KR20210089178A - 샘플 품질 평가 방법 - Google Patents

샘플 품질 평가 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210089178A
KR20210089178A KR1020217015976A KR20217015976A KR20210089178A KR 20210089178 A KR20210089178 A KR 20210089178A KR 1020217015976 A KR1020217015976 A KR 1020217015976A KR 20217015976 A KR20217015976 A KR 20217015976A KR 20210089178 A KR20210089178 A KR 20210089178A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sample
shh
protein
hours
ihh
Prior art date
Application number
KR1020217015976A
Other languages
English (en)
Inventor
도미닉 앤서니 지치
매튜 조엘 웨스타코트
Original Assignee
소마로직, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 소마로직, 인크. filed Critical 소마로직, 인크.
Publication of KR20210089178A publication Critical patent/KR20210089178A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer

Abstract

본 발명은 개선된 품질의 생물학적 샘플들을 얻기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 샘플 수집, 핸들링 및 프로세싱에서의 변동으로 인해 변화되는 생물학적 샘플들에서 마커 또는 단백질을 식별하는 것을 포함한다. 이들은 또한 질병 바이오마커에 대하여 측정된 결과들에 있어서의 변동을 교정함에 유용하다. 또한, 이들은 샘플들의 수집 방법이 미리정해진 프로토콜에 부합하지 않았던 것으로 결정되는 경우 필요에 따라 샘플들 또는 샘플들의 그룹들을 거부할 수 있게 한다. 당업자에게 유용한 다른 이점들이 본원에 기재되어 있다.

Description

샘플 품질 평가 방법
발명의 분야
의료 진단 및 약물 개발 분야에서는 특정 병태나 질병과 관련이 있을 수 있는 변화들을 파악하고 이해하기 위해 개인의 혈액 조성과 기타 생물학적 샘플들 간의 비교가 이루어진다. 예를 들어, 바이오마커는 특정 약물에 반응하는 능력, 암과 같은 질병의 존재를 나타내거나 또는 치료에 대한 반응 또는 장기 기능의 변화와 같은 과정을 모니터링 할 수 있다. 신뢰할 수 있고 완건하게 생성되면 이러한 바이오마커 측정치들을 임상적으로 사용할 수 있다.
바이오마커로서 발견됨에 그리고 더욱 임상적으로 유용해짐에 필요한 이상적인 바이오마커 측정을 위한 핵심 특성들에는 신뢰성 및 완건성이 포함된다.
발명의 배경
혈액은 부상이나 이물질 및 감염원에 반응하기 위한 강력한 세포 및 체액 시스템을 포함한다. 작은 시험감염은 선천 면역 시스템 (보체 시스템 및 대식세포와 같은 세포)를 유도하여 강력한 신호와 효소를 방출하고 혈소판을 활성화하고 혈액 응고를 유발할 수 있다. 이러한 신호들이 신체 내부의 과정들과 관련이 있는 만큼 이들은 관심 대상이 되는데, 왜냐하면 이들이 방어 및 복구 시스템에 직접 관여 할 수 있고 질병의 마커로서 역할 할 수 있기 때문이다. 그러나 이러한 과정의 신호들은 또한 혈액 샘플 준비의 효과에도 반응한다. 단순히 바늘을 통해 혈관에서 혈액을 뽑거나 혈액을 공기에 노출시키는 것으로도 이러한 메커니즘이 의도치 않게 활성화 될 수 있다. 예를 들어, 샘플 처리 단계의 시간, 원심분리 속도 또는 온도를 변경하면 혈청 또는 혈장의 겉보기 조성이 변경 될 수 있고, 그리하여 수집 및 처리 중에 샘플에 부여되는 분석 전 가변성에 의해 생리학적 정보가 가려지게 된다. 단백질 샘플 핸들링시 미묘한 변동들에 대한 단백질 및 이들 과정들의 강한 민감성으로 인하여 수반되는 완건성 부족은 이들을 바이오마커로서 사용하기 어렵게 할 수 있다.
현재 다변량 생물학에 대한 연구 노력은 분석 전 샘플 변동 (종종 “배치 효과 (batch effects)”라고 함)에 강한 관심을 나타내고 있다. 현재 샘플 품질을 결정할 수 있는 정도는 시각적으로 명백한 변화, 가령, 적혈구 용해를 나타내는 적색 그리고 높은 지질 또는 기타 오염물질을 나타내는 탁도(cloudiness)로 대부분 제한된다. 이는 임상의가 가장 어렵고 가장 완건한 단백질 측정값들을 제외한 모든 것을 연구에 포함시킬 수 있다는 믿음에 제한을 가한다. 혈청 및 혈장 준비에서 변동들의 복잡한 그리고 비선형적인 효과들 중 일부를 보고한 연구는 Ostroff, R. 등, (2010) J. Proteomics 73:649-666에 기재되어 있다. 샘플 준비 프로토콜의 변동에 의해 영향을 받는 특정 단백질 세트의 측정값들의 비선형 (로그) 변환에 기반하여 샘플 준비 프로토콜의 준수 여부를 결정하는 구체적인 기술들이 본원에 제시되어 있다. 이러한 방법에서 유래된 지표(metrics)를 사용하여 관심 분석물에서 컴플라이언스를 모니터하고, 샘플을 거부하고, 교정을 실시할 수 있다. 이들 기술들은 바이오마커 연구, 임상 진단 응용, 바이오-뱅크 샘플 품질 모니터링 및 약물 개발에 사용되는 인간 또는 동물 혈액 샘플들의 품질을 평가하는데 유용하다. 소변, 뇌척수액, 가래 또는 조직을 포함한 다른 많은 샘플 유형에 대한 샘플 무결성을 평가하기 위하여 유사한 접근 방식들이 개발될 수 있다.
요약
본원에 기재된 바와 같이, 바이오마커 발견에 그리고 임상적 유용성을 얻는데 필요한 이상적인 바이오마커 측정을 위한 핵심 특성들에는 신뢰성 및 완건성이 포함된다. 바이오 마커의 신뢰성은 바이오마커 신호가 건강 또는 질병의 기본적인 생물작용을 포착하는데 있어 진실함을 의미한다 (즉, “거짓 양성” 마커가 아님). 바이오마커의 완건성은 바이오마커가 질병이 없는 개체들에 비해 질병이 있는 개체들에서 차등적으로 발현됨을 나타낸다. 진실한 질병 바이오마커를 찾을 확률을 높이고 샘플 편향으로 인한 거짓 양성을 식별함에 있어 변화를 줄이려면 샘플 품질과 일관성을 측정하는 방법이 필수적이다.
혈장 샘플에서 단백질 분석물의 측정은 샘플을 수집 및 핸들링하는데 사용되는 프로토콜의 영향을 크게 받을 수 있다. 특정된 샘플 수집 및/또는 핸들링 프로토콜로부터 생기는 편차는 샘플 내 단백질 수준의 변화 또는, 그밖에도 음성 대조군을 포함한 많은 분석물들에 대한 신호 변화를 가져오는, 측정값들에 대한 전반적인 효과를 초래할 수 있다. 이러한 편차는 단백질 분석물을 측정하는데 사용되는 분석 유형에 관계없이 발생할 수 있다.
일련의 임상 샘플들의 품질을 평가하기 위해 프로토콜로부터 가장 명백한 편차들에 대한 효과를 특성화하였다. 샘플 수집과 스핀처리(spinning) 사이의 단백질 조성의 변동성을 시간의 함수로서 분석하였다. 또한, 샘플 스핀처리와 샘플 디캔팅까지의 시간 사이의 단백질 조성의 변동성을 시간의 함수로서 분석하였다.
임상 샘플들의 수집을 평가하기 위한 정량적 분류기준으로 사용될 수 있는, 부주의한 샘플핸들링에 관한 기호들을 확인하였다. 또한 수집 프로토콜로부터의 편차, 특히 샘플 수집과 스핀처리 사이의 지연 및 샘플 스핀처리와 샘플 디캔팅 사이의 지연과 관련하여 해당 분석물의 측정값들의 민감성을 포착하는 각 분석물에 대한 지표들이 생성되었다.
일부 기술들은 샘플 핸들링의 효과에 비교적 영향을 받지 않는다고 생각할 수 있으나, 본 경우는 그렇지 않다. 항체들이 혈장 및 혈청 매트릭스들의 존재하에서 잘 기능한다 하더라도, 질량 분석법은 펩티드 그리고 심지어 변성 단백질 조차도 측정할 수 있으며, 샘플이 채취된 후 샘플 내 세포들이 용해되는 경우, 또는 혈소판이 탈과립화되는 경우, 또는 보체 시스템이 활성화되는 경우, 샘플에서 분석물 농도에 있어서의 극적인 변화가 발생할 것이며, 임의의 “고 충실도” 측정 기술은 이를 검출할 것이다. 그러므로 샘플 핸들링 변동의 영향을 결정하기 위한 본원에 기재된 기술들과 유사한 기술들은 단백질 이외의 바이오마커들 및 다수의 분석 포맷에 유용할 수 있다. 이러한 분석 포맷은 서로 다른 방식들에서 민감할 수 있으나, 샘플 준비 변동 측면에서 동일한 근본적인 원인들에 의해 영향 받을 수 있다.
혈액 핸들링 및 프로세싱에 있어서 서로 다른 단계들의 변동은 생물학적 샘플들에 재현가능한 방식으로 영향을 미치는 것으로 나타날 수 있다. 다양한 샘플 핸들링 및 프로세싱 단계들과 관련된 파라미터들에 대한 각 바이오마커 단백질 측정의 민감성은 SOMAmer® 프로테오믹 어레이 (proteomic array)를 사용하여 정량화되어 왔으며 샘플 핸들링 프로세스들에 있어서 변동에 관한 마커들이 확인되었다. 어떠한 핸들링/프로세싱 마커들이 영향을 받았는지, 그리고 대략 얼마나 많이 영향을 받았는지 결정하기 위해, 샘플 핸들링 및 프로세싱 변동을 질병 바이오마커 측정 및 개발된 방법들에 대한 동일한 다중분석물 측정 분석내에서 정량화하였다. 본 발명의 방법은 또한 바이오마커 발견을 위한 허용가능한 샘플 핸들링 및 프로세싱 품질 지표들에 대한 제한을 설정할 수 있게 하였다.
하기 단락 번호에 본 발명의 또 다른 양상들을 기재한다:
1. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 소닉 헤지호그 (Sonic Hedgehog, SHH) 단백질 수준, 및 PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
2. 청구항 1에 있어서, 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
3. 청구항 1에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 PGAM1, SHH 및 PTPN4, SHH 및 TNFSF14, SHH 및 FAM49B, SHH 및 RBP7, SHH 및 IHH, SHH 및 DDX39B, SHH 및 S100A12, SHH 및 PGAM2, SHH 및 C4A.C4B, SHH 및 IL21R, SHH 및 TMEM9 또는 SHH 및 ADAM9를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 SHH, PGAM1 및 TNFSF14; SHH, PGAM1 및 RBB7; SHH, PGAM1 및 PTPN4; SHH, PGAM1 및 DDX39B; SHH, PGAM1 및 FAM49B; SHH, PGAM1 및 IHH; SHH, PGAM1 및 S100A12; SHH, PGAM1 및 ADAM9; SHH, PTPN4 및 RBP7; SHH, PTPN4 및 TNFSF14; SHH, PTPN4 및 IHH; SHH, RBP7 및 FAM49B; SHH, RBP7 및 IHH; SHH, FAM49B 및 TNFSF14; SHH, DDX39B 및 PTPN4; SHH, TNFSF14 및 S100A12; SHH, IHH 및 RBP7; SHH, IHH 및 TNFSF14; SHH, RBP7 및 TNFSF14; SHH, RBP7 및 S100A12; SHH, RBP7 및 DDX39B; SHH, TNFSF14 및 DDX39B; SHH, S100A12 및 DDX39B; SHH, FAM49B 및 S100A12; SHH, IHH 및 FAM49B; SHH, IHH 및 DDX39B; SHH, TNFSF14 및 ADAM9; SHH FAM49B 및 DDX39B; SHH, IHH 및 ADAM9; SHH, PGAM1 및 C4A.C4B; SHH, PGAM2 및 RBP7; SHH, PGAM1 및 IL21R; SHH, PGAM2 및 PTPN4; SHH, PGAM2 및 ADAM9, SHH, PGAM2 및 C4A.C4B; SHH, PGAM2 및 IL21R; SHH, IHH 및 PGAM2; SHH, PGAM1 및 PGAM2; SHH, TMEM9 및 PGAM2 또는 SHH, TMEM9 및 PGAM1을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 PGAM1, 및 RBP7, TNFSF14, PTPN4, DDX39B, FAM49B, S100A12, IHH, PGAM2, C4A.C4B, IL21R, TMEM9 및 ADAM9에서 선택된 적어도 2개의 단백질들을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 IHH, 및 RBP7, TNFSF14, PTPN4, DDX39B, FAM49B, S100A12, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, IL21R, TMEM9 및 ADAM9에서 선택된 적어도 2개의 단백질들을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
8. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
9. 청구항 8에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
10. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 소닉 헤지호그 (SHH), 및 PGAM1, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, ADAM9, PGAM2, C4A.C4B, IL21R 및 TMEM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
11. 청구항 10에 있어서, 포획 시약들의 세트는 압타머, 항체, 및 압타머와 항체의 조합물에서 선택되는, 방법.
