KR20210129517A - Nadph 산화효소 1 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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경북대학교병원
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Abstract

본 발명은 NADPH 산화효소 1(NOX1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 활성산소종(ROS)에 의한 ERK(extracellular-signal-regulated kinase) 신호 전달의 억제를 통해 허혈-재관류 손상 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
NOX1 저해제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 허혈-재관류로 인한 장기 손상 환경에서 활성 산소종(ROS) 매개 ERK 신호 전달의 억제를 통해 허혈-재관류로 인한 조직 손상을 완화하는 효과를 나타내어, 허혈-재관류로 인한 장기 손상의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

NADPH 산화효소 1 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating ischemia-reperfusion injury comprising NADPH oxidase 1}
본 발명은 NADPH 산화효소 1(NOX1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 활성산소종(ROS)에 의한 ERK(extracellular-signal-regulated kinase) 신호 전달의 억제를 통해 허혈-재관류 손상 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
장기 이식 수술이나 심혈관계 질환 치료를 위한 수술 등의 외과적 처치 시에 특정 조직으로의 혈액 공급을 제한할 수 있는데, 이런 경우 간, 신장, 심장, 뇌 등 계속적인 혈류 공급이 중요한 장기에 혈액 순환이 차단됨에 따라 허혈로 인한 손상이 발생한다. 또한 산소가 제대로 공급되지 않는 허혈 상태에서 재관류에 의하여 갑자기 혈류량이 증가되면 여러 복합적인 원인으로 인하여 세포와 조직이 크게 손상될 수 있다. 특히 간 또는 신장 허혈-재관류성 손상(liver or renal Ischemia Reperfusion Injury:IRI)은 주로 간 또는 신장 이식이나 심장질환 수술 이후 빈번히 발생하는 주요한 합병증이다. 수술 도중에 혈류의 차단에 의하여 간 또는 신장으로 혈액 공급이 일시 중단된 후 뒤이어 시행되는 재관류(reperfusion)는 심각한 급성염증반응(acute inflammation response)과 급성조직손상을 유도할 수 있다. 특히, 이러한 급성 염증반응이나 조식손상에 의한 세포사멸(cell apotosis)은 간부전이나 신부전을 일으키는 주요 원인 중 하나이므로 매우 심각한 위험요소로 인식되고 있다. 허혈성 재관류 손상은 산소 결핍 상태에서 갑자기 혈류량이 증가해 세포 내 칼슘 농도가 갑자기 증가함으로써 발생하기도 한다. 세포내 칼슘의 증가는 미토콘드리아의 손상을 매개할 수 있는데, 이때 미토콘드리아 손상에 의하여 유리된 물질과 ATP가 반응해서 활성산소가 발생하고, 이를 인체가 염증으로 인식해 백혈구가 공격하면서 더 많은 활성산소가 발생해 결국 세포 손상으로 이어질 수 있다. 허혈성 재관류 손상은 혈액이 다시 유입되는 속도가 빠를수록 심하게 나타나는데, 심장 수술이나 장기 이식수술이 끝난 후 혈류가 재개될 때 허혈성 재관류 손상이 빈번히 발생한다. 이처럼 허혈성 재관류 손상이 예측되는 경우, 활성산소에 의한 손상을 주요 요인 중 하나로 간주하여 이에 대한 치료제로서 강력한 항산화제를 미리 투여해 이를 예방할 수 있다는 연구결과가 보고되어 있다. 그러나, 강력한 항산화제의 경우도 유효성의 한계 때문에 제한적으로 사용되어 왔고 일부 약물에 대한 임상 연구가 진행되고 있지만, 허혈성 재관류 손상을 직접적으로 예방 또는 치료하는 약물은 현재까지 개발된 바 없다. 전 세계적으로 장기 이식술과 같은 허혈성 재관류 조직손상을 야기할 수 있는 외과적 시술이 급증하고 있으나 간 또는 신장 이식시 문제가 되는 허혈-재관류 손상 후에 염증반응과 세포 사멸을 억제하면서 장기의 기능을 회복할 수 있는 새로운 기법 개발이 의학적으로나 사회적으로 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 신장 이식 수술 과정에서 발생하는 허혈 재관류 손상은 후에 이식 신장의 점진적 기능 상실 및 기능 부전과 연관되어 있다. 또한 초기의 허혈 재관류 손상과 급성 거부반응 그리고 이에 따른 이식 시의 장기적인 예후가 서로 연관되어 있음이 임상적으로 밝혀지고 있다. 허혈 재관류 손상을 일으키는 정확한 기전은 밝혀지지 않았으나, 허혈 재관류에 의한 산소자유기의 생성이 중요한 요인 중 하나인 것으로 알려져 있다. 또한, 신장 이식 시 허혈/재관류 손상은 이식 시의 기능지연을 유발하고, 급만성 거부반응과도 연관이 있는 것으로 보고되고 있으며, 허혈성 손상에 의한 급성 신부전은 혈관 수축 및 세뇨관 폐쇄 등의 요인 외에 염증성 사이토카인 증가 및 신실질로의 중성구 침윤을 동반한 염증성, 세포독성의 손상 기전이 중요하게 작용하는 것으로 알려져 있다.
