KR20210082477A - 태그 없이 인코딩된 화학적 라이브러리 스크리닝을 위한 마이크로비드 - Google Patents

태그 없이 인코딩된 화학적 라이브러리 스크리닝을 위한 마이크로비드 Download PDF

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KR20210082477A
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데이비드 휴 윌리암스
스튜어트 로버트 우드
니콜라 톰슨
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Abstract

본 발명에는, 인코딩된 화학적 라이브러리 마이크로비드로서, 마이크로비드가 그 위에 및/또는 그 안에 고정된 (i) 인코딩 태그; 및 (ii) 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 갖고, 리포터 모이어티가 표적에 대한 활성의 부재 하에 제1 상태로 존재하고 상기 활성의 존재 하에 제2 상태로 존재하며, 상기 마이크로비드가 그에 방출 가능하게 연결되고 상기 태그에 의해 인코딩된 하나 이상의 화학 구조물(들)의 클론 집단을 추가로 포함하는 것인 인코딩된 화학적 라이브러리 마이크로비드가 개시된다.

Description

태그 없이 인코딩된 화학적 라이브러리 스크리닝을 위한 마이크로비드
본 발명은 마이크로비드(microbead) 및 이를 함유하는 마이크로컴파트먼트(microcompartment)(예컨대, 마이크로액적)에 관한 것이며, 그리고 그에 기초한 인코딩된 화학적 라이브러리에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인코딩된 라이브러리를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
약물 발견은 전형적으로 화학적 화합물의 대규모 라이브러리를 조립한 다음 검정 또는 스크리닝하는 것을 수반하며, 화합물은 표적에 대해 원하는 활성(예컨대, 효소 활성 또는 라벨의 변위)을 표시하는 "히트(hit)"을 확인하기 위해 표적을 함유하는 마이크로웰에 개별적으로 첨가된다. 이 과정은 고처리량 스크리닝(HTS)으로 공지되어 있다. 그것은 수백만 개의 화학물질을 시험하기 위해 로봇 장비를 사용하여 자동화될 수 있지만, 힘들고 비용이 많이 든다.
따라서, 라이브러리 크기가 증가하면 스크리닝 부담이 증가한다는 사실에서 비롯되는 근본적인 문제: 스크리닝 검정의 이산 특성으로 인해 스크리닝 시간 및 비용이 라이브러리 크기에 거의 선형적으로 비례한다는 점이 있다. 이는 이러한 접근법을 이용하여 스크리닝할 수 있는 화학적 라이브러리의 크기에 심각한 실제 제약을 부과하였다: HTS는 전형적으로 103-106개의 구성원을 함유하는 라이브러리에 적용된다.
이 문제는 선별에 기반한 스크리닝 기술(예컨대, 패닝 기술)의 개발로 해결되었다. 여기에서 라이브러리의 모든 화합물은 단일 포트 포맷으로 관심 표적과 상호 작용하는 능력에 대해 동시에 시험된다. 이러한 검정에서, 스크리닝 단계의 시간 및 비용이 라이브러리 크기와 무관하므로, 그 검정이 비교적 큰 라이브러리에 적용될 수 있다. 최대 1012개의 구성원을 함유하는 라이브러리가 이러한 접근법을 이용하여 스크리닝되었다.
또한, 그 문제는 처리량을 수십배의 크기까지 증가시키기 위해 마이크로유체 기술로 처리될 수 있는 마이크로액적 기반 라이브러리의 개발에 의해 해결되었다(예컨대, 문헌(Clausell-Tormos et al. (2008) Chemistry & Biology 15: 427-437) 참조).
그러나, 선별 기반 검정 및 마이크로액적 기반 스크리닝 둘 다는 선택된 화학적 화합물의 정체(즉, "히트")가 쉽게 결정될 수 있어야 한다는 점을 요구한다: 스크리닝 가능하지만 디코딩 가능하지 않은 라이브러리는 유용하지 않다.
이 문제에 대한 해결책은 브레너(Brenner) 및 러너(Lerner)(Brenner and Lerner (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 5381-5383)에 의해 1992년에 처음 제안되었으며, DNA 인코딩된 화학적 라이브러리(DECL)의 생성을 기반으로 한다. DECL에서, 각각의 화합물은 그의 구조 또는 반응 이력에 상응하여 특정 화합물의 고유 식별자 역할을 하는 DNA 서열과 연결(태그부착)된다(즉, DNA 태그는 그 화합물을 "인코딩"하여 분자 "바코드"로서 작용을 한다).
화합물은 다양한 상이한 방식으로 태그부착될 수 있으며, 이는 또한 특정 화학 구조물을 인코딩하는 데 DNA 태그를 사용할 뿐만 아니라("DNA 기록") 그 화학 구조물의 합성을 지시하는 템플릿으로서 DNA 태그를 사용할 수 있다("DNA 템플레이팅"). 이 기술은 최근에 문헌(Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47: 12747-12753; Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12): 5707-5717; and Mullard (2016) Nature 530: 367-369)에서 검토되었다.
DECL 기술은 현재 제약 산업에서 널리 확립되었다; 2007년 GSK는 DECL을 개척한 회사 중 하나인 프래시스 파마슈티칼스(Praecis Pharmaceuticals)를 5,500만 US 달러에 인수하였으며, 반면에 다른 상위 10개 제약 회사는 자체 회사내 DNA 인코딩 라이브러리 프로그램을 시작하였다. X-켐(X-Chem), 비퍼겐(Vipergen), 앙상블 쎄라피틱스(Ensemble Therapeutics) 및 필로켐(Philochem)을 포함한 다른 생명공학 회사들도 DECL 기술을 적극적으로 개발 및 개척하고 있다.
그러나, 현재 DECL의 유용성은 태그의 존재 및 결합 활성을 통해서만 발생하는 히트 평가의 성질과 관련된 문제로 인해 제한된다. 예컨대, 인코딩 태그는 (a) 태그부착된 화합물이 관심 표적의 분자 결합 부위에 접근하는 것을 화학적으로 또는 입체적으로 방해할 수 있어 회수되는 히트의 수 및/또는 유형을 제한하고; (b) 세포 투과성 및/또는 확산을 제한할 수 있어 효과적으로 세포 흡수를 방해하며 세포질에 대한 접근에 의존하는 세포 기반 표현형 스크린의 사용을 배제하고; (c) 화학적 화합물이 태그부착 후 화학적으로 변형될 수 있는 범위를 제한할 수 있으며(특정 반응은 태그와 화학적으로 비상용성임); 그리고 (d) 구조-활성 분석의 유용성을 제한할 수 있는데, 이는 그러한 분석이 활성에 미치는 태그 자체의 잠재적인 영향 및 기능적(예컨대, 효소) 활성보다는 표적 결합만 검출된다는 사실에 의해 교란되기 때문이다.
따라서, 디코딩 가능한 화학적 라이브러리의 스크리닝을 허용하고 전술된 문제를 해결하는 HTS 기술이 필요하다.
발명의 개요
본 발명의 제1 측면에 따르면, 인코딩된 화학적 라이브러리 마이크로비드로서, 마이크로비드가 그 위에 및/또는 그 안에 고정된 (i) 인코딩 태그; 및 (ii) 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 갖고, 리포터 모이어티가 표적에 대한 활성의 부재 하에 제1 상태로 존재하고 상기 활성의 존재 하에 제2 상태로 존재하며, 상기 마이크로비드가 그에 방출 가능하게 연결되고 상기 태그에 의해 인코딩된 하나 이상의 화학 구조물(들)의 클론 집단을 추가로 포함하는 것인 마이크로비드가 제공된다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, 본 발명의 마이크로비드 및 수성 용매를 함유하는 화학적 라이브러리 마이크로컴파트먼트가 제공된다.
본 발명의 제3 측면에 따르면, 본 발명의 복수의 마이크로컴파트먼트를 포함하는 인코딩된 화학적 라이브러리(ECL)로서, 각각의 마이크로컴파트먼트는 상이한 화학 구조물을 함유하는 것인 인코딩된 화학적 라이브러리(ECL)가 제공된다.
본 발명의 제4 측면에 따르면, 표적에 대해 활성을 갖는 화학 구조물에 대해 본 발명의 ECL을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 상기 ECL을 제공하는 단계;
(b) 마이크로비드로부터 화학 구조물을 방출하여, 각각의 태그 없는 화학 구조물(tagless chemical structure: TCS)과 그의 인코딩 태그 사이의 공간적 회합이 유지되도록, 용매 중에 용해되며 그리고 그 화학 구조물이 방출된 마이크로비드와 함께 마이크로컴파트먼트 내에 함유되는 복수의 유리된 TCS를 생성하는 단계;
(c) 단계 (b)의 ECL 마이크로컴파트먼트를 그 안에 함유된 마이크로비드 안에 또는 그 위에 고정된 리포터 모이어티의 상태가 표적에 대한 활성 수준에 의해 결정되는 조건 하에서 인큐베이션함으로써 TSC를 검정하는 단계;
(d) 마이크로컴파트먼트를 개방하여 검정된 마이크로비드를 방출하는 단계; 및
(e) 리포터 모이어티의 상태를 결정함으로써 방출된 마이크로비드를 스크리닝하는 단계로서, 이로써 표적에 대해 활성을 갖는 화학 구조물이 제2 상태의 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 단계
를 포함하는 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면, 바람직한 특색 및 특색의 바람직한 실효성 있는 조합은 하기에 제시된 번호의 단락에서 정의되고 설명된다.
1. 인코딩된 화학적 라이브러리 마이크로비드로서, 마이크로비드가 그 위에 및/또는 그 안에 고정된 (i) 인코딩 태그; 및 (ii) 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 갖고, 리포터 모이어티가 표적에 대한 활성의 부재 하에 제1 상태로 존재하고 상기 활성의 존재 하에 제2 상태로 존재하며, 상기 마이크로비드가 그에 방출 가능하게 연결되고 상기 태그에 의해 인코딩된 하나 이상의 화학 구조물(들)의 클론 집단을 추가로 포함하는 것인 마이크로비드.
2. 단락 1에 있어서, 상기 인코딩 태그가 또한 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 인코딩하는 것인 마이크로비드.
3. 단락 1 또는 단락 2에 있어서, 상기 인코딩 태그가 또한 표적을 인코딩하는 것인 마이크로비드.
4. 단락 1 내지 단락 3 중 어느 한 단락에 있어서, 화학 구조물이 1 내지 1013개 분자/마이크로비드의 로딩으로 존재하는 것인 마이크로비드.
5. 단락 1 내지 단락 4 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 마이크로비드가 복수의 화학 구조물의 클론 집단을 포함하고, 임의적으로 상기 인코딩 태그가 또한 화학 구조물의 로딩을 인코딩하는 것인 마이크로비드.
6. 단락 1 내지 단락 5 중 어느 한 단락에 있어서, 마이크로비드가 그 위에 또는 그 안에 고정된 복수의 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 갖고, 임의적으로 상기 인코딩 태그가 또한 리포터 모이어티의 로딩을 인코딩하는 것인 마이크로비드.
7. 단락 6에 있어서, 제1 상태 대 제2 상태의 리포터 모이어티의 비율이 표적에 대한 활성 수준과 서로 관련되는 것인 마이크로비드.
8. 단락 1 내지 단락 7 중 어느 한 단락에 있어서, 마이크로비드가 실질적으로 구형인 마이크로비드.
9. 단락 8에 있어서, 마이크로비드가 최대 400 μm의 직경을 갖는 것인 마이크로비드.
10. 단락 8에 있어서, 마이크로비드가 1-100 μm의 직경을 갖는 것인 마이크로비드.
11. 단락 8에 있어서, 마이크로비드가 < 50 μm의 직경을 갖는 것인 마이크로비드.
12. 단락 1 내지 단락 11 중 어느 한 단락에 있어서, 마이크로비드가 히드로겔 또는 중합체로 형성되는 것인 마이크로비드.
13. 단락 12에 있어서, 마이크로비드가 고체, 예컨대 실리콘, 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌 및 디비닐벤젠, 또는 히드로겔, 예컨대 아가로스, 알기네이트, 폴리아크릴아미드 및 폴리락트산으로부터 선택된 히드로겔로 형성되는 것인 마이크로비드.
14. 단락 1 내지 단락 13 중 어느 한 단락에 있어서, 인코딩 태그가 핵산을 포함하는 것인 마이크로비드.
15. 단락 14에 있어서, 핵산이 DNA인 마이크로비드.
16. 단락 1 내지 단락 14 중 어느 한 단락에 있어서, 마이크로비드가 비-DNA 태그, 비-RNA 태그, 변형된 핵산 태그, 펩티드 태그, 광 기반 바코드(예컨대, 양자점), RFID 태그, 클릭 화학에 의해 연결된 리포터 화학물질 및 질량 분광측정 디코딩 가능 태그를 포함하는 것인 마이크로비드.
17. 단락 1 내지 단락 16 중 어느 한 단락에 있어서, 화학 구조물이 소분자인 마이크로비드.
18. 단락 1 내지 단락 17 중 어느 한 단락에 있어서, 화학 구조물이 절단 가능한 링커에 의해 마이크로비드에 방출 가능하게 연결되는 것인 마이크로비드.
19. 단락 18에 있어서, 화학 구조물(들)이 링커 잔기가 전혀 또는 실질적으로 없는 형태로 마이크로비드로부터 절단될 수 있도록, 링커가 자국 없는(scarless) 것인 마이크로비드.
20. 단락 18 또는 단락 19에 있어서, 절단 가능한 링커가 효소적으로 절단 가능한 링커; 화학적으로 절단 가능한 링커; 광 절단 가능한 링커; 및 전술된 것 중 2개 이상의 조합으로부터 선택된 링커를 포함하는 것인 마이크로비드.
21. 단락 18 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 절단 가능한 링커가 친핵체/염기 민감성 링커; 환원 민감성 링커; UV 민감성 링커; 친전자체/산 민감성 링커; 금속 보조된 절단 민감성 링커; 산화 민감성 링커; 및 전술된 것 중 2 이상의 조합으로부터 선택되는 것인 마이크로비드.
22. 단락 18 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 절단 가능한 링커가 효소적으로 절단 가능한 링커, 예컨대 프로테아제(엔테로키나제 포함), 뉴클레아제, 니트로리덕타제, 포스파타제, β-글루쿠로니다제, 리소솜 효소, TEV, 트립신, 트롬빈, 카텝신 B, B 및 K, 카스파제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 포스포디에스테라제, 포스포리피다제, 에스테라제, 리덕타제 및 β-갈락토시다제로부터 선택된 효소에 의해 절단 가능한 것인 마이크로비드.
23. 단락 18 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 절단 가능한 링커가 RNA를 포함하고, 화학 구조물이 RNase와의 접촉에 의해 방출될 수 있는 것인 마이크로비드.
24. 단락 18 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 절단 가능한 링커가 펩티드를 포함하고, 화학 구조물이 펩티다제와의 접촉에 의해 방출될 수 있는 것인 마이크로비드.
25. 단락 18 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 절단 가능한 링커가 DNA를 포함하고, 화학 구조물이 부위 특이적 엔도뉴클레아제와의 접촉에 의해 방출될 수 있는 것인 마이크로비드.
26. 단락 18 내지 단락 20 중 어느 한 단락에 있어서, 절단 가능한 링커가 절단 모이어티 및 자가 희생 모이어티(self-immolative moiety: SIM)를 포함하는 자가 희생 링커이고, 임의적으로 절단 모이어티가 펩티드 또는 비-펩티드의 효소적으로 절단 가능한 모이어티, 예컨대 Val-Cit-PAB인 마이크로비드.
27. 단락 1 내지 단락 26 중 어느 한 단락에 있어서, 화학 구조물이 마이크로비드에 간접적으로 또는 직접적으로 연결되는 것인 마이크로비드.
28. 단락 27에 있어서, 화학 구조물이 마이크로비드에 인코딩 태그를 통해 간접적으로 연결되는 것인 마이크로비드.
29. 단락 28에 있어서, 화학 구조물이 인코딩 태그에 핵산 하이브리드화에 의해 연결되는 것인 마이크로비드.
30. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 효소, 임의적으로 포유동물(예컨대, 인간), 박테리아 또는 바이러스 효소, 예컨대 프로테아제; 키나제; 데히드로게나제; 및 포스파타제로부터 선택된 효소인 마이크로비드.
31. 단락 30에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 효소의 기질, 억제제, 활성제 또는 샤페론; 또는 (b) 효소 또는 그의 단편인 마이크로비드.
32. 단락 31에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 효소의 촉매 부위; 및/또는 (b) 효소의 알로스테릭 부위를 포함하는 것인 마이크로비드.
33. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 단백질, 예컨대 포유동물(예컨대, 인간), 박테리아 또는 바이러스 단백질인 마이크로비드.
34. 단락 33에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 단백질의 결합 파트너; 또는 (b) 단백질 또는 그의 단편인 마이크로비드.
35. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 수용체, 예컨대 포유동물(예컨대, 인간), 박테리아 또는 바이러스 단백질인 마이크로비드.
36. 단락 35에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 수용체의 리간드; 또는 (b) 수용체 또는 그의 단편인 마이크로비드.
37. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 수용체 리간드인 마이크로비드.
38. 단락 37에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 수용체 리간드 또는 그의 단편; 또는 (b) 수용체 또는 그의 단편인 마이크로비드.
39. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 효소 기질인 마이크로비드.
40. 단락 39에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 효소 기질; 또는 (b) 효소 또는 그의 단편인 마이크로비드.
41. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 분자 샤페론인 마이크로비드.
42. 단락 41에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 샤페론 또는 그의 단편; 또는 (b) 샤페론화된(chaperoned) 분자, 예컨대 샤페론 결합 펩티드인 마이크로비드.
43. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 독소인 마이크로비드.
44. 단락 43에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 독소 또는 그의 단편; 또는 (b) 독소의 결합 파트너인 마이크로비드.
45. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적이 약물인 마이크로비드.
46. 단락 45에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 약물 또는 그의 단편; 또는 (b) 약물의 결합 파트너인 마이크로비드.
47. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 턴 오버(turn over)되고, 촉매 활성을 갖는 화학 구조물이 턴 오버 상태의 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
48. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 형광성이고, ??칭 활성을 갖는 화학 구조물이 ??칭된 상태의 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
49. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 비형광 기질이고, 형광단 코팅으로서 기능하는 화학 구조물이 형광 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
50. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 기질이고, 발색단 코팅으로서 기능하는 화학 구조물이 크로매틱 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
51. 단락 1 내지 단락 29 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 기질이고, 기질 코팅으로서 기능하는 화학 구조물이 코팅된 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
52. 단락 1 내지 단락 51 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티의 제1 및 제2 상태가 (a) 형광, 예컨대 ??칭 또는 비??칭된 형광; 및/또는 (b) 절단 또는 비절단된 입체형태; 및/또는 (c) 인산화 또는 비인산화된 상태; (d) 상이한 글리코실화 유형, 패턴 또는 정도; 및/또는 (e) 상이한 항원성 결정인자; 및/또는 (f) 리간드에 대한 결합 또는 비결합; 및/또는 (g) 하나 이상의 추가의 검정 시스템 성분과의 복합화 또는 비복합화에 의해 구별되는 것인 마이크로비드.
53. 단락 1 내지 단락 52 중 어느 한 단락에서 정의된 마이크로비드 및 용매, 예컨대 수성 용매를 함유하는 화학적 라이브러리 마이크로컴파트먼트.
54. 단락 53에 있어서, 화학 구조물(들)을 마이크로비드로부터 용액으로 방출시키기 위한 절단제를 추가로 함유하고, 임의적으로 절단제가 효소, 예컨대 프로테아제(엔테로키나제 포함), 뉴클레아제, 니트로리덕타제, 포스파타제, β-글루쿠로니다제, 리소솜 효소, TEV, 트립신, 트롬빈, 카텝신 B, B 및 K, 카스파제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 포스포디에스테라제, 포스포리피다제, 에스테라제 및 β-갈락토시다제로부터 선택된 효소인 마이크로컴파트먼트.
55. 단락 53 또는 단락 54에 있어서, 임의적으로 계면활성제 안정화된 계면을 갖는 유중수 에멀젼의 마이크로액적인, 마이크로액적, 마이크로입자 또는 마이크로소포의 형태인 마이크로컴파트먼트.
56. 단락 53 내지 단락 55 중 어느 한 단락에 있어서, 화학 구조물이 적어도: 0.1 nM, 0.5 nM, 1.0 nM, 5.0 nM, 10.0 nM, 15.0 nM, 20.0 nM, 30.0 nM, 50.0 nM, 75.0 nM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 5.0 μM, 10.0 μM, 15.0 μM, 20.0 μM, 30.0 μM, 50.0 μM, 75.0 μM, 100.0 μM, 200.0 μM, 300.0 μM, 500.0 μM, 1 mM, 2 mM, 5 mM 또는 10 mM의 농도로 존재하는 것인 마이크로컴파트먼트.
57. 단락 53 내지 단락 56 중 어느 한 단락에 있어서, 실질적으로 구형인 마이크로컴파트먼트.
58. 단락 57에 있어서, 1 내지 500 μm, 임의적으로 < 100 μm 미만의 직경을 갖는 마이크로컴파트먼트.
59. 단락 53 내지 단락 58 중 어느 한 단락에 있어서, 화학 구조물(들)이 마이크로비드로부터 방출되어, 용매 중에 용해되며 그리고 인코딩 태그와 공간적으로 회합되는 유리된 태그 없는 화학 구조물(들)(TCS)을 생성하는 것인 마이크로컴파트먼트.
60. 단락 53 내지 단락 59 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 표적 검정 시스템의 하나 이상의 추가 성분(들)을 추가로 함유하는 마이크로컴파트먼트.
