KR20210099037A - 바실루스 메가테리움 속의 프로바이오틱 균주 및 다중불포화 지방산 성분을 포함하는 제제 - Google Patents

바실루스 메가테리움 속의 프로바이오틱 균주 및 다중불포화 지방산 성분을 포함하는 제제 Download PDF

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이네스 오흐롬벨
마틴 실링
마리오 고메즈
미하엘 쉬바름
스테판 펠체르
제시카 클라인뵐팅
토마스 베릉루버
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에보니크 오퍼레이션즈 게엠베하
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Abstract

본 발명은 바실루스 메가테리움 속에 속하는 적어도 하나의 프로바이오틱 균주, 및 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA), 아라키돈산(ARA), 알파 리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 리놀레산, γ-리놀렌산으로부터 선택된 적어도 하나의 오메가-3 또는 오메가-6 지방산을 포함하는 다중불포화 지방산 성분을 포함하며, 여기서 다중불포화 지방산 성분은 오메가-3 또는 오메가-6 지방산 염을 포함하는 것인 제제에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 사료 또는 식품 보충제, 제약 제품, 사료- 또는 식품 조성물로서의 및 국소 적용을 위한 본 발명의 제제의 용도에 관한 것이다.

Description

바실루스 메가테리움 속의 프로바이오틱 균주 및 다중불포화 지방산 성분을 포함하는 제제
본 발명은 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium) 속에 속하는 적어도 하나의 프로바이오틱 균주 또는 바실루스 메가테리움 추출물, 및 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA), 아라키돈산(ARA), 알파 리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 리놀레산, γ-리놀렌산 및/또는 그의 유도체로부터 선택되는 적어도 하나의 오메가-3 또는 오메가-6 지방산을 포함하는 다중불포화 지방산 성분을 포함하는 제제에 관한 것이다.
오메가-3 지방산, 즉 알파-리놀레산(ALA), EPA 및 DHA의 식이 섭취는, 특히 예를 들어 류마티스 관절염의 개선 및 심혈관 질환 위험 인자의 감소와 관련하여 인간 건강에 유익하다[1, 2]. 다양한 해산물 제품이 식이 EPA/DHA의 공급원이지만, 그의 소비는 종종 권장 식이 허용량(전형적으로 1 일에 500 mg EPA 및 DHA)을 충족시키기에 충분하지 않다[3]. 이러한 간극은 오메가-3 지방산을 함유하는 식이 보충제 또는 강화 식품의 광범위한 사용에 의해 좁혀진다[4]. 식이 보충제는 영양소 또는 영양 또는 생리학적 효과를 갖는 다른 물질의 농축된 공급원이며, 그의 목적은 정상 식사를 보충하는 것이다(www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/food-supplements). 예를 들어, 오메가-3 지방산 보충제는 종종 어유, 크릴유 또는 조류로부터의 EPA/DHA의 트리글리세리드 또는 오메가-3 에틸 에스테르를 함유한다.
오메가-3 지방산은 일반적으로 항염증, 심장- 및 신경보호 효과를 갖는다[2, 5]. 그의 작용 방식은, 예를 들어 반응성 산소 종의 직접 스캐빈징, 세포 신호전달 사건에 후속적으로 영향을 미치는 세포 막 유동성의 변경, 염증유발 및 항염증 시토카인의 생합성을 조율하는 전사 인자, 예컨대 PPARG 및 NFKappaB의 활성의 조정, 및 시클로옥시게나제 및 리폭시게나제에 의해 염증유발 시토카인으로 전환되는 기질의 경쟁적 배제를 수반한다.
보다 최근에, 오메가-3 및 오메가-6 지방산의 여러 산소화 생성물이 확인되었고 특히 만성 염증 상태의 개선과 관련하여 그의 유익한 건강 효과의 중대한 매개인자로서 기능적으로 특성화되었다[6]. 이들 제품은 마레신(MaR), E- 및 D- 계열 레졸빈(RvE 및 RvD), 프로텍틴, 리폭신, 및 그의 전구체 예컨대 18-히드록시-에이코사펜타엔산(18-HEPE), 17-히드록시-도코사헥사엔산(17-HDHA), 및 17,18-에폭시에이코사테트라엔산(17,18-EEQ), 총칭하여 전문 해소-촉진 지질 매개인자(SPM)로 지칭되는 것을 포함한다. SPM은 리폭시게나제, 시클로옥시게나제-2, 및 시토크롬 P450 모노옥시게나제(CYP450)에 의해 내인성으로 형성되고, 나노몰 농도에서 G-단백질 커플링된 수용체를 통해 신호전달하는, 활성 염증 해소의 강력한 작용제로서 작용한다. 다수의 감염 및 염증 질환에 대한 SPM의 유효성은 설치류에 대한 연구에서 입증되었다[6]. 예를 들어, RvE1, RvD2, 프로텍틴 D1(PD1), 및 LXA4는 병원성 슈도모나스 깅기발리스(Pseudomonas gingivalis)[7], 이. 콜라이(E.coli)[8], 단순 포진(Herpes simples)[9], 칸디다(Candida)[10], H5N1 인플루엔자(Influenza)[11]의 제거를 증진시킨다.
LXA4, LXB4, RvE1, RvE3, RvD1-5, RvD2, PD1, MaR1, MaR2는 치주염, 낭포성 섬유증, 신경염증, 허혈성 뇌졸중, 알츠하이머 질환[12], 죽상동맥경화증[13], 비-알콜성 지방간 질환[14], 각막 손상[15], 망막병증[16], 녹내장[17], 대장염[18], 천식[19, 20], 인슐린 저항성[14], 관절염[21] 및 통증[22]의 모델에서 보호적이다. 또한, SPM의 몇몇 전구체는 그 자체가 해소-촉진 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 18-히드록시-에이코사펜타엔산(18-HEPE)은 혈관 내피 세포에 대한 단핵구 부착을 억제하고[23] 압력 과부하-유도된 부적응 심장 리모델링을 억제함으로써[24] 심혈관 질환의 발생을 방해한다. 유사하게, 17,18-EEQ는 심장-보호, 항부정맥, 혈관확장 및 항염증 특성을 갖는다[5]. 장 신경교 세포에 의한 ARA-유래 15-HETE의 파라크린 분비는 예를 들어 크론 질환에서 손상되는 과정인 장 장벽 기능을 지지한다[25].
그러나, 이들 유망한 전임상 발견을 인간 건강의 개선으로 해석하는 것은 도전적인 것으로 나타났다. 실험 연구에서 수행된 바와 같이, 정맥내 또는 복강내 주사에 의한 SPM의 직접 전달은 인간에 대해 실현가능하지 않고, 특히 예방적 접근법의 맥락에서 실현가능하지 않다. SPM- 또는 SPM 전구체-함유 보충제 또는 식품의 경구 전달은 생물학적 유체에서 그의 상대적으로 짧은 반감기로 인해 합리적이지 않으며, 따라서 그의 표적 조직에 도달할 가능성이 없다. 이와 관련하여, WO 2017/041094에는 농축된 에스테르화 어유가 단지 ~ 0.0005 %의 18-HEPE 및 17-HDHA를 함유하고, 심지어 초임계 유체 추출에 의한 이들 SPM 전구체의 농축도 0.05 %(18-HEPE + 17-HDHA)/총 오메가-3 이하를 수득한다고 개시한다.
EPA/DHA를 사용한 임상 시험은 특히 염증 장 질환, 천식, 및 대사 증후군의 형질을 갖는 환자에 대해 결정적이지 않거나 무효한 결과를 수득하였다[2]. 인간에 대한 이익의 이러한 결여는 SPM에 의한 각각의 동물 질환 모델의 효과적인 치료와 대조적이다[6]. 우리는 오메가-3(및 오메가-6)의 SPM으로의 전환이 다중불포화 지방산(PUFA)을 사용하여 염증 질환을 예방, 치유, 또는 치료하는 것을 목표로 하는 임의의 개입으로부터의 성공적인 결과를 전달하는데 결정적인 중대한 단계라고 판단한다. 우리는 또한 SPM-제조 기구가 특정 조건 하에 제대로 기능을 하지 않는 것으로 생각한다. 이러한 아이디어는 당뇨병성 상처[26], 대사 증후군[27], 천식[19, 28], 궤양성 대장염[29], 크론 질환[25] 및 치주염[30]에서의 감소된(국부 또는 순환) SPM 수준, 뿐만 아니라 중증 천식[28], 궤양성 대장염[29], 낭포성 섬유증[31], 치주염[30] 및 알츠하이머 질환[12]에서의 SPM-제조 효소의 감소된 발현 또는 활성의 발견에 의해 지지된다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 언급된 상태를 앓고 있는 인간 및 동물에게 이익을 제공하기 위해 유기체 내부에서의 SPM 형성을 촉진하고 오메가-3 단독의 보충을 거의 또는 전혀 성공하지 못하는 이러한 및 유사한 상태를 예방, 개선 또는 치유하기 위한 신규 전략을 필요로 하는 기술을 제공하는 것이다.
