KR20210107077A - 아데노바이러스 유형에 특이적인 dna 압타머 - Google Patents

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KR20210107077A
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레슬리 오고르잘리
사무엘 주르단
캐서린 멀홀랜드
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룩셈부르크 인스티튜트 오브 사이언스 앤드 테크놀로지 (리스트)
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Abstract

본 발명은, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 압타머를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출, 포획, 농축 및/또는 정량화하기 위한 상기 압타머의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 포획, 검출 및/또는 정량화하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출, 정량화, 포획 및/또는 농축하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

아데노바이러스 유형에 특이적인 DNA 압타머
본 발명은 하나 이상의 아데노바이러스 유형에 특이적인 압타머 및 그의 용도에 관한 것이다.
장내 바이러스(특히, 엔테로바이러스, 노로바이러스, 아데노바이러스, A형 간염 및 E형 간염 바이러스)는 감염자의 대변에 고농도로 존재하며, 이후 하폐수를 통해 수중 환경으로 퍼질 수 있다. 이 바이러스는 주로 사람에서 사람으로, 또는 오염된 음식과 음용수, 및 목욕 또는 여가 활동을 통해 전염된다. 이들 바이러스 중, 인간 아데노바이러스(HAdV)는 위장염, 결막염, 심근염 및 폐렴을 비롯한 다수의 질환을 일으킬 수 있다. 지리적으로, 이들 바이러스는 전세계적으로 분포되어 있으며, 강물, 해수 또는 지하수를 비롯한 다양한 수원에서 흔히 발견된다. 다른 장내 바이러스(예컨대, 엔테로바이러스 또는 노로바이러스)에 비해서, 이들은 일반적으로 더 풍부하고(Lee and Kim, 2008; Verheyen et al., 2009; Wyn-Jones et al., 2011), 1년 내내 발견되며, 수중에서 주목할 만한 생존 특성을 갖는다(Enriquez et al., 1995; Ogorzaly et al., 2010).
아데노바이러스(AdV)는 비-외피 바이러스의 일족이며 이중 가닥 DNA 게놈인 아데노바이러스과에 속한다. 분석 프레임워크 및 샘플의 종류(임상, 식품 또는 환경 샘플)에 따라, 각각 장단점이 있는 바이러스 게놈 또는 캡시드를 표적으로 하는 다양한 검출 방법이 적용될 수 있다. 분자 증폭 방법, 즉, 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 식품 및 환경 설정에서 일반적으로 사용되는 반면에, 항체를 사용하는 효소 결합 면역흡착 측정법(ELISA)과 같은 면역학적 기술은 임상 샘플에 대한 통칙이다. 항원 방법은 높은 바이러스 농도를 나타내는 샘플에서 적절히 작용하지만, 환경 및 식품 샘플에는 충분히 민감하지 않다. 더욱이, 항체의 결합 능력은 샘플의 복잡한 매트릭스에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 기존의 것을 보완하는 대안적 AdV 진단 도구를 개발함으로써, 관련 당국이 장 질환 및 기타 질환으로 인한 감염 위험을 줄이고 바이러스의 확산을 제한할 수 있도록 하는 신속하고 민감하며 효과적인 방법을 제공할 필요가 있다.
US 2017/0114420 A1로 공개된 선행 기술 특허 문헌은, 노로바이러스에 특이적으로 결합하는 압타머를 개시하고 있다. 압타머는 노로바이러스의 존재를 검출하고 테스트 샘플로부터 노로바이러스를 포획 및/또는 농축하는 데 사용된다. 그러나, 아데노바이러스를 검출하고 포획하기 위한 솔루션에 대한 개시 내용은 없다.
US 9,562,900 B2로 공개된 선행 기술 특허 문헌은, 식품 매개 및 수인성 병원체 박테리아 또는 기생충, 곰팡이 또는 기타 병원성 진균을 특이적으로 표적화하고 그에 결합하는 압타머를 개시하고 있다. 이 문헌은 음식 또는 물과 같은 샘플에서 바이러스, 보다 특히는 아데노바이러스를 분석(검출 등)하기 위한 도구를 개시하고 있지 않다.
