量：０．０６ｇ（１４％）。ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳによって、色素の純度、構造及び組成を確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４４４．０６。実測値ｍ／ｚ：（＋）４４５（Ｍ＋１）。
実施例２９．蛍光強度の比較
実施例２９．蛍光強度の比較
色素溶液（エタノール：水＝１：１）の蛍光強度（最大励起波長＝４５０ｎｍ）を、同じスペクトル領域の標準色素と比較した。結果を表２に示す。これらの色素が、蛍光ベースの解析用で、有意な利点を有していることが示されている。
実施例３０．完全官能化ヌクレオシドコンジュゲートの合成のための一般手順
本明細書に開示されるクマリン蛍光色素が、適切なアミノ置換アデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ）ヌクレオチド誘導体Ａ－ＬＮ３－ＮＨ２又はＣ－ＬＮ３－ＮＨ２と結合された：
以下のアデニンスキームに従って適切な試薬を用いて色素のカルボン酸基を活性化した後：
アデニン結合の一般的な生成物は、以下に示される通りである：
ｆｆＡ－ＬＮ３－Ｄｙｅは、ＬＮ３リンカーを有する完全に機能化されたＡヌクレオチドを指し、本明細書に開示されるクマリン色素で標識化されている。各構造中のＲ基は、コンジュゲーション後のクマリン色素部分を指す。
色素（１０μｍｏｌ）を５ｍＬ丸底フラスコに入れて乾燥させ、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍＬ）に溶解させ、次いで溶媒を減圧下で留去する。この手順を２回繰り返す。乾燥した色素を無水Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、０．２ｍＬ）に室温で溶解させる。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、１．５当量、１５μｍｏｌ、４．５ｍｇ）を色素溶液に添加し、次いで、ＤＩＰＥＡ（３当量、３０μｍｏｌ、３．８ｍｇ、５．２μＬ）をマイクロピペットを介してこの溶液に加える。反応フラスコを窒素ガス下で密封する。反応の進行を、ＴＬＣ（溶離剤アセトニトリル：水＝１：９）及びＨＰＬＣによって監視する。一方、適切なアミノ置換ヌクレオチド誘導体（Ａ－ＬＮ３－ＮＨ２、２０ｍＭ、１．５当量、１５μｍｏｌ、０．７５ｍＬ）の溶液を減圧下で濃縮した後、水（２０μＬ）に再溶解させる。活性化色素のＤＭＡ溶液を、Ｎ－ＬＮ３－ＮＨ２の溶液を入れたフラスコに移す。更にＤＩＰＥＡ（３当量、３０μｍｏｌ、３．８ｍｇ、５．２μＬ）をトリエチルアミン（１μＬ）と共に添加する。カップリングの進行を、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、及びＬＣＭＳにより毎時モニタリングする。反応が完了したら、トリエチルアミン重炭酸塩緩衝液（ＴＥＡＢ、０．０５Ｍ、約３ｍＬ）をピペットを介して反応混合物に添加する。完全に官能化されたヌクレオチドの初期精製は、クエンチ反応混合物を、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムを通して、残っている未反応色素の大部分を除去することによって行われる。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘが、空の２５ｇのＢｉｏｔａｇｅカートリッジ、溶媒系ＴＥＡＢ／ＭｅＣＮに注がれる。Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムからの溶液を減圧下で濃縮する。残りの材料を、最小体積の水及びアセトニトリルに再溶解させ、その後で、２０μｍのナイロンフィルターを通して濾過する。濾過溶液を、分取ＨＰＬＣによって精製する。調製された化合物の組成をＬＣＭＳにより確認する。
シトシンカップリングの一般的な生成物は、上述のものと同様の手順に従い、以下に示す。
ｆｆＣ－ＬＮ３－Ｄｙｅは、ＬＮ３リンカーを有する完全に官能化されたＣヌクレオチドを指し、本明細書に開示されるクマリン色素で標識化されている。各構造中のＲ基は、コンジュゲーション後のクマリン色素部分を指す。
実施例３１．式（ＩＩ）の化合物のアミド誘導体の調製
実施例３１．式（ＩＩ）の化合物のアミド誘導体の調製
本明細書に記載されるいくつかの追加的実施形態は、式（ＩＩ）の化合物のアミド誘導体及びその調製方法に関連し、この方法は、式（ＩＩａ）の化合物を、カルボン酸活性化により式（ＩＩａ’）の化合物に変換することと、
式（ＩＩａ’）の化合物を、式（Ａｍ）の一級アミン又は二級アミンと反応させて、式（ＩＩｂ）のアミド誘導体に到達させることと、を含み、
変数Ｘ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が本明細書で定義され、Ｒ’は、カルボキシル活性化剤（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール、ＨＯＢｔ、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ，ＤＣＣなど）の残留部分であり、ＲＡ及びＲＢのそれぞれは、独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、Ｃ２～６アルケニル、Ｃ２～６アルキニル、Ｃ３～７カルボシクリル、Ｃ６～１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、３～１０員ヘテロシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、又は（ヘテロシクリル）アルキルである。
式（ＩＩｂ）の化合物の調製のための一般的手順
式（ＩＩｂ）の化合物の調製のための一般的手順
式（ＩＩａ）（０．００１ｍｏｌ）の適切な色素を、好適な無水有機溶媒（ＤＭＦ、１．５ｍＬ）に溶解させる。この溶液に、ＴＳＴＵ、ＢＯＰ、又はＰｙＢＯＰなどのカルボキシル活性化試薬が添加される。この反応混合物を室温で約２０分間撹拌した後、適切なアミン誘導体を添加する。反応混合物を一晩撹拌し、濾過し、余分な活性化試薬を０．１ＭのＴＥＡＢ水溶液でクエンチする。溶媒を真空下で蒸発させ、残渣をＴＥＡＢ溶液に再溶解させ、ＨＰＬＣにより精製する。
例えば、化合物ＩＩ－２の一級及び二級アミド誘導体が調製された：
実施例３２．２チャネルシークエンシング用途
本明細書に記載の色素で標識化されたＡヌクレオチドの、シークエンシング用途における効率を、２チャネル検出法において実証した。本明細書に記載の２チャネル法に関して、核酸は、米国特許出願公開第第２０１３／００７９２３２号に記載された方法及びシステムにより配列決定可能である。なお、この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２チャネル検出では、第１のチャネルで検出される第１のヌクレオチド型、第２のチャネルで検出される第２のヌクレオチド型、第１及び第２のチャネルの両方で検出される第３のヌクレオチド型、及びいずれのチャネルにおいても検出されない又は最小限しか検出されない、ラベルを欠いた第４のヌクレオチド型を提供することによって、核酸を配列決定することができる。実験のＲＴＡ２．０．９３解析によって散布図を生成した。以下の図に示される散布図は、２６サイクルのそれぞれのサイクル５であった。
シークエンシング条件：
６０Ｃでのスキャン、Ｐｏｌ１６７１、ＣＣＬ（クラスター化学線化）ＦＣ上、ＰｈｉＸ
セット３を除いて、以下の緑色色素を用いる：ｆｆＡ－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０／ｆｆＴ－ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０
等温シークエンシング２ｘ１５１ｃ
・６０Ｃでのスキャン、Ｐｏｌ１６７１、ＣＣＬ（クラスター化学線化）ＦＣ上、ＰｈｉＸ
・セット３を除いて、以下の緑色色素を用いる：ｆｆＡ－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０／ｆｆＴ－ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０
散布図
等温シークエンシング２ｘ１５１ｃ
・６０Ｃでのスキャン、Ｐｏｌ１６７１、ＣＣＬ（クラスター化学線化）ＦＣ上、ＰｈｉＸ
・セット３を除いて、以下の緑色色素を用いる：ｆｆＡ－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０／ｆｆＴ－ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０
散布図
いくつかの実施形態では、二級アミン置換クマリン化合物は、蛍光検出及び合成によるシークエンシングの方法に特に好適であり得る。以下に記載される実施形態は、式（ＩＩＩ）の構造又はその塩の色素及びそれらの誘導体に関する：
（式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、又はＮＲｎであり、ここで、Ｒｎは、Ｈ又はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ及びＲ１は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のアルケニル、置換又は無置換のアルキニル、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアミノアルキル、置換又は無置換のカルボシクリル、置換又は無置換のヘテロシクリル、置換又は無置換のアリール、又は置換又は無置換のヘテロアリールであり、
Ｒ２及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のアルケニル、置換又は無置換のアルキニル、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアミノアルキル、置換又は無置換のカルボシクリル、置換又は無置換のヘテロシクリル、置換又は無置換のアリール、又は置換又は無置換のヘテロアリールであり；又はＲ２及びＲ４のうちの一方は、Ｒ３に連結されて、置換又は無置換の複素環を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、置換Ｃ２～６アルキル、置換又は無置換のＣ２～６アルケニル、置換又は無置換のＣ２～６アルキニル、又は置換又は無置換のカルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、若しくはヘテロアリールであるか、又はＲ３は、Ｒ２又はＲ４に連結されて、置換又は無置換の環を形成し、
Ｒが－ＣＮである場合、Ｒ３はＣ１～６アルキルではなく、
各Ｒ５は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換若しくは無置換のアルキル、置換若しくは無置換のアルケニル、置換若しくは無置換のアルキニル、置換若しくは無置換のアルコキシ、置換若しくは無置換のアミノアルキル、置換若しくは無置換のカルボシクリル、置換若しくは無置換のヘテロシクリル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールであり、
ｍは、０、１、２、３、又は４である。
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、又はＮＲｎであり、ここで、Ｒｎは、Ｈ又はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ及びＲ１は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のアルケニル、置換又は無置換のアルキニル、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアミノアルキル、置換又は無置換のカルボシクリル、置換又は無置換のヘテロシクリル、置換又は無置換のアリール、又は置換又は無置換のヘテロアリールであり、
Ｒ２及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のアルケニル、置換又は無置換のアルキニル、置換又は無置換のアルコキシ、置換又は無置換のアミノアルキル、置換又は無置換のカルボシクリル、置換又は無置換のヘテロシクリル、置換又は無置換のアリール、又は置換又は無置換のヘテロアリールであり；又はＲ２及びＲ４のうちの一方は、Ｒ３に連結されて、置換又は無置換の複素環を形成し、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１～６アルキル、置換Ｃ２～６アルキル、置換又は無置換のＣ２～６アルケニル、置換又は無置換のＣ２～６アルキニル、又は置換又は無置換のカルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、若しくはヘテロアリールであるか、又はＲ３は、Ｒ２又はＲ４に連結されて、置換又は無置換の環を形成し、
Ｒが－ＣＮである場合、Ｒ３はＣ１～６アルキルではなく、
各Ｒ５は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換若しくは無置換のアルキル、置換若しくは無置換のアルケニル、置換若しくは無置換のアルキニル、置換若しくは無置換のアルコキシ、置換若しくは無置換のアミノアルキル、置換若しくは無置換のカルボシクリル、置換若しくは無置換のヘテロシクリル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールであり、
ｍは、０、１、２、３、又は４である。