이러한 목표는, 조합 기술이 오메가-3 공급원 단독과 비교하여 증진된 및/또는 표적화된 효능을 전달하도록, 적합한 제제에서 적합한 오메가-3 공급원을 새로 발견된 미생물 SPM-생산자와 조합하는 본 발명에 의해 달성된다. 적합한 제제는 소장에서 먼 위장 절편에서 성분의 동시 방출을 가능하게 하여, 오메가-3 공급원이 소장에서 흡수되는 것을 방지하고 미생물 SPM-생산자에 의한 대사에 보다 이용가능하게 한다.
SPM의 생합성은 진핵 세포, 특히 과립구 및 단핵구에 대해 상세하게 기재되어 있다. 대식세포는 SPM 생합성에 필요한 모든 효소를 발현할 수 있다; 선택된 효소만을 발현하는 다른 세포 유형은 상보성 세포와 함께 그렇게 할 수 있다. ALOX5는 비만 세포에서, ALOX12는 피부 및 상피 세포에서, ALOX15는 수지상 및 장 신경교 세포에서[25], 및 COX-2 및 CYP450 이소형은 상피 세포에서 발견된다.
장 미생물총이 식품 성분에 대한 개체의 반응을 결정하고 후속적으로 건강 결과를 변형시킨다는 것을 고려하여, 우리는 이를 촉진된 내인성 SPM 제조의 우리의 기술적 접근법에 대한 표적으로서 확인하였다. 미생물총-표적화 전략은 일반적으로 미생물총의 조성 및 활성을 변형시키기 위한 의도로 프리바이오틱스 및 프로바이오틱스의 적용을 포함한다. 프로바이오틱스는 살아있는 미생물이며, 이는 적절한 양으로 투여될 때 숙주에 건강상 이익을 부여한다(FAO-WHO; Probiotics in food. Health and nutritional properties and guidelines for evaluation; FAO Food and Nutritional Paper 85, 2006). 프리바이오틱스는 유익한 미생물의 성장을 지지한다. 오메가-3 지방산의 프리바이오틱 효과가 기재되어 있지만[32, 33], 그 반대의 경우, 오메가-3에 대한 장 미생물의 가능한 대사 영향이 결정되어야 하는 것으로 남아있고, 본 발명에 개시되어 있다. 장-거주 미생물에서의 산소-소모 효소의 발생은 제한적이며; 병원성 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의해 발현되는 15-리폭시게나제를 제외하고는, 시클로옥시게나제 및 리폭시게나제는 위장 박테리아 및 고세균에 존재하지 않는 것으로 보인다[34]. CYP450 모노옥시게나제는 바실루스 속(Genus Bacillus)에서 검출되었다[35]. CYP450BM-3으로 또한 명명되는 CYP102A1은 연속적인 옥시게나제 및 리덕타제 활성을 통해 다중불포화 지방산의 NADPH-의존성 히드록실화를 촉매하는 바실루스 메가테리움 종에서 발견되는 이관능성 효소이다. 이 P450 시스템은 하나는 헤모단백질을 함유하고 다른 하나는 FAD-리덕타제를 함유하는 2개의 상이한 도메인을 갖는 폴리펩티드 쇄로 이루어진다. 이 박테리아 시토크롬 P450 군은 가용성이고 [2Fe-2S] 유형의 철-황 단백질을 통해 NADH-의존성 FAD-함유 리덕타제로부터 반응 메카니즘에 필요한 전자를 수득한다[36]. 발현 벡터 구축물로부터 유래된 정제된 CYP450BM-3은 무세포 반응에서 EPA로부터 18-HEPE를 생성하는 것으로 나타났다[37]. 그러나, 야생형 프로바이오틱 균주가 세포 외 EPA/DHA의 18-HEPE 또는 다른 SPM으로의 활성화를 위한 "촉매"인 프로바이오틱 또는 신바이오틱 전략에서의 이러한 반응의 가능한 적용은, 보다 중요하게는 이들 분자를 숙주에게 이용가능하게 하는 것으로 기재되지 않았다. 또한, 임의의 다른 프로바이오틱 미생물에 의한 오메가-3 또는 오메가-6 화합물의 임의의 다른 SPM 또는 생물활성 지질 매개인자로의 산소화는 지금까지 기재되지 않았다.
본 발명은 바실루스 메가테리움 속에 속하는 적어도 하나의 프로바이오틱 균주, 및 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA), 아라키돈산(ARA), 알파 리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 리놀레산, γ-리놀렌산으로부터 선택된 적어도 하나의 오메가-3 또는 오메가-6 지방산을 포함하는 다중불포화 지방산 성분을 포함하며, 여기서 다중불포화 지방산 성분은 오메가-3 또는 오메가-6 지방산 염을 포함하는 것인 제제에 관한 것이다.
이러한 새로운 제제는 장 내강에서의 다양한 SPM의 형성을 촉진하고, 이에 의해 이들은 숙주에게 이용가능하게 되고 그 안에서 생리학적 기능을 발휘한다. EPA/DHA로부터 SPM의 생합성에 필요한 산소는 장 내강에서 이용가능하다: 인간 직장 내의 기체는 보고에 따르면 0.3 - 1.8 % 산소를 함유한다[38]. 또한, (혈관화) 맹장 점막을 향해 1에서 40 mmHg pO2로 증가하는 관강내 산소의 방사상 분배가 쥐에 대해 기재되었으며[39], 이는 점막과 연관된 내기성 미생물이 산소-의존성 생화학적 반응을 허용하는 상대적으로 산소-풍부한 환경에 직면함을 나타낸다.
바실루스 메가테리움 종의 박테리아는 이러한 효과에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 프로바이오틱 균주는 이 종의 균주를 포함한다. 본 발명의 중대한 특징은 균주가 숙주에 대한 생리학적 효과를 도출하기 위한 필수 조건인 SPM의 세포 외 양을 초래한다는 것이다. 우리는 나노몰 수준에서 세포 외 SPM의 바실루스 메가테리움-의존성 제조를 개시하고 -여기서 일부 SPM은 인간 혈장에 대해 보고된 것[27, 40, 41] 및 부분적으로 모유에 대해 보고된 것[42]을 초과하는 피코몰 수준[6]에서 생리학적으로 활성이다.- 본 발명에 따르면, 박테리아 세포의 모든 성분을 포함하는 전체 세포 및 용해된 박테리아 세포 둘 다를 사용하는 것이 실현가능하다. 세포 추출물이 또한 사용될 수 있다.
바실루스 메가테리움은 최근에 인간 분변[43] 및 타액[44] 샘플에서 검출되었으며, 이는 이들 박테리아가 인간 장의 거주물임을 나타낸다. 따라서 본 발명은 또한 천연 발생 장 거주물로서, 예를 들어 바실루스 메가테리움 종의 균주를 통한 위장 미생물총에 의한 위장관에서의 다양한 SPM의 형성을 촉진하기 위한 오메가-3 또는 오메가-6 성분의 용도를 포함한다.
본 발명의 균주의 세포는, 특히 본 발명의 조성물에, 포자(휴면상태임)로서, 영양 세포(성장 중임)로서, 전이 상태 세포(성장기에서 포자형성기로 전이 중임)로서, 또는 이들 유형의 세포 중 적어도 2종, 특히 모두의 조합으로서 존재할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 프로바이오틱 균주는 휴면 형태로 또는 영양 세포로서 존재한다.
바람직한 실시양태에서, 오메가-3 또는 오메가-6 지방산은 유리 지방산, 염, 천연 트리글리세리드, 어유, 인지질 에스테르 또는 에틸 에스테르의 형태이다.
추가의 바람직한 구성에서, 지방산은 오메가-3 지방산 EPA 및 DHA로부터 선택되거나 또는 여기서 오메가-6 지방산 성분은 ARA이다.
본 발명의 추가적인 구성은 상기-언급된 조성물들 중 임의의 것과 헴 생합성을 증진함으로써[45] 바실루스 메가테리움의 옥시제나제 활성을 촉발할 수 있는 화합물인 5-아미노레불린산의 조합이다.
바람직한 실시양태에서, 프로바이오틱 균주는 하기 중 하나 이상으로부터 선택된다: 바실루스 메가테리움 DSM 32963, DSM 33296 또는 DSM 33299.
바실루스 메가테리움 DSM 32963, DSM 33296 및 DSM 33299는 자연 발생 단리물의 스크리닝에 의해 확인되었다. 이들은 2018 년 11 월 27 일(DSM 32963) 및 2019 년 10 월 17 일에 에보닉 데구사 게엠베하(Evonik Degussa GmbH)의 명칭으로 이전에 언급된 수탁 번호 하에 특허 절차상 목적을 위해 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약의 규정 하에 DSMZ에 기탁되었다.
따라서, 본 발명에 따른 제제에 사용되는 바실루스 메가테리움 균주는 하기 군으로부터 선택된다:
a) DSMZ에 DSM 32963, DSM 33296 및 DSM 33299 하에 기탁된 바실루스 메가테리움 균주 중 하나;
b) 균주 DSM 32963의 모든 식별 특성을 갖는 DSM 32963 하에 기탁된 바실루스 메가테리움 균주의 돌연변이체, 여기서 상기 돌연변이체는 바람직하게는 균주 DSM 32963에 대해 적어도 95 %, 바람직하게는 적어도 96, 97 또는 98 %, 보다 바람직하게는 적어도 99 또는 99.5 %의 DNA 서열 동일성을 갖는다;
c) (a) 또는 (b)의 제제;
d) (a), (b) 또는 (c)에 함유된 대사물의 유효 혼합물을 함유하는 제제.
