KR20210117381A

KR20210117381A - 멀티플렉스 ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 ＨＬＡ 클래스 Ｉ 결핍 세포주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210117381A
Application number: KR1020200033255A
Authority: KR
Inventors: 김태규; 손현정; 홍철화
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2021-09-29

Abstract

본 발명은 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 HLA 클래스 I 결핍 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 HLA-A, -B 및 -C가 모두 완전히 제거된 H1E-25 세포주를 제공하고, 상기 H1E-25 세포주는 면역 반응을 유도하지 않아 면역원성이 더 낮은 면역조절제형 제조에 사용할 수 있다.

Description

멀티플렉스 ＣＲＩＳＰＲ―Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 ＨＬＡ 클래스 Ｉ 결핍 세포주 및 이의 용도{HLA class I null cell line constructed from multiplex CRISPR-Cas9 system and use thereof}

본 발명은 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 HLA 클래스 I 결핍 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다.

인간 백혈구 항원(HLA)은 인간의 주 조직적합성 복합체로서 가장 중요한 면역학적 분자이다. 이것의 주된 두 가지 세트는 CD8+T 세포에 항원을 제시하는 HLA 클래스 I(HLA-A,-B,-C)과 CD4+T 세포에 항원을 제시하는 HLA 클래스 II(HLA-DR,-DP,-DQ)로 이루어진다. HLA 분자에서 높은 수준의 다형성능이 밝혀졌는데, 이는 유니크한 펩타이드를 제시하거나 동종반응성 면역반응을 일으킬 수 있게 한다. 아울러, 상술한 다형성능으로 인해 다양한 아형들이 존재하며, 한 세포에서 최소 3 내지 6 종류의 HLA 클래스 I 분자가 존재할 수 있다. 또한, HLA 대립유전자들의 불일치는 장기이식 시 이식거부를 일으키거나 조혈모세포이식 시 이식편대숙주질환을 일으킬 수 있다.

이식과 세포치료의 많은 제한점을 극복하기 위해, HLA 발현을 조정하기 위한 많은 연구들이 이루어져 왔다. HLA의 조정은 백혈병 세포주와 γ-선으로 돌연변이를 유발하고 체세포 혼성화를 시킨 림포블라스토이드 세포주(LCL)를 이용하여 연구되어 왔다. 이러한 HLA 결핍 세포주들은 특정 HLA 분자의 구조와 기능에 대한 확실한 연구와 효율적인 적응세포치료를 위한 인공항원제시세포의 기반 세포로써 이용되어 왔다. 특히 인공항원제시세포는 초파리, 마우스, 그리고 인간 백혈병 세포주에 HLA와 보조자극분자들의 유전자를 전달하므로 발전되어 왔다.

유전적 조절 기술들이 발전함에 따라 HLA 조절에 대해 많은 연구가 보고되었다. 숏 헤어핀 RNA(shRNA)를 이용하여 Jurkat, T 세포, HeLa, B-LCL, 293T 세포, 조혈모세포, 인간 배아줄기세포주, 인간 제대혈 유래 내피세포 등 다양한 세포들에서 HLA 발현을 낮게 조절하였다. 이러한 보고들에선 특정 HLA 대립유전자를 타겟으로 하거나 HLA 클래스 I 분자의 이종이량체인 베타-2-마이크로글로블린을 타겟팅하므로 HLA 사일런싱을 증명하였다. 그리고 그들은 각각 동종 이식 거부의 우회, 세포치료, 혈소판 수혈 관리 등에 대한 활용을 제안하였다. loxP/Cre 시스템 역시 HLA 음성 배아줄기세포주를 위한 B2M 제거에 이용되었다.

