KR20210100575A - 조산 예측을 위한 진단용 단백질 마커 및 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조산 예측 진단용 바이오마커에 관한 것으로, 구체적으로 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3 단백질은 만기 출산과 조산에서 유의한 정량차이를 나타냄을 확인함으로써, 본 발명의 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3 유전자 또는 단백질을 포함하는 마커 조성물은 조기에 높은 민감도 및 특이도로 조산의 위험도를 평가하는데 사용될 수 있으며, 이를 통한 조산을 예방할 수 있다.
Description
본 발명은 조산 예측용 바이오마커에 관한 것으로, 보다 상세하게는 조산의 고위험군을 조기에 판별할 수 있는 단백질 마커 및 그 진단 방법에 관한 것이다.
세계보건기구에 따르면 1,500만명으로 추산되는 신생아가 매년 임신 37주 이전에 조산(preterm birth: PTB)으로 출생하고 있으며, 그 발생율은 매년 증가하고 있는 추세이다. 우리나라에서도 조산율이 매년 10%를 넘는 것으로 추산되고 있으며, 100만명으로 추산되는 신생아가 매년 조산 합병증으로 사망하고, 조산아는 생존 후에도 미숙아로서 신경계 발달장애, 간질, 호흡기 이상, 청각 손실, 시력 손실 등의 이환율이 높아 조산아의 치료에도 막대한 비용이 소모된다.
조산은 신생아 이환율과 사망률의 가장 큰 원인으로써, 신생아 사망의 70%가 조기 분만과 연관이 있다는 보고가 있다. 조산이 일어나는 원인은 크게 조기 진통(preterm labor: PTL)과 조기 양막 파수(preterm premature rupture of membrane: PPROM)에 의한 자연적 조산과 산모나 태아의 심각한 문제에 의해 인위적으로 임신을 종결해야하는 경우로 나눌 수 있다. 이 중 많은 빈도를 차지하는 것은 전자인 조기 진통이다.
그러나 조기 진통의 원인은 정확하게 밝혀지지 않고 있으며, 단지 고령 임신이 증가하고 보조생식술의 발달로 인해 다태 임신이 증가하는 것 때문인 것으로 추측되고 있다. 현재까지 조산의 치료를 위하여 조기 진통의 산모에게 자궁수축 억제제 투여, 항생제 치료, 스테로이드제 및 프로게스테론 투여를 통해 진통을 억제하고 분만을 지연시켜 왔다. 그러나 이미 조기 진통 및 조기 양막 파수가 발생한 경우에는 자궁 내 감염 및 염증에 대한 항생제의 치료 효과는 매우 제한적이며 조산을 막을 수는 없는 것으로 알려져 있다.
또한, 자궁경관 무력증의 산모인 경우 감염과 유산에 대한 위험도가 크기 때문에 조기 분만의 치료와 예방을 위해 자궁경부봉축술을 시행해 왔으나, 이것이 근본적인 치료는 될 수 없고, 단기간의 임신 연장에 도움이 되는 정도로 알려져 있다. 따라서 조기 양막 파수나 조산의 증상이 나타난 이후에 치료를 수행하는 것보다 조산의 위험을 조기에 예측하고, 이를 예방하는 것이 필요하다.
조산을 예측하기 위한 방법으로 risk scoring system, 과거 조산 병력 유무, 초음파를 통한 자궁경관의 변화 확인, 증상과 징후, 자궁경관 및 질 내 태아 파이브로넥틴(fetal fibronectin) 검출, ambulatory ureine contraction test 그리고, 타액 내 estriol 측정 방법들이 있다. 현재 유용하게 이용되는 것은 초음파를 이용하여 자궁경부 길이를 측정하는 것으로, 임신 16~24주 사이에 자궁경부 길이가 2.5 cm 미만인 경우 조산의 위험이 높아지는 것으로 판단하고 있다.
