KR20210080157A - 프리온 단백질 특이적인 항체를 포함하는 의약 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프리온 단백질 특이적 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

프리온 단백질 특이적인 항체를 포함하는 의약 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING A PRION PROTEIN-SPECIFIC ANTIBODY}
본 발명은 프리온 단백질 특이적인 항체를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
대장암은 세계적으로 흔히 진단되는 암이며, 최근 세번째로 많은 사망원인이다. 대장암의 원인으로는 산발적이며 유전적 및 환경적 요인에 의해 발생되는 것으로 알려져 있으며 환경적 요인 중에서는 식이요소 및 생활습관이 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 다만, 대장암은 초기 비전이성 단계에서 진달될 때 치료 가능한 것으로 알려져 있으며 5 년내 생존율도 90% 이상으로 높다.
그러나 림프절로 전이되는 경우, 타 장기로의 전이가 가능해지기 때문에 5년내 생존율은 10% 이하로 감소한다. 최근 몇몇 연구는 분자표적 치료와 조기 진단이 대장암 치료의 잠재적 접근 방법이라는 것을 암시하고 있다. 따라서, 대장암에 대한 메커니즘 및 이에 상응하는 새로운 표적을 억제하여 효과적으로 항암치료 효과 증진 및 환자의 삶을 개선하는데 매우 중요하다고 할 수 있다.
정상적인 프리온 단백질 (PrPC)은 신경세포에서 흔히 발현되는 당단백질로 세포 분화, 세포 이동 및 신경물질 교환을 조절한다. 최근 프리온 단백질이 제어되지 않은 암세포 증식, 종양 성장 및 전이를 촉진한다는 연구보고가 있다. 또한, 결장암, 직장암, 선종, 유방암 및 신경 아세포종 등 암 환자의 유해한 예후를 확인하기 위한 효과적인 바이오 마커로 프리온 단백질을 제시하고 있다. 여기서 바이오 마커는 단백질이나 DNA, RNA, 세포 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미한다.
특히, 프리온 단백질은 내성암 세포, 암 줄기세포 등에서 과발현되어 있다는 연구 보고가 있다. 이러한 연구보고들에 의하면 프리온 단백질은 대장암을 포함한 여러가지의 암에 대한 좋은 치료 표적이라는 것을 언급하고 있다. 그러므로, 프리온 단백질 같은 당단백질은 약물 치료의 효과적인 표적이 아니지만, 프리온 단백질의 활성을 효과적으로 제어하고 항암제에 대한 민감성을 증가시키기 위한 방법이 필요하다.
또한, 최근 종양에서 분비되는 엑소좀에는 아직 확인되지 않은 다양한 단백질 혹은 microRNA를 포함하고 있다. 종양 유래 엑소좀은 종양에 직접 관여를 하거나 체내 혈액을 통해 주요 신체기관의 조직에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이러한 영향으로는 종양 재발생, 종양 전이, 종양의 항암제 내성 유발, 혈관 조직의 결합능력 감소를 통한 종양 세포 침투 환경 조성 등의 다양한 기능을 하는 것으로 보고되었다.
본 발명은 상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 프리온 단백질의 체내 활성을 억제시켜 항암제의 민감성을 높이는 암 치료용 의약 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 본 발명은 프리온 단백질 특이적 항체를 포함하는 암 치료용 의약 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 암 치료용 의약 조성물은 항암제, 화학요법제, 톡신, 라디오아이소토프 및 세포독성 효소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있고, 상기 항암제는 5-fluorouracil (5FU) 항암제 및 Oxalaplatin 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
하나의 예에서, 본 발명은 프리온 단백질 항원 결정기에 결합하는 표적체 및 항암제, 화학요법제, 톡신, 라디오아이소토프 및 세포독성 효소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이 결합된 복합체를 포함하는 암 치료용 의약 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 프리온 단백질 특이적 항체를 포함하는 암 치료용 의약 조성물의 경우 항암제의 민감성을 향상시켜 항암 치료효과를 향상시킬 수 있다.
도 1 및 도 2는 실시예 1에 따른 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 3 및 도 4는 실시예 2에 따른 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 5 및 도 6은 실시예 3에 따른 결과를 나타내는 사진이다.
도 7 및 도 8은 실시예 4에 따른 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 9 및 도 10은 실시예 5에 따른 결과를 나타내는 이미지이다.
