KR20210097852A - 포도당 검출용 금속 나노입자 및 이를 이용한 포도당 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포도당산화효소가 부착된 금속 나노입자; 및 상기 금속 나노입자를 둘러싸는, 적혈구에서 분리한 세포막;으로 구성된 포도당 검출용 금속 나노입자 및 이를 이용하여 포도당을 검출하는 방법을 제공한다.

Description

포도당 검출용 금속 나노입자 및 이를 이용한 포도당 검출 방법 {A metal nanoparticle for glucose detection and glucose detection method using the same}
본 발명은 포도당 검출용 금속 나노입자 복합체 및 이를 이용한 포도당 검출 방법에 관한 것이다.
당뇨병으로 인해 나타날 수 있는 심혈관계 질환, 뇌졸중, 신경 손상 및 신장 기능 장애와 같은 합병증을 예방하기 위해서는, 환자의 혈당 농도를 지속적으로 측정하고 관리하는 것이 매우 중요하다. 2017년 기준 전 세계에 대략 4억 2천 5백만 명의 성인(20-79세)이 당뇨병 환자이고, 국제 당뇨 연맹은 이 수치가 2045년에는 6억 2천 9백만 명까지 증가할 것으로 예상하고 있다. 또한 2017년 성인의 경우 당뇨병을 치료하기 위해 7270억 달러가 소비되었으며 이는 곧 세계 성인 전체 소비의 12%를 차지한다.
당뇨병 환자들은 포도당 센서인 혈당 진단 기기를 이용하여 자신의 혈당량을 측정하고 이를 기반으로 인슐린 투여량과 투여 시간을 결정한다. 정밀한 혈당 측정이 필요할 때는 한 가지 기기만을 이용하는 것이 아니라 5개 이상의 서로 다른 센서 기기를 이용하여 오차 범위를 줄이는데 이처럼 단일 기기의 정확도는 조금씩 차이가 있다.
기존 포도당 측정 센서는 포도당 산화효소(glucose oxidase)나 포도당 탈수소효소(glucose dehydrogenase)를 이용한 전기 화학적 방식을 사용하여 측정 시간을 단축하고 높은 정밀도를 얻는다. 효소들이 혈액 속의 포도당과 만나면 산화-환원 반응을 촉진시키고 이때 생성된 전자 전달 물질은 환원되어 혈당을 측정하는데 필요한 신호를 제공한다. 특히 포도당은 포도당 산화효소(glucose oxidase)와 반응하여 D-glucono-1,5-lactone과 과산화수소로 변한다. 그러나 기존 센서의 단점은 정확도가 낮고 사용시 기기를 가지고 다녀야 된다는 불편함이 있다.
금속(예를 들면, 금) 나노 입자는 SPR(surface plasmon resonance) 라는 현상에 의해 특정 플라스몬 피크(plasmonic peak) 값을 가지고 있고 UV-비스 스펙트로미터를 이용하여 그 피크값에서의 세기(intensity)를 측정할 수 있다. 금 나노 입자 위에 다른 물질들(포도당 산화효소, 세포막 등)이 코팅될 때마다 플라스몬 피크 값에서 나타나는 세기가 달라지고 이를 통해 코팅이 잘 되었는지 확인할 수 있다.
한편 세포막은 인지질 이중층으로 이루어져 있어 세포막 내로 물질들이 무분별하게 유입되는 것을 막을 수 있다. 또한 인지질 이중층 사이에 존재하는 다양한 막단백질들 중 막 간 수송 단백질들은 특정 물질만 촉진 확산 현상을 통해 세포막 안, 혹은 밖으로 이동할 수 있도록 매개한다. 세포들 중 포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1)을 많이 가지고 있는 것들에는 적혈구, 상피세포, 암세포 등이 있는데 이들의 막을 이용하면 센서 내부로 혈액 내의 포도당만을 운반하고 그 외의 신호 방해 물질들(포도당 제외 당들, 요산, 아스코르빈산 등)의 유입을 막는 선택적 필터 기능을 얻을 수 있다. 또한 적혈구 막(Erythrocyte membrane, EM)에 존재하는 아쿠아포린 1(aquaporin 1, AQP1)이라는 막단백질은 막 내부에 존재하는 과산화수소를 선택적으로 막 외부로 수송하는 역할을 한다.