いくつかの態様では、Ｒが－ＣＮでなく、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換若しくは無置換のアルキル、置換若しくは無置換のアルケニル、置換若しくは無置換のアルキニル、置換若しくは無置換のアルコキシであり、置換若しくは無置換のアミノアルキル、置換若しくは無置換のカルボシクリル、置換若しくは無置換のヘテロシクリル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールである。
別の態様では、式（ＩＶ）の化合物又はその塩であり、
（式中、
Ｘ’は、Ｏ、Ｓ、及びＮＲｐから選択され、Ｒｐは、Ｈ又はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ６は、Ｈ又はＣ１～４アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＯＨ、置換又は無置換のＣ１～４アルケニル、置換又は無置換のＣ１～４アルケニル、置換又は無置換のＣ２～４アルキニル、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、及び置換又は無置換のＣ１～４アルコキシであり、
Ｒ８及びＲ１０は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、置換若しくは無置換のＣ１～６アルキル、置換若しくは無置換のＣ１～６アルケニル、置換若しくは無置換のＣ２～６アルキニル、又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルコキシであり、又は、
Ｒ８及びＲ１０のうちの一方は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、置換若しくは無置換のＣ１～６アルキル、置換若しくは無置換のＣ１～６アルケニル、置換若しくは無置換のＣ２～６アルキニル、又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルコキシであり、Ｒ８及びＲ１０の他方はＲ９でとられて、置換又は無置換の４～７員複素環を形成し、
Ｒ９は、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２Ｃ１～４アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＣＯＮ（Ｃ１～４アルキル）２、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、又は－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２で置換されたＣ２～６アルキル又はＣ１～６アルキルであり、
各Ｒ１１は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、カルボキシ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のアルケニル、置換又は無置換のアルキニル、及び置換又は無置換のＣ１～６アルコキシであり、
ｑは、０、１、又は２である。
Ｘ’は、Ｏ、Ｓ、及びＮＲｐから選択され、Ｒｐは、Ｈ又はＣ１～６アルキルであり、
Ｒ６は、Ｈ又はＣ１～４アルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＯＨ、置換又は無置換のＣ１～４アルケニル、置換又は無置換のＣ１～４アルケニル、置換又は無置換のＣ２～４アルキニル、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、及び置換又は無置換のＣ１～４アルコキシであり、
Ｒ８及びＲ１０は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、置換若しくは無置換のＣ１～６アルキル、置換若しくは無置換のＣ１～６アルケニル、置換若しくは無置換のＣ２～６アルキニル、又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルコキシであり、又は、
Ｒ８及びＲ１０のうちの一方は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、置換若しくは無置換のＣ１～６アルキル、置換若しくは無置換のＣ１～６アルケニル、置換若しくは無置換のＣ２～６アルキニル、又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルコキシであり、Ｒ８及びＲ１０の他方はＲ９でとられて、置換又は無置換の４～７員複素環を形成し、
Ｒ９は、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２Ｃ１～４アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＣＯＮ（Ｃ１～４アルキル）２、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、又は－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２で置換されたＣ２～６アルキル又はＣ１～６アルキルであり、
各Ｒ１１は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、カルボキシ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、ニトロ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、置換又は無置換のアルキル、置換又は無置換のアルケニル、置換又は無置換のアルキニル、及び置換又は無置換のＣ１～６アルコキシであり、
ｑは、０、１、又は２である。
式（ＩＩＩ）の化合物又はその塩に関して、様々な置換基の特定の実施形態が以下に示される。各単一グループは、特に指定されない限り、任意の他の個々の制限と組み合わせることができる。
バイオマーカー及び特にそれらの生体コンジュゲートの蛍光特性を水系溶液中で改善するために、式（ＩＩＩ）の化合物は、以下のような化合物である：
ｉ）Ｒ２は、－ＳＯ３Ｈであり、かつ／又は、
ｉｉ）Ｒ４は、－ＳＯ３Ｈであり、かつ／又は、
ｉｉｉ）Ｒ５は、－ＳＯ３Ｈ若しくは－ＳＯ２ＮＨ２である。
ｉ）Ｒ２は、－ＳＯ３Ｈであり、かつ／又は、
ｉｉ）Ｒ４は、－ＳＯ３Ｈであり、かつ／又は、
ｉｉｉ）Ｒ５は、－ＳＯ３Ｈ若しくは－ＳＯ２ＮＨ２である。
いくつかの態様では、ＸはＯ又はＳである。いくつかの態様では、ＸはＯである。いくつかの態様では、Ｘは、Ｓである。いくつかの態様では、ＸはＮＲｎであり、Ｒｎは、Ｈ又はＣ１～６アルキルであり、いくつかの態様では、Ｒｎは、Ｈである。
一部の態様では、Ｒ３は、Ｈである。一部の態様では、Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、又はヘキシルである。他の態様では、Ｒ３はエチルである。他の態様では、Ｒ３は、置換されたＣ２～６アルキルである。他の態様では、Ｒ３は、－ＣＯ２Ｈで置換されたＣ２～６アルキルである。他の態様では、Ｒ３は、置換若しくは無置換のＣ２～６アルケニル、又は置換若しくは無置換のＣ２～６アルキニルである。いくつかの態様では、Ｒ３は、Ｒ２又はＲ４に連結されて、置換又は無置換の環を形成する。
リンカー又はヌクレオチドへの結合が、Ｒ３を介して行われる場合には、Ｒ３は、それに取り付けられた官能基への結合を可能にするのに十分な長さであるべきである。いくつかの態様では、Ｒ３は、－ＣＨ２ＣＯＯＨ又は－ＣＨ２ＣＯＯ－である。
任意選択的に、Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、ｎは２～６である。いくつかの態様では、ｎは、２、３、４、５、又は６である。他の態様では、ｎは２又は５である。いくつかの態様では、ｎは２である。いくつかの態様では、ｎは５である。
任意選択的に、Ｒ３は、－（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈ（式中、ｎは２～６である）である。いくつかの態様では、ｎは、２、３、４、５、又は６である。他の態様では、ｎは２又は５である。いくつかの態様では、ｎは２である。いくつかの態様では、ｎは５である。
インドール部分のベンゼン環は、任意に、Ｒ５として示される置換基によって任意の１、２、３、又は４つの位置で置換される。式中、ｍはゼロであり、ベンゼン環は無置換である。式中、ｍは１より大きく、各Ｒ５は同じであっても異なっていてもよい。いくつかの態様では、ｍは０である。他の態様では、ｍは１である。他の態様では、ｍは２である。いくつかの態様では、ｍは１、２、又は３であり、各Ｒ５は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ５は、－（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨであり、式中、ｘは２～６である。いくつかの態様では、ｘは２、３、４、５、又は６である。他の態様では、ｘは２又は５である。いくつかの態様では、ｘは２である。いくつかの態様では、ｘは５である。
いくつかの態様では、Ｒ５は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ５は、ハロゲン、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ５は、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２で置換されたＣ２～６アルキルである。いくつかの態様では、各Ｒ５は、独立して、置換又は無置換のＣ１～６アルキル、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２である。
いくつかの態様では、Ｒ１は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ１は、ハロゲンである。一部の態様では、Ｒ１はＣｌである。いくつかの態様では、Ｒ１はＣ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ１はメチルである。
いくつかの態様では、Ｒは、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒはハロゲンである。一部の態様では、ＲはＣｌである。いくつかの態様では、ＲはＣ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒはメチルである。いくつかの態様では、Ｒは－ＣＮではない。いくつかの態様では、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、置換若しくは無置換のアルキル、置換若しくは無置換のアルケニル、置換若しくは無置換のアルキニル、置換若しくは無置換のアルコキシ、置換若しくは無置換のアミノアルキル、置換若しくは無置換のカルボシクリル、置換若しくは無置換のヘテロシクリル、置換若しくは無置換のアリール、又は置換若しくは無置換のヘテロアリールである。
いくつかの態様では、Ｒ２は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２は、置換又は無置換のアルキルである。一部の態様では、Ｒ２は、－ＣＯ２Ｈ又は－ＳＯ３Ｈで置換又は無置換のＣ１～４アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ２は、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２は、Ｒ３に連結されて、任意に１つ以上のアルキル基で置換されたピロリジン又はピペリジンなどの、置換又は無置換の複素環を形成する。いくつかの態様では、Ｒ２は、Ｈ、置換又は無置換のアルキル、場合により－ＣＯ２Ｈ又は－ＳＯ３Ｈで置換されるＣ１～４アルキル、又は－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２は、Ｈ又は－ＳＯ３Ｈである。
いくつかの態様では、Ｒ４は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ４は、置換又は無置換のアルキルである。一部の態様では、Ｒ４は、－ＣＯ２Ｈ又は－ＳＯ３Ｈで置換又は無置換のＣ１～４アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ４は、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ４は、Ｒ３に連結されて、任意に１つ以上のアルキル基で置換されたピロリジン又はピペリジンなどの、置換又は無置換の複素環を形成する。
式（ＩＩＩ）の化合物の具体例としては、ＸがＯ又はＳであり、ＲがＨであり、Ｒ１がＨであり、Ｒ３が、－（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、式中、ｎが２～６であり、Ｒ５が、Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２であり、Ｒ２が、Ｈ又は－ＳＯ３Ｈであり、Ｒ４が、Ｈ又は－ＳＯ３Ｈである。
式（ＩＩＩ）の化合物の具体例としては、ＸがＯ又はＳであり、ＲがＨであり、Ｒ１はＨであり、Ｒ３が、－（ＣＨ２）２ＣＯＯＨであり、Ｒ５が、Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２であり、Ｒ２が、Ｈ又は－ＳＯ３Ｈであり、Ｒ４が、Ｈ又は－ＳＯ３Ｈである。