EP 2 859 121 B1 및 EP 2 613 147 B1로 공개된 선행 기술 문헌은, 압타머를 사용하여 테스트 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 표적 분자를 검출하기 위한 방법, 장치, 시약 및 키트를 개시하고 있다. 이들 문헌은 아데노바이러스를 분석하기 위한 어떠한 도구도 개시하고 있지 않다.
본 발명은 샘플 중 아데노바이러스 유형 분석을 위한 신속하고 민감하며 효과적인 도구를 제공하는 것을 기술적 과제로 한다. 또한 본 발명은 고비용이 아닌 솔루션을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
본 발명은, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 적어도 하나의 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체, 및 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출, 포획, 정량화 및/또는 농축하기 위한, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 샘플에서 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 포획하는 시험관내 방법으로서, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 샘플에서 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출 및/또는 정량화하는 시험관내 방법으로서, 본 발명에 따른 시험관내 포획 방법을 수행하는 단계, 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 정량화하거나 검출하는 단계, 이로부터, 샘플에서 아데노바이러스의 양이나 존재 또는 부재를 추론하는 단계를 포함하는 시험관내 방법에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 정량화하거나 검출하는 단계는 대조군과의 비교를 통해 수행된다.
바람직한 실시양태에 따르면, 샘플에서 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는, 상기 압타머를 증폭하기 위한 PCR의 수행 및/또는 효소 결합 압타머 흡착 측정법(Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay)에 의해 실시되며, 상기 PCR은 서열 5'-GTGCCAGCTATGCCATTG-3' 및 5'-GCAGCAGAGATAGACGCTA-3'에 해당하는 2가지 프라이머의 세트로 수행된다.
바람직한 구체예에 따르면, 적어도 하나의 압타머는 검출가능한 표지를 포함하고, 샘플에서 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 표지를 검출함으로써 실시된다.
본 발명은 또한, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 적어도 하나의 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출, 정량화, 포획 및/또는 농축하기 위한 키트에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 키트는 적어도 하나의 아데노바이러스 유형의 적어도 하나의 포획 요소 및/또는 검출 수단을 갖는 지지체 또는 용액을 추가로 포함한다.
바람직한 실시예에 따르면, 적어도 하나의 포획 요소는 적어도 하나의 압타머 중 하나 이상을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 검출 수단은 검출가능한 표지가 결합된 압타머 중 하나 이상을 포함한다.
바람직한 실시양태에 따르면, 검출가능한 표지는 압타머의 5' 또는 3' 말단에 결합된다.
바람직한 실시양태에 따르면, 키트는 아데노바이러스에 결합된 압타머를 증폭하기 위해, 적어도 하나의 압타머에 결합할 수 있으며 서열 5'-GTGCCAGCTATGCCATTG-3' 및 5'-GCAGCAGAGATAGACGCTA-3'에 해당하는 2가지 프라이머의 세트를 추가로 포함한다.
본 발명은, 본 발명의 압타머가 아데노바이러스 유형에 특이적이고, 상이한 아데노바이러스 유형에 높은 친화도로 특이적으로 결합할 수 있다는 점에서 특히 흥미롭다. 압타머는 시판의 단일클론 항체 대신에 사용될 수 있다. 압타머는 아데노바이러스 유형에 대해 항체와 유사한 친화도를 나타낸다. 압타머는 장기적인 안정성을 나타낸다. 압타머는 항체에 비해 가격이 저렴하고 보관이 용이한 장점도 있다. 본 발명의 방법 및 키트는, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 정량화, 검출, 포획 및/또는 농축하는 데에 이용하고/하거나 수행하기 쉽다.
도 1은 20개의 비오틴화된 후보 압타머와 함께 인큐베이션된 HAdV-2(대략 107 MPN/웰)의 직접 ELISA 결과를 나타낸다. 모든 압타머는 1μM의 동일한 농도로 사용되었다.
도 2는 서열번호 1을 포함하는 압타머 10의 농도에 따른 결합된 HAdV-2의 백분율을 도시한다. 압타머의 농도는 0∼1000 nM 범위이다.
도 3은 0 ∼ 20 nM 범위의 압타머 농도에 대한 도 2의 확대도이다.