12. 청구항 10에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
13. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 PGAM1, SHH 및 PTPN4, SHH 및 TNFSF14, SHH 및 FAM49B, SHH 및 RBP7, SHH 및 IHH, SHH 및 DDX39B, SHH 및 S100A12, SHH 및 PGAM2, SHH 및 C4A.C4B, SHH 및 IL21R, SHH 및 TMEM9 또는 SHH 및 ADAM9를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
14. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 SHH, PGAM1 및 TNFSF14; SHH, PGAM1 및 RBB7; SHH, PGAM1 및 PTPN4; SHH, PGAM1 및 DDX39B; SHH, PGAM1 및 FAM49B; SHH, PGAM1 및 IHH; SHH, PGAM1 및 S100A12; SHH, PGAM1 및 ADAM9; SHH, PTPN4 및 RBP7; SHH, PTPN4 및 TNFSF14; SHH, PTPN4 및 IHH; SHH, RBP7 및 FAM49B; SHH, RBP7 및 IHH; SHH, FAM49B 및 TNFSF14; SHH, DDX39B 및 PTPN4; SHH, TNFSF14 및 S100A12; SHH, IHH 및 RBP7; SHH, IHH 및 TNFSF14; SHH, RBP7 및 TNFSF14; SHH, RBP7 및 S100A12; SHH, RBP7 및 DDX39B; SHH, TNFSF14 및 DDX39B; SHH, S100A12 및 DDX39B; SHH, FAM49B 및 S100A12; SHH, IHH 및 FAM49B; SHH, IHH 및 DDX39B; SHH, TNFSF14 및 ADAM9; SHH FAM49B 및 DDX39B; SHH, IHH 및 ADAM9; SHH, PGAM1 및 C4A.C4B; SHH, PGAM2 및 RBP7; SHH, PGAM1 및 IL21R; SHH, PGAM2 및 PTPN4; SHH, PGAM2 및 ADAM9, SHH, PGAM2 및 C4A.C4B; SHH, PGAM2 및 IL21R; SHH, IHH 및 PGAM2; SHH, PGAM1 및 PGAM2; SHH, TMEM9 및 PGAM2 또는 SHH, TMEM9 및 PGAM1을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
15. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 PGAM1, 및 RBP7, TNFSF14, PTPN4, DDX39B, FAM49B, S100A12, IHH, 및 ADAM9에서 선택된 적어도 2개의 단백질들을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
16. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 IHH, 및 RBP7, TNFSF14, PTPN4, DDX39B, FAM49B, S100A12, PGAM1, 및 ADAM9에서 선택된 적어도 2개의 단백질들을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
17. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
19. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 대상체의 샘플에서 IHH, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, DDX39B, S100A12, 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
20. 청구항 19에 있어서, 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
21. 청구항 19에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
22. 청구항 19에 있어서, 상기 방법은 IHH, RB7 및 PTPN4; IHH, RB7 및 TNFSF14; IHH, RB7 및 FAM49B; IHH, RBP7 및 DDX39B; IHH, RBP7 및 S100A12; IHH, RB7 및 ADAM9; IHH, TNFSF14 및 PTPN4; IHH, TNFSF14 및 FAM49B; IHH, TNFSF14 및 DDX39B; IHH, TNFSF14 및 S100A12; IHH, TNFSF14 및 ADAM9; IHH, FAM49 및 PTPN4; IHH, FAM49 및 TNFSF14; IHH, FAM49 및 DDX39B; IHH, FAM49 및 S100A12; IHH, ADAM9 및 PTPN4 또는 IHH, FAM49 및 ADAM9를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
23. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, SHH 및/또는 PGAM1을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
24. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
25. 청구항 19에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
26. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 IHH, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, DDX39B, S100A12, 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 단백질을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 사용하여 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
27. 청구항 26에 있어서, 포획 시약들의 세트는 압타머, 항체, 및 압타머와 항체의 조합물에서 선택되는, 방법.
28. 청구항 26에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
29. 청구항 26에 있어서, 상기 방법은 IHH, RB7 및 PTPN4; IHH, RB7 및 TNFSF14; IHH, RB7 및 FAM49B; IHH, RBP7 및 DDX39B; IHH, RBP7 및 S100A12; IHH, RB7 및 ADAM9; IHH, TNFSF14 및 PTPN4; IHH, TNFSF14 및 FAM49B; IHH, TNFSF14 및 DDX39B; IHH, TNFSF14 및 S100A12; IHH, TNFSF14 및 ADAM9; IHH, FAM49 및 PTPN4; IHH, FAM49 및 TNFSF14; IHH, FAM49 및 DDX39B; IHH, FAM49 및 S100A12; 또는 IHH, FAM49 및 ADAM9를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
30. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, SHH 및/또는 PGAM1을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
31. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
32. 청구항 26에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
33. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 DDX39B 및 S100A12에서 선택된 적어도 1개 단백질 및 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 수준을 측정하는 단계; 및
b) 상기 적어도 1개 단백질 및 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
34. 청구항 33에 있어서, 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
35. 청구항 33에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
36. 청구항 33에 있어서, 상기 방법은 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 및 S100A12; 또는 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 및 DDX39B를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
37. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
38. 청구항 33에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
39. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 DDX39B 및 S100A12에서 선택된 적어도 1개 단백질 및 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
40. 청구항 39에 있어서, 포획 시약들의 세트는 압타머, 항체, 및 압타머와 항체의 조합물에서 선택되는, 방법.
41. 청구항 39에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
42. 청구항 39에 있어서, 상기 방법은 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 및 S100A12; 또는 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 및 DDX39B를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
43. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
44. 청구항 39에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
45. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 수준 또는 수준들을 사용하여 샘플에 품질 점수를 할당한 다음, 이러한 품질 점수를 사용하여 샘플이 분석 샘플인지 또는 비-분석 샘플인지를 결정하는, 방법.
46. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 수준 또는 수준들을 사용하여 샘플에 품질 점수를 할당한 다음, 이러한 품질 점수를 사용하여 이 샘플을 샘플 내 또 다른 단백질들의 추가 분석을 위해 사용할지 여부를 결정하는, 방법.
47. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 PGAM1 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
48. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 PGAM2 단백질 수준, 및 SHH, PGAM1, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
49. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 C4A.C4B 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, PGAM1, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
50. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 PTPN4 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PGAM1, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
51. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 TNFSF14 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
52. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 FAM49B 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
53. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 RBP7 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
54. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 IHH 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
55. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 DDX39B 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
56. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 S100A12 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
57. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 IL21R 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, DDX39B, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
58. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 TMEM9 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, IL21R, DDX39B 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
59. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 ADAM9 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, IL21R, TMEM9 및 DDX39B로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
60. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 소닉 헤지호그 (SHH) 단백질, 및 PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
61. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 PGAM1 단백질, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
62. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 PGAM2 단백질, 및 SHH, PGAM1, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
63. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 C4A.C4B 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
64. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 PTPN4 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
65. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 TNFSF14 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
66. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 FAM49B 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
67. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 RBP7 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
68. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 IHH 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
69. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 DDX39B 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
70. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 S100A12 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
71. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 IL21R 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
72. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 TMEM9 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
73. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 ADAM9 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R 및 TMEM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
74. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 소닉 헤지호그 (Sonic Hedgehog, SHH) 단백질 수준, 및 PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
75. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 HNRNDPDL, PTPN4, PGAM2, C4A.C4B, EIF4A1, IHH, SHH, PGAM1, S100A9 및 HLA.DRB3 수준을 측정하는 단계; 및
b) HNRNDPDL, PTPN4, PGAM2, C4A.C4B, EIF4A1, IHH, SHH, PGAM1, S100A9 및 HLA.DRB3 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
76. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
77. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
78. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
79. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
80. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 HNRNDPDL, PTPN4, PGAM2, C4A.C4B, EIF4A1, IHH, SHH, PGAM1, S100A9 및 HLA.DRB3을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
81. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
82. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
83. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
84. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
85. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 2개 포획 시약과 접촉시키는 단계, 이 때 하나의 포획 시약은 TMEM9 단백질에 대한 친화성을 가지고 제 2 포획 시약은 PGAM1 단백질에 대한 친화성을 가지며; 및
b) 상기 2개 포획 시약을 사용하여 각 단백질 수준을 측정하는 단계.
86. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 PGAM1 및 TMEM9 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) PGAM1 및 TMEM9 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
87. 청구항 85 또는 86에 있어서, IHH 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 IHH 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
88. 청구항 85 또는 86에 있어서, C4A.C4B 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 C4A.C4B 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
89. 청구항 85 또는 86에 있어서, SHH 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 SHH 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
90. 청구항 85 또는 86에 있어서, PGAM2 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PGAM2 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
91. 청구항 85 또는 86에 있어서, ADAM9 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 ADAM9 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
92. 청구항 85 또는 86에 있어서, PTPN4 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PTPN4 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
93. 청구항 84 또는 85에 있어서, IL21R 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 IL21R 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
94. 청구항 85 또는 86에 있어서, RBP7 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 RBP7 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
95. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 2개 포획 시약과 접촉시키는 단계, 이 때 하나의 포획 시약은 SHH 단백질에 대한 친화성을 가지고 제 2 포획 시약은 IHH 단백질에 대한 친화성을 가지며; 및
b) 상기 2개 포획 시약을 사용하여 각 단백질 수준을 측정하는 단계.
96. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 SHH 및 IHH 수준을 측정하는 단계; 및
b) SHH 및 IHH 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
97. 청구항 95 또는 96에 있어서, RBP7 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 RBP7 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
98. 청구항 95 또는 96에 있어서, FAM94B 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 FAM94B 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
99. 청구항 95 또는 96에 있어서, TNFSF14 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 TNFSF14 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
100. 청구항 95 또는 96에 있어서, ADAM9 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 ADAM9 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
101. 청구항 95 또는 96에 있어서, S100A12 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 S100A12 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
102. 청구항 95 또는 96에 있어서, DDX39B 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 DDX39B 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
103. 청구항 95 또는 96에 있어서, PGAM1 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
104. 청구항 95 또는 96에 있어서, PTPN4 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PTPN4 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
105. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 4개 포획 시약과 접촉시키는 단계, 이 때 4개 포획 시약 각각은 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4에서 선택된 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 상기 4개 포획 시약을 사용하여 각 단백질 수준을 측정하는 단계.
106. 청구항 105에 있어서, SHH 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 SHH 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
107. 청구항 105에 있어서, PGAM1 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
108. 청구항 105에 있어서, TMEM9, C4A.C4B, PGAM2, FAM49B, TNFSF14, S100A12, DDX39B 및 IL21R에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 포획 시약들을 사용하여 측정하는 것을 추가로 포함하고, 각 포획 시약은 이러한 하나 이상의 단백질 중 하나에 대한 친화성을 가지는, 방법.
109. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) 샘플의 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
110. 청구항 109에 있어서, SHH 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 SHH 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
111. 청구항 109에 있어서, PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 PGAM1 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
112. 청구항 109에 있어서, TMEM9, C4A.C4B, PGAM2, FAM49B, TNFSF14, S100A12, DDX39B 및 IL21R에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 단계 및 이러한 하나 이상의 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
113. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플을 4개 포획 시약과 접촉시키는 단계, 이 때 4개 포획 시약 각각은 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4에서 선택된 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
b) 상기 4개 포획 시약을 사용하여 샘플에서 각 단백질 수준을 측정하는 단계.
114. 청구항 113에 있어서, SHH 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 SHH 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
115. 청구항 113에 있어서, PGAM1 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
116. 청구항 113에 있어서, TMEM9 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 TMEM9 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
117. 청구항 113에 있어서, C4A.C4B, PGAM2, FAM49B, TNFSF14, S100A12, DDX39B 및 IL21R에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 포획 시약들을 사용하여 측정하는 것을 추가로 포함하고, 각 포획 시약은 이러한 하나 이상의 단백질 중 하나에 대한 친화성을 가지는, 방법.
118. 청구항 113에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
119. 청구항 113에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
120. 청구항 113에 있어서, 단백질 수준을 사용하여, 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하며, 이 때 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플인, 방법.
121. 청구항 119에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
122. 청구항 113에 있어서, 포획 시약은 압타머 또는 항체에서 선택되는, 방법.
123. 다음 단계를 포함하는 방법:
a) 인간 대상체의 샘플에서 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
b) 샘플의 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
124. 청구항 123에 있어서, SHH 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 SHH 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
125. 청구항 123에 있어서, PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 PGAM1 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
126. 청구항 123에 있어서, TMEM9 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 TMEM9 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
127. 청구항 123에 있어서, C4A.C4B, PGAM2, FAM49B, TNFSF14, S100A12, DDX39B 및 IL21R에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 단계 및 이러한 하나 이상의 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
128. 청구항 123에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
129. 청구항 123에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
130. 청구항 129에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
131. 청구항 123에 있어서, 단백질 수준의 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
132. 청구항 123에 있어서, 의사결정 트리; 배깅+부스팅+포레스트 (bagging+boosting+forests); 규칙 추론 기반 학습; 파젠 창 (Parzen Windows); 선형 모델; 로지스틱; 신경망 법; 비지도 군집분석 (unsupervised clustering); K-평균; 계층적 오름차순/내림차순 (hierarchical ascending/descending); 반-지도 학습; 프로토타입법; 최근접 이웃; 커널 밀도 추정; 서포트 벡터 머신; 은닉 마르코프 모델; 볼쯔만 학습; 랜덤 포레스트 모델에서 선택된 분류기에서 단백질 수준을 사용하여, 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는, 방법.
도면의 간단한 설명
도 1은 PGAM1 RFU vs. 스핀까지의 시간을 도시하며 스핀까지의 시간에 따른 신호의 완건한 변화를 보여준다.
도 2는 분석물 RFU vs. 스핀까지의 시간을 도시하며 매우 낮은 구별 특성을 보여준다.
도 3은 스핀까지의 시간 모델에서 분석물 중요도를 도시한다. ~10개의 분석물들 이후 추가 분석물들의 상대 중요도는 정상 상태로 감소한다.
도 4는 스핀까지의 시간 모델에서 샘플 의사결정 트리를 도시한다. 첫번째 노드는 TNFSF14 RFU에 대하여 샘플을 분할하는데, 이는 RFU가 756.2 보다 큰 경우 24시간 예측으로 종료하고 그렇지 않은 경우 추가 가지를 트래버스 다운시킨다.
도 5는 랜덤 포레스트에서 예측 에러 대 트리 수를 도시한다.
도 6은 단일 분석물 랜덤 포레스트 모델에서 예측 에러를 도시한다. 가로 및 세로 막대는 클래스 임계값을 나타내고 검은색 실선은 실제 예측선을 나타낸다.
도 7은 랜덤 포레스트 및 나이브 베이즈에서 모델 안정성을 도시한다. 나이브 베이즈 모델은 단일 분석물에서 신호가 이동할 때 지속적인 변화를 보이는 반면 랜덤 포레스트는 더 많은 안정성을 보여준다.
