KR20210117837A - 녹차 유래 성분을 함유하는 바이러스 백신용 면역증강제 및 교차면역 백신 조성물 - Google Patents

녹차 유래 성분을 함유하는 바이러스 백신용 면역증강제 및 교차면역 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG) 또는 녹차 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스 백신용 면역증강제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역증강제는 안전성을 갖춘 천연 물질인 녹차 추출물 또는 EGCG를 면역증강제로 이용함으로써 다양한 변종 바이러스에 대한 면역반응에서 우수한 면역촉진 효능을 발휘할 뿐 아니라, 독성이 거의 없어 안전성이 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 녹차 추출물 또는 ECGC를 백신과 함께 사용하면, 백신항원에 대한 면역반응을 증강시킬 수 있을 뿐만 아니라, 세포성 면역반응 및 비특이적 교차면역원성을 효과적으로 향상시켜, 높은 생산성과 넓은 방어범위를 갖는 교차면역 백신(cross immunity vaccine)을 제조할 수 있다.

Description

녹차 유래 성분을 함유하는 바이러스 백신용 면역증강제 및 교차면역 백신 조성물{Vaccine adjuvant and cross immunity vaccine composition comprising green tea-derived component}
본 발명은 바이러스 백신용 면역증강제 조성물 및 이를 포함하는 교차면역 바이러스 백신 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 바이러스 자체가 아닌 단백질 항원을 백신으로 이용하는 경우 나이브 T 세포(Naive T cells)가 T 헬퍼 2 세포(T helper 2 cells)로 분화되며, T 헬퍼 2 세포는 B 세포가 IgG1 항체(마우스의 경우)를 만들어 내도록 하여 체액성 면역반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 반면 바이러스 약독화 생백신 또는 특정 면역증강제를 이용하는 경우 나이브 T 세포가 T 헬퍼 1 세포(T helper 1 cells)로 분화되며, T 헬퍼 1 세포는 B 세포가 IgG2a 항체(마우스의 경우)를 만들어 내도록 하여 세포성 면역반응을 유도한다(Abul K. Abbas et al. Cellular and molecular immunology 7th edition. Elsevier). 체내 바이러스의 제거 및 바이러스로부터의 방어 효능에는 세포성 면역반응이 더욱 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있어(Victor C. Huber. Et al. Distinct contributions of vaccine-induced immunoglobulin G1 (IgG1) and IgG2a antibodies to protective immunity against influenza. Clin Vaccine Immunol. 2006), 세포성 면역반응을 증강시키는 면역증강제에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.
독감바이러스(influenza virus)는 호흡기 바이러스로서 매년 유행성 독감(seasonal influenza)과 10-40년 주기로 발생하는 판데믹(pandemic influenza)으로 공중보건에 막대한 위협을 끼치고 있는 주요 감염성 질환이다. 인수공통 감염 능력이 있는 독감바이러스는 조류, 돼지 등 가축에도 감염을 일으켜 경제적 피해를 줄 뿐만 아니라, 사람과 동물 간 전파가 가능하여 조류인플루엔자, 돼지인플루엔자 등의 인체 감염 시에는 높은 치사율을 보인다. 세계보건기구(WHO, World Health Organization) 및 미국 질병통제예방센터(CDC, Centers for Disease Control and Prevention)에서 매년 유행성 바이러스를 예측하여 백신주를 선정하고 제작함에도 불구하고, 예측이 실패하거나, 유전자 변이 바이러스 또는 동물에서 전파되는 유전자재조합 독감바이러스의 출현은 백신의 효능을 무력화시킬 수 있다.
독감백신은 산업적으로 수십 년간 수정란(embryonated eggs)에서 생산해 왔으며 최근 들어 세포배양 기술을 바탕으로 생산기술이 확대되고 있다. 생산된 바이러스를 불활성화하여 제조한 사백신(killed inactivated vaccine)과 아울러 독성이 감소된 약독화 생백신(live attenuated vaccine)도 생산되고 있다(Krammer F. et al. Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat Rev Drug Discov. 2015 Mar;14(3):167-82.). 최근에는 단백질 생산기술의 발달로 항원단백질을 백신으로 사용하는 재조합단백질 백신도 활발히 연구되고 있다.
