DE112020006244T5 - PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNG EINSCHLIEßLICH DER PRIONENPROTEIN-SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPER - Google Patents

PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNG EINSCHLIEßLICH DER PRIONENPROTEIN-SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPER Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung, die dadurch gekennzeichnet, dass sie Prionenprotein-spezifische Antikörper umfasst.

Description

  • [Technischer Bereich der Erfindung]
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Prionenprotein-spezifischen Antikörper umfasst.
  • [Technischer Bereich der Erfindung]
  • Darmkrebs ist weltweit die am häufigsten diagnostizierte Krebsart und in den letzten Jahren die dritthäufigste Todesursache unter den Krebsarten. Der Darmkrebs tritt sporadisch auf und dessen Ursachen sind bekanntlich eine genetische Prädisposition und Umweltfaktoren, wobei unter den Umweltfaktoren Ernährungsfaktoren und Lebensstil bekanntermaßen die wichtigsten Rollen spielen. Es ist jedoch bekannt, dass Darmkrebs behandelbar ist, wenn er sich in einem frühen, nicht metastasierten Stadium entwickelt, wobei die 5-Jahres-Überlebensrate mehr als 90 % beträgt.
  • Aber im Falle einer Metastasierung in Lymphknoten sinkt die 5-Jahres-Überlebensrate auf weniger als 10 %, da eine Metastasierung in andere Organe möglich ist. Einige neuere Studien deuten darauf hin, dass eine zielgerichtete Molekulartherapie und Früherkennung potenzielle Ansätze für die Behandlung von Darmkrebs sind. Daher kann gesagt werden, dass es sehr wichtig ist, die Wirkung der Antikrebsbehandlung effektiv zu erhöhen und das Leben der Patienten zu verbessern, indem der Mechanismus für Darmkrebs und ein entsprechendes neues Ziel gehemmt wird.
  • Eine zelluläre (normale) Form des Prionenproteins (PrPc) ist ein Glykoprotein, das üblicherweise in Neuronen exprimiert wird und die Zelldifferenzierung, Zellmigration und den neuronalen Austausch reguliert. Jüngste Forschungsberichte haben gezeigt, dass Prionenprotein die unkontrollierte Proliferation von Krebszellen, Tumorwachstum und Metastasierung fördert. Darüber hinaus wird das Prionenprotein als ein wirksamer Biomarker zur Bestätigung der schädlichen Prognose von Krebspatienten wie Dickdarmkrebs, Rektumkrebs, Adenom, Brustkrebs und Neuroblastom präsentiert. Als Biomarker werden hier Indikatoren bezeichnet, die unter Verwendung von Proteinen, DNA, RNA und Zellmetaboliten die Veränderungen im Körper erkennen können.
  • Insbesondere gibt es Forschungsberichte, dass das Prionenprotein in resistenten Krebszellen, Krebsstammzellen und dergleichen überexprimiert wird. Gemäß diesen Forschungsberichten wird erwähnt, dass das Prionenprotein ein gutes therapeutisches Ziel für verschiedene Krebsarten einschließlich Darmkrebs ist. Daher sind Glykoproteine wie Prionenproteine zwar keine wirksamen Ziele für eine Arzneimitteltherapie, jedoch werden Verfahren zur wirksamen Kontrolle der Aktivität von Prionenproteinen und zur Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber Antikrebsarzneimitteln benötigt.
  • Außerdem enthalten die von Tumoren abgesonderten kürzlichen Exosomen verschiedene Proteine oder microRNAs, die noch nicht identifiziert werden. Es ist bekannt, dass die von Tumoren stammenden Exosomen direkt an Tumoren beteiligt sind oder Gewebe wichtiger Körperorgane durch Blut im Körper beeinflussen, und Es wird berichtet, dass diese Wirkungen verschiedene Funktionen haben, wie Tumorrezidiv, Tumormetastasierung, Induktion von Tumorresistenz gegen Antikrebsmittel und Bildung einer Umgebung für die Infiltration von Tumorzellen durch Verringerung der Bindungskapazität von Gefäßgeweben.
  • [Ausführliche Beschreibung der Erfindung]
  • [Technische Aufgabe der Erfindung]
  • Die vorliegende Erfindung wird vorgeschlagen, um die obengenannten Probleme zu lösen, worin eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung bereitgestellt wird, die die Empfindlichkeit eines Antikrebsmittels erhöht, indem sie die Aktivität des Prionenproteins im Körper hemmt.
  • [Technische Lösung]
  • Die vorliegende Erfindung wird vorgeschlagen, um die obengenannten Probleme zu lösen, worin eine pharmazeutische Zusammensetzung einschließlich der Prionenprotein-spezifischen Antikörper zur Krebsbehandlung bereitgestellt werden kann.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung der vorliegenden Erfindung kann noch zusätzlich ein oder mehrere Bestandteile umfassen, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus Antikrebsmitteln, Chemotherapeutika, Toxinen, Radioisotopen und zytotoxischen Enzymen besteht, und das Antikrebsmittel kann ein oder mehrere Mittel sein, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus 5-Fluorouracil(5FU)- und Oxalaplatin-Antikrebsmittel besteht.
  • In der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung bereitgestellt werden, die einen Komplex umfasst, der mit einem oder mehreren Bestandteilen kombiniert ist, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus einem an eine antigene Determinante eines Prionenproteins gebundenen zielgerichteten Wirkstoff, einem Antikrebsmittel, einem chemotherapeutischen Mittel, einem Toxin, einem Radioisotop und einem zytotoxischen Enzym besteht.
  • [Wirkungen der Erfindung]
  • Im Fall einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Krebsbehandlung, die die Prionenprotein-spezifischen Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst, kann die Wirkung der Antikrebsbehandlung verbessert werden, indem die Empfindlichkeit des Antikrebsmittels verbessert wird.
  • Figurenliste
  • Es liegen:
    • Die 1 und 2 sind Fotografien und Diagramme, die die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 1 zeigen.
    • Die 3 und 4 sind Fotografien und Diagramme, die die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 2 zeigen.
    • Die 5 und 6 sind Fotografien, die die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 3 zeigen.
    • Die 7 und 8 sind Fotografien und Diagramme, die die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 4 zeigen.
    • Die 9 und 10 sind Bilder, die die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 5 zeigen.
    • Die 11 bis 13 sind Fotografien und Diagramme, die die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 6 zeigen.
    • Die 14 und 15 sind Diagramme und Fotografien, die das experimentelle Modell und die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 7 zeigen.
