KR20210122978A - 측방 유동 분석 스트립 및 이를 이용한 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단일 멤브레인을 이용한 측방 유동 분석 스트립 및 이를 이용한 분석 방법을 제공한다. 본 발명의 측방 유동 분석 스트립은 시료 용액 내에 분산되고 상기 시료 용액 내에 함유된 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자, 제1 방향으로 연장되고 상기 제1 방향을 따라 서로 이격되고 순차적으로 위치하는 시료 적하 영역, 검사 영역 및 대조 영역을 구비하고, 상기 시료 용액을 모세관 현상을 이용하여 상기 제1 방향으로 이동시킬 수 있는 기공을 포함하는 다공성 멤브레인 패드, 상기 검사 영역의 표면 또는 기공 내부에 배치되고, 상기 기공 크기와 동일하거나 이보다 큰 직경을 가지며, 상기 제1 결합물질과 특이 결합할 수 있는 제2 결합물질이 표면에 수식된 제1 형광 입자, 및 상기 대조 영역의 표면 또는 기공 내부에 배치되고, 상기 기공 크기와 동일하거나 이보다 큰 직경을 가지며, 상기 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제3 결합물질 및 상기 제1 결합물질과 특이 결합할 수 있는 제4 결합물질이 표면에 수식된 제2 형광 입자를 포함한다.
Description
본 발명은 목적 생체물질의 정량 분석을 수행하기 위한 측방 유동 분석 스트립 및 이를 이용한 분석 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 단일 멤브레인 및 탐지 입자를 이용한 측방 유동 분석 스트립에 관한 것이다.
면역크로마토그래피(immunochromatography) 기반 측방유동분석법은 일반적으로 항원-항체 반응을 이용하여 멤브레인 상에서 질병의 감염 여부를 직관적으로 확인할 수 있는 진단법으로, 혈액이나 뇨 등의 시료가 모세관 현상에 의해 다공성 멤브레인을 진행하면서 탐지자가 항원-항체 반응에 의해 멤브레인의 일정 부분에 고정되는 현상을 이용한다.
종래의 측방유동분석법을 이용한 측방 유동 검정 스트립은 시료가 주입되는 시료 패드, 시료와 탐지자 사이에 생화학적 반응이 일어나는 콘쥬게이션 패드, 모세관 현상에 의해 시료가 흘러가면서 면역 검정이 진행되는 측정 패드, 측정 패드의 하류에 위치하여 과량의 시료를 흡수하여 측방 유동을 유지하는 흡수 패드 등이 한 방향으로 배치되어 구성된다.
그러나 이러한 구조의 검정 스트립은 각각의 구성 요소마다 다양한 종류의 패드와 멤브레인을 사용해야 하기 때문에 제작 방법이 복잡하고, 시료에 따라 각 패드를 구성하는 멤브레인의 측방 유동 특성을 고려해야하여 개발 및 생산이 어려운 문제점이 있다.
본 발명의 일 목적은 여러 종류의 패드와 멤브레인이 필요한 기존의 측방 유동 검정 스트립을 하나의 멤브레인으로 구현한 측방 유동 분석 스트립을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 측방 유동 분석 스트립을 이용한 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 측방 유동 분석 스트립은 시료 용액 내에 분산되고 상기 시료 용액 내에 함유된 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자, 제1 방향으로 연장되고 상기 제1 방향을 따라 서로 이격되고 순차적으로 위치하는 시료 적하 영역, 검사 영역 및 대조 영역을 구비하고, 상기 시료 용액을 모세관 현상을 이용하여 상기 제1 방향으로 이동시킬 수 있는 기공을 포함하는 다공성 멤브레인 패드, 상기 검사 영역의 표면 또는 기공 내부에 배치되고, 상기 기공 크기와 동일하거나 이보다 큰 직경을 가지며, 상기 제1 결합물질과 특이 결합할 수 있는 제2 결합물질이 표면에 수식된 제1 형광 입자, 및 상기 대조 영역의 표면 또는 기공 내부에 배치되고, 상기 기공 크기와 동일하거나 이보다 큰 직경을 가지며, 상기 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제3 결합물질 및 상기 제1 결합물질과 특이 결합할 수 있는 제4 결합물질이 표면에 수식된 제2 형광 입자를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 탐지 입자는 금, 은, 구리, 백금 및 팔라듐 중에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 복합체로 형성될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인 패드는 실리카, 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 나일론, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴 플루오라이드 및 폴리테트라플루오로에틸렌 중에서 선택된 어느 하나로 될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기는 1 내지 8 ㎛일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제1 