도 11 내지 도 13은 실시예 6에 따른 결과를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 14 및 도 15는 실시예 7에 따른 실험 모델 및 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 16 및 도 17은 실시예 8에 따른 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18은 실시예 9에 따른 실험 모델 및 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<준비예 1>
대장암 환자의 혈장 샘플의 준비
대한민국 인체자원 은행으로부터 익명의 대장암 환자의 혈장 샘플을 공여 받았으며, 공여 받은 샘플에는 환자의 제한적인 정보 (나이, 설명, 병리학의 종양 상태, 항암제 치료 이력)를 포함하고 있다. 본 실험 및 임상 시료의 정보는 대한민국 인체자원 은행의 윤리위원회의 승인 아래 실시하였다.
<준비예 2>
항암제 내성을 갖는 대장암 세포주 배양법
인간 일반 대장암 세포주인 SNU-C5/WT와 5FU 항암제 내성을 갖는 인간 대장암 세포주 SNU-C5/5FUR, Oxalaplatin 항암제 내성을 갖는 인간 대장암 세포주 SNU-C5/OXR를 제공받았으며, 인간 대장암 줄기세포 [S707; cancer stem cell (CSC)]는 코넬 의학대학교 (New York, NY, USA), 의학과 Steven M Lipkin 교수로부터 제공받았다. SNU-C5 관련 세포주는 10%의 Fetal bovine serum이 포함된 RPMI 배양 배지를 이용하여 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2 존재 하에 배양하였다. 대장암 줄기세포는 비필수아미노산 (Thermo Fisher Scientific), 피루브산나르륨 (Thermo Fisher Scientific), 페니실린-스트렙토마이신 (Thermo Fisher Scientific), B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific), 40 μg/ml의 헤파린 (Sigma-Aldrich), 20 ng/ml의 섬유아세포 증식인자 (Thermo Fisher Scientific) 및 40 ng/ml의 표피생장인자 (Thermo Fisher Scientific)를 포함하는 첨가물과 함께 DMEM/F12 배지를 이용하여 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2 존재 하에 배양하였다.
<준비예 3>
항암제 내성을 갖는 대장암 세포주의 스페로이드 형성 배양법
일반 대장암 세포주 (SNU-C5/WT)와 항암제 내성을 갖는 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR) 및 대장암 줄기세포주는 스페로이드 형성 배양을 위해 6-well 울트라 로우 클러스터 플레이트를 이용하여 세포 현탁배양을 하였다. 배양에는 증식 배양액 (준비예 2 참고)을 이용하여 배양한 다음, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
대장암 세포주의 스페로이드는 배양 후, 7일 째에 형성되었다. 각 세포주의 스페로이드는 광학현미경을 이용하여 확인 및 측정하였다.
<준비예 4>
항암제 내성 세포의 저산소 배양 기법
5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR)를 증식배양액 (준비예 2 참조)에서 배양하며, 저산소 배양 챔버 속에서 2% O2. 5% CO2, N2 balance의 저산소 환경에 노출시키고 37℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 저산소 배양의 유무는 도면에서 정상 산소 환경 (N으로 표기), 저산소 환경 (H으로 표기)을 구분하여 표기하였다.
<준비예 5>
엑소좀 추출 기법
5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR)를 저산소 환경에서 48 시간 배양 후, 배양 배지를 모아 400g, 10분 동안 원심분리하여 세포와 그 외의 부스러기 (debris)를 제거하였고, 0.45 μm 시린지 필터를 이용하여 배양 배지를 준비하였다. 배양 배지에서 엑소좀의 추출을 용이하게 만들기 위해 배양배지를 100 kDa MWCO ultrafiltration devices를 이용해 2000g, 20분 동안 원심분리 하여 배양 배지를 농축하였다. 농축된 배양배지는 ExoLutE® conditioned medium Exosome isolation kit를 이용해 엑소좀을 추출하였다. 8 ml 배양배지에 solution A, B와 C를 넣고 10분간 교반하여 반응시킨 뒤 3000g, 15분 동안 원심분리하고 펠렛을 solution R에 녹인 후, 컬럼 L에서 700g, 5분 동안 원심분리를 통해 tube에 crude extracellular vesicles을 수확하였다. 다음으로 crude extracellular vesicles에 Solution B와 C를 넣은 후 15분 동안 교반하여 반응하였고, 3000g, 5분 동안 원심분리를 통해 pellet을 얻고 solution R에 녹인 후 컬럼 R에서 300g, 5분동안 원심분리를 통해 정제된 엑소좀을 획득하였다.