최근에는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFNs), CRISPR/Cas9 시스템 등 유전자 편집 도구를 이용한 HLA 조정이 보고되고 있다. 특히 CRISPR/Cas9 시스템은 다중 유전자 편집에 적합한 유전자 편집 기술이다. 게다가, CRISPR/Cas9 시스템은 다중 가이드 RNAs(gRNAs)를 이용하여 큰 결실을 유도할 수 있다. ZFN는 HLA-A 유전자를 제거하는데 사용되었다. 그리고 CRISPR/Cas9 시스템은 B2M 유전자를 제거하는데 사용되었고, HLA 클래스 II 발현을 조절하기 위해 클래스 II 트렌스엑티베이터(CllTA)를 제거하였다.

본 발명은 HEK 293T 세포에 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 HLA 클래스 I 유전자들의 엑손 2와 엑손 3 사이의 큰 결실을 유도하여, HLA 클래스 I 유전자를 완전히 제거한 HLA 클래스 I 결핍-293T 세포주를 제조하고, 이들을 면역억제 또는 면역치료를 위한 제형 제조에 사용함으로써 본 발명을 완성하였다.

1. Cong, L., et al., Science, 2013. 541 339(6121): p. 819-23. 2. Ran, F.A., et al., Nature Protocols, 2013. 8(11): p. 2281-2308. 3. Hong, C.H., et al., J Immunother, 2017. 40(6): p. 201-210.

본 발명의 목적은 HLA 클래스 I 유전자를 완전히 제거한 HLA 클래스 I 결핍 293T 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HLA 클래스 I 결핍 293T 세포주의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP)를 제공한다.

본 발명은 또한 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및 HLA 클래스 I 유전자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 혈청 내 HLA 아형 특이 항체 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및 면역억제-관련 단백질의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 면역억제 제형 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 보조자극분자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터; 및 HLA 클래스 I 유전자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 면역치료 제형 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및 역분화 유도인자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 유도만능줄기세포 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명은 HLA-A, -B 및 -C가 모두 완전히 제거된 H1E-25 세포주를 제공하고, 상기 H1E-25 세포주는 면역 반응을 유도하지 않아 면역원성이 더 낮은 면역조절제형 제조에 사용할 수 있다.

도 1은 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 HLA-A, -B, -C 엑손 2~3의 온전한 제거를 나타낸다.
도 2는 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템 형질주입 후 HLA 클래스 1 분자의 발현 및 음성세포 분포를 나타낸다.
도 3은 HLA 음성분리 단일 세포 클론에서의 유전자형 변화 양상 분석 결과로, A는 1번~94번 클론들에서의 스크리닝 결과이고, B는 총 클론에 대한 각 HLA 클래스 I 유전자 부위의 돌연변이 분포이다(full length: 야생형 293T 산물 크기와 유사한 것; deletion: 야생형 293T 산물 크기보다 짧은 것; insertion: 야생형 293T 산물 크기보다 긴 것; unamplified: 밴드가 없거나 비특이적인 다중밴드인 것. 상기 데이터는 HLA 클래스 I 대립 유전자위치(locus)에 따라 백분율로 변환함).
도 4는 변화한 유전자의 상관관계 분석 결과이다.
도 5는 유전체에서 HLA-A, -B, -C 유전자 엑손 2~3이 온전히 제거된 단일클론 세포주의 시퀀싱 결과(상단 도면) 및 발현도 측정 결과이다(하단 도면).
도 6은 단일 HLA 발현 세포 생산(A) 및 면역 반응 측정(B) 결과이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP)에 관한 것이다.

본 발명의 H1E-25 세포주는 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLA-A*02:01, HLA-B*07:02 및 HLA-C*07:02 각각의 엑손 2 및 3을 타겟으로 하여 이들 유전자를 넉아웃 시킨 HEK 293T 세포주인 것을 특징으로 한다. 기존의 HEK 293T 세포는 HLA 클래스 I을 발현하므로 항원에 대한 반응이 있어도 어떤 HLA에 특이적인 반응인지 측정이 어렵다. 그러나, 본 발명의 H1E-25 세포주는 HLA-A, -B 및 -C 유전자가 결핍되어 있어 항원에 대한 반응이 없다. 또한, 본 발명의 H1E-25 세포주는 단일 HLA 클래스 I 유전자의 형질주입을 통해 단일 HLA를 발현하는 세포주로 확립할 수 있고 단일 HLA를 발현하는 세포주는 특정 HLA에 대한 항원 특이 항체 반응을 측정할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 H1E-25 세포주는 HLA-A*02:01/*02:01, HLA-B*07:02/*07:02 및 HLA-C*07:02/*07:02의 아형을 갖고 있는 HEK 293T 세포로부터 제조될 수 있다.

