KR20210130002A - 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 질환 예방용 백신 조성물 - Google Patents
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 질환 예방용 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD 도메인을 이용한 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백신 조성물은 동물에서 대량 생산 가능하며, 항원으로써 항체 생성을 효과적으로 유도할 수 있을 뿐만 아니라 백신으로써 질환의 예방에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 사스 코로나바이러스 2의 스파이크의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain)을 포함하는 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
신종 급성 호흡기 증후군은 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 의한 호흡기 감염증이다. SARS-CoV-2는 2019년 12월 23일에 중국 우한에서 새로 발견된 단일 가닥 RNA의 신종 베타코로나 바이러스로 2020년 1월 국제바이러스 분류 위원회에서 SARS-CoV-2 라 명명하였다. 이러한 SARS-CoV-2의 감염경로는 아직 명확하게 규명되지 않았으나, 일부 연구에 따르면 박쥐로부터 사람에게 감염되는 것으로 보고되고 있다.
SARS-CoV-2의 유전체는 비분절 형태이며 크기는 약 30 kb로 10개의 단백질을 encoding하고 있다. 10개의 단백질은 한 개의 복제 polyproteins(open reading frames 1ab), 4개의 구조 단백질 (spike, envelope, membrane and nucleocapsid), 5개의 non-structural 단백질(open reading frames 3a, 6, 7a, 8 and 10)로 구성되어 있다.
SARS-CoV-2는 사람 간의 전염이 가능하며 상당히 높은 치사율을 보이고 있어 국내외로 큰 문제가 되고 있다. 2020년 3월 16 일, 167,511 건의 환자가 발생했으며, 그 중 13,908명의 환자가 사망하였음이 WHO에 보고되었으며, 현재도 그 사망자가 급속하게 증가하고 있는 추세이다.
국내에서는 2019년 1월 중국에서 입국한 36세 여성에서 최초 SARS-CoV-2 감염이 확인되었으며, 2020년 3월 17일까지 SARS-CoV-2 감염 확진자가 발생하여 8,320명의 SARS-CoV-2 감염자가 확진되었고, 286,716명의 격리자가 발생하였다.
2019년 중국에서의 첫 발견 이후 중국지역에서 집중적으로 발병하였으며, 2020년 한국, 일본, 이탈리아 등 160 개 이상의 국가에서 감염자가 발생하여 높은 전파율을 보인 SARS-CoV-2는 감염 시 호흡기뿐만 아니라 폐렴이나 급성신부전 등의 합병증을 동반하는 문제가 있으며, 높은 치사율 및 전염성으로 인해 큰 문제를 발생시키고 있다.
이에 따라, 기존의 사스 코로나 바이러스의 연구를 바탕으로 하거나 기타의 바이러스에 대한 연구를 바탕으로 하여 백신 개발을 진행하고 있다. 현재에도 다양한 SARS-CoV-2 백신이 개발 중이나 사용이 승인된 백신이나 치료제는 없다. 국내외에서 신규 환자가 지속적으로 발생하고 있는 문제를 고려할 때, 이를 예방하기 위한 백신의 개발이 매우 시급하다.
본 연구자들은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 백신으로 바이러스의 스파이크(Spike) 영역의 Receptor binding domain(RBD) 재조합 단백질을 기반으로 신규의 백신을 개발하려고 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 스파이크의 수용체 결합 도메인 단백질을 항원 단백질로 사용하여 사스 코로나바이러스 2 감염 질환 예방용 백신 조성물을 제조하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 스파이크 단백질의 수용체 결합도메인 단백질 또는 이의 단편을 인간을 제외한 동물에 주입하는 단계; 및
(b) 상기 동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염에 따른 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편을 제공한다.
중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 막 바깥표면에 돌기형태의 단백질(스파이크 단백질)이 촘촘히 달려있는데, 이 스파이크 단백질은 숙주세포의 ACE2 수용체에 결합하여 바이러스가 숙주세포로 빠르게 침투하도록 지지해준다. 이 스파이크단백질이 숙주의 특이성, 선택성, 감염성을 결정하며, ACE2는 사람의 혀, 호흡기, 장내 상피세포막에 다량 존재한다. 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain)는 ACE2 수용체와 결합하는 부분이다.