도 8은 개별 분석물을 스케일링 할 때 모델 안정성을 보여준다. 효과 크기에 따라 각 분석물을 스케일링할 때 각 패널 제목에 제공된 실제 스핀까지의 시간을 예측 시간에 대하여 비교한다. 개별 선들은 해당 분석물을 스케일링하고 나머지 9개를 일정하게 두었을 때 랜덤 포레스트의 예측을 나타낸다.
도 9는 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 SHH에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 10은 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 IHH에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 11은 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 RBP7에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 12는 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 FAM49B에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 13은 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 TNFSF14에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 14는 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 ADAM9에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 15는 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 S100A12에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 16은 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 DDX39B에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 17은 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 PGAM1에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 18은 스핀까지의 시간 변화에 따른, 단백질 마커 PTPN4에 대한 18명 개체들의 누적 분석물 분포 함수를 도시한다.
도 19는 분석물 모델의 성능을 도시하는데, 이 때 각 모델의 성능은 각 개체 및 시점에 있어서 실제 스핀까지의 시간에 대한 예측된 스핀까지의 시간에 관한 RMSE를 사용하여 정량화되었다.
도 20은 모델 성능에 대한 각 분석물의 중요도를 명시하기 위하여 모델 성능의 각 그룹에서 분석물이 사용되었던 시간의 비율을 기준으로 저 성능 분석물들을 도시한다.
도 21은 모델 성능에 대한 각 분석물의 중요도를 명시하기 위하여 모델 성능의 각 그룹에서 분석물이 사용되었던 시간의 비율을 기준으로 중간 성능 분석물들을 도시한다.
도 22는 모델 성능에 대한 각 분석물의 중요도를 명시하기 위하여 모델 성능의 각 그룹에서 분석물이 사용되었던 시간의 비율을 기준으로 고 성능 분석물들을 도시한다.
도 23은 특정 수의 분석물에 따른 사용된 모델 수의 분포를 도시한다.
발명의 설명
이제 본 발명의 대표적인 구체예들을 상세하게 살펴볼 것이다. 본 발명은 열거된 구체예들과 관련하여 설명될 것이나, 본 발명을 이러한 구체예들에 제한하고자 하는 것이 아님이 이해될 것이다. 반대로, 본 발명은 모든 대안, 변형 및 균등예들을 포함하고자 하며, 이는 청구범위에 정의된 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
당업자는 본 명세서에서 설명된 것들에 유사한 또는 대등한 많은 방법 및 재료를 알고 있을 것이며, 이는 본 발명의 실시에 사용될 수 있으며 실시 범위에 속한다. 본 발명은 상기 설명된 방법 및 재료에 어떤 방식으로든지 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 균등한 방법, 장치 및 재료들 또한 본 발명을 실시 또는 테스트함에 사용될 수 있으나, 본 명세서에는 바람직한 방법, 장치 및 재료들이 기재되어 있다.
본 출원에 인용된 모든 간행물, 공개된 특허 문서 및 특허 출원은 해당 출원과 관련된 기술 수준을 나타낸다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 공개된 특허 문서 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 공개된 특허 문서 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되도록 지시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
첨부된 청구범위를 비롯하여 본원에서 사용되는 단수형 “하나 (a, an)” 및 “그것(the)”은 내용상 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수형을 포함하며, “적어도 하나” 및 “하나 이상”과 호환적으로 사용된다. 따라서, “압타머”에 대한 언급은 압타머의 혼합물을 포함하고, “프로브”에 대한 언급은 프로브의 혼합물 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “약”은 수치 값의 중요하지 않은 변형 또는 변화를 나타내므로, 해당 수치 값이 관련되어 있는 항목의 기본적인 기능은 변화하지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 “포함하다”, “포함하는”, “비롯하다”, “비롯하는”, “함유하다”, “함유하는” 및 이의 변화형은 비배타적인 포함을 포괄하는 것이므로, 구성요소 또는 구성요소들의 목록을 포함하거나 내포하거나 함유하는 본 발명의 프로세스, 방법, 공정에 따른 생성물, 또는 조성물이 오직 이들 요소들만을 포함하는 것이 아니라 명시적으로 열거되지 않은 또는 이러한 본 발명의 프로세스, 방법, 공정에 따른 생성물, 또는 조성물에 고유하지 않은 다른 구성요소들도 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 “바이오마커”는 개체 내 정상 또는 비정상 프로세스 또는 개체 내 질병 또는 기타 병태를 나타내거나 이의 징후인 표적 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 보다 구체적으로, “바이오마커”는 정상이든 비정상이든, 비정상인 경우 만성이든 급성이든 특정 생리학적 상태 또는 프로세스의 존재와 관련된 해부학적, 생리적, 생화학적 또는 분자적 파라미터이다. 바이오마커는 실험실 분석 및 의료용 영상화를 포함한 다양한 방법으로 검출 및 측정 할 수 있다. 바이오마커가 단백질인 경우, 생물학적 샘플에서 상응하는 단백질 바이오마커의 양 또는 존재 또는 부재 또는 바이오마커 또는 바이오마커의 발현을 제어하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 메틸화 상태에 대한 대용 척도로서 상응하는 유전자의 발현을 사용할 수도 있다.
특정 질병 상태에 대한 바이오마커 선택은 먼저 특정 의학적 적용에 대한 대조군 집단과 비교하여 질병 집단에서 측정가능하고 통계적으로 유의한 차이를 가지는 마커들의 식별을 포함한다. 바이오마커는 질병 발생 또는 진행과 병행하고 질병 또는 병태에 의해 영향을 받은 조직 또는 질병 또는 병태에 반응하는 주변 조직 및 순환 세포로부터 혈류로 용이하게 확산되는 분비된 또는 방출된 분자들을 포함할 수 있다. 식별된 바이오마커 또는 바이오마커들의 세트는 일반적으로 이를 선택한 원래 의도한 용도에 대하여 신뢰가능한 지표인 것으로 나타내어지거나 임상적으로 검증된다. 바이오마커는 소분자, 펩티드, 단백질, 및 핵산을 비롯한 다양한 분자들을 포함할 수 있다. 바이오마커 식별에 영향을 미치는 주요 문제 중 일부에는 사용가능한 데이터의 과적합과 샘플 핸들링 프로토콜 변형을 포함한 데이터의 편향이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는, “바이오마커 값”, “값”, “바이오마커 수준” 및 “수준”은 생물학적 샘플에서 바이오마커를 검출하기 위한 임의의 분석 방법을 사용하여 이루어지고 생물학적 샘플 내 바이오마커의, 이에 관한 또는 이에 상응하는 존재, 부재, 절대량 또는 농도, 상대량 또는 농도, 역가, 수준, 발현 수준, 측정된 수준의 비율, 등을 나타낸다. “값” 또는 “수준”의 정확한 특성은 바이오마커 검출에 사용되는 특정 분석 방법의 구체적인 설계 및 구성요소들에 따라 달라진다.
“질병 바이오마커 대조 범위” 또는 “바이오마커 대조 범위”는 호환적으로 사용되며 질병이없는 또는 정상 개체들에서의 정상 또는 비-질병 바이오마커 범위를 의미한다. 이들은 통상적으로 대조 집단으로부터 유래된다.
“샘플”, “사례” 또는 “테스트 세트”는 호환적으로 사용되며 병에 걸렸거나 앓을 것으로 의심되고 궁극적으로 병에 걸렸거나 병에 걸리지 않은 것으로 결정될 수 있는 개체 또는 사례 환자를 의미한다.
본원에서 사용되는 “샘플 핸들링 및 프로세싱 마커”, “핸들링/프로세싱 마커”, “샘플 핸들링 및 프로세싱 프로토콜에서 변화에 민감한 마커”, “분석 전 변화에 민감한 마커” 등은 샘플 핸들링 및 프로세싱 프로토콜에서 변화에 민감한, 본원에 기술된 방법에 의해 발견된 마커를 지칭하기 위하여 호환적으로 사용된다. “샘플 핸들링 및 프로세싱 마커”는 바이오마커를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
샘플 핸들링 및 프로세싱 마커는 정상 개체들의 대조 집단 내 후보 마커들로부터 식별될 수 있다. 상기 대조 집단으로부터 얻은 샘플들을 후보 마커에 대해 분석하여, 샘플 핸들링 및 프로세싱 프로토콜의 변화에 민감한 후보 마커를 선택한다. 이러한 변화는 샘플 분석 이전의, 샘플 프로세싱 시간, 프로세싱 온도, 저장 시간, 저장 온도, 저장 용기 조성 및 다른 저장 조건들에 있어서의 변화; 샘플의 산소에의 노출, 정맥 천자에 사용된 바늘 구멍의 크기, 수집 기구, 수집 튜브 첨가물을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 정상 개체로부터 샘플을 추출함에 사용된 방법에 있어서의 변화; 원심분리 속도, 온도 및 시간, 여과 및 필터 구멍 크기를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 샘플 프로세싱에 있어서의 변화, 수집 용기(receptable or vessel), 동결 방법; 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 변이에 실질적으로 민감한 것으로 식별된 후보 마커들은 샘플 핸들링 및 프로세싱 마커로 인정된다. 후보 마커들은 소분자, 펩티드, 단백질, 및 핵산을 비롯한 다양한 분자들을 포함할 수 있다.
일부 경우에서, 선택된 핸들링/프로세싱 마커들에서 해당 분석법에서 문제의 특정 질병에 대한 마커 또는 질병 마커가 될 수도 있는 것들을 구별하여 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 한편, 사용되는 핸들링/프로세싱 마커의 수가 더 큰 경우, 예컨대, 약 20, 30, 50 또는 그 이상 보다 큰 경우, 이러한 상황에서 핸들링/프로세싱 마커를 제거할 필요가 없을 수 있다.
본원에 사용되며 본원에서 호환적으로 사용되는 “결정하는 것”, “결정”, “검출하는 것” 등은 형광, 화학발광, 방사성 표지, 표면 플라즈몬 공명, 표면 탄성파, 질량 분석법, 적외선 분광법, 라만 분광법, 원자 현미경, 주사 터널링 현미경, 전기화학 검출법, 핵 자기 공명, 양자점 등을 포함하는 임의의 적절한 방법을 사용하여 분자를 검출하거나 정량(측정)하는 것을 지칭한다. “검출” 및 이의 변화형은 생물학적 샘플에서 분자의 존재의 식별 또는 발견을 지칭하고 및/또는 해당 분자의 값을 측정하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 “생물학적 샘플”, “샘플”, 및 “테스트 샘플”은 개체로부터 얻은 또는 그 밖의 방식으로 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직, 또는 세포를 지칭하기 위해 본원에서 호환적으로 사용된다. 여기에는 혈액 (전혈, 백혈구, 말초 혈액 단핵 세포, 버피 코트, 혈장, 혈청 및 여과지에 수집된 건조 혈반 포함), 가래, 눈물, 점액, 비강 세척, 비강 흡인물, 호흡, 소변, 정액, 타액, 낭포액, 수막액, 양수, 선액, 림프액, 유두 흡인물, 기관지 흡인물, 흉막액, 복막액, 활액, 관절 흡인물, 복수, 세포, 세포 추출물 및 뇌척수액이 포함된다. 이는 또한 상기 모든 것들의 실험적으로 분리된 분획들을 포함한다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈청 또는 특정 형태의 혈액 세포, 가령, 적혈구 세포 또는 백혈구 세포 (백혈구)를 포함하는 분획들로 분획화될 수 있다. 필요에 따라, 샘플은 개체에서 얻은 샘플들의 조합, 가령, 조직 및 체액 샘플의 조합이 될 수 있다. 용어 “생물학적 샘플”은 또한 균질화된 고체 물질을 내포하는 물질, 가령, 대변 샘플, 조직 샘플, 또는 조직 생검을 포함한다. 용어 “생물학적 샘플”은 또한 조직 배양물 또는 세포 배양물로부터 유래한 물질을 포함한다. 생물학적 샘플을 얻기 위한 적절한 방법을 사용할 수 있다; 예시적인 방법은 예를 들어, 채혈, 면봉법 (예를 들어, 협측 면봉법), 세척, 체액 흡인 및 미세 바늘 흡인 생검 절차를 포함한다. 샘플들은 또한 예를 들어, 미세절개(micro dissection)(예를 들어, 레이저 포획 미세절개(laser capture microdissection; LCM) 또는 레이저 미세 절개(laser micro dissection; LMD)), 방광 세척(bladder wash), 도말(smear)(예를 들어, PAP 도말) 또는 유즙도관 세척법(ductal lavage)에 의해 수집 될 수 있다. 개체로부터 얻은 또는 이로부터 유래된 “생물학적 샘플”은 개체로부터 얻은 후 임의의 적절한 방법으로 처리된 임의의 이러한 샘플들을 포함한다.
또한, 생물학적 샘플은 다수의 개체들로부터 생물학적 샘플을 취하고 이들을 통합하거나 각 개체들의 생물학적 샘플의 분취물을 통합함으로써 얻을 수 있음을 이해하여야 한다.
“세포 어뷰즈 (Cell Abuse)”는 세포 오염, 세포 용해, 세포 단편화, 세포 단편들, 내부 세포 구성성분들 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 “샘플 거부”는 샘플이 속하는 서브세트, 그룹 또는 콜렉션의 거부를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는, “SOMAmer” 또는 “느린 해리 속도의 변형 압타머”는 개선된 해리 속도 특성을 가지는 압타머를 지칭한다. SOMAmer는 발명의 명칭이 “Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”인, 현재는 미국 특허 제 7,947,447호인 미국 공개 공보 제 2009/0004667호에 기재된 개선된 SELEX 방법들을 사용하여 생성될 수 있다.
이 출원에서, 샘플 핸들링 및 프로세싱에 대한 마커 단백질의 측정값을 측정였으며, 샘플 수집 및 제조에 있어서의 변화에 대하여 확실하고 재현가능한 거동(behavior)을 가짐이 발견되었다.
