KR20210114516A - 프리바이오틱 제제로서 사용하기 위한 효모 생성물 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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버트랜드 로드리게즈
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Abstract

프리바이오틱 제제로 사용하기 위한 효모 생성물 및 이를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 프리바이오틱 제제로서 효모 생성물 및 이를 포함하는 조성물의 비치료적 용도가 제공된다. 효모 생성물 및 이를 포함하는 조성물은 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진한다.

Description

프리바이오틱 제제로서 사용하기 위한 효모 생성물 및 이를 포함하는 조성물
본 발명은 인간 및/또는 동물 영양 및 건강 분야에 속한다. 본 발명은 특히 프리바이오틱 제제로서 사용하기 위한 효모 생성물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 프리바이오틱 제제로서의 효모 생성물 및 이를 포함하는 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다. 상기 효모 생성물 및 이를 포함하는 조성물은 공여자 및 장 유형 (enterotype)의 초기 미생물 조성에는 관계없이 포유동물 장내 미생물총 (gut microbiota)에서 박테로이데테스 문 (Bacteroidetes phylum)의 박테리아의 성장을 촉진한다.
비-소화성 올리고사카라이드 (NDO: non-digestible oligosaccharide)는 인간 소장에서 소화 및 흡수에 저항하여 이들은 대장에서 완전히 또는 부분적으로 발효된다. 이들 탄수화물은 결장 기능의 규칙성을 유지하는 데 도움이 되고 만성 질환의 위험을 감소시킴으로써 인간 건강에 기여할 수 있다. 많은 NDO가 프리바이오틱 제제로 간주된다.
포유류 장내 미생물총, 특히 인간 장내 미생물총에 대한 프리바이오틱 제제의 활성은 락토바실러스 (Lactobacillus) 및 비피도박테리아 (Bifidobacteria)와 같은 건강-증진 박테리아의 성장, 장내 병원체의 감소 및 건강-관련된 박테리아 대사산물 생산의 증가 또는 감소에 기반하여 평가될 수 있다. 후자는, 예를 들어, 일반적으로 결장 건강에 긍정적인 것으로 여겨지는 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트와 같은 선형의 단쇄 지방산 (SCFA)을 포함하지만, 암모니아 및 분지형 SCFA는 결장 발암에 대한 위험 인자로서 간주된다.
그러나, 락토바실러스 및 비피도박테리아는 장내 마이크로바이옴 (microbiome), 특히 인간 장내 미생물총 내에서 단지 소수 그룹을 구성하는 2개의 속 (genera)이다. 이들은 프리바이오틱 화합물이 비피도박테리아와 락토바실리를 포함하는 특정 박테리아 그룹에 의해 선택적으로 발효되어야 하며 따라서 잠재적인 건강-증진 효과가 발생한다고 언급된 프리바이오틱 화합물의 초기 정의로 인해 많은 관심을 받았다. 이러한 좁은 정의의 결과로서, 새로운 섬유의 프리바이오틱 효과에 초점을 맞춘 많은 초기 연구는 이들 두 그룹에 초점을 맞춘 표적화된 접근 방식을 적용하여 다량의 다른 장내 미생물에 대한 프리바이오틱스의 잠재적 효과를 무시하였다.
장내 미생물총은 매우 다양한 미생물을 포함한다. 예를 들어, 문 (phyla) 악티노박테리아 (Actinobacteria), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 피르미쿠테스 (Firmicutes) 및 프로테오박테리아 (Proteobacteria)의 박테리아가 장내 미생물총에 존재한다. 이들 박테리아 중 일부의 성장은 이들이 건강한 발효를 촉진하고 특히 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트와 같은 단쇄 지방산 (SCFA)의 생성을 증가시키기 때문에 유익한 것으로 입증되었다.
따라서, 포유동물 장내 미생물총을 촉진하고 특히 박테로이데테스 문의 박테리아 성장을 촉진하는 데 적합한 새로운 프리바이오틱 제제를 제공할 필요가 있다.
본 발명의 제1 목적은 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진하기 위한 프리바이오틱 제제로서 사용하기 위한, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것으로, 상기 효모 생성물은 효모 세포의 벽 또는 이의 분획을 포함한다.
일부 구현예에서, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물은 속 사카로미세스 (Saccharomyces,), 피키아 (Pichia), 칸디다 (Candida), 클루베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로이야 (Yarrowia) 및/또는 위케호모마이세스 (Wickehomomyces)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 바람직하게는 상기 효모는 종 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 쟈디니 (Pichia jadinii), 클루베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는 상기 효모는 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)이다.
일부 구현예에서, 박테로이데테스 문의 박테리아는 박테로이디아 강 (Bacteroidia class)의 박테리아; 바람직하게는 박테로이달레스 목 (Bacteroidales order)의 박테리아; 더욱 바람직하게는 박테로이다세애 과 (Bacteroidaceae family)의 박테리아; 더욱 더 바람직하게는 박테로이데스 속 (Bacteroides genus)의 박테리아; 가장 바람직하게는 박테로이데스 오바투스 종 (Bacteroides ovatus spp)이다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아 대 피르미쿠테스 문 (Firmicutes phylum)의 박테리아의 비를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 프리바이오틱 제제는 비활성화된 전체 효모, 효모 세포 벽, 효모 세포 벽의 분획, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 효모의 파괴 처리를 사용하여 수득된 분획이고; 바람직하게는 효모 생성물은 효모 세포의 불용성 분획이다. 파괴 처리는 생화학적 처리 및/또는 기계적 처리일 수 있다. 기계적 파괴는 유리 비드, 가압 균질화, 초음파 또는 마이크로파를 사용하여 얻어질 수 있다. 생화학적 처리는 자가분해, 열 원형질분리, 효소 가수분해, 삼투압 쇼크 및/또는 반복된 냉동-해동 사이클로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 전체 효모 세포를 파괴 처리, 바람직하게는 열 원형질분리에 적용하고, 불용성 분획으로부터 가용성 분획을 분리한 다음, 가용성 하위-분획으로부터 단백질이 풍부한 불용성 하위-분획을 분리하기 전에 상기 불용성 분획을 리보뉴클레아제 (E.C. 3.1.4.1) 및 글루카나제 (E.C. 3.2.1)로 처리함으로써 수득된 가용성 하위-분획이다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 전체 효모 세포를 파괴 처리, 바람직하게는 열 원형질분리에 적용한 다음, 가용성 하위-분획으로부터 단백질이 풍부한 불용성 하위-분획을 분리하기 전에 상기 수득된 혼합물을 리보뉴클레아제 (E.C. 3.1.4.1) 및 글루카나제 (E.C.3.2.1)로 처리함으로써 수득된 가용성 하위-분획이다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 건조 물질 기준으로 15 내지 50 질량%의 β-글루칸 함량 (글루코스의 등가 질량으로 표시됨); 및/또는 건조 물질 기준으로 10 내지 40 질량%의 만난 함량 (만노스의 등가 질량으로 표시됨)을 갖는다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은, 건조 물질 질량 기준으로, 15 내지 50%의 β-글루칸 함량 (글루코스의 등가 질량으로 표시됨), 10 내지 40%의 만난 함량 (만노스의 등가 질량으로 표시됨), 5 내지 15%의 추가 단백질, 5 내지 15%의 유리 뉴클레오티드, 2 내지 8%의 유리 아미노산 및 1　kDalton 이하의 펩타이드, 2% 이하의 올리고사카라이드, 6 내지 11%의 회분 및 1 내지 3%의 지방 성분을 포함하고, 건조 물질 함량이 적어도 90%이다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium genus)의 박테리아; 바람직하게는 비피도박테리아세애 과 (Bifidobacteriaceae family)의 박테리아; 더욱 바람직하게는 비피도박테리알레스 목 (Bifidobacteriales order)의 박테리아의 성장을 촉진하지 않는다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 락토바실러스 속 (Lactobacillus genus)의 박테리아; 바람직하게는 락토바실라세애 과 (Lactobacillaceae family)의 박테리아; 더욱 바람직하게는 락토바실랄레스 목 (Lactobacillales order)의 박테리아의 성장을 촉진하지 않는다.
