KR20210124088A - 로즈마린산 유도체, 로즈마린산-유래 입자 및 이를 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 로즈마린산 유도체, 로즈마린산-유래 입자 및 이를 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 로즈마린산 유도체 및 로즈마린산-유래 입자를 이용하는 경우, 낮은 수용성과 낮은 생체 이용률로 인해 활용이 제한되었던 로즈마린산을 의약 용도로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 로즈마린산 유도체, 로즈마린산-유래 입자 및 이를 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
로즈마리를 포함한 여러 식물에서 발견되는 활성 성분인 로즈마린산(rosmarinic acid, RA)는 가장 중요한 폴리 페놀계 산화 방지제 중 하나이다. 실제로, RA의 다양한 질병을 치료하기 위한 치료제로서의 잠재력을 입증하기 위해 엄청난 노력이 기울여져 왔다. RA의 항산화 및 면역 조절 능력으로 인해, RA는 항 염증, 항암 및 항균 작용을 입증하였다. 이러한 높은 잠재력에도 불구하고, RA는 다른 소분자 생물 활성 화합물을 괴롭히는 불량한 수용성 및 낮은 생체 이용률의 문제에 직면하여 그의 임상적 잠재력이 제한 받고 있다.
Adomako-Bonsu, A. G. et al., Antioxidant activity of rosmarinic acid and its principal metabolites in chemical and cellular systems: Importance of physico-chemical characteristics. Toxicol In Vitro 2017, 40, 248-255.
Zhu, F. et al., Rosmarinic acid extract for antioxidant, antiallergic, and alpha-glucosidase inhibitory activities, isolated by supramolecular technique and solvent extraction from Perilla leaves. J Agric Food Chem 2014, 62 (4), 885-92.
본 발명자들은 로즈마린산의 낮은 수용성과 낮은 생체 이용률을 개선하고 이를 다양한 용도에 사용하기 위한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 로즈마린산을 친수성 개질제로 개질시킨 화합물을 제조하고, 이 화합물이 수계에서 자가조립되어 입자를 형성함을 확인하고, 이 입자의 항염증 효과, 항산화 효과, 약물전달체로서의 가능성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다음 화학식으로 표시되는 로즈마린산 유도체를 제공하는 것이다:
본 발명의 다른 목적은 상기 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세 입자를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세 입자를 유효성분으로 포함하는 항염증용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 로즈마린산 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세 입자의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식으로 표시되는 로즈마린산 유도체를 제공한다:
상기 -X는 친수성 그룹이고, 친수성화 개질제 H-X (H는 수소)로부터 유래한 것임.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 친수성화 개질제 H-X는 로즈마린산의 카르복실 그룹(-COOH)와 공유결합하여 상기 친수성 그룹 -X를 포함하는 로즈마린산 유도체를 형성하는 것이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 친수성화 개질제 H-X는 H-(Y-Z)이고, 상기 -Y-는 로즈마린산의 카르복실 그룹(-COOH)과 공유 결합 가능하고, 상기 -Z와도 공유결합 가능한 연결기이고, -Z는 H-Z 화합물에서 유래하며 (H는 수소), 상기 연결기 -Y-를 통해 로즈마린산의 카르복실 그룹에 결합되어 상기 친수성 그룹 -(Y-Z)를 포함하는 로즈마린산 유도체를 형성하고,
상기 H-Z 화합물은 덱스트란 (dextran), 카르보덱스트란(carbodextran), 덱스트린(dextrin), 헤파린(heparin), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 키틴(chitin), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 콜라겐, 젤라틴, 아카시아 검, 피브린, 히알루론산, 펙틴, 아가로즈(agararose), 갈락토만난(Galactomannan), 잔탄 검(Xanthan gum), 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 알긴산, 폴리사카라이드(polysaccharide), 사이클로덱스트란(cyclodextran), 풀루란(pluronic), 셀룰로오즈(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 카르보하이드레이트(carbohydrate), 단당류(monosaccharide), 이당류(bisaccharide), 올리고당류 (oligosaccharide), 아미노산(amino acid), 폴리펩타이드(polypeptide), 폴리포스파젠 (polyphosphagen), 폴리말릭산(polymaleic acid), 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate), 폴리하이드로옥시부틸레이트(polyhydroxybutylate), 폴리카르보네이트(polycarbonate), 폴리오르소에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(methoxy polyethyleneglycol, mPEG), 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymetacrylate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리(아크릴산염)(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinylester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리옥사이드(polyoxide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌옥사이드(Polyethyleneoxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide-bpropyleneoxide]), 및 폴리라이신(Polylysine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 연결기 -Y-는 상술한 친수성화 개질제 H-Z 화합물에서 유래한 -Z- 를 반복 단위로 1개 이상 결합된 연결기일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 연결기 -Y-는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리아크릴릭애시드 (PAA), 폴리아크릴로니트릴 (PAN), 폴리에틸렌옥사이드 (PEO), 폴리비닐아세테이트 (PVAc), 폴리비닐알코올 (PVA), 또는 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 반복 단위로 1개 이상 결합된 연결기일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 친수성화 개질제 H-X는 덱스트란 (dextran), 카르보덱스트란(carbodextran), 덱스트린(dextrin), 헤파린(heparin), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 키틴(chitin), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 콜라겐, 젤라틴, 아카시아 검, 피브린, 히알루론산, 펙틴, 아가로즈(agararose), 갈락토만난(Galactomannan), 잔탄 검(Xanthan gum), 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 알긴산, 폴리사카라이드(polysaccharide), 사이클로덱스트란(cyclodextran), 풀루란(pluronic), 셀룰로오즈(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 카르보하이드레이트(carbohydrate), 단당류(monosaccharide), 이당류(bisaccharide), 올리고당류 (oligosaccharide), 아미노산(amino acid), 폴리펩타이드(polypeptide), 폴리포스파젠 (polyphosphagen), 폴리말릭산(polymaleic acid), 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate), 폴리하이드로옥시부틸레이트(polyhydroxybutylate), 폴리카르보네이트(polycarbonate), 폴리오르소에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(methoxy polyethyleneglycol, mPEG), 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymetacrylate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리(아크릴산염)(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinylester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리옥사이드(polyoxide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌옥사이드(Polyethyleneoxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide-bpropyleneoxide]), 및 폴리라이신(Polylysine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명에서 사용가능한 친수성 개질제를 구성하는 상기 H-Z 화합물, 또는 친수성 개질제 H-X는 콜라겐, 키토산, 젤라틴, 아카시아 검, 덱스트란, 피브린, 히알루론산, 펙틴, 아가로즈(agararose), 갈락토만난(Galactomannan), 잔탄 검(Xanthan) 및 알지네이트 등이 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키토산은 친수성 또는 저분자량의 키토산이다. 상기 친수성 또는 저분자량의 키토산은 키토올리고사카라이드를 잘게 파편화시키는 과정(fractionation)에 의해 제조된 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 친수성 또는 저분자량의 키토산은 3 kDa 내지 30 kDa, 보다 구체적으로는 3 kDa 내지 25 kDa , 3 kDa 내지 20 kDa, 3 kDa 내지 15 kDa, 3 kDa 내지 10 kDa, 5 kDa 내지 30 kDa , 5 kDa 내지 25 kDa , 5 kDa 내지 20 kDa, 5 kDa 내지 15 kDa, 5 kDa 내지 10 kDa의 분자량을 가진 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분자량은 수평균 분자량일 수 있다. 상기 분자량은 상기 수치 범위 사이의 정수 뿐만 아니라, 모든 소수점 단위에 해당하는 수치를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 히알루론산은 1 내지 300 kDa, 1 내지 250 kDa, 1 내지 200 kDa, 1 내지 150 kDa, 1 내지 125 kDa, 1 내지 100 kDa, 1 내지 75 kDa, 1 내지 50 kDa, 1 내지 30 kDa, 30 내지 300 kDa, 30 내지 250 kDa, 30 내지 200 kDa, 30 내지 150 kDa, 30 내지 125 kDa, 30 내지 100 kDa, 30 내지 75 kDa, 30 내지 50 kDa, 50 내지 300 kDa, 50 내지 250 kDa, 50 내지 200 kDa, 50 내지 150 kDa, 50 내지 125 kDa, 50 내지 100 kDa, 50 내지 75 kDa, 75 내지 300 kDa, 75 내지 250 kDa, 75 내지 200 kDa, 75 내지 150 kDa, 75 내지 125 kDa, 75 내지 100 kDa, 100 내지 300 kDa, 100 내지 250 kDa, 100 내지 200 kDa, 100 내지 150 kDa, 100 내지 125 kDa, 125 내지 300 kDa, 125 내지 250 kDa, 125 내지 200 kDa, 125 내지 150 kDa, 150 내지 300 kDa, 150 내지 250 kDa, 150 내지 200 kDa, 200 내지 300 kDa, 200 내지 250 kDa, 1 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 50 kDa, 75 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 또는 300 kDa이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분자량은 수평균 분자량일 수 있다. 상기 분자량은 상기 수치 범위 사이의 정수 뿐만 아니라, 모든 소수점 단위 해당하는 수치를 포함한다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명에서 사용가능한 친수성 개질제를 구성하는 상기 H-Z 화합물, 또는 친수성 개질제 H-X는 2개 이상(예컨대 2-50개)의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드 등이 있다. 상기 아미노산에는 천연형 아미노산뿐만 아니라, 비천연 아미노산도 포함된다. 친수성 아미노산에는 글루타민, 아스파라긴산, 글루탐산, 트레오닌, 아스파라긴, 아르기닌, 세린 등이 있으며, 소수성 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판, 이소류신, 류신, 프롤린, 메티오닌, 발린, 알라닌 등이 있다. 비코드화된 친수성 아미노산은, 예를 들어, Cit 및 hCys 등이 있다. 당업자는 이러한 정보와 펩타이드 합성기술을 바탕으로 친수성의 펩티드를 용이하게 합성하여 본 발명의 로즈마린산 유래 미세 입자의 제조에 사용할 수 있다.
또한, 상기 친수성 개질제의 범위에는, 위에서 언급한 고분자 뿐만 아니라, 이들의 유도체도 포함된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체이다.
본 발명에서 폴리에틸렌 글리콜의 유도체는, 예를 들면, 메톡시 PEG(methoxy polyethylene glycol), PEG 프로피론산의 숙시니미드(succinimide of PEG propionic acid), PEG 부타논산의 숙시니미드(succinimide of PEG butanoic acid), 가지 달린 PEG-NHS(branched PEG-NHS), PEG 숙시니미딜 숙시네이트(PEG succinimidyl succinate), 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드(succinimide of carboxymethylated PEG), PEG의 벤조트리아졸 카보네이트(benzotriazole carbonate of PEG), PEG-글리시딜 에테르(PEG-glycidyl ether), PEG-옥시카보닐이미다졸(PEGoxycarbonylimidazole), PEG 니트로페닐 카보네이트(PEG nitrophenyl carbonates), PEG-알데히드(PEGaldehyde), PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에스테르(PEG succinimidyl carboxymethyl ester) 및 PEG 숙시니미딜에스테르(PEG succinimidyl ester) 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 친수성 개질제는 로즈마린산의 카르복실기에 결합되어 양친매성 복합체를 형성한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 로즈마린산 유도체는 로즈마린산과 상기 친수성 개질제와의 가교반응에 의해 제조될 수 있다. 상기 가교반응은 화학적 가교제에 의해 이루어진다. 상기 화학적 가교제로는 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), DCC (dicyclohexyl carbodiimide), NHS (N-hydroxysuccinimide), Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide), imidoester 계열 가교제, Sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 화학적 가교제를 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 로즈마린산 또는 상기 친수성 개질제는 아민기를 가지거나, 아민기를 가지도록 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 구현예에 있어서, 상기 친수성 개질제는 측쇄 또는 말단에 아민기를 가지나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 로즈마린산 유도체를 구성하는 로즈마린산 및 친수성 개질제의 중량비는 1:1 내지 1:15, 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:8, 1:1 내지 1:7, 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:4, 1:1 내지 1:3, 1:1 내지 1:2, 1:15, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 또는 1:1이다. 상기 중량비는 상기 수치 범위 사이의 정수 뿐만 아니라, 모든 소수점 단위에 해당하는 수치를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세 입자를 제공한다.
상기 용어 "포함하는"은 로즈마린산 유도체로만 구성될 수도 있고, 상기 로즈마린산 유도체뿐만 아니라 추가적인 물질을 더 포함하여 미세 입자를 구성할 수도 있음을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세입자는 상기 로즈마린산 유도체가 자기-조립하여 형성된 입자로서, 수계에서 자기-조립하여 형성된 미세 입자일 수 있다.
본 발명의 미세 입자를 이루는 상기 로즈마린산 유도체에서 친수성 개질제는 친수성 모이어티를 구성하고, 로즈마린산은 소수성 모이어티를 구성한다. 친수성 모이어티는 친수성인 중합체 또는 소분자를 의미하고, 소수성 모이어티는 소수성인 중합체 또는 소분자를 의미한다. 본 발명의 복수개의 로즈마린산 유도체의 자가조립에 의해 형성된 입자는 소수성 모이어티를 구성하는 로즈마린산이 소수성 코어를 갖는 마이셀 구조를 형성하고, 친수성 모이어티를 구성하는 키토산이 코어의 바깥 쪽으로 배향한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세입자는 10 내지 5,000 nm, 보다 구체적으로는 10 내지 4,000 nm, 10 내지 3,000 nm, 10 내지 2,000 nm, 10 내지 1,000 nm, 10 내지 800 nm, 10 내지 600 nm, 10 내지 500 nm, 10 내지 400 nm, 10 내지 350 nm, 10 내지 300 nm, 10 내지 250 nm, 10 내지 220 nm, 10 내지 200 nm, 10 내지 150 nm, 10 내지 140 nm, 10 내지 130 nm, 10 내지 120 nm, 또는 10 내지 110 nm; 20 내지 350 nm, 20 내지 220 nm, 20 내지 200 nm, 20 내지 150 nm, 20 내지 140 nm, 20 내지 130 nm, 20 내지 120 nm, 또는 20 내지 110 nm; 30 내지 350 nm, 30 내지 220 nm, 30 내지 200 nm, 30 내지 150 nm, 30 내지 140 nm, 30 내지 130 nm, 30 내지 120 nm, 또는 30 내지 110 nm; 40 내지 350 nm, 40 내지 220 nm, 40 내지 200 nm, 40 내지 150 nm, 40 내지 140 nm, 40 내지 130 nm, 40 내지 120 nm, 또는 40 내지 110 nm; 50 내지 350 nm, 50 내지 220 nm, 50 내지 200 nm, 50 내지 150 nm, 50 내지 140 nm, 50 내지 130 nm, 50 내지 120 nm, 또는 50 내지 110 nm; 100 내지 350 nm, 100 내지 220 nm, 100 내지 200 nm, 100 내지 150 nm, 100 내지 140 nm, 100 내지 130 nm, 100 내지 120 nm, 또는 100 내지 110 nm의 입자크기를 가지나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 미세 입자의 크기는 동적광산란(dynamic light scattering, DLS)에 의해 측정시 수력학적 직경(hydrodynamic diameter)이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 미세 입자를 포함하는 약물전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 본 발명의 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세 입자는 운반대상(cargo)을 봉입할 수 있다. 운반대상이 소수성 물질인 경우 나노입자의 내부에 봉입되거나, 본 발명의 미세 입자를 구성하는 막 중 소수성 부분에 포집(intergrate) 될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서, 용어 "봉입"은 운반대상의 포집을 포함하는 넓은 개념으로 사용된다.