및 제2 형광 입자의 직경은 상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기의 80% 이상 200% 이하일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 형광 입자는 고분자 코어 입자 및 상기 고분자 코어 입자의 표면을 덮고 있는 형광 나노입자를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 고분자 코어 입자의 크기는 1 내지 8 ㎛ 이고, 상기 형광 나노 입자의 크기는 40 내지 100 ㎚일 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 위한 상기 측방 유동 분석 스트립을 이용한 시료 내의 목적 생체물질의 정량 분석 방법은 상기 목적 생체물질이 미지의 농도로 포함된 시료에 상기 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자를 첨가하여 혼합 시료를 제조하는 제1 단계, 상기 혼합 시료를 상기 시료 적하 영역에 적하하여 모세관 현상을 통해 이동시킴으로써, 상기 혼합 시료를 상기 검사 영역의 제1 형광 입자 및 상기 대조 영역의 제2 형광 입자와 순차적으로 반응시키는 제2 단계, 및 상기 검사 영역 및 상기 대조 영역의 상기 제1 및 제2 형광 입자로부터 각각 생성되는 각각의 제1 및 제2 형광 신호를 측정하여 분석하는 제3 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 제1 단계에서, 상기 목적 생체물질은 상기 제1 결합물질에 의해 상기 탐지 입자의 표면에 결합될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제2 단계에서, 상기 검사 영역의 상기 제1 형광 입자는 상기 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자와 결합되고, 상기 대조 영역의 상기 제2 형광 입자는 상기 목적 생체물질 및 상기 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자와 결합할 수 있다.
본 발명에 따르면, 단일 멤브레인을 이용하여 측방 유동 분석 스트립을 구성함으로써, 종래의 다양한 종류의 멤브레인으로 구성된 패드들을 정밀하게 조합하는 과정, 각 패드에서 시료의 유체이동 특성 고려하는 과정, 시료에 따른 각 패드의 최적화 과정 등을 생략할 수 있어, 측방 유동 분석 스트립 생산 및 구조의 복잡성을 줄일 수 있다.
도 1은 본 발명의 측방 유동 분석 스트립을 설명하기 위한 구조를 나타낸 도면이다.
도 2 및 3은 본 발명의 측방 유동 분석 스트립을 이용한 분석 방법을 설명하기 위한 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1의 cTnI 정량 분석-1 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2의 cTnI 정량 분석-2 결과를 나타낸 도면이다.
도 2 및 3은 본 발명의 측방 유동 분석 스트립을 이용한 분석 방법을 설명하기 위한 구조를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1의 cTnI 정량 분석-1 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2의 cTnI 정량 분석-2 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 측방 유동 분석 스트립을 설명하기 위한 구조를 나타낸 도면이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 측방 유동 분석 스트립은 시료 용액 내에 분산되고 상기 시료 용액 내에 함유된 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자, 제1 방향으로 연장되고 상기 제1 방향을 따라 서로 이격되고 순차적으로 위치하는 시료 적하 영역, 검사 영역 및 대조 영역을 구비하고, 상기 시료 용액을 모세관 현상을 이용하여 상기 제1 방향으로 이동시킬 수 있는 기공을 포함하는 다공성 멤브레인 패드, 상기 검사 영역의 표면 또는 기공 내부에 배치되고, 상기 기공 크기와 동일하거나 이보다 큰 직경을 가지며, 상기 제1 결합물질과 특이 결합할 수 있는 제2 결합물질이 표면에 수식된 제1 형광 입자, 및 상기 대조 영역의 표면 또는 기공 내부에 배치되고, 상기 기공 크기와 동일하거나 이보다 큰 직경을 가지며, 상기 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제3 결합물질 및 상기 제1 결합물질과 특이 결합할 수 있는 제4 결합물질이 표면에 수식된 제2 형광 입자를 포함할 수 있다.
상기 시료는 상기 분석하고자 하는 상기 목적 생체물질을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 물질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 시료는 혈액, 뇨, 타액, 땀 등과 같은 물질일 수 있다.