본 발명에 따른 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 또는 이의 단편은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain)는 스파이크 단백질 전체 서열 중 323 내지 532 번째 서열을 언급하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain)의 구조 예측에 기반을 둔 단백질 구조 분석을 통해 RBD 단백질의 구조를 분석하여, RBD 단백질의 일부 서열을 선택하였다. 이러한 선택된 아미노산 서열은 RBD의 다른 영역과 대비하여 구조적 안정성이 매우 우수할 뿐만 아니라 항원으로써 작용 효과 또한 타 부위와 대비하여 현저히 우수하다는 차이점을 가진다.
본 발명은 또한 서열번호 2와 동일한 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산이 보존적 치환에 의하여 치환된 폴리펩타이드, 이와 80 내지 99%, 85 내지 99%, 바람직하게는 90 내지 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다.
상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질 또는 이의 단편의 RBD(Receptor-Binding Domain)는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질 전장 서열의 323번 내지 532 번 위치의 아미노산 서열을 갖거나 이로 이루어지는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명에서는 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 기초로 하여, 서열번호 4의 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인의 재조합 단백질을 제조하였다.
이에 따라, 본 발명에서는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 또는 이의 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 RBD(Receptor-Binding Domain) 또는 이의 단편은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖거나 이로 이루어지는 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 서열번호 4와 동일한 폴리펩타이드 뿐만 아니라 이의 아미노산이 보존적 치환에 의하여 치환된 폴리펩타이드, 이와 80 내지 99%, 85 내지 99%, 바람직하게는 90 내지 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "보존적 치환"이란, 한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다. 보존적 치환은 폴리펩타이드의 구조, 기능 또는 두 가지 모두를 변경시키지 않는다. 보존적 치환의 목적을 위한 아미노산의 부류는 소수성(예를 들어, Met, Ala, Val, Leu), 중성 친수성(예를 들어, Cys, Ser, Thr), 산성(예를 들어, Asp, Glu), 염기성(예를 들어, Asn, Gln, His, Lys, Arg), 입체 형태 파괴물질 (disrupter)(예를 들어, Gly, Pro) 및 방향족(예를 들어, Trp, Tyr, Phe)을 포함한다.
본 발명에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열로 코딩되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 3의 염기서열로 코딩되는 것일 수 있다.
본 발명에서는 상기 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편의 변이체를 포함한다.
본 발명에서, "변이체"는 야생형 단백질 또는 이의 단편과 비교하여 대립유전자의 변이를 포함하여 하나(또는 그 이상)의 아미노산으로부터 또는 서열에의 치환, 결실 또는 부가(또는 이들의 임의의 조합)을 갖는 임의의 펩타이드(해당 핵산에 의해 암호화되는 펩타이드를 포함하여)를 의미한다. 어떤 구체예에서, 그 결과로 생기는 단백질 또는 이의 단편은 본 발명에서 사용될 때 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 생물학적 활성이 증가할 수 있다.
본 발명에서, "결실"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 없는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로 정의된다.
본 발명에서, "삽입" 또는 "부가"는 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 부가로 인한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.
본 발명에서, "치환"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의해 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체에서 비롯된다.
이에 따라, 본 발명에서는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 발현 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 1을 가진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 서열번호 3을 가진 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에서 사용한 용어, "발현 벡터"란, 서열번호 1 또는 3으로 표시되는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 발현 도메인 또는 이의 단편을 PCR로 증폭한 절편을 제한효소를 이용하여 절단한 벡터에 삽입하여 세포 내에서 유전물질을 발현할 수 있게 제작된 것을 의미한다.
상기 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터일 수 있다. 상기 바이러스성 벡터는 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스, 헬퍼-의존형 아데노바이러스 및 레트로바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 비바이러스성 벡터는 플라스미드, 리포좀 등일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, pcDNA3.4 벡터를 변형시켜 제작한 modified pcDNA3.4 벡터를 BamHI 과 XhoI 제한효소를 이용하여 자른 후, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 PCR로 증폭한 절편을 삽입하여 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 발현 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터를 제작하였다.
또한, 본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 수용체 발현 도메인 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 또한, 상기 발현 벡터로 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
상기 발현 벡터는 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)" 유전자를 포함하며, 이는 목적하는 핵산 서열의 발현이 이루어질 수 있도록 조절 서열에 연결되어 있음을 의미한다.