일부 구현예에서, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물은 경구 투여되고; 바람직하게는 상기 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물은 500 mg 내지 15 g의 1일 용량으로 경구 투여되고; 바람직하게는 상기 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물은 최대 10회의 복용으로 500 mg 내지 5 g의 1일 용량으로 경구 투여된다.
일부 구현예에서, 조성물은 검, 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립 또는 현탁액으로서 제형화된다.
본 발명의 제2 목적은 설사 및 과민성 대장 증후군과 같은 장내 병리를 예방하거나 제한하고, 면역을 촉진하고, 혈당증 및/또는 지질혈증을 조절하고, 비만과 관련된 대사 장애를 치료하거나 제한하는데 사용하기 위한, 본원에 정의된 바와 같은 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제3 목적은 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진하기 위한 프리바이오틱 제제로서 본원에 정의된 바와 같은 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물의 비치료적 용도를 제공하는 것으로, 상기 효모 생성물은 효모 세포의 벽 또는 이의 분획을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 식료품 (foodstuff) 또는 식품 보충제 (food supplement); 바람직하게는 유제품, 과일-기반 제품, 음료, 고형 식료품 또는 식품 보충제이다.
본 발명은 종래 기술의 요구를 해결할 수 있도록 한다. 특히, 본 발명은 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진하기 위한 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물을 제공한다. "성장을 촉진하는 것"이란, 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 집단을 증가시키고/시키거나 다른 박테리아에 비해 이의 상대적인 풍부도를 증가시키는 것을 의미한다.
효모 생성물은 효모 세포의 벽 또는 이의 분획을 포함한다. 따라서, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물은 프리바이오틱 제제로서 사용하기에 적합하다. "프리바이오틱 제제"란, 결장에서 하나 또는 제한된 수의 유익한 박테리아의 성장 및/또는 활성을 선택적으로 촉진하여 숙주 건강을 개선함으로써 숙주에 유익하게 영향을 미치는 비-소화성 또는 비-완전 소화성 식제품을 의미한다. 프리바이오틱 제제가 살아있는 유기체가 아니라는 점에서 프리바이오틱 제제는 프로바이오틱 제제와 다르다.
본 발명자들은 효모, 특히 사카로미세스 세레비지애 또는 이의 유도체가 특히 박테로이데스 속의 박테리아와 같은 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진함으로써 장내 미생물총을 조절한다는 것을 보여주었다. 따라서, 효모 생성물은 신진대사 및 구성 둘 다에 긍정적이고 선택적으로 영향을 미침으로써 장내 미생물총에 대한 프리바이오틱 잠재력을 갖는다는 것이 입증되었다. 이러한 프리바이오틱 잠재력은 설사 및 과민성 대장 증후군과 같은 장내 병리를 예방하거나 제한하고, 면역을 촉진하고, 혈당증 및/또는 지질혈증을 조절하고, 비만과 관련된 대사 장애 (예를 들어, 글루코스 내성 및 지방간 질환)를 치료하거나 제한하는 데 특히 유용하다.
구현예의 설명
본 발명은 이제 다음 설명에서 제한 없이 더 상세히 기술될 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진하기 위한 프리바이오틱 제제로서 사용하기 위한, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 제2 양태에서, 본 발명은 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진하기 위한 프리바이오틱 제제로서 사용하기 위한, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 포유동물은 인간이다.
다른 구현예에서, 포유동물은 동물이다.
효모 생성물의 치료적 및 비치료적 용도는 투여되는 대상체에 따라 다르다.
대상체가 건강하다면, 효모 생성물은 대상체의 안전을 유지하고 위장관의 기능을 촉진하기 위해 투여될 수 있다. 효모 생성물은, 예를 들어, 편안한 소화를 유지하기 위해, 예를 들어, 식품 보충제로서 비치료적으로 사용될 수 있다.
대상체가 위장 장애 또는 임의의 관련된 병태에 의해 영향을 받거나 위장 장애 또는 임의의 관련된 병태에 의해 영향을 받을 위험이 있는 경우, 효모 생성물은 그러한 장애를 예방하거나 치료하거나 제한하고, 위장관의 정상적인 기능을 회복하거나 보존하기 위해 투여될 수 있다. 이어서, 효모 생성물은 치료학적으로 사용될 수 있고 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있다.
효모 생성물은 효모 세포의 벽 또는 이의 분획을 포함한다. 본 발명자들은 효모 세포 벽 또는 이의 분획, 특히 본원에 상술된 하위-분획이 특히 유리하다는 것을 보여주었다.
효모는 속 사카로미세스, 피키아, 칸디다, 클루베로마이세스, 야로이야 및/또는 위케호모마이세스로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고; 바람직하게는 종 사카로미세스 세레비지애, 피키아 쟈디니, 클루베로마이세스 마르시아누스로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 효모는 사카로미세스 세레비지애 종이다.
효모는 특히 제빵용 효모 및/또는 맥주용 효모일 수 있다.
효모는 세포 막으로 둘러싸인 세포질을 포함한다. 세포질은 핵, 미토콘드리아 및 골지를 포함하는 세포내 구획을 포함한다. 세포 막은 세포 벽으로 둘러싸여 있다. 세포 막과 세포 벽 사이의 공간은 주변 세포질을 형성한다.
효모 생성물은 비활성화된 전체 효모, 효모 세포 벽, 효모 세포 벽의 분획, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
효모 세포 벽을 포함하는 효모 생성물은 통상적인 파괴 처리를 사용하여 수득될 수 있다. 파괴 처리를 적용하면, 불용성 분획, 및 효모 세포의 가용성 분획이 수득된다. 가용성 분획은 통상적으로 "효모 추출물"로 알려진 것을 형성하고, 두 용어 모두 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 글루탐산, 펩타이드 및 미네랄을 포함하는 대부분 유리 아미노산을 포함한다. 불용성 분획은 효모 세포 벽, 중합체, 폴리사카라이드, 뉴클레오타이드 및 열-응고된 단백질을 포함한다.
파괴 처리는 생화학적 처리 및/또는 기계적 처리일 수 있다. 기계적 파괴는 유리 비드, 가압 균질화, 초음파 또는 마이크로파를 사용하여 얻어질 수 있다. 생화학적 처리는 자가분해, 열 원형질분리, 효소 가수분해, 삼투압 쇼크 및/또는 반복된 냉동-해동 사이클로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 효모 생성물은 바람직하게는 전체 효모 세포를 건조 물질 중량 기준으로 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 가용화하고 효모 세포 벽의 구조적 폴리사카라이드, 즉 β-글루칸 및 만난을 보존하는, 본질적으로 프로테아제에 의해 자가분해 또는 효소 가수분해 후에 수득된 효모 세포의 불용성 분획으로서 생성될 수 있다.