도 4는 서열번호 3을 포함하는 압타머 20의 농도에 따른 결합된 HAdV-2의 백분율을 도시한다. 압타머의 농도는 0∼1000 nM 범위이다.
도 5는 다양한 바이러스에 대한 압타머 10의 특이성을 도시한다.
도 6은 다양한 바이러스에 대한 압타머 20의 특이성을 도시한다.
바이러스 스톡의 생산 및 정제
압타머의 선택을 수행하기 위해 HAdV-2(인간 아데노바이러스 2형)를 선정하였다. HAdV-2는 영국 보건 보호국의 배양균 콜렉션(NCPV#213)로부터 수득하여, 인간 배아 신장 세포주 293A(Invitrogen)에서 증식시켰다. 세포는, 높은 글루코오스 농도 및 글루타맥스(Life Technologies)를 함유하며, 1%의 비필수 아미노산(Life Technologies) 및 5%의 비-열실활화된 소태아 혈청(Life Technologies)이 보충된 둘베코 수정 이글 배지(D-MEM)에서 성장시켰다. HAdV-2 스톡은 감염된 293A 단층으로부터 동결-해동 용해 후 원심분리(1200 rpm, 10분, 4℃)에 의해 제조하여 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 바이러스 현탁액을 염화세슘 평형 밀도 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 정제된 AdV 밴드를 주사기를 사용하여 수집하고, 분자량 컷오프가 100 KDa인 플로트 라이저(float-a-lyser) 투석 장치(Spectrum Labs, USA)에 직접 주입하였다. 투석 장치를, 4℃에서 온건히 회전(50 rpm)하면서 둘베코 PBS(DPBS)(Gibco)로 채워진 2L 용기에 넣었다. DPBS는 2-4시간, 6-8시간 및 12-14시간 후에 교체하였다. 투석 단계 후, 바이러스 현탁액을 수집하고 4℃에서 보관하였다. 정제된 HAdV-2 스톡의 정량화를, 293A 세포를 사용하는 최확수(MPN) 분석에 의해 수행하였다(Ogorzaly et al. 2013).
압타머의 선택
일정한 정방향 및 역방향 영역 및 각각의 위치에서 A, T, C 및 G의 등몰 혼입을 함유하는 28개 염기쌍 무작위 영역(N28)을 갖는 65개 염기쌍 조합 DNA 라이브러리(GTGCCAGCTATGCCATTG-N28-TAGCGTCTATCTCTGCTGC)를 합성하였다(Eurogentec). 선택하기 전에, 선택 완충액(본원에서 SB로 일컬음)[pH 7.4에서 MgCl2(3 mM) 및 NaCl2(20 mM)로 보충된 DPBS(Gibco)로 구성되고 오토클레이브와 그 후속의 0.2 μm 막 여과에 의해 멸균된 것] 중 단일 가닥 DNA(ss DNA) 풀(pool) 1 μM를 95℃로 가열하여 DNA를 변성시킨 다음, 바이러스와 함께 인큐베이션하기 전에 30분 동안 실온으로 냉각시켰다.
하기 표 1은 AdV에 대한 압타머의 선택에 사용된 올리고뉴클레오티드를 개시한다.
Figure pct00001
SELEX에 대한 표적 복합체는 정제된 HAdV-2를 항체-자성 비드 복합체에 고정화함으로써 제조하였다. AdV에 대한 비오틴화된 단일클론 항체 8C4(HyTest, Finland)를 스트렙트아비딘 다이나비즈(Streptavidin Dynabeads)(ThermoFisher Scientific Aalst, 벨기에)에, 제조사의 설명서에 따라 접합하였다. 간단히 말해서, 100 μL의 스트렙트아비딘 다이나비즈를 분취하고 세정 완충액 DPBS-T(0.005%의 Tween20을 함유하는 PBS)로 3회 세정하였다. 3배 과량의 비오틴화된 단일클론 항체 8C4(30 ㎍)를 5∼10 분마다 피펫팅에 의해 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 스트렙트아비딘 다이나비즈에 결합시켰다. 항체-비드 복합체를 자석에 의해 분리하고, DPBS-T로 3회 세정하고, 0.05% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma Darmstadt, Germany)을 함유하는 100 μL의 DPBS에서 용리시켰다. 100 μL의 정제된 HAdV-2 스톡(약 107 MPN/mL에 해당)을 490 μL의 SB에 현탁된 10 μL의 항체-비드 복합체와 혼합하고, 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 표적 복합체 HAdV-2-항체-비드를 0.1% BSA가 보충된 PBS로 3회 세정하고, 마지막으로 20 μL의 DPBS에 재현탁시켰다.