하나의 특정예에서, 상기 운반대상은 약물이다. 상기 약물에는 친수성 약물, 소수성 약물, 화학약물 및 바이오 약물이 모두 포함된다. 이러한 약물로는, 예를 들면, 항암제, 항산화제, 항염증증제, 진통제, 항관절염제, 진정제, 항우울증제, 항정신병 약물, 신경안정제, 항불안제, 항혈관신생 억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식용억제제, 항히스타민제, 호르몬제, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제 및 혈관 확장제 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세 입자는 활성산소를 소거할 수 있다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 미세 입자는 활성산소를 소거할 수 있으며, 염증 조직에 선택적으로 축적될 수 있으므로 염증조직의 염증을 치료하는 데 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 미세 입자는 활성산소종과의 접촉시 활성산소종을 소거시키며 와해(disassembled or disruption)되어 봉입된 운반대상을 주위로 방출시킬 수 있다.
하나의 특정예에서, 본 발명의 미세 입자가 덱사메타손과 같은 항염증제를 봉입하는 경우, 본 발명의 미세 입자는 염증반응이 있는 염증성 조직에 선택적으로 축적될 수 있으며, 염증부위의 활성산소종과 반응하여 미세 입자가 와해됨으로써 염증 조직으로 항염증제를 방출할 수 있고, 방출된 항염증제에 의하여 염증성 질환에 대한 치료효과를 거둘 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 로즈마린산 유도체, 이를 포함하는 미세 입자, 또는 이들의 조합; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항염증용 또는 염증개선용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 로즈마린산 유도체, 이를 포함하는 미세 입자, 또는 이들의 조합; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증성 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항염증용은 염증성 질환의 예방 용도 및 치료 용도를 의미한다. 상기 염증성 질환에는 예를 들면, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD), 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 죽상경화증, 인후염, 편도염, 폐렴, 위 궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증 등이 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항염증용은 만성염증성 질환의 예방 용도 및 치료 용도를 의미한다. 상기 만성 염증성 질환에는 예를 들면, 비알콜성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis), 폐렴, 폐섬유화(pulmonary fibrosis), 신장염, 신부전(kidney failure), 방광염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성경화증(multiple sclerosis), 천식(asthma), 동맥경화증(atherosclerosis), 심근경색, 췌장염, 당뇨병, 건선(psoriasis), 골다공증, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 전신성염증반응증후군, 패혈증, 치매(dementia) 등이 있다. 상기 만성 염증성 질환은 전신의 염증 반응으로 인해 발병이 가능하거나, 상기 염증성 질환의 발명으로 전신에 염증반응을 일으키는 질환이다. 본 명세서에서 용어 "염증성 장질환"은 장, 즉 소장, 및 대장에 염증이 생기는 질환을 의미하며, 장관 내 비정상적인 만성 염증이 호전과 재발을 반복하는 질환을 포함한다. 또한, 원인이 밝혀진 특이성 장염, 원인이 밝혀지지 않은 비특이성 장염, 및 타질환으로부터 야기된 장염, 예를 들어 장형 베체트병 등을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(crohn's disease), 장형 베체트(intestinal behcet's disease), 불확정 대장염(indeterminate colitis), 세균성 장염, 바이러스성 장염, 아메바성 장염, 출혈성 직장 궤양, 장누수증후군, 허혈성 대장염 및 결핵성 장염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이나 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적으로 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염 또는 크론병이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미세 입자는 MPO(myeloperoxidase) 활성을 저해시키고, 염증 조직에서 호중구의 침윤을 억제한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미세 입자는 염증 유발 사이토카인(TNF-alpha, IFN-gamma, IL-1beta, IL-6 및 IL-12)의 수준을 감소시킨다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 미세 입자는 H2O2, AAPH, 및 NaOCl 등 ROS를 소거하는 효능이 우수하여 항산화 제제로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 미세 입자는 대식세포를 타겟팅하여 작용한다. 보다 구체적으로, 본 발명의 입자는 대식세포에서 염증과 관련된 사이토카인인 IL-1beta, IL-6, 및 TNF-alpha의 발현 및 분비를 억제하고, 손상된 조직의 회복에 관여하는 사이토카인인 TGF-beta, 및 IL-10의 발현 및 분비를 촉진하므로 항염증용 제제 또는 염증개선용 제제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 입자는 염증성 장질환에 의한 체중의 감소를 정상화시키는 효과를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 입자는 염증성 장질환에 의한 질병활성도(DAI)를 낮추는 효과를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 입자는 염증성 장질환에 의한 결장의 길이 감소를 정상화시키는 효과를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 입자는 염증성 장질환에 의한 장의 손상을 나타내는 지표인 ZO-1, Claudin-1 및 Occludin-1 유전자의 mRNA 발현양을 정상 수준에 가깝게 증가시키는 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 입자는 마이크로바이옴 분포와 관련하여, 염증성 장질환 모델 마우스의 마이크로바이옴 분포를 정상 마우스와 유사한 마이크로바이옴 분포로 정상화시키는 예측불가의 우수한 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분인 본 발명의 로즈마린산 유도체 또는 이를 포함하는 미세 입자는 경구 투여시 장내 염증 뿐만 아니라, 전신성 염증을 나타내는 지표를 개선하는 효과가 있으므로, 전신성, 만성염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 약제학적으로 허용되는 담체가 포함된다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 가능하며, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하투여 또는 국부투여될 수 있다. 또한, 그밖에도 경구투여, 직장투여, 흡입투여, 경비투여 등이 가능하다. 본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구투여용이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 대상(subject)에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 상술한 바와 같이 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포, 조직 또는 기관으로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 명세서에서 용어 "대상(subject)"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환의 증상을 호전시키거나 완치시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 입자의 약제학적 유효량을 포함한다. 상기 약제학적 유효량은 상기한 입자가 약리학적 효과를 달성하는데 충분한 양을 의미한다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 염증성 장질환 또는 만성 염증성 질환의 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있는 유효 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 글루코코르티코스테로이드(glucocorticosteroid) 등의 스테로이드류, 설파 살라진 (sulfasalazine), 메살라진(mesalazine) 등의 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid, 5-ASA) 계통 약물, 항-TNF-α 단일클론항체 등이다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 로즈마린산 유도체, 미세 입자, 또는 이들의 조합을 포함하는 염증개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 로즈마린산 유도체, 미세 입자, 또는 이들의 조합을 포함하는 항산화용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등의 형태로 제조될 수 있다. 예컨대 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 상기 로즈마린산 유도체, 입자, 또는 이들의 조합 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 로즈마린산 유도체, 미세 입자, 또는 이들의 조합 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 로즈마린산 유도체, 미세 입자, 또는 이들의 조합을 포함하는 항염증, 또는 염증 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물 및 사료 조성물에 포함되는 로즈마린산 유도체, 입자, 또는 이들의 조합에 관한 내용은 상기 약제학적 조성물에 포함되는 로즈마린산 유도체, 입자, 또는 이들의 조합에 관한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 로즈마린산 유도체의 제조방법을 제공한다.
(a) 로즈마린산을 카르복실기 활성화제와 반응시켜 카르복실기를 활성화시키는 단계; 및
(b) 친수성 개질제와 반응시키는 단계.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 카르복실기 활성화제는 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 또는 N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (a) 단계의 반응에 N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS)가 첨가될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 로즈마린산 또는 상기 친수성 개질제는 아민기를 가지거나, 아민기를 가지도록 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 친수성 개질제는 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 또는 키토산이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 친수성 개질제는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리아크릴릭애시드 (PAA), 폴리아크릴로니트릴 (PAN), 폴리에틸렌옥사이드 (PEO), 폴리비닐아세테이트 (PVAc), 및 폴리비닐알코올 (PVA)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 한 개의 연결기로 연결될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b) 단계의 반응은 아미드 결합 반응일 수 있다.
상기 본 발명의 로즈마린산 유도체의 제조방법은 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 로즈마린산 유도체를 제조하는 방법이므로, 친수성 개질제 등 양 발명 간에 공통되는 내용은 본 발명의 로즈마린산 유도체의 제조방법에도 동일하게 적용된다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세 입자의 제조방법을 제공한다:
(a) 상술한 로즈마린산 유도체를 유기용매에 용해시키는 단계;
(b) 상기 유기용매를 제거하여 로즈마린산 유도체로 이루어진 필름층을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 필름층에 친수성 용매를 가하여 자기-조립(self-assembly)에 의해 생성된 미세 입자를 제조하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유기용매는 N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드(DMF), 에탄올, 메탄올, 에틸 아세테이트(ethyl acetate: EA), 디에틸에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 디클로로벤젠, 디메틸벤젠, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니며 본 발명의 로즈마린산 유도체를 용해시키고 유기용매를 휘발시켜 필름 층을 얻을 수 있는 유기용매이면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 제조방법은 본 발명의 도면 및 실시예에 상세하게 설명되어 있다.
본 발명은 로즈마린산 유도체, 로즈마린산-유래 입자 및 이를 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 로즈마린산 유도체 및 로즈마린산-유래 입자를 이용하는 경우, 낮은 수용성과 낮은 생체 이용률로 인해 활용이 제한되었던 로즈마린산을 의약 용도로 활용할 수 있다.
도 1은 PEG-RA 및 RANP의 특성 확인을 위한 합성 계획을 나타낸 도이다. (A) RA 및 PEG화된 RA (PEG-RA)의 화학 구조. 아미드 결합을 통한 유리 RA 및 유리 mPEG2000-아민으로부터 출발하는 PEG-RA의 합성 및 PBS에서 PEG-RA로부터의 자기 조립을 통한 RANP의 형성. (B) 음성 염색을 한 대표적인 TEM 이미지. 삽화: 개별 RANP의 확대 이미지. 스케일 바 : 100 nm. (C) DLS를 사용하여 유체 역학적 직경을 측정함으로써 결정된 RANP의 크기 분포. 입자 크기는 40 내지 120nm (평균, ~ 60nm) 범위였다.
도 2는 PEG-RA의 특성 확인에 관한 도이다. (A) PEG-RA의 DMSO-d6 에서의 1H-NMR 스펙트럼. (B) mPEG-아민 및 PEG-RA의 MALDI-TOF/MS 스펙트럼. (C) UV-Vis 흡수 스펙트럼: RA (25 μg/mL), mPEG-amine (10 mg/mL) 및 PEG-RA (0.1 mg/mL). (D) PEG-RA의 FTIR 스펙트럼.
도 3은 필름 형성 및 재수화 방법에 의한 RANP 형성 과정에 대한 개략도이다. Chloroform containing PEG-RA (1-2 mol%)를 포함하는 클로로포름을 진공에서 증발시키거나 질소가스를 이용하여 유기용매를 완전히 제거하여 건조시켜 필름층을 만든다. 그런 다음, 제조된 필름층에 PBS 완충액을 가하여 필름층을 수화시키고, 초음파를 처리하여 RANP를 제조한다.
도 4는 RANP의 PBS(pH 7.4)에서 4°C에서 14일간 보관시의 DLS로 측정된 입자 크기 및 안정성 데이터를 나타낸 도이다.
도 5는 (C) Determination of the critical micelle concentration of RANPs in PBS (pH 7.4)에서 25 °C 조건 하에 RANP의 임계 미셀농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다. 폴리머 수성 용매(polymer aqueous solution)의 분산 강도(scattering intensity)는 0.01-10,000 nM의 농도 범위에서 조사되었다.
도 6은 ROS 소거를 통한 RANP의 생체 내 세포 보호 효과를 나타낸 도로서, H2O2에 대한 소거 활성을 측정하여 RANP의 항산화 능력을 평가한 도이다. HRP/dye 시약을 사용하여 형광 강도를 측정함으로써, H2O2 (50 μM) 및 40 분 동안 상이한 농도의 RANP (1-1000 nM)로 처리한 후 남은 H2O2의 농도를 정량하였다.
도 7은 ROS 소거를 통한 RANP의 생체 내 세포 보호 효과를 나타낸 도로서, 대조군 (배양 배지)으로 정규화 된 H2O2-처리 된 CHO-K1 세포에 대한 RANP의 세포 보호 효과를 나타낸 도이다. 세포를 상이한 농도의 H2O2 (50 및 100 μM) 및 RANP (0, 1, 10, 100 μM)로 처리하고, 이어서 24 시간 인큐베이션 후 WST-8 분석에 의해 세포 생존율을 측정하였다.
도 8은 RANP의 세포보호 효과를 나타내는 WST-8 분석 결과의 사진이다.
CHO-K1 세포는 8시간 동안 H2O2 (100 or 50 μM), H2O2 (100 or 50 μM) + RANPs (100, 10, or 1 μM) 또는 배양배지만(control)을 처리한 후, 추가로 24시간 동안 인큐베이션되었다. RANP로 처리된 세포들과 대조군의 차이는 각 그룹별 WST-8 분석 결과의 발색 강도를 기초로 측정되었다.
도 9는 ROS (H2O2)에 의해 유도된, DLS로 측정된 RANP의 입자의 크기 변화를 나타낸 도이다. RANP는 서로 다른 농도의 H2O2 (0.1 to 10 mM)에 10분간 처리되었고, 그후 빠르게 나노입자가 붕괴되는 것이 DLS 측정에 의해 확인되었다.
도 10은 DEX-로딩된 RANPs의 제조 및 특성 확인에 대한 개략도이다. (A) DEX-로딩된 RANPs의 수용성 용매 내에서의 자기 조립과 얇은 필름 수화법의 개략적인 방법을 나타낸 도이다. PEG-RA 필름과 DEX (1:10 mol%)를 PBS (pH 7.4)에서 수화시킨다. 10분간 초음파를 처리하고, 로딩되지 않은 자유 DEX를 겔 여과로 제거하고, DEX가 로딩된 RANP만 나노입자만 회수한 후, RANPs 내 봉입된 DEX를 0.5% Triton-X로 처리하여 방출시키고, HPLC 분석으로 농도 측정을 하여 정량화 하였다. (B) DEX-로딩된 RANP에 0.5% Triton-X가 있는 ACN:10 mM PBS (pH 7.0) (30:70 v/v)로 처리한 후 확인한 HPLC 크로마토그램. (Retention times: PEG-RA, 4.21 minutes; DEX, 20.478 minutes). (C) DLS를 이용하여 측정한 유체역학적 직경을 측정하여 나타낸 RANPs의 크기 분포. 입자 크기의 분포는 40-120 nm이고, 평균으로는 ~60 nm이다.
도 11은 I.V. 투여 후의 RANP의 약동학을 나타낸 도로서, 평균 혈장 농도-시간 곡선을 나타낸 도이다. 단일 정맥 내 투여(30 mg/kg) 후 0, 0.083, 0.167, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 및 16 시간에 각 마우스로부터의 혈액 샘플을 수집하였다.
도 12는 건강한 마우스 및 3 % DSS-유도된 결장염 마우스에서 ICG-로딩 된 RANP의 생물학적 분포를 나타낸 도이다. (A) 건강한 정상 마우스 및 (B) ICG-로딩 된 RANP(ICG @ RANP; 1.55 mg ICG; 20 mg PEG-RA)로 처리된 IBD 모델 마우스에서 투여 5 시간 후 채취한 주요 기관 (비장, 신장, 간, 폐, 심장 및 결장)에서의 생체 분포 이미지. ICG-로딩 된 RANP는 IBD 마우스의 결장 조직에서 상당한 축적을 나타냈다.
도 13 내지 도 16은 DSS- 손상 마우스의 RANP 처리를 위한 전반적인 실험 설계 및 그 결과를 나타낸 도이다. 마우스에게 일반 식수 (H2O) 또는 3 % DSS를 함유한 식수를 5일 동안 자유롭게 제공하였다. 마우스에 RANP (10, 20 또는 30 mg/kg/일) 또는 PBS를 격일로 10 일 동안 후안와 투여하였다(도 13). 10 일에 걸친 각 그룹의 마우스에서 DAI의 변화(도 14). 10 일에 걸친 각 그룹에서 마우스의 일일 체중 변화(도 15). IBD 마우스 모델에서 결장 길이에 대한 RANP의 효과(도 16). 10 일에 마우스를 희생시키고, 결장을 수확하여 이미지화하고, 길이를 비교하였다. 결장 길이의 대표적인 사진 및 통계 분석이 제시되었다.