상기 H1ME-5 세포주는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 유전자가 유전체 상에서 제거된 세포주로 HEK 293T 세포-기반 세포주일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 H1ME-5 세포주는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 각각의 엑손 2와 3 사이를 결실시켜 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자가 유전체 상에서 완전히 제거된 HLA 클래스 I 결핍 293T 세포주이다. 상기의 RNA 유전자 가위(RNA-guided CRISPR)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)-연관된 뉴클레아제 Cas9는 타겟 넉-아웃, 전사 활성화 및 single guide RNA(sgRNA)(즉, crRNA-tracrRNA 융합 전사체)를 이용한 억제에 대한 획기적인 기술을 제공하며, 이 기술은 수많은 유전자 위치를 타겟팅한다.

상기 CRISPR-Cas9 시스템은 HLA 발현 억제를 위해 mRNA 수준을 조절하는 shRNA 및 유전체 DNA를 편집하는 ZFN을 이용한 유전자 조절 및 편집 기술에 비해 다양한 HLA 아형에 적용할 수 있고, 여러 유전자를 동시에 제거할 수 있으며 HLA 분자의 인위적인 발현이 가능한 장점을 갖는다.

상기 HLA 클래스 I 결핍 293T 세포주 확립을 위해 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 엑손 2 및 3의 타겟 서열을 포함하는 sgRNA를 발현하는 플라스미드; 및 Cas9 단백질을 발현하는 플라스미드를 293T 세포에 형질주입하고, 상기 타겟 서열을 포함하는 sgRNA에 의해 타겟 유전자를 인식하고 Cas9 단백질과 복합체를 형성하며, Cas9 단백질에 의한 타겟 DNA의 절단을 통해 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C의 엑손 2와 3 사이가 결실될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 각 HLA 클래스 I 대립유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이에 큰 결실을 유도하기 위해 6개의 gRNA-Cas9 플라스미드를 야생형 293T 세포에 동시 또는 순차적으로 형질감염시키고, 형질감염 6일 후, Moflo FACS 솔터와 HLA 클래스 I 단클론 항체를 이용하여 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 음성세포들을 선별하고 96-웰 플레이트에 단일세포로 분주한다. 단일세포로 분주하고 2~3주 후, 단일세포 클론을 확립하고 배양한다. 유전형을 분석하기 위해 각각의 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 PCR과 전기영동을 시행한다. 그리고 유전체 서열을 분석하기 위해 선별된 클론들에서 생거 시퀀싱을 시행한다. 플로우 사이토메트리 분석과 HLA 클래스 I 단클론 항체를 이용하여 HLA 클래스 I 발현을 확인함으로써 HLA 클래스 I 결핍 세포주를 확립할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, HLA 클래스 I의 엑손 2 및 3을 타겟으로 하는 sgRNA 서열은 다음과 같다:

HLA-A 엑손 2(SEQ ID NO: 1) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 2);

HLA-B 엑손 2(SEQ ID NO: 3) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 4); 및

HLA-C 엑손 2(SEQ ID NO: 5) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 6)

본 명세서에서, 용어 "절단"은 뉴클레오티드 분자의 공유결합 백본의 파손(breakage)을 의미한다.

상기 가이드 RNA(sgRNA)는 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 타겟 서열을 포함하고 있어 세포 내로 전달된 후 전사를 통해 발현되어 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자를 인식하고 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있으며 Cas9 단백질을 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자로 가져오는 RNA이다. 따라서, 상기 가이드 RNA는 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 타겟 서열; 및 타겟과 무관한 불변 서열(non-variable sequence)로 이루어진 가이드 RNA 스캐폴드를 포함한다.