상기 목적 생체물질은 측방 유동 분석 스트립을 이용하여 분석하고자 하는 생체물질을 의미한다. 예를 들어, 상기 생체물질은 항원, 항체, 단백질 등과 같은 물질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 생체물질은 항원일 수 있다.
상기 결합물질은 상기 탐지 입자와 상기 목적 생체물질, 상기 탐지 입자와 상기 형광 입자 및 상기 형광 입자와 상기 목적 생체물질의 결합을 매개하는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 목적 생체물질이 항원인 경우, 상기 제1 생체물질은 상기 항원과 특이적으로 결합하는 항체일 수 있고, 상기 제2 생체물질은 상기 항원과 경쟁 반응을 하는 항원일 수 있고, 상기 제4 생체물질은 상기 항체와 특이 결합하는 항체일 수 있다.
상기 탐지 입자는 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제1 결합물질이 표면에 수식되어, 상기 시료 용액 내에서 목적 생체물질과 결합할 수 있다. 또한, 상기 탐지 입자는 형광물질에 대한 소광능력을 가진 물질로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 탐지 입자는 금, 은, 구리, 백금 및 팔라듐 중에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상의 복합체로 형성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 탐지 입자는 금으로 형성될 수 있다. 상기 탐지 입자의 형태는 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어, 나노로드(nanorod)형태일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 탐지 입자는 금 나노로드(nanorod) 입자일 수 있다.
상기 다공성 멤브레인 패드는 상기 시료를 모세관 현상에 의해 상기 멤브레인 패드 내에서 이동시킬 수 있는 것으로, 상기 다공성 멤브레인 패드는 실리카, 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 나일론, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴 플루오라이드 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등 중에서 선택된 어느 하나로 형성될 수 있다. 그러나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기는 약 1 내지 8 ㎛일 수 있다. 바람직하게는, 상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기는 약 1 내지 6 ㎛일 수 있다.
상기 제1 및 제2 형광 입자의 직경은 상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기의 약 80% 이상 200% 이하일 수 있다. 상기 제1 및 제2 형광 입자의 직경이 상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기의 약 80% 미만인 경우에는 상기 제1 및 제2 형광 입자가 상기 다공성 멤브레인 패드의 표면 또는 기공에 고정되지 못하고 상기 멤브레인의 기공 사이로 빠져나가 상기 시료랑 반응하기 어렵고, 상기 제1 및 제2 형광 입자의 직경이 상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기의 약 200%를 초과하는 경우에는 상기 스트립을 이용한 정량 분석 시 상기 제1 및 제2 형광 입자가 상기 검사 영역 및 상기 대조 영역에서 유지 및 고정되지 못하고 쓸려나가는 문제점이 있다.
상기 형광 입자는 형광 신호를 방출할 수 있는 입자로, 상기 형광 입자는 고분자 코어 입자 및 상기 고분자 코어 입자의 표면을 덮고 있는 형광 나노입자를 포함할 수 있다. 상기 고분자 코어 및 상기 형광 나노입자는 독성을 띄지 않는 물질로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 고분자 코어는 폴리스티렌으로 형성될 수 있고, 상기 형광 나노입자는 입자에 형광 특성을 부여하기 위한 란탄계 착물인 TBP-Ln(Ⅲ) 계열 착물, DTPA-cs124-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BHHCT-Ln(Ⅲ) 계열 착물, BPTALn(Ⅲ) 계열 착물 및 BCPDA-Ln(Ⅲ) 계열 착물 등 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함하여 형성될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 고분자 코어 입자의 크기는 약 1 내지 8 ㎛ 이고, 상기 형광 나노 입자의 크기는 약 40 내지 100 ㎚일 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 고분자 코어 입자의 크기는 약 1.5 내지 2.5 ㎛ 이고, 상기 형광 나노 입자의 크기는 약 70 내지 80 ㎚일 수 있다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 측방 유동 분석 스트립을 이용한 분석 방법을 설명하기 위한 구조를 나타낸 도면이다.
도 2를 참조하면, 목적 생체물질이 미지의 농도로 포함된 시료에 상기 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자를 첨가하여 혼합 시료를 제조하는 제1 단계, 상기 혼합 시료를 시료 적하 영역에 적하하여 모세관 현상을 통해 이동시킴으로써, 상기 혼합 시료를 검사 영역의 제1 형광 입자 및 대조 영역의 제2 형광 입자와 순차적으로 반응시키는 제2 단계, 및 상기 검사 영역 및 상기 대조 영역의 상기 제1 및 제2 형광 입자로부터 각각 생성되는 각각의 제1 및 제2 형광 신호를 측정하여 분석하는 제3 단계를 포함할 수 있다.
