KR20210110834A - 이중 방식의 18f-표지된 테라노스틱 화합물 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

화합물 또는 분자 복합체. 화합물 또는 분자 복합체는 방사능 동위원소 또는 비-방사능 동위원소와 킬레이트화 하도록 구성된 금속 킬레이트; 및 ¹⁹F/¹⁸F 교환하도록 구성된 트리플루오로보레이트 (BF₃)-함유 모이어티 또는 이의 전구체; 및 선택적으로, 세포-표적화 도메인을 포함한다.

Description

이중 방식의 18F-표지된 테라노스틱 화합물 및 그 용도

본 발명은 영상화 및/또는 치료용 화합물/복합체에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 ¹⁸F-표지된 경우에는 영상화 용도로, 방사성 금속이 킬레이트화된 경우에는 치료 용도로 구성된 이중 방식의 화합물/복합체에 관한 것이다.

PET 영상화는 비-침습적인 임상 진단에서 점점 더 중요한 역할을 차지하고 있다.^1-7 PET는, MRI 또는 SPECT와 비교해, 생체분포 및 소거를 조사하기 위해 매우 높은 감도¹⁰를 동적 시공간 해상도와 결합한 것이다.^{11 ,12 18}F-데옥시글루코스 (FDG) 및 ¹⁸F-티민 (FLT)¹³은 모든 암은 아니지만 대부분의 암에서 두드러진 대사 특징에 기반하여 이미지를 제공해준다.⁴ 암 하위유형은 병리학적으로 구분되는 세포 유형을 구별해 특이적인 분자 표적의 존재를 분석하는 펩타이드^{4 ,14-19}에 의해 점점 구분되고 있지만, 이는 FDG로는 불가능하다.^{20 -2} 임상 펩타이드 추적자 및 약물로는 옥트레오테이트 (octreotate)^24-28, 봄베신 (bombesin)²⁹ 및 RGD^{30 -32}, 루프론 (Lupron™) 및 산도스타틴 (Sandostatin™)^33,34 등이 있다.

방사성 금속 (예, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ^99mTc)의 킬레이트화는 표지를 용이하게 하지만, ¹⁸F-불화물은 보다 적은 비용으로 확장성을 제공해준다. 따라서, ¹⁸F-불화물이 선호된다: 이 불화물은 깨끗하게 붕괴되고 (>97% β+), ⁶⁸Ga과 비교해 훨씬 저렴한 비용으로 높은 동위원소 순도로 생산할 수 있으며 (>1 Ci, $400)³⁵, 최적의 영상화 특성을 제공해준다.^{36 ,37} 이것의 짧은 반감기는 방사선 선량을 최소화화면서도, 높은 비활성으로 인해 추적자는 매우 적은 투여량 요건을 충족한다.³⁸ 하지만, 이의 짧은 반감기 (109.8분)는 펩타이드를 표지하는데도 문제가 된다. ¹⁸F-표지된 오가노트리플루오로보레이트 (RBF3s)에 대한 선행 연구를 통해, 이제 방사성 금속의 킬레이트화만큼이나 ¹⁸F-표지화가 쉬워졌다. 일부 ¹⁸F-RBF3-펩타이드가 높은 종양 흡수성을 보이고 있지만,⁴⁰ 방사성 금속 펩타이드의 확실한 이점은 일반적으로 보다 높은 종양 흡수성이다.⁴¹

그렇지만, 방사독성 메탈로펩타이드는 몇가지 치료 옵션이 존재하는 일부 암을 치료하는데 사용되고 있다. 예를 들어, 췌장암을 치료하기 위해 옥트레오테이트-킬레이터에 ⁹⁰Y를 킬레이트화 하였다.⁴² 몇가지 펩타이드들이 방사선요법의 표적 물질로 부상하고 있다.^{43 ,44} 그러나, 모든 환자가 이러한 요법에 반응하는 것은 아니다. 이상적으로는, 환자는 치료에 돌입하기 전에 동일한 펩타이드를 이용해 영상 진단하여야 한다. 방사선 치료 펩타이드의 PET 영상 진단에는, 하나는 영상 진단 용도이고 다른 하나는 치료 용도인, 동위원소 쌍 (예, ⁸⁶Y/⁹⁰Y, ⁶⁴Cu/⁶⁷Cu, ²⁰³Pb/²¹²Pb)을 가진 금속으로 제한된다.^{45 ,46} 불행히도, 진단용 PET 금속의 생산은 제한적이고, 비싸다. 더 나쁜 점은, 일부 방사성 금속, 예를 들어 ¹⁷⁷Lu의 경우, 쉽게 입수할 수 없거나, 또는 PET에 유용하지 않다 (β+-방출성 ¹⁶⁷Lu을 이용한 PET에 대한 보고는 단 1건 있음). 전형적으로, 영상 진단에는 다른 금속들이 사용된다.

따라서, 현행 관행은, 하나의 방사성 금속을 영상 진단에 이용하고 다른 방사성 금속을 치료에 이용하는 경우에, 상당한 문제들을 일으킨다. 예를 들어, TATE는 (영상 진단 용도로) ¹¹¹In로 표지되고, (치료 용도로) ⁹⁰Y로 표지된다. 현저한 흡수성 차이로 인해, TATE는 동일한 동위원소, 즉 β+-방출성 ⁸⁶Y로 평가하여야 한다는 결론에 도달하게 되었다.^{45 ,46} 공교롭게도, ⁸⁶Y는 매우 비싸고, ¹⁸F에 비해 해상도가 낮다.⁴⁷ 비슷한 문제는 SPECT 영상 진단에서도 계속된다: ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ¹⁷⁷Lu 및 ⁹⁰Y의 DOTA-TATE 킬레이트들은 모두 서로 다른 친화성을 보이므로, 방사성 금속이 친화성과 영상 신호 모두에 영향을 미치게 되어, 서로 다른 메탈로-펩타이드의 이미지들을 상호 연관시키기 어렵다.^{43 ,48} 유사한 문제는 봄베신-NOTA를 이용한 경우에서도 관찰되는데; ⁶⁸Ga-킬레이트가 ¹¹¹In-킬레이트에 비해 친화성이 훨씬 낮다: 각각 1.2 nM vs. 23 pM.⁴⁹ 친화성 편차는 이미지를 연관짓고 방사선치료제의 흡수를 예측하기 어렵게 만든다. 또한, 2종의 금속 동위원소가 이소토폴로그 (isotopolog)들로 이루어진 테라노스틱 쌍을 제공하도록 동정가능한 사례가 소수에 불과하다. 이에, 테라노스틱 이중-기능의 PET 영상화 추적자/방사선치료 분야에서 PET 영상 진단 결과를 토대로 개선된 치료 계획을 용이하게 설립하고자 하는 충족되지 못한 요구가 존재하는 실정이다.

어떠한 선행 정보도 본 발명에 대해 선행 기술을 구성한다는 용인으로서 반드시 의도되거나 또는 해석되어서는 안된다.

다양한 구현예들은, 방사능 금속 동위원소 또는 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트화 하도록 구성된 금속 킬레이터; 및 ¹⁹F/¹⁸F 교환하도록 구성된 트리플루오로보레이트 (BF₃)-함유 모이어티 또는 ¹⁸F-표지된 트리플루오로보레이트로 변환할 수 있는 보로네이트 전구체를 포함하는, 화합물 또는 분자 ^복합체에 관한 것이다.

다양한 구현예들은, 세포-표적화 도메인; 금속 방사능 동위원소 또는 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트화 하도록 구성된 금속 킬레이터; 및 ¹⁹F/¹⁸F 교환하도록 구성된 트리플루오로보레이트 (BF₃)-함유 모이어티 또는 ¹⁸F-표지된 트리플루오로보레이트로 변환할 수 있는 보로네이트 전구체를 포함하는, 화합물 또는 분자 ^복합체에 관한 것이다. 일부 이러한 구현예들에서, 세포-표적화 도메인은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 펩타이드 모방체, 또는 핵산 앱타머, 마크로사이클, 스테로이드 또는 소분자를 포함할 수 있으며, 여기서 세포-표적화 도메인은 세포 마커에 특이적으로 결합한다. 다른 이러한 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 LLP2A, PSMA-617, TATE 또는 펩타이드 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂를 포함한다. 다른 이러한 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 (i) 표적 세포의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유도체 또는 단편을 포함하거나, 또는 (ii) 상기한 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유도체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 단백질 도메인을 포함한다.

일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 BF₃-함유 모이어티를 함유한 링커를 통해 세포-표적화 도메인에 연결될 수 있다. 링커는 BF₃-함유 모이어티를 여러개 포함할 수 있다. 링커는 펩타이드 링커일 수 있다. 링커는 Lys(AMBF₃)를 포함할 수도 있다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 ^복합체에서, 금속 킬레이터는 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하거나 또는 형성하지 않으며, BF₃-함유 모이어티는 ¹⁸F-표지된다.

일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하고, BF₃-함유 모이어티는 ¹⁹F-표지된다.

일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하고, BF₃-함유 모이어티는 ¹⁸F-표지된다.

일부 구현예에서, 방사능 금속 동위원소는 α 방출체, β 방출체 또는 오제 방출체이다.

일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 DOTA 및 유도체; DOTAGA; NOTA; NODAGA; NODASA; CB-DO2A; 3p-C-DEPA; TCMC; DO3A; DTPA, 및 CHX-A"-DTPA 및 1B4M-DTPA로부터 선택적으로 선택되는 DTPA 유사체; TETA; NOPO; Me-3,2-HOPO; CB-TE1A1P; CB-TE2P; MM-TE2A; DM-TE2A; 사르코파긴, 및 SarAr, SarAr-NCS, diamSar, AmBaSar 및 BaBaSar로부터 선택적으로 선택되는 사르코파긴 유도체; TRAP; AAZTA; DATA 및 DATA 유도체; H2-macropa 또는 이의 유도체; H2dedpa, H4octapa, H4py4pa, H4Pypa, H2azapa, H5decapa 및 기타 피콜린산 유도체; CP256; PCTA; DOTP; HEHA; C-NETA; C-NE3TA; HBED; SHBED; BCPA; CP256; YM103; cyclam; DiamSar; 데스페리옥사민 (DFO) 및 DFO 유도체; H6phospa; 트리티올 킬레이트; 머캅토아세틸; 하이드라지노니코틴아미드; 다이머캅토숙신산; 1,2-에틸렌다이일비스-L-시스테인 다이에틸 에스테르; 메틸렌다이포스포네이트; 헥사메틸프로필렌아민옥심; 및 헥사키스(메톡시 이소부틸 이소니트릴); 포르피린, 클로린, 텍사프린, 프탈로시아닌로 이루어진 군으로부터 선택되는 킬레이트들로부터 선택되는 킬레이터이다. 일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 DOTA 및 DOTA 유도체로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 DOTA이다.

일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티는

이거나, 또는 표 3 또는 4에 언급된 기이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 C₁-C₅의 선형 또는 분지형 알킬 기이다.

일부 구현예에서, 화합물은 DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A; PSMA-617-LysAMBF3-DOTA; DOTA-Lys(AMBF3)-TATE; 및 DOTA-Lys-AMBF3-Pip-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 형광단 또는 다른 광 방출 모이어티를 더 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 Lys(AMBF₃)를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물은 DOTA-Bn-NH-Lys-(AMBF₃)를 포함한다.

화합물 또는 분자 복합체가 BF₃-함유 모이어티와 세포-표적화 도메인을 둘다 포함하는 일부 구현예에서, 이 화합물 또는 분자 복합체는, ¹⁸F로 표지된 화합물 또는 분자 복합체를 이용하여 질환 또는 병태의 세포 마커의 존재를 검증하기 위해 개체를 영상 진단하고; 치료학적 방사능 동위원소와 킬레이트를 형성한 화합물 또는 분자 복합체를 이용해 질환 또는 병태를 치료하기 위한 용도이다.

화합물 또는 분자 복합체가 BF₃-함유 모이어티를 포함하는 화합물이고 세포-표적화 도메인을 포함하지 않는 일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 개체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 및/또는 영상 진단하기 위해 이중 특이성 항체와 조합하여 사용하기 위한 것이며, 여기서 이중 특이성 항체는 (i) 질환 또는 병태의 세포 마커와, (ii) 금속 킬레이터에 특이적이다. 일부 이러한 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 이중 특이성 항체와의 복합체로서 개체에 투여하기 위한 것일 수 있다. 다른 이러한 구현예에서, 이중 특이성 항체는 개체에게 화합물 또는 분자 복합체를 투여하기 전에 이중 특이성 항체가 세포 마커에 결합하는 사전-표적화 단계에서 개체에 투여하기 위한 것일 수 있다.

본 발명의 특징들은 첨부된 도면을 참조하여 후술한 설명으로부터 명확해질 것이다:
도 1은 일부 이중-방식의 PET 영상 진단 방사선치료의 기능성 도메인의 다양한 상대적인 배열들을 나타낸 도식도이다.
도 2는 DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A (LLP2A-LysAMBF3-DOTA로도 지칭됨) 및 PSMA-617-LysAMBF3-DOTA의 화학적 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 B16F10 흑색종 이종이식편-보유 마우스에서, (A) 비-방사능 LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA (100 ㎍)의 주사 없이 및 (B) 이와 공동-주사하는 경우의, F-18 표지된 LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA의 (주사 후 1시간) 최대 강도 투사 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 LNCaP 전립선암 이종이식편-보유 마우스에서, (A) DCFPyL (0.5 mg) 주사 없이 및 (B) 이와 공동-주사하는 경우의, F-18 표지된 PSMA-617-Lys-AMBF3-DOTA의 (주사 후 1시간) 최대 강도 투사 이미지를 나타낸 것이다.
도 5는 a) HPLC 방법 B에 따른, 방사화학적 순도가 98.5%인 t _R = 14.97분에서의 7, 1.1%인 ¹⁸F^- (t _R = 2.30분) 및 0.4% 불순물 (t _R = 8.26분)을 나타낸 방사성 크로마토그램 및 b) 7 단독 (t _R = 14.44분) 및 0.1 nmol 콜드 전구체 6 (t _R = 14.49분)이 공동-주입된 경우의 흡광 크로마토그램을 도시한, (1:9) EtOH: 0.9% 식염수 (v/v) 중에 조제된 정제된 ¹⁸F-방사성 추적자 7의 (분취용 HPLC 정제 및 C18 Sep-Pak 용출 후) 대표적인 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 B16-F10 종양 (화살 표시) 보유 마우스에서 7 단독 (a 및 b; 4-6 MBq 주입) 및 7 (4-6 MBq 주입됨)과 차단제 1 (200 ㎍)의 공동-주입 (c 및 d) 한 경우, 1h p.i. 시점의 PET 이미지를 나타낸 것으로, 스케일 바는 0-20%ID/g이다.
도 7은 B16-F10 종양-보유 마우스에서 [¹⁸F]6 (5 MBq 주입)의 동적 PET 스캔 (5초 - 52.5분 p.i., 28가지 시간대) 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 1의 ¹H NMR (아세톤-d₆, 300 MHz, RT) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 LLP2A-PEG₂-AMBF₃-Fmoc (3)의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₇₆H₉₈BF₃N₁₄O₁₃, 계산치 1483.5 m /z; 실측치 [M+Na]⁺ = 1506.8 m /z, [M+K]⁺ = 1520.9 m /z.
도 10은 AMBF₃-PEG₂-LLP2A-NH₂ (4)의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₆₁H₈₈BF₃N₁₄O₁₁, 계산치 1261.3 m /z; 실측치 [M+H]⁺ = 1262.6 m /z, [M+Na]⁺ = 1284.6 m /z.
도 11은 DOTA-AMBF₃-PEG₂-LLP2A (6)의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₇₇H₁₁₄BF₃N₁₈O₁₈, 계산치 1647.6 m /z; 실측치 [M+H]⁺ = 1648.9 m /z, [M+Na]⁺ = 1670.9 m /z, [M+K]⁺ = 1687.0 m /z.
도 12는 HPLC 방법 A에 따라 수행된, 반-분취용 HPLC 정제 (>95% 순도)를 거친 6 (t_R = 8.9분)의 분석용 HPLC 크로마토그램 (λ_Abs = 241nm)을 도시한 것이다.
도 13은 HPLC 방법 C를 이용하여 수득한, 6의 UV-vis 흡수 (λ = 257 nm)에 기반한 (HPLC 정제 후 및 제형화) [¹⁸F]6의 특정화를 위한 표준 곡선을 나타낸 것이다.
도 14는 VLA-4를 발현하는 B16-F10 세포를 이용한, ¹⁸F-방사성 추적자 [¹⁸F]6에 대한 시험관내 결합 포화 분석을 나타낸 것으로 (각각 2세트, 오차 막대는 ±SD임), K_d 계산값은 6.9 ± 0.59 nM (n = 3)이다.
도 15는 1의 ¹³C{¹H} NMR (아세톤-d₆, 75 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 16은 1의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₁₂H₂₃BNO₂ ⁺ 계산치 224.1 m/z; 실측치 [M]⁺ = 224.6 m/z.
도 17은 2의 ¹H NMR (아세톤-d₆, 300 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 18은 2의 ¹³C{¹H} NMR (아세톤-d₆, 75 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 19는 2의 ¹⁹F{¹H} NMR (아세톤-d₆, 282 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 20은 2의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₆H₁₁BF₃N에 대한 계산치 165.0 m/z; 실측치 [M+Na]⁺ = 188.4 m/z.
도 21은 3의 ¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 22는 3의 ¹³C{¹H} NMR (CDCl₃, 75 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 23은 3의 ESI-MS(-) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₂₁H₂₂N₄O₄에 대한 계산치 394.4 m/z; 실측치 [M-H]^- = 393.4 m/z 및 [2M-H]^- = 787.7 m/z.
도 24는 4의 ¹H NMR (CD₃CN, 300 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 25는 4의 ¹³C{¹H}NMR (CD₃CN, 75 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 26은 4의 ¹⁹F{¹H} NMR (CD₃CN, 282 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 27은 4의 ESI-MS(-) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₂₇H₃₃BF₃N₅O₄에 대한 계산치 559.4 m/z; 실측치 [M-H]^- = 558.5 m/z 및 [M+I]^- = 686.4 m/z.
도 28은 5의 ¹ H NMR (CD₃CN, 300 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 29는 5의 ¹³C{¹H} NMR (CD₃CN, 75 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 30은 5의 ¹³C DEPT-135 NMR (CD₃CN, 75 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 31은 5의 ¹⁹F{¹H} NMR (CD₃CN, 282 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 32는 5의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₃₁H₃₆BF₃N₆O₆에 대한 계산치 656.5 m/z; 실측치 [M+Na]⁺ = 679.8 m/z.
도 33은 5의 HRMS 스펙트럼을 도시한 것이다: C₃₁H₃₆BF₃N₆O₆에 대한 계산치 656.4702 m/z; 실측치 [M+Na]⁺ = 679.2618 m/z.
도 34는 Fmoc-LysAMBF₃-OH의 ¹H NMR (CD₃CN, 300 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 35는 Fmoc-LysAMBF₃-OH의 ¹³C{¹H} NMR (CD₃CN, 75 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 36은 Fmoc-LysAMBF₃-OH의 ¹⁹F{¹H} NMR (CD₃CN, 282 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 37은 Fmoc-Lys(AMBF₃)-OH의 ESI-MS(-) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₂₇H₃₃BF₃N₅O₄에 대한 계산치 559.4 m/z; 실측치 [M-H]^- = 558.5 m/z 및 [M+I]^- = 686.4 m/z.
도 38은 ¹H NMR (CD₃CN, 300 MHz, RT)에 의한 Fmoc-LysAMBF₃-O-NHS의 구조 특정화를 나타낸 것이다.
도 39는 ¹³C{¹H} NMR (CD₃CN, 75 MHz, RT)에 의한 Fmoc-LysAMBF₃-O-NHS의 구조 특정화를 나타낸 것이다.
도 40은 Fmoc-LysAMBF₃-O-NHS의 ¹⁹F{¹H} NMR (CD₃CN, 282 MHz, RT) 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 41은 Fmoc-LysAMBF₃-O-NHS의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₃₁H₃₆BF₃N₆O₆에 대한 계산치 656.5 m/z; 실측치 [M+Na]⁺ = 679.8 m/z.
도 42는 PSMA-617-NH₂의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₄₁H₆₁N₅O₉에 대한 계산치 767.97 m/z; 실측치 [M+H]⁺ = 768.7 m/z.
도 43은 PSMA-617-LysAMBF₃-Fmoc의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₆₈H₉₂BF₃N₁₀O₁₂에 대한 계산치 1309.35 m/z; 실측치 [M-F]⁺ = 1290.1 m/z, [M+Na]⁺ = 1332.0 m/z.
도 44는 PSMA-617-LysAMBF₃-NH₂의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₅₃H₈₂BF₃N₁₀O₁₀에 대한 계산치 1087.10 m/z; 실측치 [M-F]⁺ = 1068.1 m/z, [M+H]⁺ = 1088.1 m/z, [M+Na]⁺ = 1110.1 m/z.
도 45는 PSMA-617-LysAMBF₃-DOTA의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₆₁H₉₃BF₃N₁₃O₁₇에 대한 계산치 1360.31 m/z; 실측치 [M-3F-2H]⁺ = 1302.1 m/z, [M+H]⁺ = 1362.1 m/z.
도 46은 PSMA-617-LysAMBF₃-DOTA(Cu)의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₆₁H₉₀BCuF₃N₁₀O₁₀에 대한 계산치 1422.8 m/z; 실측치 [M-3F-2H]⁺ = 1362.8 m/z, [M-F]⁺ = 1402.8 m/z, [M+H]⁺ = 1423.8 m/z, [M+Na]⁺ = 1444.8 m/z.
도 47은 DOTA/AMBF₃-접합된 RM2 펩타이드 (11)를 나타낸 것이다.
도 48은 DOTA/AMBF₃-접합된 BK 펩타이드 (9)를 나타낸 것이다.
도 49는 고상 펩타이드 합성에 사용된 공통 보호기를 나타낸 것이다.
도 50은 229 nm에서 DOTA-Lys(AMBF₃)-BK (화합물 9)의 HPLC 추적 결과를 나타낸 것이다.
도 51은 분해된 펩타이드 (10)에 대한 MALDI-TOF를 나타낸 것이다.
도 52는 분해된 펩타이드 (10)에 대한 특징적인 동위원소 패턴을 나타낸 것이다.
도 53은 DOTA-Lys(AMBF₃)-BK (9)에 대한 MALDI-TOF를 나타낸 것이다.
도 54는 DOTA-Lys(AMBF₃)-BK (9)에 대한 특징적인 동위원소 패턴을 나타낸 것이다.
도 55는 절단 공정 (반응식 6v) 중에 펩타이드 9의 탈보릴화의 결과인 것으로 예측되는 DOTA-Lys(AMBF₃)-BK (10)의 제안된 탈보릴화 산물을 나타낸 것이다. 실제 중량은 1784.03이다. 도 52는 [M+Na⁺]⁺ = 1807.02에서 예측된 동위원소 패턴을 보이는 펩타이드 10의 MALDI-TOF를 도시한 것이다.
도 56은 DOTA-Lys(AMBF₃)-RM2 (11)에 대한 MALDI-TOF를 도시한 것이다.
도 57은 DOTA-((L)-Lys-ε-1,2,3-트리아졸-N,N-다이메틸-암모니오메틸-트리플루오로보레이트)-4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-Pro-Leu-COOH의 구조를 나타낸 것이다.
도 58은 화합물 9 조산물의 HPLC 추적 결과 (229 nm)를 도시한 것이다.
도 59는 화합물 9의 MALDI-TOF 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 60은 DOTA-Lys(AMBF₃)-TATE의 ESI-MS(+) 스펙트럼을 도시한 것이다: C₇₉H₁₁₄BF₃N₂₀O₂₁S₂에 대한 계산치 1811.8 m/z; 실측치 [M+2Na]⁺ = 1855.1 m/z.

본원에서, 용어 "포함하는", "가진", "비롯하여" 및 "함유하는" 및 이의 문법적으로 변형된 용어들은, 심지어 일부로서 정의된 특징/구성성분이 명시된 특징(들)/구성성분(들)으로 구성되거나 또는 이들로 필수적으로 구성되더라도, 포괄적이거나 또는 제한적이지 않으며, 추가적인 언급되지 않은 요소 및/또는 방법 단계들을 배제하진 않는다. 용어 "필수적으로 구성되는"은, 본원에서 화합물, 조성물, 용도 또는 방법과 관련하여 사용되는 경우, 부가적인 요소 및/또는 방법 단계들이 존재할 수 있지만, 이들의 첨가가 언급된 화합물, 조성물, 방법 또는 용도가 기능하는 방식에 실질적으로 영향을 미치지 않는다는 것을, 의미한다. 용어 "로 구성되는"은 본원에서 화합물, 조성물, 용도 또는 방법의 특징과 관련하여 사용되는 경우, 그러한 점에서 부가적인 요소들 및/또는 방법 단계의 존재를 배제한다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 것으로 본원에 언급된 화합물, 조성물, 용도 또는 방법은, 또한, 특정 구현예에서는, 그러한 요소 및/또는 단계들로 필수적으로 구성되고, 다른 구현예에서는, 이들 구현예가 구체적으로 언급되는지 유무에 관계없이, 이들 요소 및/또는 단계들로 구성된다. 특정 요소 및/또는 단계들을 포함하는 것으로 본원에 언급된 용도 또는 방법, 또한, 특정 구현예에서는, 그러한 요소 및/또는 단계로 필수적으로 구성되고, 다른 구현예에서는, 이들 구현예들이 구체적으로 언급되는지 유무에 관계없이, 이들 요소 및/또는 단계로 구성된다.

부정 관사 ("a")가 언급하는 요소는, 문맥상 명확하게 요소가 하나 및 단 하나만 존재하여야 하지 않은 한, 요소가 하나보다 많이 존재할 가능성을 배제하진 않는다. 단수 형태 ("a", "an", 및 "the")는, 문맥상 명확하게 달리 지시되지 않은 한, 복수의 언급도 포함한다. 용어 "a" 또는 "an"의 사용은, 본원에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우에, "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 하나 또는 하나보다 많은"의 의미에 부합한다.

본원에서, 종점에 의해 표현되는 수치 범위는 모든 전체 수치, 모든 정수, 적절한 경우 그 사이에 존재하는 모든 분수 수치를 비롯한 그 범위 내에 포함되는 모든 수치들을 포함한다 (예를 들어, 1-5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4 및 5 등을 포함할 수 있음).

달리 명시되지 않은 한, "특정 구현예", "다양한 구현예", "구현예" 및 유사 용어들은, 다른 구현예들이 직접 또는 간접적으로 언급되는지의 여부 및 특징 또는 구현예가 방법, 생산물, 용도, 조성물, 화합물 등의 문맥에서 기술되는지와 상관없이, 단독으로, 또는 본원에 기술된 임의의 다른 구현예 또는 구현예들과 조합하여, 그 구현예에 대해 기술된 특정한 특징(들)을 포함한다.

본원에서, 용어 "치료한다", "치료", "치료학적" 등은 증상 개선, 질환의 진행 감소, 예후 개선 및 재발 감소를 포함한다.

본원에서, 용어 "진단제"는 "영상화제"를 포함한다. 이와 같이, "진단용 방상성 핵종"은 영상화제로 사용하기 적합한 방사핵종을 포함한다.

용어 "개체"는 동물 (예, 포유류 또는 비-포유류 동물)을 지칭한다. 개체는 인간 또는 인간을 제외한 영장류일 수 있다. 개체는 실험용 포유류 (예, 마우스 랫, 토끼, 햄스터 등)일 수 있다. 개체는 농장 동물 (예, 말, 양, 소, 돼지, 낙타과 등) 또는 가축 동물 (예, 개, 고양이 등)일 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.

본원에 개시된 화합물은 또한 이의 염기가 없는 형태, 용매화물, 염 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 달리 명시되거나 또는 지시되지 않은 한, 본원에 청구되고 기술된 화합물들은, 본원에 명확하게 표시되는지의 여부에 관계없이, 모든 라세믹 혼합물과 모든 개별 거울상 이성질체 또는 이들의 조합을 포괄하는 것으로 의도된다.

본원에 개시된 화합물은 하나 이상의 하전된 기를 가진 것으로 표시될 수 있으며, 이온화가능한 기를 비-하전된 (예, 양성자화된) 상태로 가진 것으로 표시되거나, 또는 형식 전하를 명시하지 않고 표시될 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 화합물 (예, 비-제한적으로, CO₂H, PO₃H₂, SO₂H, SO₃H, SO₄H, OPO₃H₂ 등)에서 특정 기의 이온화 상태는, 특히 그 기의 pKa 및 그 위치에서의 pH에 의존한다. 예를 들어, 비-제한적이지만, 양성자화된 상태가 안정화되지 않은 한, 카르복시산 기 (즉, COOH)는 통상적으로 중성 pH에서, 최대 생리학적 pH 값에서 탈양성자화(되고 음으로 하전)되는 것으로 이해될 것이다. 마찬가지로, OSO₃H (즉, SO₄H) 기, SO₂H 기, SO₃H 기, OPO₃H₂ (즉, PO₄H₂) 기 및 PO₃H 기는 일반적으로 중성 및 생리학적 pH 값에서 탈양성자화(되고 음으로 하전)될 것이다.

본원에서, 용어 "염" 및 "용매화물"은 화학에서의 일반적인 의미를 가진다. 이와같이, 화합물이 염 또는 용매화물인 경우, 이는 적합한 반대 이온과 조합된다. 염 제조 방법 또는 반대 이온 교환 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 형태를 화학량론적 함량의 적정 염기 (예, 비-제한적으로, Na, Ca, Mg, 또는 K 하이드록사이드, 카보네이트, 바이카보네이트, 또는 기타 등)와 반응시켜, 또는 이들 화합물의 유리 염기 형태를 화학량론적 함량의 적정 산과 반응시켜, 제조할 수 있다. 이러한 반응은 일반적으로 수 중에, 또는 유기 용매 중에, 또는 물과 유기 용매의 혼합물 중에 수행된다. 반대 이온은, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피와 같은 이온 교환 기법에 의해 교환할 수 있다. 특정 형태가 명시적으로 언급되지 않은 한, 모든 양쪽성이온, 염, 용매화물 및 반대 이온이 의도된다.

특정 구현예에서, 염 또는 반대 이온은 개체에게 투여하기에 약제학적으로 허용가능할 수 있다. 본원에서, "약제학적으로 허용가능한"은 개체에서 생체내 사용하기 적합하다는 것을 의미하며, 반드시 치료학적 용도로 제한되는 것은 아니며, 진단 용도도 포함한다. 보다 일반적으로, 본원에 개시된 임의의 약학적 조성물과 관련하여, 적절한 부형제에 대한 비-제한적인 예로는 임의의 적절한 완충제, 안정화제, 염, 항산화제, 착화제, 강장제, 동해 방지제, 동결건조보호제, 현탁화제, 유화제, 항미생물제, 보존제, 킬레이트제, 결합제, 계면활성제, 습윤제, 고정유와 같은 비-수성 비히클 또는 서방형 또는 제어 방출형 폴리머 등이 있다. 예를 들어, Berge et al. 1977. (J. Pharm Sci. 66:1-19), 또는 Remington- The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition (Gennaro et al editors. Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia)을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본원에서, 표현 "Cy-Cz"는, 여기서 y 및 z는 정수로서 (예, C₁-C₁₅, C₁-C₃₀, C₁-C₁₀₀, 등), 화합물, R-기 또는 치환기 (예, 알킬, 아케닐 또는 알키닐 기)에서 탄소의 개수를 나타내거나, 또는 이 표현이 하나 이상의 이종원자를 가지는 것으로 또는 선택적으로 가지는 것으로 추가적으로 정의되는 경우에는, 탄소 + 이종원자의 개수를 나타낸다. 후자의 경우, 표현 "Xy-Xz"도 사용될 수 있으며 (예, X₃-X₁₅ 등), 여기서 y 및 z는 탄소 + 이종원자의 개수를 나타내는 정수이다. 이종원자는 임의의, 일부 또는 모든 가능한 이종원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 이종원자는 N, O, S, P 및 Se으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 이종원자는 N, O, S 및 P로부터 선택된다. 이러한 구현예들은 비-제한적이다.

명시적으로 달리 언급되지 않은 한, 용어 "알킬"은 알칸에서 수소 원자가 빠진 것을 의미하며, 다음 중 어느 하나 이상을 포함한다: 선형 알킬, 분지형 알킬, 비환식 알킬, 다환식 및 다환식 사이클로알킬 등의 사이클로알킬 (예, 융합된 고리, 복수의 비-융합된 고리 또는 이들의 조합), 및/또는 비-치환 또는 치환된 형태. 예를 들어, 알킬은 분지형 및 사이클 둘다일 수 있다. 명시되어 있지 않다면, 알킬 길이는 당해 기술 분야의 당업자에게 합리적인 것으로 간주되는 수준일 것이다. 예를 들어, 비-제한적으로, 명시되어 있지 않다면, 알킬의 길이는, 당해 기술 분야의 당업자의 공통적인 일반 상식에 속하는, 탄소 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 또는 100개보다 많은 수로 된 길이일 있다. 본원에서, 용어 "알킬레닐"은 알킬 기의 2가 유사체를 의미한다.

본원에서, 화합물의 알킬 기 맥락에서, 용어 "선형"은, 당해 기술 분야의 당업자에게 정상적으로 이해되는 바와 같이 사용될 수 있으며, 일반적으로 2 이상의 인접한 체인으로 분할되지 않은 골격 또는 주쇄를 포함하는 화학적 실체를 지칭한다. 선형 알킬에 대한 비-제한적인 예로는 메틸, 에틸, n-프로필 및 n-부틸을 포함한다.

본원에서, 용어 "분지형"은 당해 기술 분야의 당업자에게 정상적으로 이해되는 바와 같이 사용될 수 있으며, 일반적으로 2 이상의 인접한 쇄로 분할된 골격 또는 주쇄를 포함하는 화학적 실체를 지칭한다. 2 이상의 방향으로 분할된 골격 또는 주쇄의 일부는 선형, 사이클릭 또는 이들의 조합일 수 있다. 분지형 알킬 기에 대한 비-제한적인 예로는 tert-부틸 및 이소프로필을 포함한다.