SELEX는 표적 복합체(HAdV-2-항체-비드)를 이용하여 수행하였고, 음성 SELEX는 항체-비드 복합체를 이용하여 수행하였다. 간단히, 선택 완충액 중 500 pmol/500 μL의 DNA 라이브러리를 95℃에서 5분 동안 가열함으로써 변성시키고, 30분 동안 실온으로 냉각하였다. DNA 풀과 표면의 비특이적 상호작용을 감소시키기 위해서, DNA 라이브러리를 실온에서 45분 동안 항체-비드 복합체와 함께 인큐베이션함으로써 음성 선택을 초기에 수행하였다. 결합된 DNA를 자석에 의해 분리하고, 상층액(재회수된 DNA 라이브러리)을 SELEX의 1회차에 직접 사용하였다. 재회수된 DNA를 10 μL의 표적 복합체(대략 107개의 감염성 바이러스 입자/반응에 해당함)에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 결합된 DNA 서열을 자기 포획에 의해 회수하고 DPBS-T로 3회 세정하여, 비결합제 및/또는 불량한 결합제의 제거를 촉진하였다. 100 마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 비드에 첨가하고, 그 샘플을 90℃로 5분 동안 가열하여 DNA를 방출하였다. ss-DNA는, 일정한 정방향 프라이머와 인산화된 역방향 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다(표 1). PCR 최종 부피는 50 μL였고, 그 중 10 μL에는 DNA 표적이 함유되어 있다. 반응은 Biometra T-Advanced 96SG System(독일) 상에서 수행되었으며, 다음의 조건들: 95℃에서 2분 후, 95℃에서 15초, 67℃에서 1분, 72℃에서 30초 및 72℃에서 2분의 최종 확장의 다양한 사이클이 적용되었다. PCR 생성물은 에티듐 브로마이드로 염색된 4% 아가로오스 겔에서 시각화하였다. PCR 반응은, 아가로오스 겔 상에 65 bp의 밴드가 나타났을 때 중지하였다. 이중 가닥 DNA(ds DNA)는, 스핀 컬럼(Nucleospin Gel 및 PCR 클린업 시스템, Machery-Nagel)을 사용하여 정제하였다. dsDNA의 분리를 위해, 1U Lambda 엑소뉴클레아제(Thermo Scientific, UK) 1μL를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 4% 아가로오스 겔 전기영동으로 ssDNA를 확인하였다. 모든 선택 회차는 동일한 방식으로, 그러나 HAdV-2 감염성 입자의 농도를 감소시키고 DNA 풀의 농도를 감소시키면서 수행하였다. 또한 인큐베이션 시간을 각각의 회차 사이에서 감소시켰고, 세정 단계를 부피와 양 모두에서 증가시킴으로써, 공정에 대한 선택압을 증가시켰다.
압타머 서열의 식별
9차, 10차 및 11차 SELEX 회차로부터 얻은 ssDNA를, 앞서 기술한 동일 조건에서 비변성 프라이머(표 1에서 D1 정방향 및 역방향)에 의해 증폭시켰다. 생성물을 에티듐 브로마이드로 염색된 4% 아가로오스 겔에 의해 분석하고, Purelink Quick 겔 추출 및 PCR 정제 콤보 키트(Invitrogen)를 사용하여 65 bp 밴드를 절단 및 정제하였다. 정제된 생성물을 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 이중 프로모터 PCR2.1 TOPO 벡터에 클로닝하였다. 총 86개의 백색 클론을, Sanger 시퀀서(Applied Biosystems) 상에서 수행되는 시퀀싱을 위해 선택하였다.