상기 제1 단계에서, 상기 목적 생체물질은 상기 제1 결합물질에 의해 상기 탐지 입자의 표면에 결합될 수 있다.
상기 제2 단계에서, 상기 검사 영역의 상기 제1 형광 입자는 상기 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자와 결합되고, 상기 대조 영역의 상기 제2 형광 입자는 상기 목적 생체물질이 결합된 탐지 입자 및 상기 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자와 결합할 수 있다.
도 3을 참조하여, 더욱 구체적으로 본 발명의 측방 유동 분석 스트립을 이용한 분석 방법을 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 측방 유동 분석 스트립을 이용하여 목적 생체물질이 포함된 시료 분석을 진행하는 경우에는, 상기 제1 단계 동안 상기 목적 생체물질이 상기 제1 결합물질에 의해 상기 탐지 입자의 표면에 결합된 목적 생체물질-탐지 입자 복합체를 형성할 수 있다. 상기 복합체를 포함하는 상기 혼합 시료는 모세관 현상에 의해 상기 검사 영역으로 이동될 수 있다. 상기 검사 영역으로 이동된 상기 혼합 시료는 상기 탐지 입자의 상기 제1 결합물질에 상기 목적 생체물질이 결합되어 있어, 상기 제1 결합물질과 특이 결합하는 상기 제2 결합물질이 표면에 수식된 제1 형광 입자와 반응하지 못하고 모세관 현상을 통해 상기 대조 영역으로 이동될 수 있다.
반면, 목적 생체물질이 포함되지 않는 시료 분석을 진행하는 경우에는, 상기 검사 영역으로 이동된 상기 혼합 시료의 상기 탐지 입자의 상기 제1 결합물질과 상기 검사 영역의 상기 제1 형광 입자의 제2 결합물질과 반응하여, 서로 결합할 수 있다. 이 때, 상기 제1 형광 입자와 상기 탐지 입자는 매우 근접한 거리로 결합되기 때문에 상기 탐지 입자로 인하여 상기 제1 형광 입자의 형광 특성을 소광시킬 수 있다.
따라서, 상기 검사 영역의 상기 제1 형광 신호를 측정함으로써 상기 시료 내부의 목적 생체물질의 유무를 정량 분석할 수 있다. 이 때, 상기 대조 영역의 제2 형광 입자는 상기 탐지 입자를 항상 포획하도록 설계되었기 때문에 목적 생체물질의 농도 및 유무에 관계없이 소광 상태를 유지하여 본 발명의 측방 유동 분석 스트립의 신뢰성을 보장할 수 있다.
한편, 상기 시료에 상기 목적 생체물질이 다양한 농도로 포함된 경우, 상기 목적 생체물질의 농도가 높을수록 대부분의 탐지 입자는 상기 목적 생체물질과 결합하여 복합체를 형성하므로 상기 검사 영역의 상기 제1 형광 입자와 결합하는 탐지 입자가 적어 상기 제1 형광 입자의 형광을 소광시키지 못해 상기 제1 형광 신호가 높게 측정되고. 이와 대조적으로, 상기 시료에 상기 목적 생체물질의 농도가 낮을수록 상기 제1 형광 신호는 낮게 측정되므로, 이러한 제1 형광 신호의 결과를 비교하여 농도에 따른 상기 목적 생체물질의 정량 분석을 수행할 수 있다.
본 발명에 따르면, 종래의 측방 유동 스트립과 동일한 방식의 측정 방법과 결과 해석 방법을 유지하면서도 단일 멤브레인을 사용하여 스트립의 구조를 단순화하였으므로, 바이오 분야의 시장 진입이 용이할 수 있다.
이하에서, 구체적인 실시예를 통해서 본 발명의 측방 유동 분석 스트립 및 이를 이용한 분석 방법에 대해서 보다 상세히 설명하기로 한다.
목적 생체물질
목적 생체물질로는 급성 심근 경색 진단 마커인 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I, 이하에서 cTnI이라 함)를 이용하였다.