본 출원의 핵심적인 아이디어는 각 샘플에서 측정될 수 있는 많은 프로세싱 및 핸들링 마커 단백질들 중 일부를 사용하여 샘플 수집 및 샘플 제조 단계들에서의 변화에 대한 차등적인 반응들을 제공하는 것이다. 이러한 맥락에서, 이들 핸들링/프로세싱 마커 단백질 신호들은, 예를 들어, 혈액 샘플 프로세싱에 있어서 이전의 사건들, 가령, 원심분리 이전의 지연 그리고 디캔팅 이전의 지연을 모니터하기 위해 사용될 수 있다. 이는 직접적으로 관심 바이오마커 단백질들의 분해를 모니터하는 것과 다르며, 넓은 범위에 걸쳐 더욱 민감하고 유익할 수 있다. 본원에 설명된 방법을 사용함으로써, 관심있는 특정 바이오마커 단백질의 추출 후 변화와 관련하여 가능한 샘플 품질은 각 프로세스 변화에 대한 핸들링/프로세싱 마커들의 공지된 민감성을 바이오마커들의 추정 값에 적용함으로써 특성화할 수 있다. 또한 샘플 프로세싱 및 핸들링 마커의 모니터링을 사용하여 겉보기 단백질 농도로부터 샘플 핸들링 구성성분을 뺌으로써 질병 바이오마커에서의 각 변화에 관해 추정된 효과를 교정 할 수 있다. 항체 분석, 질량 분석법 등을 비롯한 다양한 측정 시스템으로 질병의 바이오마커들을 평가하기 이전에 이러한 샘플 핸들링 및 프로세싱 바이오마커 측정값들을 사용하여 샘플들을 특성화할 수 있다.
이러한 방식에서, 혈액의 생물학적 메커니즘들 중 일부는 시계, 타이머 및 기록 장치들처럼 기능하도록 사용된다. 이러한 기술이 작동하게 하려면, 다양한 메커니즘의 생체내 생물학적 활성화와 혈액이 체내에서 배출된 후 발생하는 활성화 또는 “시험관내” 변화를 구별 할 수 있어야 한다. 생체내 질병 바이오마커와 핸들링/프로세싱 마커 분해를 시험관내에서 발생하는 분해와 구별하는 주된 툴은 샘플을 단순히 단일 샘플 핸들링/프로세싱 변화에 대해서만이 아니라, 여러개에 대해 특성화할 수 있도록 대단히 많은 단백질들을 동시에 측정하는 능력이다. 특정한 샘플 핸들링 프로토콜 변화를 나타내는 상관된 단백질 측정값들은 샘플 핸들링/프로세싱 마커의 패널을 제공한다.
몇 개의 샘플들을 평가하여 하나 이상의 부위들에서 또는 샘플들의 몇몇 분획들에서 해당 샘플 핸들링 및 프로세싱 기술들이 관심 바이오마커 단백질들의 차이를 측정하기 어렵게 할 것임을 발견함으로써, 우리의 시스템에 의해 각 샘플에 전달된 지표들을 통해 임상 부위들로부터 얻은 샘플들의 세트를 거부할 수 있다. 즉, 이러한 지표들은 문제되는 샘플들이 샘플 핸들링 효과로 인해 실제 건강한 또는 질병이 있는 생물작용을 은닉할 것인지, 또는 샘플 핸들링 효과가 기저의 건강한 또는 질병이 있는 생물작용을 실제로 반영하지 않는 “거짓 양성” 바이오마커 결과를 생성할 것인지를 결정할 수 있게 한다. 샘플 수집/프로세싱 지표들은 또한 신뢰가능하고 완건한 바이오마커를 발견하게 하는 창을 제공하였다. 일관된 샘플 준비 지표들을 가지는 샘플들의 그룹들을 선택함으로써, 의도치 않은 편향을 최소화하고 질병 특이적 바이오마커 발견을 향상시킬 수 있다. 또한 이러한 지표들을 사용하여 잘 수집된 표준 샘플들과 비교함으로서 가벼운 샘플 핸들링 효과를 교정할 수 있다. 임상적 활용에서, 값비싼 추가 평가에 앞서 몇가지 샘플들을 거부하기 위해, 그리고 샘플 핸들링으로 인한 어느 정도의 불확실성을 반영하기 위해 제공되는 측정값 또는 기록을 조정하기 위하여, 샘플 핸들링 지표들을 사용하여 지표들의 수집 절차상의 부위들을 권고할 수 있다.
요약하면, 이제 다음이 가능하다:
1. 샘플들 간 샘플 핸들링 변화의 형태 및 정량화 정도를 결정한다. 이는 샘플 세트를 분류하고 바이오마커 발견에 적합한 샘플들을 분리해 낼 수 있게 한다.
2. 샘플들 간의 변화를 실질적으로 감소 또는 최소화하기에 바람직한 샘플 핸들링/프로세싱 프로토콜을 식별 또는 확립한다.
3. 유사하게, 샘플들의 수집 부위들 또는 배치들의 샘플 핸들링/프로세싱 값을 참조 샘플 핸들링/프로세싱 바이오마커 값과 비교하여 개개 부위들이 바람직한 수집 프로토콜에 부합하는지를 결정할 수 있다.
4. 샘플 세트들을 조사하고 참조 샘플 핸들링/프로세싱 바이오마커 값과 비교하여 사례와 대조 샘플들 간에 존재할 수 있는 예상되는 핸들링 및 프로세싱 변화 정도를 결정할 수 있다. 이러한 방식에서, 샘플들의 서브세트들을 유사한 샘플 수집 조건들에 기반하여 비교하기 위해 선택하므로, 식별된 바이오마커들은 기저 생물작용을 신뢰가능하게 반영하게 된다.
5. 개별 샘플들은 해당 샘플이 바람직한 핸들링/프로세싱 프로토콜에 부합하는 방식으로 수집되지 않은 것으로 결정되는 경우 진단 테스트에 대해 거부될 수 있다.
6. 하나 이상의 사례 샘플들의 단백질 측정값들은 샘플 핸들링/프로세싱 변동성을 반영하도록 조정될 수 있다.
7. 샘플 핸들링/프로세싱 변동성에 덜 민감한 단백질들의 완건한 서브세트는 임상 또는 시판용으로 선택될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 이상적인 혈액 샘플 수집 조건들로부터의 편차 효과를 정량하는 방법을 포함한다. 이 방법은 프로테오믹 분석 측정에 앞서, 혈액 샘플 채취 및 핸들링에 관련된 단계들에서의 변화에 의해 영향을 받는 생물학적 프로세스들을 식별하는 것을 포함한다. 이들 생물학적 프로세스들은 이러한 프로세스로 고유하게 식별되고 모니터될 수 있는 분석물 (예컨대, 단백질) 측정값들의 구체적인 리스트들에 의해 모니터된다. 이들 단백질 리스트들은 측정되는 각 단백질에 특이적인 단백질 계수를 사용하는 단백질 양의 대수적 측정값들을 프로젝션하여 정량적으로 적용된다. 샘플 프로세싱 마커 SMV (샘플 마커 변화)로 공지된, 이러한 투영으로부터 얻은 점수를 사용하여, 샘플 단위 그리고 샘플 그룹 단위 기준으로 절차상의 혈액 샘플 수집 변화를 평가할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 SMV 계수를 생성하는 방법을 보호한다. 구체적으로, 이상적인 혈액 샘플 수집 조건들로부터의 편차 효과를 정량하는 방법이 확인되었다. 이 방법은 프로테오믹 분석 측정에 앞서, 혈액 샘플 채취 및 핸들링에 관련된 단계들에서의 변화에 의해 영향을 받는 생물학적 프로세스들을 식별하는 것을 포함한다. 이들 생물학적 프로세스들은 이러한 프로세스로 고유하게 식별되고 우리가 모니터할 수 있는 단백질 측정값들의 구체적인 리스트들에 의해 모니터된다. 이들 단백질 리스트들은 측정되는 각 단백질에 특이적인 단백질 계수를 사용하여 단백질 양의 대수적 단백질 측정값을 프로젝션하여 정량적으로 이용된다. SMV로 공지된, 이러한 투영으로부터 얻은 점수를 사용하여, 샘플 단위 그리고 샘플 그룹 단위 기준으로 절차상의 혈액 샘플 수집 변화를 평가할 수 있다. 이러한 생물학적 프로세스를 사용하여 혈액 샘플 수집 조건의 변화를 모니터할 수 있으며 특정 단백질 벡터를 사용하여 이러한 생물학적 프로세스를 모니터하고 정량화 할 수 있다. 이는 샘플 자체에 기록되는 샘플 수집 변동의 정량화를 제공하며 시간, 온도, 원심분리 속도와 같은 변수들에 대한 독립적인 모니터링을 수집시 필요로 하지 않는다.
SMV 단백질 성분들을 식별하기 위해 보체 활성화, 혈소판 활성화 및 세포 용해와 같은 특정 생물학적 프로세스의 생화학적 조작을 포함하는 표적화 실험이 사용되었다. 이러한 실험들은, 임상 샘플 수집에 있어서의 변동을 샘플 단위 기준으로 정량적으로 평가하는데 사용될 수있는 생물학적 프로세스들을 고유하게 식별하기 위하여, 임상 실습과 일관된 방식으로 혈액 샘플 수집 조건을 변경하는 실험들과 결합된다.
본원에 기재된 기술들은 이러한 생물학적 프로세스들에 직접 관여하는 단백질들의 측정값 품질에 대해 샘플을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 이는 샘플 핸들링 변화에 의해 영향을 받을 수 있으나 본원에서 측정된 생물학적 프로세스들에 단순히 직접 연결되지는 않는, 이들 샘플들에서의 단백질 측정값들에 관한 결정을 알리기 위해 이용될 수 있는 샘플 품질의 정량적 측정값들을 제공한다. 예를 들어, 일반적인 단백질분해 활성은 보체의 활성화와 세포의 용해에 의해 영향 받을 수 있다. 그러나, 영향받은 단백질들은 단순 폐쇄 그룹 또는 프로세스를 형성하지 않으며 보체 및 세포 용해를 모니터하기 위해 사용될 수 없는데, 왜냐하면 기타 단백질들이 샘플 핸들링 변화와 관련이 없는, 샘플들 간 달라지는 많은 이유들, 가령, 질병 프로세스 또는 신장 기능을 가질 수 있기 때문이다.
생물학적 프로세스들 그리고 간접적으로 샘플 수집 조건들에 있어서의 변화를 모니터하기 위한 계수들을 가지는 단백질들의 세트를 사용하는 것이 본 발명이며, 이는 개별적인 변화를 겪을 가능성이 더 적고 생물학적 프로세스 활성화의 완건한 추정을 제공하는 것으로 해석될 수 있는 측정값들의 앙상블을 형성한다는 점에서 단일 단백질에 비해 이점을 가진다. 로그 스케일 측정값을 사용하여 생물학적 프로세스 활성화에서 상대 배수 변화를 모니터링 할 수 있으며 선형 공간에서 비율에 상응하는 차이를 사용하여 참조 샘플들과 간단히 비교할 수 있다. 이러한 로그 사용은 또한 단백질 측정값들을 절대적으로 스케일링하므로, 참조 샘플 사용시 해당 세트 또는 벡터 내 단백질들 간 농도에 있어서의 차이 범위가 자동적으로 정규화된다.
SMV 계산을 개별 혈액 샘플에 직접 적용하여 생물학적 프로세스 측면에서 해석될 수 있는 또는 간접적으로 참조 샘플의 이상적인 조건들로부터 특정 샘플 수집 조건들의 편차 측면에서 해석될 수 있는 점수를 제공한다. 이어서 이들 점수를 사용하여 어떤 샘플들이 기준을 만족시키는지 또는 허용가능한 한도에 속하는지를 결정할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 개별 샘플들을 거부할 수 있다. 단백질 양 (abundance) 변화가 상이한 샘플 수집 프로토콜 또는 조건들하에서 처리되는 샘플들의 개개 세트 중 일부 세트에 의해 유발되었을 수 있는 경우, 바이오마커 발견을 위한 연구 중인 질병 또는 프로세스에 이러한 변화를 할당하지 않기 위해 바이오마커를 발견하는 동안 개별 샘플들을 거부하는 것은 중요하다.
개별 샘플들에 대한 SMV 점수를 사용하여 샘플 수집 파라미터의 특정 범위에 해당하는 샘플들의 세트를 그룹화할 수 있다. 이것은 어느 세트로부터의 샘플이 이전의 또는 다른 수집 연구로부터의 샘플과 비슷한 샘플 수집 절차 및 파라미터를 가지는 경우, 샘플들 중 매치된 세트들을 정의할 수 있게 한다. 매치된 세트들을 형성할 수 있는 이러한 능력은 서로 다른 조건들 하에서 수집되었을 수 있는 샘플들의 그룹들을 비교하는데 있어서 매우 유용하다. 또한 다른 단백질들에서 상관된 변화가 결정될 수 있는 경우 개별 샘플들로부터 계산된 SMV 점수를 사용하여 샘플 핸들링에서의 변화를 교정할 수도 있으며, 서로 다른 SMV 점수를 가지는 샘플들 간에 변화를 초래하는 프로세스들에 의해 영향을 받은 각 단백질에서의 변화를 기반으로 수학적 모델(mathematical model)을 구축한다.
임상적으로 서로 다른 개체들로부터 수집된 샘플들 간의 차이는 샘플이 어떻게 수집되었는지에 대한 차이가 아니라 그들 개체들간의 차이를 의미함을 알고 있으므로, 샘플들의 SMV 점수를 기준으로 한 개별 샘플들의 거부는 더욱 민감한 바이오마커 발견을 수행할 수 있게 한다. 단백질의 양에 관련된 진단 테스트는 그 변화가 개체의 임상적 상태로 인한 것이 아니라 혈액 샘플을 수집하였던 절차로 인한 것인 경우 오해의 소지가 있을 수 있다. 이것은 합당한 샘플 수집의 절차상의 변화에 상응하는 SMV 점수 임계값을 충족하지 않는 샘플들을 거부함으로써 제거될 수 있다.
많은 기존의 샘플 수집은 샘플 수집 절차에서의 변화에 의해 전반적으로 손상된다. SMV 점수를 사용하여, 샘플 수집 내부에서 또는 샘플 수집 부위들 간 이와 같은 변화를 정량화할 수 있고, 사례와 대조군 간 샘플 수집에 있어서의 전반적 변화(systematic variation)와 같은, 연구원이 오해할 수 있는 변화를 기준으로 전체 연구를 거부할 수 있다. 이와 같은 변화를 평가하기 위하여 수집물의 서브세트들만 측정하는 것이 필요할 수 있으며; 샘플 수집이 허용불가한 것으로 간주되는 경우 많은 절약이 가능하다. 또한 연구의 샘플 취득 단계 동안 샘플 수집을 모니터할 수 있으므로, 교정 어드바이스를 제공하며, 연구 프로토콜과의 비-부합 (non-compliance)을 검출한다. 기존의 또는 진행중인 연구에서의 변화를 모니터하기 위하여, 이는 전체 수집 중 몇 개의 서브샘플을 측정하는 것이 필요할 뿐이다.