그러나 이러한 방법들은 그 방식이 민감하거나 특이적이지 않다는 문제가 있어, 생화학적인 표지자를 발견하고자 하는 연구가 시행되어 왔고, 프로게스테론 또는 C-반응성 단백질(C-reactive protein)과 같은 물질들이 후보로 거론되었으나 이 역시 정확도가 떨어지는 문제가 있다. 따라서 보다 검출이 용이하고 민감도 및 특이도가 높은 단백질 마커의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 정상 임산부들과 조산을 겪은 임산부 사이의 유전자의 발현 및 단백질 활성 차이를 발견하고, 상기 유전자 또는 단백질이 조산 예측을 진단하는 바이오마커가 될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 조산 예측 진단용 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 및 상기 유전자의 발현 또는 상기 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 조산 예측 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 및 상기 유전자의 발현 또는 상기 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 조산 예측 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 a) 개체로부터 얻은 생물학적 시료에서 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 유전자의 mRNA의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 조산 예측 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 및 상기 유전자의 발현 또는 상기 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 조산 예측 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 및 상기 유전자의 발현 또는 상기 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 조산 예측 진단용 키트를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 a) 개체로부터 얻은 생물학적 시료에서 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 유전자의 mRNA의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에 있어서, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법으로서 상기 GRN 또는 NEDD8 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 조산의 위험성이 높은 것으로 예측되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 조산의 위험성이 높은 것으로 예측되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈장, 혈청, 혈액, 소변, 양수, 활액(synovial fluid), 세척액(lavage fluid) 및 자궁경부 질액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), Rnase 보호 분석법(Rnase protection assay: RPA), 마이크로 어레이(microarray) 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 통하여 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 단백질의 활성 수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역형광염색법(immunofluorescene), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 통하여 측정되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조산 예측용 바이오마커 조성물은 임상적 진단이 어려운 무증상 임산부에 대해서도 조산을 조기에 예측할 수 있도록 함으로써, 사전 치료로 조산을 예방할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조산 예측을 위한 진단 방법 또는 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법에 의하면 경질 초음파 검사에 의한 자궁경부의 길이를 측정하는 검사에 비해 정확도 및 특이도가 높다.
본 발명에 따른 조산 예측용 바이오마커 조성물을 이용하여 다양한 단백질군을 마커로 활용함으로써 민감도를 높여 침습적인 추가 검사를 통하지 않고도 조산을 예측하는 것이 가능하다.
도 1은 정상 분만 시료와 조산 시료에 대한 질 세척액 유래 단백체 분석 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 정상 분만 시료와 조산 시료에 대한 단백체 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 정상 분만 시료와 조산 시료에 대한 질 세척액에서 up-/down- regulation된 단백질들의 세포 구성성분, 분자기능 및 생물학적 과정에 따른 분류를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 단백질 바이오마커 중, 대조군 시료에 비해 조산 시료에서 단백질 발현 수준(expression level)이 낮게 나타나는 바이오마커를 나타낸 비교 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 단백질 바이오마커 중, 대조군 시료에 비해 조산 시료에서 단백질 발현 수준이 높게 나타나는 바이오마커를 나타낸 비교 그래프이다.
도 6은 추가로 모집된 정상 분만 시료 및 조산 시료를 대상으로, 본 발명에 따른 단백질 바이오마커의 정량적 변화를 비교하여 검증하는 그래프이다.
도 2는 정상 분만 시료와 조산 시료에 대한 단백체 정량 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 정상 분만 시료와 조산 시료에 대한 질 세척액에서 up-/down- regulation된 단백질들의 세포 구성성분, 분자기능 및 생물학적 과정에 따른 분류를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 단백질 바이오마커 중, 대조군 시료에 비해 조산 시료에서 단백질 발현 수준(expression level)이 낮게 나타나는 바이오마커를 나타낸 비교 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 단백질 바이오마커 중, 대조군 시료에 비해 조산 시료에서 단백질 발현 수준이 높게 나타나는 바이오마커를 나타낸 비교 그래프이다.
