KR20210127924A - 고다양성 펩티드 라이브러리의 제조 및 단백질 폴딩의 촉진 방법 - Google Patents

고다양성 펩티드 라이브러리의 제조 및 단백질 폴딩의 촉진 방법 Download PDF

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KR20210127924A
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조안나 펠트햄 스웨인
엘렌 로비사 라르스도터 아프젤리우스
오하드 요세프손
벤자민 피터 로스코에
피터 리우보미로브 로고브
하쉬 자예쉬쿠마르 바이드야
조지 로버트 3세 마브리
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레퍼토리 아임뮨 메디신스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 증가된 펩티드 다양성을 갖는 펩티드 라이브러리를 제공한다. 펩티드 다양성의 증가는 펩티드 내의 특정 아미노산의 절단을 통해 일어날 수 있다. 본 개시내용은 펩티드의 활성 입체형태로의 폴딩을 촉진하는 방법을 추가로 제공한다.

Description

고다양성 펩티드 라이브러리의 제조 및 단백질 폴딩의 촉진 방법
상호 참조
본 출원은 2019년 1월 4일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/788,673의 우선권을 주장하며, 이의 전문은 본원에 참조 인용된다.
시험관내 단백질 생산은 연구 및 치료 목적을 위한 소량의 기능성 단백질의 발현 및 제조를 가능하게 한다.
참조에 의한 통합
본 출원에 인용된 각 특허, 공개 및 비특허 문헌은 각각 개별적으로 참조 인용된 것과 같이 그 전문이 참조 인용된다.
본 개시내용은 라이브러리 조성물, 라이브러리의 제조 방법, 및 펩티드 폴딩의 촉진 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 복수의 펩티드를 코딩하는 복수의 핵산 구축물을 포함하는 라이브러리로서, 상기 복수의 핵산 구축물의 핵산 구축물이 a) 복수의 펩티드로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및 b) 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 복수의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 복수의 펩티드는, 절단가능한 모이어티에 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 절단가능한 모이어티가 절단됨으로써 펩티드의 초기 아미노산 잔기를 절단할 때, 1,000 초과의 펩티드 다양성을 포함하는 것인 라이브러리를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 복수의 펩티드를 포함하는 라이브러리로서, 상기 복수의 펩티드의 펩티드가 a) 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기; b) 절단가능한 모이어티; 및 c) 펩티드의 나머지를 포함하고, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있으며; 복수의 펩티드는, 절단가능한 모이어티에 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 절단가능한 모이어티가 절단됨으로써 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 절단할 때, 1,000 초과의 펩티드 다양성을 포함하는 것인 라이브러리를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 펩티드 라이브러리의 제조 방법으로서, a) 복수의 펩티드를 코딩하는 복수의 핵산 구축물을 제공하는 단계로서, 상기 복수의 핵산 구축물의 핵산 구축물이 i) 복수의 펩티드로부터의 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및 ii) 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 복수의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단계; b) 복수의 핵산 구축물을 전사 및 번역, 또는 번역하는 단계; 및 c) 엔도프로테아제를 사용하여, 임의로, (b)와 동시에, 절단가능한 모이어티를 절단함으로써, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 펩티드의 나머지로부터 절단하는 단계로서, 펩티드로부터 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기의 절단은 펩티드 라이브러리의 적절하게 폴딩된 펩티드를 생성하는 것인 단계를 포함하는 제조 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 에피토프를 발현시키기 위한 DNA 구축물로서, 상기 DNA 구축물은 a) 단백질 에피토프를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및 b) 단백질 에피토프의 N 말단에서 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 단백질 에피토프의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, DNA 구축물의 전사 및 번역시, 절단가능한 모이어티에 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 절단가능한 모이어티가 절단됨으로써, 단백질 에피토프의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 절단하고, 단백질 에피토프는 펩티드 라이브러리의 일부인 DNA 구축물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 단백질 에피토프를 발현시키기 위한 RNA 구축물로서, 상기 RNA 구축물은 a) 단백질 에피토프를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및 b) 단백질 에피토프의 N 말단에서 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 단백질 에피토프의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, RNA 구축물의 번역시, 절단가능한 모이어티에 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 절단가능한 모이어티가 절단됨으로써, 단백질 에피토프의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 절단하고, 단백질 에피토프는 펩티드 라이브러리의 일부인 RNA 구축물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 펩티드의 폴딩 방법으로서, a) 펩티드를 코딩하는 핵산 구축물을 제공하는 단계로서, 상기 핵산 구축물은 i) 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및 ii) 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단계; b) 핵산 구축물을 전사 및 번역, 또는 번역하는 단계; 및 c) 엔도프로테아제를 사용하여, 임의로, (b)와 동시에, 절단가능한 모이어티를 절단함으로써, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 펩티드의 나머지로부터 절단하는 단계로서, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기의 절단은 폴딩된 펩티드를 생성하는 것인 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 입체형태(conformational) 단백질 에피토프의 라이브러리의 제조 방법으로서, a) 복수의 핵산 구축물에서 코딩된 복수의 단백질 에피토프를 얻는 단계로서, 상기 복수의 핵산 구축물의 핵산 구축물은 단백질 에피토프의 N 말단에서 절단가능한 모이어티를 추가로 코딩하고, 절단가능한 모이어티는, 단백질 에피토프의 초기 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 단계; b) 임의로, 복수의 핵산 구축물을 전사하는 단계로서, 복수의 리보핵산 분자가 복수의 핵산 구축물로부터 전사되는 것인 단계; c) 복수의 리보핵산 분자를 번역하는 단계로서, 복수의 단백질 에피토프는 복수의 리보핵산 분자로부터 번역되는 것인 단계; 및 d) 프로테아제를 사용하여, 임의로, (c)와 동시에, 절단가능한 모이어티를 절단함으로써, 후보 단백질 에피토프의 초기 아미노산 잔기를 후보 단백질 에피토프의 나머지로부터 절단하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 특성 및 이점의 보다 완전한 이해를 위해서는, 첨부 도면과 함께 취해진 후속하는 상세한 설명을 참조해야 한다. 본 개시내용은 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 다양한 측면에서 변형될 수 있다. 따라서, 이들 실시양태의 도면 및 설명은 제한적이지 않다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다.
도 1은 실시예 1에서 생성된 펩티드는 소화되어 절단 도메인이 제거되었음을 나타낸다.
도 2는 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 펩티드로부터 SUMO 도메인의 절단을 입증한다.
도 3은 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 펩티드의 올바른 폴딩의 정량화를 제공한다.
도 4는 본원에 기재된 방법을 사용하여 제조된 펩티드의 유세포 분석을 제공한다.
정의
본원에 사용된 용어 "절단가능한 모이어티"는 절단가능한 모티프 또는 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 절단 모이어티는 단백질, 예를 들어 효소 절단 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 모이어티는, 예를 들어 산화/환원 조건, 빛/소리, 온도, pH, 압력 등에 대한 노출을 통한 화학적 절단 부위를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "엔도프로테아제"는 비말단 아미노산의 펩티드 결합을 절단하는 프로테아제를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "고다양성"은 고도의 다양성을 갖는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "라이브러리 펩티드"는 라이브러리 내의 단일 펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "N 말단 아미노산 잔기"는 폴리펩티드의 N 말단에 있는 하나 이상의 아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "펩티드 다양성"은 2 이상의 펩티드 사이의 변형 또는 가변성을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "펩티드 라이브러리"는 복수의 펩티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 독특한 서열을 갖는 하나 이상의 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라이브러리 내의 각각의 펩티드는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 동일하고 상이한 서열을 갖는 펩티드의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "고다양성 펩티드 라이브러리"는 고도의 펩티드 다양성을 갖는 펩티드 라이브러리를 지칭한다. 예를 들어, 고다양성 펩티드 라이브러리는 약 103, 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015, 약 1016, 약 1017, 약 1018, 약 1019, 약 1020, 또는 그 이상의 상이한 펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단백질 에피토프"는 파트너와 상호작용할 것으로 예측되는 펩티드 서열 또는 구조를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "단백질 폴딩"은 펩티드의 공간적 조직화를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열은 펩티드의 공간적 조직화 또는 폴딩에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 기능적 입체형태로 폴딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴딩된 펩티드는 하나 이상의 생물학적 기능을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴딩된 펩티드는 3차원 구조를 획득한다.