샘플 수집 변화를 모니터하고 평가하기 위한 이들 기술은 연구 프로토콜을 최적화하는데 적용될 수 있으며, 특정 샘플 수집 장비 및 용기 이용 비용이, 덜 비싼 프로토콜로 작동함으로 인한 정확한 변화 및 손상의 평가와 비교될 수 있는 경우, 바이오-뱅크와 같은 대규모 샘플 수집하려는 노력을 경제적으로 최대화하기 위해 적용 될 수 있다.
몇몇의 경우에 있어서, 아마도 생물학적 샘플들의 가장 통상적인 수집물의 소급적용적 특성(retrospective nature)으로 인하여, 오염되지 않은 샘플 수집물을 얻는 것은 불가능하다. 그리고, 어느 정도의 비교는 서로 다른 부위에서 수집된 샘플들 사이 그리고 서로 다른 시간에 수집된 샘플들의 그룹들 사이에서 필연적으로 발생할 수 있다. 이들 샘플 수집물들은 수집 절차상의 차이를 보여줄 것이며, 프로테오믹 프로파일(proteomic profiles)에서의 변화를 유발하게 되고, 의도한 차등적 임상 비교와 혼동될 것이다. 샘플 그룹들간의 매치된 세트들을 생성함으로써, 수집된 샘플들의 서브세트들을 동등하게 비교할 수 있다.
혈장 샘플에서 단백질 분석물의 측정은 샘플을 수집 및 핸들링하는데 사용되는 프로토콜의 영향을 크게 받을 수 있다. 특정된 샘플 수집 및/또는 핸들링 프로토콜로부터 생기는 편차는 샘플 내 단백질 수준의 변화 또는, 그밖에도 음성 대조군을 포함한 많은 분석물들에 대한 신호 변화를 가져오는, 측정값들에 대한 전반적인 효과를 초래할 수 있다. 이러한 편차는 단백질 분석물을 측정하는데 사용되는 분석 유형에 관계없이 발생할 수 있다.
일련의 임상 샘플들의 품질을 평가하기 위해 프로토콜로부터 가장 명백한 편차들에 대한 효과를 특성화하였다. 샘플 수집과 스핀처리(spinning) 사이의 단백질 조성의 변동성을 시간의 함수로서 분석하였다. 또한, 샘플 스핀처리와 샘플 디캔팅까지의 시간 사이의 단백질 조성의 변동성을 시간의 함수로서 분석하였다.
임상 샘플들의 수집을 평가하기 위한 정량적 분류기준으로 사용될 수 있는, 부주의한 샘플핸들링에 관한 기호들을 확인하였다. 또한 수집 프로토콜로부터의 편차, 특히 샘플 수집과 스핀처리 사이의 지연 및 샘플 스핀처리와 샘플 디캔팅 사이의 지연과 관련하여 해당 분석물의 측정값들의 민감성을 포착하는 각 분석물에 대한 지표들이 생성되었다.
실시예
하기의 실시예들은 설명을 위한 목적으로 제공되며, 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 기재된 모든 실시예들은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적인 표준 기술을 사용하여 수행되었다. 하기의 실시예에 기재된 일반적인 분자 생물학 기술들은 표준 실험실 메뉴얼, 가령, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001) 에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
실시예 1 샘플 수집
혈장 샘플은 정의된 프로토콜에서 관심 변수를 제외하고 모든 샘플 수집 변수가 일정하게 유지된 18명의 개체들의 그룹에서 수집되었다. 동일한 개체들의 세트에서 여러 개의 튜브를 채취하여 서로 다른 개체들 간의 반응 변화를 평가했다.
샘플 수집 - 단계들
1. 라벤더 탑 EDTA 튜브의 유효 기간을 확인했다. 만료된 경우 새 것으로 교체되었다.
2. 라벤더 탑 EDTA 튜브에 정확한 참가자 ID와 수집 날짜를 라벨하였다.
3. 정맥천자는 표준 건강 및 안전 절차에 따라 기관 지침에 따라 수행되었다.
4. 라벤더 탑 EDTA 튜브는 정맥 천자 샘플로 완전히 채워졌다.
5. 실험실에서 동시에 채취되는 경우, 튜브들은 다음 순서로 수집되었다:
a. 혈청
b. 시트레이트 혈장
c. 헤파린 혈장
d. 라벤더 탑 EDTA 혈장
6. 라벤더 탑 EDTA 튜브를 8-10 회 뒤집어 랙에 똑바로 세웠다.
스핀까지의 시간
샘플들을 진공 튜브에 수집하고 상기 샘플 수집-단계에 설명된 바와 같이 뒤집었다. 그 후, 18 명의 개체 각각에 대해 샘플을 회전시키기 전에 6개의 다른 시간, 즉 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간이 경과하게 두었다. 라벤더 탑 EDTA 튜브를 15분 동안 2200xg (RPM 아님)에서 회전시켰다. Microfuge 튜브에 정확한 참가자 ID를 라벨하였다. 1.0 ml의 혈장을 Microfuge 튜브에 피펫팅하였다. 혈장 층만 제거되었다. 일부 플라스마를 남겨두고 세포층을 피함으로써 분취 할 때 버피 코트를 교란시키지 않도록 주의를 기울였다. Microfuge 튜브의 상단을 닫고 -80 °C 냉동고에 두었다.
디캔팅/동결까지의 시간
샘플 회전을 통해 상기 샘플 수집-단계들 및 스핀까지의 시간에 설명된 바와 같이 샘플을 수집했다. 그 후, 18 명의 개체 각각에 대해 회전시킨 샘플들을 디캔팅 및 동결시키기 전에 6개의 다른 시간, 즉 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간이 경과하게 두었다.
일변량 분석
모델 생성 전에 스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간과 관련된 모든 분석물 신호들에 대한 일변량 분석을 수행하여 모델 구축에 사용되는 특징 (분석물) 수를 줄였다 (도 1-2).
스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간 변화에 따른 일반적인 기능적 영향에 액세스하기 위해 18명 개체들 RFU에 대한 피어슨 (Pearson) 상관 관계 (공식 1)를 ~ 5K 분석물 각각에 대해 계산하였다.
Figure pct00001
(1)
거동의 연속이 존재한다 하더라도 분석물들은 피어슨 상관 계수 >0.95인 경우 높은 구별 특성으로 (도 1), 또는 상관 계수 <1E-3인 경우 매우 낮은 구별 특성으로 (도 2) 특징될 수 있으며, 이는 18명의 개체들에서 스핀까지의 시간에 있어 시각적으로 변화가 없음을 보여준다.
스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간 상관에 따른 몇 가지 분석물들에 대한 통계 요약을 표 1과 2에 나타낸다. 표 3은 스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간 분석물 중요도를 순위매김한다. 스핀까지의 시간 모델에서 분석물들의 정성적 그룹들이 존재하며; 이들은 스핀까지의 시간을 증가시킴에 따라 그리고 스핀까지의 시간 반응의 정도를 변화시킴에 따라 RFU에 있어 음의 또는 양의 상관 이동을 보여준다. 표 4는 측정된 분석물의 수준과 스핀까지의 시간 사이의 상관관계를 보여준다 (예컨대, 측정된 SHH 수준은 수집시로부터 스핀시까지 시간이 증가함에 따라 감소한다 (음의 상관관계)).
계산된 분석물 상관관계를 사용하여, 우리는 스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간 분류에서 사용할 수 있는 잠재적인 마커들의 수를 ~5K에서 ~100로 감소시켰으며, 계산된 피어슨 계수 >|0.7| 였다. 이러한 초기 분석물 세트를 사용하여, 우리는 분류기를 구성할 때 특징 감소를 추가로 수행한다.
실시예 2 분류기 생성
샘플 핸들링 모델을 생성하기 위한 랜덤 포레스트 분류기들을 선택하였다. 랜덤 포레스트에 대한 간략한 소개, SOMAscan 데이터를 사용한 구현 및 다른 기계 학습 기술에 대한 강점은 다음과 같다.
랜덤 포레스트 모델
간단히 말해서 랜덤 포레스트는 아래의 실시예에서와 같이 많은 (수백 개)의 의사결정 트리 모음이다 (도 4). 노드의 RFU 수준은 트리를 두 방향으로 분할할 것이다- 엔드포인트 및 분류 예측으로 이어지거나 또 다른 노드로 이어지는데, 또 다른 노드에서 추가 분석물 RFU 값이 트리를 다시 분할하게 되고 또 다른 하위의 다수의 가지들로 이어지게 된다.
랜덤 포레스트의 이점은 하나의 의사결정 트리가 예측 에러, 가령, 도 4에서 다수의 부정확한 비닝(binning)을 일으키기 쉽게 되는 경우, 수백개의 트리들에서의 평균 예측이 임의의 주어진 예측에 대한 에러를 감소시키게 될 것이라는 점에 있다 (도 5).
모델 생성
랜덤 포레스트 모델은 log10 변환된 RFU 데이터에 대하여 R에서 Caret (Kuhn, M. (2008). Caret package. Journal of Statistical Software, 28(5)) 및 randomForest (A. Liaw and M. Wiener (2002). Classification and Regression by randomForest. R News 2(3), 18-22) 패키지를 사용하여 훈련되었다. 모델 성능에 대한 각 분석물의 상대적 중요도 측정인 IncNodePurity (분류에서 Gini 인덱스)를 평가하여 추가적인 특징 감소를 수행했다. 여기서부터 특징들을 추가로 감소시켜 스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간에서 가장 중요한 분석물 10개를 포함하는 모델을 생성하였다 (표 3, 도 3).
개별 분석물을 사용하여 모델 성능을 평가할 때 (도 6, PGAM1 모델) 두 가지 지표들을 사용한다. 먼저 평균 제곱근 에러 (RMSE)를 사용하여 예측 시간을 실제 시간에 대해 평가하거나 잘 수집된 샘플 (2 시간 미만의 실제 스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간) 또는 제대로 수집되지 않은 샘플 (2 시간보다 큰 실제 시간)로 간주되는 것들에 의한 샘플 시간들을 임계값으로 설정한다. 이러한 이진 분류를 사용하여, 우리는 예측들을 예측 시간이 잘 수집된 샘플을 정확하게 설명함을 의미하는 참 양성 (TP), 예측 시간이 제대로 수집되지 않은 샘플을 정확하게 설명함을 의미하는 참 음성 (TN), 그리고 교차 용어 거짓 양성 (FP) 및 거짓 음성 (FN)으로 할당할 수 있다. 스핀까지의 시간에 대한 예측자로서 PGAM1만을 사용하여 (도 X), 우리는 이진 분류 시스템에서 우수한 수준의 민감성/특이성을 관찰하지만, 보다 긴 스핀까지의 시간에서는 종종 실제 값을 과소평가하거나 과대평가한다.
모델 안정성
랜덤 포레스트 모델의 또 다른 이점은 분석 노이즈가 발생하는 경우 안정성이다. 실제 스핀까지의 시간이 9 시간인 샘플을 고려하라 (도 7). 하나의 분석물 (본 실시예에서 SHH)에 대한 RFU 값이 일부 효과 크기만큼 증가/감소되는 경우, 모델 예측 (실선 곡선)은 유사한 나이브 베이즈 모델 (점선 곡선) 보다 더 안정적이다.
10개 분석물 각각에 대한 RFU를 주어진 샘플 및 스핀까지의 시간에 대해 독립적으로 조정할 때, 우리는 그 주변에서 실제 예측이 유의하게 달라지지 않는 상대적으로 안정한 지점이 존재함을 관찰한다 (도 8). 분석물 신호가 보다 심하게 변화할 때 우리는 예측 시간에 대한 보통 정도의 급격한 변화(jump)를 관찰하는데, 연속적인 변화는 아니다.
이진 분류 성능
사전-정의된 2 시간의 컷오프 시간을 사용하여 - 실제 스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간이 2 시간 미만인 샘플은 “양호” 샘플로 그리고 2 시간 초과인 샘플은 “손상/불량” 샘플임- 각 모델 예측에 대하여 실제 분류인 것으로 알려진 것에 대한 전체 민감성과 특이성을 정의하였다. 이러한 이진 분류를 사용하여, 우리는 예측들을 예측 시간이 잘 수집된 샘플을 정확하게 설명함을 의미하는 참 양성 (TP), 예측 시간이 제대로 수집되지 않은 샘플을 정확하게 설명함을 의미하는 참 음성 (TN), 그리고 제대로 수집되지 않은 샘플을 올바르지 않게 설명하는 교차 용어 거짓 양성 (FP) 및 잘 수집된 샘플을 올바르지 않게 설명하는 거짓 음성 (FN)으로 할당하였다. 예를 들면, PGAM1 모델에 기초하여 (도 6) 1.5 또는 3 시간의 실제 시간에서 표 5의 이진 분류 성능이 생성되었다.
혼돈 행렬에는 다음 정보가 포함된다:
Figure pct00002
17개 샘플들이 참 양성으로 표시된 경우, 15개가 참 음성으로, 1개가 거짓 음성으로, 3개가 거짓 양성으로 표시되었다.
모델의 민감성은 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00003
그리고 특이성은 다음과 같이 계산된다:
Figure pct00004
2개 시점에서 이들 18명 개체들에 대하여 민감성/특이성은 다음에 상응한다:
Figure pct00005
6개 스핀까지의 시간/디캔팅까지의 시간에서 18명 개체들 전반에 걸쳐 전체 민감성/특이성이 계산된다.
RMSE 계산
평균 제곱근 에러 (RMSE)는 각 샘플 및 시간의 예측에 대해 실제 스핀까지의 시간에서 계산된 연속적인 성능 측정값이다.
Figure pct00006
본 실시예 PGAM1 마커에서 9시간의 실제 스핀까지의 시간에서, 18명 개체들에 대하여 이 방정식의 분자는 표 6의 데이터를 포함한다.