Lynside® Wall Basic은 청구된 발명을 구현하기에 적합한 상업적으로 이용 가능한 효모 세포 벽 생성물의 예이다. Lynside® Wall Basic은 약 20% 내지 약 29%의 β-1,3/1,6-글루칸, 약 18% 내지 약 25%의 만난을 포함하고, 생성물의 총 중량을 기준으로 건조 물질을 적어도 94% 갖는다. Lynside® Wall Basic의 영양소 함량은 다음과 같다: 생성물의 총 중량 기준으로 약 10.0% 내지 약 31.2%의 단백질, 약 10% 내지 약 25%의 지질, 약 38%의 총 탄수화물 및 약 3% 내지 약 9%의 회분.
효모 세포 벽 또는 이의 분획을 수득하는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 유럽 출원 EP2170359, PCT 출원 WO2005/021015 및 PCT 출원 WO2009/013357은 중량 기준으로 특정 총 글루칸 및 만난 건조 물질 함량 및 중량 기준으로 특정 글리코겐 건조 물질 함량을 포함하는, 효모 세포 벽으로 구성된 효모 생성물을 개시한다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 전체 효모 세포를 열 원형질분리에 적용한 다음, 가용성 하위-분획으로부터 단백질이 풍부한 불용성 하위-분획을 분리하기 전에 상기 수득된 혼합물을 리보뉴클레아제 (EC 3.1.4.1) 및 글루카나제 (EC 3.2.1)로 처리함으로써 수득된 가용성 하위-분획일 수 있다. 이러한 과정으로 수득된 가용성 하위-분획은 효모 추출물을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 효모 생성물은 전체 효모 세포를 열 원형질분리에 적용한 다음, 가용성 하위-분획으로부터 단백질이 풍부한 불용성 하위-분획을 분리하기 전에 가용성 분획, 즉 효모 추출물로부터 불용성 분획을 분리한 다음, 수득된 불용성 분획을 리보뉴클레아제 및 글루카나제로 처리함으로써 수득된 가용성 하위-분획일 수 있다. 이러한 과정으로 수득된 가용성 하위-분획은 효모 추출물을 포함하지 않는다.
그러한 단백질이 풍부한 불용성 하위-분획 및 가용성 하위-분획을 수득하기 위한 방법은 2018년 4월 27일에 출원된 프랑스 출원 FR　3080521　A1 (1853748) 및 이의 관련 PCT 출원 WO　2019/207111　A1에 개시되어 있다.
단백질이 풍부한 불용성 하위-분획은 3% 미만의 뉴클레오타이드 및 적어도 72%의 단백질을 포함한다.
최종 가용성 하위-분획, 예를 들어, 효모 추출물을 포함하지 않는 가용성 하위-분획은 가용성 분획의 총 중량을 기준으로 45 내지 70%의 탄수화물을 포함한다. 탄수화물은 탄수화물의 총 중량을 기준으로 25 내지 40%의 글루칸 및 25 내지 35%의 만난을 포함한다. 가용성 하위-분획은 또한, 데아미나제를 사용한 처리 단계가 수행되는 경우 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
열 원형질분리는 적어도 45℃, 바람직하게는 70 내지 95℃의 온도에서 당업자에 따른 기간 동안, 바람직하게는 30초 내지 4시간, 더 바람직하게는 1분 내지 3시간, 더욱 바람직하게는 40분 내지 2시간 동안 수행될 수 있다. 리보뉴클레아제 및 글루카나제로 처리하는 단계는 40 내지 65℃, 바람직하게는 60℃의 온도에서 8 내지 24시간; 바람직하게는 18시간의 기간 동안 수행될 수 있다.
리보뉴클레아제 및 글루카나제로 처리하는 단계는 또한 데아미나제의 존재하에 수행될 수 있다.
가용성 하위-분획으로부터 단백질이 풍부한 불용성 하위-분획을 분리하는 단계는 지질을 제거하고 단배질의 비율을 높이기 위해 에탄올, 용매 또는 초임계 CO2에서 수행될 수 있다
효모 생성물의 제조는 분무-건조, 진공-건조, 유동층 건조, 드럼-건조 및/또는 동결-건조와 같은 건조 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 바람직하게는 효모 세포 막, 효모 세포질 및 세포 구획, 이들의 유도체, 또는 이들의 혼합물이 없다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 효모 추출물이 아니며 그러한 효모 추출물을 포함하지 않는다. 효모 추출물은 전체 효모 세포를 생화학적 처리 및/또는 기계적 처리와 같은 파괴 처리에 적용하여 직접적으로 수득된 가용성 분획이다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 인스턴트 건조 효모 또는 활성 건조 효모와 같은 살아있는 전체 효모가 아니다.
바람직하게는, 효모 생성물은 글루칸을 포함한다.
효모 생성물, 특히 본원에 기재된 가용성 하위-분획은 건조 물질 질량 기준으로 15 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 40%, 더욱 바람직하게는 20 내지 30%의 β-글루칸 함량 (글루코스의 등가 질량으로 표시됨)을 가질 수 있다.
바람직하게는, 글루칸은 β-1,3-글루칸, β-1,6-글루칸, 또는 이들의 조합물을 포함한다.
바람직하게는, 효모 생성물은 유리 형태 또는 만노단백질 복합체 형태로 만난을 포함한다.
효모 생성물은 건조 물질 질량 기준으로 10 내지 40%의, 바람직하게는 15 내지 30%, 더욱 바람직하게는 18 내지 25%의 만난 함량 (만노스의 등가 질량으로 표시됨)을 가질 수 있다.
효모 생성물은 특히 건조 물질 질량 기준으로 5 내지 15%, 바람직하게는 8 내지 12%의 함량으로 추가 단백질을 포함할 수 있다.
효모 생성물은 특히 건조 물질 질량 기준으로 5 내지 15%, 바람직하게는 8 내지 12%의 함량으로 유리 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
효모 생성물은 특히 건조 물질 질량 기준으로 2 내지 8%, 바람직하게는 4 내지 6%의 함량으로 유리 아미노산 및 1　kDalton 이하의 펩타이드를 포함할 수 있다.
효모 생성물은 특히 건조 물질 질량 기준으로 2% 이하, 바람직하게는 약 1%의 함량으로 올리고사카라이드, 예를 들어, 트레할로스를 포함할 수 있다.
효모 생성물은 특히 건조 물질 질량 기준으로 6 내지 11%, 바람직하게는 8% 내지 9%의 함량으로 회분을 포함할 수 있다.
효모 생성물은 특히 건조 물질 질량 기준으로 1 내지 3%의 함량으로 지방 성분을 포함할 수 있다.
효모 생성물은 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 98%의 건조 물질 함량을 가질 수 있다.
구체적인 구현예에서, 효모 추출물이 없는 가용성 하위-분획과 같은 효모 생성물은, 건조 물질 질량 기준으로 15 내지 50%의 β-글루칸 함량 (글루코스의 등가 질량으로 표시됨), 10 내지 40%의 만난 함량 (만노스의 등가 질량으로 표시됨), 5 내지 15%의 추가 단백질, 5 내지 15%의 유리 뉴클레오티드, 2 내지 8%의 유리 아미노산 및 1　kDalton 이하의 펩타이드, 2% 이하의 올리고사카라이드, 6 내지 11%의 회분 및 1 내지 3%의 지방 성분을 포함하고 건조 물질 함량이 적어도 90%이다.
본 발명에 따른 효모 생성물의 프리바이오틱 잠재력, 예를 들어, 인간 근위 결장에서의 발효를 시뮬레이션하는 시험관내 단기 모델을 사용하여 평가될 수 있다.