이러한, 신장이식 수술에서 신장 허혈 재관류 손상(renal ischemic reperfusion injury, IRI)은 수술 후 치명적 환자 합병증과 사망률을 높이는 원인이 된다. 이를 예방하기 위하여 허혈 선조정(ischemic preconditioning), 아데노신 전처치, 흡입 입마취제 선조정, AMPK (AMP-activated protein kinase) 활성화 등의 방법들이 연구되고 있으며, 지금까지 급성 허혈 선조정뿐만 아니라 지연성 허혈 선조정이 신장의 허혈 재관류 손상에 대하여 세포내 신호전달 단백질인 Akt, ERK, HSP27(heat shock protein 27), HSP70, iNOS (inducible nitric oxide synthase) 등의 중간 매개물질을 통하여 보호작용을 한다고 알려져 왔다. 또한, 신장 이식 수술과정에서 발생하는 신장의 허혈 재관류 손상을 치료할 수 있는 약물을 개발하고자 하는 연구가 진행되었으나, 여러 가지 부작용이 있었으며, 이식에 의해 발생하는 신장의 기능 저하 등의 문제점을 해소하는데 어려움이 있었다.
이에, 본 발명자는 허혈-재관류에 의한 조직 손상을 완화할 수 있는 안전한 신규 물질을 개발하기 위하여 예의 노력을 기울인 결과, NOX1 저해제가 활성산소종(ROS)에 의한 ERK(extracellular-signal-regulated kinase) 신호 전달의 억제를 통해 허혈-재관류로 인한 조직 손상에 매우 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 NOX1(NADPH oxidase 1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 NOX1(NADPH oxidase 1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NOX1(NADPH oxidase 1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 NOX1(NADPH oxidase 1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 NOX1(NADPH oxidase 1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 NOX1 저해제는 그 종류가 특별히 제한되지 않으며 NOX1-의존적인 활성 산소종(ROX) 생성 저해효과를 나타내는 물질이라면 모두 본 발명의 상기 저해제에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 NOX1 저해제는 단일 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨데, 천연 추출물, 또는 세포 또는 조직 배양물), 항체, 펩타이드, 단백질; 또는 NOX1의 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 NOX1 저해제는 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 신장 허혈 재관류를 유도한 마우스 모델에서 활성 산소종 매개 ERK 신호 전달을 억제함으로써, 허혈-재관류로 인한 조직 손상을 완화하는 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
본 발명에서 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출 된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 NOX1 저해제를 단독으로 함유하거나 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA,1995)에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 허혈-재관류 손상이 나타나는 장기의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면 간, 심장, 신장, 폐, 뇌일 수 있으며, 가장 바람직하게는 신장일 수 있다.
본 발명은 또한 NOX1(NADPH oxidase 1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 NOX1 저해제를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 허혈-재관류 조직손상에 예방 또는 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 식품 조성물은 NOX1 저해제 성분 이외에 미량의 미네랄, 비타민, 지질, 당류 및 공지의 성분 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 미네랄로는 칼슘, 철 등 성장기에 필요한 영양성분이 함유될 수 있으며 비타민으로는 비타민 C, 비타민 E, 비타민B1, 비타민 B2, 비타민 B6 등이 함유될 수 있다. 지질로는 알콕시글리세롤 또는 레시틴 등이 함유될 수 있으며 당류로는 프락토올리고당 등이 함유될 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 NOX1 저해제를 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 NOX1 저해제를 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 NOX1 저해제의 바람직한 함량은 식품 조성물 총 중량에 대하여 식품의 전체 중량을 기준으로 0.01∼90%, 바람직하게는 0.1∼50%의 비율로 함유될 수 있다.