61. 단락 60에 있어서, 추가 성분이 항체를 포함하는 것인 마이크로컴파트먼트.
62. 단락 61에 있어서, 항체가 리포터 모이어티의 제1 상태 또는 제2 상태에 특이적으로 결합하는 것인 마이크로컴파트먼트.
63. 단락 61 또는 단락 62에 있어서, 항체가 자기 비드 또는 검출 가능한 라벨, 임의적으로 형광 라벨에 부착되는 것인 마이크로컴파트먼트.
64. 단락 60 내지 단락 63 중 어느 한 단락에 있어서, 추가 성분이, 임의적으로 라벨링된 형태로, 단락 30, 단락 34, 단락 37, 단락 40, 단락 43, 단락 46 및 단락 49 중 어느 한 단락에 정의된 것으로부터 선택된 표적을 포함하는 것인 마이크로컴파트먼트.
65. 단락 64에 있어서,
(a) 추가 성분이, 임의적으로 라벨링된 형태로, 단락 30, 단락 34, 단락 37, 단락 40, 단락 43, 단락 46 및 단락 49 중 어느 한 단락에서 정의된 것으로부터 선택된 표적을 포함하고;
(b) 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 각각 단락 31 내지 33, 단락 35 내지 36, 단락 38 내지 49, 단락 41 내지 42, 단락 44 내지 45, 단락 47 내지 48, 및 단락 50 내지 51 중 어느 한 단락에서 정의된 것으로부터 선택되는 것인 마이크로컴파트먼트.
66. 단락 53 내지 단락 65 중 어느 한 단락에 있어서, 용매 중에 용해되며 그리고 마이크로비드 안에 또는 그 위에 고정된 제2 태그에 의해 인코딩되는 추가 모이어티를 추가로 함유하는 마이크로컴파트먼트.
67. 단락 66에 있어서, 단락 1 내지 52 중 어느 한 단락에서 정의된 마이크로비드를 상기 추가 모이어티 및 제2 인코딩 태그로 공동 캡슐화한 후 제2 태그를 마이크로비드 위에 또는 그 안에 고정함으로써 수득 가능하거나 수득되는 마이크로컴파트먼트.
68. 단락 67에 있어서, 인코딩 태그가 DNA 태그이고, 제2 인코딩 태그가 공동 캡슐화 후 화학 구조물을 인코딩하는 태그에 리게이션되는 것인 마이크로컴파트먼트.
69. 단락 53 내지 단락 68 중 어느 한 단락에서 정의된 복수의 마이크로컴파트먼트를 포함하는 인코딩된 화학적 라이브러리(ECL)로서, 각각의 마이크로컴파트먼트는 상이한 화학 구조물을 함유하는 것인 인코딩된 화학적 라이브러리(ECL).
70. 단락 69에 있어서, 화학 구조물의 n개의 상이한 클론 집단을 포함하고, 각각의 클론 집단이 n개의 개별 라이브러리 마이크로컴파트먼트로 제한되는 것인 ECL.
71. 단락 70에 있어서, (a) n > 103; 또는 (b) n > 104; 또는 (c) n > 105; 또는 (d) n > 106; 또는 (e) n > 107; 또는 (f) n > 108; 또는 (g) n > 109; 또는 (h) n > 1010; 또는 (i) n > 1011; (j) n > 1012; (k) n > 1013; (l) n > 1014; 또는 (m) n > 1015인 ECL.
72. 단락 71에 있어서, n = 106 내지 109인 ECL.
73. 표적에 대해 활성을 갖는 화학 구조물에 대해 단락 69 내지 단락 72 중 어느 한 단락에서 정의된 ECL을 스크리닝하는 방법으로서,
(a) 상기 ECL을 제공하는 단계;
(b) 마이크로비드로부터 화학 구조물을 방출하여, 각각의 태그 없는 화학 구조물(TCS)과 그의 인코딩 태그 사이의 공간적 회합이 유지되도록, 용매 중에 용해되며 그리고 그 화학 구조물이 방출된 마이크로비드와 함께 마이크로컴파트먼트 내에 함유되는 복수의 유리된 TCS를 생성하는 단계;
(c) 단계 (b)의 ECL 마이크로컴파트먼트를 그 안에 함유된 마이크로비드 안에 또는 그 위에 고정된 리포터 모이어티의 상태가 표적에 대한 활성 수준에 의해 결정되는 조건 하에서 인큐베이션함으로써 TSC를 검정하는 단계;
(d) 마이크로컴파트먼트를 개방하여 검정된 마이크로비드를 방출하는 단계; 및
(e) 리포터 모이어티의 상태를 결정함으로써 방출되고 검정된 마이크로비드를 스크리닝하는 단계로서, 이로써 표적에 대해 활성을 갖는 화학 구조물이 제2 상태의 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드마 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 단계
를 포함하는 방법.
74. 단락 73에 있어서, 단계 (a)가 화학 구조물의 핵산 기록된, 예컨대 DNA 기록된 합성 단계를 포함하는 것인 방법.
75. 단락 73에 있어서, 단계 (a)가 화학 구조물의 분할 및 풀(split-and-pool) 핵산 기록된 합성 단계를 포함하는 것인 방법.
76. 단락 73 내지 단락 75 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (c)가 균질한 수성 상 검정 시스템에서의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
77. 단락 73 내지 단락 76 중 어느 한 단락에 있어서, 단계 (d)가, 예컨대 열 변성, 동결, 억제제의 첨가 또는 마이크로컴파트먼트의 파괴에 의한 인큐베이션의 중단을 추가로 포함하는 것인 방법.
78. 단락 77에 있어서, 마이크로컴파트먼트가 원심분리, 음파처리 및/또는 여과에 의해 또는 용매 및/또는 계면활성제의 첨가에 의해 파괴되는 것인 방법.
79. 단락 73 내지 단락 78 중 어느 한 단락에 있어서, 스크리닝 단계 (e) 중에 또는 전에 단계 (d)에서 방출된 마이크로비드를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
80. 단락 73 내지 단락 79 중 어느 한 단락에 있어서, 스크리닝 단계가 방출되고 검정된 마이크로비드의 분획화 및/또는 선별을 포함하는 것인 방법.
81. 단락 80에 있어서, 스크리닝 단계가 FRET, FACS, 면역침전, 면역침강, 면역여과, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및/또는 자기 마이크로비드 친화성 선별 고처리량 스크리닝을 포함하는 것인 방법.
82. 단락 73 내지 단락 81 중 어느 한 단락에 있어서, 스크리닝 단계 (e)가 제1 상태 대 제2 상태의 리포터 모이어티의 비율을 측정함으로써 표적에 대한 활성 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
83. 단락 73 내지 단락 82 중 어느 한 단락에 있어서, 마이크로비드가 복수의 화학 구조물의 클론 집단을 포함하고, 상기 인코딩 태그가 또한 화학 구조물의 로딩을 인코딩하고, 스크리닝 단계 (e)가 화학 구조물의 로딩을 제1 상태 대 제2 상태의 리포터 모이어티의 비율과 서로 관련시킴으로써 표적에 대한 활성 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
본원에 언급된 모든 공개물, 특허, 특허 출원 및 다른 참조문헌은, 마치 각각의 개별 공개물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되고 그 내용이 전부 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 같이, 모든 목적을 위해 전부 참조로 포함된다.
정의 및 일반적인 선호
하기 용어는, 본원에서 사용되고 특별히 달리 명시되지 않는 경우, 용어가 당업계에서 지닐 수 있는 임의의 더 넓은 (또는 더 좁은) 의미에 추가하여 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다.
문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 본원에서 단수의 사용은 복수를 포함하도록 해석되고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 실체와 관련하여 사용되는 용어 "단수"는 하나 이상의 그 실체를 지칭하도록 해석되어야 한다. 이와 같이, 용어 "단수", "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 그의 변형은 임의의 인용된 완전체(예컨대, 피쳐, 요소, 특징, 특성, 방법/공정 단계 또는 제한) 또는 완전체(예컨대, 피쳐, 요소, 특징, 특성, 방법/공정 단계 또는 제한)의 군의 포함을 지시하지만, 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 군의 배제를 지시하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "포함하는"은 포괄적 또는 개방형이며 추가의 비인용된 완전체 또는 방법/공정 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "본질적으로 ~로 이루어지는"은 (정의된 완전체(들), 피쳐 또는 단계의 특징 또는 기능에 실질적으로 영향을 미치는 다른 완전체, 피쳐 또는 단계를 배제하면서) 특정된 완전체(들), 피쳐 또는 단계(들) 뿐만 아니라 정의된 완전체(들), 피쳐 또는 단계의 특징 또는 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들을 정의하기 위해 본원에 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이루어진"은 인용된 완전체(들), 피쳐 또는 단계(예컨대, 요소, 특징, 특성, 방법/공정 단계 또는 제한) 또는 완전체(들)(예컨대, 피쳐, 요소, 특징, 특성, 방법/공정 단계 또는 제한)의 군의 존재만을 나타내고 다른 완전체(들), 피쳐 또는 단계를 배제하기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 검정 시스템은 표적에 대한 활성을 검출하기 위한 수단을 정의한다. 표적은 전형적으로 약물 표적이므로 질환과 관련된 분자(예컨대, 단백질)일 수 있다. 검정 시스템은 하나 이상의 성분이 라이브러리에 존재하고 원하는 활성을 갖는 화학 구조물과 접촉하거나 반응할 때 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능하고/하거나 측정 가능한 신호를 생성한다. 본 발명에 따르면, 임의의 검정 시스템이, 이것이 고정된 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 포함하는 한, 사용될 수 있으며, 여기서 리포터 모이어티는 표적에 대해 활성의 부재 하에 제1 상태 및 상기 활성 존재 하에 제2 상태로 존재한다. 일부 경우에서, 검정 시스템은, 예를 들면 유리된 화학 구조물이 리포터 모이어티와 (예컨대, 선택적으로 그 리포터 모이어티에 결합함으로써) 직접적으로 상호 작용하는 실시양태에서 또는 리포터 모이어티 단독 및 자체가 유리된 화학 구조물과의 상호 작용을 (예컨대, 유리된 화학 구조물의 존재 하에서 형광을 자가인산화, 입체형태 스위칭, 형광 또는 형광의 ??칭에 의해) 신호하는 실시양태에서, 고정된 표적 검정 시스템 리포터 모이어티로 이루어질 수 있거나 본질적으로 이루어질 수 있다(즉, 검정 시스템은 고정된 리포터 모이어티 이외의 성분을 포함하지 않는다).
원하는 활성은 표적 단백질 결합, 약리학적 활성, 세포 수용체 결합, 항생물, 항암, 항바이러스, 항진균, 항기생충, 살충, 약리학적, 면역학적 활성, 임의의 원하는 화합물의 생성, 화합물의 증가된 생성 또는 특정 생성물의 분해일 수 있다. 원하는 활성은 약리학적 표적 세포, 세포 단백질 또는 대사 경로에 대한 활성일 수 있다. 또한, 원하는 활성은, 예컨대 하나 이상의 유전자(들)의 발현 및/또는 그들의 시간적 또는 공간적(예컨대, 조직 특이적) 발현 패턴을 감소 또는 증가시킴으로써, 유전자 발현을 조정하는 능력일 수 있다. 원하는 활성은 결합 활성, 예컨대 표적 단백질에 대해 리간드로서 작용하는 결합 활성일 수 있다. 또한, 원하는 활성은 생물정화, 미생물 강화된 오일 회수, 하수 처리, 식품 생산, 바이오연료 생산, 에너지 생성, 바이오-생산, 바이오-분해/생분해, 백신 생산 및 프로바이오틱 생산을 포함한 다양한 산업 공정에서 유용한 것일 수 있다. 그것은 또한 화학 작용제, 예컨대 형광단 또는 안료의 특정 화학 반응일 수 있거나, 또는 색상, 매트릭스 구조 또는 굴절률 변화와 관련될 수 있는 임의의 화학 반응일 수 있다.
검정 시스템은 (본원에 정의된 바와 같은) 리포터 분자 및 검출 가능한 라벨을 포함하는 화학적 지시자를 포함할 수 있다. 그것은, 예컨대 비색(즉, 가시 범위의 광을 흡수하는 유색 반응 생성물을 결과로 생성하는 것), 형광(예컨대, 특정 파장의 광에 의해 여기될 때 기질을 형광을 발하는 반응 생성물로 전환시키는 효소에 기반한 것) 및/또는 발광(예컨대, 생물발광, 화학발광 및/또는 광발광에 기반한 것)일 수 있다.
검정 시스템은 세포, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포를 포함할 수 있다. 검정 시스템은 또한 단백질, 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 표적 단백질을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 검정 시스템은 세포 분획, 세포 성분, 조직, 조직 추출물, 다중 단백질 복합체, 막 결합된 단백질 막 분획 및/또는 오가노이드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 리간드는 생체내 생물학적 표적 분자(예컨대, 효소 또는 수용체)에 대한 결합 파트너를 정의하기 위해 사용된다. 따라서, 이러한 리간드는 그 결합의 생리학적 결과에 관계 없이 생체내에서 표적과 결합하는 (또는 물리적으로 직접 상호 작용)하는 것들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 리간드는 표적이 일부를 형성하는 세포 신호전달 캐스케이드의 일부로서 표적에 결합할 수 있다. 대안적으로, 그 리간드는 세포 생리학의 일부 다른 측면의 맥락에서 표적에 결합할 수 있다. 후자의 경우, 리간드는, 예컨대 신호전달 캐스케이드를 유발하지 않고 세포 표면에서 표적에 결합할 수 있으며, 이 경우 그 결합은 세포 기능의 다른 측면에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 발명의 리간드는 세포 표면에서 및/또는 세포내에서 표적에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 소분자는 1500 Da 이하, 바람직하게는 1000 Da 이하, 예컨대 900 Da 미만, 800 Da 미만, 600 Da 미만 또는 500 Da 미만의 분자량을 갖는 임의의 분자를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 라이브러리에 존재하는 화학 구조물은 본원에 정의된 소분자, 특히 분자량이 600 Da 미만인 소분자일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 대형 분자는 1500 Da 초과의 분자량을 갖는 임의의 분자를 의미한다. 이러한 분자는, 예컨대 마크로사이클 및 펩티드(전형적으로 kDa 범위의 분자량을 갖는 것) 뿐만 아니라 항체 및 단백질(100 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있는 것)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체는 (폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체(mAbs)를 포함한) 전체 항체를 정의한다. 상기 용어는 또한 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있는 F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, Fc3 및 단일쇄 항체(및 이들의 조합)를 포함하는 항체 단편을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 "항체"는 또한 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 합성 하이브리드 항체인 이중특이적 또는 이중기능적 항체를 포괄하기 위해 본원에서 사용된다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 용어 "항체"는 또한 키메라 항체(하나 이상의 비-인간 가변 항체 면역글로불린 도메인에 커플링된 인간 불변 항체 면역글로불린 도메인을 갖는 항체, 또는 그의 단편)이다. 따라서, 이러한 키메라 항체는 "인간화" 항체를 포함한다. 또한, 용어 "항체"는 미니바디(WO 94/09817 참조), 단일쇄 Fv-Fc 융합물 및 트랜스제닉 동물에 의해 생산된 인간 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 다량체 항체 및 단백질의 고차 복합체(예컨대, 이종이량체 항체)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질은 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 유기 화합물을 정의하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 상응하는 형용사적 용어("peptidic")도 그에 따라 해석되어야 한다. 펩티드는 구성 아미노산의 수와 관련하여 지칭될 수 있다. 즉, 디펩티드는 2개의 아미노산 잔기를 함유하고, 트리펩티드는 3개의 아미노산 잔기를 함유하는 등이다. 10개 이하의 아미노산을 함유하는 펩티드는 올리고펩티드로 지칭될 수 있는 반면, 10개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드는 폴리펩티드이다. 이러한 펩티드는 또한 임의의 변형 및 추가 아미노 및 카르복시기를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 클릭 화학은 수율이 높고, 범위가 넓으며, 크로마토그래피 없이 제거될 수 있는 부산물만 생성하고, 입체특이적이며, 수행하기 쉽고, 쉽게 제거 가능하거나 무해한 용매에서 수행될 수 있는 반응을 설명하기 위해 샤프리스(Sharpless)가 2001년에 도입한 기술 용어이다. 이후 그것은 화학 및 생물학 모두에서 광범위한 적용과 함께 많은 상이한 형태로 구현되고 있다. 클릭 반응의 서브클래스는 주변 생물학적 환경에 불활성인 반응물을 수반한다. 이러한 클릭 반응은 생물직교적(bioorthogonal)으로 칭해진다. 생물직교적 클릭 화학에 적합한 생물직교적 반응물 쌍은 다음의 특성을 갖는 분자 군이다: (1) 이들은 상호 반응적이지만 세포내 환경에서 세포 생화학 시스템과 유의적으로 교차 반응하거나 상호 작용하지 않으며; (2) 이들 및 이들의 생성물 및 부산물은 생리학적 세팅에서 안정적이고 무독성이며; (3) 이들의 반응은 매우 특이적이고 빠르다. 반응적 모이어티 (또는 클릭 반응물)는 사용된 특정 클릭 화학을 참조하여 선택될 수 있으며, 따라서 역 전자 수요 딜스-알더(Diels-Alder) 고리첨가 반응(IEDDA), 균주 촉진된 알킨 아지드 고리첨가(SPAAC) 및 스타우딩거(Staudinger) 리게이션을 포함하는 당업자에게 공지된 생물직교적 클릭 반응물의 광범위한 상용성 쌍 중 임의의 것이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
용어 단리된 (및 관련된 용어)는 물질이 자연 상태에서 발생 (또는 단리 전에 발생)하는 것과 다른 물리적 환경에 존재함을 나타내기 위해 임의의 물질(예컨대, 화학적 화합물, 검정 시약, 마이크로비드, 표적 단백질 또는 표적 세포)과 관련하여 본원에서 사용된다. 예컨대, 마이크로컴파트먼트로부터 방출되는 마이크로비드의 단리는, 예컨대 (a) 유리된 태그 없는 화학 구조물(들); 및/또는 (b) 용매; 및/또는 (c) 절단제(들); 및/또는 (d) 표적 검정 시스템의 추가 성분으로부터 분리에 의해 개방된(예컨대, 파괴된) 마이크로컴파트먼트의 하나 이상의 물리화학적 성분으로부터 비드를 간단히 분리하는 것을 포함할 수 있다. 예컨대, 단리된 세포는 자연적으로 발생하는 복잡한 조직 환경과 관련하여 실질적으로 단리(예컨대, 정제)될 수 있다. 예컨대, 단리된 세포는 정제되거나 분리될 수 있다. 이러한 경우에서, 단리된 세포는 존재하는 총 세포 유형의 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%를 구성할 수 있다. 단리된 세포는 FACS, 밀도 구배 원심분리, 농축 배양, 선별적 배양, 세포 분류 및 표면 단백질에 대해 고정화된 항체를 사용하는 패닝 기술을 포함하는 당업자에게 공지된 통상적인 기술에 의해 수득될 수 있다.
단리된 물질이 정제될 때, 절대 순도 수준은 중요하지 않으며, 당업자는 물질이 투입될 용도에 따라 적절한 수준의 순도를 쉽게 결정할 수 있다. 그러나, 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% w/w의 순도 수준이 바람직하다. 일부 상황에서, 단리된 물질은 다른 성분을 함유할 수 있는 조성물(예컨대, 많은 다른 세포 성분을 함유하는 다소 조잡한(crude) 세포 추출물) 또는 버퍼 시스템의 일부를 형성한다.
용어 접촉 및 관련 용어는 적어도 2개의 별개의 모이어티 또는 시스템(예컨대, 화학 구조물 및 리포터 모이어티와 같은 검정 시스템의 성분)이 반응하거나 상호 작용하거나 물리적으로 접촉하거나 결합하도록 충분히 근접하게 되는 과정을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 검출 가능한 라벨은 분광, 형광, 광화학, 생화학, 면역화학, 화학, 전기화학, 고주파 또는 임의의 다른 물리적 수단에 의해 검출 가능한 모이어티를 정의하기 위해 본원에서 사용된다. 적합한 라벨은 형광단백질, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(예컨대, ELISA에서 일반적으로 사용되는 것), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐 및 단백질, 또는 예컨대 펩티드로 방사성 또는 형광 라벨을 혼입함으로써, 검출 가능하게 제조될 수 있는 다른 실체 또는 표적 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 마이크로비드는 최대 400 μm, 바람직하게는 1-100 μm, 더욱 바람직하게는 50 μm 미만의 가장 긴 치수를 갖는 고체(예컨대, 중합체, 폴리스티렌), 또는 히드로겔(예컨대, 알기네이트) 입자를 정의하기 위해 사용된다. 최대 400 μm, 바람직하게는 1-100 μm, 더욱 바람직하게는 50 μm 미만의 직경을 갖는 실질적으로 구형의 입자가 바람직하다. 바람직한 마이크로비드는 겔(아가로스와 같은 히드로겔을 포함)로부터, 예컨대 겔화된 벌크 조성물의 단편화 또는 사전 겔화된 상태로부터 몰딩에 의해 형성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 화학적 라이브러리에 적용되는 용어 마이크로컴파트먼트는 본 발명의 마이크로비드를 함유하거나 캡슐화할 수 있고 유리된 화학 구조물과 이것이 방출된 마이크로비드 사이의 공간적 회합을 유지할 수 있는 임의의 구조물을 정의한다. 따라서, 본 발명의 마이크로컴파트먼트는 표적 검정 시스템 리포터 모이어티, 표적 검정 시스템의 임의의 추가 성분(들) 및/또는 절단제와 함께 유리된 태그 없는 화학 구조물이 동족 인코딩 태그와 공간적으로 회합되어 있는 용매를 함유하는 폐쇄된 반응 챔버로서 기능을 한다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 마이크로컴파트먼트는 마이크로비드를 물리적으로 제한하는 과정인 마이크로컴파트먼트화(micro-compartmentalization)에 의해 편리하게 달성된다. 물리적 제한은 하기에서 설명되는 바와 같이 마이크로액적, 마이크로입자 및 마이크로소포를 포함하는 다양한 마이크로컴파트먼트의 사용을 통해 달성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 마이크로액적은 0.1 μm 내지 1000 μm의 직경 및/또는 5 x 10-7 pL 내지 500 nL의 부피를 갖는 작은 개별 부피의 유체, 액체 또는 겔을 정의한다. 전형적으로, 마이크로액적은 1000 μm 미만, 예컨대 500 μm 미만, 500 μm 미만, 400 μm 미만, 300 μm, 200 μm 미만, 100 μm 미만, 50 μm 미만, 40 μm 미만, 30 μm 미만, 20 μm 미만, 10 μm 미만, 5 μm 미만 또는 1 μm 미만의 직경을 갖는다. 따라서, 마이크로액적은 (a) 1 μm 미만; (b) 10 μm 미만; (c) 0.1-10 μm; (d) 10 μm 내지 500 μm; (b) 10 μm 내지 200 μm; (c) 10 μm 내지 150 μm; (d) 10 μm 내지 100 μm; (e) 10 μm 내지 50 μm; 또는 (f) 약 100 μm의 직경을 갖는 실질적으로 구형일 수 있다.
