KR20210112337A - 파브리병의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20210112337A
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마샬 더블유. 휴스턴
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상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 α-Gal A 단백질을 발현하고 파브리병 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 억제 또는 치료하는데 사용하기 위한 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진을 포함하는 발현 작제물을 제공한다.

Description

파브리병의 치료를 위한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 1월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 62/788,439의 이익을 주장하며, 그 개시내용은 그의 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그의 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2019년 12월 3일에 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 8325018840SL.txt이며, 크기는 10,636 바이트이다.
기술 분야
본 개시내용은 유전자 요법에 의한 파브리병의 예방 및/또는 치료 분야에 있다.
α-갈락토시다제 A(GLA) 유전자는 리소좀 가수분해효소 효소인 α-갈락토시다제 A(α-Gal A)를 암호화한다. α-갈락토시다제는 올리고당과 다당류의 말단 α-갈락토실 모이어티의 가수분해를 촉매하는 효소이다.
파브리병은 GLA 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 X-연관 리소좀 저장 질환이다. α-Gal A 활성이 부족하면 1차 기질인 글로보트리아오실세라마이드(globotriaosylceramide)(Gb3)와 그의 탈아세틸화된 가용성 형태인 글로보트리아오실스핀고신(globotriaosylsphingosine)(리소-Gb3)이 점진적이고 체계적으로 축적된다. 이러한 기질의 장기 축적은 신장 질환, 피부 질환, 심장 질환, 각막 이영양증(예를 들어, 각막 및 렌즈형 혼탁) 및/또는 뇌혈관 질환으로 이어지며, 기대 수명이 감소한다. 돌연변이 및 잔류 α-Gal A 효소 수준에 따라, 질환은 아동기/청소년기의 고전적인 조기-발병 파브리병으로 나타나거나, 나중에 약화된(성인) 형태로 나타난다. 고전적인 파브리병은 잔류 효소 활성이 5% 미만일 때 발생하며(Arends 등 2017), 전형적으로 남성에서 발생한다. 초기 증상에는 주기적 고착감각, 혈관각화종, 각막 및 렌즈형 혼탁, 진행성 신부전, 심장 질환 및 뇌혈관 이벤트가 포함될 수 있다. 약화된 또는 성인 형태의 파브리병은 일반적으로 하나의 기관계, 일반적으로 심장 또는 신장에만 관련된다.
고전적 및 성인 형태 모두에서, 현재 치료 표준은 재조합 α-Gal A, FABRAZYME®(아갈시다제 베타 또는 등가물)를 사용하는 효소 대체 요법(ERT), 또는 돌연변이가 치료가능한 환자에게만 제공되는 샤페론 요법이다. 재조합 α-Gal A를 혈류에 주입하면 만노스-6-포스페이트 수용체-매개 흡수(교차-교정)를 통해 2차 조직으로 이동할 수 있다. 그러나, ERT에 사용되는 재조합 α-Gal A의 짧은 반감기(혈장에서 약 1시간)(Clarke 등 2007)는 주입 수명을 필요로 하며, 상당수의 환자에서 주입-관련 반응의 위험과 관련이 있으며(Clarke 등 2007), 그중 일부는 중증이다. 또한, 상당한 비율의 환자가 결국 재조합 효소에 대한 항체를 생성하여, ERT 효소의 활성에 영향을 미칠 수 있으며, 결과적으로 신장과 같은 기관에서 모든 기질을 제거하지 못할 수 있다(Linthorst 등 2004).
반감기가 더 긴 재조합 α-Gal A 제품이 개발되고 있으며, 이는 덜 자주 투여될 수 있다. 그러나 이들은 항체 중화로 인해 주입-관련 반응 및/또는 비활성의 관련 위험이 있는 장기 투여를 여전히 필요로 하며, α-Gal A 수준은 시간이 지남에 따라 여전히 크게 변동할 것으로 예상된다.
따라서, 파브리병에서 충족되지 않은 요구를 해결하는 대체 요법이 필요하다.
발명의 내용
세포에서 적어도 하나의 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질을 발현시키는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시형태에서, 방법은 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 α-Gal A 단백질이 세포에서 발현되도록 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진을 포함하는 발현 작제물을 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물은 야생형 GLA 서열 또는 코돈 최적화된 GLA 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물은 인핸서, 프로모터, 인트론, 신호 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진은 신호 펩타이드와 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 사이에 위치한다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물은 서열번호: 9의 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 파브리병을 앓고있는 대상체에 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 남성 대상체에 있다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물은 약제학적으로 허용되는 담체로 투여된다.
일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 CaCl2, MgCl2, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P188을 함유하는 인산염 완충 식염수를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물 서열은 표 1에 제시된 서열을 포함하고, 발현 작제물은 AAV 바이러스 벡터에 의해 세포로 전달된다.
일부 실시형태에서, AAV 바이러스 벡터 혈청형은 AAV2/6이다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물은 킬로그램 당 약 5.0E+12 내지 1.0E+14 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물은 대상체의 간에 투여된다. 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 정맥 내 주입에 의해 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 발현 작제물의 단 1회 용량이 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 발현 작제물의 투여 전 및/또는 투여 동안 면역억제제를 투여받는다. 일부 실시형태에서 면역억제제는 프레드니손을 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질의 발현은 적어도 3개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 지속된다.
일부 실시형태에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 치료되지 않은 대상체에 비해 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 2배 내지 약 9배 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 치료되지 않은 대상체에 비해 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 80% 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 혈장, 간, 심장, 신장 또는 비장 중 하나 이상에서 글리코스핑고지질의 양을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, HEK293 세포 시스템에서 제조된 발현 작제물은 Sf9 세포 시스템에서 제조된 발현 작제물을 투여받은 대상체에서 GLA 수준과 비교하여 대상체에서 약 21배 더 높은 GLA 수준을 제공한다.
일부 실시형태에서, 대상체에서 α-Gal A 단백질 활성은 생리적 정상/야생형보다 약 100배 내지 1,500배 더 높다.
일부 실시형태에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 신장, 간 및 심장에서 활성이다.
일부 실시형태에서, GLA 트랜스진은 염색체 외로 유지되고, 세포의 게놈내로 통합되지 않는다.
일부 실시형태에서, 대상체의 간 세포에서 내인성 알부민 유전자를 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제는 트랜스진이 알부민 유전자 내로 통합되고 그로부터 발현되도록 투여된다.
본원에 기재된 방법에 의해 제조된 외인성 GLA 트랜스진을 포함하는 유전자 변형된 세포가 제시된다. 일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포 또는 전구체 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 간 또는 근육 세포이다. 일부 실시형태에서, GLA 트랜스진은 염색체 외로 유지되고 세포의 게놈내로 통합되지 않는다. 일부 실시형태에서, GLA 트랜스진은 세포의 게놈으로 통합된다.
파브리병 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 억제 또는 치료하는 방법이 또한 제시된다. 방법은 발현 작제물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있으며, 발현 작제물은 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진을 포함한다.
일부 실시형태에서, 증상은 정상 또는 기준선보다 높은 Gb3 수준, 정상 또는 기준선보다 높은 리소(lyso)-Gb3 수준, 신장 질환, 심장 질환, 말단감각이상, 혈관각화종, 위장관 통증, 각막 및 수정체 혼탁, 또는 뇌 혈관 질환 중 하나 이상을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 기준선은 임의의 시작 측정, 즉 특정 치료가 투여되기 전에 취해진 측정을 의미할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 남성이고, 약 5% 미만의 α-Gal A 효소 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 발현 작제물은 야생형 GLA 서열 또는 코돈 최적화된 GLA 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 작제물은 인핸서, 프로모터, 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 여기서 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진은 신호 펩타이드와 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 사이에 위치한다. 일부 실시형태에서, 발현 작제물은 약제학적으로 허용되는 담체로 투여된다. 일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 CaCl2, MgCl2, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P188을 함유하는 인산염 완충 식염수를 포함한다.
다른 실시형태에서, 발현 작제물 서열은 표 1에 나타낸 서열을 포함하고, 발현 작제물은 AAV 바이러스 벡터에 의해 대상체의 세포로 전달된다. 일부 실시형태에서, AAV 바이러스 벡터 혈청형은 AAV2/6이다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물은 킬로그램 당 약 5.0E+12 내지 1.0E+14 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 발현 작제물은 대상체의 간에 투여된다. 일부 실시형태에서, 발현 벡터는 정맥 내 주입에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 발현 작제물의 단 1회 용량이 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 발현 작제물의 투여 전 및/또는 투여 동안 면역억제제를 투여받는다. 일부 실시형태에서, 면역억제제는 프레드니손을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질의 발현은 적어도 3개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 지속된다.
다른 실시형태에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 치료되지 않은 대상체에 비해 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 3배 내지 약 9배 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 치료되지 않은 대상체에 비해 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 80% 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 혈장, 간, 심장, 신장 또는 비장 중 하나 이상에서 글리코스핑고지질의 양을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 발현 작제물은 HEK293 세포 시스템에서 제조되고, 여기서 대상체의 GLA 수준은 Sf9 세포 시스템에서 제조된 발현 작제물을 투여받은 대상체의 GLA 수준과 비교하여 21배 더 높다.
일부 실시형태에서, 대상체에서 α-Gal A 단백질 활성은 정상/야생형보다 약 100배 내지 1,500배 더 높다.
일부 실시형태에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 신장, 간 및 심장에서 활성이다.
일부 실시형태에서, GLA 트랜스진은 염색체 외로 유지되고 대상체 세포의 게놈으로 통합되지 않는다.
일부 실시형태에서, 방법은 트랜스진이 알부민 유전자로 통합되고 그로부터 발현되도록 대상체의 간 세포에서 내인성 알부민 유전자를 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제를 투여하는 단계를 포함한다.
본원에는 발현 작제물, 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열을 포함하는 발현 작제물, 및 파브리병 치료를 위한 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진을 포함하는 조성물이 설명된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 제56항의 조성물로서, 약제학적으로 허용되는 담체는 CaCl2, MgCl2, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P188을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 야생형 GLA 서열 또는 코돈 최적화된 GLA 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 인핸서, 프로모터, 인트론, 신호 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 중 하나 이상을 포함하며, 여기서 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진은 신호 펩타이드와 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 사이에 위치한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 표 1에 제시된 서열을 포함하고, 발현 작제물은 AAV 바이러스 벡터에 의해 세포로 전달된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 AAV 바이러스 벡터 혈청형, AAV2/6을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 대상체 킬로그램 당 약 5.0E+12 내지 1.0E+14 벡터 게놈(vg/kg)을 포함하는 발현 작제물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 서열번호: 9의 서열을 포함하는 발현 작제물을 포함한다.
파브리병 치료를 위한 α-Gal A 단백질의 생산 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 따라 단리된 세포에서 α-Gal A 단백질을 발현하는 단계, 및 세포에 의해 생성된 α-Gal A 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 돌연변이된 WRPE 서열, 선택적으로 mut6 WPRE 서열 및 GLA 트랜스진을 포함하는 전달 벡터가 제시된다.
일부 실시형태에서, 전달 벡터는 바이러스 벡터 또는 지질 나노입자(LNP)이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV2/6을 포함하고, 여기서 바이러스 벡터는 발현 작제물을 세포의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%에 전달한다.
파브리병의 치료를 위한 발현 작제물, AAV 벡터 및/또는 선행 청구항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 세포의 용도가 또한 본원에 제시된다. 일부 실시형태에서, 인핸서는 서열번호: 2를 포함하고, 프로모터는 서열번호: 3을 포함하고, 인트론은 서열번호: 4를 포함하고, GLA 트랜스진은 서열번호: 5를 포함하고, 돌연변이된 WPRE 서열은 서열번호: 6을 포함하고, 폴리아데닐화 신호는 서열번호: 7을 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 서열번호: 2의 인핸서, 서열번호: 3의 프로모터, 서열번호: 4의 인트론, 서열번호: 5의 GLA 트랜스진, 서열번호: 6의 돌연변이된 WPRE 서열, 및 서열번호: 7의 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
도 1a는 변이체 #4로 지정된 GLA 유전자를 암호화하는 작제물을 도시하는 개략도를 보여준다. 변이체 #4 작제물은 인핸서(예를 들어, APOE); 프로모터(예를 들어, hAAT); 인트론 서열(예를 들어, HBB-IGG); 신호 펩타이드(예를 들어, GLA); GLA 암호화 서열(예를 들어, "GLAco"); 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, bGH)를 포함한다.
도 1b는 변이체 #21로 지정된 GLA 유전자를 암호화하는 작제물을 도시하는 개략도를 보여주며, 이는 돌연변이된 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사후 조절 요소(WPRE)("mut 6" 또는 "WPREmut6 v1"로도 알려짐)를 포함한다. 변이체 #21 작제물은 또한 인핸서(예를 들어, APOE); 프로모터(예를 들어, hAAT); 인트론 서열(예를 들어, HBB-IGG); 신호 펩타이드(예를 들어, GLA); GLA 암호화 서열(예를 들어, "GLAco"); 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, bGH)를 포함한다.
도 2는 85일에 걸쳐 나타난 바와 같이 변이체 #4 작제물 또는 대조군 동물로 처리된 표시된 그룹 2 내지 4의 개별 GLA 녹아웃(GLAKO) 마우스에서의 혈장 GLA 활성을 나타내는 그래프를 보여준다. 그룹 1은 제형 완충액("제형")으로 처리되었다. 그룹 2는 2.0E+12 vg/kg 용량의 작제물로 처리되었고, 그룹 3은 5.0E+12 vg/kg 용량의 작제물로 처리되었으며, 그룹 4는 5.0E+13 vg/kg 용량의 작제물로 처리되었다.
도 3은 85일에 걸쳐 발현 작제물(변이체 #4 발현 작제물)로 처리된 표시된 그룹 2 내지 4의 GLAKO 마우스 또는 대조군 동물에서의 혈장 GLA 활성을 나타내는 그래프이다. 그룹 1에는 제형 완충액("제형")이 투여되었다. 그룹 2는 2.0E+12 vg/kg 용량의 작제물로 처리되었고, 그룹 3은 5.0E+12 vg/kg 용량의 작제물로 처리되었으며, 그룹 4는 5.0E+13 vg/kg용량의 작제물로 처리되었다.
도 4a는 변이체 #4 발현 작제물로 처리된 지정된 동물 그룹 또는 대조군 동물의 간 용해물에서 α-Gal A 활성을 보여주는 그래프이다. 그룹 2는 2.0E+12 vg/kg을 투여받고, 그룹 3은 5.0E+12 vg/kg을 투여받고, 그룹 4는 5.0E+13 vg/kg을 투여받았다.
도 4b는 발현 작제물(변이체 #4 발현 작제물)로 처리된 표시된 동물 그룹 또는 대조군 동물의 신장 용해물에서 α-Gal A 활성을 보여주는 그래프이다. 그룹 2는 2.0E+12 vg/kg 용량의 작제물로 처리되었고, 그룹 3은 5.0E+12 vg/kg 용량의 작제물로 처리되었으며, 그룹 4는 5.0E+13 vg/kg 용량의 작제물로 처리되었다.
도 4c는 발현 작제물(변이체 #4 발현 작제물)로 처리된 표시된 동물 그룹 또는 대조군 동물의 심장 용해물에서 α-Gal A 활성을 보여주는 그래프이다. 그룹 2는 2.0E+12 vg/kg을 투여받고, 그룹 3은 5.0E+12 vg/kg을 투여받았으며, 그룹 4는 5.0E+13 vg/kg을 투여받았다.
도 5a는 처리 후 91일째에 발현 작제물(변이체 #4 발현 작제물)로 처리된 GLAKO 마우스의 표시된 그룹 또는 대조군 동물에서 혈장, 비장, 간, 심장 및 신장에서의 리소-Gb3 기질 농도를 보여주는 그래프이다. 각 조직에 대해, 왼쪽에서 오른쪽으로의 바아는 제형 완충액을 받은 그룹 1 동물, 2.0E+12 vg/kg의 용량으로 작제물을 받은 그룹 2(10마리 동물), 5.0E+12 vg/kg의 용량으로 작제물을 받은 그룹 3(9마리 동물); 및 5.0E+13 vg/kg의 용량으로 작제물을 받은 그룹 4(20마리 동물)를 보여준다. 도시된 바와 같이, 리소-Gb3 기질 농도는 시험된 모든 조직에서 대조군 그룹 1에 비해 그룹 2 내지 4에서 더 낮다. 또한, 점선으로 표시되는 것은 정량화의 하한(LLOQ)이다.
도 5b는 발현 작제물(변이체 #4)로 처리된 동물들의 표시된 그룹 또는 대조군 동물에서 혈장, 비장, 간, 심장 및 신장에서의 Gb3 수준을 보여주는 그래프이다. 각 조직에 대해, 왼쪽에서 오른쪽으로의 바아는 제형 완충액을 받은 그룹 1 동물, 2.0E+12 vg/kg의 용량으로 작제물을 받은 그룹 2(10마리 동물), 5.0E+12 vg/kg 용량으로 작제물을 받은 그룹 3(9마리 동물); 및 5.0E+13 vg/kg의 용량으로 작제물을 받은 그룹 4(20마리 동물)를 보여준다. 도시된 바와 같이, Gb3 기질 농도는 시험된 모든 조직에서 대조군 그룹 1에 비해 그룹 2 내지 4에서 더 낮다. 또한, 점선으로 표시되는 것은 정량화의 하한(LLOQ)이다.
도 6a는 변이체 #4 발현 작제물로 처리된 동물들의 표시된 그룹 또는 대조군 동물에서 혈장, 비장, 간, 심장 및 신장에 남아있는 Gb3 및 리소-Gb3 기질의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 6b는 변이체 #4 발현 작제물로 처리된 동물들의 표시된 그룹 또는 대조군 동물에서 혈장, 비장, 간, 심장 및 신장에 남아있는 Gb3 및 리소-Gb3 기질의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 7a는 cDNA 변이체 #4 작제물 또는 cDNA 변이체 #21 작제물로 처리된 인간 HepG2 세포의 상청액에서 시험관내 α-Gal A 활성을 보여주는 그래프이다(도 1a 및도 1b에 도시됨). 트랜스진 활성은 발현 작제물로서 작제물 변이체 #4가 사용되는 경우의 활성과 비교하여, WPRE 서열을 포함하는 발현 작제물(도 1b에 도시된 바와 같은 작제물 변이체 #21)을 사용하여 300,000 AAV vg/세포로 처리된 세포에서 적어도 약 9배까지 증가되었다. 트랜스진 활성은 발현 작제물로서 작제물 변이체 #4가 사용되는 경우의 활성과 비교하여, WPRE 서열을 포함하는 발현 작제물(도 1b에 도시된 바와 같은 작제물 변이체 #21)을 사용하여 100,000 AAV vg/세포로 처리된 세포에서 적어도 약 7배까지 증가되었다.
도 7b는 cDNA 변이체 #4 작제물 또는 cDNA 변이체 #21 작제물로 처리된 유도 만능 간세포("iCell 간세포")의 상청액에서 시험관내 α-Gal A 활성을 보여주는 그래프이다(도 1a 및 도 1b). 트랜스진 활성은 발현 작제물로서 변이체 #4가 사용되는 경우의 활성과 비교하여, WPRE 서열을 포함하는 발현 작제물(도 1b에 도시된 바와 같은 변이체 #21)을 사용하여 300,000 AAV vg/세포로 처리된 세포에서 적어도 약 4배까지 증가되었다. 트랜스진 활성은 발현 작제물로서 변이체 #4가 사용되는 경우의 활성과 비교하여, WPRE 서열을 포함하는 발현 작제물(도 1b에 도시된 바와 같은 변이체 #21)을 사용하여 100,000 AAV vg/세포로 처리된 세포에서 적어도 약 3배까지 증가되었다.
도 8은 2.0E+12 vg/kg 또는 5E+11 vg/kg의 용량의 변이체 #21 작제물 또는 2.0E+12 vg/kg 또는 5E+11 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물 또는 제형 완충액으로 처리된 야생형 마우스의 혈장에서 작제물 용량 증가와 함께 증가된 GLA A 활성을 보여주는 그래프이다.
도 9는 5.0E+13 vg/kg 용량의 변이체 #21 작제물, 5.0E+12 vg/kg 용량의 변이체 #21 작제물, 5.0E+13 vg/kg 용량의 변이체 #4 작제물, 5.0E+12 vg/kg 용량의 변이체 #4 작제물, 또는 제형 완충액으로 처리된 후 29일에 걸친 C57BL/6 마우스에서 α-Gal A 혈장 활성을 나타내는 그래프이다. 도시된 바와 같이, 변이체 #21 작제물은 C57BL/6 마우스에서 생리학적으로 정상적인 혈장 α-Gal A 활성 수준의 1,500배 이상을 생성할 수 있다.
도 10은 5.0E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물로 처리된 GLAKO 마우스의 간 샘플에서 AAV 벡터 게놈에 대해 염색된 인 시츄 DNA 혼성화 이미지이다. 비-암호화 서열이 표적화되었다. 이 샘플에서, 간 세포의 57.5%는 처리 후 90일에 AAV 벡터 게놈에 대해 양성으로 염색되었다.
도 11은 6.0E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물로 처리된 야생형 비인간 영장류(NPH)의 간 샘플에서 AAV 벡터 게놈에 대해 염색된 인 시츄 DNA 혼성화 이미지이다. 비-암호화 서열이 표적화되었다. 이 샘플에서, 간세포의 57.5%는 처리 후 60일에 AAV 벡터 게놈에 대해 양성으로 염색되었다.
도 12a는 2E+12 vg/kg, 5E+12 vg/kg, 5E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물 또는 대조군으로서 제형 완충액으로 처리된 GLAKO 마우스에서 hGLA cDNA를 함유하는 간세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 12b는 6E+12 vg/kg, 1E+13 vg/kg, 3E+13 vg/kg, 6E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물 또는 대조군으로서 제형 완충액으로 처리된 사이노몰구스 NHP에서 hGLA cDNA를 함유하는 간세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 12c는 2E+12 vg/kg, 5E+12 vg/kg, 5E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물 또는 대조군으로서 제형 완충액("0")으로 처리된 개별 GLAKO 마우스에서 hGLA cDNA를 함유하는 간세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 12d는 6E+12 vg/kg, 1E+13 vg/kg, 3E+13 vg/kg, 6E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물 또는 대조군으로서 제형 완충액("0")으로 처리된 개별 사이노몰구스 NHP에서 hGLA cDNA를 함유하는 간세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 13a 및 도 13b는 6.0E+12 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물 또는 제형 완충액으로 처리된 개별 동물에 대한 NHP 혈장 hGLA 활성 대 단백질 농도를 보여주는 그래프이다.
도 13c 및 도 13d는 1.0E+13 vg/kg 또는 3.0E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물로 처리된 개별 동물에 대한 NHP 혈장 hGLA 활성 대 단백질 농도를 보여주는 그래프이다.
도 13e 및 도 13f는 면역억제제없이 6.0E+13 vg/kg 또는 6.0E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물로 처리된 개별 동물에 대한 NHP 혈장 hGLA 활성 대 단백질 농도를 보여주는 그래프이다.
도 14는 6.0E+12 vg/kg, 1.0E+13 vg/kg, 3.0E+13 vg/kg, 6.0E+13 vg/kg, 면역억제제없이 6.0E+13 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물 또는 제형 완충액으로 처리한 후 60일에 개별 동물로부터의 NHP 간 샘플에서 hGLA 및 상응하는 mRNA 수준의 웨스턴 블롯 분석이다. 도시된 바와 같이, hGLA 단백질 수준은 대부분의 샘플에서 mRNA 수준과 상관 관계가 있는 작제물 용량 및 단백질 수준에 따라 증가한다.
파브리병을 치료 또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 본 명세서는 유전자가 간에서 발현되고 치료(대체) 단백질이 발현되도록, 파브리병이 있는 대상체에서 결핍되거나 불충분하게 발현되는 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진의 도입을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 명세서는 또한 높은 수준의 치료제를 생성하고 이러한 변경된 세포 집단을 환자에게 도입하면 필요한 단백질을 공급할 수 있도록 하는, 세포(예를 들어, 전구체 또는 성숙한 RBC, iPSC 또는 간 세포)의 변경을 설명한다. 트랜스진은 이를 필요로 하는 환자에게 치료적으로 유익한 원하는 단백질 또는 구조적 RNA를 암호화할 수 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용한 유전자 치료는 혈우병 B에 대해 6년까지 안정적인 수준의 트랜스진 발현에 대한 보고와 함께, 치료용 트랜스진을 간으로 효율적으로 전달하기 위한 전임상 및 임상 시험 모두에서 큰 가능성을 보여주었다(Lheriteau E, Davidoff E, Nathwani AC. Haemophilia gene therapy: Progress and challenges. Blood Rev. 2015 Sep;29(5):321-8).
특히 유망한 한 영역은 세포가 이전에 그 세포에서 생산되지 않았거나 차선적으로 생산되고 있던 생성물을 발현하도록 세포에 트랜스진을 추가하는 능력이다. 이 기술의 사용 예로는 치료 단백질을 암호화하는 유전자 삽입, 세포 또는 개체에서 어떻게든 부족한 단백질을 암호화하는 암호화 서열의 삽입 및 microRNA와 같은 구조적 핵산을 암호화하는 서열의 삽입이 있다.
트랜스진은 다양한 방식으로 세포에 도입되고 유지될 수 있다. "cDNA" 접근법에 따라, 트랜스진이 세포의 염색질로의 통합을 통하지 않고 염색체 외로 유지되도록 세포에 도입된다. 트랜스진은 원형 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 AAV 또는 렌티바이러스와 같은 비-통합 바이러스 벡터)에서 유지될 수 있으며, 여기서 벡터는 프로모터, 인핸서, 폴리A 신호 서열, 인트론 및 스플라이싱 신호와 같은 전사 조절 서열을 포함할 수 있다(미국 특허 번호 제10,143,760호).
트랜스진은 다양한 방법으로 세포에 전달될 수 있으며, 따라서 트랜스진은 세포 자체의 게놈에 통합되어 그곳에서 유지된다. 최근 몇 년 동안, 선택된 게놈 유전자좌로의 표적 삽입을 위해 부위-특이적 뉴클레아제에 의한 절단을 사용하는 트랜스진 통합을 위한 전략이 개발되었다(예를 들어, 공동 소유한 미국 특허 제7,888,121호 참조). 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)와 같은 뉴클레아제 또는 RNA 유도 CRISPR/Cas 시스템(조작된 가이드 RNA 활용)과 같은 뉴클레아제 시스템은 표적 유전자에 특이적이며, 상동성 지정 복구(HDR)에 의해, 또는 비-상동 말단 결합(NHEJ) 구동 프로세스 동안 말단 포획에 의해 트랜스진 작제물이 삽입되도록 활용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제9,877,988호; 제9,816,074호; 제9,616,090호; 제9,873,894호; 제9,597,357호; 제9,567,573호; 제9,458,205호; 제9,447,434호; 제9,394,545호; 제9,255,250호; 제9,222,105호; 제9,206,404호; 제9,200,266호; 제9,045,763호; 제9,005,973호; 제9,150,847호; 제8,956,828호; 제8,945,868호; 제8,895,264호; 제8,771,985호; 제8,703,489호; 제8,586,526호; 제8,106,255호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,888,121호; 제7,972,854호; 제7,914,796호; 제7,951,925호; 제8,110,379호; 제8,409,861호; 미국 특허 공개 20030232410 및 20050064474를 참고하며, 그의 개시내용은 그 전체가 참고로 포함된다.