C₁-C₂₀ 알킬 기에 대한 비-제한적인 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, sec-프로필, n-부틸, i-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, i-펜틸, sec-펜틸, t-펜틸, n-헥실, i-헥실, 1,2-다이메틸프로필, 2-에틸프로필, 1-메틸-2-에틸프로필, l-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1,2-트리에틸프로필, 1,1-다이메틸부틸, 2,2-다이메틸부틸, 2-에틸부틸, 1,3-다이메틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, sec-헥실, t-헥실, n-헵틸, i-헵틸, sec-헵틸, t-헵틸, n-옥틸, i-옥틸, sec-옥틸, t-옥틸, n-노닐, i-노닐, sec-노닐, t-노닐, n-데실, i-데실, sec-데실, t-데실, 사이클로프로파닐, 사이클로부타닐, 사이클로펜타닐, 사이클로헥사닐, 사이클로헵타닐, 사이클로옥타닐, 사이클로노나닐, 사이클로데카닐 등을 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않은 한, C₁-C₂₀ 알킬레닐은 따라서 상기에 열거된 포화된 알킬 기에 대한 모든 2가 유사체를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

본원에서, 용어 "알케닐" 및 "알키닐"은, 알켄 및 알킨에서 각각 수소 원자가 빠진 것으로, 선형, 분지형 및/또는 사이클릭 기를 포함할 수 있으며, 비-치환되거나 또는 치환될 수 있다. C₂-C₂₀ 알케닐 기에 대한 비-제한적인 예로는 비닐, 알릴, 이소프로페닐, l-프로펜-2-일, 1-부텐-l-일, l-부텐-2-일, l-부텐-3-일, 2-부텐-l-일, 2-부텐-2-일, 옥테닐, 데세닐, 사이클로프로페닐, 사이클로부테닐, 사이클로펜테닐, 사이클로헥세닐, 사이클로헵테닐, 사이클로옥테닐, 사이클로노난닐, 사이클로데칸닐 등을 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않은 한, C₁-C₂₀ 알케닐레닐은 따라서, 비-제한적으로, 상기에 열거된 알케닐 기의 모든 2가 유사체를 포함한다. C₂-C₂₀ 알키닐 기에 대한 비-제한적인 예로는 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 헵티닐, 옥티닐, 노니닐, 데시닐 등을 포함할 수 있다. 달리 명시되지 않은 한, C₁-C₂₀ 알키닐레닐은 따라서, 비-제한적으로, 상기에 열거된 알키닐 기의 모든 2가 유사체를 포괄한다.

비-방향족 헤테로사이클릭 기에 대한 비-제한적인 예로는 아지리디닐, 아제티디닐, 다이아제티디닐, 피롤리디닐, 피롤리닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 이미다졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리디닐, 프탈이미딜, 숙신이미딜, 옥시라닐, 테트라하이드로피라닐, 옥세타닐, 다이옥사닐, 티에타닐, 티에피닐, 모르폴리닐, 옥사티올라닐 등을 포함한다. 추가로 명시되지 않은 한, "아릴" 기는 단일 방향족 고리뿐 아니라 하나 이상의 방향족 고리를 가진 융합된 고리를 모두 포함한다. C₃-C₂₀ 아릴 기에 대한 비-제한적인 예로는 페닐 (Ph), 펜탈레닐, 인데닐, 나프틸 및 아줄레닐을 포함한다. X₃-X₂₀ 방향족 헤테로사이클릭 기에 대한 비-제한적인 예로는 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 아크리디닐, 인돌릴, 이소인돌릴, 인돌리지닐, 푸리닐, 카바졸릴, 인다졸릴, 프탈라지닐, 나프티리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프테리디닐, 페난트리디닐, 페나지닐, 페난트롤리닐, 페리미디닐 (perimidinyl), 푸릴, 다이벤조푸릴, 크산테닐, 벤조푸릴, 티오페닐, 티안트레닐, 벤조티오페닐, 포스포리닐, 포스피놀리닐, 포스프인돌릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴 등을 포함한다.

본원에서, 용어 "치환된"은 당해 기술 분야의 당업자들에게 정상적으로 이해되는 바와 같이 사용되며, 일반적으로 하나의 화학 기가 다른 화학 기로 치환된 화합물 또는 화학적 실체에 대해 사용된다. 달리 명시되지 않은 한, 치환된 알킬은 하나 이상의 수소 원자(들)가 독립적으로 각각 수소가 아닌 원자로 치환된 알킬이다. 예를 들어, 클로로메틸은 치환된 알킬의 비-제한적인 예이며, 보다 구체적으로는 치환된 메틸의 일 예이다. 아미노에틸은 치환된 알킬에 대한 또 다른 비-제한적인 예이며, 보다 구체적으로는 치환된 에틸에 대한 일 예이다. 달리 명시되지 않은 한, 치환된 화합물 또는 기 (예, 알킬, 아릴 등)는 당해 기술 분야의 당업자들에게 합리적인 임의의 화학 기로 치환될 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 탄소 또는 이종원자 (예, N)에 결합된 수소는 할라이드 (예, F, I, Br, Cl), 아민, 아미드, 옥소, 하이드록실, 티올, 포스페이트, 포스포네이트, 설페이트, SO₂H, SO₃H, 알킬, 아릴, 케톤, 카르복스알데하이드, 카르복실레이트, 카르복사미드, 니트릴, 모노할로메틸, 다이할로메틸 또는 트리할로메틸로 치환될 수 있다.

본원에서, 용어 "비-치환된"은 당해 기술 분야의 당업자들에게 정상적으로 이해되는 바와 같이 사용된다. 비-치환된 알킬에 대한 비-제한적인 예로는 메틸, 에틸, tert-부틸, 펜틸 등을 포함한다. 표현 "선택적으로 치환된"은 표현 "비-치환 또는 치환된"과 상호 호환적으로 사용된다.

본원에 제시된 구조에서, 수소는 표시되거나 또는 표시되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, (표시되거나 또는 내포된) 수소는 프로튬 (즉 ¹H), 중수소 (즉 ²H) 또는 ¹H와 ²H의 조합일 수 있다. ¹H를 ²H와 교환하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 용매-교환가능한 수소의 경우, ¹H와 ²H의 교환은 임의의 촉매 없이 적합한 중수소원의 존재 하에 용이하게 이루어진다. 산, 염기 또는 금속 촉매를, 승온된 온도 및 압력 조건과 조합 사용하여, 교환가능하지 않은 수소 원자를 쉽게 교환시킬 수 있으며, 이로써 일반적으로 분자에서 모든 ¹H가 ²H로 교환된다.

화학 식 (예, 표 3 및 4에 열거된 기)에서 결합 말단에 또는 경유하는 것으로 표시된 물결선 "

" 기호는, 물결선의 한쪽 편에 있는 R 기를 정의하고, 물결선의 다른 쪽 사이드에 구조에 대한 정의는 수정하지 않는 것으로 의도된다. R 기가 2 이상의 사이드 (예, R²)와 결합한다면, 물결선의 바깥 사이드에 나타낸 임의 원자는 R 기의 방향성을 명확하게 하기 위한 것이다. 이와 같이, 2개의 물결선 사이에 위치한 원자만 R 기의 정의를 구성한다. 원자가 물결선의 바깥 사이드에 표시되지 않은 경우 또는 물결선 없이 표시되지만 복수의 사이드 (예, -C(O)NH-, 등)에 결합된 화학 기의 경우, 화학 기는 다른 방향성이 명확하게 의도되지 않은 한, 기와 관련된 식에서의 방향성과 일치하게 좌측에서 우측 방향으로 읽어야 한다 (예, 식 -R^a-R^b-R^c-에서, R^b가 -C(O)NH-로 정의되면, 식에는 -R^a-NHC(O)-R^c-가 아닌 -R^a-C(O)NH-R^c-로서 병합됨).

본원은 방사성 동위원소 및 비-방사능 동위원소뿐 아니라 이소토폴로그인 화합물, 복합체 또는 분자 조성물을 참조한다. 이소토폴로그가 특정 동위원소를 함유한 것으로 식별된다면, 실제 현실에서 화합물/복합체/조성물이 식별된 동위원소를 상당히 선호하는 이소토폴로그의 혼합물 형태로 수득될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 핫-F 또는 ¹⁸F 이소토폴로그로서 식별된 화합물/복합체/조성물의 조제물은 실제 대응되는 ¹⁹F 이소토폴로그를 최소량으로 함유할 수 있다. 역으로, 핫-M 또는 방사성 금속화된 이소토폴로그 (예, ¹⁷⁷Lu)로서 식별된 화합물/복합체/조성물의 조제물은 대응되는 비-방사능 이소토폴로그 (예, ¹⁷⁴Lu, ^natLu)를 최소량으로 함유할 수 있다.

용어 "Xaa"는 펩타이드 쇄에서 아미노산 잔기 또는 그렇지 않다면 화합물의 일부인 아미노산을 나타낸다. 아미노산은 아미노 기 및 카르복시산 기 둘다를 가지고 있으며, 이중 하나 또는 둘다가 공유 결합에 사용될 수 있다. 화합물의 나머지 부분에 부착되는 경우, 아미노 기 및/또는 카르복시산 기가 아미드 또는 다른 구조로 바뀔 수 있으며; 예를 들어, 제1 아미노산의 카르복시산 기가 제2 아미노산의 아미노 기에 결합하는 경우, 아미드 (즉, 펩타이드 결합)로 변환된다. 이와 같이, Xaa는 식 -N(R^a)R^bC(O)-를 가질 수 있으며, 여기서 R^a 및 R^b는 R-기이다. R^a는 전형적으로 수소 또는 메틸이거나, 또는 R^a 및 R^b는 사이클릭 구조를 형성할 수 있다. 펩타이드의 아미노산 잔기는 전형적인 펩타이드 (아미드) 결합을 포함할 수 있으며, 측쇄 관능기와 다른 아미노산의 측쇄 또는 주쇄 관능기 간의 결합을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드에서 아미노산 잔기 하나 (예, Asp, Glu, 등)의 측쇄 카르복실레이트는 펩타이드의 다른 아미노산 잔기 (예, Dap, Dab, Orn, Lys)의 아민과 결합할 수 있다. 추가적인 상세한 설명은 아래에 제공된다. 달리 언급되지 않은 한, "Xaa"는, 단백질성 또는 비-단백질성 아미노산을 비롯하여 임의의 아미노산일 수 있다. 비-단백질성 아미노산에 대한 비-제한적인 예는 표 1에 열거하며, 이하를 포함한다: D-아미노산 (비-제한적으로, 다음과 같은 아미노산의 임의의 D-형태), 오르니틴 (Orn), 3-(1-나프틸)알라닌 (Nal), 3-(2-나프틸)알라닌 (2-Nal), α-아미노부티르산, 노르발린, 노르루신 (Nle), 호모노르루신, β-(1,2,3-트리아졸-4-일)-L-알라닌, 1,2,4-트리아졸-3-알라닌, Phe(4-F), Phe(4-Cl), Phe(4-Br), Phe(4-I), Phe(4-NH₂), Phe(4-NO₂), 호모아르기닌 (hArg), 2-아미노-4-구아니디노부티르산 (Agb), 2-아미노-3-구아니디노프로피온산 (Agp), B-알라닌, 4-아미노부티르산, 5-아미노발레르산, 6-아미노헥산산, 7-아미노헵타노익산, 8-아미노옥타노익산, 9-아미노노나노익산, 10-아미노데카노익산, 2-아미노옥타노익산, 2-아미노-3-(안트라센-2-일)프로판산, 2-아미노-3-(안트라센-9-일)프로판산, 2-아미노-3-(피렌-1-일)프로판산, Trp(5-Br), Trp(5-OCH₃), Trp(6-F), Trp(5-OH) 또는 Trp(CHO), 2-아미노아디프산 (2Aad), 3-아미노아디프산 (3Aad), 프로파길글리신 (Pra), 호모프로파길글리신 (Hpg), β-호모프로파길글리신 (Bpg), 2,3-다이아미노프로피온산 (Dap), 2,4-다이아미노부티르산 (Dab), 아지도라이신 (Lys(N₃)), 아지도-오르니틴 (Orn(N₃)), 2-아미노-4-아지도부탄산 Dab(N₃), Dap(N₃), 2-(5'-아지도펜틸)알라닌, 2-(6'-아지도헥실)알라닌, 4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘 (Pip), 4-(2-아미노에틸)-1-카르복시메틸-피페라진 (Acp), 및 트라넥삼산. L- 또는 D-아미노산으로 명시되어 있지 않다면, 아미노산은 L-아미노산으로 이해될 것이다.

표 1. 비-단백질성 아미노산에 대한 비-제한적인 예 목록.

p-아미노메틸아닐린-다이글리콜산 (pABzA-DIG)	10-아미노데카노익산
오르니틴 (Orn)	2-아미노옥타노익산
3-(1-나프틸)알라닌 (Nal)	2-아미노-3-(안트라센-2-일)프로판산
3-(2-나프틸)알라닌 (2-Nal)	2-아미노-3-(안트라센-9-일)프로판산
α-아미노부티르산	2-아미노-3-(피렌-1-일)프로판산
노르발린	Trp(5-Br),
노르루신 (Nle)	Trp(5-OCH3),
호모노르루신	Trp(6-F),
β-(1,2,3-트리아졸-4-일)-L-알라닌	Trp(5-OH)
1,2,4-트리아졸-3-알라닌	Trp(CHO),
Phe(4-F),	2-아미노아디프산 (2Aad)
Phe(4-Cl),	3-아미노아디프산 (3Aad)
Phe(4-Br),	프로파길글리신 (Pra)
Phe(4-I),	호모프로파길글리신 (Hpg)
Phe(4-NH2),	β-호모프로파길글리신 (Bpg)
Phe(4-NO2),	2,3-다이아미노프로피온산 (Dap)
호모아르기닌 (hArg)	2,4-다이아미노부티르산 (Dab)
4-(2-아미노에틸)-1-카르복시메틸-피페라진 (Acp)	아지도라이신 (Lys(N3))
2-(5'-아지도펜틸)알라닌, 2-(6'-아지도헥실)알라닌	아지도-오르니틴 (Orn(N3))
2-아미노-4-구아니디노부티르산 (Agb)	아미노-4-아지도부탄산 Dab(N3)
2-아미노-3-구아니디노프로피온산 (Agp)	트라넥삼산
β-알라닌	4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘 (Pip)
4-아미노부티르산	NH2(CH2)2O(CH2)2C(O)OH
5-아미노발레르산	NH2(CH2)2[O(CH2)2]2C(O)OH (dPEG2)
6-아미노헥산산	NH2(CH2)2[O(CH2)2]3C(O)OH
7-아미노헵타노익산	NH2(CH2)2[O(CH2)2]4C(O)OH
8-아미노옥타노익산	NH2(CH2)2[O(CH2)2]5C(O)OH
9-아미노노나노익산	NH2(CH2)2[O(CH2)2]6C(O)OH
N ε , N ε , N ε -트리메틸-라이신	이 표에서 단백질성 아미노산의 임의의 D-아미노산 또는 비-단백질성 아미노산의 임의의 D-아미노산
시스테익산

본원에서, 용어 "분자 조성물"은 분자 2개 이상이 다중-쇄 단백질에서와 같이 비-공유적 상호작용 (예, 소수성, 이온성, 정전기성 등)에 의해 함께 묶인 분자 복합체를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명에 대한 다양한 측면은 하기를 포함하는 화합물 또는 분자 복합체에 관한 것이다:

­ 방사능 동위원소 또는 비-방사능 동위원소 금속과 선택적으로 킬레이트화 하도록 구성된 금속 킬레이터;

­ ¹⁹F/¹⁸F 교환에 의해 방사성 불소화하도록 구성된 트리플루오로보레이트 (BF₃)-함유 모이어티, 또는 ¹⁸F-표지된 트리플루오로보레이트로 변환할 수 있는 보로네이트 전구체; 및 선택적으로,

­ 세포-표적화 도메인.

이러한 화합물/복합체는 영상 진단 또는 방사선치료에 적합하거나 또는 이들 2가지 용도 모두에 이용할 수 있다는 점에서 이중 방식을 취한다. 예를 들어, 화합물/복합체는, ¹⁸F-표지되는 ("핫-F") 경우 영상화제/진단제로서 사용할 수 있거나, 또는 치료학적 방사능 금속 동위원소 ("핫-M")와 킬레트를 형성한 경우에는 치료학적 물질로서 사용할 수 있다. 이는 영상화 및 치료에 동일한 화합물을 사용하는 이점을 제공하며; 즉, (핫-F를 이용한 영상화를 위해 최적화된) ¹⁸F-표지된 동반 진단제는 (핫-M을 이용한 치료를 위해 최적화된) 방사선 치료제와 화학적으로 동일하게 제공된다.

일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 비-방사능 금속 동위원소 ("콜드-M")와 킬레이트를 형성하거나 또는 킬레이트를 형성하지 않는다. 본원에서, 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하지 않은 경우와 킬레이트를 형성한 경우 둘다, "콜드-M"으로 간주된다. 이러한 구현예의 BF₃-함유 모이어티가 ¹⁸F-표지된다면, 핫-F/콜드-M 화합물/복합체는, 방사능 금속 동위원소로부터 임의의 부정적인 효과의 유발 없이, 영상화제 또는 진단제로서 사용가능하다.

영상 진단에서 개체가 치료학적 치료의 후보 대상인 것으로 드러나면, 동일한 화합물/복합체를 (콜드-F/핫-M 또는 핫-F/핫-M으로서) 투여할 수 있다. 이와 같이, 핫-F/콜드-M 화합물/복합체는 핫-M 치료학적 물질에 대한 동반 진단제로서 사용가능하다. 다른 경우에, 킬레이트를 형성하지 않은 화합물/복합체도 동일하게 충분히 사용할 수 있을 것으로 생각되며, 다른 구현예에서 서로게이트 금속 양이온을 핫 금속 양이온 대신 사용할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 비-방사능 Zn^{2 +}와 킬레이트를 형성한 핫-F 화합물은, 방사능 Zn²⁺가 치료학적으로 또는 진단학적으로 통상적으로 이용되지 않음에도 불구하고, 이용할 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 방사능 동위원소와 킬레이트를 형성하고 BF₃-함유 모이어티는 ¹⁹F-표지되고, 다른 구현예에서, 금속 킬레이터는 방사능 동위원소와 킬레이트를 형성하고 BF₃-함유 모이어티는 또한 ¹⁸F-표지된다.

용어 "BF3" 및 "BF₃" (즉, 아랫첨자 "3")는 동일한 의미를 가지며, 본 출원에서 상호 호환적으로 사용된다.

용어 "세포-표적화 도메인" ("세포 항원 표적화 모듈"이라고도 함)은 광의적인 의미를 가지며, 세포 마커에 특이적으로 결합하는 임의의 화합물 또는 복합체, 예를 들어, 비-제한적으로 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드 모방체, 핵산, 스테로이드, 앱타머, 아피바디, 미니바디, 비타민, 소형 분자, 마크로사이클 등을 포함한다. 용어 "세포 마커"는, 비-제한적으로, 분화 클러스터 (CD) 분자와 같은 세포 표면 항원을 포함한다. 달리 언급되지 않은 한, 본원에서, 용어 "항원"은 세포-표적화 도메인이 세포 마커 (또는 항원)에 결합함으로써 생기는 면역 반응이 반드시 필요한 것은 아닌 것으로서 이해될 것이며; 다양한 구현예들은 생리학적 조건 (예, 생체내)에서 세포 마커에 대한 특이적인 결합만 필수 조건이다. 일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 인간 세포 마커 또는 인간 CD 분자를 표적으로 한다. 상기에 열거된 범주들 각각의 다양한 세포-표적화 도메인들이 제조되고 있으며, 그 다수가 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 항체는 매우 다양한 인간 CD 분자들에 대해 생산되고 있다.

본원에서, 표현 "특이적으로 결합한다"는, 단백질 및/또는 다른 거대분자들로 된 이종의 집단과의 백그라운드 결합과는 대조적으로, 선호적인 결합 (예, 비-공유 복합체 형성)을 의미한다. 즉, 지정된 조건 (예, 면역분석 조건)에서, 샘플 (시험관내) 또는 유기체 (생체내)에 존재하는 다른 거대분자와 결합하는 백그라운드 수준와 비교해 적어도 2배 이상의 수준으로 결합한다면, 세포-표적화 도메인은 세포 마커에 "특이적으로 결합"하는 것이다. 다양한 면역분석 형태 또는 기타 결합 분석을 이용해, 특정 표적 마커에 특이적으로 결합하는 세포-표적화 도메인을 선별할 수 있다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역분석을 통례적으로 이용해, 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 선별한다. 일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 백그라운드 신호와 비교해 적어도 2배 이상, 일부 경우에는 백그라운드에 대해 적어도 10배 내지 100배 이상 높은 결합 신호를 발생시킬 것이다. 달리 명시되지 않은 한, 세포-표적화 도메인이 표적 마커에 결합하는 경우, 평형 해리 상수 (K_D)는 일반적으로 약 10^-4 M 내지 10^-15 M일 것이다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-4 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-5 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-6 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-7 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-8 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-9 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-10 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-11 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-12 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-13 M 미만으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 결합은 약 10^-14 M 미만으로 이루어진다. 평형 해리 상수는 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법으로 측정할 수 있다.

일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 펩타이드 및 폴리펩타이드는 표준 방법으로 합성할 수 있으며, 이에 대한 비-제한적인 예들은 아래에서 더욱 상세히 기술된다. 단백질은 표준 분자 생물학 방법을 사용해 제조할 수 있다.

표적 세포 마커에 특이적으로 결합하는 다양한 펩타이드, 폴리펩타이드 및 펩타이드 모방체들이 공지되어 있다. 비-제한적인 예로는 LLP2A, PSMA-617, TATE, 봄베신 또는 유도체 (예, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂ 등), RGD, 콜레사이토키닌 등이 있다. LLP2A는 세포횡단 최-후기 항원 4 (VLA-4)를 표적으로 한다. PSMA-617은 전립선-특이적인 막 항원 (PSMA)을 표적으로 한다. TATE는 소마스타틴 수용체를 표적으로 한다. 봄베신 및 유도체는 가스트린-방출성 펩타이드 수용체 (GRPR)를 표적으로 한다. 브라디키닌 (BK) 및 유도체는 브라디키닌-1-수용체를 표적으로 한다. 수용체에 대한 임의의 다른 펩타이드 리간드들도 이용할 수 있다.

일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 펩타이드 모방체이다. 펩타이드 모방체는 펩타이드/폴리펩타이드 기를 비-펩타이드 기로 치환함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 생체내 펩타이드 반감기를 연장하기 위해, 펩타이드 결합 아미드 (-C(O)-NH-)를 슈도펩타이드 결합 (-CH₂-NH-), 탄소-탄소 결합 (-CH₂-CH₂-) 또는 우레아 결합 (-NH-C(O)-NH-)에 의해 치환할 수 있다.

세포 마커를 특이적으로 표적화할 수 있는 폴리펩타이드/단백질 도메인의 다양한 유형들이 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은, 세포 마커에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 항체 가변성 도메인을 포함하는 항체 유도체/단편이거나 또는 이들을 포함한다. 항체 및 항체 유도체의 경우, 세포 마커는 항체 가변성 도메인에 의해 특이적으로 결합하는 에피토프를 포함하는 항원으로 간주될 것이다. 일반적으로, "에피토프"는 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물, 다당류, 지질, 유기 화합물 등 뿐만 아니라 항체 가변성 도메인과 접촉을 형성하는 이의 복합체일 수 있다. 에피토프는 연속적이거나 또는 불연속적일 수 있다. 항체 가변성 도메인과 접촉하는 에피토프의 면적은 전형적으로 약 4 내지 10 nm²이다. 항체 또는 항체 유도체/단편을 화합물/복합체의 나머지 부분에 링커를 이용해 또는 링커 없이 부착하는 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 화합물은 (항체-약물 접합체에서 잘 입증된 바와 같이) N-말단, C-말단, 시스테인 잔기, 라이신 잔기 또는 도처에서 화학적 또는 효소적 접합에 의해 항체에 부착한다.

항체의 중쇄는 가변성 도메인 (V_H)과 복수의 불변 도메인 (예, IgG1의 경우: C_H ¹, C_H ² 및 C_H ³)으로 구성된다. 항체의 경쇄는 가변성 도메인 (V_L)과 불변 도메인 (C_L)으로 구성된다. 각각의 V_L 및 V_H는 각각 상보성 결정부 (CDR) 3개와 프래임워크 영역을 포함한다. CDR 6개는 모두 에피토프 결합에 기여할 수 있지만, 이들의 상대적인 기여는 다양하며, 일부 경우에 CDR 6개 모두가 결합에 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 중쇄의 CDR 3개는 에피토프 결합에 대해 비-균등하게 기여하는 경향을 보인다. 또한, 단일 도메인 항체, 나노바디 등은 CDR 3개만 가지고 있는 것으로 알려져 있다 (예, 단봉 낙타, 낙타, 라마, 알파카, 상어 또는 유사 동물의 중쇄 가변성 도메인으로부터 수득 또는 유래되거나, 또는 비-제한적으로, 인간 및 뮤라인 항체 등의 통상적인 항체의 중쇄로부터 조작된, 단일 도메인 항체). 달리 명시되지 않은 한, 본원에서, 표현 "항체 가변성 도메인"은 V_H, V_H 및 V_L 둘다, 단일 도메인 항체, 나노바디 또는 항원의 에피토프 부분에 특이적으로 결합하기 위해 필요한 CDR(들) (예, CDR 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)이 적절하게 위치된 임의의 항체-유래 단백질을 포함하는 임의의 단백질을 지칭한다. 면역화된 동물, 전체 항체의 변형, 재조합 DNA 방법을 이용한 신규 합성 또는 고상 펩타이드/폴리펩타이드 합성으로부터 분리, 또는 디스플레이 라이브러리로부터 선별 등을 (비-제한적으로) 비롯해, 표적 에피토프에 결합하는 항체 가변성 도메인을 포함하는 단백질을 제조하는 방법들이 공지되어 있다.

일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 항체를 포함한다. 항체는 임의의 종의 항체이거나, 키메라 항체이거나 또는 인공 항체이거나 또는 유전자 조작된 것일 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 항체는 비-인간 (예, 낙타, 단봉 낙타, 알파카, 라마 등과 같은 낙타과; 상어 등과 같은 연골 어류; 마우스 랫, 원숭이 등) 항체, 영장류화된 항체, 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체일 수 있다. 키메라 항체는 복수의 종들로부터, 예를 들어 인간과 비-인간으로부터, 또는 비-인간 종 2종으로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 비-인간 항체를 인간화 또는 영장류화하는 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 비-인간 (또는 비-영장류) 불변 도메인을 인간 항체의 것으로 치환하거나 (키메라 항체 구축), 또는 인간 (또는 영장류) 항체의 하나 이상 (예, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR을 비-인간 항체로 치환함으로써, 이루어진다. 항체는 중쇄 2개와 경쇄 2개로 구성될 수 있다. 항체는 링커에 의해 이격된 중쇄와 경쇄를 가진 단쇄 항체일 수 있다. 항체는 중쇄 단독 항체 (예, 경쇄가 결핍된 낙타, 단봉 낙타, 알파카, 라마 또는 상어 항체, 또는 인간 중쇄)일 수 있다. 항체는 단일-도메인 항체 (sdAb)일 수 있다.

일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 항체 유도체를 포함한다. 본원에서, 용어 "항체 유도체"는 항원-결합 기능을 보유한 항체 단편뿐 아니라 인공 항체를 포함한다. 항체 유도체는 항체 가변성 도메인을 포함한다. 항원 결합 단편은 V_L 및 V_H 둘다를 포함하거나, 또는 V_L 없이 V_H만 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 유도체는 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv (즉, 단쇄 Fv), scFv-Fc, sdAb, 미니바디, 나노바디, 다이아바디 또는 트리(아)바디를 포함한다.

일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유도체는 IgA, IgM, IgG, IgE, IgD, sdAb, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, scFv-Fc, 미니다비, 나노바디, 다이아바디 또는 트리(아)바디이다. 일부 구현예에서, 항체는 IgG 항체이다.

많은 항체들이 낮은 μM 내지 nM 범위의 K_D 값을 가지며, 고 친화성 항체는 낮은 nM 수준의 K_D 값을 가지고, 고 친화성 항체는 pM 수준의 K_D 값을 가진다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유도체는 K_D 500 nM 미만, 400 nM 미만, 300 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만 또는 1 nM 미만으로 세포 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 유도체는 결합성 기질에 pM K_D (10^-10 M 내지 10^-12 M)로 결합할 수 있다. 이러한 결합 친화성은, 원하는 표적에 대한 특이성 및 고-친화성을 선별함으로써 라이브러리를 스크리닝하기 위해, mRNA 디스플레이, 파지 디스플레이, 리소좀 디스플레이 및 효모 디스플레이 등의 공지된 디스플레이 기술을 이용하여, 일부 경우에는 친화성 성숙화 방법을 이용해, 수득가능하다.

일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은 세포 마커에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머이다. 앱타머는 매우 다양한 세포 표적에 결합할 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 (DNA 또는 RNA)이다. 앱타머는 높은 친화성으로, 예를 들어 nM 수준의 K_D로, 원하는 표적에 결합하도록, 랜덤 라이브러리로부터 선별 및 서열 최적화와 같은 다양한 방법을 이용해 제조할 수 있다. 앱타머는 표준적인 올리고뉴클레오티드 합성 방법/장치에 의해 합성할 수 있으며, 화학적 접합을 이용해, 링커를 사용하거나 또는 링커를 사용하지 않고 화합물/복합체의 나머지 부분에 부착시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 세포-표적화 도메인은, 주입하기 전 또는 주입한 후, 킬레이터-BF₃와 반응하는 반응성 기에 먼저 접합시켜, 사전-표적화 상황에 이용할 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 항체 또는 앱타머에 사이클로옥텐을 접합한다. 이를 주입할 수 있으며, 이것이 표적에 결합되게 한 다음, N₂-압출성 사이클로 부가 반응 (N₂-extruding cycloaddition reaction)을 통해 생체내에서 사이클로옥텐 접합체와 반응하도록 테트라진에 연결된 킬레이터-BF₃를 동일한 동물 또는 환자에게 주입한다. 다른 경우에, N₂-압출성 사이클로 부가 반응을, 주입 전에, 수행한다.

금속 킬레이터는 방사성 금속을 결합시키는데 적합한 임의의 킬레이터일 수 있다. 적합한 다수의 방사성 금속 킬레이터들이, 예를 들어 Price and Orvig, Chem. Soc . Rev., 2014, 43, 260-290에 요약 기술된 바와 같이, 공지되어 있으며, 매우 다양한 금속 킬레이터들이 상업적으로 구입가능하거나 (예, Macrocyclics^TM) 또는 문헌에 기술되어 있으며, 매우 많아 본원에 모두 열거하긴 어렵다.

일부 구현예에서, 비-제한적으로, 금속 킬레이터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: DOTA 및 유도체; DOTAGA; NOTA; NODAGA; NODASA; CB-DO2A; 3p-C-DEPA; TCMC; DO3A; DTPA, 및 선택적으로 CHX-A"-DTPA 및 1B4M-DTPA로부터 선택되는 DTPA 유사체; TETA; NOPO; Me-3,2-HOPO; CB-TE1A1P; CB-TE2P; MM-TE2A; DM-TE2A; 사르코파긴, 및 선택적으로 SarAr, SarAr-NCS, diamSar, AmBaSar 및 BaBaSar로부터 선택되는 사르코파긴 유도체; TRAP; AAZTA; DATA 및 DATA 유도체; H2-macropa 또는 이의 유도체; H2dedpa, H4octapa, H4py4pa, H4Pypa, H2azapa, H5decapa 및 기타 피콜린산 유도체; CP256; PCTA; DOTP; HEHA; C-NETA; C-NE3TA; HBED; SHBED; BCPA; CP256; YM103; cyclam; DiamSar; 데스페리옥사민 (DFO) 및 DFO 유도체; H6phospa; 트리티올 킬레이트; 머캅토아세틸; 하이드라지노니코틴아미드; 다이머캅토숙신산; 1,2-에틸렌다이일비스-L-시스테인 다이에틸 에스테르; 메틸렌다이포스포네이트; 헥사메틸프로필렌아민옥심; 및 헥사키스(메톡시 이소부틸 이소니트릴); 포르피린, 클로린, 텍사프린, 프탈로시아닌. 일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 DOTA 또는 DOTA 유도체이다. 특히, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본원에 열거된 킬레이터들 중 임의의 것을 당해 기술 분야에 공지된 다른 킬레이터로 치환할 수 있을 것이다.

금속 킬레이터 및 이들 킬레이터와 킬레이트를 형성할 수 있는 방사성 금속에 대한 예시적인 비-제한적인 예들을 표 2에 나타낸다. 대안적인 구현예에서, 금속 킬레이터는 표 2에서 선택되는 금속 킬레이터이거나 또는 이들을 포함한다.

표 2: 예시적인 금속 킬레이터 및 이 킬레이터에 결합하는 방사핵종의 예

킬레이터	방사핵종
DOTA, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산	Cu-64/67 Ga-67/68 In-111 Lu-177 Y-86/90 Bi-203/212/213 Pb-212 Ac-225 Gd-159 Yb-175 Ho-166 As-211 Sc-44/47 Pm-149 Pr-142 Sn-117m Sm-153 Tb-149/152/155/161 Er-165 Ra-223/224 Th-227
CB-DO2A, 4,10-비스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자바이사이클로[5.5.2]테트라데칸	Cu-64/67
TCMC, 1,4,7,10-테트라키스(카바모일메틸)-l,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸	Pb-212
3p-C-DEPA	Bi-212/213
p-NH2-Bn-Oxo-DO3A	Cu-64/67
TETA, 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산	Cu-64/67
CB-TE2A, 4,11-비스-(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2]-헥사데칸	Cu-64/67
Diamsar	Cu-64/67
NOTA, 1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산	Cu-64/67 Ga-68 In-111 Sc-44/47
NETA, {4-[2-(비스-카르복시메틸아미노)-에틸]-7-카르복시메틸-[1,4,7]트리아조난-1-일}-아세트산	Cu-64/67 Ga-68 Lu-177 Y-86/90 Bi-213 Pb-212
HxTSE	Au-198/199
P2N2Ph2	Rh-105
DTPA, 다이에틸렌트리아민펜타아세트산	In-111 Sc-44/47 Lu-177 Y-86/90 Sn-117m Pd-109
CHX-A00-DTPA, 2-(p-이소티오시아나토벤질)-사이클로헥실다이에틸렌트리아민펜타아세트산	In-111 Lu-177 Y-86/90 Bi-212/213
H2dedpa, 1,2-[[6-(카르복시)-피리딘-2-일]-메틸아미노]에탄	Cu-64/67
H2azapa, N,N0-[1-벤질-1,2,3-트리아졸-4-일]메틸-N,N0-[6-(카르복시)피리딘-2-일]-1,2-다이아미노에탄	Cu-64/67
	In-111 Lu-177 Y-86/90 Ac-225
	Ac-225
	In-111 Ac-225
	In-111 Lu-177 Ac-225
	In-111 Lu-177 Ac-225
SHBED, N,N0-비스(2-하이드록시-5-설포벤질)-에틸렌다이아민-N,N0-다이아세트산	In-111 Ga-68
	In-111
PCTA, 3,6,9,15-테트라아자바이사이클로[9.3.1]-펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9,-트리아세트산	Cu-64/67
H2-MACROPA (N,N'-비스[(6-카르복시-2-피리딜)메틸]-4,13-다이아자-18-crown-6)	Ac-225

일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 킬레이트를 형성하지 않는다 (즉, 금속이 결합되지 않음).