본 발명의 마이크로액적은 전형적으로 제2 유체, 액체 또는 겔(예컨대, 비혼화성 액체 또는 기체)로 완전히 둘러싸인 제1 유체, 액체 또는 겔의 단리된 부분으로 구성된다. 일부 경우에서, 액적은 구형이거나 실질적으로 구형일 수 있다. 그러나, 일부 경우에서, 마이크로액적은 비-구형일 수 있고 (예컨대, 외부 환경에 의해 또는 본원에 기재된 검정 및 스크리닝 과정 동안 물리적 조작 중에 부과되는 힘으로 인해) 불규칙한 모양을 가질 수 있다. 따라서, 마이크로액적은 (예컨대, 주변 마이크로채널의 기하학적 구조에 부합하는 상황에서) 실질적으로 원통, 플러그-유사 및/또는 타원형일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 마이크로입자는 1000 μm 미만, 예컨대 500 μm 미만, 500 μm 미만, 400 μm 미만, 300 μm 미만, 200 μm 미만, 100 μm 미만, 50 μm 미만, 40 μm 미만, 30 μm 미만, 20 μm 미만, 10 μm 미만, 5 μm 미만 또는 1 μm 미만의 직경을 갖는 입자를 정의한다. 마이크로입자는 바람직하게는 비-평면이고 (a) 10 μm 내지 500 μm; (b) 10 μm 내지 200 μm; (c) 10 μm 내지 150 μm; (d) 10 μm 내지 100 μm; (e) 10 μm 내지 50 μm; 또는 (f) 약 100 μm의 가장 큰 치수를 가질 수 있다(또는 이의 직경을 갖는 실질적으로 구형일 수 있다). 따라서, 마이크로입자는 본원에서 정의되는 바와 같이 마이크로액적 내에 캡슐화될 수 있다. 마이크로입자는 경질 고체, 가요성 겔, 다공성 고체, 다공성 겔 또는 경질 또는 반경질 원섬유 또는 세관의 네트워크 또는 매트릭스로부터 형성될 수 있다.
용어 마이크로소포는 리포솜과 같은 내부 부피를 둘러싸는 외부 벽 또는 막을 포함하는 중공 마이크로입자를 정의하기 위해 본원에서 사용된다.
본 발명의 마이크로액적, 마이크로입자 및 마이크로소포는 단분산성일 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 마이크로액적 및 마이크로입자에 적용되는 용어 단분산은 1.0 이하, 0.5 이하, 바람직하게는 0.3 이하의 액적/입자 크기 분산 계수 ε을 갖는 마이크로액적/마이크로입자 집단을 정의한다. 상기 계수 ε는 하기 수학식으로 정의된다:
ε=(90 Dp- 10 Dp)/50 Dp(1)
상기 식에서, 10　Dp,　50　Dp　및　90　Dp는 에멀젼의 상대적 누적 입자 크기 분포 곡선으로부터 추정된 누적 도수가 각각 10%, 50% 및 90%일 때의 입자 크기이다. ε = 0인 경우는 에멀젼 입자가 입자 크기 산란을 전혀 나타내지 않는 이상적인 상태를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 인코딩 태그는, 화학 구조물과 관련하여, 화학 구조물 또는 그 반응 이력을 고유하게 확인하는 정보를 함유하는 모이어티 또는 작용제를 정의하기 위해 사용되어 특정 화학 구조물의 고유 식별자 역할을 한다(즉, 태그는 그 구조물을 "인코딩"하고 분자 "바코드"로서 기능을 한다. 정보는 임의의 형태로 인코딩될 수 있지만, 바람직한 실시양태에서 태그는 정보가 핵산의 서열로 인코딩되는 핵산(예컨대, DNA) 태그이다. 그러나, 비DNA 태그, 비RNA 태그, 변형된 핵산 태그, 펩티드 태그, 광 기반 바코드(예컨대, 양자점) 및 RFID 태그를 포함하는 다른 태그가 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 클론은 화학 구조물 집단과 관련하여 각각 공통 태그에 의해 인코딩되는 하나 이상의 화학 구조물의 집단을 정의한다. 클론 화학 구조물은 화학적으로 동일하거나, 화학 구조물을 마이크로비드에 가역적으로 연결하는 절단 가능한 링커의 특성 및/또는 위치에 대해서만 (또는 이러한 링커의 절단 후 남아 있는 자국(scar)에 대해서만) 상이할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 화학 구조물에 적용되는 용어 유리된은 고체 상에 결합되지 않거나 용액에 있는 화학 구조물을 정의하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 고체 상에 공유 결합되지 않는 화학 구조물을 정의한다. 따라서, 유리된 화학 구조물은 액체 또는 겔 상 및/또는 용액에 들어갈 수 있으며, 일부 실시양태에서 표적 검정 시스템의 하나 이상의 성분(예컨대, 본 발명의 마이크로비드의 고정된 표적 검정 시스템 리포터 모이어티)과 상호 작용할 수 있다).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 자가 희생 링커는 안정한 태그부착된 화학 구조물을 형성하도록 화학 구조물과 그의 인코딩 태그를 직접적으로 또는 간접적으로 (예컨대, 펩티드 모이어티를 통해) 공유 결합할 수 있고 화학 구조물의 자발적 방출을 수반하는 메커니즘에 의해 (예컨대, 이탈기의 추방 및 유리된 화학 구조물의 방출을 이끄는 효소적 절단에 의해 유발되는 전자 캐스케이드를 통해) 화학 구조물로부터 인코딩 태그를 방출시킬 수 있는 자가 희생 화학 기(본원에서 자가 희생 모이어티 또는 "SIM"으로도 지칭될 수 있음)를 포함하는 링커를 정의한다.
마이크로비드
본 발명의 마이크로비드는 임의의 기하학적 구조를 가질 수 있고, 타원형, 구형, 입방형, 피라미드형, 직사각형(oblong), 원통형 또는 도넛형일 수 있다. 그들은 고체 또는 겔로 형성될 수 있다.
적합한 겔은 중합체 겔, 예컨대 가열, 냉각 또는 pH 조정에 의해 액체로부터 겔로 고형화될 수 있는 다당류 또는 폴리펩티드 겔을 포함한다. 다른 적합한 겔은 알기네이트, 젤라틴, 아가로스 및 자가 조립 펩티드 겔을 포함하는 히드로겔을 포함한다.
다른 적합한 물질은 지질, 펩티드, 플라스틱(예컨대, 폴리스티렌, 폴리(비닐) 클로라이드, 사이클로-올레핀 공중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리락트산, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트)), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 나일론 및 폴리비닐 부티레이트를 포함한다.
따라서, 마이크로비드는 중합체 또는 중합체의 조합으로 형성될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 마이크로비드는 폴리에스테르, 예컨대 친수성 중합체에 커플링된 폴리에스테르를 포함할 수 있다. 여기서, 폴리에스테르는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트-코-글리콜산) 또는 폴리카프럴락톤을 포함할 수 있고/있거나 친수성 중합체는 폴리에테르(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜을 포함함)를 포함할 수 있다.
적합한 마이크로입자 물질은 또한 규소, 유리, 금속 및 세라믹과 같은 무기 물질을 포함한다.
마이크로비드는 스트렙트아비딘, 아민, 브롬화시안 또는 카르복실산과 같은 반응성 기 또는 모이어티로 작용화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 마이크로비드는 규소, 폴리스티렌(PS), 가교된 폴리(스티렌/디비닐벤젠)(P[S/DVB]) 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)로 제조된 것과 같은 고체 지지체일 수 있다.
인코딩 태그
본 발명에 따르면, 임의의 인코딩 태그가, 이것이 동족 화학 구조물 (또는 반응 이력)를 고유하게 확인하는 정보를 (예컨대, 화학적 및/또는 광학적 특성/특징의 형태로) 함유하여 특정 화학 구조물의 고유한 식별자 역할을 하는 한, 사용될 수 있다. 따라서, 태그는 특정 화학 구조물을 "인코딩"하고 분자 "바코드" 로서 기능을 한다.
바람직한 실시양태에서, 태그는 정보가 핵산의 서열에서 인코딩되는 핵산(예컨대, DNA) 태그이다. 그러나, 비DNA 태그, 비RNA 태그, 변형된 핵산 태그, 펩티드 태그, 광 기반 바코드(예컨대, 양자점) 및 RFID 태그를 포함하는 다른 태그가 사용될 수 있다.
상기에서 설명되는 바와 같이, 화학 구조물은 다양한 방식으로 태그부착될 수 있으며, 또한 특정 화학 구조물을 인코딩할 뿐만 아니라("DNA 기록") 합성을 지시하는 템플릿으로도("DNA 템플레이팅" - 하기 참조) DNA 태그를 사용할 수 있다. 이 기술은 최근에 문헌(Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47: 12747-12753; Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12): 5707-5717; and Mullard (2016) Nature 530: 367-369)에서 검토되었다.
인코딩 태그는 또한 다른 유용한 정보를 인코딩할 수 있다. 예컨대, 태그는 또한 (a) 마이크로비드에 화학적 화합물의 로딩; 및/또는 (b) 리포터 모이어티의 특성 및/또는 로딩; 및/또는 (c) 표적의 특성 및/또는 로딩을 특정하는 정보를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 인코딩 태그는 별도의 태그로서 마이크로비드에 고정되거나 단일 연결 태그의 일부로서 존재할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 인코딩 태그는 복수의 상이한 가교기로 작용화될 수 있어서, 태그부착은 마이크로비드 상의 복수의 별개의 가교 부위에서 발생할 수 있다.
이러한 태그를 사용하면 다중 표적의 스크리닝이 가능하고 용량 반응이 확립될 수 있다.
태그는 또한 마이크로비드와 함께 마이크로컴파트먼트화되는 추가 모이어티의 특성 및/또는 로딩을 특정하는 정보를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 많은 수의 추가 인자가 캡슐화 동안 혼입될 수 있고 라이브러리 스크린의 일부로서 빠르게 스크리닝될 수 있다. 이는 다양한 표적, 추가 보조 인자, 화합물 또는 단백질일 수 있다. 이는 당업자에게 널리 공지된 상이한 유체 채널, 피코 주입(pico-injection) 또는 액적 병합 기술을 이용하여 수행될 수 있다.
태그 시퀀싱
생어(Sanger) 시퀀싱을 포함하여 임의의 적합한 시퀀싱 기술을 이용할 수 있지만, 고처리량 시퀀싱으로도 공지된 차세대 시퀀싱(NGS)이라고 하는 시퀀싱 방법 및 플랫폼이 선호된다. 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 많은 상업적으로 이용 가능한 NGS 시퀀싱 플랫폼이 있다. 합성에 의한 시퀀싱(SBS) 기반 시퀀싱 플랫폼이 특히 적합하다. Illumina™ 시스템(수많은 상대적으로 짧은 서열 판독물(54, 75, 100, 150 또는 300 bp)을 생성)가 특히 선호된다. 여기서, DNA 분자는 먼저 슬라이드 상의 프라이머에 부착되고 증폭되어 국소 클론 콜로니가 형성된다(브릿지 증폭) 4가지 유형의 ddNTP가 첨가되고 비혼입 뉴클레오티드는 세척된다. 피로시퀀싱과 달리, DNA는 한 번에 하나의 뉴클레오티드만 확장할 수 있다. 카메라로 형광 라벨링된 뉴클레오티드의 이미지를 촬영한 다음, 염료를 말단 3' 차단제와 함께 DNA로부터 화학적으로 제거하고, 다음 주기를 허용한다.
짧은 시퀀스 판독이 가능한 다른 시스템은 SOLiD™ 및 이온 토렌트 테크놀로지(Ion Torrent technology(둘 다 Thermo Fisher Scientific Corporation에서 판매)를 포함한다. SOLiD™ 테크놀리지는 리게이션에 의한 시퀀싱을 이용한다. 여기서, 고정된 길이의 모든 가능한 올리고뉴클레오티드 풀은 시퀀싱된 위치에 따라 라벨링된다. 올리고뉴클레오티드는 어닐링되고 리게이션되고; 서열 맞춤을 위한 DNA 리가제에 의한 우선적 리게이션은 그 위치에서 뉴클레오티드에 대한 정보를 제공하는 신호를 생성한다. 시퀀싱하기 전에 DNA는 에멀젼 PCR로 증폭된다. 각각 동일한 DNA 분자의 카피만을 함유하는 생성된 비드는 유리 슬라이드에 부착된다. 그 결과 일루미나(Illumina) 시퀀싱과 유사한 수량 및 길이의 서열이 생성된다.
이온 토렌트 시스템스 인크.(Ion Torrent Systems Inc.)는 표준 시퀀싱 화학을 이용하지만 새로운 반도체 기반 검출 시스템을 사용하는 시스템을 개발하였다. 이 시퀀싱 방법은 다른 시퀀싱 시스템에서 사용되는 광학 방법과 달리 DNA 중합 중에 방출되는 수소 이온의 검출을 기반으로 한다. 시퀀싱될 템플릿 DNA 가닥을 함유하는 마이크로웰은 단일 유형의 뉴클레오티드로 채워진다. 도입된 뉴클레오티드가 주요 템플릿 뉴클레오티드에 상보적인 경우, 이는 성장하는 상보적 가닥에 혼입된다. 이는 초고감도 이온 센서를 작동시키는 수소 이온을 방출시키며, 이는 반응이 발생하였음을 나타낸다. 동종중합체 반복체가 템플릿 서열에 존재하는 경우, 다중 뉴클레오티드가 단일 주기로 혼입될 것이다. 이는 상응하는 수의 방출된 수소 및 비례적으로 더 높은 전자 신호로 이어진다.
옥스포드 나노 포어 테크놀로지즈(Oxford Nanopore Technologies)에 의해 사용하는 것과 같거나 유사한 방법으로, 여기서 핵산 또는 다른 거대분자는 나노 규모의 세공을 통과하고 생성된 특정 이온 전류 변화 또는 전기 신호는 이를 확인하는 데 사용된다. 예컨대, 올리고뉴클레오티드의 개별 염기는 연속적인 염기가 올리고뉴클레오티드의 일부로서 이온 세공을 통과하거나 연속적인 절단 단계 후에 단일 뉴클레오티드로 확인될 수 있다.
표적 검정 시스템 리포터 모이어티
본 발명의 마이크로비드는 고정된 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 포함한다. 리포터 모이어티는, 화학 구조물(들)이 방출되어 용매 중에 용해된 유리된 태그 없는 화학 구조물(들)(TCS)를 생성하는, 마이크로비드 및 수성 용매를 함유하는 화학적 라이브러리 마이크로컴파트먼트의 맥락에서 그 자체로 기능한다. 이 맥락에서, TCS는 표적 검정 시스템 리포터 모이어티 및/또는 표적 검정 시스템의 하나 이상의 추가 성분(들)과 자유롭게 접촉할 수 있으며, 마이크로비드는 본 발명의 스크리닝 방법에서 검정될 수 있다.
모이어티가 적어도 제1 상태(표적에 대한 활성의 부재 하에 채택됨) 및 제2 상태(상기 활성의 존재 하에 채택됨)로 존재하는 한, 어떠한 적합한 리포터 모이어티도 사용될 수 있다. 따라서, 제1 상태로부터 제2 상태로 리포터 모이어티의 상태 변화의 결정은 표적에 대한 활성의 신호 역할을 하며, 신호는 (표적에 대한 활성 스크리닝을 위해 TCS를 제공하기 위해) 마이크로비드의 마이크로컴파트먼트화 및 화학 구조물의 용액으로의 방출 후 획득된다.
이러한 신호는 양성 신호(예컨대, 형광 획득 또는 입체형태 이동) 또는 널(null) 신호(예컨대, 형광 손실 또는 입체형태 이동의 부재)일 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 가장 간단한 경우에, 리포터 모이어티는 표적 자체 (또는 그의 단편)이고, 검정 시스템은 표적 결합 활성에 대한 것이다. 이러한 실시양태에서, 제1 상태는 결합되지 않은 표적이고, 제2 상태는 표적-화학적 화합물 복합체이다. 이 경우, 검정 시스템은 제1 상태로부터 제2 상태로의 변화를 유도하는 데 다른 검정 시스템 성분이 관련되지 않기 때문에 리포터 모이어티로 이루어진다(또는 본질적으로 이루어진다). 이러한 경우에서, 마이크로컴파트먼트는 추가 표적 검정 시스템 성분(들)을 함유할 필요가 없으며; 리포터 모이어티의 상태 변화는 물리적 기술에 의해 또는 적합한 검출 프로브 및/또는 스크리닝 마이크로비드에 직접적으로 적용되는 시약의 사용을 통해 개방된 마이크로컴파트먼트로부터 스크리닝 및 방출되는 마이크로비드의 분석에 의해 검출될 수 있다.
또 다른 간단한 경우에서, 리포터 모이어티는 효소 표적의 기질이고, 검정은 효소 표적에 대한 억제 활성에 대한 것이다. 이러한 실시양태에서, 제1 상태는 효소적으로 변형된 기질이고 제2 상태는 비-효소적으로 변형된 기질이다. 이 경우에서, 검정 시스템은 추가 성분으로서 표적 효소를 필요로 하며 이는 마이크로비드가 검정되는 마이크로컴파트먼트에 포함된다. 리포터 모이어티의 상태 변화는 항체 프로브 또는 효소 변형 시 형광 어텐던트(attendant)의 획득 (또는 손실), 라벨링된 마커의 효소적 통합 등을 포함한 편리한 검출 시스템에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 리포터 모이어티의 상태 변화는 물리적 기술에 의해 또는 적합한 검출 프로브 및/또는 스크리닝 마이크로비드에 직접적으로 적용되는 시약의 사용을 통해 개방된 마이크로컴파트먼트로부터 스크리닝 및 방출되는 마이크로비드의 분석에 의해 다시 검출될 수 있다.
또 다른 간단한 경우에서, 리포터 모이어티는 수용체 표적에 대한 결합 파트너(예컨대, 리간드)이고, 검정은 수용체 차단 활성에 대한 것이다. 이러한 실시양태에서, 제1 상태는 수용체와 복합된 리포터 모이어티이고 제2 상태는 비복합된 리포터 모이어티이다. 이 경우에서, 검정 시스템은 추가 성분으로서 표적 수용체를 필요로 하며, 이는 마이크로비드가 검정되는 마이크로컴파트먼트에 포함된다. 리포터 모이어티의 상태 변화는 항체 프로브 또는 (예컨대, 리포터 모이어티의 형광 라벨을 수용체 상의 ??칭기에 의해 ??칭시킴으로써) 리간드-수용체 결합에 대한 형광 어텐던트의 획득 (또는 손실)을 포함하는 임의의 편리한 검출 시스템에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 리포터 모이어티의 상태 변화는 물리적 기술에 의해 또는 적합한 검출 프로브 및/또는 스크리닝 마이크로비드에 직접적으로 적용되는 시약의 사용을 통해 개방된 마이크로컴파트먼트로부터 스크리닝 및 방출되는 마이크로비드의 분석에 의해 다시 검출될 수 있다.
따라서, 당업자는 시스템 리포터 모이어티가 표적의 특성 및 스크리닝될 활성에 따라 선택될 수 있고, 표적 검정의 제1 및 제2 상태가 상태 변화 중에 발생하는 임의의 변형에 기반하여 구별될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
이는 (a) 형광, 예컨대 ??칭 또는 비??칭 형광; 및/또는 (b) 절단 또는 비절단 입체형태; 및/또는 (c) 인산화 또는 비인산화 상태; (d) 상이한 글리코실화 유형, 패턴 또는 정도; 및/또는 (e) 상이한 항원성 결정인자; 및/또는 (f) 리간드에 대한 결합 또는 비결합; 및/또는 (g) 하나 이상의 추가의 검정 시스템 성분과 복합화 또는 비복합화의 측정에 의해 검출될 수 있다.
이는 본 발명의 마이크로비드가 화학 구조물의 특성 뿐만 아니라 용액 중의 표적에 대해 어떠한 입체적 억제도 없이 검정될 때 이러한 화학 구조물의 활성에 관한 정보를 인코딩하는 데 사용될 수 있음을 의미한다.
이는 신호가 획득되면 TCS 및/또는 검정 시스템의 다른 성분(들)과의 공간적 회합이 더 이상 필요하지 않기 때문에, 리포터 모이어티의 상태가 고정된 후 (및 따라서 신호가 생성된 후) 마이크로비드가 마이크로컴파트먼트에서 유지될 필요가 없으므로, 반응 후 스크리닝을 매우 용이하게 한다.