트랜스진은 알부민 유전자와 같은 고도로 발현된 세이프 하버(safe harbor) 위치에 통합될 수 있다(미국 특허 번호 제9,394,545호 참조). 이 접근 방식을 생체 내 단백질 대체 플랫폼(In Vivo Protein Replacement Platform) 또는 IVPRP라고 한다. 이 접근법에 따라, 트랜스진은 알부민 프로모터에 의해 트랜스진의 발현이 유도되는 뉴클레아제-매개 표적 삽입을 통해 세이프 하버(예를 들어, 알부민) 유전자에 삽입된다. 트랜스진은 트랜스진에 의해 암호화된 단백질의 분비/배설을 돕기 위해 신호 서열을 포함하도록 조작된다.
"세이프 하버" 유전자좌는 인간 세포의 AAVS1, HPRT, 알부민 및 CCR5 유전자 및 뮤린 세포의 Rosa26과 같은 유전자좌를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제9,877,988호; 제9,567,573호; 제9,447,434호; 제9,394,545호; 제9,222,105호; 제9,206,404호; 제9,150,847호; 제8,895,264호; 제8,771,985호; 제8,106,255호; 제7,888,121호; 제7,972,854호; 제7,914,796호; 제7,951,925호; 제8,110,379호; 제8,409,861호; 및 제8,586,526호; 미국 특허 공개 20030232410 및 20060063231을 참고한다. 뉴클레아제-매개 통합은 유전자 침묵 또는 인근 종양유전자의 활성화의 위험을 최소화하기 위한 정확한 트랜스진 위치지정을 허용하므로, 트랜스진의 무작위 통합에 의존하는 고전적 통합 접근법에 비해 개선된 트랜스진 발현, 증가된 안전성 및 발현 내구성의 전망을 제공한다. 치료 파브리(Fabry) 단백질을 암호화하는 유전자의 뉴클레아제-매개 트랜스진 삽입은 미국 공개 번호 20180117181에 설명되어 있다.
트랜스진을 표적 세포로 전달하는 것은 이 기술을 완전히 제정하기 위해 극복해야하는 하나의 장애물이지만, 정복해야 할 또 다른 문제는 트랜스진이 세포에 삽입되어 발현된 후 그렇게 암호화된 유전자 산물이 유기체와 함께 필요한 위치에 도달해야 하며, 효과적일 수 있도록 충분한 국소 농도로 만들어져야 한다는 것이다. 단백질의 부족 또는 비정상적 비-기능적 단백질의 존재를 특징으로 하는 질환의 경우, 트랜스진 암호화된 야생형 단백질의 전달이 매우 도움이 될 수 있다.
리소좀 저장 질환(LSD)은 정상적으로 폐 지질, 당 단백질 및 뮤코 다당류의 분해에 관여하는 기능적 개별 리소좀 단백질의 부족을 특징으로 하는 희귀 대사 단일원성 질환 그룹이다. 이러한 질환은 특정 효소의 오작동으로 인해 재활용을 위해 처리할 수 없기 때문에 세포에 이러한 화합물이 축적되는 특징이 있다. 가장 일반적인 예는 가우셔의 (글루코세레브로시다제 결핍- 유전자 명칭: GBA), 파브리의 (갈락토시다제 A 결핍- GLA), Hunter의 (이두로네이트-2-설파타제 결핍-IDS), Hurler의 (알파-L 이두로니다제 결핍-IDUA), 폼페(Pompe)의 (알파-글루코시다제(GAA)) 및 니만-픽(스핑고미엘린 포스포디에스테라제 1 결핍-SMPD1) 질환이다. 모두 함께 그룹화하면, LSD는 7000명의 출생 중 약 1명의 인구에서 발생한다. 또한 미국 특허 번호 제9,877,988호 및 제9,956,247호 및 미국 공개 번호 20160060656을 참조한다.
예를 들어, 파브리병은 α-갈락토시다제 A 효소(α-GalA)의 결핍으로 인한 글리코스핑고지질 대사의 X-연관 장애이다. 이는 글로보트리아오실세라마이드(globotriaosylceramide)(GL-3 및 Gb3으로도 알려져 있음) 및 글로보트리아오실스핀고신(globotriaosylsphingosine)(리소-Gb3), 갈라바이오아실세라마이드(galabioasylceramide) 및 그룹 B 물질을 포함한 글리코스핑고지질의 점진적 침착과 관련이 있다. 질환의 증상은 다양하며, 작열감, 따끔거림(지각 감각) 또는 몇 분에서 며칠까지 지속될 수 있는 '파브리 위기'라고 하는 강렬한 통증 에피소드를 포함할 수 있다. 다른 증상으로는 발한 장애, 운동에 대한 낮은 내성, 혈관각화종이라고 불리는 적자빛(reddish-purplish) 발진, 눈 이상, 위장 문제, 심장 비대 및 심장 마비와 같은 심장 문제, 신부전 및 CNS 문제로 이어질 수 있는 신장 문제 등이 있다. 파브리 환자의 기대 수명이 실질적으로 단축되었다.
파브리병에 대한 현재 치료는 인간 α-GalA, 아갈시다제 베타 또는 아갈시다제 알파의 두 가지 다른 제제를 사용한 효소 대체 요법(ERT)을 포함할 수 있으며, 이는 2주마다 환자에게 비용과 시간이 많이 소요되는 주입(전형적으로 약 0.2~1 mg/kg)을 필요로 한다. 이러한 치료는 증상을 치료하기 위한 것이며, 치유적이지 않다. 따라서 환자는 평생 동안 이러한 단백질을 반복적으로 투여받아야 하며, 잠재적으로 주입된 단백질에 대한 중화 항체를 발생시킬 수 있다.
더욱이, 부작용은 α-GalA 제제로 치료된 대상체에서 항 -α-GalA 항체의 발생과 같은 면역 반응을 포함하는 ERT와 관련된다. 실제로, 아갈시다제 알파로 치료받은 남성의 50%와 아갈시다제 베타로 치료받은 남성의 88%가 α-GalA 항체를 발생시켰다. 중요한 것은 이러한 항체의 상당 부분이 중화 항체이므로, 결과적으로 치료의 치료 효과를 감소시킨다(Meghdari 등 (2015) PLoS One 10(2):e0118341. Doi:10.1371/journal.pone.0118341). 또한 ERT는 모든 환자의 질환 진행을 중단시키지 않는다.
따라서, 방법 및 조성물은 예를 들어 바이러스 벡터에 의해 전달되거나 임의의 유전자좌(예를 들어, 고도로 발현된 알부민 유전자좌)에 삽입되어 파브리병에서 결핍되고/되거나 부족한 효소를 대체한 cDNA 작제물로부터 하나 이상의 치료학적으로 유익한 α-GalA 단백질을 트랜스진으로부터 발현하는데 사용될 수 있다. 추가로, 본 명세서는 간 세포와 같은 세포에서 고도로 발현된 유전자좌에 트랜스진 서열을 삽입함으로써 파브리병의 치료(하나 이상의 증상 완화 포함)를 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 개시내용에는 바이러스 벡터를 통해 α-GalA 암호화 트랜스진을 필요로 하는 대상체의 간에 전달하기 위한 방법 및 조성물이 포함되며, 여기서 바이러스는 말초 정맥계로의 주사 또는 간-지향성 혈관(예를 들어, 문맥)으로의 직접 주사를 통해 도입될 수 있다. 방법 및 조성물은 트랜스진을 세이프 하버 유전자좌(예를 들어, 알부민)로 삽입하는 것을 유도하는데 사용할 수 있거나, 간 세포에서 바이러스 cDNA 작제물의 염색체 외 유지를 유발하는 데 사용할 수 있다. 두 경우 모두 트랜스진은 고도로 발현되며, 필요한 파브리 환자에게 치료적 이점을 제공한다.
또한, 트랜스진은 예를 들어 환자 유래 세포, 예를 들어 환자 유래 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 최종 이식에 사용하기 위한 다른 유형의 줄기 세포(배아 또는 조혈)에 도입될 수 있다. 특히 유용한 것은 치료를 필요로 하는 환자에게 이식하기 위해 치료용 트랜스진을 조혈 줄기 세포에 삽입하는 것이다. 줄기 세포가 성숙한 세포로 분화됨에 따라, 이들은 조직에 전달하기 위한 높은 수준의 치료 단백질을 함유할 것이다.
일반적인 사항
본 명세서에 개시된 조성물의 제조 및 사용뿐만 아니라 방법의 실행은 달리 명시되지 않는 한, 기술의 범위 내에 있는 바와 같이 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 전산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야에서 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook 등 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 및 Third edition, 2001; Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 정기 업데이트; 시리즈 METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman 및 A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999를 참고한다.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 교환적으로 사용되며, 선형 또는 원형 형태의 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 이들 용어는 중합체의 길이에 대해 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이 용어는 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(예를 들어, 포스포로티오에이트 백본)에서 변형된 뉴클레오타이드뿐만 아니라 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로 특정 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가지며; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 거대분자 사이(예를 들어, 단백질과 핵산 사이)의 서열-특이적, 비공유 상호작용을 지칭한다. 결합 상호작용의 모든 구성요소는 전체 상호작용이 서열-특이적인 한 서열 특이적일 필요는 없다(예를 들어, DNA 백본에서 인산염 잔기와의 접촉). 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6 M-1 이하의 해리 상수(Kd)를 특징으로 한다. "친화도"는 결합 강도를 의미한다: 증가된 결합 친화도는 더 낮은 Kd와 상관된다.
"결합 도메인"은 다른 분자에 비공유적으로 결합할 수 있는 분자이다. 결합 분자는 예를 들어 DNA 분자(징크 핑거 단백질 또는 TAL-효과기 도메인 단백질 또는 단일 가이드 RNA와 같은 DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 분자의 경우, 그 자체에 결합할 수 있고(동종이량체, 동종삼량체 등을 형성)/있거나, 다른 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 분자는 하나 이상의 유형의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어 징크 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가지고 있다. 따라서, 인조 뉴클레아제 및 전사 인자의 DNA-결합 성분을 포함하는 DNA-결합 분자는 ZFP, TALE 및 sgRNA를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
"징크 핑거 DNA-결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인, 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 징크 핑거 DNA-결합 단백질이라는 용어는 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 축약된다. 인조 뉴클레아제 및 전사 인자는 ZFP DNA-결합 도메인 및 기능 도메인(ZFN의 경우 뉴클레아제 도메인 또는 ZFP-TF의 경우 전사 조절 도메인)을 포함할 수 있다. 용어 "징크 핑거 뉴클레아제"는 하나의 ZFN뿐만 아니라 표적 유전자를 절단하기 위해 이량체화하는 한 쌍의 ZFN을 포함한다.
"TALE DNA-결합 도메인" 또는 "TALE"는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함하는 폴리펩타이드이다. 반복 도메인은 TALE의 동족 표적 DNA 서열에 대한 결합에 관여한다. 단일 "반복 단위"("반복"이라고도 함)는 전형적으로 길이가 33~35 아미노산이며, 자연 발생 TALE 단백질 내에서 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,586,526호를 참고한다. 인조 뉴클레아제 및 전사 인자는 TALE DNA-결합 도메인 및 기능 도메인(TALEN의 경우 뉴클레아제 도메인 또는 TALEN-TF의 경우 전사 조절 도메인)을 포함할 수 있다. 용어 "TALEN"은 하나의 TALEN뿐만 아니라 표적 유전자를 절단하기 위해 이량체화하는 한 쌍의 TALEN을 포함한다.
징크 핑거 및 TALE 결합 도메인은 예를 들어 자연 발생 징크 핑거 또는 TALE 단백질의 인식 나선 영역의 조작(하나 이상의 아미노산 변경)을 통해 미리 결정된 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 따라서, 조작된 DNA-결합 단백질(징크 핑거 또는 TALE)은 자연적으로 발생하지 않는 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하는 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA-결합 단백질은 설계/조성물이 주로 합리적인 기준에서 비롯된 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적 기준에는 기존 ZFP 및/또는 TALE 설계의 정보와 결합 데이터를 저장하는 데이터베이스에서 정보를 처리하기 위한 대체 규칙 및 전산화된 알고리즘의 적용이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,568,526호; 제6,140,081호; 제6,453,242호; 및 제6,534,261호를 참고하며; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496을 참고한다.
"선택된" 징크 핑거 단백질 또는 TALE는 생산이 주로 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 경험적 과정에서 발생하는 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, 특허 번호 제8,586,526호; 제5,789,538호; 미국 특허 제5,925,523호; 미국 특허 제6,007,988호; 미국 특허 제6,013,453호; 미국 특허 제6,200,759호; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084를 참고한다.
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 사이의 유전 정보 교환 과정을 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, "상동성 재조합(HR)"은 예를 들어 상동성-지시된 복구 메커니즘을 통해 세포에서 이중-가닥 파손의 복구 동안 발생하는 이러한 교환의 특수한 형태를 지칭한다. 이 과정은 뉴클레오타이드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자(즉, 이중-가닥 절단을 경험한 분자)의 주형 복구를 위해 "공여체" 분자를 사용하며, "비-교차 유전자 전환" 또는 "짧은 기관 유전자 전환”이라고 다양하게 설명했으며, 이는 공여체로부터 표적으로 유전 정보를 전달하기 때문이다. 특정 이론에 얽매이지 않으면서, 그러한 전달은 파손된 표적과 공여체 사이에 형성되는 이종이중체 DNA의 불일치 수정 및/또는 공여체가 표적의 일부가 될 유전 정보 재합성 및/또는 관련 프로세스에 사용되는 "합성-의존적 가닥 어닐링"을 포함할 수 있다. 이러한 특화된 HR은 종종 공여체 폴리뉴클레오타이드의 서열의 일부 또는 전부가 표적 폴리뉴클레오타이드 내로 통합되도록 표적 분자의 서열의 변경을 초래한다.
본 개시내용의 방법에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적화된 뉴클레아제는 미리 결정된 부위에서 표적 서열(예를 들어, 세포 염색질)에서 이중-가닥 절단을 생성하며, 파단 영역의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상동성을 갖는 "공여체" 폴리뉴클레오타이드가 세포에 도입될 수 있다. 이중-가닥 파손의 존재는 공여체 서열의 통합을 용이하게 하는 것으로 나타났다. 공여체 서열은 물리적으로 통합될 수 있거나, 대안적으로 공여체 폴리뉴클레오타이드는 상동성 재조합을 통한 파단 복구를 위한 주형으로 사용되어, 공여체에서와 같이 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부가 세포 염색질로 도입된다. 따라서, 세포 염색질의 제1 서열이 변경될 수 있고, 특정 실시형태에서 공여체 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 서열로 전환될 수 있다. 따라서, "대체하다" 또는 "대체"라는 용어의 사용은 하나의 뉴클레오타이드 서열을 다른 것으로 대체(즉, 정보적 의미에서 서열의 대체)하는 것으로 이해될 수 있으며, 하나의 폴리뉴클레오타이드의 물리적 또는 화학적 대체를 반드시 요구하지는 않는다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 징크-핑거 또는 TALEN 단백질의 추가 쌍은 세포 내 추가 표적 부위의 추가 이중-가닥 절단에 사용될 수 있다.
세포 염색질의 관심 영역에서 서열의 표적화된 재조합 및/또는 대체 및/또는 변경을 위한 방법의 특정 실시형태에서, 염색체 서열은 외인성 "공여체" 뉴클레오타이드 서열과의 상동성 재조합에 의해 변경된다. 파단 영역과 상동한 서열이 존재하는 경우, 이러한 상동성 재조합은 세포 염색질내 이중-가닥 파단의 존재에 의해 자극된다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 제1 뉴클레오타이드 서열("공여체 서열")은 관심 영역의 게놈 서열과 상동성이지만 동일하지는 않은 서열을 함유할 수 있으며, 이에 따라 상동성 재조합을 자극하여 관심 영역에서 비-동일한 서열을 삽입할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 관심 영역의 서열과 상동성인 공여체 서열의 부분은 대체되는 게놈 서열에 대해 약 80 내지 99%(또는 그 사이의 임의의 정수) 서열 동일성을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 예를 들어 100개 초과의 연속 염기쌍의 공여체와 게놈 서열 사이에서 단지 1개의 뉴클레오타이드가 다른 경우, 공여체와 게놈 서열 사이의 상동성은 99% 이상이다. 특정 경우에, 공여체 서열의 비-상동성 부분은 관심 영역에 존재하지 않는 서열을 함유할 수 있으므로, 새로운 서열이 관심 영역에 도입된다. 이러한 경우에, 비-상동성 서열은 일반적으로 관심 영역의 서열과 상동하거나 동일한 50~1,000개 염기쌍(또는 그 사이의 임의의 정수 값)의 서열 또는 1,000개를 초과하는 임의의 수의 염기쌍의 측면에 위치한다. 다른 실시형태에서, 공여체 서열은 제1 서열과 비상동성이고 비상동성 재조합 메커니즘에 의해 게놈 내로 삽입된다.
본원에 기재된 임의의 방법은 관심 유전자(들)의 발현을 방해하는 공여체 서열의 표적 통합에 의해 세포에서 하나 이상의 표적 서열의 부분적 또는 완전한 불활성화에 사용될 수 있다. 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 유전자를 가진 세포주도 제공된다.
더욱이, 본원에 기재된 표적 통합 방법은 또한 하나 이상의 외인성 서열을 통합하는데 사용될 수 있다. 외인성 핵산 서열은 예를 들어 하나 이상의 유전자 또는 cDNA 분자, 또는 임의의 유형의 암호화 또는 비-암호화 서열뿐만 아니라 하나 이상의 제어 요소(예를 들어, 프로모터)를 포함할 수 있다. 또한, 외인성 핵산 서열은 하나 이상의 RNA 분자(예를 들어, 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 억제 RNA(RNAis), 마이크로RNA(miRNA) 등)를 생성할 수 있다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 백본의 파단을 의미한다. 절단은 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단이 모두 가능하며, 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 이벤트의 결과로 발생할 수 있다. DNA 절단은 블런트 말단 또는 엇갈린 말단을 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 이중-가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 절반-도메인"은 제2 폴리펩타이드(동일하거나 상이함)와 함께 절단 활성(바람직하게는 이중-가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 절반-도메인"; "+ 및 - 절단 절반-도메인" 및 "오른쪽 및 왼쪽 절단 절반-도메인"은 이량체화하는 절단 절반-도메인 쌍을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
"조작된 절단 절반-도메인"은 또 다른 절단 절반-도메인(예를 들어, 또 다른 조작된 절단 절반-도메인)과 함께 완전한 이종이량체를 형성하도록 변형된 절단 절반-도메인이다. 미국 특허 번호 제7,888,121호; 제7,914,796호; 제8,034,598호 및 제8,823,618호를 참고하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있는 임의의 길이의 뉴클레오타이드 서열을 지칭하고; 선형, 원형 또는 분지형일 수 있으며, 단일-가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "공여체 서열"은 게놈에 삽입된 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 공여체 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 길이(또는 그 사이 또는 그위의 임의의 정수 값), 바람직하게는 약 100개 내지 1,000개 뉴클레오타이드 길이(또는 그 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는 약 200개 내지 500개 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
"질환 관련 유전자"는 일원성 질환에서 어떤 방식으로든 결함이 있는 유전자이다. 단일원성 질환의 비제한적인 예로는 중증 복합 면역결핍, 낭포성 섬유증, 혈우병, 리소좀 저장 질환(예를 들어, 고셔(Gaucher's), 후를러(Hurler's), 헌터(Hunter's), 파브리(Fabry's), 니만-픽(Neimann-Pick), 테이-삭스(Tay-Sach's) 등), 겸상 적혈구 빈혈 및 지중해 빈혈이 있다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함한 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하며, 여기서 뉴클레오솜 코어는 2개의 각각의 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 포함하는 옥타머와 관련된 약 150 염기쌍의 DNA를 포함하고; 링커 DNA(유기체에 따라 가변 길이)는 뉴클레오솜 코어 사이에서 확장된다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로 링커 DNA와 연관되어 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 모든 유형의 세포 핵단백질, 원핵 및 진핵 모두를 포함하는 것을 의미한다. 세포 염색질에는 염색체 및 에피솜 염색질이 모두 포함된다.
"염색체"는 세포 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 종종 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 집합인 핵형으로 특징화된다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 복제 핵산, 핵 단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 일부가 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예에는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈이 포함된다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재한다면 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 정의하는 핵산 서열이다.
"외인성" 분자는 세포에 정상적으로 존재하지 않지만 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에의 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대한 외인성 분자이다. 마찬가지로 열충격에 의해 유도된 분자는 열충격을 받지 않은 세포에 대한 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들어 오작동하는 내인성 분자의 기능하는 버전 또는 정상적으로 작동하는 내인성 분자의 오작동하는 버전을 포함할 수 있다.
외인성 분자는 무엇보다도 조합 화학 공정에 의해 생성된 것과 같은 소분자이거나 거대 분자, 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당 단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산에는 DNA와 RNA가 포함되며, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있으며, 선형, 분기형 또는 원형일 수 있으며; 임의의 길이가 될 수 있다. 핵산은 삼중체-형성 핵산뿐만 아니라 이중 나선을 형성할 수 있는 것들을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,176,996호 및 제5,422,251호를 참조한다. 단백질은 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA-결합 단백질, 폴리머라아제, 메틸라아제, 데메틸라아제, 아세틸라아제, 데아세틸라아제, 키나아제, 포스파타아제, 인테그라아제, 재조합효소, 리가아제, 토포이소머라아제, 자이라아제 및 헬리카제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염 바이러스 게놈, 세포에 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포 내로 외인성 분자를 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 지질-매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접 주입, 세포 융합, 입자 충격, 인산 칼슘 공침, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있지만, 세포가 유래된 것과는 다른 종에서 유래한다. 예를 들어, 인간 핵산 서열은 원래 마우스 또는 햄스터로부터 유래된 세포주에 도입될 수 있다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계에서 특정 세포에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아의 게놈, 엽록체 또는 기타 세포기관, 또는 자연 발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자에는 단백질, 예를 들어 전사 인자 및 효소가 포함될 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가 바람직하게는 공유적으로 연결된 분자이다. 서브유닛 분자는 동일한 화학 유형의 분자이거나 다른 화학 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 분자의 예에는 융합 단백질(예를 들어, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 하나 이상의 활성화 도메인 간의 융합) 및 융합 핵산(예를 들어, 상기 기술된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 제2 유형의 융합 분자의 예는 삼중체-형성 핵산과 폴리펩타이드 사이의 융합, 및 소홈 결합제와 핵산 사이의 융합을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
세포에서 융합 단백질의 발현은 융합 단백질을 세포로 전달하거나 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 세포에 전달함으로써 발생할 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오타이드가 전사되고 전사체가 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩타이드 절단 및 폴리펩타이드 결찰은 또한 세포내 단백질의 발현에 관여할 수 있다. 세포로의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달 방법은 본 개시내용의 다른 곳에서 제시된다.
본 개시내용의 목적 상 "유전자"는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 영역(아래 참조)뿐만 아니라 이러한 조절 서열이 암호화 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부에 관계없이 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 번역 조절 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일런서, 절연체, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함하지만, 반드시 이들로 한정되지는 않는다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보를 유전자 산물로 변환하는 것을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 구조적 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA)의 직접 전사 생성물 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 산물에는 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA와, 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질이 포함된다.
"GLA 유전자"는 글로보트리아오실세라미드를 분해하는 효소인 α-갈락토시다제를 암호화한다. GLA 유전자의 유전적 돌연변이는 α-갈락토시다제의 효소 기능에 결함을 일으킨다. GLA 유전자는 위치 22.1에 있는 X 염색체의 긴(q) 팔인, Xq22.1에 있다. GLA 유전자는 또한 AGAL_HUMAN, 아갈시다제 알파(Agalsidase alpha), 알파-D-갈락토시다제 A, 알파-D-갈락토시다제 갈락토하이드롤라제, 알파-갈락토시다제, 알파-갈락토시다제 A, 세라마이데트리헥소시다제, GALA, 갈락토시다제, 알파, 또는 멜리비아제(Melibiase)라고도 한다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자 활성의 변화를 의미한다. 발현의 조절은 유전자 활성화, 유전자 최적화 및 유전자 억제를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 게놈 편집(예를 들어, 절단, 변경, 비활성화, 무작위 돌연변이)을 사용하여 발현을 조절할 수 있다. 유전자 불활성화는 본원에 기재된 ZFP, TALE 또는 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현의 임의의 감소를 의미한다. 따라서, 유전자 불활성화는 부분적이거나 완전할 수 있다.
"관심 영역"은 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대 예를 들어 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 유전자 또는 유전자 내부 또는 유전자에 인접한 비-암호화 서열이다. 결합은 표적 DNA 절단 및/또는 표적 재조합의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심 영역은 예를 들어 염색체, 에피솜, 세포기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 관심 영역은 유전자의 암호화 영역 내에, 전사된 비-암호화 영역 내에, 예컨대 예를 들어 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론내에, 또는 암호화 영역의 상류 또는 하류에 있는 전사되지 않은 영역 내에 있을 수 있다. 관심 영역은 단일 뉴클레오타이드 쌍 또는 최대 2,000개의 뉴클레오타이드 쌍 길이, 또는 뉴클레오타이드 쌍의 정수 값만큼 작을 수 있다.
"진핵" 세포는 진균 세포(예컨대, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포 및, 줄기 세포(만능성 및 다능성)를 포함하는, 인간 세포(예를 들어, 간 세포, 근육 세포, RBC, T-세포 등)를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
"적혈구"(RBC) 또는 적혈구는 조혈 줄기 세포로부터 유래된 말기 분화 세포이다. 그들은 뉴클레아제와 대부분의 세포 소기관이 없다. RBC에는 폐에서 말초 조직으로 산소를 운반하는 헤모글로빈이 함유되어 있다. 실제로, 개별 적혈구의 33%가 헤모글로빈이다. 그들은 또한 신진 대사 중에 세포에서 생성된 CO2를 조직 밖으로 운반하고, 숨을 내쉴 때 방출하기 위해 폐로 다시 운반한다. 적혈구는 신장에 의한 에리트로포이에틴(EPO) 방출에 의해 매개되는 혈액 저산소증에 반응하여 골수에서 생성된다. EPO는 전적혈구아세포(proerythroblast)의 수를 증가시키고, 완전한 RBC 성숙에 필요한 시간을 단축시킨다. 약 120일 후, 적혈구에는 핵이나 다른 재생 능력이 없기 때문에 간, 비장 및 림프절에서 대식세포의 식세포 활성에 의해(~ 90%) 또는 혈장 내 용혈에 의해(~ 10%), 세포가 순환에서 제거된다. 대식세포 침윤 후, 적혈구의 화학 성분은 리소좀 효소의 작용으로 인해 대식세포의 액포 내에서 분해된다. 시험관 내 또는 생체 내 RBC는 본원에 기재된 바와 같이 유전자 변형된 줄기 또는 RBC 전구체 세포로부터 유래될 수 있다.
