KR20210091122A - 키메릭 플라비바이러스 리사바이러스 백신 - Google Patents

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KR20210091122A
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카이 달메이어
니라 미쉬라
요한 네이츠
로레나 산체스
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카톨리에케 유니버시테이트 루벤
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Abstract

본 발명은 E/NS1 유전자간 영역에 리사바이러스 G 단백질을 포함하는 키메라 플라비바이러스 구축물에 대해 기재하고 있다.

Description

키메라 플라비바이러스 리사바이러스 백신
본 발명은 키메라 플라비바이러스(Flavivirus) 기반의 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 광견병(rabies) 백신에 관한 것이다.
인간에 사용하기 위한 광견병 백신은, 불활성화된 광견병 바이러스(RABV)를 함유하는, 정제된 세포 배양 및 발육란-기반의 광견병 백신(CCEEV: cell culture and embryonated egg-based rabies vaccine)이다.
이들 백신은 다중-투여 요법, 콜드 체인(cold chain)이 필요하고, 생산과 유지에 높은 비용이 드는 불활성화 바이러스 백신이다. 이들 백신은 풍토병 지역의 사람들인 주요 목표 그룹에서 인간 광견병을 예방하는데 실패하였다. 나아가, 예방적 백신화에 의해 유발된 면역 보호는 비교적 빨리 약화되며, 이뮤노글로빈(RIG)과 백신 요법의 조합에 의한 노출-후 치료의 필요성과 관련된다.
광견병 당단백질 G(RabG)는 세포 부착과 막 융합에 관여하며, 백신 개발의 표적인 핵심 면역원이다. 광견병 당단백질 G와 이의 에피토프는, 문헌[Kuzmina 등 (2013) J antivir antiretrovir. 5:2 37-43]에 검토되어 있다.
문헌[Bonaldo 등 (2014) Human Vacc . & Immunother . 10, 1256-1265]은 황열 바이러스(YFV) 키메라 구축물(construct)에 대해 검토하는데, 여기에서는 비-플라비바이러스 항원이 YFV 게놈 내에 삽입된다.
복제-결함이 있는 백신 플랫폼 RepliVax™(RV) 웨스트 나일 바이러스(WNV)와 관련된 접근법은, 광견병 백신(RV-RabG)을 얻는데 사용되어 왔다(문헌[Giel-Moloney 등 (2017) Vaccine. 35( 49PtB ), 6898-6904]). 이러한 접근법에서, 몇몇 RV-RabG 구축물들은 상이한 WN 결실 변이체들 내에 광견병 바이러스 당단백질 G 유전자를 삽입함으로써 생성되었다(C, prME 또는 CprME WN 유전자가 RabG 유전자로 교체되었다). C-말단에 2A 자가-절단 요소를 갖는 천연 RabG 신호 서열을 포함하는 전장의 RabG 단백질이 사용되었다.
이들 구축물은 새끼 햄스터 신장(BHK) 헬퍼 세포(HC)에서 시험관 내-전사 및 형질감염될 것을 요구하며, 백신으로 사용되는 단일-성분 위 감염성 바이러스(sPIV: pseudo infectious virus)로서 RV-RabG 레플리콘(replicon)을 패키징하는데 필요한 구조적 WN C-prM-E 단백질을 발현시킨다. 이들 PIV는 광견병 및 WN에 대한 특이적인 항체 반응을 유발한다.
황열 바이러스 17D는 라사-바이러스(Lassa virus) 당단백질(GPC), 또는 이의 서브유닛 GP1 및 GP2에 대한 벡터로 사용되어 왔다(문헌[Bredenbeek 등 (2006) Virology 345, 299-304] 및 문헌[Jiang 등 (2011) Vaccine. 29, 1248-1257]). 이들 구축물에서, GP 유전자(신호 펩티드 결여, SSP)(또는, GP1 서열 또는 GP2 서열)는 YF-E/NS1의 사이에 삽입되었다. 이들 구축물은 YF-E로부터 유래된 삽입체 융합 서열(YF-E의 23개의 C 말단 소수성 아미노산)의 C-말단에서, WNV-E 또는 인공 디자인된 서열을 갖는다. 이들 구축물은 세포에 형질감염될 필요가 있으며, 이로부터 유래된 바이러스는 백신으로 사용된다.
RepliVax™-RabG (RV-RabG) 구축물은 직접 백신으로 사용될 수 없고, BHK 헬퍼 세포(HC) 내에서 먼저 위-감염성 바이러스(PIV)를 생성할 필요가 있는데, 이는 WNV 골격으로부터 결실된 단백질을 트랜스로(in trans)로 공급하여, 백신화에 사용되는 PIV를 얻는다. 이것은 높은 생산 비용과 관련될 뿐만 아니라, PIV를 보존하기 위한 콜드 체인도 요구한다.
당단백질 전구체를 발현하는 벡터로서의 YFV17D의 사용에 대한, 이 재조합 바이러스의 주요 문제는 불안정성이며, 이로 인해 백신 생산에 필요한 만큼 기술을 스케일-업 시킬 수 없었다.
본 발명의 개요
본 발명은 E/NS1 유전자간 영역 내에 리사바이러스(lyssavirus) G 단백질을 포함하는 키메라 플라비바이러스 구축물에 대해 기재한다.
신규한 황열 바이러스 기반의 형질전환 백신은, RabG를 이하와 같이 YFV-17D의 황열 E/NS1 유전자간 영역에 삽입함으로서 조작되었다: RabG의 N-말단(Nt) 신호 펩티드가 절단되고, NS1의 처음 9개의 아미노산(27개 뉴클레오티드)이 RabG의 N-말단에 첨가되어 RabG 단백질의 적절한 방출을 허용하고, RabG 세포질 C 말단 서열은 보존되어, WNV(웨스트 나일 바이러스) 막투과 도메인 2에 융합된다. 생성된 광견병/YFV-17D 구축물은 기능성 RabG 및 YFV-17D 단백질을 발현하는 생존하는 생-약독화 바이러스를 새로 생성하였다(launch). 이러한 YFV17D-RabG 구축물을 포함하는 박테리아 인공 염색체는 백신으로 직접 사용될 수 있는데, 이는 이러한 YFV17D-RabG 구축물의 DNA-기반 병용 요법(modality)이 열안정성 백신으로 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 백신은 하나의-단일 샷(one-single shot) 이후, RABV 및 YFV 둘 다에 대한 면역 반응을 유도한다.
YFV17D-RabG는 YFV 및 광견병 바이러스 특이적인 면역을 유도하는 이중 백신(dual vaccine)이다. 또한, YFV17D-RabG를 포함하는 BAC도, 조직 배양-유래의 생-약독화 백신의 생산에 사용될 수 있다.
본 발명은 이하의 진술에 요약되어 있다:
1. 감염성 생-약독화 플라비바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 리사바이러스 G 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 플라비바이러스의 E 유전자와 NS1 유전자 사이의 유전자간 영역에 삽입/위치하여, 키메라 바이러스가 발현되고,
상기 플라비바이러스의 E 단백질의 C 말단이자 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질의 신호 펩티드의 N 말단의 암호화 서열은 이하의 순서대로:
- 플라비바이러스 NS1 단백질의 추가적인 신호 펩티드;
- 결함이 있는 기능성 신호 펩티드를 포함하거나 기능성 신호 펩티드가 결여되어 있고, IIb 에피토프를 포함하고, C 말단의 TM 막을 포함하고, C 말단의 세포질 서열을 포함하는, 리사바이러스 G 단백질; 및
- 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
2. 진술 1에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 상기 감염성 생-약독화 플라비바이러스의 서열은 황열 바이러스, 전형적으로 YF17D 균주인, 폴리뉴클레오티드.
3. 진술 2에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 플라비바이러스 골격은 키메라 바이러스인, 폴리뉴클레오티드.
4. 진술 1 내지 3 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 리사바이러스는 광견병 바이러스인, 폴리뉴클레오티드.
5. 진술 1 내지 4 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 광견병 G 단백질은 ERA 균주의 것인, 폴리뉴클레오티드.
6. 진술 1 내지 5 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 G 단백질의 뉴클레오티드 서열은 포유류 세포에서의 개선된 발현을 위해 코돈 최적화되는, 폴리뉴클레오티드.
7. 진술 1 내지 6 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 상기 감염성 생-약독화 플라비바이러스의 NS1 단백질의 추가적인 신호 펩티드는, 서열 DQGCAINFG[서열번호 6]을 포함하거나, 이로서 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
8. 진술 1 내지 6 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 TM2 도메인의 C 말단에 위치한 NS1 단백질의 신호 펩티드는, 서열 DQGCAINFG[서열번호 6]을 포함하거나, 이로서 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
9. 진술 1 내지 8 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 IIb 에피토프는 서열 GCTNLSGFS[서열번호:15]를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
10. 진술 1 내지 9 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 상기 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인은 웨스트 나일 바이러스 유래인, 폴리뉴클레오티드.
11. 진술 1 내지 10 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 상기 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인은 서열 RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA[서열번호 13]를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
12. 진술 1 내지 11 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 상기 Rab G의 결함이 있는 기능성 신호 펩티드는 F14S 돌연변이인, 폴리뉴클레오티드.
13. 진술 1 내지 12 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 Rab G는 아미노산 1 내지 19개의 MVPQALLFVPLLVFPLCFG[서열번호 18]의 N 말단 신호 서열이 결여되어 있는, 폴리뉴클레오티드.
14. 진술 1 내지 13 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 키메라 바이러스의 서열은 플라비바이러스 E 유전자, NS1 신호 펩티드 및 Rab G 단백질의 접합부에, 서열 LGVGA DQGCAINFG KFPIY[서열번호 21]를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
15. 진술 1 내지 14 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 키메라 바이러스의 서열은 WNV TM2 도메인과 YFV 단백질의 접합부에, 서열 VNVHA DQGCAINFG KRELK[서열번호 22]을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
16. 진술 1 내지 15 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 키메라 바이러스의 암호화 서열은 서열번호 2의 서열, 또는 이것과 95% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열, 또는 진술 1 내지 15 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열, 또는 이것과 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
17. 진술 1 내지 16 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 박테리아 인공 염색체인, 폴리뉴클레오티드.
18. 진술 1 내지 17 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드로서, 의약 용도를 위한 폴리뉴클레오티드.
19. 진술 18에 의한 의약 용도를 위한 폴리뉴클레오티드로서, 상기 의약은 백신인, 폴리뉴클레오티드.
20. 진술 1 내지 19 중 어느 하나에 의한 폴리뉴클레오티드 서열로서, 리사바이러스에 대한 백신화에 사용하기 위한, 폴리뉴클레오티드 서열.
21. 감염성 생-약독화된 키메라 플라비바이러스로서, 여기에서 리사바이러스 G 단백질, 예컨대 광견병 G 단백질의 적어도 일부는 상기 플라비바이러스의 E 단백질과 NS1 단백질 사이에 위치하여, 바이러스의 E 단백질의 C 말단이자 NS1 단백질의 신호 펩티드의 N 말단이 이하의 순서대로:
- 플라비바이러스 NS1 단백질의 추가적인 신호 펩티드,
- 결함이 있는 기능성 신호 펩티드를 포함하거나 기능성 신호 펩티드가 결여되고, IIb 에피토프를 포함하고, C 말단 TM 막과 C 말단 세포질 서열을 포함하는 리사바이러스 G 단백질, 및
- 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인을 포함하는, 키메라 플라비바이러스.
22. 진술 21에 의한 키메라 바이러스로서, 의약 용도를 위한, 키메라 바이러스.
23. 진술 22에 의한 키메라 바이러스로서, 리사바이러스의 예방에 사용하기 위한, 키메라 바이러스.