제곱차이를 합하고, N=18 샘플을 사용시, 방정식이 다음과 같이 환산된다:
Figure pct00007
예상 시간과 실제 시간의 차이를 줄이면 RMSE가 낮아지므로 모델 성능의 좋은 척도가 된다. 모든 시점들 및 샘플들에 걸쳐 RMSE 0은 각 예측이 실제 스핀까지의 시간과 동일한 것에 해당할 것이다 (즉, 완벽한 예측자).
모델 훈련 및 성능
18명 개체들이 모델들을 훈련시킴에 그리고 모델 성능을 평가함에 사용되었다. “양호한” 샘플들은 이진 분류 시스템을 생성하기 위해 2시간 미만의 예측된 스핀까지의 시간을 가지는 것으로 정의되었다. 또한, 실제 시간에 대한 예측 시간과 관련된 상대 에러는 모델 성능 (RMSE)의 또 다른 척도이다. 랜덤 포레스트 모델은 예측을 0 내지 24 시간 사이로 제한한다 (데이터를 사용가능한 경우). 도 6은 단일 분석물 예측자를 가지는 모델의 성능을 보여주는데, 샘플이 참 양성으로 올바르게 식별되었는지 여부를 색으로 표시하고, 2 시간 미만의 올바르게 예측된 스핀까지의 시간을 가진 것들 그리고 다른 분류 예측을 가진 것들을 모델 정확도의 척도로서 실제 스핀까지의 시간에 대하여 플롯하였다.
스핀까지의 시간 변화에 따른 18명 개체들에 대한 누적 분포 함수들은 도 9-18에 도시되어 있다.
분석물 모델 성능
분석물 개개 및 조합들의 성능을 정량화하기 위한 분석은 표 7-24에 요약되어 있다. 표 7은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 단일 마커 모델 성능에 있어 스핀까지의 시간을 보여준다. 표 8은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 2 마커 모델 성능에 있어 스핀까지의 시간을 보여준다. 표 9는 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 3 마커 모델 성능에 있어 스핀까지의 시간을 보여준다. 표 10은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 소닉 헤지호그 (SHH) 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 11은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 인디언 헤지호그 (IHH) 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 12는 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 ADAM9 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 13은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 DDX39B 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 14는 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 FAM49B 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 15는 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 PGAM1 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 16은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 PTPN4 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 17은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 RBP7 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 18은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 S100A12 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 19는 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 TNFSF14 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 20은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 단일 마커 모델 성능에 있어 디캔팅까지의 시간을 보여준다. 표 21은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 2 마커 모델 성능에 있어 디캔팅까지의 시간을 보여준다. 표 22는 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 3 마커 모델 성능에 있어 디캔팅까지의 시간을 보여준다. 표 23은 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 조합 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다. 표 24는 모든 예측된 시점들 (스핀처리 전 0, 0.5, 1.5, 3, 9 및 24 시간 샘플)에 대하여 일부 PGAM1 및/또는 PTPN4를 포함하는 분석물 조합 모델에 대한 스핀까지의 시간 성능을 보여준다.
분석물 모델 군집분석
각 모델의 성능은 각 개체 및 시점에 있어서 실제 스핀까지의 시간에 대한 예측된 스핀까지의 시간에 관한 RMSE를 사용하여 정량화되었다. 도 19는 1023개 모델들에 대한 RMSE 값들의 분포를 보여준다. 분포는 4 개 그룹의 모델 성능으로 나뉜다-고성능 모델의 경우 0 내지 0.35 RMSE, 중간 범위 성능의 경우 0.35 내지 0.5, 저 성능의 경우 0.5 내지 1, 성능이 매우 낮은 모델의 경우 1 내지 2 이다.
사용된 분석물
각 모델 성능 그룹에서 분석물이 사용된 시간 비율을 정량하여, 도 20-22에 도시된 바와 같이, 모델 성능에 대한 각 분석물의 중요도를 나타내었다.
모델 성능에 있어서 분석물 그룹
고성능 모델 중 필요한 분석물 수의 분포를 도 23에 도시한다. 우수한 성능의 모델은 모든 분석물들에 대해 최소 2개 만큼의 분석물을 사용할 수 있다.
실시예 3. 샘플의 다중 압타머 분석
본 실시예는 표 1에 제시된 샘플 수집/프로세싱 변동성 마커를 식별하기 위한 샘플들 및 대조들을 분석하기 위해 사용된 다중 압타머 분석을 설명한다.
다중 압타머 분석법
다중 압타머 분석의 모든 단계는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행되었다.
압타머 마스터 믹스 용액의 제조.
5272개 압타머들을 각각 20%, 0.5% 및 0.005%의 혈장 또는 혈청 샘플 희석에 해당하는 3개의 고유한 믹스, Dil1, Dil2 및 Dil3으로 그룹화하였다. 하나의 믹스에 대한 압타머 할당은 각 압타머와 일치하는 혈장 및 혈청 샘플의 희석 시리즈들을 분석하고 가장 큰 선형 범위의 신호를 제공하는 샘플 희석을 식별함으로써 경험적으로 결정되었다. 압타머를 분리하고 상이하게 희석된 혈장 또는 혈청 샘플 (20%, 0.5% 또는 0.005%)과 혼합하면 분석을 107-배 범위의 단백질 농도에 걸치게 할 수 있다. 압타머 마스터 믹스용 스톡 용액들을 4 nM의 각 압타머로 HE-Tween 버퍼 (10 mM Hepes, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20)에서 제조하고 -20 °C에서 동결 보존하였다. 4271개 압타머들은 Dil1 믹스에서, 828개 압타머는 Dil2에서 그리고 173개 압타머는 Dil3 믹스에서 혼합되었다. 사용 전에 스톡 용액을 HE-Tween 버퍼에서 0.55 nM의 각 압타머 작업 농도로 희석하고 개별 사용 분취량으로 분취하였다. 캐치-0 플레이트 준비를 위하여 압타머 마스터 믹스들을 사용하기 전에, 작업 용액을 사용전 95 °C에서 10분간, 그 후 25 °C에서 30분 이상 동안 배양함으로써 가열-냉각시켜 압타머를 재폴딩시켰다.
캐치-0 플레이트 제조.
60 μL의 스트렙타비딘 자성 세파로즈 10 % 슬러리 (GE Healthcare, 28-9857)를 96-웰 플레이트 (Thermo Scientific, AB-0769)의 각 웰에 분배하였다. 비드들을 175 μL의 분석 버퍼 (40 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0.05% Tween-20)로 1회 세척한 다음 100 μL의 열-냉각된 압타머 마스터 믹스를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 ThermoMixer C 쉐이커 (Eppendorf)에서 850 rpm으로 흔들면서 25 °C에서 30분간 배양하였다. 30분 배양 후, 6 μL의 MB 블록 버퍼 (50 mM Tris-HCl 중 50 mM D-비오틴, pH 8, 0.01 % Tween)를 플레이트의 각 웰에 첨가하고 플레이트들을 흔들면서 2분간 추가로 배양하였다. 이어서 플레이트들을 175 μL의 분석 버퍼로 세척하고, ThermoMixer C에서850 rpm로 1분간 진탕하는 세척 사이클에 이어 30 초 동안 자석에서 분리하였다. 세척 용액을 제거한 후, 비드들을 175 μL의 분석 버퍼에 재현탁시키고 사용시까지 -20 °C에서 보관하였다.
캐치-2 비드 제조.
분석의 로봇 프로세싱 시작에 앞서, 다중 압타머 분석의 캐치-2 단계에 사용되는 MyOne 스트렙타비딘 C1 비드 (Dynabeads, 파트 넘버 35002D, Thermo Scientific)의 비드 슬러리 10 mg/mL를 MB 프렙 버퍼 (10 mM Tris-HCI, pH8, 1 mM EDTA, 0.4% SDS)로 5 분 동안 벌크로 1회, 이어서 분석 버퍼로 2회 세척하였다. 최종 세척 후, 비드들을 10 mg/mL 농도로 재현탁시키고 75 μL의 비드 슬러리를 캐치-2 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 분석 시작시, 캐치-2 플레이트를 알루미늄 어댑터에 놓고 Fluent 데크 위에 적절하게 위치시켰다.
샘플 해동 및 희석.
80 °C의 Matrix 튜브에 보관된 100% 혈장 또는 혈청 샘플들 65 μL 분취량을 실온에서 10분 동안 배양하여 해동시켰다. 해동을 촉진시키기 위해 튜브들을 Matrix 튜브 랙을 통해 공기를 순환시키는 팬 유닛 상부에 배치하였다. 해동 후 샘플을 1000xg에서 1 분 동안 원심 분리하고
샘플 희석을 위해 Fluent 로봇 데크에 배치했다. 해동된 샘플 35 μL를 적절한 샘플 희석액 140 μL를 포함하는 96-웰 플레이트로 옮겨 20% 샘플 용액을 준비하였다. 혈장에 대한 샘플 희석액은 50 mM Hepes, pH 7.5, 100 mM NaCl 8 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1.25 mM EGTA, 1.2 mM 벤즈아미딘, 37.5 μM Z-Block 및 1.2% Tween-20. 혈청 샘플 희석액은 75 μM Z-block을 함유하였으며, 다른 구성성분들은 혈장 샘플 희석액에서와 동일한 농도였다. 0.5% 및 0.005% 희석 샘플들을 제조하기 위한 후속 희석작업이 Fluent 로봇에서의 연속 희석을 사용하여 분석 버퍼로 이루어졌다. 0.5% 샘플 희석액을 제조하기 위해, 45 μL의 20% 샘플을 180 μL의 분석 버퍼와 혼합하여 20% 샘플의 4%로의 중간 희석액을 제조한 다음, 25 μL의 4% 희석 샘플을 175 μL의 분석 버퍼와 혼합하여 0.5% 샘플을 제조하였다. 0.005% 샘플을 제조하기 위해, 20 μL의 0.5% 샘플을 180 μL의 분석 버퍼와 혼합하여 0.05% 중간 희석액을 제조한 다음, 20 μL의 0.05% 샘플을 180 μL의 분석 버퍼와 혼합하여 0.005% 샘플을 제조하였다.
샘플 결합 단계.
상기 기재한 바와 같이 스트렙타비딘 자성 세파로스 비드에서 압타머를 부동화시켜 캐치-0 플레이트들을 준비하였다. 동결시킨 플레이트들을 25 °C에서 30분 동안 해동시키고 175 μL의 분석 버퍼로 1회 세척하였다. 100 μL 의 각 샘플 희석액 (20%, 0.5% 및 0.005%)을 3개의 서로 다른 압타머 마스터 믹스 (각각 Dil1, Dil2 및 Dil3)와 함께 비드를 내포하는 플레이트에 첨가하였다. 그 다음 캐치-0 플레이트를 알루미늄 포일 씰 (마이크로씰 'F' 포일, Bio-Rad)로 밀봉하고 850 rpm, 28 °C로 설정된 4-플레이트 회전 쉐이커 (PHMP-4, Grant Bio)에 넣었다. 샘플 결합 단계는 3.5 시간 동안 수행되었다.
Fluent 로봇에서의 다중 압타머 분석 프로세싱
샘플 결합 단계를 종료한 후, 캐치-0 플레이트들을 알루미늄 플레이트 어댑터에 놓고 로봇 데크위에 놓았다. 온도-제어 플레이트를 사용하여 자성 비드 세척 단계들을 수행하였다. 모든 로봇 프로세싱 단계들에서, 아래 설명되는 바와 같은 캐치-2 세척을 제외하고 플레이트들은 25 °C 온도로 설정되었다. 플레이트들을 175 μL의 분석 버퍼로 4회 세척하였으며, 각 세척 사이클은 플레이트들을 최소 1분 동안 1000 rpm으로 진탕한 다음, 버퍼 흡인 전 최소 30초 동안 자성 비드들을 분리하도록 프로그램되었다. 최종 세척 사이클 동안, 100x Tag 시약 (EZ-Link NHS- PEG4-비오틴, 파트 넘버 21363, Thermo, 무수 DMSO에서 제조된 100 mM 용액)을 분석 버퍼에서 1:100으로 희석하여 Tag 시약을 준비하고 이를 로봇 데크 위 트로프에 부었다. 100 μL의 Tag 시약을 플레이트들의 각 웰에 첨가하고 1200 rpm에서 5 분 동안 흔들면서 배양하여, 비드 표면에 포획된 단백질들을 비오티닐화하였다. 175 μL의 퀀치 버퍼 (분석 버퍼 중의 20 mM 글리신)를 각 웰에 첨가하여 비오티닐화 반응들을 퀀칭하였다. 플레이트들을 3분 동안 정적 배양한 다음, 175 μL 분석 버퍼로 4회 세척하였으며 세척은 상기 설명한 동일한 조건하에서 수행되었다.
광-절단 및 동적 검사 (kinetic Challenge).
플레이트들을 최종 세척 후, 90 μL의 광절단 버퍼 (분석 버퍼 중의 2 μM의 올리고뉴클레오티드 경쟁자; 이러한 경쟁자는 5'- (AC-Bn-Bn)7-AC-3'의 뉴클레오티드 서열을 가짐, 이 때 Bn은 5-위치 벤질-치환된 데옥시우리딘 잔기를 나타냄)를 플레이트들의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 Fluent 데크 위의 광절단 서브스테이션으로 옮겼다. 서브스테이션은 BlackRay 광원 (UVP XX-시리즈 Bench Lamps, 365 nm) 및 3개의 Bioshake 3000-T 쉐이커 (Q Instruments)로 구성된다. 플레이트들을 1000 rpm으로 흔들면서 20분 동안 조사 (irradiated)하였다.
캐치-2 비드 포획.