상기 HLAA-A, HLA-B 및 HLA-C 유전자의 타겟 서열은 가이드 RNA가 타겟 유전자를 인식할 수 있게 하는 서열을 의미하며, 숙주 세포의 종류, 타겟 유전자의 종류 또는 삽입 부위에 따라 적당한 변형이 가해질 수 있다.

상기 가이드 RNA 스캐폴드는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 필수적 부분의 융합에 의해 생성된 단일 사슬 RNA (single-chain guide RNA, sgRNA)일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA(dual RNA)일 수 있다. 만약 상기 가이드 RNA 스캐폴드가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 타겟과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA 스캐폴드라도 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 crRNA는 타겟 DNA와 혼성화될 수 있다.

바람직하게는, 단일-사슬 가이드 RNA일 수 있다.

상기 터미네이터는 가이드 RNA를 코딩하는 DNA의 전사를 종결하기 위해 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 말단에 연결되는 것으로, 프로모터에 맞게 당업자의 적정 선택 수준에서 채택하여 사용할 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예컨대, RNA Polymerase III terminator 또는 -TTTTTT- 서열일 수 있다.

상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제를 형성한다. Cas9 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 Cas9 단백질이 세포 내로 전달될 경우, 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌(poly-arginine) 도메인 또는 HIV로부터 유래한 TAT 단백질일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 발현하는 벡터, 즉, Cas9 단백질 코딩 핵산을 포함하는 벡터의 형태로 트랜스펙션을 통해 전달될 수 있다. 상기 Cas9 단백질 코딩 핵산은 CMV 또는 CAG와 같은 프로모터 하에서 Cas9 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 같은 벡터의 형태일 수 있다.

상기 sgRNA를 발현하는 플라스미드 및 Cas9 단백질을 발현하는 플라스미드의 전달은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리(DEAE-dextran treatment), 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 트랜스펙션 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 상술한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.

본 발명의 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 H1E-25 세포주는 HLA-A,-B,-C가 모두 확실히 제거된 인간 세포주로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 7월 26일자로 특허기탁되었다(기탁번호: KCTC 13601BP).

본 발명은 또한 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및 HLA 클래스 I 유전자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 혈청 내 HLA 아형 특이 항체 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 H1E-25 세포주는 단일 HLA 클래스 I 유전자가 형질주입되어 단일 HLA 클래스 I을 발현하는 세포주를 다수 확립할 수 있고, 이식 전 환자의 혈청과 반응시켜 특정 HLA 아형에 특이적인 항체 유무를 조사할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 단일 HLA 클래스 I 유전자가 형질주입된 H1E-25 세포주 또는 상기 세포주 유래의 엑소좀 형태로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및 면역억제-관련 단백질의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 면역억제 제형 제조용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 H1E-25 세포주는 면역억제-관련 단백질을 코딩하는 유전자가 형질주입되어 면역억제-관련 단백질을 발현하는 H1E-25 세포주를 통해 면역원성을 최소화한 엑소좀을 제조함으로써 면역억제에 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물의 면역억제 제형은 면역억제-관련 단백질을 코딩하는 유전자가 형질주입된 H1E-25 세포주 또는 상기 세포주 유래의 엑소좀일 수 있다.

상기 면역억제-관련 단백질는 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 면역억제 제형은 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중에서 선택된 면역질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.

본 발명은 또한 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 보조자극분자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터; 및 HLA 클래스 I 유전자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 면역치료 제형 제조용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 H1E-25 세포주는 보조자극분자 및 HLA 클래스 I 유전자가 형질주입되어 항원제시능을 갖는 H1E-25 세포주 또는 상기 세포주 유래의 엑소좀을 통해 T 세포 자극에 의한 CTL 반응을 유도함으로써 면역치료에 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물의 면역치료 제형은 보조자극분자 및 HLA 클래스 I 유전자가 형질주입된 항원제시능을 갖는 H1E-25 세포주 또는 상기 세포주 유래의 엑소좀일 수 있다.