비색적 방법을 통해 혈당량을 측정하는 방법은 발색 기질(chromogenic substrate)과 산화제가 서로 반응하는 화학반응에 의해 빛이 발생하는 화학 발광(chemiluminescence, CL)이라는 현상에 기초를 둔다. 포도당 산화효소와 포도당이 반응할 때 생성되는 과산화수소는 산화제로, ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)는 발색제로 작용하여 산화-환원 반응을 촉매해 주는 홍당무과산화효소(horseradish peroxidase)에 의해 빛이 발생한다.
기존의 포도당 측정 센서에 이용되는 포도당 산화효소(glucose oxidase)는 혈액 내의 포도당뿐만 아니라 분자 구조가 유사한 단당류(galactose, fructose, mannose, xylose)와 이당류(maltose)와도 반응하여 과산화수소를 생성하기 때문에 화학 발광 강도가 더 크게 나타나 결과적으로 실제 포도당 농도보다 더 높은 농도로 측정되는 문제점이 발생한다. 또한 혈액 내에 존재하는 항산화 물질(아스코르브산, 요산, 시스테인 등)도 포도당 산화효소의 작용을 방해하여 왜곡된 포도당 농도 결과 값이 나오게 한다.
본 발명자들은 포도당만을 선택적으로 검출할 수 있는 금속 나노입자 센서에 대해 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제 2019-0013474호
본 발명의 목적은 포도당 검출용 금속 나노입자를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 포도당 검출용 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 금속 나노입자를 이용하여 포도당을 검출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은,
포도당산화효소가 부착된 금속 나노입자; 및
상기 금속 나노입자를 둘러싸는, 적혈구에서 분리한 세포막;
을 포함하여 이루어진 포도당 검출용 금속 나노입자를 제공한다.
본 발명의 금속 나노입자는, 포도당 산화효소가 부착된 금속 나노입자(코어)를 적혈구에서 분리된 세포막으로 둘러싼 것이다.
본 발명에서는, 적혈구 유래 세포막이 금속 나노입자를 둘러싸는 것을 "금속 나노입자를 코팅"하는 것으로도 표현하였다. 세포막이 금속 나노입자를 코팅하는 기술은 extrusion 방법으로 이 기술분야에 널리 알려져있다(Gao, W., Hu, C.-M.J., Fang, R.H., Luk, B.T., Su, J. and Zhang, L. (2013), Surface Functionalization of Gold Nanoparticles with Red Blood Cell Membranes. Adv. Mater., 25: 3549-3553. doi:10.1002/adma.201300638 ).
상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 백금, 실리콘, 게르마늄, 이들의 합금 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 세포막은　포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1) 및　아쿠아포린(aquaporin 1, AQP1)을 포함할 수 있다.
상기 포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1)은 시료 내의 포도당만을 코어인 포도당산화효소가 부착된 금속 나노입자로 운반하고, 그 외의 신호 방해 물질들(포도당 제외 당들, 요산, 아스코르빈산 등)의 유입을 막는 역할을 한다.
또한 상기 아쿠아포린 1(aquaporin 1, AQP1)은 적혈구 유래 세포막 내부에 존재하는 과산화수소를 선택적으로 막 외부로 수송하는 역할을 한다.
본 발명은 적혈구의 세포막을 포도당산화효소가 부착된 금속 나노입자에 코팅하여 포도당을 제외한 다른 물질들이 물리적으로 금속 나노 입자에 부착되어 있는 포도당 산화효소(glucose oxidase)와 반응하지 않도록 막아준다. 또한 적혈구 유래 세포막에 다량으로 존재하는 포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1)는 선택적으로 막 바깥 영역에 존재하는 포도당만을 선택적으로 막 안쪽으로 수송하고 아쿠아포린은 막 내부에서 생성된 과산화수소를 막 외부로 이동시킨다. 이러한 방해 물질의 선택적 차단 및 과산화수소의 확산 효과로 인해 방해 물질의 영향을 배제하고 세포막 안에서 포도당의 농도에 따라서만 화학 발광에 필요한 과산화수소가 생성될 수 있는 플랫폼을 제공하여 포도당 검출의 정확도를 높여준다.
본 발명의 포도당 검출용 금속 나노입자는 포도당 검출용 바이오센서로 기능한다.