    • Die 16 und 17 sind Diagramme, die die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 8 zeigen.
    • 18 ist ein Diagramm und eine Fotografie, die das experimentelle Modell und die Ergebnisse gemäß Ausführungsbeispiel 9 zeigen.
  • [Beste Ausführungsformen der Erfindung]
  • Gemäß einem Umsetzungsbeispiel wird in der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung bereitgestellt, die Prionenprotein-spezifische Antikörper umfasst.
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung der vorliegenden Erfindung kann noch zusätzlich ein oder mehrere Bestandteile umfassen, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus Antikrebsmitteln, Chemotherapeutika, Toxinen, Radioisotopen und zytotoxischen Enzymen besteht, und das Antikrebsmittel kann ein oder mehrere Mittel sein, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus 5-Fluorouracil(5FU)- und Oxalaplatin-Antikrebsmittel besteht.
  • In der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung bereitgestellt werden, die einen Komplex umfasst, der mit einem oder mehreren Bestandteilen kombiniert ist, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus einem an eine antigene Determinante eines Prionenproteins gebundenen zielgerichteten Wirkstoff, einem Antikrebsmittel, einem chemotherapeutischen Mittel, einem Toxin, einem Radioisotop und einem zytotoxischen Enzym besteht.
  • [Ausführungsformen der Erfindung]
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen noch detaillierter beschrieben. Aber die folgenden Ausführungsbeispiele und experimentellen Beispiele veranschaulichen nur die vorliegende Erfindung, wobei der Inhalt der vorliegenden Erfindung nicht durch die folgenden Ausführungsbeispiele und experimentellen Beispiele beschränkt ist.
  • <Vorbereitungsbeispiel 1>
  • Vorbereitung von Plasmaproben von Darmkrebspatienten
  • Plasmaproben eines anonymen Darmkrebspatienten wurden von der National Biobank of Korea (NBK) gespendet, und die gespendeten Proben enthalten begrenzte Informationen über den Patienten (Alter, körperliche Beschreibung, pathologischer Tumorstatus und Vorgeschichte der Behandlung mit Antikrebsmitteln). Informationen zu diesem Experiment und den klinischen Proben wurden mit Genehmigung der Ethikkommission der National Biobank of Korea (NBK) erstellt.
  • <Vorbereitungsbeispiel 2>
  • Kultivierungsverfahren für kolorektale Krebszelllinien mit Resistenz gegen Antikrebsmittel
  • Menschliche Darmkrebszelllinie SNU-C5/WT, menschliche Darmkrebszelllinie SNU-C5/5FUR mit Resistenz gegen 5FU-Antikrebsmittel und menschliche Darmkrebszelllinie SNU-C5/OXR mit Resistenz gegen Oxalaplatin-Antikrebsmittel werden bereitgestellt, und menschliche Darmkrebs-Stammzellen [S707; Krebsstammzelle (CSC)] wurden von Professor Steven M. Lipkin, Department of Medicine, Cornell Medical University (New York, NY, USA) bereitgestellt. Die mit SNU-C5 verwandte Zelllinie wird unter Verwendung von RPMI-Kulturmedium, das 10 % fötales Rinderserum enthielt, in Gegenwart von 5 % CO2 in einem Inkubator bei 37 °C kultiviert. Die Darmkrebs-Stammzellen werden unter Verwendung von DMEM/F12-Medium mit folgenden Zusätzen in Gegenwart von 5 % CO2 in einem Inkubator bei 37 °C kultiviert, wobei sie die nicht-essentielle Aminosäuren (Thermo Fisher Scientific), Natriumpyruvat (Thermo Fisher Scientific), Penicillin-Streptomycin (Thermo Fisher Scientific), B27-Ergänzung (Thermo Fisher Scientific), N2-Ergänzung (Thermo Fisher Scientific), 40 µg/ml Heparin (Sigma-Aldrich), 20 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Thermo Fisher Scientific) und 40 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor (Thermo Fisher Scientific) enthalten.
  • <Vorbereitungsbeispiel 3>
  • Sphäroid-bildendes Kulturverfahren einer kolorektalen Krebszelllinie mit Resistenz gegen Antikrebsmittel
  • Allgemeine Darmkrebszelllinie (SNU-C5/WT), die gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinien (SNU-C5/5FUR und SNU-C5/OXR) und eine Darmkrebs-Stammzelllinie werden eine Zellsuspensionskultur unter Verwendung einer 6-Well-Ultra-Low-Cluster-Platte für eine Sphäroid-bildende Kultur durchgeführt. Die Kultur wird unter Verwendung eines Wachstumsmediums (siehe Vorbereitungsbeispiel 2) durchgeführt und dann unter Bedingungen bei 37 °C und von 5 % CO2 kultiviert.
  • Sphäroide von Darmkrebszelllinien werden am 7ten Tag nach der Kultivierung ausgebildet. Sphäroide jeder Zelllinie werden unter Verwendung eines optischen Mikroskops identifiziert und gemessen.
  • <Vorbereitungsbeispiel 4>
  • Hypoxische Kulturtechnik der gegen Antikrebsmittel resistenten Zellen
  • Eine gegen 5FU-Antikrebsmittel resistente Zelllinie (SNU-C5/5FUR) wird in einem Wachstumsmedium (siehe Vorbereitungsbeispiel 2) kultiviert, wobei sie einer hypoxischen Umgebung von 2 % O2, 5 % CO2 und N2-Gleichgewicht in einer hypoxischen Kulturkammer ausgesetzt ist und bei 37 °C für 24 Stunden lang kultiviert wird. Das Vorhandensein oder Fehlen einer hypoxischen Kultur wird durch Unterscheidung der normalen Sauerstoffumgebung (bezeichnet als N) und der hypoxischen Umgebung (bezeichnet als H) in der Zeichnung angegeben.