측방 유동 분석 스트립
다공성 멤브레인 패드는 약 2.3 ㎛ 기공 크기를 갖는 60 mm ㅧ 4 mm FUSION 5™ 멤브레인을 사용하였고, 상기 다공성 멤브레인 패드의 검사 영역 및 대조 영역의 형광 입자로는 약 70 내지 80 nm의 직경을 갖는 형광 나노입자가 표면을 덮고 있는 직경 약 2 ㎛의 폴리스티렌 입자가 사용되었다. 탐지 입자로는 60 ㅧ 25 nm의 금 나노 로드를 이용하였다.
실시예 1: cTnI의 정량 분석-1
측방 유동 분석 스트립을 이용하여 인산완충생리식염수(PBS)에 다양한 농도(0, 0.5, 1 ng/mL)로 존재하는 cTnI의 정량 분석을 수행하였다. 측정 스트립으로는 FUSION 5™ 멤브레인을 이용하였으며, 60 mm ㅧ 4 mm 크기로 잘라 사용하였다. 검사 영역에는 cTnI가 수식된 형광 입자를 도포하였고, 대조 영역에는 anti-mouse IgG가 수식된 형광 입자가 도포하여 준비하였다.
여기서, 측정에 사용된 형광 입자와 탐지 입자의 합성 방법은 다음과 같다. 먼저, 검사 영역 및 대조 영역에 사용된 형광 입자는 2 ㎛ 크기의 폴리스티렌 입자에 70 nm 내지 80 nm 크기의 형광 나노입자가 수식된 형태로 준비된다. 표면에 primary amine 기를 가지는 폴리스티렌 입자 8 ㎍과 350 ㎍의 EDC 및 595 ㎍의 sulfo-NHS를 포함한 800㎕의 50 mM MES 버퍼에 80 ㎍의 형광 나노입자를 포함한 800 ㎕의 100 mM PBS 용액을 섞고 4℃에서 12 시간동안 반응시킨다. 이후 20 mM 의 ethanolamine을 포함한 100 ㎕의 100 mM PBS 버퍼를 추가하고 다시 4℃에서 30분간 반응시킨다. 이후 원심분리기를 이용하여 12000g에서 30분간 회전시킨 후, 상층액을 분리하여 미반응 잔여물을 제거하였다. 그 다음, 1 mL의 증류수를 첨가하여 현탁액을 만들고 원심분리를 진행하는 과정을 3번 더 진행하였다. 최종적으로, 원심 분리를 통해 생성된 상층액을 모두 제거한 후, 1%(w/v)의 BSA가 첨가되어있는 100 mM의 PBS 용액에 보관하였다.
합성된 형광 입자에는 검사부와 대조부에 각각 cTnI와 anti-mouse IgG가 수식되었다. 먼저, 보관된 형광 입자 원심분리하고 상층액을 모두 제거한 후, 5 mg/mL의 BS3를 포함하는 1 mL의 100 mM PBS 용액을 추가하고 재분산하여, 4℃에서 30분간 반응시킨다. 이후 원심분리기를 이용하여 12000g에서 30분간 회전시킨 후, 상층액을 분리하여 미반응 잔여물을 제거하였다. 이후, 1 mL의 100 mM PBS 버퍼를 첨가하여 현탁액을 만들고 원심분리를 진행하는 과정을 3번 더 진행하였다. 상층액을 모두 제거한 후, 10 ㎍/mL의 cTnI 또는 anti-mouse IgG를 포함하는 800 ㎕의 100 mM PBS 용액을 넣고 입자를 재분산시키고 4℃에서 1 시간동안 반응시킨다. 이후, 20 mM 의 ethanolamine을 포함한 200 ㎕의 100 mM PBS를 추가하고 4℃에서 30분간 추가로 반응시킨다. 이후 원심분리기를 이용하여 12000g에서 30분간 회전시킨 후, 상층액을 분리하여 미반응 잔여물을 제거하였다. 그 다음, 1 mL의 100 mM PBS를 첨가하여 현탁액을 만들고 원심분리를 진행하는 과정을 3번 더 진행하였다. 원심 분리 후, 상층액을 모두 제거하고 800 ㎕의 lining buffer에 재분산하여 보관하였다.
준비된 형광 입자들은 멤브레인의 검사 영역과 대조 영역에 각각 도포되었고, 멤브레인은 입자 도포 후 2 시간 동안 진공 건조하여 사용하였다.