"분비 조직"은 개별 세포로부터의 산물을 전형적으로 상피로부터 유래된 일부 유형의 루멘으로 분비하는 동물의 조직이다. 위장관에 국한된 분비 조직의 예로는 장, 췌장 및 담낭을 감싸는 세포가 있다. 다른 분비 조직에는 간, 눈과 관련된 조직 및 점막, 예컨대 타액선, 유선, 전립선, 뇌하수체 및 내분비계의 다른 구성원이 포함된다. 추가로, 분비 조직은 분비할 수 있는 조직 유형의 개별 세포를 포함한다.
용어 "작동가능 연결" 및 "작동가능하게 연결된"(또는 "작동할 수 있게 연결된")은 둘 이상의 구성요소(예를 들어, 서열 요소)의 병치와 관련하여 상호 교환적으로 사용되며, 여기서 구성요소는 두 구성요소 모두가 정상적으로 기능하고 구성요소 중 적어도 하나가 다른 구성요소 중 하나 이상에 발휘되는 기능을 중재할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열된다. 예를 들어, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 암호화 서열의 전사 수준을 조절한다면, 프로모터와 같은 전사 조절 서열이 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스로 작동 가능하게 연결되지만, 바로 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 연속적이지 않더라도 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 각각의 성분이 그렇게 연결되지 않은 경우와 같이 다른 성분에 대한 연결에서 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, ZFP, TALE 또는 Cas DNA-결합 도메인이 활성화 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드의 경우, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 활성화 도메인은 만약 융합 폴리펩타이드에서, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 그것의 표적 부위 및/또는 결합 부위에 결합할 수 있는 반면, 활성화 도메인이 유전자 발현을 상향-조절할 수 있다면, 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드의 경우, ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 융합 폴리펩타이드에서 ZFP 또는 TALE DNA-결합 도메인 부분이 그의 표적 부위 및/또는 그의 결합 부위에 결합할 수 있는 반면, 절단 도메인이 표적 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있다면, 작동가능하게 연결되어 있는 것이다.
단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산의 "기능성 단편"은 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지 않지만 전장 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 기능을 유지하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 기능성 단편은 상응하는 천연 분자와 동일한 수의 잔기를 더 많이, 더 적게 또는 동일하게 가질 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 암호화 기능, 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 마찬가지로, 단백질 기능을 결정하는 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 DNA-결합 기능은 예를 들어 필터-결합, 전기영동 이동성-이동 또는 면역침강 분석에 의해 결정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해 분석될 수 있다. Ausubel 등, 상동 참조. 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은 예를 들어 유전적 및 생화학적 공동-면역침강, 2-하이브리드 분석 또는 보완에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, Fields 등(1989) Nature 340:245-246; 미국 특허 번호 제5,585,245호 및 국제 특허 공개 번호 WO 98/44350을 참고한다.
"벡터"는 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다. 전형적으로, "벡터 작제물", "발현 벡터", "유전자 전달 벡터" 및 "발현 작제물"은 관심 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 의미한다. 따라서, 이 용어에는 클로닝 및 발현 비히클 뿐만 아니라 통합 벡터가 포함된다.
"리포터 유전자" 또는 "리포터 서열"은 바람직하게는 일상적인 분석에서 반드시 필요한 것은 아니지만 쉽게 측정되는 단백질 생성물을 생성하는 임의의 서열을 지칭한다. 적합한 리포터 유전자에는 항생제 내성(예를 들어, 암피실린 내성, 네오마이신 내성, G418 내성, 퓨로마이신 내성)을 매개하는 단백질을 암호화하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시퍼라제) 및 강화된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질(예를 들어, 디하이드로폴레이트 환원 효소)을 암호화하는 서열이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 에피토프 태그는 예를 들어 FLAG, His, myc, Tap, HA 또는 임의의 검출 가능한 아미노산 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. "발현 태그"는 관심 유전자의 발현을 모니터링하기 위해 원하는 유전자 서열에 작동가능하게 연결될 수 있는 리포터를 암호화하는 서열을 포함한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 상호 교환적으로 사용되며, 인간 환자 및 비인간 영장류와 같은 포유동물뿐만 아니라 토끼, 개, 고양이, 래트, 마우스 및 기타 동물과 같은 실험 동물을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본원에 기재된 변경된 세포 및/또는 본원에 기재된 변경된 세포에 의해 생성된 단백질이 투여될 수 있는 임의의 포유동물 환자 또는 대상체를 의미한다. 본 개시내용의 대상체는 LSD를 갖는 대상체를 포함한다.
파브리병을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 본 개시내용은 트랜스진 서열을 적합한 표적 세포(예를 들어, 파브리병을 앓는 대상체로부터의 세포)로 삽입하는 방법을 기재하고, 여기서 트랜스진은 질환을 치료하는 적어도 하나의 단백질(예를 들어, 적어도 하나의 α-GalA 단백질)을 암호화한다. 방법은 생체 내(생존 대상체의 세포로 트랜스진 서열 전달) 또는 생체 외(생존 대상체에 변형된 세포 전달)일 수 있다. 본 개시내용은 또한 α-GalA 암호화 트랜스진이 질환을 치료하는 (예를 들어, 질환과 관련된 증상 중 하나 이상을 완화시키는) 단백질을 발현하도록 발현 시스템으로 적합한 표적 세포의 형질감염 및/또는 형질도입 방법을 설명한다. α-GalA 단백질은 트랜스진을 보유하지 않는 다른 세포에 영향을 미치거나 흡수할 수 있도록(교차 교정) 표적 세포에서 배설(분비)될 수 있다. 본 개시내용은 또한 높은 수준의 α-GalA를 생성하는 세포(예를 들어, 성숙 또는 미분화 세포)의 생산 방법을 제공하며, 여기서 이러한 변경된 세포 집단을 환자에게 도입하면 질환 또는 병태를 치료하는 데 필요한 단백질이 공급될 것이다. 또한, α-GalA의 고활성 형태를 생산(치료)하는 세포(예를 들어, 성숙 또는 미분화 세포)를 생산하는 방법이 제공되며, 여기서 환자에서의 이러한 변형된 세포의 집단의 도입 또는 생성은 파브리병 치료(예를 들어, 하나 이상의 증상 감소 또는 제거)에 필요한 단백질 활성을 공급할 것이다. 본원에 기재된 바와 같이 생성된 고활성 형태의 α-GalA는 또한 본원에 기재된 바와 같은 세포로부터 단리될 수 있고 당업자에게 공지된 표준 효소 대체 절차를 사용하여 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.
적어도 하나의 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질을 발현하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 기재되어 있다. 조성물 및 방법은 시험관내, 생체 내 또는 생체 외 사용을 위한 것일 수 있으며, 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진(예를 들어, 야생형 또는 코돈 최적화된 GLA 서열을 갖는 cDNA)를 세포에 투여하여, α-Gal A 단백질이 세포에서 발현되도록 하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 파브리병을 앓는 대상체에 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 트랜스진은 대상체의 간에 투여될 수 있다. 선택적으로, 방법은 트랜스진이 알부민 유전자로 통합되고 그로부터 발현되도록 대상체의 간 세포에서 내인성 알부민 유전자를 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 제형 완충액 또는 다른 담체로 치료된 대상체 또는 치료되지 않은 대상체에 비해 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 2배 감소시킬 수 있다. GLA 트랜스진은 예를 들어 신호 펩타이드 및/또는 하나 이상의 대조군 요소를 포함하는 추가 요소를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, GLA 트랜스진(예를 들어, cDNA 작제물)은 야생형 또는 조작된 WPRE 서열, 예를 들어 Zanta-Boussif 등 (2009) Gene Therapy 16:605-619 및 미국 특허 번호 제10,179,918호에 기재된 WPRE mut6 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 WPRE 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, mut6 돌연변이는 J04514 WPRE 요소에서 생성되는 반면, 다른 실시형태에서 이들은 J02442.1 WPRE에서 생성된다(Ong 등(2017) doi.org/10.1101/126904). 특정 실시형태에서, 발현 GLA 작제물은 도 1b에 도시된 작제물(변이체 #21)을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 WPRE-함유 발현 작제물은 WPRE 서열을 포함하지 않는 발현 작제물에 비해 개선된 트랜스진 발현 및 활성을 초래한다(예를 들어, 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 이상 증가된 발현 또는 활성). 특정 실시형태에서, 발현 작제물은 표 1에 제시된 것이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 대상체의 세포에서 하나 이상의 교정 GLA 트랜스진을 암호화하는 트랜스진을 발현하는 방법을 설명한다. 트랜스진은 적합한 표적 세포(예를 들어, 혈액 세포, 간 세포, 뇌 세포, 줄기 세포, 전구 세포 등)의 게놈 내로 삽입될 수 있어, 그 교정 트랜스진에 의해 암호화된 α-GalA 생성물이 세포의 게놈내로 안정적으로 통합되거나("IVPRP" 접근법이라고도 함), 대안적으로 트랜스진은 세포에서 염색체 외로 유지될 수 있다("cDNA" 접근법이라고도 함). 일 실시형태에서, 교정 GLA 트랜스진은 대체 단백질의 시험관내 생산을 위해 세포주의 세포에(안정적으로 또는 염색체 외로) 도입되고, 이어서 (예를 들어, 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 제거함으로써) 파브리병에 걸린 대상체를 치료하기 위해 (선택적으로 정제 및/또는 단리된) 단백질이 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 교정 트랜스진에 의해 암호화된 α-GalA 생성물은 치료되지 않은 대상체와 비교하여 대상체의 조직에서 α-GalA 활성을 임의의 양만큼, 예를 들어 2 내지 100배(또는 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배를 포함하는 이들 사이의 임의의 값), 100 내지 500배(또는 그 사이의 임의의 값), 500 내지 1000배(또는 그 사이의 임의의 값) 또는 1000 내지 2000배 이상을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 약 2 내지 약 2000배 이상 (또는 그 사이의 임의의 값) 증가시킨다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 (예를 들어, 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 감소 및/또는 제거함으로써) 파브리병에 걸린 대상체를 치료하는 생체 외 또는 생체 내 방법이며, 상기 방법은 GLA 트랜스진을 본원에 기재된 세포(cDNA 및/또는 IVPRP 접근법)에 삽입하여, 단백질이 파브리병을 가진 대상체에서 생산되도록 하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, GLA 트랜스진은 표 1에 개시된 바와 같은 작제물의 일부이다. 특정 실시형태에서, GLA 트랜스진을 포함하는 단리된 세포는 예를 들어, 세포를 파브리병에 걸린 대상체에게 투여함으로써, 치료를 필요로 하는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 교정 GLA 트랜스진은 대체 단백질이 생체 내에서 생산되도록 체내 표적 조직에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 교정 트랜스진은 표적 조직의 세포 게놈에 삽입되는 반면, 다른 바람직한 실시형태에서, 교정 트랜스진은 표적 조직의 세포에 삽입되고 세포에서 염색체 외로 유지된다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 발현된 α-GalA 단백질은 GLA 트랜스진(교차 교정)이 결여된 (예를 들어, 혈액으로의 배출을 통해) 다른 조직의 다른 세포를 포함하여 2차 표적에 작용하거나 2차 표적에 의해 흡수될 수 있도록 세포로부터 배출될 수 있다. 일부 예에서 1차 및/또는 2차 표적 조직은 간이다. 다른 경우에, 1차 및/또는 2차 표적 조직은 뇌이다. 다른 경우에, 1차 및/또는 2차 표적은 혈액(예를 들어, 혈관계)이다. 다른 경우에, 1차 및/또는 2차 표적은 골격근이다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 파브리를 앓고 있는 대상체의 조직에 침착된 글로보트리아오실세라미드(GL-3 및 Gb3로도 알려짐) 및 글로보트리아오실스핑고신(리소-Gb3), 갈라비오아실세라미드를 포함하는 글리코스핑고지질의 양을 감소시키는 데 사용된다. 특정 실시형태에서, 교정 트랜스진에 의해 암호화된 α-GalA 생성물은 치료되지 않은 대상체에 비해 대상체의 조직에서 글리코스핑고지질을 임의의 양, 예를 들어 2배 내지 100배(또는 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배를 포함하는 그 사이의 임의의 값)를 포함하는, 약 2배 내지 약 100배(또는 그 사이의 임의의 값) 더 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 교정 트랜스진에 의해 암호화된 α-GalA 생성물은 치료되지 않은 대상체와 비교하여 대상체의 조직에서 글리코스핑고지질을 임의의 양만큼, 예를 들어 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 약 100% 감소시킨다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 교정 GLA 트랜스진은 기능하는 GLA 유전자의 야생형 서열을 포함하는 반면, 다른 실시형태에서, 교정 GLA 트랜스진의 서열은 향상된 생물학적 활성을 제공하기 위해 일부 방식으로 변경된다(예를 들어, 생물학적 활성을 증가시키기 위한 최적화된 코돈 및/또는 유전자 발현을 개선하기 위한 전사 및 번역 조절 서열의 변경). 일부 실시형태에서, GLA 유전자는 발현 특성을 개선하기 위해 변형된다. 이러한 변형은 번역 시작 부위(예를 들어, 메티오닌)의 삽입, 최적화된 Kozak 서열의 추가, 신호 펩타이드의 삽입 및/또는 코돈 최적화를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 신호 펩타이드는 알부민 신호 펩타이드, F.IX 신호 펩타이드, IDS 신호 펩타이드 및/또는 α-GalA 신호 펩타이드로부터 선택될 수 있다.
특정 양태에서, 공여체는 cDNA 공여체이다. cDNA 공여체는 전형적으로 인핸서 서열, 프로모터 서열, 인트론 서열, 신호 펩타이드, GLA 암호화 서열, 폴리아데닐화 신호, 및 선택적으로 야생형 또는 돌연변이된 WPRE 서열을 포함한다. 비제한적인 예시적인 cDNA 공여체는 도 1a 및 도 1b에 개략적으로 도시되어 있다.
임의의 프로모터, 인핸서, 인트론, 신호 펩타이드, GLA-암호화 또는 폴리A 서열 및 임의의 WPRE 서열이 cDNA 작제물에 사용될 수 있는 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 인핸서 및/또는 프로모터는 간-특이적이며, 예를 들어 인간 ApoE 인핸서 및 인간 α1-항-트립신(hAAT) 프로모터로 구성된다(Miao CH 등 (2000) Mol. Ther. 1(6): 522-532 (200)). 일부 실시형태에서, 간 특이적 프로모터는 하나 이상의 ApoE 인핸서 서열(예를 들어, 1, 2, 3 및/또는 4; Okuyama 등 (1996) Hum Gen Ther 7(5):637-45 참조)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 인트론에 연결된다. 일부 실시형태에서, 인트론은 인간 β-글로빈 유전자의 제1 인트론으로부터의 5' 공여체 부위 및 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 인트론으로부터의 분지 및 3' 수용체 부위를 포함하는 HBB-IGG 키메라 인트론이다. 일부 실시형태에서, ApoE/hAAT 프로모터는 의도된 표적 조직인 간세포에서 특이적이고 고활성이지만, 비-간 세포 및 조직 유형에서는 비활성이고; 비-표적 조직에서 발현 및 활동을 감소 또는 방지한다. 특정 실시형태에서, 신호 펩타이드는 GLA 신호 펩타이드를 포함하고 폴리아데닐화 신호는 SPA51 또는 bGH 폴리A 서열을 포함한다. 임의의 WPRE 서열은 임의의 야생형 또는 돌연변이된 WPRE 서열일 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제10,179,918호를 참조한다. 특정 실시형태에서, WPRE 서열은 mut6 WPRE 서열과 같은 돌연변이된 WPRE를 포함한다.
본원에 기재된 cDNA 발현 벡터는 임의의 혈청형(예를 들어, AAV2, AAV6 또는 AAV2/6)의 AAV와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 임의의 적합한 벡터를 통해 전달될 수 있다.
특정 실시형태에서, 발현 서열(즉, 발현 벡터 또는 발현 작제물)은 도 1b에 도시되고, 하기 표 1에 개시된 변이체 #21의 요소 및 서열을 포함한다.
표 1:변이체 #21 cDNA 요소 및 전체 시퀀스
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
WPRE 서열을 포함하는 표 1의 발현 작제물은 임상 규모로 쉽게 생산될 수 있으며, WPRE 서열을 포함하지 않는 발현 작제물과 비교하여, 개선된 GLA 활성, 예를 들어 적어도 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 11배, 약 12배, 약 13배, 약 14배, 약 15배, 약 16배, 약 17배, 약 18배, 약 19배, 약 20배를 나타내는 것으로 나타났다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 뉴클레아제를 암호화하고, 프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레아제(예를 들어, ZFN, ZFN 쌍, TALEN, TALEN 쌍 및/또는 CRISPR/Cas 시스템) 발현 벡터가 본원에 기재된다. 일 실시형태에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 추가 양태에서, 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 본원에 기재된 바와 같은 α-GalA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 GLA 발현 벡터가 본원에 기재된다. 한 실시형태에서, 발현은 바이러스 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 뉴클레아제(예를 들어, ZFN, ZFN 쌍, TALEN, TALEN 쌍 및/또는 CRISPR/Cas 시스템) 발현 벡터 및/또는 α-GalA 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 기재된다. 숙주 세포는 안정하게 형질전환되거나 일시적으로 형질감염되거나 하나 이상의 뉴클레아제 발현 벡터와 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 간 세포이다.
다른 실시형태에서, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제(예를 들어, ZFN, ZFN 쌍, TALEN, TALEN 쌍 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)(또는 상기 뉴클레아제를 암호화하는 하나 이상의 벡터) 및 뉴클레아제로 표적 절단 후 유전자에 삽입되는 "공여체" 서열 또는 GLA 트랜스진을 사용하여 임의의 표적 유전자의 게놈 서열을 본원에 기재된 바와 같은 치료 GLA 트랜스진으로 대체하는 방법이 제공된다. GLA 서열은 뉴클레아제(또는 이의 성분)를 운반하는 벡터에 존재할 수 있고, 별도의 벡터(예를 들어, Ad, AAV 또는 LV 벡터 또는 mRNA)에 존재할 수 있거나, 대안적으로 다른 핵산 전달 메커니즘을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 공여체 뉴클레오타이드 서열을 표적 유전자좌(예를 들어, 고도로 발현된 유전자, 질환 관련 유전자, 기타 세이프 하버 유전자 등)로 삽입하면, 표적 유전자좌(예를 들어, 알부민, 글로빈 등) 내인성 유전자 제어 요소의 제어하에 GLA 트랜스진의 발현을 초래한다. 일부 양태에서, 예를 들어 표적 유전자(예를 들어, 알부민)로 GLA 트랜스진을 삽입하면, 온전한 α-GalA 단백질 서열의 발현을 초래하고 표적에 의해 암호화된 임의의 아미노산(예를 들어, 알부민)이 결여된다. 다른 양태에서, 발현된 외인성 α-GalA 단백질은 융합 단백질이고, GLA 트랜스진에 의해, 그리고 (예를 들어, 내인성 표적 유전자좌로부터 또는 대안적으로 표적 유전자좌의 서열을 암호화하는 트랜스진 상의 서열로부터) GLA 트랜스진이 삽입되는 내인성 유전자좌에 의해 암호화된 아미노산을 포함한다. 표적은 임의의 유전자, 예를 들어 세이프 하버 유전자, 예컨대 알부민 유전자, AAVS1 유전자, HPRT 유전자; CCR5 유전자; 또는 고도로 발현된 유전자, 예컨대 RBC 전구체 세포의 글로빈 유전자(예를 들어, 베타 글로빈 또는 감마 글로빈)일 수 있다. 어떤 경우에는 내인성 서열이 외인성 α-GalA 단백질의 아미노(N)-말단 부분에 존재하는 반면, 다른 경우 내인성 서열은 외인성 α-GalA 단백질의 카르복시(C)-말단 부분에 존재할 것이다. 다른 경우에, 내인성 서열은 α-GalA 외인성 단백질의 N- 및 C-말단 부분 모두에 존재할 것이다. 일부 실시형태에서, 내인성 서열은 세포로부터 α-GalA 단백질의 분비 과정 동안 제거되는 분비 신호 펩타이드를 암호화한다. 내인성 서열은 전장 야생형 또는 돌연변이 내인성 서열을 포함할 수 있거나, 대안적으로 부분 내인성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자-트랜스진 융합은 세포 내의 내인성 유전자좌에 위치하는 반면, 다른 실시형태에서, 내인성 서열-트랜스진 암호화 서열은 게놈 내의 다른 유전자좌에 삽입된다(예를 들어, GLA-트랜스진 서열은 알부민, HPRT 또는 CCR5 유전자좌에 삽입됨). 일부 실시형태에서, GLA 트랜스진은 치료용 α-GalA 단백질 생성물이 세포(예를 들어, 전구체 또는 성숙한 세포) 내에 유지되도록 발현된다. 다른 실시형태에서, GLA 트랜스진은 발현시 트랜스진 α-GalA 융합이 치료 단백질의 표면 국소화를 초래하도록 막 단백질의 세포 외 도메인에 융합된다. 일부 양태에서, 편집된 세포는 세포를 특정 조직 유형으로 트래픽하기 위해 막 횡단 단백질을 추가로 포함한다. 일 양태에서, 막 횡단 단백질은 항체를 포함하는 반면, 다른 양태에서 막 횡단 단백질은 수용체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 전구체(예를 들어, CD34+ 또는 조혈 줄기 세포) 또는 성숙한 RBC(본원에 기재된 바와 같이 유전적으로 변형된 GAL-생산 세포로부터 유래됨)이다. 일부 양태에서, 트랜스진에 암호화된 치료용 α-GalA 단백질 생성물은 세포 밖으로 내 보내져 트랜스진이 없는 세포에 영향을 미치거나 흡수된다. 특정 실시형태에서, 세포는 치료용 α-GalA 단백질을 혈류로 방출하여 원위 조직(예를 들어, 신장, 비장, 심장, 뇌, 피부 등)에 작용하는 간 세포이다.
일 실시형태에서, GLA 트랜스진은 알부민 유전자좌로의 삽입 후 알부민 프로모터로부터 발현된다. GLA 트랜스진에 의해 암호화된 생물학적 제제는 트랜스진이 생체 내에서 간세포에 삽입되면 혈류로 방출될 수 있다. 일부 양태에서, GLA 트랜스진은 정맥 내 투여를 통해 바이러스 벡터로 생체 내에서 간에 전달된다. 일부 실시형태에서, 공여체 GLA 트랜스진은 α-GalA 암호화 서열(Kozak (1987) Nucl Acid Res 15(20):8125-48) 이전에 Kozak 컨센서스 서열을 포함하여, 발현된 생성물이 알부민 신호 펩타이드가 결여되도록 한다. 일부 실시형태에서, 공여체 α-GalA 트랜스진은 천연 GLA 신호 서열 대신에 알부민, IDS 또는 F9 유전자로부터의 것과 같은 대체 신호 펩타이드를 함유한다.
추가 양태에서, 핵산 서열을 내인성 유전자좌(예를 들어, 질환-관련, 고도로 발현됨, 예컨대 간 세포의 알부민 유전자좌 또는 염색체의 RBC 전구체 세포내 글로빈 유전자좌)로, 예를 들어 비인간 배아의 염색체 내로의 부위 특이적 통합을 위한 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시형태에서, 방법은 (a) 비인간 배아에 (i) 적어도 하나의 DNA 벡터 및 (ii) 표적 유전자좌에서 통합 부위를 인식하는 적어도 하나의 뉴클레아제(징크 핑거, ZFN 쌍, TALE 뉴클레아제, TALEN 쌍 또는 CRISPR/Cas 시스템)를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 분자를 주입하는 단계로서, 여기서 DNA 벡터는 통합될 α-GalA 암호화 핵산 서열에 인접하는 업스트림 서열 및 다운스트림 서열을 포함하는 단계, 및 (b) 뉴클레아제(ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)의 발현을 허용하도록 배아를 배양하는 단계로서, DNA 벡터와의 상동성 재조합을 통해 뉴클레아제에 의한 통합 부위에 도입된 이중 가닥 파단이 복구되어 핵산 서열을 염색체에 통합시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다.
뉴클레아제
트랜스진이 표적화된 방식으로 게놈 내로 통합되도록 세포의 게놈 절단을 위한 뉴클레아제 및 트랜스진을 운반하는 공여체 분자의 생체 내 절단에 유용한, 적어도 하나의 ZFN, TALEN, 호밍 엔도뉴클레아제, 및 CRISPR/Cas 및/또는 Ttago 가이드 RNA를 포함하는 시스템을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 본원에 기재된 방법의 양태의 실시에 임의의 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 따라서, 본원에는 선택된 유전자를 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제를 포함하는 조성물이 기재되어 있으며, 절단은 유전자의 게놈 변형(예를 들어, 절단된 유전자로의 삽입 및/또는 결실)을 초래한다. 특정 실시형태에서, 뉴클레아제 중 하나 이상은 자연적으로 발생한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제 중 하나 이상은 비-천연 발생이며, 즉 DNA-결합 분자(DNA-결합 도메인이라고도 함) 및/또는 절단 도메인에서 조작된다. 예를 들어, 자연 발생 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 선택된 표적 부위에 결합하도록 변경될 수 있다(예를 들어, 선택된 표적 부위에 결합하도록 조작된 CRISPR/Cas의 ZFP, TALE 및/또는 sgRNA). 다른 실시형태에서, 뉴클레아제는 이종성 DNA-결합 및 절단 도메인(예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제; TAL-효과기 도메인 DNA-결합 단백질; 이종성 절단 도메인을 갖는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제는 Ttago 시스템의 CRISPR/Cas와 같은 시스템을 포함한다.