도 17 내지 도 23은 DSS-유도된 결장염 모델에서 RANP의 항 염증 효과를 나타낸 도이다. 마우스의 결장 샘플에서 ELISA에 의해 측정된 (도 17) MPO 활성 및 전-염증성 사이토 카인: (도 18) TNF-alpha, (도 19) IFN-gamma, (도 20) IL-1beta, (도 21) IL-6 및 (도 22) IL-12. 도 23은 대표적인 H&E 염색된 결장의 조직 절편. 상피 궤양 (검은 색 화살표), 심한 부종/염증 (황색 별표) 및 장움(crypt)의 유지/재생 (빨간색 화살표). 값은 평균 ± SD (n = 5)로 나타냄.
도 24는 DSS 마우스에서 조직학적 변화의 면에서의 RANP 처리의 효과를 나타낸 도이다. (A) 결장 조직 절편의 근육의 두께는 ImageJ software를 이용하여 평가되었다. 염색된 조직 절편은 광학현미경(Olympus IX53)으로 x40 및 x100로 측관찰되었다. (B) DSS 유도된 마우스에서 예상되는 염증 스코어. 값은 평균 ± SD (n = 5)로 나타내었다. 평균 염증 스코어는 PBS-처리 마우스 (9.6 ± 1.49)와 RANP-처리 마우스 (5.2 ± 1.17)의 결장 간에 상당히 다르게 나타났다.
도 25 내지 도 27은 시험관 내 및 생체 내에서 평가 된 RANP의 생체 적합성을 나타낸 도이다. (도 25) CHO-K1 세포에서 상이한 농도의 RANP (1 내지 100 μM)를 처리하고 8 시간 동안 인큐베이션 한 후 WST-8 분석에 의해 결정된 시험관 내 세포 독성. (도 26) RANP (30 mg/kg, 7 일 동안 매일) 또는 PBS 로 처리 된 건강한 마우스(n = 5 마리/그룹)의 일별 체중 변화. (도 27) RANP (30 mg/kg, 7 일 동안 매일) 또는 PBS 로 처리 된 건강한 마우스(n=5 마우스/그룹)의 주요 기관 (폐, 간, 신장 및 비장)의 H&E 염색된 조직 절편의 대표적인 현미경 사진).
도 28은 본 발명의 HA-RA 컨쥬게이트가 합성되었음을 UV/vis 스펙트럼으로 확인한 도이다.
도 29는 본 발명의 HA-RA 컨쥬게이트로부터 비교적 균일한 나노 크기의 HA-RANP가 형성되었음을 확인한 도이다.
도 30은 HA-RANP의 수용액 내 입자의 모양을 전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 31은 HA-RANP의 과산화수소에 의한 (ROS) 세포 손상 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 32는 HA-RANP의 농도별 세포독성 유무를 나타낸 도이다.
도 33은 HA-RANP의 대식세포 분극화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 HA-RANP를 처리한 대식세포의 사이토카인 mRNA의 상대적 발현량을 나타낸 도이다.
도 34는 실시예 11의 시험방법의 개요를 나타낸 것이다.
도 35는 HA-RANP가 염증성 장 질환 모델 마우스에서 체중 변화에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 36은 HA-RANP가 염증성 장 질환 모델 마우스에서 결장 길이에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 37은 HA-RANP가 염증성 장 질환 모델 마우스에서 MPO 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 38 내지 도 41은 본 발명의 HA-RANP가 전-염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 발현량에 미치는 영향을 확인하고자 ELISA로 각 사이토카인의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 42는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직을 나타낸 도이다.
도 43 및 도 44은 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 체중 및 결장길이를 나타낸 도이다.
도 45는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 MPO 활성을 나타낸 도이다.
도 46 내지 도 49는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 전염증성 사이토카인(순서대로 IL-1beta, IL-6, IFN-gamma, 및 TNF-alpha)의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 50은 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직을 나타낸 도이다.
도 51 내지 53는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직의 ZO-1, claudin-1, 및 occludin-1 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 54 내지 56은 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직의 NF-κB p65, COX-2 및 INOS 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 57은 고용량 (100mg/kg)의 HA-RANP 처리 후 주요 장기를 적출하여 (간, 폐, 심장, 신장, 비장, 대장) H&E 염색된 조직검사 결과를 나타낸 도이다.
도 58은 합성된 LMWC-RA와 고분자량 키토산 (HMWC), 저분자량 키토산(LMWC), RA와의 물에서의 용해도 비교를 통하여 LMWC-RA의 수용성 성질을 확인한 도이다.
도 59는 본 발명의 LWMC-RA의 1H NMR 스펙트럼을 나타내어 LWMC-RA의 합성여부를 보여주는 도이다.
도 60은 본 발명의 LWMC-RA의 UV/vis 흡광도 스펙트럼을 나타내어 LWMC-RA의 합성여부를 보여주는 도이다(RA peak: 약 330 nm).
도 61은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 유체역학적 크기를 나타낸 도이다.
도 62는 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 제타 전위값을 나타낸 도이다.
도 63은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 수용매 내에서 시간에 따른 입자안정성을 나타낸 도이다.
도 64는 본 발명의 LWMC-RA 나노입자 내 RA 함량에 따른 유체역학적 입자 크기를 나타낸 도이다.
도 65는 본 발명의 LWMC-RA 입자의 농도별 UV/vis 흡광도 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 66은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자를 활성산소종과 반응시키면서 시간에 따른 UV 흡광도를 나타낸 도이다. 도 67은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자를 활성산소종과 반응 후 입자크기를 나타낸 도이다.
도 68은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 처리 농도가 높아질수록 과산화수소가 환원되어, 과산화수소의 농도가 감소됨을 나타낸 도이다.
도 69는 LMWC-RA 나노입자의 과산화수소에 의한 (ROS) 세포 손상 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 70는 LPS를 처리한 대식세포에 대한 LMWC-RA의 전-염증성 사이토카인의 억제효과를 나타낸 도이다.
도 71은 LMWC-RA가 LPS-처리 대식세포에서 항염증성 사이토카인인 TGF-beta 및 IL-10의 발현수준에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 72는 본 발명의 LMWC-RA 나노입자의 인 비보 시험법의 개요를 나타낸 도이다.
도 73 및 도 74는 본 발명의 LMWC-RA 나노입자를 염증성 장질환 마우스 모델에 투여시의 체중 변화 및 DAI를 나타낸 도이다.
도 75 및 도 76은 본 발명의 LMWC-RA 나노입자를 염증성 장질환 마우스 모델에 투여시의 결장 길이를 나타낸 도이다.
도 77 및 도 78은 본 발명의 LMWC-RA 나노입자를 염증성 장질환 마우스 모델에 투여시의 비장의 무게를 나타낸 도이다.
도 2는 PEG-RA의 특성 확인에 관한 도이다. (A) PEG-RA의 DMSO-d6 에서의 1H-NMR 스펙트럼. (B) mPEG-아민 및 PEG-RA의 MALDI-TOF/MS 스펙트럼. (C) UV-Vis 흡수 스펙트럼: RA (25 μg/mL), mPEG-amine (10 mg/mL) 및 PEG-RA (0.1 mg/mL). (D) PEG-RA의 FTIR 스펙트럼.
도 3은 필름 형성 및 재수화 방법에 의한 RANP 형성 과정에 대한 개략도이다. Chloroform containing PEG-RA (1-2 mol%)를 포함하는 클로로포름을 진공에서 증발시키거나 질소가스를 이용하여 유기용매를 완전히 제거하여 건조시켜 필름층을 만든다. 그런 다음, 제조된 필름층에 PBS 완충액을 가하여 필름층을 수화시키고, 초음파를 처리하여 RANP를 제조한다.
도 4는 RANP의 PBS(pH 7.4)에서 4°C에서 14일간 보관시의 DLS로 측정된 입자 크기 및 안정성 데이터를 나타낸 도이다.
도 5는 (C) Determination of the critical micelle concentration of RANPs in PBS (pH 7.4)에서 25 °C 조건 하에 RANP의 임계 미셀농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다. 폴리머 수성 용매(polymer aqueous solution)의 분산 강도(scattering intensity)는 0.01-10,000 nM의 농도 범위에서 조사되었다.
도 6은 ROS 소거를 통한 RANP의 생체 내 세포 보호 효과를 나타낸 도로서, H2O2에 대한 소거 활성을 측정하여 RANP의 항산화 능력을 평가한 도이다. HRP/dye 시약을 사용하여 형광 강도를 측정함으로써, H2O2 (50 μM) 및 40 분 동안 상이한 농도의 RANP (1-1000 nM)로 처리한 후 남은 H2O2의 농도를 정량하였다.
도 7은 ROS 소거를 통한 RANP의 생체 내 세포 보호 효과를 나타낸 도로서, 대조군 (배양 배지)으로 정규화 된 H2O2-처리 된 CHO-K1 세포에 대한 RANP의 세포 보호 효과를 나타낸 도이다. 세포를 상이한 농도의 H2O2 (50 및 100 μM) 및 RANP (0, 1, 10, 100 μM)로 처리하고, 이어서 24 시간 인큐베이션 후 WST-8 분석에 의해 세포 생존율을 측정하였다.
도 8은 RANP의 세포보호 효과를 나타내는 WST-8 분석 결과의 사진이다.
CHO-K1 세포는 8시간 동안 H2O2 (100 or 50 μM), H2O2 (100 or 50 μM) + RANPs (100, 10, or 1 μM) 또는 배양배지만(control)을 처리한 후, 추가로 24시간 동안 인큐베이션되었다. RANP로 처리된 세포들과 대조군의 차이는 각 그룹별 WST-8 분석 결과의 발색 강도를 기초로 측정되었다.
도 9는 ROS (H2O2)에 의해 유도된, DLS로 측정된 RANP의 입자의 크기 변화를 나타낸 도이다. RANP는 서로 다른 농도의 H2O2 (0.1 to 10 mM)에 10분간 처리되었고, 그후 빠르게 나노입자가 붕괴되는 것이 DLS 측정에 의해 확인되었다.
도 10은 DEX-로딩된 RANPs의 제조 및 특성 확인에 대한 개략도이다. (A) DEX-로딩된 RANPs의 수용성 용매 내에서의 자기 조립과 얇은 필름 수화법의 개략적인 방법을 나타낸 도이다. PEG-RA 필름과 DEX (1:10 mol%)를 PBS (pH 7.4)에서 수화시킨다. 10분간 초음파를 처리하고, 로딩되지 않은 자유 DEX를 겔 여과로 제거하고, DEX가 로딩된 RANP만 나노입자만 회수한 후, RANPs 내 봉입된 DEX를 0.5% Triton-X로 처리하여 방출시키고, HPLC 분석으로 농도 측정을 하여 정량화 하였다. (B) DEX-로딩된 RANP에 0.5% Triton-X가 있는 ACN:10 mM PBS (pH 7.0) (30:70 v/v)로 처리한 후 확인한 HPLC 크로마토그램. (Retention times: PEG-RA, 4.21 minutes; DEX, 20.478 minutes). (C) DLS를 이용하여 측정한 유체역학적 직경을 측정하여 나타낸 RANPs의 크기 분포. 입자 크기의 분포는 40-120 nm이고, 평균으로는 ~60 nm이다.
도 11은 I.V. 투여 후의 RANP의 약동학을 나타낸 도로서, 평균 혈장 농도-시간 곡선을 나타낸 도이다. 단일 정맥 내 투여(30 mg/kg) 후 0, 0.083, 0.167, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12 및 16 시간에 각 마우스로부터의 혈액 샘플을 수집하였다.
도 12는 건강한 마우스 및 3 % DSS-유도된 결장염 마우스에서 ICG-로딩 된 RANP의 생물학적 분포를 나타낸 도이다. (A) 건강한 정상 마우스 및 (B) ICG-로딩 된 RANP(ICG @ RANP; 1.55 mg ICG; 20 mg PEG-RA)로 처리된 IBD 모델 마우스에서 투여 5 시간 후 채취한 주요 기관 (비장, 신장, 간, 폐, 심장 및 결장)에서의 생체 분포 이미지. ICG-로딩 된 RANP는 IBD 마우스의 결장 조직에서 상당한 축적을 나타냈다.
도 13 내지 도 16은 DSS- 손상 마우스의 RANP 처리를 위한 전반적인 실험 설계 및 그 결과를 나타낸 도이다. 마우스에게 일반 식수 (H2O) 또는 3 % DSS를 함유한 식수를 5일 동안 자유롭게 제공하였다. 마우스에 RANP (10, 20 또는 30 mg/kg/일) 또는 PBS를 격일로 10 일 동안 후안와 투여하였다(도 13). 10 일에 걸친 각 그룹의 마우스에서 DAI의 변화(도 14). 10 일에 걸친 각 그룹에서 마우스의 일일 체중 변화(도 15). IBD 마우스 모델에서 결장 길이에 대한 RANP의 효과(도 16). 10 일에 마우스를 희생시키고, 결장을 수확하여 이미지화하고, 길이를 비교하였다. 결장 길이의 대표적인 사진 및 통계 분석이 제시되었다.
도 17 내지 도 23은 DSS-유도된 결장염 모델에서 RANP의 항 염증 효과를 나타낸 도이다. 마우스의 결장 샘플에서 ELISA에 의해 측정된 (도 17) MPO 활성 및 전-염증성 사이토 카인: (도 18) TNF-alpha, (도 19) IFN-gamma, (도 20) IL-1beta, (도 21) IL-6 및 (도 22) IL-12. 도 23은 대표적인 H&E 염색된 결장의 조직 절편. 상피 궤양 (검은 색 화살표), 심한 부종/염증 (황색 별표) 및 장움(crypt)의 유지/재생 (빨간색 화살표). 값은 평균 ± SD (n = 5)로 나타냄.
도 24는 DSS 마우스에서 조직학적 변화의 면에서의 RANP 처리의 효과를 나타낸 도이다. (A) 결장 조직 절편의 근육의 두께는 ImageJ software를 이용하여 평가되었다. 염색된 조직 절편은 광학현미경(Olympus IX53)으로 x40 및 x100로 측관찰되었다. (B) DSS 유도된 마우스에서 예상되는 염증 스코어. 값은 평균 ± SD (n = 5)로 나타내었다. 평균 염증 스코어는 PBS-처리 마우스 (9.6 ± 1.49)와 RANP-처리 마우스 (5.2 ± 1.17)의 결장 간에 상당히 다르게 나타났다.
도 25 내지 도 27은 시험관 내 및 생체 내에서 평가 된 RANP의 생체 적합성을 나타낸 도이다. (도 25) CHO-K1 세포에서 상이한 농도의 RANP (1 내지 100 μM)를 처리하고 8 시간 동안 인큐베이션 한 후 WST-8 분석에 의해 결정된 시험관 내 세포 독성. (도 26) RANP (30 mg/kg, 7 일 동안 매일) 또는 PBS 로 처리 된 건강한 마우스(n = 5 마리/그룹)의 일별 체중 변화. (도 27) RANP (30 mg/kg, 7 일 동안 매일) 또는 PBS 로 처리 된 건강한 마우스(n=5 마우스/그룹)의 주요 기관 (폐, 간, 신장 및 비장)의 H&E 염색된 조직 절편의 대표적인 현미경 사진).
도 28은 본 발명의 HA-RA 컨쥬게이트가 합성되었음을 UV/vis 스펙트럼으로 확인한 도이다.
도 29는 본 발명의 HA-RA 컨쥬게이트로부터 비교적 균일한 나노 크기의 HA-RANP가 형성되었음을 확인한 도이다.
도 30은 HA-RANP의 수용액 내 입자의 모양을 전자현미경으로 관찰한 도이다.