式（ＩＩＩ）の化合物の具体例としては、ＸがＯ又はＳであり、ＲはＨであり、Ｒ１はＨであり、Ｒ３は、－（ＣＨ２）５ＣＯＯＨであり、Ｒ５が、Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２であり、Ｒ２が、Ｈ又は－ＳＯ３Ｈであり、Ｒ４が、Ｈ又は－ＳＯ３Ｈである。
式（ＩＶ）のいくつかの態様では、Ｘ’はＯである。一部の態様では、Ｘ’は、Ｓである。いくつかの態様では、Ｘ’はＮＲｐであり、Ｒｐは、Ｈ又はＣ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｘ’はＮＲｐであり、ＲｐはＨである。
一部の態様では、Ｒ６は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ６は、Ｃ１～４アルキルである。
一部の態様では、Ｒ７は、Ｈである。一部の態様では、Ｒ７は、任意選択的に置換されたＣ１～４アルキル、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、又は－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２である。一部の態様では、Ｒ７は、－ＣＯ２Ｈで置換又は無置換のＣ１～４アルキルである。
一部の態様では、Ｒ８は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ８は、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ８は、－ＳＯ３Ｈである。
一部の態様では、Ｒ１０は、Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ１０は、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ１０は、－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ８はＨであり、Ｒ１０は－ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ８は－ＳＯ３Ｈであり、Ｒ１０は、Ｈである。
いくつかの態様では、Ｒ８及びＲ１０のうちの一方は、Ｈ、ハロゲン、－ＣＮ、－ＣＯ２Ｈ、アミノ、－ＯＨ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、置換若しくは無置換のＣ１～６アルキル、置換若しくは無置換のＣ１～６アルケニル、置換若しくは無置換のＣ２～６アルキニル、又は置換若しくは無置換のＣ１～６アルコキシであり、Ｒ８及びＲ１０のうちの他方は、Ｒ９と共にとられて、置換又は無置換の４～７員複素環を形成する。
いくつかの態様では、Ｒ９は、Ｃ２～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ９は、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２Ｃ１～４アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＣＯＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＣＯＮ（Ｃ１～４アルキル）２、－ＣＮ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、又は－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２で置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ９は、－ＣＯ２Ｈで置換されたＣ１～６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ９は、－（ＣＨ２）ｙ－ＣＯ２Ｈであり、式中、ｙは、２、３、４、又は５である。
いくつかの態様では、各Ｒ１１は、独立して、ハロゲン、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１～４アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１～４アルキル）２、又は置換若しくは無置換のアルキルである。他の態様では、各Ｒ１１は、独立して、ハロゲン、－ＣＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、又は－ＳＯ２ＮＨ２である。
いくつかの態様では、ｑは０である。他の態様では、ｑは１である。更に他の態様では、ｑは２である。
二級アミン置換クマリン色素の具体例としては、以下が挙げられる：
及びこれらの塩が挙げられる。
特に有用な化合物は、本明細書に記載の色素で標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、アルキル－カルボキシ基を介してクマリン分子の窒素原子に結合してアルキル－アミドを形成してもよい。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置に取り付けられた標識、又は７デアザプリン塩基のＣ７位置にリンカー部分を介して取り付けられた標識を有してもよい。
標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖に共有結合したブロッキング基を有してもよい。ブロッキング基は、リボース糖又はデオキシリボース糖上の任意の位置に付着されてもよい。特定の実施形態では、ブロッキング基は、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖の３’ＯＨ位置にある。
本明細書では、少なくとも１つのヌクレオチドが、本開示の化合物で標識化されたヌクレオチドである、２つ以上のヌクレオチドを含むキットが提供される。キットは、２つ以上の標識化されたヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、２つ以上の蛍光標識で標識されてもよい。ラベルのうちの２つ以上は、レーザーであってもよい単一の励起源を用いて励起されてもよい。例えば、２つ以上の標識の励起帯は、スペクトルの重複領域における励起が両方の標識を蛍光発光させるように少なくとも部分的に重なっていてもよい。特定の実施形態では、２つ以上の標識からの発光は、スペクトルの異なる領域において発生し、その結果、ラベルの少なくとも１つの存在は、発光を光学的に区別することによって決定することができる。
キットは、４つの標識化されたヌクレオチドを含んでもよく、４つのヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドは、本明細書に開示される化合物で標識化される。このようなキットでは、４つのヌクレオチドのそれぞれは、他の３つのヌクレオチド上の標識と同じであるか又は異なる化合物で標識され得る。したがって、化合物のうちの１つ以上は、その化合物が他の化合物と区別可能であるように、異なる吸光度最大値及び／又は放射最大値を有することができる。例えば、各化合物は、各化合物が他の３つの化合物と区別可能であるように、異なる吸光度最大値及び／又は放射最大値を有し得る。最大値以外の吸光度スペクトル及び／又は発光スペクトルの部分は異なる場合があり、これらの差異は、化合物を区別するために利用され得ることが理解されるであろう。キットは、２つ以上の化合物が異なる吸光度最大値を有するようなものであってもよい。化合物は、５００ｎｍ未満の領域で光を吸収し得る。
本明細書に記載される化合物、ヌクレオチド、又はキットは、生物学系（例えば、プロセス又はそのコンポーネントを含む）を検出、測定、又は同定するために使用されてもよい。化合物、ヌクレオチド又はキットを用いることができるいくつかの技術としては、シークエンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合又は細胞機能解析）、又はタンパク質アッセイ（例えば、タンパク質結合アッセイ又はタンパク質活性アッセイ）が挙げられる。その使用は、自動シークエンシング器具などの特定の技術を実行するための自動化器具であってもよい。シークエンシング器具は、異なる波長で動作する２つのレーザーを含んでもよい。
以下に開示されるのは、本開示の化合物の合成方法である。本開示による色素は、様々な異なる好適な出発物質から合成することができる。クマリン色素を調製するための方法は、当該技術分野において周知である。
本明細書に記載の化合物は、いくつかのメソメリー形態として表すことができる。単一の構造が描かれている場合、関連するメソメリー形態のいずれかが意図される。本明細書に記載のクマリン化合物は、単一の構造によって表されるが、関連するメソメリー形態のいずれかとして同様に示され得る。いくつかのメソメリー構造は、下記式（ＩＩＩ）で示される。
本明細書に記載される化合物の単一のメソメリー形態が示されている各事例においては、代替のメソメリー形態も同様に企図される。
生体分子への付着は、式（ＩＩＩ）の化合物のＲ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、又はＸ位置を介してもよい。いくつかの態様では、接続は、式（ＩＩＩ）のＲ３又はＲ５基を介している。式（ＩＶ）の場合には、取り付けは、任意の位置Ｒ６～１１又はＸ’であってもよい。いくつかの実施形態では、置換基は、置換アルキル、例えば、－ＣＯ２Ｈ又はカルボキシル基の活性化形態、例えば、アミド又はエステルであるが、それらは生体分子のアミノ基又はヒドロキシル基への結合に使用され得る。一実施形態では、式（ＩＩＩ）のＲ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、若しくはＸ基、又は式（ＩＶ）のＲ６～１１若しくはＸ’基は、更なるアミド／ペプチド結合形成に最も好適な活性化エステル又はアミド残基を含有してもよい。本明細書で使用するとき、用語「活性化エステル」は、例えばアミノ基を含有する化合物と、穏和な条件下で反応することができるカルボキシル基誘導体を指す。活性化エステルの非限定的な例としては、ｐ－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、及びスクシンイミドエステルが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、色素化合物は、ヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチド又はヌクレオチドに共有結合してもよい。例えば、標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置に取り付けられた標識、又は７デアザプリン塩基のＣ７位置にリンカー部分を介して取り付けられた標識を有してもよい。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖に共有結合した３’－ＯＨブロッキング基を有してもよい。
本明細書に記載される蛍光色素の特定の有用な用途は、生体分子、例えば、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを標識することである。本出願のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の蛍光化合物で標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを対象とする。
追加的実施形態が、以下の実施例において更に詳細に開示されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。
追加的実施形態が、以下の実施例において更に詳細に開示されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。表３には、実施例において開示されるクマリン蛍光色素のスペクトル特性がまとめられている。表４は、本明細書に開示される色素で標識化された様々なヌクレオチドの構造及びスペクトル特性がまとめられている。
実施例３３：化合物ＩＩＩ－１－１：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例３３：化合物ＩＩＩ－１－１：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン誘導体（ＦＣ－１、０．４ｇ、１．３４５ｍｍｏｌ、１当量）及び６－アミノヘキサン酸（ＡＣ－Ｃ５、０．２５ｇ、１．９０６ｍｍｏｌ、１．４１７当量）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、３ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分撹拌した後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－Ｎ－エチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．２５ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）をこの混合物に添加した。反応混合物を１２０℃で３時間撹拌した。室温で１時間静置した後、黄色の半固体反応混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．３６ｇ（６５．５％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４０８．４７。実測値ｍ／ｚ：（＋）４０９（Ｍ＋１）＋；（－）４０７（Ｍ－１）－。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１２．０３（ｍ、２Ｈ）、９．００（ｓ、１Ｈ）、８．１２（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．９９（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．７３（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．５４（ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ、１Ｈ）、３．１８（ｑ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．２３（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．５７（ｄｐ、Ｊ＝１４．７、７．２Ｈｚ、４Ｈ）、１．３９（ｄｑ、Ｊ＝９．２、４．５、３．５Ｈｚ、２Ｈ）。