상기 보조자극분자는 CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 또한 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및 역분화 유도인자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 유도만능줄기세포 제조용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 H1E-25 세포주는 역분화 유도인자가 형질주입되어 HLA 결핍 유도만능줄기세포로 확립될 수 잇고, 상기 HLA 결핍 유도만능줄기세포는 다양한 종류의 세포들로 분화시켜 활용할 수 있다.

상기 역분화 유도인자는 Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 및 Lin28로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> Null-293T(H1E-25) 세포주 확립

Null-293T(H1E-25) 세포주 확립을 위해 HEK(human embryonic kidney) 293T 세포를 사용하였다. HEK 293T 세포(CRL-3216; ATCC, Manassas, VA)를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지(Lonza)에서 배양하였다. T2 세포를 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지(Lonza)에서 배양하였다.

HLA 클래스 I 분자의 완벽한 제거를 위해, 각 HLA-A,-B,-C 유전자들의 엑손 2와 3을 타겟으로 하는 gRNA와 Cas9을 암호화하고 있는 6개의 플라스미드를 사용하였다(도 1):

1) gRNA(타겟: HLA-A*02:01 exon2(AE2: 5'-GAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGG-3', SEQ ID NO: 1), exon3(AE3: 5'-GAAGGAGACGCTGCAGCGCACGG-3', SEQ ID NO: 2), HLA-B*07:02 exon2(BE2: 5'-GCTGTCGAACCTCACGAACTGGG-3', SEQ ID NO: 3), exon3(BE3: 5'-GAGCATGTACGGCTGCGACGTGG-3', SEQ ID NO: 4), HLA-C*07:02 exon2(CE2: 5'-GACACAGAAGTACAAGCGCCAGG-3', SEQ ID NO: 5), exon3(CE3: 5'-CCAGAGGATGTCTGGCTGCGACC-3', SEQ ID NO: 6))

2) Cas9 protein co-expression all-in-one vector (Genscript, PX458, PX459).

HEK 293T 세포를 항생제가 없는 DMEM(Lonza)을 이용해 2×10⁶/10mL로 깔았다. 24시간 후, 6개의 타겟 각각에 특이적인 6종의 all-in-one 플라스미드(각각 3.3㎍)을 이용하여 293T 세포주에 형질주입하였다. 형질주입 48시간 후, 세포에 대해 플로우 사이토메트리를 수행하였다. 형질주입 6일 후, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 음성 세포를 분리하고 클론을 확립하였다. 소팅 후 2-3주째에, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 음성 단일 세포 클론을 확립하여 6-웰 플레이트에서 배양하였다. TIANamp Genomic DNA Kit (Tiangen, China)를 이용하여 제조업체의 설명서에 따라 1×10⁵-5×10⁶cells의 각 클론으로부터 클론의 게놈 DNA를 분리하였다. 각 타겟 영역의 증폭은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 엑손 2 및 3에 특이적인 프라이머 세트(HLA-A forward primer: 5'-GAA ACS GCC TCT GYG GGG AGA AGC AA-3'; HLA-A reverse primer: 5'-TGT TGG TCC CAA TTG TCT CCC CTC-3'; HLA-B forward primer: 5'-GGG AGG AGC GAG GGG ACC SCA G-3'; HLA-B reverse 50-GGA GGC CAT CCC CGG CGA CCT AT-30; HLA-C forward primer: 5'-CTC MTC CTG CTG CTC TCG GGA-3'; HLA-C reverse primer: 5'-TGG GAG GCC ATS CCG GGA GAT-3')를 사용한 PCR을 통해 수행하였다. 선별된 클론의 PCR 산물은 Sanger 시퀀싱(Cosmo Genetech, Korea)을 통해 분석하였다. 이후, HLA-A, -B, -C null 293T 클론 (Null-293T(H1E-25))을 선별하였다.