다른 측면에서 본 발명은 상기 금속 나노입자를 포함하는 포도당 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 과산화효소 및 발색 기질을 더 포함할 수 있다.
발색반응 기질은 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine),　ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], DAB (3,3'-Diaminobenzidine) 및 OPD(o-phenylenediamine)일 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 측면에서 본 발명은 하기 단계를 포함하는 포도당 검출방법을 제공한다:
포도당산화효소가 부착된 금속 나노입자;　및 상기 금속 나노입자를 둘러싸는, 적혈구에서 분리한 세포막으로 구성된 포도당 검출용 금속 나노입자를 제조하는 단계;
상기 금속 나노입자를 과산화효소와 발색 기질을 포함하는 발색 측정 용액에 첨가하는 단계;
상기 금속 나노입자 및 발색용액에　시료를 첨가하여 발색 반응을 유도하는 단계; 및　
발색 반응에 따른 색 변화를 감지하는 단계.
상기 시료는 생물학적 시료 또는 비생물학적 시료일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 혈액, 눈물, 소변 또는 땀일 수 있고, 상기 비생물학적 시료는 음식물일 수 있다.
상기 발색 측정 용액에서, 상가 과산화수소와 발색 기질의 함량은 1:1일 수 있다.
상기 금속 나노입자; 시료: 발색측정 용액의 첨가 비율은 2: 1: 1일 수 있다. 구체적으로 금속 나노입자를 포함하는 용액; 시료: 발생측정 용액의 첨가 비율이 2: 1: 1의 부피일 수 있다.
상기 금속 나노입자를 포함하는 용액이란, 금속 나노입자를 소듐 시트레이트 용액에 포함한 것이다.
도 2는 포도당 검출 과정을 구체적으로 나타낸 모식도이다. 구체적으로, ① 생물학적 시료(예를 들면, 혈액) 또는 음식 속의 포도당이 선택적으로 적혈구막을 투과한다. ② 적혈구 세포막을 투과한 포도당이 효소와 반응하여 H2O2를 생성한다. ③ 생성된 H2O2가 아쿠아포린을 통해 적혈구막 밖으로 빠져나간다. ④ 빠져나간 H2O2가 용액 속의 HRP(horse radish peroxidase)와 반응하여 발색 기질(ABTS)을 환원 시켜 450 nm대역에서 빛을 내게 만든다(발색 반응 유도).
본 발명의 포도당 측정용 금속 나노입자는 적혈구 세포막을 이용하여 포도당만을 선택적으로 흡수하여 금속 나노입자에 부착된 포도당 산화효소가 포도당이 아닌 다른 물질과 반응하는 것을 막아주고, 그리고 금속 나노입자에 부착된 포도당 산화효소가 포도당과 반응하여 생성된 과산화수소는 적혈구 세포막 외부로 이동시킨다. 본 발명에 따른 금속 나노입자는 포도당이 아닌 다른 방해 물질의 영향을 배제하고 세포막 안에서 포도당의 농도에만 따라서 과산화수소가 생성되어 화학 발광이 일어날 수 있게 해준다. 따라서 본 발명의 금속 나노입자는 매우 정확도가 높은 포도당 측정 센서 및 포도당 측정 키트로 이용될 수 있다.
도 1은 코어로 60 nm 크기의 금 나노 입자(GNP)를 가지고 그 외각에 포도당산화효소(GOx)를 코팅한 후 적혈구 세포막(EM)으로 둘러 싸인 본 발명에 따른 포도당 검출용 금속 나노입자(EM-GOx-GNP) 의 제작 과정을 나타낸다. 적혈구에서 세포막을 추출한 후 이 세포막을 포도당산화효소가 부착된 금 나노입자를 둘러싸는 방식을 취한다.
도 2는 본 발명의 금속 나노입자를 이용한 포도당 검출 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 금 나노 입자 표면에 포도당 산화효소를 부착할 때 걸리는 최적의 인큐베이션 시간을 찾기 위하여 0, 10, 30, 60, 120분에 나노 입자의 직경과 PDI(polydispersity index)를 확인한 결과이다. A는 시간에 따른 입자의 크기, B는 시간에 따른 입자의 균일도, C는 시간에 따른 흡광도 및 D는 시간에 따른 흡광도 피크(최대값)를 나타낸다.