DNA-결합 도메인
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 공여체 분자에 결합하고/하거나 세포 게놈내 관심 영역에 결합하기 위해 메가뉴클레아제(호밍 엔도뉴클레아제) DNA-결합 도메인을 사용한다. 자연-발생 메가뉴클레아제는 15~40개의 염기쌍 절단 부위를 인식하고, 일반적으로 4개의 계열: LAGLIDADG 계열(서열번호:10에 개시된 "LAGLIDADG"), GIY-YIG 계열, His-Cyst 박스 계열 및 HNH 계열로 그룹화된다. 예시적인 호밍 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII을 포함한다. 그들의 인식 순서는 알려져 있다. 또한, 미국 특허 번호 제5,420,032호; 미국 특허 번호 제6,833,252호; Belfort 등 (1997) Nucleic AcidsRes.25:3379-3388; Dujon 등 (1989) Gene 82:115-118; Perler 등 (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble 등 (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast 등 (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그를 참고한다. 또한, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, Chevalier 등 (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat 등 (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth 등 (2006) Nature 441:656-659; Paques 등 (2007) Current Gene Therapy7:49-66; 미국 특허 번호 제8,021,867호를 참고한다. 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 전체로서 뉴클레아제의 맥락에서 변경될 수 있거나(즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록), 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용된 뉴클레아제 중 하나 이상의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 효과기 DNA-결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,586,526호를 참고하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물에서 많은 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 크산토모나스의 병원성은 식물 세포에 25개 초과의 다른 효과기 단백질을 주입하는 보존된 유형 III 분비(T3S) 시스템에 따라 달라진다. 이러한 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 전사체를 조작하는 전사 활성화제-유사(TAL) 효과기가 있다(Kay 등(2007) Science 318:648-651 참조). 이 단백질은 DNA-결합 도메인과 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특성화된 TAL-효과기 중 하나는 크산토모나스 캄페스트그리스 pv. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다(Bonas 등 (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 및 WO2010079430 참조). TAL-효과기는 탠덤 반복의 중앙 도메인을 포함하며, 각 반복은 약 34개의 아미노산을 포함하며, 이는 이러한 단백질의 DNA-결합 특이성에 핵심이다. 또한, 그들은 핵 국소화 서열과 산성 전사 활성화 도메인을 포함한다(검토를 위해 Schornack S, 등(2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272 참조). 또한, 식물병원성 박테리아인 랄스토니아 솔라나케아룸(Ralstonia solanacearum)에서 R. solanacearumbiovar 1 균주 GMI1000 및 biovar 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 계열에 상동성인 brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 발견되었다(Huer 등(2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). 이들 유전자는 뉴클레오타이드 서열이 서로 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인에서 1,575bp의 결실이 상이하다. 그러나 두 유전자 산물은 크산토모나스의 AvrBs3 계열 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,586,526호를 참고하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
이러한 TAL 효과기의 특이성은 직렬 반복에서 발견되는 서열에 따라 달라진다. 반복된 서열은 약 102bp를 포함하고 반복은 전형적으로 서로 91~100% 상동성이다(Bonas 등, ibid). 반복의 다형성은 일반적으로 위치 12 및 13에 위치하며, 위치 12 및 13에서 초가변 이잔기(RVD)의 동일성과 TAL-효과기의 표적 서열에서 연속 뉴클레오타이드의 동일성 사이에 일대일 대응이 있는 것으로 보인다(Moscou 및 Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch 등(2009) Science 326:1509-1512 참조). 실험적으로, 이러한 TAL-효과기의 DNA 인식을 위한 자연 코드는 위치 12 및 13의 HD 서열이 시토신(C)에 결합하고, NG가 T에 결합하고, NI가 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN은 A 또는 G에 결합하고 ING는 T에 결합하도록 결정되었다. 이러한 DNA-결합 반복은 새로운 서열과 상호작용할 수 있고 식물 세포의 비-내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있는 인공 전사 인자를 만들기 위해 새로운 조합과 반복 횟수를 갖는 단백질로 조립되었다(Boch 등, ibid). 조작된 TAL 단백질은 FokI 절단 절반 도메인에 연결되어, 효모 리포터 분석(플라스미드 기반 표적)에서 활성을 나타내는 TAL 효과기 도메인 뉴클레아제 융합(TALEN)을 생성한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,586,526호; Christian 등((2010) Genetics epub 10.1534/genetics.110.120717)를 참고한다.
특정 실시형태에서, 세포 게놈의 생체 내 절단 및/또는 표적 절단에 사용되는 뉴클레아제 중 하나 이상의 DNA-결합 도메인은 징크 핑거 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 징크 핑거 단백질은 선택한 표적 부위에 결합하도록 조작된다는 점에서 비-자연적으로 발생한다. 예를 들어, 참조: 예를 들어, Beerli 등 (2002) Nature Biotechnol.20:135-141; Pabo 등 (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan 등 (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal 등 (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Choo 등 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; 미국 특허 번호 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,503,717호; 제6,689,558호; 제7,030,215호; 제6,794,136호; 제7,067,317호; 제7,262,054호; 제7,070,934호; 제7,361,635호; 제7,253,273호; 제7,888,121호; 제7,972,854호; 및 미국 특허 공개 번호 20050267061호를 참고하며, 이들은 모두 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
조작된 징크 핑거 결합 도메인은 자연-발생 징크 핑거 단백질과 비교하여 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법에는 합리적인 설계와 다양한 유형의 선택이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 합리적 설계는 예를 들어 삼중항(또는 사중항) 뉴클레오타이드 서열 및 개별 징크 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각 삼중항 또는 사중항 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 징크 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참고하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법은 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; 및 WO 01/88197에 개시되어 있다. 또한, 징크 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상은 예를 들어 공동 소유 WO 02/077227에 기술되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고 문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질은 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 예시적인 링커 서열에 대하여 미국 특허 번호 제8,772,453호; 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참고한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 징크 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
표적 부위의 선택; 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구축을 위한 ZFP 및 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 제6,140,081호; 제5,789,538호; 제6,453,242호; 제6,534,261호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,200,759호; WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970; WO　01/88197; WO　02/099084; WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536 및 WO　03/016496에 상세히 기재되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고 문헌에 개시된 바와 같이, 징크 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 징크 핑거 단백질은 예를 들어 5개 이상의 아미노산 길이의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 또한, 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해 미국 특허 번호 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참고한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 징크 핑거 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, DNA결합 도메인은 예를 들어 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 일부이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,697,359호 및 제9,873,894호를 참고한다. 시스템의 RNA 구성요소를 암호화하는 CRISPR(규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복) 유전자좌 및 단백질을 암호화하는 Cas(CRISPR-관련) 유전자좌(Jansen 등, 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova 등, 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova 등, 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft 등, 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60)는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템의 유전자 서열을 구성한다. 미생물 숙주의 CRISPR 유전자좌는 CRISPR-매개 핵산 절단의 특이성을 프로그래밍할 수 있는 비-암호화 RNA 요소뿐만 아니라 CRISPR-관련(Cas) 유전자의 조합을 함유한다.
유형 II CRISPR은 가장 잘 특성화된 시스템 중 하나이며, 4개의 연속 단계로 표적 DNA 이중-가닥 절단을 수행한다. 첫째, 2개의 비-암호화 RNA인 프리-crRNA 어레이와 tracrRNA가 CRISPR 유전자좌에서 전사된다. 둘째, tracrRNA는 프리-crRNA의 반복 영역에 혼성화하고 프리-crRNA를 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙 crRNA로의 처리를 매개한다. 셋째, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체는 표적 인식을 위한 추가 요건인, crRNA의 스페이서와 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 옆에 있는 표적 DNA 상의 프로토스페이서 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 통해 Cas9를 표적 DNA로 유도한다. 마지막으로 Cas9는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에서 이중-가닥 절단을 생성한다. CRISPR/Cas 시스템의 활성은 3단계로 구성된다: (i) '적응'이라는 과정에서 미래의 공격을 방지하기 위해 외래 DNA 서열을 CRISPR 어레이에 삽입, (ii) 관련 단백질의 발현 뿐만 아니라 어레이의 발현 및 처리, 이어서 (iii) 외래 핵산에 의한 RNA-매개 간섭. 따라서, 박테리아 세포에서 소위 'Cas' 단백질 중 일부는 CRISPR/Cas 시스템의 자연적 기능과 관련되어 있으며, 외래 DNA 삽입 등의 기능에서 역할을 한다.
특정 실시형태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질의 "기능성 유도체"일 수 있다. 천연 서열 폴리펩타이드의 "기능성 유도체"는 천연 서열 폴리펩타이드와 공통되는 정성적 생물학적 특성을 갖는 화합물이다. "기능성 유도체"는 천연 서열의 단편 및 천연 서열 폴리펩타이드 및 그의 단편의 유도체를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않으며, 단 이들은 상응하는 천연 서열 폴리펩타이드와 공통적인 생물학적 활성을 갖는다. 본원에서 고려되는 생물학적 활성은 DNA 기질을 단편으로 가수분해하는 기능성 유도체의 능력이다. 용어 "유도체"는 폴리펩타이드의 아미노산 서열 변이체, 공유 변형 및 이들의 융합을 모두 포함한다. Cas 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 적합한 유도체는 Cas 단백질 또는 이의 단편의 돌연변이, 융합, 공유 변형을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. Cas 단백질 또는 이의 단편뿐만 아니라 Cas 단백질의 유도체 또는 이의 단편을 포함하는 Cas 단백질은 세포로부터 얻거나 화학적으로 또는 이들 두 절차의 조합에 의해 합성될 수 있다. 세포는 자연적으로 Cas 단백질을 생산하는 세포이거나 Cas 단백질을 자연적으로 생산하고 더 높은 발현 수준에서 내인성 Cas 단백질을 생산하거나, 외인성 Cas로부터 동일하거나 상이한 Cas를 암호화하는 외인적으로 도입된 핵산으로부터 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 세포일 수 있다. 어떤 경우에는 세포가 자연적으로 Cas 단백질을 생산하지 않고 Cas 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된다. Cas 단백질에 추가로 및/또는 대신에 사용될 수 있는 RNA 유도 뉴클레아제의 추가의 비제한적인 예는 Cpf1과 같은 클래스 2 CRISPR 단백질을 포함한다. 예를 들어, Zetsche 등(2015) Cell 163:1-13을 참고한다.
프란시셀라(Francisella) spp에서 확인된 CRISPR-Cpf1 시스템은 인간 세포에서 강력한 DNA 간섭을 매개하는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템이다. 기능적으로 보존되어 있지만 Cpf1 및 Cas9는 가이드 RNA 및 기질 특이성을 포함하여 여러 양태에서 상이하다(Fagerlund 등, (2015) Genom Bio 16:251 참조). Cas9와 Cpf1 단백질의 주요 차이점은 Cpf1이 tracrRNA를 사용하지 않으므로 crRNA만 필요하다는 점이다. FnCpf1 crRNA는 42~44 뉴클레오타이드 길이(19-뉴클레오타이드 반복 및 23~25-뉴클레오타이드 스페이서)이며, 2차 구조를 유지하는 서열 변경을 허용하는 단일 스템-루프를 포함한다. 또한, Cpf1 crRNA는 Cas9에 필요한 ~ 100-뉴클레오타이드 조작된 sgRNA보다 상당히 짧으며, FnCpfl에 대한 PAM 요건은 변위된 가닥에서 5'-TTN-3' 및 5'-CTA-3'이다. Cas9와 Cpf1 모두 표적 DNA에서 이중 가닥 절단을 생성하지만, Cas9는 RuvC- 및 HNH-유사 도메인을 사용하여 가이드 RNA의 시드 서열 내에서 평활-말단 절단을 생성하는 반면, Cpf1은 RuvC-유사 도메인을 사용하여 시드 바깥쪽에서 엇갈린 절단을 생성한다. Cpf1은 중요한 시드 영역에서 엇갈리게 절단하기 때문에 NHEJ는 표적 부위를 방해하지 않으므로 원하는 HDR 재조합 이벤트가 발생할 때까지 Cpf1이 동일한 부위를 계속 절단할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에서, 용어 "Cas"는 Cas9 및 Cfp1 단백질 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 본원에서 사용되는 "CRISPR/Cas 시스템"은 뉴클레아제 및/또는 전사 인자 시스템을 모두 포함하는 CRISPR/Cas 및/또는 CRISPR/Cfp1 시스템을 모두 지칭한다.
일부 실시형태에서, DNA-결합 도메인은 TtAgo 시스템의 일부이다(Swarts 등, ibid; Sheng 등, ibid 참조). 진핵 생물에서 유전자 침묵은 Argonaute(Ago) 단백질 계열에 의해 매개된다. 이 패러다임에서 Ago는 작은(19~31 nt) RNA에 결합된다. 이 단백질-RNA 침묵 복합체는 작은 RNA와 표적 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍을 통해 표적 RNA를 인식하고 표적 RNA를 엔도뉴클레오타이드적으로 절단한다(Vogel(2014) Science 344:972-973). 대조적으로, 원핵 Ago 단백질은 작은 단일-가닥 DNA 단편에 결합하고, 외래(종종 바이러스) DNA를 검출하고 제거하는 기능을 할 수 있다(Yuan 등, (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, 등(2013)) Mol. Cell 51, 594; Swarts 등, ibid). 예시적인 원핵 Ago 단백질은 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 및 써무스 써모필루스(Thermus thermophilus)로부터의 단백질을 포함한다.
가장 잘 특성화된 원핵 Ago 단백질 중 하나는 써무스 써모필루스(T. thermophilus)로부터의 Ago 단백질(TtAgo; Swarts 등 ibid)이다. TtAgo는 5' 포스페이트 기가 있는 15 nt 또는 13~25 nt 단일-가닥 DNA 단편과 연관된다. TtAgo에 의해 결합된 이 "가이드 DNA"는 단백질-DNA 복합체가 제3자 DNA 분자에서 왓슨-크릭 상보적 DNA 서열에 결합하도록 지시하는 역할을 한다. 이러한 가이드 DNA의 서열 정보가 표적 DNA의 식별을 허용하면 TtAgo-가이드 DNA 복합체가 표적 DNA를 절단한다. 이러한 메커니즘은 또한 TtAgo-가이드 DNA 복합체의 구조에 의해 지원되는 반면 표적 DNA에 결합된다(G. Sheng 등, ibid). 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides)(RsAgo)의 Ago는 비슷한 특성을 가지고 있다(Olivnikov 등 ibid).
임의의 DNA 서열의 외인성 가이드 DNA는 TtAgo 단백질에 로딩될 수 있다(Swarts 등 ibid.). TtAgo 절단의 특이성은 가이드 DNA에 의해 지시되기 때문에, 외인성 조사자-지정 가이드 DNA로 형성된 TtAgo-DNA 복합체는 따라서 TtAgo 표적 DNA 절단을 상보적 조사자-지정 표적 DNA로 보낼 것이다. 이런 식으로, DNA에서 표적 이중-가닥 절단을 만들 수 있다. TtAgo-가이드 DNA 시스템(또는 다른 유기체로부터의 오솔로그 Ago-가이드 DNA 시스템)을 사용하면 세포 내에서 게놈 DNA의 표적 절단이 가능하다. 이러한 절단은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 포유동물 게놈 DNA의 절단을 위해, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 TtAgo 코돈 버전을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 또한, TtAgo 단백질이 세포-침투 펩타이드에 융합된 시험관 내에서 형성된 TtAgo-DNA 복합체로 세포를 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 섭씨 37도에서 향상된 활성을 갖도록 돌연변이 유발을 통해 변경된 TtAgo 단백질 버전을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. TtAgo-RNA-매개 DNA 절단은 유전자 녹아웃, 표적화된 유전자 추가, 유전자 교정, DNA 절단의 착취를 위한 기술 표준을 사용하는 표적화된 유전자 결실을 포함하는 결과의 전체에 영향을 미치는 데 사용될 수 있다.
따라서, 뉴클레아제는 공여체(트랜스진)를 삽입하고자 하는 임의의 유전자의 표적 부위에 특이적으로 결합하는 DNA-결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인
임의의 적합한 절단 도메인은 뉴클레아제를 형성하기 위해 DNA-결합 도메인에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인은 뉴클레아제 도메인에 융합되어 ZFN을 생성한다. 이는 조작된(ZFP) DNA-결합 도메인을 통해 의도된 핵산 표적을 인식하고 뉴클레아제 활성을 통한 ZFP 결합 부위 근처에서 DNA가 절단되도록 하는 기능적 실체이다. 예를 들어, Kim 등(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-1160을 참고한다. 용어 "ZFN"은 표적 유전자를 절단하기 위해 이량체화하는 한 쌍의 ZFN을 포함한다. 최근에는 ZFN이 다양한 유기체의 게놈 변형에 사용되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,888,121호; 제8,409,861호; 제8,106,255호; 및 제9,447,434호를 참고한다. 마찬가지로, TALE DNA-결합 도메인은 TALEN을 생성하기 위해 뉴클레아제 도메인에 융합되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,586,526호를 참고한다. 표적 절단을 유도하기 위해 DNA에 결합하고 절단 도메인(예를 들어, Cas 도메인)과 결합하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템도 기술되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,697,359호 및 제8,932,814호 및 미국 특허 번호 제9,873,894호를 참고한다.
위에서 언급한 바와 같이, 절단 도메인은 DNA-결합 도메인, 예를 들어 징크 핑거 DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제로부터의 절단 도메인 또는 TALEN DNA-결합 도메인 및 뉴클레아제로부터의 절단 도메인; 뉴클레아제로부터의 sgRNA DNA-결합 도메인 및 절단 도메인(CRISPR/Cas); 및/또는 메가뉴클레아제 DNA-결합 도메인 및 상이한 뉴클레아제로부터의 절단 도메인에 대해 이종성일 수 있다. 이종 절단 도메인은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들어, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort 등 (1997) Nucleic Acids Res.25:3379-3388을 참고한다. DNA를 절단하는 추가 효소가 알려져 있다(예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코커스(micrococcal) 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 Linn 등(eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993 참조). 하나 이상의 이들 효소(또는 이의 기능성 단편)는 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는, 상기 기재된 바와 같이 임의의 뉴클레아제 또는 그의 일부로부터 유도될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하는 경우 절단을 위해 2개의 융합 단백질이 필요하다. 대안적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있거나, 각각의 절단 절반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 바람직하게는 서로에 대해 배치되어, 2개의 융합 단백질이 각각의 표적 부위에 결합하면 절단 절반-도메인이 서로 공간적 방향으로 배치되어 예를 들어, 이량체화에 의해 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 절반-도메인을 절단한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 표적 부위의 가까운 가장자리는 5~8개 뉴클레오타이드 또는 15~18개 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 그러나, 임의의 정수 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍은 2개의 표적 부위 사이에 개재할 수 있다(예를 들어, 2 내지 50개 뉴클레오타이드 쌍 이상). 일반적으로 절단 부위는 표적 부위 사이에 있다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하고 DNA(인식 부위)에 서열-특이적 결합을 할 수 있고 결합 부위 또는 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, IIS 형)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리 가능한 결합 및 절단 도메인을 가지고 있다. 예를 들어, IIS형 효소 Fok I은 한 가닥의 인식 부위로부터 9개 뉴클레오타이드, 다른 가닥의 인식 부위로부터 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이중-가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호; 뿐만 아니라 Li 등(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li 등(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim 등(1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim 등(1994b) J. Biol. Chem. 269: 31,978-31,982를 참고한다. 따라서, 일 실시형태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 유형 IIS 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 절반-도메인) 및 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리 가능한 예시적인 유형 IIS 제한 효소는 Fok I이다. 이 특정 효소는 이량체로서 활성이다. Bitinaite 등(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10,570-10,575. 따라서, 본 개시내용의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에 사용되는 Fok I 효소의 일부는 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 징크 핑거-Fok I 융합을 사용한 세포 서열의 표적화된 이중-가닥 절단 및/또는 표적화된 대체를 위해, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매 활성 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 대안적으로, 징크 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자가 또한 사용될 수 있다. 징크 핑거-Fok I 융합을 사용한 표적 절단 및 표적 서열 변경을 위한 파라미터는 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 보유하거나 기능적 절단 도메인을 형성하기 위해 다중화(예를 들어, 이량체화)하는 능력을 보유하는 단백질의 임의의 부분일 수 있다.
예시적인 유형 IIS 제한 효소는 그 전체가 본원에 포함된 미국 특허 번호 제7,888,121호에 기재되어 있다. 추가 제한 효소는 또한 분리 가능한 결합 및 절단 도메인을 포함하며, 이들은 본 개시내용에 의해 고려된다. 예를 들어, Roberts 등(2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420을 참고한다.
특정 실시형태에서, 절단 도메인은 예를 들어 미국 특허 번호 제8,772,453호; 제8,623,618호; 제8,409,861호; 제8,034,598호; 제7,914,796호; 및 제7,888,121호에 기술된 바와 같이 동종이량체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 절단 절반-도메인(이량체화 도메인 돌연변이체라고도 함)을 포함하며, 이들 모두의 개시는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에 있는 아미노산 잔기는 모두 FokI 절단 절반 도메인의 이량체화에 영향을 주는 표적이다.
절대 이종이량체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 절반-도메인은 제1 절단 절반-도메인이 FokI의 위치 490 및 538에서 아미노산 잔기에서의 돌연변이를 포함하고 제2 절단 절반-도메인이 아미노산 잔기 486 및 499에서의 돌연변이를 포함하는 한 쌍을 포함한다.
따라서, 일 실시형태에서, 490에서의 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)로 대체하고; 538에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체하고; 486에서의 돌연변이는 Gln(Q)을 Glu(E)로 대체하고; 위치 499에서의 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 대체한다. 구체적으로, 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 하나의 절단 절반-도메인에서 위치 490(E→K) 및 538(I→K)을 돌연변이시켜 "E490K:I538K"("KK")로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생성하고, 또 다른 절단 절반-도메인에서 위치 486(Q→E) 및 499(I→L)를 돌연변이시켜 "Q486E:I499L", ("EL")로 지정된 조작된 절단 절반-도메인을 생성함으로써 제조되었다. 본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 비정상적인 절단이 최소화되거나 폐지되는 절대 이종이량체 돌연변이체이다. 미국 특허 번호 제7,914,796호 및 제8,034,598호를 참고하며, 그 개시내용은 그 전체가 참고로 포함된다. 특정 실시형태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 486, 499 및 496(야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서의 돌연변이, 예를 들어 위치 486에서 야생형 Gln(Q) 잔기를 Glu(E) 잔기로, 위치 499에서의 야생형 Iso(I) 잔기를 Leu(L) 잔기로, 그리고 위치 496에서의 야생형 Asn(N) 잔기를 Asp(D) 또는 Glu(E) 잔기로 대체하는 돌연변이를 포함한다(또한 각각 "ELD" 및 "ELE" 도메인으로 지칭됨). 다른 실시형태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490, 538 및 537(야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서의 돌연변이, 예를 들어 위치 490에서의 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 위치 538에서의 야생형 Iso(I) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 그리고 위치 537에서의 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로 대체하는 돌연변이를 포함한다(또한 각각 "KKK" 및 "KKR" 도메인으로 지칭됨). 다른 실시형태에서, 조작된 절단 절반-도메인은 위치 490 및 537(야생형 FokI에 대해 넘버링됨)에서의 돌연변이, 예를 들어 위치 490에서의 야생형 Glu(E) 잔기를 Lys(K) 잔기로, 그리고 위치 537에서의 야생형 His(H) 잔기를 Lys(K) 잔기 또는 Arg(R) 잔기로 대체하는 돌연변이를 포함한다(또한 각각 "KIK" 및 "KIR" 도메인으로 지칭됨). 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,772,453호를 참고한다. 다른 실시형태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 "Sharkey" 돌연변이를 포함한다(Guo 등, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107 참조).
본원에 기재된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 번호 제8,623,618호; 제8,409,861호; 제8,034,598호; 제7,914,796호; 및 제7,888,121호에 기술된 바와 같이 야생형 절단 절반-도메인(Fok I)의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
비-표적 부위로 알려진 다른 의도하지 않은 절단 부위에 비해 의도된 표적에 대한 뉴클레아제 쌍의 특이성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물도 사용된다(미국 특허 공개 번호 20170218349 및 20180087072 참조). 따라서, 본원에 기재된 뉴클레아제는 하나 이상의 DNA 결합 도메인 백본 영역에서의 돌연변이 및/또는 이들의 뉴클레아제 절단 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레아제는 DNA 백본의 인산염과 비특이적으로 상호작용할 수 있는 ZFP DNA 결합 도메인('ZFP 백본') 내의 아미노산에 대한 돌연변이를 포함할 수 있지만, DNA 인식 나선의 변화는 포함하지 않는다. 따라서, ZFP는 뉴클레오타이드 표적 특이성에 필요하지 않은 ZFP 백본에서 양이온성 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, ZFP 백본에서의 이러한 돌연변이는 양이온성 아미노산 잔기를 중성 또는 음이온성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, ZFP 백본에서의 이러한 돌연변이는 극성 아미노산 잔기를 중성 또는 비극성 아미노산 잔기로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, DNA-결합 나선에 대해 위치 (-5), (-9) 및/또는 위치 (-14)에서 만들어진 돌연변이. 일부 실시형태에서, 징크 핑거는 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, 멀티-핑거 징크 핑거 단백질에서 하나 이상의 징크 핑거는 (-5), (-9) 및/또는 (-14)에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, (-5), (-9) 및/또는 (-14)의 아미노산(예를 들어, 아르기닌(R) 또는 리신(K))은 알라닌(A), 류신(L), Ser(S), Asp(N), Glu(E), Tyr(Y) 및/또는 글루타민(Q)으로 돌연변이된다.
특정 실시형태에서, 조작된 절단 절반 도메인은 FokI 뉴클레아제 도메인으로부터 유래되고, 야생형 전장 FokI에 대해 넘버링된 아미노산 잔기 416, 422, 447, 448 및/또는 525 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 잔기 416, 422, 447, 448 및/또는 525에서의 돌연변이는 FokI "ELD", "ELE", "KKK", "KKR", "KK", "EL", "KIK", "KIR" 및/또는 위에서 설명한 Sharkey에 도입된다.
추가로, 뉴클레아제 복합체의 조작된 절단 절반-도메인 파트너의 독립적 적정을 통해 절단 활성의 특이성을 증가시키는 방법이 본원에 기재되어있다. 일부 실시형태에서, 두 파트너(절반 절단 도메인)의 비율은 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:8, 1:9, 1:10 또는 1:20 비율 또는 그 사이의 값으로 제공된다. 다른 실시형태에서, 두 파트너의 비율은 1:30보다 크다. 다른 실시형태에서, 두 파트너는 1:1과 다른 비율로 배치된다. 개별적으로 또는 조합하여 사용되는 경우, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 표적 외 절단 활성의 감소를 통해 표적화 특이성의 놀랍고 예상치 못한 증가를 제공한다. 이들 실시형태에서 사용되는 뉴클레아제는 ZFN, 한 쌍의 ZFN, TALEN, 한 쌍의 TALEN, CRISPR/Cas, CRISPR/dCas 및 TtAgo, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
대안적으로, 뉴클레아제는 소위 "분할-효소" 기술을 사용하여 핵산 표적 부위에서 생체 내 조립될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20090068164 참조). 이러한 분할 효소의 성분은 별도의 발현 작제물에서 발현될 수 있거나, 예를 들어 자가-절단 2A 펩타이드 또는 IRES 서열에 의해 개별 성분이 분리되는 하나의 오픈 리딩 프레임에서 연결될 수 있다. 성분은 개별 징크 핑거 결합 도메인 또는 메가뉴클레아제 핵산 결합 도메인의 도메인일 수 있다.
뉴클레아제는 예를 들어 미국 특허 번호 제8,563,314호에 기재된 바와 같이 효모-기반 염색체 시스템에서 사용 전에 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 뉴클레아제의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 라피노스 및/또는 갈락토스의 존재하에 활성화되고(감소된) 글루코스 존재하에 억제되는 갈락토키나제 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.