24. 진술 23에 의한 키메라 플라비바이러스로서, 리사바이러스의 예방과 플라비바이러스의 예방에 사용하기 위한, 키메라 플라비바이러스.
25. 리사바이러스 감염, 예컨대 광견병에 대한 백신의 제조 방법으로서,
a) 상기 BAC를 박테리아 세포당 10개 카피수 초과로 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열과, 진술 1 내지 15 중 어느 하나에 의한 플라비바이러스 리사바이러스 키메라 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포 내에서의 상기 바이러스 cDNA의 전사와 전사된 RNA의 감염성 RNA 바이러스로의 가공을 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트를 포함하는 BAC를 제공하는 단계;
b) 포유류 세포를 단계 a)의 BAC로 형질감염시키고, 감염된 세포를 계대하는 단계;
c) 단계 b)의 형질감염된 세포의 복제된 바이러스를, 병독성 및 항체 생성과 리사바이러스 감염에 대한 보호를 유도하는 능력에 대해 입증하는 단계;
d) 단계 c)에서 입증된 바이러스를 벡터에 클로닝하는 단계; 및
e) 상기 벡터를 백신 제제로 제제화하는 단계를 포함하는, 방법.
26. 진술 25에 의한 방법으로서, 여기에서 벡터는 상기 BAC를 박테리아 세포당 10개 카피수 초과로 증폭시키기 위해 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 BAC인, 방법.
이 프로젝트는 RABYD-VAX 비영리 단체(grant agreement) No 733176 하에 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램으로부터 자금을 지원받았다.
도 1. A) YFV17D-RabG-ERA(E/NS1)의 개략적인 도식. SP: 신호 펩티드; TM: 막투과 도메인. B) YFV17D에 대비된 YFV17D-RabG-ERA(E/NS1)의 플라크 표현형. C) AG129 마우스에서의 YFV17D-RabG-ERA(E/NS1)의 면역원성을 시험하기 위한 백신화 일정. AG129 마우스에서의 YFV17D-RabG -ERA(E/NS1)에 대한 사망률 및 혈청학적 반응(표)(IP - 복강내; TCID50 - 중간 조직 배양 감염 용량; PEI - 폴리에틸렌이민).
도 2: A) YF-E/NS1 부위에 삽입된 ERA-RabG 또는 Δ82-ERA-RabG를 발현시키는 BAC 자손의 플라크 표현형. B) 패널 A에 도시된 구축물에 대한 범례.
도 3: A) AG129 마우스에서 YFV17D-RabG-ERA-Δ82 및 라비푸르(Rabipur)의 면역원성을 시험하기 위한 백신화 일정. (IP - 복강내; TCID50 - 중간 조직 배양 감염 용량). B) RABV에 대한 중화 항체 역가.
도 4: A) YFV17D-RabG-CVS(E/NS1)의 개략적인 도식. SP: 신호 펩티드; TM: 막투과 도메인. B) YFV17D에 대비된 YFV17D-RabG-CVS (E/NS1)의 플라크 표현형.
도 5: A) AG129 마우스에서 YFV17D-RabG-CVS(E/NS1)의 면역원성을 시험하기 위한 백신화 일정. B) AG129 마우스에서의 YFV17D-RabG-CVS(E/NS1)에 대한 사망률 및 혈청학적 반응(IP - 복강내).
도 6. A) RabG-ERA는 이하와 같이 YF-E/NS1 사이에 삽입되었다: N-말단 RabG 신호 펩티드(SP)는 YF 다단백질(polyprotein) 내에 RabG를 수용하기 위해 제거되고, NS1의 처음 9개의 aa는 Rab G의 Nt에 첨가되어 RabG을 적절히 방출시킬 수 있게 하고, C 말단의 RabG 세포질 도메인은 보존되고, WNV의 막투과 도메인 앵커-2에 융합되어, RabG를 YF 다단백질의 토폴로지(topology)에 맞춘다. B) YFV17D-RabGERAΔSP 구축물의 개략적인 도식.
도 7: A) RabGERAΔSP를 발현하는 BAC 자손의 플라크 표현형. B) pShuttle-YF17D-RabGERAΔSP에 의해 형질감염된 세포의 상청액으로 감염된 BHK21J 세포의 면역형광에 의해 탐지된, RabGERAΔSP 및 YFV 항원의 공동-발현. 세포는 48hp.i.로 고정되었고, RabG와 YFV에 대해 염색되었다.
도 8. YF17D-RabGERAΔSP 바이러스의 일련의 계대 동안 수집된 바이러스 샘플의 RT-PCR 분석. C+, 양성 대조군 pSYF17D-YF17D-RabGERAΔSP; -RT: 역전사효소 없는 RT-PCR 반응; RNA: 바이러스 RNA에 의한 RT-PCR 반응. (패널 A: 계대 1~6; 패널 B: 계대 7~10)
도 9: AG129 마우스에서 YF17D-RabGERAΔSP 바이러스의 면역원성을 시험하기 위한 백신화 일정. B) 광견병에 대한 혈청 중화 항체(SNA)의 역가.
도 10: AG129 마우스에서 (i) PLLAV- YF17D-RabGERAΔSP, (ii) YF17D-RabGERAΔSP 바이러스, (iii) YF17D-CVS-RabG-F14S를 포함하는 BAC 및 (iv) YF17D-CVS-RabG-F14S 바이러스의 생체 내 면역원성을 시험하기 위한 단일 백신화 일정. YFV-17D-NLuc 및 라비푸르(Rabipur)(단일 또는 이중 백신화)는, 각각 YF 백신화 및 광견병 백신화에 대한 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 11: AG129 마우스에서 (i) PLLAV- YF17D-RabGERAΔSP, (ii) YF17D-RabGERAΔSP 바이러스, (iii) YF17D-CVS-RabG-F14S를 갖는 BAC, (iv) YF17D-CVS-RabG-F14S, (v) YFV-17D-Nluc, 및 라이푸르(Raipur)에 의한 (vi) 단일 면역화 및 (vii) 이중 면역화에 의한 IP 백신화의 (A) 7일 후, (B) 14일 후, (C) 21일 후, 및 (D) 28일 후에서의, RABV에 대한 혈청 중화 항체(SNA)의 역가. 라비푸르 2-샷: 데이터는 마우스가 라비푸르에 의해 부스팅된 지 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후에 상응한다.
도 12: A) JE-E와 YF-NS1 사이에 삽입된 RabG의 개략적인 도식(ChimeriVax JE 골격). B) YF17D에 대비된 ChimeriVaxJE-RabG의 플라크 표현형. C). ChimeriVaxJE-RabG 바이러스의 일련의 계대 동안 수집된 바이러스 샘플의 RT-PCR 분석. C+, 양성 대조군 pShuttle-ChimeriVaxJE-RabG; -RT: 역전사효소가 없는 RT-PCR 반응; RNA: 바이러스 RNA에 의한 RT-PCR 반응.
도 13: A) AG129 마우스에서 ChimeriVaxJE-RabG의 면역원성을 시험하기 위한 백신화 일정. B) AG129 마우스에서의 ChimeriVaxJE-RabG에 대한 사망률 및 혈청학적 반응(IP - 복강내).
도 14: A) ZIK-E와 YF-NS1 사이에 삽입된 RabG (ChimeriVaxZIK 골격)의 개략적인 도식. B) YF17D에 대비된 ChimeriVaxZIK-RabG의 플라크 표현형. C). ChimeriVaxZIK-RabG 바이러스의 일련의 계대 동안 수집된 바이러스 샘플의 RT-PCR 분석. C+, 양성 대조군 pShuttle-ChimeriVaxZIK-RabG; -RT: 역전사효소 없는 RT-PCR 반응; RNA: 바이러스 RNA에 의한 RT-PCR 반응.
도 15: A) AG129 마우스에서 ChimeriVaxZIK-RabG의 면역원성을 시험하기 위한 백신화 일정. B) AG129 마우스에서의 ChimeriVaxZIK-RabG에 대한 사망률 및 혈청학적 반응(IP - 복강내).
도 16: 골격 변형의 실시형태.
(A) 플라비바이러스 벡터 골격. 생 백신으로 사용된 전형적인 생-약독화 플라비바이러스의 게놈 구조의 개략적인 도식. 각각의 백신 바이러스는 C 유전자 및 NS1-5 유전자를 포함하는 골격 (1), 및 바이러스 표면 단백질 prME (2)를 암호화한다. 성분 (1) 및 (2)는 바이러스 특이적인 체액성 면역과 세포성 면역을 유발하고; 특히 성분 (2)는 중화 항체(nAb)를 유발한다고 알려져 있다.
YF17D - 황열 백신 균주 17D; JE SA14-14-2 - 일본 뇌염(Japanese encephalitis) 백신 균주 SA14-14-2; ZIKV - 지카(Zika) 바이러스, 또는 백신으로 사용될 이의 생-약독화된 지카 바이러스 변이체.
(B) 플라비바이러스 표면 단백질이 변이된, YF17D 벡터 골격으로부터 발현된 원형 리사바이러스 백신. 광견병에 대한 백신으로 사용될, 원형 리사바이러스 광견병 바이러스에서 유래한 보호 항원으로서, 광견병 바이러스 G 단백질(RabG, 성분 3)을 갖도록 형질전환된 전형적인 생-약독화 플라비바이러스의 게놈 구조의 개략적인 도식. 골격으로서의 YF17D 바이러스의 성분 (1), 및 플라비바이러스 표면 단백질 성분으로서의 (2) YF17D, JE SA14-14-2, 및 ZIKV 유래의 요소를 각각 사용하는 3개의 가능한 변이체가 나타나 있다.
YF17D-RabG - RabG를 발현하는 재조합 YF 17D; CVax-JE-RabG - RabG를 발현하는 키메라 YF17D/JE 백신 균주(예를 들어, 문헌[Arroyo 등 2001 PMID: 11134306]에 개시됨); Cvax-ZIK-RabG - RabG를 발현하는 YF17D/ZIK 백신 균주(예를 들어, 문헌[Kum 등 2018 PMID: 30564463]에 개시됨).
(C) YF17D 벡터 골격으로부터 발현된 항원성 리사바이러스 백신 변이체. 골격으로서의 YF17D 바이러스의 성분 (1), 및 전달유전자(transgene)로서의 항원이 상이한 필로그룹(phylogroup) I (광견병 바이러스), II (라고스(Lagos) 박쥐 바이러스, LBV; 및 모콜라(Mokola) 바이러스, MOKV) 및 III (예이다(Lleida) 박쥐 바이러스, LLEBV)을 각각 나타내는 넓은 범위의 리사바이러스의 G 단백질 서열의 성분 (3)을 사용하는 전형적인 생-약독화 플라비바이러스의 게놈 구조의 개략적인 도식. 각각의 G 단백질은 관련된 리사바이러스, 적어도 동일한 필로그룹에 속하는 바이러스에 대한 면역성을 유도하는 보호 항원으로 고려된다.
YF17D-RabG - RabG를 발현하는 재조합 YF 17D; YF17D-LBV-G - LBV G-단백질을 발현하는 재조합 YF17D; YF17D-MOKV-G - MOKV G-단백질을 발현하는 재조합 YF17D; YF17D-LLEBV- LLEBV G-단백질을 발현하는 재조합 YF17D.
(D) JE SA14-14-2 벡터 골격으로부터 발현된 원형 리사바이러스 백신. 골격으로서의 JE SA14-14-2 바이러스의 성분 (1)과, 전달유전자로서의 성분 (3)을 사용하는 생-약독화 플라비바이러스의 게놈 구조의 개략적인 도식.