도 4는 금 나노입자(GNP), 포도당 산화효소 부착 금 나노입자(GOx-GNP), 적혈구 유래 세포막을 코팅된 금 나노입자(EM-GOx-GNP)의 TEM 이미지(A-D) 및 각 입자들의 평균 직경(E) 및 제타 포텐셜 값(F)이다.
도 5A는 포도당 농도를 변화시키며 1분 간격으로 포도당 센서인 EM-GOx-GNPs의 화학 발광(chemiluminescence, CL) 강도가 어떻게 변화하는지 나타낸 그래프이다. 5B는 5A 그래프의 10분에서의 CL신호를 포도당 농도에 따른 화학 발광 강도로 나타낸 것이다.
도 6은 포도당 농도 10 mM 조건에서 포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1) 저해제의 농도를 변화시켜 EM-GOx-GNPs의 화학 발광(chemiluminescence, CL) 신호를 측정한 결과이다.
도 7은 포도당 농도 10 mM 조건에서 적혈구 막에 존재하는 aquaporin 1(AQP1) 저해제를 첨가하였을 때 포도당 센서인 GOx-GNPs와 EM-GOx-GNPs의 상대적 CL 강도(포도당 10 mM 기준 100%)를 확인한 그래프이다.
도 8은 포도당과 분자 구조가 유사한 단당류(galactose, fructose, mannose, xylose)와 이당류(maltose)를 각각 포도당과 함께 첨가하였을 때 (10 mM) 적혈구막이 코팅된 EM-GOx-GNPs와 적혈구 막이 코팅되지 않은 GOx-GNPs의 화학 발광(chemiluminescence, CL) 강도가 어떻게 나타나는지 확인한 그래프이다.
도 9는 10 부피%로 희석한 인간 혈청에서 GOx-GNPs와 EM-GOx-GNPs의 포도당 검출 능력을 확인한 그래프와 표이다.
도 10은 본 발명에 따른 EM-GOx-GNP와 시료 및 발색 측정 용액의 함유량에 따른 흡광도를 나타낸 것이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 포도당 측정용 금속 나노입자 복합체 제조
1-1. 적혈구 막 정제
인간 전혈(28 세, 수컷, 유형 B)을 EDTA-K2 진공관(라벤더)으로 새로 채취하고 잘 혼합하여 4 ℃에서 보관하였다. 다음 단계를 4 ℃ 증류수에서 수행하였다: 적혈구(RBC)를 800g에서 10 분 동안 연속 원심분리에 의해 전혈로부터 단리하고, 그리고 상청액을 제거하고 세척을 위해 1x PBS를 RBC 침전물에 첨가하였다. 용혈을 위해, 수집된 RBC에 0.25X 농도의 PBS를 RBC의 부피의 5배 이상 첨가하여 4 ℃에서 30 분 동안 현탁시켰다. 생성된 용액을 1x PBS로 4 회 헤모글로빈을 제거하기 위해 20000g에서 원심 분리하였다. 연분홍색 펠릿 (적혈구 세포막 농축물)을 수집하고, 증류수에 현탁시키고, 추가 사용을 위해 -80 ℃에서 저장 하였다.
1-2: 포도당산화효소가 부착된 금속 나노입자 제조
GNPs (Gold nanoparticles) 60 nm 800 μL에 포도당 산화효소(glucose oxidase, GOx) 10 μL (1 mg / 1 mL)를 첨가하고 37℃, 5 % CO2 조건에서 10, 30, 60 및 120분 동안 인큐베이션하고 GNPs 표면에 기능화되지 않은 GOx를 제거하기 위해 4000 rpm, 30 분으로 원심분리하였다.
도 3은 금 나노입자에 GOx의 코팅 시간에 따른 변화를 확인한 것이다(효소 코팅 최적화). 도 3의 결과, 120분 인큐베이션 하였을 때 입자의 크기가 균일함을 알 수 있었고, 입자의 손실도 적은 것을 알 수 있었다. 따라서 금 나노 입자에 효소를 붙이는 데 120분이 최적 시간임을 알 수 있다.