実施例３４：化合物ＩＩＩ－１－２：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（ベンズイミダゾール－２－イル）クマリン
実施例３４：化合物ＩＩＩ－１－２：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（ベンズイミダゾール－２－イル）クマリン
３－（ベンズイミダゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（ＦＣ－２、０．２８ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）及び６－アミノヘキサン酸（ＡＣ－Ｃ５、０．１３ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２ｍＬ）に添加した。得られた混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．２５ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を、温度１３０℃で４時間撹拌した。６－アミノヘキサン酸（ＡＣ－１、０．１３ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）及びＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）を反応混合物に添加し、１３０℃で加熱を５時間にわたって続けた。室温で１時間静置した後、淡黄色反応混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．２６ｇ（６８．５％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３９１．１５。実測値ｍ／ｚ：（＋）３９２（Ｍ＋１）＋；（－）３９０（Ｍ－１）－、７８１（２Ｍ－１）－。
実施例３５：化合物ＩＩＩ－１－３：７－（２－カルボキシエチル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例３５：化合物ＩＩＩ－１－３：７－（２－カルボキシエチル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
工程Ａ：７－［２－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）エチル］アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン。
３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（ＦＣ－１、０．３ｇ、１．０１ｍｍｏｌ、１当量）及びｔ－ブチル３－アミノプロピオネートヒドロクロリド（ＡＣ－Ｃ２、０．２ｇ、１．１ｍｍｏｌ、１．０９当量）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２ｍＬ）に添加し、得られた混合物を室温で数分撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。得られた混合物を１００℃で２時間撹拌した。室温で１時間静置した後、黄色反応混合物を水（７ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．３８ｇ（６９％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４２２．１３。実測値ｍ／ｚ：（＋）４２３（Ｍ＋１）＋；（－）、４２１（Ｍ－１）－。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：９．２８（ｓ、１Ｈ）、９．０１（ｓ、１Ｈ）、８．２７－８．１６（ｍ、１Ｈ）、８．１０（ｔｔ、Ｊ＝８．３、０．９Ｈｚ、２Ｈ）、８．０５－７．９２（ｍ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．６６－７．５５（ｍ、１Ｈ）、７．５１（ｄｄｄｄ、Ｊ＝１１．４、８．２、７．１、１．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．４６－７．３２（ｍ、２Ｈ）、６．７４（ｄｄ、Ｊ＝８．７、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．５８（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．４１（ｑ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．５５（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、１．４１（ｓ、９Ｈ）。
工程Ｂ．
７－［２－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）エチル］アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン（ＩＩＩ－１－３ｔＢｕ、０．２ｇ、０．４７３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液をトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）で処理し、得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を留去し、残留物を水（１０ｍＬ）で粉砕した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．１５ｇ（８６％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３６６．３９。実測値ｍ／ｚ：（＋）３６７（Ｍ＋１）＋；（－）３６５（Ｍ－１）－。
実施例３６：化合物ＩＩＩ－１－４：７－（３－カルボキシプロピル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
実施例３６：化合物ＩＩＩ－１－４：７－（３－カルボキシプロピル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン
工程Ａ：７－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン。
３－（ベンゾチアゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（ＦＣ－１、０．６ｇ、２．０２ｍｍｏｌ、１当量）及びｔ－ブチル４－アミノブタノエートヒドロクロリド（ＡＣ－Ｃ３、０．５ｇ、２．５６ｍｍｏｌ、１．２７当量）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。反応混合物を、温度１００℃で３時間撹拌した。室温で１時間静置した後、黄色の半固体反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．７ｇ（７９％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４３６．５３。実測値ｍ／ｚ：（＋）４３７（Ｍ＋１）＋；（－）４３５（Ｍ－１）－。
工程Ｂ．
７－［３－（ｔ－ブチルオキシカルボニル）プロピル］アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン（ＩＩＩ－１－４ｔＢｕ、０．７ｇ、１．６０４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）溶液をトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）で処理し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を留去し、残留物を水（１０ｍＬ）で粉砕した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．５９ｇ（９７％）。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３６６．３９。実測値ｍ／ｚ：（＋）３８１（Ｍ＋１）＋；（－）３７９（Ｍ－１）－。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１２．１７（ｓ、１Ｈ）、９．０１（ｓ、１Ｈ）、８．１２（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．９９（ｄ、Ｊ＝８．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．７１（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．４８－７．３０（ｍ、２Ｈ）、６．７３（ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．１Ｈｚ、１Ｈ）、６．５７（ｄ、Ｊ＝２．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．２１（ｑ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．３６（ｄ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．８０（ｐ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）。
実施例３７：化合物ＩＩＩ－１－５：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
実施例３７：化合物ＩＩＩ－１－５：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）クマリン
３－（５－クロロ－ベンゾオキサゾール－２－イル）－７－フルオロ－クマリン（ＦＣ－３、０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）及び６－アミノヘキサン酸（ＡＣ－Ｃ５、０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を、温度１３５℃で７時間撹拌した。６－アミノヘキサン酸（ＡＣ－１、０．１３ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）及びＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）を加え、加熱を１３５℃で５時間継続した。室温で１時間静置した後、淡黄色反応混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率０．０９ｇ（２１％）。生成物の純度、構造、及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４２６．１０。実測値ｍ／ｚ：（＋）４２７（Ｍ＋１）＋；（－）４２５（Ｍ－１）－、８５１（２ Ｍ－１）－。
実施例３８：化合物ＩＩＩ－２Ａ：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン－６－スルホン酸及び化合物ＩＩＩ－２Ｂ：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン－８－スルホン酸
実施例３８：化合物ＩＩＩ－２Ａ：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン－６－スルホン酸及び化合物ＩＩＩ－２Ｂ：７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－（ベンゾチアゾール－２－イル）クマリン－８－スルホン酸
化合物ＩＩＩ－１－１（０．１ｇ、０．２４５ｍｍｏｌ）を、ドライアイス／アセトン浴中で冷却した２０％の発煙硫酸（１ｍＬ）に撹拌しながら少量ずつ添加した。添加が完了した後、混合物を０℃で１時間撹拌し、室温に加温し、次いで室温で２時間撹拌した。溶液を無水エーテル（２５ｍＬ）に注いだ。室温で１時間静置した後、得られた沈殿物を吸引濾過によって回収した。収率７８ｍｇ（６５％）。１Ｈ ＮＭＲ（ｄ６ －ＤＭＳＯ）は、化合物２Ａと少量（約４％）の化合物２Ｂとを示した。
実施例化合物ＩＩＩ－２Ａ、ナトリウム塩：上記の沈殿物を水（２ｍＬ）に再懸濁させ、５ＭのＮａＯＨ溶液を添加することにより、懸濁液のｐＨを約５に調整した。得られた混合物を１０ｍＬのメタノールに注ぎ、懸濁液を濾過した。濾液を蒸発乾固させ、色素をナトリウム塩（ＩＩＩ－２Ａ－Ｎａ）として得た。純度、構造及び組成をＨＰＬＣ、ＮＭＲ、及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４８８．０７。実測値ｍ／ｚ：（＋）４８９（Ｍ＋１）＋；（－）２４３（Ｍ－１）２－、４８７（Ｍ－１）－。