조절 서열은 프로모터, 인핸서, 개시 코돈, 중단 코돈 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 조절 서열에는 많은 숙주세포에서 목적으로 하는 핵산이 항상적으로 발현될 수 있도록 지시하는 것, 특정한 조직세포에서만 목적으로 하는 핵산이 발현될 수 있도록 지시하는 것(예, 조직특이적 조절 서열), 그리고 특정 신호에 의해 발현이 유도되도록 지시하는 것(예, 유도성 조절 서열)이 포함된다. 발현벡터의 설계는 형질전환될 숙주세포의 선택 및 원하는 단백질 발현의 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 벡터는 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 제조될 수 있으며, 표준 재조합 DNA 기술에는, 예를 들어, 평활말단 및 접착말단 라이게이션, 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 처리, 부적합한 결합을 방지하기 위하여 알칼리 포스테이즈 처리에 의한 인산기 제거 및 T4 DNA 라이게이즈에 의한 효소적 연결 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주세포"란 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 진핵세포는 진균, 효모 등을 포함하는 하등 진핵 세포뿐만 아니라 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포를 포함한다. 적당한 원핵세포들은 대장균 (E. Coli) 또는 고초균(Bacillus subtilis)와 같이 클로닝에 보통 사용되는 세포들이다. 그리고, 진핵세포들은 진균세포(fungus), 식물세포 또는 동물세포들을 포함한다. 적당한 진균세포들의 예로는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 중의 효모일 수 있다. 적당한 동물세포들의 예로는 곤충세포들, 식물세포들, 바람직하게는 포유류 세포들, 예컨대 HEK293, 293T, NSO, CHO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따른 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주세포는 상기 벡터에 의해 유전적으로 변형된 숙주세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "유전적으로 변형된(genetically modified)"은 숙주세포에 도입된 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를, 숙주세포가 자신의 게놈 외에 포함하는 것을 의미한다. 아울러, 본 발명의 일 실시태양에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 게놈 외부의 독립적 분자, 바람직하게는 복제할 수 있는 분자로서 유전적으로 변형된 숙주세포 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주세포의 게놈으로 안정적으로 삽입될 수 있다. 또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 높은 역가의 중화항체를 유도한다. 일 실시태양에서, 본 발명의 백신 조성물은 기타의 사스 코로나바이러스 2 유래 단백질과 대비하여 더 높은 역가의 중화항체를 유도한다. 이에 따라 본 발명의 백신 조성물은 효과적인 중화항체 반응을 나타낸다. 또한 구조적으로 안정적인 단백질을 항원 단백질로 선정하여 사용함으로써 안정적으로 백신의 작용 효과를 나타낼 수 있다.
상기 백신 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피(transdermal) 팻치에 함유시킬 수도 있다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양 (예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 백신에 적합한 담체는 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 단백질, 당 등을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 담체는 수용액 또는 비-수용액, 현탁액, 및 에멀전일 수 있다. 비-수용액 담체의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식용유 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올리에이트일 수 있다.
수용액 담체는 식염수 및 완충배지를 포함하는, 물, 알콜/수용액, 에멀전 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 비경구 담체는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 유산처리 링거 또는 고정 오일을 포함할 수 있다. 정맥주사용 담체는 예컨대 링거 덱스트로오스를 기본으로 하는 것과 같은 전해질 보충제, 액체 및 영양보충제 등을 포함할 수 있다. 방부제 및 기타 첨가제 예컨대 항미생물제제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성가스 등과 같은 것이 추가로 존재할 수 있다. 바람직한 방부제는 포르말린, 티메로살, 네오마이신, 폴리믹신 B 및 암포테리신 B를 포함할 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물은 어주번트(adjuvant, 면역조성제, 면역증강제)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 어주번트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함할 수 있다. 허용 가능한 어주번트로는 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, 사포닌, 미네랄 젤 예컨대 수산화 알루미늄, 계면활성제 예컨대 리소레시틴, 플루론 폴리올, 다중음이온, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀전, 키홀림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 백신 조성물은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 투여경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 주사로 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란, 백신효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양으로, 부작용 또는 심각하거나 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량의 수준은 치료하려는 장애, 장애의 중증도, 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 치료 지속 기간, 단백질과 조합되거나 동시에 사용되는 약물, 개체의 연령, 체중, 성별, 식습관, 일반적인 건강 상태 및 의학 분야에 공지된 인자를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 스파이크 단백질의 수용체 결합도메인 단백질 또는 이의 단편이 백신으로 작용하여 개체 내에서 세포성 면역 반응 및 면역항체를 효과적으로 유도하고, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 질환을 효과적으로 방어함을 확인하였다. 이를 통해, 항원이 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 질환 예방 또는 치료를 위한 백신으로 사용 가능함을 확인하였다.