<준비예 6>
Western blot 분석
5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR) 유래 엑소좀으로부터 단백질을 추출하고, 세포 단백질 (20 μg 단백질)을 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis로 전기영동 하고, 니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane)에 블롯팅 (blotting) 하였다. 그 다음, 상기 막을 TBS-T [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 및 0.05% Tween-20]로 세척한 다음, 5% skim milk로 1시간 동안 블록킹한 후, 1차 항체 (PrPC, CD81, CD63) 들로 배양하였다. 그 다음, 막을 과산화효소와 결합된 2차 항체와 함께 배양하였다. 밴드는 화학발광 검출 시약 (enhanced chemiluminescence)을 처리하고, 엑스레이 필름 (X-ray film)에 감광시켜 현상하여 확인하였다.
<준비예 7>
유세포 분석기 (fluorescence-activated cell sorting; FACS)를 이용한 엑소좀 분석
정상 혹은 저산소 환경에 노출된 5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR) 유래 엑소좀과 같이 각각 CD81 혹은 CD63 항체 (형광물질 PE가 부착된 FACS용 항체)를 상온 30분 동안 배양한 후 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다.
<준비예 8>
Invasion assay 기법
정상 혹은 저산소 환경에 노출된 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR) 유래 엑소좀을 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR) 또는 혈관내피 전구세포 (endothelial progenitor cell; EPC)에 처리한 후 마트리겔 (50 μl)가 코팅된 8 μm pore insert culture plate에 도말한다.
이후 low chamber plate에는 성장 배지, insert culture plate에는 혈청이 제거된 배지를 넣어 24 시간동안 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2 존재 하에 배양하였다.
그 다음 배지를 모두 제거 후 insert culture plate 존재하는 세포를 4% paraformaldehyde 용액에서 1시간 동안 세포 고정 후에 크리스탈 바이올렛 염색 용액에 5분간 세포 염색 후 광학 현미경 촬영을 수행하였다.
<준비예 9>
Wound healing assay 기법
약 1 mm 정도의 두께를 갖는 세포 스크랩퍼 (cell scraper)를 이용하여 세포 배양접시 (cell culture plate)에 부착된 혈관내피 전구세포를 제거한다. 그리고 PBS를 이용하여 3번 세척하고 정상 혹은 저산소 환경에 노출된 5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR) 유래 엑소좀 혹은 프리온 단백질 표적 small interfering RNA (PRNP siRNA) 혹은 비표적 siRNA (scrambled siRNA; si-Con)가 처리된 SNU-C5/5FUR 유래 엑소좀을 혈관내피 전구세포에 처리한 후, 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2 존재 하에 배양하였다. 그리고 광학현미경을 통해 1mm의 거리로부터 24시간 이후 좁혀지는 거리를 측정하였다.
<준비예 10>
Angiogenesis antibody array-Membrane 테스트
혈관 형성 관련 인자 항체 (총 43개 타겟)가 부착된 membrane을 구입 (abcam; ab193655)하여 dot blot analysis를 수행하였다. 사용된 단백질 샘플은 정상 혹은 저산소 환경에 노출된 5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR) 유래 엑소좀 혹은 프리온 단백질 특이적 siRNA (si-PRNP) 혹은 비표적 siRNA (si-Con)가 처리된 SNU-C5/5FUR 유래 엑소좀이 처리된 혈관내피 전구세포이며, 엑소좀 처리 후 24시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 5% CO2 존재 하에 배양한 다음 세포로부터 전체 단백질 샘플을 획득하였다.
<준비예 11>
Rhodamine-dextran stain
정상 혹은 저산소 환경에 노출된 5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR) 유래 엑소좀 (2 μg; 주 2회, 총2주간)을 마우스 꼬리 정맥 주사하였고, 생검 3시간 전에 Rhodamine-dextran (100 mg/kg)을 마우스 꼬리 정맥 주사하였다. 이후, 마우스의 간, 폐 조직을 생검하여 적출하였다. 적출된 조직은 동결 조직절편 방법을 수행하고 조직 슬라이드를 제작한 후, DAPI 염색 후 공초점 현광현미경을 통해 이미지를 촬영하였다.
<준비예 12>
종양 형성 동물모델
정상 혹은 저산소 환경에 노출된 5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR) 유래 엑소좀을 처리한 일반 대장암 세포주인 SNU-C5/WT (5×106 cells)를 마우스의 피하층에 이식하고 1주일 이후 형성된 종양의 크기가 8 ~ 10 mm3의 부피부터 5FU (30 mg/kg)와 프리온 단백질 항체를 마우스 꼬리정맥을 통해 투약하였다. 약물 투약 기간은 주 2회 총 4주간 투약하였다.