독감백신의 주요 목적은 바이러스의 표면항원인 HA(hemagglutinin), NA(neuraminidase)에 대한 항체를 유도하여 바이러스 침입 후 세포 감염을 원천 봉쇄하는 것이다. 그러나 독감바이러스는 RNA 유전자를 지니고 있어 돌연변이율이 매우 높고, 유전자재조합을 통해 전혀 새로운 항원을 획득함으로써 백신 접종 혹은 이전 감염에 의해 생성된 항체 반응을 회피할 수 있다. 특히 HA, NA 항원단백질은 내부 단백질에 비해 유전자 변이율이 높기 때문에 매년 새로운 항원형을 갖는 백신 접종이 필요하다. 따라서 이러한 변이주의 출현으로 인해 거의 매년 새로운 백신주로 대체하여 생산해야 하는 번거로움이 있을 뿐 아니라 변이주 예측이 빗나갈 경우 백신의 효능이 떨어지는 등의 문제점이 지속적으로 부각되어 왔다. 아울러 백신주 확인으로부터 백신 생산 완료 시점까지 3-6개월의 장기간이 소요되는 단점이 있다. 특히 2009년 판데믹의 사례에서 알 수 있듯이 예상하지 못한 시점에 신종인플루엔자가 급속한 인체 감염을 일으킨 경우에는 감염 확산 속도가 백신 공급 속도를 앞지름에 따라 전 세계적인 전염(pandemic)이 불가피하게 된다(Fineberg HV. Pandemic preparedness and response-lessons from the H1N1 influenza of 2009. N Engl J Med. 2014 Apr 3;370(14):1335-42.).
이와 같은 이유로, 최근에는 다양한 항원형을 지닌 독감바이러스에 대한 교차방어에 대한 면역학적 기작 규명과 이를 유도할 수 있는 새로운 백신 전략에 대한 연구들이 활발해지고 있다. 이종 독감바이러스 사이에서 보존되어 있는 M2 단백질에 대한 항체반응, 내부단백질에 대한 T 세포 면역반응 유도는 기존의 사백신에 비해 다양한 항원형을 지닌 바이러스에 대한 넓은 범위의 교차방어 효능을 보이긴 하지만 그 방어 능력이 매우 낮아 효과적인 백신 전략으로 제시되기 어렵다는 한계를 보여 주고 있다 (Sridhar S. Heterosubtypic T-Cell Immunity to Influenza in Humans: Challenges for Universal T-Cell Influenza Vaccines. Front Immunol. 2016 May 19;7:195., Neirynck S. et al. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat Med. 1999 Oct;5(10):1157-63.).
HA 항원은 유전자 변이가 심한 구형 도메인(GD, globular domain)과 변이가 거의 없는 줄기 도메인(SD, stalk domain)으로 구분된다. 독감백신 접종 시 대부분 GD에 대한 항체가 만들어 지며 따라서 변이주 특이적인 예방 효과가 나타나는 반면, 다른 아형바이러스에 대해서는 예방 효과가 적다. 이에 비해 SD에 대한 항체가가 높을 경우 다양한 유전자변이주 및 아형에 대해 광범위한 방어 예방 효과가 나타나며 바로 이것이 만능형 백신 디자인 기술의 요체를 제공한다. 최근에는 표면 항원 HA 단백질의 줄기(stalk) 부분에 대한 항체반응을 선택적으로 유도하기 위한 전략으로서 headless HA 혹은 chimeric HA 재조합단백질의 반복 투여 방법이 제시되었다(Krammer, F. (2015). The quest for a universal flu vaccine: headless HA 2.0. Cell Host Microbe 18, 395-397, Krammer, F., and Palese, P. (2015). Advances in the development of influenza virus vaccines. Nat. Rev. Drug Discov. 14, 167-182.). 또한, HA 머리(head) 도메인의 과당쇄화(hyperglycosylation) 혹은 줄기(stalk) 도메인의 저당쇄화(hypoglycosylation)를 통해 항체 생성을 줄기 쪽으로 방향 전환(redirection)하는 전략도 제시된 바 있다(J. Virol. 2014, 88, 699-704. Guiding the immune response against influenza virus hemagglutinin toward the conserved stalk domain by hyperglycosylation of the globular head domain. J Virol. 2016;90:8496-508. Unmasking Stem-Specific Neutralizing Epitopes by Abolishing N-Linked Glycosylation Sites of Influenza Virus Hemagglutinin Proteins for Vaccine Design).