일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 금속, 즉 방사능 금속 동위원소 (방사성 금속) 또는 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하거나/복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, 킬레이트를 형성하는 금속은 비-방사능이다. 일부 구현예에서, 킬레이트를 형성하는 금속은 방사성 금속이다. 일부 구현예에서, 방사성 금속은 치료학적 방사성 금속이며, 이는 방사독성 (또한 본원에서 "방사선독소"라고도 함)임을 의미한다. 일부 구현예에서, 방사성 금속은 치료학적 α 방출체이다. 일부 구현예에서, 방사성 금속은 β 방출체이다. 일부 구현예에서, 방사성 금속은 오제 방출체 (auger emitter)이다. 일부 구현예에서, 치료학적 방사성 금속은 ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ^117mSn, ¹⁶⁵Er, ⁹⁰Y, ²²⁷Th, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ²¹¹As, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ¹⁷⁵Yb, ¹⁴²Pr 또는 ^114mIn이다.

일부 구현예에서, 방사성 금속은 ⁶⁸Ga, ⁶¹Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ⁴⁴Sc, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Nb, ¹⁷⁷Lu, ^117mSn, ¹⁶⁵Er, ⁹⁰Y, ²²⁷Th, ²²⁵Ac, ²¹³Bi, ²¹²Bi, ⁷²As, ⁷⁷As, ²¹¹At, ²⁰³Pb, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁶⁶Ho, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁴⁹Pm, ¹⁵⁹Gd, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ¹⁷⁵Yb, ¹⁴²Pr, ^114mIn, ^94mTc, ^99mTc, ¹⁴⁹Tb, ¹⁵²Tb, ¹⁵⁵Tb 또는 ¹⁶¹Tb이다. 다른 구현예들에서, 방사성 금속, 방사성 핵종-결합된 금속, 또는 방사성 핵종-결합된 금속-함유 모이어티 또는 보결기 (prosthetic group)는 ⁶⁸Ga, ⁶¹Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ⁴⁴Sc, ⁸⁶Y, ¹⁷⁷Lu, ⁹⁰Y, ²²⁵Ac, ²¹³Bi 또는 ²¹²Bi이다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 표 2의 킬레이터이고, 킬레이트를 형성하는 방사성 금속/방사성 핵종은 킬레이터의 결합제로서 표 2에 언급된 방사핵종이다.

일부 구현예에서, 킬레이터는, ¹⁷⁷Lu, ¹¹¹In, ²¹³Bi, ⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga, ²⁰³Pb, ²¹²Pb, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ⁹⁰Y, ⁸⁶Y, ²²⁵Ac, ^117mSn, ¹⁵³Sm, ¹⁴⁹Tb, ¹⁵²Tb, ¹⁵⁵Tb, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁵Er, ²¹³Bi, ²²⁴Ra, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²⁷Th, ²²³Ra, ⁴⁷Sc, ⁶⁴Cu 또는 ⁶⁷Cu와 킬레이트를 형성하는, DOTA 또는 이의 유도체; ²²⁵Ac와 접합되는 H2-MACROPA; ²²⁷Th와 킬레이트를 형성하는 Me-3,2-HOPO; ²²⁵Ac, ²²⁷Th 또는 ¹⁷⁷Lu과 킬레이트를 형성하는 H₄py4pa; ¹⁷⁷Lu과 킬레이트를 형성하는 H₄pypa; ⁶⁸Ga과 킬레이트를 형성하는 NODAGA; ¹¹¹In과 킬레이트를 형성하는 DTPA; 또는 ⁸⁹Zr과 킬레이트를 형성하는 DFO이다.

일부 구현예에서, 킬레이터는 TETA (1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산), SarAr (1-N-(4-아미노벤질)-3,6,10,13,16,19-헥사아자바이사이클로[6.6.6]-에이코산-1,8-다이아민), NOTA (1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리아세트산), TRAP (1,4,7-트리아자사이클로노난-1,4,7-트리스[메틸(2-카르복시에틸)포스핀산), HBED (N,N0-비스(2-하이드록시벤질)-에틸렌다이아민-N,N0-다이아세트산), 2,3-HOPO (3-하이드록시피리딘-2-온), PCTA (3,6,9,15-테트라아자바이사이클로[9.3.1]-펜타데카-1(15),11,13-트리엔-3,6,9,-트리아세트산), DFO (데스페리옥사민), DTPA (다이에틸렌트리아민펜타아세트산), OCTAPA (N,N0-비스(6-카르복시-2-피리딜메틸)-에틸렌다이아민-N,N0-다이아세트산) 또는 기타 피콜린산 유도체이다.

일부 구현예에서, 킬레이터는, 머캅토아세틸, 하이드라지노니코틴아미드, 다이머캅토숙신산, 1,2-에틸렌다이일비스-L-시스테인 다이에틸 에스테르, 메틸렌다이포스포네이트, 헥사메틸프로필렌아민옥심 및 헥사키스(메톡시 이소부틸 이소니트릴) 등과 같이, ^99mTc, ^94mTc, ¹⁸⁶Re 또는 ¹⁸⁸Re로 방사성 표지하기 위한 킬레이터이다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 머캅토아세틸, 하이드라지노니코틴아미드, 다이머캅토숙신산, 1,2-에틸렌다이일비스-L-시스테인 다이에틸 에스테르, 메틸렌다이포스포네이트, 헥사메틸프로필렌아민옥심 또는 헥사키스(메톡시 이소부틸 이소니트릴)이다. 이들 구현예들 중 일부에서, 킬레이터에 방사성 금속이 결합한다. 일부 이러한 구현예에서, 방사성 금속은 ^99mTc, ^94mTc, ¹⁸⁶Re 또는 ¹⁸⁸Re이다.

일부 구현예에서, 킬레이터는 트리티올 킬레이트 등과 같이 ⁷²As 또는 ⁷⁷As에 결합할 수 있는 킬레이터이다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 트리티올 킬레이트이다. 일부 구현예에서, 킬레이터에 ⁷²As이 접합된다. 일부 구현예에서, 킬레이터에 ⁷⁷As이 접합된다.

상기한 금속 킬레이터에 킬레이트를 형성하는데 적합한 비-방사능 금속들은, 금속 킬레이트화 분야에서 익숙한 물질이 전형적으로 이용되는 바와 같이, 전이 금속, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소에서 통상적으로 공지된 안정적인 또는 준-안정적인 동위원소를 비롯하여 잘 알려져 있으며, 예를 들어 ⁸⁹Y, ¹⁷⁴Lu, ²⁰⁸Pb 등이 있다.

BF₃-함유 모이어티 ("BF₃-함유 보결기"이라고도 함)는 ¹⁸F/¹⁹F 교환을 방사성 표지할 수 있는 임의의 기일 수 있다.

일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티는

이며, 여기서 각각의 R^a 및 R^b는 독립적으로 C₁-C₅의 선형 또는 분지형 알킬 기이다. 일부 구현예에서, R^a는 메틸이다. 일부 구현예에서, R^a는 에틸이다. 일부 구현예에서, R^a는 프로필이다. 일부 구현예에서, R^a는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R^a는 n-부틸이다. 일부 구현예에서, R^b는 메틸이다. 일부 구현예에서, R^b는 에틸이다. 일부 구현예에서, R^b는 프로필이다. 일부 구현예에서, R^b는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R^b는 n-부틸이다. 일부 구현예에서, R^a 및 R^b는 동일하다. 일부 구현예에서, R^a 및 R^b는 서로 다른 것이다.

일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티는 (아래) 표 3에 나타낸 기이며, 여기서 각각의 R은 (존재하는 경우에), 예를 들어 -OR, -SR, -NR-, -NHR 또는 NR₂ 기로 치환된 피리딘에서, 독립적으로 C₁-C₅ 선형 또는 분지형 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 프로필이다. 일부 구현예에서, R은 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R은 n-부틸이다. 일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티는

이다.

표 3: BF₃-함유 기에 대한 비-제한적인 예들.

일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티는 (아래) 표 4에 나타낸 기이며, 여기서 각각의 R은 (존재하는 경우에), 예를 들어 -OR, -SR, -NR-, -NHR 또는 NR₂ 기로 치환된 피리딘에서, 독립적으로 C₁-C₅ 선형 또는 분지형 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 메틸이다. 일부 구현예에서, R은 에틸이다. 일부 구현예에서, R은 프로필이다. 일부 구현예에서, R은 이소프로필이다.

표 4: BF₃-함유 기에 대한 추가적인 비-제한적인 예들.

일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티는 ¹⁸F를 포함한다. 일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티에서 불소 하나는 ¹⁸F이다. 일부 구현예에서, 불소 3개 모두 ¹⁸F이다. 일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티에서 불소 3개 모두 ¹⁹F이다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 복합체는, 각각 동일하거나 상이할 수 있는, 또는 이의 조합일 수 있는, 여러 개의 BF₃-함유 모이어티를 포함한다. 일부 구현예들은, 각각 독립적으로 상기에 열거된 것들로부터 선택되는, BF₃-함유 모이어티 2종을 포함한다. 일부 구현예들은, 각각 독립적으로 상기에 열거된 것들로부터 선택되는, BF₃-함유 모이어티 3종을 포함한다. 일부 구현예들은, 각각 독립적으로 상기에 열거된 것들로부터 선택되는, BF₃-함유 모이어티 4종을 포함한다. 일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티는 금속 킬레이터와 세포-표적화 도메인 사이에 위치한 링커에 부착된다.

동위원소 교환을 통해 ¹⁸F-표지하는 것이 바람직한 표지 방법일 수 있지만, 다른 sp2/sp3 혼성화 보로네이트 종들의 변환도 일부 경우에는 선호될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 보로네이트에 대한 예로는 피나콜레이트, 다이-, 트리-, 테트라-아릴레이트화 피나콜레이트, 네오펜틸다이올레이트, 카테콜레이트, 다이올레이트, 일반적으로, MIDA-보로네이트, 안트라닐아미드를 기본으로 하는 복합체, 더욱 가능하게는 보로하이드라이드를 포함한다. 이러한 보로네이트 복합체들은 유기붕소 화학 분야에서 숙련된 자들에게 공지되어 있거나 또는 쉽게 알려져 있으며, 이러한 복합체는 대응되는 트리플루오로보레이트로 쉽게 변환가능할 경우 선택적으로 주목되는 대상이다. 이에, 일부 구현예에서, 화합물/복합체는 BF₃-함유 모이어티 대신 ¹⁸F-표지된 트리플루오로보레이트로 변환가능한 보로네이트 전구체를 포함한다.

화합물 또는 분자 복합체는 링커를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 금속 킬레이터는 BF₃-함유 모이어티를 함유한 링커를 통해 세포-표적화 도메인과 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 BF₃-함유 모이어티를 2 (또는 그 이상)개 포함한다. 그러나, 화합물/복합체의 구성성분들은 임의의 배위를 취할 수도 있다. 예를 들어, BF₃-함유 모이어티 (또는 모이어티)는 금속 킬레이터 및/또는 세포-표적화 도메인에 직접 부착될 수 있다. 링커에 대한 비-제한적인 예는 펩타이드 링커이다.

링커는, 예를 들어, 비-제한적으로, 아미노산 링커, 펩타이드 링커, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커, 알킬렌 링커 (예, C₁-C₃₀), 에테르, 에스테르, 티오에테르, 다이설파이드, 티오에스테르, 아미드, 카바메이트, 우레이도, 포스포다이에스테르를 비롯한 임의의 링커일 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 -N(H)-(CH₂)n-C(O)-이거나 또는 이를 포함할 수 있으며, 이때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 >15이다.

일부 구현예에서, 링커는 선형 또는 분지형 펩타이드 링커 (Xaa¹)_n이고, 여기서 n은 1 내지 8이고, 각각의 Xaa¹은 서로 동일하거나 또는 상이하거나, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 선형 펩타이드 링커이다. 일부 구현예에서, 펩타이드 링커는 분지형 펩타이드 링커이다. 일부 구현예에서, n은 1이다. 일부 구현예에서, n은 2이다. 일부 구현예에서, n은 3이다. 일부 구현예에서, n은 4이다. 일부 구현예에서, n은 5이다. 일부 구현예에서, n은 6이다. 일부 구현예에서, n은 7이다. 일부 구현예에서, n은 8이다. 일부 구현예에서, 각각의 Xaa¹은 독립적으로 표 1에 열거된 단백질성 아미노산 및 비-단백질성 아미노산으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 링커에서 각각의 펩타이드 백본 아미노 기는 선택적으로 메틸화된다.

일부 구현예에서, 링커는 Lys(AMBF₃)를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 (비-제한적으로) PEG 링커 또는 펩타이드 링커 (Xaa¹)_1-8을 포함하는 구현예에서, 링커는 -N(H)-C(R¹R²R³)(H)-C(O)-로서 정의되는 아미노산 잔기 Xaa²를 포함하며, 여기서 R¹은 C₁-C₅ 알킬레닐 기이고, R²는

또는

이고, R³는

또는 표 1 또는 표 2에 나타낸 기이되, 각각의 R은 독립적으로 C₁-C₅의 선형 또는 분지형 알킬 기이다. 일부 구현예에서, R¹은 -CH₂-이다. 일부 구현예에서, R¹은 -(CH₂)₂-이다. 일부 구현예에서, R¹은 -(CH₂)₃-이다. 일부 구현예에서, R¹은 -(CH₂)₄-이다. 일부 구현예에서, R¹은 -(CH₂)₅-이다. 일부 구현예에서, R²는

이다. 일부 구현예에서, R²는

이다. 일부 구현예에서, R³는

이고, 여기서 각각의 R^a 및 R^b는 독립적으로 C₁-C₅의 선형 또는 분지형 알킬 기이다. 일부 구현예에서, R^a는 메틸이다. 일부 구현예에서, R^a는 에틸이다. 일부 구현예에서, R^a는 프로필이다. 일부 구현예에서, R^a는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R^a는 n-부틸이다. 일부 구현예에서, R^b는 메틸이다. 일부 구현예에서, R^b는 에틸이다. 일부 구현예에서, R^b는 프로필이다. 일부 구현예에서, R^b는 이소프로필이다. 일부 구현예에서, R^b는 n-부틸이다. 일부 구현예에서, R^a 및 R^b는 서로 동일하다. 일부 구현예에서, R^a 및 R^b는 서로 다른 것이다. 일부 구현예에서, R³는

이다. 일부 구현예에서, R³는

이다. 일부 구현예에서, 링커는 각각 독립적으로 상기에서와 같이 정의되는 (즉, 동일하거나 또는 상이한) Xaa² 잔기 2개를 포함한다.

일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 (아미노 기와 카르복시산 기 사이에) 아미드 결합 또는 (아지드와 알킨 사이에) 1,2,3-트리아졸을 형성함으로써, 또는 말레이미드 또는 티올 기 간의 반응에 의해, 링커 또는 세포-표적화 도메인에 부착된다.

일부 구현예에서, 킬레이터는 펩타이드/폴리펩타이드/단백질 세포-표적화 도메인의 N-말단에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착되고, BF₃-함유 모이어티 (또는 전구체)는 세포-표적화 도메인의 C-말단에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착된다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 펩타이드/폴리펩타이드/단백질 세포-표적화 도메인의 C-말단에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착되고, BF₃-함유 모이어티 (또는 전구체)는 세포-표적화 도메인의 N-말단에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착된다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 펩타이드/폴리펩타이드/단백질 세포-표적화 도메인의 N-말단에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착되고, BF₃-함유 모이어티 (또는 전구체)는 세포-표적화 도메인의 측쇄에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착된다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 펩타이드/폴리펩타이드/단백질 세포-표적화 도메인의 C-말단에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착되고, BF₃-함유 모이어티 (또는 전구체)는 세포-표적화 도메인의 측쇄에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착된다. 일부 구현예에서, 킬레이터 및 BF₃-함유 모이어티 둘다 펩타이드/폴리펩타이드/단백질 세포-표적화 도메인의 개별 쇄에 (링커를 이용해 또는 링커 없이) 부착된다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 펩타이드/폴리펩타이드/단백질 세포-표적화 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 링커를 통해 부착되고, BF₃-함유 모이어티 (또는 전구체)는 링커에 부착된다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 펩타이드/폴리펩타이드/단백질 세포-표적화 도메인의 측쇄에 링커를 통해 부착되고, BF₃-함유 모이어티 (또는 전구체)는 이 링커에 부착된다. 목적을 예시하기 위해, 도 1은 화합물 또는 복합체에 대한 다양한 비-제한적인 배치 구조들을 보여준다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 식 I을 가지거나, 또는 식 I의 염 또는 용매화물이다:

[킬레이터]-[링커]-[세포-표적화 도메인] (I),

상기에서, 킬레이터는 상기에 기술된 임의의 킬레이터이고; 세포-표적화 도메인은 상기에 기술된 임의의 세포-표적화 도메인이고; 링커는 상기에 기술된 것들로부터 독립적으로 선택되는 임의의 BF₃-함유 모이어티들 중 어느 하나 또는 여러 개를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 상기에서 정의되는 임의의 펩타이드 링커이다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A이거나 또는 이를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 PSMA-617-LysAMBF3-DOTA이거나 또는 이를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 DOTA-Lys(AMBF3)-TATE이거나 또는 이를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 DOTA-Lys-AMBF3-Pip-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂이거나 또는 이를 포함한다.

일부 구현예에서, 조성물은 [킬레이터]-[링커]-BF₃를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물 또는 분자 복합체는 (비-제한적으로) Cy3, Cy5, Cy7, 기타 근적외선 염료 또는 플루오레세인과 같은 형광단 또는 다른 광 방출 모이어티이다.

화합물 또는 분자 복합체에 대한 다양한 구현예들은, a) 세포성 항원 표적화 모듈; b) ¹⁸F에 의해 쉽게 표지되는 BF₃-함유 모이어티/보결기; 및 c) 치료학적 방사능 동위원소 또는 비-방사능 동위원소로 쉽게 제형화되는 방사선독소-함유 모이어티를 포함하는, 영상화 및 방사선치료에 적합한 이중-방식의 화합물 또는 분자 조성물에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 진단 영상화 방식/형식에서, BF₃ 모이어티는 하나 이상의 '핫' 방사능 불소 (즉, ¹⁸F)를 함유하는데 반해, 방사선독소-함유 모이어티는 비-방사능 ('콜드') 동위원소/금속 원자를 함유한다 (또는 대안적으로, 전혀 함유하지 않는다). 즉, 일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티/보결기는 ¹⁸F로 표지되고, 방사선독소-함유 모이어티는 치료학적 방사능 동위원소를 함유한다. 표적화된 방사선 치료 방식/형식에서, BF₃ 모이어티는 '콜드' 불소 (즉, ¹⁹F)를 함유할 수 있는 반면, 방사선독소-함유 모이어티는 방사능/방사독성 '핫' 동위원소/금속 원자 (적합하게는, 방사선 치료에 효과적인)를 포함할 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, BF₃-함유 모이어티/보결기는 ¹⁹F로 표지되고, 방사선독소-함유 모이어티는 비-방사능 동위원소를 함유하거나 또는 방사능 동위원소를 함유하지 않는다. 따라서, 이러한 화합물은, 질환 검출/진단이 진단 영상화 방식 (즉, ¹⁸F를 이용한)에 조성물을 사용함으로써 이루어지고; 질환 치료/요법이 동일한 조성물을 표적화된 방사선치료 방식 (즉, ¹⁸F 없이, 방사선치료 동위원소를 사용한)으로 이후에 사용함으로써 이루어지는, 유용한 테라노스틱 쌍을 포함한다. 전자는 후자에 대한 '동반 진단제'를 형성한다.

전술한 바와 같이, 다양한 구현예들에서, 본 발명의 이중-방식 (영상화/방사선치료) 화합물의 기능적인 도메인들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려진 다양한 크기/길이의 다양한 링커/개입 기에 의해 이격되어 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포성 항원 결합 모듈, 즉 BF₃-함유성 보결기 및 방사선독소-함유 모이어티는 테라노스틱 쌍 (동일한 화학적 조성물을 영상화 및 표적 방사선치료에 사용하기 위한 동반 진단제)의 바람직한 특성을 구현하도록 여러가지 복수의 배위들로 서로 배치될 수 있다. 도 1은 이중 방식의 PET 영상화제/방사선치료제의 몇가지 배위들을 비-제한적으로 보여준다.

일부 구현예에서, 세포성 항원-결합 모듈은, i) 펩타이드/폴리펩타이드, ii) 표적이 되는 세포성 항원에 결합할 수 있는 비-펩타이드/비-단백질 리간드, iii) 항체 또는 항체 단편, iv) scFv 도메인/단편, v) 핵산 앱타머, 또는 vi) 이중 특이성 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 이에, 트리플루오로보레이트 및 킬레이터 둘다를 이용한 변형은 비-펩타이드성의 소분자, 약물 또는 다양한 특성을 가진 기타 조성물 또는 더 큰 분자, 예를 들어 항체, 앱타머 등에 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적이 되는 세포성 항원은 세포횡단 최후기 항원 4 (VLA-4)로 알려진 인테그린이며, 화합물은 DOTA-AMBF₃-PEG2-LLP2A이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적이 되는 세포성 항원/단백질은 전립선-특이적인 막 항원 (PSMA)이며, 화합물은 PSMA-617-LysAMBF₃-DOTA이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적이 되는 세포성 항원은 소마스타틴 수용체 (즉 SSTR)이며, 화합물은 DOTA-Lys(AMBF₃)-TATE이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적이 되는 세포성 항원은 가스트린-분비성 펩타이드 수용체 (GRPR)이며, 화합물은 DOTA-Lys(AMBF₃)-RM2 (DOTA-Lys-AMBF₃-4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂)이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적이 되는 세포성 항원은 브라디키닌 수용체 (예, 브라디키닌-1-수용체; B1R)이며, 화합물은 DOTA-Lys(AMBF3)-BK이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, ¹⁸F로 쉽게 표지되는 BF₃-함유 모이어티/보결기는 특허 출원(들) WO/2005/077967, WO/2009/012596A1 및 WO/2014/134716에 기술된 바와 같으며, 이들 문헌은 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

일부 구현예에서, 비-제한적으로, 방사선독소-킬레이팅 모이어티는 금속 이온 킬레이터 (예, DOTA, NOTA, NODAGA, Octapa, Macropa 등) 등일 수 있다. 다른 구현예들에서, 킬레이터는 형광, MRI 용도 및 금속을 수반하는 기타 용도에서 금속과 킬레이트를 형성하기 위해 사용할 수 있으며, 이는 바이모달 또는 멀티모달로 간주될 수 있는 용도로 금속 또는 킬레이터를 이용하는 방식으로 방출성, 진단적 또는 치료학적일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-제한적으로, 치료학적 방사선독소/금속로는 ¹⁷⁷Lu 또는 ²¹⁰Bi 또는 ²¹²Pb 등이 있다. 본 발명의 치료학적 방식을 수행하는데 유용한, 그외 적합한 방사성 금속은 공지되어 있거나 또는 입수가능하다. 일부 구현예에서, 킬레이터는 금속없이 사용되거나, 또는 비-방사능 금속, 예를 들어 Zn²⁺, Ca^{2 +}, Ni^{2 +}, Gd^{3 +} 등과 킬레이트를 형성한다. 이러한 화합물은 영상화 (예, PET 영상화)에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 ¹⁸F 및 방사성 금속 (예, ²²⁵Ac)을 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 ²²⁵Ac의 안정적인 동위원소가 없다는 지식을 이용하여 ²²⁵Ac 표적 요법에 반응성인 환자를 식별하기 위해 영상화 (예, PET)에 이용할 수 있다. 요법에서는 방사독성 ²²⁵Ac를 유지하면서 ¹⁹F-동위원소를 이용할 것이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 트리플루오로보레이트가 하나 이상의 킬레이터를 함유한 추적자에 연결될 수 있다. 이에, 일부 구현예에서, 화합물/조성물은 2 이상의 트리플루오로보레이트 기를 포함한다. 또한, 방사성 금속이 요망되는 영상화 용도에 맞게 이중 표지된 방사성 추적자를 준비하도록 ¹⁸F-불화물을 제한적인 양으로 사용할 수도 있다.

본원에 제시된 화합물은, 당해 기술 분야에서 확립된 다양한 방법들 중 임의 방법에 의해 합성가능한 펩타이드를 병합한다. 이는 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 및/또는 t-부틸옥시카르보닐 (Boc) 화학 반응을 수반한 방법 및/또는 기타 합성 방식을 이용한 액상 및 고상 펩타이드 합성을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

고상 펩타이드 합성 방법 및 기법들은 당해 기술 분야에 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 펩타이드는 대상 아미노산 잔기들을 한번에 하나씩 순차적으로 병합하여 합성할 수 있다. 이러한 방법에서, 펩타이드 합성은 전형적으로 대상 펩타이드의 C-말단 아미노산을 적절한 수지에 부착시킴으로써 개시된다. 그 전에, 아미노산의 반응성 측쇄와 α 아미노 기를 적절한 보호기를 사용해 반응으로부터 보호하여, 고체 지지체 상에서 α 카르복실만 아민 기, 하이드록시 기 또는 알킬 할라이드 기와 같은 관능기와 반응하게 만든다. C-말단 아미노산을 지지체에 커플링한 후, 아미노산의 α 아미노 기 및/또는 측쇄의 보호기를 선택적으로 제거하여, 다음번 대상 아미노산이 커플링될 수 있게 한다. 이러한 과정은 원하는 펩타이드가 완전히 합성될 때까지 반복 실시하고, 완전히 합성되면 펩타이드를 지지체로부터 절단하여 정제할 수 있다. 고상 펩타이드 합성 장치에 대한 비-제한적인 예는 Aapptec Endeavor 90 펩타이드 합성기이다.

추가적인 아미노산의 커플링을 허용하기 위해, 고체 지지체 상에서 아미노산으로부터 Fmoc 보호기를, 예를 들어 DMF 중의 피페리딘 (20-50% v/v)과 같은 약 염기성 조건 하에 제거할 수 있다. 부가할 아미노산은 또한 커플링하기 위해 (예, α 카르복실레이트에서) 활성화되어야 할 수 있다. 활성화 시약에 대한 비-제한적인 예로는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HBTU), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 (TBTU), 2-(7-아자-1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 (HATU), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(다이메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(피롤리디노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (PyBOP) 등이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 라세미화는 1-하이드록시-벤조트리아졸 (HOBt) 및 1-하이드록시-7-아자-벤조트리아졸 (HOAt)과 같은 트리아졸을 이용함으로써 최소화된다. 커플링은 N,N-다이이소프로필에틸아민 (DIPEA/DIEA) 등과 같은 적절한 염기의 존재 하에 수행될 수 있다. 긴 펩타이드의 경우 또는 필요한 경우, 펩타이드 합성 및 라이게이션을 이용할 수도 있다.

펩타이드를 연장하기 위한 전형적인 펩타이드 결합 형성과는 별도로, 펩타이드는 측쇄에서 측쇄로 또는 측쇄에서 백본 아미노 또는 카르복실레이트로 측쇄 관능기 (예, 카르복시산 기 또는 아미노 기)에 부착시킴으로써 분지형 방식으로 연장될 수도 있다. 아미노산 측쇄에의 커플링은 임의의 공지된 방법에 의해 수행할 수 있으며, 수지 상에서 또는 수지 없이 수행할 수 있다. 비-제한적인 예로는, 카르복시 기를 함유한 아미노산 측쇄 (예, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, 등)와 아미노 기를 함유한 아미노산 측쇄 (예, Lys, D-Lys, Orn, D-Orn, Dab, D-Dab, Dap, D-Dap, 등) 또는 펩타이드 N-말단 간에 아미드를 형성하는 방법; 아미노 기를 함유한 아미노산 측쇄 (예, Lys, D-Lys, Orn, D-Orn, Dab, D-Dab, Dap, D-Dap, 등)와 카르복시 기를 함유한 아미노산 측쇄 (예, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, 등) 또는 펩타이드 C-말단 간에 아미드를 형성하는 방법; 아지드 기를 함유한 아미노산 측쇄 (예, Lys(N₃), D-Lys(N₃), 등)와 알킨 기 (예, Pra, D-Pra, 등) 간에 클릭 화학 반응을 통해 1,2,3-트리아졸을 형성하는 방법 등이 있다. 적절한 관능기에 대한 보호기는 아미드 결합을 형성하기 전에 선택적으로 제거하여야 하지만, 알킨과 아지도 기 간에 클릭 반응을 통해 1,2,3-트리아졸을 형성하는 반응의 경우에는 선택적인 탈보호가 필요없다. 선택적으로 제거가능한 보호기에 대한 비-제한적인 예로는 2-페닐이소프로필 에스테르 (O-2-PhiPr) (예, Asp/Glu 상의) 뿐 아니라 4-메틸트리틸 (Mtt), 알릴옥시카르보닐 (alloc), 1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴))에틸 (Dde) 및 1-(4,4-다이메틸-2,6-다이옥소사이클로헥스-1-일리덴)-3-메틸부틸 (ivDde) (예, Lys/Orn/Dab/Dap 상의) 등이 있다. O-2-PhiPr 및 Mtt 보호기는 DCM 중의 2.5% 트리플루오로아세트산 (TFA)과 같은 약 산성 조건에서 선택적으로 탈보호화할 수 있다. Alloc 보호기는 DCM 중의 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) 및 페닐 실란을 사용해 선택적으로 탈보호화할 수 있다. Dde 및 ivDde 보호기는 DMF 중의 2-5% 하이드라진을 사용해 선택적으로 탈보호화할 수 있다. Asp/Glu (L-형태 또는 D-형태) 및 Lys/Orn/Dab/Dap (L-형태 또는 D-형태)의 탈보호된 측쇄는, 예를 들어, 전술한 커플링 반응 조건을 이용함으로써, 커플링할 수 있다.

펩타이드 백본 아미드는 N-메틸화 (즉, α 아미노 메틸화)될 수 있다. 이는 펩타이드 합성 중에 Fmoc-N-메틸화된 아미노산을 직접 사용함으로써 달성할 수 있다. 대안적으로, N-메틸화를 미츠노부 조건에서 수행할 수 있다. 먼저, NMP 중의 4-니트로벤젠설포닐 클로라이드 (Ns-Cl) 및 2,4,6-트리메틸피리딘 (콜리딘) 용액을 이용해 유리 1차 아민 기를 보호화한다. 그런 후, 트리페닐포스핀, 다이이소프로필 아조다이카르복실레이트 (DIAD) 및 메탄올의 존재 하에 N-메틸화를 수행할 수 있다. 이후, NMP 중의 머캅토에탄올 및 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔 (DBU)을 이용해 N-탈보호를 달성할 수 있다. 보호된 아미노산을 N-메틸화된 α 아미노 기에 커플링하기 위해, HATU, HOAt 및 DIEA를 사용할 수도 있다.

링커를 본 발명의 화합물/복합체의 여러 구성성분과 커플링하는데 티오에테르 (-S-) 또는 에테르 (-O-) 연결을 형성하여야 할 수도 있으며; 이는 고상 또는 액상에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 티올-함유 화합물 (예, 시스테인 측쇄 상의 티올 기)를 알킬 할라이드 (예, 3-(Fmoc-아미노)프로필 브로마이드 등)와 적절한 용매 (예, N,N-다이메틸포름아미드 등)에서 염기 (예, N,N-다이이소프로필에틸아민 등)의 존재 하에 커플링함으로써, 티오에테르 (-S-) 연결을 형성시킬 수 있다. 에테르 (-O-) 연결 형성은, 알코올 (예, 세린 또는 트레오닌의 측쇄 상의 하이드록시 기)과 페놀 기 (예, 티로신의 측쇄)를 트리페닐포스핀 및 다이이소프로필 아지다이카르복실레이트 (DIAD)의 존재 하에 비-양성자성 용매 (예, 1,4-다이옥산 등) 중에 미츠노부 반응으로 반응시킴으로써, 달성할 수 있다. 만일 반응이 액상에서 이루어진다면, 사용되는 반응물들은 바람직하게는 등가의 몰 비율 (1:1)이며, 원하는 산물은 플래시 컬럼 크로마토그래피 또는 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 정제할 수 있다. 만일 반응이 고상에서 이루어진다면, 즉 하나의 반응물이 고상에 부착되어 있다면, 다른 반응물은 일반적으로 과량으로 사용된다 (고상에 부착된 반응물의 ≥3 당량). 반응 후, 과잉의 미반응 반응물 및 시약은, 예를 들어, N,N-다이메틸포름아미드, 메탄올 및 다이클로로메탄과 같은 용매의 조합을 이용해, 고상 (수지)을 순차적으로 헹굼으로써 제거할 수 있다.

펩타이드가 고형 지지체에 부착된 상태에서, 펩타이드 N-말단에 비-펩타이드 모이어티 (예, 방사성 표지 기, 알부민-결합 기 및/또는 링커)가 커플링될 수 있다. 이는, 비-펩타이드 모이어티가 활성화된 카르복실레이트 (및 필요에 따라 보호된 기)를 포함하여, 커플링이 수지 상에서 수행될 수 있을 경우에, 용이하다. 예를 들어, 비-제한적으로, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA) 트리스(tert-부틸 에스테르)와 같은 이관능성 킬레이터는 펩타이드에 커플링하기 위해 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 및 N,N'-다이사이클로헥실카르보디이미드 (DCC)의 존재 하에 활성화할 수 있다. 대안적으로, 화합물에 비-펩타이드 모이어티는 액상 또는 고상 조건에서 구리-촉매화된 클릭 반응을 통해 병합할 수 있다. 구리-촉매화된 클릭 반응은 당해 기술 분야에 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 2-아지도아세트산을 NHS 및 DCC에 의해 활성화한 다음 펩타이드에 커플링한다. 그런 후, 알킨-함유 비-펩타이드 모이어티를 아지드-함유 펩타이드에 아세토니트릴 (ACN) 및 DMF 등과 같은 유기 용매와 물 중의 Cu^{2 +} 및 소듐 아스코르베이트의 존재 하에 클릭 반응을 통해 연결할 수 있다.