적합한 모델은 SHIME®로 알려진 인간 미생물 생태계의 연속 시뮬레이터로, 이는 수년 동안 사용되어 생체내 파라미터로 검증되었고, 위, 소장 및 3개의 결장 구획 (상행, 횡행 및 하행)을 모델링하는 5개의 순차적 반응기로 이루어진다. 단순화된 버전도 개발되었다.
시험관내 단기 시뮬레이션 모델은 상이한 결장 영역에서 구성과 기능이 둘 다 상이한 대표적인 미생물 군집을 구축하고 시험할 수 있다. 장내 미생물총의 신진대사에 대한 프리바이오틱 제제의 잠재력은 전반적인 미생물 발효, 미생물 활동의 변화 및 미생물 군집 구성의 변화에 대해 상이한 파라미터를 모니터링하고 측정하여 평가할 수 있다.
전반적인 미생물 발효는 pH 및 가스 생성을 측정하여 모니터링할 수 있다. 미생물 활동의 변화는 박테리아 대사산물 (SCFA 및 락테이트 포함) 생산의 키네틱을 비교하여 평가될 수 있다. 미생물 군집 구성의 변화는 증폭 (표적화된 qPCR 및 16S-기반 일루미나 서열분석)을 통해 특정 박테리아 서열 (16S rRNA 유전자)을 정량화하여 평가될 수 있다.
결장 배양 동안 pH를 모니터링하면 SCFA, 락테이트의 생성의 우수한 징후를 제공한다. 일반적으로, SCFA 및 락테이트의 형성으로 인해 배양의 첫 24시간 동안 pH 강하가 관찰된다. 이러한 pH 강하는 종종 단백질분해 발효로 인해 다음 배양 24시간 동안 pH 증가로 이어진다.
가스 생성은 전반적인 미생물 활동 및 따라서 발효 속도에 대한 우수한 척도이다.
SCFA 생성은 결장의 탄수화물 대사로부터 발생하며 다양한 건강 효과와 관련되어 있다. 가장 많이 생성되는 SCFA는 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트로 이루어진다. 아세테이트는 숙주에 대한 에너지 공급원 및 신체의 지질 합성을 위한 잠재적 기질로서 사용될 수 있는 반면, 프로피오네이트는 간에서 콜레스테롤과 지방산 합성을 감소시킨다 (대사 항상성에 대한 유익한 효과). 반면, 부티레이트는 대장세포 (colonocyte)의 주요 에너지 공급원이고 장내 점막에서의 면역 반응 (조절 T 세포의 수 증가와 관련됨)에서의 조절기 뿐만 아니라 이들 세포에서의 분화 (암 예방과 관련됨)를 유도한다. 총 SCFA 수준은 시험 성분의 전반적인 발효를 반영한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 효모 생성물은 공여자 및 장 유형의 초기 미생물 조성과는 독립적으로 포유동물 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진한다. 효모 생성물은 박테로이디아 강의 박테리아; 바람직하게는 박테로이달레스 목의 박테리아; 더욱 바람직하게는 박테로이다세애 과의 박테리아; 더욱 더 바람직하게는 박테로이데스 속의 박테리아; 가장 바람직하게는 박테로이데스 오바투스 종의 성장을 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 비피도박테리알레스 목의 박테리아; 바람직하게는 비피도박테리아세애 과의 박테리아; 더욱 바람직하게는 비피도박테리움 속의 박테리아의 성장을 촉진하지 않는다. 마찬가지로, 효모 생성물은 락토바실랄레스 목의 박테리아; 바람직하게는 락토바실라세애 과의 박테리아; 더욱 바람직하게는 락토바실러스 속의 박테리아의 성장을 촉진할 수 없다.
일부 구현예에서, 효모 생성물은 박테로이데테스 문 박테리아 대 피르미쿠테스 문의 박테리아의 비를 증가시킨다. 박테로이데테스 대 피르미쿠테스 비는 비만인에 비해 마른 대상체에서 더 높은 것으로 보고되었다. 또한, 이러한 비의 증가는 비만 관련된 장애 (체중 증가, 글루코스 불내성 또는 지방간 장애)의 예방과 관련되었다.
효모 생성물은 경구 투여될 수 있다. 효모 생성물은 1일 유효 용량, 예를 들어, 500 mg 내지 15 g의 1일 용량으로 투여될 수 있다. 1일 유효 용량은 최대 10회, 예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회 또는 이상의 복용으로 투여될 수 있다. 효모 생성물은 경구 투여에 더 적합한 형태로 그 자체로 또는 조성물로 투여될 수 있다.
조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 약제학적 조성물은 임의의 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적 활성제를 추가로 포함할 수 있다.
조성물은 또한 식료품 및/또는 식품 보충제일 수 있다. 조성물은 유제품, 과일-기반 제품, 음료, 고형 식료품 또는 임의의 다른 적합한 식용 제품일 수 있다. 조성물은 영양약학적 (nutraceutical) 조성물, 식이 보충제 또는 임의의 다른 적합한 식품 보충제일 수 있다.
조성물은 액체, 페이스트 또는 고체 조성물일 수 있다.
조성물은 하나 이상의 추가 성분을 포함할 수 있다. 추가 성분은 비타민 (예를 들어, A, C, D, E, K, B1, B2, B3, B5, B6, B8, B9, B12 또는 이들의 혼합물), 미네랄 (예를 들어, 칼슘, 인, 나트륨, 마그네슘, 철 또는 이들의 혼합물) 일 수 있다.
조성물은 바람직하게는 효모 추출물이 없다.
조성물은 바람직하게는 인스턴트 건조 효모 또는 활성 건조 효모와 같은 살아있는 전체 효모가 없다.
효모 생성물은 정제, 캡슐, 환제, 분말, 검, 과립 또는 현탁액으로 제형화될 수 있다. 분말 또는 과립으로서 제형화된다면, 프리바이오틱 제제, 또는 이를 포함하는 조성물은 사쉐에 또는 임의의 적합한 대안적 패키징으로 패키징될 수 있다.
실시예
다음 실시예는 본 발명을 제한하지 않고 설명한다.
실시예 1 - 효모 세포 벽 분획의 프리바이오틱 잠재력의 시험관내 평가
요약 - Lynside® Wall Basic이 보충된 최소 배지에서 장형 (enterotype) (Arumugam M, et al. (2011) Enterotypes of the human gut microbiome. Nature 474(7353):666-666; Costea PI, et al. (2018) Enterotypes in the landscape of gut microbial community composition. Nat Microbiol 3(1):8-16.)의 공여자 계층화에 따라 선택된 대표적인 공여자 세트로부터 6개의 대표적인 마이크로바이옴으로부터 미생물 농축을 연구하였다. 희석된 분변 슬러리는 엄격한 혐기성 배양 기술을 사용하여 Lynside® Wall Basic이 보충된 배지에서 선택적으로 농축하였다. 복합 기질에서 성장할 수 있도록 48시간 동안 배양을 수행하였다. 48시간 농축 후 대사산물 생성 및 마이크로바이옴 조성의 변화를 분석하고 시험된 섬유 기질에 대한 반응을 예측할 수 있는 작용기를 식별하기 위해 비 선택적 농축 및 비-보충된 최소 배지와 비교하였다.