DSMZ에 DSM 32963 하에 기탁된 바실루스 메가테리움 균주는 하기 특징화 서열을 나타낸다:
a) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 또는 서열식별번호: 2에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA 서열;
b) 서열식별번호: 3에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 yqfD 서열;
c) 서열식별번호: 4에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 gyrB 서열;
d) 서열식별번호: 5에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 rpoB 서열;
e) 서열식별번호: 6에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 groEL 서열.
DSM 33296 하에 DSMZ에 기탁된 바실루스 메가테리움 균주는 하기 특징화 서열을 나타낸다:
a) 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 14에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA 서열;
b) 서열식별번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 yqfD 서열;
c) 서열식별번호: 16에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 gyrB 서열;
d) 서열식별번호: 17에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 rpoB 서열;
e) 서열식별번호: 18에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 groEL 서열.
DSM 33299 하에 DSMZ에 기탁된 바실루스 메가테리움 균주는 하기 특징화 서열을 나타낸다:
a) 서열식별번호: 25 또는 서열식별번호: 26에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA 서열;
b) 서열식별번호: 27에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 yqfD 서열;
c) 서열식별번호: 28에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 gyrB 서열;
d) 서열식별번호: 29에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 rpoB 서열;
e) 서열식별번호: 30에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 groEL 서열.
따라서, 본 발명의 추가 대상은 바실루스 메가테리움 균주, 특히 상기 언급된 바와 같은 비. 메가테리움 균주이며, 하기 특징 중 적어도 하나, 바람직하게는 모두를 나타낸다:
a) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 25 또는 서열식별번호: 26에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99 %, 바람직하게는 적어도 99.5 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.8 또는 99.9 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA 서열;
b) 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 27에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99 %, 바람직하게는 적어도 99.5 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.8 또는 99.9 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 yqfD 서열;
c) 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 28에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99 %, 바람직하게는 적어도 99.5 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.8 또는 99.9 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 gyrB 서열.
바람직하게는, 이러한 비. 메가테리움 균주는 하기 추가의 특징 중 적어도 하나, 보다 바람직하게는 모두를 나타낸다:
d) 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 29에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99 %, 바람직하게는 적어도 99.5 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.8 또는 99.9 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 rpoB 서열;
e) 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 30에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99 %, 바람직하게는 적어도 99.5 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.8 또는 99.9 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 groEL 서열.
따라서, 본 발명의 특정 대상은 또한 하기 특징을 나타내는 바실루스 메가테리움 균주이다:
a) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 14 또는 서열식별번호: 25 또는 서열식별번호: 26에 따른 16S rDNA 서열;
b) 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 27에 따른 yqfD 서열;
c) 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 16 또는 서열식별번호: 28에 따른 gyrB 서열.
바람직하게는, 이러한 비. 메가테리움 균주는 하기 추가의 특징을 나타낸다:
d) 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 17 또는 서열식별번호: 29에 따른 rpoB 서열;
e) 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 18 또는 서열식별번호: 30에 따른 groEL 서열.
유리한 구성에서, EPA 및 DHA는 유리 지방산, 염, 천연 트리글리세리드, 어유, 인지질 에스테르 또는 오메가-3 에틸 에스테르의 형태이다.
EPA 및 DHA는 이들이 지방산 염으로서 첨가되었을 때 프로바이오틱 균주에 의해 SPM으로 효과적으로 형질전환되었고, 그의 제조 및 적용은 이전에 개시되었다. WO2016102323A1에는 산화에 대해 안정화될 수 있는 다중불포화 오메가-3 지방산 염을 포함하는 조성물이 기재되어 있다. WO2017202935A1은 오메가-3 지방산 염 및 아민을 포함하는 조성물의 제조 방법을 개시하며, 여기서 하나 이상의 오메가-3 지방산(들), 하나 이상의 염기성 아민(들) 및 페이스트의 총 중량을 기준으로 20 중량% 이하의 물을 포함하는 페이스트를 균질 페이스트가 수득될 때까지 혼련한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구성에서 오메가-3 성분은 아미노산이 리신, 아르기닌, 오르니틴, 히스티딘, 시트룰린, 콜린 및 그의 혼합물로부터 선택된 염기성 아미노산으로부터 선택된 것인 오메가-3 지방산 아미노산 염을 포함한다.
추가의 바람직한 구성에서, 아미노산은 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린 및 이들의 혼합물로부터 선택된 염기성 아미노산으로부터 선택된다.
리신의 아미노산 염을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구성은 프로바이오틱 균주에 대한 생체이용률을 추가로 개선시키기 위한 오메가-3 분산액(아마도 리포솜)의 제제이다. 이러한 분산액 제제는 바람직하게는 인지질 혼합물(예를 들어, 탈유 해바라기 레시틴) 또는 한정된 인지질, 예를 들어 디올레일포스파티딜콜린(DOPC)으로 이루어진다. 이러한 분산액 제제의 가장 바람직한 형태는 유리 오메가-3 지방산 염 또는 유리 오메가-3 지방산을 함유한다.
따라서, 이러한 바람직한 실시양태에서 다중불포화 지방산 성분은 적어도 하나의 인지질 및 적어도 하나의 오메가-3 지방산의 분산액을 포함하는 제제를 포함한다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 다중불포화 지방산 성분은 적어도 하나의 인지질의 분산액 및 오메가-3 또는 오메가-6 지방산으로부터 유래된 음이온과 양이온의 적어도 하나의 지방산 염을 포함하는 제제를 포함한다. 오메가-3 지방산을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 대안적 구성에서 인지질은 40 중량% 초과, 바람직하게는 70 중량%, 보다 바람직하게는 90 중량% 초과의 포스파티딜콜린 함량 및 5 중량% 미만, 바람직하게는 1 중량% 미만의 포스파티딜에탄올아민 함량을 포함하는 탈유 인지질이다.
대안적 실시양태에서 인지질은 총 지방산의 70 중량% 초과의 올레산 및/또는 리놀레산 함량을 갖는 비-수소화 인지질이다.
본 발명의 추가의 바람직한 구성에서 지방산 염에 대한 인지질의 질량비는 0.001 초과, 바람직하게는 0.05 초과, 보다 바람직하게는 0.01 초과, 보다 바람직하게는 0.09 초과, 가장 바람직하게는 0.39 초과이다.
대안적 실시양태에서 제제는 pH 6.5 내지 7.5의 pH 값에서 물과 혼합되는 경우에 1μm 미만, 바람직하게는 500 nm 미만, 가장 바람직하게는 250 nm 미만의 평균 입자 크기를 갖는 콜로이드성 분산액을 생성하는 분말 또는 액체의 형태이다.
또 다른 실시양태에서 성분은 인지질 및 지방산 염 둘 다가 100 μg 이하의 양으로 존재하고 검출가능하도록 서로 미세하게 분산된다.
본 발명의 제제의 장내 전달을 위한 바람직한 제제는 위 상태에 대한 보호를 제공하는 제제, 또는 소장에서 제제의 표적화 방출을 제공하는 제제 또는 대장에서 제제의 표적화 방출을 제공하는 제제이다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 제제는 지연 방출 또는 장 또는 결장 방출을 위한 코팅을 포함한다.
본 발명의 한 대상은 사료 또는 식품 보충제로서의 본 발명에 따른 제제의 용도 또는 식품에서의 그의 용도이다. 본 발명에 따른 바람직한 식품은 초콜릿 제품, 젤리, 뮤즐리, 뮤즐리 바 및 유제품이다.
본 발명의 추가의 대상은 또한 사료 또는 식품 제품의 신바이오틱 성분으로서의 본 발명의 제제의 용도이다.
본 발명의 추가의 대상은 본 발명에 따른 제제 및 바람직하게는 단백질, 탄수화물, 지방, 추가의 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 효소, 비타민, 면역 조절제, 우유 대체품, 미네랄, 아미노산, 항 콕시듐증 제제, 산-기재 제품, 의약, 및 그의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 사료 또는 식품 성분을 함유하는 사료- 또는 식품 조성물이다.
본 발명에 따른 사료- 또는 식품 조성물은 또한 환제, 캡슐, 정제 또는 액체 형태의 식이 보충제를 포함한다.
본 발명의 추가의 대상은 본 발명에 따른 제제 및 제약상 허용되는 담체를 함유하는 제약 조성물이다.
본 발명의 추가의 대상은 제약 제품의 제조를 위한 제제의 용도이다.
본 발명에 따른 제제는, 동물 또는 인간에게 투여되는 경우에, 바람직하게는 동물 또는 인간의 건강 상태, 특히 장 건강, 심혈관 건강, 심장-대사 건강, 폐 건강, 관절 건강, 눈 건강, 정신 건강, 구강 건강 또는 면역 건강을 개선시킨다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 동물 또는 인간의 건강 상태, 특히 장 건강, 심혈관 건강, 심장-대사 건강, 폐 건강, 관절 건강, 눈 건강, 정신 건강, 구강 건강 또는 면역 건강을 개선시키기 위한 본 발명에 따른 조성물이고, 본 발명의 일부이다.