결합 친화도 연구
직접 ELASA(Enzyme Linked Aptamer Sorbent Assay: 효소 결합 압타머 흡착 측정법) 방법을 수행하여, 선택된 압타머 각각의 결합 활성을 시험하였다. 96웰 폴리스티렌 플레이트(Greiner)를 HAdV-2 입자에 의해 107 MPN/mL(대략 106 입자/웰) 농도로 코팅하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 300 μL의 DPBS로 5회 세정한 후, 웰을 300 μL의 3% BSA로 4℃에서 하룻밤 동안 블로킹하였다. 300 μL의 DPBS로 5회 세정한 후, 100 μL의 선택 완충액에 희석된 각각의 비오틴화된 후보 압타머 1 μM를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰은 300 μL의 DPBS-T로 2회, 및 300 μL의 1% BSA로 2회 세정하였다. 1% BSA에 희석된 100 마이크로리터의 스트렙트아비딘 접합 HRP(1/300, ThermoScientific)를 각각의 웰에 첨가하고, 암실에서 실온으로 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL의 DPBS로 3회 세정하고, 50 μL의 TMB 기질 용액(ThermoScientific)으로 암실에서 실온으로 30분 동안 현상하였다. 마지막으로, 50 μL의 2M 황산을 각각의 웰에 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 기록하였다(Tecan). 그 결과에 기초하여, 상위 3개의 압타머를 추가 분석용으로 선택하였다.
선택된 압타머의 결합 친화도를, 앞서 기술한 ELASA법을 이용하여 분석하였다. 107 MPN/mL 농도의 HAdV-2를 96웰 폴리스티렌 플레이트(Greiner)에 코팅하고, 다양한 농도(0-1000 nM)의 비오틴화된 압타머 10 및 20과 반응시켰다. 플레이트를 450 nm에서 판독하고, OD 값을 SigmaPlot 소프트웨어에 입력하고, 비특이적 결합이 있는 한 부위 포화 방정식을 이용하여 처리함으로써, Kd 값을 결정하였다.
도 1은 1 μM에서의 다양한 비오틴화된 후보 압타머와 함께 인큐베이션된 정제 HAdV-2의 직접 ELASA에 대해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 1의 결과에 기초하면, 압타머 10, 18, 20이 가장 유망한 후보이다.
도 2 및 3은 HAdV-2 및 압타머 10의 ELASA 결합 연구를 나타낸다. 그 결과는, 압타머 10이 고친화도로 HAdV-2에 특이적으로 결합할 수 있음을 시사한다. 상기 압타머의 Kd는 3.6 ± 0.7 nM인 것으로 계산되었다. 각각의 점은 6개의 독립적 실험의 평균이다.
도 4는 HAdV-2 및 압타머 20의 ELASA 결합 연구를 나타낸다. 그 결과는, 압타머 20이 높은 친화도로 HAdV-2에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여준다. Kd 값은 75.9 ± 68.6 nM으로 추정되었다. 각각의 점은 7개의 독립적 실험의 평균이다.
특이도 연구
압타머 10 및 20의 특이도를, 다양한 유형의 아데노바이러스(양 아데노바이러스 1형 및 소 아데노바이러스 9형)와 다양한 유형의 기타 수인성 바이러스(F-특이적 RNA 박테리오파지 균주 MS2, GA, Qβ 및 SP)를 사용하는 ELASA에 의해 분석하였다. 표적 및 비표적 바이러스를 동일한 초기 농도(대략 107 바이러스 입자/웰)로 플레이트에 코팅하고, 앞서 기술한 ELASA 프로토콜에 따라 80 nM 농도의 압타머 10 및 20 각각에 대해 시험하였다.
그 결과는 도 5 및 6에 제시되어 있으며, 압타머 10 및 20이 아데노바이러스 유형에 특이적임을 보여준다. 이들은 다른 수인성 바이러스가 아닌 아데노바이러스에 대해서만 신호를 생성한다.