프리바이오틱 제제 - Lynside® Wall Basic
접종원의 준비 - 기재된 3개의 장형 (즉, 루미노코커스 (Ruminococcus), 프레보텔란 (Prevotella) 및 박테로이데스 (Bacteroides))을 대표하는 6명의 공여자로부터의 신선한 분변 샘플을 기질 활용 실험을 위한 접종원으로서 사용하였다. 200 g의 2개의 분취량을 각각의 신선한 분변 샘플에 대해 수집하고, 안정화를 위해 978 μL의 50 mM EDTA 용액을 각각의 분취량에 첨가하고, 분취량은 후속 추출 및 미생물총 프로파일링을 위해 -20℃에서 보관하였다. 접종에 사용된 2개 분취량의 1 mL의 1:10 희석된 분변 슬러리를 수집하고 16000 g에서 5' 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 978 μL의 50 mM EDTA 용액을 보호를 위해 펠릿에 첨가하고 펠릿을 -20℃에서 보관하였다.
기질 농축 - 6명의 공여자의 분변 샘플 희석으로부터 시작하는 실험은 Lynside® Wall Basic 보충과 함께 또는 이의 보충 없이 M2-기반 최소 배지에서 그리고 브로스 M2GSC 배지 (Miyazaki K, Martin J., Marinsek-Logar R, Flint H. (1997) Degradation and Utilization of Xylans by the Rumen Anaerobe Prevotella bryantii (formerly P. ruminicola subsp. brevis) B14. Anaerobe 3(6):373-381)에서 3회 수행하여 54개의 농축을 생성하였다. 농축은 37℃에서 48시간 동안 수행되었다. 각각의 농축으로부터, 1 mL의 배양액은 16000 g에서 5' 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 978 μL의 50 mM EDTA 용액을 펠릿에 안정화를 위해 첨가하고, 펠릿을 -20℃에서 보관하였다.
SCFA 분석 - SCFA 분석은 미생물 탄수화물 대사산물, 즉 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트의 배양 48시간 후 상대적 대사 산물 농도를 평가한 것이다.
Lynside® Wall Basic 보충과 함께 그리고 이의 보충 없이 6개의 분변 샘플 및 상청액의 대사 프로파일은 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 결정되었다. HPLC 분석은 ResexTM ROA-유기 산 H+ (8%) 컬럼 (300 x 7.8 mm)에 연결된 SecurityGuartTM Carbo-H+ 카트리지 (4 x 32 mm)를 사용하여 Hitachi LaChrome 장치 (Merck, Switzerland)로 수행되었다. 분석은 80℃의 온도 및 0.6 mL/min의 유속으로 40 μL의 주입 부피로 수행되었다. 아지드화 나트륨 (0.005%)을 함유하는 H2SO4 (10 mM)을 용리액으로서 사용하였다. 대사산물 농도는 굴절률 (RI) 검출에 의해 정량화되었다. 세 가지 분석물에 대한 검출 한계 (mM)는 다음과 같았다: 아세테이트의 경우 2.06 mM, 프로피오네이트의 경우 1.61 mM 및 부티레이트의 경우 1.55 mM. 세 가지 분석물에 대한 정량 한계 (mM)는 다음과 같았다: 아세테이트의 경우 6.23 mM, 프로피오네이트의 경우 4.89 mM 및 부티레이트의 경우 4.69 mM.
SCFA 분석 결과 - 수득된 SCFA 농도는 아래 표 1에 나타낸다:
[표 1]
Figure pct00001
참고 - 공여자 샘플에 대해 "Spl" (6개 중); 각 공여자에 대한 시험 번호에 대해 "Tr" (3중으로 만듦); Lynside® Wall Basic 보충과 함께 그리고 이의 보충 없이 수행된 시험에 대해 "w/L" 또는 "w/o L"; 아세테이트 농도 (mM)에 대해 "△A"; 프로피오네이트 농도 (mM)에 대해 "△P"; 및 부티레이트 농도 (mM)에 대해 "△B".
DNA 미생물 추출 - 미생물 DNA의 추출은 각각의 공여자의 신선한 분변 샘플로부터 하나의 동결된 분취량, 분변 물질의 1:10 희석의 하나의 펠릿 및 농축 실험에서 수집된 모든 펠릿에 대해 수행되었다. 미생물 DNA는 생산자가 나타낸 바와 같이 오물 (soil)용 FastDNATM SPIN 키트 (MP Biomedicals, USA)를 사용하여 추출되었다. DNA 추출물의 품질은 TAE-1.5% 아가로스 겔에서 확인되었으며, 추출된 샘플의 총 DNA 농도는 Tecan Spark M10 멀티모드 플레이트 리더를 사용하여 dsDNA Qubit 검정에 의해 결정되었다.
16S rRNA 유전자 앰플리콘 서열분석 - 미생물 조성은 V3V4 영역의 16S rRNA 유전자 앰플리콘 서열분석에 의해 결정되었다. 서열분석은 MiSeq v3 쌍 형성-말단 (paired-end) 시약 키트를 사용하여 MiSeq (미국 일리노이주 소재) 플랫폼에서 수행되어 약 450 bp 길이의 대략 7 Mio. 우수한 품질의 스티치 판독치 (샘플 당 평균 17k 판독치, 및 처리 당 평균 51k)를 얻었다.
생물정보 처리 - 원 (raw) 판독치는 트리밍되고 통합되고 품질 필터링되었다. OTU (Operational taxonomic unit) 피킹 (picking)은 노이즈 제거 알고리즘 unoise3을 사용하여 수행되었다 (참조 : Edgar RC (2016) UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv:81257). 수득된 OTU의 제1 분류학적 분류는 HITdb 및 수득된 881 OTU (단독 개체 (singleton) 없음)를 가진 계통수 (phylogenetic tree)를 사용하여 최종 수동 정제와 함께 인간 장관 데이터베이스 (HITdb - Ritari J, Salojarvi J, Lahti L, de Vos WM (2015) Improved taxonomic assignment of human intestinal 16S rRNA sequences by a dedicated reference database. BMC Genomics 16(1):1056)를 사용하여 수행되었다.
결과 - V3V4 가변 영역의 16S rRNA 유전자 앰플리콘의 차세대 서열분석은 분변 샘플의 전체 박테리아 DNA에서 수행되었다.
주요 목표는 연구된 기질인 Lynside® Wall Basic에 의해 선택적으로 촉진 된 계통발생 분류군 (phylogenetic taxa)을 확인하는 것이었다. 따라서, 모든 서열분석된 샘플은 세 가지 실험 그룹으로 분류되었다: (1) 6명의 공여자의 분변 샘플과 각각 1:10 희석을 포함한 공여자 샘플; (2) 시험 기질인 Lynside® Wall Basic이 보충된 최소 배지에서 농축된 모든 샘플로 구성된 Lynside 샘플; 및 (3) 기질 보충제 없이 최소 배지에서 음성 대조군 농축.
모든 샘플을 포함하는 교차-비교에서, 선형 판별 분석 (LDA - Segata N, et al. (2011) Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biol 12(6):R60)을 수행하여 모든 다른 그룹과 비교하여 세 가지 실험 그룹 중 하나에서 유의하게 농축된 계통발생 분류균 (LDA ≥2)을 확인하였다. LDA 스코어는 연구된 기질인 Lynside® Wall Basic으로 보충된 배지에서의 농축이 박테로이데테스 문에 속하는 계통발생 분류군이 최대 네 자릿수 정도까지 유의한 증가를 보여주었다는 것을 나타냈다. Lynside® Wall Basic 보충시 박테로이데테스 문 내의 대표 박테리아의 촉진은 이들의 장형 또는 초기 박테로이데테스 풍부도와 관계없이 모든 공여자에서 관찰되었다.