특히, 본 발명에서는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 스파이크 단백질의 RBD 중 구조적으로 안정하면서도 백신으로 작용 효과가 큰 단백질의 단편을 이용하였다는 점에서 우수한 효과를 나타낸다. 즉, 강력한 숙주 항체 반응 또는 방어 면역(protective immunity)을 유도할 수 있는 장점을 가진다.
본 발명은 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 스파이크 단백질의 수용체 결합도메인 단백질 또는 이의 단편을 인간을 제외한 동물에 주입하는 단계; 및
(b) 상기 동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 제조 방법을 제공한다.
상기 단백질 또는 이의 단편의 도입은 피내, 피하 또는 근육 조직 내로 주사하여 수행될 수 있다.
상기 용어 "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 성분으로서 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원-항체반응을 일으키는 단백질이다. 항원-항체 반응은 각 항원에 대하여 높은 특이성을 갖는다. 이는 림프구의 B세포에서 항체가 만들어질 때 특정항원에 의해 생성된 항체는 원칙적으로 다른 항원과 반응하지 않는다. 이러한 높은 특이성은 면역, 알레르기, 각종 병 및 감염의 종류·형의 결정 등의 검사에 사용된다.
이 때 상기 동물은 인간을 제외한 포유동물 일 수 있다. 예를 들어, 래트, 마우스, 햄스터, 돼지, 토끼, 말, 당나귀, 염소, 양, 기니 피그, 라마 등을 비제한적으로 포함한다. 예를 들어, 마우스는 단클론성 항체를 제조하기 위해 사용되기 바람직하다.
일 실시태양에서, 비-인간 포유동물에서 제조된 중화항체는 인간화 항체로 변환될 수 있다. 이 경우 본 발명의 상기 방법은 비-인간 포유동물에서 생성된 중화항체를 인간화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다
본 발명의 중화항체는 포유동물에서 바이러스 감염에 의한 질병을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 중화항체는 바이러스를 중화시키기에 충분한 용량으로 사용된다
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 4의 아미노산 서열이 개체에 투여되었을 때, 면역 항체 형성을 유도하는 항원으로 작용하였다. 이에 따른 면역 반응을 통해, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체가 제조될 수 있다.
제조된 항체는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염에 따른 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 중화항체로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염에 따른 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염에 따른 질환은 호흡기 질환일 수 있으며, 바이러스 감염 후 2일 내지 14일의 잠복기를 거친 뒤 증상은 고열, 기침, 숨가쁨, 폐렴, 설사와 같은 위-장관 증상, 기관 기능 부전(신부전 및 신장 기능장애), 패혈성 쇼크 및 심한 경우 사망을 포함한다.
상기 약학적 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 ㎎/kg 내지 100 ㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 ㎎/kg 내지 10 ㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편은 안정한 형태의 단백질 구조를 가지며, SARS-CoV-2에 대한 우수한 방어 능력을 통해 백신으로 현저히 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 최적화된 서열을 이용하여 절감된 생산 단가와 함께 우수한 단백질의 발현 수준으로 생산될 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2 스파이크의 수용체 결합 도메인 단백질의 발현을 위한 동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.4-SARS-CoV-RBD를 나타낸 도이다.
도 2의 a 내지 c는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하여 SDS-PAGE로 SARS-CoV-2 스파이크의 수용체 결합 도메인 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 마우스를 이용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 단백질의 항체 형성 효과를 ELISA 실험을 통해 나타낸 도이다.
도 2의 a 내지 c는 니켈-친화성 크로마토그래피로 정제하여 SDS-PAGE로 SARS-CoV-2 스파이크의 수용체 결합 도메인 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 마우스를 이용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 단백질의 항체 형성 효과를 ELISA 실험을 통해 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 제조
백신 개발을 위한 항원으로 사용될 수 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 단백질(이하, RBD)의 서열을 정립하기 위하여, 구조 예측에 기반을 둔 단백질 구조분석 서버 (XtalPred-RF, RaptorX)를 이용하여 RBD 단백질의 구조를 확인하였다.
위 구조 분석을 통해 안정한 형태의 2차 구조를 갖는 RBD 단백질의 아미노산 서열을 결정하였으며, 이를 기초로 이하의 항원을 제조하였다.