모티브 및 구조 분석
모티프 분석은, 온라인 소프트웨어 프로그램인 MEME 모티프 디스커버리 툴에 의해 수행하였다. 각각의 압타머의 예측된 2D 폴딩은, 온라인 소프트웨어 프로그램인 MFOLD에 의해 수행하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
하기의 서열이 식별되었다:
서열 번호 1:
GTGCCAGCTATGCCATTGGGGGACAATATCGCAGTGCATCTTCCTCTAGCGTCTATCTCTGCTGC.
서열번호 2:
GTGCCAGCTATGCCATTGGCCAGTAGTTTCAGTCTACCAACGGTCATAGCGTCTATCTCTGCTGC.
서열번호 3:
GTGCCAGCTATGCCATTGGGCGGGTCGTCCAATTCGAGAGGTCCCCTAGCGTCTATCTCTGCTGC.
압타머 10, 18 및 20은 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3을 포함한다.
본 발명은, 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 제공한다. 바람직하게는, 변이체는 적어도 80%, 더 바람직하게는 90%의 서열 동일성을 갖는다.
압타머는 적어도 하나의 스템-루프 구조를 갖는다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 적어도 하나의 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체, 및 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 포함하는 조성물을 제공한다.
아데노바이러스 유형은, 예를 들어 인간 또는 동물 아데노바이러스일 수 있다.
본 발명은 또한, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출, 포획, 정량화 및/또는 농축하기 위한, 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 샘플에서 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 포획하는 시험관내 방법으로서, 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 샘플에서 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출 및/또는 정량화하는 시험관내 방법으로서, 상기 정의된 시험관내 포획 방법을 수행하는 단계, 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 정량화하거나 검출하는 단계, 및 이로부터, 샘플에서 아데노바이러스의 양이나 존재 또는 부재를 추론하는 단계를 포함하는 시험관내 방법을 제공한다. 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 정량화하거나 검출하는 단계는 대조군과의 비교를 통해 수행된다. 상기 방법은, 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 정량화하거나 검출하는 단계 이전에, 결합되지 않은 압타머를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
샘플에서 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는, 상기 압타머를 증폭하기 위한 PCR의 수행 및/또는 효소 결합 압타머 흡착 측정법(ELASA)에 의해 실시되며, 상기 PCR은 서열 5'-GTGCCAGCTATGCCATTG-3'(정방향) 및 5'-GCAGCAGAGATAGACGCTA-3'(역방향)에 해당하는 2가지 프라이머의 세트로 수행된다. 대안적으로, 적어도 하나의 압타머는 검출가능한 표지를 포함하고, 샘플에서 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 표지를 검출함으로써 실시된다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 적어도 하나의 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출, 정량화, 포획 및/또는 농축하기 위한 키트를 제공한다. 한 실시양태에 따르면, 키트는 적어도 하나의 아데노바이러스 유형의 적어도 하나의 포획 요소 및/또는 검출 수단을 갖는 지지체 또는 용액을 추가로 포함한다. 지지체는 고체 지지체, 예컨대 폴리스티렌 플레이트, 자기 비트 또는 추출, 크로마토그래피 또는 친화도 컬럼일 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시양태에 따르면, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형의 적어도 하나의 포획 요소는, 지지체 상에 또는 용액에 고정된 적어도 하나의 압타머이다.
키트는 또한 아데노바이러스와 결합된 압타머의 검출 수단을 포함할 수 있다. 한 실시양태에 따르면, 검출 수단은 검출가능한 표지가 결합된 압타머 중 하나 이상을 포함한다.
검출가능한 표지는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있는 모이어티일 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 표지는 광학 표지, 전기화학적 표지, 방사성 동위원소, 또는 이들의 조합일 수 있다. 검출가능한 표지는 압타머의 특정 염기, 압타머의 헤어핀 루프 구조와 같은 특정 구조의 특정 부위, 또는 압타머의 3'-말단 또는 5'-말단에 부착될 수 있다. 광학 표지는, 예를 들어 형광 물질일 수 있다. 또한, 광학 표지는 효소일 수 있으며, 이러한 효소는 효소 결합 면역흡착 측정법(ELISA)에 사용될 수 있다. 그 밖의 물질은 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
키트는, 아데노바이러스에 결합된 압타머를 증폭하기 위해, 적어도 하나의 압타머에 결합할 수 있으며 서열 5'-GTGCCAGCTATGCCATTG-3' 및 5'-GCAGCAGAGATAGACGCTA-3'에 해당하는 2가지 프라이머의 세트를 추가로 포함한다.