본 발명에 따른 유리한 구성은 하기 중 하나 이상에 의해 동물 또는 인간의 건강 상태를 개선시키기 위한 조성물이다:
- 위장 미생물에 의한 그의 제조를 통해 숙주에서 하기 지질 매개인자의 총량을 증가시키는 것:
17-히드록시-DHA(17-HDHA), 14-히드록시-DHA(14-HDHA), 13-히드록시-DHA(13-HDHA), 7-히드록시-DHA(7-HDHA), 4-히드록시-DHA(4-HDHA), 18-히드록시-에이코사펜타엔산(18-HEPE), 15-히드록시-에이코사펜타엔산(15-HEPE), 12-히드록시-에이코사펜타엔산(12-HEPE), 11-히드록시-에이코사펜타엔산(11-HEPE), 8-히드록시-에이코사펜타엔산(8-HEPE), 5-히드록시-에이코사펜타엔산(5-HEPE), 15-히드록시-에이코사테트라엔산(15-HETE), 12-히드록시-에이코사테트라엔산(12-HETE), 11-히드록시-에이코사테트라엔산(11-HETE), 8-히드록시-에이코사테트라엔산(8-HETE), 5-히드록시-에이코사테트라엔산(5-HETE), 9-히드록시옥타데카디엔산(9-HODE), 13-히드록시옥타데카디엔산(13-HODE), 19Z-도코사헥사엔산(PDX), 프로텍틴 D1(PD1), 아스피린-촉발 PD1(AT-PD1), 마레신 1(MaR1), 마레신 2(MaR2), 류코트리엔 B4(LTB4), t-LTB4, 레졸빈 D1-5(RvD1-5), 아스피린-촉발 RvD1(AT-RvD1), 레졸빈 E1(RvE1), 레졸빈 E3(RvE3), 리폭신 A4(LXA4), 리폭신 A5(LXA5), 리폭신 B4(LXB4), 리폭신 B5(LXB5),
- 숙주에서 EPA의 총량을 증가시키는 것,
- 숙주에서 DHA의 총량을 증가시키는 것.
본 발명의 추가의 대상은 또한 적합한 매트릭스 또는 담체를 사용하여 피부, 눈 및 구강 공동 상에 국소 적용하기 위한 본 발명의 제제의 용도이다.
바람직한 구성에서, 제제는 나노셀룰로스를 포함하는 사전-합성된 다상 생체물질 상에 및/또는 내에 로딩되며, 여기서 나노셀룰로스는 하기로부터 선택된 박테리아 합성된 나노셀룰로스(BNC)이다:
- 셀룰로스 섬유 또는 나노위스커의 네트워크를 포함하는 BNC,
- 셀룰로스 피브릴의 2개 이상의 상이한 층을 포함하며, 여기서 각각의 층은 상이한 미생물로부터의 또는 상이한 조건 하에 배양된 미생물로부터의 BNC로 이루어진 것인 BNC,
- 적어도 2종의 상이한 셀룰로스 네트워크를 포함하는 BNC 또는
- 중합체를 추가로 포함하는 BNC 복합 물질.
나노셀룰로스는 나노-구조화 셀룰로스를 지칭하는 용어이다. 이는 셀룰로스 나노결정(CNC 또는 NCC), 마이크로피브릴화 셀룰로스(MFC)로도 불리는 셀룰로스 나노섬유(CNF), 또는 박테리아에 의해 제조된 나노-구조화 셀룰로스를 지칭하는 박테리아 나노셀룰로스(BNC)일 수 있다. BNC는 셀룰로스 제조에서 가장 높은 효율을 제공하는 최상의 박테리아 종 중 하나인 코마가타에이박터 크실리누스(Komagataeibacter xylinus)와 같은 균주에 의해 제조된 나노피브릴 중합체이다. BNC는 독특한 특성, 예컨대 화학적 순도, 탁월한 기계적 강도, 높은 가요성, 높은 흡수성, 뛰어난 성형성 및 연성 및 많은 다른 것으로 인한 임의의 형상 및 크기의 형성 가능성을 갖는 생체물질이다. 또한, 상기 물질은 채식이고 높은 수분 함량을 포함한다.
박테리아 셀룰로스는 3-차원 네트워크이고 미생물 및 추가의 물질을 고정하고 포획하기 위한 담체이다. 고정화된 생물제제(미생물 포함)는 계 내/생체 내 생물활성 대사물(예를 들어 항미생물제, 대사 생물활성제)의 생합성, 미생물 및 생물활성제의 촉발된 방출을 위해 사용되고/거나 발효 공정을 위한 고정화된 초소형공장으로서 사용된다.
본 발명의 추가의 대상은 또한 SPM의 생명공학적 제조를 위한, 하기 특징을 나타내는, 휴면 형태의 또는 영양 세포로서의 바실루스 메가테리움 균주의 용도이다:
a) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 25 또는 서열식별번호: 26에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA 서열; 및/또는
b) 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 27에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 yqfD 서열; 및/또는
c) 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 28에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 gyrB 서열; 및/또는
d) 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 29에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 rpoB 서열; 및/또는
e) 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 30에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 groEL 서열.
작업 실시예
실시예 1: 균주 바실루스 메가테리움 DSM 32963, DSM 33296 및 DSM 33299는 각각 시토크롬 P450 모노옥시게나제(CYP450)에 대한 유전자 서열을 보유한다
균주 바실루스 메가테리움 DSM 32963, DSM 33296 및 DSM 33299를 각각 웨스트팔리아(Westphalia) 동부의 깨끗한 정원으로부터의 토양 샘플로부터 단리하였다. 이들은 2018 년 11 월 27 일(DSM 32963) 및 2019 년 10 월 17 일에 에보닉 데구사 게엠베하의 명칭으로 이전에 언급된 수탁 번호 하에 특허 절차상 목적을 위해 미생물 기탁의 국제적 승인에 대한 부다페스트 조약의 규정 하에 DSMZ에 기탁되었다.
비. 메가테리움 DSM 32963의 게놈 서열은 비. 메가테리움 ATCC 14581(AAA87602.1)의 P450 BM3(CYP102A1)에 대해 아미노산 수준에서 97.9 %의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자 [서열식별번호: 7]를 함유한다. 이 효소는 P450 옥시게나제 및 NADPH:P-450 리덕타제 둘 다를 혼입한다[46]. P450 BM3의 천연 기질은 장쇄 지방산(C12 내지 C20)인 것으로 분석되었고, 이는 오로지 말단하 위치(ω-1 내지ω-3)에서 히드록실화된다[47].
P450 BM3에 비해 비. 메가테리움 DSM 32963의 게놈 서열 내에서 확인된 서열에 대해 부분 서열 히트 상의 21.1 % 내지 30.5 % 범위의 아미노산 수준에 대한 보다 낮은 서열 유사성이 관찰되었다. 이들 추가의 잠재적인 시토크롬 유전자는 P450 BM3[서열식별번호: 8 - 12]에 비해 유사한 기능을 가질 수 있다(표 1 참조).
Figure pct00001
표 1: 바실루스 메가테리움 DSM 32963의 단백질 서열에 대한 P450 BM3의 BLASTp(히트 열에서의 SEQ ID 는 상응하는 뉴클레오티드 서열을 지칭함)
비. 메가테리움 DSM 33296의 게놈 서열은 비. 메가테리움 ATCC 14581(AAA87602.1)의 P450 BM3(CYP102A1)에 대해 아미노산 수준에서 98.9 %의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자[서열식별번호: 19]를 함유한다. 이 효소는 P450 옥시게나제 및 NADPH:P-450 리덕타제 둘 다를 혼입한다[46]. P450 BM3의 천연 기질은 장쇄 지방산(C12 내지 C20)인 것으로 분석되었고, 이는 오직 말단하 위치(ω-1 내지ω-3)에서 히드록실화된다[47].
P450 BM3에 비해 비. 메가테리움 DSM 33296의 게놈 서열 내에서 확인된 서열에 대해 부분 서열 히트 상의 21.5 % 내지 30.7 % 범위의 아미노산 수준에 대한 보다 낮은 서열 유사성이 관찰되었다. 이들 추가의 잠재적인 시토크롬 유전자는 P450 BM3[서열 20 - 24]에 비해 유사한 기능을 가질 수 있다(표 2 참조).
Figure pct00002
표 2: 바실루스 메가테리움 DSM 33296의 단백질 서열에 대한 P450 BM3의 BLASTp(히트 열에서의 서열은 상응하는 뉴클레오티드 서열을 지칭함)
비. 메가테리움 DSM 33299의 게놈 서열은 비. 메가테리움 ATCC 14581(AAA87602.1)의 P450 BM3(CYP102A1)에 대해 아미노산 수준에서 96.1 %의 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자[서열식별번호: 31]를 함유한다. 이 효소는 P450 옥시게나제 및 NADPH:P-450 리덕타제 둘 다를 혼입한다[46]. P450 BM3의 천연 기질은 장쇄 지방산(C12 내지 C20)인 것으로 분석되었고, 이는 오직 말단하 위치(ω-1 내지ω-3)에서 히드록실화된다[47].
P450 BM3에 비해 비. 메가테리움 DSM 33299의 게놈 서열 내에서 확인된 서열에 대해 부분 서열 히트 상의 20.9 % 내지 30.5 % 범위의 아미노산 수준에 대한 보다 낮은 서열 유사성이 관찰되었다. 이들 추가의 잠재적인 시토크롬 유전자는 P450 BM3[서열식별번호: 32 - 37]에 비해 유사한 기능을 가질 수 있다(표 3 참조).