도 6은 추가로 모집된 정상 분만 시료 및 조산 시료를 대상으로, 본 발명에 따른 단백질 바이오마커의 정량적 변화를 비교하여 검증하는 그래프이다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 조산 예측 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조산 예측 진단용 바이오마커 "GRN"은 그래뉼린(Granulin) 단백질을 암호화하는 유전자로서, 그래뉼린 단백질은 외부의 세균이나 바이러스로부터 유래한 DNA를 정확히 인식, 포획하여 여러 면역세포들에게 감염 여부를 알려줌으로써 감염된 세포를 효과적으로 제거하는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로 그래뉼린 단백질은 선천성 면역 반응에 필수적인 톨 수용체(Toll-like receptor)와의 결합을 통하여 면역반응의 활성을 조절할 수 있는 기능을 한다.
본 발명에 따른 조산 예측 진단용 바이오마커 "NEDD8(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 8)"은 NEDD8 유전자가 암호화하는 단백질로서, 기질 단백질에 대해 변형(modification)을 진행할 수 있는 유비퀴틴 단백질이다. NEDD8 단백질은 다른 단백질과 결합하여 기능이 변하는 네딜화 현상에 의해 스트레스 과립을 형성하고, Cullin 단백질의 변형을 통하여 Cullin-RING E3 연결효소의 활성을 제어, 조절한다는 점이 알려져 있다.
본 발명에 따른 조산 예측 진단용 바이오마커 "SERPINB12"는 Serpin B12(Plasminogen activator inhibitor type 12) 단백질을 암호화하는 유전자로서, Serpin B12 단백질은 세린 프로테아제 억제제(세르핀) 수퍼 패밀리 중의 Class B에 속한다.
본 발명에 따른 조산 예측 진단용 바이오마커 "CA1"은 Carbonic anhydrase 1(탄산무수화 효소) 단백질을 암호화하는 유전자로서, 탄산무수화 효소는 탄소 이산화물의 가역적 수화반응과 사이안아마이드를 수화하여 유레아로 변형시킨다(Briganti F. et al., J, Biol, Inorg. Chem,. 4:528-536, 1999). 탄산무수화 효소는 여러 조직 및 기관이 적절한 작용을 통해 생명 활동을 조절하도록 하는 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서, 단백질 정량 프로파일링을 통하여, 조산을 예측하는 데 유의미한 상관관계를 가지는 153개의 유전자를 선별하였고, 본 발명의 다른 일 실시예에서 조산을 경험한 환자군에서 전술한 단백질을 암호화하는 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준이 유의적으로 조산과 관련 있음을 확인하였다.
상기의 결과는 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 또는 TGM3 유전자가 조산의 조기 예측을 위한 진단에 있어 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어인 “진단(diagnosis)”이란, 넓은 의미에서는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미하고, 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에 있어서 진단은 조산의 예측 및 위험도 등을 판단하는 것이다.
본 발명은 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 및 상기 유전자의 발현 또는 상기 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 조산 예측 진단용 키트를 제공한다.
상기 제제는 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3 유전자에 대한 프라이머, 프로브 또는 각 단백질에 대한 항체인 것이 바람직하나 이제 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 생물학적 샘플에서 본 발명에 따른 바이오마커로 사용될 수 있는 유전자 또는 단백질의 검출 및 정량 분석에 필요한 임의의 수단을 포함할 수 있으며, 질량분석법 기반 표적 단백질 측정용 트립신 분해 펩티드(tryptic peptide)들에 대한 특정 질량[또는 질량 대 전하량(mass to charge, m/z)] 및 텐덤 질량(MS/MS) 스펙트럼에 대한 정보를 포함하며, 필요한 시약에 더하여 상기 키트는 타깃 펩티드를 결합하기 위한 항체 또는 이의 절편(fragment), 고체 기질, 항체-항원 복합체 검출용의 추가적인 항원 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법”이란, 진단을 위한 예비적 단계로서 조산의 예측을 위하여 필요한 객관적인 기초 정보를 제공하는 것이며, 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명은 a) 개체로부터 얻은 생물학적 시료에서 GRN, NEDD8, CA1, SERPINB12 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 유전자의 mRNA의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준을 대조군 시료와 비교하여 조산의 위험을 평가하는 단계;를 포함하는, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법을 제공한다.