  • <Vorbereitungsbeispiel 5>
  • Technik zur Extraktion von Exosomen
  • Nach 48-stündiger Kultivierung der gegen Antikrebsmittel resistenten 5FU-Zelllinie (SNU-C5/5FUR) in einer hypoxischen Umgebung werden die Kulturmedien gesammelt und bei 400 g für 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zellen und andere sonstige Trümmer (debris) zu entfernen, und dann werden die Kulturmedien unter Verwendung einer 0,45 µm Spritzenfilter bereitgestellt. Um die Extraktion von Exosomen aus dem Kulturmedium zu erleichtern, werden die Kulturmedien unter Verwendung von 100 kDa MWCO-Ultrafiltrationsvorrichtungen bei 2000 g für 20 Minuten lang zentrifugiert und konzentriert. Von den konzentrierten Kulturmedien werden Exosomen unter Verwendung von „ExoLutE® conditioned medium Exosome isolation kit“ extrahiert. Nachdem die Lösungen A, B und C zu einem 8 ml Kulturmedium zugeben, 10 Minuten lang rühren und reagieren lassen, wird es bei 3000g für 15 Minuten lang zentrifugiert und nachdem ein Pellet in Lösung R gelöst wird, werden rohe extrazelluläre Vesikel in einem Rohr dadurch geerntet, dass es in Säule L bei 700 g für 5 Minuten lang zentrifugiert wird. Als nächstes lassen die Lösungen B und C zu den rohen extrazellulären Vesikeln (crude extracellular vesicles) zugeben, 15 Minuten lang rühren und reagieren, und nachdem ein Pellet durch Zentrifugation bei 3000 g für 5 Minuten lang erhalten und in Lösung R gelöst wird, werden gereinigte Exosomen durch Zentrifugation bei 300 g für 5 Minuten lang in Säule R geerntet.
  • <Vorbereitungsbeispiel 6>
  • Western-Blot-Analyse
  • Proteine werden aus Exosomen extrahiert, die von einer gegen Antikrebsmittel resistenten 5FU-Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, und zelluläre Proteine (20 µg Protein) werden einer Elektrophorese mit Natrium-dodecyl-sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ausgesetzt und es wird ein Klecksen (Blotting) auf eine Nitrocellulose-Membran durchgeführt. Als nächstes wird die Membran mit TBS-T [10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl und 0,05 % Tween-20] gewaschen und in Blockierungslösung mit 5 % Magermilch für 1 Stunde lang gelegt, und dann mit primären Antikörpern ( PrPc, CD81, CD63) kulitiviert. Danach wird die Membran mit den sekundären Antikörpern kultiviert, der mit Peroxidase kombiniert ist. Die Bande wird bestätigt, dass, indem sie mit einem Chemilumineszenz-Nachweisreagenz (enhanced chemiluminescence) behandelt wird, einem Röntgenfilm ausgesetzt und entwickelt wird.
  • <Vorbereitungsbeispiel 7>
  • Analyse von Exosomen unter Verwendung von Durchflusszytometrie (FACS: fluorescence-activated cell sorting)
  • Wie Exosomen, die von einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, die einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzt ist, wird jeder CD81- oder CD63-Antikörper (Antikörper für FACS, woran ein fluoreszierendes Material PE gebunden ist) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur kultiviert und danach erfolgen die Messungen unter Verwendung der Durchflusszytometrie.
  • <Vorbereitungsbeispiel 8>
  • Invasionsassay-Technik
  • Exosomen, die von den gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/OXR) stammen, die also einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzt sind, werden mit den gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien (SNU-C5/5FUR, SNU-C5/5FUR und SNU-C5/OXR) oder endotheliale Vorläuferzelle (EPC: endothelial progenitor cell) behandelt und dann werden sie auf einer mit Matrigel (50 µl) beschichteten Kulturplatte zum Einsatz mit einer Porengröße von 8 µm ausgestrichen.
  • Nachdem ein Wachstumsmedium auf eine Platte mit niedriger Kammer gegeben und ein serumfreies Medium auf eine Kulturplatte zum Einsatz (insert culture plate)gegeben wird, werden sie in Gegenwart von 5 % CO2 in einem Inkubator bei 37 °C für 24 Stunden lang kultiviert.
  • Nach Entfernen der gesamten Medien werden die auf der Kulturplatte zum Einsatz existierenden Zellen in 4%iger Paraformaldehydlösung für 1 Stunde lang fixiert und dann werden die Zellen in Kristallviolett-Färbelösung für 5 Minuten gefärbt und eine optische Mikroskopie wird durchgeführt.
  • <Vorbereitungsbeispiel 9>
  • Wundheilungsassay-Technik
  • Die an der Zellkulturplatte angehafteten vaskulären endothelialen Vorläuferzellen werden unter Verwendung eines etwa 1 mm dicken Zellschabers (cell scraper) entfernt und unter Verwendung einer Phosphate-gepufferten Kochsalzlösung (PBS: Phosphate buffered saline) dreimal gewaschen. Danach werden sie (die vaskulären endothelialen Vorläuferzellen) mit den einen oder anderen Exosomen behandelt, und zwar Exosomen, die von einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, die also einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzt ist, oder Exosomen, die von einer Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, die wiederum mit zielgerichteter Prionenprotein-RNA (PRNP-siRNA: small interfering RNA) oder nicht zielgerichteter siRNA (scrambled siRNA; si-Con) behandelt wird, und dann werden sie in Gegenwart von 5 % CO2 bei 37 °C für 24 Stunden lang in dem Inkubator kultiviert. Zugleich wird ein Abstand, der sich nach 24 Stunden in einem Abstand von 1 mm verengt, durch ein optisches Mikroskop gemessen.
  • <Vorbereitungsbeispiel 10>
  • Membrantest für Angiogenese-Antikörper-Array
  • Eine Membran, an die Antikörper des auf Angiogenese bezogenen Faktors (insgesamt 43 Ziele) gebunden sind, wird eingekauft (abcam; ab193655) und es wird eine Dot-Blot-Analyse durchgeführt. Die verwendeten Proteinproben sind vaskuläre endotheliale Vorläuferzellen, die mit den einen oder anderen Exosomen behandelt werden, und zwar Exosomen, die von einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, die also einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzt ist, oder Exosomen, die von einer Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, die also mit zielgerichteter Prionenprotein-RNA (PRNP-siRNA) oder nicht zielgerichteter siRNA (si-Con) behandelt wird. Nach der Exosomenbehandlung werden die vaskulären endothelialen Vorläuferzellen in Gegenwart von 5 % CO2 bei 37 °C für 24 Stunden lang in dem Inkubator kultiviert und dann werden vollständige Proteinproben aus den Zellen geerntet.