NOX1 저해제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 허혈-재관류로 인한 장기 손상 환경에서 활성 산소종(ROS) 매개 ERK 신호 전달의 억제를 통해 허혈-재관류로 인한 조직 손상을 완화하는 효과를 나타내어, 허혈-재관류로 인한 장기 손상의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 산화적 스트레스를 유도한 동물실험에서 ML171을 처리한 마우스의 신장 기능 검사 및 조직 염색을 통한 신장 손상을 확인한 결과이다.
도 2는 산화적 스트레스 유도에 의한 마우스 내 NOX1, 4의 mRNA 발현과 조직내 NOX4의 발현 및 ROS 생성을 확인한 결과이다.
도 3은 마우스 모델에서의 세포사멸을 확인한 결과이다.
도 4는 산화적 스트레스에 의한 신장 섬유화를 확인한 결과이다.
도 5는 산화적 스트레스에 의한 신장 세포 사멸 및 섬유화의 메커니즘을 확인하기 위해 MAPK Pathway의 유전자를 western blot으로 확인한 결과이다.
도 6은 MDCK 세포를 이용하여 산화적 스트레스에 의한 신장 세포의 ROS 생성 및 NOX 발현 양상을 확인한 결과이다.
도 7에서는 ML171의 산화적 스트레스에 의한 신장 세포의 세포사멸 차단 효과를 확인하였다.
도 8은 세포 내 H2O2에 의한 산화적 스트레스 유도를 ML171이 효과적으로 차단시키는 Mechanism을 규명한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험방법
C57BL / 6 마우스에 한 번에 60mg / kg의 ML171, 선택적 NOX 억제제 또는 부용제를 복강 내 주사하고, 양측 신장 혈관을 30 분 동안 클램핑 하여 신장 허혈 재관류 손상(IRI)을 유도하였다. MDCK 세포를 1 시간 동안 H2O2 (1.4mM)와 배양하여 산화 스트레스를 유도하고 ML171 (1 및 2.5μM)으로 처리하였다. 신장 손상은 신장 기능 검사 및 조직학을 사용하여 추정되었다. NOX 발현, 산화 스트레스 마커, 세포 사멸 분석 및 MAPK 경로는 또한 신장 조직 및 MDCK 세포에서 평가되었다.
실험결과
도 1은 산화적스트레스를 유도한 동물실험에서 ML171을 처리한 마우스의 신장 기능 검사 및 조직 염색을 통한 신장 손상을 확인한 결과이다.
도 1A 및 B를 참고하면, 혈액 내 신장 손상 수치를 확인한 결과 ML171을 처리한 마우스군에서 유의성 있는 감소를 확인하였으며, 도 1C를 참고하면 PAS 염색을 통한 조직학적 분석에서도 산화적 스트레스에 의한 신장 세뇨관 상피세포의 손상을 ML171이 감소시켜주는 것을 확인하였다.
도 2는 산화적 스트레스 유도에 의한 마우스 내 NOX1, 4의 mRNA 발현과 조직내 NOX4의 발현 및 ROS 생성을 확인한 결과이다.
도 2A 및 B를 참고하면, 마우스 신장의 mRNA 발현양을 조사한 결과 산화적 스트레스에 의해 증가한 NOX가 ML171에 의해 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다. 도 2C를 참고하면 NOX4 면역염색을 통한 결과에서도 IRI 동물모델에서 NOX4의 발현양이 증가함을 확인할 수 있었다. 도 2D 및 E를 참고하면, 신장 내 ROS(reactive oxygen species)를 측정한 결과 IRI 군에서 유의성 있게 증가하는 ROS를 ML171이 효과적으로 차단함을 확인하였다.
도 3은 마우스 모델에서의 세포사멸을 확인한 결과이다.
도 3A를 참고하면, Caspase-3 activity를 신장에서 확인한 결과 ML171에 의한 유의성 있는 세포사멸 완화 효과를 확인하였고, 도 3B를 참고하면, TUNEL assay 조직학적 염색을 통한 결과에서도 산화적 스트레스에 의한 세포사멸을 ML171이 완화시킴을 확인하였다. 도 3C를 참고하면, 세포사멸 마커인 BCL-2와 BAX의 신장 내 단백질 발현양을 조사한 결과 IRI에 의한 세포사멸을 ML171이 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
도 4는 산화적 스트레스에 의한 신장 섬유화를 확인 한 결과로써, 도 4A 및 B를 참고하면, Trichrome stain을 통한 신장 섬유화를 확인한 결과 유의성 있게 ML171에 의해 섬유화가 감소되는 것을 확인하였으며, 도 4C 및 D를 참고하면, 섬유화 마커 Fibronectin과 a-SMA 마커를 확인한 결과 산화적 스트레스에 의해 섬유화 진행이 유의성 있게 증가함을 확인하였다.