상기 개체로부터 얻은 생물학적 시료는 혈장, 혈청(sera), 혈액, 소변(urine), 뇌척수액, 양수(amniotic fluid), 활액(synovial fluid), 세척액(lavage fluid) 및 자궁경부 질액(cervicovaginal fluid: CVF)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 자궁경부 질액으로부터얻어진 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
질량 분석기(mass spectrometer) 기반 단백질 정량(quantification)은 다수의 시료(sample)에 존재하는 단백질 혼합물을 트립신(trypsin) 효소 반응을 통해 펩티드화 한 후, 동위원소 표지 기법을 통해 시료 간 서로 다른 질량을 갖는 펩티드 혼합물을 제조한다. 동위원소 표지 기법에 의해 생성된 펩티드 혼합물은 시료 간 동일한 농도로 혼합한 후, 역상 액체크로마토그래피(reversed phase chromatography, RPLC)를 통해 펩타이드가 갖는 소수성 정도에 따라 분리한다. RPLC를 통해 분리되어 용리된 펩타이드는 전기분무 이온화(electrospray ionization, ESI) 과정을 통해 질량분석기에 도입되어 서로 다른 질량값을 갖는 펩티드 특이적 MS 및 MS/MS 분석을 통해 용리된 펩티드의 정성 분석 및 서로 다른 동위원소 비율로 상대적인 정량 비교분석이 가능하다.
이하 하기의 실시 예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기의 실시 예로 한정하는 것은 아니다.
<시험예 1> 실험준비 및 실험방법
1. 연구 대상집단의 준비
본 시험은 건양대학교 병원의 연구윤리위원회의 승인을 받아 건양대학교 병원에서 대상집단을 모집하였다. 62명의 임부로부터 동의를 받아 14주와 20주 임신기간에 있는 CVF 시료샘플을 수집하였다. 이들 중 9명은 추적 중 데이터를 소실하였고, 시험에 적합한 53명의 시료를 연구에 적용하였다. 53명의 참가자들에서 47명은 만기 출산, 6명이 조기 출산(preterm birth: PTB)을 하였으며, 조기 출산자들 중 1명의 데이터는 오염되어 제외하였다. 최종적으로 상기 47명의 만기 출산자들 중 20명을 컨트롤 집단으로 선정하고, 5명의 PTB군과 함께 단백질 프로파일링을 진행하였다.
2. 단백질 정량분석 및 결과
iTRAQ(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitaion)기반 동중 표지 기법을 이용하여 단백질 정량분석을 실시하였다. iTRAQ를 통한 정량 분석은 펩티드 말단에 동일한 m/ z 를 나타내는 동중 원소표지를 서로 다른 조건에서 추출한 시료들 각각에 서로 다른 동중 동위원소 표지 기법이다.
iTRAQ 기반 동중 표지에는 114 리포터 이온(reporter ion)을 갖는 iTRAQ-114는 컨트롤 CVF 시료, PTB CVF 시료는 115 리포터 이온, 5개의 개별적인 PTB CVF 시료는 각각 116, 117, 118, 119, 121로 동중 표지되었다. 2시간 동안 실온에서 반응 후, 오아시스 HLB 카트리지로 탈염시키고, 건조시켰다. CVF 프로테옴의 정량적 프로파일링을 위해 컨트롤 군으로부터 랜덤하게 선택된 7개의 개별 CVF 시료는 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119로 표지하였으며, pooled 컨트롤 시료는 121로 동중 표지되었다. 도 1에 이러한 과정에 대한 모식도가 나타나 있다.
3. 통계적 분석
개별 시료에 대한 two-sample student's t-test에서 p-value 0.05 미만을 기준으로 질 세척액에서 조산 시료/정상 분만 시료를 비교하였으며, 분석결과, 71개의 단백질이 정상 분만 시료 대비 1.5배 이상 증가하였으며, 82개의 단백질 종이 1.5배 이상 감소되었음을 도 2를 통해 확인할 수 있다.