본 발명은 황열 바이러스에 대해 예시되어 있지만, 일본 뇌염, 뎅기열(Dengue), 머레이 밸리 뇌염(MVE: Murray Valley Encephalitis), 세인트 루이스 뇌염(SLE: St. Louis Encephalitis), 웨스트 나일(WN: West Nile), 진드기 매개 뇌염(TBE: Tick-borne Encephalitis), 러시아 춘하뇌염(RSSE: Russian Spring-Summer Encephalitis), 쿤진 바이러스(Kunjin virus), 포와산 바이러스(Powassan virus), 카야사나 삼림병 바이러스(Kyasanur Forest Disease virus), 지카 바이러스, 우수타 바이러스(Usutu virus), 웨셀스브론병 바이러스 및 옴스크 출혈열 바이러스(Wesselsbron and Omsk Hemorrhagic Fever virus)와 같지만, 이에 제한되지 않는 플라비바이러스 종의 다른 바이러스 골격을 사용하여 적용될 수도 있다.
본 발명은 블라비바이러스 속뿐만 아니라 또한 페기바이러스(Pegivirus), 헤파시바이러스(Hepacivirus) 및 페스티바이러스(Pestivirus) 속을 포함하는 플라비바이러스과에도 추가로 적용 가능하다.
헤파시바이러스 속은 예를 들어 헤파시바이러스 C(간염 C 바이러스) 및 헤파시바이러스 B(GB 바이러스 B)를 포함한다.
페기바이러스 속은 예를 들어 페기바이러스 A(GB 바이러스 A), 페기바이러스 C(GB 바이러스 C), 및 페기바이러스 B (GB 바이러스 D)를 포함한다.
페스티바이러스 속은 예를 들어 소 바이러스 설사 바이러스(Bovine virus diarrhea virus) 1, 및 전통적인 돼지 열병 바이러스(Classical swine fever virus)(이전에는 돼지 콜레라 바이러스(hog cholera virus))를 포함한다.
골격으로 사용되는 플라비바이러스는, 그 자체로 상이한 플라비바이러스의 일부로 구성된 키메라 바이러스에 의할 수 있다.
예를 들어, C 영역과 NS1-5 영역은 황열 바이러스 유래이고, prME 영역은 일본 뇌염 바이러스 또는 지카 바이러스 유래이다. 이의 예는 표 2 및 도 16에 제시되어 있다.
본 발명은 광견병 리사바이러스(Rabies lyssavirus)의 G 단백질에 대해 예시되어 있지만, 또한 다른 리사바이러스의 G 단백질에도 적용가능하다. 이의 예는, 아라반 리사바이러스 아라반 바이러스(ARAV: Aravan lyssavirus Aravan virus), 호주 박쥐 리사바이러스, 보켈로(Bokeloh) 박쥐 리사바이러스, 두벤하게(Duvenhage) 리사바이러스, 유럽 박쥐 리사바이러스 1, 유럽 박쥐 리사바이러스 2, 이코마(Ikoma) 리사바이러스, 이르쿠트(Irkut) 리사바이러스, 후잔트(Khujand) 리사바이러스, 라고스 박쥐 리사바이러스, 모콜라 리사바이러스, 광견병 리사바이러스, 시모니(Shimoni) 박쥐 리사바이러스 및 웨스트 코카시안(West Caucasian) 박쥐 리사바이러스, 및 이의 가능한 키메라 및 항원성 변이체이다. 많은 이들 종은 박쥐에서 발생한다. 그러나, 박쥐로부터 인간으로의 바이러스 전달은 유의미하게 건강에 위험을 준다.
본 발명의 구축물은 암호화된 삽입체를 ER 내강에 적절히 제시하게 하고, 단백질용해성 가공이 가능하게 한다. Rab G 단백질에서 예시된 바와 같이, 삽입체에 의해 암호화된 단백질은 단지 C 말단 근처에 막투과 도메인만을 포함하여, 그 이후 사이토졸에 위치하는 펩티드가 연결된다. 이러한 구성을 얻기 위해, Rab G의 N 말단 신호 펩티드를 제거한다(또는 비-기능성으로 만든다). 이 원칙에 기초하여, 어떠한 면역원성 단백질도 본 발명의 벡터를 통해 제시될 수 있는데, 상기 단백질은 N 말단의 막 표적화 도메인이 결여되어 있고, C 말단에 막 표적 서열 및 그 이후의 세포질 서열을 포함하여, NS1 단백질 앞에 막투과성 막이 연결되도록 한다.
본 발명은 이제 실시형태에 대해 추가로 기재되는데, 여기에서 플라비바이러스는 골격으로 사용되고, 리사바이러스의 G 단백질은 삽입체로 사용된다.
광견병의 G 단백질은, 문헌[Kuzmina 등 (2013) J antivir antiretrovir . 5:2, 37-43]에 검토되어 있다. 서열 내의 특징들의 번호 부여는 성숙한 단백질에 관한 것인데, 이 앞에는 19개 AA(MVPQALLFVPLLVFPLCFG)[서열번호 18]의 신호 펩티드가 선행한다. 성숙한 단백질 내의 관련 서열 요소는, IIb 에피토프 GCTNLSGFS(AA 34-42)[서열번호 15], 막투과 도메인 VLLSAGALTALMLIIFLMTCC(AA 440-461)[서열번호 19], 및 세포질 도메인 RRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL[서열번호 20](AA 462-505)이다.
상이한 리사바이러스 G 단백질들 간의 높은 서열 동일성으로 인해, 숙련자는 관련된 서열 내에서 광견병 바이러스 G 단백질 내에 존재하는 것들과 상응하는 서열 요소를 식별하는데 아무 문제가 없다.
플라비바이러스는 대략 11,000개 길이의 뉴클레오티드의 양성 단일-가닥 RNA 게놈을 갖는다. 게놈은 5′ 비번역 영역(UTR), 긴 오픈-리딩 프레임(ORF), 및 3′ UTR을 함유한다. ORF는 3개의 구조적 단백질(캡시드[C], 프리멤브레인[prM], 및 외피[E])과 7개의 비구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및 NS5)을 암호화한다. 게놈 RNA와 함께, 구조적 단백질은 바이러스 입자를 형성한다. 비구조적 단백질은 바이러스 다단백질의 가공, 복제, 비리온 조합, 및 숙주 면역 반응의 회피에 참여한다. C 단백질의 C 말단의 신호 펩티드(C-신호 펩티드; 또한 C-앵커 도메인이라고도 불림)는, (세포질의 바이러스 NS2B/NS3 프로테아제에 의해) 신호 펩티드 서열의 N 말단과 (소포체[ER] 내강의 숙주 시그날라제(signalase)에 의해) C 말단에서, 순차적인 절단의 조정을 통해 플라비바이러스 패키징(packaging)을 조절한다.
양성-센스 단일-가닥 게놈은 번역과 함께, 그리고 번역 후에 바이러스 및 숙주 단백질에 의해, 3개의 구조적 단백질[캡시드(C), 프리멤브레인(prM), 외피(E)]과, 7개의 비-구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)로 절단되는 단일 다단백질로 번역된다. 구조적 단백질은 비리온의 (구형) 구조를 형성하고, 비리온 부착, 내재화 및 세포로의 바이러스 RNA의 방출을 시작하고, 이로 인해 바이러스 생애 주기를 시작하는데 관여한다. 다른 한편으로, 비-구조적 단백질은 감염된 세포 내에서의 바이러스 복제, 조작 및 면역 반응의 회피, 및 모기로의 바이러스 전파에 관여한다. 구조적 단백질과 비-구조적 단백질 사이의 분자-내 및 분자-간 상호작용은, 바이러스 감염과 발병에 핵심 역할을 한다.
E 단백질은 이의 C 말단에 2개의 막투과 서열을 갖는데, 예를 들어 도 6에서 TM1 및 TM2으로 나타난다.
NS1은 E의 최종 24개의 아미노산에 상응하는 신호 서열을 통해 ER의 내강으로 이동하고, ER에 체류하는 숙주의 신호 펩티다제에 의해 절단됨으로써, 이의 아미노 말단에서 E로부터 방출된다(문헌[Nowak 등 (1989) Virology 169, 365-376]). NS1은 이의 C 말단에 프로테아제에 대한 인식 부위를 함유하는 8-9개의 아미노산 신호 서열을 포함한다(문헌[Muller & Young (2013) Antiviral Res. 98, 192-208]).
본 발명의 구축물은 키메라 바이러스이며, 여기에서 리사바이러스 G 단백질은 E 단백질과 NS1 단백질 사이의 경계에 삽입된다. 그러나, 추가적인 서열 요소는 G 단백질 삽입체의 N 말단 및 C 말단에 제공된다.
본 발명은 감염성 생-약독화 플라비바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로, 여기에서 리사바이러스 G 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 플라비바이러스의 E 유전자와 NS1 유전자 사이의 유전자간 영역에 삽입되어, 키메라 바이러스가 발현되며, 상기 플라비바이러스의 E 단백질의 C 말단이자 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질의 N 말단의 암호화 서열은 다음의 순서대로:
- 신호 펩티다제에 의해 E 단백질로부터 G 단백질의 단백질용해성 가공을 허용하는 서열 요소,
- 결함이 있는 기능성 신호 펩티드를 포함하거나 또는 기능성 신호 펩티드가 결여되어 있고, IIb 에피토프를 포함하고, C 말단 TM 막을 포함하고, C 말단 세포질 서열을 포함하는, 리사바이러스 G 단백질, 및
- 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
아미노 말단에서 플라비바이러스 E 단백질로부터 리사바이러스 G 단백질의 단백질용해성 가공을 허용하고, 이의 C 말단에서 플라비바이러스 NS1 단백질로부터 리사바이러스 G 단백질의 단백질용해성 가공을 허용하기 위하여, 신호 펩티다제에 대한 기질인 서열 요소가 제공된다. 이들은 길이 및 서열이 달라질 수 있고, 상기 인용된 문헌[Jang 등]에 나타난 바와 같이 아미노산 1개만큼 짧을 수도 있다. 신호 프로테아제에 적합한 인식 부위에 대한 논의는 문헌[Nielsen 등 (1997) Protein Eng. 10, 1-6]에서 나와 있다.
전형적으로, G 단백질의 C 말단에, NS1 단백질의 N 말단의 신호 펩티드 (또는 단백질용해성 가공을 허용하는 절편)가 사용될 것이다.
전형적으로, G 단백질의 N 말단에, 플라비바이러스 골격의 NS1 단백질의 동일한 신호 펩티드 (또는 절편)이 도입된다.
본 발명은 동등하게, 감염성 생-약독화 플라비바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본원에서, 리사바이러스 G 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 상기 플라비바이러스의 E 유전자와 NS1 유전자 사이의 유전자간 영역에 삽입되었다. 추가적인 서열들은 키메라 바이러스가 발현될 때, E 단백질의 C 말단으로부터 NS1 단백질의 신호 펩티드의 N 말단까지의 암호화 서열이 다음의 순서대로:
E 단백질의 C 말단이자 NS1 단백질의 N 말단의, 플라비바이러스 NS1 유전자의 추가적인 신호 펩티드 (또는 이의 절단성 절편).
결함이 있는 기능성 신호 펩티드를 포함하거나 기능성 신호 펩티드가 결여되어 있고, IIb 에피토프를 포함하고, C 말단 TM 막과 C 말단 세포질 서열을 포함하는, 리사바이러스 G 단백질을 포함하도록 제공된다. 이 G 단백질은 NS1 신호 펩티드의 C 말단에 위치한다. G 단백질의 C 말단은, 플라비바이러스의 플라비바이러스 TM2 막투과 도메인의 서열이다. 이 TM2 서열의 C 말단 이후에는, 이의 천연 신호 펩티드 서열을 포함하는 NS1 단백질이 뒤따른다.