광절단 프로세스 종료시, 버퍼를 자성 분리를 통해 캐치-2 플레이트에서 제거하고, 플레이트를 100 μL의 분석 버퍼로 1회 세척하였다. 압타머-단백질 복합체를 함유하는 광절단된 용리액을 희석 3 플레이트부터 시작하여 각 캐치-0 플레이트에서 제거하였다. 모든 90 μL 용액을 먼저 흡인되었을 수도 있는 스트렙타비딘 자성 세파로스 비드를 포획하기 위하여 자석들을 올려놓은 쉐이커 위에 위치한 캐치-1 용리액 플레이트로 옮겼다. 그 후, 용액을 캐치-2 플레이트로 옮기고 이 플레이트를 1400 rpm으로 25 °C에서 흔들면서 3분 동안 배양하였다. 3분 동안 배양 후, 자성 비드들을 90초 동안 분리하고, 용액을 플레이트로부터 제거하고, 광절단된 Dil2 플레이트 용액을 플레이트에 첨가하였다. 동일한 프로세스 후, Dil1 플레이트로부터의 용액을 첨가하고 3분 동안 배양하였다. 3분 배양 종료시, 6 μL의 MB 블록 버퍼를 자성 비드 현탁액에 첨가하고 비드들을 1200 rpm으로 25 °C에서 흔들면서 2분 동안 배양하였다. 이러한 배양 후, 플레이트를 38 °C 온도로 사전설정된 다른 쉐이커로 옮겼다. 자성 비드들을 2분 동안 분리한 다음 용액을 제거하였다. 이어서, 캐치-2 플레이트를 175 μL의 MB 세척 버퍼 (분석 버퍼 중의 20% 글리세롤)로 4회 세척하였으며, 각 세척 사이클은 1200 rpm으로 1분 동안 비드들을 진탕하고 비드가 3.5분 동안 자석 위에 분획되도록 프로그램되었다. 최종 비드 분리 단계 동안, 쉐이커 온도는 25 °C로 설정되었다. 이어서 비드들을 175 μL의 분석 버퍼로 1회 세척하였다. 이러한 세척 단계에서, 비드들은 1200 rpm으로 1분 동안 진탕된 다음 2분 동안 자석 위에서 분리되었다. 세척 단계 후, 압타머들을 정제된 압타머-단백질 복합체로부터 용리 버퍼 (1.8 M NaClO4, 40 mM PIPES, pH 6.8, 1 mM EDTA, 0.05% Triton X-100)를 사용하여 용리시켰다. 용리는 1250 rpm으로 비드들을 흔들면서 75 μL의 용리 버퍼를 사용하여 25 °C에서 10분 동안 수행되었다. 70 μL의 용리액을 아카이브 플레이트로 옮기고 자석 위에서 분리시켜 흡인되었을 수 있는 자성 비드들이 분획되게 하였다. 10 μL의 용리된 물질을 검은색 플레이트 절반-영역으로 옮기고, 분석 버퍼에서 1:5 희석시키고, 내부 분석 QC에 따라 모니터되는 Cy3 형광 신호들을 측정하기 위해 사용하였다. 20 μL의 용리된 물질을 5 μL의 혼성화 블록 용액 (올리고 aCGH/ChIP-온-칩 혼성화 키트, 대용량, Agilent Technologies 5188-5380, Agilent 어레이에서 코너 마커 프로브에 상보적인 시아닌 3-라벨된 DNA 서열의 스파이크를 포함)을 함유하는 플레이트로 옮겼다. 이 플레이트를 로봇 데크에서 제거하고 혼성화를 위해 추가 프로세싱하였다 (하기 참조). 나머지 용리액이 있는 아카이브 플레이트를 알루미늄 포일을 사용하여 열-밀봉시키고 -20 °C에서 보관하였다.
혼성화.
25 μL의 2x Agilent 혼성화 버퍼 (올리고 aCGH/ChIP-온-칩 혼성화 키트, Agilent Technologies, 파트 넘버 5188-5380)를 용리된 샘플 및 블록 버퍼를 함유하는 플레이트의 각 웰에 손으로 피펫팅하였다. 이 용액 40 μL를 혼성화 가스켓 슬라이드 (혼성화 가스켓 슬라이드 - 슬라이드 포맷 당 8 마이크로어레이, Agilent Technologies)의 각 “웰”에 손으로 피펫팅하였다. 각 압타머에 상보적인, 어레이 당 10개 프로브들을 내포하는 맞춤형 SurePrint G3 8x60k Agilent 마이크로어레이 슬라이드들을 제조업체의 프로토콜에 따라 가스켓 슬라이드들 위에 놓았다. 각 어셈블리 (혼성화 챔버 키트 - SureHyb 활성화, Agilent Technologies)를 단단하게 고정시키고 55 °C에서 20 rpm으로 회전시키면서 19시간 동안 혼성화 오븐에 로딩하였다.
혼성화 후 세척.
Little Dipper 프로세서 (모델 650C, Scigene)를 사용하여 슬라이드 세척을 수행하였다. 대략 700 mL의 세척 버퍼 1 (올리고 aCGH/ChIP-온-칩 세척 버퍼 1, Agilent Technologies)을 큰 유리 염색 디쉬에 붓고 이를 사용하여 가스켓 슬라이드들로부터 마이크로어레이 슬라이드들을 분리하였다. 분해되면, 슬라이드들을 신속하게 상기 Little Dipper 위 세척 버퍼 1을 함유하는 배치에 있는 슬라이드 랙에 옮겼다. 슬라이드들을 자기 교반 막대로 혼합되는 세척 버퍼 1에서 5분 동안 세척하였다. 그 후 슬라이드 랙을 37 °C 세척 버퍼 2 (올리고 aCGH/ChIP-온-칩 세척 버퍼 2, Agilent Technologies)가 있는 배치로 옮기고 교반하면서 5분 동안 배양시켰다. 두 번째 배치로부터 슬라이드 랙을 서서히 제거한 다음 아세토니트릴을 함유하는 배치로 옮기고 교반하면서 5분 동안 배양하였다.
마이크로어레이 영상화.
마이크로어레이 슬라이드들을 100% PMT 세팅 및 20-비트 옵션 가능인 3 μm 해상도의 시아닌 3-채널에서 마이크로어레이 스캐너 (Agilent G4900DA 마이크로어레이 스캐너 시스템, Agilent Technologies)를 사용하여 영상화하였다. 생성된 tiff 이미지들을 GE1_1200_Jun14 프로토콜의 Agilent 특성 추출 소프트웨어 (버전 10.7.3.1 또는 그 이상)를 사용하여 프로세싱하였다.

Claims (112)

  1. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 소닉 헤지호그 (Sonic Hedgehog, SHH) 단백질 수준, 및 PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  2. 청구항 1에 있어서, 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 PGAM1, SHH 및 PTPN4, SHH 및 TNFSF14, SHH 및 FAM49B, SHH 및 RBP7, SHH 및 IHH, SHH 및 DDX39B, SHH 및 S100A12, SHH 및 PGAM2, SHH 및 C4A.C4B, SHH 및 IL21R, SHH 및 TMEM9 또는 SHH 및 ADAM9를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 SHH, PGAM1 및 TNFSF14; SHH, PGAM1 및 RBB7; SHH, PGAM1 및 PTPN4; SHH, PGAM1 및 DDX39B; SHH, PGAM1 및 FAM49B; SHH, PGAM1 및 IHH; SHH, PGAM1 및 S100A12; SHH, PGAM1 및 ADAM9; SHH, PTPN4 및 RBP7; SHH, PTPN4 및 TNFSF14; SHH, PTPN4 및 IHH; SHH, RBP7 및 FAM49B; SHH, RBP7 및 IHH; SHH, FAM49B 및 TNFSF14; SHH, DDX39B 및 PTPN4; SHH, TNFSF14 및 S100A12; SHH, IHH 및 RBP7; SHH, IHH 및 TNFSF14; SHH RBP7 및 TNFSF14; SHH, RBP7 및 S100A12; SHH, RBP7 및 DDX39B; SHH, TNFSF14 및 DDX39B; SHH, S100A12 및 DDX39B; SHH, FAM49B 및 S100A12; SHH, IHH 및 FAM49B; SHH, IHH 및 DDX39B; SHH, TNFSF14 및 ADAM9; SHH FAM49B 및 DDX39B; SHH, IHH 및 ADAM9; SHH, PGAM1 및 C4A.C4B; SHH, PGAM2 및 RBP7; SHH, PGAM1 및 IL21R; SHH, PGAM2 및 PTPN4; SHH, PGAM2 및 ADAM9, SHH, PGAM2 및 C4A.C4B; SHH, PGAM2 및 IL21R; SHH, IHH 및 PGAM2; SHH, PGAM1 및 PGAM2; SHH, TMEM9 및 PGAM2 또는 SHH, TMEM9 및 PGAM1을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 PGAM1, 그리고 RBP7, TNFSF14, PTPN4, DDX39B, FAM49B, S100A12, IHH, PGAM2, C4A.C4B, IL21R, TMEM9 및 ADAM9에서 선택된 적어도 2개의 단백질들을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 IHH, 그리고 RBP7, TNFSF14, PTPN4, DDX39B, FAM49B, S100A12, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, IL21R, TMEM9 및 ADAM9에서 선택된 적어도 2개의 단백질들을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
  10. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 소닉 헤지호그 (SHH), 및 PGAM1, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, ADAM9, PGAM2, C4A.C4B, IL21R 및 TMEM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  11. 청구항 10에 있어서, 포획 시약들의 세트는 압타머, 항체, 및 압타머와 항체의 조합물에서 선택되는, 방법.
  12. 청구항 10에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 PGAM1, SHH 및 PTPN4, SHH 및 TNFSF14, SHH 및 FAM49B, SHH 및 RBP7, SHH 및 IHH, SHH 및 DDX39B, SHH 및 S100A12, SHH 및 PGAM2, SHH 및 C4A.C4B, SHH 및 IL21R, SHH 및 TMEM9 또는 SHH 및 ADAM9를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 SHH, PGAM1 및 TNFSF14; SHH, PGAM1 및 RBB7; SHH, PGAM1 및 PTPN4; SHH, PGAM1 및 DDX39B; SHH, PGAM1 및 FAM49B; SHH, PGAM1 및 IHH; SHH, PGAM1 및 S100A12; SHH, PGAM1 및 ADAM9; SHH, PTPN4 및 RBP7; SHH, PTPN4 및 TNFSF14; SHH, PTPN4 및 IHH; SHH, RBP7 및 FAM49B; SHH, RBP7 및 IHH; SHH, FAM49B 및 TNFSF14; SHH, DDX39B 및 PTPN4; SHH, TNFSF14 및 S100A12; SHH, IHH 및 RBP7; SHH, IHH 및 TNFSF14; SHH, RBP7 및 TNFSF14; SHH, RBP7 및 S100A12; SHH, RBP7 및 DDX39B; SHH, TNFSF14 및 DDX39B; SHH, S100A12 및 DDX39B; SHH, FAM49B 및 S100A12; SHH, IHH 및 FAM49B; SHH, IHH 및 DDX39B; SHH, TNFSF14 및 ADAM9; SHH FAM49B 및 DDX39B; SHH, IHH 및 ADAM9; SHH, PGAM1 및 C4A.C4B; SHH, PGAM2 및 RBP7; SHH, PGAM1 및 IL21R; SHH, PGAM2 및 PTPN4; SHH, PGAM2 및 ADAM9, SHH, PGAM2 및 C4A.C4B; SHH, PGAM2 및 IL21R; SHH, IHH 및 PGAM2; SHH, PGAM1 및 PGAM2; SHH, TMEM9 및 PGAM2 또는 SHH, TMEM9 및 PGAM1을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 PGAM1, 그리고 RBP7, TNFSF14, PTPN4, DDX39B, FAM49B, S100A12, IHH, 및 ADAM9에서 선택된 적어도 2개의 단백질들을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 청구항 10에 있어서, 상기 방법은 SHH 및 IHH, 그리고 RBP7, TNFSF14, PTPN4, DDX39B, FAM49B, S100A12, PGAM1, 및 ADAM9에서 선택된 적어도 2개의 단백질들을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  17. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
  19. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 대상체의 샘플에서 IHH, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, DDX39B, S100A12, 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  20. 청구항 19에 있어서, 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
  21. 청구항 19에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
  22. 청구항 19에 있어서, 상기 방법은 IHH, RB7 및 PTPN4; IHH, RB7 및 TNFSF14; IHH, RB7 및 FAM49B; IHH, RBP7 및 DDX39B; IHH, RBP7 및 S100A12; IHH, RB7 및 ADAM9; IHH, TNFSF14 및 PTPN4; IHH, TNFSF14 및 FAM49B; IHH, TNFSF14 및 DDX39B; IHH, TNFSF14 및 S100A12; IHH, TNFSF14 및 ADAM9; IHH, FAM49 및 PTPN4; IHH, FAM49 및 TNFSF14; IHH, FAM49 및 DDX39B; IHH, FAM49 및 S100A12; IHH, ADAM9 및 PTPN4 또는 IHH, FAM49 및 ADAM9를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  23. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, SHH 및/또는 PGAM1을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
  25. 청구항 19에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
  26. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 IHH, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, DDX39B, S100A12, 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 단백질을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 사용하여 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  27. 청구항 26에 있어서, 포획 시약들의 세트는 압타머, 항체, 및 압타머와 항체의 조합물에서 선택되는, 방법.
  28. 청구항 26에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법
  29. 청구항 26에 있어서, 상기 방법은 IHH, RB7 및 PTPN4; IHH, RB7 및 TNFSF14; IHH, RB7 및 FAM49B; IHH, RBP7 및 DDX39B; IHH, RBP7 및 S100A12; IHH, RB7 및 ADAM9; IHH, TNFSF14 및 PTPN4; IHH, TNFSF14 및 FAM49B; IHH, TNFSF14 및 DDX39B; IHH, TNFSF14 및 S100A12; IHH, TNFSF14 및 ADAM9; IHH, FAM49 및 PTPN4; IHH, FAM49 및 TNFSF14; IHH, FAM49 및 DDX39B; IHH, FAM49 및 S100A12; 또는 IHH, FAM49 및 ADAM9를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  30. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, SHH 및/또는 PGAM1을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
  32. 청구항 26에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
  33. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 DDX39B 및 S100A12에서 선택된 적어도 1개 단백질 및 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 상기 적어도 1개 단백질 및 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  34. 청구항 33에 있어서, 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
  35. 청구항 33에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
  36. 청구항 33에 있어서, 상기 방법은 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 및 S100A12; 또는 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 및 DDX39B를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  37. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
  38. 청구항 33에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
  39. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 DDX39B 및 S100A12에서 선택된 적어도 1개 단백질 및 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  40. 청구항 39에 있어서, 포획 시약들의 세트는 압타머, 항체, 및 압타머와 항체의 조합물에서 선택되는, 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
  42. 청구항 39에 있어서, 상기 방법은 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 및 S100A12; 또는 RB7, FAM49B, TNFSF14, ADAM9, PGAM1 및 DDX39B를 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  43. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
  44. 청구항 39에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
  45. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 수준 또는 수준들을 사용하여 샘플에 품질 점수를 할당한 다음, 이러한 품질 점수를 사용하여 샘플이 분석 샘플인지 또는 비-분석 샘플인지를 결정하는, 방법.