본원에 사용된 용어 "소형 유비퀴틴 유사 변형체 모이어티" 또는 "SUMO 도메인" 또는 "SUMO 모이어티"는 상호 혼용되며 특정 프로테아제 인식 모이어티를 지칭한다.
본 개시내용은, 예를 들어 시험관내 단백질 생산을 위한 방법을 제공한다. 일반적으로, 시험관내 단백질 생산에는 유전자 형질감염, 세포 배양 또는 광범위한 단백질 정제가 필요하지 않지만, 단백질 발현의 다양성이 낮을 수 있다. 반대로, 포유류 기반 발현 시스템은 시험관내 방법에 비해 단백질 발현의 다양성을 증가시킬 수 있지만, 포유류 기반 발현 시스템은 느리고 어렵다. 따라서, 본 개시내용은, 예를 들어 펩티드 라이브러리에 사용하기 위한 고처리량 및 고다양성 펩티드 생산을 위한 시험관내 단백질 발현 방법을 제공한다.
추가로, 본 개시내용은 본원에 기재된 시험관내 단백질 생산 방법을 사용하여 단백질 생성시 적절한 단백질 폴딩을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 경우, 시험관내 박테리아 시스템에서 초기 메티오닌 잔기인 N-포르밀메티오닌(fMet)은 적절한 펩티드 폴딩을 방해하고 펩티드 기능에 영향을 미친다. 본원에 개시된 시험관내 방법은 번역 후 초기 메티오닌 잔기를 절단하는 데 사용될 수 있으며, 이는 적절한 단백질 폴딩을 허용한다.
본원에 사용된 바와 같이, l-거울상 이성질체 및 d-거울상 이성질체 아미노산에 대한 약어는 다음과 같다: 알라닌(A, Ala); 아르기닌(R, Arg); 아스파라긴(N, Asn); 아스파르트산(D, Asp); 시스테인(C, Cys); 글루탐산(E, Glu); 글루타민(Q, Gln); 글리신(G, Gly); 히스티딘(H, His); 이소류신(I, Ile); 류신(L, Leu); 라이신(K, Lys); 메티오닌(M, Met); 페닐알라닌(F, Phe); 프롤린(P, Pro); 세린(S, Ser); 트레오닌(T, Thr); 트립토판(W, Trp); 티로신(Y, Tyr); 발린(V, Val). 일부 실시양태에서, 아미노산은 L-거울상 이성질체이다. 일부 실시양태에서, 아미노산은 D-거울상 이성질체이다.
시험관내 전사/번역.
본 개시내용의 방법은 시험관내 전사/번역(IVTT)을 수행하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법은 시험관내 전사/번역(IVTT)을 수행하여 고다양성 펩티드 라이브러리를 제조하고 단백질의 올바른 폴딩을 허용하는 방법을 포함한다.
IVTT는 DNA 또는 RNA 탬플레이트로부터 직접 무세포 환경에서 단백질 생산을 가능하게 할 수 있다. IVTT는, 예를 들어 mRNA 디스플레이 라이브러리, 펩티드, 항체, 리보솜 디스플레이, DNA 디스플레이, CIS 디스플레이 및 원하는 단백질을 생성하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 IVTT 방법은, 예를 들어, PCR 산물, 선형 DNA 플라스미드, 원형 DNA 플라스미드, 또는 리보솜 결합 부위(RBS) 서열을 갖는 mRNA 탬플레이트를 사용하여 수행될 수 있다. 적절한 탬플레이트가 단리된 후, 예를 들어, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 RNA 중합효소를 포함하는 전사 성분을 탬플레이트에 첨가할 수 있다. 전사가 완료된 후, 예를 들어 토끼 망상적혈구 용해물 또는 밀 배아 추출물에서 찾을 수 있는 번역 성분을 첨가할 수 있다. 일부 방법에서, 예를 들어 핵산 탬플레이트에 전사 성분을 첨가함과 동시에 토끼 망상적혈구 용해물 또는 밀 배아 추출물에서 발견되는 정제된 번역 성분을 첨가하는 단일 단계 동안 전사 및 번역이 일어날 수 있다.
단백질 폴딩.
본원에 개시된 방법은 높은 펩티드 다양성을 갖는 펩티드 라이브러리를 생산하기 위한 개시된 IVTT 방법에 의해 생산된 펩티드의 적절한 단백질 폴딩을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
펩티드의 무세포 단백질 합성(CFPS)은 펩티드의 생산을 가능하게 할 수 있다. CFPS로 높은 수율을 얻으려면, 번역된 서열의 제1 아미노산이 N-포르밀메티오닌(fMet)인 박테리아 시스템의 사용이 필요할 수 있다. fMet는 양으로 하전된 아미노 말단(NH3 +) 대신 중성 포르밀기(HCO)를 함유한다는 점에서 메티오닌과 다르다. 박테리아가 fMet를 절단하기 위해 내인성 아미노펩티다제를 사용할 수 있지만, fMet의 제거는 서열의 제2 아미노산의 동일성에 따라 불완전하거나 폐지될 수 있다. 예를 들어, 메티오닌 아미노펩티다제의 작용은 fMet와 아스파라긴 사이에서 비효율적일 수 있다.
CFPS에 의해 생성된 펩티드의 일례는 아미노산 서열 fMet-NLVPMVATV(서열번호 1)를 포함하는 CMV 유래 펩티드이다. 이 펩티드의 부적절한 단백질 폴딩은, fMET 잔기의 보유로 인해 동족 T 세포 수용체에 결합하는 단백질의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 이 결과는 조 세포 추출물로 만든 박테리아 CFPS 시스템에서 단백질이 생산되는 경우 일어날 수 있다. 더욱이, 펩티드 라이브러리 맥락에서, 단일 개별 탬플레이트는 fMet가 있거나 없는 펩티드, 또는 처리가 단순히 비효율적인 경우 둘의 혼합물을 생성할 수 있다.
그러나, 정제된 성분만으로 구성되고 메티오닌 아미노펩티다제가 완전히 결여된 재구성된 CFPS 시스템에서, 모든 라이브러리 변이체는 fMet 잔기로 시작할 수 있고, 그리고나서 이 잔기는 본원의 방법에 기재된 바와 같이 균일하게 절단될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 IVTT 방법을 사용하여, 초기 메티오닌 아미노산의 제거는 성공적인 펩티드 폴딩을 허용했다.
보다 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 무세포 합성을 사용할 수 있고, 동시 절단 단계로 이어지거나 동시 절단 단계와 함께 사용할 수 있다. 무세포 펩티드 합성은 IVTT 시스템을 사용하여 일어날 수 있다. 펩티드는, 예를 들어 DNA 구축물을 RNA로 전사한 다음 RNA를 단백질로 번역할 수 있는 IVTT 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 펩티드 합성을 위한 이 무세포 시스템에서, 뉴클레오티드 서열은 펩티드의 N 말단에 존재하는 메티오닌 잔기 및 절단가능한 모이어티를 코딩할 수 있다. 절단가능한 모이어티는, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 펩티드의 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치하는 절단가능한 모이어티를 코딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나의 N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌 잔기이다. 절단가능한 모이어티는 절단가능한 모이어티에 특이적인 프로테아제를 사용하여 절단될 수 있으며, 이는 또한 펩티드의 나머지로부터 절단가능한 모이어티를 절단할 수 있다.