방사성 금속 킬레이터의 합성은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 킬레이터들이 상업적으로 구입가능하다 (예, Sigma-Aldrich^TM/Milipore Sigma^TM 등). 방사성 금속을 킬레이터에 접합하는 프로토콜들 역시 잘 알려져 있다 (예, 하기 실시예 1 참조).

일반적으로, BF₃-함유 모티프는, BF₃-함유 아지도 (또는 알키닐) 기와 링커 상의 알키닐 (또는 아지도) 기 간에 1,2,3-트리아졸 고리를 형성하거나, 또는 BF₃-함유 카르복실레이트와 링커 상의 아미노 기 간에 아미드 연결을 형성함으로써, 클릭 화학 반응을 통해 링커에 커플링할 수 있다. BF₃-함유 아지드, 알킨 또는 카르복실레이트를 형성하기 위해, 알킨 또는 카르복실레이트를 먼저 준비한 다음, HCl, DMF 및 KHF₂ 혼합물 중에서 보론상 에스테르를 BF₃로 변환한다. 알킬 BF₃의 경우, 보론산 에스테르-함유 아지드, 알킨 또는 카르복실레이트는, 보론산 에스테르-함유 알킬 할라이드 (예, 요오도메틸보론산 피나콜 에스테르)를 아민-함유 아지드, 알킨 또는 카르복실레이트 (예, N,N-다이메틸프로파길아민)과 커플링함으로써 준비할 수 있다. 아릴 BF₃의 경우, 보론산 에스테르는 아릴 할라이드 (요오드 또는 브롬) 및 비스(피나콜라토)다이붕소를 이용한 스즈키 커플링을 통해 준비할 수 있다.

¹⁸F-¹⁹F 동위원소 교환 반응을 통한 BF₃-함유 모이어티의 ¹⁸F-불소화는 기존에 공개된 공정을 따라 달성할 수 있다 (Liu et al. Nat Protoc 2015 10:1423-1432, 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 일반적으로, BF₃-함유 화합물 ~100 nmol을 피리다진-HCl 완충제 (pH = 2.0-2.5, 1 M) 15 ㎕, DMF 15 ㎕ 및 7.5 mM KHF₂ 수용액 1 ㎕로 된 혼합물에 용해한다. ¹⁸F-불화물 용액 (식염수 중의, 60 ㎕)을 반응 혼합물에 첨가한다. 제조된 용액을 20분간 80℃에서 가열한다. 반응이 끝나면, 원하는 산물을 고상 추출 또는 역상 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 이동상으로서 물 및 아세토니트릴 혼합물을 이용해 정제할 수 있다.

펩타이드를 고상 지지체에서 완전히 합성한 후, 원하는 펩타이드/화합물을 TFA, 트리-이소프로필실란 (TIS) 및 물과 같은 적절한 시약을 사용해 고상 지지체로부터 절단할 수 있다. Boc, 펜타메틸다이하이드로벤조푸란-5-설포닐 (Pbf), 트리틸 (Trt) 및 tert-부틸 (tBu)과 같은 측쇄 보호기는 동시에 제거 (즉, 탈보호)한다. 펩타이드/화합물 조산물은, 차가운 에테르를 첨가한 다음 원심분리하여, 용액으로부터 침전 및 수집할 수 있다. 펩타이드의 정제 및 특정화는 펩타이드의 크기, 전하 및 극성에 따른 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)와 같은 표준 분리 기법으로 수행할 수 있다. 정제한 펩타이드의 순도는 질량 분광 측정 또는 다른 비슷한 방식으로 검증할 수 있다.

합성 반응식의 예는 실시예들에서 제공된다.

언급된 바와 같이, 본원에 개시된 화합물/복합체는, 영상 진단 또는 방사선치료에 적합하거나 또는 이들 2가지 용도로 사용할 수 있다는 점에서, 이중-방식이다. 예를 들어, 화합물/복합체는 ¹⁸F-표지 ("핫-F")할 경우 영상화제/진단제로서 이용할 수 있거나, 또는 치료학적 방사능 금속 동위원소 ("핫-M")와 킬레이트를 형성하는 경우에는 치료학적 물질로 이용할 수 있다.

이에, 일부 구현예에서, 금속 킬레이터는 핫-F/콜드-M이며, 즉 ¹⁸F-표지되고 (PET에 바람직함) 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하지 않거나 또는 형성한다. 이러한 구현예들은 영상화제 또는 진단제로서 유용하며, 방사능 금속 동위원소로부터 유해한 효과를 유발하지 않는다. 영상 촬영에서 개체가 치료학적 치료의 후보 대상인 것으로 확인되면, 동일한 화합물/복합체를 (콜드-F/핫-M 또는 핫-F/핫-M으로서) 투여할 수 있다. 이와 같이, 핫-F/콜드-M 화합물/복합체는 핫-M 치료학적 물질에 대한 동반 진단제로서 유용하다. 그래서, ¹⁸F를 이용해, 비-방사능 금속 동위원소, 예를 들어, ⁸⁹Y, ¹⁷⁴Lu, ²⁰⁸Pb에 킬레이트화된 결합된 화합물/복합체의 이미지를 촬영한다. 핫-F/콜드-M 이소토폴로그에 양성 이미지를 나타낸 환자는 콜드-F/핫-M을 포함하는 방사독성 이소토폴로그로 치료할 수 있다.

BF₃-함유 모이어티 기가 ¹⁸F-표지 (즉, 핫-F)되는 경우, 개체에서 세포 마커/항원을 발현하는 조직을 영상 촬영하기 위한 방사성 표지된 추적자를 제조하기 위한 화합물/복합체의 용도를 개시한다. 또한, 화합물/복합체 및 적절한 부형제를 포함하는 조성물을 개체에 투여하고, 개체의 조직을, 예를 들어, PET 또는 SPECT를 이용해 영상 촬영하는 것을 포함하는, 개체에서 세포 마커/항원을 발현하는 조직을 영상 촬영하는 방법을 개시한다. 조직이 질병에 걸린 조직인 경우, 핫-M 버전을 이용한 표적 치료를 개체를 치료하기 위한 목적으로 선정할 수 있다.

금속 킬레이터가 치료학적 방사성 동위원소에 킬레이트화되는 경우, 세포 마커/항원의 발현과 관련된 병태 또는 질환을 개체에서 치료하기 위한 화합물/복합체 (또는 이의 약학적 조성물)의 용도를 개시한다. 이에, 세포 마커/항원의 발현과 관련된 병태 또는 질환을 개체에서 치료하기 위한 약제의 제조에 있어 화합물의 용도가 제공된다. 또한, 개체에게 화합물/복합체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 병태 또는 질환의 치료 방법을 제공한다.

화합물 또는 분자 복합체에 대한 다양한 구현예들은, ¹⁸F로 표지된 화합물 또는 분자 복합체를 이용해 질환 또는 병태의 세포 마커의 존재를 검증하기 위해 개체를 영상 촬영하고; 치료학적 방사능 동위원소가 킬레이트화된 화합물 또는 분자 복합체를 이용해 질환 또는 병태를 치료하는데 이용할 수 있다. 따라서, 개체에게 테라노스틱 쌍의 ¹⁸F-표지된 화합물 또는 분자 복합체를 투여하고; ¹⁸F로 표지된 화합물 또는 분자 복합체를 이용해 질환 또는 병태의 세포 마커의 존재를 검증하기 위해 개체를 영상 촬영하고; 및 테라노스틱 쌍의 방사성 금속 결합된 화합물 또는 분자 복합체를 투여함으로써 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함하는, 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 방법/용도는 ¹⁸F/¹⁹F-동위원소 교환 반응을 수행하여 방사성 불소화 화합물/복합체를 제조하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 방법/용도는 킬레이트화 반응을 수행하여 방사성 금속 결합된 화합물/복합체를 제조하는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 진단 단계에 사용되는 화합물/복합체에는, 치료 단계에서 사용되는 화합물/복합체에 킬레이트화된 치료학적 금속의 비-치료학적 이소토폴로그 금속이 결합된다.

예를 들어, 비-제한적으로, 세포-표적화 도메인은 LLP2A일 수 있으며, 영상 촬영할 조직은 VLA-4-발현 조직일 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 세포-표적화 도메인은 LLP2A일 수 있으며, 병태 또는 질환은 다발성 골수종, 백혈병 및 기타 혈액 악성 종양, 및 흑색종, 다발성 경화증, 천식, 크론 질환, 염증성 장 질환 등과 같은 VLA-4-발현성 병태 또는 질환일 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 화합물은 DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A일 수 있다.

예를 들어, 비-제한적으로, 세포-표적화 도메인은 PSMA-617일 수 있으며, 영상 촬영할 조직은 PSMA-발현성 조직일 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 세포-표적화 도메인은 PSMA-617일 수 있으며, 질환은 PSMA-발현성 암일 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 화합물은 PSMA-617-LysAMBF₃-DOTA일 수 있다. PSMA 발현은 다양한 암들에서 검출된 바 있다 (예, Rowe et al., 2015, Annals of Nuclear Medicine 29:877-882; Sathekge et al., 2015, Eur J Nucl Med Mol Imaging 42:1482-1483; Verburg et al., 2015, Eur J Nucl Med Mol Imaging 42:1622-1623; 및 Pyka et al., J Nucl Med November 19, 2015 jnumed.115.164442). 따라서, PSMA-발현성 암은 전립선 암, 신장암, 유방암, 갑상선암, 위암, 결장직장 암, 방광암, 췌장암, 폐암, 간암, 뇌암, 흑색종, 신경내분비 종양, 난소암 또는 육종일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 암은 전립선 암이다.

예를 들어, 비-제한적으로, 세포-표적화 도메인은 TATE일 수 있으며, 영상 촬영할 조직은 소마스타틴 수용체-발현성 조직일 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 세포-표적화 도메인은 TATE일 수 있으며, 병태 또는 질환은 신경내분비 종양, 유방암, 소 세포성 폐암, 림프종, 수막종, 뇌하수체 선종 및 췌장암과 같은 소마스타틴 수용체-발현성 질환 또는 병태일 수 있다. 예를 들어, 화합물은 DOTA-Lys(AMBF₃)-TATE일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 비-제한적으로, 세포-표적화 도메인은 봄베신 또는 봄베신 유도체 (예, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂)일 수 있으며, 영상 촬영할 조직은 GRPR-발현성 조직일 수 있다. 예를 들어, 비-제한적으로, 세포-표적화 도메인은 봄베신 또는 봄베신 유도체 (예, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂)일 수 있으며, 병태 또는 질환은 GRPR-발현성 병태 또는 질환일 수 있다. GRPR의 비정상적인 또는 이소성 발현은 정신의학적/신경학적 장애, 염증성 질환 및 암을 비롯한 다양한 병태 및 질환들에서 검출된 바 있다. 이에, GRPR-발현성 병태 또는 질환은 정신 질환, 신경 장애, 염증성 질환, 전립선암, 폐암, 두경부암, 대장암, 신장암, 난소암, 간암, 췌장암, 유방암, 신경교종 또는 신경모세포종일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 암은 전립선암이다. 예를 들어, 화합물은 DOTA-Lys(AMBF₃)-Pip-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 언급되지 않은 참조문헌들

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본 발명은 하기 실시예들에서 추가적으로 예시될 것이다.

실시예

¹⁸F-표지된 동반 진단제는 방사선 치료제와 화학적으로 동일하다. ¹⁸F는 PET에 바람직하므로, 영상화를 위해 핫-F/콜드-M 이소토폴로그를 준비하며, 이는 치료에 사용될 수 있는 콜드-F/핫-M 이소토폴로그에 대한 동반 진단제로서 사용된다. 그래서, ¹⁸F를 이용해 비-방사능 금속 동위원소, 예를 들어, ⁸⁹Y, ¹⁷⁴Lu, ²⁰⁸Pb와 킬레이트화된 펩타이드를 영상 촬영할 수 있다. 핫-F/콜드-M 이소토폴로그를 이용한 영상화에서 양성을 나타내는 환자는 콜드-F/핫-M을 포함하는 방사독성 이소토폴로그를 이용해 치료할 수 있다.

요법의 경우에는, 방사독성 금속 (예, ⁹⁰Y 또는 ¹⁷⁷Lu^{50 ,51} 등)을 이용할 수 있다. 치료 전 영상화에서는 여러가지 진단 금속들이 전형적으로 사용될 것이며, 예를 들어, SPECT의 경우에는 ¹¹¹In이, PET의 경우에는 ⁶⁴Cu가 사용될 것이다. 이러한 관행은 잠재적인 치료학적 성과를 영상과 상호 연관시키기 어렵다. 예를 들어, DOTA-TATE는 SPECT 영상화를 위해 ¹¹¹In으로 표지하고, 치료 목적으로 ⁹⁰Y로 표지하지만, 명확한 흡수 차이가 존재한다. PET 동위원소 ⁸⁶Y를 가진 동일한 추적자를 사용하기에는 비용이 많이 들고, 쉽게 입수하기 어렵다^{45 ,46} 그래서, 금속 킬레이터, 예를 들어 DOTA뿐 아니라 ¹⁸F-불화물로 표지하기 위한 펜던트 오가노트리플루오로보레이트를 둘다 함유한 펩타이드가 유용하다. 궁극적으로, 킬레이터는 치료학적 용도로 방사독성 금속 또는 방사성독소 (즉, 방사독성 금속)의 서로게이트로서 이용가능한 비-방사능 금속에 대한 금속 킬레이트화, 또는 F-18 표지된 추적자의 PKPC 변동을 비롯한 다른 목적으로 이용할 수 있다 - 킬레이터 및 BF₃ 보결기 둘다 가진 화합물/복합체 (추적자)가 더욱 우수한 PET 영상화제일 수 있다.

PSMA-표적화 우레아 및 인테그린-표적화 펩타이드 리간드 LLP2A를 토대로 먼저 조성물 2종을 제조하였다 (도 2 참조). 놀랍게도, 동위원소 교환을 통해 ¹⁸F-불화물로 표지하는 경우, 이들 비-금속화된 조성물이, 이례적인 종양:비-종양 흡수율과 더불어, 우수한 종양 흡수성을 나타낸다 (표 5, 표 6, 표 7, 도 3 및 도 4 참조).

세포 배양 방법

B16F10 흑색종 세포주 (무스 무스쿨러스 (Mus musculus))는 ATTC (CRL-6475)로부터 상업적으로 입수하였다. 세포주는 IMPACT 1 마우스 프로파일 검사 (IDEXX BioResearch)에 의해 무균성임을 검증하였다. 세포는 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM, StemCell Technologies)에서 37℃에서 5% CO₂ 분위기의 습윤 배양기에서 배양하였다. 약 90% 컨플루언스로 배양한 세포를 멸균 1x PBS (pH 7.4)로 헹군 다음 트립신 처리하였다.

LNCap 세포주는 ATCC (LNCaP clone FGC, CRL-1740)로부터 입수하였다. 이는 인간 전립선 선암종의 좌측 쇄골상 림프절 전이부로부터 확립되었다. 세포는 10% FBS, 페니실린 (100 U/mL) 및 스트렙토마이신 (100 ㎍/mL)이 첨가된 PRMI 1640 배지에서 37℃에서 5% CO₂ 분위기의 습윤 배양기에서 배양하였다. 약 80-90% 컨플루언스로 배양된 세포를 멸균된 포스페이트-완충화된 염수 (1x PBS pH 7.4)로 헹구고, 트립신 처리하였다.

F-18 LLP2A - Lys - AMBF3 - DOTA의 생체내 생체분포 및 PET/CT 영상화 실험

모든 동물 실험은 캐나다 동물 관리 기관에 의해 확립되고 영국 컬럼비아 대학의 동물 윤리 위원회로부터 승인된 지침에 따라 수행하였다. 동물은 캐나다 벤쿠버에 위치한 BC 암 연구 센터의 동물 자원 센터에서 무균 환경에서 사육하였으며, 12시간 명야 주기로 유지시켰다. PET 영상화 및 생체분포 실험은 C57BL/6J 수컷 마우스를 이용해 수행하였다. 종양 이식을 위해, 산소 2.0 L/min 하의 2% 이소플루란 흡입에 의해 마우스를 마취시키고, 앞다리 수준에서 우측 등에 B16F10 세포 1x10⁶개를 피하 이식하였다. 8-10일 이내에 종양이 직경 8-10 mm로 성장하면, 마우스에서 영상을 촬영하거나 또는 생체분포 실험에 이용하였다.

PET/CT 영상 촬영 실험은 microPET/CT 스캐너 (Inveon, Siemens)에서 수행하였다. 간략하게는, 정적 PET 스캔을 위해, 각각의 종양을 가진 마우스에 F-18 표지된 LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA 4-6 MBq를 이소플루란 진정제 투여 하에 꼬리 측면 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 차단 실험의 경우, 마우스에 비-방사능 LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA 100 ㎍을 공동 주사하였다. 주사 후, 마우스는 회복되게 두었으며, 사육장에서 자유롭게 움직이게 하였다. 50분 후, 마우스를 다시 진정제를 투여하여, 스캐너에 배치하였다. 위치 파악 및 감쇠 교정 (attenuation correction)을 위해 베이스라인 CT 스캔을 입수하였다. 그런 후, 10분 정적 PET 스캔을 수행하였다. 마우스는 스캔 획득시 가열 패드를 사용해 따뜻하게 유지시켰다. 정적 PET 영상 촬영 후 생체분포를 분석한 다음 CO₂ 흡입에 의해 마우스를 안락사시켰다. PET 영상은 순서화된 부분집합 기대값 최대화 (ordered subset expectation maximization) 및 최대 사후 알고리즘 (maximum a posteriori algorithm)(OSEM3D/MAP)을 이용해 2 OSEM3D 반복 및 이후 18 MAP 반복을 적용해 재구성하였으며, 요청 해상도는 1.5 mm이었다.

생체분포 실험의 경우에는, 마우스에 2% 이소플루란을 흡입시켜 마취하고, F-18 표지된 LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA를 1-2 MBq로 주사하였다. 차단 실험에서는 비-방사능 LLP2A-Lys-AMBF3-DOTA 100 ㎍을 방사능 화합물과 공동 주사하였다. 주사 후, 마우스는 사육장에서 회복하여 자유롭게 돌아다니게 두었으며, 1시간 후 CO₂ 흡입에 의해 안락사시켰다. 신속하게 혈액을 채혈하고, 대상 장기를 회수해 1x PBS (pH 7.4)로 헹군 후 닦아 건조하였다. 각 장기의 무게를 측정하고, 수집한 조직의 방사능을 WIZARD 2480 (PerkinElmer)으로 측정하였으며, 표준 곡선을 이용해 주사량에 대해 표준화하고, 조직 g 당 주사량에 대한 % (%ID/g)로서 나타내었다.

F-18 PSMA - Lys - AMBF3 - DOTA의 생체내 생체분포 및 PET/CT 영상화 실험

영상화 및 생체분포 실험을 NODSCID 1L2RγKO 수컷 마우스를 이용해 수행하였다. 마우스는 캐나다 동물 관리 기관에 의해 확립되고 영국 컬럼비아 대학의 동물 윤리 위원회로부터 승인된 지침에 따라 유지시키고, 실험을 수행하였다. 마우스는 산소 중의 2% 이소플루란을 흡입시켜 마취시키고, 좌측 어깨 뒷쪽에 LNCaP 세포 1x10⁷개를 피하 이식하였다. 5-6주 동안 종양이 직경 최대 5-8 mm에 도달하도록 성장하면, 마우스에서 영상을 촬영하거나 또는 생체분포 실험에 사용하였다.

PET 영상화 실험은 Siemens Inveon (Erlanger, Germany) micro PET/CT 스캐너를 사용해 수행하였다. 종양을 가진 각 마우스에 F-18 표지된 PSMA-Lys-AMBF3-DOTA 6 - 8 MBq를 마취 (산소 중의 2% 이소플루란) 하에 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 차단 실험을 위해, 마우스에 비-방사능 DCFPyL (0.5 mg)을 공동 주사하였다. 50분 후, 마우스를 산소 흡입 하에 2% 이소플루란을 사용해 다시 진정시키고, 스캐너에 배치하였다. PET 이미지를 재구성하기 위해 분할한 후 위치 파악 및 감쇠 교정을 위해 10분 CT 스캔을 먼저 수행하였다. 그런 후, 10분 정적 PET 스캔을 수행하여, 종양 및 다른 장기에서 흡수를 측정하였다. 마우스는 스캔 획득시 가열 패드를 사용해 따뜻하게 유지시켰다.

생체분포 실험을 위해, 마우스에 상기에 언급한 바와 같이 방사성 추적자를 주사하였다. 차단 실험을 위해, 비-방사능 DCFPyL (0.5 mg)을 공동 주사하였다. 1시간 후, 마우스는 2% 이소플루란 흡입에 의해 마취하고, CO₂ 흡입에 의해 안락사시켰다. 신속하게 심장으로부터 혈액을 채혈하고, 대상 장기/조직을 회수하였다. 회수한 장기/조직은 무게를 측정하고, 자동 감마 카운터를 사용해 계수하였다. 각 장기/조직에서의 흡수를 표준 곡선을 이용해 주사량에 대해 표준화하고, %ID/g으로 나타내었다.

실시예 1: 흑색종의 VLA -4 표적화된 PET 영상화에 있어 DOTA 접합에 의한 ¹⁸ F-LLP2A 트리플루오로보레이트 방사성 추적자의 생체분포 조정

1.1 요약

세포횡단 최후기 항원 4 (VLA-4)는 종양 전이, 약물 내성과 연관되어 있으며, 다수의 암들에서 과다 발현된다. 이전의 보고들에 따르면, VLA-4를 발현하는 흑색종 종양에 대한 PET가, LLP2A 접합체에 킬레이트화된 ⁶⁴Cu 및 ⁶⁸Ga을 이용해, 최근에는 [¹⁸F]RBF₃ 방사성 보결기 (radioprosthetic)를 이용한 ¹⁸F로 성공을 거두었다. 그러나, 이러한 기존의 [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A 유도체들은 종양 흡수 수준이 보통 수준이고 GI 관에 현저하게 축적되는 것으로 확인되었다. 이를 해결하기 위해, 본 발명자들은 종양 흡수를 개선하고 GI 관내 축적은 낮추는, DOTA 모이어티가 부착된 새로운 RBF₃-LLP2A 생체접합체를 설계하였다. 방법: 본원에서, 본 발명자들은 ¹⁸F-트리플루오로보레이트 방사성 보결기, AMBF₃ 및 DOTA 모이어티가 구비된 변형된 LLP2A-PEG₂-NH₂ (1) 접합체의 합성을 기술한다. 전구체, DOTA-AMBF₃-PEG₂-LLP2A (6)를 동위원소 교환에 의해 방사성 표지하고, 반-분취용 HPLC 및 C18 카트리지 용출에 의해 정제하였다. VLA-4 표적을 과다 발현하는 B16-F10 흑색종 종양을 가진 C57BL/6J 수컷 마우스에서, 정적 및 동적 PET 스캔, 생체분포 실험, 및 주사 후 (p.i.) 1시간 시점에 [¹⁸F]6에 대해 과량으로 1을 공동 주사하는 차단 실험으로 이루어진 조합을 이용해, DOTA-[¹⁸F]AMBF₃-PEG₂-LLP2A ([¹⁸F]6)를 평가하였다. 결과: 전구체 6를 합성하고, ¹⁸F-표지하여, 평균 (±SD) 방사화학 순도가 95.9 ± 1.8%이고, 방사화학 수율이 4.8 ± 2.9%이며, 몰 활성이 131.72 ± 50.32 GBq/μmol인 [¹⁸F]6 제제들을 수득하였다. [¹⁸F]6의 생체내 정적 PET 스캔에서, 종양이 명확하게 가시화되었으며, 생체분포 실험에서는 종양 흡수율이 조직 g 당 주사량의 9.46 ± 2.19% (%ID/g)이었고, 종양:근육 및 근육:혈액 콘트라스트 비가 각각 ~8 및 ~10으로 높게 확인되었다. 차단 실험에서는 종양 및 골수에서 VLA-4에 대한 [¹⁸F]6의 특이성이 검증되었다. 동적 PET에서는 [¹⁸F]6가 주로 신장 경로를 통해 소거되는 것으로 확인되었으며, 장내 축적은 이전에 조사된 [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A와 비교해 ~10배 감소한 반면, 비장 흡수는 이전에 발표된 LLP2A-킬레이터 방사성 추적자와 비슷한 수준까지 강화되었다. 결론: 본 실험에서는 [¹⁸F]6가 기대되는 VLA-4 방사성 추적자로서 부각되었으며, LLP2A 방사성 추적자의 생체분포가 GI 관으로부터 비장 및 방광으로 어떻게 변경될 수 있는 지를 보여준다.

1.2 서론

세포횡단 최후기 항원 4 (VLA-4) 수용체는 몇가지 암에서 과다 발현되며 (1-15), 종양 전이 (11, 16-18) 및 화학요법 내성 (19)과 상호 관련되어 있다. 즉, 이것은 고-친화성 펩타이드 모방체 리간드 LLP2A에 의해 영상화하기 위한 다목적성 바이오마커이다. 이것은 Lam 등 (20)에 의해 최초로 개발된 이래로, LLP2A 약물작용발생단 (pharmacophore)은, NIR 형광 영상화 (21), ¹¹¹In (22) 및 ^99mTc (23)을 이용한 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 그리고 광의적으로는 ⁶⁸Ga 및 ⁶⁴Cu를 이용한 양전자 방출 단층촬영술 (PET)을 통해, 생체내 VLA-4 표적화가 입증되었다. (23-27) 그러나 지금까지 ¹⁸F를 이용한 PET 영상화는 단 1건만 발표되었으며; LLP2A-PEG₂-NH₂ (1)에 방사성 보결기 2종 암모늄다이메틸-트리플루오로보레이트 (AMBF₃) 및 N-피리디닐-para-트리플루오로보레이트 (N-Pyr-p-BF₃) 중 한가지를 부착한 다음, 한단계로 성공적으로 ¹⁸F-표지하고, B16-F10 흑색종 종양을 가진 마우스에서 PET 영상 촬영하였다 (28). 주사 후 (p.i.) 1시간 경과시, 이들 [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A 2종의 종양 흡수 수준은 보통이었으나 (2.8 및 4.4 %ID/g), 상당한 장 축적 (~52 %ID/g)이 관찰되었다.

이와는 대조적으로, 방사성 금속이 킬레이트화된 LLP2A 접합체는 동일한 뮤라인 흑생종 종양 모델에서 p.i. 1시간 내지 2시간 경과시 10-15% ID/g 범위의 종양 흡수 수준을 일관되게 나타내었다 (23-27). 그럼에도 불구하고, 방사성 금속화된 LLP2A-킬레이터 접합체는 망상내피 시스템 (RES)에 의해 일부 소거되어 계속적으로 비장에 격리되었다. 상기한 [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A는 소수성 특성을 나타내어 준-최적 이미지가 수득되었기에, 본 발명자들은 RBF₃-PEG₂-LLP2A 생체접합체에 친수성 킬레이터 DOTA를 병합하는 것이 신장 소거에 유리할 것으로 추정하였다. 그래서, 이러한 추정을 조사하기 위해, 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 (DOTA)을 거의 동일한 AMBF₃-PEG₂-LLP2A 전구체 스캐폴드에 접합하였다. 이를 위해, 이식한 후 DOTA 모이어티를 추가로 부착할 수 있도록 탈보호화한, 새로운 아미노산 Fmoc-Lys-(AMBF₃)를 고안하였다. 제조된 접합체 DOTA-[¹⁸F]AMBF₃-LLP2A (6)를 ¹⁸F/¹⁹F-동위원소 교환 (IEX) (28, 29)에 의해 표지하고, 생체내 PET 영상화 (정적 및 동적 스캔), 생체분포 실험 및 검증된 차단제로서 1을 이용한 VLA-4 차단 실험을 통해 평가하였다. 본 발명자들이 인지하는 한, 이는 신장 소거에 유리하게 생체분포를 조정하기 위해 사용한 DOTA-킬레이터를 부착한 임의의 ¹⁸F-표지된 펩타이드 방사성 추적자를 최초로 조사한 발표이다.

1.3 재료 및 방법

DOTA - AMBF ₃ - PEG ₂ - LLP2A (6) 합성. PEG₂ 스페이서 및 -NH₂ 접합 핸들을 고정하기 위해 O-비스-(아미노에틸)에틸렌글리콜 트리틸 수지를 기존에 발표된 바와 같이(28, 30) 이용해, LLP2A 펩타이드 모방체를 고상에서 기존에 기술된 바와 같이 합성하였다 (20). LLP2A-PEG₂-NH₂ (1) (4.2 mg, 4.46 μmol, 1 eq.)를 (1:19) DIPEA: DMF (v/v) 200 ㎕에 용해한 다음 여기에 Fmoc-Lys-(AMBF₃)-NHS (2) (5.85 mg, 8.91 μmol, 2 eq.)를 용해하였으며, 이의 합성은 보충 정보에 제공된다 (반응식 2). 접합은 2시간 동안 r.t.에서 진행하였다. 혼합물은 스피드-벡에 의해 농축하고 (~50 ㎕ - 100 ㎕), 1.0 mL Et₂O로 석출한 다음 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 산물을 DMF 50 ㎕에 다시 용해하였다. 전술한 Et₂O 석출/원심분리 방법을 반복 실시하였으며, 최종 펠릿을 스피드-벡에서 건조시켰다. 이러한 방법으로 산물 6.5 mg (~4.3 μmol)을 LLP2A-PEG₂-AMBF₃-Fmoc (3)의 거의 정량적인 수율로 수득하였다. ESI-MS(+): C₇₆H₉₈BF₃N₁₄O₁₃에 대한 계산치 1483.5 m /z; 실측치 [M+Na]⁺ = 1506.8 m /z, [M+2Na-H]⁺ = 1528.8 m /z (도 9). TLC: [(1:19) NH₄OH: EtOH, v/v], R _f = 0.46 (254 nm에서 가시화됨). 중간산물 3 (1.5 mg, 1 μmol, 1 eq.)를 (1:4) 피페리딘: DMF (v/v) 200 ㎕에 용해하고, rt에서 2시간내에 Fmoc-제거를 수행하였다. 혼합물을 농축한 다음 상기한 Et₂O 석출/원심분리 방법을 2회 수행하였다. 최종 펠릿은 스피드-벡으로 건조시켜 AMBF₃-PEG₂-LLP2A-NH₂ (4) ~1.3 mg (~1 μmol)을 정량적인 수율로 수득하였다. ESI-MS(+): C₆₁H₈₈BF₃N₁₄O₁₁에 대한 계산치 1261.3 m /z; 실측치 [M+H]⁺ = 1262.6 m/z, [M+Na]⁺ = 1284.6 m /z (도 10). TLC: [(1:19) NH₄OH: EtOH, v/v], R _f = 0.18 (254 nm에서 가시화 가능, 닌하이드린으로 염색). 중간산물 4 (1.8 mg, 1.4 μmol, 1 eq.)를 (1:19) DIPEA: DMF (v/v) 100 ㎕에 용해하고, rt에서 2시간내에 DOTA-NHS (5) (1.6 mg, 2.1 μmol, 1.5 eq.)와 접합하였다. 혼합물을 농축하고, 상기한 Et₂O 석출/원심분리 방법을 2회 수행하였다. 최종 펠릿은 스피드-벡으로 건조시켜 DOTA-AMBF₃-PEG₂-LLP2A (6) 조산물 2.4 mg (~1.4 μmol)을 수득하였다. 전술한 공정을 반복하여 HPLC 정제용 조산물 6 42.1 mg을 수득하였다. 이들 조합한 샘플을 (1:1) MeCN + 0.1% 포름산: H₂O + 0.1% 포름산 (v/v) 1.0 mL에 용해하고, HPLC 방법 A로 정제하였다. 산물 (6)을 t _R = 8.9분에 수집하고, 동일 부피의 H₂O로 희석한 다음 드라이아이스로 냉동한 후 동결건조하였다. 이 방법을 통해 정제된 (순도 >95%) 방사성 추적자 전구체 6 (ESI-MS, 도 11 및 HPLC, 도 12에 의해 특정화됨) 3.1 mg (1.9 μmol)이 수율 7.4%로 수득되었다. ESI-MS(+): C₇₇H₁₁₄BF₃N₁₈O₁₈에 대한 계산치 1647.6 m /z; 실측치 [M+H]⁺ = 1648.9 m /z, [M+Na]⁺ = 1670.9 m /z [M+K]⁺ = 1687.0 m/z. TLC: [(1:19) NH₄OH: MeOH], R _f = 0.67 (254 nm에서 가시화 가능, 브로모크레졸 그린으로 연하늘색으로 염색됨).

반응식 2: Fmoc-Lys(AMBF₃)-O-NHS의 합성 반응식.

ESI -MS 특정화. 질량 스펙트럼은 이동상으로서 MeOH 또는 CH₃CN을 이용해 Waters ZQ 분광기에서 획득하였다.

HPLC 방법 및 특정화. Agilent 1100 HPLC (자동-샘플러 유닛 및 다중-채널 PDA 검출기)를 사용해 HPLC 방법 A에 따라 전구체 6를 정제하였다. Chromatographic Specialties Inc. Knauer Smartline pump 100 및 Bioscan 방사선 검출기를 사용해 ¹⁸F-방사성 추적자 7을 HPLC 방법 B으로 정제하였다. Agilent Technologies 1200 HPLC (단일-채널 1200 Series PDA 검출기 및 Bioscan 방사선 검출기, Agilent Interface 35900E에 의해 연결됨)를 사용해 전구체 6에 대한 표준 곡선을 작성하고, 동물 주사하기 전에 7 제제는 HPLC 방법 C으로 QC하였다.

HPLC 방법 A: 6의 정제 및 분석. Agilent Eclipse XDB-C18, 9.4 mm x 250 mm, 5 ㎛ 컬럼; 용매 A = MeCN + 0.1% 포름산 (v/v) 및 용매 B = H₂O + 0.1% 포름산 (v/v); 유속 = 2.0 mL/min; 흡광 채널 = 257 nm (정제) 및 241 nm (분석). 농도 구배: i) 15분간 용매 A 25% -> 80%, ii) 1분간 용매 A 80% -> 100%, iii) 6분 동안 용매 A 100%, iv) 1분간 용매 A 100% -> 25%, v) 6분 동안 용매 A 25%.

HPLC 방법 B: [ ¹⁸ F]6 정제. Phenomenex Luna C18-100A, 10 mm x 250 mm, 5 ㎛ 컬럼; 용매 A = H₂O + 0.1% TFA (v/v) 및 용매 B = MeOH + 0.1% TFA (v/v); 유속 = 4.5 mL/min; 흡광 채널 = 257 nm. 먼저, 용매 B 40% (v/v)를 함유한 등용매성 혼합물을 12분간 사용한 다음 100% 용매 B (v/v)로 전환하여 12분간 둔다. ¹⁸F-방사성 추적자, [¹⁸F]6는 ~21분부터 23분까지 수집하였다.