<실시예 2> HLA 클래스 I 음성세포 클론의 확립

HEK 293T 세포는 높은 형질주입 효율과 동형의 HLA 클래스 I(A*02:01, B*07:02, 및 C*07:02) 종류를 가진다는 이점이 있다. HLA 클래스 I 분자의 완벽한 제거를 위해, 각 HLA-A,-B,-C 유전자들의 엑손 2와 3을 표적으로 하는 gRNA와 Cas9을 암호화하고 있는 6개의 플라스미드를 사용하였다(도 1). 이 6개의 플라스미드를 293T 세포에 동시 형질주입하였다. 형질주입 6일 후, HLA 클래스 I 분자 특이적인 항체(HLA-ABC-APC, G46-2.6, BD Bioscience)를 염색하여, 가장 낮게 발현하는 세포들을 분리하여 6-웰 플레이트 또는 8개의 96-웰 플레이트에 단일세포로 깔았다(도 2). 6-웰 플레이트에 배양한 세포를 16일째, HLA 클래스 I 음성세포군은 57.3%였다(도 2). 소팅 후 2~3주 후, 총 768 웰에서 188개의 클론(24.5%)을 배양하여 HLA 클래스 I 유전자 변이와 발현을 분석하였다.

<실시예 3> HLA 클래스 I 음성세포 클론에 대한 유전적 분석 및 플로우 사이토메트리 분석

유도된 돌연변이를 검출하기 위해, 각 HLA 클래스 I 유전자의 엑손 2와 3에 gRNA 표적 부위를 포함한 특정 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하여 PCR 산물의 크기를 측정하였다(도 3A). 측정한 PCR 산물의 크기가 대조군 크기와 비교하여 차이가 있을 경우, PCR 산물이 보다 짧은 것은 결실(D), 길어진 것은 삽입(I)으로 명명하였고, 크기의 변화가 없거나 증폭되지 않은 산물들은 각각 야생형(WT)과 확인되지 않음(U)로 명명하였다(도 3A). PCR 산물이 단일 밴드로 검출될 때, 동질 접합체 또는 이중 밴드로 검출될 때, 이형 접합체(HT)로 간주되었다(도 3A). 결실 및 삽입 돌연변이의 유전자 빈도는 각각 HLA-A에서 35.6%와 1.1%, HLA-B에서 52.1% 와 3.2%, HLA-C에서 13.3% 와 1.1%였다(도 3B). 증폭되지 않은 산물은 동형의 결실로 PCR에 영향을 주는 더 큰 결실로 추정된다. 증폭되지 않은 유전자 빈도는 HLA-A에서 26.6%, HLA-B에서 21.3%, HLA-C에서 3.2%였다(도 3B). PCR 산물의 크기가 동일하거나 유사한 것들은 돌연변이가 없거나, 치환 또는 작은 삽입 또는 결실을 포함하는 것으로 간주하였다. 이러한 결과는 HLA-B, HLA-A 및 HLA-C의 돌연변이가 순서대로 빈번하게 발생함을 입증했다. 각 HLA 클래스 I 유전자 위치의 돌연변이 빈도는 각 HLA 클래스 I 유전자 위치에 대한 gRNA 표적화의 효율을 나타낼 수 있다.

또한, 큰 결실이나 삽입 및 증폭산물의 부재와 같이 측정이 가능할 정도로 변화된 산물(detectable changes of product, DCP)에 대해 HLA 클래스 1 분자 발현 변화와 상관관계 분석을 수행하였다(도 3A, 도 4). 그 결과, 배양된 94개 클론에서, 6개 클론(6.4%)은 3개의 HLA 클래스 I 위치 어디에서도 DCP가 보이지 않았다. 14개 클론(14.9%)은 오직 HLA-A에서만 DCP가 보였고, 22개 클론(23.4%)은 오직 HLA-B에서만, 그리고 1개 클론(1.1%)은 오직 HLA-C에서만 DCP가 보였다. HLA-A와 B 위치에서 둘 다 DCP가 있는 것은 28개 클론(29.8%)이고, HLA-B와 C 위치에 둘 다 있는 것은 5개 클론(5.3%), 그리고 HLA-A와 C 부위 둘 다 있는 것은 1개 클론이었다(1.1%). 17개 클론의 모든 HLA 클래스 I 위치에서 9의 동형 DCP(9.6%)와, 8개의 이형 DCP(8.5%)가 보였다(도 3A, 도 4).