化合物ＩＩＩ－２Ａ及びＩＩＩ－２Ｂのトリエチルアンモニウム塩の調製：化合物ＩＩＩ－１－１（０．４１ｇ、１ｍｍｏｌ）を、ドライアイス／アセトン浴中で冷却した２０％の発煙硫酸（５ｍＬ）に撹拌しながら少量ずつ添加した。添加が完了した後、混合物を０℃で１時間撹拌し、室温に加温し、次いで室温で２時間撹拌した。溶液を無水エーテル（５０ｍＬ）に注いだ。室温で１時間静置した後、有機溶媒層をデカントし、半固体底層をアセトニトリル－水（１：１、１０ｍＬ）に溶解した。２ＭのＴＥＡＢ水溶液を添加することにより、溶液のｐＨを約７．０に調整した。得られた溶液を２０μｍのナイロンフィルターを通して濾過し、異性体を分取ＨＰＬＣによって分離した。異性体の溶液を減圧下で濃縮した後、水（２０μＬ）に再溶解させ、減圧下で溶媒を乾燥させて、トリエチルアンモニウム塩として色素を得た。純度及び組成をＨＰＬＣ及びＬＣＭＳにより確認した。
実施例３９：化合物ＩＩＩ－３ ７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－［５－スルホナト（ベンゾチアゾール－２－イル）－クマリン－６－スルホネートトリエチルアンモニウム塩
実施例３９：化合物ＩＩＩ－３ ７－（５－カルボキシペンチル）アミノ－３－［５－スルホナト（ベンゾチアゾール－２－イル）－クマリン－６－スルホネートトリエチルアンモニウム塩
化合物ＩＩＩ－１－１（０．０８ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ドライアイス／アセトン浴中で冷却した２０％の発煙硫酸（２ｍＬ）に撹拌しながら少量ずつ添加した。添加が完了した後、混合物を０℃で１時間撹拌し、室温に加温し、次いで７０℃で２時間撹拌した。次いで、混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を無水エーテル（３０ｍＬ）に注いだ。室温で１時間撹拌した後、得られた沈殿物を吸引濾過により回収した。収率４３ｍｇ（３８％）。
沈殿物を水（２ｍＬ）に再懸濁させ、２ＭのＴＥＡＢ水溶液を添加することにより、懸濁液のｐＨを約７．５に調整した。得られた混合物を２０μｍのナイロンフィルターを通して濾過し、分取ＨＰＬＣにより精製した。色素画分を減圧下で濃縮し、次いで水（２０μＬ）に再溶解させ、減圧下で溶媒を乾燥させて、ビス－トリエチルアンモニウム塩として色素を得た。純度及び組成をＨＰＬＣ及びＬＣＭＳにより確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５６８．０３。実測値ｍ／ｚ：（＋）５６９（Ｍ＋１）＋。
色素溶液の蛍光強度を、同じスペクトル領域の市販の色素と比較した。結果を表３に示す。これらの色素が、蛍光ベースの解析用で、有意な利点を有していることが示されている。
＊蛍光の励起@４６０ｎｍ
実施例４０：蛍光色素を有する完全官能化ヌクレオチドコンジュゲートの合成の一般手順
実施例４０：蛍光色素を有する完全官能化ヌクレオチドコンジュゲートの合成の一般手順
本明細書に開示されるクマリン蛍光色素が、適切なアミノ置換アデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ）ヌクレオチド誘導体Ａ－ＬＮ３－ＮＨ２又はＣ－ＬＮ３－ＮＨ２に結合された：
以下のアデニンスキームに従って適切な試薬を用いて色素のカルボン酸基を活性化した後、
アデニン結合の一般的な生成物は、以下に示される通りである：
ｆｆＡ－ＬＮ３－Ｄｙｅは、ＬＮ３リンカーを有する完全に機能化されたＡヌクレオチドを指し、本明細書に開示されるクマリン色素で標識化されている。各構造中のＲ基は、コンジュゲーション後のクマリン色素部分を指す。
色素（１０μｍｏｌ）を５ｍＬ丸底フラスコに入れて乾燥させ、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍＬ）に溶解させ、次いで溶媒を減圧下で留去する。この手順を２回繰り返す。乾燥した色素を無水Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、０．２ｍＬ）に室温で溶解させる。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、１．５当量、１５μｍｏｌ、４．５ｍｇ）を色素溶液に添加し、次いで、ＤＩＰＥＡ（３当量、３０μｍｏｌ、３．８ｍｇ、５．２μＬ）をマイクロピペットを介してこの溶液に加える。反応フラスコを窒素ガス下で密封する。反応の進行を、ＴＬＣ（溶離剤アセトニトリル：水＝１：９）及びＨＰＬＣによって監視する。一方、適切なアミノ置換ヌクレオチド誘導体（Ａ－ＬＮ３－ＮＨ２、２０ｍＭ、１．５当量、１５μｍｏｌ、０．７５ｍＬ）の溶液を減圧下で濃縮した後、水（２０μＬ）に再溶解させる。活性化色素のＤＭＡ溶液を、Ｎ－ＬＮ３－ＮＨ２の溶液を入れたフラスコに移す。更にＤＩＰＥＡ（３当量、３０μｍｏｌ、３．８ｍｇ、５．２μＬ）をトリエチルアミン（１μＬ）と共に添加する。カップリングの進行を、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、及びＬＣＭＳにより毎時モニタリングする。反応が完了したら、トリエチルアミン重炭酸塩緩衝液（ＴＥＡＢ、０．０５Ｍ、約３ｍＬ）をピペットを介して反応混合物に添加する。完全に官能化されたヌクレオチドの初期精製は、クエンチ反応混合物を、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムを通して、残っている未反応色素の大部分を除去することによって行われる。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘが、空の２５ｇのＢｉｏｔａｇｅカートリッジ、溶媒系ＴＥＡＢ／ＭｅＣＮに注がれる。Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムからの溶液を減圧下で濃縮する。残りの材料を、最小体積の水及びアセトニトリルに再溶解させ、その後で、２０μｍのナイロンフィルターを通して濾過する。濾過溶液を、分取ＨＰＬＣによって精製する。調製された化合物の組成をＬＣＭＳにより確認した。
同じスペクトル領域の市販の色素（ＡｔｔｏＴｅｃ ＧｍｂＨから市販のＡｔｔｏ４６５）で標識化されたヌクレオチドについての適切なデータと、本明細書に開示される色素で標識化されたヌクレオチドの溶液における蛍光強度の比較をすると、蛍光ベースの解析用途で使用するための生体分子の標識について本明細書に記載される色素の利点が示される。
Ａ．赤色及び緑色の色素の例
Ａ．赤色及び緑色の色素の例
本開示のいくつかの態様は、式（Ｖ）の化合物又はそのメソメリー形態を提供する。
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｐは整数１～２であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立して、アルキル又は置換アルキルである。
ｍは整数０～３であり、
ｐは整数１～２であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立して、アルキル又は置換アルキルである。
いくつかの態様では、Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立してアルキル又は置換アルキルであり、Ｒａ１又はＲａ２のうちの少なくとも１つがＳＯ３
－であるか、又はＲａ１又はＲａ２は、隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、ＳＯ３
－を有する更なる環、又はＲｃ１若しくはＲｃ２は、アルキルスルホン酸基である。いくつかの態様では、Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立してアルキル又は置換アルキルであり、ｎが０であるとき、ＹはＳ又はＯである。いくつかの態様では、Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立してアルキル又は置換アルキルであり、式中、Ｒａ１又はＲａ２のうちの少なくとも１つはＳＯ３
－であるか、又はＲａ１若しくはＲａ２が、隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、ＳＯ３
－を有する更なる環、又はＲｃ１若しくはＲｃ２がアルキルスルホン酸基であり、ｎが０である場合、ＹはＳ又はＯである。
分子は、位置Ｒａに１つ以上のスルホンアミド又はＳＯ３
－部分を含有してもよい。Ｒａ１及び／又はＲａ２は、ＳＯ３
－又はスルホンアミドであってもよい。他方のＲａ（Ｒａ１又はＲａ２）は、独立して、Ｈ、ＳＯ３
－、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であってもよい。Ｒａ１又はＲａ２は、Ｈであり得る。Ｒａ１又はＲａ２は、ＳＯ３
－であり得る。Ｒａ１はＲａ２と異なっていてもよく、例えば、構造はＲａ１で単一のスルホンアミド基を有し、Ｒａ２ではＨを有することができる。Ｒａ１及びＲａ２は両方ともスルホンアミドであってもよい。スルホンアミドは、ＳＯ２ＮＨ２又はＳＯ２ＮＨＲであってよく、式中、Ｒはアルキル基、置換アルキル基、アリール基、又は置換アリール基である。Ｒａ１又はＲａ２のいずれも、ＳＯ３
－ではなく、また、隣接する炭素原子に縮合した更なる環でもないという場合には、Ｒｃ１又はＲｃ２が、アルキルスルホン酸基でなければならない。
Ｒａ１又はＲａ２は、インドール環の隣接する炭素に縮合した更なる脂肪族、芳香族又は複素環であり得る。例えば、芳香環が縮合している場合、色素末端基は、次のタイプの構造を表すことができる：
式中、Ｒｄは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、又はスルホン酸であり得る。
したがって、本開示のいくつかの色素は、式（ＶＣ）又は（ＶＤ）又はそのメソ異性体の形態によって記載することができる。
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｐは整数１～２であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立してアルキル又は置換アルキルであり、
Ｒｄは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、又はスルホン酸である。
ｍは整数０～３であり、
ｐは整数１～２であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立してアルキル又は置換アルキルであり、
Ｒｄは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、又はスルホン酸である。
いくつかの態様では、Ｒｄは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、又はスルホン酸であり、Ｒａ１又はＲａ２のうちの少なくとも１つはＳＯ３
－であるか、又はＲｄがｉＳＯ３
－であるか、又はＲｃ１若しくはＲｃ２がアルキルスルホン酸基である。いくつかの態様では、Ｒｄは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、又はスルホン酸であり、ｎが０である場合、ＹはＳ又はＯである。いくつかの態様では、Ｒｄは、Ｈ、アルキル、置換アルキルであり、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、又はスルホン酸であって、Ｒａ１又はＲａ２のうちの少なくとも１つがＳＯ３
－であるか、又はＲｄがＳＯ３
－であるか、又はＲｃ１若しくはＲｃ２がアルキルスルホン酸基であり、ｎが０である場合、ＹはＳ又はＯである。
式（ＶＣ）又は（ＶＤ）において、インドール環の隣接する炭素原子に縮合した追加の環は、例えばスルホン酸又はスルホンアミドで任意に置換されてもよい。
Ｃ（＝Ｏ）－Ｘカルボキシ基又はその誘導体は、長さｑのアルキル鎖によってインドール窒素原子に結合し、式中、ｑは１～５炭素又はヘテロ原子である。鎖は（ＣＨ２）ｑであってよく、式中、ｑは１～５である。基は、（ＣＨ２）５ＣＯＯＨであってもよい。
分子は、位置Ｒｃに１つ以上のアルキル－スルホネート部分を含有することができる。Ｒｃ１及び／又はＲｃ２のいずれかは、アルキル－ＳＯ３
－であってもよい。他のＲｃ（Ｒｃ１又はＲｃ２）は、独立してアルキル又は置換アルキルであり得る。Ｒｃ１及びＲｃ２は、独立して、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、又は（ＣＨ２）ｔＳＯ３Ｈであってもよく、式中、ｔは１～６である。ｔは、１～４であってよく、またｔは４であってもよい。Ｒｃ１及びＲｃ２は、置換アルキル基であってもよい。Ｒｃ１及びＲｃ２は、ＣＯＯＨ又は－ＳＯ３Ｈ部分又はそれらのエステル又はアミド誘導体を含有してもよい。
特定の実施形態では、Ｒａ１又はＲａ２のうちの一方がＳＯ３
－であり、Ｒａ１又はＲａ２の他方がＨ又はＳＯ３
－である場合、Ｒｃ１又はＲｃ２のいずれかも、アルキルスルホン酸基であり得る。
Ｃ（＝Ｏ）－Ｘとして示されるＣＯＯＨ基は、更なる結合のための連結部分として作用し得るか、又は更なる分子に連結される。コンジュゲートが生じた後、ＣＯＯＨ又はＣＯＯ－はアミド又はエステルに変換される。
化合物の例としては、式（ＶＩ）又は（ＶＩａ）による構造又はそのメソ異性体が挙げられる：
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｐは整数１～２であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立して、アルキル又は置換アルキルである。