그러나 이러한 HA 줄기 기반(stalk-based) 전략들에서도 방어 효능과 방어 범위에서 만족할 만한 결과를 얻지 못하여 실제 임상적으로 사용 가능한 것인지에 대한 지속적인 의문이 제기되고 있다. 또한 HA 줄기 특이 항체가 바이러스를 중화하지 못하고 오히려 감염성을 증가시킨 결과가 보고되었으며 항체의 중화를 회피하는 돌연변이 바이러스도 보고되어 백신 안전성(vaccine safety)과 관련된 심각한 우려를 낳고 있다(Khurana S. et al. Vaccine-induced anti-HA2 antibodies promote virus fusion and enhance influenza virus respiratory disease. Sci Transl Med. 2013 Aug 28;5(200):200ra114., Chai N. et al. Two Escape Mechanisms of Influenza A Virus to a Broadly Neutralizing Stalk-Binding Antibody. PLoS Pathog. 2016 Jun 28;12(6):e1005702.). 아울러 HA 줄기 항체 제작의 기술적 단점으로는 모두 단백질 구조 기반 유전공학/단백질공학 기술이 필요하며 아직 구조 디자인 기술이 최적화되지 않아 많은 시간과 인력이 소요된다는 점, 그리고 고가의 고등 세포 배양 방법을 통해 유전자재조합 단백질을 생산/정제하는 방법을 쓰기 때문에 고비용의 문제점과 백신의 생산성(productivity)에도 분명한 한계가 존재한다는 점이 지적되고 있다.
이러한 문제들을 해결하기 위하여 본 발명자들은 바이러스 백신 특이적 면역반응 및 광범위한 비특이적 면역반응을 동시에 증진시키기 위해 녹차 추출물을 선택하였다. 녹차 추출물을 면역증강제의 성분 물질로서, 또는 교차면역 백신 제조에 이용한 사례는 보고되어 있지 않다.
녹차는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)라는 식물에서 생산되며, 흔히 음료로 음용되거나 다이어트 식품 또는 화장품에 응용된다(Cabrera, C. 등, Beneficial effects of green tea review. Journal of the American College of Nutrition 25, 79-99). 녹차 추출물은 여러 종류의 카테킨으로 구성되어있는데, 구체적으로 (-)-에피갈로카테킨(EGC, (-)-epigallocatechin), (-)-에피카테킨 갈레이트(ECG, (-)-epicatechin gallate), (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG, (-)-epigallocatechin gallate) 및 (-)-에피카테킨(EC, (-)-epicatechin)으로 이루어져있다.
한국등록특허 제10-1160743호는 녹차를 H9N2형 조류 인플루엔자에 대한 항바이러스제로 사용될 수 있음을 개시하고 있다. 아울러 한국등록특허 제10-1843564호에는 바이러스 불활화 기능을 활용한 불활화 백신 사용 용도에 대해서 기술되어 있다. 그러나 녹차 유래 성분을 면역증강제로 이용하여 다양한 유전자 재조합 항원이나 바이러스, 세균 유래 항원에 대한 백신의 개선 용도로서의 구체적인 결과는 개시한 바 없다.
본 발명자들은 다양한 변종 바이러스 백신에 적용할 수 있는 면역증강제를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 녹차추출물 또는 이로부터 유래된 순수정제 카테킨이 백신항원에 대해 매우 강력한 면역증강 효과가 있음을 확인하였으며, 백신의 세포성 면역반응을 크게 향상시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다양한 바이러스 백신에 적용할 수 있는 교차면역 바이러스 백신용 면역증강제 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상용화된 백신의 면역반응을 크게 향상시킬 수 있는 교차면역 바이러스 백신용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG) 또는 녹차 추출물을 면역증강제 조성물의 유효성분으로 하며, 바이러스 백신에 녹차 추출물 또는 EGCG가 첨가될 경우, 그렇지 않은 경우에 비해 종래 기술에서 기대하기 어려울 정도로 높은 수준의 교차 반응을 유도함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG) 및 녹차 추출물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 교차면역 바이러스 백신용 면역증강제 조성물을 제공한다.