<준비예 13>
종양 전이 동물모델
정상 혹은 저산소 환경에 노출된 5FU 항암제 내성 세포주 (SNU-C5/5FUR) 유래 엑소좀을 처리한 일반 대장암 세포주인 SNU-C5/WT (1×107 cells)를 마우스의 비장에 이식 후 1주일 이후부터 5FU (30 mg/kg)와 프리온 단백질 항체를 마우스 꼬리정맥을 통해 투약하였다. 투약기간은 주 2회 총 7주 동안 투약하였다. 이후, 생검하여 마우스의 간에 전이된 종양을 확인하였다.
<준비예 14>
면역 조직형광 염색
종양 형성 동물모델 및 종양 전이 동물모델에서 생검된 조직(종양조직, 간 전이 종양조직)을 4% paraformaldehyde에 고정하고, paraffin 포매 후, 조직절편 하였다. 절편된 조직을 이용하여 세포 증식과 관련한 인자 Ki67, 세포사멸 관련인자 cleaved caspase-3, 혈관내피 세포의 세포-세포 연접 관련 단백질 ZO-1, 모세혈관 마커인 CD31을 이용하여 형광 염색하고, DAPI를 이용하여 조직의 핵을 형광염색 하였다. 이후, 공초점 형광 현미경을 이용하여 이미지를 촬영하였다.
<실시예 1>
대장암 환자의 혈장내 프리온 단백질 발현 확인 및 항암제 내성을 갖는 대장암 세포주의 3차원 구체형성 능력
도 1A는 대장암 환자를 대장암 진행 상태에 따라 분류하였으며, 각 대장암 진행 단계 (stage Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ)에 따라 프리온 단백질의 발현을 프리온 단백질 특이적 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 통해 측정하였다. 그 결과, 암의 진행 단계가 높아짐에 따라 환자의 혈장 내에 프리온 단백질의 발현이 증가되었다.
도 1B는 대장암 진행 3단계 (stage Ⅲ) 환자들을 약물치료 유무로 분류하고, 그들의 혈장 내의 프리온 단백질 발현을 ELISA를 통해 측정하였다. 그 결과, 약물 치료를 받은 이력이 있는 환자들의 혈장 내에 프리온 단백질의 발현이 증가되었다.
도 1C는 대장암 환자의 대장암 조직내의 프리온 단백질 발현 유무로 분류하고, 그들의 5년 이내의 생존율을 측정하였다. 그 결과, 대장암 조직에서의 프리온 단백질 발현이 증가된 환자의 경우 5년 이내의 생존율이 감소하였다.
도 2는 항암제 내성을 갖는 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR, SNUC-C5/OXR) 및 대장암 줄기세포주 (CSC)에서 프리온 단백질의 발현 유무에 따라 세포를 분리하고 프리온 단백질 발현 유무에 따른 3차원 구체 형성 실험법을 통해 암세포의 종양 형성 능력을 확인하였다. 그 결과, 프리온 단백질 발현이 높은 대장암 세포는 구체 형성이 촉진된 것으로 확인되었다.
따라서, 도 1과 도 2의 결과는 대장암 세포에서 프리온 단백질 발현 유무가 종양 형성 능력을 증가시킨다는 것을 의미한다.
<실시예 2>
5FU 항암제 내성 세포주로부터 추출한 엑소좀과 엑소좀 내에 포함된 프리온 단백질 확인 및 대장암 세포에게 미치는 영향
도 3의 A는 5FU 항암제 내성 세포주로부터 엑소좀을 추출하였고, 추출한 엑소좀이 200 μm 이하인지 동결 전자현미경을 통해 확인한 이미지이다.
도 3의 B는 추출한 엑소좀을 유세포분석기를 통해 엑소좀 마커인 CD81과 CD63을 측정하였다.
도 3의 C는 추출한 엑소좀의 프리온 단백질의 발현과 엑소좀 마커인 CD81과 CD63을 western blot 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 5FU 항암제 내성 세포주를 저산소 배양했을 때, 엑소좀 내에 프리온 단백질의 발현이 증가하였다. 하지만, 5FU 항암제 내성 세포주에서 프리온 단백질의 발현을 PRNP siRNA를 통해 억제한 결과 5FU 항암제 내성 세포주를 저산소 배양하여도 엑소좀 내의 프리온 단백질 발현을 증가시키지 못하였다.