또한, 동형 접합체 클론에서 HLA 클래스 I 유전자 위치의 DCP 분포에 따라 HLA 클래스 I 발현을 분석한 결과(도 4), 염색되지 않은 HEK 293T 세포에서 가장 높은 강도 수준을 HLA 클래스 I 발현의 분기점으로 사용된 경우, 야생형 HEK 293T 세포의 94.0%가 HLA 클래스 I 발현의 양성으로 결정되었다. 평균 양성비는 DCP가 없는 군에서 55.0%, 1개 있는 군에서 38.6%, 2개 있는 군에서 6.4%, 그리고 3개 있는 군에서 1.8%였다(도 4). DCP가 없는 군에서 대조군보다 더 낮은 HLA 클래스 I 발현은 단일 gRNA 효과에 의한 작은 삽입 또는 결실의 존재를 암시한다. 이러한 결과는 DCP 대립 형질의 수에 따라 HLA 클래스 I 발현이 감소함을 보여 주었다.

또한, HLA-A, -B, -C 결핍 293T 세포주(HLA-A, -B, -C Null cell line)의 선별을 위해 HLA-A, -B 및 -C 유전자에서 예측된 결실이 일어난 동형 접합체 클론 25번의 뉴클레오타이드 서열을 확인하였다(도 5). 25번 클론은 각각의 표적화 된 HLA 클래스 I 유전자 위치에서 예상되는 2개의 절단 부위에 가까운 영역 사이의 큰 결실을 보였다. 최종적으로, 배양된 94개 클론을 스크리닝하여 HLA-A, -B 및 -C 모두 null deletion 된 단 하나의 동형 접합체 클론 25번(HLA class I Null clone)을 최종 HLA-A, -B, -C 결핍 293T 세포주로 확립하였다 (도 3A, 도 5).

<실시예 4> 단일 HLA 발현 세포 생산 및 면역 반응 측정

null-293T(H1E-25)에서 단일 HLA 클래스 I 대립 유전자에 제한된 항원제시와 자연적 항원 처리를 입증하기 위해 null-293T(H1E-25) 세포주에 A*02:06 또는 B*40:06 형질주입 후 6일째에 HLA 클래스 I 양성세포를 분류하였다. A*02:06- 그리고 B*40:06-293T(H1E-25) 세포는 플로우 사이토메트리로 95% 이상의 HLA 클래스 I을 나타내었다(도 6A). 그 후 CMV pp65 전체 항원을 발현하는 플라스미드는 야생형 293T, null-, A*02:06-, 및 B*40:06-293T(H1E-25) 세포에 형질주입되었다. IFN-γ enzyme-linked immunospot(ELISPOT) 분석은 HLA 일치 기증자의 CD8+T 세포에서 수행되었다.

HLA-A*02:06 일치 HD1과 HD2로부터 나온 CD8+T 세포에서, 스팟이 각각 A*02:06-293T(H1E-25)에서 22개와 181.5개 나타났다. HLA-B*40:06 일치 HD3과 HD4로부터 나온 CD8+T 세포에서, 스팟이 각각 B*40:06-293T(H1E-25)에서 54.5개와 49.5개 나타났다. 모든 기증자에서 불일치하는 군에서는 0~25.5개의 스팟이 나타났고, null-293T(H1E-25) 군에서는 0~0.5개의 스팟이 나타났다. 이 IFN-γ ELISPOT 데이터는 각 그룹의 일치하는 특이적 면역 반응에 대해 명확한 결과를 보여주었다.