절단가능한 모이어티의 절단은, 예를 들어 아미노-펩티다제의 사용을 통해 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기의 절단은 메티오닌 아미노-펩티다제의 사용을 통해 일어난다. 메티오닌 아미노-펩티다제는, 위치 2의 아미노산 잔기가, 예를 들어 글리신, 알라닌, 세린, 시스테인 또는 프롤린인 경우, 펩티드로부터 메티오닌을 절단할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA 구축물에서 코딩될 수 있는 절단가능한 모이어티의 예는 프로테아제에 의해 절단되는 임의의 절단가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 유사 변형체(SUMO) 단백질일 수 있다. SUMO 도메인은 SUMO에 특이적인 프로테아제를 사용하여 펩티드가 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티는 엔테로키나제 절단 부위인 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열번호 2)일 수 있다. 프로테아제는, 예를 들어 Ulp1 프로테아제 또는 엔테로키나제일 수 있다. Ulp1 프로테아제는, 아미노산 서열이 아닌, SUMO의 3차 구조를 인식하여 특정 방식으로 SUMO를 절단할 수 있다. 엔테로키나제(엔테로펩티다제)는 또한 하기 절단 부위에서 라이신 다음을 절단하는 데 사용될 수 있다: Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열번호 2). 엔테로키나제는 또한 단백질 기질의 서열에 따라 다른 염기성 잔기를 절단할 수 있다.
펩티드를 코딩하는 구축물의 번역 동안 또는 번역 후에, N 말단 아미노산 잔기는 적절하게 폴딩된 펩티드를 생성하기 위해 효율적으로 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단되어 펩티드를 생성한다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 N 말단 아미노산 잔기가 절단되어 펩티드를 생성한다. N 말단 아미노산은 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌 아미노산 잔기일 수 있다. 따라서, 이 적절하게 폴딩된 펩티드는 N 말단 메티오닌을 갖도록 제한되지 않으며, 무세포 시험관내 방법에 의해 제조된 고다양성 펩티드 라이브러리의 일부가 될 수 있다.
본 개시내용은, 예를 들어 본원에 기재된 방법을 사용하여 적절하게 폴딩될 수 있는 펩티드를 코딩할 수 있는 DNA 또는 RNA 구축물을 제공한다. 펩티드는 임의의 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 또는 이의 단편일 수 있다. 예를 들어, DNA 또는 RNA 구축물은 단백질 에피토프를 코딩할 수 있다. DNA 또는 RNA 구축물은 단백질 다량체, 예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체 등을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다량체는 동종다량체, 예를 들어 동일한 서브유닛 또는 동종올리고머이다. 일부 실시양태에서, 다량체는 이종다량체, 예를 들어 상이한 서브유닛이다.
본원에 기재된 바와 같은 단백질 에피토프는 단백질, 예를 들어 수용체에 결합할 것으로 예측되는 펩티드를 코딩하는 특정 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 대해 임의의 수준의 친화도를 가질 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 대해 높은 친화도를 가질 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 대해 낮은 친화도를 가질 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 대해 친화성을 갖지 않을 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 특이적일 수 있거나 특이적이지 않을 수 있다.
또 다른 예로서, 단백질 에피토프는, 예를 들어 DNA 구축물을 RNA로 전사한 다음, RNA를 단백질로 번역할 수 있는 IVTT 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 단백질 에피토프의 합성을 위한 무세포 시스템의 사용으로 인해, 뉴클레오티드 서열은 단백질 에피토프의 N 말단에서 메티오닌 잔기를 코딩할 수 있다. N 말단 메티오닌 잔기는 전술한 바와 같이 단백질 에피토프의 나머지로부터 절단될 수 있다. 본원에 기술된 방법의 사용은 이들 DNA 구축물 및/또는 RNA 구축물로부터 단백질의 적절한 폴딩을 허용할 수 있다.
펩티드 라이브러리.
본원에 기재된 IVTT 시스템은 펩티드 라이브러리를 제조하는 데 사용될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 잠재적인 진단 또는 치료 표적 또는 작용제를 확인하기 위한 다양한 스크리닝 검정에 사용될 수 있다. 펩티드 라이브러리는, 예를 들어 질병 특이적 또는 장기 특이적 펩티드를 스크리닝하고, 치료 용도로 펩티드를 스크리닝하고, 진단 용도로 펩티드를 스크리닝하고, 종양 표적화 펩티드를 스크리닝하고, 항체 에피토프 또는 항원을 스크리닝하고, T 세포 에피토프 또는 항원을 스크리닝하고, 항균 펩티드를 스크리닝하는 데 사용될 수 있거나, 또는 이들의 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 적절한 품질의 다양한 펩티드 라이브러리는 많은 가치 있는 용도를 갖는다.
본원에 기재된 IVTT 시스템은 고다양성 펩티드 라이브러리를 생산하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 IVTT 시스템은 고처리량 방법을 통해 고다양성 펩티드 라이브러리를 생산하는 데 사용될 수 있다. 생산된 고다양성 펩티드 라이브러리는 전술한 바와 같이 정확하게 폴딩된 펩티드를 포함할 수 있다.
펩티드 다양성은, 예를 들어 특정 라이브러리에 존재하는 상이한 유형의 펩티드의 직접 측정에 기초하여 평가될 수 있다. 펩티드 다양성은 또한 샘플에서 단일 아미노산 및 디펩티드의 분포를 결정함으로써 측정될 수 있다. 고다양성 펩티드 라이브러리는 서로 비교하여 고유한 103개 이상의 펩티드를 포함하는 라이브러리일 수 있다. 펩티드 다양성은, 예를 들어 라이브러리에서 개별 펩티드를 시퀀싱하거나 질량 분석법을 사용하여 라이브러리에서 다른 종을 측정함으로써 결정될 수 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하여 제조된 펩티드 라이브러리는, 예를 들어 약 103, 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015, 약 1016, 약 1017, 약 1018, 약 1019, 약 1020, 또는 그 이상의 펩티드 다양성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 펩티드 라이브러리는 약 109 이상의 펩티드 다양성을 갖는다.
본원에 개시된 방법은, 예를 들어 무세포 방법을 사용하여 펩티드 라이브러리를 제조하는 데 사용될 수 있다. 무세포 라이브러리 합성은 IVTT 시스템을 사용하여 일어날 수 있다. 펩티드는, 예를 들어 DNA 구축물을 RNA로 전사한 다음 RNA를 단백질로 번역할 수 있는 IVTT 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 펩티드의 N 말단에 있는 메티오닌 잔기 및 절단가능한 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 DNA 구축물 또는 RNA 구축물에서 코딩될 수 있다. 절단가능한 모이어티는 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 펩티드의 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 절단가능한 모이어티를 코딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나의 N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌 잔기이다. 절단가능한 모이어티는 절단가능한 모이어티에 특이적인 프로테아제를 사용하여 절단될 수 있으며, 이는 또한 펩티드의 나머지로부터 절단가능한 모이어티를 절단할 수 있다.