본 명세서의 용어, "녹차 추출물"은 다양한 추출 용매, 예를 들어 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 부틸 아세테이트를 추출 용매로 하여 얻을 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 녹차 추출물은 물을 추출용매로 하여 얻어진 것이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 녹차 추출물은 여러 종류의 카테킨을 포함하며, 구체적으로 (-)-에피갈로카테킨(EGC: (-)-epigallocatechin), (-)-에피카테킨 갈레이트(ECG: (-)-epicatechin gallate), (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG: (-)-epigallocatechin gallate) 및 (-)-에피카테킨(EC: (-)-epicatechin)을 포함하며, 가장 구체적으로는 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG: (-)-epigallocatechin gallate)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면 본 발명의 녹차 추출물은 물이나 에탄올을 추출 용매로 하여 얻어질 수 있고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 70% 에탄올을 추출 용매로 하여 얻을 수 있다. 한편, 본 발명의 추출물은 상기 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
본 명세서의 용어 “추출물”은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉 본 발명의 녹차 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다. 또한 본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 것을 포함한다.
본 명세서의 용어, "면역증강제"는 일반적으로 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질을 의미한다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 인유두종 바이러스(HPV, human papilloma virus), 호흡기세포융합바이러스(RSV, Respiratory syncytial virus), 또는 뎅기바이러스(Dengue virus)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 본 발명의 면역증강제 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이에 대한 설명은 하기에 기재되어 있다.
본 발명의 상기 면역증강 효과는 세포성 면역반응 증가 또는 교차면역원성 증가 효과를 포함할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG) 및 녹차 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 성분, 및 바이러스 항원을 유효성분으로 포함하는 교차면역 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 백신 조성물은 상술한 면역증강제 조성물을 유효성분으로 사용하기 때문에, 면역증강제 조성물에 대한 중복된 기재는 생략한다.
본 명세서의 용어, "백신"은 대상(subject)의 면역 반응에 긍정적으로 영향을 주는 조성물을 의미하는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 백신 조성물은 접종대상에게 체액성 면역 반응 (Humoral immune response), 예를 들어 항체에 의해 유발되는 향상된 전신적(systemic)/국소적(local) 면역반응뿐 아니라 세포성 면역 반응 (cell-mediated immune response), 예를 들어 CTL(Cytotoxic TLymphocyte) 반응 등을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백신 조성물에 포함되는 바이러스 항원은 인플루엔자 바이러스, 인유두종 바이러스, 호흡기세포융합바이러스 또는 뎅기 바이러스 자체 및 종래 공지된 다양한 인플루엔자 바이러스 유래 항원, 인유두종 바이러스 유래 항원, 호흡기세포융합바이러스 유래 항원 또는 뎅기 바이러스 유래 항원을 포함한다.
상기 항원은 바이러스 구성성분 중 면역반응을 일으킬 수 있는 항원을 의미하며, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 구형 도메인(HAgd) 및 인플루엔자 A/PuertoRico/8/34(H1N1) 바이러스의 HA 재조합 단백질(rHA), 뎅기 바이러스의 E 단백질 중 도메인 3과 CTB 융합 항원(CTB-ED3) 또는 이들의 단편일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 본 발명의 백신은 약독화된 생백신 또는 사백신, 서브유닛 백신, 합성 백신 또는 유전공학 백신일 수 있다.
하기 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 면역증강제를 포함하는 백신은 적은 용량의 항원으로도 우수한 면역반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 백신 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 면역증강제는 안전성을 갖춘 천연 물질인 녹차 추출물 또는 EGCG를 면역증강제로 이용함으로써 다양한 변종 바이러스에 대한 면역반응에서 우수한 면역촉진 효능을 발휘할 뿐 아니라, 독성이 거의 없어 안전성이 매우 우수하다.
또한, 본 발명의 녹차 추출물 또는 ECGC를 백신과 함께 사용하면, 백신항원에 대한 면역반응을 증강시킬 수 있을 뿐만 아니라, 세포성 면역반응 및 비특이적 교차면역원성을 효과적으로 향상시켜, 높은 생산성과 넓은 방어범위를 갖는 교차면역 백신(cross immunity vaccine)을 제조할 수 있다.