ｍは整数０～３であり、
ｐは整数１～２であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立して、アルキル又は置換アルキルである。
いくつかの態様では、Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立して、アルキル又は置換アルキルであり、ｎが０のとき、ＹはＳ又はＯである。
化合物の更なる例としては、式（ＶＩＩａ）又は（ＶＩＩｂ）による構造が挙げられる：
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｐは整数１～２であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
ｔは整数１～６であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立して、アルキル又は置換アルキルである。
ｍは整数０～３であり、
ｐは整数１～２であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
ｔは整数１～６であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立して、アルキル又は置換アルキルである。
いくつかの態様では、Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立して、アルキル又は置換アルキルであり、ｎが０のとき、ＹはＳ又はＯである。
化合物の更なる例としては、式（ＶＩＩＩａ）～（ＶＩＩＩｄ）による構造が挙げられる：
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１は、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１は、アルキル又は置換アルキルであり、
Ｒｄは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、又はスルホン酸である。
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートであり、
Ｒａ１は、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｃ１は、アルキル又は置換アルキルであり、
Ｒｄは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ハロゲン、カルボキシ、スルホンアミド、又はスルホン酸である。
化合物の更なる例としては、式（ＩＸａ）～（ＩＸｄ）による構造が挙げられる：
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートである。
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートである。
化合物の更なる例としては、式（Ｘａ）～（Ｘｄ）による構造が挙げられる：
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
Ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
ｔは整数１～６であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートである。
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
Ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する１～５個の炭素原子の鎖であり、
ｔは整数１～６であり、
Ｙは、Ｓ、Ｏ、又はＣＨ２であり、
ＺはＯＨであり、
ｎは整数０～３であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートである。
前述の実施形態では、ａｌｋは、１つ以上の二重結合又は三重結合を任意に含有する、１～５個の炭素原子のアルキル、アルケニル、又はアルキニル鎖である。Ａｌｋは、（ＣＨ２）ｒ基（式中、ｒは１～５である）であり得る。Ａｌｋは、（ＣＨ２）３であり得る。あるいは、炭素鎖は、１つ以上の二重結合又は三重結合を含有してもよい。鎖は、結合－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－を含有してもよく、任意に更なるＣＨ２基を有してもよい。鎖は、結合－ＣＨ２－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ２－を、任意選択的に更なるＣＨ２基と共に含有してもよい。
式Ｖ～ＸＩＩで与えられる実施例のいずれかにおいて、ｑは、５に等しくてもよい。式ＶＩＩ、式Ｘ又は式ＸＩに示される任意の実施例では、ｔは、４に等しくてもよい。式Ｖ～Ｘで与えられる実施例のいずれかにおいて、ｎは、１～３と等しくてもよい。式Ｖ～Ｘで与えられる実施例のいずれかにおいて、ｎは、１に等しくてもよい。式Ｖ～Ｘで与えられる実施例のいずれかにおいて、ｎは整数０～１であり得る。ｎが１である場合、ＯＨ基は、環上の任意の位置にあることができる。ＯＨ基は、４位にあってもよい。ｎが２又は３である場合、ＯＨ基はフェニル環上の任意の位置にあり得る。式Ｖ～Ｘで与えられる実施例のいずれかにおいて、Ｎがゼロである場合、ＹはＯ又はＳに等しく、ＣＨ２ではない。式Ｖ～Ｘで与えられる実施例のいずれかにおいて、Ｙは、Ｏと等しくてもよい。式Ｖ～Ｘで与えられる実施例のいずれかにおいて、Ｙは、Ｏと等しくてもよい。ＹがＯである場合には、ｎは０～３であり得る。ＹがＣＨ２である場合、ｎは１～３であり得る。
化合物の更なる例としては、式（ＸＩａ）～（ＸＩｄ）による構造が挙げられる：
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
ｒは整数１～５であり、
ｔは整数１～６であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートである。
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
ｒは整数１～５であり、
ｔは整数１～６であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートである。
化合物の更なる例としては、式（ＸＩＩａ）～（ＸＩＩｄ）による構造が挙げられる：
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
ｒは整数１～５であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートである。
ｍは整数０～３であり、
ｑは整数１～５であり、
ｒは整数１～５であり、
Ｘは、ＯＨ又はＯ－又はこれらのアミド若しくはエステルコンジュゲートである。
式ＸＩ～ＸＩＩで与えられる実施例のいずれかにおいて、ｒは、３と等しくてもよい。
特に有用な化合物は、本明細書に記載の色素で標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、アルキル－カルボキシ基を介してインドールの窒素原子に結合してアミドを形成してもよい。標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ピリミジン塩基のＣ５位置に取り付けられた標識、又は７デアザプリン塩基のＣ７位置にリンカー部分を介して取り付けられた標識を有してもよい。
標識化されたヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖に共有結合したブロッキング基を有してもよい。ブロッキング基は、リボース糖又はデオキシリボース糖上の任意の位置に付着されてもよい。特定の実施形態では、ブロッキング基は、ヌクレオチドのリボース糖又はデオキシリボース糖の３’ＯＨ位置にある。
本明細書では、少なくとも１つのヌクレオチドが、本開示の化合物で標識化されたヌクレオチドである、２つ以上のヌクレオチドを含むキットが提供される。キットは、２つ以上の標識化されたヌクレオチドを含んでもよい。ヌクレオチドは、２つ以上の蛍光標識で標識化されてもよい。ラベルのうちの２つ以上は、レーザーであってもよい単一の励起源を用いて励起されてもよい。例えば、２つ以上の標識の励起帯は、スペクトルの重複領域における励起が両方の標識を蛍光発光させるように少なくとも部分的に重なっていてもよい。特定の実施形態では、２つ以上の標識からの発光は、スペクトルの異なる領域において発生し、その結果、ラベルの少なくとも１つの存在は、発光を光学的に区別することによって決定することができる。
キットは、４つの標識化されたヌクレオチドを含んでもよく、４つのヌクレオチドのうちの第１のヌクレオチドは、本明細書に開示される化合物で標識化される。このようなキットでは、第２、第３、及び第４のヌクレオチドはそれぞれ、第１のヌクレオチド上の標識と任意選択的に異なる化合物で標識化することができ、かつ任意選択的に、互いの標識とは異なる化合物で標識することができる。したがって、化合物のうちの１つ以上は、その化合物が他の化合物と区別可能であるように、異なる吸光度最大値及び／又は放射最大値を有することができる。例えば、各化合物は、各化合物が他の３つの化合物と区別可能であるように、異なる吸光度最大値及び／又は放射最大値を有し得る。最大値以外の吸光度スペクトル及び／又は発光スペクトルの部分は異なる場合があり、これらの差異は、化合物を区別するために利用され得ることが理解されるであろう。キットは、２つ以上の化合物が、６００ｎｍより高い周波数で、異なる吸光度最大値を有するようなものであってもよい。化合物は、６４０ｎｍを超える領域の光を吸収することができる。キットは、本明細書に記載の赤色、緑色、又は青色波長発光化合物のいずれかを含んでもよい。
本明細書に記載される化合物、ヌクレオチド、又はキットは、生物学系（例えば、プロセス又はそのコンポーネントを含む）を検出、測定、又は同定するために使用されてもよい。化合物、ヌクレオチド又はキットを用いることができるいくつかの技術としては、シークエンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合又は細胞機能解析）、又はタンパク質アッセイ（例えば、タンパク質結合アッセイ又はタンパク質活性アッセイ）が挙げられる。その使用は、自動シークエンシング器具などの特定の技術を実行するための自動化器具であってもよい。シークエンシング器具は、異なる波長で動作する２つのレーザーを含んでもよい。
以下に開示されるのは、本開示の化合物を合成する方法である。式（ＸＩＩＩ）及び／又は（ＸＩＩＩ－１）、（ＸＩＩＩ－２）（ＸＩＩＩ－３）若しくは（ＸＩＩＩ－４）の化合物又はその塩を、対称又は非対称のポリメチン色素の合成のための出発物質として使用することができる：
又はその塩であるが、式中、Ｒａ１が、Ｈ、ＳＯ３
－、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、Ｒｃ１は、アルキル又は置換アルキルであり、Ａｒは芳香族基であり、Ｒはアルキル基である。４－ヒドロキシフェニルの具体例が示されている場合、ｎが１より大きい場合には、更なるヒドロキシル基が環上で置換されてもよい。またｒは３に等しくてもよい。
以下に開示されるのは、本開示の化合物を合成する方法である。式（ＸＩＩＩ－５）の化合物又はその塩を、対称又は非対称ポリメタイン色素の合成のための出発物質として使用することができる：
本開示の更なる態様は、式（ＸＩＶ）のポリメチン色素化合物又はそのメソメリー形態を提供する。
式中、ｍＣａｔ＋又はｍＡｎ－は、有機又は無機の正／負に帯電した対イオンであり、
ｍは整数０～３であり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｂは、置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のアルキルであり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立してアルキル又は置換アルキルであり、
Ｒｂ又はＲｃ１若しくはＲｃ２のうちの１つのいずれかは、更なる結合のための連結部分を含み、又は更なる分子に連結されている。
ｍは整数０～３であり、
Ｒａ１及びＲａ２のそれぞれは、独立して、Ｈ、ＳＯ３ －、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｂは、置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のアルキルであり、
Ｒｃ１及びＲｃ２のそれぞれは、独立してアルキル又は置換アルキルであり、
Ｒｂ又はＲｃ１若しくはＲｃ２のうちの１つのいずれかは、更なる結合のための連結部分を含み、又は更なる分子に連結されている。
各Ｒａ１又はＲａ２は、独立して、Ｈ、ＳＯ３
－、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であってもよい。Ｒａ１又はＲａ２は、Ｈであり得る。Ｒａ１又はＲａ２は、ＳＯ３
－であり得る。Ｒａ１はＲａ２と異なっていてもよく、例えば、構造はＲａ１で単一のスルホン酸基を有し、Ｒａ２ではＨを有することができる。Ｒａ１又はＲａ２は、スルホンアミドであってもよい。スルホンアミドは、ＳＯ２ＮＨ２又はＳＯ２ＮＨＲであってよく、式中、Ｒはアルキル基、置換アルキル基、アリール基、又は置換アリール基である。
Ｒａ１又はＲａ２は、インドール環の隣接する炭素に縮合した更なる脂肪族、芳香族又は複素環であり得る。例えば、芳香環が縮合している場合、色素末端基は、次のタイプの構造を表すことができる：
したがって、本開示の色素は、式（ＸＩＶＡ）、（ＸＩＶＢ）又は（ＸＩＶＣ）によって記載することができる。