절단가능한 모이어티의 절단은, 예를 들어 아미노-펩티다제를 사용하여 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 잔기의 절단은 메티오닌 아미노-펩티다제를 사용하여 일어난다. 메티오닌 아미노-펩티다제는, 위치 2의 아미노산 잔기가, 예를 들어 글리신, 알라닌, 세린 또는 프롤린인 경우, 펩티드로부터 메티오닌을 절단할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA 구축물에서 코딩될 수 있는 절단가능한 모이어티의 예는 프로테아제에 의해 절단되는 임의의 절단가능한 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 유사 변형체(SUMO) 단백질일 수 있다. SUMO 도메인은 SUMO에 특이적인 프로테아제를 사용하여 펩티드가 절단될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단가능한 모이어티는 엔테로키나제 절단 부위: Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열번호 2)일 수 있다. 프로테아제는, 예를 들어 Ulp1 프로테아제 또는 엔테로키나제일 수 있다. Ulp1 프로테아제는 아미노산 서열이 아닌 SUMO의 3차 구조를 인식하여 특정 방식으로 SUMO를 절단할 수 있다. 엔테로키나제(엔테로펩티다제)는 또한 하기 절단 부위에서 라이신 다음을 절단하는 데 사용될 수 있다: Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열번호 2). 엔테로키나제는 또한 단백질 기질의 서열에 따라 다른 염기성 잔기를 절단할 수 있다.
라이브러리 펩티드를 코딩하는 구축물의 번역 동안 또는 번역 후에, N 말단 아미노산 잔기가 절단되어 고다양성 펩티드 라이브러리용 펩티드를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단되어 펩티드를 생성한다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개, 또는 그 이상의 N 말단 아미노산 잔기가 절단되어 라이브러리 펩티드를 생성한다. N 말단 아미노산은 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌 아미노산 잔기일 수 있다.
펩티드 라이브러리는, 예를 들어 수용체/리간드의 상호작용을 확인하는 것과 같은 펩티드-표적 단백질의 상호작용을 확인하고, 단백질 입체형태 연구를 수행하고, 높은 친화도 및 적은 항체를 개발하고, 펩티드 모방체를 확인하고, 면역원성 펩티드를 확인하고, 펩티드 간의(예를 들어, 단일 펩티드, 면역원성 펩티드 또는 펩티드 모방체 간의) 결합 패턴을 확인하고, 면역 세포 수용체/항원 쌍을 확인하고, 백신을 개발하고, 단백질 키나제 연구를 수행하고, 프로테아제 연구를 수행하고, 약물 설계 연구를 수행하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 펩티드 라이브러리에 다양한 펩티드 어레이를 갖는 것은, 정확한 표적을 확인하고 생성된 생물학적 검정을 수행하여 정확한 결과를 산출하도록 하는 데 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 펩티드 라이브러리의 펩티드 다양성을 증가시켜 단백질-단백질 상호작용을 확인할 수 있다. 단백질 에피토프는, 예를 들어 수용체, 항체, 면역 세포 수용체(BCR, MHC, TCR), 세포 표면 단백질, 키나제, 프로테아제, 약물 등에 결합할 수 있다.
본 개시내용은, 예를 들어 라이브러리 펩티드를 코딩할 수 있는 DNA 또는 RNA 구축물을 제공한다. 라이브러리 펩티드는 임의의 폴리펩티드, 단백질, 단백질 융합체, 또는 이들의 단편일 수 있다. 예를 들어, DNA 또는 RNA 구축물은 단백질 에피토프를 포함하는 라이브러리 펩티드를 코딩할 수 있다. DNA 또는 RNA 구축물은 라이브러리 펩티드를 포함하는 단백질 다량체, 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체 등을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다량체는 동종다량체, 예를 들어 동일한 서브유닛 또는 동종올리고머이다. 일부 실시양태에서, 다량체는 이종다량체, 예를 들어 상이한 서브유닛이다.
본원에 기재된 바와 같은 단백질 에피토프를 포함하는 라이브러리 펩티드는, 특정 단백질, 예를 들어 수용체에 결합될 것으로 예측되는 라이브러리 펩티드를 코딩하는 특정 뉴클레오티드 서열을 지칭할 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 대해 임의의 수준의 친화도를 가질 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 대해 높은 친화도를 가질 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 대해 낮은 친화도를 가질 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 대해 친화성을 갖지 않을 수 있다. 단백질, 예를 들어 수용체는 단백질 에피토프에 특이적이거나 특이적이지 않을 수 있다.
또 다른 예로서, 단백질 에피토프를 포함하는 라이브러리 펩티드는, 예를 들어 DNA 구축물을 RNA로 전사한 다음, RNA를 단백질로 번역할 수 있는 IVTT 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 단백질 에피토프의 합성을 위한 무세포 시스템의 사용으로 인해, 뉴클레오티드 서열은 단백질 에피토프의 N 말단에서 메티오닌 잔기를 코딩할 수 있다. N 말단 메티오닌 잔기는 전술한 바와 같이 단백질 에피토프의 나머지로부터 절단될 수 있다.
단백질 에피토프의 결합을 검출하는 데 사용되는 방법.
본원에 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA 구축물의 IVTT 후에, 예를 들어 표적 수용체에 대한 단백질 에피토프의 결합이 결정될 수 있다. 결합은 FACS를 사용하여 평가될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA 구축물의 번역 후, 단백질 에피토프는, 예를 들어 표적 수용체-발현 세포의 샘플에 노출될 수 있다. 그런 다음 세포는, 예를 들어 단백질 에피토프에 특이적일 수 있는 형광 염료로 염색될 수 있다. 그런 다음 형광 신호의 강도에 따라 FACS를 사용하여 염색된 세포를 분류할 수 있다. FACS 분석에 사용되는 염색은, 예를 들어 피코에리트린(PE), 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD), 알로피코시아닌(APC), 또는 이들의 임의의 조합 또는 변형일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 DNA 또는 RNA 구축물의 번역 후, 펩티드 라이브러리는, 예를 들어 표적 수용체의 샘플, 예를 들어 복수의 수용체, 예를 들어 상이한 수용체의 풀에 노출될 수 있다. 상호작용하는 라이브러리 펩티드 및 수용체는, 예를 들어 단백질 에피토프에 특이적일 수 있는 형광 염료로 염색될 수 있다. 단백질 상호작용의 검출을 위한 당업계의 다른 방법은 비제한적으로 ELISA, 웨스턴 블롯, 공동면역침전, 면역전기영동, 친화성 정제, 질량분석법 등을 포함한다.
구축물.
본원에 기재된 구축물은, 예를 들어 DNA 또는 RNA 구축물일 수 있다. 구축물은 또한 인공 핵산을 포함할 수 있다. 구축물의 핵산은, 예를 들어 게놈 DNA, cDNA, tRNA, mRNA, rRNA, 변형된 RNA, miRNA, gRNA, 및 siRNA, 또는 다른 RNAi 분자를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 구축물은 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 적어도 약 30개의 뉴클레오티드, 적어도 약 40개의 뉴클레오티드, 적어도 약 50개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75개의 뉴클레오티드, 적어도 약 100개의 뉴클레오티드, 적어도 약 200개의 뉴클레오티드, 적어도 약 300개의 뉴클레오티드, 적어도 약 400개의 뉴클레오티드, 적어도 약 500개의 뉴클레오티드, 적어도 약 1,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 2,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 5,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 6,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 7,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 8,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 9,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 10,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 12,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 14,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 15,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 16,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 17,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 18,000개의 뉴클레오티드, 적어도 약 19,000개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 20,000개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
링커.