  • <Vorbereitungsbeispiel 11>
  • Rhodamin-Dextran-Färbung (Rhodamine-dextran stain)
  • Exosomen, die von einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, die also einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzt ist, werden intravenös in den Schwanz einer Maus injiziert (2 µg; zweimal pro Woche, für insgesamt 2 Wochen), und 3 Stunden vor der Biopsie wird Rhodamin-Dextran (100 mg/kg) intravenös in den Schwanz der Maus injiziert. Danach werden die Leber- und Lungengewebe der Maus herausgeschnitten und biopsiert. Die entnommenen Gewebe werden einem Verfahren der gefrorenen Gewebeschnitten unterzogen und Bilder werden durch ein konfokales Fluoreszenzmikroskop nach DAPI-Färbung aufgenommen, nachdem Objektträger der Gewebeschnitten hergestellt werden.
  • <Vorbereitungsbeispiel 12>
  • Tumorbildendes Tiermodell
  • Als eine allgemeine Darmkrebszelllinie, die mit Exosomen behandelt wird, die von einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, die also einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzt ist, wird SNU-C5/WT (5 × 106 Zellen) in die subkutane Schicht der Maus transplantiert und ab einem Tumorvolumen, in dem eine Tumorgröße von 8 bis 10 mm3 nach 1 Woche ausgebildet ist, werden 5FU (30 mg/kg) und Prionenprotein-Antikörper durch die Schwanzvene der Maus verabreicht. Der Arzneimittelverabreichungszeitraum ist zweimal pro Woche für insgesamt 4 Wochen.
  • <Vorbereitungsbeispiel 13>
  • Tumormetastasierung beim Tiermodell
  • Als eine allgemeine Darmkrebszelllinie, die mit Exosomen behandelt wird, die von einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie (SNU-C5/5FUR) stammen, die also einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzt ist, wird SNU-C5/WT (1 × 107 Zellen) in die Milz der Maus transplantiert und ab eine Woche nach der Transplantation werden 5FU (30 mg/kg) und Prionenprotein-Antikörper durch die Schwanzvene der Maus verabreicht. Der Arzneimittelverabreichungszeitraum ist zweimal pro Woche für insgesamt 7 Wochen. Danach wird eine Biopsie durchgeführt und es wird bestätigt, dass der Tumor in die Leber der Maus metastasiert ist.
  • <Vorbereitungsbeispiel 14>
  • Immunhistofluoreszenz-Färbung
  • Die von Tumorentstehung und Tumormetastasierung beim Tiermodell biopsierten Gewebe (Tumorgewebe und Lebermetastasen-Tumorgewebe) werden in 4%iger Paraformaldehydlösung fixiert und in Paraffin eingebettet, und danach werden sie geschnitten. Die ausgeschnittenen Gewebe werden unter Verwendung des Zellproliferations-bezogenen Faktors Ki67, des Apoptosebezogenen Faktors gespaltene Caspase-3, des auf Zell-Zellverbindungen von vaskulären Endothelzellen bezogenen Proteins ZO-1 und des Kapillarmarkers CD31 fluoreszierend angefärbt, und die Zellkerne der Gewebe werden unter Verwendung von DAPI fluoreszierend angefärbt. Danach werden Bilder unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops aufgenommen.
  • <Ausführungsbeispiel 1>
  • Bestätigung der Exprimierung des Prionenproteins im Plasma von Darmkrebspatienten und die Fähigkeit zur dreidimensionalen Kugelbildung der gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinien
  • In 1A sind Darmkrebspatienten gemäß der Exprimierung eines Darmkrebses klassifiziert und gemäß jedem Progressionsstadium des Darmkrebses (Stadium I, III, III) wird eine Exprimierung des Prionenproteins durch einen Prionenprotein-spezifischen enzymgebundenen Immunadsorptionstest (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay) gemessen. Als Folge ist je weiter fortgeschritten ein Krebsstadium, umso höher ist die Exprimierung des Prionenproteins im Plasma von Patienten.
  • In 1B sind die sich im Fortschreiten des Stadiums 3 (Stadium III) befindenden Darmkrebspatienten mit oder ohne Arzneimittelbehandlung klassifiziert und eine Exprimierung des Prionenproteins im Plasma der Patienten wird durch ELISA gemessen. Als Folge ist die Exprimierung des Prionenproteins im Plasma von Patienten mit einer Vorgeschichte einer medikamentösen Behandlung erhöht.
  • In 1C sind Darmkrebspatienten durch das Vorhandensein oder Fehlen einer Exprimierung des Prionenproteins in Darmkrebsgeweben klassifiziert, und ihre Überlebensrate innerhalb von 5 Jahren werden gemessen. Als Folge ist die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten, bei denen die Exprimierung des Prionenproteins in Darmkrebsgeweben erhöht wird, verringert.
  • In 2 sind von den gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinien (SNU-C5/5FUR und SNUC-C5/OXR) und einer Darmkrebs-Stammzelllinie (CSC) die Zellen nach dem Vorhandensein oder dem Fehlen einer Exprimierung des Prionenproteins getrennt und nach dem Vorhandensein oder dem Fehlen einer Exprimierung des Prionenproteins wird die tumorbildende Fähigkeit (Tumorigenität) von Krebszellen durch ein experimentelles Verfahren zur dreidimensionalen Kugelbildung bestätigt. Als Folge wird bestätigt, dass je höher eine Exprimierung des Prionenproteins in Darmkrebszellen ist, desto mehr wird eine Kugelbildung gefördert.
  • Daher bedeuten die Ergebnisse von 1 und 2, dass nach dem Vorhandensein einer Exprimierung des Prionenproteins in Darmkrebszellen eine tumorbildende Fähigkeit (Tumorigenität) erhöht.
  • <Ausführungsbeispiel 2>
  • Identifizierung von Exosomen, die aus einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie extrahiert werden, und von dem in Exosomen enthaltenen Prionenprotein sowie deren Wirkung auf Darmkrebszellen
  • 3A zeigt ein Bild, das durch ein gefrorenes Elektronenmikroskop bestätigt wird, ob Exosomen, die aus einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie extrahiert werden, 200 µm oder weniger groß sind.
  • 3B zeigt, dass auf den extrahierten Exosomen die Exosomenmarker CD81 und CD63 durch Durchflusszytometrie gemessen werden.
  • 3C zeigt, dass eine Exprimierung des Prionenproteins der extrahierten Exosomen und die Exosomenmarker CD81 und CD63 durch Western-Blot-Analyse bestätigt werden.