HPLC 방법 C: [ ¹⁸ F]6 분석. Phenomenex Jupiter C18-300A, 4.6 mm x 250 mm, 10 μm 컬럼, 용매 A = H₂O + 0.1% TFA (v/v), 용매 B = MeCN + 0.1% TFA (v/v); 유속 = 2.0 mL/min; 흡광 채널 = 257 nm. 농도 구배: i) 4분간 용매 B 0%, ii) 2분간 용매 B 0% -> 40%, iii) 4분간 용매 B 40%, iv) 4분간 용매 B 40% -> 80%, v) 11분간 용매 B 80%, vi) 3분간 용매 B 80% -> 0%, 및 vii) 4분간 용매 B 0%.

Fmoc - Lys - AMBF ₃ - NHS 합성

화학제, 용매, 하드웨어. 3-다이메틸아미노-1-프로핀 및 트리플루오로메틸설포닐 무수물은 Sigma-Aldrich 사에서 구입하였다. 요오도메틸보론산 피나콜 에스테르는 Frontier Scientific 사에서 구입하였다. 포타슘 바이플루오라이드 (KHF₂)는 Acros Organics 사에서 구입하였다. 소듐 아지드는 Honeywell Riedel-de Haen 사에서 구입하였다. Fmoc-Lys-OH는 Novabiochem 사에서 구입하였다. 구리 설페이트, 아스코르브산, 소듐 하이드록사이드 및 포타슘 카보네이트는 Fisher Scientific 사에서 구입하였다. N-하이드록시숙신이미드 및 N,N'-다이사이클로헥실카르보디이미드는 Alfa Aesar 사에서 구입하였다. 플래시 크로마토그래피는 Silicycle 사에서 구입한 실리카 겔 (230-400 메쉬)을 이용해 수행하였다. 박층 크로마토그래피 (TLC)는 EMD Chemicals 사에서 구입한 실리카 겔 60 F₂₅₄에서 수행하였다. ¹H, ¹⁹F 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 실온에서 Bruker AV300 장치에서 기록하였다. 중수소화 용매 아세토니트릴-d₃, 클로로포름-d 및 아세톤-d₆는 Sigma-Aldrich 사에서 구입하였다. 전자분무-이온화 질량 분광 측정 (ESI-MS)은 Micromass LCT 장치를 사용해 기록하였다. HRMS는 Waters-Micromass LCT와 비행 시간 (TOF) 검출기를 사용해 수행하였다.

N - 프로파르길 - N , N - 다이메틸암모니오메틸보로닐피나콜레이트 . 열 건조한 (flamed dried) 둥근 바닥형 플라스크에, Ar_(g) 분위기 하에 3-다이메틸아미노-1-프로핀 (13.8 mmol, 1.01 eq) 1.5 mL을 투입하고, Et₂O 28 mL에 용해하였다. 요오도메틸보론산 피나콜 에스테르 (13.7 mmol, 1 eq) 3.67 g을 점적 첨가하여, 반응물을 RT에서 30분간 교반하였다. 산물을 백색 고형물로서 석출시켜, 진공 여과를 통해 수집하였다. 조산물을 차가운 Et₂O로 헹구었다. 조산물을 미리 무게를 측정한 신틸레이션 바이얼로 옮기고, 진공 건조하였다. 1 3.4 g (9.81 mmol)이 연한 베이지색 분말로 72% 수율로 수득되었다. ¹H NMR (300 MHz, 아세톤-d₆) δ ppm: 1.35 (s, 12H), 3.56 (s, 6H), 3.67 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 3.74 (s, 2H), 4.90 (d, J = 2.3 Hz, 2H). ¹³C NMR (75 MHz, 아세톤-d₆) δ ppm: 25.04, 53.61, 57.75, 73.01, 82.88, 86.48. ESI-MS(+): C₁₂H₂₃BNO₂ ⁺에 대한 계산치 224.1 m/z; 실측치 [M]⁺ = 224.6 m /z.

N - 프로파르길 - N , N - 다이메틸암모니오메틸 - 트리플루오로보레이트 . 3 M KHF_{2 (aq)} 및 4 M HCl _(aq) 원액을 각각 준비하였다. 화합물 1 (1.87 g, 5.33 mmol, 1 eq)을 CH₃CN 10 mL이 든 50 mL 팔콘 튜브에 투입하였다. 3 M KHF_{2 (aq)} (27 mmol, 5.1 eq) 9 mL 및 4 M HCl _(aq) (32 mmol, 6 eq) 8 mL을 첨가하고, 용액을 45℃에서 가열하면서 2시간 동안 교반하였다. 그런 후, 용액에 농축 NH₄OH _(aq)를 CH₃CN 층과 수성 층으로 된 2상이 형성되는 pH ~7가 될 때까지 첨가하여 중성화하였다. 상층 (유기 CH₃CN 층)을 250 mL 둥근 바닥형 플라스크에 수집하고, 수 층은 CH₃CN (3 x 10 mL)으로 헹구었다. 조산물을 회전식 증발에 의해 건조하였다. 아세톤 20 mL을 사용해 조산물 샘플로부터 부가적인 염을 석출시키고, 혼합물을 소결 유리 깔때기를 사용해 여과하였다. 여과물을 둥근 바닥형 플라스크에서 수집하고, 회전식 증발에 의해 농축한 다음 추가로 진공 건조하였다. 그런 후, 조산물을 다이에틸 에테르 20 mL로 헹구고, 클로로포름 20 mL을 사용해 임의의 남아있는 과잉의 피나콜을 용해시켰다. 조산물 샘플을 최소량의 아세톤으로 용해하고, 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 43-60 마이크로미터, 230-400 메쉬, ~ 40 g; 등용매성 아세톤)를 TLC (아세톤, R_f = 0.41, I₂로 염색)에 의해 용출 분획을 모니터링하면서 수행하였다. 정제된 2가 함유된 분획들은 합치고, 회전식 증발에 의해 농축한 다음 다시 진공 건조하였다. 고형 산물을 미리 무게를 측정한 바이얼에 수집하여 진공 건조하였다. 2 911 mg (5.52 mmol)이 밝은 오렌지색 고형물로서 정량적인 수율로 수득되었다. ¹H NMR (300 MHz, 아세톤-d₆) δ ppm: 2.54 (br. s, 2H), 3.24 (s, 6H), 3.47 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 4.40 (d, J = 2.3 Hz, 2H). ¹³C NMR (75 MHz, 아세톤-d₆) δ ppm: 52.21, 56.57, 73.13, 80.48. ¹⁹F NMR (282 MHz, 아세톤-d₆) δ ppm: -138.66 (q, 3F). ESI-MS(+): C₆H₁₁BF₃N에 대한 계산치 165.0 m/z; 실측치 [M+Na]⁺ = 188.4 m/z.

Fmoc - Lys (N ₃ )-OH. Fmoc-Lys-OH의 1차 아민을 다이아조-전이하기 위해 트리플루오로메틸설포닐 아지드를 사용하였다. NaN₃ (45.2 mmol, 8.63 eq) 샘플 2.94 g을 둥근 바닥형 플라스크에 투입하고, (2:3) H₂O:CH₂Cl₂ (v/v) 20 mL에 용해하였다. 혼합물을 교반하면서, 트리플릭산 무수물 (Tf₂O) (6 mmol, 1.15 eq) 1.02 mL을 30분에 걸쳐 점적 첨가하였다. 반응물을 빙수조에서 ~0℃에서 5시간 동안 교반하였다. 유기층을 CH₂Cl₂ (2 x 20 mL)로 추출하고, 수집한 유기층은 이후 NaHCO_{3 (aq)} 포화 용액 (20 mL)으로 헹구었다. 트리플루오로메틸설포닐 아지드를 수집한 유기층에 용해하였다. Fmoc-Lys-OH (5.24 mmol, 1 eq) 샘플 1.93 g을, K₂CO₃ (16.8 mmol, 3 eq) 2.32 g 및 Cu(II)SO₄ (94.0 μmol, 0.39 mol%) 15 mg이 든 둥근 바닥형 플라스크에 투입하고, (1:1) MeOH:H₂O (v/v) 15 mL에 용해하였다. 트리플릭 아지드가 함유된 유기층을 30분에 걸쳐 점적 첨가하였다. 용액을 RT에서 21시간 동안 교반하고, 2.5 M HCl _(aq) 60 mL로 반응을 퀀칭하였다. 유기층을 CH₂Cl₂ (3 x 20 mL)로 추출하고, 브린 (2 x 50 mL)으로 헹구었다. 수집한 유기층을 무수 Na₂SO₄를 사용해 건조시키고, 진공 여과에 의해 염을 제거하였다. 수집한 용액을 회전식 증발에 의해 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 43-60 마이크로미터, 230-400 메쉬, ~80 g; 용매 농도 구배 (0.5:99.5) MeOH:CH₂Cl₂ (v/v) -> (1:99) MeOH:CH₂Cl₂ (v/v))를, 용출 분획을 TLC ((1:9) MeOH:CH₂Cl₂ (v/v), R_f = 0.37, 254 nm로 가시화 가능, I₂ 및 브로모크레졸 그린으로 염색)에 의해 모니터링하면서, 수행하였다. 순수한 분획을 회전식 증발에 의해 농축하고, 추가적으로 진공 건조하였다. 이로써 3 1.60 g (4.06 mmol)이 왁스형 백색 고형물로서 77% 수율로 수득되었다. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ ppm: 1.05 - 2.21 (m, 6H), 3.05 - 3.36 (m, 2H), 4.23 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.39 - 4.74 (m, 3H), 5.57 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.32 (t, J = 7.32 Hz, 2H), 7.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.51 - 7.67 (m, J = 7.5 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 9.76 (s, 1H). ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ ppm: 22.48, 28.36, 31.86, 47.16, 51.07, 53.59, 67.22, 120.09, 125.10, 127.14, 127.83, 141.37, 143.67, 156.27, 176.84. ESI-MS(-): C₂₁H₂₂N₄O₄에 대한 계산치 394.4 m /z; 실측치 [M-H]^- = 393.4 m /z and [2M-H]^- = 787.7 m /z.

Fmoc - Lys ( AMBF ₃ )-OH. 소듐 아스코르베이트 (0.01 mol) 1.98 g을 DI H₂O 10 mL에 용해하여 신선한 1 M 소듐 아스코르베이트 원액을 제조하였다. 그런 후, 무수 Cu(II)SO₄ (0.01 mol) 1.60 g을 DI H₂O 10 mL에 용해하여 1 M Cu(II)SO_{4 (aq)} 원액을 제조하였다. 화합물 2 (2.513 mmol, 5.24 eq) 샘플 414.6 mg을 둥근 바닥형 플라스크에 투입하고, (3:2) CH₃CN:H₂O (v/v) 2.5 mL에 용해하였다. 1 M Cu(II)SO_{4 (aq)} (1.5 mmol, 3.1 eq) 1.5 mL을 먼저 첨가한 다음 1 M 소듐 아스코르베이트 (3 mmol, 6.2 eq) 3 mL을 첨가하였다. 화합물 3 (479 μmol, 1 eq) 샘플 189 mg을 용액에 첨가하였다. 그런 후, K₂CO₃ (732 μmol, 1.5 eq) 101 mg을 첨가하여 용액을 pH ~7로 중화한 다음 45℃에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 여과하여 석출물을 제거하고, 여과물을 회전식 증발에 의해 농축하였다. 건조된 조산물을 (1:1) MeOH:CH₂Cl₂ (v/v) (5 x 10 mL)에 재현탁하고, 진공 여과하여 석출물을 제거한 다음 여과물을 회전식 증발에 의하 건조하였다. 건조된 산물을 이후(5:95) MeOH:CH₂Cl₂ (v/v) (5 x 10 mL)에 재현탁하고, 진공 여과하여 석출물을 제거한 다음, 여과물을 다시 회전식 증발에 의해 건조하였다. 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 230-400 메쉬, ~50 g; 용매 (1:4:95) AcOH:MeOH:CH₂Cl₂ (v/v/v))를, TLC (1:10:89 AcOH:MeOH:CH₂Cl₂ (v/v/v), R_f = 0.21, 254 nm 광으로 가시화 가능, I₂로 염색)에 의해 용출 분획을 모니터링하면서, 수행하였다. 순수한 4를 함유한 분획들을 합치고, 회전식 증발에 의해 농축한 다음 추가적으로 진공 건조하였다. 이로써 4 192 mg (343 μmol)이 어두운 노란색 오일로서 71% 수율로 수득되었다. ¹H NMR (300 MHz, CD₃CN) δ ppm: 1.27 - 1.91 (m, 6H), 2.29 (d, J = 4.57 Hz, 2H), 2.95 (s, 6H), 4.08 (br s, 1H), 4.22 (t, J = 6.90 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 7.08 Hz, 2H), 4.38 (t, J = 6.97 Hz, 2H), 4.43 (s, 2H), 6.01 (d, J = 5.94 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.30 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 7.50 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 4.34 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 7.54 Hz, 2H), 8.02 (s, 1H). ¹³C NMR (75 MHz, CD₃CN) δ ppm: 23.22, 30.19, 31.56, 47.97, 50.79, 53.45, 54.73, 61.28, 67.20, 120.93, 126.16, 128.07, 128.43, 128.65, 137.30, 142.07, 145.08, 157.09. ¹⁹F NMR (282 MHz, CD₃CN) δ ppm: -138.16 (d, 3F). ESI-MS(-): C₂₇H₃₃BF₃N₅O₄에 대한 계산치 559.4 m /z; 실측치 [M-H]^- = 558.5 m /z and [M+I]^- = 686.4 m /z.

Fmoc - Lys ( AMBF ₃ )-O- NHS. 4 (291.7 μmol, 1 eq) 샘플 163.3 mg을 둥근 바닥형 플라스크에 투입하고, (1:1) CH₂Cl₂:CH₃CN (v/v) 8 mL에 용해하였다. DCC (1.48 mmol, 5.07 eq) 샘플 305 mg을 용액에 첨가한 다음, NHS (1.48 mmol, 5.07 eq) 170 mg을 첨가하고, 용액을 RT에서 21시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 소결 깔때기를 사용해 진공 여과하고, 수집한 여과물은 회전식 증발에 의해 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (컬럼 직경 = 0.5 cm; 실리카 겔 (230-400 메쉬), ~10 g; CH₂Cl₂로 부터 50 mL 당 10% CH₃CN (v/v) 씩 증가시켜 (1:1) CH₂Cl₂:CH₃CN (v/v)까지 높이는 농도 구배)를, TLC (1:1) CH₂Cl₂:CH₃CN (v/v), R_f = 0.52, 254 nm로 가시화 가능, I₂로 염색)에 의해 용출 분획을 모니터링하면서, 수행하였다. 순수한 5를 함유한 분획들을 합치고, 회전식 증발에 의해 농축한 후 추가적으로 진공 건조하였다. 이로써 5 118 mg (180 μmol)이 노란색 오일로서 61% 수율로 수득되었다. ¹H NMR (300 MHz, CD₃CN) δ ppm: 1.47 - 1.53 (m, 1H), 1.86 - 1.98 (m, 5H), 2.33 (d, J = 4.1 Hz, 2H), 2.79 (s, 4H), 2.98 (s, 6H), 4.26 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 4.38 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.46 (d, J = 4.3 Hz, 2H), 4.49 - 4.56 (m, 1H), 6.33 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.36 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.45 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 8.06 (s, 1H). ¹³C NMR (75 MHz, CD₃CN) δ ppm: 22.04. 25.16, 25.24, 25.40, 29.10, 30.55, 46.95, 49.83, 52.31, 52.55, 54.34, 60.27, 66.63, 117.34, 120.02, 125.21, 127.16, 127.54, 127.76, 136.42, 141.14, 144.02, 155.99, 168.64, 169.83. ¹⁹F NMR (282 MHz, CD₃CN) δ ppm: -138.21 (d, 3F). ESI-MS(+): C₃₁H₃₆BF₃N₆O₆에 대한 계산치 656.5 m/z; 실측치 [M+Na]⁺ = 679.8 m /z. HRMS: C₃₁H₃₆BF₃N₆O₆에 대한 계산치 656.4702 m/z; 실측치 [M+Na]⁺ = 679.2618 m/z.

Lys-AMBF₃의 구조 특정화를 첨부된 도 15 내지 도 33에 도시한다.

포화 결합 분석. 시험관내 포화 결합 분석은 B16-F10 세포에서 공개된 공정에 따라 수행하였다 (n = 3).(28) 세포를 24웰 폴리-L-라이신 플레이트에서 거의-컨플루언스로 배양하였다. 배양 배지를 제거하고, 반응 매질 (RPMI, 1% BSA, 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신)을 첨가한 다음 37℃에서 적어도 1시간 동안 배양되게 두었다. [¹⁸F]6를 농도를 증가시키면서 (5 pM - 20 nM) 세포에 첨가하여, 1시간 동안 25℃에서 약간 교반하면서 인큐베이션하였다. 1 (10 μM)을 동시에 첨가하면서 [¹⁸F]6와의 인큐베이션을 반복하여 비-특이적인 결합을 측정하였다. 인큐베이션한 후, 세포를 빙랭한 PBS로 2번 세척하고, 트립신과 인큐베이션하여 회수한 다음 WIZARD 2480 감마 카운터 (PerkinElmer)를 사용해 방사성을 측정하였다. 비-특이적인 결합 분석의 값을 특이적인 결합 분석의 각각의 값에서 제하였다. 해리 상수 (K_d ^'s)를 원-사이트 특이적인 결합 모델로 GraphPad PRISM 7을 이용해 구하였다.

[ ¹⁸ F] 불화물 음이온으로 DOTA - AMBF ₃ - PEG ₂ - LLP2A ( 6)의 방사성 표지 . 전구체 6 (80 nmol)를 1 M 피리다진-HCl (pH = 2) 15 ㎕, DMF 10 ㎕, MeOH 15 ㎕ 및 최종 pH ~2.0의 5 mM KHF_{2 (aq)} (50 mol% ¹⁹F^- 담체) 4 ㎕에 용해하였다 (반응식 1). ¹⁸F/ H₂ ¹⁸O (~1 Ci)를 활성화된 9 mg QMA 카트리지 (1.7 mL 브린으로 예비-컨디셔닝한 다음 2.5 mL 물로 헹구고, 3 mL 공기로 건조된)를 통해 통과시켜, ¹⁸F (>95% 효율)를 포획한 후, 0.9% 식염수 ~80-100 ㎕를 사용해 전구체가 든 격막-밀봉된 반응 용기로 용출시켰다 (>90% 효율). 용액을 82-84℃에서 5분간 가열한 다음 진공 하에 15분간 가열하였다. 40 mM NH₄HCO_{2 (aq)} (pH = 6.8) 2 mL을 첨가하여 퀀칭한 다음, 반-분취용 HPLC에서 2번의 연속적인 등용매성 용매 조건 (HPLC 방법 B) 하에 정제하였다. 방사성 추적자 [¹⁸F]6를 수집하고, H₂O 50 mL로 바로 희석하였다. 용기에 He _(g) 압력을 약간 가하여, 수득한 용액을 Sep-Pak Light C18 카트리지 (EtOH 9 mL, H₂O 9 mL 및 공기 10 mL로 연속적으로 미리 세척)를 통과시켰다. 포획된 [¹⁸F]6는 (9:1) EtOH: 0.9% 식염수 (v/v) 0.5 mL이 든 격막-밀통된 바이얼로 용출시킨 다음 마지막으로 PBS 4 mL을 첨가하여 제형화하여, 동물에 주사하기 위한 용도로 pH ~7의 (1:9) EtOH: PBS (v/v) 중에 [¹⁸F]6를 수득하였다. [¹⁸F]6의 모든 정제된 제제들을 분석용 HPLC (방법 C)에 의해 특정화하여, 동물에 주사하기 전에 방사화학적 순도, 방사화학 수율 및 표준 곡선에 기반한 몰 활성을 정량하였다 (도 13).

반응식 1. [¹⁸F]6을 제조하기 위한 4 및 전구체 6의 합성.

B16-F10 종양-보유 마우스에서 DOTA -[ ¹⁸ F] AMBF ₃ - PEG ₂ - LLP2A ( [ ¹⁸ F]6)의 PET 영상화. B16-F10 세포 (ATTC, CRL-6475)를 10% FBS (v/v), 100 U/ mL 페니실린 및 100 ㎍/ mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 37℃ 및 5% CO_{2 (g)} 하에 배양하였다. 모든 동물 실험은 캐나다 동물 관리 기관의 가이드라인에 따라 수행하였으며, 영국 콜롬비아 대학의 동물 윤리 위원회로부터 승인받았다. C57BL/6J 수컷 마우스를 2% 이소플루란으로 마취하고, 우측 어깨에 B16-F10 세포 1x10⁶개를 피하 주사하였다. 종양이 직경 7-9 mm에 도달할 때까지 성장하게 두었다. PET 및 CT 영상화 실험은 기존에 발표된 바와 같이 (28, 31-33) microPET/CT 스캐너 (Inveon, Siemens)를 사용하였다. 정적 PET 스캔 (10분간 기록)하기 위해, 먼저 마우스를 2% 이소플루란 마취 하에 꼬리 정맥을 통해 ([¹⁸F]6) 4-6 MBq를 주사하고, PET 영상 촬영하기 전에 베이스라인 CT 스캔 (10분간 기록)을 수행하였다. 경쟁적인 VLA-4 차단을 수반하는 정적 PET 이미지를 위해, 1 200 ㎍을 [¹⁸F]6 4-6 MBq와 공동 주사하고, 기술된 방법을 이용해 1h p.i.에 베이스라인 CT 이미지와 PET 이미지를 확보하였다. 동적 PET 스캔은 상기한 마취 하에 [¹⁸F]6 4-6 MBq를 주사하여 수행하였으며, 베이스라인 CT 스캔 및 PET 스캔을 p.i. 5초부터 52.5분까지 (총 28번) 기록하였다. 마지막으로, 정적 PET 영상화 실험 후 CO_{2 (g)} 흡입에 의해 마우스를 안락사시키고, 생체분포를 측정하기 위해 장기를 회수하였다.

B16-F10 종양-보유 마우스에서 DOTA -[ ¹⁸ F] AMBF ₃ - PEG ₂ - LLP2A ( [ ¹⁸ F]6)의 생체분포. 마우스를 2% 이소플루란으로 마취하고, 꼬리 정맥을 통해 [¹⁸F]6 2-3 MBq를 주사하였다. 경쟁적인 VLA-4 차단 실험을 위해, 1 200 ㎍을 2-3 MBq [¹⁸F]6와 공동 주사하였다. 1h p.i.에, 마우스에 CO_2(g) 흡입시켜 안락사시키고, 혈액을 채혈하고, 장기를 적출하였다. 샘플을 세척 및 건조한 후, 장기의 무게를 측정하고, Wallac WIZARD2 감마 카운터 (PerkinElmer)를 사용해 방사능을 기록하였으며, 값들은 각각의 장기에 대한 %ID/g로서 나타내었다. 양측 ANOVA Sidak의 다중 비교 검정 (GraphPad PRISM)을 이용해, 1의 공동 주사에 의한 경쟁적인 VLA-4 차단과 비교해, [¹⁸F]6 단독의 생체분포의 통계학적 유의성을 평가하였다.

추가적인 상세 내용은 Lepage et al., ChemBiochem 10.1002/cbic.201900632에 제공된다.

1.4 결과

DOTA - AMBF ₃ - PEG ₂ - LLP2A (6) 합성 및 VLA -4 친화성. LLP2A 펩타이드 모방체를 본 실험실에서 발표한 수정 (수지 절단시 PEG₂-NH₂ 병합) (28)을 가하여 이전에 언급 (20)된 바와 같이 합성하였다. 중간산물 1의 말단 1차 아민을 Fmoc-보호된 라이신-AMBF₃ 접합체 2에 NHS-화학 반응을 통해 정량적인 수율로 커플링하였다. 이후 중간산물 3에 대해 효율적인 Fmoc-제거를 수행하고 (중간산물 4), 비-보호된 DOTA-NHS (5)에 염기성 조건 하에 커플링하였다. 이 방법을 반복하여, HPLC 정제하기 위한 6의 조산물 샘플 상당량 (42.1 mg)을 수득하였다. 이러한 전략으로 동결건조된 전구체 6 3.1 mg (1.9 μmol)이 후속적인 ¹⁸F-방사성 표지하기 위해 고 순도 (HPLC에 따라 >95%)로 수득되었다. K_d 값은 6.9 ± 0.59 nM (n = 3)으로 계산되었으며 (도 14), 이는 다른 [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A 접합체에서 확인된 K_d 값보다 적어도 5배 높았다 (도 8).

DOTA -[ ¹⁸ F] AMBF ₃ - PEG ₂ - LLP2A ([ ¹⁸ F]6) 합성. 전구체 6 (80 nmol)를 [¹⁸F]불화물로 산성 피리다진 수성 완충제에서 IEX를 통해 71.8 ± 1.0분 (±SD) (¹⁸F/ H₂ ¹⁸O-제제에 전달, n = 4) 안에 방사성 표지하였다. HPLC에 의해 샘플이 6의 ¹⁸F-표지된 유도체임을 검증 (도 5b)한 후, [¹⁸F]6의 평균 방사화학적 순도는 95.9 ± 1.8 % (±SD) (도 5a)인 것으로 계산되었다. [¹⁸F]6의 평균 방사화학적 수율은 4.8 ± 2.9%이었으며, 평균 몰 활성 (A_m)은 131.72 ± 50.32 GBq/μmol (3.56 ± 1.36 Ci/μmol)인 것으로 계산되었다.

B16-F10 종양-보유 마우스에서 DOTA -[ ¹⁸ F] AMBF ₃ - PEG ₂ - LLP2A ( [ ¹⁸ F]6)의 PET 영상화.

[¹⁸F]6의 정적 PET 이미지는 B16-F10 종양-보유 마우스의 종양, 비장, 신장 및 골수에서 1 h p.i. (n = 2) 시점에 추적자가 선호적으로 흡수됨을 보여준다 (도 6a 및 6b). [¹⁸F]6를 1 (n = 2)과 공동 주사하는 차단 실험에서는, 추적자의 흡수 값이 종양 및 골수에서 거의 베이스라인 수준으로 감소하였고, 활성은 비장에서 가시적으로 남아있었다 (도 6c 및 6d). 모든 이미지들에서 방광에 상당한 활성이 존재하는 것으로 관찰되었으며, 이는 신장을 통한 [¹⁸F]6의 신장 소거를 검증해준다.

동적 PET 스캔에서는 순환을 통한 [¹⁸F]6의 초기 관류 및 p.i. 4분 이내에 간을 통한 1차 통과가 확인되었다 (도 7). 방사성 추적자는 p.i. 1.9분 이내에 종양에 효과적으로 흡수되었으며, p.i. 52.5분까지 종양에 계속 축적되었다. VLA-4 표적화는 또한 골수에서 방사성 추적자 축적에 의해서도 관찰되었다. 이들 스캔에서 [¹⁸F]6가 처음에는 장에 존재하고, 스캔하는 동안 장내 체류하는 것으로 확인되었다. 동적 PET 스캔에서도, 백그라운드 근육 조직에서 [¹⁸F]6 축적이 낮게 유지되어, 높은 콘트라스트의 정적 PET 이미지가 재현되었다.

생체분포 실험에서 [¹⁸F]6가 비장에 다량 축적되는 것으로 드러났으며, p.i. 1시간 경과시 폐와 장에 상당히 흡수된 것으로 확인되었다 (표 5). 특이적인 VLA-4 결합은 종양 및 골수에서의 높은 [¹⁸F]6 흡수에 의해 입증되었다. 1의 공동 주사시 비장 (88% 낮음, p < 0.0001), 장 (43% 낮음, p < 0.05), 폐 (85% 낮음, p < 0.0001), 뼈 & 골수 (78% 낮음, p < 0.0001) 및 종양 (75% 낮음, p < 0.0001)에서 [¹⁸F]6 축적이 저하되었다. 콘트라스트 비 (표 6)는 백그라운드 근육 (~7배 높음) 및 혈액 풀 (~9배 높음)과 비교해 종양에서 [¹⁸F]6가 상대적으로 높은 수준으로 흡수됨을 보여준다. VLA-4 차단 결과, [¹⁸F]6에 대한 종양/근육 (92% 낮음, p < 0.0001) 및 종양/혈액 (85% 낮음, p < 0.0001)에서는 콘트라스트가 감소한 반면 종양/신장 및 종양/뼈&골수 콘트라스트에는 유의한 효과가 없었다 (p > 0.05).

표 5. B16-F10 종양-보유 마우스에서 p.i. 1시간 경과시 [¹⁸F]6의 생체분포 및 차단 물질 1의 공동 주사시 (200 ㎍)의 생체 분포 (평균 %ID/g ±SD).

조직	[18F]6 (n = 6)	[18F]6 + 차단 물질 (n = 5)
혈액	0.94 ± 0.05	0.72 ± 0.09
지방	0.31 ± 0.08	0.08 ± 0.01
정액	0.92 ± 0.24	0.27 ± 0.16
고환	0.31 ± 0.02	0.22 ± 0.04
장	4.55 ± 0.80	2.6 ± 0.55
비장	28.33 ± 4.28	3.49 ± 0.61
췌장	0.86 ± 0.14	0.22 ± 0.01
위	1.20 ± 0.20	1.24 ± 1.82 a
간	1.61 ± 0.21	0.63 ± 0.06
부신	1.51 ± 0.31	0.47 ± 0.17
신장	4.32 ± 0.50	3.70 ± 0.56
심장	0.66 ± 0.09	0.26 ± 0.03
폐	6.86 ± 0.46	1.06 ± 0.03
종양	9.46 ± 2.19	2.37 ± 0.34
뼈 & 골수	8.23 ± 0.84	1.80 ± 0.17
근육	1.30 ± 0.33	0.27 ± 0.05
뇌	0.07 ± 0.02	0.04 ± 0.01
꼬리	1.84 ± 0.41	1.10 ± 0.85
a. 4.45 %ID/g인 마우스 1마리 포함

표 6. B16-F10 종양-보유 마우스에서 p.i. 1시간 경과시 [¹⁸F]6의 종양/조직 비율 및 차단 물질 1의 공동 주사시 (200 ㎍) [¹⁸F]6의 종양/조직 비율 (평균 %ID/g ±SD).

비율	[18F]6 (n = 6)	[18F]6 + 차단 물질 (n = 5)
종양 : 뼈 & 골수	1.98 ± 0.78	0.46 ± 0.07
종양 : 근육	7.96 ± 3.37	0.60 ± 0.05
종양 : 혈액	10.08 ± 2.17	1.50 ± 0.18
종양 : 신장	2.22 ± 0.60	2.55 ± 0.95

1.5 고찰

¹⁸F-표지된 LLP2A 방사성 추적자를 상기와 같이 제조하였으며, 각각 구조적으로 비슷한 비교적 소수성인 [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A 추적자 2종을 동위원소 교환에 의해 표지하였다. 방사성 추적자의 극성을 높이기 위한 몇가지 방법들이 존재하지만 (예, 글루타메이트 부가, PEG 링커의 길이 증가), 본원에서는 친수성을 높이기 위한 수단으로서 DOTA 모이어티를 도입하여 추적자 소거를 조절하는 새로운 접근법을 제시하였다. [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A 접합체에 대한 높은 장 흡수성은 기존에 관찰된 바 있다. 펩타이드 스캐폴드로서 리간드의 LLP2A 클래스를 조사하기 위해, DOTA 모이어티를 제외한 모든 차이들을 최소화하기 위해 DOTA를 거의 동일한 LLP2A 접합체에 부착시켜 화합물 6을 설계하였다 (도 8에서 구조 비교 참조). DOTA-변형된 LLP2A 유도체 6의 합성은 대부분의 화학적 반응에서 거의 정량적인 수율로 효율적이고 단계적인 방식으로 진행되었다. 최종 단계에서 6의 비교적 낮은 회수 수율은 엄격한 HPLC 정제 조건의 결과로서 샘플 소실이 그 이유였다. 그러나, 수집된 물질은 순도가 높았으며, 전술한 ¹⁸F-방사성 표지 및 생체내 실험 둘다에 충분한 양으로 확보되었다.

[¹⁸F]6의 방사성 합성은, AMBF₃ 방사성 보결기 및 그외 본 실험실에서 조사된 트리플루오로보레이트에서 기존에 입증된 바와 같이, 수성 조건 하에 ¹⁸F-IEX에 의한 수성 한 단계로 달성하였다. 방사성 합성 시간, 방사화학적 수율, 순도 및 몰 활성은 생체내 실험에 적합하였으며, 선행 물질 [¹⁸F]AMBF₃-PEG₂-LLP2A 및 [¹⁸F]N-Pyr-p-BF₃-PEG₂-LLP2A (28)와 유사하였다. 수율은 상대적으로 낮았지만, [¹⁸F]6는 0.37-1.85 GBq (10-50 mCi)의 충분한 활성으로 각각의 생체내 실험에서 일관되게 수득되었다 (n>6). 표지 방법 및 회수 방법 둘다 최적화되어 있지 않아, 본 발명자들은, [¹⁸F]6의 직접 제제화 및 수집을 위한 HPLC 정제시 대안적인 용액 (예, 완충화된, 수성, 등장성 에탄올 용액)을 사용함으로써 수율을 높일 수 있을 것으로, 확신하였다. 이는, 친수성 추적자가 초기 포획 단계에서 소실될 가능성이 높은, 표지 후 [¹⁸F]6의 C18 카트리지를 이용한 분리 필요성을 회피할 수 있을 것이다.

표적 VLA-4를 발현하는 표준적인 뮤라인 흑색종 모델인 B16-F10을 영상 촬영하였다. [¹⁸F]6는 비장, 종양 및 골수에 p.i. 1시간 경과시 선호적으로 축적되었다. 만족스럽게도, B16-F10 흑색종 종양에서 [¹⁸F]6 흡수 및 대응되는 종양/근육 및 종양/혈액 비율은. 동일한 종양 모델에서 비슷한 시점 (1h - 2h p.i.)에서 [⁶⁴Cu]Cu-CB-TE1A1P-PEG₄-LLP2A, [⁶⁴Cu]Cu-CB-TE2A-LLP2A, [⁶⁴Cu]Cu-NODAGA-PEG₄-LLP2A 및 [⁶⁸Ga]Ga-NODAGA-PEG₄-LLP2A에서 관찰되는 결과와 비슷하였다 (23, 25-27). 차단시, 종양 및 골수에서 VLA-4에 대한 [¹⁸F]6의 특이성이 검증되었으며, 이는 B16-F10 종양 및 골수에서 발견된 조혈 줄기 세포에서의 널리 알려진 VLA-4의 발현과 일치하였다 (2, 9, 10, 34-37). 비장에서 [¹⁸F]6의 다량 축적은 바람직하지 않지만, LLP2A 방사성 추적자의 RES에 대한 격리는 전술한 ⁶⁴Cu- 및 ⁶⁸Ga-표지된 LLP2A 유도체들에서 관찰되었다 (23, 25-27). 본 발명자들의 결과는, 또한, 기존에 보고된 LLP2A 방사성 추적자를 이용한 생체내 실험 (22, 24, 26, 38- 40)에서처럼, [¹⁸F]6의 소거 경로가 신장 및 방광을 통해 이루어짐을 입증해주었다.