실험에 사용된 SARS-CoV-2의 RBD 단백질(210개 아미노산)은 SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 염기서열을 이용하여 제조되었다. 구체적으로, 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 전장 단백질의 323 내지 532 아미노산 서열(서열번호 2)에 대한 염기서열을 CHO 세포주에 맞게 codon optimization 하여 ㈜바이오니아를 통해 합성하였다. 항원 단백질 제조를 위해 선택된 SARS-CoV-2의 RBD 단백질의 단편에 대한 염기 서열은 서열 번호 1에 나타내었고, CHO 세포주에 맞게 codon optimization 하여 제조된 염기서열을 서열번호 3에 나타내었다.
상기 서열번호 3을 이용하여, 서열번호 4로 표시되는 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 단편을 modified pcDNA3.4 vector를 이용하여 제조하였다. 구체적으로, modified pcDNA3.4 vector의 BamHI 과 XhoI 부위에 서브클론(subclone)하여 재조합 plasmid를 제작하였다. 이와 같이, 제조된 재조합 플라스미드의 모식도를 도 1에 나타내었다.
재조합 plasmid는 CHO 세포주(Chinese hamster ovary)에 Expi CHO transfection kit를 이용하여 형질주입하였다. RBD 단백질은 CHO 세포주 셀의 수 6.0 X 106 cell/㎖에 접종하여 12일간 배양하였다. 배양 상층액은 반투과성 막을 이용하여 배지 성분을 제거한 후, 니켈-친화성 크로마토그래피로 일차 정제하였다. 이 후 단백질은 2X PBS 완충용액을 사용하여 HiPrep 16/60 Superdex S-200 겔-여과 크로마토그래피로 한번 더 정제하여, RBD 단백질을 얻었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 (a) 및 (b)를 통해 크로마토그래피에 의하여 순도 95%이상으로 정제되고 RBD 단백질이 제조된 것을 확인하였고, 도 (c)를 통해 농도에 따라 RBD 단백질이 SDS-PAGE 상에서 발현이 증가된 것을 확인하였다. 이렇게 제조되는 RBD 단백질의 220개의 아미노산 서열을 서열번호 4에 표시하였으며, 이하 제조된 RBD 단백질을 항원으로 하여 SARS-CoV-2에 대한 항체 생성 여부를 확인하였다.
실시예 2. SARS-CoV-2 RBD 단백질 및 NC 단백질의 SARS-CoV-2 항체 생성 확인
상기 실시예 1에서 제조된 RBD 단백질 항원이 효과적으로 항체 생성을 유도하는지 여부를 확인하기 위하여, 이의 항체 생성 효과를 확인하였다.
먼저 정제된 RBD 단백질 항원을 마우스에 주사하기 전에 전-면역 혈청(pre-immune serum)을 채취하여 이를 음성 대조군으로 사용하였다.
일차적 면역화(Primary immunize)를 위하여 항원 10 μg을 ISA 51 adjuvant와 혼합하여 근육주사하고, 2주 후 ISA 51와 혼합하여 부스팅(boosting)을 하였다. 2주 후 1차 혈액을 채취하여 ELISA 테스트를 진행하고, 부스팅 2주 후 쥐에서 채혈하고 최종 혈청을 분리하여 ELISA 실험을 수행하였다. ELISA 테스트에서 항원은 웰 당 100ng을 사용하였으며, 면역 혈청은 1X PBS로 1:100 내지 1:500 내지 1:1,000 내지 1:5,000 내지 1:10,000 내지 1:50,000 1:100,000 내지 1:500,000 비율로 희석하였고, 2차 확인을 위하여 항-마우스 IgG-HRP(ABC5001)을 1:5,000 비율로 희석하여 사용하였다. 광학 밀도 405 nm에서 발색을 검출하여 우선적으로 면역 항체 생성 여부를 확인하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, RBD 단백질은 실험에 사용한 5 마리의 쥐 모두에서 면역 항체 형성 효과를 우수하게 나타내었다. 위와 같은 결과를 통해 RBD 단백질이 개체 내에서 항체를 효과적으로 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.