  • Als Folge wird die Exprimierung des Prionenproteins in den Exosomen erhöht, wenn eine gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie in Hypoxie kultiviert wird. Da als Folge ist, dass die Exprimierung des Prionenproteins in der gegen Antikrebsmittel resistenten 5FU-Zelllinie durch zielgerichtete Prionenprotein-RNA (PRNP siRNA) unterdrückt wird, kann die Exprimierung des Prionenproteins in den Exosomen jedoch nicht erhöht werden, selbst wenn die gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinie in Hypoxie kultiviert wird.
  • 4 zeigt, dass, wenn Exosomen, die aus den gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinien (SNU-C5/5FUR und SNUC-C5/OXR) und einer Darmkrebs-Stammzelllinie (CSC) jeweils extrahiert werden, die also in einer normalen oder hypoxischen Umgebung kultiviert werden, entsprechend den gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinien (SNU-C5/5FUR und SNUC-C5/OXR) und einer Darmkrebs-Stammzelllinie (CSC) behandelt werden, die also in einer normalen Umgebung ausgesetzt sind, die Fähigkeit von Darmkrebszelllinien zur dreidimensionalen Kugelbildung bestätigt wird. 4A zeigt, dass Exosomen, die aus der in einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzten Zelllinie (SNU-C5/5FUR) extrahiert werden, mit der in einer normalen Umgebung ausgesetzten Zelllinie (SNU-C5/5FUR) behandelt werden; 4B zeigt, dass Exosomen, die aus der in einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzten Zelllinie (SNU-C5/OXR) extrahiert werden, mit der in einer normalen Umgebung ausgesetzten Zelllinie (SNU-C5/OXR) behandelt werden, und 4C zeigt, dass Exosomen, die aus der in einer normalen oder hypoxischen Umgebung ausgesetzten Zelllinie (CSC) extrahiert werden, mit der in einer normalen Umgebung ausgesetzten Zelllinie (CSC) behandelt werden.
  • Im Vergleich zu einer Gruppe, in der die Exosomen mit niedriger Exprimierung des Prionenproteins (N-5FUR-Exo, N-OXR-Exo und N-CSC-Exo) behandelt werden, erhöht sich die Fähigkeit zur dreidimensionalen Kugelbildung als eine tumorbildende Fähigkeit (Tumorigenität) einer Gruppe, in der alle Exosomen mit hoher Exprimierung des Prionenproteins (H-5FUR-Exo, H-OXR-Exo und H-CSC-Exo) behandelt werden. Aber im Falle einer Gruppe, in der die Prionenprotein-freien Exosomen (si-PRNP+H-5FUR-Exo, si-PRNP+H-OXR-Exo und si-PRNP+H-CSC-Exo) mit der zielgerichteten Prionenprotein-RNA (siRNA) behandelt werden und aus den hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinien (SNU-C5/5FUR und SNU-C5/OXR) und einer Dickdarmkrebs-Stammzelllinie extrahiert werden, kann die Fähigkeit zur dreidimensionalen Kugelbildung der Darmkrebszelllinien nicht verbessert werden. Nur in einer Gruppe, die mit Exosomen (si-CON+H-5FUR-Exo, si-CON+H-OXR-Exo und si-CON+H-CSC-Exo) behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinien (SNU-C5/5FUR und SNU-C5/OXR), die mit der nicht zielgerichteten siRNA (si-Con), die kein Protein hemmen kann, als Kontrollgruppe von si-PRNP behandelt werden, und aus einer Dickdarmkrebs-Stammzelllinie extrahiert werden, erhöht sich immer noch die Fähigkeit zur dreidimensionalen Kugelbildung als eine tumorbildende Fähigkeit (Tumorigenität).
  • <Ausführungsbeispiel 3>
  • Wirkung von Exosomen, die aus hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, auf die Invasionsfähigkeit von Darmkrebszellen
  • In 5 wird es durch einen Invasionsassay bestätigt, dass eine Invasionsfähigkeit von Dickdarmkrebszelllinien (SNU-C5/5FUR und SNU-C5/OXR) verbessert wird, die mit Exosomen behandelt werden, die also aus normalen oder hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden.
  • *Als Folge ist festzustellen, dass sich in einer Gruppe, die mit Exosomen (H-5FUR-Exo und H-OXR-Exo) behandelt wird, die also aus hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, die Invasionsfähigkeit von Darmkrebszelllinien erhöht. Aber im Falle einer Gruppe, in der die Prionenprotein-inhibierten Exosomen (si-PRNP+H-5FUR-Exo und si-PRNP+H-OXR-Exo) behandelt werden, wird die Invasionsfähigkeit der Darmkrebszelllinien nicht verbessert.
  • 6 zeigt ein Bild, in dem die morphologische Veränderung der mit Exosomen behandelten Darmkrebszelllinien mit einem Lichtmikroskop fotografiert wird, wobei die Exosomen aus normalen oder hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, und die mit Exosomen (H-5FUR-Exo und H-OXR-Exo) behandelten Darmkrebszelllinien ändern sich für Zellmigration in eine Stern- oder Radialform, wobei die Exosomen aus hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden. Aber im Fall einer Gruppe, in der die Prionenprotein-inhibierten Exosomen (si-PRNP+H-5FUR-Exo und si-PRNP+H-OXR-Exo) behandelt werden, entsteht keine Veränderung der Zellmorphologie zur Verbesserung der Zellmotilität.
  • <Ausführungsbeispiel 4>
  • Wirkung von Exosomen, die aus hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, auf vaskuläre endotheliale Vorläuferzellen
  • 7A zeigt, dass, nachdem Exosomen, die aus normalen oder hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, mit vaskulären endothelialen Vorläuferzellen behandelt werden, ein Zellmigrationsassay durchgeführt wird, um die Zellmigrationsfähigkeit zu bestätigen.
  • 7B zeigt, dass, nachdem Exosomen, die aus normalen oder hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, mit vaskulären endothelialen Vorläuferzellen behandelt werden, ein Invasionsassay durchgeführt wird, um die Zellmigrationsfähigkeit zu bestätigen.
  • Als Folge ist festzustellen, dass die Motilität von vaskulären endothelialen Vorläuferzellen einer Gruppe verbessert wird, in der Exosomen (H-5FUR-Exo) behandelt werden, die aus den in einer hypoxischen Umgebung kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden. Aber im Fall einer Gruppe, in der die Prionenprotein-inhibierten Exosomen (si-PRNP+H-5FUR-Exo) behandelt werden, wird die Motilität der vaskulären endothelialen Vorläuferzellen nicht verbessert.