도 1은 EGCG를 첨가한 rHA 단백질 백신의 면역원성 확인 결과로서, 인플루엔자 H1N1 A/Puerto Rico/8/34(PR8) 바이러스에 대한 IgG1 및 IgG2a 항체가 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 EGCG를 첨가한 rHA 단백질 백신의 면역원성 확인 결과로서, PR8 바이러스의 GD(globular domain) 또는 SD(stalk domain)에 대한 IgG1 및 IgG2a 항체가 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 EGCG를 첨가한 rHA 단백질 백신의 ADCC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 EGCG를 첨가한 rHA 단백질 백신의 교차면역 효과를 확인한 결과로서, H1N1 A/Seoul/Y-1/2009(pdm), A/New Caledonia/20/99(NewCal), 또는 A/Brisbane/59/2007(Bris) 바이러스 각각에 대한 IgG1 및 IgG2a 항체가 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 EGCG를 첨가한 rHA 단백질 백신의 pdm, NewCal, Bris 바이러스 각각에 대한 ADCC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 EGCG를 첨가한 rHA 단백질 백신의 교차 방어 효능 분석 결과이다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실험재료
세포주
MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였고, 상기 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, HyClone, 미국) MEM(minimal essential medium, HyClone, 미국) 또는 10% FBS DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium, HyClone, 미국) 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 배양하였다.
녹차 추출물 및 EGCG
녹차 추출물은 고온·고압 멸균한 3차 증류수에 가루 녹차(녹차 100%, 아모레퍼시픽, 대한민국)를 녹여 사용하였다.
EGCG는 고온·고압 멸균한 3차 증류수에 분말 형태의 EGCG(98%, 중국의 Changsha Sunfull Biotech 사에서 정제하여 판매)를 녹여 사용하였다.
실시예 1. 세포성 면역반응 유도 확인
1-1. 단백질 항원과 면역증강제 접종 및 혈액 채취
EGCG를 면역증강제로 섞은 단백질 백신의 면역원성을 확인하기 위해, 마우스를 5마리씩 4개 군으로 나누고, 각각 rHA 단백질 7 ug/50 ul와 함께 군 별로 다양한 농도의 면역증강제를 투여하였다. 구체적으로 PBS(통제집단) 50 ul, 또는 면역증강제로서 EGCG(군 별로 70 ug, 350 ug, 700 ug/50 ul)를 근육주사로 투여하였다. 2, 4주 후에 같은 농도로 추가접종 하였고, 마지막 접종으로부터 2주 후 혈액을 채취하였으며, 원심분리를 통해 혈청만 수집하여 면역원성 분석을 위해 사용하였다.
모든 실험 과정은 국제백신연구소(IVI) 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC))의 가이드라인에 따라 수행하였다.
1-2. IgG1, IgG2a 항체가 분석
96 웰 플레이트에 인플루엔자 H1N1 A/Puerto Rico/8/34(PR8) 바이러스 105 PFU/100 μl 또는 PR8 바이러스 헤마글루티닌(HA)의 globular domain(GD) 혹은 stalk domain(SD)을 0.1 ug/100 ul씩 분주하고 4℃에서 하루 동안 코팅하였다. 바이러스 또는 단백질이 코팅된 플레이트를 PBST로 3회 워싱한 후, 1% BSA로 상온에서 1시간 동안 블로킹 하였다. 상기와 동일한 방법으로 워싱한 후, 마우스 혈청을 1:400으로 희석하여 100 μl/웰씩 96웰에 분주하고 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 상기와 동일한 방법으로 워싱한 후, HRP-conjugated anti-mouse IgG1(Mab) 또는 HRP-conjugated anti-mouse IgG2a(Mab)를 1:10000으로 희석하여 100 μl/웰씩 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 상기와 동일한 방법으로 워싱한 후, TMB 용액을 100 μl/웰씩 상온에서 30분 동안 처리하였다. 2N H2SO4를 처리하여 반응을 정지시키고 스펙트로포토미터로 450 nm에서 분석하였다.
바이러스를 코팅하여 실험한 결과, [도 1]에 나타난 바와 같이, IgG1 항체의 경우 모든 군에서 일정 수준 이상 만들어졌음을 확인하였으며, EGCG에 의해 항체가가 소폭 상승하였다. 한편, EGCG를 첨가하지 않은 항원을 주입한 군에서는 IgG2a 항체가 전혀 만들어지지 않았으나, EGCG를 첨가한 항원을 주입한 군에서는 IgG2a 항체가 만들어졌음을 확인하였다. 또한, EGCG를 더 많이 첨가할수록 IgG2a 항체가는 높은 수준으로 증가하였다. 이는 면역증강제로 EGCG를 처리하면 IgG1과 IgG2a 두 항체 모두를 높은 수준으로 만들어 낸다는 것을 의미한다.