도 5는 산화적 스트레스에 의한 신장 세포 사멸 및 섬유화의 메커니즘을 확인하기 위해 MAPK Pathway의 유전자를 western blot으로 확인한 결과이다.
도 5A 및 B에서 MAPK Pathway의 유전자를 확인한 결과 ERK의 인산화가 유의성 있게 증가함을 확인하였고 이를 ML171이 효과적으로 감소시키는 것으로 확인되었다.
도 6은 MDCK 세포를 이용하여 산화적 스트레스에 의한 신장 세포의 ROS 생성 및 NOX 발현 양상을 확인한 결과이다.
도 6A 내지 E를 참고하면, H2O2를 통해 산화적 스트레스를 유도한 후 NOX 관련 유전자의 발현 양상을 확인한 결과 H2O2에 의해 유의성 있게 증가한 산화적 스트레스 마커가 ML171에 의해 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다. 도 6F를 참고하면, ROS 생성을 확인하였을 때에도 동일하게 H2O2에 의해 세포 내 증가한 ROS를 ML171이 유의성 있게 감소시킴을 확인하였다.
도 7에서는 ML171의 산화적 스트레스에 의한 신장 세포의 세포사멸 차단 효과를 확인하였다.
도 7A를 참고하면, Caspase-3 activity를 통해 H2O2에 의한 산화적 스트레스를 유도하였을 때, 세포 사멸이 유의성 있게 증가함을 확인하였고, 도 7B를 참고하면, 세포사멸 마커인 BCL-2, BAX의 단백질 발현양이 H2O2에 의해 증가하였으며 ML171에 의해 유의성 있게 세포 사멸이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 도 7C의 세포 내 TUNEL assay 염색 결과 H2O2에 의해 세포사멸 양상이 증가함을 확인하였고, ML171이 이를 효과적으로 차단함을 확인하였다.
도 8은 세포 내 H2O2에 의한 산화적 스트레스 유도를 ML171이 효과적으로 차단시키는 Mechanism을 규명한 결과이다.
MDCK 세포에서의 MAPK Pathway 유전자들을 확인 한 결과 in vivo 실험과 동일하게 ERK의 인산화에 의해 산화적 스트레스에 의한 신장 손상이 유도되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 ML171이 유의성 있게 감소 조절시키는 것을 확인할 수 있었다.
결론적으로, IRI는 신장 기능을 악화시키고 신장 조직에서 H2O2 및 DCFDA와 같은 ROS 생성을 증가시키는 반면, ML171의 치료는 IRI를 통한 매개 손상을 상당히 약화시켰다. 복강 내 ML171은 Bcl-2 감소 및 Caspase-3 활성 증가를 역전시켰다. ML171은 또한 MDCK 세포에서 H2O2 처리에 의해 유도된 NOX1, NOX2 및 p40의 발현을 감소시켰다. H2O2는 ML171 처리에 의해 완화된 SOD 및 GXP 생산의 산화 적 스트레스 관련 효소의 변화를 일으켰다. ML171은 Bcl-2 수준의 현저한 증가 및 Caspase-3 활성의 감소를 야기하였다. MAPK 경로 중에서 ML171은 신장 조직 및 관형 세포에서 ERK의 인산화에 의해 ERK 신호 전달에 영향을 미치는 것으로 확인되었다.
NOX1 저해제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 허혈-재관류로 인한 장기 손상 환경에서 활성 산소종(ROS) 매개 ERK 신호 전달의 억제를 통해 허혈-재관류로 인한 조직 손상을 완화하는 효과를 나타내어, 허혈-재관류로 인한 장기 손상의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Claims (7)

  1. NOX1(NADPH oxidase 1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 허혈-재관류 손상은 신장 손상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 NOX1 저해제는 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00002

  4. 제1항에 있어서, 상기 NOX1 저해제는 상기 NOX1의 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 NOX1 저해제는 활성산소종(ROS) 매개 ERK(extracellular-signal-regulated kinase) 신호 전달의 억제를 통해 허혈-재관류 손상 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. NOX1(NADPH oxidase 1) 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury) 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 허혈-재관류 손상은 신장 손상인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
KR1020200047663A 2020-04-20 2020-04-20 Nadph 산화효소 1 저해제를 유효성분으로 포함하는 허혈-재관류 손상 예방 또는 치료용 조성물 KR20210129517A (ko)

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