따라서, 마이크로비드는 방출된 TCS의 검정이 수행되는 마이크로컴파트먼트로부터 제거, 분리 및/또는 단리된 후, 상대적으로 크고 취약한 마이크로컴파트먼트를 물리적으로 붕괴시킬 수 있는 선택 및 분획화 기술을 포함하는 매우 다양한 물리화학적 조작을 받게 될 수 있다. 이는 뛰어난 유연성을 제공하며 HTS 처리량 및 히트 디컨볼루션 및 특징규명을 크게 개선하는 데 활용될 수 있다.
이러한 검정 후 반응 물리화학적 조작은 FRET, FACS, 면역침전, 면역침강, 면역여과, 원심분리, 구배 원심분리, 차등 부력 분리, 여과, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및/또는 자기 마이크로비드 친화성 선별 고처리량 스크리닝의 사용을 포함하는 HTS 프로토콜을 포함한다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 FADS 및/또는 FACS를 포함할 수 있다. 스크리닝 단계는 또한 FRET, FliM, 형광단 태그부착된 항체, 형광단 태그부착된 DNA 서열 또는 형광 염료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 형광 분석을 포함할 수 있다.
화학 구조물
화학 구조물은 (본원에서 정의되는 바와 같이) 소분자일 수 있다. 특정 실시양태에서, 구조물은 다수의 연결된 서브구조물로 구성된다. 바람직한 실시양태에서, 화학 구조물은 (하기에서 기재되는 바와 같이) 분할-및-풀 방법론에 의해 정교화된다.
다른 실시양태에서, 화학 구조물은 (본원에서 정의되는 바와 같이) 대형 분자일 수 있다.
화학 구조물의 분할-및-풀 생성
바람직한 실시양태에서, 분할-및-풀 화학 구조물/태그부착 기술이 이용된다(예컨대, 문헌(Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47: 12747-12753, 특히 이의 도 3, 본원에 참조로 포함됨) 참조).
이 접근법에서, 코어 또는 일련의 코어가 먼저 마이크로비드 표면에 고정된다. 이 단계에서 코어의 로딩을 변경함으로써 궁극적으로 비드 상에 생성될 화합물의 양을 제어할 수 있으므로 (태그에 로딩을 특정하는 정보를 혼입함으로써 촉진될 수 있는) 용량 반응 결정이 가능하다. 많은 실시양태에서, 화학 구조물의 로딩은 마이크로컴파트먼트화(예컨대, 마이크로액적 내의 캡슐화) 후의 농도가 피코몰로부터 몰 농도까지의 범위 내에 있도록 선택된다. 따라서, 동일한 서열의 DNA의 복수의 조각이 코어 구조물 뿐만 아니라 마이크로비드 상의 코어 로딩을 인코딩하도록 이 단계에서 추가된다. 따라서, 인코딩 태그는 다중 카피로 존재할 수 있으며, 일부 실시양태에서 수백만 카피의 태그가 단일 마이크로비드에 고정된다.
코어는 표면 상에 하나 초과의 벡터를 가지고 있기 때문에, 상이한 화학 반응에 의해 화학적으로 변형되어 분할-및-풀 방법을 적용할 수 있다. 이 방법론에서, 코어는 특정 벡터에 많은 수의 상이한 화학 단량체를 추가하여 변형되며, 유일한 제약은 각각의 벡터가 적합한 화학에 의해 변형되어야 한다는 것이다. 이는 1 내지 100,000개의 단량체를 수반할 수 있다. 단량체 추가의 특성은 이미 비드에 부착된 DNA 단편에 새로운 DNA 조각을 연결함으로써 인코딩된다. 이어서, 단량체를 갖는 비드는 다시 단일 풀로 풀링된 다음 새로운 집단으로 분할되고 제2 단량체 세트가 추가되며, 이는 또한 DNA 리게이션에 의해 인코딩된다. 이는 임의의 수의 단량체 추가에 대해 반복될 수 있다. 그러나, 선호되는 방법론에서, 코어당 2 또는 3개의 벡터가 사용된다.
기존의 화학적 라이브러리의 클론 태그부착
태그부착된 화학 구조물은 임의의 적절한 수단에 의해 제공될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따라 사용하기 위한 마이크로비드는 화학 구조물의 클론 집단을 포함할 수 있고, 인코딩 태그 또는 태그들은 마이크로비드에 방출 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 실시양태에서 화학 구조물의 클론 집단은 상업적으로 이용 가능한 화학적 라이브러리의 요소일 수 있다.
적합한 핵산 기반 태그는 (예컨대, Twist Bioscience Corporation으로부터) 상업적으로 이용 가능할 수 있지만, 예컨대 WO2015/021080(이의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에서 기재되는 바와 같이 합성될 수 있다.
화학 구조물의 템플릿 합성
특정 실시양태에서, 인코딩 핵산 태그는 화학 구조물에 대한 템플릿 역할을 한다. 이러한 실시양태에서, 태그부착된 화학 구조물의 라이브러리는 화학 구조물의 핵산 템플릿, 예컨대 DNA 템플릿 합성에 이어 마이크로입자로의 방출 가능한 연결에 의해 제공된다. 임의의 적합한 템플레이팅 기술이 이용될 수 있으며, 적합한 기술은, 예컨대 문헌(Mannocci et al. (2011) Chem. Commun., 47: 12747-12753; Kleiner et al. (2011) Chem Soc Rev. 40(12): 5707-5717 and Mullard (2016) Nature 530: 367-369)에 기재되어 있다. 퍼 하버리(Pehr Harbury) 교수 및 동료 (미국 스탠포드 대학교)에 의해 개발된 DNA 라우팅(DNA-routing) 접근법도 적합하다. DNA 템플릿은 임의의 방식으로 패턴화/설계될 수 있으며: 예컨대, 욕토리엑터(YoctoReactor) 시스템은 3 방향 DNA 헤어핀 루프 접합을 이용하여 적절한 공여체 화학 모이어티를 코어 수용체 부위로 전달함으로써 라이브러리 합성을 지원한다(개시내용이 본원에 참조로 포함된 WO2006/048025 참조).
문헌(Lundberg et al. (2008) Nucleic acids symposium (52): 683-684)에 기재되는 바와 같은 4 방향 DNA 할리데이 접합(4-way DNA Holliday Junctions) 및 육각형 구조 및 문헌(Rothemund (2006) Nature 440: 297-302)에서 검토되는 "스캐폴드 DNA 오리가미(scaffolded DNA origami)" 기술에 의해 생성되는 복잡한 모양 및 패턴과 같은 대안적인 구조의 기하학도 이용 가능하다.
절단 가능한 링커
화학 구조물(들)은 절단 가능한 링커에 의해 마이크로비드에 방출 가능하게 연결된다.
임의의 절단 가능한 링커를 사용하여 화학 구조물(들)의 클론 집단을 마이크로비드 (및 따라서, 간접적으로, 그의 인코딩 태그)에 방출 가능하게 연결할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 "자국 없는" 것이다. 이러한 실시양태에서, 인코딩된 화학 구조물은 링커 잔기가 전혀 또는 실질적으로 없는 형태로 방출되어, 스크린에서 그의 활성은 링커 절단 후에 남아 있는 "자국"에 의해 손상되지 않는다. -OH 및/또는 -SH 및/또는 -NH기와 같은 일부 링커 "자국"이 용인될 수 있다는 것은 이해될 것이다. 절단 방법/절단제도 검정 시스템과 적합한 것이 바람직하다.
광범위한 적합한 절단 가능한 링커가 당업자에게 공지되어 있고, 적합한 예는 문헌(Leriche et al. (2012) Bioorganic & Medicinal Chemistry 20 (2): 571-582)에 기재되어 있다. 따라서, 적합한 링커는 효소적으로 절단 가능한 링커; 친핵체/염기 민감성 링커; 환원 민감성 링커; 광 절단 가능한 링커; 친전자체/산 민감성 링커; 금속 보조된 절단 민감성 링커; 산화 민감성 링커; 및 전술된 것 중 2개 이상의 조합을 포함한다.
효소 절단 가능한 링커는, 예컨대 문헌(WO 2017/089894; WO 2016/146638; US2010273843; WO 2005/112919; WO 2017/089894; de Groot et al. (1999) J. Med. Chem. 42: 5277; de Groot et al. (2000) J Org. Chem. 43: 3093 (2000); de Groot et al., (2001) J Med. Chem. 66: 8815; WO 02/083180; Carl et al. (1981) J Med. Chem. Lett. 24: 479; Studer et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3 (5): 424-429; Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24 (5): 479-480 and Dubowchik et al. (1998) Bioorg & Med. Chern. Lett. 8: 3347)에 기재되어 있다. 이들은 프로테아제(엔테로키나제 포함), 뉴클레아제, 니트로리덕타제, 포스파타제, β-글루쿠로니다제, 리소솜 효소, TEV, 트립신, 트롬빈, 카텝신 B, B 및 K, 카스파제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 포스포디에스테라제, 포스포리피다제, 에스테라제 및 β-갈락토시다제로부터 선택되는 효소에 의해 절단 가능한 링커를 포함한다. 친핵체/염기 절단 가능한 링커는 디알킬 디알콕시실란, 시아노에틸기, 술폰, 에틸렌 글리콜 디숙시네이트, 2-N-아크릴니트로벤젠술폰아미드, α-티오페닐에스테르, 불포화된 비닐 술파이드, 술폰아미드, 말론디알데히드 인돌 유도체, 레불리노일 에스테르, 히드라진, 아실히드라존, 알킬 티오에스테르를 포함한다. 환원 절단 가능한 링커는 디술파이드 브릿지 및 아조 화합물을 포함한다. 방사선 절단 가능한 링커는 2-니트로벤질 유도체, 페나실 에스테르, 8-퀴놀리닐 벤젠술포네이트, 코우마린, 포스포트리에스테르, 비스-아릴히드라존, 비마네 비-티오프로피온산 유도체를 포함한다. 친전자체/산 절단 가능한 링커는 파라메톡시벤질 유도체, tert-부틸카르바메이트 유사체, 디알킬 또는 디아릴 디알콕시 실란, 오르토에스테르, 아세탈, 아코니틸, 히드라진, β-티오프로피오네이트, 포스포르아마다이트, 이민, 트리틸, 비닐 에테르, 폴리케탈, 알킬 2-(디페닐포스피노) 벤조에이트 유도체를 포함한다. 유기금속/금속 촉매 절단 가능한 링커는 알릴 에스테르, 8-히드록실 퀴놀린 에스테르 및 피콜리네이트 에스테르를 포함한다. 산화에 의해 절단 가능한 링커는 인접 디올 및 셀레늄 화합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 공유 및 비공유 결합의 조합(예컨대, 핵산 하이브리드화로부터 발생하는 수소 결합)을 포함한다. 따라서, 화학 구조물은 핵산 하이브리드화에 의해 마이크로입자에 (직접적으로 또는 간접적으로) 방출 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 RNA를 포함할 수 있고, 이러한 실시양태에서 절단제는 RNase를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 DNA를 포함할 수 있고, 이러한 실시양태에서, 절단제는 부위 특이적 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 절단 가능한 링커가 핵산 하이브리드화로부터 발생하는 경우, 절단제는 화학 구조물에 커플링되고 마이크로입자에 커플링된 핵산에 하이브리드화된 핵산의 탈하이브리드화, 예컨대 융해를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 펩티드를 포함할 수 있고, 이러한 실시양태에서 절단제는 펩티다제를 포함할 수 있다. 절단 가능한(예컨대, 효소 절단 가능한) 펩티드 링커는 단일 아미노산, 또는 아미노산의 디펩티드 또는 트리펩티드 서열로 이루어진 펩티드 모이어티를 함유할 수 있다. 아미노산은 천연 및 비천연 아미노산으로부터 선택될 수 있으며, 각각의 경우에서 측쇄 탄소 원자는 D 또는 L(R 또는 S) 배열일 수 있다. 예시적인 아미노산은 알라닌, 2-아미노-2-사이클로헥 아세트산, 2-아미노-2-페 아세트산, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, γ-아미노부티르산, β,β-디메틸 γ-아미노부티르산, α,α-디메틸 γ-아미노부티르산, 오르니틴, 및 시트룰린(Cit)을 포함한다. 적합한 아미노산은 또한 측쇄의 반응성 작용기가 보호되는 전술된 아미노산의 보호된 형태를 포함한다. 이러한 보호된 아미노산은 아세틸, 포르밀, 트리페닐메틸(트리틸) 및 모노메톡시트리틸(MMT)로 보호된 리신을 포함한다. 다른 보호된 아미노산 단위는 토실 또는 니트로기로 보호된 아르기닌 및 아세틸 또는 포르밀기로 보호된 오르니틴을 포함한다.
자가 희생 링커
본 발명에서 절단 가능한 링커로서 사용하기에 특히 적합한 것은 (a) 절단 모이어티; 및 (b) 자가 희생 모이어티("SIM")를 포함하는 자가 희생 링커이다.
이러한 링커는 도 1에서 도식적으로 나타낸 바와 같이 사용될 수 있으며, 이는 유리된 화학 구조물을 방출하기 위해 절단 후 SIM의 자발적인 제거를 나타내는 다.
(a) 효소적 절단 모이어티; 및 (b) SIM을 포함하는 자가 희생 링커가 특히 적합하다. 이러한 실시양태에서, 효소적 절단 모이어티는 (프로테아제로 절단 가능한) 펩티드 서열 또는 비-펩티드의 효소적 절단 가능한 기, 예컨대 (문헌(McCombs and Owen (2015) Antibody Drug Conjugates: Design and Selection of Linker, Payload and Conjugation Chemistry The AAPS Journal 17(2): 339-351)에서 설명되는 바와 같고) 하기에 나타나는 바와 같이 베타-글루쿠로니다제에 의해 절단 가능한 친수성 슈가기를 포함하는 글루쿠로나이드 모이어티일 수 있다:
Figure pct00001
적합한 β-글루쿠로나이드 기반 링커는 WO 2007/011968, US 20170189542 및 WO 2017/089894(이들의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 따라서, 이러한 링커는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00002
상기 식에서, R3은 수소 또는 카르복실 보호기이고 각각의 R4는 독립적으로 수소 또는 히드록실 보호기이다.
본 발명에서 사용하기 위한 자가 희생 링커의 SIM은 치환된 알킬, 비치환된 알킬, 치환된 헤테로알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 헤테로사이클로알킬, 치환된 헤테로사이클로알킬, 치환 및 비치환된 아릴 또는 치환 및 비치환된 헤테로아릴로부터 선택될 수 있다. 따라서, 적합한 SIM은 p-아미노벤질 알콜(PAB) 단위 및 PAB기와 전자적으로 유사한 방향족 화합물(예컨대, 문헌(Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237) 기재된 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체) 및 오르토- 또는 파라-아미노벤질아세탈을 포함한다.
다른 적합한 SIM은 아미드 결합 가수분해 시 고리화되는 것, 예컨대 문헌(Rodrigues et al. (1995) Chemistry Biology 2: 223)에 기재되는 치환 및 비치환 4-아미노부티르산 아미드이다. 추가로 적합한 SIM은 문헌(Storm et al. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94: 5815)에 기재되는 바와 같은 적절하게 치환된 비사이클로 [2.2.1] 및 비사이클로[2.2.2] 고리 시스템 및 다양한 2-아미노페닐프로피온산 아미드(예컨대, 문헌(Amsberry et al. (1990) J. Org. Chem. 55: 5867) 참조)를 포함한다.
절단 모이어티로서 펩티드를 포함하는 자가 희생 펩티드 링커가 특히 적합하다. 도 2 및 3은 이러한 링커를 사용하는 인코딩된 화학적 라이브러리의 구축 및 사용을 도시한다. 여기서, 절단 가능한 펩티드는 디펩티드 발린-시트룰린이고, SIM은 p-아미노벤질알콜(PAB)이다. 이러한 실시양태에서, 아미드-연결된 PAB의 효소적 절단은 이산화탄소의 1,6-제거 및 유리된 화학 구조물의 동반 방출을 유발한다. 도 2에서도 도시되는 바와 같이, 인코딩 태그 및 화학 구조물(들)은 비드를 통해 연결될 수 있으며, 단일 비드는 복수(n > 1)의 화학 구조물로 로딩될 수 있어, 예컨대 인코딩 태그(들) 대 연결된 화학 구조물의 비율은 1:10 내지 1:1000이다. 이러한 실시양태에서, 비교적 작은 크기의 펩티드 링커는 향상된 확산 속도 및 더 높은 비드 로딩을 허용하는 반면, 화학 구조물은 작용화를 위해 단일 아민만을 필요로 한다.
본 발명에 따른 자가 희생 링커로서 사용하기 위한 적합한 절단 모이어티 및 SIM의 비제한적인 예는, 예컨대 문헌(WO 2017/089894; WO 2016/146638; US2010273843; WO 2005/112919; WO 2017/089894; de Groot et al. (1999) J. Med. Chem. 42: 5277; de Groot et al. (2000) J Org. Chem. 43: 3093 (2000); de Groot et al., (2001) J Med. Chem. 66: 8815; WO 02/083180; Carl et al. (1981) J Med. Chem. Lett. 24: 479; Studer et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3 (5): 424-429; Carl et al. (1981) J. Med. Chem. 24 (5): 479-480 and Dubowchik et al. (1998) Bioorg & Med. Chern. Lett. 8: 3347, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
표적
표적 단백질
본 발명의 검정 시스템의 표적은 표적 단백질을 포함할 수 있다. 이는 단리된 표적 단백질 또는 단리된 표적 단백질 복합체를 포함할 수 있다. 예컨대, 표적 단백질/단백질 복합체는 세포내 표적 단백질/단백질 복합체일 수 있다. 표적 단백질/단백질 복합체는 용액에 있을 수 있거나 막 또는 막횡단 단백질/단백질 복합체로 구성될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 화학 구조물은 표적 단백질/단백질 복합체에 결합하는 리간드에 대해 스크리닝될 수 있다. 리간드는 표적 단백질/단백질 복합체의 억제제일 수 있다.
하기 섹션에서 논의되는 임의의 표적 세포로부터의 단백질을 포함하여 임의의 적합한 표적 단백질이 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 검정 시스템에 사용하기에 적합한 표적 단백질은 진핵생물, 원핵생물, 진균 및 바이러스 단백질로부터 선택될 수 있다.
따라서, 표적 단백질은 종양 단백질, 수송(핵, 캐리어, 이온, 채널, 전자, 단백질), 행동, 수용체, 세포 사멸, 세포 분화, 세포 표면, 구조 단백질, 세포 부착, 세포 소통, 세포 운동성, 효소, 세포 기능(헬리카제, 생합성, 운동, 항산화, 촉매, 대사, 단백분해), 막 융합, 발달, 생물학적 과정을 조절하는 단백질, 신호 변환기 활성을 갖는 단백질, 수용체 활성, 이소머라제 활성, 효소 조절자 활성, 샤페론, 샤페론 조절자, 결합 활성, 전사 조절자 활성, 번역 조절자 활성, 구조 분자 활성, 리가제 활성, 세포외 조직화 활성, 키나제 활성, 생물발생 활성, 리가제 활성 및 핵산 결합 활성을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
표적 단백질은 DNA 메틸 트랜스퍼라제, AKT 경로 단백질, MAPK/ERK 경로 단백질, 티로신 키나제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 섬유모세포 성장 인자 수용체(FGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 에리트로포이에틴 생산 인간 간세포 수용체(Ephs), 트로포미오신 수용체 키나제, 종양 괴사 인자, 아폽토시스 조절자 Bcl-2 패밀리 단백질, 오로라 키나제, 염색질, G-단백질 커플링된 수용체(GPCR), NF-κB 경로, HCV 단백질, HIV 단백질, 아스파르틸 프로테아제, 히스톤 데아세틸라제(HDAC), 글리코시다제, 리파제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT), 시토카인 및 호르몬으로부터 선택될 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
특정 표적 단백질은 ERK1/2, ERK5, A-Raf, B-Raf, C-Raf, c-Mos, Tpl2/Cot, MEK, MKK1, MKK2, MKK3, MKK4, MKK5, MKK6, MKK7, TYK2, JNK1, JNK2, JNK3, MEKK1, MEKK2, MEKK3, MEKK4, ASK1, ASK2, MLK1, MLK2, MLK3, p38α, p38β, p38γ, p38δ, BRD2, BRD3, BRD4, 포스파티딜 이노시톨-3 키나제(PI3K), AKT, 단백질 키나제 A(PKA), 단백질 키나제 B(PKB), 단백질 키나제 C(PKC), PGC1α, SIRT1, PD-L1, mTOR, PDK-1, p70 S6 키나제, 포크헤드 전위 인자, MELK, eIF4E, Hsp90, Hsp70, Hsp60, 토포이소머라제 유형 I, 토포이소머라제 유형 II, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, Cdk11, Cdk2, Cdk3, Cdk4, Cdk5, Cdk6, Cdk7, α-투불린, β-투불린, γ-투불린, δ-투불린, ε-투불린, 야누스 키나제(JAK1, JAK2, JAK3), ABL1, ABL2, EGFR, EPH A1, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6, EPHA7, EPHA8, EPHA10, EPHB1, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB6, HER2/neu, Her3, Her4, ALK, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, IGF1R, INSR, INSRR, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, FLT-3, FLT4,PDGFRA, PDGFRB, CSF1R, Axl, IRAK4, SCFR, Fyn, MuSK, Btk, CSK, PLK4, Fes, MER, c-MET, LMTK2, FRK, ILK, Lck, TIE1, FAK, PTK6, TNNI3, ROSCCK4, ZAP-70, c-Src, Tec, Lyn, TrkA,TrkB, TrkC, RET, ROR1, ROR2, ACK1, Syk, MDM2, HRas, KRas, NRas, ROCK, PI3K, BACE1, BACE2, CTSD, CTSE, NAPSA, PGC, 레닌, MMSET, 오로라 A 키나제, 오로라 B 키나제, 오로라 C 키나제, 파르네실트랜스퍼라제, 텔로머라제, 아데닐릴 사이클라제, cAMP 포스포디에스테라제, PARP1, PARP2, PARP4, PARP-5a, PARP-5b, PKM2, Keap1, Nrf2, TNF, TRAIL, OX40L 림포톡신-알파, IFNAR1, IFNAR2, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFNLR1, CCL3, CCL4, CCL5, IL1α, IL1β, IL-2, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, HCV 헬리카제, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B, NF-κB1, NF-κB2, RelA, RelB, c-Rel, RIP1, ACE, HIV 프로테아제, HIV 인테그라제, Gag, Pol, gp160, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vif, Vpu, RNA 폴리머라제, GABA 트랜스아미나제, 리버스 트랜스크립타제, DNA 폴리머라제, 프롤락틴, ACTH, ANP, 인슐린, PDE, AMPK, iNOS, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, HDAC11, 락타제, 아밀라제, 리소자임, 뉴라미니다제, 인버타제, 키티나제, 히알루로니다제, 말타제, 수크라제, 포스파타제, 포스포릴라제, P, 히스티딘 데카르복실라제, PTEN, 히스톤 리신 데메틸라제(KDM), GCN5, PCAF, Hat1, ATF-2, Tip60, MOZ, MORF, HBO1, p300, CBP, SRC-1, SRC-3, ACTR, TIF-2, TAF1, TFIIIC, 단백질 O-만노실-트랜스퍼라제 1(POMT1), 아밀로이드 β 및 Tau로부터 선택될 수 있다.