도 4는 정상 혹은 저산소 배양된 항암제 내성 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR)와 대장암 줄기세포주 (CSC)에서 각각 추출한 엑소좀을 일반 정상 산소 환경에 노출된 항암제 내성 대장암 세포주(SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR)와 대장암 줄기세포주 (CSC)에게 대응하여 처리하였을 때, 대장암 세포주의 3차원 구체 형성 능력을 확인한 것이다. 도 4의 A는 정상 혹은 저산소 환경에 노출된 SNU-C5/5FUR에서 추출한 엑소좀을 일반 정상 산소 환경에 노출된 SNU-C5/5FUR에 처리한 것이고, 도 4의 B는 정상 혹은 저산소 환경에 노출된 SNU-C5/OXR에서 추출한 엑소좀을 일반 정상 산소 환경에 노출된 SNU-C5/OXR에 처리한 것이며, 도 4의 C는 정상 혹은 저산소 환경에 노출된 CSC에서 추출한 엑소좀을 일반 정상 산소 환경에 노출된 CSC에 처리한 것이다.
프리온 단백질의 발현이 높은 엑소좀(H-5FUR-Exo, H-OXR-Exo 및 H-CSC-Exo)이 처리된 그룹은 모두 프리온 단백질의 발현이 낮은 엑소좀(N-5FUR-Exo, N-OXR-Exo 및 N-CSC-Exo)이 처리된 그룹 대비 종양 형성 능력인 3차원 구체 형성 능력이 증가하였다. 하지만 프리온 단백질 표적 siRNA (si-PRNP)를 처리하고 저산소 배양된 항암제 내성 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR)와 대장암 줄기세포주에서 추출된 프리온 단백질이 없는 엑소좀(si-PRNP+H-5FUR-Exo, si-PRNP+H-OXR-Exo 및 si-PRNP+H-CSC-Exo)이 처리된 그룹의 경우는 대장암 세포주의 3차원 구체 형성 능력을 향상시키지 못하였다. 다만, si-PRNP의 대조군으로써 어떠한 단백질도 억제시키지 못하는 비표적 siRNA (si-Con)를 처리한 저산소 배양된 항암제 내성 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR)와 대장암 줄기세포주에서 추출한 엑소좀(si-CON+H-5FUR-Exo, si-CON+H-OXR-Exo 및 si-CON+H-CSC-Exo)이 처리된 그룹은 여전히 종양 형성 능력인 3차원 구체 형성 능력이 증가하였다.
<실시예 3>
저산소 배양한 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀이 대장암 세포의 침윤 능력에 미치는 영향
도 5는 정상 혹은 저산소 배양된 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀이 처리된 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR)의 침윤 능력을 향상시키는 것을 invasion assay를 통해 확인하였다.
*그 결과, 저산소 배양된 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀 (H-5FUR-Exo, H-OXR-Exo)이 처리된 그룹에서 대장암 세포주의 침윤 능력이 증가하였다. 하지만, 프리온 단백질이 억제된 엑소좀(si-PRNP+H-5FUR-Exo, si-PRNP+H-OXR-Exo)이 처리된 그룹의 경우는 대장암 세포주의 침윤 능력을 향상시키지 못하였다.
도 6은 정상 혹은 저산소 배양된 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀이 처리된 대장암 세포주의 형태학적 변화를 광학현미경으로 촬영한 모습이며, 저산소 배양된 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀(H-5FUR-Exo, H-OXR-Exo)이 처리된 대장암 세포주는 세포의 이동을 위해 형태가 별 혹은 방사상의 형태로 변화하였다. 하지만, 프리온 단백질이 억제된 엑소좀(si-PRNP+H-5FUR-Exo, si-PRNP+H-OXR-Exo)이 처리된 그룹의 경우는 세포의 운동성 향상을 위한 세포의 형태 변화가 발생되지 않았다.
<실시예 4>
저산소 배양한 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀이 혈관내피 전구세포에게 미치는 영향
도 7의 A는 정상 혹은 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀을 혈관내피 전구세포에 처리 후 세포의 이동 능력을 확인하기 위해 cell migration assay를 수행하였다.
도 7의 B는 정상 혹은 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀을 혈관내피 전구세포에 처리 후, 세포의 이동 능력을 확인하기 위해 invasion assay를 수행하였다.
그 결과, 저산소 환경에서 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀(H-5FUR-Exo)이 처리된 그룹의 혈관내피 전구세포의 운동능력이 향상되었다. 하지만, 프리온 단백질이 억제된 엑소좀(si-PRNP+H-5FUR-Exo)이 처리된 그룹의 경우는 혈관내피 전구세포의 운동 능력을 향상시키지 못하였다.
도 8의 A는 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀을 혈관내피 전구세포에 처리 후, 혈관내피 전구세포 내의 혈관형성 인자의 발현 정도를 Angiogenesis antibody array-Membrane 테스트로 측정한 결과이다.
도 8의 B는 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀을 혈관내피 전구세포에 처리 후, 혈관내피 전구세포 내의 혈관형성 인자의 발현 정도를 Angiogenesis antibody array-Membrane 테스트로 측정한 결과를 통계수치로 변경한 그래프이다.