탐지 입자는 60 nm X 25 nm의 금 나노 로드에 cTnI에 대한 항체인 16A11 monoclonal 항체가 수식되어 준비되었다. 항체 수식은 금 나노 로드의 제조사인 cytodiagnostic에서 제공하는 방법을 따랐다.
cTnI의 정량 분석은 다음과 같은 방식으로 진행된다. 먼저, 형광 소광이 일어나기 전의 형광 신호를 확인하기 위하여, 준비된 스트립의 형광 신호를 수득한다. 형광 신호는 300 μsec 동안 여기광을 조사하고 여기광을 제거한 후, 100 μsec부터 700 μsec 사이의 신호를 합산하여 수득한다. 이후, cTnI의 농도에 따른 형광의 소광 정도를 확인하기 위하여 다음의 순서를 진행한다. 먼저, 탐지 입자를 1%(w/v)의 BSA가 첨가되어있는 100 mM의 PBS 용액에 OD 1의 농도가 되도록 희석하고 cTnI를 포함하는 시료와 섞고 20분간 상온에서 반응시킨다. 반응 종료 후, 혼합된 시료를 스트립의 시작 부분에 적하하고 이어서 100 ㎕의 PBS 버퍼를 같은 부위에 적하한다. 용액이 모세관 현상을 이용하여 스트립의 말단까지 진행된 후, 형광 신호를 수득한다. 시료 적하 후의 형광 신호를 기존의 형광 신호와 비교하여 잔여 형광 신호를 %로 변환하였을 때, cTnI의 농도가 높을수록 높은 비율의 형광 신호가 잔여하여 측정된 것을 확인할 수 있다.
상기 측방 유동 분석 스트립을 통해 측정된 형광 신호를 도 4에 나타냈다.
도 4를 참조하면, cTnI의 농도에 따른 검사 영역에서 측정된 제1 형광 신호의 차이를 확인할 수 있다. cTnI의 농도가 높을수록 제1 형광 신호가 높게 측정된 것을 확인할 수 있다.
실시예 2: cTnI의 정량 분석-2
실시예 2는 실시예 1과 같은 방식으로 진행되며, 사용된 시료의 기반이 되는 용액이 100 mM PBS에서 cTnI free serum으로 바꿔, 실제 혈장 시료와 유사한 조건을 부여하였다.
측방 유동 분석 스트립을 이용하여 인간 혈청에 다양한 농도(0, 0.15, 0.29, 0.58, 1.16 ng/mL)로 존재하는 cTnI의 정량 분석을 수행하였다. 상기 측방 유동 분석 스트립을 통해 측정된 형광 신호를 도 5에 나타냈다.
도 5를 참조하면, 검출 한계는 약 0.097 ng/mL인 것을 확인할 수 있다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
1: 다공성 멤브레인 패드
2: 시료 적하 영역
3: 검사 영역
4: 대조 영역
A: 시료
A-1: 목적 생체물질
A-2: 탐지 입자
3-1: 제1 형광입자
4-1: 제2 형광입자
5-1: 검사 영역의 제1 형광입자와 결합한 탐지 입자
5-2: 시료의 목적 생체물질과 결합한 탐지 입자
5-3: 대조 영역의 제2 형광입자와 결합한 탐지 입자
2: 시료 적하 영역
3: 검사 영역
4: 대조 영역
A: 시료
A-1: 목적 생체물질
A-2: 탐지 입자
3-1: 제1 형광입자
4-1: 제2 형광입자
5-1: 검사 영역의 제1 형광입자와 결합한 탐지 입자
5-2: 시료의 목적 생체물질과 결합한 탐지 입자
5-3: 대조 영역의 제2 형광입자와 결합한 탐지 입자
Claims (10)
- 시료 용액 내에 분산되고 상기 시료 용액 내에 함유된 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자;
제1 방향으로 연장되고 상기 제1 방향을 따라 서로 이격되고 순차적으로 위치하는 시료 적하 영역, 검사 영역 및 대조 영역을 구비하고, 상기 시료 용액을 모세관 현상을 이용하여 상기 제1 방향으로 이동시킬 수 있는 기공을 포함하는 다공성 멤브레인 패드;
상기 검사 영역의 표면 또는 기공 내부에 배치되고, 상기 기공 크기와 동일하거나 이보다 큰 직경을 가지며, 상기 제1 결합물질과 특이 결합할 수 있는 제2 결합물질이 표면에 수식된 제1 형광 입자; 및
상기 대조 영역의 표면 또는 기공 내부에 배치되고, 상기 기공 크기와 동일하거나 이보다 큰 직경을 가지며, 상기 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제3 결합물질 및 상기 제1 결합물질과 특이 결합할 수 있는 제4 결합물질이 표면에 수식된 제2 형광 입자를 포함하는, 측방 유동 분석 스트립.