[¹⁸F]6는 ⁶⁴Cu-표지된 LLP2A 유도체에 대해 기존에 보고된 것보다는 높은 몰 활성으로 표지되었다 (24, 26, 27). 높은 몰 활성은 [¹⁸F]6에 대한 높은 콘트라스트 정적 PET 이미지에 기여했을 수도 있지만, 마찬가지로 높은 몰 활성은 또한 VLA-4에 대해 4.6배 및 23배 더 높은 시험관내 결합 친화성이 확인된 기존에 보고된 [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A 추적자 2종에서도 달성되었다. 그러나, 기존 사례 2종 모두, 종양 흡수 값이 본원에서 확인된 값보다 2-3배 낮았다.

특히, 6과 선행 AMBF₃-PEG₂-LLP2A 접합체 (도 8) 간의 유일하게 인지가능한 차이는 DOTA 모이어티로서, 본 발명자들은 이 모이어티가 더 높은 종양 흡수 값과 선호적인 신장 소거에 주로 기여하는 것으로 제안하였다. 반면, 본 발명자들이 기존에 발표한 [¹⁸F]RBF₃-PEG₂-LLP2A는 [¹⁸F]6에 비해 소수성이 더 강하고 (HPLC 체류 차이에 의해 입증됨); 그래서, 이들 유도체는 비장 체류성이 ~3 내지 ~5배 낮았으며, GI 관에 ~11배 높은 수준으로 축적되었다. 일반적으로, 이러한 결과는, 다른 결과와 더불어, LLP2A 생물접합체의 소거 경로에 영향을 미치는 수단으로서 (즉, 신장 대 간담도), 고 친수성 모이어티 (기존에는 포스페이트 및 카르복실레이트가 사용되었고, 본원에서는 DOTA를 이용함)의 부착을 뒷받침해준다. DOTA는, 신장 소거에 유리하기 위해 사용된 다른 화학적 관능기들과는 다르게, 다양한 비-방사능 금속 (예, Zn^{2 +}, Ca^{2 +})이 킬레이트화되어 생체내 PK/PC에 대한 효과를 ¹⁸F-PET 영상화를 통해 추가로 연구할 수 있으므로, 추가적인 이점을 제공할 수 있다. 또한, PET 영상화에서는 F-18에, 치료시에는 방사성 금속에 각각 의존하는, 동반 이중-동위원소 "핫-콜/콜드-핫" 동위원소 치환 테라노스틱스 (예, ¹⁸F/¹⁷⁴Lu 및 ¹⁹F/¹⁷⁷Lu)의 개발 가능성도 쉽게 예상할 수 있다.

본 실시예에서는, ¹⁸F-표지된 RBF₃-PEG₂-LLP2A의 종양 흡수를 간단한 합성 방식으로 도입할 수 있는 친수성 금속-프리 DOTA를 이용함으로써 강화하고, ¹⁸F-표지를 높은 몰 활성에서 동위원소 교환에 의해 진행할 수 있음을, 보여준다. 생체내 PET 영상화 및 생체분포 실험에서, DOTA 모이어티는 방사성 추적자의 축적을 GI 관에서 RES로, 특히 대부분 비장으로 전환하는 것으로 확인되었다. 본 발명자들은 VLA-4 표적 영상화에서 크게 개선된 ¹⁸F-표지된 LLP2A 방사성 추적자를 제시하였는 바, 부착된 DOTA가 추적자의 소거를 조정하기 위한 새롭고 유용한 기로서 작용하는 것으로 보인다. 이는 물론 다른 ¹⁸F-표지된 방사성 보결기를 사용해 용도를 찾을 수도 있다.

실시예 2: PSMA -617- LysAMBF3 - DOTA

AMBF ₃ 및 Fmoc - LysN ₃ -OH는 다음과 같이 발표된 공정에 따라 제조하였다. Perrin et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 11876-11880. Nakahara et al., 테트라hedron Lett . 2008, 49, 5492-5494.

I. Fmoc-LysAMBF ₃ -OH

소듐 아스코르베이트 (0.01 mol) 1.98 g을 탈이온수 10 mL에 용해하여 신선한 1 M 소듐 아스코르베이트 원액을 제조하였다. 무수 Cu(II)SO₄ (0.01 mol) 1.60 g을 탈이온수 10 mL에 용해하여 1 M Cu(II)SO_{4 (aq)} 원액을 제조하였다. AMBF ₃ (414.6 mg, 2.513 mmol, 5.24 당량)를 플라스크에 넣고, (3:2) MeCN:H₂O (v/v) (2.5 mL)에 용해하였다. 1 M Cu(II)SO_{4 (aq)} (1.5 mmol, 3.1 당량) 1.5 mL을 먼저 첨가한 다음 1 M 소듐 아스코르베이트 (3 mmol, 6.2 당량) 3 mL을 첨가하였다. 그런 후, 이 용액에 Fmoc - LysN ₃ -OH (189.1 mg, 0.479 mmol, 1 당량)를 첨가하였다. 이후, 용액에 K₂CO₃ (101.1 mg, 0.732 mmol, 1.5 당량)를 첨가하여 pH 7로 중화하였다. 용액을 45℃에서 16시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공 여과하여 석출물을 제거한 다음 여과물을 회전식 증발에 의해 농축하였다. 건조된 산물을 (1:1) MeOH:DCM (v/v) (5 x 10 mL)에 재현탁하고, 진공 여과하여 석출물을 제거한 다음, 여과물을 회전식 증발에 의해 건조하였다. 건조된 산물을 이후 (5:95) MeOH:DCM (v/v) (5 x 10 mL)에 재현탁하고, 진공 여과하여 석출물을 제거한 다음, 여과물을 다시 회전식 증발에 의해 건조하였다. 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 230-400 메쉬, 50 g; 용매 (1:4:95) AcOH:MeOH:DCM (v/v))를, TLC (1:10:90 AcOH:MeOH:DCM (v/v), 산물의 R_f = 0.21, 254 nm UV 램프에서 가시화 가능, I₂로 염색/Silica)에 의해 용출 분획을 모니터링하면서, 수행하였다. 순수한 분획은 회전식 증발기에 의해 농축하고, 추가적으로 진공 건조하였다. 이로써 Fmoc - LysAMBF ₃ -OH (192.0 mg, 0.343 mmol)가 어두운 노란색 오일로 71% 수율로 수득되었다. ¹H NMR (300 MHz, CD₃CN) δ (ppm): 1.27 - 1.91 (m, 6H), 2.30 (d, J = 4.57 Hz, 2H), 2.95 (s, 6H), 4.11 (q, J = 5.00 Hz, 1H), 4.22 (t, J = 6.90 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 7.08 Hz, 2H), 4.38 (t, J = 6.97 Hz, 2H), 4.44 (s, 2H), 6.02 (d, J = 5.94 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.30 Hz, 2H), 7.42 (t, J = 7.50 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 4.34 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 7.54 Hz, 2H), 8.02 (s, 1H). ¹³C NMR (75 MHz, CD₃CN) δ (ppm): 23.22, 30.19, 31.56, 47.97, 50.79, 53.45, 54.73, 61.28, 67.20, 120.93, 126.16, 128.07, 128.43, 128.65, 137.30, 142.07, 145.08, 157.09. ¹⁹F NMR (282 MHz, CD₃CN) δ (ppm): -138.16 (m, 3F). ESI-MS(-): C₂₇H₃₃BF₃N₅O₄에 대한 계산치 559.4 m/z; 실측치 [M-H]- = 558.5 m/z 및 [M+I]- = 686.4 m/z. 스펙트럼 특정화는 도 33-37을 참조한다.

II. Fmoc - LysAMBF ₃ -O- NHS

Fmoc - LysAMBF ₃ -OH (163.3 mg, 295.5 μmol, 1 당량)를 플라스크에 투입하고, (1:1) DCM:MeCN (v/v) 8 mL에 용해하였다. 다이사이클로헥실카르보디이미드 (DCC) (305 mg, 1.48 mmol, 5 당량)를 이 용액에 첨가한 다음 N-하이드록시숙신이미드 (NHS) (170 mg, 1.48 mmol, 5 당량)를 첨가하였다. 이 용액을 RT에서 21시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 소결 깔때기를 사용해 진공 여과하고, 수집한 여과물을 회전식 증발기에 의해 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (컬럼 직경 = 0.5 cm; 실리카 겔 (230-400 메쉬), 10 g; DCM에서 시작해 50 mL 당 CH₃CN을 10% (v/v) 씩 증가시켜 (1:1) DCM:MeCN (v/v)까지 농도구배)를, TLC (1:1 DCM:CH₃CN, 산물의 R_f = 0.52, 254 nm UV 램프에서 가시화 가능, I₂로 염색/Silica)에 의해 용출 분획을 모니터링하면서, 수행하였다. 순수한 분획들은 합치고, 회전식 증발기에 의해 농축한 다음 추가적으로 진공 건조하였다. 이로써 Fmoc - LysAMBF ₃ -O- NHS (118.3 mg, 180.2 mmol)가 노란색 오일로서 61% 수율로 수득되었다. ¹H NMR (300 MHz, CD₃CN) δ (ppm): 1.36 - 1.91 (m, 6 H), 2.24 - 2.34 (m, 2 H), 2.74 (s, 4 H), 2.93 (s, 6 H), 4.21 (m, J = 6.85 Hz, 1 H), 4.30 - 4.34 (m, 2 H), 4.38 (t, J = 7.08 Hz, 2 H), 4.43 (s, 2 H), 4.43 - 4.52 (m, 1 H), 7.31 (t, J = 7.30 Hz, 2 H), 7.40 (t, J = 7.30 Hz, 2 H), 7.63 (d, J = 7.31 Hz, 2 H), 7.81 (d, J = 7.54 Hz, 2 H), 8.01 (s, 1 H). ¹³C NMR (75 MHz, CD₃CN) δ (ppm): 22.96, 26.32, 30.02, 31.46, 47.86, 50.74, 53.23, 53.46, 61.22, 67.54, 120.93, 126.12, 128.07, 128.45, 128.67, 137.33, 142.05, 144.93, 156.90 169.56, 170.75. ¹⁹F NMR (282 MHz, CD₃CN) δ (ppm): -138.13 (m, 3F). ESI-MS(+): C₃₁H₃₆BF₃N₆O₆에 대한 계산치 656.5 m /z; 실측치 [M+Na]⁺ = 679.8 m /z. 도 38-41을 참조한다.

III. PSMA -617-NH2

수지 상의 PSMA -617- Fmoc는 발표된 공정에 따라 SPPS에 의해 합성하였다. Eder et al., J. Nucl . Med . 2015, 56, 914-920.

수지 상의 PSMA -617- Fmoc (45.6 mg, 15.1 μmol)를 에펜도르프 튜브에 넣었다. DMF (400 ㎕)를 첨가하여, 로티세리 셰이커에 샘플을 장착함으로써 30분간 수지를 팽윤시켰다. 혼합물은 원심분리하여 침전시키고, 상층액은 제거하였다. 수지에 (1:4) 피페리딘:DMF (200 ㎕)를 첨가하고, 혼합물을 로티세리 셰이커를 사용해 RT에서 30분간 교반하였다. 혼합물을 원심분리하여 침전시키고, 상층액을 제거하였다. DMF (3 x 200 ㎕)를 사용해 수지를 볼텍싱에 의해 헹군 다음 원심분리하여 상층액을 제거하였다. (3:7) HFIP:DCM (200 ㎕)을 첨가하여 수지로부터 산물을 절단시키고, 혼합물을 로티세리 셰이커에서 30분간 교반하였다. 산물 혼합물을 1 mL 파이펫 필터를 통해 여과하여 수지를 제거하고, 여과물은 불리된 에펜도르프 튜브에서 수집하였다. 혼합물은 부피가 약 50 - 100 ㎕이 될 때까지 부드럽게 공기를 블로잉함으로써 농축시켜 침전시켰다. 차가운 다이에틸 에테르 (1 mL)를 첨가하여 산물을 분쇄하였다. 산물은 볼텍싱하고, 원심분리하여 침전시켰다. 그런 후, 상층액을 제거하고, 산물을 DMF 50 ㎕에 용해하였다. 추가로 세척하기 위해 다이에틸 에테르 (1 mL)를 첨가하고, 혼합물을 볼텍싱 후 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 혼합물은 스피드-벡에 의해 건조시켜, 예상한 PSMA -617-NH ₂ 를 정량적인 수율로 수득하였다 (11.6 mg, 15.1 μmol). ESI-MS(+): C₄₁H₆₁N₅O₉에 대한 계산치 767.97 m /z; 실측치 [M+H]⁺ = 768.7 m /z. TLC (2:98) MeOH, 산물의 Rf = 0.29, 254 nm UV 램프에서 가시화 가능). 데이터는 도 42를 참조한다.

IV. PSMA -617- LysAMBF ₃ - NH ₂

PSMA -617-NH ₂ (12.2 mg, 9.3 μmol, 1 eq.)를 에펜도르프 튜브에서 (1:19) DIPEA:DMF (200 ㎕)에 용해하고, Fmoc - LysAMBF ₃ -O- NHS (25.2 mg, 38.4 μmol, 4.1 eq.)가 수용된 별도의 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 로티세리 교반기를 사용해 교반하였다. 혼합물은 부피가 약 50 - 100 ㎕이 될 때까지 스피드-벡을 사용해 농축하였다. 차가운 다이에틸 에테르 (1 mL)를 첨가하여 산물을 석출시켰다. 그런 후, 혼합물을 볼텍싱하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 산물을 용해시키기 위해 산물에 DMF를 최소량 (50 ㎕)으로 첨가하고, 다이에틸 에테르 (1 mL)를 첨가해 조산물을 헹구었다. 혼합물을 볼텍싱하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그런 후, 산물을 스피드-벡을 사용해 건조시켰다. 이후, MeCN (500 ㎕)을 첨가해 용해하고, 과량의 Fmoc - LysAMBF ₃ -O- NHS를 제거하였다. 혼합물을 원심분리하여 침전시키고, 과량의 시약이 함유된 상층액은 제거하였다. 산물을 스피드-벡에서 1회 이상 건조시켰다. 산물 PSMA -617- LysAMBF ₃ - Fmoc 샘플 소량을 MS를 위해 MeOH에 용해하였다. ESI-MS(+): C₆₈H₉₂BF₃N₁₀O₁₂에 대한 계산치 1309.35 m /z; 실측치 [M-F]⁺ = 1290.1 m /z, [M+Na]⁺ = 1332.0 m /z. TLC (1:19 NH₄OH:EtOH, 산물의 R_f = 0.42, 254 nm로 가시화 가능). 도 43을 참조한다.

PSMA -617- LysAMBF ₃ - Fmoc를 (1:4) 피페리딘:DMF (200 ㎕)에 용해하여 Fmoc를 제거하였다. 반응은 로티세리 교반기에서 혼합하여 30분간 RT에서 수행하였다. 부피가 약 50 - 100 ㎕가 될 때까지 혼합물을 스피드-벡을 사용해 농축하였다. 차가운 다이에틸 에테르 (1 mL)를 첨가하여 산물을 석출시켰다. 그런 후, 이를 볼텍싱하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 산물에 DMF를 최소량 (50 ㎕)으로 첨가하여 용해시켜, 다이에틸 에테르를 1회 이상 세척하였다. 혼합물을 볼텍싱하고, 원심분리하였다. 상층액을 제거한 다음 산물을 스피드-벡을 사용해 건조시켜, PSMA -617-LysAMBF ₃ -NH ₂ 가 함유된 조 혼합물을 수득하였다. ESI-MS(+): C₅₃H₈₂BF₃N₁₀O₁₀에 대한 계산치 1087.10 m /z; 실측치 [M-F]⁺ = 1068.1 m /z, [M+H]⁺ = 1088.1 m /z, [M+Na]⁺ = 1110.1 m /z. TLC (1:19 NH₄OH:MeOH, 산물의 Rf = 0.23, 254 nm UV 램프에서 가시화 가능, 닌하이드린으로 염색). 도 44를 참조한다.

V. PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA

DOTA - NHS · HPF ₆ · TFA (20.2 mg, 26.2 μmol, 2.8 eq.)의 무게를 측정하여, 조산물 PSMA -617- LysAMBF ₃ -NH ₂ (max. 9.3 μmol, 1 eq.)에 에펜도르프 튜브에서 첨가하였다. 혼합물에 (1:19) DIPEA:DMF (v/v)를 첨가하여 2시간 동안 RT에서 로티세리 교반기를 사용해 교반하였다. 부피가 최소 (50 - 100 ㎕)가 될 때까지 혼합물을 스피드-벡으로 농축하고, 혼합물을 다이에틸 에테르 (1 mL)를 사용해 석출시켰다. 혼합물을 볼텍싱하고, 원심분리하였다. 상층액을 제거한 다음 산물을 스피드-벡을 사용해 건조시켰다. (95:2.5:2.5) TFA:TIPS:H₂O (v/v/v) (200 ㎕)를 첨가해 Tert-부틸을 탈보호화하고, 이 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 후, 혼합물은 부피가 50 - 100 ㎕가 될 때까지 부드럽게 공기를 블로잉하여 농축시켰다. 다이에틸 에테르 (1 mL)를 첨가하여 산물을 석출시키고, 혼합물을 볼텍싱한 다음 원심분리하였다. 상층액을 제거한 다음 혼합물을 스피드-벡에 의해 건조시켜, PSMA -617-LysAMBF ₃ -DOTA를 함유한 조산물 잔류물 (33 mg)을 수득하였다. ESI-MS(+): C₆₁H₉₃BF₃N₁₃O₁₇에 대한 계산치 1360.31 m /z; 실측치 [M-3F-2H]⁺ = 1302.1 m /z, [M+H]⁺ = 1362.1 m/z. 도 45를 참조한다.

조산물 잔류물 (33 mg)을 (1:1) MeCN:H₂O (+ 0.1% 포름산) (1mL)에 용해하고, HPLC에 의해 정제하였다 (컬럼: Agilent Eclipse XDB-C18, 5 μm, 9.4 mm x 250 mm; 유속: 2 mL/min; UV-vis 검출기: 276 nm; 농도 구배: 19분간 15% -> 65% MeCN:H₂O (+ 0.1% 포름산)). 피크들을 9.25분에 수집하였다. 산물을 50 mL 팔콘 튜브에 수집하여, 드라이 아이스에서 냉동시켰다. 완전히 냉동되면, 수집한 분획을 동결건조하여 순수한 PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA (2.5 mg, 1.8 μmol, 19%)를 수득하였다.

VI. PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA(Cu)

PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA (44.2 mg, 31.1 μmol)에 0.1M CuCl₂-NaOAc (1.55 mL, pH = 4)를 MeCN (1.5 mL)과 함께 처리하여, PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA(Cu)를 합성하였다. 혼합물을 65℃ 핫 플레이트에 30분간 두었다. 그런 후, 혼합물을 스피드-벡을 사용해 농축하여, 예상된 구리-킬레이트를 함유한 조산물 잔류물을 수득하였다. ESI-MS(+): C₆₁H₉₀BCuF₃N₁₀O₁₀에 대한 계산치 1422.8 m /z; 실측치 [M-3F-2H]⁺ = 1362.8 m/z,[M-F]⁺ = 1402.8 m/z, [M+H]⁺ = 1423.8 m /z, [M+Na]⁺ = 1444.8 m /z.

조산물 잔류물 (44.2 mg)을 (1:1) MeCN:H₂O (+ 0.1% 포름산) (1 mL)에 용해한 다음 HPLC에서 정제하였다 (컬럼: Agilent Eclipse XDB-C18, 5 μm, 9.4 mm x 250 mm; 유속: 2 mL/min; UV-vis 검출기: 276 nm; 농도 구배: 23분 동안 15% -> 40% MeCN:H₂O (+ 0.1% 포름산)). 산물을 50 mL 팔콘 튜브에서 수집한 다음 드라이 아이스에서 냉동시켰다. 완전히 냉동되면, 수집한 분획을 동결건조하여, 순수한 PSMA-617-LysAMBF ₃ -DOTA(Cu) (8.5 mg, 6.0 μmol, 19%)를 수득하였다. 도 46을 참조한다.

VII. PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA 또는 PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA(Cu)의 ¹⁸ F-표지

80 nmol ¹⁹ F- PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA 또는 ¹⁹ F- PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA(Cu)를 폴리프로필렌 튜브에서 수성 피리다진-HCl 수성 완충제 (15 ㎕, 1M, pH = 2), DMF (15 ㎕) 및 수성 KHF₂ (4 ㎕, 5 mM)에 재현탁하였다. H₂ ¹⁸O를 18 MeV 양성자로 충돌시킨 후 음이온 교환 컬럼에서 (9 mg, QMA, 클로라이드 형태) 포획함으로써, 담체 부가되지 않은 ¹⁸F-불화물을 수득하여다. ¹⁸F-불화물을 식염수 (100 ㎕)를 사용해 반응 용기로 용출시켰다. 반응 혼합물을 진공 하에 20분간 80℃에서 가열하고, 40 mM 수성 암모늄 포르메이트 (2 mL)로 희석하였다. 용액을 반-분취용 컬럼에서 (30:70) MeCN/물 (+0.1% TFA)(v/v)로 유속 4.5 mL/min으로 용출시켜 HPLC에 의해 정제하였다. 체류 시간은 킬레이트화된 추적자 및 킬레이트화되지 않은 추적자 둘다 약 10분이었다. 붕괴-교정한 방사화학적 수율은 ¹⁸ F- PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA 또는 ¹⁸ F- PSMA -617- LysAMBF ₃ - DOTA(Cu)에 대해 각각 1.0 ± 0.3% (n = 3) 또는 2.7 ± 0.7% (n = 3)이었다. 방사성 HPLC에 의해 확인된 바와 같이 표지된 추적자들 둘다 방사화학적 순도는 >99%이었다. 비활성을 분석용 HPLC 시스템을 사용해 측정하였다. 이는 최종 산물 용액내 주입된 방사성 (1.5 - 3 mCi)을 주입 용액내 중량으로 나누어 계산하였다. 주입한 산물의 중량은 주입으로부터 수득한 UV 흡광도를 기존에 준비한 표준 곡선과 비교하여 추정하였다. 비활성은 ¹⁸F-PSMA-617-LysAMBF₃-DOTA 또는 ¹⁸F-PSMA-617-LysAMBF₃-DOTA(Cu)의 경우 각각 3.7 ± 2.5 Ci/μmol (n = 3) 또는 4.8 ± 2.2 Ci/μmol (n = 3)이었다.

결과

표 7은 PSMA를 발현하는 LNCaP 전립선암 이종이식편을 가진 마우스에서 F-18 표지된 PSMA-617-Lys-AMBF3-DOTA의 생체분포 (주사 후 1시간)를 보여준다. PSMA-617-LysAMBF3-DOTA의 구조는 도 2에 도시된다. 도 4는 LNCaP 전립선암 이종이식편-보유 마우스에서 F-18 표지된 PSMA-617-Lys-AMBF3-DOTA의 최대 강도 투사 PET 이미지 (주사 후 1시간)를 도시한다.

표 7: PSMA를 발현하는 LNCaP 전립선암 이종이식편을 가진 마우스에서 F-18 표지된 PSMA-617-Lys-AMBF3-DOTA의 생체분포 (주사 후 1시간).

장기/조직	흡수 (%ID/g)
	베이스라인 (n = 5)	차단 (n = 5)
혈액	0.76 ± 0.25	0.82 ± 0.43
뇨	270.38 ± 148.78	1093.02 ± 468.46
지방	0.93 ± 0.20	0.18 ± 0.08
정액	6.60 ± 8.78	1.32 ± 2.04
고환	0.56 ± 0.11	0.31 ± 0.18
장	0.48 ± 0.10	0.76 ± 0.24
위	0.14 ± 0.06	0.22 ± 0.23
비장	4.14 ± 2.35	0.27 ± 0.06
간	0.29 ± 0.07	0.40 ± 0.11
췌장	0.36 ± 0.09	0.17 ± 0.06
부신	2.77 ± 0.94	0.28 ± 0.18
신장	131.54 ± 56.67	6.70 ± 4.19
폐	1.81 ± 0.40	0.74 ± 0.28
심장	0.34 ± 0.09	0.30 ± 0.14
종양	10.64 ± 4.00	0.78 ± 0.26
근육	0.25 ± 0.06	0.40 ± 0.35
뼈	0.57 ± 0.05	1.73 ± 0.70
뇌	0.03 ± 0.01	0.03 ± 0.01
꼬리	0.98 ± 0.18	1.85 ± 0.33
갑상선	0.68 ± 0.23	0.28 ± 0.12
침샘	1.70 ± 0.58	0.28 ± 0.09
눈물샘	0.16 ± 0.10	0.19 ± 0.26
종양/근육	41.55 ± 10.83	2.91 ± 1.65
종양/혈액	14.19 ± 3.85	1.01 ± 0.23
종양/신장	0.09 ± 0.03	0.13 ± 0.04

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실시예 3 및 4: DOTA - Lys ( AMBF3 )-RM2 ( DOTA - Lys - AMBF3 -4-아미노-1- 카르복시메틸 -피페리딘-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH ₂ ) 및 DOTA - Lys ( AMBF3 )-BK의 합성 및 특정화

결과 및 고찰

DTPA 합성

다이에틸렌펜타아세트산 (DTPA)은 방사성 금속 (예, ⁶⁴Cu)의 샤페론으로서 치료학적 약물 및 진단 약물 둘다를 합성하는데 사용되는 산성 킬레이터이다.²⁵ 이 킬레이터는 펩타이드와의 접합에 이용가능한 5개의 아암을 가지고 있어, 아암 자체는 용도에 특이적인 설계로 보호되어야 한다. 이를 위해, 고상 화학 반응에서는 자유 아암 하나가 바람직하고, 나머지 아암 4개는 산-취약성 보호기 (화합물 4)에 의해 보호하여야 한다. 그런 후, 수지로부터 펩타이드를 산성 TFA로 최종 절단한 다음 이들 보호기를 제거할 수 있다. 이러한 설계 개념은 문헌으로부터 수정된 합성 반응식 3이 도출되었다:^{26 , 27}

반응식 3. DTPA의 합성 반응식.

상업적으로 구입가능한 에탄올아민을 2 당량의 t--부틸브로모아세테이트와 염기성 조건에서 혼합하여, 화합물 4의 합성을 수행하였다. 다이에틸 에테르로 추출한 다음 소듐 바이카보네이트 및 브린으로 헹군 후, 오일성 잔류물을 실리카 컬럼에서 정제하였다. 정제시, 화합물 1 거의 3 g을 71% 수율로 정제되었으므로, 규모 확장이 가능하였다. 이 화합물의 ¹H-NMR에서 고 순도가 확인되었으며, 물 및 헥산 신호는 무시가능한 수준이었다 (부록 참조). 이후, 터셔리 아미노알코올에 DCM 중의 NBS/PPh₃를 무수 조건에서 처리하여 화합물 1에 2로 변환하고, 71% 수율로 정제하였다. 반응이 끝나면, 짧은 실리카 컬럼에서 반응 조 혼합물로부터 트리페닐포스핀옥사이드 부산물을 여과 제거한 다음, 원하는 산물을 2차 실리카 컬럼에서 5:1 헥산/다이에틸 에테르를 적용해 정제하였다. 이 화합물의 순도는 ¹H-NMR에 의해 검증하였고, ESI-MS에서 예상된 브롬 동위원소 패턴이 확인되었다 (데이터 도시 안함).

이 시점에, 적합한 글리신 에스테르는 2를 사용해 2회 알킬화하여, DTPA 유도체 (3)를 수득하였다. 본 발명자들은, 먼저, 사포닌화 반응을 통해 메틸 기를 쉽게 제거하는 방안을 구상하였기에 메틸 에스테르를 선택하였으며, 이로써 영향을 받지 않은 다른 아암 4개에는 tert-부틸 보호기가 남게 된다. 이를 위해, 3a의 합성은 소듐 포스페이트 염으로부터 제조한 포스페이트-완충화된 아세토니트릴 수용액에서 수행하였다. 공교롭게도, 포스페이트의 용해성이 낮아, 주위 온도가 떨어지면 염이 종종 석출되었다. 그래서 대신 포스페이트의 모노- 및 다이-포타슘 염을 사용해 완충제를 제조하였으며, NaOH 또는 HCl 수용액을 첨가하여 pH 8로 적정하였다. 아세토니트릴과 혼합하였을 때 진하게 농축된 용액이 2상 시스템을 형성하였다. 24시간 후, 이 혼합물을 여과하고, 유기층은 제거한 다음 증발시켰다. 남아있는 무기 염을 제거하기 위해, 비정질 오일을 CHCl₃에 용해하여 다시 여과하였다. 이 화합물은, 터셔리 아미노 기 3개가 산성 실리카에서 쉽게 양성자화될 수 있어. 크로마토그래피로 정제하기 어려웠다. 실망스럽게도, 실리카를 트리에틸아민으로 전처리하고 1% 트리에틸아민으로 용출시키는 경우에도, 여전히 완전히 정제하기 어려웠다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 메틸 에스테르 (4)의 사포닌화 반응을 수행하기 위해 순수하지 않은 3a를 LiOH 수용액 1 당량에 첨가하기로 하였다. TLC에서 확인된 바와 같이 반응이 완료되면, 산물을 다이에틸 에테르로 추출하였다. 질량 분광측정 분석에서 모노-탈보호된 DTPA 부가생성물의 존재가 검증되었으며, 이는 m/z = 640에서 [M+Na⁺] 신호를 나타낸다 (데이터 도시 안함). 사포닌화로 일부 원하는 물질이 형성되었지만, 반응이 깨끗하지도 고 수율도 아니었다. 본 발명자들은, 사포닌화 조건이 산물의 정제를 방해하는 것으로 추정하였으며; 실제, 문헌 조사에서 모노-메틸 테트라-tert-부틸-보호된 DTPA (3a)의 합성은 보고된 바 없는 것으로 확인되었다. 벤질-보호된 글리신 에스테르를 대신 채택하였으며, 팔라듐-촉매화된 수소화 반응으로 원하는 산물 (3b)을 수득하였다.^{26, 28}

3b를 합성하기 위해, 먼저 글리신 벤질 에스테르를 벤질 글리시네이트 p-톨루엔설포네이트의 염으로부터 에테르/카보네이트 추출에 의해 분리하여 바로 사용하였다. 이를 화합물 2와 비슷한 조건 (상기 참조)에서 반응시켜, 벤질-보호된 DTPA를 27% 조산물 수율로 수득하였다. 또 다시, 관능기의 특성으로 인해, 크로마토그래피에 의해 정제하기 곤란하였으며, 완벽하게 진행하지 못하였다. 다른 정제 방법 (예, 산성/염기성/중성 알루미나, C18 역상, 증류)은 조사하지 않았다. 오히려, 조산물 3b를 MeOH 중에서 팔라듐-촉매화된 수소화 반응에 의해 밤새 81% 수율로 탈보호화하였다. 반응이 완료되면, 혼합물을 소결 유리 여과기에서 여과하여 Pd/C 고형물을 제거하였다. 흥미롭게도, 화합물 4는 ¹H-NMR에서 검증된 바와 같이 (부록 참조) 추가적인 정제가 필요하지 않았다. 전체 수율은 4 단계에 걸쳐 11.4%이었다.

새로운 AMBF ₃ 합성

연구 계획상 이 시점에, 본 발명자들은 DTPA 킬레이터 (4)의 합성에서 임의의 펩타이드 쇄를 병합할 수 있는 새로운 트리플루오로보레이트의 구축으로 관심을 전환하였다. 다이메틸암모니오메틸트리플루오로보레이트 (AMBF₃) (7)는, 높은 가수분해 안정성, 제조 용이성 및 구리-보조된 아지드-알킨 사이클로 부가 반응의 유용성으로 인해, 이를 전구체로 선택하였다.¹⁹ 실제, pH 7.5에서 상당한 희석 조건 (~ 5 mM)에서도, 화합물 7은 유리 불화물을 도 4에 나타낸 바와 같이 매우 느리게 1차 속도로 상실하였다.¹⁹ 이러한 시험관내 안정성과, 화합물 7의 합성 용이성으로 인해, AMBF₃ 아키텍처는 PET 영상화제로서 고유한 표적이 되었다.

화합물 6는 상업적으로 구입가능한 요오도메틸보로네이트 피나콜 에스테르와 N,N-다이메틸프로파길아민을 다이에틸 에테르에서 동일 몰로 반응시켜 수득하였다 (반응식 4 참조). 신속하게 염 석출 후 여과하여, NMR-순도의 산물을 >90% 수율로 수득하였다 (부록 참조). pH 2에서 KHF₂로 불소화하여, 화합물 7을 수득하였다 (반응식 4 참조). 이를 짧은 실리카 플러그를 통해 20% ACN/EtOH로 용출시킴으로써 유리 불화물을 제거하였다. 산물은 ¹H-NMR에서 δ = 1.15 ppm을 나타내었으며, 이는 피나콜 다이올 불순물을 의미한다. 아울러, 플루오라이드 염 KBF₄ (¹⁹F-NMR -150 ppm에서 관찰됨), 용해된 실리케이트 및 기타 비-특정 무기 불순물과 같은 불순물로 인해 반응 수율이 종종 200% - 300%이었다. 이러한 문제를 일부 해결하기 위해, 조산물 고형물을 다이에틸 에테르 중에서 취하여, 다시 여과하였다. 수득한 백색 분말은 여전히 제거되지 않은 KBF₄ 불순물을 제외하고는 ¹H-NMR 및 ¹⁹F-NMR 순도였다.

반응식 4. AMBF ₃ (7) 합성 반응식.