Figure pct00003
표 3: 바실루스 메가테리움 DSM 33299의 단백질 서열에 대한 P450 BM3의 BLASTp(히트 열에서의 서열은 상응하는 뉴클레오티드 서열을 지칭함)
실시예 2: 포스페이트 완충액 중 디올레일포스파티딜콜린(DOPC)을 갖는 오메가-3 지방산 분산액의 제조
오메가-3 지방산 분산액의 제제를 제조하기 위해 0.8 g의 디올레일포스파티딜콜린(DOPC, 리포이드 게엠베하(Lipoid GmbH))을 1 ml 에탄올 중에 용해시켰다. 0.2 g의 어유(오메가-3 1400, 도펠헤르츠(Doppelherz)®), 오메가-3 에틸 에스테르(프로노바퓨어(PronovaPure)® 500:200 EE, 바스프(BASF)) 또는 오메가-3 리신 염 형태의 유리 오메가-3 지방산의 리신 염(아배일옴(AvailOm)®, 에보닉)을 첨가하고 용해시켰다. 유리 오메가-3 지방산 염의 경우에, 증류수 20 μl를 첨가하여 생성물을 완전히 용해시켰다.
오메가-3 리신 염 형태의 유리 오메가-3 지방산의 리신 염(아배일옴®, 에보닉)은 약 67 %의 지방산 및 다량의 오메가-3 지방산 EPA 및 DHA 및 소량의 오메가-3 지방산 도코사펜타엔산 및 오메가-6 지방산 아라키돈산, 도코사테트라엔산 및 도코사엔산 이성질체를 함유한다.
1 ml의 각각의 용액을 45 ℃의 온도에서 강하게 교반하면서 20 ml의 0.1 M 포스페이트 완충액, pH = 8에 적가하였다. 그 후, 분산액을 얼음 상에 놓고 15 분 동안 초음파 처리하여 나노미터 규모 분산액, 아마도 리포솜(브랜슨 소니파이어(Branson Sonifier), 100 % 진폭, 50 % 임펄스)을 생성하였다. 최종적으로, 분산액을 0.2 μm 주사기 필터를 통해 멸균 여과하였다. 생성된 분산액을 동적 광 산란(DLS) 측정(제타사이저 나노(Zetasizer Nano) ZS, 말번(Malvern))을 통해 입자 크기와 관련하여 특성화되었다. 분산액은 40 g/l 인지질 및 10 g/l 오메가-3 지방산 또는 에스테르를 함유하였다.
실시예 3: 균주 비. 메가테리움 DSM 32963은 세포 내 18-히드록시-에이코사펜타엔산(18-HEPE)을 제조할 수 있다
비. 메가테리움 DSM 32963에 대해 SPM-제조 효소(들)의 연관된 세포 내 활성이 입증될 수 있다. 0.1 % 글루코스(LBG)를 함유하는 10 ml 루리아 베르타미 브로쓰(Luria Bertami broth)(LB, 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))로부터 비. 메가테리움 DSM 32963의 배양물을 100 ml 플라스크에서 24 시간 동안 30 ℃ 및 200 rpm에서 성장시켰다. 완전 배양물을 LBG 중 200 ml 주 배양물로 옮겼다. 주 배양물을 2 l 플라스크에서 30 ℃ 및 200 rpm에서 6 시간 동안 성장시켰다. 이어서 세포 배양물을 10 ml 부분으로 수확하고, 상등액을 원심분리(15 분, 4000 rpm, 실온)에 의해 제거하고, 세포 펠렛을 각각 10 ml LBG 및 2 ml의 보충제 중에 재현탁시켰다(표 2). 이들 배양물을 100 ml 진탕 플라스크에서 16 시간 동안 30 ℃ 및 200 rpm에서 인큐베이션하였다.
상이한 형태의 에이코사펜타엔산(EPA) 및 도코사헥사엔산(DHA) 공급원을 비. 메가테리움 DSM 32963 세포 배양물에 0.4 g/l의 최종 농도로 오메가-3 리신 염(에보닉의 아배일옴®), 어유(도펠헤르츠®의 오메가-3 1400), 및 오메가-3 에틸 에스테르(바스프의 프로노바퓨어® 500:200 EE)의 형태로 첨가하였다. 이들 물질을 초음파 처리된 에멀젼 및 분산액 제제(실시예 2에 기재된 제제)로서 각각 첨가하였다.
오메가-3 지방산 함량이 없는 DOPC 제제, 및 PBS 완충액을 EPA가 없는 대조군으로서 사용하였다.
Figure pct00004
표 2: 보충제, 저장 용액의 제제, 및 그의 계산된 EPA 함량(g/l)
상등액을 원심분리(15 분, 4000 rpm, 실온)에 의해 분리한 다음, 세포 배양물을 각각 수확하였다. 그 후, 상등액을 물/아세토니트릴 혼합물로 이루어진 용매로 희석하였다(상등액:용매 비는 1:2, 용매 조성: 65 % H2O, pH 8 및 35 % MeCN). 펠렛을 밤새 동결 건조시키고 물/아세토니트릴 혼합물로 이루어진 용매(펠렛:용매 비는 1:2였음, 용매 조성: 65 % H2O, pH 8 및 35 % MeCN) 중에 재현탁시켰다. 세포 파괴를 리보라이저(Ribolyser)에서 용해 매트릭스(Lysing Matrix) 튜브(0.1 mm 실리카 구체)에서 수행하였다.
세포 균질화액(및 희석된 상등액)을 여과한 다음 m/z 318에서의 양성 SIM-모드 뿐만 아니라 m/z 302에서의 전구체 화합물 EPA에서의 LC/ESI-MS 분석(애질런트(Agilent) QQQ 6420, 제미니(Gemini) 3μ C6-페닐)에 의한 18-히드록시-에이코사펜타엔산(18-HEPE)의 검출에 사용하였다.
비. 메가테리움 세포에 오메가-3 리신 염, 오메가-3 에틸 에스테르, DOPC를 갖는 오메가-3 리신 염 분산액, 또는 DOPC를 갖는 어유 분산액의 형태로의 EPA의 첨가는 18-HEPE의 세포 연관된(= 세포 내 + 세포 외 흡착된) 축적을 초래하였다(표 3). 단연코 세포 내 18-HEPE의 가장 높은 값은 오메가-3 리신 염의 첨가에 의해 달성되었다; 다른 접근법에서보다 10배 더 높았다.
Figure pct00005
표 3: 바실루스 메가테리움 DSM 32963 세포의 세포 추출물 중 세포 연관된 18-HEPE의 농도(mg/ml)
실시예 4: 바실루스 메가테리움 DSM 32963과 오메가-3 지방산 염 아배일옴®의 분산액 제제의 신바이오틱 조합은 세포 외 양의 18-HEPE를 초래한다
세포 외 출현 18-HEPE의 양을 조사하기 위해, 비. 메가테리움 DSM 32963 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하였다. 세포를 타우로콜레이트, 인지질 및 담즙 계면활성제를 모의하도록 설계된 다른 성분의 혼합물인 9.76 g/l FeSSIF-V2(biorelevant.com)를 함유하는 LBG 또는 10 ml LBG 중에 재현탁시키고, 2 ml의 보충제(표 2)를 각각 첨가하였다. 추가로, 보충제를 또한 세포가 없는 진탕 플라스크 내의 상이한 배지에 각각 첨가하고 동일한 조건 하에 처리하였다(대조군). 배양 상등액 및 대조군의 18-HEPE 농도를 16 시간, 30 ℃ 및 200 rpm에서의 인큐베이션 후에 측정하였다(표 4). 바실루스 메가테리움 DSM 32963 세포는 세포 외에서 검출가능한 오메가-3 리신 염(아배일옴®) 분산액으로부터 18-HEPE를 합성할 수 있는 것으로 나타날 수 있다. 주목할 만하게, 이 방법에 의해 검출된 오메가-3 → 18-HEPE 전환율은 0.075 이하이며, 이는 WO 2017/041094에 개시된 에스테르화 어유 중 18-HEPE의 기초 함량을 0.0005 % 초과한다. 보다 중요하게는, 우리는 오메가-3 리신 염이 바실루스 메가테리움 균주에 의해 생리학적 관련성을 갖는 18-HEPE보다 훨씬 더 높은 농도에서 다수의 (최종) SPM 생성물로 전환된다는 것을 발견하였다(실시예 6 참조).
Figure pct00006
표 4: 배양물 상등액 및 대조군의 측정된 18-HEPE 농도(mg/l)
실시예 5: 상이한 바실루스 종에 의한 EPA의 생체변환
상이한 바실루스 종이 세포 내 18-HEPE를 제조하는 능력을 조사하기 위해, 상이한 종의 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하였다. 세포를 담즙 계면활성제를 모의하도록 설계된 타우로콜레이트, 인지질 및 다른 성분의 혼합물인 9.76 g/l FeSSIF-V2(biorelevant.com)를 함유하는 10 ml LBG 중에 재현탁시키고, 1.2 ml의 오메가-3 리신 염 분산액과 DOPC를 각각 첨가하였다. 30 ℃ 및 200 rpm에서 16 시간 동안 인큐베이션한 후 세포의 내부 18-HEPE 농도를 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정하였다.