표적 세포
본 발명은 살아 있는 세포 또는 죽은 세포가 본 발명의 마이크로비드와 함께 마이크로컴파트먼트화될 수 있기 때문에 표현형, 세포 기반 검정에서 특별한 적용을 발견한다. 이러한 실시양태에서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티는 그 세포에 대해 원하는 활성을 나타내는 화학 구조물에 의해 유도된 표적 세포의 변화에 반응하여 상태를 이동시킨다. 이러한 변화는 시토카인, 대사산물, 독소, 항체, 호르몬, 신호전달 분자 또는 효소의 방출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검정 시스템은 균질한 수성상 검정 시스템일 수 있고, 표현형 스크린을 포함할 수 있다. 그러한 실시양태에서, 검정 시스템은 살아 있는 표적 세포를 포함할 수 있다.
하기에 기재되는 바와 같이 임의의 적합한 표적 세포가 사용될 수 있다.
표적 세포는, 예컨대 (a) 크레나르카에오타(Crenarchaeota); (b) 유리아르카에오타(Euryarchaeota); (c) 코라르카에오타(Korarchaeota); (d) 나노아르카에오타(Nanoarchaeota) 및 (e) 타우마르카에오타(Thaumarchaeota)의 문으로부터 선택되는 고세균, 예컨대 할로페락스 볼카니이(Haloferax volcanii) 또는 술폴로부스 종(Sulfolobus spp.)일 수 있다.
본 발명에 따라 표적 세포로 사용하기에 적합한 원핵 세포는 박테리아 세포를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 표적 세포는 병원성 박테리아일 수 있다. 다른 박테리아 표적 세포는 그람 양성 박테리아(예컨대, 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움(Enterococcus faecium) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 선택됨); 그람 음성 박테리아(예컨대, 클렙시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박테르 바우마니이(Acinetobacter baumanii), 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli), 이. 콜리(E. coli) ST131 균주, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로박테르 클로아카에(Enterobacter cloacae), 엔테로박테르 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 및 네이세리아 고노르호에아에(Neisseria gonorrhoeae)로부터 선택됨) 및 불확정 그람 반응을 나타내는 박테리아로부터 선택되는 세포를 포함한다.
본 발명에 따른 표적 세포로 사용하기에 적합한 진핵 세포는 (a) 진균; (b) 포유동물; (c) 고등 식물 세포; (d) 원생동물; (e) 기생충 세포; (f) 조류; (g) 임상 조직 샘플, 예컨대 인간 환자 샘플로부터 유래된 세포 및 (h) 무척추동물 세포를 포함한다.
적합한 포유동물 세포는 암 세포, 예컨대 인간 암 세포, 근육 세포, 인간 뉴런 세포 및 질환 관련 표현형을 나타내는 살아 있는 인간 환자로부터 유래된 다른 세포를 포함한다.
세포가 진핵 세포(예컨대, 인간 세포)인 경우, 세포는 전능성 세포, 만능성 세포, 유도된 만능성 세포, 다능성 세포, 올리고능성 세포, 줄기 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 체세포, 배선 세포, 말단 분화된 세포, 비분열(유사분열 후) 세포, 유사분열 세포, 일차 세포, 세포주 유래된 세포 및 종양 세포로부터 선택될 수 있다.
세포는 바람직하게는 단리되고/되거나(즉, 천연 세포/조직 환경에 존재하지 않는다), 대사적으로 활성이다(예컨대, 세포 생존 및/또는 활성을 유지 및/또는 세포 성장 또는 증식을 지지하기 위한 배양 또는 수송 배지와 함께 검정 시스템에 존재한다).
적합한 진핵 세포는 유기체, 예컨대 후생동물, 진균(예컨대, 효모), 포유동물, 비포유동물, 식물, 원생동물, 기생충, 조류, 곤충(예컨대, 파리), 어류(예컨대, 제브라피시), 양서류(예컨대, 개구리), 새, 무척추동물 및 척추동물로부터 선택되는 유기체로부터 단리될 수 있다.
적합한 진핵 세포는 또한 포유동물, 설치류, 토끼, 돼지, 양, 염소, 소, 래트, 마우스, 비인간 영장류 및 햄스터로부터 선택되는 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 비인간 질환 모델 또는 이종 유전자, 예컨대 치료 생성물을 인코딩하는 이종 유전자를 발현하는 트랜스제닉 비인간 동물로부터 단리될 수 있다.
표적 세포로서의 박테리아
본 발명에 따라 사용하기 위한 표적 세포는 박테리아 세포일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 박테리아는 (a) 그람 양성, 그람 음성 및/또는 그람 가변 박테리아; (b) 포자 형성 박테리아; (c) 비-포자 형성 박테리아; (d) 사상 박테리아; (e) 세포내 박테리아; (f) 절대 호기성균; (g) 절대 혐기성균; (h) 조건부 혐기성균; (i) 미호기성 박테리아 및/또는 (f) 기회적 박테리아 병원체로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 표적 세포는 하기 속의 박테리아로부터 선택될 수 있다: 아시네토박테르(Acinetobacter)(예컨대, 에이. 바우마니이(A. baumannii)); 아에로모나스(Aeromonas)(예컨대, 에이. 히드로필라(A. hydrophila)); 바실루스(Bacillus)(예컨대, 비. 안트라시스(B. anthracis)); 박테로이데스(Bacteroides)(예컨대, 비. 프라길리스(B. fragilis)); 보르데텔라(Bordetella)(예컨대, 비. 페르투시스(B. pertussis)); 보렐리아(Borrelia)(예컨대, 비. 부르그도르페리(B. burgdorferi)); 브루셀라(Brucella)(예컨대, 비. 아보르투스(B. abortus), 비. 카니스(B. canis), 비. 멜리텐시스(B. melitensis) 및 비. 수이스(B. suis)); 부르크홀데리아(Burkholderia)(예컨대, 비. 세파시아(B. cepacia) 컴플렉스); 캄필로박테르(Campylobacter)(예컨대, 씨. 제주니(C. jejuni)); 클라미디아(Chlamydia)(예컨대, 씨. 트라코마티스(C. trachomatis), 씨. 수이스(C. suis) 및 씨. 무리다룸(C. muridarum)); 클라미도필라(Chlamydophila)(예컨대,(예컨대, 씨. 뉴모니아에(C. pneumoniae), 씨. 페코룸(C. pecorum), 씨. 프시타시(C. psittaci), 씨. 아보르투스(C. abortus), 씨. 펠리스(C. felis) 및 씨. 카비아에(C. caviae)); 시트로박테르(Citrobacter)(예컨대, 씨. 프레운디이(C. f reundii)); 클로스트리디움(Clostridium)(예컨대, 씨. 보툴리눔(C. botulinum), 씨. 디피실레(C. difficile), 씨. 페르프린겐스(C. perfringens) 및 씨. 테타니(C. tetani)); 코리네박테리움(Corynebacterium)(예컨대, 씨. 디프테리아에(C. diphteriae) 및 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)); 엔테로박테르(Enterobacter)(예컨대, 이. 클로아카에(E. cloacae) 및 이. 아에로게네스(E. aerogenes)); 엔테로코쿠스(Enterococcus)(예컨대, 이. 파에칼리스(E. faecalis) 및 이. 파에시움(E. faecium)); 에쉐리키아(Escherichia)(예컨대, 이. 콜리); 플라보박테리움(Flavobacterium); 프란시셀라(Francisella)(예컨대, 에프. 툴라렌시스(F. tularensis)); 푸소박테리움(Fusobacterium)(예컨대, 에프. 네크로포룸(F. necrophorum)); 하에모필루스(Haemophilus)(예컨대, 에이치. 솜누스(H. somnus), 에이치. 인플루엔자에(H. influenzae) 및 에이치. 파라인플루엔자에(H. parainfluenzae)); 헬리코박테르(Helicobacter)(예컨대, 에이치. 필로리(H. pylori)); 클렙시엘라(Klebsiella)(예컨대, 케이. 옥시토카(K. oxytoca) 및 케이. 뉴모니아에(K. pneumoniae)), 레기오넬라(Legionella)(예컨대, 엘. 뉴모필라(L. pneumophila)); 렙토스피라(Leptospira)(예컨대, 엘. 인테로간스(L. interrogans)); 리스테리아(Listeria)(예컨대, 엘. 모노시토게네스(L. monocytogenes)); 모락셀라(Moraxella)(예컨대, 엠. 카타르할리스(M. catarrhalis)); 모르가넬라(Morganella)(예컨대, 엠. 모르가니이(M. morganii)); 미코박테리움(Mycobacterium)(예컨대, 엠. 렙라에(M. leprae) 및 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)); 미코플라스마(Mycoplasma)(예컨대, 엠. 뉴모니아에(M. pneumoniae)); 네이세리아(Neisseria)(예컨대, 엔. 고노르호에아에(N. gonorrhoeae) 및 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)); 파스테우렐라(Pasteurella)(예컨대, 피. 물토시다(P. multocida)); 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus); 프레보텔라(Prevotella); 프로테우스(Proteus)(예컨대, 피. 미라빌리스(P. mirabilis) 및 피. 불가리스(P. vulgaris)), 슈도모나스(Pseudomonas)(예컨대, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa)); 리케트시아(Rickettsia)(예컨대, 알. 리케트시이(R. rickettsii)); 살모넬라(Salmonella)(예컨대, 혈청형. 티피(Typhi) 및 티피무리움(Typhimurium)); 세라티아(Serratia)(예컨대, 에스. 마르세센스(S. marcesens)); 쉬겔라(Shigella)(예컨대, 에스. 플렉스나리아(S. flexnaria), 에스. 디센테리아에(S. dysenteriae) 및 에스. 소네이(S. sonnei)); 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예컨대, 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 하에몰리티쿠스(S. haemolyticus), 에스. 인테르메디우스(S. intermedius), 에스. 에피데르미디스(S. epidermidis) 및 에스. 사프로피티쿠스(S. saprophyticus)); 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)(예컨대, 에스. 말토필라(S. maltophila)); 스트렙토코쿠스(Streptococcus)(예컨대, 에스. 아갈락티아에(S. agalactiae), 에스. 무탄스(S. mutans), 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 및 에스. 피로게네스(S. pyogenes)); 트레포네마(Treponema)(예컨대, 티. 팔리둠(T. pallidum)); 비브리오(Vibrio)(예컨대, 브이. 콜레라에(V. cholerae)) 및 예르시니아(Yersinia)(예컨대, 와이. 페스티스(Y. pestis)).
본 발명에 따라 사용하기 위한 표적 세포는 높은 G+C 그람 양성 박테리아 및 낮은 G+C 그람 양성 박테리아로부터 선택될 수 있다.
표적 세포로서의 병원성 박테리아
인간 또는 동물 박테리아 병원체는 레지오넬라 종(Legionella spp.), 리스테리아 종(Listeria spp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 하프니아 종(Hafnia spp.), 하에모필루스 종(Haemophilus spp.), 프로테우스 종(Proteus spp.), 세라티아 종(Serratia spp.), 쉬겔라 종(Shigella spp.), 비브리오 종(Vibrio spp.), 바실루스 종(Bacillus spp.), 캄필로박테르 종(Campylobacter spp.), 예르시니아 종(Yersinia spp.), 클로스트리디움 종(Clostridium spp.), 엔테로코쿠스 종(Enterococcus spp.), 네이세리아 종(Neisseria spp.), 스트렙토코쿠스 종(Streptococcus spp.), 스타필로코쿠스 종(Staphylococcus spp.), 미코박테리움 종(Mycobactherium spp.), 엔테로박테르 종(Enterobacter spp.)과 같은 박테리아를 포함한다.
표적 세포로서의 진균
본 발명에 따라 사용하기 위한 표적 세포는 진균 세포일 수 있다. 이들은 효모, 예컨대 씨. 알비칸스(C. albicans), 씨. 크루세이(C krusei) 및 씨. 트로피칼리스(C tropicalis)를 포함하는 캔디다(Candida) 종, 아스페르길루스 종(Aspergillus spp.) 및 페니실리움 종(Penicillium spp.)과 같은 사상 진균 및 트리코피톤 종(Trichophyton spp.)과 같은 피부사상균을 포함한다.
표적 세포로서의 식물 병원체
본 발명에 따라 사용하기 위한 표적 세포는 식물 병원체, 예컨대 슈도모나스 종, 크실렐라 종(Xylella spp.), 랄스토니아 종(Ralstonia spp.), 크산토모나스 종(Xanthomonas spp.), 에르위니아 종(Erwinia spp.), 푸사리움 종(Fusarium spp.), 피토프토라 종(Phytophthora spp.), 보트리티스 종(Botrytis spp.), 렙토스파에리아 종(Leptosphaeria spp.), 흰가루병(아스코미코타(Ascomycota)) 및 녹병(바시디오미코타(Basidiomycota))일 수 있다.
표적으로의 암 세포
암세포는 표적 세포로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 세포주로부터 또는 원발성 종양으로부터 유래될 수 있다. 암세포는 포유동물일 수 있고, 바람직하게는 인간이다. 특정 실시양태에서, 암 세포는 흑색종, 폐, 신장, 결장, 전립선, 난소, 유방, 중추신경계 및 백혈병 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적합한 암세포주는 제한 없이 난소암 세포주(예컨대, CaOV-3, OVCAR-3, ES-2, SK-OV-3, SW626, TOV-21G, TOV- 112D, OV-90, MDA-H2774 및 PA-I); 유방암 세포주(예컨대, MCF7, MDA-MB- 231, MDA-MB-468, MDA-MB-361, MDA-MD-453, BT-474, Hs578T, HCC1008, HCC1954, HCC38, HCCl 143, HCCl 187, HCC1395, HCC1599, HCC1937, HCC2218, Hs574.T, Hs742.T, Hs605.T 및 Hs606); 폐암 세포주(예컨대, NCI-H2126, NCI- H1395, NCI-H1437, NCI-H2009, NCI-H1672, NCI-H2171, NCI-H2195, NCI-Hl 184, NCI- H209, NCI-H2107 및 NCI-H128); 피부암 세포주(예컨대, COLO829, TE354.T, Hs925.T, WM-115 및 Hs688(A).T; 골암 세포주(예컨대, Hs919.T, Hs821.T, Hs820.T, Hs704.T, Hs707(A).T, Hs735.T, Hs860.T, Hs888.T, Hs889.T, Hs890.T 및 Hs709.T); 결장암 세포주(예컨대, Caco-2, DLD-I, HCT-116, HT-29 및 SW480); 및 위암 세포주(예컨대, RF-I)를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 암 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 및 내셔날 캔서 인스티튜트(National Cancer Institute)를 포함하는 임의의 편리한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
다른 암 세포주는 증식성 장애, 양성, 전암 및 악성 신생물, 과형성, 화생 및 이형성을 포함하는 신생물 세포/신생물을 앓고 있는 대상체로부터 유래된 것들을 포함한다. 증식성 장애는 제한 없이 암, 암 전이, 평활근 세포 증식, 전신 경화증, 간경변, 성인 호흡 곤란 증후군, 특발성 심근병증, 홍반성 루푸스, 망막병증(예컨대, 당뇨병성 망막증), 심장 과형성, 양성 전립선 과형성, 난소 낭종, 폐 섬유증, 자궁내막증, 섬유종증, 해마토종, 림프관종증, 유육종증 및 데스모이드 종양을 포함한다. 평활근 세포 증식을 포함하는 신생물은 혈관계에서 세포의 과증식(예컨대, 내막 평활근 세포 과형성, 재협착 및 혈관 폐쇄, 특히 혈관성형술과 같은 생물학적 또는 기계적으로 매개된 혈관 손상 후 협착을 포함)을 포함한다. 또한, 내막 평활근 세포 과형성은 혈관계 이외의 평활근에서의 과형성을 포함할 수 있다(예컨대, 신장 간질성 섬유증을 갖는 환자의 담관, 기관지 기도 및 신장의 차단). 비-암성 증식성 장애는 또한 건선 및 그의 다양한 임상 형태와 같은 피부 세포의 과 증식, 라이터 증후군, 모공성홍색비강진 및 각질화 장애의 과증식 변형(광선 각화증, 노인 각화증 및 경피증을 포함)을 포함한다.
표적으로의 세포주
세포주로부터 유래되는 다른 세포가 표적 세포로 사용될 수 있다. 바람직하게는 인간 또는 포유동물일 수 있는 이러한 세포는 검출 가능한 세포 표현형을 갖는 희귀 질환을 앓고 있는 환자로부터의 것을 포함한다. 세포는 제한 없이 혈액 세포, 면역 세포, 골수 세포, 피부 세포, 신경 조직 및 근육 세포를 포함하는 임의의 유형일 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC) 및 내셔날 캔서 인스티튜트를 포함하는 임의의 편리한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
예컨대, 세포/세포주는, 예컨대 리소솜 저장 질환, 근육 디스트로피, 낭포성 섬유증, 마르판 증후군, 겸상 적혈구 빈혈, 왜소증, 페닐케톤뇨증, 신경섬유종증, 헌팅턴 질환, 골형성 불완전증, 지중해 빈혈 및 혈색소침착증을 앓고 있는 대상체로부터 유래될 수 있다.
세포/세포주는, 예컨대 혈액, 응고, 세포 증식 및 조절곤란, 신생물(암을 포함), 염증 과정, 면역 시스템(자가면역 질환을 포함), 대사, 간, 신장, 근골격, 신경계, 신경, 뉴론 및 눈 조직의 질환 및 장애를 포함하는 다른 질환을 앓고 있는 대상체로부터 유래될 수 있다. 예시적인 혈액 및 응고 질환 및 장애는 빈혈, 베어 림프구 증후군, 출혈 장애, 인자 H의 결핍, 인자 H-유사 1, 인자 V, 인자 VIII, 인자 VII, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIIIA, 인자 XIIIB, 판코니 빈혈, 혈구 혈구포식 림프조직구증, 혈우병 A, 혈우병 B, 출혈 장애, 백혈구 결핍, 겸상 적혈구 빈혈 및 지중해 빈혈을 포함한다.
면역 관련 질환 및 장애의 예는 AIDS; 자가면역 림프증식 증후군; 복합 면역 결핍; HIV-1; HIV 감수성 또는 감염; 면역결핍 및 중증 복합 면역결핍(SClD)을 포함한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 자가면역 질환은 그레이브 질환, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 백반증, I형(조기 발병) 당뇨병, 악성 빈혈, 다발성 경화증, 사구체신염, 전신성 루푸스 E(SLE, 루푸스) 및 쇼그렌 증후군을 포함한다. 다른 자가면역 질환은 경피증, 건선, 강직성 척추염, 중증 근무력증, 천포창, 다발성 근염, 피부 근염, 포도막염, 길랭-바레 증후군, 크론 질환 및 궤양성 결장염(종종 총칭하여 염증성 장 질환(IBD)으로 지칭됨)을 포함한다.
다른 예시적인 질환은 아밀로이드 신경병증; 아밀로이드증; 낭포성 섬유증; 리소솜 저장 질환; 간 선종; 간부전; 신경 장애; 간 리파아제 결핍; 간모세포종, 암 또는 암종; 수질 낭성 신장 질환; 페닐케톤뇨증; 다낭성 신장; 또는 간 질환을 포함한다.
예시적인 근골격 질환 및 장애는 근 디스트로피(예컨대, 뒤시엔느 및 베커 근 디스트로피), 골다공증 및 근 위축을 포함한다.
예시적인 신경 및 뉴론 질환 및 장애는 ALS, 알츠하이머 질환; 자폐증; 취약 X 증후군, 헌팅턴 질환, 파킨슨 질환, 정신분열증, 세크레타제 관련된 장애, 트리뉴클레오티드 반복 장애, 케네디 질환, 프리드리히 운동실조, 마차도-요셉 질환, 척수소뇌 운동실조, 근육긴장 디스트로피 및 치아적핵 담창구루이체 위축(DRPLA)을 포함한다.