수득된 LDA 스코어는 아래 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00002
참고 - 계통발생 분류군은 다음과 같다: 박테리아 > 박테로이데테스 > 박테로이디아 > 박테로이달레스 > 박테로이다세애 > 박테로이데스 > 박테로이데스 종
시험 기질인 Lynside® Wall Basic이 보충된 배지에서 6명의 연구된 공여자 모두의 대변 샘플에 존재하는 기질 분해물의 유의하고 선택적인 농축이 나타났다. 대사산물 조성의 경미한 변화는 공여자 간에 관찰되었지만, 장형 의존성 패턴이 관찰되지 않았다. 차세대 서열분석의 결과는 시험 기질인 Lynside® Wall Basic이 보충된 배지에서 명확하게 정의된 계통 발생 분류군인 박테로이데테스의 농축으로 명확한 패턴을 나타내었다. 게다가, 박테로이데테스는 공여자의 초기 미생물 조성과는 독립적으로 최상의 성능을 나타내는데, 이는 기질의 분해를 위해 복잡한 효소 세트가 필요함을 나타낸다. 이러한 결과는 효모 세포 벽 제품인 Lynside® Wall Basic이 인간 장내 미생물총에서 박테로이데스 속의 박테리아와 같은 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진한다는 것을 입증한다.
실시예 2
프리바이오틱 제제 - 2개의 재료, 즉 제제 #1; 및 제제 #2가 시험되었다. 두 재료 모두는 2018년 4월 27일에 출원된 프랑스 출원 FR　3080521　A1 (1853748) 및 이의 관련 PCT 출원 WO　2019/207111　A1에 개시된 방법에 따라, 파괴 처리에 이어서 리보뉴클레아제 및 글루카나제로 처리한 후 수득된 효모 추출물이 없는 가용성 하위-분획이다. 두 재료 모두는 건조 물질 질량 기준으로 34.0 중량%의 총 글루칸 (31.0 중량%의 β-글루칸 포함) 및 31.0 중량%의 만난을 포함한다. 이들은 입자 크기가 상이하다.
영양 배지 - 영양 배지는 결장에 존재하는 기본 영양소 (예를 들어, 뮤신과 같은 숙주-유래된 글리칸)를 포함하는 당-결핍된 영양 배지이다.
용량 - 프리바이오틱 제제는 5 g/L의 최적 용량으로 블랭크 (음성 대조군)에 대해 시험되었다.
접종원 - 결장 미생물총의 공급원으로서, 신선하게 준비된 인간 배설물 접종원이 추가되었다.
배양 - 진탕 (90 rpm) 및 혐기성 조건하에 37℃에서 48시간 동안 배양을 수행하였다. 이 절차로 결장 미생물총의 대사 및 군집 구성 프로파일에 대한 시험 성분의 특정 효과를 평가할 수 있었다.
측정된 파라미터 - 상이한 양태, 즉 전반적인 미생물 발효 (pH 및 가스 생성), 박테리아 대사산물의 생성시 키네틱을 비교하기 위한 미생물 활동의 변화 (단쇄 지방산 또는 SCFA, 및 락테이트 분석), 및 미생물 군집 구성의 변화 (표적화된 qPCR 및 16S-기반 일루미나 서열분석)가 모니터링되었다.
pH - 실험 동안 산성화 정도는 잠재적인 프리바이오틱 (발효)의 박테리아 신진대사의 강도에 대한 척도이다. 배양 시작 후 0, 3, 6, 24 및 48시간 째에 배양의 pH를 결정하여 상이한 섬유 블렌드의 발효 속도를 대략적으로 나타낸다.
가스 생성 - 결장 배양은 폐쇄된 배양 시스템에서 수행되었다. 이것으로 압력계로 측정될 수 있는 헤드스페이스의 가스 축적을 평가할 수 있었다. 가스 생성은 미생물 활동의 척도이며, 따라서 잠재적인 프리바이오틱 기질의 발효 속도의 척도이다. H2와 CO2는 미생물 발효시 생성되는 첫 번째 가스이고; 이들은 이후 CH4 생성을 위한 기질로 사용되어 가스 부피를 감소시킬 수 있다. H2는 또한 설페이트를, 단백질분해 발효로부터 발생되는 H2S로 환원시키는데 사용될 수 있다. 그 결과, N2, O2, CO2, H2 및 CH4는 장내 가스 부피의 99%를 구성한다. 나머지 1%는 NH3, H2S, 휘발성 아미노산 및 단쇄 지방산으로 이루어진다. 배양 동안의 가스 생성은 배양 시작 후 0, 3, 6, 24 및 48시간 째에 결정되었다.
SCFA 분석 - SCFA 분석은 미생물 탄수화물 신진대사 (아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트)에 대한 평가이며, 정상적인 GI 미생물총에 대한 전형적인 발효 패턴과 비교될 수 있다. SCFA 분석을 위한 샘플은 배양 0, 3, 6, 24 및 48시간 후에 분석되었다.
락테이트 분석 - 인간의 장은 락테이트-생성 및 락테이트-사용 박테리아 둘 다를 보유한다. 락테이트는 락트산 박테리아에 의해 생성되어 환경의 pH를 감소시켜 항균제로도 작용한다. 양성자화된 락트산은 미생물 세포에 침투하고 그 후 세포 내에서 양성자를 해리 및 방출시켜 산성화 및 미생물 세포사를 초래한다. 또한 다른 미생물에 의해 특히 부티레이트로 빠르게 전환될 수 있다. 락테이트 분석을 위한 샘플은 배양 0, 3, 6, 24 및 48시간 후에 분석되었다.
표적화된 qPCR - 정량적 PCR (qPCR)은 증폭을 통한 특정 박테리아 서열 (16S rRNA 유전자)의 정량화를 기반으로 하는 분자 기술이다. 현재 프로젝트의 경우, 비피도박테리아 및 락토바실러스의 정량화는 배양 시작시, 24시간 후 및 48시간 후 수행되었다.
16S-기반 일루미나 서열분석 - 일루미나 서열분석 방법은 PCR-기반이기 때문에, 미생물 서열은 포화 수준에 도달할 때까지 증폭된다. 따라서, 상이한 계통발생 수준 (미생물 문, 과 및 속 또는 OTU 수준)에서 표현된 결과는 각 샘플 내에서 서열의 총량에 대한 비례 값으로서 표시되어 반-정량적 결과를 제공한다. 적용된 방법론은 16S rDNA의 2개의 초가변 영역 (V3-V4)에 걸쳐 있는 프라이머를 포함한다. 2 x 250 bp의 서열분석인 쌍-말단 (pair-end) 서열분석 접근법을 사용하면 424 bp 앰플리콘이 생성된다. 그러한 단편은 분류학적으로 덜 유익한 작은 단편에 비해 분류학적으로 더 유용하다. 배양 시작시와 48시간의 말미에 샘플을 채취하였다.
결과 - 다음 결과를 얻었다:
pH 감소 - pH를 모니터링하였다. 얻은 pH 측정치는 아래 표 3에 나타낸다:
[표 3]
Figure pct00003
초기 pH 감소 (3시간 및 6시간 후)는 두 생성물 간 비슷했으며, 블랭크 배양보다 강했다.
생성물의 pH 감소는 주로 0 내지 24시간 사이에 발생했고, 블랭크보다 훨씬 강했다. 24시간 발효 후, 제제 #2에 비해 제제 #1에 대해 약간 더 강한 pH 감소가 있었다.
제제 #1을 사용한 배양 동안 24 내지 48시간 간격 동안 pH는 상대적으로 일정하게 유지되었고, 제제 #2를 사용한 배양에서 약간 더 감소했다.