따라서, 상기 G 단백질과 상기 TM2 도메인은 N 말단과 C 말단에 NS1 서열이 측접하게 된다. 실시예에 개시된 실시형태에서, 양쪽 NS1의 단백질 서열과 DNA 서열은 동일하다.
전형적인 실시형태에서, 양쪽 NS1 신호 서열은 서열 DQGCAINFG[서열번호 6]을 포함한다.
본 발명의 구축물은 이 반복 서열의 존재 때문에 재조합을 나타내지 않는다. 암호화된 펩티드가 이들 NS1의 N 말단 신호 서열을 가공하는 프로테아제로부터 표적을 유지하는 이상, 서열 변형이 도입될 수 있거나, 동일한 서열의 존재를 회피하기 위해 상이한 플라비바이러스 유래의 NS1 서열이 사용될 수 있다.
전형적인 실시형태에서, 본 실시예에 개시된 바와 같이, G 단백질은 광견병 바이러스, 바람직하게는 광견병 바이러스의 ERA 균주의 것이다.
포유류 숙주에서 바이러스의 생산을 촉진하기 위해, G 단백질의 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
본 발명의 구축물 내의 G 단백질은, IIb 에피토프가 존재할 때, 면역원성을 제공한다. 광견병 바이러스의 IIb 에피토프는, 전형적으로 서열 GCTNLSGFS[서열번호 15]을 갖는다.
나아가, 바이러스의 가공 동안 광견병 G 단백질의 원하는 토폴로지를 얻기 위해, G 단백질의 막투과 서열뿐만 아니라 C 말단 세포질 서열의 존재도 필요하다. TM 도메인의 서열과 G 단백질의 세포질 서열은, 전형적으로 각각 아미노산 440-461개 및 아미노산 462-505개의 광견병 G 단백질의 서열이다.
G 단백질과 C 말단 꼬리의 경미한 서열 변형은, 이들 서열 요소의 기능 상실 없이 도입될 수 있다고 제안되었다. 예를 들어, 소수성 측쇄가 막투과 도메인, 또는 세포질 도메인의 N 말단과 C 말단에 막투과 도메인이 적절히 국재화되기에 충분한 길이를 갖는 세포질 도메인의 절단된 버전에 보존된 아미노산 치환.
G 단백질의 기능성 신호 펩티드의 존재는 선택 압력을 발생시킴으로써, 이의 신호 펩티드를 포함하는 G 단백질의 일부가 결실되거나 돌연변이화되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 구축물은 전형적으로 이 서열의 부분적인 또는 완전한 제거를 통해, 또는 신호 단백질을 비-기능성으로 만드는 돌연변이(예컨대, 신호 펩티드 MVPQALLFVPLLVFPLCFG[서열번호 18] 내의 Rab G F14S 돌연변이)의 도입에 의해, 결함이 있는 G 단백질 신호를 함유한다.
G 단백질의 C 말단이자 NS1의 N 말단에 위치하는 TM 도메인은, 플라비바이러스, 전형적으로 E 단백질, 더욱 전형적으로는 E 단백질의 TM2 도메인이다. 바람직한 실시형태에서, E 단백질의 이러한 TM2 도메인은 골격을 형성하는 바이러스와는 상이한 플라비바이러스 유래이다. 본 발명의 예는 웨스트 나일 바이러스의 E 단백질의 TM2 도메인을 기재한다. 이 도메인은 서열 RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA[서열번호 13]을 갖는다.
이하의 실시예 섹션과 개략적인 도식에서, 모든 서열 요소는 어떠한 개재 서열 요소도 없이 연속 서열을 형성한다. 단백질의 ER 내강 또는 사이토졸에서의 국재화가 방해받지 않고, 단백질용해성 가공이 유지되는 한, 이러한 서열 요소들 사이에 추가적인 아미노산이 존재할 수도 있다고 제안된다.
상기 기재된 뉴클레오티드 서열은 바이러스 그 자체의 것일 수 있거나, 벡터 내의 서열을 지칭할 수 있다. 플라비바이러스와 키메라 버전을 클로닝하는데 적합한 벡터는, 이하에서 더욱 상세히 기재된 바와 같이, 박테리아 인공 염색체이다.
본 발명의 방법 및 화합물은 의학적 응용을 갖고, 이로 이해 바이러스 또는 바이러스를 암호화하는 벡터를 사용하여, 플라비바이러스에서 클로닝된 G 단백질을 함유하는 리사바이러스에 대해 백신화할 수 있다. 추가로, 플라비바이러스 유래의 단백질은 동등하게 보호를 제공하여, 본 발명의 화합물은 단일 바이러스 또는 DNA 백신을 사용하는 플라비바이러스 및 리사바이러스에 대한 백산화를 위해 사용될 수 있다.
박테리아 인공 염색체의 사용, 특히 국제공개 WO 2014174078호에 본 발명자들이 기재한 바와 같은 유도성 BACS의 사용은, RNA 바이러스의 cDNA, 예컨대 본 발명의 키메라 구축물의 고수율, 고품질의 증폭에 특히 적합하다:
이러한 간행물 BAC에 기재된 BAC는:
- 상기 BAC를 박테리아 세포당 10개 카피수 초과로 증폭시키기 위한 유도성 박테리아 ori 서열, 및
- RNA 바이러스 게놈의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서의 상기 바이러스 cDNA의 전사 및 전사된 RNA의 감염성 RNA 바이러스로의 가공을 위한 시스-조절 요소를 포함하는, 바이러스 발현 카세트를 포함한다.
본 발명에서의 경우와 같이, RNA 바이러스 게놈은 RNA 바이러스 게놈 및 광견병 G 단백질의 키메라 바이러스 cDNA 구축물이다.
이들 BAC에서, 상기 바이러스 발현 카세트는 양성-가닥 RNA 바이러스 게놈의 cDNA, 및 전형적으로 이하의:
- 상기 cDNA의 전사를 개시하기 위한, 상기 cDNA의 5' 말단 앞에 선행하는 RNA 폴리머라제 구동 프로모터, 및
- 상기 바이러스 cDNA의 RNA 전사체를 설정된 위치에서 절단하기 위한, 상기 cDNA의 3 말단 이후의 RNA 자가-절단 요소를 포함한다.
BAC는 효모에서 상기 박테리아 인공 염색체를 효모로 운반(shuttling)하고, 이를 유지하기 위한 효모 자율 복제 서열을 추가로 포함할 수 있다. 효모 ori 서열의 예는, 2μ 플라스미드 기원 또는 ARS1(자율 복제 서열 1) 또는 이의 기능적으로 동일한 유도체이다.
본 발명의 제1 양태의 RNA 폴리머라제 구동 프로모터는, RNA 폴리머라제 II 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스 극초기(CMV-IE) 프로모터, 또는 시미안(Simian) 바이러스 40 프로모터, 또는 이들의 기능적으로 동일한 유도체일 수 있다.
RNA 폴리머라제 구동 프로모터는, 동등하게 RNA 폴리머라제 I 또는 III 프로모터일 수 있다.
BAC는 또한 RNA 자가-절단을 위한 요소, 예컨대 간염 델타 바이러스의 게놈 리보자임, 또는 기능적으로 동일한 RNA 요소의 cDNA도 포함할 수 있다.
DNA의 백신 제제로의 제제화는 당업계에 잘 알려져 있는데, 예를 들어 문헌["DNA Vaccines" Methods in Molecular Medicine Vol 127, (2006) Springer Saltzman, Shen 및 Brandsma (Eds.) Humana Press. Totoma, N.J.의 챕터 6 내지 10], 및 문헌[백신(6판)(2013)(Plotkin 등 Eds.)의 챕터 61 Alternative vaccine delivery methods, P 1200-1231]에 기재되어 있다. DNA 백신의 제조에 적합한 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 및 어주번트에 대한 상세는, 또한 이하에 나타난 국제공개 WO 2005042014호에서도 찾아볼 수 있다.
"허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제(Acceptable carrier, diluent or excipient)"는, 인간 및/또는 수의학적 의약에 사용할 때, 특히 면역 치료에 대해 허용가능한 추가적인 물질을 지칭한다.
예로서, 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제는 전신 또는 국소 투여에 안전하게 사용될 수 있는 고체 또는 액체의 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질일 수 있다. 특정 투여 경로에 따라서, 당업계에 잘 알려진 다양한 담체들이 사용될 수 있다. 이들 담체는 당, 전분, 셀룰로스 및 이의 유도체, 맥아, 젤라틴, 탈크, 황산칼슘 및 탄산염, 식물성 오일, 합성 오일, 폴리올, 알긴산, 인산 완충 용액, 유화제, 등장성 식염수 및 염, 예컨대 하이드로클로라이드, 브로마이드 및 설페이트를 포함하는 미네랄산 염, 유기산, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트 및 말로네이트 및 발열원-불포함수를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제를 설명하기 위해 유용한 참고 문헌은, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(미국 뉴저지주 소재의 Mack Publishing Co.(1991))]이며, 이는 본원에 인용되어 포함된다.
환자에게 DNA 백신을 제공하기 위한 어떠한 안전한 투여 경로도 이용될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장, 비경구, 설하, 볼, 정맥 내, 관절-내, 근육-내, 피-내, 피하, 흡입, 안구 내, 복강 내, 뇌실 내(intracerebroventricular), 경피 등이 이용될 수 있다. 근육-내 및 피하 주사는 예를 들어, 면역치료성 조성물, 단백질성 백신 및 핵산 백신의 투여에 적합할 수 있다. 또한, 미세입자 충돌(bombardment) 또는 전기영동이 핵산 백신의 전달에 특히 유용할 수 있다는 사실도 고려된다.
제형은 정제, 분산제, 현탁제, 주사, 용액, 시럽, 트로키(troche), 캡슐, 좌제, 에어로졸, 경피 패치 등을 포함한다. 또한, 이들 제형은 이러한 목적으로 특별히 디자인된 조절방출 기기, 또는 이러한 경향으로 추가로 작용하도록 변형된 다른 형태의 임플란트를 주사 또는 이식하는 것을 포함한다. 치료제의 조절된 방출은 예를 들어, 아크릴 수지, 왁스, 고급 지방산 알콜, 폴리락트산 및 폴리글리콜산을 포함하는 소수성 중합체와, 특정 셀룰로스 유도체, 예컨대 히드록시프로필메틸 셀룰로스에 의해 상기 치료제를 코팅함으로써 영향을 받을 수 있다. 추가로, 조절된 방출은 다른 중합체 기질, 리포좀 및/또는 미세구체를 사용함으로써 영향을 받을 수 있다.
경구 또는 비경구 투여에 적합한 DNA 백신은, 개별 단위, 예컨대 캡슐, 샤세 또는 정제로서 제공될 수 있으며, 이들 각각은 분말 또는 과립으로서, 또는 수성 액체, 비-수성 액체, 수-중-유 에멀전 또는 유-중-수 액체 에멀전 내의 용액 또는 현탁제로서 사전-결정된 양의 플라스미드 DNA를 함유된다. 이러한 조성물은 임의의 약제 방법에 의해 제조될 수 있으나, 모든 방법들은 상기 기재된 하나 이상의 제제를 하나 이상의 필요한 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 DNA 플라스미드를 액체 담체 또는 미세 분할된 고체 담체 또는 상기 둘 다와 균일하고 충실하게 혼합시킨 후, 필요하다면 상기 생성물을 원하는 제공 형태(presentation)로 성형함으로써 제조된다.
상기 조성물은 투여 제제와 상용가능한 방식으로, 유효한 양으로 투여될 수 있다. 환자에게 투여된 용량은, 환자에서 적절한 시기 동안 유익한 반응에 효과를 주기에 충분해야 한다. 투여될 제제(들)의 양은 투여될 대상에 따라 달라질 수 있으며, 이의 나이, 성별, 체중 및 전체적인 건강 상태, 의사의 판단에 따라 달라질 요인에 따라서도 달라질 수 있다.