도 31은 HA-RANP의 과산화수소에 의한 (ROS) 세포 손상 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 32는 HA-RANP의 농도별 세포독성 유무를 나타낸 도이다.
도 33은 HA-RANP의 대식세포 분극화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 HA-RANP를 처리한 대식세포의 사이토카인 mRNA의 상대적 발현량을 나타낸 도이다.
도 34는 실시예 11의 시험방법의 개요를 나타낸 것이다.
도 35는 HA-RANP가 염증성 장 질환 모델 마우스에서 체중 변화에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 36은 HA-RANP가 염증성 장 질환 모델 마우스에서 결장 길이에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 37은 HA-RANP가 염증성 장 질환 모델 마우스에서 MPO 활성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 38 내지 도 41은 본 발명의 HA-RANP가 전-염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 발현량에 미치는 영향을 확인하고자 ELISA로 각 사이토카인의 양을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 42는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직을 나타낸 도이다.
도 43 및 도 44은 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 체중 및 결장길이를 나타낸 도이다.
도 45는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 MPO 활성을 나타낸 도이다.
도 46 내지 도 49는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 전염증성 사이토카인(순서대로 IL-1beta, IL-6, IFN-gamma, 및 TNF-alpha)의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 50은 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직을 나타낸 도이다.
도 51 내지 53는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직의 ZO-1, claudin-1, 및 occludin-1 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 54 내지 56은 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직의 NF-κB p65, COX-2 및 INOS 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 57은 고용량 (100mg/kg)의 HA-RANP 처리 후 주요 장기를 적출하여 (간, 폐, 심장, 신장, 비장, 대장) H&E 염색된 조직검사 결과를 나타낸 도이다.
도 58은 합성된 LMWC-RA와 고분자량 키토산 (HMWC), 저분자량 키토산(LMWC), RA와의 물에서의 용해도 비교를 통하여 LMWC-RA의 수용성 성질을 확인한 도이다.
도 59는 본 발명의 LWMC-RA의 1H NMR 스펙트럼을 나타내어 LWMC-RA의 합성여부를 보여주는 도이다.
도 60은 본 발명의 LWMC-RA의 UV/vis 흡광도 스펙트럼을 나타내어 LWMC-RA의 합성여부를 보여주는 도이다(RA peak: 약 330 nm).
도 61은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 유체역학적 크기를 나타낸 도이다.
도 62는 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 제타 전위값을 나타낸 도이다.
도 63은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 수용매 내에서 시간에 따른 입자안정성을 나타낸 도이다.
도 64는 본 발명의 LWMC-RA 나노입자 내 RA 함량에 따른 유체역학적 입자 크기를 나타낸 도이다.
도 65는 본 발명의 LWMC-RA 입자의 농도별 UV/vis 흡광도 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 66은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자를 활성산소종과 반응시키면서 시간에 따른 UV 흡광도를 나타낸 도이다. 도 67은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자를 활성산소종과 반응 후 입자크기를 나타낸 도이다.
도 68은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 처리 농도가 높아질수록 과산화수소가 환원되어, 과산화수소의 농도가 감소됨을 나타낸 도이다.
도 69는 LMWC-RA 나노입자의 과산화수소에 의한 (ROS) 세포 손상 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 70는 LPS를 처리한 대식세포에 대한 LMWC-RA의 전-염증성 사이토카인의 억제효과를 나타낸 도이다.
도 71은 LMWC-RA가 LPS-처리 대식세포에서 항염증성 사이토카인인 TGF-beta 및 IL-10의 발현수준에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 72는 본 발명의 LMWC-RA 나노입자의 인 비보 시험법의 개요를 나타낸 도이다.
도 73 및 도 74는 본 발명의 LMWC-RA 나노입자를 염증성 장질환 마우스 모델에 투여시의 체중 변화 및 DAI를 나타낸 도이다.
도 75 및 도 76은 본 발명의 LMWC-RA 나노입자를 염증성 장질환 마우스 모델에 투여시의 결장 길이를 나타낸 도이다.
도 77 및 도 78은 본 발명의 LMWC-RA 나노입자를 염증성 장질환 마우스 모델에 투여시의 비장의 무게를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
재료 및 방법
페길화 RA(PEGylated RA, PEG-RA)의 합성
RA(rosmarinic acid)를 포함한 대부분의 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (미국, 미주리 주, 세인트루이스)에서 구입하였고 달리 지시되지 않는 한 추가 정제없이 사용 하였다. 등량 (0.28 mmol)의 RA 및 mPEG2K-아민 (메톡시-폴리(에틸렌글리콜 아민); MW 2000) (Sunbio, Korea)을 5 mL의 디메틸 포름 아미드 (dimethylformamide, DMF)에 15 μL의 N,N-디이소프로필에틸아민 (N,N-diisopropylethylamine, DIPEA) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd, Japan)과 함께 용해시켰다. 실온에서 10 분 동안 교반한 후, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸몰포리늄 클로라이드 (4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride, DMTMM) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd, Japan)를 혼합물에 첨가하고, 질소 대기 하에서 실온에서 교반하면서 밤새 반응을 수행하였다. 미정제 생성물을 디클로로 메탄 (dichloromethane, DCM)과 메탄올 (10:1)의 혼합물을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 연 황색 고체의 생성물 (~ 88 % 수율)을 수득하였다.
PEG-RA의 특성 분석(Characterization of PEG-RA)
이어서, 상기 생성물을 1H-NMR, UV-Vis, MALDI-TOF (매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 시간) 및 FT-IR 분광 분석으로 특성을 확인하였다. 1H-NMR 스펙트럼은 Bruker Instrument Inc. AVANCE400 시스템상에서 400 MHz에서 기록되었다. 양성자 화학적 이동은 내부 테트라메틸실란 (TMS, δ0.0 ppm)에 대해 ppm (δ)으로 보고되거나, 내부 표준 (디메틸 설폭 사이드-d6, δ2.50 ppm) 으로서 TMS에 대한 용매 기준을 사용한다.
적외선 스펙트럼은 Nicolet iS20 푸리에 변환 적외선 (FT-IR) 분광계 (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 기록되었다. UV-Vis 스펙트럼은 Beckman Coulter DU-800 UV-Vis 분광 광도계에서 기록되었다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 Bruker Autoflex Ⅲ MALDI-TOF 시스템에서 기록되었다.
RANP의 제조(Preparation of RANPs)
PEG-RA (20 mg)를 4 mL의 클로로포름:메탄올의 1:3 혼합물 (v/v)에 용해시키고 수분간 혼합하였다. 이어서, 유기 용매를 회전식 진공 증발에 의해 제거하고, 일정한 질소 흐름 하에서 30 분 동안 추가로 건조시켜 필름 층을 수득 하였다. 필름 층을 1 mL의 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4)에 현탁시키고, 생성된 미셀 현탁액을 10 분 동안 bath sonicator (50W, 40kHz)에서 초음파 처리하여, 균일 한 크기의 RANP를 생성하였다. 미셀 용액을 4 ℃로 유지하고 이하의 실험에 직접 사용하였다. RANP의 입자 크기는 633 nm에서 작동하는 4.0 mW HeNe 레이저 및 avalanche photodiode detector 가 장착된 Nanosizer ZS90 (Malvern Instrument Ltd., Malvern, UK)을 사용하여 광자 상관 분광법 (photon correlation spectroscopy, PCS) 기술로 분석되었다. 제타 전위는 또한 동일한 장비를 사용하여 수용액 (pH 7)에서 25 ℃에서 측정되었다. RANP의 형태 학적 특성을 음성-염색 투과 전자 현미경 (TEM) 기술을 사용하여 조사하였다. 간략히 설명하면, 한 방울의 희석된 샘플을 탄소 필름으로 코팅된 구리 그리드에 놓고 0.5 %w/v 우라닐 아세테이트 용액으로 염색하고 실온에서 건조시켰다. 그리드는 Tecnai F20 (FEI Co., Hillsboro, OR, USA) 투과 전자 현미경을 사용하여 이미지화되었다.
덱사메타손-로딩된 RANP의 제조 (Preparation of dexamethasone (DEX)-loaded RANPs)
전술한 바와 같이 PEG-RA의 필름층(4 μmol) 및 DEX (0.41 μmol)를 수득하였다. 필름 층을 PBS (pH 7.4)로 수화시킨 다음 초음파 처리 하였다. 10 분 동안 초음파 처리 한 후, MicroSpin G-25 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA, USA)을 사용하여 로딩되지 않은 자유 DEX를 겔 여과에 의해 제거 하였다. 로딩 된 DEX의 양은 먼저 0.5 % Triton-X로 처리한 다음 HPLC 분석에 의해 DEX 농도를 측정함으로써 정량화되었다. 분리는 25 ℃에서 유지되는 Poroshell 120 EC-C18 컬럼 (250 × 4.6 mm, i.d., 4 mm, Agilent, USA)에서 수행되었다. 아세토 니트릴:10 mM 포스페이트 완충액(30:70, v/v)으로 구성된 pH 7.0의 이동상을 1 mL/min의 유속으로 작동시켰다. 주입량은 50 mL였고 235 nm에서 UV 검출기를 사용하여 신호를 모니터링 하였다. 각 HPLC 분석의 총 실행 시간은 40 분이었다.
세포 배양 및 WST-8 분석에 의한 세포 생존력 분석(Cell culture and analysis of cell viability by WST-8 assay)
CHO-K1 세포는 10 % (v/v) 열-불활성화 우태아혈청 (FBS), 100 IU/mL의 페니실린 및 1 % (v/v) L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640 배지(Welgene, Daegu, Korea)에서 일상적으로 배양되었다. 세포를 37 ℃에서 가습된 제어 대기 (95 % 공기/5 % CO2)에서 배양하였다. 배지는 2 일마다 교체되었다. 세포를 최종 부피 50 μL에 1x104 세포/웰의 밀도로 96-웰 마이크로 플레이트에 시딩하고, 가습된 5 % CO2 대기에서 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션 하였다. 그 후, 배지를 제거하고 웰당 1, 10, 또는 100 nM 농도의 서로 다른 RANP를 첨가하거나 첨가하지 않은 상태에서, 세포를 웰당 최종 부피 100 μL의 i) 새로운 배지 (대조군), ii) 100 μM H2O2 또는 iii) 50 μM H2O2 (세포 배양 배지에서 제조된 원액으로부터 첨가)를 포함하는 배지에서 추가로 배양하였다.
RANPs에 8 시간 동안 노출시키고, 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 모든 세포배양물의 대사 활성을 제조사의 프로토콜에 따라 Quanti-MAX WST-8 검정 (Biomax, Seoul, Korea)을 사용하여 측정하였다. 간략하게 설명하면, 인큐베이션 기간 후, 세포를 세척하고 100 μL의 새로운 배양 배지를 각 웰에 첨가한 후, 10 μL의 WST-8 분석 용액을 첨가하였다. 4 시간 동안 인큐베이션 한 후, 96-웰 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 데이터는 평균±표준편차로 나타냈다. RANP 및 대조군으로 처리된 세포 간의 세포 증식 (WST-8 검정)의 차이의 유의성은 Dunnett's post hoc test와ANOVA(analysis of variance) 분석에 의해 결정되었다.
동물(Animals)
6 주령의 암컷 C57BL/6 마우스는 오리엔트 바이오 (성남, 한국) 또는 삼타코 바이오 (Samtaco Bio, Co., 오산, 한국)로부터 입수하였다. 모든 동물은 KAIST (Korea Advanced Institute of Science and Technology)의 동물 시설에서 22 ± 1 ° C의 일정한 온도와 45~53%의 실내 상대 습도에서 12 시간 명/암 주기로 병원체가없는 조건하에 수용되었습니다. 물과 사료 (Teklad Global Rodent Diets, 18 % 단백질 [2018S]; Envigo, Madison, WI, USA)은 자유롭게 제공되었습니다. 마우스는 실험 전에 1주일 간 순화시켰다. 1 주 후, 마우스 체중은 18-20g이었다. 마우스를 실험 그룹에 무작위로 할당하고 케이지 당 최대 5마리를 할당하였다. 모든 수술은 이소플루란 마취하에 수행되었으며, 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 모든 동물 절차는 윤리적 절차와 과학적 관리를 준수하기 위해 KAIST-IACUC에 의해 검토 및 승인되었다 (승인 번호: KA2019-16).
생체 내 생체적합성 연구(
In vivo
biocompatibility study)
RANP의 생체 내 독성을 7 일 처리 후 마우스에서 평가하였다. RANP로 처리한 후 체중 변화를 매일 기록하고, 주요 기관 (심장, 간, 폐, 비장 및 신장)의 절편을 제조하고 조직학적 평가를 위해 H&E 염색을 하였다. 처리되지 않은 건강한 마우스는 대조군으로 사용되었다.
생체 내 결장염 모델의 유도(Induction of the
in vivo
colitis model)
실험적 결장염은 3% (w/v) 덱스트란 설페이트 나트륨 염 (DSS; MW 36,000 ~ 50,000, 결장염 등급; MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)을 포함하는 식수를 자유롭게 0일에 시작하여 5일동안 제공함으로써 유발되었고, 이어서 일반 식수를 5일 동안 제공하였다. 각 그룹의 마우스를 매일 주의 깊게 모니터링하여 이들이 거의 동일한 양의 DSS를 포함하는 물을 소비했는지 확인했다. 생쥐의 체중 및 설사의 징후를 매일 기록하였다.
RANPs의 생체 내 항 염증 효과 평가(Assessment of
in vivo
anti-inflammatory effects of RANPs)
각각의 실험을 위해, 마우스를 5 개의 실험 그룹 (n = 5/그룹)으로 나누었다. 첫 번째 그룹은 대조군 (일반 식수)으로 유지되었고, 두 번째 그룹은 실험 기간 동안 DSS를 함유한 식수만 제공받았다. 다른 세 그룹에서, 마우스는 3% DSS를 투여 받았으며, 실험 설계에 따라 PBS 또는 RANP (10, 20 또는 30 mg/kg/d)를 10 일 동안 2 일마다 1 회 경구 또는 정맥 내 주사하였다. PBS 또는 RANP의 투여는 DSS 처리와 동시에 시작되었다. 체중 감량, 변 상태 및 직장 출혈에 대한 종합 점수를 반영하는 임상 활성 지표인 DAI는 표준 스코어링 시스템에 따라 실험기간 동안 매일 측정되었다.
각 매개 변수의 점수는 다음과 같이 정의되었다:
(1) 체중: 0, 체중 감소 없음; 1, 1-5%의 체중 감소; 2, 5-10%의 체중 감소; 3, 10-20%의 체중 감소, 및 4, >20% 의 체중감소.
(2) 변 상태: 0, 잘 형성된 펠렛; 2, 항문 부위에 들러 붙지 않는 묽은 변; 및 4, 항문 부위에 들러 붙는 액상 변.
(3) 출혈 평가: 0, 출혈 없음; 2, 변속에 혈흔이 명확하게 보임; 4, 눈에 보이는 직장 출혈.
희생 당일 (10 일), 생쥐는 4-8 시간 동안 절식하였다. 모든 마우스를 이소플루란 마취하에 희생시키고, 전체 결장을 절제하고, 이미지화하고, 분쇄한 후 생화학적 분석을 수행하였다.
결장 길이는 결장과 맹장을 먼저 회맹장 이행부에서 소장과 분리하고, 직장의 원위부에서 항문과 분리하여 측정하였다. 이어서, 결장을 맹장으로부터 분리하고 (회맹장 이행부에서) 대변 및 혈액이 없을 때까지 23G 바늘이 부착된 10 mL 주사기를 사용하여 차가운 PBS로 수회 철저히 세척하였다. 결장을 신장시키지 않고 곧게 펴고 그 길이를 눈금자 또는 버니어 캘리퍼를 사용하여 측정하였다 (DSS 투여가 결장의 팽창 및 단축으로 이어 지므로 연신은 피하였다).