  • 8A zeigt, dass, nachdem Exosomen, die aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, mit vaskulären endothelialen Vorläuferzellen behandelt werden, die Ergebnisse der Messungen des Exprimierungsniveaus von angiogenen Faktoren in den vaskulären endothelialen Vorläuferzellen unter Verwendung eines Membrantests für Angiogenese-Antikörper-Array erfolgen.
  • 8B zeigt ein Diagramm, in dem die Ergebnisse der Messungen des Exprimierungsniveaus von angiogenen Faktoren in den vaskulären endothelialen Vorläuferzellen unter Verwendung eines Membrantests für Angiogenese-Antikörper-Array in statistische Werte umgewandelt werden, nachdem Exosomen, die aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, mit vaskulären endothelialen Vorläuferzellen behandelt werden.
  • Als Folge wird die Exprimierung der angiogenen Faktoren (Angiogenin, EGF, ENA-78, bFGF, MCP-1) in vaskulären endothelialen Vorläuferzellen erhöht, die mit Exosomen (H-5FUR-Exo) behandelt werden, wobei sie aus den hypoxisch kultivierten 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden. Wenn jedoch die Prionenprotein-inhibierten Exosomen (si-PRNP+H-5FUR-Exo) behandelt werden, wird die Exprimierung der angiogenen Faktoren in vaskulären endothelialen Vorläuferzellen nicht erhöht.
  • Diese Ergebnisse legen nahe, dass Prionenproteinpositive Exosomen, die von Darmkrebs ausgeschieden werden, die Motilität der vaskulären endothelialen Vorläuferzellen, die Blutgefäße bilden, erhöhen und die Bildung von Blutgefäßen fördern.
  • <Ausführungsbeispiel 5>
  • Wirkung von Exosomen, die aus hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, auf kleine Tierversuche
  • In 9 zeigen die Ergebnisse, in denen die Wirkung der Exosomen auf die Gewebebindungskraft der Körperorgane bestätigt wird, wenn Exosomen, die aus normalen oder hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten 5FU-Zelllinien extrahiert werden, an Versuchsmaus verabreicht werden. Nach Verabreichung der Exosomen zweimal wöchentlich für insgesamt 4 Wochen wird Rhodamin-Dextran 3 Stunden vor der Biopsie durch die Schwanzvene der Maus verabreicht. Rhodamin-Dextran hat die Eigenschaft, in Bereiche einzudringen, in denen die Gewebebindungskraft der Körperorgane geschwächt ist. 9 wird durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. 9A ist ein Lebergewebe einer Maus und 9B ist ein aufgenommenes Bild eines Lungengewebes einer Maus.
  • Als Folge wird bestätigt, dass Rhodamin-Dextran in die Gewebe eingedrungen ist, da die Bindungskraft zwischen Leber- und Lungengewebe der experimentellen Maus geschwächt wird, an der die Exosomen (H-5FUR-Exo) verabreicht wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Exosomen, die aus den hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, die Gewebebindungskraft von Körperorganen schwächen. Im Fall der Prionenprotein-inhibierten Exosomen (si-PRNP+H-5FUR-Exo) dring Rhodamin-Dextran jedoch nicht in das Gewebe der Körperorgane ein, da sie keine Wirkung auf die Gewebebindungskraft der Körperorgane aufweisen.
  • 10 zeigt, dass die Wirkung der Exosomen auf ein Protein ZO-1, das in vaskulären Geweben vorhanden und auf Zell-Zellverbindungen bezogen ist, durch die Fluoreszenzmikroskopie bestätigt wird, wenn Exosomen, die aus normalen oder hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, an Versuchsmaus verabreicht werden. In 10 werden Blutgefäße mit CD31 fluoreszierend angefärbt. 10A ist ein Lebergewebe einer Maus, und 10B ist ein Bild eines Lungengewebes einer Maus.
  • Als Folge wird bestätigt, dass die Exosomen (H-5FUR-Exo), die aus den hypoxisch kultivierten und gegen Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, die Exprimierung des im Gefäßgewebe vorhandenen ZO-1-Proteins reduzieren. Die Verringerung der Exprimierung des ZO-1-Proteins bedeutet, dass die Zell-Zell-Bindungskraft des Gewebes verringert wird, und daher bedeuten die Ergebnisse, dass die von Darmkrebs stammenden Exosomen die Zell-Zell-Bindungskraft des in der Leber und Lunge vorhandenen Gefäßgewebes schwächen.
  • <Ausführungsbeispiel 6>
  • Bestätigung der Hemmung der Darmkrebstumorbildung unter Verwendung einer Kombination mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern und Antikrebsmitteln
  • Zur Bestätigung der Hemmung der Darmkrebstumorbildung werden die folgenden Gruppen bereitgestellt:
    • eine Gruppe der allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel (PBS);
    • eine Gruppe, in der 5-FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg), das in tertiär destilliertem Wasser verdünnt wird, an die allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel zweimal pro Woche für insgesamt 7 Wochen intraperitoneal verabreicht wird (nur 5-FU);
    • eine Gruppe, in der 5-FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg), das in tertiär destilliertem Wasser verdünnt wird, an die allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel zweimal pro Woche für insgesamt 7 Wochen intraperitoneal verabreicht wird, nachdem Exosomen, die aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, mit den allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel behandelt werden (H-5FUR-Exo + 5-FU);
    • eine Gruppe, in der Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper (5 mg/kg) und 5-FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg), die in tertiär destilliertem Wasser verdünnt werden, an die allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel zweimal pro Woche für insgesamt 7 Wochen intraperitoneal verabreicht werden, nachdem Exosomen, die aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, mit den allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel behandelt werden (H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP), und
    • eine Gruppe, in der Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper (5 mg/kg), die in tertiär destilliertem Wasser verdünnt werden, an die allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel zweimal pro Woche für insgesamt 7 Wochen intraperitoneal verabreicht wird, nachdem Exosomen, die aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, mit den allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel behandelt werden (H-5FUR-Exo + Anti-PrP) .
  • Die in Ausführungsbeispiel 6 verwendeten Prionenprotein-zielgerichteten Antikörper sind die Produktnummer MAB1562 von US Merck.
  • Als Folge ist 11A ein Bild, das den Zustand des gebildeten Tumors zeigt. 11B ist ein Graph, der die Verteilung des Volumens des gebildeten Tumors zeigt. Gemäß diesen Ergebnissen zeigt es, dass die allgemeine Darmkrebszellliniengruppe (H-5FUR-Exo), die mit Exosomen, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, behandelt wird, eine höhere tumorbildende Fähigkeit als eine alleinige Gruppe der allgemeinen Darmkrebszelllinien (PBS) aufweist.