  46. 전술한 청구항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 수준 또는 수준들을 사용하여 샘플에 품질 점수를 할당한 다음, 이러한 품질 점수를 사용하여 이 샘플을 샘플 내 또 다른 단백질들의 추가 분석을 위해 사용할지 여부를 결정하는, 방법.
  47. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 PGAM1 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  48. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 PGAM2 단백질 수준, 및 SHH, PGAM1, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  49. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 C4A.C4B 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, PGAM1, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  50. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 PTPN4 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PGAM1, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  51. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 TNFSF14 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  52. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 FAM49B 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임
  53. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 RBP7 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  54. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 IHH 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  55. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 DDX39B 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  56. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 S100A12 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  57. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 IL21R 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, DDX39B, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  58. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 TMEM9 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, IL21R, DDX39B 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  59. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 ADAM9 단백질 수준, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, PGAM1, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, IL21R, TMEM9 및 DDX39B로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  60. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 소닉 헤지호그 (SHH) 단백질, 및 PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  61. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 PGAM1 단백질, 및 SHH, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  62. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 PGAM2 단백질, 및 SHH, PGAM1, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  63. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 C4A.C4B 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  64. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 PTPN4 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  65. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 TNFSF14 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  66. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 FAM49B 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  67. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 RBP7 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  68. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 IHH 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  69. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 DDX39B 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  70. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 S100A12 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  71. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 IL21R 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  72. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 TMEM9 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  73. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 포획 시약들의 세트와 접촉시키는 단계, 이 때 각 포획 시약은 ADAM9 단백질, 및 SHH, PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R 및 TMEM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질의 수준을 포함하는 단백질 세트의 서로 다른 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 포획 시약들의 세트를 기준으로, 단백질 세트의 각 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  74. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 소닉 헤지호그 (Sonic Hedgehog, SHH) 단백질 수준, 및 PGAM1, PGAM2, C4A.C4B, PTPN4, TNFSF14, FAM49B, RBP7, IHH, DDX39B, S100A12, IL21R, TMEM9 및 ADAM9로 구성된 그룹에서 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 수준 및 상기 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  75. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 2개 포획 시약과 접촉시키는 단계, 이 때 하나의 포획 시약은 SHH 단백질에 대한 친화성을 가지고 제 2 포획 시약은 IHH 단백질에 대한 친화성을 가지며; 및
    b) 상기 2개 포획 시약을 사용하여 각 단백질 수준을 측정하는 단계.
  76. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 SHH 및 IHH 수준을 측정하는 단계; 및
    b) SHH 및 IHH 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  77. 청구항 75 또는 76에 있어서, RBP7 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 RBP7 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  78. 청구항 75 또는 76에 있어서, FAM94B 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 FAM94B 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  79. 청구항 75 또는 76에 있어서, TNFSF14 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 TNFSF14 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  80. 청구항 75 또는 76에 있어서, ADAM9 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 ADAM9 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  81. 청구항 75 또는 76에 있어서, S100A12 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 S100A12 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  82. 청구항 75 또는 76에 있어서, DDX39B 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 DDX39B 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  83. 청구항 75 또는 76에 있어서, PGAM1 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  84. 청구항 75 또는 76에 있어서, PTPN4 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PTPN4 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  85. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 4개 포획 시약과 접촉시키는 단계, 이 때 4개 포획 시약 각각은 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4에서 선택된 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 상기 4개 포획 시약을 사용하여 각 단백질 수준을 측정하는 단계.
  86. 청구항 85에 있어서, SHH 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 SHH 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  87. 청구항 85에 있어서, PGAM1 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  88. 청구항 85에 있어서, TMEM9, C4A.C4B, PGAM2, FAM49B, TNFSF14, S100A12, DDX39B 및 IL21R에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 포획 시약들을 사용하여 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 각 포획 시약은 이러한 하나 이상의 단백질 중 하나에 대한 친화성을 가지는, 방법.
  89. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 샘플의 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  90. 청구항 89에 있어서, SHH 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 SHH 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  91. 청구항 89에 있어서, PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 PGAM1 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  92. 청구항 89에 있어서, TMEM9, C4A.C4B, PGAM2, FAM49B, TNFSF14, S100A12, DDX39B 및 IL21R에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 단계 및 이러한 하나 이상의 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  93. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플을 4개 포획 시약과 접촉시키는 단계, 이 때 4개 포획 시약 각각은 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4에서 선택된 단백질에 대하여 친화성을 가지며; 및
    b) 상기 4개 포획 시약을 사용하여 샘플에서 각 단백질 수준을 측정하는 단계.
  94. 청구항 93에 있어서, SHH 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 SHH 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  95. 청구항 93에 있어서, PGAM1 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  96. 청구항 93에 있어서, TMEM9 단백질에 대한 친화성을 가지는 포획 시약을 사용하여 TMEM9 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  97. 청구항 93에 있어서, C4A.C4B, PGAM2, FAM49B, TNFSF14, S100A12, DDX39B 및 IL21R에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 포획 시약들을 사용하여 측정하는 단계를 추가로 포함하고, 각 포획 시약은 이러한 하나 이상의 단백질 중 하나에 대한 친화성을 가지는, 방법.
  98. 청구항 93에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
  99. 청구항 93에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
  100. 청구항 93에 있어서, 단백질 수준을 사용하여, 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하며, 이 때 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플인, 방법.
  101. 청구항 99에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
  102. 청구항 93에 있어서, 포획 시약은 압타머 또는 항체에서 선택되는, 방법.
  103. 다음 단계를 포함하는 방법:
    a) 인간 대상체의 샘플에서 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
    b) 샘플의 IHH, RBP7, ADAM9 및 PTPN4 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계;
    이 때, 분석 샘플은 단백질 바이오마커 발견 분석, 단백질 발현 수준 분석, 진단 방법 또는 예후 방법 중 하나 이상에서 사용되는 샘플이고, 음성 샘플은 분석 샘플로서 사용되지 않는 샘플임.
  104. 청구항 103에 있어서, SHH 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 SHH 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  105. 청구항 103에 있어서, PGAM1 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 PGAM1 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  106. 청구항 103에 있어서, TMEM9 단백질 수준을 측정하는 단계 및 샘플의 TMEM9 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  107. 청구항 103에 있어서, C4A.C4B, PGAM2, FAM49B, TNFSF14, S100A12, DDX39B 및 IL21R에서 선택된 하나 이상의 단백질 수준을 측정하는 단계 및 이러한 하나 이상의 단백질 수준을 기준으로 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  108. 청구항 103에 있어서, 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택되는, 방법.
  109. 청구항 103에 있어서, 단백질 수준은 인간 대상체로부터의 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간 길이 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간 길이를 예측하는데 사용되는, 방법.
  110. 청구항 109에 있어서, 샘플 수집과 샘플 원심분리 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과이고, 및/또는 샘플 원심분리와 샘플 디캔팅 사이의 시간은 약 0 시간 내지 0.5 시간; 0.5 시간 내지 1.5 시간; 1.5 시간 내지 3 시간; 3 시간 내지 9 시간; 9 시간 내지 24 시간 또는 24 시간 초과인, 방법.
  111. 청구항 103에 있어서, 단백질 수준의 측정 단계는 질량 분석법, 압타머 기반 분석법 및/또는 항체 기반 분석법을 사용하여 수행되는, 방법.
  112. 청구항 103에 있어서, 의사결정 트리; 배깅+부스팅+포레스트 (bagging+boosting+forests); 규칙 추론 기반 학습; 파젠 창 (Parzen Windows); 선형 모델; 로지스틱; 신경망 법; 비지도 군집분석 (unsupervised clustering); K-평균; 계층적 오름차순/내림차순 (hierarchical ascending/descending); 반-지도 학습; 프로토타입법; 최근접 이웃; 커널 밀도 추정; 서포트 벡터 머신; 은닉 마르코프 모델; 볼쯔만 학습; 랜덤 포레스트 모델에서 선택된 분류기에서 단백질 수준을 사용하여, 샘플을 분석 샘플 또는 음성 샘플로 식별하는, 방법.
KR1020217015976A 2018-10-30 2019-10-28 샘플 품질 평가 방법 KR20210089178A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862752947P 2018-10-30 2018-10-30
US62/752,947 2018-10-30
PCT/US2019/058302 WO2020092211A1 (en) 2018-10-30 2019-10-28 Methods for sample quality assessment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210089178A true KR20210089178A (ko) 2021-07-15

Family

ID=70464670

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217015976A KR20210089178A (ko) 2018-10-30 2019-10-28 샘플 품질 평가 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210311071A1 (ko)
EP (1) EP3874043A4 (ko)
JP (1) JP7467447B2 (ko)
KR (1) KR20210089178A (ko)
CN (1) CN113167782A (ko)
AU (1) AU2019371238A1 (ko)
CA (1) CA3116768A1 (ko)
IL (1) IL282501A (ko)
SG (1) SG11202103884UA (ko)
WO (1) WO2020092211A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023141248A1 (en) * 2022-01-21 2023-07-27 Somalogic Operating Co., Inc. Methods for sample quality assessment
WO2023211769A1 (en) * 2022-04-24 2023-11-02 Somalogic Operating Co., Inc. Methods for sample quality assessment
WO2023211773A1 (en) * 2022-04-24 2023-11-02 Somalogic Operating Co., Inc. Methods for sample quality assessment
WO2023211771A1 (en) * 2022-04-24 2023-11-02 Somalogic Operating Co., Inc. Methods for sample quality assessment
WO2023211770A1 (en) * 2022-04-24 2023-11-02 Somalogic Operating Co., Inc. Methods for sample quality assessment
WO2024015486A1 (en) * 2022-07-14 2024-01-18 Somalogic Operating Co., Inc. Methods for sample quality assessment

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2439854A1 (en) * 2001-03-01 2002-09-12 Epigenomics Ag Method for the development of gene panels for diagnostic and therapeutic purposes based on the expression and methylatoin status of the genes
DE602004018927D1 (de) * 2003-06-18 2009-02-26 Genelux Corp Modifizierte rekombinante vacciniaviren, verwendungen davon
EP2269060B1 (en) * 2008-03-10 2016-08-17 Lineagen, Inc. Copd biomarker signatures
US20130116150A1 (en) * 2010-07-09 2013-05-09 Somalogic, Inc. Lung Cancer Biomarkers and Uses Thereof
WO2012170669A1 (en) 2011-06-07 2012-12-13 Yale University Avenue Biomarkers for assessment of the molecular quality in biospecimens
WO2013063139A1 (en) * 2011-10-24 2013-05-02 Somalogic, Inc. Selection of preferred sample handling and processing protocol for identification of disease biomarkers and sample quality assessment
US20170335395A1 (en) 2014-10-27 2017-11-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A parkinson's disease diagnostic biomarker panel
EP3347720A1 (en) 2015-09-09 2018-07-18 Somalogic, Inc. Methods for developing personalized drug treatment plans and targeted drug development based on proteomic profiles
JP7026625B2 (ja) 2015-11-04 2022-02-28 メタボロン，インコーポレイテッド サンプルの質の自動評価

Also Published As

Publication number Publication date
SG11202103884UA (en) 2021-05-28
EP3874043A4 (en) 2022-10-26
CN113167782A (zh) 2021-07-23
CA3116768A1 (en) 2020-05-07
AU2019371238A1 (en) 2021-06-03
EP3874043A1 (en) 2021-09-08
JP2022512890A (ja) 2022-02-07
WO2020092211A1 (en) 2020-05-07
IL282501A (en) 2021-06-30
US20210311071A1 (en) 2021-10-07
JP7467447B2 (ja) 2024-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7467447B2 (ja) 試料の品質評価方法
CN106714556B (zh) 用于测定自闭症谱系病症风险的方法和系统
US20130103321A1 (en) Selection of Preferred Sample Handling and Processing Protocol for Identification of Disease Biomarkers and Sample Quality Assessment
Dayon et al. Proteomics of human biological fluids for biomarker discoveries: technical advances and recent applications
Zhang et al. Fast and efficient measurement of clinical and biological samples using immunoassay-based multiplexing systems
Lamont et al. Commentary on a combined approach to the problem of developing biomarkers for the prediction of spontaneous preterm labor that leads to preterm birth
Piggott et al. Analytical evaluation of four faecal immunochemistry tests for haemoglobin
Wagner et al. Prenatal maternal biomarkers for the early diagnosis of congenital malformations: A review
Mittag et al. Recent advances in cytometry applications: preclinical, clinical, and cell biology
Chao et al. Towards proteome standards: the use of absolute quantitation in high-throughput biomarker discovery
Mizuno et al. Evaluation of red blood cell parameters provided by the UF-5000 urine auto-analyzer in patients with glomerulonephritis
EP3315594B1 (en) Inspection system
AU2011215826B2 (en) Compositions and methods for predicting cardiovascular events
Silman Rapid diagnosis of sepsis using biomarker signatures
Midde et al. Evaluation of single molecule array digital immunoassay technology to quantitate neurofilament light chain
Ungerer et al. A fit-for-purpose approach to analytical sensitivity applied to a cardiac troponin assay: time to escape the ‘highly-sensitive’trap
Gomase et al. Cytomics
CN115976221B (zh) 一种用于bcr或tcr重排定量检测的内掺参考物及其制备方法和应用
Lee et al. In Vitro Cancer Diagnostics
WO2020158260A1 (ja) 心房性不整脈検査方法及び心房性不整脈検査システム
Chen et al. Development of toluidine red particle agglutination-based turbidimetric immunoassay for anticardiolipin antibody detection in syphilis
WO2023283265A2 (en) All-electronic analysis of biochemical samples
Laterza et al. Biomarker discovery
KR20210044711A (ko) 응고 검사 결과 분석 장치 및 방법
CN117925807A (zh) Uhrf2基因在早发性卵巢功能不全的诊断中的应用