그 결과, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀(H-5FUR-Exo)을 처리한 혈관내피 전구세포에서 혈관 형성인자 (Angiogenin, EGF, ENA-78, bFGF, MCP-1)의 발현을 증가시켰다. 하지만, 프리온 단백질이 억제된 엑소좀(si-PRNP+H-5FUR-Exo)이 처리된 경우는 혈관내피 전구세포의 혈관 형성인자 발현을 증가시키지 못하였다.
이러한 결과는 대장암에서 분비되는 프리온 단백질 양성 엑소좀이 혈관을 형성하는 혈관내피 세포의 운동성을 증가시키고 혈관 형성을 촉진한다는 것을 의미한다.
<실시예 5>
저산소 배양된 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀이 소동물 실험에 미치는 영향
도 9는 정상 혹은 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀을 실험용 마우스에 투여했을 때, 엑소좀이 신체기관의 조직 결합력에 미치는 영향을 확인한 결과이다. 엑소좀을 주 2회 총 4주간 투여한 뒤에 생검 3시간 전에 Rhodamine-dextran을 마우스의 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. Rhodamine-dextran은 신체기관의 조직의 결합력이 약해진 부분에 침투하는 특징이 있다. 해당 도 9는 형광현미경 촬영을 통해 확인하였다. 도 9A는 마우스의 간 조직이며, 도 9B는 마우스의 폐 조직을 촬영한 이미지이다.
그 결과, 저산소 배양된 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀(H-5FUR-Exo)을 투여 받은 실험용 마우스의 간과 폐 조직의 결합력이 약해져서 Rhodamine-dextran이 조직에 침투한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 저산소 배양된 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀이 신체기관의 조직 결합력을 약화시킨다는 것을 뜻한다. 하지만, 프리온 단백질이 억제된 엑소좀(si-PRNP+H-5FUR-Exo)의 경우는 신체기관의 조직 결합력에 어떠한 영향을 미치지 못하였기 때문에 Rhodamine-dextran이 신체기관의 조직에 침투하지 못하였다.
도 10은 정상 혹은 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀을 실험용 마우스에 투여했을 때, 엑소좀이 혈관조직에 존재하는 세포-세포 연접 관련 단백질 ZO-1에 미치는 영향을 형광 현미경 촬영을 통해 확인하였다. 해당 도 10에서 혈관은 CD31로 형광 염색되었다. 도 10A는 마우스의 간 조직이며, 도 10B는 마우스의 폐 조직을 촬영한 이미지이다.
그 결과, 저산소 배양된 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀(H-5FUR-Exo)이 혈관 세포 조직에 존재하는 ZO-1 단백질의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. ZO-1 단백질의 발현 감소는 조직의 세포-세포 결합력을 감소시킨다는 것을 의미하며, 따라서 해당 결과는 대장암 유래 엑소좀이 간과 폐에 존재하는 혈관 조직의 세포-세포 결합력을 약화시킨다는 것을 의미한다.
<실시예 6>
프리온 단백질 표적 항체와 항암제 조합제를 이용하여 대장암 종양 형성 억제 확인
항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주 군 (PBS), 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주에 5FU 항암제 (30 mg/kg)를 3차 증류수에 희석하여 주 2회로 총 7주간 복강내 투여한 군 (Only 5-FU), 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주에 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀을 처리한 군(H-5FUR-Exo), 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주에 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀을 처리한 후 5FU 항암제 (30 mg/kg)를 3차 증류수에 희석하여 주 2회로 총 7주간 복강내 투여한 군 (H-5FUR-Exo + 5-FU), 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주에 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀을 처리한 후 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg)를 3차 증류수에 희석하여 주 2회로 총 7주간 복강내 투여한 군 (H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP) 및 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주에 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀을 처리한 후 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)를 3차 증류수에 희석하여 주 2회로 총 7주간 복강내 투여한 군 (H-5FUR-Exo + Anti-PrP)을 각각 준비하였다.
해당 실시예 6에서 사용된 프리온 단백질 표적항체는 미국 Merck 사의 제품번호 MAB1562를 사용하였다.
그 결과, 도 11의 A는 형성된 종양의 상태를 보여주는 이미지이다. 도 11의 B는 형성된 종양의 부피의 분포를 나타내는 그래프이다. 본 결과에 따르면, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출한 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주 그룹 (H-5FUR-Exo)은 일반 대장암 세포주 (PBS) 단독 그룹 보다 높은 종양 형성 능력을 보여주었다.