1-3: 포도당 측정용 금속 나노입자(EM-GOx-GNP) 제조
GNPs (Gold nanoparticles) 60 nm 800 μL에 포도당 산화효소(glucose oxidase, GOx) 10 μL (1 mg/ 1 mL)를 첨가하고 37℃, 5 % CO2 조건에서 120분 동안 인큐베이션하고 GNPs 표면에 기능화되지 않은 GOx를 제거하기 위해 4000 rpm, 30분으로 원심분리하였다. 원심분리가 끝난 뒤에 상층액 700 μL를 따내고 증류수 400 μL와 1% 적혈구 막 300 μL를 첨가하고 필터 압출방법(filter extrusion method)을 이용하여 0.2 μm 다공성 막(pore membrane)을 여러 번 통과시켜 GOx가 붙어있는 GNPs 위에 적혈구 막이 코팅되게 하였다.
대조군으로 금 나노입자(GNP), 포도당 산화효소만 부착된 금 나노입자(GOx-GNP)를 사용하였다. GNP, GOx-GNP 및 EM-GOx-GNP의 TEM 이미지는 시료를 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 염색하여 에너지여과 투과전자현미경 (energy filtering transmission electron microscope)으로 측정하였고, 평균 직경 및 제타전위는 입도 및 제타전위 분석기 (Zetasizer)로 측정하였다.
도 4는 금 나노입자(GNP), 포도당 산화효소 부착 금 나노입자(GOx-GNP), 적혈구 유래 세포막을 코팅된 금 나노입자(EM-GOx-GNP)의 TEM 이미지(A-D) 및 각 입자들의 평균 직경(E) 및 제타 포텐셜 값(F)이다. 투과전자현미경 이미지(B)를 통해 얇은 막이 금나노입자를 코팅하고 있는 것을 확인하여 효소막이 금나노입자에 코팅된 것을 확인할 수 있었다. 적혈구막을 코팅한 후 얇은 막이 평균적으로 2 nm 증가한 것을 확인할 수 있었다(C). 이와 같은 시각적 정보를 입도 및 제타전위 분석을 통해 확인해본 결과, 금나노입자에 효소를 코팅할 경우 평균적으로 7 nm가 증가하고, 그 위에 세포막을 코팅할 경우 또 다시 지름이 약 7 nm 커지는 것을 확인할 수 있었고(E), 제타전위측정을 통해 금나노입자에 세포막을 코팅할 경우 그 제타전위가 세포막의 제타전위와 유사해짐을 관찰했다. 이를 통해 EM-GOx-GNP가 잘 형성되었음을 확인하였다(F).
실시예 2. 포도당 측정용 금속 나노입자의 특성 확인
2-1. 포도당 검출 능력 확인
금속 나노입자의 포도당 검출 능력을 확인하기 위해, 금 나노입자(EM-GOx-GNPs 또는 GOx-GNPs) 를 소듐 시트레이트 용액에 0.05 mg/ml의 농도로 첨가하여 금 나노입자 용액을 제조하였다. 96 웰 플레이트에 EM-GOx-GNPs 용액과 화학 발광 검지 용액(horseradish peroxidase (200 μg/mL) to 1mM ABTS), 포스페이트 버퍼에 녹아있는 여러 다른 농도의 포도당(0.1, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 mM)의 부피비를 2:1:1로 순서대로 넣은 후 마이크로플레이트 리더를 통해 420 nm 파장에서의 화학 발광 강도를 10분 동안 1분의 간격을 가지고 측정하였다. ABTS의 산화는 420 nm의 파장에서 화학 발광을 일으키며 이는 시간이 지날수록 점차 강해진다. 마이크로플레이트 리더를 통해 측정할 때 처음 측정 전에는 5초 동안 흔들어 주었고 그 후 각 측정 전에는 3초 동안 흔들어 주었다. 그 결과를 도 5A에 나타내었다. 도 5B는 서로 다른 농도의 포도당(0.1, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 mM)의 10분일 때의 화학 발광 강도만 모아서 나타낸 것이다.
도 5를 통해, EM-GOx-GNPs의 화학 발광(chemiluminescence, CL) 신호가 포도당 농도에 대해 선형적으로 증가하는 것을 알 수 있다. 이를 통해 정상적인 EM-GOx-GNPs의 (PBS에 녹은) 포도당 검출 능력을 확인할 수 있었다.