예시적인 눈 질환은 연령 관련된 황반 변성, 각막 혼탁 및 디스트로피, 선천성 편평 각막, 녹내장, 레버 선천성 흑암시 및 황반 디스트로피를 포함한다.
세포/세포주는, 예컨대 특히 신경퇴행성 장애(예컨대, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환 및 헌팅턴 질환)을 포함하는 응집성 및 미스폴딩 단백질항상성 질환을 포함하는 단백질항상성 결핍에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환, 리소솜 저장 장애, 당뇨병, 폐기종, 암 및 낭포성 섬유증을 앓고 있는 대상체로부터 유래될 수 있다.
표적 세포로서의 고세균
표적 세포는, 예컨대 (a) 크레나르카에오타; (b) 유리아르카에오타; (c) 코라르카에오타; (d) 나노아르카에오타 및 (e) 타우마르카에오타의 문으로부터 선택되는 고세균, 예컨대 할로페락스 볼카니이 또는 술폴로부스 종일 수 있다.
예시적인 고세균 속은 아시디아누스(Acidianus), 아시딜로부스(Acidilobus), 아시도코쿠스(Acidococcus), 아시둘리프로푼둠(Aciduliprofundum), 아에로피룸(Aeropyrum), 아르카에오글로부스(Archaeoglobus), 바실로비리다에(Bacilloviridae), 칼디스파에라(Caldisphaera), 칼디비르가(Caldivirga), 칼도코쿠스(Caldococus), 세나르카에움(Cenarchaeum), 데술푸로코쿠스(Desulfurococcus), 페로글로부스(Ferroglobus), 페로플라스마(Ferroplasma), 게오겜마(Geogemma), 게오글로부스(Geoglobus), 할라답타우스(Haladaptaus), 할랄칼리코쿠스(Halalkalicoccus), 할로알칼로필리움(Haloalcalophilium), 할로아르쿨라(Haloarcula), 할로박테리움(Halobacterium), 할로바쿨룸(Halobaculum), 할로비포르마(Halobiforma), 할로코쿠스(Halococcus), 할로페락스(Haloferax), 할로게오메트리쿰(Halogeometricum), 할로미크로비움(Halomicrobium), 할로피게르(Halopiger), 할로플라누스(Haloplanus), 할로쿠아드라툼(Haloquadratum), 할로르하브두스(Halorhabdus), 할로루브룸(Halorubrum), 할로사르시나(Halosarcina), 할로심플렉스(Halosimplex), 할로스타그니콜라(Halostagnicola), 할로테리게나(Haloterrigena), 할로비박스(Halovivax), 히페르테르무스(Hyperthermus), 이그니코쿠스(Ignicoccus), 이그니스파에라(Ignisphaera), 메탈로스파에라(Metallosphaera), 메타니미크로코쿠스(Methanimicrococcus), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메타노브레비박테르(Methanobrevibacter), 메타노칼쿨루스(Methanocalculus), 메탄특살도코쿠스(Methantxaldococcus), 메타노셀라(Methanocella), 메타노코코이데스(Methanococcoides), 메타노코쿠스(Methanococcus), 메타노코르푸스쿨룸(Methanocorpusculum), 메타노쿨레우스(Methanoculleus), 메타노폴리스(Methanofollis), 메타노게니움(Methanogenium), 메타노할로비움(Methanohalobium), 메타노할로필루스(Methanohalophilus), 메타놀라시니아(Methanolacinia), 메타놀로부스(Methanolobus), 메타노메틸로보란스(Methanomethylovorans), 메타노미크로비움(Methanomicrobium), 메타노플라누스(Methanoplanus), 메타노피루스(Methanopyrus), 메타노레굴라(Methanoregula), 메타노사에타(Methanosaeta), 메타노살숨(Methanosalsum), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노스파에라(Methanosphaera), 메타노스피릴룸(Melthanospirillum), 메타노써모박테르(Methanothermobacter), 메타노써모코쿠스(Methanothermococcus), 메타노쎄라무스(Methanothermus), 메타노트릭스(Methanothrix), 메타노토리스(Methanotorris), 나노아르카에움(Nanoarchaeum), 나트리알바(Natrialba), 나트리네마(Natrinema), 나트로노박테리움(Natronobacterium), 나트로노코쿠스(Natronococcus), 나트로놀림노비우스(Natronolimnobius), 나트로노모나스(Natronomonas), 나트로노루브룸(Natronorubrum), 니트라코푸밀루스(Nitracopumilus), 팔라에오코쿠스(Palaeococcus), 피크로필루스(Picrophilus), 피로바쿨룸(Pyrobaculum), 피로코쿠스(Pyrococcus), 피로딕티움(Pyrodictium), 피롤로부스(Pyrolobus), 스타필로쎄르무스(Staphylothermus), 스테테리아(Stetteria), 스티기올로부스(Stygiolobus), 술폴로부스, 술포포보코쿠스(Sulfophobococcus), 술푸리스파에라(Sulfurisphaera), 써모클라디움(Thermocladium), 써모코쿠스(Thermococcus), 써모디스쿠스(Thermodiscus), 써모필룸(Thermofilum), 써모플라스마(Thermoplasma), 써모프로테우스(Thermoproteus), 써모스파에라(Thermosphaera) 및 불카니사에타(Vulcanisaeta)을 포함한다.
예시적인 고세균 종은 아에로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix), 아르카에글로부스 풀기두스(Archaeglobus fulgidus), 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 데술포르코쿠스 종 TOK(Desulforcoccus species TOK), 메타노박테리움 써모안토로피쿰(Methanobacterium thermoantorophicum), 메타노코쿠스 얀나시이(Methanococcus jannaschii), 피로바쿨룸 아에로필룸(Pyrobaculum aerophilum), 피로바쿨룸 칼리디폰티스(Pyrobaculum calidifontis), 피로바쿨룸 이슬란디쿰(Pyrobaculum islandicum), 피로코쿠스 아비시(Pyrococcus abyssi), 피로코쿠스 GB-D(Pyrococcus GB-D), 피로코쿠스 글리코보란스(Pyrococcus glycovorans), 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii), 피로코쿠스 종 GE23(Pyrococcus spp. GE23), 피로코쿠스 종 ST700(Pyrococcus spp. ST700), 피로코쿠스 워우시(Pyrococcus woesii), 피로딕티움 옥쿨툼(Pyrodictium occultum), 술폴로부스 아시도칼다리움(Sulfolobus acidocaldarium), 술폴로부스 솔라타리쿠스(Sulfolobus solataricus), 술폴로부스 토코달리이(Sulfolobus tokodalii), 써모코쿠스 아그레간스(Thermococcus aggregans), 써모코쿠스 바로시이(Thermococcus barossii), 써모코쿠스 셀레르(Thermococcus celer), 써모코쿠스 퓨미콜란스(Thermococcus fumicolans), 써모코쿠스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius), 써모코쿠스 히드로써말리스(Thermococcus hydrothermalis), 써모코쿠스 온누리네우스 NA1(Thermococcus onnurineus NA1), 써모코쿠스 팔시피쿠스(Thermococcus pacificus), 써모코쿠스 프로푼두스(Thermococcus profundus), 써모코쿠스 시쿨리(Thermococcus siculi), 써모코쿠스 종 GE8(Thermococcus spp. GE8), 써모코쿠스 종 JDF-3(Thermococcus spp. JDF-3), 써모코쿠스 종 TY(Thermococcus spp. TY), 써모코쿠스 티오레두센스(Thermococcus thioreducens), 써모코쿠스 질리그티(Thermococcus zilligti), 써모플라스마 아시도필룸(Thermoplasma acidophilum), 써모플라스마 볼카니움(Thermoplasma volcanium), 아시디아누스 호스피탈리스(Acidianus hospitalis), 아시딜로부스 사카로보란스(Acidilobus sacharovorans), 아시둘리프로푼둠 부네이(Aciduliprofundum boonei), 아에로피룸 페르닉스(Aeropyrum pernix), 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus), 아르카에오글로부스 프로푼두스(Archaeoglobus profundus), 아르카에오글로부스 베네피쿠스(Archaeoglobus veneficus), 칼디비르가 마퀼린겐시스(Caldivirga maquilingensis), 칸디다투스 코라르카에움 크립토필룸(Candidatus Korarchaeum cryptofilum), 칸디다투스 메타노레굴라 부네이(Candidatus Methanoregula boonei), 칸디다투스 니트로소아르카에움 림니아(Candidatus Nitrosoarchaeum limnia), 세나르카에움 심비오숨(Cenarchaeum symbiosum), 데술푸로코쿠스 캄카트켄시스(Desulfurococcus kamchatkensis), 페로글로부스 플라시두스(Ferroglobus placidus), 페로플라스마 아시다르마누스(Ferroplasma acidarmanus), 할랄칼리코쿠스 제오트갈리(Halalkalicoccus jeotgali), 할로아르쿨라 히스파니카(Haloarcula hispanica), 할라오아르쿨라 마리스모르투이(Holaoarcula marismortui), 할로박테리움 살리나룸(Halobacterium salinarum), 할로박테리움 종(Halobacterium species), 할로비포르마 루시살시(Halobiforma lucisalsi), 할로페락스 볼바니이(Haloferax volvanii), 할로게오메트리쿰 보린??세(Halogeometricum borinquense), 할로미크로비움 무코하타에이(Halomicrobium mukohataei), 할로필릭 아르카세온 종 DL31(halophilic archaceon sp. DL31), 할로피게르 크산나두엔시스(Halopiger xanaduensis), 할로쿠아드라툼 왈스비이(Haloquadratum walsbyi), 할로르하브두스 티아마테아(Halorhabdus tiamatea), 할로르하브두스 우타헨시스(Halorhabdus utahensis), 할로루브룸 라쿠스프로푼디(Halorubrum lacusprofundi), 할로테리게나 투르크메니카(Haloterrigena turkmenica), 히페르테르무스 부틸리쿠스(Hyperthermus butylicus), 이그니오코쿠스 호스피탈리스(Igniococcus hospitalis), 이그니스파에라 아그레간스(Ignisphaera aggregans), 메탈로스파에라 쿠프리나(Metallosphaera cuprina), 메탈로스파에라 세둘라(Metallosphaera sedula), 메타노박테리움 종 AL-21(Methanobacterium sp. AL-21), 메타노박테리움 종 SWAN-1(Methanobacterium sp. SWAN-1), 메타노박테리움 써모아우트로피쿰(Methanobacterium thermoautrophicum), 메타노브레비박테르 루미난티움(Methanobrevibacter ruminantium), 메타노브레비박테르 스미티이(Methanobrevibacter smithii), 메타노칼도코쿠스 페르벤스(Methanocaldococcus fervens), 메타노칼도코쿠스 인페르누스(Methanocaldococcus infernus), 메타노칼도코쿠스 얀나시이(Methanocaldococcus jannaschii), 메타노칼도코쿠스 종 FS406-22(Methanocaldococcus sp. FS406-22), 메타노칼도코쿠스 불카니우스(Methanocaldococcus vulcanius), 메타노셀라 콘라디이(Methanocella conradii), 메타노셀라 팔루디콜라(Methanocella paludicola), 메타노셀라 종 라이스 클러스터 I(RC-I)(Methanocella sp. Rice Cluster I (RC-I)), 메타노코코이데스 부르토니이(Methanococcoides burtonii), 메타노코쿠스 아에올리쿠스(Methanococcus aeolicus), 메타노코쿠스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis), 메타노코쿠스 바니엘리이(Methanococcus vannielii), 메타노코쿠스 볼타에(Methanococcus voltae), 메타노코르푸스쿨룸 라브레안툼(Methanocorpusculum labreantum), 메타노쿨레우스 마리스니그리(Methanoculleus marisnigri), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 메타노할로필루스 마히이(Methanohalophilus mahii), 메타노플라누스 페트롤레아리우스(Methanoplanus petrolearius), 메타노피루스 칸들레리(Methanopyrus kandleri), 메타노사에타 콘실리이(Methanosaeta concilii), 메타노사에타 하룬디나세아(Methanosaeta harundinacea), 메타노사에타 써모필라(Methanosaeta thermophila), 메타노살숨 질리나에(Methanosalsum zhilinae), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans), 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei), 메타노스파에라 스타드트마나에(Methanosphaera stadtmanae), 메타노스파에룰라 팔루스트리스(Methanosphaerula palustris), 메타노스피리울룸 훈가테이(Methanospiriullum hungatei), 메타노써모박테르 마르부르겐시스(Mathanothermobacter marburgensis), 메타노써모코쿠스 오키나웬시스(Methanothermococcus okinawensis), 메타노쎄라무스 페르비두스(Methanothermus fervidus), 메타노토리스 이그네우스(Methanotorris igneus), 나노아르카에움 에퀴탄스(Nanoarchaeum equitans), 나트리알바 아시아티카(Natrialba asiatica), 나트리알바 마가디이(Natrialba magadii), 나트로노모나스 파라오니스(Natronomonas pharaonis), 니트로소푸밀루스 마리티무스(Nitrosopumilus maritimus), 피크로필루스 토리두스(Picrophilus torridus), 피로바쿨룸 아에로필룸(Pyrobaculum aerophilum), 피로바쿨룸 아르세나티쿰(Pyrobaculum arsenaticum), 피로바쿨룸 칼리디폰티스(Pyrobaculum calidifontis), 피로바쿨룸 이슬란디쿰(Pyrobaculum islandicum), 피로바쿨룸 종 1860(Pyrobaculum sp. 1860), 피로코쿠스 아비시(Pyrococcus abyssi), 피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii), 피로코쿠스 종 NA42(Pyrococcus sp. NA42), 피로코쿠스 야야노시이(Pyrococcus yayanosii), 피롤로부스 푸마리이(Pyrolobus fumarii), 스타필로쎄르무스 헬레니쿠스(Staphylothermus hellenicus), 스타필로쎄르무스 마리누스(Staphylothermus marinus), 술폴로부스 아시도칼디리우스(Sulfolobus acidocaldirius), 술폴로부스 이슬란디쿠스(Sulfolobus islandicus), 술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 술폴로부스 토코다이(Sulfolobus tokodaii), 써모코쿠스 바로필루스(Thermococcus barophilus), 써모코쿠스 감마톨레란스(Thermococcus gammatolerans), 써모코쿠스 코다카라엔시스(Thermococcus kodakaraensis), 써모코쿠스 리토랄리스(Thermococcus litoralis), 써모코쿠스 온누리네우스(Thermococcus onnurineus), 써모코쿠스 시비리쿠스(Thermococcus sibiricus), 써모코쿠스 종 4557(Thermococcus sp. 4557), 써모코쿠스 종 AM4(Thermococcus sp. AM4), 써모필룸 펜덴스(Thermofilum pendens), 써모플라스마 아시도필룸(Thermoplasma acidophilum), 써모플라스마 볼카니움(Thermoplasma volcanium), 써모프로테우스 뉴트로필루스(Thermoproteus neutrophilus), 써모프로테우스 테낙스(Thermoproteus tenax), 써모프로테우스 우조니엔시스(Thermoproteus uzoniensis), 써모스파에라 아그레간스(Thermosphaera aggregans), 불카니사에타 디스트리부타(Vulcanisaeta distributa), 및 불카니사에타 모우트노브스키아(Vulcanisaeta moutnovskia)를 포함한다.
본 발명에 따른 생산자 세포로서 유용한 고세균 세포의 특정 예는 할로페락스 볼카니이 및 술폴로부스 종을 포함한다.
라이브러리 마이크로컴파트먼트
본 발명의 마이크로비드는 마이크로컴파트먼트화될 때 HTS에 사용될 수 있다. 라이브러리 마이크로컴파트먼트는 마이크로비드로부터 방출되는 TCS의 공간적 회합이 유지되는 한 임의의 형태를 취할 수 있다. 즉, 마이크로컴파트먼트화는 TCS 및 이것이 방출된 동족 마이크로비드가 공간적 근접성에 제한되도록 달성되어야 한다.
화학 구조물은 세포 기반 또는 표현형 스크린, 특히 균질한 세포 기반 표현형 검정을 허용하기에 충분히 높은 농도로 라이브러리 마이크로컴파트먼트(들)에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 태그부착된 화학 구조물은 적어도 0.1 nM, 0.5 nM, 1.0 nM, 5.0 nM, 10.0 nM, 15.0 nM, 20.0 nM, 30.0 nM, 50.0 nM, 75.0 nM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 5.0 μM, 10.0 μM, 15.0 μM, 20.0 μM, 30.0 μM, 50.0 μM, 75.0 μM, 100.0 μM, 200.0 μM, 300.0 μM, 500.0 μM, 1 mM, 2 mM, 5 mM 또는 10 mM의 농도로 라이브러리 마이크로컴파트먼트(들)에 존재할 수 있다.
다른 실시양태에서, 화학 구조물은 적어도 0.1 pM, 0.5 pM, 1.0 pM, 5.0 pM, 10.0 pM, 15.0 pM, 20.0 pM, 30.0 pM, 50.0 pM, 75.0 pM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1.0 nM 5.0 nM, 10.0 nM, 15.0 nM, 20.0 nM, 30.0 nM, 50.0 nM, 75.0 nM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 5.0 μM, 10.0 μM, 15.0 μM, 20.0 μM, 30.0 μM, 50.0 μM, 75.0 μM, 100.0 μM, 200.0 μM, 300.0 μM, 500.0 μM, 1 mM, 2 mM, 5 mM 또는 10 mM의 농도로 라이브러리 마이크로컴파트먼트(들)에 존재할 수 있다.
다른 실시양태에서, 화학 구조물은 1 μM 미만; 1-100 μM; 100 μM 초과; 5-50 μM 또는 10-20 μM의 농도로 라이브러리 마이크로컴파트먼트(들)에 존재할 수 있다.
라이브러리 마이크로컴파트먼트는 본 발명의 마이크로비드 및 수성 용매를 포함한다. 마이크로컴파트먼트는 또한 마이크로비드로부터 용액으로 화학 구조물(들)을 방출하기 위한 절단제와 같은 다른 성분 및/또는 상기 표적 검정 시스템의 하나 이상의 추가 성분(들)을 함유할 수 있다. 표적이 세포인 실시양태에서, 라이브러리 마이크로컴파트먼트는 또한 하나 이상의 표적 세포를 함유할 수 있다.
본 발명의 방법은 마이크로비드로부터 각각의 화학 구조물을 방출하여 복수의 유리된 태그 없는 화학 구조물(TCS)를 생성하는 단계를 포함한다. TCS는 확산, 예컨대 용매화 후 확산에 의해 라이브러리 마이크로컴파트먼트로 편리하게 방출된다.
물리적 제한은 마이크로액적, 마이크로입자 및 마이크로소포를 포함한 다양한 마이크로컴파트먼트를 사용하여 달성될 수 있다. 하기 섹션에서 더 자세히 기재되는 바와 같이 마이크로액적이 바람직하다.
마이크로액적
본 발명에 따른 마이크로컴파트먼트화에 사용하기에 적합한 마이크로액적을 제조 및 처리하기에 적합한 물질 및 방법은, 예컨대 WO2010/009365, WO2006/040551, WO2006/040554, WO2004/002627, WO2004/091763, WO2005/021151, WO2006/096571, WO2007/089541, WO2007/081385 및 WO2008/063227(이들의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되는 당업자의 일반적인 지식의 일부를 형성한다.
마이크로액적의 크기는 캡슐화될 화학 구조물 및 검정 시스템의 특성을 참조하여 선택될 것이다. 마이크로액적은 (a) 1 μm 미만; (b) 10 μm 미만; (c) 0.1-10 μm; (d) 10 μm 내지 500 μm; (b) 10 μm 내지 200 μm; (c) 10 μm 내지 150 μm; (d) 10 μm 내지 100 μm; (e) 10 μm 내지 50 μm; 또는 (f) 약 100 μm의 직경을 갖는 실질적으로 구형일 수 있다.
마이크로액적은 바람직하게는 동일한 라이브러리 내의 다른 액적의 직경과 비교하여 라이브러리 내의 임의의 액적의 직경이 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 0.5% 미만으로 변할 수 있도록 크기가 균일하다. 일부 실시양태에서, 마이크로액적은 단분 산성이다. 그러나, 다분산 마이크로액적도 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
단일 W/O 유형 에멀젼에서, 캐리어 액체는 임의의 수-비혼화성 액체, 예컨대 오일일 수 있으며, 임의로 (a) 탄화수소 오일; (b) 플루오로카본 오일; (c) 에스테르 오일; (d) 실리콘 오일; (e) 수성상의 생물학적 성분에 대한 용해도가 낮은 오일; (f) 마이크로액적 사이의 분자 확산을 억제하는 오일; (g) 소수성 및 소유성인 오일; (h) 기체에 대한 용해도가 우수한 오일; 및/또는 (i) 전술된 것 중 임의의 2개 이상의 조합으로부터 선택된다.
따라서, 마이크로액적은 W/O 에멀젼에 포함될 수 있으며, 마이크로액적은 수성 분산상을 구성하고 캐리어 액체는 연속 오일상을 구성한다.
다른 실시양태에서, 마이크로액적은 W/O/W 이중 에멀젼에 포함되고 캐리어 액체는 수성 액체일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 수성 액체는 포스페이트 완충된 식염수(PBS)일 수 있다.
따라서, 마이크로액적은 W/O/W 이중 에멀젼에 포함될 수 있으며, 마이크로액적은 (a) 분산상으로서 외부 오일 쉘에 둘러싸인 수성 성장 배지의 내부 코어, 및 (b) 연속적인 수성상으로서 캐리어 액체를 포함한다. 물론 O/W/O 액적은 비-생물학적 실체를 스크리닝하는 데 특히 유용할 수 있음을 인식할 것이다.