나아가, DNA 백신은 참고문헌으로 제공된 문헌[Darji 등 (2000) FEMS Immunol Med Microbiol 27, 341-349] 및 문헌[Cicin-Sain 등 (2003) J Virol 77, 8249-8255]에 의해 예시된 바와 같이, 상기 DNA 플라스미드로 형질전환된 살모넬라의 생-약독화 균주의 사용에서처럼, 박테리아 형질도입(transduction)에 의해 전달될 수 있다.
전형적으로, DNA 백신은 인간의 예방적 또는 치료적 면역화에 사용되나, 특정 바이러스에 대하여서는 사육 동물, 예컨대 가축 및 반려 동물을 포함하는 척추 동물(전형적으로 포유류, 조류 및 어류)에도 또한 적용될 수 있다. 바이러스의 살아있는 저장소(동물원성감염증(zoonosis))인 동물, 예컨대 원숭이, 개, 마우스, 래트, 조류 및 박쥐의 백신화도 구상 중에 있다.
특정 실시형태에서, 백신은 어주번트, 즉 백신 조성물의 면역원성 및/또는 효능을 강화시키는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있으나, 생 백신(life vaccine)은 결국 바이러스 복제와는 독립적으로 선천성 면역 반응을 자극할 수 있는 어주번트에 의해 해를 입을 수 있다. 적합한 어주번트의 비-제한적인 예는, 스쿠알란 및 스쿠알렌 (또는 동물 기원의 다른 오일); 블록 공중합체; 계면활성제, 예컨대 Tween-80; Quill A, 미네랄 오일, 예컨대 Drakeol 또는 Marcol, 식물성 오일, 예컨대 땅콩유; 코리네박테리움(Corynebacterium)-유래 어주번트, 예컨대 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum); 프로피오니박테리움(Propionibacterium)-유래 어주번트, 예컨대 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acne); 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)[결핵 백신(Bacille Calmette 및 Guerin), 또는 BCG]; 인터루킨, 예컨대 인터루킨 2 및 인터루킨 12; 모노카인, 예컨대 인터루킨 1; 종양괴사인자; 인터페론, 예컨대 감마 인터페론; 조합제, 예컨대 사포닌(saponin)-수산화알루미늄 또는 Quil-A 수산화알루미늄; 리포좀; ISCOMt) 및 ISCOMATRIX (B) 어주번트; 마이코박테리아 세포벽 추출물; 합성 글리코펩티드 예컨대 무라밀 디펩티드 또는 다른 유도체; 아브리딘(Avridine); 지질 A 유도체; 덱스트란 설페이트; DEAE-덱스트란 또는 인산알루미늄을 포함하는 DEAE-덱스트란; 카르복시폴리메틸렌, 예컨대 Carbopol'EMA; 아크릴 공중합체 에멀전, 예컨대 Neocryl A640; 백시니아 또는 동물 폭스바이러스 단백질; 서브-바이러스 입자 어주번트, 예컨대 콜레라 독소, 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
실시예
실시예 1. E/NS1에서의 Rab G의 삽입
1.1. PLLAV-YFV17D-RabG-ERA
YF-E/NS1 유전자 사이의 유전자간 영역에 삽입된 전장의 RabG (ERA 균주)를 갖는 제1 구축물은, 이하와 같이 클로닝하였다: NS1의 처음 9개의 아미노산 (27개 뉴클레오티드)을 RabG 신호 펩티드(SP) 앞에 첨가하여, E와 NS1의 사이에 신호 펩티다제 절단 부위를 재생성하고, RabG 단백질의 방출을 허용하고, RabG의 C 말단을 보존하여, WNV-E의 제2 막투과 도메인에 융합하였다(도 1a).
일련의 계대 및 플라크-정제된 YFV17D-RabG-ERA(E/NS1) 바이러스의 서열 분석으로, ERA-RabG 암호화 서열의 시작점에 246 bp의 결실(82개의 aa)이 있다는 사실이 밝혀졌는데, 이는 구축물이 안정하지 않다는 것을 나타낸다. 이 결실은 RabG의 신호 펩티드(SP)의 첫 아미노산에서 시작되고, 에피토프 II의 일부, 뿐만 아니라 단백질 폴딩에 필요한 다이설파이드 브리지의 일부의 손실과도 관계된다. 그러나, 이러한 생-약독화 YFV-ERA-RabG(E/NS1) 바이러스는 마우스에서 RABV에 대한 중화 항체를 유도할 수 있었으며, 상기 마우스는 YF 및 광견병 둘 다로 혈청전환되었다(도 1c). 이러한 Δ82-ERA-RabG 단백질은 면역원성을 갖는 것으로 보이므로, 플라크-정제된 바이러스 유래의 cDNA는 유도성 ori를 갖는 상기 기재된 BAC 벡터(PLLAV-YFV17D)에 클로닝하였다. 상이한 돌연변이를 갖는 4개의 변이체(도 2에서, 각각 pSYF17D-Δ82-ERA-RabG-ENS1 #1, #2, #9 및 #12)를, 13개의 E. coli 클론의 서열 분석 이후 탐지하였다. 이러한 새로운 pSYF17D-Δ82-ERA-RabG(E/NS1) 구축물들을, 각각 BHK21J 세포에 형질감염시켰다. 이들 모두는 전형적인 바이러스-유도된 세포병원성 효과(CPE)를 일관되게 유도하는 것으로 나타났다. 마찬가지로, 형질감염된 세포로부터 수집한 바이러스 상청액은, 특징적인 바이러스 용해 플라크를 형성할 수 있는 감염성 입자를 함유하였다(도 2). 또한 cDNA를 생성하는데에도 사용되었던 플라크-정제된 바이러스를 AG129 마우스에 접종하였고, YF에 대한 혈청전환이 있기는 했지만, 광견병 바이러스에 대한 중화 항체는 탐지되지 않았다(도 3). 따라서, 이들 구축물의 추가적인 시험관 내 및/또는 생체 내 특성화는 수행하지 않았다.
1.2. PLLAV - YFV17D - RabG - CVS
ERA-RabG 단백질은 현저한 어팝토시스를 유발한다고 나타났었다(문헌[Pr
Figure pct00001
haud 등 (2003) J Virol . 77, 10537-10547]). 비-어팝토시스 광견병에 걸린 바이러스 균주(rabies challenge virus strain) 유래의 코돈 최적화된 전장 RabG는, ERA 균주에 대해 기재한 것와 동일한 구성으로, E/NS1 사이에 (CVS) 삽입하였다(도 4a).
이 구축물을 BHK-21J에 형질전환하였고, 바이러스-유도된 CPE를 관찰하였다. 조직 유래의 바이러스 상청액은 CPE 및 플라크를 유발할 수 있었다(도 4b). 이 구축물로부터 유래된 3종의 플라크 정제된 바이러스의 추가적인 특성화에서, 이 경우에 RabG 서열에서는 결실이 없었으나, RabG 단백질의 신호 펩티드의 단일 점 뉴클레오티드 돌연변이가 탐지된 것으로 밝혀졌다. 이러한 돌연변이는 아미노산 페닐알라닌을 세린으로 변화시켰다(F14S). 구축물 및 플라크 정제된 바이러스로 형질감염시킨 후 수집한 조직 배양된 바이러스 상청액을, AG129 마우스에 접종하여, 면역원성을 결정하였다. 모든 마우스들은 RABV 및 YFV로 혈청전환되었다(도 5). 따라서, 이러한 CVS-RabG-F14S가 면역원성을 갖는 것으로 나타나므로, 플라크-정제된 바이러스로부터 유래된 cDNA를 pShuttle-YF17D (PLLAV)에 클로닝하였고, 이러한 새로운 구축물을 이전의 구축물에서 상기 설명한 바와 같이 특성화하였는데(CPE 및 플라크 표현형 분석), 이는 생존하고 완전히 복제된-컴피턴트 재조합 형질전환 백신 바이러스를 생성할 수 있는 것으로 나타났다. PLLAV-YFV17D-RabG-CVS-F14S를 플라크 정제된 바이러스 YF17D-CVS-RabG-F14S와 함께 AG129 마우스(n=10)에 주사하였고, 10마리의 동물들 중 4마리, 및 10 마리 중 9마리는 각각 RABV 및 YFV 둘 다로 혈청전환되었다(표 1 및 도 11). 이 결과는 PLLAV YF17D-RabG(E/NS1)의 면역원성을 개선시키기 위해 PLLAV의 더욱 추가적인 최적화가 필요하다는 것을 암시한다.
상기 실시예는 전체 신호 펩티드의 전체 결실에 의하여, 또는 신호 펩티드 내에 돌연변이를 도입함으로써, 천연 Rab G 단백질 신호 펩티드의 비-기능성 변이체를 얻기 위한 압력이 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 새로운 sYF17D-RabG 구축물이 생성되었고, 여기에서 RabG SP 서열은 결실되어 발현된 RabG 단백질의 면역원성을 개선시켰다.
실시예 2. PLLAV YF17D - RabG - ΔSP (E/NS1) 구축물
Rab G의 신호 펩티드는 단백질의 면역원성에 관여한다. RabG 단백질은 YF 다단백질의 전체 토폴로지에 적응하여, 전달유전자를 적절히 발현시키고, YFV 벡터를 복제시킬 필요가 있다(도 6). 전장의 RabG SP의 존재는 YF 다단백질 구조를 혼란시키고, 완전한 항원성에 필요한 RabG의 자연적인 폴딩에 영향을 주는 하나의 추가적인 막투과를 도메인을 바이러스 구축물에 추가한다.
RabGERAΔSP를 보유하는 최적화된 구축물(도 3)를 생성하여, 이전에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 특성화하였다(도 7a). YFV 다단백질과 함께 RabG의 공동-발현을 확인할 수 있었고(도 7b), 이는 RabG의 적절한 폴딩을 나타낸다. 도 1a에 도시되고 실시예 1에 기재된 구축물에 비해, 19개의 N 말단 아미노산을 암호화하는 서열이 결실되었다.
pShuttle-YF17D-RabGERAΔSP 유래 바이러스의 안정성은, RT-PCR을 실시하여, YF17D-RabGERAΔSP 바이러스의 일련의 계대 동안 수집된 바이러스 샘플에서 전달유전자 삽입체를 탐지함으로써 결정하였다(도 8). RT-PCR 산물의 서열 분석으로, 계대 7까지 돌연변이 없이 N-말단 절단된 RabG 삽입체가 탐지될 수 있다는 사실이 나타났다.
BAC 구축물 PLLAV-YF17D-RabGERAΔSP의 면역원성은, 이러한 PLLAV에 의해 세포를 형질감염시킨 후 얻은 재조합 바이러스로 IP 접종한 후, AG129 마우스(n = 5)의 생체 내에서 평가되었다(도 9a). 이러한 N 말단 절단된 RabG 구축물로부터 유래한 바이러스로 백신화된 모든 동물들은, 단일 백신화 이후 YFV 및 RABV 둘 다에 대해 혈청전환되었다. 광견병에 대한 혈청 중화 항체(SNA) 역가는 또한 10 IU/ml 초과인 것으로 발견되었다. 이후, 역가는 각각의 부스터 이후, 추후 증가하였다(도 9b).