또한, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주 그룹은 항암제 내성이 생성되어 5FU 항암제 단독 처리(H-5FUR-Exo + 5-FU) 시, 종양 형성을 효과적으로 억제하지 못한 것을 표로 보여주고 있다. 하지만, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀이 처리된 일반 대장암 그룹에 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg)을 3차 증류수에 희석한 제조물을 투약한 그룹(H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP)의 경우, 종양 형성을 효과적으로 억제하였다. 이러한 결과는 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주 단독 그룹에 5FU 항암제를 처리한 그룹(Only 5-FU)의 결과와 매우 유사한 것을 보여줌으로써, 본 발명에서 제작되는 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg) 조합물이 항암제 내성을 갖는 대장암에서의 치료효과를 상승시키는 것을 증명하였다.
도 12의 A는 종양 세포의 세포 증식을 확인하기 위해 세포 증식관련 인자인 Ki67의 형광염색을 통해 확인하였다.
그 결과, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주에 5FU 항암제를 투약한 그룹 (H-5FUR-Exo + 5-FU)은 5FU 항암제를 투약하여도 종양 세포의 세포 증식능력을 감소시키지 못하였다. 하지만, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주 유래 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주 그룹에 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg)을 3차 증류수에 희석한 제조물을 투약한 그룹(H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP)의 경우, 종양 조직내 암세포의 세포증식율이 현저하게 감소하고 있음을 보여주고 있다.
도 12의 B는 세포사멸을 확인할 수 있는 cleaved caspase-3를 조직 형광 염색하여 공초점 형광 현미경을 통해 확인하였다.
그 결과, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주 그룹에 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg)를 3차 증류수에 희석한 제조물을 투약한 그룹(H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP)의 경우, 현저하게 cleaved caspase-3의 발현이 증가하였다.
이러한 결과는 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주 단독 그룹에 5FU 항암제를 처리한 그룹(Only 5-FU)의 결과와 매우 유사하는 것을 보여줌으로써, 본 발명에서 제작되는 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg) 조합물이 항암제 내성을 갖는 대장암 세포의 세포사멸을 촉진한다는 것을 의미한다.
도 13은 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주 그룹에 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg)를 3차 증류수에 희석한 제조물을 투약한 그룹(H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP)의 경우, 종양 형성 동물모델의 종양조직에서 세포-세포 연접 관련 인자 ZO-1의 발현을 유지시킨다는 것을 종양 조직 내의 혈관에서 조직 형광 염색법을 통해 확인하였다.
<실시예 7>
프리온 단백질 표적 항체와 항암제 조합제를 이용하여 대장암 종양의 전이에 미치는 영향
해당 실시예 7에서 사용된 프리온 단백질 표적항체는 미국 Merck 사의 제품번호 MAB1562를 사용하였다.
도 14의 A는 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주 (SNU-C5/WT)에 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주에서 추출된 엑소좀을 처리한 후, 실험용 쥐의 비장에 이식하여 종양 전이 동물 모델을 구축하였다. 그리고 1주 후 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg)를 3차 증류수에 희석하여 주 2회로 총 7주간 복강내 투여하는 방법을 도식한 것이다.
도 14의 B는 마우스의 비장에 이식된 암세포가 마우스의 간으로 전이된 것을 촬영한 이미지이다.
그 결과, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주 유래 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주 (H-5FUR-Exo)의 경우 간으로 전이가 활발해졌다. 하지만, 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주 유래 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주에 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg) 조합물 투약한 그룹(H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP)의 경우, 간으로의 전이 능력을 감소시켰다.
도 15는 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주 유래 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주에 프리온 단백질 표적항체 (5 mg/kg)와 5FU 항암제 (30 mg/kg) 조합물 투약한 그룹(H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP)의 경우, 종양 전이 소동물 모델의 간으로 전이된 저산소 배양된 5FU 항암제 내성 세포주 유래 엑소좀이 처리된 일반 대장암 세포주의 종양 조직에서 혈관 세포의 세포-세포 연접 관련 인자 ZO-1의 발현을 유지시킨다는 것을 조직 형광 염색을 통해 확인하였다.
따라서, 본 실시예는 프리온 단백질이 혈관 세포의 결합력을 약화시켜 대장암의 전이가 활발하게 이루어지며, 프리온 단백질을 억제했을 때 대장암의 전이를 억제할 수 있다는 것을 의미한다.
<실시예 8>
프리온 단백질 표적 항체와 항암제 조합제의 항암제 내성 대장암의 세포주기에 미치는 영향
해당 실시예 8에서 사용된 프리온 단백질 표적항체는 미국 Santa Cruz Biotec사의 제품번호 Sc-393165를 사용하였다.