2-2. 포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1) 저해 여부에 따른 포도당 검출 능력 확인
포도당 저해제인 fasentin과 BAY 876는 Sigma-Aldrich에서 구매하였다. 각각의 저해제들을 서로 다른 농도(0.0001 - 0.1 mg/ml)로 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹이고 여기에 EM-GOx-GNPs 용액을 첨가하여 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후에 10 mM의 포도당이 첨가된 포스페이트 버퍼를 각기 다른 농도의 fasentin과 BAY 876이 적용된 EM-GOx-GNPs 용액에 첨가하고 마이크로플레이트 리더를 통해 420 nm 파장에서 화학 발광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 통해 포도당이 선택적으로 적혈구 막 내부로 이동할 때 포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1)이 필요함을 알 수 있다.
2-3. 아쿠아포린(Aquaporin 1, AQP1) 저해 여부에 따른 화학발광 강도 확인
AQP1 저해제인 TC AQP1 1은 Tocris Bioscience에서 구매하였다. AQP1 저해제를 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 서로 다른 농도(0 - 5 mM)로 녹이고 여기서 10 μl를 빼내어 EM-GOx-GNPs 용액과 GOx-GNPs 용액에 각각 첨가하여 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 그 후에 10 mM의 포도당이 첨가된 포스페이트 버퍼를 각기 다른 농도의 AQP1 저해제가 적용된 EM-GOx-GNPs 용액에 첨가하고 마이크로플레이트 리더를 통해 420 nm 파장에서 화학 발광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 포도당 농도 10 mM 조건에서 적혈구 막에 존재하는 aquaporin 1(AQP1) 저해제를 첨가하였을 때 포도당 센서인 GOx-GNPs와 EM-GOx-GNPs의 상대적 CL 강도(포도당 10 mM 기준 100%)를 확인한 그래프이다. GOx-GNPs의 경우 적혈구 막이 코팅되어있지 않으므로 AQP1 저해제의 영향을 받지 않지만 EM-GOx-GNPs의 경우 적혈구 막으로 코팅되어 있어서 막에 존재하는 aquaporin 1(AQP1)의 기능이 저해되어 CL 강도가 줄어들었다. 이는 아쿠아포린이 적혈구 막 내에서 생성된 과산화수소를 막 바깥으로 수송한다는 사실을 나타낸다.
2-4. 본 발명의 EM-GOx-GNP 센서의 선택적 포도당 검출 능력 확인
10 mM 포도당 용액에 각각 다른 단당류(galactose, fructose, mannose, xylose)와 이당류(maltose) 10 mM을 첨가하고 이를 EM-GOx-GNPs 용액과 섞어서 마이크로플레이트 리더를 통해 420 nm 파장에서의 화학 발광 강도를 10분 동안 측정하여 평균값과 표준편차를 막대그래프로 나타내었다. 그 결과는 도 8과 같다.
도 8을 보면, 적혈구 막을 코팅하지 않은 GOx-GNPs의 경우 포도당 이외의 당류들이 포도당 산화효소와 반응하여 상대적 CL 강도(포도당 10 mM 기준 100%)가 110% 정도로 나타났지만, 적혈구 막이 코팅된 EM-GOx-GNPs의 경우 100%에 가까운 CL 강도를 보여주었다. 이를 통해 적혈구 막에 있는 포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1)이 분자구조가 유사한 단당류는 통과시키지 않고 포도당만을 선택적으로 막 내부로 이동시키는 사실을 확인할 수 있다.
2-5. 인간 혈청에서의 EM-GOx-GNP 센서의 포도당 검출 능력 확인
10배 희석한 인간 혈청 용액에 서로 다른 농도(0 - 5 mM)의 포도당을 첨가하고 이를 각각 EM-GOx-GNPs 용액과 GOx-GNPs 용액과 섞어 10분 마이크로플레이트 리더를 통해 420 nm 파장에서의 화학 발광 강도를 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9A 및 9B를 보면, 포도당 농도가 증가함에 따라 GOx-GNPs와 EM-GOx-GNPs 모두 선형적으로 증가하는 양상을 보이지만 EM-GOx-GNPs의 경우가 PBS 증가 양상에 더 유사한 모습을 나타낸다. 즉, EM-GOx-GNPs의 포도당 센싱 감도가 높음을 알 수 있다. 이는 9C와 9D에서도 확인할 수 있는데, 적혈구 막이 포도당을 제외한 원하지 않는 물질들이 막 내부로 유입되는 것을 차단하여 포도당 센싱 감도를 높였음을 확인할 수 있다.