Cas9 관련 CRISPR/Cas 시스템은 2개의 RNA 비-암호화 구성요소: tracrRNA 및 동일한 직접 반복(DR)에 의해 간격을 두고있는 뉴클레아제 가이드 서열(스페이서)을 함유하는 프리-crRNA 어레이를 포함한다. 게놈 조작을 수행하기 위해 CRISPR/Cas 시스템을 사용하려면 이러한 RNA의 두 기능이 모두 존재해야 한다(Cong 등, (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143 참조). 일부 실시형태에서, tracrRNA 및 프리-crRNA는 별도의 발현 작제물을 통해 또는 별도의 RNA로서 공급된다. 다른 실시형태에서, 키메라 RNA는 조작된 성숙 crRNA(표적 특이성을 부여함)가 tracrRNA(Cas9와의 상호작용을 제공함)에 융합되어 키메라 cr-RNA-tracrRNA 하이브리드(단일 가이드 RNA라고도 함)를 생성하는 곳에서 구성된다.(Jinek ibid 및 Cong, ibid 참조).
표적 부위
위에서 상세히 설명된 바와 같이, DNA 도메인은 유전자좌에서 선택된 임의의 서열, 예를 들어 알부민 또는 다른 세이프 하버 유전자에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 DNA-결합 도메인은 자연적으로 발생하는 DNA-결합 도메인에 비해 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법에는 합리적인 설계와 다양한 유형의 선택이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 합리적 설계는 예를 들어 삼중항(또는 사중항) 뉴클레오타이드 서열 및 개별(예를 들어, 징크 핑거) 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서 각 삼중항 또는 사중항 뉴클레오타이드 서열은 특정 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 DNA의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호를 참고하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. TAL-효과기 도메인의 합리적 설계도 수행될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 8,5896,526호를 참조한다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는 DNA-결합 도메인에 적용 가능한 예시적인 선택 방법은 미국 특허 제5,789,538호; 제5,925,523호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,410,248호; 제6,140,466호; 제6,200,759호; 및 제6,242,568호; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다.
표적 부위의 선택; 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 구축을 위한 뉴클레아제 및 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 미국 특허 번호 제7,888,121호 및 제8,409,891호 상세하게 설명되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
또한, 이들 및 다른 참고 문헌에 개시된 바와 같이, DNA-결합 도메인(예를 들어, 멀티-핑거 징크 핑거 단백질)은 예를 들어 5개 이상의 아미노산의 링커를 포함하는 임의의 적합한 링커 서열을 사용하여 함께 연결될 수 있다. 6개 이상의 아미노산 길이의 예시적인 링커 서열에 대해 예를 들어, 미국 특허 번호 제9,567,609호; 제6,479,626호; 제6,903,185호; 및 제7,153,949호를 참고한다. 본원에 기재된 단백질은 단백질의 개별 DNA-결합 도메인 사이에 적합한 링커의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
공여체
상기 언급된 바와 같이, 예를 들어 돌연변이 유전자를 교정하거나 조성물 파브리병에 없거나 결핍된 단백질(예를 들어, α-GalA)을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키기 위해 외인성 서열("공여체 작제물" 또는 "공여체 서열" 또는 "공여체"라고도 함)을 대상체에 도입하기 위한 방법 및 제공된다.
공여체 서열이 일반적으로 그것이 배치되는 게놈 서열과 동일하지 않다는 것은 쉽게 명백할 것이다. 공여체 서열은 관심 위치에서의 효율적인 HDR을 허용하기 위해 2개의 상동성 영역("상동성 아암")이 옆에 있는 비상동성 서열을 포함할 수 있다. 추가로, 공여체 서열은 세포 염색질에서 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 포함하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 공여체 분자는 세포 염색질에 대해 여러 불연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 관심 영역에 정상적으로 존재하지 않는 서열의 표적 삽입을 위해, 상기 서열은 공여체 핵산 분자에 존재할 수 있고 관심 영역의 서열에 대한 상동성 영역 옆에 있을 수 있다.
선택된 위치로의 삽입을 위해 α-GalA 단백질을 암호화하는 트랜스진의 표적 삽입 방법이 본원에 설명된다. GLA 트랜스진은 전장 α-GalA 단백질을 암호화하거나 절단된 α-GalA 단백질을 암호화할 수 있다. 삽입을 위한 폴리뉴클레오타이드는 또한 "외인성" 폴리뉴클레오타이드, "공여체" 폴리뉴클레오타이드 또는 분자 또는 "트랜스진"으로 지칭될 수 있다. 비-제한적인 예시적인 GLA 공여체 작제물은 도 1a 및 1b에 도시되어 있다.
공여체 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있으며, 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제8,703,489호 및 제9,255,259호를 참고한다. 공여체 서열(들)은 또한 DNA MC 내에 포함될 수 있으며, 이는 원형 또는 선형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20140335063을 참고한다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여체 서열의 말단은 당업자에게 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 외핵 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오타이드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 추가되고/되거나 자기-상보성 올리고뉴클레오타이드가 한쪽 또는 양쪽 말단에 결찰된다. 예를 들어, Chang 등(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls 등(1996) Science 272:886-889를 참고한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드를 분해로부터 보호하기 위한 추가 방법은 말단 아미노기(들)의 첨가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오타이드 간 연결의 사용을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.
폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 복제 기점, 프로모터 및 항생제 내성을 암호화하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 더욱이, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합된 핵산과 같은 네이키드 핵산으로 도입될 수 있거나, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여체는 그의 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉 공여체가 삽입되는 내인성 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(예를 들어, 고도로 발현된 알부민, AAVS1, HPRT 등)에 의해 발현되도록 삽입될 수 있다. 그러나, 공여체는 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있음이 명백할 것이다. 일부 실시형태에서, 공여체는 유전자가 염색체 외로 발현되도록 발현 플라스미드내 세포에 유지된다.
공여체 분자는 내인성 유전자의 전부, 일부가 발현되거나, 또는 전혀 발현되지 않도록 내인성 유전자에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 트랜스진은 예를 들어 α-GalA 단백질(들)을 암호화하는 트랜스진와의 융합으로, 일부(리소좀 효소를 암호화하는 트랜스진에 대한 N-말단 및/또는 C-말단)가 발현되거나 내인성 알부민 서열이 발현되지 않도록 알부민 또는 다른 유전자좌에 삽입될 수 있다. 다른 실시형태에서, 트랜스진(예를 들어, 알부민에 대한 추가 암호화 서열이 있거나없는)은 임의의 내인성 유전자좌, 예를 들어 세이프-하버 유전자좌로 통합된다.
내인성 서열(내인성 또는 트랜스진의 일부)이 트랜스진으로 발현될 때, 내인성 서열(예를 들어, 알부민 등)은 전장 서열(야생형 또는 돌연변이체) 또는 부분 서열일 수 있다. 바람직하게는 내인성 서열은 기능성이다. 이러한 전장 또는 부분 서열(예를 들어, 알부민)의 기능의 비-제한적인 예는 트랜스진(예를 들어, 치료 유전자)에 의해 발현되는 폴리펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키는 것 및/또는 담체로서 작용하는 것을 포함한다.
더욱이, 발현에 필요하지는 않지만, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 절연체, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
트랜스진에 연결된 외인성 서열은 또한 암호화된 단백질의 처리 및/또는 분비를 돕는 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 이들 신호 펩타이드의 비-제한적인 예는 알부민, IDS 및 인자 IX로부터의 것들을 포함한다.
특정 실시형태에서, 외인성 서열(공여체)은 관심 단백질의 융합을 포함하고, 그 융합 파트너로서 막 단백질의 세포 외 도메인을 포함하여 융합 단백질이 세포 표면에 위치하도록 한다. 이는 트랜스진에 의해 암호화된 단백질이 잠재적으로 혈청에서 작용하도록 한다. 파브리병의 경우, 트랜스진에 의해 암호화된 α-GalA 효소는 세포 표면(예를 들어, RBC)의 위치에서 혈청에 축적되는 대사 산물에 작용한다. 또한 정상적인 분해 과정과 같이 RBC가 비장 대식세포에 의해 삼켜진다면, 대식세포가 세포를 삼킬 때 형성된 리소좀은 자연적으로 그 효소에 유리한 pH에서 리소좀에 있는 고농도의 대사 산물에 막 결합 융합 단백질을 노출시킬 것이다. 잠재적인 융합 파트너의 비-제한적인 예는 아래 표 2에 개시되어 있다.
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일부 경우에서, 발현 작제물은 변형된 내인성 GLA 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 코돈 최적화는 내인성 유전자에 대해 수행될 수 있다. 더욱이, 효소 대체 요법에 대한 항체 반응은 문제의 특정 치료 효소와 개별 환자에 따라 다르지만, 야생형 α-GalA로의 효소 대체로 치료받는 많은 파브리병 환자에서 상당한 면역 반응이 관찰되었다. 트랜스진은 트랜스진이 없는 대상체와 비교하여 단백질의 양(및/또는 그의 활성)을 증가시킬 때 치료 단백질을 제공하는 것으로 간주된다. 또한, 치료 효능에 대한 이들 항체의 관련성도 다양하다(Katherine Ponder, (2008) J Clin Invest 118(8):2686 참조). 따라서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 야생형 GLA와 비교하여 변형된 서열을 갖는 발현 작제물의 생성을 포함할 수 있으며, 여기에는 내인성 면역 반응 및/또는 이러한 서열에 의해 생성된 폴리펩타이드가 덜 면역원성이 되도록 하는 절단에 대한 프라이밍 에피토프인 것으로 알려진 부위에서 기능적으로 침묵 아미노산 변화를 생성하는 변형이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
파브리병 환자는 뇌에서 누락된 α-GalA 효소가 없기 때문에 종종 신경학적 후유증을 보인다. 불행히도 혈액 뇌 장벽의 불투과성으로 인해 혈액을 통해 뇌에 치료제를 전달하는 것이 종종 어렵다. 따라서, 방법 및 조성물은 고혈압 만니톨 용액의 경동맥 내 투여, 집중된 초음파 사용 및 브라디키닌 유사체 투여를 통해 일시적인 삼투 파괴와 같은 뇌 모세혈관의 세포 사이의 단단한 접합부의 일시적인 개방을 야기하는 방법을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는, 치료제의 뇌로의 전달을 증가시키는 방법과 함께 사용될 수 있다(Matsukado 등(1996) Neurosurgery 39:125). 대안적으로, 치료제는 뇌로의 특정 수송을 위해 수용체 또는 수송 메커니즘을 활용하도록 설계될 수 있다. 사용될 수 있는 특정 수용체의 예는 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체 또는 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 1 및 2(LRP-1 및 LRP-2)를 포함한다. LRP는 apoE, tPA, PAI-1 등과 같은 다양한 분비 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있으므로 LRP에 대한 이러한 단백질 중 하나의 인식 서열을 융합하면, 간에서의 치료 단백질의 발현 및 혈류로의 분비후, 효소가 뇌로 전달되는 것을 촉진할 수 있다. (Gabathuler, (2010) ibid 참조).
세포
본원에 기재된 방법에 의해 제조된 세포를 포함하여 외인성 GLA 트랜스진(통합 또는 염색체 외)를 포함하는 유전자 변형 세포(예를 들어, 줄기 세포, 전구체 세포, 간 세포, 근육 세포 등)도 제공된다. 이들 세포는 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체에게 세포(들)를 투여함으로써 또는 대안적으로, 세포에 의해 생성된 α-Gal A 단백질을 분리함으로써, 그리고 치료를 필요로 하는 대상체에게 단백질 투여(효소 대체 요법)함으로써, 파브리병 환자에게 α-Gal A 단백질을 제공하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 본원에 기재된 바와 같은 발현 작제물의 투여에 의해 대상체에서 생체 내 생성될 수 있다. 따라서, 단리된 및 생체 내 유전적으로 변형된 세포가 제공된다. 또한 파브리병의 치료에 사용하기 위한 것을 포함하여, 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 GLA 트랜스진을 포함하는 벡터(예를 들어, AAV 또는 Ad 또는 지질 나노입자와 같은 바이러스 벡터)가 제공된다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, GLA 트랜스진은 뉴클레아제를 사용하여 표적 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 적합한 뉴클레아제의 비-제한적인 예는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN), TALEN(단백질 뉴클레아제와 같은 전사 활성화제) 및/또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템을 포함하며, 이는 세포의 게놈 및 하나 이상의 뉴클레아제 도메인(예를 들어, 절단 도메인 및/또는 절단 절반-도메인)에서의 관심 영역(예를 들어, 질병 관련 유전자, 고도로 발현된 유전자, 알부민 유전자 또는 기타 세이프 하버 유전자)에서 표적 부위에 결합하는 DNA-결합 분자를 포함한다. 절단 도메인 및 절단 절반 도메인은 예를 들어 다양한 제한 엔도뉴클레아제, Cas 단백질 및/또는 호밍 엔도뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 특정 실시형태에서, 징크 핑거 도메인은 적혈구 전구 세포(RBC)에서 알부민 유전자 또는 글로빈 유전자의 표적 부위를 인식한다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 제9,877,988호를 참조한다. 다른 실시형태에서, 뉴클레아제(예를 들어, ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)는 세이프-하버 유전자, 예를 들어 CCR5 유전자, PPP1R12C(AAVS1로도 알려짐) 유전자, 알부민, HPRT 또는 Rosa 유전자에 결합하고/하거나 절단한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제9,877,988호; 제9,567,573호; 제9,447,434호; 제9,394,545호; 제9,222,105호; 제9,206,404호; 제9,150,847호; 제8,895,264호; 제8,771,985호; 제8,106,255호; 제7,888,121호; 제7,972,854호; 제7,914,796호; 제7,951,925호; 제8,110,379호; 제8,409,861호; 및 제8,586,526호; 미국 특허 공개 20030232410호 및 20060063231호를 참고한다. 뉴클레아제(또는 이의 구성요소)는 본원에 기재된 하나 이상의 뉴클레아제(예를 들어, ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 제공될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 mRNA일 수 있다. 일부 양태에서, mRNA는 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어 Kormann 등, (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157 참조). 다른 양태에서, mRNA는 ARCA 캡을 포함할 수 있다(미국 특허 제7,074,596호 및 제8,153,773호 참조). 추가 실시형태에서, mRNA는 변형되지 않은 뉴클레오타이드와 변형된 뉴클레오타이드의 혼합물을 포함할 수 있다(미국 특허 공개 20120195936 참조). 추가 실시형태에서, mRNA는 WPRE 요소를 포함할 수 있다(미국 특허 번호 10,179,918 참조).
또 다른 양태에서, 원하는 GLA 트랜스진(선택적으로 뉴클레아제를 사용하여 통합됨)를 갖는 유전적으로 변형된 세포(예를 들어, 줄기 세포, 전구체 세포, 간 세포, 근육 세포 등)가 기술된다. 일부 양태에서, 편집된 줄기 또는 전구체 세포는 확장되고 생체 외에서 성숙한 편집된 세포로 분화하도록 유도될 수 있고, 이어서 세포가 환자에게 제공된다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 유전적으로 편집된(변형된) GLA-생산 줄기 또는 전구체 세포로부터 유래된 세포가 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 편집된 전구체(예를 들어, CD34+줄기 세포)는 성공적인 이식 후, 편집된 세포를 생산하는 것을 증식시키는 골수 이식에서 제공되며, 그 후 생체 내에서 분화되고 성숙되고 GLA 트랜스진으로부터 발현된 생물학적 제제를 함유한다. 일부 실시형태에서, 편집된 CD34+줄기 세포는 편집된 세포가 골수로 이동하고, 분화되고 성숙되어 α-Gal A 단백질을 생성하도록 환자에게 정맥 내로 제공된다. 다른 양태에서, 편집된 줄기 세포는 근육 조직으로 도입되는 근육 줄기 세포이다. 일부 양태에서, 조작된 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN)(용어 "ZFN"은 한 쌍의 ZFN을 포함함)이고, 다른 양태에서 뉴클레아제는 TALE 뉴클레아제(TALEN)(용어 "TALEN"은 한 쌍의 TALEN을 포함함)이고, 다른 양태에서 CRISPR/Cas 시스템이 사용된다. 뉴클레아제는 질병과 관련된 유전자, 또는 세포에서 고도로 발현되는 유전자에 대해 세이프 하버 유전자좌에 대한 특이성을 갖도록 조작될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 세이프 하버 유전자좌는 AAVS1 부위, CCR5 유전자, 알부민 또는 HPRT 유전자일 수 있는 반면, 질병 관련 유전자는 α-갈락토시다제 A를 암호화하는 GLA 유전자일 수 있다.
GLA 트랜스진은 전장 또는 변형될 수 있고 염색체 외로 발현될 수 있거나 하나 이상의 뉴클레아제를 사용하여 표적화된 방식으로 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 무작위 통합과 달리, 뉴클레아제-매개 표적 통합은 트랜스진이 특정 유전자에 통합되도록 한다. 트랜스진은 표적 유전자의 어느 곳에서나 통합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 트랜스진은 뉴클레아제 결합 및/또는 절단 부위에서 또는 그 근처에서, 예를 들어 절단 및/또는 결합 부위의 상류 또는 하류에서 1~300개의 염기 쌍(또는 이들 사이의 임의의 수의 염기 쌍) 내에, 보다 바람직하게는 절단 및/또는 결합 부위의 양쪽의 1~100개 염기쌍(또는 그 사이의 임의의 수의 염기쌍) 내에, 더욱더 바람직하게는 절단 및/또는 결합 부위의 양쪽의 1 내지 50개 염기쌍(또는 그 사이의 임의의 수의 염기쌍) 내에 통합된다. 특정 실시형태에서, 통합 서열은 임의의 벡터 서열(예를 들어, 바이러스 벡터 서열)을 포함하지 않는다.
임의의 세포 유형은 세포 또는 세포주를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 트랜스진을 포함하도록 본원에 기재된 바와 같이 유전적으로 변형될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 유전적으로 변형된 세포의 다른 비-제한적 예는 T-세포(예를 들어, CD4+, CD3+, CD8+ 등); 수지상 세포; B 세포; 자가 조직(예를 들어, 환자 유래), 근육 세포, 뇌 세포 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세포는 간 세포이고, 생체 내에서 변형된다. 특정 실시형태에서, 세포는 이종 다능성, 전능성 또는 다 능성 줄기 세포(예를 들어, CD34+세포, 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC), 배아 줄기 세포 등)를 포함하는 줄기 세포이다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 세포는 환자로부터 유래된 줄기 세포이다.
본원에 기재된 세포는 예를 들어 생체 내 요법에 의해 장애가 있는 대상체에서 파브리병을 치료 및/또는 예방하는데 유용하다. 예를 들어, 뉴클레아제-변형 세포가 확장된 다음 표준 기술을 사용하여 환자에게 재도입될 수 있는 경우 생체 외 요법도 제공된다. 예를 들어, Tebas 등(2014) New Eng J Med 370(10):901을 참고한다. 줄기 세포의 경우, 대상체에게 주입된 후, 이들 전구체가 (삽입된 공여체로부터) 기능성 단백질을 발현하는 세포로의 생체 내 분화도 발생한다.
본원에 기재된 세포를 포함하는 약제학적 조성물도 제공된다. 또한, 세포는 환자에게 투여하기 전에 동결보존될 수 있다.
전달
본원에 기재된 cDNA 발현 작제물, 뉴클레아제, 이들 뉴클레아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 공여체 폴리뉴클레오타이드 및/또는 조성물(예를 들어, 세포, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 등)은 임의의 적합한 수단에 의해 생체 내 또는 생체 외 전달될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레아제를 전달하는 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 제6,453,242호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,599,692호; 제6,607,882호; 제6,689,558호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호에 기재되어 있으며, 이들 모두의 개시는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 발현 작제물 및/또는 뉴클레아제는 또한 징크 핑거, TALEN 및/또는 Cas 단백질(들) 중 하나 이상을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 임의의 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 또한 미국 특허 번호 제6,534,261호; 제6,607,882호; 제6,824,978호; 제6,933,113호; 제6,979,539호; 제7,013,219호; 및 제7,163,824호를 참고하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 더욱이, 이들 벡터 중 임의의 것이 치료에 필요한 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, 하나 이상의 뉴클레아제 및 공여체 작제물이 세포 내로 도입될 때, 뉴클레아제 및/또는 공여체 폴리뉴클레오타이드는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터상에서 운반될 수 있다. 다중 벡터가 사용되는 경우, 각 벡터는 하나 또는 다중 뉴클레아제 및/또는 공여체 작제물을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용하여 cDNA 발현 작제물 또는 뉴클레아제 및/또는 발현 작제물을 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 및 표적 조직에 암호화하는 핵산을 도입할 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템에는 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산 및 리포솜 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합된 핵산이 포함된다. 바이러스 벡터 전달 시스템에는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함되며, 이는 세포로 전달된 후 에피솜 또는 통합 게놈을 가지고 있다. 유전자 치료 절차에 대한 검토는 Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada 등, in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler 및
Figure pct00005
(eds.) (1995); 및 Yu 등, Gene Therapy 1:13-26 (1994)를 참고한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 전기천공, 리포펙션, 미세주입, 바이오리스틱스, 비로좀, 리포솜, 면역리포솜, 폴리양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 작용제 강화 DNA 흡수를 포함한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용하는 초음파 처리는 핵산 전달에 사용될 수도 있다.
추가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(독일 쾰른), Maxcyte, Inc.(메릴랜드주 록빌), BTX 분자 전달 시스템(매사추세츠주 홀리 스톤) 및 Copernicus Therapeutics Inc(예를 들어 US6008336 참조)에서 제공하는 것들을 포함한다. 리포펙션은 예를 들어 미국 특허 번호 제5,049,386호; 제4,946,787호; 및 제4,897,355호)에 기재되어 있으며, 리포펙션 시약(예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™)이 상업적으로 판매된다. 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024의 것을 포함한다.
면역 지질 복합체와 같은 표적화된 리포솜을 포함하는 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese 등, Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr 등, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy 등, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao 등, Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad 등, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 번호 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 및 제4,946,787호 참고).
본원에 기재된 cDNA 및/또는 뉴클레아제 조성물은 또한 나노입자, 예를 들어 지질 나노입자(LNP)를 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, Lee 등 (2016) Am J Cancer Res 6(5):1118-1134; 미국 특허 번호 제10,166,298호; 및 미국 공개 번호 20180185516을 참고한다.
추가 전달 방법은 EnGeneIC 전달 비히클(EDV)로 전달될 핵산을 패키징하는 사용을 포함한다. 이들 EDV는 항체의 한쪽 아암이 표적 조직에 대한 특이성을 갖고 다른 아암이 EDV에 대한 특이성을 갖는 이중특이성 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 전달된다. 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 가져오고, EDV는 세포 내 이입에 의해 세포로 가져온다. 세포에 들어가면 내용물이 방출된다(MacDiarmid 등 (2009) Nature Biotechnology 27(7):643 참조).
조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 신체의 특정 세포로 표적화하고 바이러스 페이로드를 핵으로 트래피킹하는 고도로 진화된 프로세스를 이용한다. 바이러스 벡터는 대상체에게 직접 투여하거나(생체 내) 또는 시험관 내에서 세포를 치료하는 데 사용할 수 있고 변형된 세포를 대상체에게 투여할 수 있다(생체 외). ZFP 전달을 위한 통상적인 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련, 우두 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 숙주 게놈에의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하며, 종종 삽입된 트랜스진의 장기 발현을 초래한다. 또한, 많은 다른 세포 유형과 표적 조직에서 높은 형질도입 효율이 관찰되었다.
레트로바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 통합함으로써 변경될 수 있고, 표적 세포의 잠재적인 표적 집단을 확장시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비분 할 세포를 형질도입하거나 감염시킬 수 있고 일반적으로 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 따라 다르다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6~10kb의 외래 서열에 대한 패키징 용량을 가진 시스-작용 긴 말단 반복으로 구성된다. 최소 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이는 치료 유전자를 표적 세포에 통합하여 영구적인 트랜스진 발현을 제공하는 데 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 이들의 조합을 기반으로 하는 것들을 포함한다(예를 들어, Buchscher 등, J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann 등, J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt 등, Virol. 176:58-59 (1990); Wilson 등, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller 등, J. Virol. 65:2220-2224 (1991) 참고).
일시적인 발현이 바람직한 용도에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하며, 세포 분열이 필요하지 않다. 이러한 벡터로 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 얻어졌다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량으로 생성될 수 있다. 아데노-관련 바이러스("AAV") 벡터는 예를 들어 핵산 및 펩타이드의 시험관 내 생산에서, 그리고 생체 내 및 생체 외 유전자 치료 절차에서 표적 핵산과 함께 세포에 도입하는데 사용된다(예를 들어, West 등, Virology 160:38-47 (1987); U.S. Patent No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994) 참고). 재조합 AAV 벡터의 작제는 미국 특허 번호 제5,173,414호; Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, 등, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 그리고 Samulski 등, J. Virol. 63:03822-3828 (1989)를 포함한 여러 공보들에 기재되어 있다.
적어도 6개의 바이러스 벡터 접근법이 현재 임상 시험에서 유전자 전달에 이용 가능하며, 이는 형질도입제를 생성하기 위해 헬퍼 세포주에 삽입된 유전자에 의한 결함 벡터의 보완을 포함하는 접근법을 활용한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar 등, Blood 85:3048-305 (1995); Kohn 등, Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech 등, PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN은 유전자 치료 시험에 사용된 최초의 치료 벡터였다.(Blaese 등, Science 270:475-480 (1995)). MFG-S 패키지 벡터에 대해 50% 이상의 형질도입 효율이 관찰되었다.(Ellem 등, Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff 등, Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).
재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)는 결함 및 비병원성 파보바이러스 아데노-관련 2형 바이러스에 기초한 유망한 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스진 발현 카세트 측면에 있는 AAV 145 bp 역전된 말단 반복만을 보유하는 플라스미드에서 유래한다. 형질도입된 세포의 게놈으로의 통합으로 인한 효율적인 유전자 전달과 안정적인 트랜스진 전달은 이 벡터 시스템의 핵심 특징이다.(Wagner 등, Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns 등, Gene Ther. 9:748-55 (1996)). 비-제한적인 예로서, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV 8.2, AAV9, 및 AAV rh10 및 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6과 같은 의사형 AAV를 포함하는 다른 AAV 혈청형이 또한 사용될 수 있다.
AAV는 다수의 상이한 공정에 의해 임상 규모로 제조될 수 있다. 사용할 수 있는 시스템의 예로는 (1) 포유류 세포에서의 플라스미드 DNA 형질감염, (2) 안정한 포유류 세포주의 Ad 감염, (3) 재조합 단순 포진 바이러스(rHSV)에 의한 포유류 세포 감염 및 (4) 재조합 배큘로바이러스가 있는 곤충 세포(Sf9 세포)의 감염이 포함된다(검토를 위해 Penaud-Budloo 등 (2018) Mol Ther Methods Clin Dev. 8: 166-180 참조).