본원에 기재된 구축물은 구축물의 상이한 도메인 사이에 링커를 포함할 수 있다. 링커는 화학 결합, 예를 들어 하나 이상의 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 공유 결합이다. 일부 실시양태에서, 링커는 비공유 결합이다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 이러한 링커는 2∼30개 또는 그 이상의 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는, 예를 들어 표적 분자로부터 히드로겔을 이격시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 링커는 표적 분자와 또 다른 표적 분자 사이에 위치될 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는, 예를 들어 2차 및 3차 구조의 분자 유연성을 제공하기 위해 표적 분자의 도메인 사이에 위치될 수 있다. 링커는 가요성, 강성, 및/또는 본원에 기재된 절단가능한 링커를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 가요성을 제공하기 위해 적어도 하나의 글리신, 알라닌, 및 세린 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 음으로 하전된 술포네이트 기, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기, 또는 피로포스페이트 디에스테르 기를 포함하는 것과 같은 소수성 링커이다. 일부 실시양태에서, 링커는 히드로겔로부터 표적 분자를 선택적으로 방출하도록 절단가능하지만, 조기 절단을 방지하기에 충분히 안정하다.
가장 일반적으로 사용되는 가요성 링커는 주로 Gly 및 Ser 잔기의 스트레치("GS" 링커)로 이루어진 서열을 갖는다. 가요성 링커는 특정 정도의 이동 또는 상호작용을 필요로 하는 도메인을 연결하는 데 유용할 수 있으며 작은 비극성(예를 들어, Gly) 또는 극성(예를 들어, Ser 또는 Thr) 아미노산을 포함할 수 있다. Ser 또는 Thr의 통합은 또한 물 분자와 수소 결합을 형성함으로써 수용액에서 링커의 안정성을 유지할 수 있고, 이에 따라 링커와 단백질 모이어티 사이의 불리한 상호작용을 감소시킬 수 있다.
강성 링커는 구축물의 도메인 사이의 고정된 거리를 유지하고 각 도메인의 독립적인 기능을 유지하는 데 사용될 수 있다. 강성 링커는, 예를 들어 알파 나선 구조 또는 Pro 농후 서열, (XP)n을 가질 수 있으며, X는 임의의 아미노산이 지정된다.
절단가능한 링커는 생체내에서 무기능 도메인을 방출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 환원제 또는 프로테아제의 존재와 같은 특정 조건 하에 절단될 수 있다. 생체내 절단가능한 링커는 이황화 결합의 가역적 성질을 이용할 수 있다. 일례로는 2개의 Cys 잔기 사이에 트롬빈 민감성 서열(예를 들어, PRS)을 포함한다. CPRSC의 시험관내 트롬빈 처리는 트롬빈 민감성 서열의 절단을 유도하는 반면, 가역적 이황화 결합은 손상되지 않은 상태로 유지된다. 이러한 링커는 공지되어 있으며, 예를 들어 [Chen et al. 2013. Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357-1369]에 설명되어 있다. 융합에서 링커의 생체내 절단은, 또한 특정 조건 하에 생체내, 특정 세포 또는 조직에서 발현되거나 특정 세포 구획 내에 구속되는 프로테아제에 의해 수행될 수 있다. 많은 프로테아제의 특이성은 구속된 구획에서 링커의 더 느린 절단을 제공한다.
링커의 예로는 친수성 또는 소수성 링커, 예를 들어 음으로 하전된 술포네이트 기; 지질, 예를 들어 폴리(--CH2--) 탄화수소 쇄, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기, 이의 불포화 변이체, 이의 히드록실화 변이체, 이의 아미드화 또는 그렇지 않은 경우 N-함유 변이체, 비탄소 링커; 탄수화물 링커; 포스포디에스테르 링커, 또는 촉진제의 2개 이상의 성분(예를 들어, 2개의 폴리펩티드)을 공유적으로 연결할 수 있는 다른 분자를 포함한다. 예를 들어, 류신, 이소류신, 발린, 또는 아마도 또한 알라닌, 페닐알라닌, 또는 심지어 티로신, 메티오닌, 글리신 또는 기타 소수성 잔기가 농후한 일련의 잔기와 같은 폴리펩티드의 소수성 영역 또는 폴리펩티드의 소수성 확장을 통해, 표적 분자가 연결된 소수성 지질 구상체와 같은 비공유 링커도 포함된다. 표적 분자 또는 히드로겔의 성분은 전하 기반 화학을 사용하여 연결되어, 표적 분자 또는 히드로겔의 양으로 하전된 성분이 다른 분자의 음전하에 연결될 수 있다.
펩티드 또는 단백질.
본 개시내용은, 예를 들어 펩티드를 코딩할 수 있는 DNA 또는 RNA 구축물을 제공한다. 펩티드는 임의의 폴리펩티드, 단백질, 또는 이의 단편일 수 있다.
펩티드는, 일단 번역되면, 약 3개 내지 약 40,000개의 아미노산, 약 15개 내지 약 35,000개의 아미노산, 약 20개 내지 약 30,000개의 아미노산, 약 25개 내지 약 25,000개의 아미노산, 약 50개 내지 약 20,000개의 아미노산, 약 100개 내지 약 15,000개의 아미노산, 약 200개 내지 약 10,000개의 아미노산, 약 500개 내지 약 5,000개의 아미노산, 약 1,000개 내지 약 2,500개의 아미노산, 또는 이들 사이의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 40,000개 미만의 아미노산, 약 35,000개 미만의 아미노산, 약 30,000개 미만의 아미노산, 약 25,000개 미만의 아미노산, 약 20,000개 미만의 아미노산, 약 15,000개 미만의 아미노산, 약 10,000개 미만의 아미노산, 약 9,000개 미만의 아미노산, 약 8,000개 미만의 아미노산, 약 7,000개 미만의 아미노산, 약 6,000개 미만의 아미노산, 약 5,000개 미만의 아미노산, 약 4,000개 미만의 아미노산, 약 3,000개 미만의 아미노산, 약 2,500개 미만의 아미노산, 약 2,000개 미만의 아미노산, 약 1,500개 미만의 아미노산, 약 1,000개 미만의 아미노산, 약 900개 미만의 아미노산, 약 800개 미만의 아미노산, 약 700개 미만의 아미노산, 약 600개 미만의 아미노산, 약 500개 미만의 아미노산, 약 400개 미만의 아미노산, 약 300개 미만의 아미노산의 길이를 갖거나 또는 그 미만이 유용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩티드는 약 5개 내지 약 200개의 아미노산, 약 15개 내지 약 150개의 아미노산, 약 20개 내지 약 125개의 아미노산, 약 25개 내지 약 100개의 아미노산, 또는 그 이내의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다. 단백질 에피토프는, 일단 번역되면, 약 5개 내지 약 200개의 아미노산, 약 15개 내지 약 150개의 아미노산, 약 20개 내지 약 125개의 아미노산, 약 25개 내지 약 100개의 아미노산, 또는 그 이내의 임의의 범위의 길이를 가질 수 있다.
본원에 기재된 펩티드 라이브러리는 어레이의 표면 상에 복수의 개별 특징을 함유하는 어레이 플랫폼을 함유할 수 있다. 각 특징은 어레이의 표면 상의 계내 또는 시험관내에서 합성되거나 표면 상에 스폿팅된 복수의 개별 펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 분자는 특징 내에서 동일하지만 분자의 서열 또는 동일성은 특징 간에 상이하다. 이러한 어레이 분자에는 대형 합성 펩티드 어레이의 합성이 포함된다.
펩티드 어레이는, 예를 들어 세포 수용체에 결합하는 것으로 알려진 제어 서열을 포함할 수 있다. 제어 서열 및 라이브러리 펩티드에 대한 결합 패턴을 측정하여 어레이 및 검정 프로세스를 적격화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 펩티드 라이브러리는 약 100개, 약 500개, 약 1,000개, 약 2,000개, 약 3,000개, 약 4,000개, 약 5,000개, 약 6,000개, 약 7,000개, 약 8,000개, 약 9,000개, 약 10,000개, 약 15,000개, 약 20,000개, 약 30,000개, 약 40,000개, 약 50,000개, 약 100,000개, 약 200,000개, 약 300,000개, 약 400,000개, 약 500,000개, 또는 그 이상의 상이한 서열을 갖는 펩티드를 포함한다.