결장 MPO 분석 및 전-염증성 사이토카인 수준의 측정을 위해, 결장 조직의 무게를 측정하고 (50 내지 100 mg), 텅스텐 카바이드 비드 (직경 3mm)와 함께 TissueLyserII Qiagen, Germany)를 30Hz에서 5 분 동안 사용하여, 50 mM PBS (pH 6.0)에 녹인 0.5% 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드 (hexadecyltrimethylammonium bromide)에서 균질화시켰다. 생성된 샘플을 각각 -80 ℃ 및 37 ℃에서 3 회 동결-해동하고, 10 초 동안 초음파 처리하여 균질 조직 현탁액을 수득하고 10 분 동안 20,000xg (4 ℃)에서 원심 분리하였다.
결장 MPO 활성은 제조사의 지시에 따라 분석 키트 (Biovision, Milpitas, CA, USA)를 사용하여 측정되었고 밀리그램 단백질 당 단위 (U/mg)로 표시되었다. 조직에서 사이토 카인 IFN-γ, IL-1β, IL-6 및 IL-12의 수준은 제조사의 프로토콜에 따라, 마우스에 대한 ELISA 키트 (DY485 for IFN-γ, DY401 for IL-1beta, DY-406 for IL-6, DY-419 for IL-12; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였다. 조직학적 분석을 위하여, 결장 조직 절편은 H&E 염색되고 스코어링 되었다. 간단히 설명하면, 원위 결장의 일부를 먼저 4 % (v/v) 완충 포르말린 및 70 % (v/v) 알코올과 함께 인큐베이션 한 다음 고정하고 파라핀에 포매시켰다. 원위 결장의 조직 절편을 제조하고, H&E로 염색하고, 현미경으로 분석하였다. 염증 세포의 침윤에는 0-3의 점수가 부여되었고, 조직 손상에는 0-3의 점수가 부여되었다.
ICG 캡슐화 RANP의 제조(Preparation of ICG-encapsulated RANPs)
ICG(indocyanine green, ICG) (Cardiogreen)가 캡슐화 된 RANP는 상기 한 바와 같이 PEG-RA (20 mg)의 필름 층을 제조하고 1-2 μmol의 인도시아닌 그린 (indocyanine green, ICG, Cardiogreen)을 함유하는 PBS (pH 7.4) 용액을 교반하면서 적가함으로써 생성되었고, 그 후 10 분 동안 bath sonicator 를 사용하여 초음파 처리 (주파수, 40 kHz; 전력, 50 W)하였다.
이어서, ICG가 캡슐화 된 RANP를 3 회 세척하고, 로딩되지 않은 유리 ICG를 MicroSpin G-25 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences)을 사용한 겔 여과에 의해 제거하였다. RANP 중 ICG의 양은 먼저 0.5 % Triton-X로 처리한 다음 형광 마이크로 플레이트 리더 (Spark multimode microplate reader; Tecan, Switzerland)를 사용하여 ICG 농도를 측정하여 정량화 하였다.
캡슐화 효율 (Encapsulation efficiency, EE)은 다음 식에 따라 나노 입자 현탁액에서 발견 된 ICG의 총 농도와 한외 여과/원심 분리에 의해 나노 입자를 분리 한 후 얻어진 한외 여과 액에서 자유 ICG의 농도의 차이로 계산되었다:
여기에서 Csup은 상층액에서 ICG의 농도이고, Ctot 은 제조 과정중 초기에 첨가된 ICG의 총량이다.
상처 부위에서 형광 표지 된 리포좀의 특이적인 축적의 확인(Confirmation of specific accumulation of fluorescently labeled liposomes at the injury site)
ICG가 캡슐화 된 RANP를 DSS 미처리 (점수 0) 및 DSS 처리된 (점수 4) 마우스에 정맥 내 투여하였다. 투여 5 시간 후, 마우스를 희생시키고 주요 기관 (결장, 신장, 간, 비장, 폐 및 심장)을 수집 하였다. Xenogen IVIS Spectrum in vivo 이미징 시스템 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 각 그룹으로부터 수집한 기관의 형광 강도를 측정하고 계산하였다.
HPLC에 의한 마우스의 RANP의 약동학적 분석(Pharmacokinetic analysis of RANPs in mice by HPLC)
30 마리의 암컷 마우스 (7 주령의 C57BL/6)를 무작위로 10 개의 그룹 (n = 3 마리의 마우스/그룹)으로 나누었다. 약물을 투여하기 전에, 동물들에게 사료 및 물에 7일 동안 자유롭게 접근하도록 허용하였다. 각 그룹에 후안와 투여를 통해 RANP를 30 mg/kg의 단일 정맥 내 용량으로 투여하였다. 정맥 내 주사 후 0, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 720 및 960 분에 각각의 마우스로부터의 혈액 샘플 (대략 0.4 mL)을 하대 정맥으로부터 1.5 mL의 헤파린화 튜브로 수집하였다. 4 ℃에서 2 시간 동안 혈액 샘플을 냉각시킨 후, 12,000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리하여 혈액으로부터 혈장을 분리하였다. 수집된 혈장을 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 분석을 위해 -20 ℃에 보관하였다. 분석 전에, 200 μL 분취 량의 혈장을 1.5-mL 폴리 프로필렌 튜브에 옮기고 1 mL의 아세토 니트릴을 첨가하여 혈장 샘플을 탈 단백화시켰다. 혼합물을 짧게 볼텍싱 (~10초) 한 다음 13,000 × g에서 5 분 동안 원심 분리하였다. 상청액을 진공 하에서 증발시키고, 잔류물을 아세토 니트릴:0.1 % 포름산이 88:12 (v/v)로 이루어진 100 μL의 이동상으로 재구성하고, 10 초 동안 볼텍싱한 후, 호박색 유리 오토 샘플러 바이알이 있는 플라스틱 인서트에 옮겼다. 분석을 위해 샘플 (30 μL)을 HPLC 시스템에 주입 하였다 (유속: 1 mL/분). 비구획 모델을 사용하는 PKsolver를 사용하여 약동학적 파라미터를 추정하였다.
통계적 분석(Statistical analyses)
모든 통계 분석은 SPSS 통계 소프트웨어 (IBM SPSS Statistics version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 수행되었다. 결과는 3 중 실험의 평균 ± SD (표준 편차)로 표시되었다. 다중 분석에 대한 일원 분산 분석 테스트와 Dunnett's post-hoc test는 모든 분석에 사용되었다.
실시예 1: PEG-RA의 합성 및 RANP의 제조(Synthesis of PEG-RA and preparation of RANPs)
PEG-RA는 PEG 함유 아민과 RA의 카르복실산 기 사이의 원-스텝 아미드 커플링 화학을 통해 합성되었다 (도 1의 (A)). 1H NMR, FT-IR, MALDI-TOF 질량 분석법 및 UV-Vis (UV-Vis) 분석법을 사용한 특성 분석은 PEG-RA가 성공적으로 합성되었음을 뒷받침하였다 (도 2). 다음으로, RANP를 필름 형성 및 재수화 방법을 사용하여 제조되었다 (도 3). 제조된 RANP는 TEM 이미지로 측정되었고, 평균 직경 63.5 ± 4.0 nm (mean ± S.D.; n = 156 nanoparticles)의 구형의 형태를 나타내었다 (도 1의 (B)).
동적 광산란 (dynamic light scattering, DLS)에 의해 측정된 인산 완충 용액 (pH 7.4)에서 RANP의 유체 역학적 크기 및 제타 전위는 각각 67.5 ± 3.5 nm 및 -33.70 mV였으며, 이는 나노 입자 표면상의 PEG 층의 노출을 시사하였다 (도 1의 (C) 및 표 1).
Sample | Zeta potential (mV) |
Mobility (μm cm/Vs) |
Conductivity (mS/cm) |
Polydispersity index (PDI) |
Particle size (nm) |
Rosmarinic acid (RA) | -15.53 | -1.217 | 24.10 | - | - |
mPEG-amine | -8.77 | -4.975 | 0.319 | - | - |
RANPs | -33.70 | -0.688 | 24.76 | 0.580 | 67.53 |
RANP의 크기는 14 일의 배양 후에도 변하지 않고 유지되었으며 (도 4), 이는 높은 콜로이드 안정성을 나타낸다. RANP는 1nM보다 큰 농도로 형성될 수 있었으며 (도 5), 이는 초저임계 미셀 형성 농도(ultra-low critical micelle-formation concentration)를 나타낸다.
실시예 2: 활성 산소 종 (ROS)에 대한 RANP의 항산화 효과 (Anti-oxidative effects of RANPs against reactive oxygen species)
본 발명자들은 다음으로 개별 PEGylated RA 분자의 자기 조립으로 제조된 RANP가 RA의 ROS 소거 능력을 유지하는지 여부를 조사하였다. 과산화수소 (H2O2)는 가장 일반적인 내인성 ROS 유형 중 하나이기 때문에 이러한 목적으로 선택되었다.
도 2A에 도시 된 바와 같이, 잔류 H2O2의 양은 RANP의 양을 증가시키면서 배양함에 따라, 급격히 감소 하였다; ~ 100 nM의 나노 입자는 수십 마이크로 몰의 H2O2를 소거하기에 충분하여 RANP의 강력한 항산화력을 나타낸다. 그런 다음 RANP와 중국 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)를 8 시간 동안 인큐베이션 한 후 50 또는 100 μM의 H2O2로 처리하여 RANP가 ROS-유발 손상으로부터 세포를 보호 할 수 있는지 여부를 조사하였다.
생존력 분석 결과, 세포 증식은 RANP가 없는 H2O2-처리된 세포에서 실질적으로 감소하였으나, RANP의 존재 하에서 세포 증식이 현저하게 회복되었으며, 이는 용량 의존적 방식으로 작용하였으며, 세포 생존력을 거의 대조군 수준으로 회복시켰다 (도 7 및 도 8). 이러한 결과는 본 발명의 RANP가 고유의 높은 항산화력을 발휘하여 산화적 손상으로부터 세포를 보호할 수 있음을 분명히 나타낸다.
실시예 3: ROS에 대한 반응으로 RANP의 붕괴(Disruption of RANPs in response to ROS)
RA는 ROS와의 반응시 화학적으로 변형되고 더 작은 화합물로 단편화 될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 10 분 동안 상이한 농도를 가진 H2O2와 함께 RANP를 인큐베이션 한 후 DLS에 의해 RANP의 크기를 측정함으로써 산화시 RANP가 붕괴되거나 붕괴되는지 여부를 조사하였다.
H2O2의 농도가 증가함에 따라, RANP의 크기가 극적으로 감소하여 테스트 된 H2O2의 최고 농도 (10 mM)에서 나노 입자가 거의 남아 있지 않아 (도 9), ROS에 대한 나노 입자의 붕괴 또는 분해를 시사하였다. 이러한 결과는 RANP가 ROS- 반응성 약물 전달 비히클로 용도로서 잠재성이 있음을 시사한다. 본 발명자들은 이러한 잠재성을 더 연구하기 위해, 모델 약물로 사용된 덱사메타손이 약물이 로딩되지 않은 naked RANP의 제조에 사용된 것과 동일한 필름 형성 및 재수화 방법을 사용하여 약물 로딩 연구를 수행하였다.
고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 분석에 따르면 약 ~ 16.5 wt %의 덱사메타손이 RANP에 로딩되었고, 본 발명의 RANP가 약물 전달용 캐리어로 사용될 가능성이 있음을 시사하였다.
실시예 4: 정상 생쥐에서 정맥 주사 후 RANP의 약동학(Pharmacokinetics of RANPs after intravenous injection in normal mice)
높은 콜로이드 안정성을 갖는 RAMP는 모체 소분자 RA보다 혈액에서 훨씬 더 긴 순환을 가질 것으로 예상되는데, RA는 일반적으로 ~ 30 분 이내에 체내에서 배출된다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 정상 마우스에서 RANP의 약동학적 연구를 수행하였다.
Parameter | Value |
AUC0-∞(μg h/mL) | 278.953 |
MRT (h) | 3.919 |
t1/2 (h) | 2.912 |
Cmax (μg/ml) | 175.798 |
AUC, area under the curve; MRT, mean residence time; t1/2, elimination half-life; Cmax, maximal concentration |
30 mg/kg (4.58mg RA/kg에 해당)의 용량으로 마우스에 정맥 주사 후 측정한 RANP의 평균 혈장 농도-시간 곡선이 도 11에 도시되어 있으며, 상응하는 약동학 적 파라미터가 표 2에 제시되어 있다. 이전에 보고된 기준 약동학과 비교하여, 0.625 mg/kg의 용량으로 유리 RA의 정맥 주사 후 래트에서 측정 된 RANP는 훨씬 더 넓은 곡선 하 면적(AUC) 을 나타냈고 (3,667.5 대 245.4 min·mg/mL), 혈액에서 훨씬 긴 순환 (또는 제거) 반감기 (t1/2) (174.7 대 42.9 분) 및 혈액 내 평균 체류 시간 (mean residence time, MRT) (254.1 대 50.1 분)을 나타내었다. 각각의 경우에, 이들 약동학적 값은 유리 RA에 대한 것보다 적어도 4 배 더 컸다. 이러한 결과는 생체 내(in vivo) 환경에서 RA의 나노 입자 형태의 생물학적 활성이 부모 RA의 생물학적 활성과 비교하여 연장됨을 시사한다.
실시예 5: RANP의 염증이 있는 결장 내 우선 국재화 특성 (RANPs preferentially localize to the inflamed colon)
염증이 있는 조직은 능동적인 혈관 형성 및 향상된 ROS 과잉 생산으로 인해 혈관 투과성이 향상 되어있기 때문에, 장기-순환 나노 입자(long-circulating nanoparticles)는 부모 소분자에 비해 염증이 있는 조직에 우선적으로 위치할 가능성이 더 높을 것으로 예상된다. 이것을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 정상 대조군과 DSS-유도 된 급성 결장염 모델 마우스 둘 다에서 인도시아닌 그린 (indocyanine green ICG)이 로딩 된 RANP를 IV 투여하여 생물분포 연구(biodistribution study)를 수행 하였다.
도 12는 ICG-로딩 된 RANP를 주사한 건강한 정상 마우스 (A) 및 급성 대장염 유도 마우스 (B)로부터 수득 된 주요 기관 (심장, 간, 비장, 신장, 폐 및 결장)의 대표적인 생체 외(ex vivo) 형광 이미지를 보여준다. 건강한 정상 생쥐의 결장에서는 무시할 수 있는 정도의 형광 방출이 관찰되었으며, 이는 조직에 RANP가 거의 축적되지 않음을 나타낸다 (A). 대신에, 나노 입자는 전형적인 망상 내피 기관인 간에서 크게 축적되는 것처럼 보였다. 대조적으로, 동일한 염료가 로딩된 RANP는 염증성 결장에 상당히 국재화되었다 (B). 종합적으로, 이들 결과는 RANP가 염증성 결장에 축적됨을 시사한다.
실시예 6: DSS-유도 급성 결장염 모델에서 RANP의 치료적 효능(Therapeutic efficacy of RANPs in a DSS-induced acute colitis model) (정맥내 투여)
시험관 내에서 RANP의 강력한 항산화 및 세포-보호 활성과, 염증성 결장에서의 연장된 혈액 순환 및 우선적 국재화 결과에 고무되어, 본 발명자들은 다음으로 인간의 IBD의 대리 모델로 사용하는 급성 결장염의 마우스 모델에서 RANPs의 치료 효과를 평가했다. 생쥐는 5개의 그룹으로 무작위로 나누었다: 정상 대조군 생쥐, 인산 완충 식염수 (PBS) 처리 된 생쥐, 및 10 (저용량), 20 (중간 용량) 또는 30 (고용량) mg/kg의 RANP로 처리된 생쥐. 마우스는 PBS 또는 RANP를 후안와를 통하여 (i.v.) 격일로 총 5 회 투여 받았다 (도 13).