복제-결핍 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 높은 역가로 생산될 수 있으며, 여러 다른 세포 유형을 쉽게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 트랜스진이 Ad E1a, E1b 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작되며; 이어서 복제 결함 벡터는 트랜스에서 결실된 유전자 기능을 제공하는 인간 293 세포에서 증식된다. Ad 벡터는 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것과 같은 분열되지 않는 분화된 세포를 포함하여 생체 내에서 여러 유형의 조직을 형질도입할 수 있다. 기존의 Ad 벡터는 큰 운반 능력을 가지고 있다. 임상 시험에서 Ad 벡터를 사용하는 예는 근육 주사를 통한 항-종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 요법을 포함했다(Sterman 등, Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). 임상 시험에서 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터 사용의 추가 예에는 Rosenecker 등, Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman 등, Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh 등, Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez 등, Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf 등, Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman 등, Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)이 포함된다.
포장 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포와 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 생산자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주로의 후속 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 포함하고(적용 가능한 경우), 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트로 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료에 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 숙주 게놈으로의 패키징 및 통합에 필요한 AAV 게놈의 역 말단 반복(ITR) 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 포함하지만 ITR 서열이 없는 세포주에 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스에 감염된다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 벡터의 복제 및 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부족으로 인해 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열처리로 감소될 수 있다.
많은 유전자 치료 용도에서, 유전자 치료 벡터는 특정 조직 유형에 대해 높은 정도의 특이성을 가지고 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 외표면에 바이러스 외피 단백질과의 융합 단백질로서 리간드를 발현함으로써 주어진 세포 유형에 대한 특이성을 갖도록 바이러스 벡터를 변형시킬 수 있다. 리간드는 관심있는 세포 유형에 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대한 친화성을 갖도록 선택된다. 예를 들어 Han 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)에는 몰로니 뮤린(Moloney murine) 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 헤레굴린을 발현하도록 변형될 수 있으며, 재조합 바이러스가 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킨다고 보고되어 있다. 이 원리는 다른 바이러스-표적 세포 쌍으로 확장될 수 있으며, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현하고 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들어, 사상 파지는 사실상 임의의 선택된 세포 수용체에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 단편(예를 들어, FAB 또는 Fv)을 표시하도록 조작될 수 있다. 위의 설명은 주로 바이러스 벡터에 적용되지만 동일한 원칙이 비바이러스 벡터에도 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특정 표적 세포에 의한 흡수를 선호하는 특정 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.
유전자 치료 벡터는 전형적으로 하기에 기재되는 바와 같이, 전신 투여(예를 들어, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 두개 내 주입) 또는 국소 적용에 의해 개별 환자에게 투여함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 개별 환자(예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 보편적인 공여체 조혈 줄기 세포로부터 이식된 세포와 같은 생체 외 세포에 전달될 수 있고, 이어서 벡터를 포함하는 세포에 대한 선택후 일반적으로 이후에 환자에게 세포를 재이식시킬 수 있다.
뉴클레아제 및/또는 공여체 작제물(발현 작제물)을 함유하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등)는 생체 내 세포 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수도 있다. 대안적으로, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는 혈액 또는 조직 세포와의 최종 접촉에 분자를 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에게 잘 알려져 있으며, 특정 조성물을 투여하기 위해 하나 이상의 경로가 사용될 수 있지만, 특정 경로는 종종 다른 경로보다 즉각적이고 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 도입에 적합한 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터(IDLV)를 포함한다. 예를 들어, Ory 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull 등 (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery 등 (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi 등 (2000) Nature Genetics 25:217-222를 참고한다.
약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물 및 조성물 투여에 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 아래에 설명된 바와 같이 이용 가능한 약제학적 조성물의 다양한 적합한 제형이 있다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참조).
뉴클레아제-암호화 서열 및 공여체 작제물은 동일하거나 상이한 시스템을 사용하여 전달될 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 공여체 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드에 의해 운반될 수 있는 반면, 하나 이상의 뉴클레아제는 AAV 벡터에 의해 운반될 수 있다. 더욱이, 상이한 벡터는 동일하거나 상이한 경로(근육 내 주사, 꼬리 정맥 주사, 기타 정맥 내 주사, 복강 내 투여 및/또는 근육 내 주사로 투여될 수 있다. 벡터는 동시에 또는 임의의 순차적 순서로 전달될 수 있다.
생체 외 및 생체 내 투여 모두를 위한 제형은 액체 또는 유화 액체 중의 현탁액을 포함한다. 활성 성분은 종종 약제학적으로 허용되고 활성 성분과 양립할 수 있는 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 조성물은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정화제 또는 약제학적 조성물의 효과를 향상시키는 기타 시약과 같은 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
용도
본원에 개시된 방법은 파브리병(예를 들어, 리소좀 축적 질환)의 치료 및/또는 예방을 고려한다. 치료는 필요한 효소의 발현 및 혈류로의 방출을 위해 세포의 세이프 하버 유전자좌(예를 들어, 알부민)에 교정 질환 관련된 GLA 트랜스진의 삽입을 포함할 수 있다. 트랜스진을 암호화하는 교정 α-GalA는 야생형 또는 변형된 단백질을 암호화할 수 있으며/있거나 코돈 최적화된 GLA 트랜스진; 및/또는 단백질을 기능적으로 변경하지 않고 에피토프가 제거될 수 있는 트랜스진을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 방법은 필요한 효소의 발현 및 혈류로의 방출을 위해 α-GalA 암호화 트랜스진을 발현하는 에피솜을 세포에 삽입하는 단계를 포함한다. 혈류로 제품을 방출하기 위해 간 세포와 같은 분비 세포에 삽입하는 것이 특히 유용하다. 방법 및 조성물은 또한 조혈 줄기 세포에서 하나 이상의 치료제를 암호화하는 GLA 트랜스진을 공급하는 것이 바람직한 임의의 상황에서 사용될 수 있어서, 이들 세포로부터 유래된(후속된) 성숙 세포(예를 들어, RBC)가 치료용 α-GalA 단백질을 함유하도록 한다. 이러한 줄기 세포는 시험관 내 또는 생체 내에서 분화될 수 있으며, 모든 환자에게 사용될 수 있는 보편적인 공여체 유형의 세포에서 유래될 수 있다. 또한, 세포는 체내 세포를 이동시키기 위해 막 관통 단백질을 포함할 수 있다. 치료는 또한 세포가 생체 외에서 개발된 후 환자에게 다시 도입되는 치료용 트랜스진을 함유하는 환자 세포의 사용을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 α-GalA 암호화 트랜스진을 함유하는 HSC는 골수 이식을 통해 환자에게 삽입될 수 있다. 대안적으로, α-GalA 암호화 트랜스진을 사용하여 편집된 근육 줄기 세포 또는 iPSC와 같은 줄기 세포도 근육 조직에 주입될 수 있다.
따라서, 이 기술은 환자가 문제(예를 들어, 발현 수준의 문제 또는 기능이 적거나 없는 것으로 표현되는 단백질의 문제)로 인해 일부 단백질이 결핍된 상태에서 사용될 수 있다. 특히 유용한 것은 파브리병에 걸린 대상체의 기능을 교정하거나 복원하기 위한 트랜스진의 발현이다.
비-제한적인 예로서, 결함이 있거나 누락된 α-Gal A 단백질을 대체하기 위한 기능적 α-Gal A 단백질의 다양한 생산 방법이 달성되고 파브리병을 치료하는데 사용된다. 단백질을 암호화하는 핵산 공여체는 세이프 하버 유전자좌(예를 들어, 알부민 또는 HPRT)에 삽입되고 외인성 프로모터를 사용하거나 세이프 하버에 존재하는 프로모터를 사용하여 발현될 수 있다. 특히 유용한 것은 간 세포의 알부민 유전자좌에 GLA 트랜스진을 삽입하는 것이며, 여기서 GLA 트랜스진은 간 세포에서 혈류로 발현된 α-Gal A 단백질의 분비를 매개하는 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다. 대안적으로, 공여체를 사용하여 현장에서 결함이 있는 유전자를 수정할 수 있다. 원하는 α-GalA 암호화 트랜스진은 CD34+ 줄기 세포에 삽입되어 골수 이식 중에 환자에게 반환될 수 있다. 마지막으로, 핵산 공여체는 베타 글로빈 유전자좌에서 CD34+ 줄기 세포에 삽입되어, 이 세포로부터 유래된 성숙 적혈구가 핵산 공여체에 의해 암호화된 생물학적 제제의 고농도를 갖도록 할 수 있다. 그런 다음 생물학적 함유 RBC는 막 횡단 단백질(예를 들어, 수용체 또는 항체)을 통해 올바른 조직으로 표적화될 수 있다. 추가적으로, 적혈구는 전기 감작을 통해 생체 외에서 감작되어 에너지 원에 노출된 후 파괴에 더 민감하게 만들 수 있다(WO2002007752 참조).
일부 용도에서, 내인성 유전자는 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 녹아웃될 수 있다. 이러한 양태의 예는 비정상 유전자 조절자 또는 비정상 질환 관련 유전자를 녹아웃시키는 것을 포함한다. 일부 용도에서 비정상적인 내인성 유전자는 기능적으로 또는 현장에서 야생형 버전의 유전자로 대체될 수 있다. 삽입된 유전자는 또한 치료용 α-GalA 단백질의 발현을 개선하거나 그의 면역원성을 감소시키기 위해 변경될 수 있다. 일부 용도에서, 삽입된 α-GalA 암호화 트랜스진은 뇌와 같은 선택된 조직으로의 수송을 증가시키는 융합 단백질이다.
적합한 GLA 공여체는 아래에 예시된 것들로 제한되지 않고 임의의 GLA 트랜스진을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본 개시내용은 또한 동종 제품으로서 모든 환자에 대해 보편적으로 사용될 수 있는 파브리병의 치료를 위한 α-GalA 치료 단백질을 운반하는 세포(예를 들어, RBC)의 생산을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이를 통해 예를 들어 파브리병 환자의 치료를 위한 단일 제품을 개발할 수 있다. 이들 담체는 세포의 트래피킹을 돕기 위해 막 횡단 단백질을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 막 횡단 단백질은 항체를 포함하는 반면, 다른 양태에서 막 횡단 단백질은 수용체를 포함한다.
일부 실시형태에서, GLA 트랜스진 공여체는 트랜스진의 에피솜 또는 염색체 외 유지를 위해 형질감염되거나 세포 내로 형질도입된다. 일부 양태에서, GLA 트랜스진 공여체는 트랜스진 공여체의 발현을 조절하기 위해 조절 도메인을 포함하는 벡터상에서 유지된다. 일부 예에서, 트랜스진 발현을 조절하기 위한 조절 도메인은 발현되는 트랜스진에 내인성 도메인인 반면, 다른 경우에 조절 도메인은 트랜스진에 대해 이종성이다. 일부 실시형태에서, GLA 트랜스진은 바이러스 벡터상에서 유지되는 반면, 다른 실시형태에서는 플라스미드 또는 미니 서클상에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV, Ad 또는 LV이다. 추가 양태에서, 트랜스진 공여체를 포함하는 벡터는 트랜스진 공여체에 의해 암호화된 α-GalA 치료 단백질이 트랜스진 공여체 벡터가 간세포로 전달될 때 혈류로 방출되도록 생체 내 적합한 표적 세포에 전달된다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 GLA 트랜스진이 삽입되어 이들 전구체로부터 유래된 성숙 세포가 트랜스진에 의해 암호화된 높은 수준의 α-GalA 생성물을 함유하도록 한 전구체 세포(근육 줄기 세포, 전구 세포 또는 CD34+ 조혈 줄기 세포(HSPC) 세포)를 기술한다. 일부 실시형태에서, 이러한 전구체는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)이다.
일부 실시형태에서, 방법은 트랜스제닉 동물 시스템에서 생체 내에서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 트랜스제닉 동물은 트랜스진이 인간 α-GalA 단백질을 암호화하는 모델 개발에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 트랜스제닉 동물은 상응하는 내인성 유전자좌에서 녹아웃되어, 인간 단백질이 분리되어 연구될 수 있는 생체 내 시스템의 개발을 허용할 수 있다. 이러한 트랜스제닉 모델은 관심있는 인간 단백질과 상호작용하거나 변형할 수 있는 소분자, 큰 생체 분자 또는 기타 개체를 식별하기 위한 스크리닝 목적으로 사용될 수 있다. 일부 양태에서, GLA 트랜스진은 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 간 줄기 세포, 신경 줄기 세포 등) 또는 본 명세서에 기술된 방법 및 당해 분야의 표준 중 임의의 것에 의해 수득된 비인간 동물 배아로 선택된 유전자좌(예를 들어, 고도로 발현되거나 세이프 하버)로 통합된 다음, 살아있는 동물이 태어나도록 배아가 이식된다. 그런 다음, 동물을 성적으로 성숙시키고 자손을 생산하도록 허용하며, 여기서 자손 중 적어도 일부는 통합된 GLA 트랜스진을 포함한다.
임의의 이전 실시형태에서, 방법 및 화합물은 파브리병 환자의 치료를 위해 다른 치료제와 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법 및 조성물은 파브리 단백질의 정확한 폴딩을 보장하기 위해 분자 샤페론(Hartl 등 (2011) Nature 465: 324-332)의 사용을 포함한다. 일부 양태에서, 샤페론은 AT1001(Benjamin 등 (2012) Mol Ther 20(4):717-726), AT2220(Khanna 등 (2014) PLoS ONE 9(7): e102092, doi:10.1371), 및 Migalastat(Benjamin 등 (2016) Genet Med doi: 10.1038/gim.2016.122)과 같은 잘 알려진 샤페론 단백질로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서, 방법 및 조성물은 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있도록 방법 및 조성물과 조합하여 사용된다. 다른 양태에서, 방법 및 조성물은 대상체의 면역 반응을 억제하는 것으로 알려진 화합물과 조합하여 사용된다.
본원에 기재된 뉴클레아제 시스템 및/또는 GLA 공여체를 포함하는 키트도 제공된다. 키트는 하나 이상의 뉴클레아제(예를 들어, ZFN, ZFN 쌍, TALEN, TALEN 쌍 및/또는 CRISPR/Cas 시스템)를 암호화하는 핵산(예를 들어, 적합한 발현 벡터에 포함된 유전자를 암호화하는, RNA 분자 또는 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas 시스템) 공여체 분자, 단일-가이드 RNA 적합한 숙주 세포주를 암호화하는 발현 벡터, 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 지침서 등을 포함한다.
이러한 양태 및 다른 양태들은 본 개시내용 전체를 고려하여 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 본 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 예시적인 방법 및 물질이 아래에 설명되지만, 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수도 있다. 상충되는 경우 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 일반적으로, 본원에 기재된 심장학, 의학, 의약 및 제약 화학 및 세포 생물학과 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당 업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 것들이다. 효소 반응 및 정제 기술은 당 업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 제조자의 사양에 따라 수행된다. 또한 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함해야 한다. 본 명세서 및 실시형태 전체에 걸쳐, "갖다" 및 "포함하다"라는 단어, 또는 "갖는", "갖고 있는", "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 다른 정수 또는 정수 그룹은 제외되지 않다. 본 명세서에 언급된 모든 공보 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 여기에 많은 문서가 인용되어 있지만, 이 인용은 이러한 문서가 해당 분야의 일반적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 용어는 어느 방향으로든 문맥으로부터 달리 명시되지 않는 한 언급된 참조값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 이하에 속하는 값의 범위(보다 크거나 작음)를 지칭한다.
본 발명이 더 잘 이해될 수 있도록 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
3개월 동안 지속된, 변이체 #4 발현 작제물로 처리된 GLAKO 마우스에서 높은 혈장 α-Gal A 활성
도 1a에 도시된 바와 같은 변이체 #4 발현 작제물의 샘플을 수컷 GLAKO 마우스에 투여하여 단일 IV 투여 후 약력학적 활성 및 생체 분포를 평가하였다.
GLAKO 수컷 마우스는 연구 개시 시점에 8~12주령이었다. 동물(n=10~20마리 수컷/그룹)은 CaCl2, MgCl2, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P188(대조군 마우스) 또는 3가지 용량 수준의 변이체 #4 발현 벡터(각각 2.0E+12, 5.0E+12 또는 5.0E+13 vg/kg, n=10/그룹) 중 하나를 1일에 단일 200μl IV 꼬리 투여로 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함하는 제형 완충액을 받았다. 마우스를 3개월 동안 모니터링했다. 약동학적 평가(혈장 α-Gal A 활성)의 결과는 개별 마우스에 대해 도 2에 개시되어 있으며, 그룹 평균(평균+SD)이 도 3에 제시되어 있다. 나타낸 바와 같이, 혈장 α-Gal A 활성은 AAV/작제물 용량으로 스케일링되었다. 또한, 혈장 α-Gal A 활성은 야생형(돌연변이 되지 않은) 대상체에서 생리적 정상 또는 α-Gal A 활성의 300배 이상에 도달했다. (도 3의 *는 성능 초과로 인해 하나의 이상값이 제거되었음을 나타낸다.)
임상 규모 제조 공정을 사용하여 WPRE(변이체 #4)가 없는 AAV hGLA cDNA의 증가량을 1회 투여하고, 연구일 15일차까지 혈장 α-GalA(WT의 300배 이상)의 생리학적 발현을 초래하였으며, 주사 후 3개월 동안 내약성이 좋았고 안정적이었다. α-GalA 활성의 용량-의존적 증가는 Gb3/리소-Gb3의 상응하는 감소와 함께 간, 심장 및 신장에서 달성되었다.
간에서 생산된 α-Gal A는 혈류로 분비되어 2차 조직에 흡수되었다. 도 4a는 간 용해물에서 조직 α-Gal A 활성을 보여준다. 도 4b는 신장 용해물에서 조직 α-Gal A 활성을 보여준다. 도 4c는 심장 용해물에서 조직 α-Gal A 활성을 보여준다.
실시예 2
높은 수준의 α-Gal A 활성은 파브리 기질의 상응하는 감소를 초래한다.
변이체 #4 작제물 제형을 GLAKO 마우스에 0 vg/kg, 2.0E+12 vg/kg, 5.0E+12 vg/kg 또는 5.0E+13 vg/kg의 용량으로 IV 투여하여 마우스 혈장 및 조직의 파브리 기질의 수준을 평가하였다. 조직은 투여 후 91일에 부검에서 수확하고, LC-MS를 사용하여 α-Gal A 기질 Gb3(이소형 C22:0 및 C24:0) 및 그의 탈아실화된 형태 리소-Gb3의 수준에 대해 분석하였다. 간단히 말해서, 조직의 중량을 재고, 조직 파괴 액(5% MeOH, 95% 물 및 0.1% 아세트산)에서 조직 mg 당 5ml 유체의 비율로 기계적으로 파괴했다. 10 μl의 혈장 또는 조직 슬러리를 실리콘 처리된 튜브에서 90 μl의 침전 용매(내부 표준 N-트리코사노일 세라마이드 트리헥소사이드(C23:0, Matreya)가 용액에 스파이크된 MeOH)에 첨가하고, 볼텍싱하고 실온에서 30분 동안 진탕하였다. 그런 다음, 샘플을 원심분리하고 유리 LC-MS 바이알에 있는 90 μl의 단일 블랭크 매트릭스(DMSO/MeOH 1:1+0.1% FA)에 10μl의 샘플을 첨가했다. GLAKO 마우스에 존재하는 우세한 Gb3 종인 Gb3 사슬 길이 24:0에 대해 샘플을 분석하고 세라마이드 트리헥소사이드(Gb3, Matreya)로 구성된 표준 곡선에 대해 측정했다.
글루코실스핑고신(Glucosylsphingosine)(Matreya)을 내부 표준으로 사용하고, 리소-세라마이드 트리헥소사이드(리소-Gb3, Matreya)를 사용하여 글로보트리아오실스핑고신(Globotriaosylsphingosine)(리소-Gb3)을 유사한 방식으로 측정하여 표준 곡선을 생성했다. 데이터는 범례에 표시된대로 9 내지 20마리 동물/그룹의 평균+SD를 나타낸다. 파브리 기질 글로보트리아오실세라마이드(Gb3)는 질량 분석법을 통해 선택된 뮤린 혈장 및 조직에서 측정하였다.
α-Gal A의 지속적인 생산은 파브리병 기질, Gb3 및 리소-Gb3의 감소 및 잠재적 제거를 가능하게 해야 한다. 파브리 기질 Gb3 및 리소-Gb3 수준의 용량-관련 감소는 도 5a 및 도 5b에 도시된 바와 같이 혈장, 간, 심장, 신장 및 비장에서 발견되었다. 고용량 그룹의 동물 샘플 대부분은 도 5b에 도시된 바와 같이 제형 대조군의 동물 샘플과 비교하여 조직 Gb3 수준이 80% 이상 감소되었다.
고용량 수준에서, 심장 및 신장의 Gb3 수준은 도 6a에 도시된 바와 같이 처리되지 않은 동물의 약 10%로 감소되었다. 처리된 대상체에서, Gb3 수준은 도 6b에 도시된 바와 같이 더 낮은 수준의 정량화보다 낮았다.
실시예 3
변이체 #21 발현 벡터는 시험관 내 및 생체 내에서 혈장 α-Gal A 활성을 생성한다.
분비된 인간 α-Gal A의 수준 및 활성은 변이체 #4 또는 변이체 #21 발현 벡터로 형질도입한 후 다양한 마우스, 사이노몰구스 원숭이 및 인간 1차 세포 및 세포주에서 평가되었다. 변이체 #4 또는 변이체 #21 발현 벡터는 1) HEK293 세포 또는 2) Sf9 곤충 세포주에서 생산되었다.
HepG2 세포 및 iPSC-유래 간세포(iCell 간세포)를 표준 기술을 사용하고 미국 공개 번호 20180117181에 설명된대로 형질도입했다. 간단히 말해서, 세포를 웰당 다양한 밀도로 시딩하고, 변이체 #21 발현 작제물 또는 변이체 #4 발현 작제물의 100,000 내지 600,000 vg/세포 범위의 감염 다중도(MOI)로 형질도입했다. 상청액 샘플을 3일에서 7일까지 수집하고, α-Gal A 효소 활성을 α-Gal A 형광측정 활성 분석 및 연구 종료시 수집된 세포 펠릿에서 평가했다(6일 또는 7일).
cDNA 접근법은 hAAT 프로모터에 연결된 APOE 인핸서(Okuyama 등 (1996) Hum Gene Ther 7(5):637-45), HBB-IGG 인트론(인간 베타-글로빈 유전자 및 분지의 제1 인트론으로부터의 5'-공여체 부위와 면역글로불린 유전자 중쇄 가변 영역의 인트론으로부터의 3'-수용체 부위로 구성된 키메라 인트론), 신호 펩타이드, 암호화 서열(여기서 암호화 서열은 선택적으로 코돈 최적화됨) 및 소 성장 호르몬(예를 들어, bGH 또는 SPA51) 폴리A 신호 서열을 포함하는 AAV 전달 발현 작제물의 사용을 포함할 수 있다.
HepG2/C3A 세포("HepG2"세포라고도 함)(ATCC, CRL 10741)는 얼 염(Earle's Salts) 및 L 글루타민(Corning,)과 10% 소 태아 혈청(FBS)(Life Technologies) 및 1X 페니실린 스트렙토마이신 글루타민(Life Technologies)이 포함된 최소 필수 배지(MEM)에서 유지되고, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 세포는 3 내지 4일마다 계대되었다.
형질 도입을 위해, 세포를 헹구고 0.25% 트립신/2.21 mM EDTA(Corning)로 트립신 처리하고, 성장 배지에 다시 현탁시켰다. 소량의 분취량을 인산염 완충 식염수(PBS; Corning)에서 트립판 블루 용액 0.4%(w/v)과 1:1로 혼합하고 TC20 자동 세포 계수기(Bio Rad)에서 계수했다. 세포를 성장 배지에서 mL 당 2e5의 밀도로 재현탁시키고 웰당 0.5 mL 배지에서 1e5로 24 웰 플레이트(Corning)에 시딩하였다. 재조합 AAV2/6 입자를 적당한 감염 다중도(MOI)에서 성장 배지와 혼합하고, 세포에 첨가했다. GLA cDNA 작제물에 대한 MOI는 3e4, 1e5, 3e5 또는 1e6 vg/세포이었다.
형질도입 후, 세포를 6~10일 동안 배양물에 두었다. 3, 5, 7 및 10일(적용 가능한 경우)에 상청액을 수집하고, 신선한 배지로 교체했다. 최종 상청액 수집 단계 후, 세포를 트립신 처리하고 위에서 설명한대로 재현탁한 다음, 원심분리하여 세포 펠릿을 생성시키고, PBS로 세척하고, -80℃에서 보관했다.
합성 기질 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노사이드(4MU-α-Gal, Sigma)를 사용하여 형광 분석법으로 α-GalA 활성을 평가하였다.
간단히, 10 마이크로리터의 HepG2 세포 배양 상청액을 인산염 완충액(0.1M 시트레이트/0.2M 인산염 완충액, pH 4.6, 1% Triton X-100)에 용해된 40 μL의 5 mM 4MU-α-Gal과 혼합하였다. 반응을 37℃에서 인큐베이션하고 100 μL의 0.5M 글리신 완충액, pH 10.3을 첨가하여 종결시켰다. SpectraMax Gemini XS 형광 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale CA)를 사용하여 형광(Ex365/Em450)을 측정하여 4개의 메틸움벨리페론(4MU)의 방출을 결정하였다.
4MU의 연속 2배 희석을 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 결과 데이터에는 로그 로그 곡선이 적용되었으며; 테스트 샘플에서 4MU의 농도는 이 최적 곡선을 사용하여 계산하였다. 효소 활성은 세포 배양 상청액(nmol/hr/mL)의 mL 당 분석 인큐베이션 시간의 시간당 방출된 nmol 4 MU로 표현된다.
도 7a 및 7b로 돌아간다면, 변이체 #21 발현 작제물은 시험관내 AAV GLA 변이체 #4 발현 벡터보다 개선된 α-Gal A 효능을 갖는다. HepG2 세포에서, 상청액의 α-Gal A 활성은 도 7a에 제시된 바와 같이 약 4배 내지 약 9배 증가되었다. iPSC- 유래 인간 간세포에서, 상청액의 활성은 도 7b에 제시된 바와 같이 약 3배 내지 약 5배 증가하였다.
돌연변이된 WPRE 서열이 없거나(변이체 #4) 이를 포함하는(변이체 #21) 간-특이적 프로모터에 의해 유래된, 인간 GLA cDNA(hGLA)를 암호화하는 에피솜 AAV(혈청형 2/6) 벡터가 다양한 용량으로 동물에게 투여되었다. 도 8은 2.0E+12 vg/kg 또는 5E+11 vg/kg의 용량의 변이체 #21 작제물 또는 2.0E+12 vg/kg 또는 5E+11 vg/kg의 용량의 변이체 #4 작제물 또는 제형 완충액으로 처리된 야생형 마우스의 혈장에서 작제물 용량의 증가에 따른 GLA A 활성의 증가를 보여준다. 결과는 야생형 마우스에서 28일에 걸쳐 약 7배 내지 약 9배의 혈장 활성의 개선을 나타낸다.