마이크로액적에 사용하기 위한 계면활성제
마이크로액적이 에멀젼에 포함되는 실시양태에서, 캐리어 액체는 연속상을 구성하고 마이크로액적은 분산상을 구성할 수 있으며, 이러한 실시양태에서 에멀젼은 계면활성제 및 임의적으로 보조 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.
계면활성제 및/또는 보조 계면활성제는 분산상 및 연속상의 계면에 위치될 수 있으며, 마이크로액적이 W/O/W 이중 에멀젼에 포함되는 경우 계면활성제 및/또는 보조 계면활성제는 수성 코어 및 오일 쉘의 계면 및 오일 쉘 및 외부 연속상의 계면에 위치될 수 있다.
광범위한 적합한 계면활성제가 이용 가능하며, 당업자는 선택된 스크리닝 파라미터에 따라 적절한 계면활성제(및 필요한 경우 보조 계면활성제)를 선택할 수 있을 것이다. 예컨대, 적합한 계면활성제는 문헌(Bernath et al. (2004) Analytical Biochemistry 325: 151-157; Holtze and Weitz (2008) Lab Chip 8(10): 1632-1639; and Holtze et al. (2008) Lab Chip. 8(10):1632-1639)에 기재되어 있다. 특히 플루오로 계면활성제를 포함하는 다른 적합한 계면활성제는 WO2010/009365 및 WO2008/021123(이들의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
계면활성제(들) 및/또는 보조 계면활성제(들)는 바람직하게는 W/O 계면(들)에 혼입되어 단일 W/O 유형 에멀젼이 사용되는 실시양태에서 계면활성제(들) 및/또는 보조 계면활성제(들)는 수성 성장 배지 마이크로액적 및 연속(예컨대, 오일)상의 계면에 존재할 수 있다. 유사하게, 이중 W/O/W 유형 에멀젼이 본 발명에 따른 공동 캡슐화에 사용되는 경우, 계면활성제(들) 및/또는 보조 계면활성제(들)는 수성 코어 및 비혼화성(예컨대, 오일) 쉘의 계면 및 오일 쉘과 수성 연속상 사이의 계면 중 하나 또는 둘 모두에 존재할 수 있다.
계면활성제(들)는 바람직하게는 생체적합성이다. 예컨대, 계면활성제(들)는 스크린에서 사용되는 임의의 세포에 대해 무독성으로 선택될 수 있다. 선택된 계면활성제(들)는 또한 임의의 캡슐화된 세포의 성장 및/또는 생존력에 필요할 수 있는 기체에 대해 우수한 용해도를 가질 수 있다.
생체적합성은 세포 수준에서 생체적합성에 대해 대리자 역할을 하는 참조 민감성 생화학적 검정(예컨대, 시험관내 번역)과의 호환성 시험에 기반한 검정을 포함한 임의의 적절한 검정에 의해 결정될 수 있다. 예컨대, 형광성 기질(플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드(FDG))과 함께 효소 β-갈락토시다제를 코딩하는 플라스미드 DNA의 시험관내 번역(IVT)은, 캡슐화된 DNA, 전사 및 번역에 관련된 분자, 번역된 단백질이 액적 계면에 흡착되지 않으며 단백질의 고차 구조를 그대로 유지하는 경우, 형광 생성물이 형성되기 때문에 생체적합성 지시자로 사용될 수 있다.
생체적합성은 또한 계면활성제 존재 하에 검정에 사용될 세포를 성장시키고 항체 또는 생존 세포 염료로 세포를 염색하고 계면활성제 부재 하의 대조군과 비교하여 세포 집단에 대한 전체 생존력을 결정함으로써 결정될 수 있다.
계면활성제(들)는 또한 마이크로액적 계면에서 생체분자의 흡착을 방지할 수 있다. 계면활성제는 또한 개별 마이크로액적 (및 상응하는 마이크로배양물)을 단리하는 기능을 할 수 있다. 계면활성제는 바람직하게는 마이크로액적을 안정화(즉, 유착을 방지)한다. 안정화 성능은 위상차 현미경, 광 산란, 집속 빔 반사 측정, 원심분리 및/또는 유변학 등으로 모니터링될 수 있다.
계면활성제는 또한 검정 시스템의 기능적 부분을 형성할 수 있으며, 예컨대 다른 성분으로부터 검정에 존재하는 반응물 및/또는 검정물 및/또는 다른 모이어티(예컨대, 방출된 태그)를 분할하거나 격리하는 역할을 할 수 있다. 예컨대, 기능성 계면활성제의 친수성 헤드기의 니켈 복합체는 표면에 히스티딘 태그부착된 단백질을 농축할 수 있다(예컨대, 문헌(Kreutz et al. (2009) J Am Chem Soc. 131(17): 6042-6043) 참조). 이러한 작용화된 계면활성제는 또한 소분자 합성을 위한 촉매 역할을 할 수 있다(예컨대, 문헌(Theberge et al. (2009) Chem. Commun.: 6225-6227) 참조). 또한, 세포 용해를 유발하는 데 사용될 수 있다(예컨대, 문헌(Clausell-Tormos et al. (2008) Chem Biol. 15(5): 427-37) 참조). 따라서, 본 발명은 이러한 작용화된 계면활성제의 사용을 고려한다.
에멀젼 공동 캡슐화에 사용하기 위한 오일
본 발명에 따라 사용하기 위한 마이크로액적 에멀젼의 형성에 분산상과 비혼화성인 임의의 액체가 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이지만, 비혼화성 유체는 전형적으로 오일이다.
바람직하게는, 수성상의 생물학적 성분에 대해 낮은 용해도를 갖는 오일이 선택된다. 다른 바람직한 기능적 특성은 기체에 대한 조정 가능한(예컨대, 높거나 낮은) 용해도, 마이크로액적 사이의 분자 확산을 억제하는 능력 및/또는 조합된 소수성과 소유성을 포함한다. 오일은 탄화수소 오일, 예컨대 경질 미네랄 오일, 플루오로카본 오일, 실리콘 오일 또는 에스테르 오일일 수 있다. 2개 이상의 상기 기재된 오일의 혼합물이 또한 바람직하다.
적합한 오일의 예는 WO2010/009365, WO2006/040551, WO2006/040554, WO2004/002627, WO2004/091763, WO2005/021151, WO2006/096571, WO2007/089541, WO2007/081385 및 WO2008/063227(이들의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
마이크로액적 유화 과정
광범위한 상이한 유화 방법이 당업자에게 공지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 발명의 마이크로액적을 생성하는 데 이용될 수 있다.
많은 유화 기술은 벌크 과정에서 2개의 액체를 혼합하는 것을 수반하며, 종종 난류를 사용하여 액적 분해를 향상시킨다. 이러한 방법은 볼텍싱, 음파처리, 균질화 또는 이들의 조합을 포함한다.
유화에 대한 이들 "하향식" 접근법에서는 개별 액적의 형성을 거의 제어할 수 없으며, 전형적으로 마이크로액적 크기의 광범위한 분포가 생성된다. 대안적인 "상향식" 접근법은 개별 액적 수준에서 작동하며 마이크로유체 디바이스의 사용을 수반할 수 있다. 예컨대, 에멀젼은 오일 스트림 및 물 스트림을 T자형 접합부에서 충돌시킴으로써 마이크로유체 디바이스에서 형성될 수 있으며; 생성된 마이크로액적은 각각의 스트림의 유속에 따라 크기가 다르다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 마이크로액적을 생성하기 위한 바람직한 과정은 (예컨대, 문헌(Anna et al. (2003) Appl. Phys. Lett. 82(3): 364-366)에 기재되는 바와 같이) 유동 집속을 포함한다. 여기에서 분산상(집속된 또는 코어 유체)의 측면에 있거나 둘러싸는 연속상 유체(집속하는 또는 시스(sheath) 유체)는 두 유체가 모두 압출되는 오리피스 부근에서 액적 파괴를 생성한다. 유동 집속 디바이스는 연속 집속 유체 공급으로 가압되는 압력 챔버로 이루어진다. 내부에서는 압력 챔버를 외부 주변 환경과 연결하는 작은 오리피스 앞에서 끝이 열리는 모세관 공급 튜브를 통해 하나 이상의 집속된 유체가 주입된다. 집속하는 유체 스트림은 유체 메니스커스를 커스프로 몰딩하여 오리피스를 통해 챔버를 빠져 나가는 안정적인 마이크로 또는 나노 제트를 발생시키고; 제트 크기는 출구 오리피스보다 훨씬 작다. 모세관 불안정성은 안정된 제트를 균질한 액적 또는 기포로 분해한다.
공급 튜브는 2개 이상의 동심 바늘로 구성될 수 있으며 상이한 비혼화성 액체 또는 기체가 주입되어 화합물 액적이 발생한다. 유동 집속은 제트가 분해될 때 초당 최대 수백만 개의 액적을 제어할 수 있을 뿐만 아니라 매우 빠르게 생성할 수 있도록 한다.
다른 마이크로유체 처리 기술은 전기장을 사용하여 시약을 수성 액적에 주입하는 기술인 피코 주입을 포함한다(예컨대, 문헌(Eastburn et al. (2013) Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR. PLoS ONE 8(4): e62961. doi:10.1371/journal.pone.0062961) 참조). 마이크로액적은, 예컨대 전기융합에 의해 능동적으로(예컨대, 문헌(Tan and Takeuchi (2006) Lab Chip. 6(6): 757-63) 참조) 또는 (문헌(Simon and Lee (2012) "Microdroplet Technology", in Integrated Analytical Systems pp 23-50, 10.1007/978-1-4614-3265-4_2)에서 검토되는 바와 같이) 수동적으로 2개의 시약을 합치기 위해 융합될 수 있다.
모든 경우에서, 선택된 마이크로액적 형성 과정의 성능은 위상차 현미경, 광 산란, 집속 빔 반사 측정, 원심분리 및/또는 유변학에 의해 모니터링될 수 있다.
형광 활성화된 마이크로액적 분류
본원에서 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 마이크로비드를 적은 부피의 용매에서 개별 마이크로액적 형태로 마이크로컴파트먼트화하는 것을 수반하기 때문에 고처리량 스크리닝에 적합하다. 이를 통해 각각의 마이크로액적을 별도의 배양 용기로 처리할 수 있어 확립된 마이크로유체 및/또는 세포 분류 방법을 이용하여 다수의 개별 액체 공동 배양물을 신속하게 스크리닝할 수 있다.
마이크로액적은 널리 확립된 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 디바이스 및 프로토콜을 적용하여 분류될 수 있다. 이 기술은 형광 활성화된 액적 분류(FADS)로 불리며, 예컨대 문헌(Baret et al. (2009) Lab Chip 9: 1850-1858)에 기재되어 있다. 형광 모이어티를 사용하여 검출될 수 있는 어떠한 변화도 스크리닝될 수 있다.
앞서 설명되는 같이, 마이크로액적 내에 함유된 마이크로비드에 고정된 리포터 모이어티의 상태 변화는 형광 신호일 수 있다. 이는 FADS의 적용을 허용한다. 예컨대, 애쿼레아 빅토리아(Aequorea victoria)의 야생형 형광 단백질(GFP)(Chalfie et al. 1994, Science 263:802-805) 및 변형된 GFP(Heim et al. 1995, Nature 373:663-4; PCT publication WO 96/23810)을 포함하는 다양한 형광 물질이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, DNA2.0의 IP-Freeⓒ 합성 비-애쿼레아 형광 단백질은 PCR에 의해 증폭되거나 측면에 위치하는 BsaI 제한 부위를 사용하여 쉽게 절단되고 선택된 임의의 다른 발현 벡터에 클로닝될 수 있는 상이한 형광단백질 코딩 서열의 공급원으로 사용될 수 있다.
이 유형의 리포터 유전자의 전사 및 번역은 세포에 형광 단백질이 축적되게 유도하여 그들을 FADS에 적응시킬 수 있다.
대안적으로, 세포 내의 특정 수준 및 조건에서 형광을 발하는 광범위한 염료를 사용할 수 있다. 예로는 몰리큘라 프로브스(Molecular probes)(Thermo Scientific)로부터 이용 가능한 것들이 있다. 대안적으로, 세포 성분은 항체로 검출될 수 있으며, 이들은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 임의의 수의 형광단으로 염색될 수 있다. 유사하게, DNA 서열은 형광단으로 라벨링된 것을 세포에 도입할 수 있으며, 세포에서 상보적 DNA 및 RNA 서열에 하이브리드화에 의해 부착하여 형광 제자리 하이브리드화(FISH)로 불리는 과정에서 유전자 발현을 직접 검출하는 것을 가능하게 할 것이다.
현재 고 함량 스크리닝에 적용될 수 있는 모든 라벨링 과정은 FADS에 적용될 수 있으며 대조군과 비교하여 형광 신호의 변화로 검출될 수 있다.
인코딩된 화학적 라이브러리(ECL)
본 발명의 스크리닝 방법은 본 발명의 복수의 마이크로컴파트먼트를 포함하고, 마이크로컴파트먼트 각각은 상이한 화학 구조물을 함유하는, 인코딩된 화학적 라이브러리(ECL)에 적용된다.
ECL은 바람직하게는 화학 구조물의 n개의 클론 집단을 포함하고, 각각의 클론 집단은 n개의 개별 라이브러리 마이크로컴파트먼트로 제한된다. 이러한 실시양태에서: (a) n > 103; 또는 (b) n > 104; 또는 (c) n > 105; 또는 (d) n > 106; 또는 (e) n > 107; 또는 (f) n > 108; 또는 (g) n > 109; 또는 (h) n > 1010; 또는 (i) n > 1011; (j) n > 1012; (k) n > 1013; (l) n > 1014; 또는 (m) n > 1015. n = 106 내지 109인 ECL이 특히 바람직하다.
서열 기반 구조물 활성 분석
본 발명의 스크리닝 방법은 리포터 모이어티의 상태를 결정하여 방출된 마이크로비드를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이로써 표적에 대해 활성을 갖는 화학 구조물은 제1 상태의 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있다.
태그가 핵산 서열을 포함하는 경우, 디코딩 단계는 핵산을 시퀀싱하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 방법은 복수의 상이한 스크리닝된 TCS의 서열을 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 단계는 스크리닝된 TCS에 대해 서열 활성 관계 분석을 수행하는 단계가 뒤따를 수 있으며, 이는 스크리닝된 라이브러리 구성원을 상이한 화학형으로 분류할 수 있다.
예시
본 발명은 이제 특정 실시예를 참조하여 설명될 것이다. 이들은 단지 예시적이며 설명하기 위한 것일 뿐이고; 이들은 어떤 방식으로든 청구된 독점권의 범위 또는 설명된 발명을 제한하려는 것이 아니다.
도면의 간단한 설명
도 1: 자가 희생 링커를 사용하는 유리된 화학 구조물의 방출에 대한 개략도.
도 2: 자가 희생 디펩티드 링커를 사용하는 분할-및-풀 DECL에 대한 개략도.
도 3: Val-Cit-PAB 자가 희생 펩티드 링커를 사용하는 유리된 화학 구조물의 방출에 대한 개략도.
도 4: 기질 A의 감소 및 생성물 B의 증가를 나타내는 자가 희생 과정.
도 5: 각각의 로딩 샘플에 대해 명백히 다른 집단을 나타내는, 비드 상의 비례적 화합물 로딩.
도 6: 형광 리포터 모이어티를 사용하는 마이크로액적에서 효소 활성 측정에 대한 계략도.
도 7: 형광 리포터 모이어티를 사용하는 마이크로액적에서 FITC 신호의 상대적 강도.
실시예 1: 비드 연결 상용성 링커로부터 소분자 화합물의 '자국 없는' 방출
시험 기질 A의 스톡 용액을 DMSO에서 10 mg/ml로, NADPH(Sigma Aldrich)를 40 mM MOPS, pH 7.5, 150 mM NaCl에서 10 mg/ml(11.9 mM)로 제조하였다.
20 μl 기질 A 용액을 480 μl의 40 mM MOPS pH 7.5 150 mM NaCl 버퍼 및 500μL NADPH 용액과 합하였다. 반응을 3 μL(29.6 mg/ml) 니트로리덕타제(Prozomix)를 첨가하여 개시하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 50 μl의 반응 용액을 LCMS(Agilent Technologies, Infinity 1290)에서 실행되는 200 μl 3:1 ACN:H2O + 0.1% 포름산과 합하였다.
기질 A의 명확한 감소 및 생성물 B의 증가가 관찰될 수 있었으며(도 4 참조), 이는 원하는 '약물 분자'가 3분에 방출되는 자가 희생 과정을 나타낸다. 이 결과는 소분자의 '자국 없는' 방출을 유도하는 유용하고 특이적인 링커의 제어 가능한 효소적 절단을 나타낸다. 따라서, 이 링커는 활성 검정에 사용하기 위해 비드에 소분자를 방출 가능하게 부착하는 데 유용하다.
실시예 2: 비드 상의 정확히 비례적인 화합물 로딩
제조
50 ml의 100 μM 스톡을 50 ml의 100 mM MOPS, 150 mM NaCl 중의 1.99 mg의 AMF.HCl을 사용하여 4-(아미노메틸) 플루오레세인 히드로클로라이드(AMF.HCl) 용액으로 제조하였다. 이 용액을 필요에 따라 100 mM MOPS pH 7.5, 150 mM NaCl을 사용하여 10 μM 및 3 μM으로 희석하였다.
로딩 시험을 위해 하기 용액을 5x50 ml 팔콘 튜브(각각 1 ml)에 넣었다.
모든 경우에서, DMTMM(4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드, Sigma Aldrich)을 커플링 시약으로 사용하였다(비드 상의 모든 산의 10%를 가정) = 4.77x10-7 mol - 각각의 팔콘에 100 μl가 첨가된 4.8 mM 스톡의 부피:
팔콘 1 - 0.11% 로딩 - 5.247x10-9 mol의 AMF 필요 - 사용된 100 μM(AMF.HCl)(Fisher) 스톡의 부피 = 52.5 μL;
팔콘 2 - 0.033% 로딩 - 1.574x10-9 mol의 AMF 필요 - 사용된 100 μM(AMF.HCl) 스톡의 부피 = 15.7 μL;
팔콘 3 - 0.011% 로딩 -　5.247x10-10 mol의 AMF 필요　- 사용된 10 μM(AMF.HCl) 스톡의 부피 = 52.5 μL;
팔콘 4 - 0.0033% 로딩 - 1.574x10-10 mol의 AMF 필요 - 사용된 3 μM(AMF.HCl) 스톡의 부피 = 15.7 μL;
팔콘 5 - 0.0011% 로딩 -　5.247x10-11 mol의 AMF 필요 -　사용된 10 μM(AMF.HCl) 스톡의 부피 = 5.25 μL.
절차
3.9 ml의 100 mM MOPS pH 7.5, 150 mM NaCl을 5x50 ml 팔콘에 첨가하였다. 100 μL의 새로 제조된 4.8 mM DMTMM 스톡 용액을 첨가하여 완전 혼합하였다. 1 ml의 50 μm 비드 현탁액(35개 비드/μl)을 각각의 팔콘에 첨가하여 60분 동안 혼합하였다. 5개의 분리된 50 mL 팔콘에 AMF.HCl을 상기에 나타낸 바와 같이 첨가하였다.
비드를 DMTMM과 60분 동안 반응시킨 다음, 관련 AMF 50 mL 팔콘에 붓고, 실온에서 밤새 반응시켰다.
비드를 1000 g에서 10분 동안 펠릿화하고, 가능한 한 많은 용매를 제거하였다. 15 ml의 새로운 버퍼를 첨가하고, 혼합하고, 세척 단계를 추가로 2회 반복하였다. 비드 샘플은 488 nM 레이저를 사용하여 비드 상의 엑사이트 AFM(Excite AFM)에서 여기하는 FACS(MoFloXDP, Beckmann Coulter)를 사용하고 540 nm +/- 20 nm 필터를 사용하여 방출을 측정하여 분석되었다. 샘플은 개별적으로 및 풀로 대수 척도로 측정되었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 상대적인 로딩 샘플 각각에 대해 명백히 다른 집단이 관찰되었으며, CV<6.5%로 상대적인 AMF.HCl 비드 로딩에 정확히 비례하는 형광 증가를 나타내었다. 이는 활성 검정에서 정량적 용량 반응을 수행할 수 있도록 상이한 양의 화학적 화합물이 비드에 정확하게 로딩될 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 3: 마이크로액적에서 효소 활성 측정
500 μl의 -COOH 자기 비드(Bang Beads Inc)를 10 mM MOPS pH 5.5, 150 mM NaCl로 5 x 1 ml 세척한 다음, 마지막으로 500 μl의 동일한 버퍼에 재현탁하였다. 올리고 1 및 2를 각각 100 μM 농도로 뉴클레아제 유리수에 재현탁하였다.
올리고 1 - /5A mMC6/ATGC/iFluroT/ACGTGCATCCAAGCA/3IABkFQ/ (서열번호 1)
올리고 2 - TGC TTG GAT GCA CGT AGC AT (서열번호 2)
5AmC6 = C6 아민 링커, iFluroT는 FITC-융합된 dT이고, 3IAbkDQ는 3' 말단 상의 블랙 홀 ??처이다. 밑줄은 BstCI 제한 효소 부위이다.
올리고 1 및 2(비드 부착용)는 먼저 동일한 비율의 각각의 올리고를 40 μl의 각각의 올리고, 10 μl의 10x T4 DNA 리가제 버퍼((50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM 디티오트레이톨, 1 mM ATP, pH 7.5) 및 10 μl의 뉴클레아제 유리수로 이루어진 100 μl의 총 부피로 혼합함으로써 어닐링되었다. 혼합물을 10분 동안 뜨거운 블록에서 95℃로 가열한 다음, 블록의 스위치를 끄고 샘플을 알루미늄 블록에 남겨 두어 천천히 실온(25℃)으로 냉각시켰다.