키트는 사용 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 양성 대조군, 예를 들어 불활성화된 아데노바이러스 입자 및 음성 대조군을 추가로 포함할 수 있다.
샘플은 임상 샘플, 예컨대 대변, 혈액; 환경 샘플, 예컨대 물, 침전물 및/또는 식품 샘플을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> Luxembourg Institute of Science and Technology (LIST) <120> DNA aptamers specific of Adenovirus types <130> PT06203WO <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Aptamer specific of Adenoviruses <400> 1 gtgccagcta tgccattggg ggacaatatc gcagtgcatc ttcctctagc gtctatctct 60 gctgc 65 <210> 2 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Aptamer specific of Adenoviruses <400> 2 gtgccagcta tgccattggc cagtagtttc agtctaccaa cggtcatagc gtctatctct 60 gctgc 65 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Aptamer specific of Adenoviruses <400> 3 gtgccagcta tgccattggg cgggtcgtcc aattcgagag gtcccctagc gtctatctct 60 gctgc 65 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 4 gtgccagcta tgccattg 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 gcagcagaga tagacgcta 19

Claims (14)

  1. 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체.
  2. 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 적어도 하나의 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체, 및 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 포함하는 조성물.
  3. 적어도 하나의 아데노바이러스 유형의 치료 방법에 사용하기 위한, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체.
  4. 샘플에서 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 포획하는 시험관내 방법으로서, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 시험관내 방법.
  5. 샘플에서 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출 및/또는 정량화하는 시험관내 방법으로서,
    - 제4항에 따른 시험관내 포획 방법을 수행하는 단계,
    - 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 정량화하거나 검출하는 단계,
    - 이로부터, 샘플에서 아데노바이러스의 양이나 존재 또는 부재를 추론하는 단계
    를 포함하는 시험관내 방법.
  6. 제5항에 있어서, 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 정량화하거나 검출하는 단계는 대조군과의 비교를 통해 수행되는 것인 시험관내 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 샘플에서 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는, 상기 압타머를 증폭하기 위한 PCR의 수행 및/또는 효소 결합 압타머 흡착 측정법에 의해 실시되며, 상기 PCR은 서열 5'-GTGCCAGCTATGCCATTG-3' 및 5'-GCAGCAGAGATAGACGCTA-3'에 해당하는 2가지 프라이머의 세트로 수행되는 것인 시험관내 방법.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 적어도 하나의 압타머는 검출가능한 표지를 포함하고, 샘플에서 아데노바이러스에 결합된 압타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계는 표지를 검출함으로써 실시되는 것인 시험관내 방법.
  9. 적어도 하나의 아데노바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있으며 서열번호 1 내지 3의 서열 중 하나를 포함하거나 그 하나로 구성되는 적어도 하나의 단일 가닥 핵산 압타머, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 그의 변이체를 포함하는, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형을 검출, 정량화, 포획 및/또는 농축하기 위한 키트.
  10. 제9항에 있어서, 적어도 하나의 아데노바이러스 유형의 적어도 하나의 포획 요소 및/또는 검출 수단을 갖는 지지체 또는 용액을 추가로 포함하는 키트.
  11. 제10항에 있어서, 적어도 하나의 포획 요소는 적어도 하나의 압타머 중 하나 이상을 포함하는 것인 키트.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 검출 수단은 검출가능한 표지가 결합된 압타머 중 하나 이상을 포함하는 것인 키트.
  13. 제12항에 있어서, 검출가능한 표지는 압타머의 5' 또는 3' 말단에 결합되는 것인 키트.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스에 결합된 압타머를 증폭하기 위해, 적어도 하나의 압타머에 결합할 수 있으며 서열 5'-GTGCCAGCTATGCCATTG-3' 및 5'-GCAGCAGAGATAGACGCTA-3'에 해당하는 2가지 프라이머의 세트를 추가로 포함하는 키트.
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