본원의 플랫폼은 또한 본원에 제공된 단백질 에피토프의 단백질 상호작용을 결정하기 위한 미세역가 플레이트에 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 미세역가 플레이트는 비제한적으로 96웰, 384웰, 1536웰, 3456웰 및 9600웰 플레이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 초과의 펩티드가 미세역가 플레이트의 각 웰에 존재하며, 즉 펩티드가 풀링되고 표적 단백질과 상호작용하는 개별 펩티드가 검정에서 양성 및 음성 웰의 디콘볼루션(deconvolution)에 의해 결정된다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 일부 측면을 추가로 설명하기 위해 포함되며, 본 발명의 범위를 제한하는 데 사용되어서는 안 된다.
실시예 1: 펩티드 라이브러리의 시험관내 번역
이 실시예는 단백질의 무세포 합성(CFPS)을 입증한다.
펩티드 라이브러리의 CFPS는 광범위한 범위의 다양한 펩티드의 생산을 가능하게 한다. CFPS로 높은 수율을 얻으려면, 번역된 서열의 제1 아미노산이 N-포르밀메티오닌(fMet)인 박테리아 시스템을 사용해야 한다. 이 잔기는 양으로 하전된 아미노 말단(NH3 +) 대신 중성 포르밀기(HCO)를 함유한다는 점에서 메티오닌과 다르다. 박테리아가 fMet를 절단하기 위해 내인성 아미노펩티다제를 사용하고 있지만, fMet의 제거는 서열의 제2 아미노산의 동일성에 따라 불완전하거나 폐지될 수 있다. 예를 들어, 메티오닌 아미노펩티다제는 fMet와 아스파라긴 사이에서 비효율적으로 절단된다. 결과적으로, 이 시스템의 모델 펩티드인 CMV 유래 펩티드는 단쇄 HLA 또는 MHC 디자인에서 fMet-NLVPMVATV(서열번호 1)로 궁극적으로 생산되고; 이에 따라, 전체 분자는 올바르게 폴딩되지 않고 동족 T 세포 수용체를 인식하지 못한다. 이 것은 조 세포 추출물로 만든 박테리아 CFPS 시스템에서 단백질이 생산된다면 예측되는 결과이다. 더욱이, 라이브러리 맥락에서 단일 개별 탬플레이트는 fMet가 있거나 없는 펩티드를 생성할 수 있거나, 또는 처리가 단순히 비효율적인 경우, 둘 다의 혼합물을 생성할 수 있다. 정제된 성분으로만 구성되고 메티오닌 아미노펩티다제가 완전히 결여된 재구성된 CFPS 시스템에서, 모든 라이브러리 변이체는 fMet 잔기로 시작한다.
이 문제를 해결하기 위해, 효소 절단 도메인 및 라이브러리 펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하도록 구축물을 조작했다. 적어도 초기 메티오닌 아미노산을 제거하면, 펩티드 라이브러리의 상한은 더 큰 다양성, 예를 들어 20x을 포함할 수 있고, 이 때 x는 펩티드의 길이인 반면, 메티오닌 잔기를 포함하면, 라이브러리 다양성이 20(x-1)으로 제한된다. 또한, 초기 메티오닌 아미노산을 제거하면 성공적인 펩티드 폴딩 및 측정가능한 수준의 펩티드 발현을 허용했다.
펩티드는 무세포 조건에서 합성되었다. 모든 CFPS 성분을 해동하고 얼음 위에서 혼합한 다음 해당 온도로 이동하여 반응을 개시했다. 하나의 튜브에 다음 시약을 첨가했다: 40%(v/v) PURExpress 용액 A, 30%(v/v)의 PURExpress 용액 B(E6800L, New England Biolabs, Inc.), RN아제 억제제의 0.8U/㎕ 반응물(10777019, ThermoFischer Scientific), 4%(v/v)의 각 이황화 증강제 1 및 2(E6820L, New England Biolabs, Inc.), PBS(12588018, Invitrogen)에 희석된 SUMO-프로테아제의 0.004 U/㎕ 반응물(절단 후 돌출부 절제를 완전히 제거(스카-리스)하기 위해 선택됨), 뉴클레아제 불포함 물, 및 원하는 CFPS 생성물을 코딩하는 해당 플라스미드 DNA의 20 ng/㎕ 반응물. 20, 25, 30 및 37℃의 4가지 상이한 CFPS 온도를 테스트했다. 각각의 표시된 시점에서, 샘플을 채취하고, 튜브를 얼음 위에 놓고 EDTA를 2 mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 중단시켰다.
도 1은 펩티드가 소화되어 절단 도메인을 제거함으로써 다양성이 증가되었음을 나타낸다. 래인 쌍 1-2, 3-4, 5-6, 7-8 및 9-10은 각각 SUMO 도메인이 없는 탬플레이트, 프로테아제가 첨가되지 않은 SUMO 도메인이 있는 탬플레이트, 반응 종료 후 프로테아제가 첨가된 SUMO가 있는 탬플레이트, 반응 중 프로테아제가 존재하는 SUMO 도메인을 갖는 탬플레이트 및 DNA 탬플레이트가 결여된 반응물 상에서 수행된 CFPS 반응을 나타낸다. 홀수 래인의 샘플은 100 mM DTT를 첨가하여 환원된 조건에서 겔 전기영동을 위해 제조했다. 실온에서 4시간 후 튜브를 얼음 위에 놓아 모든 반응을 종료했다. SUMO 프로테아제의 4 U/반응물을 샘플 3-8에 첨가했다. 래인 5-6에 로딩된 반응물에서, 튜브를 10 mM EDTA와 함께 얼음에 놓은 후 프로테아제를 첨가한 다음, 다시 얼음 위에 놓기 전에 추가로 3.5시간 동안 실온으로 옮겼다.
펩티드 이전에 엔테로키나제 절단 도메인을 갖는 별도의 구축물은 또한 웨스턴 블롯에 의해 평가될 때 단백질 생성 및 절단을 나타내었다.
총 단백질 수율을 결정하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행했다. 각 CFPS 샘플을 물, 4x 샘플 버퍼 및 1 M DTT와 혼합하고, 95℃에서 5분 동안 비등한 다음 10% SDS-PAGE 겔에 로딩했다. HRP-항-FLAG 항체를 사용하여 샘플을 블롯팅했다.
도 2는 SUMO 도메인이 있거나 없는 템플레이트를 포함하는 CFPS 반응물 유래의 샘플을 도시한다. 실온에서 4시간 후 튜브를 얼음 위에 놓아 반응을 종결시켰다. 95℃ 비등 단계를 제외하고 상기와 같이 웨스턴 블롯팅을 위해 샘플을 제조했다. 이러한 결과는 SUMO 도메인이 존재하는 경우 그리고 그 경우에만 SUMO 프로테아제가 CFPS 생성물을 절단한다는 것을 입증한다.
실시예 2: 시험관내 번역된 단백질의 3D 구조 평가
이 실시예는 실시예 1에서 제조된 CFPS 단백질이 인식 가능한 3차원 구조로 폴딩되어 있음을 입증한다.
CFPS 단백질은 항체에 의한 입체형태 인식에 대해 테스트되었다. 미스폴딩되거나 폴딩되지 않은 단백질은 항체가 인식하지 못한다. 절단된 효소 도메인을 갖는 CFPS 단백질은 폴딩되어 입체형태 특이적 항체에 의해 인식되었다.