- 제1항에 있어서,
상기 탐지 입자는 금, 은, 구리, 백금 및 팔라듐 중에서 선택된 어느 하나로 형성된 것을 특징으로 하는,
측방 유동 분석 스트립.
- 제1항에 있어서,
상기 다공성 멤브레인 패드는 실리카, 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 나일론, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리덴 플루오라이드 및 폴리테트라플루오로에틸렌 중에서 선택된 어느 하나로 형성된,
측방 유동 분석 스트립.
- 제1항에 있어서,
상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기는 1 내지 8 ㎛인,
측방 유동 분석 스트립.
- 제4항에 있어서,
상기 제1 및 제2 형광 입자의 직경은 상기 다공성 멤브레인 패드의 기공 크기의 80% 이상 200% 이하인 것을 특징으로 하는,
측방 유동 분석 스트립.
- 제5항에 있어서,
상기 형광 입자는,
고분자 코어 입자 및 상기 고분자 코어 입자의 표면을 덮고 있는 형광 나노입자를 포함하는,
측방 유동 분석 스트립.
- 제6항에 있어서,
상기 고분자 코어 입자의 크기는 1 내지 8 ㎛ 이고,
상기 형광 나노 입자의 크기는 40 내지 100 ㎚인,
측방 유동 분석 스트립.
- 제1항에 따른 측방 유동 분석 스트립을 이용한 시료 내의 목적 생체물질의 정량 분석 방법에 있어서,
상기 목적 생체물질이 미지의 농도로 포함된 시료에 상기 목적 생체물질과 특이 결합할 수 있는 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자를 첨가하여 혼합 시료를 제조하는 제1 단계;
상기 혼합 시료를 상기 시료 적하 영역에 적하하여 모세관 현상을 통해 이동시킴으로써, 상기 혼합 시료를 상기 검사 영역의 제1 형광 입자 및 상기 대조 영역의 제2 형광 입자와 순차적으로 반응시키는 제2 단계; 및
상기 검사 영역 및 상기 대조 영역의 상기 제1 및 제2 형광 입자로부터 각각 생성되는 각각의 제1 및 제2 형광 신호를 측정하여 분석하는 제3 단계를 포함하는, 측방 유동 분석 스트립 분석 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 제1 단계에서, 상기 목적 생체물질은 상기 제1 결합물질에 의해 상기 탐지 입자의 표면에 결합되는 것을 특징으로 하는,
측방 유동 분석 스트립 분석 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 제2 단계에서,
상기 검사 영역의 상기 제1 형광 입자는 상기 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자와 결합되고,
상기 대조 영역의 상기 제2 형광 입자는 상기 목적 생체물질 및 상기 제1 결합물질이 표면에 수식된 탐지 입자와 결합하는 것을 특징으로 하는,
측방 유동 분석 스트립 분석 방법.
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| KR20110058719A (ko) * | 2009-11-24 | 2011-06-01 | 한국생명공학연구원 | 다공성 필름이 부착되어 있는 멤브레인 바이오센서 및 이를 이용한 면역반응 또는 효소반응 측정방법 |
| KR20140143120A (ko) * | 2013-06-04 | 2014-12-15 | (주)프로테옴텍 | 가변 대조선을 구비한 분석 스트립 및 이를 구비한 진단 키트 |
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|---|---|---|---|---|
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| KR20140143120A (ko) * | 2013-06-04 | 2014-12-15 | (주)프로테옴텍 | 가변 대조선을 구비한 분석 스트립 및 이를 구비한 진단 키트 |
| JP2016520200A (ja) * | 2013-06-04 | 2016-07-11 | プロテオメテック インコーポレイテッドＰｒｏｔｅｏｍｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ． | 可変対象線を具備したラピッドテスト用ストリップ及びそれを用いた診断キット |
| KR20190117350A (ko) * | 2018-04-06 | 2019-10-16 | 바디텍메드(주) | 측방 유동 분석 스트립 |
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