式（ＸＩＶＡ）、（ＸＩＶＢ）及び（ＸＩＶＣ）において、インドール環の隣接する炭素原子に縮合した１つ又は両方の追加の環は、例えばスルホン酸又はスルホンアミドで任意に置換されてもよい。
化合物は、Ｒａ基のうちの１つが、式（ＸＶ）の構造を形成する更なる縮合環であり、
式中、Ｒａ３は、Ｈ、ＳＯ３
－、スルホンアミド、又はハロゲンであり、
Ｒｃ１は、アルキル又は置換アルキルである。
Ｒｃ１は、アルキル又は置換アルキルである。
Ｒｂは、置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のアルキルであり得る。Ｒｂは、アルキルであってもよい。Ｒｂは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、又はヘキシルであり得る。アルキル鎖は、例えば、カルボキシ基又はスルホン基で更に置換され得る。Ｒｂは、更なるコンジュゲーションのために使用することができる。例えば、ＲｂがＣＯＯＨ部分を含有する場合、ラベルを取り付けるために、これを更なる分子と結合させることができる。生体分子、タンパク質、ＤＮＡ標識等の場合、コンジュゲーションは、Ｒｂを介して行うことができる。Ｒｂは、コンジュゲ－ションが生じた後に、アミド又はエステル誘導体を形成することができる。化合物は、Ｒｂを介してヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。
Ｒｂは、アリール又は置換アリールであってもよい。Ｒｂはフェニルであってもよい。
各Ｒｃ１及びＲｃ２は、独立してアルキル又は置換アルキルであり得る。Ｒｃ１及びＲｃ２は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、又は（ＣＨ２）ｑＳＯ３Ｈであってよく、式中、ｑは１～６である。またｑは、１～３であってもよい。Ｒｃ１及びＲｃ２は、置換アルキル基であってもよい。Ｒｃ１及びＲｃ２は、ＣＯＯＨ又は－ＳＯ３Ｈ部分又はそれらのエステル又はアミド誘導体を含有してもよい。
Ｒｂ又はＲｃ１若しくはＲｃ２のいずれかは、更なる結合のための連結部分を含み、又は更なる分子に連結されている。Ｒｂ又はＲｃ１若しくはＲｃ２は、カルボキシ又はカルボキシレート（ＣＯＯＨ又はＣＯＯ－）部分を含有してもよい。コンジュゲ－ションが生じた後、Ｒｂ又はＲｃ１若しくはＲｃ２は、アミド又はエステルを含有してもよい。
化合物の例としては、以下が挙げられる：
又はその塩である。
以下に開示されるのは、本開示の化合物を合成する方法である。式（ＸＶＩ）及び／若しくは（ＸＶＩ１）、（ＸＶＩ２）の化合物又はその塩は、対称又は非対称のポリメチン色素の合成のための出発物質として使用することができる：
式中、Ｒａは、Ｈ、ＳＯ３
－、スルホンアミド、ハロゲン、又は隣接する炭素原子に縮合した更なる環であり、
Ｒｂは、置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のアルキルであり、
Ｒｃは、アルキル又は置換アルキルである。
Ｒｂは、置換若しくは無置換のアリール又は置換若しくは無置換のアルキルであり、
Ｒｃは、アルキル又は置換アルキルである。
特定の励起波長は、５３２ｎｍ、６３０ｎｍ～７００ｎｍ、特に６６０ｎｍであり得る。
実施例４１：化合物ＸＶＩＩ：２，３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート
実施例４１：化合物ＸＶＩＩ：２，３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート
２－メチレン－３，３－トリメチル－１－フェニル－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドール（１ｇ、４．２５ｍｍｏｌ）を、５℃未満の温度で１ｍＬの硫酸に溶解させ、撹拌しながら１ｍＬの発煙硫酸（２０％）を添加した。溶液を室温で１時間撹拌した後、６０℃で３時間加熱した。生成物をジエチルエーテルで沈殿させ、アセトン及びエタノールで洗浄した。収率０．７ｇ（５２％）。構造をＮＭＲにより確認した。
実施例４２：化合物ＸＶＩＩＩ：２－（２－アニリノビニル－１）－３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート
実施例４２：化合物ＸＶＩＩＩ：２－（２－アニリノビニル－１）－３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート
反応スキーム：
２，３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート（０．６３ｇ）及びエチルＮ－フェニルホルムイミデート（０．５ｇ）の混合物を、７０℃で３０分間加熱した。形成された橙色溶融物が形成された。生成物をジエチルエーテルで粉砕し、濾過した。収率０．７ｇ（８４％）。
実施例４３：化合物ＸＩＸ：２－（２－アセトアニドビニル－１）－３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホン酸
実施例４３：化合物ＸＩＸ：２－（２－アセトアニドビニル－１）－３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホン酸
反応スキーム：
２，３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート（０．６３ｇ）、Ｎ，Ｎ－ジフェニルホルムイミジン（０．５ｇ）、酢酸（１ｍＬ）及び無水酢酸（２ｍＬ）の混合物を７０℃で３時間加熱した後、５０℃で一晩加熱した。黄色溶液が形成された。生成物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。収率０．６９ｇ（７５％）。
実施例４４：化合物ＸＸ：１，２－ジメチル－１－（４－スルホナトブチル）－３－フェニル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドリウム
実施例４４：化合物ＸＸ：１，２－ジメチル－１－（４－スルホナトブチル）－３－フェニル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドリウム
反応スキーム：
無水エタノール（３０ｍＬ）中に、Ｎ－（２－ナフチル），Ｎ－フェニルヒドラジンヒドロクロリド（１９．５１ｍｍｏｌ、５．２８ｇ）、５－メチル－６－オキソヘプタスルホン酸（１７．１８ｍｍｏｌ、３．７０ｇ）及び無水ＺｎＣｌ２（１７．１８ｍｍｏｌ、２．３４ｇ）を加え、室温で３０分間撹拌した後、８０℃で２時間撹拌した。反応進行をＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ中１０％Ｈ２Ｏ）によって確認した。完了後、反応物を冷却し、溶媒を真空下で除去した。残渣をＤＣＭに溶解し、シリカゲル上のフラッシュカラムにより精製した。収率：３．０６ｇ、４２％。
プロトンＮＭＲ：（ＭｅＯＨ－Ｄ４）：８．２８（０．５Ｈ、ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）；８．０５～８．０２（１Ｈ，ｍ）；７．８９（０．５Ｈ、ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）；７．７５～７．６６（３Ｈ、ｍ）；７．６５～７．６０（１Ｈ、ｍ）；１．４９～１．４３（１．５Ｈ、ｍ）；７．３１～７．２５（２Ｈ、ｍ）；７．１６（．５Ｈ、ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ）；７．０７（．５Ｈ、ａｐｐｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、６．６１（０．５Ｈ、ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ）；２．８５～２．３５（４Ｈ、ｍ）；１．８８（３Ｈ、ａｐｐｄ、Ｊ＝９Ｈｚ）；１．７５～１．４（５Ｈ、ｍ）；１．３５～１．２５（０．５Ｈ、ｍ）；１．１～０．９５（０．５Ｈ、ｍ）；０．８～０．６５（０．５Ｈ、ｍ）；０．５８～０．４５（０．５Ｈ、ｍ）。
実施例４５：化合物ＸＸＩ：１、２－ジメチル－１－（３－スルホナトプロピル）－３－フェニル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドリウム
実施例４５：化合物ＸＸＩ：１、２－ジメチル－１－（３－スルホナトプロピル）－３－フェニル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドリウム
反応スキーム：
Ｎ－（２－ナフチル）－Ｎ－フェニルヒドラジンヒドロクロリド及び４－メチル－５－オキソペンタンスルホン酸から、従来の化合物として表題化合物を調製した。生成物を、シリカゲル上のフラッシュカラムによって精製した。収量：４０％．構造がＮＭＲスペクトルにより確認された。
実施例４６：化合物ＸＸＩＩ ２，３－ジメチル－３－（４－スルホナトブチル）－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム
実施例４６：化合物ＸＸＩＩ ２，３－ジメチル－３－（４－スルホナトブチル）－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム
反応スキーム：
Ｎ，Ｎ－ジフェニルヒドラジンヒドロクロリド（０．０１ｍｏｌ、２．２ｇ）、５－メチル－６－オキソヘプタスルホン酸（０．０１７ｍｏｌ、３．０ｇ）を氷酢酸（２０ｍＬ）中で室温（約２０℃）で１時間撹拌した後、１００℃で３時間撹拌した（ＴＬＣチェック）。反応混合物を冷却し、溶媒を真空下で除去した。残留物をジエチルエーテルで洗浄し、シリカゲル上のフラッシュカラムにより精製した。収量：２ｇ（５６％）。構造がＮＭＲスペクトルにより確認された。
実施例４７：化合物ＸＸＩＩＩ：インドカルボシアニン
実施例４７：化合物ＸＸＩＩＩ：インドカルボシアニン
化学名：２－｛（５－［１－フェニル－３，３－ジメチル）－１，２－ジヒドロ－３Ｈ－インドール－２－イリデン］－１－プロペン－１－イル｝－３，３－ジメチル－１－（５－カルボキシペンチル）－インドリウム－５－スルホネート。
反応スキーム：
無水酢酸（２ｍＬ）と酢酸（１ｍＬ）との混合物中の３，３－ジメチル－１－（５－カルボキシペンチル－２－（４－アニリノビニル）－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート（０．４６ｇ）及び２，３，３－トリメチル－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム過塩素酸塩（０．３４ｇ）を、室温（約２５℃）で０．５時間撹拌した。次に、この溶液にピリジン（０．５ｍＬ）を添加した。反応混合物を８０℃で３時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ中２０％Ｈ２Ｏ）及びＵＶ測定により確認した。反応が終了すると、赤色の着色混合物を冷却し、溶媒を真空下で除去した。残渣をＣ１８フラッシュカラム（水及びアセトニトリル中のＴＥＡＢ ０．１Ｍ）により精製した。収量：０．３３ｇ（５５％）。
実施例４８：化合物ＸＸＩＶ：インドカルボシアニン
実施例４８：化合物ＸＸＩＶ：インドカルボシアニン
化学名：トリエチルアンモニウム２－｛（５－［（４－スルホナトブチル）－１－フェニル－３－メチル）－１，２－ジヒドロ－３Ｈ－インドール－２－イリデン］－１－プロペン－１－イル｝－３，３－ジメチル－１－（５－カルボキシペンチル）－インドリウム－５－スルホネート。
反応スキーム：
無水酢酸（２ｍＬ）と酢酸（１ｍＬ）との混合物中の３，３－ジメチル－１－（５－カルボキシペンチル－２－（４－アニリノビニル）－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート（０．４６ｇ）及び２，３－ジメチル－３－（４－スルホナトブチル）－１－フェニル－３Ｈ－インドリウム（０．３６ｇ）を、室温（約２５℃）で０．５時間撹拌した。次に、この溶液にピリジン（１ｍＬ）を添加した。反応混合物を８０℃で３時間撹拌し、ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ中２０％Ｈ２Ｏ）とＵＶ測定により反応の完了をチェックした。反応が終了すると、赤色の着色反応混合物を冷却し、溶媒の大部分を真空下で除去した。残渣をＣ１８フラッシュカラム（水及びアセトニトリル中のＴＥＡＢ ０．１Ｍ）により精製した。収量：０．２９ｇ（３５％）。
実施例４９：化合物ＸＸＶ：インドカルボシアニン
実施例４９：化合物ＸＸＶ：インドカルボシアニン
化学名：２－｛（５－［（３－フェニル－１，１－ジメチル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドール－２－イリデン］－１－プロペン－１－イル｝－３，３－ジメチル－１－（５－カルボキシペンチル）－インドリウム－５－スルホネート。
反応スキーム：
無水酢酸（１ｍＬ）と酢酸（１ｍＬ）との混合物中の３，３－ジメチル－１－（５－カルボキシペンチル－２－（４－アニリドビニル）－３Ｈ－インドリウム－５－スルホネート（０．４６ｇ）及び１，１，２－トリメチル－３－フェニル－３Ｈ－インドリウム過塩素酸塩（０．３９ｇ）を、室温（約２５℃）で０．５時間撹拌した。次に、この溶液にピリジン（１ｍＬ）を添加した。反応混合物を６０℃で３時間撹拌し、反応の進行をＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ中２０％Ｈ２Ｏ）／及びＵＶ測定により確認した。反応が終了すると、赤色の着色反応混合物を冷却し、溶媒の大部分を真空下で除去した。残渣をＣ１８フラッシュカラム（水及びアセトニトリル中のＴＥＡＢ ０．１Ｍ）により精製した。収量：０．３８ｇ（５４％）。