단백질 발현은 ELISA를 통해 측정했다. 플레이트를 100 mM 중탄산염/탄산염 코팅 버퍼에 희석된 항-스트렙타비딘 항체(410501, Biolegend)로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 그런 다음, 웰에 워싱 버퍼(0.05% 트윈-20이 보충된 PBS)를 충전하여 플레이트를 3회 세척하고 블로킹 버퍼(2%(V/V) BSA가 보충된 워싱 버퍼)로 웰을 충전하여 실온에서 2시간 동안 블로킹했다. 그런 다음 웰을 블로킹 버퍼에서 각 CFPS 단백질의 연속 희석액으로 충전한 후 실온에서 1시간 인큐베이션했다. 그 다음, 플레이트를 워싱 버퍼로 3회 세척하고 블로킹 버퍼에 희석된 단백질에 특이적인 0.15 ㎍/㎖ 호스래디시 퍼옥시다제 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다.
3회 더 세척한 후, 각 웰에 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘 기질을 첨가하여 발색하고, 시판되는 중지 용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 플레이트 리더기를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정했다. 흡광도 값을 이중으로 취하고 평균을 냈다. 플레이트를 접착성 플라스틱으로 덮고 모든 인큐베이션 동안 회전 장치에서 부드럽게 교반했다. 각 샘플의 농도는 양성 대조군 단백질의 표준 곡선에서 내삽되었다.
도 3은 선형 에피토프 또는 입체형태 에피토프의 ELISA 검출을 도시하며, 이로부터 올바르게 폴딩된 백분율을 계산했다. SUMO 프로테아제를 두 CFPS 반응물에 모두 첨가했다. 도 3은 SUMO 절단 펩티드 또는 fMet 생성물이 입체형태 에피토프 항체로 인식되어 올바른 폴딩을 보여주었는지 여부를 나타낸다.
FACS 염색을 위해, CMV 농후 T 세포(도너 153, Astarte 3835FE18, Cat # 1049)를 사용했다. 96웰 둥근 바닥 미세역가 플레이트의 웰을 T 세포로 충전하고 세포를 얼음 냉각된 FACS 버퍼(D-PBS, 2 mM EDTA 및 2%(V/V) 소 태아 혈청)로 1회 세척하고, 4℃에서 300 g 회전시키고, 상층액을 제거했다. 그런 다음, 해당 웰을 Fc 수용체 블로킹 용액으로 4℃에서 30분간 부드럽게 교반하면서 블로킹하고, FACS 버퍼로 세척하고, 상층액을 제거했다. FACS 버퍼를 보상 제어 웰에 추가했다.
다음 단계에서, 세포를, 20 nM 양성 대조군 또는 상기 기재된 바와 같이 표시된 CFPS 반응물로부터 채취한 샘플의 희석액과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, FACS 버퍼로 1회 세척했다. FACS 버퍼에 희석된 100 nM 검출 항체를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, PBS로 2회 세척하고, 고정 가능한 생존성 염료 APC-efluor780(1:8000 희석액, 50 ㎕/웰)으로 실온에서 15분 동안 염색했다. 이어서, 플레이트를 FACS 버퍼로 2회 세척하고 고정 버퍼 PBS, 3.7% 포름알데히드(v/v), 2% FBS(v/v)로 고정했다. 마지막으로, 분석을 위해 샘플을 FACS 튜브로 옮겼다.
도 4는 SUMO 절단 후 다량체 단백질의 우측 이동을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> REPERTOIRE IMMUNE MEDICINES, INC. <120> METHODS OF PRODUCING HIGH DIVERSITY PEPTIDE LIBRARIES AND PROMOTING PROTEIN FOLDING <130> 56813-708.601 <140> PCT/US2020/012231 <141> 2020-01-03 <150> 62/788,673 <151> 2019-01-04 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> N-formylmethionine <400> 1 Met Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 10 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Cys Pro Arg Ser Cys 1 5

Claims (80)

  1. 복수의 펩티드를 코딩하는 복수의 핵산 구축물을 포함하는 라이브러리로서, 상기 복수의 핵산 구축물의 핵산 구축물이
    a) 복수의 펩티드로부터 선택된 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 복수의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열
    을 포함하고;
    복수의 펩티드는, 절단가능한 모이어티에 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 절단가능한 모이어티가 절단됨으로써 펩티드의 초기 아미노산 잔기를 절단할 때, 1,000 초과의 펩티드 다양성을 포함하는 것인 복수의 펩티드를 코딩하는 복수의 핵산 구축물을 포함하는 라이브러리.
  2. 제1항에 있어서, 복수의 펩티드로부터 선택된 펩티드는 표적 수용체에 결합하는 것인 라이브러리.
  3. 제1항에 있어서, 복수의 펩티드로부터 선택된 펩티드는 항체, 면역 세포 수용체(BCR, MHC, TCR), 세포 표면 단백질, 키나제, 프로테아제, 약물, 또는 이의 임의의 조합으로부터 선택된 적어도 하나에 결합되는 것인 라이브러리.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 유사 변형체(SUMO) 모이어티인 라이브러리.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 서열번호 2인 라이브러리.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 엔테로키나제인 라이브러리.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 Ulp1 펩티다제인 라이브러리.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌인 라이브러리.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 핵산 구축물의 전사 및 번역 동안 일어나는 것인 라이브러리.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 핵산 구축물의 전사 및 번역 후에 일어나는 것인 라이브러리.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 약 103, 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 또는 약 1014의 펩티드 다양성보다 큰 펩티드 다양성을 갖는 라이브러리.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 라이브러리인 라이브러리.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물은 DNA 구축물인 라이브러리.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물은 RNA 구축물인 라이브러리.
  15. 복수의 펩티드를 포함하는 라이브러리로서, 상기 복수의 펩티드의 펩티드가
    a) 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기;
    b) 절단가능한 모이어티; 및
    c) 펩티드의 나머지
    를 포함하고, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있으며;
    복수의 펩티드는, 절단가능한 모이어티에 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 절단가능한 모이어티가 절단됨으로써 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 절단할 때, 1,000 초과의 펩티드 다양성을 포함하는 것인 복수의 펩티드를 포함하는 라이브러리.
  16. 제15항에 있어서, 복수의 펩티드의 펩티드는 세포 수용체에 결합하는 것인 라이브러리.
  17. 제15항에 있어서, 복수의 펩티드의 펩티드는 T 세포 수용체(TCR)에 결합하는 것인 라이브러리.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 서열번호 2인 라이브러리.
  19. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 유사 변형체(SUMO) 모이어티인 라이브러리.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 엔테로키나제인 라이브러리.
  21. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 Ulp1 펩티다제인 라이브러리.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌인 라이브러리.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 펩티드의 펩티드는 제1 뉴클레오티드 서열로 코딩되고, 상기 제1 뉴클레오티드 서열은 DNA 구축물의 일부인 라이브러리.
  24. 제23항에 있어서, DNA 구축물은 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 절단가능한 모이어티를 코딩하는 것인 라이브러리.
  25. 제24항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 DNA 구축물의 전사 및 번역 동안 일어나는 것인 라이브러리.
  26. 제24항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 DNA 구축물의 전사 및 번역 후에 일어나는 것인 라이브러리.
  27. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 펩티드의 펩티드가 제1 뉴클레오티드 서열로 코딩되고, 상기 제1 뉴클레오티드 서열은 RNA 구축물의 일부인 라이브러리.
  28. 제27항에 있어서, RNA 구축물은 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 제2 뉴클레오티드 서열은 절단가능한 모이어티를 코딩하는 것인 라이브러리.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 RNA 구축물의 번역 동안 일어나는 것인 라이브러리.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 RNA 구축물의 번역 후에 일어나는 것인 라이브러리.
  31. 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 약 103, 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 또는 약 1014의 펩티드 다양성보다 큰 펩티드 다양성을 갖는 라이브러리.