알킬 트리플루오로보레이트의 전자 특성에 대한 혁신적인 논의는 화합물 6 및 7에 대한 ¹H-NMR 스펙트럼을 토대로 이루어질 수 있다. 이들 2종의 화합물이 용해성이고 대상 신호를 간섭하지 않는 유일한 용매인 D₂O에서, 2가지 NMR 실험을 수행하였다. 암모늄 기와 붕소 간의 메틸렌 양성자 신호는 불소화되었을 때 크게 이동하였다. 구체적으로, 6의 2H 싱글렛이 δ = 3.09 ppm에 위치하지만, 화합물 7의 경우에는 신호가 δ = 2.55 ppm에 위치한다 (부록 참조). 화합물 7에서 붕소는 더욱 차폐된 NMR 환경을 제공하는 포멀 음 전하 (formal negative charge)를 가진 것이 분명하였지만, 불소 원자 3개의 존재가 메틸렌 양성자에 대해 고도의 전자-구인성 (따라서, 탈-차폐성) 환경을 조성하였다. 이러한 상충되는 작용은, 업필드 이동이 D₂O와 MeOD 둘다에서 관찰되므로 (데이터 도시 안함), 실제 전자 차폐 (전자 공여)로 나타났다. 메틸렌 신호의 화학적 이동 변화와 더불어, 이의 외양이 강한 싱글렛에서 넓은 싱글렛 또는 가능하게는 멀티플렛으로 바뀌었다. 붕소-11에 대한 커플링은 화합물 6에 대한 스펙트럼에서 관찰되지 않았으므로, 제외시킬 수 있다. 따라서, 이는 불소-19에 원거리 커플링에 의해 또는 NMR 시간 범위 내에서 일부 입체구조적 불요성으로 인한 것으로 설명할 수 있다. 이러한 이론에 대한 검증은 철저하게 조사하지 않았다.

화합물 7 및 8의 ¹⁹F-NMR에서, ¹¹B-¹⁹F 커플링으로부터 예상된 1:1:1:1 사중선이 고 해상도로 관찰되지 않는다. ¹¹B는 핵 스핀이 3/2이지만, 이의 비교적 빠른 이완이 종종 표준 펄스 프로그램을 이용한 NMR 실험에서 분할 패턴의 가시화를 저해한다.^29-31 나타나는 것은 오히려 -140 ppm에서의 넓은 신호이다. 앞서 언급한 바와 같이, 화합물 7의 다이에틸 에테르 세척은 테트라플루오로보레이트 염 불순물을 제거하는데 성공적이지 못하였으며, 그래서 이에 대한 신호가 화합물 7에서 -150 ppm 위치에서 나타난다. 그러나, 다음 단계에서 수득한 변형된 AMBF₃ 잔기에서는 -150 ppm 위치에서 신호가 나타나지 않는다. 화합물 6, 7 및 8에 대한 ¹¹B-NMR 분석에서, 피크들이 매우 넓고 (5 ppm), 즉 분할된 패턴을 얻을 수 없으므로 (데이터 도시 안함), 어떠한 추가적인 정보도 설명하지 못하였다는 점에 유념하여야 한다.

클릭 반응에서 아지드 파트너는 변형된 라이신 잔기 (5) 형태를 취하였다. 반응식 5에 나타낸 바와 같이, 이러한 짧은 합성 프로토콜은 필요한 트리플루오로보레이트 관능기를 표준 고상 펩타이드 합성으로 병합하는데 이용할 수 있는 잠재적으로 다재다능한 펩타이드 빌딩 블록을 제공해 줄 것이다. 이런 점은, Perrin 등에 의해 기존에 이용된 아릴트리플루오로보레이트는 고상 지지체로부터 절단 및 HPLC 정제한 후 펩타이드에만 부착할 수 있었으므로, 중요한 차이가 있다. 최근 2년 동안, 몇몇 간행물들에서는 이 기술을 주로 RGD의 아지드-유도체와 알킨-ArBF₃s 간의 구리-촉매화된 클릭 반응에 집중하였다.^{18 , 32-35} 알킨-치환된 아릴트리플루오로보레이트는 SPPS에서 수지 절단하는데 필수적인 낮은 pH에서는 불안정하기 때문에, 이를 이용해 펩타이드를 합성 및 정제하기 어려웠다. 실제, 심지어 HPLC에 0.1% TFA/H₂O 용매 시스템을 이용하는 경우에도 아릴트리플루오로보레이트가 분해되었다.¹⁹ 2.3장에서의 논의는, 새로운 라이신-AMBF₃와 접합된 펩타이드 2종의 안정성을 개략적으로 보여줄 것이다. 5를 합성하기 위해, DCM 중의 NaN₃ 및 Tf₂O 혼합물을 Fmoc-Lys-OH에 첨가하였다. 이 반응의 기전은, 라이신의 ε-아미노 기에 친전자체를 제공하는 트리플루오로메탄설포닐 아지드 (트리플릭 아지드) 중간산물을 경유하여 진행된다. 이러한 2차 반응 중간산물은 새롭게 방출된 아지드 음이온에 의해 ε-탄소에서 공격받게되어 Fmoc-Lys(N₃)-OH (5)가 86% 수율로 수득된다.

반응식 5. Lys ( AMBF ₃ ) ( 8)의 합성 반응식.

2001년에 샤플리스와 공동 연구자들에 의해 처음에 언급된 클릭 반응은, "모듈식, 넓은 범위, 높은 수율, 입체특이성 및 무해한 부산물만 생성"하는 임의의 방응으로서 정의된다.³⁶ 클릭 반응의 계속적인 외연 확장으로 가장 널리 사용되는 예는 60년대 초에 롤프 휘스겐에 의해 개발된 구리-촉매화된 아지드-알킨 고리 부가 반응이다.³⁷ 이 화학 반응은 알킨 화합물 7 및 아지드 화합물 5를 이용해 화합물 8을 합성하기 위해 채택되었다. 8의 합성은 반응 조건의 최적화와 재현성 문제로 인해 어려움을 겪고 있었다 (표 8).

표 8. Lys(AMBF ₃ )를 합성하기 위 한 반응 조건들.

	규모 (화합물 5)	pH	워크업	염 제거	크로마토그래피 시스템	수율	순도	건조 방법	1M CuSO 4 / 아스코르베이트 당량
1	250 μmol	~7	x	비-세척	비-정제	<10%	비-정제	비-수행	0.1/0.2
2	250 μmol	~7	x	비-세척	비-정제	<10%	비-정제	비-수행	1/2
3	250 μmol	~4-5	x	비-세척	비-정제	<10%	비-정제	비-수행	1/2
4	250 μmol	~7	x	비-세척	0% - 5% - 10% MeOH/DCM	<10%	NMR 순도	비-수행	1/2
5	250 μmol	~7	브린 세척	수성 w/u	0% - 5% - 10% MeOH/DCM	<10%	NMR 순도	비-수행	1/2
6	250 μmol	~7	x	DCM 세척	5% - 10% MeOH/DCM	65%	NMR 순도	비-수행	3/6
7	500 μmol	~7	x	DCM 세척	5% - 10% MeOH/DCM	40%	비-정제	비-수행	3/6
8	1 mmol	~7	x	DCM 세척	5% - 10% MeOH/DCM	<10%	비-정제	비-수행	3/6
9	125 μmol	~7	x	비-세척	비-정제	N/A	비-정제	SpeedVac	0.1/0.2
10	125 μmol	~7	x	비-세척	비-정제	N/A	비-정제	SpeedVac	0.5/1
11	125 μmol	~7	x	비-세척	비-정제	N/A	비-정제	SpeedVac	1/2

알킨 기질을 처음에 결합시키기 위해 소듐 아스코르베이트를 사용해 구리를 Cu(II)에서 Cu(I)로 인 시추 환원하였다. 전체 반응에서 용매는 대략 3:2의 ACN/H₂O이었다. 필요한 경우, 이 비율은 단일 상 시스템을 유지하도록 조정하였다. 모든 반응은 45℃에서 밤새 수행하였다. 환원제, 1M 소듐 아스코르베이트를 신선하게 준비하였다. Fmoc-Lys-(N₃)-OH는 9:1 DCM/MeOH에서 R_f = 0.37인 반면, 화합물 8은 R_f = 0.15에서 베이스라인에 근접하게 진행되므로, 반응 진행은 TLC에 의해 모니터링하였다. 반응 1 및 반응 2에서 24시간 동안 출발 물질이 산물로 유의하게 변환되지 않았다 (UV 가시화). 비슷한 문제는 반응 3에서도 나타났으며, 1M 소듐 바이카보네이트에 의해 중화되지 않았다. 반응 1-3과 비슷한 양상으로, 반응 4를 중화하였으며, 부가적으로 컬럼 정제하였다. 용매 시스템은 매우 느리게 정제되었으며, 산물이 여러 분획들에 걸쳐 용출되었다. 반응 5의 조 혼합물을 DCM 중에 취하고, 브린 (3 x 5 mL)으로 헹궈 무기 염을 제거하였다. 유기 추출물은 컬럼 정제에 더 적합하게 되었지만, 전체 반응 수율은 여전히 낮았다. 반응 6에서는 유기층에서 무기 염을 제거하기 위해 반응의 조 혼합물을 간단하게 DCM 추출하는 방법을 채택하였다. 이후, 유기 추출물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다 (수율은 65%임). 공교롭게도, 규모를 확장한 경우, 이 방법의 재현성은, 반응 7 및 8의 수율이 각각 45% 및 <10%로, 낮았다. 이 클릭 반응이 그람 규모의 조건에 맞지 않은 이유를 파악하기 위해서는 더 많은 통찰력이 필요하다. 화합물 8의 전체 수율은 4 단계에 걸쳐 56%인 것으로 계산되었다 (수렴 합성).

최근 들어, 혼합물 농축과 소듐 아스코르베이트에 대한 환원성 환경을 조성하기 위한 용액의 탈기 처리 이들 2가지에 의해 반응을 완료하기 위해, "건조 (dry-down)" 방법이 제안되었다. 반응 9 - 11을 구리 및 아스코르베이트의 당량을 증가시켜 수행하였다. 반응물은 정제하지 않았지만 TLC 플레이트에서의 육안 검사 결과, 건조 방법에 따른 눈에 띠는 향상은 없는 것으로 나타났다. 그러나, 24시간 후, 유의하게도, 반응 9 및 10에서 반응 11과 비교해 출발 물질이 더 많이 남아있는 것으로 확인되었다. 이는, 이 반응에 구리를 화학량론적인 양으로 또는 심지어 과량으로 사용하여야 함을, 의미한다.

고상 펩타이드 합성

최근, 서열에 Lys(AMBF₃) 잔기가 병합된 펩타이드 2종이 합성되었다. 첫번째 펩타이드는 DOTA- 및 AMBF₃-접합된 RM2 (DOTA-Lys-AMBF₃-4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂)로서, 자동 펩타이드 합성기를 사용해 제조되었고, Zhibo Liu (도 47)에 따라 HPLC에 의해 정제되었다.¹⁹ 수지-연결된 펩타이드 RM2는 BCCA (BC Cancer Association)의 Lin 실험실로부터 제공받았다. RM2는, 전립선 종양, 유방 종양 및 GI 관 종양에서 발견된 가스트린-방출성 펩타이드 수용체 (GRPr)에 대해 고 친화성인 봄베신 길항제이다.^{20 , 38-42} 이후의 논의는 2번째 펩타이드, 즉, 브라디키닌-유래 AMBF₃ 접합체 (도 48)의 합성에 집중될 것이다. 먼저, RM2 접합체를 합성하기 위해 반응식 6을 채택한 다음 수동 고상 펩타이드 합성으로 수득하였다.

천연 브라디키닌과 이의 유사체는 총체적으로 키닌으로 지칭되며, 체내에서 통증 및 정상적인 생리학적 조절 신호로서 존재한다.⁴³ 이들 나노펩타이드는 2가지 유형의 수용체, 즉 B1 및 B2를 가진다.⁴⁴ 후자는, 세포에서 B1 수용체보다 더 흔히 존재하며, 정상적인 9량체와 비슷한 키닌 유사체에 결합한다. 반대로, B1 수용체는 아미노산 하나가 더 짧은 키닌, 특히 [des-Arg⁹]-BK에만 결합한다.⁴⁴ 체내에서 BK를 파괴하는 1차 효소는, 7-8 및 5-6 결합에서 절단하는, 안지오텐신 I 전환 효소 (ACE)이다.⁴⁵ 암 요법에서 BK 수용체의 역할은, B2 수용체가 전신에 고 농도로 존재하기 때문에 매력적인 약물 표적이 되지 못한다는 사실로, 입증되었다. 오히려, B1 수용체가, 염증 증가 및 종양 증식시 더 만연해져, 암 부위에 특이적이므로, 유망한 약물 표적이 되었다.⁴⁵ 이런 이유로, 본 발명자들은 B1-수용체-특이적인 [des-Arg⁹] 브라디키닌 유사체에 Lys(AMBF₃)를 접합하는 것으로 정하였다.

이들 펩타이드의 디자인은 몇가지 요소들을 토대로 한다. 먼저, 1.5장에서 언급한 바와 같이, 이들 천연적으로 친지성인 펩타이드는 마우스 PET 스캔에서 간과 장에 축적되는 것으로 밝혀졌다.²¹ 킬레이터 DOTA와 같은 약동학 개변제의 부가는 간담도에 의한 소거 저하를 촉진하고, 이미지 콘트라스트를 개선한다.^{22 ,23} 그러나, 이것이 킬레이트에 첨가하는 유일한 이유가 아니다. 이름에서 시사되듯이, DOTA 및 DTPA와 같은 킬레이팅 관능기는 질환에 대한 치료제로서 또는 ¹⁸F와 비슷하게 진단 영상화제 (예, ⁶⁸Ga)로서 작용할 수 있는 특정 금속 (예, ⁹⁰Y 또는 ¹⁸⁶Re)과 킬레이트를 형성할 수 있다.^{25 ,46, 47} 2002년에 펑크하우저에 의해 테라노스틱스로 명명된 의학의 비교적 새로운 분야는, 표적 요법이 질환의 가시화와 공격을 둘다 수행할 수 있어, 매우 기대되고 있다.^{47 ,48} 본 발명자들의 아키텍처를 이용해, AMBF₃는 ¹⁸F-PET 영상화와 결합해 진단제로서 작용하고, DOTA에 킬레이트화된 금속은 암에 대한 잠재적인 치료제로서 작용한다는, 가설을 세웠다. 이러한 2가지 기능은 높은 종양 흡수성에 좌우되며, 그래서 Lys(AMBF₃)과 천연 펩타이드 사이의 양이온성 링커가 매우 중요해졌다. 만시 등은, 4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘이, 펩타이드에 접합되어 생리학적 pH에서 양성자화될 경우, DOTA-RM2의 K_d를 거의 3배 줄일 수 있다고 표명하였다.²⁰

반응식 6. DOTA - Lys ( AMBF ₃ )-BK 펩타이드 ( 9)의 합성 반응식. (i) 표준적인 Fmoc 합성. BCCA의 Lin 실험실에서 수행된 공정. 단계 (ii)에서 사용되는 수지-결합된 BK는 협력을 통해 제공받음; (ii) 20% 피페리딘/DMF, rt, 3 x 5분, 이후 Fmoc-4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘, HBTU, DIPEA, DMF, rt, 2시간; (iii) 20% 피페리딘/DMF, rt, 3 x 5분, 이후 Fmoc-L-Lys-AMBF₃-OH (8), HBTU, DIPEA, DMF, rt, 24시간; (iv) 20% 피페리딘/DMF, rt, 3 x 5분, 이후 DOTA-트리-t-부틸-에스테르, NHS, DCC, DCM, rt, 24시간; (v) 95:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIPS + 30 mM KHF₂.

반응식 6은 펩타이드 9를 제조하기 위해 사용한 수동 고상 펩타이드 합성 프로토콜을 예시해준다. 고상 지지체는 BCCA의 Lin 실험실에서 진행된 Fmoc-보호된 변형된 브라디키닌이 커플링된, 하이드록시메틸페닐 관능화된 수지 (Wang 수지)이다. 생체내 안정성을 높이기 위해, 본 합성에서 사용한 BK 유사체는 3번 및 5번 위치에 Hyp³ 및 Cha⁵를 각각 사용해 변형시켰다 (도 48). 이러한 변형은 이들 위치에서 ACE의 작용을 변화시켜, 탁월한 PET 이미지를 제공해야 하는 펩타이드에 보다 긴 반감기를 부여한다.⁴⁹ 라이신 및 아르기닌 잔기를 각각 Boc (tert-부톡시카르보닐) 및 Pbf (2,2,4,6,7-펜타메틸-다이하이드로벤조푸란-5-설포닐) 기로 보호하였다. 이들 기는 산에 취약하므로, 마지막 TFA 수지 절단시에만 절단한다. 마지막 루신 잔기는, 천연 브라디키닌에 이 잔기가 존재하지 않으므로, 작용제 BK를 길항제 형태로 변환하기 위해 추가하였다. 모든 반응은 3 mL 스핀 컬럼에서 수행하였다. 탈보호 조건은 각각 5분씩 20% 피페리딘/DMF 2.5 mL을 이용한 연속적인 3회 세척을 수반하였다. 수지를 DMF 및 DCM으로 세척한 후, 첫번째 커플링 반응 (반응식 6ii)에서는 양이온성 스페이서를 연결시키고, 활성화제로서 HBTU를 이용해 DMF 중에서 수행하였다. 각각의 탈보호/커플링 반응 (반응식 6ii-6iv) 후, 완료를 확인하기 위해 카이저 (닌하이드린) 검사를 이용하였다. 간략하게는, 이러한 색 검사는 1차 아미노 기의 존재로 인해 보호된 펩타이드와 비-보호된 펩타이드를 신속하게 구분할 수 있다.⁵⁰ 이는 반-분취용 분석 방법임에도 불구하고 (비드의 육안 검사로만으로는 보호된 아민이 얼마나 탈보호되었는 지를 정확하게 구분할 수 없으므로), 양성 대조군을 사용하면 비드를 얼마나 오래 가열하여야 하는지 결정하는데 도움이 된다. 검사는 몇가지 수지 비드를 취하여 닌하이드린, 에탄올에 용해된 페놀 및 피리딘 중의 수성 KCN으로 처리하는 것을 포함한다. 하나의 시험관에는 유리 아미노 기를 가진 Ring 아미드 수지 (양성 대조군)를 넣고, 다른 시험관에는 대상 펩타이드를 가진 수지를 넣는다. 가열하면, 유리 말단 아민으로 인해 진한 파란색이 나타날 것으로 예상되지만, Fmoc-보호된 펩타이드에서는 색 변화가 관찰되지 않는다.

다음 커플링 반응 (반응식 6iii)은 비슷한 조건을 이용하지만, 화합물 8이 양이온성 링커보다 훨씬 더 유용하므로 가능한 최고 수율을 확보하기 위해 24시간 동안 혼합하였다. DOTA-트리-t-부틸-에스테르의 커플링 (반응식 6iv)은 먼저 DMF 중의 NHS/DCC를 이용해 24시간 동안 수행하였다. 반응 기간이 끝나면, 카이저 검사에서 상당한 파란색 발색이 여전히 관찰되었다. 비슷한 결과는, 다시 24시간 이후에도 관찰되었다. 그래서, 용매를 DCM으로 바꾸었으며, 48시간 후 카이저 검사에서 만족스럽게도 음성 결과가 나타났다. HBTU가 소형 펩타이드 합성시 DOTA와 함께 작용하는 것으로 입증되었음에도 불구하고, RM2 및 BK 유사체에 대한 이전의 경험에 따르면, DCC 커플링을 통해 DOTA의 NHS 에스테르를 합성하는 것이 더 효과적인 방법이었다.^{19, 51}

본 발명자들이 95% TFA 수용액을 사용해 수지로부터 펩타이드를 절단하고자 하였을 때 문제가 발생하였다. 절단된 펩타이드에 대한 HPLC에서 10분 내지 20분 사이에 다수의 피크들이 나타났으며, MALDI-TOF 분석에서 산물을 확인할 수 없었다 (데이터 도시 안함). 수지로부터 서열 절단시 AMBF₃가 분해되었거나, 또는 TFA가 펩타이드를 복수의 위치들에서 절단할 가능성이 있는 것으로 추정되었다. 이는, 새로운 기법의 목적이 가수분해 안정성이었기에, 실망스런 결과였다. 그렇지만, 극히 가혹한 조건이었다는 것을 깨달았다는 점에서 중요하였으며, 따라서 임의의 트리플루오로보레이트는 살아남을 가능성이 거의 없었다. 이 문제를 해결하기 위해, 보론산 쪽으로가 아닌 트리플루오로보레이트 방향으로 평형을 향하게 하기 위해 절단 혼합물에 과량의 유리 불화물을 첨가하여야 하는 것으로 보였다. 이는 반응식 4에 나타낸 Ting 등에 의해 수행된 카이네틱 연구를 기반으로 하였다. 이러한 추론으로, 30 mM KHF₂를 95:2.5:2.5 TFA/H₂O/TIPS에 첨가하였으며, 절단 반응을 최대 2시간 동안 수행하였다. 용액을 여과, 수집, 증발시키고, MeOH/다이에틸 에테르를 사용해 트리투레이션하였다. 석출된 고형물을 50% 아세토니트릴 수용액에 용해하고, 도 50에 나타낸 바와 같이 HPLC에 의해 정제하였다 (상세한 HPLC 프로토콜은 방법 및 재료 참조). 10-11분 피크 (피크 1), 11.1-12분 피크 (피크 2), 14-14.8분 피크 (피크 3) 및 14.9-15.7분 피크 (피크 4)를 수집하고, MALDI-TOF에 의해 분석하였다. 처음 2개의 피크만 유용한 특징 데이터를 제공하였다 (도 51-54).

브라디키닌 유도체는, 피크들이 본질적으로 체류 시간이 비슷해, HPLC 정제하기 어려운 것으로 나타났다. 이는 합성 공정의 특성으로 인한 것일 수도 있지만, 비슷한 HPLC 추적은 이전의 다른 BK 유사체들에서도 관찰된 바 있다.¹⁹ 이에 대한 설명은, BK 펩타이드가 3/4 및 8 위치에서 각각의 Pro 및 Hyp 잔기로 인해 여러가지 입체 구조를 가지는 경향이 있을 수 있다는 것이다. 그래서, 심지어 화학적으로 순수한 펩타이드도 넓은 피크로 용출될 수 있다. 도 50에 도시된 바와 같이, 피크 1 및 피크 2는 별도로 용출되었지만; 공교롭게도, 이러한 분리는 충분히 효과적이지 않아, 피크 1의 화합물 (m/z = 1807)이 피크 2의 MALDI-TOF에서 나타날 수 있으며, 그 반대도 마찬가지였다. 피크 1의 정체는 펩타이드 9의 탈보릴화 산물인 것으로 보인다 (도 55). 이 구조에 대해 예측된 동위원소 패턴은 관찰된 MALDI-TOF 스펙트럼과 매우 상당히 일치하였다 (도 52).

도 53은 피크 2, 즉 원하는 산물 DOTA-Lys(AMBF₃)-BK의 MALDI-TOF이다. 공교롭게도, HPLC 정제하기 어려운 문제로 인해, 스펙트럼에서, 소량의 탈붕소화된 산물과 더불어, 일부 부가적인 비-특정화된 불순물들이 존재하는 것으로 나타났다. 이는, RM2 펩타이드가 기존에 더 깨끗한 HPLC 추적을 제공하고 현저하게 훨씬 더 비슷한 MALDI-TOF 스펙트럼을 제공하므로, 브라디키닌에 특이적인 것으로 보인다 (도 56).

펩타이드 9의 수율은 5.5%에 불과한데, 이는 몇가지 이유들로 설명될 수 있다. 첫째, 보호된 BK를 16.5 μmol만 사용하였으므로, 고상 합성의 전체 규모가 매우 작다. 또한, 앞서 논의한 바와 같이, 산물의 HPLC 정제는 원하는 펩타이드와 체류 시간이 비슷한 다른 피크들로 인해 정제하기 어렵다. 마지막으로, DOTA-Lys(AMBF₃)-BK의 탈보릴화도 낮은 수율의 일부 원인이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들은, 이 방법이 브라디키닌과 같이 합성이 어려운 펩타이드에서도 MADLI-TOF 분석에 의해 검증된 바와 같이 성공을 거두었다는 것을 확인하게 되어 만족하였다.

펩타이드 11은 MALDI-TOF에서 m/z = [M+H⁺]⁺ 1959.1에 단일 피크 하나를 나타내었다. 이 순수한 스펙트럼은 RM2가 BK (펩타이드 9)와 비교해 상대적으로 합성하기 용이하다는 것을 설명해준다.

전술한 논의 내용을 기반으로, 다음과 같은 의문이 제기되었다: 제안된 기술이 AMBF₃에 특이적인가? 또는 아릴트리플루오로보레이트와 함께 사용할 수 있나? 아릴트리플루오로보레이트를 아미노산 잔기 상에 접합하여 고상 합성으로 펩타이드에 병합할 수 있나?. 본원에 제시된 관찰 결과는, Lys(AMBF₃) 관능기를 이용해 펩타이드를 합성하는 것이 ArBF₃를 이용하는 것보다 훨씬 더 쉽다는 것을 시사해주었다. 절단 및 정제 조건이 트리플루오로보레이트를 파괴할 것이므로, ArBF₃ 관능기는 클릭가능한 (clickable) 펩타이드의 SPPS 및 정제한 이후에만 접합시킬 수 있다.²¹ 이는, 아릴 트리플루오로보레이트 동족체 (congener)와 비교해, 암모늄 기에 인접하는 경우에, 트리플루오로보레이트의 높은 가수분해 안정성 때문이었다 (도 3 및 4).¹⁹ 아울러, AMBF₃의 본질적으로 유용한 이점은, 이의 잠재적인 생체내 안정성으로 인해 유리 불화물의 골 흡수성이 낮다는 것이다. 새로운 AMBF₃를 가진 오직 2가지 펩타이드만 합성되었지만, 본 발명자들은 물론 몇가지를 더 조사할 예정이다.

결론

본 과제의 목적은 아릴트리플루오로보레이트-유래된 ¹⁸F-PET 영상화제에서 문제가 되는 몇가지 사항들을 개선하는 것이었다. 구체적으로, 높은 친지성 및 고상 펩타이드 합성과의 비-호환성은 각각 이미지 품질 불량 및 합성 다양성 제한을 야기하였다. 이를 위해, 펩타이드에 접합하여 극성을 높이기 위한 목적으로 보호된 금속 킬레이트를 표적으로 하였다. 테트라-t-부틸 보호된 DTPA (4)를 4 단계를 통해 전체 수율 11%로 합성하였다. 화합물 3a 및 3b의 정제 문제로 인해 이렇듯 수율은 만족할 수 없는 수준이었다.

AMBF₃ (7)와 변형된 라이신-아지드 아미노산 (5) 간의 클릭 반응의 결과로 새로운 알킬트리플루오로보레이트 (8)를 합성하였다. AMBF₃의 시험관내 가수분해 안정성 개선을 보여주는 이전의 카이네틱 연구를 토대로, 이 잔기는 종양 친화성이 높은 소형 펩타이드를 고상 펩타이드 합성하는데 적합한 것으로 추정하였다.¹⁶ 브라디키닌 길항제를 Lys(AMBF₃) 잔기의 부착 기질로 선정하였다. 또한, 펩타이드에, 각각 낮은 친지성 및 높은 종양 흡수성에 중요한 것으로 알려져 있는, DOTA (금속 킬레이터)와 양이온성 암모늄 링커를 커플링하였다.²⁰ 이들 펩타이드는 HPLC에 의해 정제하고, MALDI-TOF 분석을 통해 특정화하였다.

이러한 새로운 기술의 강점은 트리플루오로보레이트 펩타이드 유사체를 고상 펩타이드 합성을 통해 합성할 수 있는 우수한 다용성이다. AMBF₃는 또한 유리 불소의 골 흡수를 감소시키는 가수분해 안정성으로 인해 본질적으로 유용하다. 이러한 작업은 ¹⁸F-표지된 펩타이드를 DOTA에 킬레이트화된 치료학적 금속과 커플링함으로써 이중 방식의 테라노스틱 연구를 가능하게 해준다.

실험

모든 시판 화학제들은 Sigma-Aldrich, Fischer Scientific, Alfa-Aesar, Oakwood Chemicals 또는 Combi-Blocks 사에서 구입하였으며, 추가적으로 정제하지 않고 사용하였다. 용매는 Fischer Scientific 또는 Sigma-Aldrich 사에서 구입하였고, 추가적으로 정제하지 않고 사용하였다. 드라이 THF는 지시제로서 벤조페논과 함께 소듐 금속 상에서 증류를 통해 수득하였다. DMF는 사용하기 전 적어도 24시간 동안 활성화된 4A 분자체 상에서 용매를 보관하여 건조시켰다. 중수소화 용매는 Cambridge Isotope Laboratories에서 구입하였다. ¹H-NMR 데이터는 300 MHz Bruker Avance 스펙트로미터에서 수집하였으며, 모든 화학적 이동은 기준점으로서 용매 신호에 대한 δ 척도에 대한 ppm으로 기록하였다: CDCl₃의 경우 δ 7.26, CD₃CN의 경우 δ 1.94, D₂O의 경우 δ 4.79, CD₂Cl₂의 경우 δ 5.32 및 CD₃OD의 경우 δ 3.31. 다중도는 싱글렛 (s), 더블렛 (d), 트리플렛 (t), 콰르텟 (q), 멀티플렛 (m) 또는 넓은 (br) 싱글렛으로 기록한다. 질량 스펙트럼은 샘플을 주입하기 위해 Waters 2695 HPLC와 연계된 Waters ZQ GC-MS를 사용해 획득하였다. 플래시 컬럼 크로마토그래피에 사용되는 HPLC 실리카 겔은 SiliCycle 사의 SiliaFlash F60 (230-400 메쉬) 실리카 겔이었다. HPLC 정제는 Agilent 1100 시리지 시스템을 사용해 Agilent Eclipse XDB-C18 컬럼을 통과시켜 수행하였다. 검출은 229 nm에서의 UV 흡광으로 수행하였다. 농도 구배 프로그램은 다음과 같다: 용매 A: 아세토니트릴, 용매 B: 0.1% TFA/H₂O; 0에서 2분까지: 0% -> 5% A, 2분부터 15분까지: 5% -> 20% A, 15분부터 16분까지: 20% -> 35% A, 16분부터 18분까지: 35% -> 100% A, 18분부터 19분까지: 100% -> 5% A; 유속: 3 mL/min; 컬럼 온도: 50 내지 51℃. 문헌으로부터 수정된 합성 공정은 참조문헌과 함께 아래에 기술된다.

N,N - 비스 [( tert - 부틸옥시카르보닐 ) 메틸 ]-2- 아미노에탄올 ( 1) ²⁶

열-건조한 둥근 바닥형 플라스크에서, tert-부틸 브로모아세테이트 (5.00 mL, 33.9 mmol, 2.5 eq.), 무수 KHCO₃ (3.45 g, 34.5 mmol, 2.5 eq.) 및 DMF (22 mL) 혼합물을 0℃까지 냉각시켰다. DMF (1.68 mL) 중의 에탄올아민 (0.826 mL, 13.7 mmol, 1 eq.) 용액을 5분에 걸쳐 불활성 분위기 하에 상기 플라스크에 점적 첨가하고, 30분간 교반하였다. 반응물을 다시 RT에서 24시간 동안 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 여과하고, 여과물에 다이에틸 에테르 (25 mL)와 포화 NaHCO₃ 용액 (17 mL)를 첨가하였다. 수 층은 이후 다이에틸 에테르 (3 x 10 mL)로 추출하고, 유기 추출물을 조합하여 브린 (3 x 10 mL)으로 헹구었다. MgSO₄를 사용해 건조한 후, 유기 혼합물을 여과하고, 감압 증발시켜, 점성의 오일을 수득하였으며, 이를 플래시 크로마토그래피에 의해 실리카 컬럼에서 정제하였다 (페트롤륨 에테르/다이에틸 에테르, 2:1; R_f = 0.17). 수율: 2.79 g, 71%. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, rt): δ (ppm) = 1.51 (s, 18H, tert-부틸 CH ₃), 2.93 (t, 2H, J = 5.01, HOCH₂CH ₂N), 3.47 (s, 4H, N(CH ₂)₂), 3.57 (m, 2H, HOCH ₂), 3.81 (t, 1H, J = 5.75, OH); ESI-LRMS: [M+Na⁺]⁺ 312.4 (100%).

N,N - 비스[ tert- 부틸옥시카르보닐)메틸 ]-2- 브로모에틸아민 ( 2) ²⁶

열 건조한 둥근 바닥형 플라스크에서, 1 (2.77 g, 9.51 mmol, 1 eq.)을 DCM (15 mL)에 용해하였다. 이 용액에, 트리페닐포스핀 (2.17 g, 8.27 mmol, 0.8 eq.)을 첨가하고, 혼합물을 0℃까지 냉각시켰다. N-브로모숙신이미드 (1.47 g, 8.27 mmol, 0.8 eq.)를 5분에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 무색 혼합물을 0℃에서 90분간 교반하였으며, 약간의 색 변화를 관찰할 수 있었다. 혼합물을 감압 하에 증발시켜, 밝은 분홍색 고형물을 수득하였다. 여기에 다이에틸 에테르 (28 mL)를 첨가하고, 형성된 백색 석출물은 여과하였다. 여과물을 다시 감압 하에 증발시켜, 노란색 오일을 수득하였으며, 이를 짧은 실리카 컬럼에 로딩한 다음 다이에틸 에테르로 용출시켰다. 조 용출물을 1회 이상 증발시키고, 마지막으로 플래시 크로마토그래피에 의해 실리카 컬럼 상에서 정제하였다 (헥산/다이에틸 에테르, 5:1; R_f = 0.65). 수율: 2.38 g, 71%. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, rt): δ (ppm) = 1.51 (s, 18H, tert-부틸 CH ₃), 3.18 (t, 2H, J = 7.54, HOCH₂CH ₂N), 3.48 (dd, 2H, J₁ = 8.16 J₂ = 6.96, HOCH ₂), 3.52 (s, 4H, N(CH ₂)₂); ESI-LRMS: [M+K⁺]⁺ 390.0 (60%).