오직 바실루스 메가테리움 세포만이 오메가-3 리신 염(아배일옴®) 분산액으로부터 내부적으로 18-HEPE를 합성할 수 있었으며, 비. 서브틸리스(B.subtilis), 비. 아밀로리퀘파시엔스(B. amyloliquefaciens), 비. 푸밀루스(B. pumilus) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis)는 그렇지 않았다.
Figure pct00007
표 5: 비. 메가테리움 DSM 32963 세포의 세포 내 측정된 18-HEPE 함량(mg/ml)
실시예 6: 상이한 배양 조건 하에 오메가-3 지방산 염 아배일옴®으로부터 바실루스 메가테리움 DSM 32963에 의한 SPM의 제조
지질대사체:
박테리아 상등액 샘플을 RP-상 고체 상 추출을 사용하여 지질 추출에 적용하고 후속적으로 공개된 절차에 따라 초고성능 액체 크로마토그래피 ESI 탠덤 질량 분광법(UPLC-MS/MS)에 의해 분석하였다[48]. 이들 조건 하에 5-히드록시-에이코사펜타엔산 5-HEPE, 8-HEPE, 11-HEPE, 12-HEPE, 15-HEPE, 18-HEPE, 5-히드록시-에이코사테트라엔산(5-HETE), 8-HETE, 11-HETE, 12-HETE, 15-HETE, 4-히드록시-DHA(4-HDHA), 7-HDHA, 13-HDHA, 14-HDHA, 17-HDHA, 리폭신 A4(LXA4), LXB4, 레졸빈 E1(RvE1), RvE3, 레졸빈 D1-5(RvD1-5), AT-RvD1, RvD2, 프로텍틴 D1(PD1), AT-PD1, 마레신 1(MaR1), MaR2, 4개의 지방산 기질을 포함한 대략 40종의 상이한 LM이 1 pg의 검출 하한치로 검출될 수 있다.
바실루스 메가테리움이 18-HEPE에 추가로 다른 PUFA 산소화 생성물을 제조할 수 있는지를 조사하기 위해, 실시예 4에서와 같이 아배일옴®과 함께 배양된 바실루스 메가테리움 균주 32963으로부터의 상등액의 지질대사체 스크리닝을 담즙산과 함께 또는 없이 용해되어 또는 분산액 제제 중에서 수행하였다. 아배일옴® 제제의 세포가 없는 제제를 처리하고 동시에 분석하였고 이는 산소화 생성물의 비-효소적, 자발적 형성에 대한 대조군으로서의 역할을 하였다. 표 6에 주어진 값은 형성된 생성물의 순 농도, 즉 대조군 값의 차감 후를 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, SPM을 포함한 수많은 산소화 생성물이 박테리아에 의해 형성되었다. 여러 SPM의 농도는 인간 혈장 샘플에서 발견되는 SPM의 농도를 훨씬 초과하며, 이는 전형적으로 ~ 20-100 pg/ml의 범위이다[27, 40, 41]. 비교를 위해, 인간 모유는 ~ 6.000 pg/ml RvE1 및 ~ 10.000 pg/ml RvD1을 함유한다[42]. SPM이 설치류에 대해 시험관 내 및 생체 내에서 nM 또는 심지어 pM 범위로 수용체-매개 효과를 발휘한다는 사실을 고려하면[6], 표 6에 나타낸 발견은 본 발명의 생리학적 및 치료적 중요성을 강하게 암시한다.
PUFA 제제의 유형은 생성물 수준에 큰 영향을 미쳤고, 이는 일반적으로 PUFA 분산액 제제의 존재 및/또는 가용화제로서의 담즙산의 첨가에서 더 높았다. 동시에, 모노-히드록실화 SPM 전구체 5-HEPE, 11-HEPE, 12-HEPE, 15-HEPE, 18-HEPE, 5-HETE, 8-HETE, 및 9-HODE의 풍부함은 분산액 제제 및 담즙산의 부재 하에 아배일옴으로 처리된 샘플에 비해 이들 샘플에서 더 낮았다. 이는 이들 전구체의 디- 및 트리히드록실화 지방산으로의 증가된 전환에 의해 설명될 수 있다.
Figure pct00008
표 6: 바실루스 메가테리움 DSM 32963 세포의 PUFA 산소화 생성물의 세포 외 농도
실시예 7: 다른 바실루스 메가테리움 균주에 의한 오메가-3 지방산 염 아배일옴®의 분산액 제제로부터의 SPM의 제조
다양한 서식지로부터 공급된 47개의 추가의 바실루스 메가테리움 균주를 그의 SPM 제조 능력에 대해 스크리닝하여 이것이 바실루스 메가테리움 종의 일반적인 현상인지 측정하고 제조되는 SPM의 유형 및 양에서 균주-특이적 차이를 검출하였다. 오메가-3 지방산 공급원으로서의 역할을 하는 아배일옴®의 분산액 제제와 함께, 세포를 실시예 4에 상술된 바와 같이 배양하였다. 아배일옴®의 세포가 없는 제제를 처리하고 동시에 분석하였고 이는 산소화 생성물의 비-효소적, 자발적 형성에 대한 대조군으로서의 역할을 하였다. 모든 시험된 균주는 측정가능한(> 1 pg/ml) 양의 다양한 SPM 및 그의 전구체를 제조하였고, 이들의 양은 균주 사이에서 크게 상이하였고(최대 2.000배), RvE3의 농도는 대부분의 균주에서 특히 높은 것(최대 1.3 μg/ml)이 관찰되었다.
표 7에 주어진 값은 최고 성능 균주, 바실루스 메가테리움 DSM 33296 및 바실루스 메가테리움 DSM 33299 중 2종에 의해 형성된 PUFA 산소화 생성물의 순 농도를 나타낸다.
Figure pct00009
표 7: 바실루스 메가테리움 DSM 33296 및 바실루스 메가테리움 DSM 33299 세포의 PUFA 산소화 생성물의 세포 외 농도.
실시예 8: 식품 보충제로서 또는 약물로서 EPA-DHA 아미노산 염 및 바실루스 메가테리움 균주(들)를 포함하는 캡슐
하기 성분을 HPMC 캡슐(크기 00)에 충전하였다.
Figure pct00010
표 7: HPMC 캡슐에 충전하기 위한 제제 *아미노산은 L-오르니틴, L-리신 및 L-아르기닌으로부터 선택된다. #바실루스 메가테리움 DSM 32963, DSM 33296, DSM 33299로부터 선택된 균주.
캡슐은 L-오르니틴, L-아스파르테이트, L-리신 및 L-아르기닌으로부터 선택된 아미노산을 추가로 함유할 수 있다.
캡슐은 아라비녹실란, 보리 곡물 섬유, 귀리 곡물 섬유, 호밀 섬유, 밀겨 섬유, 이눌린, 프룩토올리고사카라이드(FOS), 갈락토올리고사카라이드(GOS), 저항성 전분, 베타-글루칸, 글루코만난, 갈락토글루코만난, 구아 검 및 크실로올리고사카라이드로부터 선택된 추가의 탄수화물 성분을 추가로 함유할 수 있다.
캡슐은 생강, 계피, 자몽, 파슬리, 심황, 강황, 올리브 과일, 파낙스 인삼, 양고추냉이, 마늘, 브로콜리, 스피룰리나, 석류, 콜리플라워, 케일, 실란트로, 녹차, 양파, 및 밀크시슬로부터 선택된 1종 이상의 식물 추출물을 추가로 함유할 수 있다.
캡슐은 아스타잔틴, 목탄, 키토산, 글루타티온, 모나콜린 K, 식물 스테롤, 식물 스타놀, 술포라판, 콜라겐, 히알루론, 포스파티딜콜린을 추가로 함유할 수 있다.
캡슐은 비오틴, 비타민 A, 비타민 B1(티아민), 비타민 B2(리보플라빈), 비타민 B3(니아신), 비타민 B5(판토텐산), 비타민 B9(폴산 또는 폴레이트), 비타민 C(아스코르브산), 비타민 D(칼시페롤), 비타민 E(토코페롤 및 토코트리에놀) 및 비타민 K(퀴논)로부터 선택된 비타민 또는 황, 철, 염소, 칼슘, 크로뮴, 코발트, 구리, 마그네슘, 망가니즈, 몰리브덴, 아이오딘, 셀레늄, 및 아연으로부터 선택된 미네랄을 추가로 포함할 수 있다.