  32. 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 라이브러리인 라이브러리.
  33. 펩티드 라이브러리의 제조 방법으로서,
    a) 복수의 펩티드를 코딩하는 복수의 핵산 구축물을 제공하는 단계로서, 상기 복수의 핵산 구축물의 핵산 구축물이
    i) 복수의 펩티드로부터의 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및
    ii) 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 복수의 펩티드로부터 선택된 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 것인 단계;
    b) 복수의 핵산 구축물을 전사 및 번역, 또는 번역하는 단계; 및
    c) 엔도프로테아제를 사용하여, 임의로, (b)와 동시에, 절단가능한 모이어티를 절단함으로써, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 펩티드의 나머지로부터 절단하는 단계로서, 펩티드로부터 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기의 절단은 펩티드 라이브러리의 적절하게 폴딩된 펩티드를 생성하는 것인 단계
    를 포함하는 펩티드 라이브러리의 제조 방법.
  34. 제33항에 있어서, 복수의 펩티드로부터의 펩티드는 세포 수용체에 결합하는 것인 제조 방법.
  35. 제33항에 있어서, 복수의 펩티드로부터의 펩티드는 T 세포 수용체(TCR)에 결합하는 것인 제조 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 단백질인 제조 방법.
  37. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 서열번호 2인 제조 방법.
  38. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 유사 변형체(SUMO) 모이어티인 제조 방법.
  39. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 엔테로키나제인 제조 방법.
  40. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 Ulp1 펩티다제인 제조 방법.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌인 제조 방법.
  42. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 라이브러리는 약 103, 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 또는 약 1014의 펩티드 다양성보다 큰 펩티드 다양성을 갖는 것인 제조 방법.
  43. 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물은 DNA 구축물인 제조 방법.
  44. 제33항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물은 RNA 구축물인 제조 방법.
  45. 단백질 에피토프를 발현시키기 위한 DNA 구축물로서, 상기 DNA 구축물은
    a) 단백질 에피토프를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 단백질 에피토프의 N 말단에서 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 단백질 에피토프의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열
    을 포함하고,
    DNA 구축물의 전사 및 번역시, 절단가능한 모이어티에 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 절단가능한 모이어티가 절단됨으로써, 단백질 에피토프의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 절단하고,
    단백질 에피토프는 펩티드 라이브러리의 일부인, 단백질 에피토프를 발현시키기 위한 DNA 구축물.
  46. 제45항에 있어서, 후보 펩티드가 세포 수용체에 결합하는 것인 DNA 구축물.
  47. 제45항에 있어서, 후보 펩티드가 T 세포 수용체(TCR)에 결합하는 것인 DNA 구축물.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 유사 변형체(SUMO) 모이어티인 DNA 구축물.
  49. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 서열번호 2인 DNA 구축물.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 엔테로키나제인 DNA 구축물.
  51. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 Ulp1 펩티다제인 DNA 구축물.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌인 DNA 구축물.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 DNA 구축물의 전사 및 번역 동안 일어나는 것인 DNA 구축물.
  54. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 DNA 구축물의 전사 및 번역 후에 일어나는 것인 DNA 구축물.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 라이브러리는 약 103, 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 또는 약 1014의 펩티드 다양성보다 큰 펩티드 다양성을 갖는 것인 DNA 구축물.
  56. 단백질 에피토프를 발현시키기 위한 RNA 구축물로서, 상기 RNA 구축물은
    a) 단백질 에피토프를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및
    b) 단백질 에피토프의 N 말단에서 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 단백질 에피토프의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열
    을 포함하고,
    RNA 구축물의 번역시, 절단가능한 모이어티에 특이적인 엔도프로테아제를 사용하여 절단가능한 모이어티가 절단됨으로써, 단백질 에피토프의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 절단하고,
    단백질 에피토프는 펩티드 라이브러리의 일부인, 단백질 에피토프를 발현시키기 위한 RNA 구축물.
  57. 제56항에 있어서, 후보 단백질이 세포 수용체에 결합하는 것인 RNA 구축물.
  58. 제56항에 있어서, 후보 단백질이 T 세포 수용체(TCR)에 결합하는 것인 RNA 구축물.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 단백질인 RNA 구축물.
  60. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 유사 변형체(SUMO) 모이어티인 RNA 구축물.
  61. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 서열번호 2인 RNA 구축물.
  62. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 엔테로키나제인 RNA 구축물.
  63. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 Ulp1 펩티다제인 RNA 구축물.
  64. 제56항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌인 RNA 구축물.
  65. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 RNA 구축물의 번역 동안 일어나는 것인 RNA 구축물.
  66. 제56항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티의 절단이 RNA 구축물의 번역 후에 일어나는 것인 RNA 구축물.
  67. 제56항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 라이브러리는 약 103, 약 104, 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 또는 약 1014의 펩티드 다양성보다 큰 펩티드 다양성을 갖는 것인 RNA 구축물.
  68. 펩티드의 폴딩 방법으로서,
    a) 펩티드를 코딩하는 핵산 구축물을 제공하는 단계로서, 상기 핵산 구축물은
    i) 펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및
    ii) 절단가능한 모이어티를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 상기 절단가능한 모이어티는, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 제2 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 것인 단계;
    b) 핵산 구축물을 전사 및 번역, 또는 번역하는 단계; 및
    c) 엔도프로테아제를 사용하여, 임의로, (b)와 동시에, 절단가능한 모이어티를 절단함으로써, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기를 펩티드의 나머지로부터 절단하는 단계로서, 펩티드의 적어도 하나의 N 말단 아미노산 잔기의 절단은 폴딩된 펩티드를 생성하는 것인 단계
    를 포함하는 펩티드의 폴딩 방법.
  69. 제68항에 있어서, 펩티드는 세포 수용체에 결합하는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 펩티드는 T 세포 수용체(TCR)에 결합하는 것인 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 유사 변형체(SUMO) 모이어티인 방법.
  72. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 서열번호 2인 방법.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 엔테로키나제인 방법.
  74. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도프로테아제는 Ulp1 펩티다제인 방법.
  75. 제68항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 N 말단 아미노산 잔기는 메티오닌인 방법.
  76. 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물은 DNA 구축물인 방법.
  77. 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구축물은 RNA 구축물인 방법.
  78. 입체형태 단백질 에피토프의 라이브러리의 제조 방법으로서,
    a) 복수의 핵산 구축물에서 코딩된 복수의 단백질 에피토프를 얻는 단계로서, 상기 복수의 핵산 구축물의 핵산 구축물은 단백질 에피토프의 N 말단에서 절단가능한 모이어티를 추가로 코딩하고, 절단가능한 모이어티는, 단백질 에피토프의 초기 아미노산 잔기가 절단가능한 모이어티의 앞 또는 내부에 있도록 위치되는 것인 단계;
    b) 임의로, 복수의 핵산 구축물을 전사하는 단계로서, 복수의 리보핵산 분자가 복수의 핵산 구축물로부터 전사되는 것인 단계;
    c) 복수의 리보핵산 분자를 번역하는 단계로서, 복수의 단백질 에피토프는 복수의 리보핵산 분자로부터 번역되는 것인 단계; 및
    d) 프로테아제를 사용하여, 임의로, (c)와 동시에, 절단가능한 모이어티를 절단함으로써, 후보 단백질 에피토프의 초기 아미노산 잔기를 후보 단백질 에피토프의 나머지로부터 절단하는 단계
    를 포함하는, 입체형태 단백질 에피토프의 라이브러리의 제조 방법.
  79. 제78항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 소형 유비퀴틴 관련 변형체(SUMO) 모이어티인 제조 방법.
  80. 제78항에 있어서, 절단가능한 모이어티는 서열번호 2인 제조 방법.
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