YF17D-RabGERAΔSP 바이러스에 의해 얻은 결과를 확인하고, 이의 상응하는 유도성 BAC의 면역원성을 생체 내에서 평가하기 위해, 본 발명자들은 단일 백신화(0일차) 및 이중 백신화(-7일차 및 0일차) 이후, 상업적으로 이용가능한 광견병 바이러스 백신 라비푸르®와 병행하여 새로운 실험을 실시하였다(도 10). 1세대 구축물 YF17D-CVS-RabG-F14S의 면역원성 특성을 고려하여, 본 발명자들은 또한 연구에 PLLAV-YF17D-CVS-RabG-F14S BAC도 포함시켰다(B.1 섹션 참고). YFV-17-NLuc는 YF 백신화에 대한 양성 대조군으로 사용되었다(표-3). 모든 조작은 IP로 수행되었다.
먼저, 혈청학적 분석으로, YFV17D-RabG 바이러스뿐만 아니라 상응하는 BACS도 항-YFV 항체와 항-RABV 항체를 유발할 수 있다는 것을 밝혔다(표 1 및 도 11). BAC 구축물 PLLAV-YF17D-RabGERAΔSP는, 동등하게 효율(백신화 21일 후, BAC 대 바이러스 백신에 대하여 n = 9/10 대 n = 8/9)뿐만 아니라 속도(kinetics)(단지 백신화 7일 후 항체의 유도) 면에서도, 항-YFV 특이적인 항체와 항-RABV 특이적인 항체를 둘 다 유도하기 위한 YF17D-RabGERAΔSP 바이러스 백신에 강력하였다. 예측된 바와 같이, YFV-17D-NLuc 또는 라비푸르로 백신화된 모든 동물들은, 각각 백신화 7-일 후 또는 14-일 후, YFV 또는 RABV로 혈청전환되었다. YFV17D-RabG-CVS-F14S 바이러스 백신은, 또한 동등하게 효율 면에서는 YFV17D-RabGERAΔSP와 유사하나(백신화 21일 후 n = 9/10 동물에서의 YFV 및 RABV에 대한 이중 면역 반응), 속도가 지연된(백신화 14일 이후의 이중 면역 반응) 강력한 면역 반응을 유도하였다. 나아가, PLLAV-YFV17D-RabG-CVS-F14S도 또한 YFV 및 RABV에 대한 이중 면역 반응을 유발하나, 이것은 최적화된 구축물에 비해, 현저히 덜 효율적이고(n = 4/10), 속도가 더 느렸다(백신화 21일 후 시작한다). 라비푸르, YF17D-RabGERAΔSP 및 BAC 구축물 PLLAV-YF17D-RabGERAΔSP에 의한 단일 백신화는, 효율(백신화 7일 후 90% 초과의 동물)뿐만 아니라 규모(백신화 14일 후) 면에서도 유사한 이중 면역 반응을 유발할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, 라비푸르에 의한 단일 백신화는 YF17D-RabGERAΔSP 및 BAC 구축물 PLLAV-YF17D-RabGERAΔSP보다 더 빨랐으나(SNA; 백신화 7일 후 대 14일 후, 각각 10 IU/ml), 모든 동물들은 백신화 이후의 WHO 권고 보호 역가(0.5 IU/ml)보다 유의하게 더 높은 면역 반응을 나타내었다. 라비푸르의 이중 백신화 요법(-07일차 및 0일차)은, 단일 YF17D-RabGERAΔSP 및 BAC 구축물 PLLAV-YF17D-RabGERAΔSP에 의한 백신화에 비해, RABV에 대해 유의하게 더 높은 면역 반응을 나타내었다. 이것은 라비푸르에 대한 더 낮은 비교 면역 반응이 오히려 백신화를 위한 YF17D-RabGERAΔSP 및 PLLAV-YF17D-RabGERAΔSP의 효율적인 용량을 최적화하는 것과 관련되며, 이것은 용량 증량 연구에서 최적화될 수 있다는 것을 나타낸다.
표 1: AG129 마우스에서 2세대 YFV - RabG 구축물에 대한 사망률 및 혈청학적 반응
Figure pct00002
* 라비푸르 ™ 2-샷: 이 마우스들은 라비푸르 ™로 백신화하였고 , 7일 후 동일한 조건에서 부스팅시켰다 . 이런 이유로, 이 동물들에 대하여 7일차 , 14일차 , 21일차 및 28일차는 부스터 7일 후, 14일 후, 21일 후 및 28일 후에 상응한다.
PLLAV-YFV17D-RabGERAΔSP 외에, CVS 균주 유래의 RabG 서열을 갖는 유사한 구축물(ΔSP)이 생성되었다. 나아가, 이는 문헌(상기 인용된 문헌[Bonaldo 등 (2007)]; 문헌[Trindade 등 (2012) Mem Inst Oswaldo Cruz 107, 262-272])에 기재되어 있으며, 여기에서 E YF-단백질과 NS1 YF-단백질 사이에 삽입된 단백질은 YFV, 또는 일반적으로 플라비바이러스에서 발견되는 체류 신호인 이 문헌들에서 기재된 삽입체 말단의 막투과 도메인(문헌[Op De Beeck et al (2004) J Virol . 78, 12591-125602]; 문헌[Op De Beeck 등 (2003) J Virol . 77, 813-820])에 기인하여, ER 내에 유지될 수 있는 것도 가능할 수 있다고 한다. 본 발명자들이 YF TM1과 상이한 신호를 갖는 본 발명자들의 구축물 내에 RabG의 천연 막투과 도메인을 보존하기는 했지만, 본 발명자들은 2A 자가-절단 펩티드가 RabG의 세포질 꼬리의 말단에 첨가되어 ER 체류 신호를 보충하는 2개의 PLLAV(ERA-ΔSP 및 CVS-ΔSP RabG)를 더 클로닝하였다.
예측하지 못하게, (상기 인용된) 문헌[Giel-Moloney 등 2017]에서 암시된 최적의 RabG 발현과는 반대로, 각각 YFV17D-RabGERAΔSP/2A에 대하여 0.8~1.4×104 TCID50/mL, 그리고 YFV17D-RabGERAΔSP에 대해서는 8×105 TCID50/mL의 역가에 의해 예시된 바이러스 적정으로 측정할 때, YFV17D-RabGERAΔSP/2A의 자기 복제능(replication competence)은, BAC의 BHK21J 세포로의 형질감염 이후 바이러스 수율에 대해 2A가 결여된 YFV17D-RabGERAΔSP 바이러스와 비교할 때 더 훨씬 낮았다. 바이러스 수율의 유사한 감소는 pShuttle-YFV17D-RabGcvsΔSP/2A 대 pShuttle-YFV17D-RabGcvsΔSP에 대해서도 나타났다.
그러나, AG129 마우스(n=9)는 광견병 및 YF 둘 다에 대해 혈청전환된 YFV17D-RabGERAΔSP/2A (바이러스)로 백신화시켰다(9마리의 마우스 중 7마리).
실시예 3. ChimeriVax - JE - RabG
상기 세대 PLLAV-YF17D-RabGERAΔSP에서 얻은 지식을 기초로 하여(도 6), 최적화된 G 단백질 서열을 갖는 최적화된 광견병/ChimeriVax-JE PLLAV 백신 구축물(RabGERAΔSP)을 생성하였다. 이 구축물은 RABV, JEV 및 YFV에 대한 특이적인 면역 반응을 유도할 것으로 기대된다.
RabGERAΔSP 서열을 PLLAV ChimeriVax-JE 골격에 도입하여, PLLAV ChimeriVaxJE-RabG 백신 구축물을 생성하였다(도 12a). 이러한 PLLAV ChimeriVax-JE는, 일본 뇌염 LAV 바이러스(JE SA14-14-2)의 prME (표면 당단백질) 암호화 영역을 갖는다. RabGERAΔSP 서열은 JE-E 유전자와 YF17D-NS1 유전자 사이에 삽입되었다.
PLLAV ChimeriVaxJE-RabG를 BHK21J 세포에 형질감염시켰는데, 전형적인 CPE가 관찰되었으며, 뿐만 아니라 이들로부터 수집한 바이러스 상청액은 YFV17D의 플라크 표현형에 비해 현저히 더 작은 플라크를 형성하였다(도 12b). 따라서, 생성된 키메라(JEV/YFV) 형질전환(RabG) 바이러스는 추가로 약독화되었고, 광견병/키메라(JEV/YFV) PLLAV 구축물로부터의 바이러스 수율은 상동의(homologous) 광견병/YFV PLLAV보다 적어도 100-배 더 적었다.
PLLAV ChimeriVaxJE-RabG의 안정성은, ChimeriVaxJE-RabG 바이러스의 일련의 계대 동안 수집한 바이러스 샘플에서 전달유전자 삽입체를 탐지하기 위해, RT-PCR을 실시함으로써 결정하였다(도 12c). RT-PCR 산물의 서열 분석에서는, 돌연변이가 없는 RabG 삽입체가 적어도 계대 4까지는 탐지될 수 있다고 나타났다(추가적인 계대도 분석할 것이다).
PLLAV-ChimeriVaxJE-RabG의 면역원성에 관해서는, 세포에 이러한 PLLAV를 형질감염시킨 후에 얻은 재조합 바이러스를, IP 접종 후의 AG129 마우스 (n=9)에서 생체 내 평가하였다(도 13a). JEV-, YFV- 및 RABV-특이적인 항체 반응은, 간접 면역형광 검정법(IIFA) (Euroimmune YFV 및 JEV) 및/또는 혈청 중화 검정법(SNA)(JEV 및 RABV)에 의해 정량화하였다.
백신화된 마우스를 이환율/사망률에 대해 매일 모니터링하였고, 혈청학적 분석을 위해 기준시 및 2-주 간격으로 혈액 샘플을 채취하였다. 일부 동물들(9마리의 마우스 중 4마리)은 처음 백신화와 동일한 용량 및 경로를 사용하여 ChimeriVaxJE-RabG (바이러스)에 의해 처음 접종 2주 후 부스팅하였다(도 13a). ChimeriVaxJE-RabG에 대한 면역원성 분석에서는, 세포 배양-유래된 바이러스의 IP 투여에 의해 백신화된 9마리의 마우스 중 8마리가, 백신화 14일 후, JEV, YFV 및 RABV에 대해 혈청전환된 것으로 밝혀졌다(도 13b).
게다가, 0.5 IU/ml 초과의 항-RABV 항체를 백신화 7일 후 2마리의 바이러스-백신화 마우스에서 탐지할 수 있었고, 4마리의 동물에서는 이미 0.48 IU/ml의 항체 역가가 동시에 관찰되었다. 특히, WHO 지침에 의하면, 0.5 IU/ml의 최소 혈청 항체 농도가 백신화 이후의 적절한 혈청전환의 측정치로 사용되었다. 나아가, JEV SNA 시험(백신화 42일 후에 수집된 혈청 샘플)에서는, IIFA에 의해 결합 항체가 탐지된 8마리의 이들 마우스 내에서 JEV에 대한 중화 항체의 존재를 확인하였다. 나아가, 백신 안전성에 대해서는, AG129 마우스에 백신 바이러스를 접종한 후, 사망은 관찰되지 않았다.
이들 결과는 심지어 1.2 PFU만큼 낮은 용량에서도 3종의 바이러스: JEV, RABV 및 YFV에 대해 강력한 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낸다.
실시예 4. ChimeriVax - ZIK - RabG
PLLAV ChimeriVaxJE-RabG에 대해 기재한 바와 유사하게, 최적화된 G 단백질 서열(RabGERAΔSP)을 갖는 최적화된 광견병/ChimeriVax-ZIKV PLLAV 백신 구축물을 생성하였다. 이 구축물은 RABV, ZIKV 및 YFV에 대해 특이적인 면역 반응을 유도한다고 기대된다.