블랭크에 비해 프리바이오틱 제제를 사용한 더 강한 pH의 감소는 두 시험 생성물 모두의 높은 발효성을 일관되게 보여주었다.
가스 생성 - 5 g/L의 시험된 프리바이오틱 제제 및 음성 대조군의 발효시 상이한 시간 간격에서 평균 가스 생성 (kPa)을 모니터링하였다. 얻은 측정치는 아래 표 4에 나타낸다:
[표 4]
Figure pct00004
초기 가스 생성 (0 내지 3시간 및 3 내지 6시간)은 블랭크보다 제제 # 1 및 제제 # 2에서 상당히 높았다.
가스 생성은 6 내지 24시간의 기간 내에 가장 높았다. 블랭크와 비교하여 두 생성물 모두 높은 발효 속도를 시사했다.
두 생성물 모두는 24 내지 48시간 간격 동안 유사하지만 약간의 추가 가스 생성이 증가되었는데 이는 블랭크보다 약간 더 낮았다.
블랭크에 비해 프리바이오틱 제제를 사용한 더 높은 수준의 가스 생성은 두 시험 생성물 모두의 높은 발효성을 일관되게 보여주었다.
SCFA 생성 - 5 g/L의 시험된 프리바이오틱 제제 및 음성 대조군의 발효시 상이한 시간 간격에서 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트 및 총 SCFA (mM)의 평균 생성을 모니터링하였다.
총 SCFA 생성 (mM)에 대해 얻어진 측정치는 아래 표 5에 나타낸다:
[표 5]
Figure pct00005
두 프리바이오틱 제제 모두는 총 SCFA 수준을 거의 70 mM까지 강력하고 유사하게 증가시켜 대조군에 비해 SCFA 생산이 2배가 되었다.
락테이트 생성 (mM)에 대해 얻어진 측정치는 아래 표 6에 나타낸다:
[표 6]
Figure pct00006
두 프리바이오틱 제제 모두는 음성 대조군에 비해 아세테이트 수준으로 2배가 되어 대략 거의 20 mM로 증가했다.
프로피오네이트 생성 (mM)에 대해 얻어진 측정치는 아래 표 7에 나타낸다:
[표 7]
Figure pct00007
아세테이트와 마찬가지로, 프로피오네이트는 광범위한 장내 미생물에 의해 생성될 수 있으며, 이때 가장 풍부한 프로피오네이트 생성자는 박테로이데스 종 (문 = 박테로이데테스) 및 아케만시아 무치니필라 (Akkermansia muciniphila) (문 = 베루코미크로비아 (Verrucomicrobia))이다. 후자는 뮤신-분해 미생물이기 때문에, 관찰된 프로피오네이트 생성은 아마도 박테로이데스 종에 기인할 수 있다. 다시, 두 생성물 모두 최종 프로피오네이트 수준이 음성 대조군에 비해 2배를 초과했다.
부티레이트 생성 (mM)에 대해 얻어진 측정치는 아래 표 8에 나타낸다:
[표 8]
Figure pct00008
부티레이트 생성은 두 생성물 모두를 투여할 때 강하게 증가했다.
대조적으로, 두 프리바이오틱 제제 모두는 대조군에 비해 총 SCFA 생산이 2배가 되었다. 이러한 증가는 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트의 생성 증가와 관련이 있고 이는 대조군에 비해 세 가지 모두 거의 2배가 되었다. pH 및 가스 생성의 결과와 일치하여, 첫 24시간 동안 증가가 가장 강했으며 이는 두 생성물 모두에서 높은 발효 속도가 유도되었음을 나타낸다.
락테이트 생성 - 5 g/L의 시험된 프리바이오틱 제제 및 음성 대조군의 발효시 상이한 시간 간격에서 평균 락테이트 생성 (mM)을 모니터링하였다.
락테이트 생성 (mg/L)에 대해 얻어진 측정치는 아래 표 9에 나타낸다:
[표 9]
Figure pct00009
두 프리바이오틱 제제 모두는 대조군에 비해 초기 락테이트 생성 (0 내지 3시간)이 높았다. 배양 3시간 이후부터 락테이트가 소비되었고 3 내지 6시간 및 24 내지 48시간의 기간 동안 약간의 소비와 6 내지 24시간의 기간 동안 가장 높은 소비가 있었다. 6 내지 24시간의 기간 내에 락테이트 소비는 주로 이 기간에 발생한 높은 부티레이트 생성과 잘 일치하므로, 이는 락테이트가 부티레이트의 전구체로 작용했을 수 있음을 나타낸다.
비피도박테리아 수준 - 5 g/L의 시험된 프리바이오틱 제제 및 음성 대조군의 발효시 상이한 시점에서 비피도박테리아의 수준 (16S rRNA 유전자 카피/mL로 표현된 평균 절대 비피도박테리움 수)을 모니터링하였다.
16S rRNA 유전자 카피/mL로 표현되는 평균 절대 비피도박테리움 수는 아래 표 10에 나타낸다:
[표 10]
Figure pct00010
BDL: 검출 한계 미만
배양의 시작시, 비피도박테리움 수준은 검출 한계 미만이었다. 배양 동안, 비피도박테리아는 블랭크와 유사한 방식으로 농축되었다. 이와 같이, 비피도박테리아에 대한 치료의 촉진 효과는 관찰되지 않았다.
락토바실러스 수준 - 락토바실러스의 수준 (16S rRNA 유전자 카피/mL로 표현된 평균 절대 락토바실러스 수)은 5 g/L의 시험된 프리바이오틱 제제 및 음성 대조군의 발효시 상이한 시점에서 모니터링하였다.
16S rRNA 유전자 카피/mL로 표현되는 평균 절대 락토바실러스 수는 아래 표 11에 나타낸다:
[표 11]
Figure pct00011
프리바이오틱 제제는 블랭크에 비해 락토바실러스 수준을 촉진하지 않았다.
16S-표적화된 일루미나 서열분석 (문 (phylum) 수준) - 블랭크에 대한 프리바이오틱 제제의 첨가시 원래 접종원 및 결장 배양에서 상이한 문의 상대적인 풍부도 (%)를 결정하였다.
상이한 문의 상대적인 풍부도는 아래 표 12에 나타낸다:
[표 12]
Figure pct00012
접종원에 원래 존재했던 모든 주요 문 (phyla)은 시험관내 배양 동안에도 보존되었다. 두 프리바이오틱 제제 모두는 두 원래 접종원 모두와 비교했을 때뿐만 아니라 블랭크와 비교했을 때 48시간의 배양 후 박테로이데테스 수준이 풍부해졌다. 많은 프로피오네이트-생성 종을 포함하는 박테로이데테스의 비율은 제제 #2 (69.7%)에 비해 제제 #1 (78.5%)을 사용한 배양에서 더 높았고 이는 이 생성물의 발효와 관련된 약간 더 높은 프로피오네이트 농도와 일치했다. 박테로이데테스의 강력한 증가로 인해, 피르미쿠테스의 상대적인 풍부도는 시험 생성물을 사용한 배양 동안 현저히 감소되었다.
16S-표적화된 일루미나 서열분석 (과 및 OTU) - 원래 접종원 및 블랭크에 대한 프리바이오틱 제제의 첨가시 결장 배양에서 박테로이데테스 문/박테로이다세애 과 및 피르미쿠테스 문/에리시펠로트리카세애 과 (Erysipelotrichaceae family)의 박테리아의 상대적인 풍부도 (%)가 결정되었다.