또한, 상기 조산시료(PTB)에서 정량적으로 증가한 71개의 단백질과 감소한 82개의 단백질을 대상으로 Gene Ontology 분석을 수행하여 단백질을 세포 구성성분(cellular component), 분자 기능 (molecular function) 및 생물학적 과정 (biological process)으로 분류하였다. 도 3은 그 결과를 나타낸 그래프로서, 조산 시료(PTB)에서 정상 분만 시료(Control)에 비해 염증반응(inflammatory response), 세르핀 활성(Serine-type endopeptidase inhibitor activity), 세포골격의 구조체 (Structural constituent of cytoskeleton)를 담당하는 단백질군이 확연한 차이를 보였음을 확인할 수 있다.
<시험예 2> 조산의 예측을 위한 마커의 선별
도 3의 분석 결과를 바탕으로 염증반응에 관여하는 단백질 GRN, 세르핀 활성에 관여하는 단백질 SERPINB12, 세포골격의 구조체에 관련된 단백질 TGM3 및 그 외 2 종의 단백질(CA1과 NEDD8)을 조산의 예측을 위한 마커로 선별하였다.
도 4는 조산 시료(PTB)가 정상 분만 시료(Control)에 대하여 down-regulation되는 단백질 마커인 SERPINB12, TGM3 및 CA1에 대한 iTRAQ ratio값을 나타낸 그래프이다.
SERPINB12는 정상 분만 시료(Control)에 비해 조산 시료(PTB)에서 2.21배 감소 (p-value 0.0069), TGM3은 2.42배 감소 (p-value 0.0016), CA1은 2.11배 감소 (p-value 0.0068)하였다. 대상체의 질 세척액에서 상기 단백질들의 down regulation이 측정된 경우 조산의 고위험군에 해당하는 것으로 진단이 가능함을 확인할 수 있다.
도 5는 조산 시료(PTB)가 정상 분만 시료(Control)에 대하여 up-regulation되는 단백질 마커인 NEDD8 및 GRN에 대한 iTRAQ ratio값을 나타낸 그래프이다. NEDD8은 정상 분만 시료(Control)에 비해 조산 시료(PTB)에서 1.59 배 증가 (p-value 0.0051), GRN은 1.78 배 증가 (p-value 0.0051)하였다. 대상체의 질 세척액에서 상기 단백질들의 up regulation이 측정된 경우 조산의 고위험군에 해당하는 것으로 진단이 가능함을 확인할 수 있다.
<시험예 3> 조산 예측 마커의 검증
상기 5종의 조산 예측 마커 (SERPINB12, TGM3, CA1, NEDD8 및 GRN)의 검증을 위해 건양대학교 병원에서 추가 연구대상 집단을 모집하였다. 50명의 만기 출산자(Control), 12명의 조기 출산(PTB)자의 질 세척액 시료(임신 14-20 주 사이)가 확보되었으며, 무작위적으로 선정된 7개의 정상분만 시료(Control)와 9개의 조산 시료 (PTB)를 대상으로 검증 실험을 수행하였다. 12명의 조기 출산(PTB)자의 질 세척액 시료 중 3개의 시료는 시료 양의 부족으로 분석을 수행하지 못하였다. 실험 방법은 시험예 1과 동일하게 iTRAQ 정량 분석법을 사용하였다.
도 6은 조산 시료(PTB)가 정상 분만 시료(Control)에 대하여 up/down-regulation되는 단백질 마커인 SERPINB12, TGM3, CA1, NEDD8 및 GRN에 대한 iTRAQ ratio값을 나타낸 그래프이다.
SERPINB12는 정상 분만 시료(Control)에 비해 조산 시료(PTB)에서 1.78배 감소(p-value 0.019), TGM3은 1.97배 감소(p-value 0.008), CA1은 1.93배 감소 (p-value 0.000)하였다. NEDD8은 정상 분만 시료(Control)에 비해 조산 시료(PTB)에서 1.67배 증가(p-value 0.013), GRN은 1.68배 증가(p-value 0.009)하였다. 이를 통해, 대상체의 질 세척액에서 상기 단백질들의 up/down regulation이 측정된 경우 조산의 고위험군에 해당하는 것으로 진단이 가능함을 확인할 수 있다.