이러한 RabGERAΔSP 서열을 PLLAV ChimeriVax-ZIKV 골격에 도입하여, PLLAV ChimeriVaxZIKV-RabG 백신 구축물을 형성한다(도 14a). 이러한 PLLAV ChimeriVax-ZIKV는, 지카 바이러스(아시아 계열, Yap Island 2007, Genbank EU545988)의 prME(표면 당단백질) 암호화 영역을 포함하다. RabGERAΔSP 서열은 ZIKV-E와 YF17D-NS1 유전자 사이에 삽입되었다.
PLLAV ChimeriVaxZIKV-RabG를 BHK21J 세포에 형질전환하였고, 전형적인 CPE가 관찰되었으며, 뿐만 아니라 이들로부터 수집한 바이러스 상청액은 YFV17D의 플라크 표현형에 비해 현저히 더 작은 플라크를 형성하였다(도 14b). 따라서, 생성된 키메라(ZIKV/YFV) 형질전환 (RabG) 바이러스는 추가로 약독화되며, 광견병/ZIKV PLLAV 구축물로부터의 바이러스 수율은, 상동의 광견병/YFV PLLAV의 경우보다 적어도 100-배 더 적다.
PLLAV ChimeriVaxZIKV-RabG의 안정성은, ChimeriVaxJE-RabG 바이러스의 일련의 계대 동안 수집한 바이러스 샘플 내에서 전달유전자 삽입체를 탐지하기 위해 RT-PCR를 실시함으로써 결정하였다(도 14c). RT-PCR 산물의 서열 분석은, 계대 2까지 돌연변이가 없는 RabG 삽입체가 탐지될 수 있다는 것을 나타난다.
이러한 PLLAV에 의해 세포를 형질전환한 후 얻은 구축물 PLLAV-ChimeriVaxZIKV-RabG 및 재조합 바이러스의 면역원성을, IP 접종 후 AG129 마우스(n = 5)에서 생체 내 평가하였다(도 15a). ZIKV-, YFV- 및 RABV-특이적인 항체 반응을, 간접 면역형광 검정법(IIFA)(Euroimmune YFV 및 ZIKV) 및/또는 혈청 중화 검정법(SNA)(ZIKV 및 RABV)에 의해 정량화하였다.
백신화된 마우스를 이환율/사망률에 대해 매일 모니터링하고, 혈청학적 분석을 위해 기준시 및 2-주 간격으로 혈액 샘플을 채취하였다.
ChimeriVaxZIKV-RabG에 대한 면역원성 분석에서, 세포 배양-유래 바이러스에 의해 (i.p.) 백신화된 모든 마우스들이 백신화 17일 후에 ZIKV, YFV 및 RABV에 대해 혈청전환되었다고 나타났다(도 15b). 백신화 28일 후에 실시된 ZIKV SNA(데이터는 나타나 있지 않음)는, 결합 항체(IIFA)에 대해 양성인 세포 배양-유래 바이러스로 백신화된 5마리의 마우스 중 4마리에서, ZIKV에 대한 중화 항체의 존재를 확인하였다.
나아가, 백신 안전성에 관해서는, 백신 바이러스를 AG129 마우스에 접종한 후, 사망이 관찰되지 않았다.
결론적으로, ChimeriVaxZIKV-RabG는 YF17D-RabG에 비해 상당히 약독화되었음에도 불구하고, ZIKV, YFV 및 RABV 바이러스에 대해 강력한 면역 반응을 유도한다.
실시예 5. 키메라 플라비바이러스 골격을 갖는 구축물.
리사바이러스 G 단백질을 포함하는 상이한 구축물들이 생성되었고, 여기에서 플라비바이러스의 골격은 그 자체로 2개의 상이한 플라비바이러스의 카이머(chimer)이다. 도 16은 예시적인 구축물의 개요를 나타내는데, 여기에서 골격은 황열 바이러스, 지카 바이러스 또는 일본 뇌염 바이러스의 일부를 포함할 수 있다.
이로 인해 리사바이러스와 하나 초과의 플라비바이러스에 대한 보호를 제공하는 백신의 생산이 가능해진다. 이것은 표 2에 나타나있는데, 백신의 일부가 체액성 면역, 세포 매개 면역 및 중화 항체를 제공한다는 것을 나타낸다.
표 2. 키메라 골격을 갖는 구축물의 면역 반응
Figure pct00003
[RabG - 광견병 바이러스 G 단백질; CMI - 세포 매개 면역; nAb - 중화 항체; prME - 플라비바이러스 표면 당단백질; YFV - 황열 바이러스]
본 출원에 기술된 서열의 개요
서열번호 1
서열번호 2
Figure pct00004
서열번호 3
YF-E 단백질의 C 말단 부분
Figure pct00005
서열번호 4
YFE-TM1
Figure pct00006
서열번호 5
YFE-TM2
Figure pct00007
서열번호 6
NS1 N 말단의 9 AA
Figure pct00008
서열번호 7
Rab G의 N 말단 부분(신호 펩티드 없음)
Figure pct00009
서열번호 8
서열번호 9
Figure pct00010
서열번호 10
광견병 당단백질 G의 C 말단 부분
Figure pct00011
서열번호 11
광견병 당단백질 G의 TM
Figure pct00012
서열번호 12
Rab의 세포질 C 말단
Figure pct00013
서열번호 13
WNV TM-2
Figure pct00014
서열번호 14
YF NS1의 N 말단 부분
Figure pct00015
서열번호 15
광견병 당단백질 G의 IIb 에피토프
Figure pct00016
서열번호 16, 서열번호 17
광견병 바이러스의 당단백질 G
(코돈 최적화된 ERA 균주)
Figure pct00017
Figure pct00018
서열번호 17
Rab G 단백질 서열
Figure pct00019
서열번호 18
광견병 당단백질 G의 AA 1-18
Figure pct00020
서열번호 19
광견병 당단백질 G의 TM 도메인
Figure pct00021
서열번호 20
RABG의 세포질 꼬리
Figure pct00022
서열번호 21
YFV NS1 신호 펩티드 - 광견병 당단백질 G의 접합부
Figure pct00023
서열번호 22
WNV TM2- NS1 신호 서열-YFV의 접합부
Figure pct00024
SEQUENCE LISTING <110> Katholieke Universiteit Leuven <120> chimeric flavivirus lyssavirus vaccines <130> ZL917184GB <150> GB1814563.1 <151> 2018-09-07 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment YFV - Rab G chimeric construct <220> <221> CDS <222> (1)..(441) <400> 1 gga aag ttg ttc act cag acc atg aaa ggc gtg gaa cgc ctg gcc gtc 48 Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val 1 5 10 15 atg gga gac acc gcc tgg gat ttc agc tcc gct gga ggg ttc ttc act 96 Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr 20 25 30 tcg gtt ggg aaa gga att cat acg gtg ttt ggc tct gcc ttt cag ggg 144 Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly 35 40 45 cta ttt ggc ggc ttg aac tgg ata aca aag gtc atc atg ggg gcg gta 192 Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val 50 55 60 ctt ata tgg gtt ggc atc aac aca aga aac atg aca atg tcc atg agc 240 Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser 65 70 75 80 atg atc ttg gta gga gtg atc atg atg ttt ttg tct cta gga gtt ggc 288 Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly 85 90 95 gcc gac cag ggc tgc gcg ata aat ttc ggt aaa ttt cca ata tac aca 336 Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr 100 105 110 att ccc gac aaa ctt gga ccc tgg agt ccg ata gac att cac cat ttg 384 Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu 115 120 125 tct tgc cct aat aac ctt gtg gtt gag gac gag ggg tgt act aac ttg 432 Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu 130 135 140 agt ggg ttc 441 Ser Gly Phe 145 <210> 2 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val 1 5 10 15 Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr 20 25 30 Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly 35 40 45 Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val 50 55 60 Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser 65 70 75 80 Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu Gly Val Gly 85 90 95 Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr 100 105 110 Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu 115 120 125 Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu 130 135 140 Ser Gly Phe 145 <210> 3 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C terminal part of YF-E protein <400> 3 Gly Lys Leu Phe Thr Gln Thr Met Lys Gly Val Glu Arg Leu Ala Val 1 5 10 15 Met Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Ser Ser Ala Gly Gly Phe Phe Thr 20 25 30 Ser Val Gly Lys Gly Ile His Thr Val Phe Gly Ser Ala Phe Gln Gly 35 40 45 Leu Phe Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val 50 55 60 Leu Ile Trp Val Gly Ile Asn Thr Arg Asn Met Thr Met Ser Met Ser 65 70 75 80 Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe Leu Ser Leu 85 90 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFE-TM1 <400> 4 Gly Gly Leu Asn Trp Ile Thr Lys Val Ile Met Gly Ala Val Leu Ile 1 5 10 15 Trp Val Gly Ile Asn Thr 20 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> YFE-TM2 <400> 5 Met Thr Met Ser Met Ser Met Ile Leu Val Gly Val Ile Met Met Phe 1 5 10 15 Leu Ser Leu Gly Val Gly Ala 20 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NS1 N terminal 9 AA <400> 6 Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly 1 5 <210> 7 <211> 41 <212> PRT <213> Rabies virus <400> 7 Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro Trp Ser Pro 1 5 10 15 Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp 20 25 30 Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe 35 40 <210> 8 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment YFV - Rab G chimeric construct <220> <221> CDS <222> (1)..(540) <400> 8 aat caa gtt tct gga gtc gac ctc gga ttg cca aat tgg ggg aag tat 48 Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr 1 5 10 15 gtt ctt ctg tct gcg gga gcg ctc acc gcg ctg atg ttg atc att ttc 96 Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe 20 25 30 ctc atg act tgc tgt aga agg gtg aat aga tcc gaa cct act caa cac 144 Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His 35 40 45 aac ctt cga ggc aca ggt cga gaa gta tcc gtc aca cct caa tct ggc 192 Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly 50 55 60 aag att atc tca agt tgg gag tcc cat aag tca ggt ggt gag acc cgg 240 Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg 65 70 75 80 ctg agg tca att gct atg acg ttt ctt gcg gtt gga gga gtt ttg ctc 288 Leu Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu 85 90 95 ttc ctt tcg gtc aac gtc cat gct gat caa gga tgc gcc atc aac ttt 336 Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe 100 105 110 ggc aag aga gag ctc aag tgc gga gat ggt atc ttc ata ttt aga gac 384 Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp 115 120 125 tct gat gac tgg ctg aac aag tac tca tac tat cca gaa gat cct gtg 432 Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val 130 135 140 aag ctt gca tca ata gtg aaa gcc tct ttt gaa gaa ggg aag tgt ggc 480 Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly 145 150 155 160 cta aat tca gtt gac tcc ctt gag cat gag atg tgg aga agc agg gca 528 Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala 165 170 175 gat gag atc aat 540 Asp Glu Ile Asn 180 <210> 9 <211> 180 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr 1 5 10 15 Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe 20 25 30 Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His 35 40 45 Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly 50 55 60 Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg 65 70 75 80 Leu Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu 85 90 95 Phe Leu Ser Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe 100 105 110 Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp 115 120 125 Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val 130 135 140 Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly 145 150 155 160 Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala 165 170 175 Asp Glu Ile Asn 180 <210> 10 <211> 81 <212> PRT <213> Rabies virus <400> 10 Asn Gln Val Ser Gly Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr 1 5 10 15 Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe 20 25 30 Leu Met Thr Cys Cys Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His 35 40 45 Asn Leu Arg Gly Thr Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly 50 55 60 Lys Ile Ile Ser Ser Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg 65 70 75 80 Leu <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Rabies virus <400> 11 Val Leu Leu Ser Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe 1 5 10 15 Leu Met Thr Cys Cys 20 <210> 12 <211> 44 <212> PRT <213> Rabies virus <400> 12 Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr 1 5 10 15 Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser 20 25 30 Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 35 40 <210> 13 <211> 23 <212> PRT <213> West Nile virus <400> 13 Arg Ser Ile Ala Met Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Ser Val Asn Val His Ala 20 <210> 14 <211> 76 <212> PRT <213> Yellow fever virus <400> 14 Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg Glu Leu Lys Cys Gly 1 5 10 15 Asp Gly Ile Phe Ile Phe Arg Asp Ser Asp Asp Trp Leu Asn Lys Tyr 20 25 30 Ser Tyr Tyr Pro Glu Asp Pro Val Lys Leu Ala Ser Ile Val Lys Ala 35 40 45 Ser Phe Glu Glu Gly Lys Cys Gly Leu Asn Ser Val Asp Ser Leu Glu 50 55 60 His Glu Met Trp Arg Ser Arg Ala Asp Glu Ile Asn 65 70 75 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Rabies virus <400> 15 Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser 1 5 <210> 16 <211> 1572 <212> DNA <213> Rabies virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1572) <400> 16 atg gtc cct caa gcg ctg ctt ttc gtt ccc ctc ctt gtc ttt cca ctt 48 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15 tgt ttt gga aaa ttt cca ata tac aca att ccc gac aaa ctt gga ccc 96 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro 20 25 30 tgg agt ccg ata gac att cac cat ttg tct tgc cct aat