  • Darüber hinaus zeigt die Tabelle, dass die allgemeine Darmkrebszellliniengruppe, die mit Exosomen behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, eine Resistenz gegen Antikrebsmittel erzeugt und nicht in der Lage ist, die Tumorbildung wirksam zu hemmen, wenn 5FU-Antikrebsmittel (H-5FUR-Exo + 5-FU) allein behandelt wird. Aber in Falle einer Gruppe (H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP), in der ein Produkt, das mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) in tertiär destilliertem Wasser verdünnt wird, an die allgemeine Darmkrebszellliniengruppe verabreicht wird, die mit Exosomen behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, wird die Tumorbildung wirksam gehemmt. Mit diesen Ergebnissen wird bewiesen, dass die in der vorliegenden Erfindung hergestellte Kombination mit Prionprotein-zielgerichteten Antikörper (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) die therapeutische Wirkung auf den gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebs erhöht, indem es sehr ähnlich zu den Ergebnissen kommt, dass 5-FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) mit den allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel in der alleinigen Gruppe behandelt wird (nur 5-FU) .
  • In 12A wird durch Fluoreszenzfärbung des Zellproliferations-bezogenen Faktors Ki67 bestätigt, um die Zellproliferation von Tumorzellen zu bestätigen.
  • Als Folge zeigt, dass die Zellproliferationsfähigkeit der Tumorzellen nicht verringert wird, nachdem in der allgemeine Darmkrebszellliniengruppe (H-5FUR-Exo + 5-FU), die mit Exosomen behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, 5FU-Antikrebsmittel verabreicht wird. Aber im Falle einer Gruppe (H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP), in der ein Produkt, das mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) in tertiär destilliertem Wasser verdünnt wird, an die allgemeine Darmkrebszellliniengruppe verabreicht wird, die mit Exosomen behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, zeigt, dass die Zellproliferationsrate von Krebszellen im Tumorgewebe deutlich verringert wird.
  • In 12B wird durch konfokales Fluoreszenzmikroskop bestätigt, indem die Gewebe von gespaltener Caspase-3, die Apoptose bestätigen kann, fluoreszierend angefärbt wird.
  • Als Folge zeigt, dass im Falle einer Gruppe (H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP), in der ein Produkt, das mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) in tertiär destilliertem Wasser verdünnt wird, an die allgemeine Darmkrebszellliniengruppe verabreicht wird, die mit Exosomen behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, die Exprimierung von gespaltener Caspase-3 signifikant erhöht ist.
  • Diese Ergebnissen bedeuten, dass die in der vorliegenden Erfindung hergestellte Kombination mit Prionprotein-zielgerichteten Antikörper (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) die Apoptose von Darmkrebszellen mit Resistenz gegen Antikrebsmittel fördert, indem es sehr ähnlich zu den Ergebnissen kommt, dass 5-FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) mit den allgemeinen Darmkrebszelllinien ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel in der alleinigen Gruppe behandelt wird (nur 5-FU) .
  • In 13 wird durch Gewebefluoreszenzfärbung an Blutgefäßen im Inneren des Tumorgewebe bestätigt, dass im Falle einer Gruppe (H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP), in der ein Produkt, das mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) in tertiär destilliertem Wasser verdünnt wird, an die allgemeine Darmkrebszellliniengruppe verabreicht wird, die mit Exosomen behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, die Exprimierung des auf Zell-Zell-Verbindungen bezogenen Faktors ZO-1 im Tumorgewebe eines tumorerzeugenden Tiermodells aufrechterhalten wird.
  • <Ausführungsbeispiel 7>
  • Wirkung auf die Metastasierung von Darmkrebstumoren unter Verwendung von Kombinationsmittel mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern und Antikrebsmitteln
  • Die in Ausführungsbeispiel 7 verwendeten Prionenprotein-zielgerichteten Antikörper sind die Produktnummer MAB1562 von US Merck.
  • In 14A ist gezeigt, dass, nachdem Exosomen, die aus hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, mit der allgemeinen Darmkrebszelllinie ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel (SNU-C5/WT) behandelt werden, ein Tiermodell für Tumormetastasen durch Transplantation in die Milz einer Versuchsmaus konstruiert wird. Und nach 1 Woche werden Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) in tertiär destilliertem Wasser verdünnt und zweimal pro Woche für insgesamt 7 Wochen intraperitoneal verabreicht.
  • 14B ist ein aufgenommenes Bild von in die Milz einer Maus transplantierten Krebszellen, die in die Leber der Maus metastasiert sind.
  • Als Folge ist, dass im Falle der allgemeinen Darmkrebszelllinie (H-5FUR-Exo), die mit Exosomen, die aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, behandelt wird, eine Metastasierung in die Leber aktiv wird. Aber im Falle einer Gruppe (H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP), in der eine Kombination mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) an eine allgemeine Darmkrebszelllinie verabreicht wird, die mit Exosomen, die aus hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, die Fähigkeit zur Metastasierung in die Leber verringert wird.
  • In 15 wird durch Fluoreszenzfärbung des Gewebes bestätigt, dass im Falle einer Gruppe (H-5FUR-Exo + 5-FU + Anti-PrP), in der eine Kombination mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern (5 mg/kg) und 5FU-Antikrebsmittel (30 mg/kg) an die allgemeine Darmkrebszelllinie verabreicht wird, die mit Exosomen behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, die Exprimierung des auf Zell-Zell-Verbindungen bezogenen Faktors ZO-1 des Gefäßgewebes im Tumorgewebe der allgemeinen Darmkrebszelllinie, die in die Leber eines Kleintiermodells für Tumormetastasen metastasiert und mit Exosomen behandelt wird, die also aus den hypoxisch kultivierten und gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Zelllinien extrahiert werden, aufrechterhalten wird.
  • Daher bedeutet dieses Ausführungsbeispiel, dass, da das Prionenprotein die Bindungskraft von Gefäßzellen schwächt, die Metastasierung von Darmkrebs aktiv durchgeführt wird und, wenn das Prionenprotein gehemmt wird, die Metastasierung von Darmkrebs gehemmt werden kann.
  • <Ausführungsbeispiel 8>
  • Wirkung auf den Zellzyklus des gegen Antikrebsmittel resistenten Darmkrebs von Kombinationsmittel mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern und Antikrebsmitteln
  • Die in Ausführungsbeispiel 8 verwendeten Prionenprotein-zielgerichteten Antikörper sind die Produktnummer Sc-393165 von US Santa Cruz Biotec.