치료적 효능은 체중, 결장 길이 및 출혈의 변화, 질병 활성 지수 (disease activity index, DAI), 골수 퍼옥시다제 및 호산구 퍼옥시다제 활성, 염증의 조직학적 증거 및 전-염증성 사이토 카인의 발현 수준을 비롯한 다양한 파라미터를 평가함으로써 결정되었다.
3 개의 RANP 처리 그룹은 모두 10 일에 PBS 처리 그룹과 비교하여 상당한 체중 감소를 나타내었다 (p <0.001) (도 14). 또한, RANP의 처리는 혈변의 발생률을 눈에 띄게 감소시켰다 (데이터는 나타내지 않음).
Symptom | Score | Characteristics |
Body weight loss | 0 1 2 3 4 |
No loss 1-5% 5-10% 10-20% >20% |
Stool | 01 2 3 4 |
Normal feces Loose stool Watery diarrhea Slimy diarrhea, little blood Severe watery diarrhea with blood |
Bleeding | 0 1 2 3 4 |
No blood Presence of blood Visible bleeding |
표 3에 나타낸 바와 같이, 전체 치료 기간 동안 정상 대조군에서 DAI 점수 (재료 및 방법에 기술된 바와 같이 결정된 체중 감소, 대변 일관성(stool consistency) 및 잠혈)에는 차이가 없었으나, 반면, PBS로 치료된 결장염 그룹은 DAI 스코어가 점진적으로 증가한 것으로 나타났으며 10 일에 최대 값 4에 도달하여 (도 15), 중증의 질환임을 나타냈다.
특히, 고용량 RANP (30 mg/kg)는 DAI 점수를 실질적으로 감소시켜 PBS-처리 마우스와 비교하여 질병 증상을 ~ 82 %까지 감소시켰다.
다음으로, 본 발명자들은 DSS-유도 급성 결장염의 중증도를 평가하기위한 주요 지표인, 결장 길이의 변화를 측정하였다. 대조군 정상 마우스와 비교하여, PBS-처리된 결장염 유발 마우스에서 결장 길이가 상당히 단축되었다 (7.20 ± 0.56 versus 5.56 ± 0.50 cm). 반면에 RANPs 처리는 결장 길이 단축에 있어 상당한 용량-의존적 감쇠를 야기하였다 (도 16). DAI 스코어에 대한 RANP의 효과와 유사하게, 저용량의 RANP 처리 (10 mg/kg)는 이와 관련하여 효과적이지 않아서 PBS-처리군과 비슷한 효과를 나타냈다 (5.70 ± 0.61 versus 5.56 ± 0.50 cm). 그러나 중간용량 (20 mg/kg) 및 고용량 (30 mg/kg)의 RANP 처리는 결장 단축을 상당히 약화시켜 각각 6.28 ± 0.40 및 6.80 ± 0.58 cm의 결장 길이를 나타내었다. 특히, 고용량의 RANP 처리군의 결장길이 값은 정상 대조군 (7.20 ± 0.56 cm)의 값에 가깝고, 이는 RANP가 결장에서의 염증을 개선함을 나타낸다. 종합하면, 이들 결과는 RANP가 용량-의존적 방식으로 급성 결장염의 진행을 억제할 수 있음을 분명히 나타낸다.
실시예 7: 병태생리학적 환경에서 RANP의 치료적 효능 평가(Evaluation of the therapeutic efficacy of RANPs in a pathophysiological setting)
인간 호중구 및 단핵구 과립에서 발견되는 글리코실화 된 혈액단백질 효소인 골수 퍼옥시다제 (myeloperoxidase, MPO)는 IBD 환자에서 질환 상태를 평가하기 위한 바이오 마커로서 작용하는 것으로 나타났다. 따라서, 염증성 조직으로의 호중구의 침윤은 MPO 활성을 측정함으로써 평가될 수 있다.
도 17은 각 처리 그룹에 대한 MPO 활성의 변화를 보여준다. PBS- 처리 된 대조군 질환 그룹에서 MPO 활성이 실질적으로 증가하였고, MPO 활성의 감소를 동반하는 RANP 처리에 의해 현저하게 약화되는 효과는 고용량 그룹 (30 mg/kg)에서 가장 명백하였다. 이는 RANP 처리가 염증성 결장으로의 호중구 침윤을 실질적으로 억제한다는 것을 나타낸다.
전-염증성 사이토카인 반응은 IBD의 개시 및 진행을 주관하는 주요 병태생리학적 인자이다. 따라서 본 발명자들은 궤양성 결장염의 발병에 중요한 역할을 하는 염증의 대한 잘 알려진 마커인, 인터페론 감마(IFN-gamma), 결장 인터루킨-1beta (IL-1beta), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-12(IL-12) 및 종양 괴사 인자 알파 (tumor necrosis factor-alpha, TNF-alpha)에 초점을 맞추어, 염증성 결장에서 전-염증성 사이토 카인 생성에 대한 RANP의 영향을 조사하였다. RANPs 처리는 DSS-유도된 대장염 결장에서 용량 의존적으로 IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-12 및 TNF-α의 생산을 상당히 감소시켰다 (도 18 내지 22).
고용량 RANP 처리 (30 mg/kg)는 모든 사이토카인을 건강한 대조군과 유사한 수준으로 감소시켜 염증이 완전히 완화되었음을 시사하였다. 염증성 결장에서 이러한 전-염증성 사이토카인의 생성에 대한 RANP의 효과는 MPO 활성에 대한 효과와 유사하였다. 이러한 결과는 DSS-유도 급성 결장염에서 RANP의 강력한 항 염증 효능을 명확하게 나타낸다.
구조적 완전성의 손실 정도, 장움(crypt)의 존재, 장움(crypt) 파괴 및 점막 표면 변화를 고려한 조직 병리학적 점수는 결장의 염증 정도를 이해하는 한 방법입니다. 건강한 대조군 마우스로부터 얻은 대표적인 결장의 조직학 소견과는 대조적으로, PBS-처리 된 대장염 결장은 불규칙한 형태, 표면 상피에 심한 손상, 출혈, 움샘(cryptal gland)의 파괴, 점막하층의 비후, 점막 궤양 및 점막하 부종, 및 염증 세포의 극심한 침윤과 같은 교란된 결장 구조를 나타냈다 (도 23). 10 또는 20 mg/kg의 RANP로 처리 된 마우스는 비교적 온전한 표면 상피를 보여 주었지만, 여전히 움샘(cryptal gland) 의 파괴 및 염증 세포의 침윤을 나타냈다. 특히, 30 mg/kg의 RANP로 처리된 생쥐의 결장 조직학은 결장의 내막층 구조가 건강한 대조군 결장에서와 유사하게 정상이었으며, 많은 잔 세포(goblet cell)이 있는 장움(crypt)의 보존을 보여주어, 상피의 회복 및 염증 완화를 나타내었다.
염증 정도는 또한 결장 근육의 두께를 측정함으로써 평가되었다. 건강한 대조군과 비교하여, PBS-처리된 결장염 마우스는 결장 근육 두께가 상당히 증가된 것으로 나타났다. 대조적으로, RANP의 투여는 용량 의존적 방식으로 결장 근육의 비후를 완화시켰다. 염증 세포 침윤, 궤양, 샘 손상(gland damage) 및 부종, 총 손상 점수의 심각도를 측정하는 스코어링 시스템을 사용하여 평가된 이러한 조직 학적 변화는 도 24에 요약되었다.
실시예 8: 시험 관내 및 생체 내 RANP의 생체 적합성(Biocompatibility of RANPs
in vitro
and
in vivo
)
본 발명자들은 시험 관내 및 생체 내 RANP의 세포 독성을 평가하였다. CHO-K1 세포에 대해 수행된 WST-8 세포 증식 분석은 100 μM의 농도까지 48 시간 동안의 RANP 처리가 CHO-K1 세포의 생존력에 영향을 미치지 않아 시험 관내에서 세포 독성이 거의 없음을 나타냈다 (도 7A).
이어서 7 일 동안 매일 30 mg/kg의 용량으로 나노 입자를 정맥 내 주사함으로써 생체 내에서 RANP의 독성을 평가하였다. RANPs 처리는 체중 감소 또는 비정상적인 행동 측면에서 명백한 독성을 유발하지 않았으며 (도 7B), 미처리 대조군과 비교하여 설사, 음식 또는 물 섭취량, 또는 기타 증상과 같은 임상적 특징을 크게 증가시키지 않았다. 또한, 사망률도 관찰되지 않았다.
주요 기관의 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색은 RANP의 반복적인 고용량 (30 mg/kg) 투여가 건강한 대조군 마우스와 비교하여 병리학적 변화를 유발하지 않는 것을 나타냈다 (도 7C). 이러한 결과는 모 화합물 RA와 같이, RANP가 치료적 용량을 초과하는 용량에서도 높은 생체 적합성을 나타내며 및 독성이 없음을 분명히 나타낸다.
실시예 9: 키토산-RA, 키토산-RA 나노입자의 제조 및 특성 확인(Chitosan-RA, Chi-RA nanoparticles and Characterization)
키토산-RA(chitosan conjugated RA, Chi-RA) 합성 및 나노입자의 제조
RA(rosmarinic acid)를 포함한 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (미국, 미주리 주, 세인트루이스)에서 구입하였고 달리 지시되지 않는 한 추가 정제없이 사용하였다. 0.083 mmol의 RA과 0.025 mmol의 chitosan (MW: ~4K) 을 5 mL의 디메틸 포름 아미드 (dimethylformamide, DMF): DW(distilled water) 혼합용액 (4:1, v/v)에 함께 용해시켰다. 실온에서 10 분 동안 교반한 후, 0.025 mmol의 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) 를 혼합물에 첨가하고, 질소 대기 하에서 실온에서 교반하면서 밤새 반응을 수행하였다. 미정제 생성물을 과량의 acetone을 사용하여 침전시키고, 원심분리기를 통해 분리하는 방법을 통해 정제하여 연 황색 고체의 생성물을 수득하였다.
Reagent | MW | Amount | Mmol | EQ |
Rosmarinic acid | 360.31 | 30 mg | 0.083 | 3.32 |
Chitosan | ~4K | 100 mg | 0.025 | 1 |
EDC | 191.7 | ~10 mg | 0.052 | 2 |
또한, 키토산-RA의 나노입자를 제조하기 위하여 수득한 키토산-RA를 PBS에 넣고, 10분 동안 bath sonicator (50W, 40kHz)에서 초음파 처리하여, 균일 한 크기의 키토산-RA 나노입자를 생성하였다.
Chi-RA 및 Chi-RA 나노입자의 특성 분석(Characterization of Chi-RA & Chi-RANP)
이어서, 상기 생성물을 Beckman Coulter DU-800 UV-Vis 분광 광도계를 이용한 UV-Vis 스펙트럼을 통해 분석했다. 또한, Chi-RA 나노입자의 입자 크기는 633 nm에서 작동하는 4.0 mW HeNe 레이저 및 avalanche photodiode detector 가 장착된 Nanosizer ZS90 (Malvern Instrument Ltd., Malvern, UK)을 사용하여 광자 상관 분광법 (photon correlation spectroscopy, PCS) 기술로 분석되었다.
그 결과 본 발명의 키토산-RA 컨쥬게이트가 합성되었음을 확인하였으며, 본 발명의 키토산-RA 컨쥬게이트로부터 비교적 균일한 나노 크기의 Chi-RA 입자가 형성되었음을 확인하였다.
실시예 10: 히알루론산-RA, 히알루론산-RA 나노입자의 제조 및 특성 확인(Hyaluronic acid-RA, HA-RA nanoparticles and Characterization)
히알루론산-RA(hyaluronic acid(HA)-RA, HA-RA)의 합성 및 나노입자의 제조
본 발명자들은 다음과 같은 단계를 통하여 로즈마린산-히알루론산(100K) 컨쥬게이트를 제조하였다.
1. Boc 프로텍션
상기와 같이 NH2-PEG2-NH2의 한쪽 아민기를 Boc 프로텍션을 한다.
2. RA-Boc-PEG2-NH2 컨쥬게이션
로즈마린산의 카르복실산에 한쪽 아민이 Boc 프로텍션된 NH2-PEG2-Boc을 EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide), 및 TEA (trimethylamine)을 사용하여 DCM/DMF solvent에서 상온에서 오버나잇 반응하여 컨쥬게이션 한다.
3. Boc 디프로텍션
이후 TFA를 사용하여 Boc 디프로텍션을 시켜주어 RA-PEG2-NH2를 제조한다.
4. Hyaluronic acid 및 RA-PEG2-NH2 컨쥬게이션
HA-나트륨염을 0.01M HCl 용액에서 오버나잇 투석한 후 동결 건조하여 으로부터 HA의 산 형태(acid form)를 제조하였다.
마지막으로 HA-RA 컨쥬게이트는 는 RA-PEG2-NH2의 아민 그룹과 HA 산 형태의 카르복실산 그룹 간의 EDC 커플링을 위해 EDC, DIPEA를 사용하여 DMSO solvent 상에서 합성하였다. 이후, 0.01 M NAOH, RT에서 하룻밤 교반하여 투석 후 증류수, RT에서 에서 2일 동안 한 번 더 투석한 후 정제하고, 이를 동결 건조하여 최종적으로 본 발명의 RA-PEG2-HA를 수득하였다
상기 과정을 보다 구체적으로 설명한다.
RA (rosmarinic acid)를 포함한 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (미국, 미주리 주, 세인트루이스)에서 구입하였고 달리 지시되지 않는 한 추가 정제없이 사용하였다. 먼저, 1.37mmol의 Di-tert-butyl dicarbonate를 10 ml의 다이클로로메테인 (dichloromethane, DCM)에 용해시켰다. 용해된 용액에 6.85mmol의 2,2′-(Ethylenedioxy)bis(ethylamine)을 천천히 떨어뜨려 혼합물에 첨가하고 질소 대기 하에서 실온에서 교반하면서 밤새 반응을 수행하였다. 미정제 생성물을 탄산수소염(Sodium bicarbonate)수용액을 이용한 워크업을 통해 제거하여 미색 고체 생성물 (Boc-PEG2-NH2)을 수득하였다. 0.77 mmol의 Boc-PEG2-NH2과 1.54 mmol의 RA, 2.31 mmol의 EDC, 162 μL의 DIPEA와 함께 5 mL의 디메틸포름아미드에 용해시키고, 질소 대기 하에서 실온에서 교반하면서 밤새 반응을 수행하였다. 미정제 생성물을 디클로로 메탄 (dichloromethane, DCM)과 메탄올 (10:1)의 혼합물을 사용하여 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체의 생성물(RA-PEG2-Boc)을 수득하였다. 0.74 mmol의 RA-PEG2-Boc을 10ml의 다이클로로메테인 (dichloromethane, DCM)에 용해시켰다. 용해된 용액에 3.7 mmol의 트리플루오로아세트산 (Trifluoroacetic acid, TFA)을 천천히 떨어뜨려 혼합물에 첨가하고 질소 대기 하에서 실온에서 교반하면서 밤새 반응을 수행하고 얻어진 생성물(RA-PEG2-NH2)은 회전증발농축기을 이용하여 용매를 제거한다 0.1 mmol의 히알루론산 (MW: ~100K, Lifecore Biomedical, USA)와 1 mmol N-하이드록시석신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS)를 1 mmol EDC와 함께 증류수에 용해시켰다. 실온에서 10 분 동안 교반한 후 0.5 mmol RA-PEG2-NH2를 첨가하고, 질소 대기 하에서 실온에서 교반하면서 밤새 반응을 수행하였다. 미정제 생성물을 과량의 acetone을 사용하여 침전시키고, 원심분리기를 통해 분리하는 방법을 통해 정제하여 연 황색 고체의 생성물을 수득하였다. 혼합물을 30 ml의 0.01 M NaOH에 천천히 부은 다음, 0.01 M NaOH에 대해 5 시간 동안 투석을 수행하였다. 물/아세토 니트릴의 1:1 비에 대해 1 일 동안 3 회 추가 투석을 수행 한 후, 증류수에 대해 2 일 동안 3 회 투석을 수행 하였다. 생성된 용액을 최종적으로 동결 건조시켜 HA-PEG2-RA을 수득 하였다.