야생형 C57BL/6 마우스에서 2개의 상이한 AAV 용량(cDNA 공여체를 운반하는 AAV)을 사용하여 1개월 연구에서 WPRE 서열(변이체 #21)을 포함하는 cDNA 작제물과 발현 작제물 변이체 #4를 비교하였다. 위의 표 1은 사용된 작제물의 전체 서열을 보여준다. WPRE 서열을 갖는 cDNA를 포함하는 작제물은 동일한 용량의 초기(비-WPRE 함유) cDNA를 투여한 마우스보다 연구 28일에 평균 7배 더 높은 수준의 혈장 α-GalA 활성이 생성되었다.
처리된 HepG2 세포의 상청액에서 GLA 활성의 4 내지 9배 증가는 변이체 #4(WPRE를 포함하지 않음)에 비해 변이체 #21(작제물 포함 WPRE)을 사용하여 관찰되었으며, 유도 만능 세포(iCells)로부터 유래된 간세포의 상청액에서 GLA 활성의 3 내지 5배 증가는 변이체 #4(WPRE를 포함하지 않음)와 비교하여 변이체 #21(작제물을 포함하는 WPRE)을 사용하여 관찰되었다. 또한, 변이체 #4(WRPE를 포함하지 않음)와 비교하여 변이체 #21(작제물을 포함하는 WRPE)로 처리된 마우스에서 혈장 GLA 활성의 7배 내지 9배 증가가 관찰되었다.
이들 연구에서 나타난 높은 수준의 α-GalA 활성은 GLAKO 마우스 모델의 주요 조직에서 축적된 Gb3/리소-Gb3의 수반되는 현저한 감소와 함께 간세포의 AAV-매개 표적화가 치료 벡터의 신속하고 효율적인 생산을 허용하는 임상 규모 제조 공정을 통한 것을 포함하여 대상체에서 인간 α-GalA의 치료적 수준을 초래함을 입증한다.
파브리 치료를 위한 α-Gal A 단백질의 치료 수준은 발현 벡터의 임상적 규모 생산을 포함하여 cDNA 접근법을 사용하여 생체 내에서 생성된다.
결과는 도 9에 제시되어 있으며, 하기 표 3은 변이체 #21 발현 작제물이 생체 내에서 최대 1,500배의 생리적 정상(wt)의 혈장 α-Gal A 활성을 생성함을 입증한다. 변이체 #4 발현 작제물은 5.0E+12 및 5.0E+13 vg/kg으로 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥 주사에 의해 투여되었다. 변이체 #21 발현 작제물은 5.0E+12, 5.0E+13 및 5.0E+14로 C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥 주사에 의해 투여되었다(미도시). 혈장 샘플은 투여 1주일 전과 8일, 15일, 22일 및 29일에 수집되었고, 나중에 형광 분석에 의해 α-Gal A 효소 활성에 대해 평가되었다. 데이터 포인트는 평균 반응 +/- 용량 당 SD를 나타낸다. 분석 정량 하한(LLOQ)은 2.5 nmol/hr/mL이다.
Figure pct00006
도 9는 5.0E+13 vg/kg 용량의 변이체 #21 작제물, 5.0E+12 vg/kg 용량의 변이체 #21 작제물, 5.0E+13 vg/kg 용량의 변이체 #4 작제물, 5.0E+12 vg/kg 용량의 변이체 #4 작제물, 또는 제형 완충액으로 처리된 후 29일 동안 C57BL/6 마우스에서 α-Gal A 혈장 활성을 예시한다.
시험관내 데이터와 일치하여, 혈장 및 간 GLA 수준은 Sf9 세포 시스템에 비해 HEK293 세포에서 제조된 변이체 #4 발현 작제물을 투여한 동물에서 더 높았다(최대 21배 더 높음).
실시예 4
변이체 #4 발현 벡터로 처리하면 GLAKO 마우스 및 비인간 영장류에서 높은 수준의 간세포 형질도입이 발생했다.
변이체 #4 발현 작제물의 IV 투여 후 간세포에서 발현 작제물 복제물의 수준을 평가하기 위해, 동물 서브세트의 포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 간 샘플을 BASESCOPE™ 제자리 부합법(in situ hybridization, ISH)에 의해 평가했다. ISH 염색 후 HALO™ 소프트웨어로 정량 이미지 분석을 수행했다. 비-암호화 서열을 표적화하였다. 하우스키핑 유전자 프로브인 PPIB(사이클로필린 B)를 샘플 QC에 대한 양성 대조군 마커로 사용하고, 조직 샘플에서 RNA 품질을 평가했다. 박테리아 유전자 DapB는 음성 대조군으로 사용되었다. 샘플 품질을 평가하고 QC 합격/불합격을 결정하기 위해 모든 샘플에 대해 반-정량적 점수(0~4 척도)를 얻었다. PPIB(사이클로필린 B; 하우스키핑 유전자 제어) 점수는 우수한 품질의 RNA를 나타내는 샘플에 대해 주로 3이었다. DapB(박테리아 유전자 대조군) 점수는 대부분 0이었으며, 비특이적 배경이 없거나 무시할 수 있음을 나타낸다. 특정 DNA 염색 신호는 세포핵에서 진한 (적색) 도트로 식별된다. 샘플은 연회색(청색)으로 표시된 Gill의 헤마톡실린으로 대조 염색되었다.
다양한 배율로 5.0+13 vg/kg 변이체 #4 발현 벡터를 투여한 GLAKO 마우스로부터의 간의 대표적인 ISH 이미지가 도 10에 제시되어 있다. 다양한 배율로 6.0+13 vg/kg 변이체 #4 발현 벡터를 투여한 NHP의 간에서 ISH 염색의 대표적인 이미지가도 11에 제시되어 있다. 특정 DNA 염색 신호는 세포핵에서 진한 회색 도트로 식별된다. 샘플은 Gill의 헤마톡실린 연회색으로 대조 염색되었다. 도시된 바와 같이, 마우스 간세포의 57.5%가 발현 벡터에 대해 양성이었으며, 2.34 도트/세포로, 도 10의 대표적인 샘플에서 126.82의 H-점수를 나타냈다. 놀랍게도, NHP 간세포의 72.9%가 발현 작제물에 대해 양성이었으며, 3.20 도트/세포로, 도 11의 대표적인 샘플에서 175.39의 H-점수를 나타냈다.
전반적으로, 양성 세포%, 평균 도트/세포 수 및 H-점수를 포함하여 평가된 모든 매개변수에 대해 마우스 간 세포에서 용량-반응 관계가 관찰되었다. H-점수를 결정하기 위해 세포당 도트 수를 기준으로 세포를 5개의 빈으로 나눈 다음, 가중 공식에 따라 각 빈의 세포 비율을 합산하여 계산했다.
2E+12 vg/kg, 5E+12 vg/kg, 5E+13 vg/kg, 또는 대조군으로서의 제형 완충액의 용량으로 변이체 #4 작제물로 처리된 GLAKO 마우스에서 hGLA cDNA를 함유하는 GLAKO 마우스 간세포의 백분율은 도 12a에 도시되어 있다. 개별 대상체에서 hGLA cDNA를 함유하는 간세포의 백분율이 도 12c에 제시되어 있다. 유사하게, 도 12b는 6E+12 vg/kg, 1E+13 vg/kg, 3E+13 vg/kg, 6E+13 vg/kg, 또는 대조군으로서의 제형 완충액의 용량으로 변이체 #4 작제물로 처리된 사이노몰구스 NHP에서 hGLA cDNA를 함유하는 간세포의 백분율을 나타내는 그래프이다. 도 12d는 개별 NHP 대상체에 대한 hGLA cDNA를 함유하는 간세포의 백분율을 보여준다.
간에서 hGLA DNA 작제물의 수준을 측정하는 제자리부합법 연구는 마우스와 NHP 간세포에서 용량-반응 관계를 보였고 DNA의 핵으로의 전달을 확인했다. 마우스의 고용량(5.0E+13 vg/kg)은 28%에서 58%의 양성 염색 세포 범위를 나타내었고, NHP 연구에서 고용량(6.0E+13 vg/kg; 면역억제 포함)은 61% 내지 73% 양성 염색 세포의 범위를 나타내었다. 또 다른 NHP(면역 억제 없음)는 49% 양성 염색 세포를 수득했다.
실시예 5
변이체 #4 발현 작제물의 1회 정맥 내 투여후 사이노몰구스 NHP의 α-Gal A 단백질 및 효소 활성
변이체 #4 발현 작제물은 약리학 및 독성학에 대해 NHP에서 평가되었다. 단일 IV 용량의 변이체 #4 발현 작제물을 수컷 사이노몰구스 원숭이(n=3/그룹)에게 0(n=2), 6.0E+12, 1.0E+13, 3.0E+13 또는 6.0E+13 vg/kg으로 투여했다. 발현 벡터 및/또는 인간 α-Gal A에 대한 가능한 면역 반응을 완화하기 위해, 동물은 발현 작제물 투여 전에 리툭시맙(10 mg/kg; IV)을 투여받고 연구 내내 매일 메틸프레드니솔론(10 mg/kg; 근육 내)을 투여받았다. 추가 그룹은 최고 용량(6.0E+13 vg/kg)으로 변이체 #4 발현 작제물을 투여받았지만 면역억제 투여는 받지 않았다. 사용된 변이체 #4 발현 작제무은 배큘로바이러스/Sf9 세포 플랫폼을 사용하는 GMP 임상 제조 공정에서 제조되었다.
투여 전(5개 시점) 및 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 및 56일에 혈액을 수집하고 혈장으로 처리하였다. 이 혈장 샘플은 인간 α-Gal A 단백질 수준 및 α-Gal A 활성에 대해 평가되었다. 56일째 부검시, α-Gal A 활성을 평가하기 위해 간 4분절(왼쪽 및 오른쪽 측면 로브 각각 2 분절) 및 비장 2 분절을 수집했다. 결과는 도 13a 내지 도 13f에 도시되어 있다.
순환 α-Gal A 단백질 수준 및 혈장 α-Gal A 활성은 일반적으로 7일째에 검출되었으며, 단백질 수준 및 활성은 7일과 21일 사이에 정점에 이르렀으며, 명확한 용량 반응은 없었다. 면역억제없이 변이체 #4 발현 작제물을 투여받은 동물은 일반적으로 면역억제를 갖는 변이체 #4 발현 작제물을 투여한 동물보다 낮은 수준의 α-Gal A 단백질 및 활성을 가졌다. 이러한 강한 용량 반응의 결여와 α-Gal A 활성 및 단백질 수준의 제거는 항-인간 α-Gal A 항체의 존재에 의해 확인되는 바와 같이 인간 α-Gal A(동물에 투여된 인간 단백질)에 대한 생성된 면역 반응으로 유지되었다. 인간 α-Gal A의 감소된 수준에도 불구하고, 일부 동물은 높은 수준의 인간 α-Gal A(활성 및 단백질)를 유지했다. 한 고용량 동물(6.0E+13 IS)에서, 56일에 193 nmol/hr/mL의 수준이 측정되었지만 비히클 처리된 동물의 수준은 검출되지 않았다(<10 nmol/hr/mL). 일부 동물에서 이 반응의 일시적인 특성은 인간 α-Gal A 효소(동물에게 투여되는 인간 단백질)에 대한 예상되는 면역 반응과 관련이 있을 가능성이 높다.
또한, 벡터 셰딩 분석용 샘플은 NHP 연구에서 qPCR 방법으로 평가되었다. 낮은 수준의 hGLA 벡터는 4일(소변) 또는 14일(타액, 대변)까지 일부 변이체 #4-처리된 동물의 타액, 소변 및 대변에서 측정되었다. 60일째에는 이러한 생물학적 유체에서 hGLA 벡터 수준이 검출되지 않았다.
실시예 6
NHP 간에서 hGLA 및 상응하는 mRNA 수준
6.0E+12 vg/kg, 1.0E+13 vg/kg, 3.0E+13 vg/kg, 6.0E+13 vg/kg, 6.0E+13 vg/kg(면역억제제 미포함)의 용량으로 변이체 #4 작제물 또는 제형 완충액으로 처리한 후 60일에 개별 동물로부터의 NHP 간 샘플에서 hGLA 및 상응하는 mRNA 수준의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, hGLA 단백질 수준은 대부분의 샘플에서 mRNA 수준과 상관 관계가 있는 작제물 용량 및 단백질 수준에 따라 증가한다.
실시예 7
인간의 변이체 #21 발현 작제물의 안전성, 내약성 및 약력학 평가
인간에서 변이체 #21 발현 작제물의 안전성 및 내약성을 평가하기 위한 연구가 수행될 것이다. 또한, α-Gal A의 약력학 및 혈장, 소변 및 조직에서 시간 경과에 따른 기질의 존재를 측정할 것이다. ERT, 신장 기능, 면역 반응 및 바이러스 벡터 DNA 셰딩에 대한 대상체의 ERT 투여에 대한 변이체 #21 발현 작제물의 영향은 또한 시간이 지남에 따라 평가될 수 있다.
전반적으로, 변이체 #21 발현 작제물 및 변이체 #4 발현 작제물은 파브리병 마우스 모델(GLAKO), 야생형(C56BL/6) 마우스 및 사이노몰구스 NHP에서 잘 견디었다. GLAKO 마우스에서, 최고 용량 수준인 5.0E+13 vg/kg까지 변이체 #4 발현 작제물의 단일 IV 투여와 관련된 부작용이 발견되지 않았다. C57BL/6 마우스에서, 예비 분석은 변이체 #21 발현 작제물이 시험된 최고 용량인 1.5E+14 vg/kg까지 잘 견디는 것으로 나타났다. NHP에서 변이체 #21 발현 작제물-관련 결과는 면역억제 치료를 받지 않은 동물(6.0E+13 vg/kg)로 제한되었다. 이러한 발견은 림프 조직 및 비장에서 림프 세포질의 증가로 구성되었으며, hGLA 및/또는 rAAV2/6 투여와 관련된 면역 반응과 일치할 가능성이 높다. 이 연구에서, 관찰되지 않은 부작용 수준(NOAEL)은 6.0E+13 vg/kg이었으며, 면역억제 요법의 유무에 관계없이 테스트된 최고 용량 수준이었다.
이 연구는 인간 α-Gal A에 대한 cDNA를 암호화하는 재조합(예를 들어, rAAV2/6) 벡터 작제물을 사용한다. 벡터 작제물은 간 특이적 프로모터를 암호화하고, rAAV2/6은 간 친화성을 나타내므로 단일 용량 투여 후 파브리병 대상체에서 α-Gal A의 장기간 동안 가능성 및 안정한 간 생산을 제공한다. AAV2, 5, 6 및 8을 포함하여 다양한 AAV 혈청형이 사용될 수 있다. rAAV2/6 혈청형은 본원에서 사용하기 위해 선택되었으며, 이전 NHP 데이터를 기반으로 위에 설명된 예는 AAV2/6이 주로 간장성이라는 것을 보여주며, AAV2/8과 유사한 생체분포를 가지고, 그 AAV2/6 및 AAV2/8 벡터는 유사한 수준의 순환 FIX 트랜스진 발현을 수득하였다. 예비 임상 안전성 데이터는 3건의 연구 시험에서 조사 제품을 투여받은 13명의 대상체로부터 수집되었으며, 이 AAV2/6 혈청형 주입이 잘 견딜 수 있음을 시사한다(데이터는 표시되지 않음).
hGLA cDNA를 암호화하는 rAAV2/6과 함께 IV 투여된 파브리병 마우스 모델에서의 연구는 α-Gal A의 치료 수준(야생형의 300배 이상)의 생성을 보여준다. 발현 벡터를 사용한 1회 처리는 주입-관련 반응의 발생률을 최소화한다. 인간에서 치료 수준의 α-Gal A의 생산은 파브리병 기질 Gb3 및 리소-Gb3의 감소 및 잠재적으로 제거를 가능하게 할 수 있으며, ERT로 나타난 최고 및 최저보다는 효소의 지속적인 생산으로 인해 생성된 효소에 대한 항체 발생 위험을 감소시킬 수 있다. 변이체 #21 발현 작제물은 파브리병 환자에서 치료 수준으로 α-Gal A의 안정적이고 장기적인 생산을 제공하도록 설계되었다. 인간에서 α-Gal A의 지속적인 생산은 파브리병 기질 Gb3 및 리소-Gb3의 감소 및 제거를 가능하게 할 수 있다.
연구 평가
평가에는 치료-긴급 이상 반응(TEAE), 일상적인 혈액학, 화학 및 간 기능, 바이탈 사인, ECG 및 ECHO, 연속 알파 태아단백질(AFP) 검사 및, 임의의 간 덩어리의 형성을 모니터링하기 위한 간 MRI(또는 동등한 이미징)의 사건이 포함될 수 있다. 또한, 기준선으로부터의 변화는 1년 동안 하기와 같은 특정 시점에서 측정될 수 있다: 혈장 내 α-Gal A 활성; 혈장 내 Gb3 수준; 혈장 내 리소-Gb3 수준; FABRAZYME®(또는 동등한 ERT) 주입 빈도; 혈액 내 크레아티닌 수치에 의해 계산된 추정 사구체 여과율(eGFR); 심장 자기 공명 영상(MRI), 소변 중의 총 단백질 및 알부민 대 크레아티닌 비율로 측정한 좌심실 질량; 조직에서 측정된 α-Gal A 및 Gb3 수준; 조직 및 소변에서 측정된 기질 수준; 소변에서 신장 기능의 바이오마커; 간이통증조사지(BPI)에 의해 측정된 신경병성 통증, 진통제 사용빈도; GI 증상 등급 척도로 측정된 위장(GI) 증상; 마인츠 심각도 지수(MSSI); SF-36 설문지로 측정한 삶의 질(QOL) 환자-보고 결과; rAAV2/6 및 α-Gal A에 대한 면역 반응; 및 rAAV 벡터 제거는 혈액, 혈장, 타액, 소변, 대변 및 정액의 벡터 게놈 수준으로 측정할 수 있다.
대상체 포함 및 제외 기준
연구 대상은 고전적인 파브리병이 있는 18세 이상의 남성 대상체를 포함할 수 있다. 고전적인 파브리병을 가진 남성 대상체는 잔류 효소 수준이 cDNA 트랜스진에 의해 생성된 효소 수준의 측정을 방해하지 않는지 확인해야 한다.
보다 구체적으로, 대상체 포함 기준은 하기를 포함할 수 있다: (1) 혈장 또는 백혈구에서 <5% α-Gal A 활성 및 고전적인 파브리병의 증상적 특징 중 하나 이상에 의해 정의된 고전적 파브리병의 문서화된 진단을 갖는 대상체: i) 나이테각막, ii) 말단감각이상, iii) 무한증, iv) 혈관각화종(만일 클러스터된 담도주위 혈관각화종(periumbilicial angiokeratoma)이 있는 경우, 고전적인 파브리병의 병리학적 징후이므로 이 증상만으로도 충분함); (2) ERT에 있는 대상체(14일[±1일] 요법); 또는 -Gal A 활성이 > 5%인 ERT 상의 대상체; 또는 ERT-나이브; 또는 ERT-의사-나이브이고 동의 전 지난 6개월 동안 ERT 치료를 받지 않은 경우; (3) ERT를 받는 대상체의 경우, ERT는 안정된 용량(동의 전 6개월 동안 3회 이상 용량의 ERT를 놓친 적이 없는 것으로 정의됨) 및 요법(등록 전 최소 3개월 동안 14일±1일)으로 투여되어야 한다; (4) 고전적인 파브리의 지표인 돌연변이를 가진 대상체(즉, www.dbfgp.org와 같은 데이터베이스에 나열됨); (5) 최저점에서의 α-Gal A 활성이 분석의 정상 범위의 하한 미만인 대상체; (6) 약 18세 이상의 남성 대상체; (7) 성적으로 성숙한 대상체는 콘돔 사용에 동의해야 하며, 연구 치료제 투여 후 최소 3회 연속 정액 샘플이 AAV에 대해 음성이 될 때까지, 그리고 연구 치료 투여 후 최소 90일이 지나면 발현 작제물 투여 시점부터 정자 기증을 자제해야 하며; 및 (8) 대상체의 서명된 서면 동의.
문서화된 진단 α-Gal A 활성 수준이 없는 대상체의 경우, (혈장 및/또는 백혈구에서) α-Gal A 활성 수준을 측정하기 위해 혈액 샘플을 채취해야 한다. ERT를 받는 대상체의 경우, 이 채혈은 마지막 ERT 주입(최저점) 후 최소 13일 후에 채취해야 한다. i. 대상체의 α-Gal A 활성 수준이 > 5%이고 대상체가 ERT 상태인 경우, 이 효소 활성 수준은 마지막 ERT 주입에서 잔류 α-Gal A 활성 때문일 수 있다. 이 경우, 하기 세 가지 기준이 충족되면 고전적인 파브리병의 진단을 확인할 수 있다.
a. 고전적 파브리의 하기 문서화된 증후적 특징 중 2개 이상: 나이테각막, 말단감각이상, 무한증, 혈관각화종. 문서화된 클러스터된 담도주위 혈관각화종이 있는 경우, 이 증상만으로도 고전적인 파브리병의 병리학적 징후이므로 충분하다.
b. 고전적인 파브리의 지표인 돌연변이(즉, www.dbfgp.org와 같은 데이터베이스에 나열됨); 및
c. 최저점에서의 α-Gal A 활성은 분석의 정상 범위의 하한보다 낮다.
파브리병 유전자 서열분석은 대상체가 GLA 유전자에 돌연변이가 있는지 확인하기 위해 스크리닝에서 수행될 수 있다. 분석은 혈액 또는 타액 샘플에서 수행될 수 있다. 가능한 경우, 연구 이전에 얻은 유전자 시퀀싱 결과를 사용할 수 있다.
HIV, HAV, HBV, HCV 및 TB에 대한 테스트는 스크리닝시 수행할 수 있다. HIV 진단 또는 활성 HAV, HBV, HCV 또는 TB 감염의 증거가 있는 대상체는 이 연구에 참여할 자격이 없을 수 있다.
AAV6에 대한 중화 항체의 수준은 AAV6에 대한 대상체의 기존 면역 반응을 평가하기 위해 스크리닝에서 측정될 수 있다. AAV6에 대한 기존 중화 항체가 상승한 대상체는 이 연구에 참여할 자격이 없을 수 있다. 스크리닝 후 3개월 이내에 투여가 완료되지 않으면, AAV6에 대한 혈청 중화 분석을 반복해야 한다.
가능한 경우, 진단 α-Gal A 활성 수준 결과로 연구 이전에 얻은 혈장 또는 백혈구를 사용할 수 있다. 문서화된 진단 α-Gal A 활성 수준이 없는 대상체의 경우 혈액 샘플을 채취하여 α-Gal A 활성 수준(혈장 및/또는 백혈구)을 측정해야 한다. ERT를 받는 대상체의 경우, 이 채혈은 마지막 ERT 주입 후 최소 13일 후에 채취해야 한다.
대상체의 일반적인 건강 및 연구 적격성을 평가하기 위해 흉부 X-선(흉부의 PA 방사선 사진이라고도 함)을 얻을 수 있다. 의학적으로 지시되지 않는 한, 연구 등록 후 6개월 이내에 촬영한 흉부 X-선을 사용하여 대상체 적격성을 결정할 수 있다. 신체 검사는 각 대상체에 대해 수행되어야하며, 최소한 일반적인 외모, 머리, 눈, 귀, 코 및 목(HEENT) 뿐만 아니라 심혈관, 피부과, 호흡기, GI, 근골격 및 신경계를 포함해야 한다.
대상체 제외 기준은 하기와 같은 대상체를 포함할 수 있다: (1) 현장 조사자 및 의료 모니터의 의견으로 ERT에 반응하지 않는 것으로 알려진 대상체(예를 들어, ERT에서 문서화된 기질 수준 감소 없음); (2) 미갈라스타트(migalastat)(Galafold™)로 현재 치료 중이거나 사전 동의 후 3개월 이내에 이전 치료를 받고 있는 대상체, (3) AAV(예를 들어, AAV6)에 대해 양성 중화 항체 반응을 갖는 대상체, (4) 현장 조사자 또는 의료 모니터의 의견에 따라 연구 관찰 기간 동안 안전성 또는 효능 평가를 손상시킬 것으로 예상되는 병발성 질환을 앓고 있는 대상체; (5) eGFR이 ≤ 60 ml/분/1.73m2이고; (6) 뉴욕 심장 협회 클래스 III 이상을 가지고 있는 대상체; (7) 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 또는 결핵에 의한 활동성 감염(TB)으로 측정 한 A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV)(음성 HCV-DNA) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 활성 감염된 대상체; (8) 사전 동의후 6개월 이내에 이차 지방증, 비-알코올성 지방간염(NASH) 및 간경변, 담관염, 담도 질환과 같은 간 질환의 병력이 있는 대상체; 길버트 증후군 제외; 비정상적인 순환 AFP; (9) ERT를 받는 대상체의 경우, 현장 조사자 및 의료 모니터의 의견에 따라 ERT에 대한 상당한 주입 반응으로 나타난 바와 같이 동의 전 6개월 이내에 ERT 치료에 대한 최근 또는 지속적인 과민 반응을 보인 대상체; (10); 하기 중 하나 이상에 의해 확인된 간 염증 또는 간 기능 장애의 명백한 또는 잠복적 원인의 마커: (i) 알부민 ≤ 3.5 g/dL; (ii) 총 빌리루빈> 정상(ULN) 상한 및 직접 빌리루빈 ≥ 0.5 mg/dL; (iii) 알칼리성 포스파타제(ALP)> 2.0 x ULN; (iv) 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)> 1.5 x ULN; (11) 지난 6개월 동안 전신(IV 또는 경구) 면역 조절제 또는 스테로이드 사용의 현재 또는 이력이 있는 경우(천식 또는 습진과 같은 국소 치료가 허용됨)(의료 모니터와의 논의 후 전신 스테로이드 사용이 허용될 수 있음); (12) 면역억제를 위한 코르티코스테로이드 사용에 대한 금기사항이 있는 대상체; (13) 비흑색 종 피부암을 제외한 악성 병력이 있는 대상체; (14) 알코올 또는 약물 남용 이력이 있는 대상체; (15) 동의 전 지난 3개월 이내에 사전 연구 중재 약물 또는 의료 기기 연구에 참여한 적이 있는 대상체(RaILRoAD 시험에서와 같이 이식 가능한 루프 레코더는 예외); (16) 유전자 치료 제품으로 사전 치료를 받은 대상체; (17) ST-920 제형의 성분에 대해 알려진 과민성; (18) 현장 조사자 및 의료 모니터의 의견으로 대상체를 연구 참여에 부적합하게 만드는 기타 이유
수반되는 약제
잠재적으로 간독성인 약제를 제외하고 모든 약제들이 허용될 수 있다. 디클로페낙, 아미오다론, 클로르프로마진, 플루코나졸, 이소니아지드, 리팜핀, 발프로산, 고용량의 아세트아미노펜(4~8 gm/일) 등과 같은 간독성제 및 세네시오/크로탈라리아, 게르만더 인 차, 덤불콩(chaparral), Jin bu huan, Ma-huang (중국 약초) 등와 같은 간독성 허브 보충제를 연구 기간 동안 복용하지 않는다. ERT를 받는 대상체의 경우, ERT는 안정된 용량(농축 전 지난 6개월 동안 3회 이상의 ERT를 놓치지 않은 것으로 정의됨) 및 요법(등록전 적어도 3개월 동안 14일±1일)으로 투여되어야 한다. 대상체는 ERT 철회를 거치지 않는 한 표준 치료에 따라 연구 기간 동안 안정된 용량과 요법(14일±1일)으로 ERT를 계속 받아야 한다.