実施例５０：化合物ＸＸＶＩ：色素コンジュゲートｐｐｐＴ－Ｉ－２
実施例５０：化合物ＸＸＶＩ：色素コンジュゲートｐｐｐＴ－Ｉ－２
反応スキーム：
調製：無水ＤＭＡ（５ｍＬ）及びヒューニッヒ塩基（０．０６ｍＬ）を、色素（化合物ＸＸＩＩＩ）の乾燥試料（６０ｍｇ）に添加した。次いで、これに５ｍＬの乾燥ＤＭＡ中のＴＳＴＵ（０．２５ｇ）の溶液を添加した。活性化エステルの赤色の色が現れた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨ３ＣＮ中２０％Ｈ２Ｏ）により、活性化が完了した。活性化が完了した後、この溶液を水（７ｍＬ）中ｐｐｐＴ－ＬＮ３（０．２３ｇ）の溶液に添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で室温で３時間撹拌した。カップリングの進行をＴＬＣ（アセトニトリル中２０％Ｈ２Ｏ）により確認した。反応混合物を氷浴で約４℃まで冷却した後、０．１ＭのＴＥＡＢ（５ｍＬ）の水溶液を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を、０．０５ＭのＴＥＡＢ水溶液中の～５０ｇのＤＥＡＥセファヘキサン樹脂懸濁液を用いてカラムに適用し、ＴＥＡＢ（濃度勾配０．１Ｍから最大０．５Ｍ）で洗浄した。着色画分を回収し、蒸発させ、次いで再び水と共蒸発させて、より多くのＴＥＡＢを除去し、乾燥するまで蒸発させた。次いで、残留物を０．１ＭのＴＥＡＢに再溶解させた。この溶液を、シリンジフィルター０．２ｎｍの孔径を用いて三角フラスコに濾過し、冷凍庫に保管した。アセトニトリル－０．１ＭのＴＥＡＢを有するＣ１８逆相カラムを使用して、生成物をＨＰＬＣにより精製した。収率６７％．
実施例５１：化合物ＸＸＶＩＩ：色素コンジュゲートｐｐｐＴ－Ｉ－４
実施例５１：化合物ＸＸＶＩＩ：色素コンジュゲートｐｐｐＴ－Ｉ－４
反応スキーム：
調製：無水ＤＭＡ（５ｍＬ）及びヒューニッヒ塩基（０．０６ｍＬ）を、色素（化合物ＸＸＩＩＩ）（８２ｍｇ）の乾燥試料に添加した。次いで、これに５ｍＬの乾燥ＤＭＡ中のＴＳＴＵ（０．２５ｇ）の溶液を添加した。活性化エステルの赤色の色がすぐに現れた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。活性化が完了した後（ＴＬＣ：ＣＨ３ＣＮ中１５％Ｈ２Ｏ）、この溶液を水（７ｍＬ）中ｐｐｐＴ－ＬＮ３（０．２３ｇ）の溶液に添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で室温で３時間撹拌した。反応混合物を氷浴で約４℃まで冷却した後、０．１ＭのＴＥＡＢ（５ｍＬ）の水溶液を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を、０．０５ＭのＴＥＡＢ溶液中の～７５ｇのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂懸濁液を用いてカラムに適用し、ＴＥＡＢ（０．１０Ｍから最大０．７５Ｍの濃度勾配）で洗浄した。赤色の着色画分を回収し、溶媒を蒸発させた後、残留物を再び水と共蒸発させて、より多くのＴＥＡＢを除去し、乾燥するまで蒸発させた。次いで、色素を０．１ＭのＴＥＡＢに再溶解した。この溶液をシリンジフィルター０．２ｎｍの孔径で濾過し、アセトニトリル－０．１ＭのＴＥＡＢを有するＣ１８逆相カラムを使用して生成物をＨＰＬＣにより精製した。収率７０％。
本明細書全体を通して使用される用語「実質的に」及び「約」は、処理のばらつきなどの小さな変動を説明及び説明するために使用される。例えば、それらは、±５％以下、例えば±２％以下、例えば±１％以下、例えば±０．５％以下、例えば±０．２％以下、例えば±０．１％以下、例えば±０．０５％以下）を指すことができる。また、本明細書で使用するとき、「ａ」又は「ａｎ」などの不定冠詞は、「少なくとも１つ」を意味する。
前述の概念及び更なる概念の全ての組み合わせが、以下でより詳細に考察される（かかる概念が相互に矛盾しないことを提供する）は、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられることを理解されたい。具体的には、本開示の終わりに現れる特許請求される主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示される発明の主題の一部であると考えられる。
いくつかの実施形態が説明された。それにもかかわらず、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。
加えて、図に描示される論理フローは、所望の結果を達成するために、示される特定の順序、又は連続的な順序を必要としない。加えて、記載されたフローから他の工程を提供することができ、又は工程を排除することができ、記載されたシステムに他のコンポーネントを追加するか、又はそこから除去することができる。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
記載された実施形態の特定の特徴が本明細書に記載されるように例示されているが、当業者には多くの修正、置換、変更、及び等価物が思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、実施形態の範囲内に含まれるような、そのような修正及び変更の全てを網羅することを意図するものであることを理解されたい。これらは単なる例として提示されており、限定するものではなく、形態及び詳細の様々な変更がなされ得ることを理解されたい。本明細書に記載される装置及び／又は方法の任意の部分は、相互に排他的な組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に記載される実施形態は、説明される異なる実施形態の機能、コンポーネント、及び／又は特徴の様々な組み合わせ及び／又は部分的組み合わせを含むことができる。
Claims (20)
- 第１のヌクレオチド及び第２のヌクレオチドを含む試料を提供することと、
前記試料を第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素と接触させて、前記第１の蛍光色素には、第１の励起照明光に応答して、第１の波長帯内で第１の放射光を放射させ、前記第２の蛍光色素には、第２の励起照明光に応答して、第２の波長帯内で第２の放射光を放射させることと、
１つ以上の画像検出器を使用して、前記第１の放射光及び前記第２の放射光を含む多重化蛍光光を同時に収集することであって、前記第１の放射光が、前記第１の波長帯に対応する第１の色チャネルであり、前記第２の放射光が前記第２の波長帯に対応する第２の色チャネルであることと、
前記第１の色チャネルの前記第１の波長帯に基づいて、前記第１のヌクレオチドを同定し、前記第２の色チャネルの前記第２の波長帯に基づいて、前記第２のヌクレオチドを同定することと、を含む方法。 - 前記第１の波長帯が青色に対応し、前記第２の波長帯が緑色に対応する、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の波長帯が、約４５０ｎｍ～約５２５ｎｍの範囲内に含まれ、前記第２の波長帯が、約５２５ｎｍ～約６５０ｎｍの範囲内に含まれる、請求項１又は２に記載の方法。
- 第１の平均又はピーク波長が、前記第１の蛍光色素の第１の発光スペクトルについて定義され、
第２の平均又はピーク波長が、前記第２の蛍光色素の第２の発光スペクトルについて定義され、
前記第１の平均波長及び前記第２の平均波長又はピーク波長は、互いから少なくとも所定の分離を有する、
請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第１の波長帯が前記第２の波長帯よりも短い波長を有し、前記第２の波長帯は第１の波長に関連づけられ、前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素との間の波長放射分離は、前記第１の蛍光色素の発光スペクトルが、前記第１の波長以上の光を、最大で所定の量含むように定義される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多重化蛍光光を同時に収集することが、
前記第１の色チャネルのための第１の光学サブシステムを使用して前記第１の放射光を検出することと、
前記第２の色チャネルのための第２の光学サブシステムを使用して前記第２の放射光を検出することと、
を含み、
発光ダイクロイックフィルタが、前記第１の色チャネルの前記第１の放射光を前記第１の光学サブシステムに方向付け、かつ前記第２の色チャネルの前記第２の放射光を前記第２の光学サブシステムに方向付ける、
請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第１の光学サブシステム及び前記第２の光学サブシステムのうちの少なくとも１つが、曲がった光路を含む、請求項６に記載の方法。
- 前記第１の蛍光色素の発光スペクトルが、前記第１の波長帯のピークを有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、第３のヌクレオチドを更に含み、
前記方法が、
前記試料を、第３の蛍光色素と接触させて、前記第１の励起照明光に応答して、前記第１の波長帯内で、前記多重化蛍光光に含まれる第３の放射光を放射させ、かつ前記第２の励起照明光に応答して、前記第２の波長帯内で、前記多重化蛍光光に含まれる第４の放射光を放射させることと、
前記第１の色チャネルの前記第１の波長帯及び前記第２の色チャネルの前記第２の波長帯に基づいて、前記第３のヌクレオチドを同定することと、
を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 - 前記試料が、第３のヌクレオチドを更に含み、
前記方法が、
前記試料を前記第３の蛍光色素と接触させ、前記第３の蛍光色素に、第３の励起照明光に応答して、第３の波長帯内で、前記多重化蛍光光に含まれる第３の放射光を放射させることと、前記第３の波長帯に基づいて前記第３のヌクレオチドを同定することと、を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。 - フローセルであって、
第１の励起照明光に応答して第１の波長帯内で第１の放射光を放射する第１の蛍光色素に結合された第１のヌクレオチド、及び
第２の励起照明光に応答して第２の波長帯内で第２の放射光を放射する第２の蛍光色素に結合された第２のヌクレオチド、
を含む試料を含有するフローセルと、
前記第１の励起照明光及び前記第２の励起照明光を前記フローセルに同時に提供する照明光システムと、
前記第１の放射光及び前記第２の放射光を含む多重化蛍光光を同時に集光する集光システムであって、前記第１の放射光が、前記第１の波長帯に対応する第１の色チャネルであり、前記第２の放射光が、前記第２の波長帯に対応する第２の色チャネルである、集光システムと
を備える装置。 - 前記第１の波長帯が青色に対応し、前記第２の波長帯が緑色に対応する、請求項１１に記載の装置。
- 前記第１の波長帯が、約４５０ｎｍ～約５２５ｎｍの範囲内に含まれ、前記第２の波長帯が、約５２５ｎｍ～約６５０ｎｍの範囲内に含まれる、請求項１１又は１２に記載の装置。
- 第１の平均又はピーク波長が、前記第１の蛍光色素の第１の発光スペクトルについて定義され、第２の平均又はピーク波長が、前記第２の蛍光色素の第２の発光スペクトルについて定義され、前記第１及び第２の平均又はピーク波長は、互いに少なくとも所定の分離を有する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の装置。
- 前記第１の波長帯が前記第２の波長帯よりも短い波長を有し、
前記第２の波長帯は第１の波長に関連づけられ、
前記第１の蛍光色素と前記第２の蛍光色素との間の波長放射分離は、前記第１の蛍光色素の発光スペクトルが、前記第１の波長以上の光を、最大で所定の量含むように定義される、
請求項１１～１４のいずれか一項に記載の装置。 - 前記集光システムが、
前記第１の放射光を検出する前記第１の色チャネルのための第１の光学サブシステムと、
前記第２の放射光を検出する前記第２の色チャネルのための第２の光学サブシステムと、
を備え、
発光ダイクロイックフィルタが、前記第１の色チャネルの前記第１の放射光を前記第１の光学サブシステムに、前記第２の色チャネルの前記第２の放射光を前記第２の光学サブシステムに方向付ける、
請求項１１～１５のいずれか一項に記載の装置。 - 前記第１の光学サブシステム及び前記第２の光学サブシステムのうちの少なくとも１つが、曲がった光路を含む、請求項１６に記載の装置。
- 前記第１の蛍光色素の発光スペクトルが、前記第１の波長帯にピークを有する、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の装置。
- 前記試料が、前記第１の励起照明光に応答して前記第１の波長帯内で第３の放射光を放射し、かつ前記第２の励起照明光に応答して前記第２の波長帯内で第４の放射光を放射する第３の蛍光色素に結合された第３のヌクレオチドを更に含み、
前記多重化蛍光光が、第３の放射光及び第４の放射光を更に含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の装置。 - 前記試料が、第３の励起照明光に応答して第３の波長帯内で第３の放射光を放射する第３の蛍光色素に結合された第３のヌクレオチドを更に含み、
前記多重化蛍光光が、前記第３の放射光を更に含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の装置。
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