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cttgacacaa tcggtctttg cggctttaat 480 taccgcttta acagctttta tcgcgatcag ccgcacccgt ttattacaag tatggtccgt 540 gcactggatg aatcgatgaa aaagctgcag cgtgcaaatc cggatgaccc agcttatgat 600 gaaaataagc gccagtttca agaagatgtt aaggtgatga acaacctagt agataaaatt 660 attgcagatc gcaaagcaag cggtgaacaa agtgatgatc tattaacgca tatgctaaac 720 ggaaaagatc cagaaacagg tgagccgctt gatgacgaga acattcgcta tcaaattatt 780 acgttcttaa ttgcgggaca cgaaacaaca agcggtctgt tatcatttgc gctgtatttc 840 ttagtgaaaa atccacatgt attacaaaaa gcagcagcag aagcagcacg agttctagta 900 gatcctgttc caacctacaa acaagtcaaa cagcttaaat atgtgggcat ggtcttaaat 960 gaagcgctgc gcttatggcc gacggctcct gcgttttctc tatatgcaaa agaggatacg 1020 gtgcttggag gagaatatcc gttagaaaaa ggggatgaac tgatggttct gattcctcag 1080 cttcaccgtg ataaaacgat ttggggagac gatgtagaag agttccgccc agagcgtttt 1140 gaaaacccaa gcgcgattcc gcagcatgcg tttaaaccat ttggaaacgg tcagcgcgcg 1200 tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgcttg tacttggtat gatgctaaaa 1260 cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctagata ttaaagaaac gttaacgtta 1320 aaacctgagg gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaacaaa ttccgcttgg cggcattcct 1380 tcaccaagcc gagagcagtc agctaaaaaa gagcgcaaaa ccgtagaaaa cgctcataat 1440 acgccgctgc ttttgctata cggttcaaat atgggaacag ccgaaggaac ggcgcgggat 1500 ttagcggata ttgcgatgag caaaggattc gcaccgcaag tcgcaacgct tgattcccac 1560 gcaggaaatc ttccgcgtga aggagctgtg ttaattgtaa cagcttcgta taacggacat 1620 ccgcctgata acgcaaagca gtttgtcgag tggttagacc aagcgtctgc tgatgaagtc 1680 aaaggcgttc gctactccgt atttggatgc ggcgataaaa actgggctac tacgtatcaa 1740 aaagtgcctg cttttattga tgaaacgctt gcggctaaag gagcagaaaa catcgctgaa 1800 cgcggcgaag cagatgcaag cgacgacttt gaaggcacat acgaagaatg gcgtgaacac 1860 atgtggagtg acgtagcagc ctactttaac ctcgacattg aaaacagtga agataatcaa 1920 tctacgcttt cacttcaatt tgtcgacagc gctgcggaca tgccgcttgc gaaaatgcac 1980 ggtgcgtttt cagcaaacgt cgtagcgagc aaagaacttc aacagccagg cagtgcacga 2040 agcacgcgac accttgaaat tgaacttcca aaagaagctt cttatcaaga aggagatcat 2100 ttaggtatta ttcctcgcaa ctatgaagga atagtaaatc gtgtaacagc aaggttcgat 2160 gtagatgcat cacagcaaat ccgtctggaa gctgaagaag aaaaattagc gcatttgcca 2220 ctcggtaaaa cagtatcagt agaagagctt ctacaatatg tagagcttca agatcctgtt 2280 acgcgcacgc agcttcgcgc aatggctgct aaaacggtct gcccgccgca taaagtggag 2340 cttgaagcct tgcttgaaaa gcaagcgtac aaagaacaag tactggcaaa acgcttaaca 2400 atgcttgaac tgcttgaaaa atacccggcg tgtgaaatgg aattcagcga atttatcgct 2460 cttcttccaa gcatgcgtcc gcgctattac tcaatttctt catcaccttg cgtcgatgaa 2520 aaacaagcaa gcatcacggt cagcgttgtt tcaggagaag cgtggagcgg atatggagaa 2580 tacaaaggaa ttgcgtcgaa ctatcttgcc gagctgcaag aaggagatac gattacgtgc 2640 tttgtttcca caccgcagtc aggctttacg ctgccaaaag aatctgaaac acctattatc 2700 atggtcggac cgggaacagg cgtcgcgcca tttagaggct ttgtgcaggc tcgcaagcag 2760 ttaaaagaac aaggacagtt gcttggagaa gcgcatttat actttggctg ccgttcacct 2820 catgaagact atctgtatca agaagagctt gaaaacgcac aaaatgaagg tgtcattacg 2880 cttcataccg ctttttcacg cgtaccaaat cagccgaaaa catacgttca gcgcctgatg 2940 gaacaagacg gtatgaaatt gattgaactt cttgatcaag gagcgcattt ctacatttgc 3000 ggagacggaa gccaaatggc acctgacgtt gaagcaacgc ttattaaaag ctatgctgat 3060 gttcataaag taagtgaagc agacgctcgc ttatggctgc agcagctaga agaaaagggc 3120 cgatacgcaa aagacgtgtg ggctgggtaa 3150 <210> 32 <211> 1812 <212> DNA <213> Bacillus megaterium strain DSM 33299 <400> 32 gtgttgcaac ttaaggtagt aaacagccct tttaatcaag aacaagcaga tttgcttaat 60 cgccttctgc cgacattaac agaagcacaa aaaatgtggt tgagtggtta tttaacagca 120 gctcaatcta cgtctgccga aggaacgcca gccgtttcta cagcagcgcc tgctcaaacg 180 aagcagacag tttcaaaaga tgtaacgatt ctttacggat cacaaacagg aaatgctcaa 240 ggacttgctg aaaatacagg caaaacgctt gaagcaaaag gttttaatgt aactgtatct 300 tctatgaatg atttcaaacc aaataattta aagaaacttg aaaatttatt aattgttgta 360 agtacacatg gagaaggaga gccgcctgat aacgccctgt ctttccacga atttcttcac 420 ggccgtcgag cgccaaaact tgagaatttc cgtttttctg tcttgtcgct tggagacagc 480 tcatacgaat ttttctgtca aaccggaaaa gaatttgatg tgcgcttagc agaacttggc 540 ggtgaaagac tgtatccgcg cgttgactgt gatttagatt ttgaagaacc cgcaaataaa 600 tggcttaaag gtgttattga cggattaagc gaagcgaaag gacacagcgc ttcggcagct 660 gttccggcgg aagctcctgc aggaacttca ccatattcaa gaacaaatcc ttttaaagca 720 gaagtgcttg agaacctaaa cttaaacggc cgcggatcaa ataaagaaac gcgacactta 780 gaactatctc tagaaggttc aggcttgacg tatgaaccag gagacagttt aggtatttat 840 cctgaaaatg acccggagct tgttgatctt cttcttaacg aattcaagtg ggatgcaagt 900 gaaagtgtaa cggttaataa agaaggagaa acgcgtcctc ttagagaagc gctaatctct 960 aattttgaaa ttaccgtttt aacaaaaccg cttttaaagc aagcagctga gcttactgga 1020 aacgataagt taaaagcgct tgtagaaaat cgcgaggaat taaaagcata cacacaaggc 1080 cgtgatgtga ttgacttagt tcgtgacttc ggcccatgga acgtatcggc acaagagttt 1140 gtagccattt tacgtaaaat gccagcgcgc ctttactcga ttgcaagcag tttatcagca 1200 aaccctgatg aagttcatct aacaatcgga gcggtacgct acgaagcgca tggacgcgag 1260 cgtaaaggtg tttgttcagt cctatgttca gaacgtttgc agccaggcga tacgattcct 1320 gtataccttc aaagcaataa aaactttaag cttcctcaag atcaagaaac gccaattatt 1380 atggtaggac ctggtacagg tgtggctccg ttccgctcat ttatgcaaga gcgtgaagaa 1440 acaggagcaa aaggcaagtc atggatgttc tttggagatc agcacttcgt aacagacttc 1500 ctttaccaaa cagaatggca aaagtggtta aaagatggcg tactgacaaa aatggacgtg 1560 gcgttttcac gcgatacaga agaaaaagta tacgtacaaa accgtatgct cgaacatagc 1620 aaagaattat tccagtggtt agaagaaggc gcatcttttt atgtgtgcgg agataaaaca 1680 aatatggcac gcgacgtgca caacacgcta gttgaaatta tcgaaacaga aggcaagatg 1740 agccgtgaac aggcggaagg ttaccttgct gaaatgaaga aacaaaaacg ttatcagcgt 1800 gatgtatact ga 1812 <210> 33 <211> 1278 <212> DNA <213> Bacillus megaterium strain DSM 33299 <400> 33 ttgccggtta tacagggccc ctcgtcgtat aagcttaccg gtcacctgca aaagtttaga 60 gagaacccac tgggtttttt ggaaaacttg actcagtatg gagaaattgc aacatttaga 120 gttgcgcaca aacgctttta tgtaacgaga gaccctcaac ttattaaaga tgtagtcatt 180 acaaacagca aggcgtttca aaaaattaaa ctaacgcata tgtttaaaac gctgctaggt 240 gaagaaatgt tatggacaga tgaagcatta tacatgagcc ccattcaacc ctcacaactt 300 aaacaacatc taacttataa taaggaagca atcgcaaaaa taattgaaaa gcatatggaa 360 acgtgggaag aagggcagct tcgaacgata gtaaaagata ttagacaaat agtcgtagct 420 gtactccttc aacttgtatt tggcatttcg attgaggata aagataaaat tcactatgtt 480 caagcgctta tgagaaaaaa agaaaagtta ggcaaaattt atattcgtct acctttgcac 540 cagcctgact cagatgagca gctagaacaa ctcctttttg aacgcgttca aatgcgtgtt 600 caaaacaaaa ccgaagaaaa tgatttactg cagtatgtat tacattctca cggggaagac 660 atcgatgaaa gagaaatata tgaacagcta aattctatat tcctttcgat gtatgaaatg 