용량 코호트
시작 용량은 5.0E+12 vg/kg이고, 다음 용량 수준으로의 용량 증량은 이전 코호트 및/또는 생체 내 rAAV2/6-기반 요법을 사용하는 다른 임상 시험의 데이터를 검토할 때 이루어질 것이며, 외부 주제 전문가, 연구 의료 모니터 및 현장 조사관으로 구성될 수 있는 안전 모니터링위원회(SMC)의 권장 사항을 기반으로 한다. 본원에 사용된 SMC 회원은 적절한 의료 및 과학 전문 지식을 보유하고, 연구에 대한 안전 감독을 제공한다. 또한 관찰된 효소 활성 수준과 투여된 대상체의 안전성 프로필에 따라 SMC는 코호트 3에서 5.0E+13 vg/kg 용량으로 5배 증가하는 대신 코호트 2의 투여량보다 3배 증가한 3.0E+13 vg/kg의 중간 투여량 수준으로 용량을 증량시킬 것을 권장할 수 있다. 약 1.0E+14 vg/kg의 용량도 고려할 수 있다. 세 가지 용량 코호트는 표 4에 개시되어 있다.
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모든 포함/제외 기준을 충족하는 18세 이상의 대상체가 등록될 것이다. SMC 검토 후 총 최대 18명의 대상체에 대해 추가 4명의 성인 대상체가 있는 코호트의 잠재적 확장과 함께 적어도 2명의 대상체가 3개 용량 코호트 각각에 할당될 것이다. 발현 벡터는 정맥 주입을 통해 투여할 수 있다. 각 코호트 내에서, 치료는 시차를 두어 각 후속 대상이 선행 대상이 투여된 후 적어도 약 2주가 될 때까지 주입될 수 없도록 한다. 다음 용량 수준으로의 용량 증량은 이전 코호트의 마지막 대상체가 투여되고 전체 이전 코호트의 안전성 데이터가 SMC에 의해 검토된 후 적어도 약 4주가 될 때까지 발생하지 않을 수 있다.
연구 등록 전에 ERT를 받은 대상체는 연구 동안 ERT를 계속 받아야 하며, ERT 철회를 겪지 않는 한 표준 치료 당 현재 용량 및 요법(14일±1일)을 유지해야 한다. ERT 대상체의 경우, 효소 및 기질 수준의 기준선 테스트는 이전 ERT 주입 후 14일(+/-1일)로 정의되는 최저점에서 아침에 2회 별도의 경우에 샘플을 채취할 수 있도록 조정된다. 추가 시점은 스크리닝 기간 동안 이전에 취해졌으므로 유전자 치료 투여 전 최저점에서 α-Gal A의 잔류 수준을 평가하기 위한 3개의 시점이 있다. 이 3개의 샘플은 최저치에서 채취해야 하며, 효소 수준에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 비특이적 요인을 최소화하기 위해 낮 동안(예를 들어, 아침에) 동시에 채취해야 한다.
rAAV 캡시드 단백질에 대한 잠재적인 면역 반응을 최소화하고, 간 손상시 트랜스진 발현 손실을 방지하고 간 기능을 보존하기 위해, 프레드니손 또는 동등한 코르티코스테로이드를 발현 벡터 주입 약 2일 전에 시작하여 예방적으로 투여할 수 있으며, 최대 약 20주 동안 테이퍼링될 수 있다.
발현 벡터는 주사기 펌프 또는 IV 주입 펌프를 사용하여 주입할 수 있다(연구 약국 매뉴얼 참조). 총 부피는 대상체의 코호트 할당 및 기준선 체중(kg)에 따라 달라질 것이다. 발현 벡터는 환자의 바이탈 사인(체온, 심박수, 호흡 수 및 혈압)을 모니터링하면서 제어된 속도로 IV 카테터를 통해 투여할 수 있으며, 대상체가 병원 또는 위급 치료 시설에 있는 동안 발현 벡터 주입 완료 후 최소 24시간 동안 관찰을 위해 남아 있다. 대상체는 모든 바이탈 사인이 안정되고 부작용(AE)이 해결되거나 대상체가 연구자 판단에 따라 안정된 것으로 간주될 때 퇴원할 수 있다.
발현 벡터 주입 후, 연구 방문은 8일차; 2주, 4주, 6주, 8주, 12주, 16주, 20주, 24주, 28주, 32주, 36주, 40주, 44주, 48주 및 52주에 수행될 수 있다. 28주, 32주, 40주, 44주 및 48주 연구 방문에는 임상 부위 평가를 필요로 하지 않으므로 원격으로 수행할 수 있다. AE 및 병용 약물에 대한 평가는 전화를 통해 원격으로 수행될 수 있다.
간 테스트(AST, ALT, GGT, 총 및 직접 빌리루빈, ALP, LDH, 알부민 및 총 단백질 수준)를 수행하여 발현 벡터 주입 후 약 처음 20주 동안 AAV-매개 면역원성을 매주 2회 모니터링할 수 있으며, 대상체는 프레드니손 또는 동등한 코르티코스테로이드를 복용하고 있는 동안 원격으로 수행될 수 있다. 간 검사를 위한 혈액 샘플은 2일째 및 8일째 방문에 채취할 수 있는 첫 주를 제외하고는, 가능하면 2~4일 간격으로 채취할 수 있다. 면역억제 중단 후(21~24주) 4주 동안 매주 간 검사를 실시한 다음 연구 방문(28~52주)과 일치하도록 매월 실시할 수 있다.
프레드니손 또는 동등한 코르티코스테로이드로의 전처리에도 불구하고 ALT 상승의 증거가 있는 경우, 프레드니손 또는 동등한 코르티코스테로이드의 용량이 계속될 것이다(프레드니손 1 mg/kg [최대 60 mg] 또는 동등; 경구 또는 정맥 내 및/또는 사례별로 증가하며, 간 효소가 정상화될 때까지 일주일에 2회 간 효소를 평가한 다음 그 후 프로토콜에 따라 평가할 수 있다.
각 코호트에서 처음 2명의 대상체에 대해, 이전 대상체가 적어도 2주 동안 관찰될 때까지 각각의 후속 대상체가 주입되지 않도록 치료가 시차를 두고 있을 수 있다. 다음 용량 수준으로의 용량 증량은 이전 코호트의 2명의 대상체가 투약되고 이전 코호트의 2명의 대상체의 안전성 데이터가 SMC에 의해 검토된 후 적어도 4주까지 발생하지 않을 수 있다.
중단 규칙 중 하나라도 충족되면 투약 및 용량 증량이 일시 중지될 수 있다.
발현 벡터를 사용한 처리는 인간 α-Gal A에 대한 cDNA를 암호화하는 rAAV 벡터를 사용함으로써 ERT의 필요성을 없앨 수 있고, 결과적으로 파브리병 대상체에서 α-Gal A의 장기적인 간-특이적 발현을 초래할 수 있다. ERT 철회를 겪는 대상체는 모든 AE, 바이탈 사인, 안전 실험실 평가의 모든 변화 및 기준선과 비교하여 α-Gal A 및 기질 수준에 대해 면밀히 모니터링될 것이다. ERT 철회는 표적 간 세포의 형질도입에 충분한 시간을 허용하기 위해 4주 후에 고려해야 한다. ERT 철회를 겪는 대상체는 피로, 신경병성 통증, 모든 AE, 바이탈 사인, 간 기능 테스트 및 α-Gal A 및 기질(Gb3 및 리소-Gb3) 수준을 포함한 안전 실험실 평가의 모든 변화를 포함한 모든 임상 증상에 대해 기준선과 비교하여 면밀히 모니터링된다. ERT 철회는 후원사와 협의한 후 현장 조사자의 재량에 따라 결정될 수 있으며, 다음 기준을 기꺼이 충족하고 충족하는 대상체에 대해 고려되어야 한다.
(1) ST-920 투여 후 4주 이상;
(2) 의학적으로 안정적이고 현장 조사자의 판단에 따라 ERT의 일시적인 중단을 용인할 수 있다.
(3) ERT 철회 후속 방문까지 증가된 안전 모니터링 및 추가 실험실 테스트에 동의한다.
(4) ERT 철회 후속 방문 후 ERT를 다시 시작할 필요가 없다. 그러나 ERT는 임상 상황 또는 현장 조사자의 판단에 따라 언제든지 다시 시작할 수 있다.
ERT 철회는 이전에 성공하지 못한 경우 반복될 수 있으며, 단, 대상체가 원할 경우 이전 시도 후 최소 12주 후에 수행되고 현장 조사자의 재량에 따라 후원사와 협의한 후에 수행될 수 있다.
연구 참여 기간은 스크리닝의 경우 최대 8주, 기준선의 경우 최대 12주 및 투약 후 52주 추적으로 나누어 각 대상체에 대해 최대 76주일 수 있다. 적립은 9 ~ 12개월 동안 계획된다. 대상체는 최대 4년 동안 별도의 추가 장기 추적 연구에 참여하도록 권장해야 한다.
하기 기준 중 하나가 충족되고 SMC가 적절한 조치 과정에 대한 권장 사항을 만들기 위해 소집할 수 있는 경우 연구 등록을 일시 중지해야 한다: (1) 발현 벡터 제형에 대한 인과 관계의 적어도 합리적인 가능성이 있는 등급 3 이상의 부작용 중 하나; (2) 발현 벡터 제형에 대한 인과 관계의 합리적 가능성이 있는 심각한 이상 반응(SAE); (3) 인간 대상체의 죽음; (4) 악성 종양의 발생.
치료-발생 AE는 전체적으로 그리고 용량 코호트별로 요약될 수 있다. 각 대상체에 대해 각 AE의 보고된 최대 심각도는 심각도 등급별 요약에서 사용할 수 있다. 또한 연구 치료와 관련된 모든 SAE 및 AE를 요약할 수 있다. 다른 안전성 평가의 경우, 각 시점에 대한 데이터를 요약할 수 있다. 기준선 값으로부터의 변화는 연속 매개변수에 대해 계산되고 시점별로 요약될 수 있다. 선택한 매개변수에 대해 시프트-테이블을 구성할 수도 있다.
혈장 내 α-Gal A 활성은 α-Gal A가 생성되고 활성 상태인지 평가하기 위해 측정되어야 한다. α-Gal A 수준 측정은 혈장, 혈청, 전혈, 건조 혈반, 백혈구 또는 기타 혈액 성분에 대해 수행할 수 있다. ERT 대상체의 경우, 이전 ERT 투여 후 14일(±1일)로 정의된 최저점에서 샘플을 확보해야 한다. 효소의 약동학에 대한 이해를 높이고 ERT 이전에 얻은 샘플이 최저점에 있는지 확인하기 위해 연구 전반에 걸쳐 추가 샘플을 얻을 수도 있다.
Gb3은 α-Gal A의 결핍으로 인해 파브리병의 혈관, 조직 및 기관 내에 축적되는 글리코스핑고지질의 한 유형이다. 혈장, 소변 및 기타 조직의 Gb3 수준을 측정하여 치료 투여 및 α-Gal A 수준의 영향을 평가할 수 있다. ERT 대상체의 경우, 이전 ERT 투여 후 14일(±1일)로 정의된 최저점에서 샘플을 확보해야 한다.
리소-Gb3는 기질 Gb3의 가용성 형태이다. 혈장, 소변 및 기타 조직의 리소-Gb3 수준은 치료 투여 및 α-Gal A 수준의 영향을 평가하기 위해 이 연구를 통해 측정될 수 있다. ERT에 있는 대상체의 경우, 이전 ERT 투여 후 14일(±1일)로 정의된 최저점에서 샘플을 확보해야 한다.
각각의 샘플링 시점에서, α-Gal A 및 Gb3 및 리소-Gb3 수준에 대한 실제 값 및 기준선으로부터의 변화는 기술 통계를 사용하여 요약될 수 있고 용량 코호트별로 시간에 따라 플롯될 수 있다. ERT 철회를 겪는 대상체의 경우, ERT 주입 빈도 및 용량의 ERT 철회 전에서 후로의 변화를 연간 총 용량 및 주입 횟수를 사용하여 평가하고 요약할 수 있다. ERT 철회 기간도 분석할 수 있다. 다양한 샘플(혈장, 타액, 소변, 대변 및 정액)에서 벡터 게놈에 의해 측정된 AAV 청소율은 용량 코호트별로 시간이 지남에 따라 플롯될 수 있다.
도 1a에 도시된 바와 같이, rAAV 벡터는 hGLA 트랜스진의 발현을 유도하는 간-특이적 조절 요소를 포함하는 변이체 #21 hGLA 발현 카세트(3321 bp)를 포함한다. hGLA 트랜스진은 인간 아포지단백질 E(ApoE) 유전자 및 인간 α-1- 항트립신(hAAT) 프로모터의 인핸서 및 간 제어 영역의 제어를 받는다. ApoE 인핸서 및 hAAT 프로모터는 의도된 표적 조직인 간에서 특이적이고 매우 활성이지만 비-간세포 및 조직 유형에서는 비활성이므로 비-표적 조직에서 hGLA 발현 및 활성을 방지한다. 변형된 키메라 인트론(HBB-IghGLA 트랜스진은 코돈-최적화된 hGLA α-Gal A 효소를 포함한다.
변이체 #21은 우드척 간염 바이러스(WHV) 전사 후 조절 요소(WPREmut6)의 돌연변이된 형태를 포함한다. WPREmut6은 WHV X 단백질의 프로모터 영역을 함유하는 592-bp DNA 서열로, 추정 프로모터 영역에서 점 돌연변이가 있는 X 단백질 자체의 절단된 형태와 X 단백질 발현을 방지하기 위한 X 단백질 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈이 뒤따른다(mut6). 폴리A 서열은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호의 유도체이다. WPREmut6 요소의 추가는 α-Gal A 단백질 생산을 증가시켰다. 실제로, 변이체 #4 발현 작제물(WPREmut6 요소가 없음)에 비해 변이체 #21 발현 작제물에서 더 큰 효능이 확인되었다.
변이체 #21 발현 작제물은 CaCl2, MgCl2, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P188을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS)에서 약 1.0E+13 vg/mL로 제형화될 수 있으며, 2 mL 또는 5 mL 또는 10 mL 등의 부피로 바이알에 채워지고, ≤-65℃에서 보관한다. 바이알에는 플립 탑이 있는 알루미늄 씰이 있다.
발현 작제물 rAAV 벡터는 Sf9 곤충 세포/재조합 배큘로바이러스(Sf9/rBV) 발현 시스템을 사용하여 캡시드 혈청형 AAV2/6과 함께 패키징될 수 있다. 대안적으로, 발현 작제물 rAAV 벡터는 포유동물 발현 시스템, 예를 들어 HEK293을 사용하여 캡시드 혈청형 AAV2/6과 함께 패키징될 수 있다.
파브리병 마우스 모델, 야생형 마우스 및 사이노몰구스 NHP에서의 연구는 변이체 #21 발현 벡터로 처리한 후 내구성 있고 잠재적으로 유효한 수준의 α-Gal A를 안전하게 생성할 수 있는 가능성을 입증한다.
1.5E+14 vg/kg까지의 용량 수준에서 마우스에서 및 각각 주어진 최고 용량 수준인 6.0E+13 vg/kg까지의 용량 수준에서 NHP에서 부작용이 관찰되지 않았다. 따라서, 5.0E+12 vg/kg의 임상 시작 용량은 마우스에서 30배 안전 용량 배수 및 NHP에서 12배 안전 용량 배수로 뒷받침된다.
측정 가능한 수준의 α-Gal A는 2.0E+12 vg/kg이 제공된 파브리병 마우스에서 기록된 현저한 약력학적 반응에 기초하여 5.0E+12 vg/kg의 용량으로 인간 대상체에서 예상된다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
명확하게 이해하기 위해 예시 및 예로서 개시내용이 다소 상세하게 제공되었지만, 본 개시내용의 정신 또는 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 수정이 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기 상세한 설명 및 실시예는 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO THERAPEUTICS, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF FABRY DISEASE <130> 8325-0188.40 <140> <141> <150> 62/788,439 <151> 2019-01-04 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 2 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta 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Claims (70)

  1. 세포에서 적어도 하나의 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질을 발현하는 방법으로서, 돌연변이된 WPRE 서열, 임의로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진을 포함하는 발현 작제물을 세포에 투여하여, α-Gal A 단백질이 세포에서 발현되도록 하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 발현 작제물이 야생형 GLA 서열 또는 코돈 최적화된 GLA 서열을 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 발현 작제물은 인핸서, 프로모터, 인트론, 신호 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 중 하나 이상을 포함하며, 상기 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진은 신호 펩타이드와 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 사이에 위치하는, 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 발현 작제물은 서열번호: 9의 서열을 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 파브리병을 앓고 있는 대상체에 있는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 남성 대상체에 있는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물은 약제학적으로 허용되는 담체로 투여되는, 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 CaCl2, MgCl2, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P188을 함유하는 인산염 완충 식염수를 포함하는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물 서열은 표 1에 제시된 서열을 포함하고, 상기 발현 작제물은 AAV 바이러스 벡터에 의해 세포로 전달되는, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 AAV 바이러스 벡터 혈청형은 AAV2/6인, 방법.
  11. 청구항 5 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물은 킬로그램 당 약 5.0E+12 내지 1.0E+14 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  12. 청구항 5 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물이 대상체의 간에 투여되는, 방법.
  13. 청구항 5 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터는 정맥 내 주입에 의해 대상체에게 투여되는, 방법.
  14. 청구항 5 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물의 단 1회 용량이 대상체에게 투여되는, 방법.
  15. 청구항 5 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 발현 작제물의 투여 전 및/또는 투여 동안 면역억제제를 투여받는, 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 면역억제제는 프레드니손을 포함하는, 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질의 발현은 적어도 3개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 지속되는, 방법.
  18. 청구항 5 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 치료되지 않은 대상체에 비해 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 2배 내지 약 9배 감소시키는, 방법.
  19. 청구항 5 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 80% 감소시키는, 방법.
  20. 청구항 5 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 혈장, 간, 심장, 신장 또는 비장 중 하나 이상에서 글리코스핑고지질의 양을 감소시키는, 방법.
  21. 청구항 5 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서, HEK293 세포 시스템에서 제조된 발현 작제물은 Sf9 세포 시스템에서 제조된 발현 작제물을 투여받은 대상체에서 GLA 수준과 비교하여 대상체에서 약 21배 더 높은 GLA 수준을 제공하는 방법.
  22. 청구항 5 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 α-Gal A 단백질 활성은 생리적 정상/야생형보다 약 100배 내지 1,500배 더 높은, 방법.
  23. 청구항 5 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 신장, 간 및 심장에서 활성인, 방법.
  24. 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA 트랜스진은 염색체 외로 유지되고, 세포의 게놈내로 통합되지 않는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 간 세포에서 내인성 알부민 유전자를 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제를 트랜스진이 알부민 유전자 내로 통합되고 그로부터 발현되도록 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 외인성 GLA 트랜스진을 포함하는 유전자 변형된 세포.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 세포가 줄기 세포 또는 전구체 세포인, 유전자 변형된 세포.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 세포가 간 또는 근육 세포인, 유전자 변형된 세포.
  29. 청구항 26 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA 트랜스진이 염색체 외로 유지되고 상기 세포의 게놈으로 통합되지 않는, 유전자 변형된 세포.
  30. 청구항 26 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA 트랜스진이 세포의 게놈으로 통합되는, 유전자 변형된 세포.
  31. 파브리병 또는 파브리병과 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 억제 또는 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 발현 작제물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 발현 작제물은 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진을 포함하는, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 증상은 정상 보다 높은 Gb3 수준, 정상 또는 기준선보다 높은 리소(lyso)-Gb3 수준, 신장 질환, 심장 질환, 말단감각이상, 혈관각화종, 위장관 통증, 각막 및 수정체 혼탁, 또는 뇌 혈관 질환 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 31 또는 청구항 32에 있어서, 상기 대상체가 남성이고, 약 5% 미만의 α-Gal A 효소 활성을 갖는, 방법.
  34. 청구항 31에 있어서, 상기 발현 작제물은 야생형 GLA 서열 또는 코돈 최적화된 GLA 서열을 포함하는, 방법.
  35. 청구항 31, 청구항 33 또는 청구항 34에 있어서, 상기 발현 작제물은 인핸서, 프로모터, 인트론, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 상기 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진은 신호 펩타이드와 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 사이에 위치하는, 방법.
  36. 청구항 31에 있어서, 상기 발현 작제물은 약제학적으로 허용되는 담체로 투여되는, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 CaCl2, MgCl2, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P 188을 함유하는 인산염 완충 식염수를 포함하는, 방법.
  38. 청구항 31에 있어서, 상기 발현 작제물 서열이 표 1에 제시된 서열을 포함하고, 상기 발현 작제물이 AAV 바이러스 벡터에 의해 대상체의 세포로 전달되는, 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 상기 AAV 바이러스 벡터 혈청형이 AAV2/6인, 방법.
  40. 청구항 31 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물이 킬로그램 당 약 5.0E+12 내지 1.0E+14 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 대상체에게 투여되는, 방법.
  41. 청구항 31 내지 청구항 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물이 대상체의 간에 투여되는, 방법.
  42. 청구항 31 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 벡터가 정맥 내 주입에 의해 대상체에게 투여되는, 방법.
  43. 청구항 31 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물의 단 1회 용량이 대상체에게 투여되는, 방법.
  44. 청구항 31 내지 청구항 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 발현 작제물의 투여 전 및/또는 투여 동안 면역억제제를 투여받는, 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 면역억제제가 프레드니손을 포함하는, 방법.
  46. 청구항 31 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 α 갈락토시다제 A(α-Gal A) 단백질의 발현은 적어도 3개월, 적어도 9개월 또는 적어도 12개월 동안 지속되는, 방법.
  47. 청구항 31 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 치료되지 않은 대상체에 비해 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 3배 내지 약 9배 감소시키는, 방법.
  48. 청구항 31 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체에서 글리코스핑고지질의 양을 적어도 약 80% 감소시키는, 방법.
  49. 청구항 31 내지 청구항 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 혈장, 간, 심장, 신장 또는 비장 중 하나 이상에서 글리코스핑고지질의 양을 감소시키는, 방법.
  50. 청구항 31 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물은 HEK293 세포 시스템에서 제조되고, 상기 대상체의 GLA 수준은 Sf9 세포 시스템에서 제조된 발현 작제물을 투여받은 대상체의 GLA 수준과 비교하여 21배 더 높은, 방법.
  51. 청구항 31 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 α-Gal A 단백질 활성은 생리적 정상보다 약 100배 내지 1,500배 더 높은, 방법.
  52. 청구항 31 내지 청구항 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스진으로부터 발현된 α-Gal A 단백질은 대상체의 신장, 간 및 심장에서 활성인, 방법.
  53. 청구항 31 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA 트랜스진은 염색체 외로 유지되고, 대상체의 세포의 게놈내로 통합되지 않는, 방법.
  54. 청구항 31 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 간 세포에서 내인성 알부민 유전자를 절단하는 하나 이상의 뉴클레아제를 트랜스진이 알부민 유전자 내로 통합되고 그로부터 발현되도록 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 발현 작제물, 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열을 포함하는 발현 작제물, 및 파브리병 치료를 위한 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진을 포함하는 조성물.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 CaCl2, MgCl2, NaCl, 수크로스 및 Kolliphor(폴록사머) P 188을 포함하는, 조성물.
  58. 청구항 55에 있어서, 상기 발현 작제물이 야생형 GLA 서열 또는 코돈 최적화된 GLA 서열을 포함하는, 조성물.
  59. 청구항 55 내지 청구항 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물이 인핸서, 프로모터, 인트론, 신호 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 중 하나 이상을 추가로 포함하며, 상기 돌연변이된 WPRE 서열, 선택적으로 mut6 돌연변이된 WRPE 서열, 및 적어도 하나의 α-Gal A 단백질을 암호화하는 GLA 트랜스진은 신호 펩타이드와 폴리아데닐화 신호를 암호화하는 서열 사이에 위치하는, 조성물.
  60. 청구항 55 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 작제물 서열이 표 1에 제시된 서열을 포함하고, 발현 작제물이 AAV 바이러스 벡터에 의해 세포로 전달되는, 조성물.
  61. 청구항 55 내지 청구항 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 바이러스 벡터 혈청형이 AAV2/6인, 조성물.
  62. 청구항 60 또는 청구항 61에 있어서, 상기 발현 작제물이 대상체 킬로그램 당 약 5.0E+12 내지 1.0E+14 벡터 게놈(vg/kg)을 포함하는, 조성물.
  63. 청구항 59에 있어서, 상기 발현 작제물이 서열번호: 9의 서열을 포함하는, 조성물.
  64. 파브리병 치료를 위한 α-Gal A 단백질을 생성하는 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 방법에 따라 단리된 세포에서 α-Gal A 단백질을 발현하는 단계, 및 세포에 의해 생성된 α-Gal A 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  65. 청구항 1의 방법에 사용하기 위한 돌연변이된 WRPE 서열, 선택적으로 mut6 WPRE 서열 및 GLA 트랜스진을 포함하는, 전달 벡터.
  66. 청구항 65에 있어서, 상기 전달 벡터가 바이러스 벡터 또는 지질 나노입자(LNP)인, 벡터.
  67. 청구항 66에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 AAV2/6을 포함하고, 상기 바이러스 벡터는 발현 작제물을 세포의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%에 전달하는, 벡터.
  68. 파브리병 치료를 위한 청구항 1 내지 청구항 67 중 어느 한 항의 발현 작제물, AAV 벡터 및/또는 유전적으로 변형된 세포의 용도.
  69. 청구항 3에 있어서, 상기 인핸서가 서열번호: 2를 포함하고, 프로모터가 서열번호: 3을 포함하고, 인트론이 서열번호: 4를 포함하고, GLA 트랜스진이 서열번호: 5를 포함하고, 돌연변이된 WPRE 서열이 서열번호: 6을 포함하고, 폴리아데닐화 신호가 서열번호: 7을 포함하는, 방법.
  70. 청구항 59에 있어서, 상기 인핸서가 서열번호: 2를 포함하고, 프로모터가 서열번호: 3을 포함하고, 인트론이 서열번호: 4를 포함하고, GLA 트랜스진이 서열번호: 5를 포함하고, 돌연변이된 WPRE 서열이 서열번호: 6을 포함하고, 폴리아데닐화 신호가 서열번호: 7을 포함하는, 방법.
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