2-6. 포도당 검출방법 최적화
포도당 검출 방법의 최적화를 위해, EM-GOx-GNP, 포도당 포함 시료, 측정 용액 (HRP&ABTS)의 부피에 변화를 주면서 흡광도를 측정하였다. 구체적으로, EM-GOx-GNP와 시료의 부피를 100 μl 와 10 μl 로 고정한 후 발색 측정용액(PBS 버퍼에 HRP(200 μg/mL), 증류수에 1mM ABTS를 녹여 1:1 부피비로 제작)을 25 μl (검정), 50 μl (빨강), 75 μl (파랑), 100 μl (주황)으로 하여, 각각의 부피비로 시료를 96 웰 마이크로플레이트에 넣어준 후60분 동안의 반응을 1분 단위로 420 nm (ABTS가 화학발광을 하는 파장대역)의 광량을 모니터링하고, 부피 조건별로 3회 측정하였다(도 10A). 그리고, EM-GOx-GNP와 포도당 포함 시료 의 부피를 100 μl 와 50 μl 로 고정한 후 측정용액 (HRP와 ABTS용액)을 25 μl (검정), 50 μl (빨강), 75 μl (파랑), 100 μl (주황)으로 하여, 각각의 부피비로 시료를 96 웰 마이크로플레이트에 넣어준 후60분 동안의 반응을 1분 단위로 420 nm (ABTS가 화학발광을 하는 파장대역)의 광량을 모니터링하고, 부피 조건별로 3회 측정하였다(도 10B). 그 결과, 반응 시간이 10분 일 때를 기준으로 살펴보면, 최종적으로 EM-GOx-GNP, 시료, 측정 용액의 부피비를 2:1:1로 (100 μl : 50 μl: 50 μl) 하였을때 검출이 잘 수행됨을 알 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 포도당산화효소가 부착된 금속 나노입자; 및
    상기 금속 나노입자를 둘러싸는, 적혈구에서 분리한 세포막;
    을 포함하여 이루어진 포도당 검출용 금속 나노입자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄, 백금, 실리콘, 게르마늄, 이들의 합금 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 금속 나노입자 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포막은　포도당 수송 막 단백질(glucose transporter-1, GLUT1)및　아쿠아포린(aquaporin 1, AQP1)을 포함하는 것인, 금속 나노입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 금속 나노입자를 포함하는 포도당 검출용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 과산화효소 및 발색 기질을 더 포함하는 것인 키트.
  6. 하기 단계를 포함하는 포도당 검출 방법:
    포도당산화효소가 부착된 금속 나노입자;　및 상기 금속 나노입자를 둘러싸는, 적혈구에서 분리한 세포막으로 구성된 포도당 검출용 금속 나노입자를 제조하는 단계;
    상기 금속 나노입자를 시료와 혼합하는 단계;
    상기 금속 나노입자와　시료의 혼합물에, 과산화효소와 발색 기질을 포함하는 발색 측정 용액을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및　
    발색 반응에 따른 색 변화를 감지하는 단계.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 시료는 생물학적 시료 또는 비생물학적 시료인, 검출 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 금속 나노입자; 시료: 발색측정 용액의 첨가 비율은 2: 1: 1인, 포도당 검출방법.

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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6053075B2 (ja) * 2015-07-16 2016-12-27 サミー株式会社 ぱちんこ遊技機
KR20190013474A (ko) 2017-07-27 2019-02-11 고려대학교 산학협력단 세포막으로 이루어진 필터를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6053075B2 (ja) * 2015-07-16 2016-12-27 サミー株式会社 ぱちんこ遊技機
KR20190013474A (ko) 2017-07-27 2019-02-11 고려대학교 산학협력단 세포막으로 이루어진 필터를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gao et al., Surface Functionalization of Gold Nanoparticles with Red Blood Cell Membranes. Adv Mater. 2013, Vol. 25, No. 26, pp. 3549-3553 1부.* *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230116649A (ko) 2022-01-28 2023-08-04 한양대학교 산학협력단 고착 액적 바이오센서 및 이를 사용한 세포외소포체 검출방법

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