<110> Korea Research Institute Standard and Science
<120> PROTEIN MARKERS FOR PREDICTING OF PRETERM BIRTH AND DIAGNOSTIC
METHODS THEREOF
<130> RESI0096500023
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 81
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Leu Ile Lys Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Glu Ile Glu Ile Asp
1 5 10 15
Ile Glu Pro Thr Asp Lys Val Glu Arg Ile Lys Glu Arg Val Glu Glu
20 25 30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Gln Gln Gln Arg Leu Ile Tyr Ser Gly Lys
35 40 45
Gln Met Asn Asp Glu Lys Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ser Val Leu His Leu Val Leu Ala Leu Arg Gly Gly Gly Gly Leu Arg
65 70 75 80
Gln
<210> 2
<211> 405
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asp Ser Leu Val Thr Ala Asn Thr Lys Phe Cys Phe Asp Leu Phe
1 5 10 15
Gln Glu Ile Gly Lys Asp Asp Arg His Lys Asn Ile Phe Phe Ser Pro
20 25 30
Leu Ser Leu Ser Ala Ala Leu Gly Met Val Arg Leu Gly Ala Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Ala His Gln Ile Asp Glu Val Leu His Phe Asn Glu Phe Ser
50 55 60
Gln Asn Glu Ser Lys Glu Pro Asp Pro Cys Leu Lys Ser Asn Lys Gln
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Lys Ala Gly Ser Leu Asn Asn Glu Ser Gly Leu Val Ser Cys Tyr Phe
85 90 95
Gly Gln Leu Leu Ser Lys Leu Asp Arg Ile Lys Thr Asp Tyr Thr Leu
100 105 110
Ser Ile Ala Asn Arg Leu Tyr Gly Glu Gln Glu Phe Pro Ile Cys Gln
115 120 125
Glu Tyr Leu Asp Gly Val Ile Gln Phe Tyr His Thr Thr Ile Glu Ser
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Val Asp Phe Gln Lys Asn Pro Glu Lys Ser Arg Gln Glu Ile Asn Phe
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Asp Ala Ile Asn Ala Glu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Ala Val Tyr
180 185 190
Phe Lys Ala Lys Trp Glu Thr Tyr Phe Asp His Glu Asn Thr Val Asp
195 200 205
Ala Pro Phe Cys Leu Asn Ala Asn Glu Asn Lys Ser Val Lys Met Met
210 215 220
Thr Gln Lys Gly Leu Tyr Arg Ile Gly Phe Ile Glu Glu Val Lys Ala
225 230 235 240
Gln Ile Leu Glu Met Arg Tyr Thr Lys Gly Lys Leu Ser Met Phe Val
245 250 255
Leu Leu Pro Ser His Ser Lys Asp Asn Leu Lys Gly Leu Glu Glu Leu
260 265 270
Glu Arg Lys Ile Thr Tyr Glu Lys Met Val Ala Trp Ser Ser Ser Glu
275 280 285
Asn Met Ser Glu Glu Ser Val Val Leu Ser Phe Pro Arg Phe Thr Leu
290 295 300
Glu Asp Ser Tyr Asp Leu Asn Ser Ile Leu Gln Asp Met Gly Ile Thr
305 310 315 320
Asp Ile Phe Asp Glu Thr Arg Ala Asp Leu Thr Gly Ile Ser Pro Ser
325 330 335
Pro Asn Leu Tyr Leu Ser Lys Ile Ile His Lys Thr Phe Val Glu Val
340 345 350
Asp Glu Asn Gly Thr Gln Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Val Val Ser
355 360 365
Glu Arg Ser Leu Arg Ser Trp Val Glu Phe Asn Ala Asn His Pro Phe
370 375 380
Leu Phe Phe Ile Arg His Asn Lys Thr Gln Thr Ile Leu Phe Tyr Gly
385 390 395 400
Arg Val Cys Ser Pro
405
<210> 3
<211> 593
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Trp Thr Leu Val Ser Trp Val Ala Leu Thr Ala Gly Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly Thr Arg Cys Pro Asp Gly Gln Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu
20 25 30
Asp Pro Gly Gly Ala Ser Tyr Ser Cys Cys Arg Pro Leu Leu Asp Lys
35 40 45
Trp Pro Thr Thr Leu Ser Arg His Leu Gly Gly Pro Cys Gln Val Asp
50 55 60
Ala His Cys Ser Ala Gly His Ser Cys Ile Phe Thr Val Ser Gly Thr
65 70 75 80
Ser Ser Cys Cys Pro Phe Pro Glu Ala Val Ala Cys Gly Asp Gly His
85 90 95
His Cys Cys Pro Arg Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg Ser Cys
100 105 110
Phe Gln Arg Ser Gly Asn Asn Ser Val Gly Ala Ile Gln Cys Pro Asp
115 120 125
Ser Gln Phe Glu Cys Pro Asp Phe Ser Thr Cys Cys Val Met Val Asp
130 135 140
Gly Ser Trp Gly Cys Cys Pro Met Pro Gln Ala Ser Cys Cys Glu Asp