또한, GD 또는 SD 단백질을 코팅하여 실험한 결과, [도 2]에 나타난 바와 같이, EGCG 첨가에 의해 IgG2a 항체가가 증가하는 것을 더욱 확실하게 확인할 수 있으며, HA 단백질의 도메인(GD 또는 SD)에 상관 없이 GD 특이적 IgG2a 항체와 SD 특이적 IgG2a 항체가 모두 만들어 졌음을 확인하였다.
1-3. Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) 분석
Promega에서 제조한 ADCC 분석 키트(assay kit)를 이용하여 ADCC 분석을 진행하였다. 키트를 이용한 실험 이틀 전에 불투명한 96 웰 플레이트에 MDCK 세포를 채운 뒤, 다음날 저녁에 MDCK 세포에 PR8 바이러스를 웰 당 104 PFU/100 μl씩 넣고 37℃에서 45분간 감염시켰다. 이후 각 웰을 PBS로 워싱한 후 트립신(Trypsin)이 첨가된 serum-free MEM을 100 ul씩 채우고 37℃에서 16시간 배양하였다. 16시간 후, 바이러스를 감염시킨 MDCK 세포에 1:100으로 희석한 마우스 혈청을 섞어준 뒤, 키트 구성품인 이펙터 T 세포(effector T cell)를 넣고 37℃에서 6시간 반응시켰다. 이펙터 T 세포는 MDCK 세포 표면에 발현된 바이러스 항원에 결합한 IgG2a 항체의 Fc 부위에 결합하는 수용체를 가지고 있으며, 수용체의 결합 이후 신호전달 과정을 거쳐서 루시퍼라아제(luciferase)를 만들어내는 기능을 가지고 있다. 6시간 후, 키트 구성품인 루시퍼라아제 시약(luciferase reagent)을 처리하고 리더기로 확인하였다.
그 결과, [도 3]에 나타난 바와 같이, EGCG가 첨가되지 않은 항원에 의해 만들어진 항체는 ADCC를 유도하지 못하는 반면, EGCG가 첨가된 항원에 의해 만들어진 항체는 높은 수준의 ADCC를 유도하는 것을 확인하였다. 이는 [도 1] 및 [도 2]에서 IgG2a 항체가 높은 수준으로 유도되었던 결과와 일치하며, EGCG의 첨가에 의해 만들어진 IgG2a 항체가 ADCC 역시 정상적으로 유도함을 보여준다.
실시예 2. 교차면역 유도 확인
2-1. 단백질 항원과 면역증강제 접종, 혈액 채취 및 공격 접종
EGCG를 면역증강제로 섞은 단백질 백신의 교차면역원성을 확인하기 위해, 마우스를 5마리씩 2개 군으로 나누고, 각각 rHA 단백질 7 ug/50 ul와 함께 PBS(통제집단) 50 ul, 또는 면역증강제로서 EGCG 700 ug/50 ul를 근육주사로 투여하였다. 2, 4주 후에 같은 농도로 추가접종 하였고, 마지막 접종으로부터 2주 후 혈액을 채취하고, 원심분리를 통해 혈청만 수집하여 면역원성 분석을 위해 사용하였다. 혈액 채취로부터 1주 후 인플루엔자 H1N1 타입인 A/Seoul/Y-1/2009(pdm)를 2MLD50(4 × 102 pfu)으로 비강 접종한 뒤 2주 동안 마우스의 체중변화 및 생존율을 관찰하였다.
모든 실험 과정은 국제백신연구소(IVI) 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC))의 가이드라인에 따라 수행하였다.