특히, 본 발명의 RBD 단백질은 항원으로 작용하여 개체 내에서 중화항체를 효과적으로 유도할 수 있음을 확인한 결과를 기초로 하여 SARS-CoV-2 RBD 단백질이 SARS-CoV-2 예방을 위한 백신으로 사용될 수 있음을 또한 확인하였다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> VACCINE COMPOSITION FOR PREVENTING SARS CORONAVIRUS 2 INFECTION
DISEASE
<130> 162
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 630
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS CoV-2 RBD fragement nucleotide
<400> 1
acagaatcta ttgttagatt tcctaatatt acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt 60
aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct tggaacagga agagaatcag caactgtgtt 120
gctgattatt ctgtcctata taattccgca tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg 180
tctcctacta aattaaatga tctctgcttt actaatgtct atgcagattc atttgtaatt 240
agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca gggcaaactg gaaagattgc tgattataat 300
tataaattac cagatgattt tacaggctgc gttatagctt ggaattctaa caatcttgat 360
tctaaggttg gtggtaatta taattacctg tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa 420
ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt 480
gttgaaggtt ttaattgtta ctttccttta caatcatatg gtttccaacc cactaatggt 540
gttggttacc aaccatacag agtagtagta ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca 600
actgtttgtg gacctaaaaa gtctactaat 630
<210> 2
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS CoV-2 RBD fragement peptide
<400> 2
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
1 5 10 15
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
20 25 30
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
35 40 45
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
50 55 60
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
65 70 75 80
Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile
85 90 95
Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
100 105 110
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn
115 120 125
Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
130 135 140
Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
145 150 155 160
Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
165 170 175
Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
180 185 190
Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
195 200 205
Thr Asn
210
<210> 3
<211> 660
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant SARS CoV-2 RBD fragement nucleotide
<400> 3
ggatccaccg agtctatcgt gcggttcccc aacatcacca acctgtgtcc tttcggcgag 60
gtgttcaacg ccaccagatt cgcctctgtg tacgcctgga accggaagcg gatctctaac 120
tgcgtggccg actactccgt gctgtacaac tccgcctcct tcagcacctt caagtgctac 180
ggcgtgtccc ctaccaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtgtacgc cgactccttc 240
gtgatcagag gcgacgaagt gcggcagatc gctcctggac agaccggcaa gatcgccgac 300
tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggctgtgtga tcgcttggaa ctccaacaac 360
ctggactcca aagtcggcgg caactacaat tacctgtacc ggctgttccg gaagtccaac 420
ctgaagcctt tcgagcggga catctccacc gagatctacc aggctggcag caccccttgt 480
aatggcgtgg aaggcttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggctt ccagcctaca 540
aacggcgtgg gctaccagcc ttacagagtg gtggtgctgt ccttcgagct gctgcatgct 600
cctgctaccg tgtgcggccc taagaaatct accaacctcg agcatcatca tcatcatcat 660
660
<210> 4
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant SARS CoV-2 RBD fragement peptide
<400> 4
Gly Ser Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
1 5 10 15
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
20 25 30
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
35 40 45
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
50 55 60
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
65 70 75 80
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
85 90 95
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100 105 110
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
115 120 125
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130 135 140
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
145 150 155 160
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
165 170 175
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
180 185 190
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
195 200 205
Lys Ser Thr Asn Leu Glu His His His His His His
210 215 220
Claims (8)
- 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편.
- 제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 3의 염기서열로 코딩되는 것인 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편.
- 제1항 또는 제2항의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 SARS-CoV-2 감염 예방용 백신 조성물.
- (a) 제1항 또는 제2항에 따른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편을 인간을 제외한 동물에 주입하는 단계; 및
(b) 상기 동물로부터 항체를 회수하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2에 특이적으로 결합하는 단클론 항체의 제조 방법. - 제1항 또는 제2항에 따른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열인 발현 벡터.
- 제5항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200048228A KR20210130002A (ko) | 2020-04-21 | 2020-04-21 | 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 질환 예방용 백신 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020200048228A KR20210130002A (ko) | 2020-04-21 | 2020-04-21 | 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2 감염 질환 예방용 백신 조성물 |
Publications (1)
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|---|---|
| KR20210130002A true KR20210130002A (ko) | 2021-10-29 |
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ID=78231454
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| KR (1) | KR20210130002A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023148641A1 (en) * | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Translational Health Science And Technology Institute | Monoclonal antibodies specific to receptor binding domain of sars-cov2 and uses thereof |
-
2020
- 2020-04-21 KR KR1020200048228A patent/KR20210130002A/ko unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023148641A1 (en) * | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Translational Health Science And Technology Institute | Monoclonal antibodies specific to receptor binding domain of sars-cov2 and uses thereof |
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