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Arg Val His Cys Cys Pro His Gly Ala Phe Cys Asp Leu Val His Thr
165 170 175
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370 375 380
Glu Trp Gly Cys Cys Pro Ile Pro Glu Ala Val Cys Cys Ser Asp His
385 390 395 400
Gln His Cys Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Cys Val Ala Glu Gly Gln Cys
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Arg Ala Ser Leu Ser His Pro Arg Asp Ile Gly Cys Asp Gln His Thr
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Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu
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Leu
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<211> 261
<212> PRT
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1 5 10 15
Trp Ser Lys Leu Tyr Pro Ile Ala Asn Gly Asn Asn Gln Ser Pro Val
20 25 30
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35 40 45
Ser Val Ser Tyr Asn Pro Ala Thr Ala Lys Glu Ile Ile Asn Val Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Tyr Ser Ser Leu Ala Glu Ala Ala Ser Lys Ala Asp Gly Leu Ala Val
130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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Ala Gln Phe Arg Ser Leu Leu Ser Asn Val Glu Gly Asp Asn Ala Val
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Val Arg Ala Ser Phe
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<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Leu Ile Lys Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Glu Ile Glu Ile Asp
1 5 10 15
Ile Glu Pro Thr Asp Lys Val Glu Arg Ile Lys Glu Arg Val Glu Glu
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Lys Glu Gly Ile Pro Pro Gln Gln Gln Arg Leu Ile Tyr Ser Gly Lys
35 40 45
Gln Met Asn Asp Glu Lys Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ile Leu Gly Gly
50 55 60
Ser Val Leu His Leu Val Leu Ala Leu Arg Gly Gly Gly Gly Leu Arg
65 70 75 80
Gln
Claims (9)
- GRN, NEDD8, CA1, 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 조산 예측 진단용 바이오마커 조성물.
- GRN, NEDD8, CA1, 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질; 및
상기 유전자의 발현 또는 상기 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제;를 포함하는, 조산 예측 진단용 조성물. - GRN, NEDD8, CA1, 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질; 및
상기 유전자의 발현 또는 상기 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제;를 포함하는, 조산 예측 진단용 키트. - a) 개체로부터 얻은 생물학적 시료에서 GRN, NEDD8, CA1, 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 유전자의 mRNA의 발현 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계;를 포함하는, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법. - 제 4항에 있어서,
상기 GRN 또는 NEDD8 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 조산의 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법. - 제 4항에 있어서,
상기 CA1, 및 TGM3으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 또는 활성 수준이 대조군 시료보다 낮을 경우 조산의 위험성이 높은 것으로 예측되는 것인, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법. - 제 4항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈장, 혈청, 혈액, 소변, 뇌척수액, 양수, 활액(synovial fluid), 세척액(lavage fluid) 및 자궁경부 질액으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법. - 제 4항에 있어서,
상기 mRNA의 발현 수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RTPCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), Rnase 보호 분석법(Rnase protection assay: RPA), 마이크로 어레이(microarray) 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 통하여 측정되는 것인, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법. - 제 4항에 있어서,
상기 단백질의 활성 수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역형광염색법(immunofluorescene), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법을 통하여 측정되는 것인, 조산 예측 진단을 위한 정보제공 방법.
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