2-2. IgG1, IgG2a 항체가 분석
96 웰 플레이트에 인플루엔자 H1N1 타입인 A/Seoul/Y-1/2009(pdm), A/New Caledonia/20/99(NewCal), 또는 A/Brisbane/59/2007(Bris)을 1 × 105 PFU/100 μl씩 분주하고 4℃에서 하루 동안 코팅하였다. 바이러스가 코팅된 플레이트를 PBST로 3회 워싱한 후, 1% BSA로 상온에서 1시간 동안 블로킹 하였다. 상기와 동일한 방법으로 워싱하고, 마우스 혈청을 1:50으로 초기 희석한 후 2배씩 계대 희석하여 100 μl/웰씩 96웰에 분주하고 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 상기와 동일한 방법으로 워싱한 후, HRP-conjugated anti-mouse IgG1 또는 HRP-conjugated anti-mouse IgG2a를 1:10000으로 희석하여 100 μl/웰씩 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 상기와 동일한 방법으로 워싱한 후, TMB 용액을 100 μl/웰씩 상온에서 30분 동안 처리하였다. 2N H2SO4를 처리하여 반응을 정지시키고 스펙트로포토미터로 450 nm에서 분석하였다.
그 결과, [도 4]에 나타난 바와 같이, EGCG가 첨가된 항원에 의해 만들어진 마우스 항체가 IgG1, IgG2a 모두 더 높은 결합력을 보이는 것을 확인하였다.
2-3. Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) 분석
Promega에서 제조한 ADCC 분석 키트를 이용하여 ADCC 분석을 진행하였다. 키트를 이용한 실험 이틀 전에 불투명한 96 웰 플레이트에 MDCK 세포를 채운 뒤, 다음날 저녁에 MDCK 세포에 pdm, NewCal, Bris 바이러스를 웰 당 104 PFU/100 μl씩 넣고 37℃에서 45분간 감염시켰다. 이후 각 웰을 PBS로 워싱한 후 트립신이 첨가된 serum-free MEM을 100 ul씩 채우고 37℃에서 16시간 배양하였다. 16시간 후, 바이러스를 감염시킨 MDCK 세포에 1:100으로 희석한 마우스 혈청을 섞어준 뒤, 키트 구성품인 이펙터 T 세포를 넣고 37℃에서 6시간 반응시켰다. 이펙터 T 세포는 MDCK 세포 표면에 발현된 바이러스 항원에 결합한 IgG2a 항체의 Fc 부위에 결합하는 수용체를 가지고 있으며, 수용체의 결합 이후 신호전달 과정을 거쳐서 루시퍼라아제를 만들어 내는 기능을 가지고 있다. 6시간 후, 키트 구성품인 루시퍼라아제 시약을 처리하고 리더기로 확인하였다.
그 결과, [도 5]에 나타난 바와 같이, 세 종류의 바이러스 모두에 대해 EGCG가 첨가된 항원에 의해 만들어진 마우스 항체가 더 높은 수준의 ADCC 반응을 유도하였음을 확인하였다.
2-4. 방어 효능 분석
EGCG가 첨가된 항원의 교차 방어 효능을 확인하기 위해 공격 접종을 실시한 뒤 마우스의 체중변화 및 생존율을 관찰하였다. 그 결과, [도 6]에 나타난 바와 같이, EGCG가 첨가되지 않은 항원을 주입 받은 쥐는 5마리 모두 사망한 반면, EGCG가 첨가된 항원을 주입 받은 쥐는 체중감소가 상대적으로 더디고 두 마리의 마우스가 생존하였다. 따라서 EGCG를 면역증강제로서 첨가할 경우 방어 효능에도 영향이 있음을 확인하였다.

Claims (6)

  1. 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG) 및 녹차 추출물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 교차면역 바이러스 백신용 면역증강제 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 인유두종 바이러스(HPV, human papilloma virus), 호흡기세포융합바이러스(RSV, Respiratory syncytial virus), 및 뎅기바이러스(Dengue virus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 교차면역 바이러스 백신용 면역증강제 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 면역증강 효과는 세포성 면역반응 증가 또는 교차면역원성 증가 효과를 포함하는 것인 교차면역 바이러스 백신용 면역증강제 조성물.
  4. 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate; EGCG) 및 녹차 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 성분, 및 바이러스 항원을 유효성분으로 포함하는 교차면역 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항원은 인플루엔자 바이러스 항원, 인유두종 바이러스 항원, 호흡기세포융합바이러스 항원 및 뎅기 바이러스 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 교차면역 백신 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 백신은 단백질 백신, 약독화된 생백신, 사백신, 서브유닛 백신, 합성 백신 또는 유전공학 백신을 포함하는 것을 특징으로 하는 교차면역 백신 조성물.
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