또한, 히알루론산-RA의 나노입자를 제조하기 위하여 수득한 히알루론산-RA를 PBS에 넣고, 10분 동안 bath sonicator (50W, 40kHz)에서 초음파 처리하여, 균일 한 크기의 히알루론산-RA 나노입자를 생성하였다.
HA-RA 및 HA-RA 나노입자의 특성 분석(Characterization of HA-RA HA-RANP)
이어서, 상기 생성물을 Beckman Coulter DU-800 UV-Vis 분광 광도계를 이용한 UV-Vis 스펙트럼을 통해 분석했다. 또한, HA-RA 나노입자의 입자 크기는 동적 광산란 (dynamic light scattering, DLS)에 의해 측정된 인산 완충 용액 (pH 7.4)에서 HA-RA 나노입자의 유체 역학적 크기를 측정하였다. 또한, HA-RA 나노입자의 형태학적 특성을 음성-염색 투과 전자 현미경 (TEM) 기술을 사용하여 조사하였다.
결과는 도 28 내지 도 30에 나타내었다.
도 28으로부터 본 발명의 HA-RA 컨쥬게이트가 합성되었음을 확인하였으며, 도 29 및 도 30으로부터 본 발명의 HA-RA 컨쥬게이트로부터 비교적 균일한 나노 크기(약 140 nm)의 HA-RA 입자가 형성되었음을 확인하였다.
실시예 11: HA-RA 나노입자의 인 비트로 특성 분석
HA-RA 나노입자의 ROS 소거능(항산화능)
본 발명자들은 HA-RA 나노입자 (HA-RANP)의 항산화 능력으로 ROS로 인한 손상으로부터 세포를 보호할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, HA-RA를 다양한 농도로 만든 후, CHO cell(Chines Hamster Ovarian cell)에 처리한 후, 약 8시간 동안 배양하였다. 이후, 100 μM의 과산화수소(hydrogen peroxide)를 처리하고 세포에서 ROS에 의한 독성으로 인해 생존능이 얼마나 감소하는지를 WST-8 assay kit를 이용하여 확인하였다. 결과는 도 33에 나타내었다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 아무것도 처리하지 않은 그룹의 세포생존능이 감소하였음을 확인하였고, HA-RANP 농도의존적으로 CHO 세포의 세포생존능이 증가하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 HA-RANP는 항산화능이 우수하여 ROS로 인한 손상으로부터 세포를 보호할 수 있음을 알 수 있었다.
HA-RANP의 세포독성
본 발명자들은 HA-RANP의 세포독성 여부를 확인하기 위하여, 본 발명의 HA-RANP를 연속희석(serial dilution)한 시료를 처리한 CHO 세포를 8시간 이상 배양한 뒤 WST-8 assay kit를 이용하여 세포생존능을 확인하였다. 결과는 도 34에 나타내었다.
도 32에 나타낸 바와 같이, HA-RANP는 10 mg/ml의 높은 농도에서도 세포생존능이 정상 그룹에 가까울 정도로 높게 측정되어서 세포독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였다
대식세포 분극화 시험 (Macrophage Polarization Test)
본 발명자들은 본 발명의 HA-RANP 처리와 대식세포의 M1/M2 분극화 사이의 상관 관계를 조사하기 위하여, LPS로 대식세포를 처리하고 mRNA 수준을 시간 의존적 방식으로 평가하였다.
구체적으로, 마우스 단핵구 대식세포 J774.1 세포를 배양한 후 0.5 μg /mL의 LPS를 처리한 후 5, 10, 15, 20 시간 동안 배양하고 농도 별(1 mg/ml, 10 mg/ml) HA-RA를 처리한 그룹의 사이토카인 mRNA 수준을 qPCR을 통해 측정하였다. 결과는 도 33에 나타내었다.
도 33은 HA-RANP의 대식세포 분극화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 HA-RANP를 처리한 대식세포의 사이토카인 mRNA의 상대적 발현량을 나타낸 도이다.
그 결과, M1 관련 전염증 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-6는 LPS 처리 후 약 5시간 후 가장 높았지만(최대 염증성 사이토카인 RNA 발현양 확인), HA-RANP를 처리한 후에는 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 HA-RANP가 M1 대식세포 분극을 억제하고 항염증성 효과를 나타냄을 의미하는 것이다.
반면, M2 관련 항염증 사이토카인 TGF-β 및 IL-10의 경우, 변화가 없었다.
실시예 12: HA-RA 나노입자의 인 비보 특성 분석
HA-RANP의 염증성 장질환 모델 마우스에 대한 효과
본 발명자들은 HA-RANP의 염증성 장 질환 모델 마우스에서의 항염증 치료 효능을 확인하기 위하여 다음과 같은 시험을 수행하였다. 마우스(C57BL/6, 6주령, 암컷, 7일 순응과정을 거침)에 5일간 음용수에 3% DSS를 투여한 염증성 장질환 모델을 이용하여, 세가지 투여농도(20, 50mg/kg, 100mg/kg)의 HA-RANP를 5일간 (D+1~D+5, 1회/1일) 총 5회 경구 투여하였다. 마우스 모든 그룹의 몸무게 변화 (매일 측정), 마지막날 대장 적출 검사를 통해 질병의 진행 정도 및 HA-RANP의 항염증 효과를 확인하였다. 본 실시예의 개요를 도 34로 나타내었다.
도 35는 HA-RANP가 염증성 장 질환 모델 마우스에서 체중 변화에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 36은 HA-RANP가 염증성 장 질환 모델 마우스에서 결장 길이에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
먼저, DSS로 유발된 증상의 급성 대장염의 중증도를 평가하기위한 핵심 지표인 체중과 대장 길이를 분석했다. 도 37에 나타낸 바와 같이, 10 일간 몸무게를 측정한 결과, PBS 처리 그룹(대조군, control)은 체중감소가 크게 일어났음을 확인하였다. 이에 비해 3개 농도의 HA-RANP 처리 그룹 모두 체중 감소가 크게 감소하여 회복함을 확인하였다. 특히, 고용량 100 mg/kg의 HA-RANP는 체중 감소를 현저하게 감소시켜 PBS 처리된 마우스에 비해 질병 증상(체중감소)을 ~ 90 % 가량 감소시켰다.
또한, 도 36에 나타낸 바와 같이, 대조군 정상 마우스에 비해 PBS 처리 된 결장염 유발 마우스에서 결장 길이가 상당히 짧아졌으나, HA-RANP를 처리한 마우스에서는 HA-RANP 용량 의존적으로 결장 길이 단축이 상당히 감소하여 정상 결장 길이로 회복되었음을 확인하였다.
또한, 마이엘로퍼옥시다아제 (myeloperoxidase, MPO) 활성 및 염증성 사이토카인의 발현을 ELISA assay를 통해 확인하였다. 구체적으로, 마우스 결장 샘플의 동일한 부분을 잘라 전처리 과정을 거쳐 분쇄한 후 일정한 양으로 이를 원심분리 시켜 얻어진 상층액을 이용하여 이하의 assay를 진행하였다. 상기 MPO 활성은 호중구의 염증 조직으로의 침윤을 평가하는 인덱스이다. MPO 활성의 측정법은 Grisham et al. (1990) 등에 개시되어 있다.
MPO 활성 측정 결과는 도 37에 나타내었다.
도 37에 나타낸 바와 같이, MPO 활성은 PBS 처리된 질병 그룹에서 증가했으나, HA-RANP의 처리에 의해 용량 의존적 방식으로 현저하게 감소함을 확인하였다.
또한, ELISA로 측정한 전-염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 발현량은 도 38 내지 41에 나타내었다.
도 38 내지 41에 나타낸 바와 같이, HA-RANP의 처리에 의해, 전-염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ 및 TNF-α의 발현이 HA-RANP 용량 의존적으로 현저하게 감소되었다. 특히, 고용량 HA-RANP 처리군(100 mg/kg)에서는 모든 사이토카인을 건강한 대조군과 비슷한 수준으로 감소시켜 염증이 완전히 완화되었음을 시사하였다.
또한, 조직 병리학적 확인으로 구조적 완전성 손실, crypt 파괴 및 점막 표면 변화 정도를 확인하여 대장의 염증도 변화를 확인하였다.
조직병리학적 소견을 도 42에 나타내었다.
그 결과, 건강한 대조군 마우스와 달리, PBS 처리 대조군의 결장의 조직은 불규칙한 형태를 나타냈다. 구체적으로 움샘(cryptal glands)의 파괴, 표면 상피의 심각한 손상, 두꺼워진 점막하층, 점막 궤양, 점막하 부종 및 염증 세포의 침윤을 확인할 수 있었다. 반면, HA-RANP 처리된 군에서는 비교적 온전한 표면 상피, 많은 술잔 세포(goblet cell)가 있는 보존된 crypt를 확인할 수 있었다.
HA, RA, 및 HA-RANP의 염증성 장질환 모델 마우스에 대한 효과
본 발명자들은 본 발명의 HA-RANP의 염증성 장질환 모델 마우스에 대한 효과를 HA, 및 RA와 비교하여 평가하였다. 상술한 실험과 동일한 방법으로 염증성 장질환 모델을 유도하고, 약물로는 100mg/kg의 HA-RANP 및 양성 약물 대조군으로서 동일한 양의 Free HA (85 mg/kg), RA (15 mg/kg) 및 5-ASA (5-amino salicylic acid)(100 mg/kg)를 경구 투여하였다 (총 5회, 1회/1일, D+1~D+5).
특히, 케이지 당 두 마리의 마우스를 사육하여 서로의 배설물을 통해 장내 세균이 공유되는 것을 방지하고 배설물 샘플을 0, 4, 9 일에 수집했다.
먼저, DSS로 유발된 증상의 급성 대장염의 중증도를 평가하기위한 핵심 지표인 체중과 대장 길이를 분석했다.
도 43 및 도 44는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 체중 및 결장길이를 나타낸 도이다.
예상대로 HA-RANP의 경우 이전 실험에서와 같이 10 일째 PBS처리군(대조군)에 비해 체중 감소 및 결장 길이 단축이 현저히 감소하여 회복됨을 확인하였다. 그러나 HA의 경우에는 전혀 효과가 없어 실험결과는 대조군과 거의 같았고 RA의 경우에는 약간의 효능을 보였다. 반면, 예상과 달리 5-ASA의 효능이 현저히 낮은 것으로 확인되었다. 아마도 5-ASA의 수용성이 매우 낮아 생체 이용률이 낮기 때문일 것으로 생각되었다.
또한, 본 발명자들은 MPO 활성 및 전 염증성 사이토 카인 수준을 평가하였다.
도 45는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 MPO 활성을 나타낸 도이다.
도 46 내지 도 49는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 전염증성 사이토카인(순서대로 IL-1beta, IL-6, IFN-gamma, 및 TNF-alpha)의 발현 정도를 나타낸 도이다.
그 결과, 100 mg/kg 용량의 HA-RANP 치료는 MPO와 모든 사이토카인을 건강한 대조군과 비슷한 수준으로 회복하였으며, 다음으로 RA 및 5-ASA 그룹은 염증을 어느 정도 완화시켰다. 반면, HA 그룹은 거의 효과가 없는 것으로 확인되었다.
본 발명자들은 또한 시료별 결장의 조직병리학적 소견을 확인하였다.
도 50는 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직을 나타낸 도이다.
그 결과, H&E 염색된 조직검사에서도 100 mg/kg 용량의 HA-RANP 처리는 건강한 대조군과 거의 비슷하였다. 다음으로 RA 및 5-ASA 그룹은 염증이 약간 완화된 것으로 나타났다. 그러나, HA 그룹은 거의 효과가 없는 것으로 확인되었다.
본 발명자들 또한 HA, RA, HA-RANP가 장벽의 건강에 영향을 미치는 밀착 연접(tight junction)과 관련된 마커 유전자들의 mRNA 발현 정도에 미치는 영향을 확인하였다.
밀착 연접은 주로 ZO-1, Claudin 및 Occludin으로 이루어져 있고, 이들은 점막의 투과성에 영향을 준다. 장 상피는 점막으로 덮혀있고, 장내 미생물이 조직 밑으로 침투하는 것을 막아준다. 염증성 장질환에서 장상피 밀착 연접, 결장 점막층의 완결성 및 투과성에 대한 부정적인 변화는 장내 미생물의 침습을 야기하고, 염증과 감염을 악화시킨다.
도 51 내지 53은 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직의 ZO-1, claudin-1, 및 occludin-1 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸 도이다.
예상한 바와 같이, 염증성 장질환 마우스의 결장에서는 밀착 연접과 관련된 유전자들의 발현이 감소되었고, HA, RA, HA-RANP 및 5-ASA는 ZO-1, Claudin-1 및 Occludin의 단백질 수준을 향상시켰다. 그 중에서도 HA-RANP는 밀착 연접 관련 유전자의 발현을 증가시키는 효과가 전반적으로 가장 우수하였다.
본 발명자들 또한 HA, RA, HA-RANP가 장벽의 건강에 영향을 미치는 밀착 연접(tight junction)과 관련된 마커 유전자들의 mRNA 발현 정도에 미치는 영향을 확인하였다.
도 54 내지 56은 HA, RA, 5-ASA, 또는 HA-RANP를 처리한 염증성 장질환 마우스 모델의 결장 조직의 NF-κB p65, COX-2 및 INOS 유전자의 mRNA 발현 정도를 나타낸 도이다.
그 결과, RA, HA-RANP, 5-ASA는 상기 염증관련 유전자 발현을 상당히 감소시켰고, 그 중에서도 HA-RANP의 염증관련 유전자 발현 감소 효과가 가장 뛰어났다. 반면, HA는 염증관련 유전자 발현 감소 효과가 가장 미미하였다.
또한, 본 발명자들은 고용량 (100mg/kg)의 HA-RANP 처리 후 주요 장기를 적출하여 (간, 폐, 심장, 신장, 비장, 대장) H&E 염색된 조직검사를 함으로써 HA-RANP의 생체적합성(Biocompatibility)을 테스트하였다.
도 57는 고용량 (100mg/kg)의 HA-RANP 처리 후 주요 장기를 적출하여 (간, 폐, 심장, 신장, 비장, 대장) H&E 염색된 조직검사 결과를 나타낸 도이다.
그 결과, 고용량 (100mg/kg)의 HA-RANP 처리군과 건강한 대조군의 경우 조직소견이 거의 유사하여, HA-RANP는 생체적합성에 뛰어남을 확인할 수 있었다.
실시예 13: 저분자량 키토산-RA, 저분자량 키토산-RA 나노입자의 제조 및 특성 확인
저분자량 키토산-RA(low molecular weight chitosan conjugated RA, LMWC-RA) 합성 및 나노입자의 제조
본 발명자들은 저분자량 키토산(fractionated low molecular weight chitosan, LMWC)(5K~10K)의 아민기와 RA의 카르복실기를 EDC를 이용하여 반응시켜 안정된 아마이드결합을 형성시킴으로써 저분자량 키토산-RA 컨쥬게이트(LMWC-RA)를 제조하였다. 반응시간 및 조건은 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 수행하였다.
LMWC-RA의 용해도
본 발명자들은 본 발명의 LMWC-RA의 용해도를 비교하기 위하여, 고분자량 키토산(non-fractionated high molecular weight chitosan, HMWC) (10K 초과), LMWC, RA, LMWC-RA를 증류수, 또는 DMSO에 각각 5 mg/ml의 농도로 용해시켰다. 그 결과는 도 58에 나타내었다.