N,N,N'',N'' - 테트라키스 [( tert - 부틸옥시카르보닐 ) 메틸 ]- N' -[(메틸옥시카르보닐) 메틸 ] 다이에틸렌트리아민 (3a) ⁵²

아세토니트릴 (2 mL) 중의 글리신 메틸 에스테르 하이드로클로라이드 (32.5 mg, 259 μmol, 1 eq.) 및 2 (187 mg, 533 μmol, 2.1 eq.) 용액을 제조하였다. K₂HPO₄ (3.26 g, 18.8 mmol)와 KH₂PO₄ (167 mg, 1.23 mmol)를 H₂O (10 mL) 중에 혼합하여 제조한 포스페이트 완충제 (1 mL, 2M, pH 8)를, 이후 첨가한 다음 반응물을 RT에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과물을 분별 깔때기로 옮겼다. 수 층으로부터 유기 층을 분리하여 MgSO₄ 상에서 건조하였다. 감압 하에 증발시켜 노란색 오일을 수득하였으며, 이를 실리카 컬럼에 로딩하였다 (CHCl₃/MeOH/NEt₃ 150:3:1; R_f = 0.3). 이 용매 시스템은, 시도한 몇가지 다른 시스템들 (예, Hex/Ether/NEt₃, Hex/EtOAc/NEt₃) 중에서도, 산성 관능기와 염기성 관능기의 특성과 용해성 문제로 인해 표적 화합물을 고 순도로 분리하지 못하였다. ESI-LRMS: [M+K⁺]⁺ 670.5 (100%).

N,N,N '',N'' - 테트라키스 [( tert - 부틸옥시카르보닐 ) 메틸 ]- N' -[( 벤질옥시카르보닐 )메틸]다이에틸렌트리아민 (3b) ^52,27

벤질 글리시네이트 p-톨루엔설포네이트 (200 mg, 592 μmol, 1 eq.)를 다이에틸 에테르 (4 mL)에 첨가한 다음 Na₂CO₃ 수용액 (189 mg, 1.8 mmol, 3 eq., 용액의 4 mL)을 첨가하였다. rt에서 30분간 교반한 후, 에테르 층을 분리해 MgSO₄ 상에서 건조하였으며, 이를 감압 하 증발시켜 벤질 글리신 에스테르 (89 mg, 540 μmol)를 수득하였다. 이 중간산물은 표적 화합물 3b에 대해 추가적으로 정제하지 않고 사용하였다. 포스페이트 완충제 (1 mL, 2M, pH = 8)를, 아세토니트릴 (2 mL)에 용해한 벤질 글리신 에스테르 (60 mg, 364 μmol, 1 eq.) 및 2 (280 mg, 795 μmol, 2.2 eq.)에 첨가하였다. 이 2상 반응물을 rt에서 24시간 동안 교반하였다. 석출된 염을 여과 제거하고, 유기층을 분리하여 MgSO₄ 상에서 건조한 다음 감압 하에 증발시켰다. 반-고체 잔류물을 이후 클로로포름 중에 취하여, 여과한 다음 다시 증발시켰다. 수득되는 노란색 오일을 플래시 크로마토그래피를 위해 실리카 컬럼에 로딩하였다 (CHCl₃/MeOH/NEt₃ 150:3:1; R_f = 0.35). 3a와 마찬가지로, 실리카 크로마토그래피를 통한 완전한 정제는 염기성 관능기의 특성으로 인해 곤란하였다. 조산물 수율: 73.1 mg, 28%. ESI-LRMS: [M+K⁺]⁺ 670.5 (100%).

N,N,N '',N'' - 테트라키스 [( tert - 부틸옥시카르보닐 ) 메틸 ]- N' -[아세트산] 다이에틸렌트리아민 ( 4) ^{52 ,27}

3b (76 mg, 108 μmol, 1eq.)를 메탄올 (1 mL)에 용해하고, Pd/C 10% (20 mg, 약 50% wet)를 첨가하였다. 반응물을 RT에서 24시간 동안 수소 분위기 (큰 벌룬 2개) 하에 교반하였다. 반응물을 소결 유리 여과기 상에서 여과하고, 감압 하에 증발시켜, 점성의 노란색 오일을 수득하였다. 수율: 53.5 mg, 81%. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃, rt): δ (ppm) = 1.48 (s, 36H, tert-부틸 CH₃), 3.02 (m, 4H, C(O)OHCH₂NCH ₂CH₂N), 3.14 (m, 4H, C(O)OHCH₂NCH₂CH ₂N), 3.47 (s, 8H, NCH ₂C(O)OtBu), 3.59 (s, 2H, NCH ₂C(O)OH); ESI-LRMS: [M+K⁺]⁺ 654.5 (100%).

Fmoc -( L )- Lys (N ₃ )-OH ( 5) ²⁴

0℃에서, NaN₃ (7.3 g, 113 mmol)를 H₂O (20 mL)와 DCM (30 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 여기에, Tf₂O (3.8 mL, 22.45 mmol)를 30분에 걸쳐 점적 첨가하였다. 이 반응물을 0℃에서 5시간 동안 교반한 다음 DCM (2 x 50 mL)으로 추출하였다. 유기층들을 조합해 Na₂CO₃ (1 x 50 mL) 수용액으로 헹구었으며, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 1:1 MeOH/H₂O (33 mL) 중의 K₂CO₃ (5.6 g, 39.5 mmol), CuSO₄·5H₂O (25 mg, cat.) 및 Fmoc-(L)-Lys-OH (4.78 g, 13 mmol) 혼합물을 제조하였다. 여기에, 유기 추출물을 30분에 걸쳐 점적 첨가하고, 이 혼합물을 rt에서 밤새 추가로 교반하였다. 2.5 N HCl (150 mL)을 사용해 반응을 퀀칭한 다음 산물을 DCM (3 x 50 mL)으로 추출하고, 브린 (2 x 50 mL)으로 헹군 다음 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 감압 하에 증발시켜, 조산물 오일을 수득하였으며, 이는 바로 플래시 크로마토그래피를 위해 실리카 컬럼에 로딩하였다 (MeOH/DCM의 농도 구배 0.5:99.5 -> 1:99). R_f = 0.37 (1:9 MeOH/DCM). 수율: 4.4 g, 86%. ¹H NMR (300 MHz, CD₂Cl₂, rt): δ (ppm) = 1.30 - 1.60 (m, 6H, β,γ,δ CH ₂), 3.32 (t, 2H, J = 6.38 Hz, ε CH ₂), 4.28 (t, 1H, J = 6.60 Hz, α CH), 4.39 - 4.47 (m, 3H, Fmoc-CHCH ₂OC(O)), 5.32 (s, 1H, OC(O)NH), 7.36 (t, J = 7.11 Hz, Fmoc 아릴 H), 7.45 (t, J = 7.26 Hz, Fmoc 아릴 H), 7.65 (d, J = 7.37 Hz, Fmoc 아릴 H), 7.82 (d, J = 7.37 Hz, Fmoc 아릴 H); ESI-LRMS: [M+Na⁺]⁺ 417.3 (100%).

N -프로파길- N,N - 다이메틸 - 암모니오메틸 - 보로닐피나콜레이트 ( 6) ⁵³

열 건조한 둥근 바닥형 플라스크에서, N,N-다이메틸프로파길아민 (0.67 mL, 6.27 mmol, 1 eq.)을 다이에틸 에테르 (28 mL)에 첨가하고, 반응물을 45℃까지 가열하였다. 요오도메틸피나콜보로네이트 (1.144 mL, 6.27 mmol, 1 eq.)를 이 용액에 점적 첨가하였다. 첨가 즉시, 혼합물은 혼탁해졌으며, 이후 용액으로부터 백색 고형물이 석출되었다. 반응물을 다시 15분간 교반한 다음, 산물을 여과해 차가운 다이에틸 에테르로 세척하였다. 잔류물을 높은 진공 하에 건조시켜, 얇게 벗겨지는 백색 고형물을 수득하였다. 수율: 1.4 g, 100%. ¹H NMR (300 MHz, D₂O, rt): δ (ppm) = 1.13 (s, 12H, 2x(CH ₃)₂), 3.09 (s, 2H, N(CH₃)₂CH ₂BF₃), 3.15 (t, 1H, J = 2.53, CH₂CCH), 3.19 (s, 6H, N(CH ₃)₂), 4.27 (d, 2H, J = 2.51, HCCCH ₂N(CH₃)₂); ESI-LRMS: [M]⁺ 224.4 (100%).

N -프로파길- N,N - 다이메틸 - 암모니오메틸 - 트리플루오로보레이트 (7)

6 (1 g, 4.46 mmol, 1 eq.)를 아세토니트릴 (12 mL)에 용해한 다음, 수성 KHF₂ (3M, 4.25 mL, 12.8 mmol, 2.8 eq.) 및 HCl (4M, 4.25 mL, 17 mmol, 3.8 eq.)을 첨가하여 45℃에서 2시간 동안 두어 불소화하였다. 맑은 오렌지색 용액에 진한 NH₄OH (~ 1.5 mL) 수용액을 pH 7까지 첨가하여 퀀칭하였다. 이 혼합물을 더 큰 둥근 바닥형 플라스크로 옮기고, 20% 아세토니트릴/에탄올 용액 (100 mL)을 첨가하였다. 이 용액에 바로 실리카 (40 mL)를 넣어, 이 혼합물을 20분간 교반하였다. 앞서 밝은 노란색을 띠던 용액은 색이 상당히 사라지고, 맑은 무색 혼합물이 되었다. 이 혼합물을 소결된 유리 깔대기에 장착된 짧은 실리카 컬럼에 로딩하고, 20% 아세토니트릴/에탄올로 용출시켰다. 감압 하에 증발시킨 다음 높은 진공 하에 건조한 후, 옅은 노란색 고형물이 분리되었다. 이를 세척한 다음 차가운 다이에틸 에테르 (20 mL)와 함께 여과하여 NMR-순도의 양쪽성 이온을 수득하였다. 산물에는 아이오다이드 (ESI-MS에 의해 관찰가능) 및 KBF₄ (¹⁹F-NMR에서 나타남) 뿐 아니라 염이 과량으로 남아있어 생산 수율은 정량적인 수준보다 높았다. 추가적인 반응에서, 7의 합성 수율은 정량적인 수준인 것으로 추정되었다. ¹H NMR (300 MHz, D₂O, rt): δ (ppm) = 2.55 (m, 2H, N(CH₃)₂CH ₂BF₃), 3.08 (s, 6H, N(CH ₃)₂), 3.12 (t, 1H, J = 2.46, CH₂CCH), 4.10 (d, 2H, J = 2.41, HCCCH ₂N(CH₃)₂); ¹⁹F NMR (282.4 MHz, CD₃OD, rt): δ (ppm) = -140 (q, 3F, BF₃), -154 (s, BF₄); ESI-LRMS: [M-F^-]⁺ 146.1 (100%).

Fmoc -( L )- Lys -ε-1,2,3- 트리아졸 - N,N - 다이메틸 - 암모니오메틸 - 트리플루오로 보레이트 [Fmoc-Lys(AMBF ₃ )] (8)

수성 CuSO₄ (1M, 0.75 mL, 0.75 mmol) 및 소듐 아스코르베이트 (1M, 1.5 mL, 1.5 mmol) 혼합물을 아세토니트릴/물 3:2 (2.5 mL)에 용해된 7 (250 mg, ~ 0.75 mmol, ~3 eq.)에 첨가하였다. 5 (100 mg, 0.25 mmol, 1 eq.)를 최소량의 아세토니트릴에 용해하고, 이를 상기 혼합물에 점적 첨가하여 밤새 45℃에서 교반하였다. 일반적으로 반응 중에 일부 Cu 또는 아스코르베이트 염이 석출된다. 반응을 실리카 TLC에 의해 모니터링하였으며, 출발 물질은 반응 시간 20 - 24시간 사이에 사라졌다. 규모 확장시 항상 재현되진 않았으며, 반응을 완료하기 위해 종종 더 많은 촉매, 환원제 또는 알킨을 첨가하여야 하였다. 석출물을 여과하고, 반응 혼합물을 감압 하에 증발시켰다. 암적색 잔류물을 1:1 MeOH/DCM 중에 취하여 여과한 다음 다시 증발시켰다. 이 과정을 1회 이상 반복하여, 5:95 MeOH/DCM을 사용해 과량의 염과 불용성 불순물들 모두 제거하였다. 최종 조산물 오일은 5:95 MeOH/DCM에 완전히 용해되었으며, 이후 이를 실리카 컬럼에 로딩하고, 플래시 크로마토그래피를 통해 MeOH/DCM (5% - 10%) 농도 구배 시스템을 적용해 용출시켰다. R_f = 0.15 (1:9 MeOH/DCM). 수율: 91.5 mg, 65%. ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD, rt): δ (ppm) = 1.37 - 1.93 (m, 6H, β,γ,δ CH ₂), 3.06 (s, 6H, N(CH ₃)₂), 4.11 (m, 1H, α CH), 4.23 (m, 2H, N(CH₃)₂CH ₂BF₃), 4.40 (m, 2H, ε CH ₂), 4.49 (m, 3H, Fmoc-CHCH ₂OC(O)), 4.55 (s, 2H, CH=CCH ₂N(CH₃)₂)), 5.52 (s, 1H, OC(O)NH), 7.34 (t, J = 7.00 Hz, Fmoc 아릴 H), 7.42 (t, J = 7.13 Hz, Fmoc 아릴 H), 7.70 (m, Fmoc 아릴 H), 7.83 (d, J = 7.38 Hz, Fmoc 아릴 H), 8.27 (s, 1H, CH=CCH₂N(CH₃)₂)); ¹⁹F NMR (282.4 MHz, CD₃OD, rt): δ (ppm) = -140 (m, 3F, BF₃); ESI-LRMS: [M+Na⁺]⁺ 582.3 (100%).

DOTA -(( L)- Lys -ε-1,2,3- 트리아졸 - N,N - 다이메틸 - 암모니오메틸 - 트리플루오로보레이트 )-4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-Pro-Leu-COOH (9)

이 선형의 변형된 펩타이드는 Wang (하이드록시메틸페닐) 수지에서 표준적인 Fmoc 고상 펩타이드 합성 화학 방법으로 제조하였다. 브라디키닌의 비-천연 버전 (Fmoc-Lys-Arg-Pro-Hyp-Gly-Cha-Ser-Pro-Leu-COOH)을 수지 위에 미리 탑재하여, 양이온성 스페이서 Lys(AMBF₃) 잔기 및 DOTA 킬레이터를 부착시키기 위한 스캐폴드로 사용하였다. 수지 탑재 수준은 0.44 mmol/g으로 미리 계산하였다. 건조된 수지 (37.5 mg, 16.7 μmol)를 3 mL 스핀 컬럼에 투입하고, 1차 커플링 반응 전 2시간 동안 DMF (2.5 mL)에서 팽윤시켰다. DMF를 여과 제거하고, Fmoc를 20% 피페리딘/DMF (3 x 2.5 mL, 각각 5분씩)로 제거하였다. 수지를 DMF (3 x 2.5 mL), DCM (3 x 2.5 mL) 및 DMF (3 x 2.5 mL)로 헹구었다. Fmoc-4-아미노-1-카르복시메틸-피페리딘 (25 mg, 65 μmol, 4 eq.), HBTU (25 mg, 65 μmol, 4 eq.) 및 DIPEA (11.4 ㎕, 65 μmol, 4 eq.)를 DMF (2.5 mL)에 용해하여, 마개가 구비된 스핀 컬럼에 투입하였다. 반응물을 rt에서 2시간 동안 진탕 혼합하였다. 용액을 스핀 컬럼을 통해 여과하고, 다음번 커플링 반응을 수행하기 전에 DMF (3 x 2.5 mL), DCM (3 x 2.5 mL) 및 DMF (3 x 2.5 mL)로 헹구었다. 8 (14 mg, 25 μmol, 1.5 eq), HBTU (10 mg, 25 μmol, 1.5 eq.) 및 DIPEA (5.6 ㎕, 32.5 μmol, 2 eq.)를 DMF (2.5 mL)에 용해하여, 마개가 달린 스핀 컬럼에 투입하였다. 이 반응물을 rt에서 밤새 진탕 혼합하였다. 다시 이 용액을 스핀 컬럼을 통해 여과하고, 다음번 커플링 반응을 수행하기 전에 DMF (3 x 2.5 mL), DCM (3 x 2.5 mL) 및 DMF (3 x 2.5 mL)로 헹구었다. DOTA-트리-t-부틸-에스테르 (24 mg, 41.6 μmol, 2.5 eq.), NHS (4.6 mg, 41.6 μmol, 2.5 eq.) 및 DCC (8.5 mg, 41.6 μmol, 2.5 eq.)를 DCM (2.5 mL)에 용해한 다음 마개가 달린 스핀 컬럼에 투입하였다. 이 반응물을 rt에서 48시간 동안 진탕 혼합하였다. 이 마지막 접합체에는 보호된 Fmoc 기가 존재하지 않으므로, 이 펩타이드를 수지로부터 원액 TFA (9.5 mL), H₂O (0.25 mL), TIPS (0.25 mL) 및 30 mM KHF₂ (3M KHF₂ 10 ㎕)로 제조한 칵테일 (2.5 mL)을 사용해 절단하였다. 혼합물을 rt에서 2시간 동안 진탕 혼합하고, 여과한 다음 감압 하에 증발시켰다. 잔류물을 0℃에서 1:11 MeOH/Et₂O (24 mL)를 사용해 트리투레이션하여, 백색 고형물을 수득하였다. 혼합물을 1.5 mL 에펜도르프 튜브 24개에 균등하게 나누어 넣고 원심분리하여 다이에틸 에테르 상층액을 제거하였다. 다이에틸 에테르 (1 mL)를 다시 각각의 튜브에 넣고, 원심분리한 다음 상층액을 제거하였다. 잔류 고형물을 1:1 H₂O/아세토니트릴 (총 2 mL)을 사용해 수집하고, HPLC에 의해 정제하였다 (상기 나타낸 조건). 수율: 1.7 mg, 5%. MALDI-TOF LRMS: [M+H]⁺ 1867.0.

실시예 3 및 4에 대한 참조문헌

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실시예 5: DOTA - Lys ( AMBF3 )-TATE 및 DOTA - Bn -NH- Lys -( AMBF3 )- NHFmoc .

OctreoTATE

TATE를 포함하는 수지 (4.6 umol, 1 eq.) 19.9 mg을 DMF로 30분간 팽윤시켰다. DMF는 원심분리에 의해 제거하고, 상층액을 옮겼다. DMF 중의 6 mM 탈륨 (III) 트리플루오로아세테이트 (713 ㎕, 4.28 umol, 0.93 eq.)를 첨가하여, 반응물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 수지를 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. DMF (200 ㎕)를 사용해 3번 헹구었다. 그런 후, DCM (500 ㎕)을 첨가해 원심분리하였다. 상층액을 제거한 다음, 샘플을 스피드 벡에서 건조시켰다. 수지 샘플 소량은 마이크로파이펫 팁을 사용해 긁어, 별도의 에펜도르프 튜브에 넣었으며, 여기서 (3:7) HFIP:DCM (100 ㎕)을 사용해 산물을 실온에서 10분간 절단 처리하였다. 혼합물을 필터 파이펫 팁을 사용해 여과하고, 여과물을 별도의 에펜도르프 튜브에서 수집하였다. 혼합물에 공기를 부드럽게 블로잉하여 건조시키고, 다이에틸 에테르를 첨가하여 산물을 탈착시켰다. 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. MeOH (200 ㎕)를 첨가해 MS 용도로 산물을 용해시켰다. ESI-MS(+): C₁₀₁H₁₂₇N₁₁O₁₅S₂Si₂에 대한 계산치 = 1855.5 m /z; 실측치 [M-Trt+2H]⁺ = 1615.8 m /z; [M-TBS-tBu]⁺ = 1684.9 m/z.

(1:4) 피페리딘:DMF (200 ㎕)를 수지에 첨가하고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 원심분리하여 침전시키고, 상층액을 제거하였다. DMF (3x200 ㎕)를 첨가해 수지를 세척하였다. 혼합물을 볼텍싱하고, 원심분리하여 침전시켰다. 상층액을 제거한 다음, 혼합물을 스피드 벡에 의해 건조시켰다. 수지 샘플 소량을 마이크로파이펫 팁을 사용해 긁어내고 별도의 에펜도르프 튜브에 넣었으며, 여기서 (3:7) HFIP:DCM (100 ㎕)을 사용해 산물을 실온에서 10분간 절단 처리하였다. 혼합물을 필터 파이펫 팁을 사용해 여과하고, 여과물을 별도의 에펜도르프 튜브에서 수집하였다. 혼합물에 공기를 부드럽게 블로잉하여 건조시키고, 다이에틸 에테르를 첨가하여 산물을 탈착시켰다. 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. MeOH (200 ㎕)를 첨가해 MS 용도로 산물을 용해시켰다. ESI-MS(+): C₈₆H₁₁₇N₁₁O₁₃S₂Si₂에 대한 계산치 1633.2 m /z; 실측치 [M]⁺ = 1663.0; [M+2CH₃CN+2H]⁺ = 1390.7 m/z.

Fmoc-Lys(AMBF3)-NHS (15.1 mg, 23.0 umol, 5 eq.)의 무게를 칭량하여, (1:19) DIPEA:DMF 200 ㎕에 용해하였다. 그런 후, 용액을 수지에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 원심분리하여 침전시키고, 상층액을 제거하였다. DMF (3x200 ㎕)를 첨가하여 수지를 세척하였다. 혼합물을 볼텍싱하고, 원심분리하여 침전시켰다. 상층액을 제거한 다음, 혼합물을 스피드 벡에 의해 건조시켰다. 수지 샘플 소량을 마이크로파이펫 팁을 사용해 긁어내고 별도의 에펜도르프 튜브에 넣었으며, 여기서 (3:7) HFIP:DCM (100 ㎕)을 사용해 산물을 실온에서 10분간 절단 처리하였다. 혼합물을 필터 파이펫 팁을 사용해 여과하고, 여과물을 별도의 에펜도르프 튜브에서 수집하였다. 혼합물에 공기를 부드럽게 블로잉하여 건조시키고, 다이에틸 에테르를 첨가하여 산물을 탈착시켰다. 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. MeOH (200 ㎕)를 첨가해 MS 용도로 산물을 용해시켰다. ESI-MS(+): C₁₁₃H₁₄₈BF₃N₁₆O₁₆S₂Si₂에 대한 계산치 2173.03 m /z; 실측치 [M+CH₃CN+Na]⁺ = 2236.5 m/z.

(1:4) 피페리딘:DMF (200 ㎕)을 수지에 첨가하고, 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 원심분리하여 침전시키고, 상층액을 제거하였다. (3x200 ㎕) DMF를 첨가해 수지를 세척하였다. DCM (200 ㎕)를 첨가하여 원심분리하였다. DCM을 제거한 다음 수지를 스피드 벡에서 건조시켰다. 수지 샘플 소량은 마이크로파이펫 팁을 사용해 긁어, 별도의 에펜도르프 튜브에 넣었으며, 여기서 (3:7) HFIP:DCM (100 ㎕)을 사용해 산물을 실온에서 10분간 절단 처리하였다. 혼합물을 필터 파이펫 팁을 사용해 여과하고, 여과물을 별도의 에펜도르프 튜브에서 수집하였다. 혼합물에 공기를 부드럽게 블로잉하여 건조시키고, 다이에틸 에테르를 첨가하여 산물을 탈착시켰다. 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. MeOH (200 ㎕)를 첨가해 MS 용도로 산물을 용해시켰다. ESI-MS(+): C₉₈H₁₃₈BF₃N₁₆O₁₄S₂Si₂에 대한 계산치 1952.3 m/z; 실측치 [M+Na]⁺ = 1975.4 m/z.

DOTA-NHS·HPF₆·TFA (8.75 mg, 11.5 umol, 2.5 eq.)를 (1:19) DIPEA:DMF (200 ㎕)에 용해하고, 혼합물을 H₂N-Lys(AMBF₃)-TATE를 포함하는 수지에 첨가하여 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 DMF (3 x 200 ㎕)로 헹구었다. 혼합물을 볼텍싱하고, 원심분리하였다. 상층액을 제거하였다. 수지를 스피드 벡에 의해 건조시켰다. 수지 샘플 소량은 마이크로파이펫 팁을 사용해 긁어, 별도의 에펜도르프 튜브에 넣었으며, 여기서 (3:7) HFIP:DCM (100 ㎕)을 사용해 산물을 실온에서 10분간 절단 처리하였다. 혼합물을 필터 파이펫 팁을 사용해 여과하고, 여과물을 별도의 에펜도르프 튜브에서 수집하였다. 혼합물에 공기를 부드럽게 블로잉하여 건조시키고, 다이에틸 에테르를 첨가하여 산물을 탈착시켰다. 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. MeOH (200 ㎕)를 첨가해 MS 용도로 산물을 용해시켰다. ESI-MS(+): C₁₁₄H₁₆₄BF₃N₂₀O₂₁S₂Si₂에 대한 계산치 2337.1 m /z; 실측치 [M+K]⁺ = 2375.4 m /z.

(95:2.5:2.5) TFA:TIPS:H₂O (200 ㎕)를 수지에 첨가하여, 일반적인 탈보호 및 수지에서 DOTA-Lys(AMBF₃)-TATE 절단을 수행하였다. 수지를 실온에서 30분간 교반하였다. 여과물을 파이펫 팁 필터를 이용해 수집하여 수지를 제거하였다. 여과물은 부피가 ~50 내지 100 ㎕가 될 때까지 공기를 부드럽게 블로잉하여 농축하였다. 다이에틸 에테르 (1 mL)를 첨가하여 산물을 탈착시키고, 혼합물을 볼텍싱한 다음 원심분리하였다. 상층액을 제거한 다음 혼합물을 스피드 벡에 의해 건조시켰다. 수율은 3.2 mg이었다. ESI-MS(+): C₇₉H₁₁₄BF₃N₂₀O₂₁S₂에 대한 계산치 1811.8 m /z; 실측치 [M+2Na]⁺ = 1855.1 m /z.

DOTA - Bn -NH- Lys -( AMBF3 )- NHFmoc 합성

에펜도르프 튜브에서 A-Bn-NH₂ (10 mg, 0.015 mmol, 1 eq.)를 2:18) DIPEA:DMF (200 ㎕)에 용해한 다음, Fmoc-Lys(AMBF3)-NHS (14 mg, 0.025 mmol, 1.5 eq.)가 든 다른 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 로티세리 교반기를 사용해 교반하였다. 그런 후, 차가운 다이에틸 에테르 1 mL를 첨가하여 산물을 석출시켰다. 이를 볼텍싱하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 산물에 최소량으로 DMF (~50 ㎕)를 첨가하여 산물을 다시 용해하고, 다이에틸 에테르 (1 mL)를 첨가하여 조산물을 다시 헹구었다. 혼합물을 볼텍싱하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 그런 후, 산물을 건조시키고, 여기에 MeCN (~500 ㎕)을 첨가해 다시 용해하고 과량의 Fmoc-Lys(AMBF3)-NHS를 제거하였다. 혼합물을 원심분리하여 침전시키고, 과잉의 시약이 함유된 상층액을 제거하였다. 산물을 스피드 벡에서 1회 이상 건조하였다. 산물 샘플 소량을 MS 용도로 MeOH에 용해하였다. ESI-MS(+): C₅₀H₆₆BF₃N₁₀O₁₁에 대한 계산치 1050.94 m /z; 실측치 [M+H]⁺ = 1051.7 m /z, [TLC (1:19 NH₄OH:EtOH, 산물의 Rf = 0.2, 254 nm로 가시화 가능).

또한, 당해 기술 분야에서 훈련된 자라면, 상기 DOTA-Lys(AMBF₃)에 형광 분자를 추가로 접합시킬 수 있음을 알 것이다. 이러한 예는 다중 방식의 영상화 응용 분야에서 훈련받은 자가 고려할 수 있는 여러가지들 중 하나로서 아래에 제공된다. 이러한 예는 실행가능한 것으로 밝혀진 DOTA, Cy7 또는 LysAMBF₃로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 하나 이상의 구현예를 들어 기술되어 있다. 그러나, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 다수의 변형 및 수정을 행할 수 있음이 자명할 것이다. 본 발명의 범위는 실시예에 기술된 바람직한 구현예들로 제한되어서는 안 되며, 전체 내용에 부합되는 가장 넓은 의미로 제공되어야 한다.

우선권 적용. 본 출원은 2018년 12월 18일자 US 62/781,584에 대해 우선권을 주장하며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

Claims (25)

1. 화합물 또는 분자 복합체로서,
   상기 화합물 또는 분자 복합체가, 방사능 금속 동위원소 또는 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트화하도록 구성된 금속 킬레이터; 및 ¹⁹F/¹⁸F 교환하도록 구성된 트리플루오로보레이트 (BF₃)-함유 모이어티 또는 ¹⁸F-표지된 트리플루오로보레이트로 변환할 수 있는 보로네이트 전구체를 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
2. 화합물 또는 분자 복합체로서,
   상기 화합물 또는 분자 복합체가, 세포-표적화 도메인; 방사능 금속 동위원소 또는 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트화하도록 구성된 금속 킬레이터; 및 ¹⁹F/¹⁸F 교환하도록 구성된 트리플루오로보레이트 (BF₃)-함유 모이어티 또는 ¹⁸F-표지된 트리플루오로보레이트로 변환할 수 있는 보로네이트 전구체를 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
3. 제2항에 있어서,
   상기 세포-표적화 도메인이 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드 모방체, 핵산 앱타머, 마크로사이클, 스테로이드 또는 소분자를 포함하고,
   상기 세포-표적화 도메인이 세포 마커에 특이적으로 결합하는, 화합물 또는 분자 복합체.
4. 제3항에 있어서,
   상기 세포-표적화 도메인이 LLP2A, PSMA-617, TATE 또는 펩타이드 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂를 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 세포-표적화 도메인이 (i) 표적 세포의 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유도체 또는 단편을 포함하거나, 또는 (ii) 상기 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 유도체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 단백질 도메인을 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 금속 킬레이터가 BF₃-함유 모이어티를 함유한 링커를 통해 상기 세포-표적화 도메인에 연결된, 화합물 또는 분자 복합체.
7. 제6항에 있어서,
   상기 링커가 상기 BF₃-함유 모이어티를 여러개 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
   상기 링커가 펩타이드 링커인, 화합물 또는 분자 복합체.
9. 제8항에 있어서,
   상기 링커가 Lys(AMBF₃)를 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 킬레이터가 비-방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하지 않거나 또는 킬레이트를 형성하고, 상기 BF₃-함유 모이어티가 ¹⁸F-표지된, 화합물 또는 분자 복합체.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 킬레이터가 방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하고, 상기 BF₃-함유 모이어티가 ¹⁹F-표지된, 화합물 또는 분자 복합체.
12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 킬레이터가 방사능 금속 동위원소와 킬레이트를 형성하고, 상기 BF₃-함유 모이어티가 ¹⁸F-표지된, 화합물 또는 분자 복합체.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 방사능 금속 동위원소가 α 방출체, β 방출체 또는 오제 방출체인, 화합물 또는 분자 복합체.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 킬레이터가 DOTA 및 유도체; DOTAGA; NOTA; NODAGA; NODASA; CB-DO2A; 3p-C-DEPA; TCMC; DO3A; DTPA, 및 CHX-A"-DTPA 및 1B4M-DTPA로부터 선택적으로 선택되는 DTPA 유사체; TETA; NOPO; Me-3,2-HOPO; CB-TE1A1P; CB-TE2P; MM-TE2A; DM-TE2A; 사르코파긴, 및 SarAr, SarAr-NCS, diamSar, AmBaSar 및 BaBaSar로부터 선택적으로 선택되는 사르코파긴 유도체; TRAP; AAZTA; DATA 및 DATA 유도체; H2-macropa 또는 이의 유도체; H2dedpa, H4octapa, H4py4pa, H4Pypa, H2azapa, H5decapa 및 기타 피콜린산 유도체; CP256; PCTA; DOTP; HEHA; C-NETA; C-NE3TA; HBED; SHBED; BCPA; CP256; YM103; cyclam; DiamSar; 데스페리옥사민 (DFO) 및 DFO 유도체; H6phospa; 트리티올 킬레이트; 머캅토아세틸; 하이드라지노니코틴아미드; 다이머캅토숙신산; 1,2-에틸렌다이일비스-L-시스테인 다이에틸 에스테르; 메틸렌다이포스포네이트; 헥사메틸프로필렌아민옥심; 헥사키스(메톡시 이소부틸 이소니트릴); 포르피린, 클로린, 텍사프린, 및 프탈로시아닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 분자 복합체.
15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 킬레이터가 DOTA 및 DOTA 유도체로부터 선택되는, 화합물 또는 분자 복합체.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 BF₃-함유 모이어티가

    

    또는 표 3 또는 4에 나타낸 기이고, 여기서 각각의 R이 독립적으로 C₁-C₅ 선형 또는 분지형 알킬 기인, 화합물 또는 분자 복합체.
17. 제2항에 있어서,
    DOTA-AMBF3-PEG2-LLP2A;
    PSMA-617-LysAMBF3-DOTA;
    DOTA-Lys(AMBF3)-TATE; 및
    DOTA-Lys-AMBF3-Pip-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH₂로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물 또는 분자 복합체.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물 또는 분자 복합체가 형광단 또는 다른 광 방출 모이어티를 더 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
19. 제1항 또는 제18항에 있어서,
    Lys(AMBF₃)를 포함하는 화합물인, 화합물 또는 분자 복합체.
20. 제1항, 제18항 또는 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 금속 킬레이터가 DOTA인, 화합물 또는 분자 복합체.
21. 제20항에 있어서,
    상기 화합물이 DOTA-Bn-NH-Lys-(AMBF₃)를 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
22. 제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물 또는 분자 복합체가,
    질환 또는 병태의 세포 마커의 존재를 검증하기 위해 ¹⁸F로 표지된 화합물 또는 분자 복합체를 이용해 개체를 영상 촬영하고; 및
    치료학적 방사능 동위원소가 킬레이트화된 화합물 또는 분자 복합체를 이용해 질환 또는 병태를 치료하는데
    이용하기 위해, 상기 BF₃-함유 모이어티와 상기 세포 표적화 도메인을 둘다 포함하는, 화합물 또는 분자 복합체.
23. 제1항 또는 제6항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    개체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 및/또는 영상 촬영하기 위해 이중 특이성 항체와 조합하여 사용하기 위한 것이되, 상기 화합물 또는 분자 복합체는 상기 BF₃-함유 모이어티를 포함하는 화합물이고, 상기 세포-표적화 도메인은 포함하지 않으며,
    상기 이중 특이성 항체가 (i) 질환 또는 병태의 세포 마커 및 (ii) 상기 금속 킬레이터에 특이적인, 화합물 또는 분자 복합체.
24. 제23항에 있어서,
    상기 화합물 또는 분자 복합체가 상기 이중 특이성 항체와의 복합체로서 개체에 투여하기 위한 것인, 화합물 또는 분자 복합체.
25. 제23항에 있어서,
    상기 이중 특이성 항체는, 개체에 상기 화합물 또는 분자 복합체를 투여하기 전에, 상기 이중 특이성 항체가 상기 세포 마커에 결합하는 사전-표적화 단계에서, 상기 개체에 투여하기 위한 것인, 화합물 또는 분자 복합체.

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