상기 ELISPOT 데이터로부터 두 가지 결론을 도출하였다. 첫째, 상기 접근법은 HLA 클래스 I 분자를 제거하고 복원할 수 있으며, 표현형뿐만 아니라 기능도 제거할 수 있었다. 둘째, HLA 유형에 상관없이 자연적인 항원 처리 및 제시가 가능하게 복원할 수 있었다.

따라서, 상기 HLA-A,-B 및 -C가 모두 확실히 제거된 인간 H1E-25 클론에 대해 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 7월 26일자로 특허기탁하였다(기탁번호: KCTC 13601BP).

한국생명공학연구원

KCTC13601BP

20180726

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Artificial antigen presentation cell derived from HLA deficient cell lines by using multiplex CRISPR-Cas9 system, and use thereof <130> P17U11C1703 <150> KR 10-2016-0163509 <151> 2016-12-02 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A exon 2 target sequence <400> 1 gagccagagg atggagccgc ggg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A exon 3 target sequence <400> 2 gaaggagacg ctgcagcgca cgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B exon 2 target sequence <400> 3 gctgtcgaac ctcacgaact ggg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B exon 3 target sequence <400> 4 gagcatgtac ggctgcgacg tgg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-C exon 2 target sequence <400> 5 gacacagaag tacaagcgcc agg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-C exon 3 target sequence <400> 6 ccagaggatg tctggctgcg acc 23 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MART-1 26-35 <400> 7 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pp65 495-503 <400> 8 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5

Claims

HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP).
제1항에 있어서,
Null-293T(H1E-25) 세포주는 HLA-A*02:01의 엑손 2 및 2, HLA-B*07:02의 엑손 2 및 3, 및 HLA-C*07:02의 엑손 2 및 3을 타겟으로 하는 다음의 single guide RNA(sgRNA)를 이용한 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 HLA-A, -B 및 -C 유전자가 유전체 상에서 제거된 HEK 293T 세포주인, H1E-25 세포주:
HLA-A 엑손 2(SEQ ID NO: 1) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 2);
HLA-B 엑손 2(SEQ ID NO: 3) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 4); 및
HLA-C 엑손 2(SEQ ID NO: 5) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 6).
HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및
HLA 클래스 I 유전자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 혈청 내 HLA 아형 특이 항체 검출용 조성물.
제3항에 있어서,
조성물은 단일 HLA 클래스 I 유전자가 형질주입된 Null-293T(H1E-25) 세포주 또는 상기 세포주 유래의 엑소좀 형태로 포함하는, 혈청 내 HLA 아형 특이 항체 검출용 조성물.
HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및
면역억제-관련 단백질의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 면역억제 제형 제조용 조성물.
제5항에 있어서,
면역억제 제형은 면역억제-관련 단백질을 코딩하는 유전자가 형질주입된 Null-293T(H1E-25) 세포주 또는 상기 세포주 유래의 엑소좀을 포함하는, 면역억제 제형 제조용 조성물.
제5항에 있어서,
면역억제-관련 단백질은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 면역억제 제형 제조용 조성물.
제5항에 있어서,
면역억제 제형은 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중에서 선택된 면역질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 것인, 면역억제 제형 제조용 조성물.
HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP);
보조자극분자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터; 및
HLA 클래스 I 유전자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 면역치료 제형 제조용 조성물.
제9항에 있어서,
면역치료 제형은 보조자극분자 및 HLA 클래스 I 유전자가 형질주입된 항원제시능을 갖는 Null-293T(H1E-25) 세포주 또는 상기 세포주 유래의 엑소좀을 포함하는, 면역치료 제형 제조용 조성물.
제9항에 있어서,
보조자극분자는 CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 면역치료 제형 제조용 조성물.
HLA-A, -B 및 -C 유전자 결핍 Null-293T(H1E-25) 세포주(기탁번호: KCTC 13601BP); 및
역분화 유도인자의 핵산 서열이 삽입된 발현 벡터를 포함하는 유도만능줄기세포 제조용 조성물.
제12항에 있어서,
역분화 유도인자는 Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4 및 Lin28로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 유도만능줄기세포 제조용 조성물.