박테로이데테스 문/박테로이다세애 과의 박테리아 및 피르미쿠테스 문/에리시펠로트리카세애 과의 박테리아의 상대적인 풍부도는 아래 표 13에 나타낸다:
[표 13]
Figure pct00013
접종원에서, 박테로이데테스 문의 박테리아의 나머지 비율은 본질적으로 포르피로모나다세애 (Porphyromonadaceae) 과의 박테리아 (1.3%) 및 리케넬라세애 (Rikenellaceae) 과의 박테리아 (0.8%)로 구성된다.
이는 블랭크에서보다 프리바이오틱 제제에 의한 박테로이다세애 및 에리시펠로트리카세애의 보다 강력한 농축을 나타낸다.
박테로이데테스 문/박테로이다세애 과의 박테리아 중에서, 박테리오데스 오바투스 종의 상대적인 풍부도가 결정되었다. 마찬가지로, 피르미쿠테스 문/에리시펠로트리카세애 과의 박테리아 중에서, 클로스트리듐 (Clostridium) XVIII (OTU5) 종의 상대적인 풍부도가 결정되었다. 데이터는 아래 표 14에 나타낸다:
[표 14]
Figure pct00014
박테로이다세애 과의 박테리아 중에서, 프리바이오틱 제제는 블랭크에 비해 박테리오데스 오바투스에서 매우 강력한 농축을 유도했다. 에리시펠로트리카세애 과의 박테리아 중에서, 프리바이오틱 제제는 블랭크에 비해 클로스트리듐 XVIII의 매우 강력한 농축을 유도했다.
결론 - 시험된 프리바이오틱 제제의 잠재력은 단기 결장 배양에서 평가되었고 음성 대조군, 즉 섬유질 없는 배양과 비교되었다. 여러 평가변수가 두 제제 모두의 큰 프리바이오틱 잠재력을 입증하여 다음의 결과가 발생되었다: (1) pH 감소 및 가스 생성의 증가; (2) 건강-증진 SCFA 아세테이트, 프로피오네이트 및 부티레이트의 생성 증가; (3) 초기 락테이트 생성의 촉진에 이어서 소비, 아마도 부티레이트 농도를 증가시킨다. 또한, 비피도박테리아와 락토바실러스에 대한 두 프리바이오틱 제제 모두의 촉진 효과는 관찰되지 않았다. 또한, 박테로이데테스, 특히 박테로이데스 오바투스에 대한 프리바이오틱 제제의 촉진 효과를 관찰하여 아세테이트 및 프로피오네이트 생성에 대한 이들의 촉진 효과를 설명할 수 있었다.

Claims (16)

  1. 포유류 장내 미생물총 (gut microbiota)에서 박테로이데테스 문 (Bacteroidetes phylum)의 박테리아의 성장을 촉진하기 (stimulating) 위한 프리바이오틱 제제로서 사용하기 위한, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물로서, 상기 효모 생성물은 효모 세포의 벽 또는 이의 분획을 포함하는, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 효모는 속 사카로미세스 (Saccharomyces,), 피키아 (Pichia), 칸디다 (Candida), 클루베로마이세스 (Kluyveromyces), 야로이야 (Yarrowia) 및/또는 위케호모마이세스 (Wickehomomyces)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 바람직하게는 상기 효모는 종 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 쟈디니 (Pichia jadinii), 클루베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고; 더욱 바람직하게는 상기 효모는 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)인, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 박테로이데테스 문의 박테리아는 박테로이디아 강 (Bacteroidia class)의 박테리아이고; 바람직하게는 박테로이달레스 목 (Bacteroidales order)의 박테리아; 더욱 바람직하게는 박테로이다세애 과 (Bacteroidaceae family)의 박테리아; 더욱 더 바람직하게는 박테로이데스 속 (Bacteroides genus)의 박테리아; 가장 바람직하게는 박테로이데스 오바투스 종 (Bacteroides ovatus spp)인, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 생성물은 상기 포유동물 장내 미생물총에서 상기 박테로이데테스 문의 박테리아 대 피르미쿠테스 문 (Firmicutes phylum)의 박테리아의 비를 증가시키는, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프리바이오틱 제제는 비활성화된 전체 효모, 효모 세포 벽, 효모 세포 벽의 분획, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 생성물은 파괴 처리 (disruption treatment)를 사용하여 수득된 분획이고; 바람직하게는 상기 효모 생성물은 파괴 처리를 사용하여 수득된 효모 세포의 불용성 부분인, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 생성물은 전체 효모 세포를 파괴 처리에 적용하고, 불용성 분획으로부터 가용성 분획을 분리한 다음, 가용성 하위-분획으로부터 단백질이 풍부한 불용성 하위-분획을 분리하기 전에 상기 불용성 분획을 리보뉴클레아제 및 글루카나제로 처리함으로써 수득된 가용성 하위-분획인, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 생성물은 전체 효모 세포를 파괴 처리에 적용한 다음, 가용성 하위-분획으로부터 단백질이 풍부한 불용성 하위-분획을 분리하기 전에 상기 수득된 혼합물을 리보뉴클레아제 및 글루카나제로 처리함으로써 수득된 가용성 분획인, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 생성물은 건조 물질 기준으로 15 내지 50 질량%의 β-글루칸 함량 (글루코스의 등가 질량으로 표시됨); 및/또는 건조 물질 기준으로 10 내지 40 질량%의 만난 함량 (만노스의 등가 질량으로 표시됨)을 갖는, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 생성물은 건조 질량 함량이 적어도 90%이고, 15 내지 50%의 β-글루칸 함량 (글루코스의 등가 질량으로 표시됨), 10 내지 40%의 만난 함량 (만노스의 등가 질량으로 표시됨), 5 내지 15%의 추가 단백질, 5 내지 15%의 유리 뉴클레오티드, 2 내지 8%의 유리 아미노산 및 1　kDalton 이하의 펩타이드, 2% 이하의 올리고사카라이드, 6 내지 11%의 회분 및 1 내지 3%의 지방 성분을 포함하고, 건조 물질 함량이 적어도 90%인, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 생성물은 비피도박테리움 속 (Bifidobacterium genus)의 박테리아 및/또는 락토바실러스 속 (Lactobacillus genus)의 박테리아의 성장을 촉진하지 않는, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물은 경구 투여되고; 바람직하게는 상기 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물은 500 mg 내지 15 g의 1일 용량으로 경구 투여되고; 바람직하게는 상기 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물은 최대 10회 복용으로 500 mg 내지 5 g의 1일 용량으로 경구 투여되는, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 검, 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립 또는 현탁액으로서 제형화되는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 설사 및 과민성 대장 증후군과 같은 장내 병리를 예방하거나 제한하고, 면역을 촉진하고, 혈당증 및/또는 지질혈증을 조절하고, 비만과 관련된 대사 장애를 치료하거나 제한하는데 사용하기 위한, 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물.
  15. 포유류 장내 미생물총에서 박테로이데테스 문의 박테리아의 성장을 촉진하기 위한 프리바이오틱 제제로서 효모 생성물 또는 이를 포함하는 조성물의 비치료적 용도로서, 상기 효모 생성물은 상기 효모 세포의 벽 또는 이의 분획을 포함하는, 비치료적 용도.
  16. 제13항에 따른 조성물의 비치료적 용도로서, 상기 조성물은 식료품 (foodstuff) 또는 식품 보충제 (food supplement)이고; 바람직하게는 유제품, 과일-기반 제품, 음료, 고형 식료품 또는 식품 보충제인, 비치료적 용도.
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