720 attacgcacg tatgcagctg gtctattcat ttactgtctc aaaatactag ggagcacctt 780 cagctgcata aagaaattca agcctatgct agcggtgaat cactttcaac caaaaatctg 840 acctatatgc gcaaaataat tgctgaaagc atgaggctgt atccgcctct ttggctattt 900 gggcgtcaag cacgtgaaga tatacaaata gatggttaca gcattaaaaa aggggagatt 960 atgttaatta gcccttatat gatgcatcgc catgaagatt attttttaga gccaagtgaa 1020 tttttacctg accgttttga aaaaggaggg tccattgatg tcccaagcta tatgtatatg 1080 ccgcttggga ttgagcatca agcggaaaga ggcatggact atatcactga aatagtaact 1140 atttttctgt cagaaatgac aaagcgcttt ttatttcaac tgactaaggc cgagtctatt 1200 gctccgatgg cgggcgttat gctgaatatg aaagaagaac tgaatgtgaa tgttcacaaa 1260 gttcacacgc 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ttactgaaat accgagtctg 780 caaaaacaag tgaaaaatga tctttcactt gtgccaacta tggtggagga ggttctccgg 840 ttttatccac ctgtacaggc gccttcacgt attgccataa aagacgttga acttagaggt 900 aagacaataa gaaaagggga tgcggtgaca gcctgggtag catcagctaa ccgagatgaa 960 gctaaatttc ctcatgctaa tgtatttcaa gcggatcgta agcccaatca gcatcttact 1020 tttgggaaag gaattcattt ctgcttaggt gctcccttag cccgtctaga agcaaaaatt 1080 gcgtttgaag aaatgctaag taaatgtacg aatcttcaat taaaagaagg ttcattaata 1140 gaacgaactc cggcaccgca aatgtacggt gtggtagaat atcctgttac attttcagtg 1200 agcccttcat tatag 1215 <210> 37 <211> 1233 <212> DNA <213> Bacillus megaterium strain DSM 33299 <400> 37 atgaacaaag aagtcattcc cgtgacagaa attccaaaat ttcaatcacg tgcagaagag 60 tttttcccta tccaatggta taaagaaatg ttaaacaatt cccccgttta ttttcatgaa 120 gaaacaaaca catggaatgt attccaatac gaacatgtta aacaagtctt gagcaactac 180 gaattttttt caagcgatgg acaaagaacc actatttttg ttggagataa tagcaagaaa 240 aaaagcacat ctccaatcac caaccttaca aacttagatc ctcctgacca ccggaaagcg 300 cgatctttgc ttgctgccgc ctttactcct cgcagtttaa agaactggga gccgcgaatc 360 aaacaaattg cagcagacct tgtagaagag acacaaaaga attcaactat taatattgtt 420 gaagatttgt cttctccttt tcctagttta gttatagcag atttattcgg cgtaccggta 480 aaagaccgat atcagttcaa aaagtgggta gatattcttt ttcagcctta tgaccaggaa 540 agattaaaag agattgaaca agaaaagcaa cgtgcaggag ctgaatattt tcaatatctc 600 tacccgattg tcgttgaaaa gcgctccaac ctttctgatg atattatttc agacttaatt 660 caagcggaag ttgatgggga aacattcaca gatgaagaaa ttgtgcacgc taccatgctg 720 cttttaggtg caggagttga aaccacaagt cacgccattg caaatatgtt ttattctttc 780 ttatatgacg acaagtcgtt atacagcgag ctgagaagca atagagaatt agctccaaaa 840 gcagtagaag aaatgcttcg atatcggttt catatctcca gacgagatcg cacggttaaa 900 caagataacg agctattagg cgttaagcta aaaaaaggag atgtcgtgat tgcgtggatg 960 agtgcatgta atatggatga aaatatgttt gaaaaccctt tttctgtaga cattcatcgt 1020 ccaactaata aaaagcactt aacattcgga aacggacctc atttttgttt gggcgcccct 1080 cttgcccgac ttgaaatgac aattatctta gaagcatttt tagaggcctt ttctcatatc 1140 gaaccatttg aaggttttga attagaaccg catttaacac cttcagctac gggtcaatct 1200 ttaacatact tgcccatgac ggtgtacaaa taa 1233

Claims (17)

  1. - 바실루스 메가테리움 속에 속하는 적어도 하나의 프로바이오틱 균주, 및
    - 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA), 아라키돈산(ARA), 알파 리놀렌산, 스테아리돈산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 리놀레산, γ-리놀렌산으로부터 선택된 적어도 하나의 오메가-3 또는 오메가-6 지방산을 포함하는 다중불포화 지방산 성분
    을 포함하고
    여기서 다중불포화 지방산 성분은 오메가-3 또는 오메가-6 지방산 염을 포함하는 것인 제제.
  2. 제1항에 있어서, 프로바이오틱 균주가 휴면 형태로 또는 영양 세포로서 존재하는 것인 제제.
  3. 제1항에 있어서, 오메가-3 또는 오메가-6 지방산이 유리 지방산, 염, 천연 트리글리세리드, 어유, 인지질 에스테르 또는 에틸 에스테르의 형태인 제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 지방산이 오메가-3 지방산 EPA 및 DHA로부터 선택되거나 또는 오메가-6 지방산 성분이 ARA인 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 5-아미노레불린산을 추가로 포함하는 제제.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로바이오틱 균주가 바실루스 메가테리움 DSM 32963, 바실루스 메가테리움 DSM 33296, 또는 바실루스 메가테리움 DSM 33299 중 하나 이상으로부터 선택되는 것인 제제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 다중불포화 지방산 성분이 오메가-3 지방산 염, 바람직하게는 아미노산 염, 보다 바람직하게는 리신, 아르기닌, 오르니틴, 콜린 및 그의 혼합물로부터 선택된 염기성 아미노산, 가장 바람직하게는 리신으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 다중불포화 지방산 성분이 적어도 하나의 인지질 및 적어도 하나의 오메가-3 또는 오메가-6 지방산의 분산액을 포함하는 제제를 포함하는 것인 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 지연 방출 또는 장 또는 결장 방출을 위한 코팅을 포함하는 제제.
  10. 사료 또는 식품 보충제로서의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제제의 용도.
  11. 제약 제품의 제조를 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제제의 용도.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제제 및 바람직하게는 단백질, 탄수화물, 지방, 추가의 프로바이오틱스, 프리바이오틱스, 효소, 비타민, 면역 조절제, 우유 대체품, 미네랄, 아미노산, 항 콕시듐증 제제, 산-기재 제품, 의약, 및 그의 조합으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 사료 또는 식품 성분을 함유하는 사료- 또는 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 동물 또는 인간의 건강 상태, 장 건강, 심혈관 건강, 심장-대사 건강, 폐 건강, 관절 건강, 눈 건강, 정신 건강, 구강 건강 또는 면역 건강을 개선시키기 위한 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    - 위장 미생물에 의한 그의 제조를 통해 숙주에서 하기 지질 매개인자의 총량을 증가시키는 것: 17-HDHA, 14-HDHA, 13-HDHA, 7-HDHA, 4-HDHA, 18-HEPE, 15-HEPE, 12-HEPE, 11-HEPE, 5-HEPE, 15-HETE, 12-HETE, 11-HETE, 8-HETE, 5-HETE, 9-HODE, 13-HODE, PDX, PD1, AT-PD1, MaR1, MaR2, LTB4, t-LTB4, RvD1-5, AT-RvD1, RvE1, RvE3, LXA4, LXA5, LXB4, LXB5,
    - 숙주에서 EPA의 총량을 증가시키는 것,
    - 숙주에서 DHA의 총량을 증가시키는 것
    중 하나 이상에 의해 동물 또는 인간의 건강 상태를 개선시키기 위한 조성물.
  15. 적합한 매트릭스 또는 담체를 사용하여 피부, 눈 및 구강 공동 상에 국소 적용하기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제제의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 제제가 나노셀룰로스를 포함하는 사전-합성된 다상 생체물질 상에 및/또는 내에 로딩되며,
    여기서 나노셀룰로스는
    - 셀룰로스 섬유 또는 나노위스커의 네트워크를 포함하는 박테리아 합성된 나노셀룰로스(BNC),
    - 셀룰로스 피브릴의 2개 이상의 상이한 층을 포함하며, 여기서 각각의 층은 상이한 미생물로부터의 또는 상이한 조건 하에 배양된 미생물로부터의 BNC로 이루어진 것인 BNC,
    - 2종 이상의 상이한 셀룰로스 네트워크를 포함하는 BNC 또는
    - 중합체를 추가로 포함하는 BNC 복합 물질
    로부터 선택된 박테리아 합성된 나노셀룰로스(BNC)인 용도.
  17. SPM의 생명공학적 제조를 위한, 하기 특징:
    a) 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 25 또는 서열식별번호: 26에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 16S rDNA 서열; 및/또는
    b) 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 27에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 yqfD 서열; 및/또는
    c) 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 28에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 gyrB 서열; 및/또는
    d) 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 29에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 rpoB 서열; 및/또는
    e) 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 30에 따른 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 99.5 %, 특히 100 %의 서열 동일성을 갖는 groEL 서열
    을 나타내는, 휴면 형태의 또는 영양 세포로서의 바실루스 메가테리움 균주의 용도.
KR1020217019791A 2018-11-30 2019-11-28 바실루스 메가테리움 속의 프로바이오틱 균주 및 다중불포화 지방산 성분을 포함하는 제제 KR20210099037A (ko)

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