비드에 대한 이중 가닥 올리고 커플링의 경우, 30 mg의 EDC를 400 μl의 10 mM MES pH 5.5, 150 mM NaCl에 용해시켰다. 비드를 자석으로 당긴 다음, EDC 함유 버퍼에 재현탁시켰다. 일단 재현탁되면, 올리고 혼합물을 첨가하여 2시간 동안 37℃에서 엔드-오버-엔드(end-over-end) 혼합하면서 인큐베이션을 수행하였다.
비드를 1 ml의 10 mM 트리스 1 mM, EDTA pH 7.5 버퍼로 5 x 세척한 다음, 물로 2 x 1 ml 세척하였다.
억제제가 있거나 없는 분해 샘플을 설정하였다: 각각의 반응은 25 μl(25 μl로 만드는 물 중 2.5 μl의 컷스마트(Cutsmart) 버퍼 3.1(New England Biolabs, UK), 17.5 μl의 비드)에서 수행되었으며, 억제제 및/또는 물을 순서대로 첨가하고, 효소를 모든 경우에서 마지막으로 첨가하였다.
샘플 1 + 5 μl 뉴클레아제 유리수, 효소 없음
샘플 2 + 4 μl 뉴클레아제 유리수 및 1 μl의 BstCI
샘플 3 + 3.5 μl 뉴클레아제 유리수, 0.5 μl 0.5 M EDTA(억제제 1) 및 1 μl의 BstCI
샘플 4 + 3.5 μl 뉴클레아제 유리수, 50 mM 스페르미딘(억제제 2, Sigma Aldrich) 및 1 μl의 BstCI
샘플을 즉시 유화시켰으며; 유화는 200 μl의 미네랄 오일(73% Tegosoft DEC, Evonik, 7% Abil EM 90, Evonik 및 10% 경질 미네랄 오일, Sigma Aldrich)과 함께 벌크로 볼텍스를 사용하여 수행되었다. 이 단계는 마이크로액적 생성 디바이스를 사용하여 수행될 수도 있다.
반응물/비드 함유 마이크로액적을 함유하는 유화 혼합물을 37℃에서 30분 동안 혼합하면서 인큐베이션한 다음, 에멀젼을 파괴하였다. 500 μl의 100% 에탄올을 첨가한 다음, 샘플을 14000 g에서 1분 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화하였다. 이 이서, 이들을 1 ml의 10 mM 트리스, 1 mM EDTA pH 7.5 버퍼로 3x 세척하고, 500 μl의 동일한 버퍼에 재현탁시켰다.
이어서, 비드를 버퍼에 20배 희석하여 약 1백만 개/ml가 되도록 희석하고, 시토플렉스(Cytoflex) 유동 세포측정기(Beckman Coulter)에서 실행시켰다. 기계는 작은 입자(예컨대, 박테리아)를 검출하도록 보정되었다. 여기는 488 nM에서 일어나고 525 nm +/- 40 nm에서 검출되었으며; 10,000개의 이벤트가 검출되었고, 평균 형광도가 플로팅되었다.
결과는 도 7에 도시된다. 샘플 2는 활성 상태로서 대조군 신호의 3배를 나타내었으며 이는 비드 상 및 마이크로액적 내에 보유된 올리고의 절단을 시사하는 한편, 억제제를 갖는 샘플 및 음성 대조군(효소 없음)은 유사하였으며, 비드 보유된 표적 기질을 절단하는 효소의 억제가 수행되고 마이크로액적 인큐베이션 시스템을 사용하여 명확하게 검출될 수 있다는 것을 나타낸다.
형광/비형광 비드는 FACS에 의해 쉽게 분리될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 화합물과 함께 비드의 초기 로딩은 특정 억제제 화합물 및 각각의 비드 로딩의 인코딩된 확인을 허용할 것이다.
등가물
전술한 설명은 본 발명의 현재의 바람직한 실시양태를 상세히 설명한 것이다. 이러한 설명을 고려할 때, 그 바람직한 실시양태의 실시에서 수많은 변형 및 변경이 당업자에게 일어날 것으로 예상된다. 이러한 변형 및 변경은 본원에 첨부된 청구범위 내에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Nanna Therapeutics Limited <120> MICROBEADS FOR TAGLESS ENCODED CHEMICAL LIBRARY SCREENING <130> P40642WO <150> GB 1817321.1 <151> 2018-10-24 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test oligonucleotide for enzyme activity measurement in micro-droplets <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> C6 amine linker, specifically 5AmC6 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> dT fused to FITC, specifically "iFluorT" <220> <221> misc_feature <222> (9)..(15) <223> BstCI restriction enzyme site <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Black hole quencher on the 3' end of the oligo, specifically 3IAbkFQ <400> 1 atgctacgtg catccaagca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Test oligonucleotide for enzyme activity measurement in micro-droplets <400> 2 tgcttggatg cacgtagcat 20

Claims (83)

  1. 인코딩된 화학적 라이브러리 마이크로비드로서, 마이크로비드가 그 위에 및/또는 그 안에 고정된 (i) 인코딩 태그; 및 (ii) 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 갖고, 리포터 모이어티가 표적에 대한 활성의 부재 하에 제1 상태로 존재하고 상기 활성의 존재 하에 제2 상태로 존재하며, 상기 마이크로비드가 그에 방출 가능하게 연결되고 상기 태그에 의해 인코딩된 하나 이상의 화학 구조물(들)의 클론 집단을 추가로 포함하는 것인 마이크로비드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인코딩 태그가 또한 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 인코딩하는 것인 마이크로비드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인코딩 태그가 또한 표적을 인코딩하는 것인 마이크로비드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 구조물이 1 내지 1013개 분자/마이크로비드의 로딩으로 존재하는 것인 마이크로비드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로비드가 복수의 화학 구조물의 클론 집단을 포함하고, 임의적으로 상기 인코딩 태그가 또한 화학 구조물의 로딩을 인코딩하는 것인 마이크로비드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로비드가 그 위에 또는 그 안에 고정된 복수의 표적 검정 시스템 리포터 모이어티를 갖고, 임의적으로 상기 인코딩 태그가 또한 리포터 모이어티의 로딩을 인코딩하는 것인 마이크로비드.
  7. 제6항에 있어서, 제1 상태 대 제2 상태의 리포터 모이어티의 비율이 표적에 대한 활성 수준과 서로 관련되는 것인 마이크로비드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로비드가 실질적으로 구형인 마이크로비드.
  9. 제8항에 있어서, 마이크로비드가 최대 400 μm의 직경을 갖는 것인 마이크로비드.
  10. 제8항에 있어서, 마이크로비드가 1-100 μm의 직경을 갖는 것인 마이크로비드.
  11. 제8항에 있어서, 마이크로비드가 < 50 μm의 직경을 갖는 것인 마이크로비드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로비드가 히드로겔 또는 중합체로 형성되는 것인 마이크로비드.
  13. 제12항에 있어서, 마이크로비드가 고체, 예컨대 실리콘, 중합체, 예컨대 폴리스티렌, 폴리프로필렌 및 디비닐벤젠, 또는 히드로겔, 예컨대 아가로스, 알기네이트, 폴리아크릴아미드 및 폴리락트산으로부터 선택된 히드로겔로 형성되는 것인 마이크로비드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩 태그가 핵산을 포함하는 것인 마이크로비드.
  15. 제14항에 있어서, 핵산이 DNA인 마이크로비드.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로비드가 비-DNA 태그, 비-RNA 태그, 변형된 핵산 태그, 펩티드 태그, 광 기반 바코드(예컨대, 양자점), RFID 태그, 클릭 화학에 의해 연결된 리포터 화학물질 및 질량 분광측정 디코딩 가능 태그를 포함하는 것인 마이크로비드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 구조물이 소분자인 마이크로비드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 구조물이 절단 가능한 링커에 의해 마이크로비드에 방출 가능하게 연결되는 것인 마이크로비드.
  19. 제18항에 있어서, 화학 구조물(들)이 링커 잔기가 전혀 또는 실질적으로 없는 형태로 마이크로비드로부터 절단될 수 있도록, 링커가 자국 없는 것인 마이크로비드.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 절단 가능한 링커가 효소적으로 절단 가능한 링커; 화학적으로 절단 가능한 링커; 광 절단 가능한 링커; 및 전술된 것 중 2 이상의 조합으로부터 선택된 링커를 포함하는 것인 마이크로비드.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 링커가 친핵체/염기 민감성 링커; 환원 민감성 링커; UV 민감성 링커; 친전자체/산 민감성 링커; 금속 보조된 절단 민감성 링커; 산화 민감성 링커; 및 전술된 것들 중 2 이상의 조합으로부터 선택되는 것인 마이크로비드.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 링커가 효소적으로 절단 가능한 링커, 예컨대 프로테아제(엔테로키나제 포함), 뉴클레아제, 니트로리덕타제, 포스파타제, β-글루쿠로니다제, 리소솜 효소, TEV, 트립신, 트롬빈, 카텝신 B, B 및 K, 카스파제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 포스포디에스테라제, 포스포리피다제, 에스테라제, 리덕타제 및 β-갈락토시다제로부터 선택된 효소에 의해 절단 가능한 것인 마이크로비드.
  23. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 링커가 RNA를 포함하고, 화학 구조물이 RNase와의 접촉에 의해 방출될 수 있는 것인 마이크로비드.
  24. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 링커가 펩티드를 포함하고, 화학 구조물이 펩티다제와의 접촉에 의해 방출될 수 있는 것인 마이크로비드.
  25. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 링커가 DNA를 포함하고, 화학 구조물이 부위 특이적 엔도뉴클레아제와의 접촉에 의해 방출될 수 있는 것인 마이크로비드.
  26. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 가능한 링커가 절단 모이어티 및 자가 희생 모이어티(SIM)를 포함하는 자가 희생 링커이고, 임의적으로 절단 모이어티가 펩티드 또는 비-펩티드의 효소적으로 절단 가능한 모이어티, 예컨대 Val-Cit-PAB인 마이크로비드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 구조물이 마이크로비드에 간접적으로 또는 직접적으로 연결되는 것인 마이크로비드.
  28. 제27항에 있어서, 화학 구조물이 마이크로비드에 인코딩 태그를 통해 간접적으로 연결되는 것인 마이크로비드.
  29. 제28항에 있어서, 화학 구조물이 인코딩 태그에 핵산 하이브리드화에 의해 연결되는 것인 마이크로비드.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 효소, 임의적으로 포유동물(예컨대, 인간), 박테리아 또는 바이러스 효소, 예컨대 프로테아제; 키나제; 데히드로게나제; 및 포스파타제로부터 선택된 효소인 마이크로비드.
  31. 제30항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 효소의 기질, 억제제, 활성제 또는 샤페론; 또는 (b) 효소 또는 그의 단편인 마이크로비드.
  32. 제31항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 효소의 촉매 부위; 및/또는 (b) 효소의 알로스테릭 부위를 포함하는 것인 마이크로비드.
  33. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 단백질, 예컨대 포유동물(예컨대, 인간), 박테리아 또는 바이러스 단백질인 마이크로비드.
  34. 제33항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 단백질의 결합 파트너; 또는 (b) 단백질 또는 그의 단편인 마이크로비드.
  35. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 수용체, 예컨대 포유동물(예컨대, 인간), 박테리아 또는 바이러스 단백질인 마이크로비드.
  36. 제35항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 수용체의 리간드; 또는 (b) 수용체 또는 그의 단편인 마이크로비드.
  37. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 수용체 리간드인 마이크로비드.
  38. 제37항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 수용체 리간드 또는 그의 단편; 또는 (b) 수용체 또는 그의 단편인 마이크로비드.
  39. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 효소 기질인 마이크로비드.
  40. 제39항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 효소 기질; 또는 (b) 효소 또는 그의 단편인 마이크로비드.
  41. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 분자 샤페론인 마이크로비드.
  42. 제41항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 샤페론 또는 그의 단편; 또는 (b) 샤페론화된 분자, 예컨대 샤페론 결합 펩티드인 마이크로비드.
  43. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 독소인 마이크로비드.
  44. 제43항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 독소 또는 그의 단편; 또는 (b) 독소의 결합 파트너인 마이크로비드.
  45. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적이 약물인 마이크로비드.
  46. 제45항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 (a) 약물 또는 그의 단편; 또는 (b) 약물의 결합 파트너인 마이크로비드.
  47. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 턴 오버되고, 촉매 활성을 갖는 화학 구조물이 턴 오버 상태의 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
  48. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 형광성이고, ??칭 활성을 갖는 화학 구조물이 ??칭된 상태의 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
  49. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 비형광 기질이고, 형광단 코팅으로서 기능하는 화학 구조물이 형광 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
  50. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 기질이고, 발색단 코팅으로서 기능하는 화학 구조물이 크로매틱 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
  51. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 기질이고, 기질 코팅으로서 기능하는 화학 구조물이 코팅된 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 것인 마이크로비드.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 검정 시스템 리포터 모이어티의 제1 상태 및 제2 상태가 (a) 형광, 예컨대 ??칭 또는 비??칭된 형광; 및/또는 (b) 절단 또는 비절단된 입체형태; 및/또는 (c) 인산화 또는 비인산화된 상태; (d) 상이한 글리코실화 유형, 패턴 또는 정도; 및/또는 (e) 상이한 항원성 결정인자; 및/또는 (f) 리간드에 대한 결합 또는 비결합; 및/또는 (g) 하나 이상의 추가의 검정 시스템 성분과의 복합화 또는 비복합화에 의해 구별되는 것인 마이크로비드.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에서 정의된 마이크로비드 및 용매, 예컨대 수성 용매를 함유하는 화학적 라이브러리 마이크로컴파트먼트.
  54. 제53항에 있어서, 화학 구조물(들)을 마이크로비드로부터 용액으로 방출시키기 위한 절단제를 추가로 함유하고, 임의적으로 절단제가 효소, 예컨대 프로테아제(엔테로키나제 포함), 뉴클레아제, 니트로리덕타제, 포스파타제, β-글루쿠로니다제, 리소솜 효소, TEV, 트립신, 트롬빈, 카텝신 B, B 및 K, 카스파제, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 포스포디에스테라제, 포스포리피다제, 에스테라제 및 β-갈락토시다제로부터 선택된 효소인 마이크로컴파트먼트.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 임의적으로 계면활성제 안정화된 계면을 갖는 유중수 에멀젼의 마이크로액적인, 마이크로액적, 마이크로입자 또는 마이크로소포의 형태인 마이크로컴파트먼트.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 구조물이 적어도 0.1 nM, 0.5 nM, 1.0 nM, 5.0 nM, 10.0 nM, 15.0 nM, 20.0 nM, 30.0 nM, 50.0 nM, 75.0 nM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1.0 μM, 5.0 μM, 10.0 μM, 15.0 μM, 20.0 μM, 30.0 μM, 50.0 μM, 75.0 μM, 100.0 μM, 200.0 μM, 300.0 μM, 500.0 μM, 1 mM, 2 mM, 5 mM 또는 10 mM의 농도로 존재하는 것인 마이크로컴파트먼트.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 구형인 마이크로컴파트먼트.
  58. 제57항에 있어서, 1 내지 500 μm, 임의적으로 < 100 μm 미만의 직경을 갖는 마이크로컴파트먼트.
  59. 제53항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 화학 구조물(들)이 마이크로비드로부터 방출되어, 용매에 용해되며 인코딩 태그와 공간적으로 회합되는 유리된 태그 없는 화학 구조물(들)(TCS)을 생성하는 것인 마이크로컴파트먼트.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 검정 시스템의 하나 이상의 추가 성분(들)을 추가로 함유하는 마이크로컴파트먼트.
  61. 제60항에 있어서, 추가 성분이 항체를 포함하는 것인 마이크로컴파트먼트.
  62. 제61항에 있어서, 항체가 리포터 모이어티의 제1 상태 또는 제2 상태에 특이적으로 결합하는 것인 마이크로컴파트먼트.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 항체가 자기 비드 또는 검출 가능한 라벨, 임의적으로 형광 라벨에 부착되는 것인 마이크로컴파트먼트.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 성분이, 임의적으로 라벨링된 형태로, 제30항, 제34항, 제37항, 제40항, 제43항, 제46항 및 제49항 중 어느 한 항에서 정의된 것으로부터 선택된 표적을 포함하는 것인 마이크로컴파트먼트.
  65. 제64항에 있어서,
    (a) 추가 성분이, 임의적으로 라벨링된 형태로, 제30항, 제34항, 제37항, 제40항, 제43항, 제46항 및 제49항 중 어느 한 항에서 정의된 것으로부터 선택된 표적을 포함하고;
    (b) 표적 검정 시스템 리포터 모이어티가 각각 제31항 내지 제33항, 제35항, 제36항, 제38항 내지 제49항, 제41항, 제42항, 제44항, 제45항, 제47항, 제48항, 제50항 및 제51항 중 어느 한 항에서 정의된 것으로부터 선택되는 것인 마이크로컴파트먼트.
  66. 제53항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 용매 중에 용해되며 그리고 마이크로비드 안에 또는 그 위에 고정된 제2 태그에 의해 인코딩되는 추가 모이어티를 추가로 함유하는 마이크로컴파트먼트.
  67. 제66항에 있어서, 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에서 정의된 마이크로비드를 상기 추가 모이어티 및 제2 인코딩 태그로 공동 캡슐화한 후 제2 태그를 마이크로비드 위에 또는 그 안에 고정함으로써 수득 가능하거나 수득되는 마이크로컴파트먼트.
  68. 제67항에 있어서, 인코딩 태그가 DNA 태그이고, 제2 인코딩 태그가 공동 캡슐화 후 화학 구조물을 인코딩하는 태그에 리게이션되는 것인 마이크로컴파트먼트.
  69. 제53항 내지 제68항 중 어느 한 항에서 정의된 복수의 마이크로컴파트먼트를 포함하는 인코딩된 화학적 라이브러리(ECL)로서, 각각의 마이크로컴파트먼트가 상이한 화학 구조물을 함유하는 것인 인코팅된 화학적 라이브러리(ECL).
  70. 제69항에 있어서, 화학 구조물의 n개의 상이한 클론 집단을 포함하고, 각각의 클론 집단이 n개의 개별 라이브러리 마이크로컴파트먼트로 제한되는 것인 ECL.
  71. 제70항에 있어서, (a) n > 103; 또는 (b) n > 104; 또는 (c) n > 105; 또는 (d) n > 106; 또는 (e) n > 107; 또는 (f) n > 108; 또는 (g) n > 109; 또는 (h) n > 1010; 또는 (i) n > 1011; (j) n > 1012; (k) n > 1013; (l) n > 1014; 또는 (m) n > 1015인 ECL.
  72. 제71항에 있어서, n = 106 내지 109인 ECL.
  73. 표적에 대해 활성을 갖는 화학 구조물에 대해 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에서 정의된 ECL을 스크리닝하는 방법으로서,
    (a) 상기 ECL을 제공하는 단계;
    (b) 마이크로비드로부터 화학 구조물을 방출하여, 각각의 태그 없는 화학 구조물(TCS)과 그의 인코딩 태그 사이의 공간적 회합이 유지되도록, 용매 중에 용해되며 그리고 그 화학 구조물이 방출된 마이크로비드와 함께 마이크로컴파트먼트 내에 함유되는 복수의 유리된 TCS를 생성하는 단계;
    (c) 단계 (b)의 ECL 마이크로컴파트먼트를 그 안에 함유된 마이크로비드 안에 또는 그 위에 고정된 리포터 모이어티의 상태가 표적에 대한 활성 수준에 의해 결정되는 조건 하에서 인큐베이션함으로써 TSC를 검정하는 단계;
    (d) 마이크로컴파트먼트를 개방하여 검정된 마이크로비드를 방출하는 단계; 및
    (e) 리포터 모이어티의 상태를 결정함으로써 방출되고 검정된 마이크로비드를 스크리닝하고, 이로써 표적에 대해 활성을 갖는 화학 구조물이 제2 상태의 리포터 모이어티를 갖는 마이크로비드의 태그를 디코딩함으로써 확인될 수 있는 단계
    를 포함하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 단계 (a)가 화학 구조물의 핵산 기록된, 예컨대 DNA 기록된 합성 단계를 포함하는 것인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 단계 (a)가 화학 구조물의 분할 및 풀(split-and-pool) 핵산 기록된 합성 단계를 포함하는 것인 방법.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 균질한 수성 상 검정 시스템에서의 인큐베이션을 포함하는 것인 방법.
  77. 제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가, 예컨대 열 변성, 동결, 억제제의 첨가 또는 마이크로컴파트먼트의 파괴에 의한, 인큐베이션의 중단을 추가로 포함하는 것인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 마이크로컴파트먼트가 원심분리, 음파처리 및/또는 여과에 의해 또는 용매 및/또는 계면활성제의 첨가에 의해 파괴되는 것인 방법.
  79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 스크리닝 단계 (e) 중에 또는 전에 단계 (d)에서 방출된 마이크로비드를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  80. 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 스크리닝 단계가 방출되고 검정된 마이크로비드의 분획화 및/또는 선별을 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 스크리닝 단계가 FRET, FACS, 면역침전, 면역침강, 면역여과, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및/또는 자기 마이크로비드 친화성 선별 고처리량 스크리닝을 포함하는 것인 방법.
  82. 제73항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 스크리닝 단계 (e)가 제1 상태 대 제2 상태의 리포터 모이어티의 비율을 측정함으로써 표적에 대한 활성 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  83. 제73항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로비드가 복수의 화학 구조물의 클론 집단을 포함하고, 상기 인코딩 태그가 또한 화학 구조물의 로딩을 인코딩하고, 스크리닝 단계 (e)가 화학 구조물의 로딩을 제1 상태 대 제2 상태의 리포터 모이어티의 비율과 서로 관련시킴으로써 표적에 대한 활성 수준을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
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