  • In 16A geht es um eine Zellzyklusanalyse, die die Proliferationsfähigkeit von Zellen bewertet, wenn Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper in einer allgemeinen Darmkrebszelllinie (SNU-C5/WT) ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel mit Konzentrationen von 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml und 200 ng/ ml behandelt werden.
  • In 16B geht es um eine Zellzyklusanalyse, die die Proliferationsfähigkeit von Zellen bewertet, wenn Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper in einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinie (SNU-C5/5FUR) mit Konzentrationen von 10 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml und 200 ng/ml behandelt werden.
  • Als Folge wird bestätigt, dass bei Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern die S-Phase des Zellzyklus von Darmkrebszelllinie verringert wird, indem die Konzentration höher wird.
  • In 17A geht es um eine Zellzyklusanalyse, die die Proliferationsfähigkeit von Zellen bewertet, wenn mit einer allgemeinen Darmkrebszelllinie (SNU-C5/WT) ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel jeweils ein 5FU-Antikrebsmittel (10 µM) behandelt und Prionprotein-zielgerichtete Antikörper (200 ng/ml) behandelt werden, sowie 5FU-Antikrebsmittel und Prionprotein-zielgerichtete Antikörper zusammen behandelt werden.
  • In 17B geht es um eine Zellzyklusanalyse, die die Proliferationsfähigkeit von Zellen bewertet, wenn mit einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinie (SNU-C5/5FUR) jeweils 5FU-Antikrebsmittel (10, 50 und 100 µM) behandelt und Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper (200 ng/ml) behandelt werden, sowie 5FU-Antikrebsmittel (10, 50 und 100 µM) und Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper (200 ng/ml) für jede Dosis je nach Verabreichungsmenge zusammen behandelt werden. In 17B zeigen die Ergebnisse der Bestätigung, wie hoch die Empfindlichkeit des Antikrebsmittels ist, indem verschiedene Konzentrationen von 5FU-Antikrebsmittel verwendet werden, da es um die gegen Antikrebsmittel resistenten Zellen geht.
  • Als Folge hemmt eine Versuchsgruppe, in der Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper (200 ng/ml) zusammen behandelt werden, die S-Phase des Zellzyklus stärker als eine Behandlungsgruppe mit alleinigem 5FU-Antikrebsmittel. Insbesondere im Falle einer gegen 5FU-Antikrebsmittel resistenten Darmkrebszelllinie (SNU-C5/5FUR) zeigt, dass die S-Phase des Zellzyklus maximal um 1/3 reduziert ist, wenn 5FU-Antikrebsmittel in den gegen Antikrebsmittel resistenten Konzentrationen von 10, 50 und 100 µM mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern (200 ng/ml) zusammen behandelt werden.
  • Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Zellproliferation gehemmt wird, indem Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper die Empfindlichkeit des Antikrebsmittels über 5FU erhöhen.
  • <Ausführungsbeispiel 9>
  • Wirkung eines Kombinationsmittels mit Prionenprotein-zielgerichteten Antikörpern und Antikrebsmitteln auf Bildung von Darmkrebs
  • Die in Ausführungsbeispiel 9 verwendeten Prionenprotein-zielgerichteten Antikörper sind die Produktnummer Sc-393165 von US Santa Cruz Biotec.
  • 18A ist ein Schema, in dem ein tumorbildendes Tiermodell hergestellt wird, indem eine allgemeine Darmkrebszelllinie (SNU-C5/WT) ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel in eine Maus transplantiert wird, und ein experimentelles Verfahren zum Verabreichen eines 5FU-Antikrebsmittels und der Prionprotein-zielgerichteten Antikörper beschrieben wird.
  • In 18B zeigen die Ergebnisse von Tumoren, die gebildet werden, wenn eine allgemeine Darmkrebszelllinie (SNU-C5/WT) ohne Resistenz gegen Antikrebsmittel in eine Maus transplantiert und ein tumorbildendes Tiermodell mit 5FU und Prionenprotein-zielgerichteten Antikörper zusammen behandelt wird.
  • Als Folge zeigt eine Tumorgröße, die in der tumorbildenden Tiermodellgruppe, die also mit 5FU und Prionenprotein-zielgerichteten Antikörper in einer Menge von 10 mg/kg oder 100 mg/kg zusammen behandelt wird, im Vergleich zu der Gruppe, der ein alleiniges 5FU verabreicht wird, reduziert. Daher zeigen die Ergebnisse, dass, wenn Prionenprotein-zielgerichtete Antikörper in einem tumorbildenden Tiermodell verwendet werden, die Empfindlichkeit über Antikrebsmittel erhöht und infolgedessen die therapeutische Wirkung gegen Krebs erhöht wird.
  • Obwohl bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Hinweis auf die Zeichnungen beschrieben werden, wie oben beschrieben, versteht sich, dass der durchschnittliche Fachmann die vorliegende Erfindung innerhalb des Umfangs auf verschiedene Weise modifizieren und variieren kann, ohne vom Geist und Umfang der in den nachstehenden Ansprüchen beschriebenen vorliegenden Erfindung abzuweichen.
  • [industrielle Anwendbarkeit und Nützlichkeit]
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung, die die Prionenprotein-spezifischen Antikörper der vorliegenden Erfindung umfasst, kann den Effekt des Antikrebsmittels selbst in Krebszellen, die eine Resistenz gegen Antikrebsmittel entwickelt haben, empfindlich wirken lassen.

Claims (4)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Prionenprotein-spezifischen Antikörper umfasst.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie noch zusätzlich ein oder mehrere Bestandteile umfasst, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus einem Antikrebsmittel, einem Chemotherapeutikum, einem Toxin, einem Radioisotop und einem zytotoxischen Enzym besteht.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein oder mehrere Mittel ist, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus 5FU-Antikrebsmittel und Oxalaplatin-Antikrebsmittel besteht.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Krebsbehandlung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Komplex umfasst, der mit einem oder mehreren Bestandteilen kombiniert ist, die aus einer Gruppe ausgewählt werden, die also aus einem an eine antigene Determinante eines Prionenproteins gebundenen zielgerichteten Wirkstoff, einem Antikrebsmittel, einem Chemotherapeutikum, einem Toxin, einem Radioisotop und einem zytotoxischen Enzym besteht.
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