도 16의 A는 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주 (SNU-C5/WT)에 프리온 단백질 표적 항체를 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml 및 200 ng/ml 농도로 처리하였을 때, 세포의 증식 능력을 평가한 cell cycle analysis이다.
도 16의 B는 5FU 항암제 내성이 있는 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR)에 프리온 단백질 표적 항체를 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml 및 200 ng/ml 농도로 처리하였을 때, 세포의 증식 능력을 평가한 cell cycle analysis이다.
그 결과, 프리온 단백질 표적항체는 농도가 증가함에 따라 대장암 세포주의 세포주기 S기를 감소시키는 결과를 확인하였다.
도 17의 A는 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주 (SNU-C5/WT)에 5FU 항암제 (10 μM) 처리, 프리온 단백질 표적 항체 (200 ng/ml) 처리 및 5FU 항암제와 프리온 단백질 표적 항체를 병합처리 하였을 때, 세포의 증식 능력을 평가한 cell cycle analysis이다.
도 17의 B는 5FU 항암제 내성이 있는 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR)에 5FU 항암제 (10, 50, 100 μM) 처리, 프리온 단백질 표적 항체 (200 ng/ml) 처리 및 5FU 항암제 (10, 50, 100 μM)와 프리온 단백질 표적 항체 (200 ng/ml)를 투여량 별로 각각 병합처리 하였을 때 세포의 증식 능력을 평가한 cell cycle analysis이다. 해당 도 17의 B는 항암제 내성 세포이기 때문에 다양한 농도의 5FU 항암제를 사용하여 항암제 민감성이 얼마나 높아지는지 확인한 결과이다.
그 결과, 프리온 단백질 표적항체가 병합처리 된 실험군이 5FU 단독 처리군 보다 더 세포주기 S기를 억제하였다. 특히, 5FU 항암제 내성이 있는 대장암 세포주 (SNU-C5/5FUR)의 경우에는 5FU 항암제의 항암제 내성을 갖는 농도들 10, 50 100 μM에서 프리온 단백질 표적항체와 동시 처리되었을 때, 세포주기 S기가 최대 1/3로 감소되는 것을 보여주고 있다.
이러한 결과는 프리온 단백질 표적항체가 5FU에 대한 항암제 민감성을 상승시켜 세포의 증식을 억제한다는 것을 나타낸다.
<실시예 9>
프리온 단백질 표적 항체와 항암제 조합제이 대장암 형성에 미치는 영향
해당 실시예 9에서 사용된 프리온 단백질 표적항체는 미국 Santa Cruz Biotec사의 제품번호 Sc-393165를 사용하였다.
도 18의 A는 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주 (SNU-C5/WT)를 마우스에 이식하여 종양 형성 동물 모델을 제작하고, 항암제 5FU와 프리온 단백질 표적항체를 투여하는 실험 방법을 설명하는 도식이다.
도 18의 B는 항암제 내성이 없는 일반 대장암 세포주 (SNU-C5/WT)를 마우스에 이식하여 종양 형성 동물 모델에게 5FU와 프리온 단백질 표적항체를 병합 처리하였을 때, 형성된 종양을 나타내는 결과이다.
이러한 결과, 5FU와 프리온 단백질 표적 항체를 10 mg/kg 혹은 100 mg/kg의 양으로 병합 처리한 종양 형성 동물 모델 그룹에서 5FU 단독 투약된 그룹에 비해 종양의 크기가 감소되었다. 따라서, 종양 형성 모델에서 프리온 단백질 표적 항체를 사용했을 때, 항암제에 대한 민감성이 높아져 항암치료 효과를 높이는 것을 나타내는 결과이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 도면을 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 프리온 단백질 특이적 항체를 포함하는 암 치료용 의약 조성물은 항암제 내성이 생긴 암 세포에서도 항암제의 효과가 민감하게 작용될 수 있도록 할 수 있다.

Claims (4)

  1. 프리온 단백질 특이적 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 의약 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항암제, 화학요법제, 톡신, 라디오아이소토프 및 세포독성 효소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 의약 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 항암제는 5FU 항암제 및 Oxalaplatin 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 의약 조성물.
  4. 프리온 단백질 항원 결정기에 결합하는 표적체; 및
    항암제, 화학요법제, 톡신, 라디오아이소토프 및 세포독성 효소로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상;
    이 결합된 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 의약 조성물.
KR1020200084071A 2019-12-20 2020-07-08 프리온 단백질 특이적인 항체를 포함하는 의약 조성물 KR102300672B1 (ko)

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