aac ctt gtg 144 Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val 35 40 45 gtt gag gac gag ggg tgt act aac ttg agt ggg ttc agt tat atg gaa 192 Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu 50 55 60 ctt aag gtg ggg tat ata ttg gct att aaa atg aac ggg ttc aca tgc 240 Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys 65 70 75 80 aca ggt gtt gtc acg gag gca gag acc tat aca aac ttt gtt ggg tac 288 Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr 85 90 95 gta act act acg ttc aag agg aaa cat ttt cgc ccg act cct gat gct 336 Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala 100 105 110 tgt cgc gcg gcc tat aac tgg aaa atg gcc ggg gac cca cgg tac gag 384 Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 115 120 125 gag agc ctc cac aat cca tat ccc gac tac cgg tgg ctc cgc aca gta 432 Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val 130 135 140 aag acg act aag gaa tct ctg gtt ata ata tcc ccc tca gtc gcc gac 480 Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp 145 150 155 160 ctc gat cca tat gat cgg tca ctt cat agt cgc gta ttt cca tcc ggt 528 Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly 165 170 175 aaa tgt agt ggg gta gcc gtc agt agc acg tac tgt tcc act aat cac 576 Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His 180 185 190 gat tac act att tgg atg ccg gaa aac ccg cgg ctt ggg atg agt tgc 624 Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys 195 200 205 gat att ttc acg aac tct cgg gga aag cgc gca agt aag ggt tct gag 672 Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu 210 215 220 acc tgt ggt ttc gtg gat gaa cga ggt ctc tac aag tca ctc aag ggt 720 Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly 225 230 235 240 gcc tgc aag ctt aag ctt tgt gga gta ctg gga ctc agg ctg atg gac 768 Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp 245 250 255 ggc aca tgg gtg gct atg caa acg tca aat gaa acc aag tgg tgt ccg 816 Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro 260 265 270 cca gat caa ctc gta aat ctt cac gat ttt cgc agt gac gag att gaa 864 Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu 275 280 285 cat ctt gta gtc gaa gaa ctc gtt aga aag agg gaa gaa tgt ctc gac 912 His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp 290 295 300 gca ctc gaa tct atc atg act act aaa tct gtc tca ttt cga cgc ctc 960 Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu 305 310 315 320 agt cac ctg aga aaa ctc gtg cca gga ttc ggc aaa gct tat act atc 1008 Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile 325 330 335 ttc aac aag acg ttg atg gaa gcg gac gct cat tac aaa tca gta aga 1056 Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg 340 345 350 act tgg aat gaa att ctg cca tcc aag ggc tgc ctt cgc gta gga ggg 1104 Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly 355 360 365 cga tgc cat cct cat gta aat ggg gtc ttc ttt aac ggg ata atc ttg 1152 Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu 370 375 380 gga ccc gac ggc aac gta ctt ata cca gag atg cag agt agt ctc ctc 1200 Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu 385 390 395 400 caa cag cac atg gag ttg ttg gaa tcc agc gtg atc cct ctc gtt cac 1248 Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His 405 410 415 ccc ttg gct gat ccg agc act gtg ttc aaa gat gga gac gag gcg gag 1296 Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu 420 425 430 gat ttc gtc gaa gtt cac ctc ccg gat gtc cat aat caa gtt tct gga 1344 Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly 435 440 445 gtc gac ctc gga ttg cca aat tgg ggg aag tat gtt ctt ctg tct gcg 1392 Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala 450 455 460 gga gcg ctc acc gcg ctg atg ttg atc att ttc ctc atg act tgc tgt 1440 Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys 465 470 475 480 aga agg gtg aat aga tcc gaa cct act caa cac aac ctt cga ggc aca 1488 Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr 485 490 495 ggt cga gaa gta tcc gtc aca cct caa tct ggc aag att atc tca agt 1536 Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser 500 505 510 tgg gag tcc cat aag tca ggt ggt gag acc cgg ctg 1572 Trp Glu Ser His Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu 515 520 <210> 17 <211> 524 <212> PRT <213> Rabies virus <400> 17 Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 1 5 10 15 Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro 20 25 30 Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val 35 40 45 Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu 50 55 60 Leu Lys Val Gly Tyr Ile Leu Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys 65 70 75 80 Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr 85 90 95 Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala 100 105 110 Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu 115 120 125 Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr Arg Trp Leu Arg Thr Val 130 135 140 Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp 145 150 155 160 Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Ser Gly 165 170 175 Lys Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His 180 185 190 Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys 195 200 205 Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu 210 215 220 Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly 225 230 235 240 Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp 245 250 255 Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro 260 265 270 Pro Asp Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu 275 280 285 His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Arg Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp 290 295 300 Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu 305 310 315 320 Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile 325 330 335 Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg 340 345 350 Thr Trp Asn Glu Ile Leu Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly 355 360 365 Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu 370 375 380 Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu 385 390 395 400 Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Val His 405 410 415 Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Ala Glu 420 425 430 Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Asn Gln Val Ser Gly 435 440 445 Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser 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Gly Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Phe 1 5 10 15 Pro Ile Tyr <210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Junction WNV TM2- NS1 signal sequence-YFV <400> 22 Val Asn Val His Ala Asp Gln Gly Cys Ala Ile Asn Phe Gly Lys Arg 1 5 10 15 Glu Leu Lys

Claims (30)

  1. 감염성 생-약독화 플라비바이러스의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 여기에서 리사바이러스 G 단백질의 적어도 일부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 플라비바이러스의 E 유전자와 NS1 유전자 사이의 유전자간 영역에 위치하여, 키메라 바이러스가 발현되며, 상기 플라비바이러스의 E 단백질의 C 말단이자 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질의 신호 펩티드의 N 말단의 암호화 서열은, 이하의 순서대로:
    - 플라비바이러스 NS1 단백질의 추가적인 신호 펩티드,
    - 결함이 있는 기능성 신호 펩티드를 포함하거나 기능성 신호 펩티드가 결핍되고, IIb 에피토프를 포함하고, C 말단 TM 막을 포함하고, C 말단 세포질 서열을 포함하는, 리사바이러스 G 단백질, 및
    - 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 감염성 생-약독화 플라비바이러스의 서열은 황열 바이러스, 전형적으로 YF17D 균주인, 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 감염성 생-약독화 플라비바이러스는 키메라 바이러스인, 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리사바이러스는 광견병 바이러스인, 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 광견병 G 단백질은 ERA 균주의 것인, 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 G 단백질의 뉴클레오티드 서열은 포유류 세포에서의 개선된 발현을 위해 코돈 최적화된, 폴리뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NS1 단백질의 신호 펩티드는 서열 DQGCAINFG[서열번호 6]를 포함하거나, 이로써 이루어지는, 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IIb 에피토프는 서열 GCTNLSGFS[서열번호 15]를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인은 웨스트 나일 바이러스 유래인, 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인은 서열 RSIAMTFLAVGGVLLFLSVNVHA[서열번호 13]를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Rab G의 결함이 있는 기능성 신호 펩티드는 F14S 돌연변이를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Rab G는 아미노산 1 내지 19개의 MVPQALLFVPLLVFPLCFG[서열번호 18]의 N 말단 신호 서열이 결여된, 폴리뉴클레오티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 바이러스의 서열은 플라비바이러스 E 유전자, NS1 신호 펩티드 및 Rab G 단백질의 접합부에, 서열 LGVGA DQGCAINFG KFPIY[서열번호 21]를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 바이러스의 서열은 WNV TM2 도메인, NS1 신호 서열 및 YFV의 접합부에, 서열 VNVHA DQGCAINFG KRELK[서열번호 22]를 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  15. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 바이러스의 암호화 서열은 서열번호 2의 서열, 또는 이것과 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  16. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열, 또는 이것과 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 인공 염색체인, 폴리뉴클레오티드.
  18. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서의 용도를 위한, 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, 상기 의약은 백신인, 의약으로서의 용도를 위한 폴리뉴클레오티드.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 리사바이러스에 대한 백신화에 사용하기 위한, 폴리뉴클레오티드 서열.
  21. 감염성, 생-약독화된 키메라 플라비바이러스로서,
    여기에서, 리사바이러스 G 단백질의 적어도 일부는 상기 플라비바이러스의 E 단백질과 NS1 단백질의 사이에 위치하여, 상기 바이러스의 E 단백질의 C 말단이자 NS1 단백질의 신호 펩티드의 N 말단이 이하의 순서대로:
    - 플라비바이러스 NS1 단백질의 추가적인 신호 펩티드,
    - 결함이 있는 기능성 신호 펩티드를 포함하거나 기능성 신호 펩티드가 결여되며, IIb 에피토프를 포함하고, C 말단 TM 막과 C 말단 세포질 서열을 포함하는, 리사바이러스 G 단백질, 및
    - 플라비바이러스 E 단백질의 TM2 도메인을 포함하는, 키메라 플라비바이러스.
  22. 제21항에 있어서, 상기 플라비바이러스는 YFV인, 키메라 플라비바이러스.
  23. 제22항에 있어서, 상기 리사바이러스는 광견병 바이러스인, 키메라 플라비바이러스.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서의 용도를 위한, 키메라 바이러스.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 리사바이러스 감염의 예방에 사용하기 위한, 키메라 바이러스.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드에 의해 암호화되며, 리사바이러스의 예방과 플라비바이러스의 예방에 사용하기 위한, 키메라 바이러스.
  27. 리사바이러스 감염에 대한 백신을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a) BAC를 박테리아 세포당 10개 초과의 카피수로 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열; 및 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 의한 플라비바이러스 리사바이러스 키메라 바이러스의 cDNA를 포함하고, 포유류 세포에서의 상기 바이러스 cDNA의 전사와 전사된 RNA를 감염성 RNA 바이러스로 가공하기 위한 시스-조절 요소를 포함하는 바이러스 발현 카세트;를 포함하는 BAC를 제공하는 단계,
    b) 포유류 세포를 단계 a)의 BAC로 형질감염시키고, 감염된 세포를 계대하는 단계,
    c) 단계 b)의 형질감염된 세포의 복제된 바이러스를 병독성(virulence), 및 항체의 생성 및 리사바이러스 감염에 대한 보호를 유도하는 능력에 대해 입증하는 단계,
    d) 단계 c)에서 입증된 바이러스를 벡터에 클로닝하는 단계, 및
    e) 상기 벡터를 백신 제제로 제제화하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 플라비바이러스는 황열 바이러스인, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 리사바이러스는 광견병 바이러스인, 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 상기 BAC를 박테리아 세포당 10개 초과의 카피수로 증폭하기 위한 유도성 박테리아 ori 서열을 포함하는 BAC인, 방법.
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