도 58에 나타낸 바와 같이, HMWC는 증류수에 전혀 용해되지 않았고, LMWC는 증류수에 용해되었다. RA는 DMSO에서는 25 mg/ml의 농도까지 용해되었으나, 증류수에서는 41 μg/ml의 농도까지만 용해가 되어 증류수에서는 부분적으로만 용해됨을 알 수 있었다. 본 발명의 LMWC-RA는 증류수에서도 5 mg/ml의 농도에서도 용해가 잘 되어 수용성이 높음을 확인하였다.
도 58은 본 발명의 LMWC-RA의 증류수에 대한 용해도를 나타낸 도이다.
LMWC-RA의 1H NMR Spectrum 및 UV/vis 흡광도 측정
또한, 1H (Proton) NMR 파장의 비교(도 61), 및 UV/vis 흡광도 스펙트럼(도 62)을 측정하여 LMWC-RA의 합성 유무를 확인하였다.
도 59는 본 발명의 LWMC-RA의 1H NMR 스펙트럼을 나타내어 LWMC-RA의 합성여부를 보여주는 도이다.
도 60은 본 발명의 LWMC-RA의 UV/vis 흡광도 스펙트럼을 나타내어 LWMC-RA의 합성여부를 보여주는 도이다(RA peak: 약 330 nm).
LWMC-RA 나노입자의 유체역학적 크기 및 제타 전위값
본 발명의 LWMC-RA로 실시예 8에 나타낸 방법으로 나노입자를 제조한 후, 유체역학적 크기 및 제타 전위값을 측정하였다. 결과는 도 61 및 도 62에 나타내었다.
도 61에 나타낸 바와 같이 본 발명의 LWMC-RA 나노입자는 평균 입자 크기가 128.5 nm이고 100 nm 안팎의 비교적 균일한 입자 크기를 가짐을 확인하였다. 또한 도 62에 나타낸 바와 같이, LWMC-RA 나노입자는 4.38 ± 4.38 정도의 양전하를 띠는 것을 확인하였으며, 이는 저분자량 키토산의 제타 전위와 유사한 수치였다.
도 61은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 유체역학적 크기를 나타낸 도이다.
도 62는 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 제타 전위값을 나타낸 도이다.
LWMC-RA 나노입자의 입자 안정성 및 CMC
본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 입자안정성을 확인하기 위하여 PBS에서 8일 동안 유체역학적 크기를 측정한 결과, 입자의 크기가 계속 유지되어 수용액 내 입자 안정성이 우수함을 확인하였다(도 63). 또한, 본 발명의 LMWC-RA 나노입자 내 RA의 함량에 따른 입자 크기를 측정한 결과, 1 uM 이상의 RA가 들어있는 경우 나노입자의 유체역학적 크기가 일정하게 측정되어 Critical Micelle Concentration (CMC) 농도가 1 uM인 것을 확인하였으며, 이는 파티클 형태로 존재하기 위한 RA의 최소한의 농도임을 확인하였다(도 64).
LWMC-RA 나노입자의 입자 내 RA 함량의 측정
또한, 본 발명자들은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 입자 내 RA 함량의 측정하였다. UV/vis 흡광도 스펙트럼 결과로부터 분석한 결과, 본 발명의 LWMC-RA 나노입자에는 약 30% (w/w)의 RA가 포함되어 있음을 확인하였다(도 65 및 표 5).
LMWC-BR | |
Concentration of LMWC-RA |
0.1 mg/ml |
Absorbance Intensity (λ = 330 nm) | 0.618 |
Concentration of RA from standard curve | 30 μg/ml ( = 0.03 mg/ml) |
Amount of RA in 1 mg LMWC-RA | 300 μg ( = 0.3 mg/ml ) |
RA content (%) | 30 % |
LWMC-RA 나노입자의 ROS 소거능
본 발명자들은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자의 ROS 소거능을 측정하기 위하여, 0.1 mg/ml의 LWMC-RA 나노입자를 DPBS, H2O2, NaOH, AAPH와 반응시키면서 시간에 따른 UV 흡광도를 측정하였다. 또한, 반응 후 이들의 유체역학적 입자 크기를 측정하였다. 결과는 도 66 및 도 67에 나타내었다.
도 66은 본 발명의 LWMC-RA 나노입자를 활성산소종과 반응시키면서 시간에 따른 UV 흡광도를 나타낸 도이다. 도 67는 본 발명의 LWMC-RA 나노입자를 활성산소종과 반응 후 입자크기를 나타낸 도이다.
도 66에서 나타낸 바와 같이, 세가지 다른 종류의 ROS 모두에서 320 nm 파장의 UV 흡광도가 감소하는 결과를 얻었고, 따라서 LMWC-RA 나노입자가 이들을 환원시킨다는 것을 확인하였다. 이로 인해 LMWC-RA는 파티클의 크기가 작아졌으며 이를 DLS상에서 hydrodynamic size 측정을 통해 확인하였다(도 67).
또한, 본 발명의 LMWC-RA 나노입자를 과산화수소와 함께 반응 시켜 LMWC-RA가 이를 환원시키는 정도를 평가하였다(도 68). 그 결과, 100 μM의 과산화수소의 농도는 높은 농도의 LMWC-RA 나노입자와 반응하여 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 68).
실시예 14: LMWC-RA 나노입자의 인 비트로 특성 확인
본 발명자들은 본 발명의 LMWC-RA 나노입자의 인 비트로 특성을 확인하였다.
CHO 세포에서 ROS 소거능 확인
세포 손상을 야기시키는 과산화수소 용액(100 μM)을 CHO 세포에 처리한 후 LMWC-RA 나노입자를 처리하였을 때 WST-8 어세이를 통하여 세포생존능을 확인함으로써, LMWC-RA 나노입자의 과산화수소에 의한 (ROS) 세포 손상 억제 효과를 확인하였다.
도 69는 LMWC-RA 나노입자의 과산화수소에 의한 (ROS) 세포 손상 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 69에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 LMWC-RA 농도가 증가함에 따라 세포생존능이 점점 증가하여, ROS 소거능이 우수함을 확인하였다. 반면, 키토산 자체(LMWC)는 ROS 처리에 아무런 영향을 끼치지 않아 ROS 소거능이 없음을 알 수 있었다.
대식세포에서 전-염증성 사이토카인의 억제 효과
LPS 처리로 인한 항염증성 마커(IL-1beta, IL-6, TNF-alpha)가 증가되는 대식세포 (=activation된 macrophage)에 농도별로 LMWC-RA 나노입자를 처리 시 염증성 마커들이 감소하는것을 qPCR을 통해 확인하였다.
도 70는 LPS를 처리한 대식세포에 대한 LMWC-RA의 전-염증성 사이토카인의 억제효과를 나타낸 도이다.
도 70에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 LMWC-RA 나노입자는 세포 단계에서도 대식세포에 효과적인 염증 억제가 가능함을 확인하였다. 반면, 키토산 자체(LMWC)는 염증 억제 효과가 없음을 확인하였다.
대식세포에서 항염증성 사이토카인의 증가 효과
또한, LMWC-RA가 LPS-처리 대식세포에서 항염증성 사이토카인인 TGF-beta 및 IL-10의 발현수준을 증가시키는 것을 확인하였다(도 71). 상기와 같은 M2 마커가 증가된 결과로부터, 본 발명의 LMWC-RA가 항염증 효과 뿐만 아니라 회복과 관련된 작용도 할 가능성이 있음을 확인하였다.
실시예 15: LMWC-RA 나노입자의 인 비보 특성 확인
본 발명자들은 본 발명의 LMWC-RA 나노입자의 인 비보 특성을 확인하였다. 본 시험법의 개요는 도 72에 나타내었다.
7주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 7일간 순치시킨 후 3% DSS (36K~50K) 투여로 유도한 급성 결장염의 마우스 모델에서 실시예 6과는 달리 LMWC-RA 나노입자를 경구투여하고 치료 효과를 평가하였다. 마우스를 4개의 그룹으로 나누고, 4개의 그룹으로 무작위로 나누었다: 정상 대조군 마우스, 인산 완충 식염수 (DPBS) 처리된 마우스, 및 60 mg/kg의 LMWC-빌리루빈 나노입자(LMWC-BR) 처리된 마우스(BR 함량기준 15 mg/kg), 50 mg/kg의 LMWC-RA 나노입자 처리된 마우스(RA 함량기준 15 mg/kg). 상기 시험물질의 투여용량은 치료적 효과를 가지는 물질(BR 및 RA)을 기준으로 HA-RA 나노입자를 투여한 인 비보 실험 결과에서 RA 기준 15 mg/kg에서 가장 좋은 효과를 나타내었으므로, 같은 기준을 적용하여 RA 및 BR 기준 15 mg/kg으로 정하였다.
몸무게 및 DAI(disease activation index)를 도 73 및 도 74에 나타내었다. 몸무게 변화 및 DAI 결과에서는 LMWC-BR과 LMWC-RA 투여군 모두 혈변 등의 증상이 관찰되지 않아 효능 차이가 크게 보이지 않았으며, 본 발명의 LMWC-RA도 급성 결장염 모델에서 우수한 항염증성 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
결장의 길이를 도 75 및 도 76에 나타내었다. 결장의 길이에서도 LMWC-BR과 LMWC-RA 투여군 모두 효능 차이가 나타나지 않았으며, 본 발명의 LMWC-RA도 급성 결장염 모델에서 우수한 항염증성 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
비장의 무게를 도 77 및 도 78에 나타내었다. DSS 섭취 시 발생하는 대장 염증에 의하여 비장 내 면역 세포 유입 및 장으로부터의 염증성 사이토카인이 비장으로 도달하여 비장의 크기가 증가하는 양상을 보이나, 본 발명의 LMWC-RA 투여군에선 정상 쥐의 비장 무게와 유사하게 나타난 것을 통해 뛰어난 항염증성 효과로 인해 비장으로의 염증 전달이 일어나지 않았음을 확인하였으며, 이는 비장 뿐만이 아니라 전신 염증 또한 억제할 가능성이 보인 것으로 해석된다.
Claims (13)
- 제1항에 있어서, 상기 친수성화 개질제 H-X는 로즈마린산의 카르복실 그룹(-COOH)와 공유결합하여 상기 친수성 그룹 -X를 포함하는 로즈마린산 유도체를 형성하는 것인, 로즈마린산 유도체.
- 제1항에 있어서, 상기 친수성화 개질제 H-X는 H-(Y-Z)이고,
상기 -Y-는 로즈마린산의 카르복실 그룹(-COOH)과 공유 결합 가능하고, 상기 -Z와도 공유결합 가능한 연결기이고,
-Z는 H-Z 화합물에서 유래하며 (H는 수소), 상기 연결기 -Y-를 통해 로즈마린산의 카르복실 그룹에 결합되어 상기 친수성 그룹 -(Y-Z)를 포함하는 로즈마린산 유도체를 형성하고,
상기 H-Z 화합물은 덱스트란 (dextran), 카르보덱스트란(carbodextran), 덱스트린(dextrin), 헤파린(heparin), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 키틴(chitin), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 콜라겐, 젤라틴, 아카시아 검, 피브린, 히알루론산, 펙틴, 아가로즈(agararose), 갈락토만난(Galactomannan), 잔탄 검(Xanthan gum), 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 알긴산, 폴리사카라이드(polysaccharide), 사이클로덱스트란(cyclodextran), 풀루란(pluronic), 셀룰로오즈(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 카르보하이드레이트(carbohydrate), 단당류(monosaccharide), 이당류(bisaccharide), 올리고당류 (oligosaccharide), 아미노산(amino acid), 폴리펩타이드(polypeptide), 폴리포스파젠 (polyphosphagen), 폴리말릭산(polymaleic acid), 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate), 폴리하이드로옥시부틸레이트(polyhydroxybutylate), 폴리카르보네이트(polycarbonate), 폴리오르소에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(methoxy polyethyleneglycol, mPEG), 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymetacrylate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리(아크릴산염)(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinylester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리옥사이드(polyoxide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌옥사이드(Polyethyleneoxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide-bpropyleneoxide]), 및 폴리라이신(Polylysine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 로즈마린산 유도체.
- 제1항에 있어서, 상기 친수성화 개질제 H-X는 덱스트란 (dextran), 카르보덱스트란(carbodextran), 덱스트린(dextrin), 헤파린(heparin), 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 키틴(chitin), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 콜라겐, 젤라틴, 아카시아 검, 피브린, 히알루론산, 펙틴, 아가로즈(agararose), 갈락토만난(Galactomannan), 잔탄 검(Xanthan gum), 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 재생셀룰로오스, 말토덱스트린, 알긴산, 폴리사카라이드(polysaccharide), 사이클로덱스트란(cyclodextran), 풀루란(pluronic), 셀룰로오즈(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 카르보하이드레이트(carbohydrate), 단당류(monosaccharide), 이당류(bisaccharide), 올리고당류 (oligosaccharide), 아미노산(amino acid), 폴리펩타이드(polypeptide), 폴리포스파젠 (polyphosphagen), 폴리말릭산(polymaleic acid), 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate), 폴리하이드로옥시부틸레이트(polyhydroxybutylate), 폴리카르보네이트(polycarbonate), 폴리오르소에스테르(polyorthoester), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(methoxy polyethyleneglycol, mPEG), 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리메틸메타아크릴레이트(polymetacrylate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 폴리(아크릴산염)(poly[acrylate]), 폴리(아크릴아마이드)(poly[acrylamide]), 폴리(비닐에스테르)(poly[vinylester]), 폴리(비닐알콜)(poly[vinyl alcohol]), 폴리옥사이드(polyoxide), 폴리일렉트로라이트(polyelectrolyte), 폴리(N-비닐피롤리돈)(poly[N-vinyl pyrrolidone]), 폴리비닐아민(poly[vinyl amine]), 폴리(베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트)(Poly[beta-hydroxyethylmethacrylate]), 폴리에틸렌옥사이드(Polyethyleneoxide), 폴리(에틸렌옥시드-b-프로필렌 옥사이드(Poly[ethylene oxide-bpropyleneoxide]), 및 폴리라이신(Polylysine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 로즈마린산 유도체.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세 입자.
- 제5항의 미세 입자를 포함하는 약물전달용 조성물.
- 제5항의 미세 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항염증용 약제학적 조성물.
- 제5항의 미세 입자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증성 질환의 치료용 약제학적 조성물.
- 다음 단계를 포함하는 로즈마린산 유도체의 제조방법:
(a) 로즈마린산을 카르복실기 활성화제와 반응시켜 카르복실기를 활성화시키는 단계; 및
(b) 친수성 개질제와 반응시키는 단계.
- 제9항에 있어서, 상기 카르복실기 활성화제는 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 또는 N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC)인, 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계의 로즈마린산 또는 (b) 단계의 친수성 개질제는 아민기를 가지거나, 아민기를 가지도록 변형된 것인, 제조방법.
- 다음 단계를 포함하는 로즈마린산 유도체를 포함하는 미세 입자의 제조방법:
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 로즈마린산 유도체를 유기용매에 용해시키는 단계;
(b) 상기 유기용매를 제거하여 로즈마린산 유도체로 이루어진 필름층을 형성하는 단계; 및
(c) 상기 필름층에 친수성 용매를 가하여 자기-조립(self-assembly)에 의해 생성된 미세 입자를 제조하는 단계.
- 제12항에 있어서, 상기 유기용매는 N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 디메틸아세트아마이드, 디메틸포름아마이드(DMF), 에탄올, 메탄올, 에틸 아세테이트(ethyl acetate: EA), 디에틸에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 디클로로벤젠, 디메틸벤젠, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 것인, 미세 입자의 제조방법.
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