KR20210072026A

KR20210072026A - 세놀리틱 약물로서 아지트로마이신 및 록시스로마이신 유도체

Info

Publication number: KR20210072026A
Application number: KR1020217012994A
Authority: KR
Inventors: 마이클 피. 리산티; 페데리카 소트지아
Original assignee: 루넬라 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2018-10-02
Filing date: 2019-10-02
Publication date: 2021-06-16
Also published as: CU20210024A7; US20240180944A1; US20210275560A1; BR112021006423A2; US11957700B2; DOP2021000056A; AU2019353002A1; EP3860616A4; JP2022504204A; EP3860616A1; PE20211006A1; ECSP21029576A; CA3114888A1; CN113164504A; ZA202102157B; CL2021000825A1; MX2021003808A; CO2021004427A2; SG11202103293UA; PH12021550719A1

Abstract

본 발명은 세놀리틱 약물로서, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신과 이의 유도체의 용도에 관한 것이다. BrdU는 인간 섬유아세포 세포주 모델에서 노화를 유도하기 위해 사용되었다. 또한 세놀리틱 활성을 나타내는 화합물을 스크리닝하는 방법이 개시된다. SRB 분석은 단백질 함량을 통해 세포 생존력을 측정하는 데 사용되었다. 임상적으로 승인된 의약품인 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신은 세놀리틱 약물로 확인되었다. 그러나 밀접하게 관련된 모 화합물인, 에리트로마이신은 세놀리틱 활성을 나타내지 않았다. 아지트로마이신은 인간 섬유아세포에서 호기성 해당 작용과 자가 포식 모두를 강하게 유도했지만, 미토콘드리아 산소 소비 속도에 대해 50 μM에서의 억제 활성과 100 μM에서의 자극 활성을 포함하여 이상성 효과를 나타냈다. xCELLigence 실시간 분석 시스템은 아지트로마이신이 우선적으로 노화 세포를 표적으로 하여 약 97%를 제거하는 것을 나타낸다(노화세포가 거의 25 배 감소).

Description

세놀리틱 약물로서 아지트로마이신 및 록시스로마이신 유도체

본 발명은 노화 세포의 사멸을 선택적으로 유도하는 화합물인 세놀리틱(senolytic) 약물에 관한 것이다.

다양한 유기체는 연대기적 연령(chronological aging)을 겪는 동안, 많은 유전적, 표현형 및 대사적 결함이 축적된다. 상기 축적은 다양한 세포 유형에서 노화의 시작을 포함한다. 축적된 결함에 대한 전반적인 견해는 노화에 대한 가설인 "축적된 손상"과 일치한다.

노화(Senescence)는 정상적인 연대기적 연령의 명확한 특징이다. 노화는 p16-INK4A, p19-ARF, p21-WAF 및 p27-KIP1와 같은 CDK 억제제의 유도뿐만 아니라, SASP(senescence-associated secretory phenotype)의 개시, 주요 리소좀 효소 (베타-갈락토시다아제) 및 노화 색소로 인정되고 있는 리포푸신(Lipofuscin)의 유도를 통한, 잠재적으로 비가역적 세포주기 정지를 수반한다. 흥미롭게도, SASP는 IL-1-베타 및 IL-6과 같은 광범위한 염증성 사이토카인을 분비하여, 노화 세포가 만성 염증을 통해, 몸 전체 전신적으로, 노화 표현형을 한 세포 유형에서 다른 세포 유형으로 "전염적으로" 전파할 수 있도록 한다. 또한, 이러한 만성 염증은 암 발병을 촉진할 뿐만 아니라 종양 재발 및 전이를 유발할 수 있다.

노화 세포를 검출 및 표지하기 위한 형질 전환 프로브로서 p16-IN4KA의 프로모터를 이용하여, 몇몇 연구 그룹은 노화 세포를 실시간 일시적 방법으로 유전적으로 제거할 수 있는 뮤린(murine) 노화 모델을 현재 제조하였다. 비록 이를 항-노화 치료법으로서 사용할 수는 없지만, 이는 노화 세포의 제거가 잠재적으로 유기체에 치료적 이점을 줄 수 있는지 여부에 대한 정보를 제공할 수 있다. 현재까지의 결과는, 노화 세포의 유전적 제거가 실제로 건강 수명(health span)과 수명(lifespan)을 연장시킬 수 있음을 나타내는 큰 가능성을 보여준다.

이러한 유전적 데이터의 결과로 인해, 많은 제약 회사가 노화 세포를 표적으로 할 수 있는 "세놀리틱" 약물 개발에 적극적으로 관여하고 있다. 이론적으로, 이러한 세놀리틱 약물은 노화와 관련하여 다양한 영향을 미칠 가능성이 있다. 그러나 약물 개발은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 드는 과정으로, 광범위한 임상 시험이 필요하며, 여러 잠재적인 이유 중 하나로 인해 실패할 위험이 있다.

따라서, 하나 이상의 치료에 대해 이미 승인된 화합물이 세놀리틱 활성이 있는지 확인하는 것이 필요하다.

본 발명은 세놀리틱 약물로 사용될 수 있는 세놀리틱 활성을 갖는 화합물에 관한 것이다. 많은 FDA-승인된 약물은 다양한 정도의 세놀리틱 활성을 가지고 있다. 이러한 화합물들의 확인 및 노화 세포를 억제하기 위한 선택성의 개선은 항-노화 약물 임상(trials)에서의 이들의 이용 가능성을 크게 높일 수 있다. 본 발명에서 인간 섬유아세포에 노화를 유도하기 위한 툴(tool)로서, 제어된 DNA 손상을 이용하여, 확인된 이러한 화합물들을 개시한다. DNA 손상제로 오랫동안 사용되고 있는 BrdU-처리는 세놀리틱 활성을 갖는 화합물들을 스크리닝하는 데 효율적인 플랫폼으로 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, BrdU-처리는 배양된 세포에서 고효율로 노화를 재현 가능하게 유도할 수 있다.

본 발명자들은, 세놀리틱 활성을 확인하기 위한 플랫폼으로서 BrdU-처리를 이용하여, 에리트로마이신(erythromycin) 계열의 두 가지 마클로라이드(macrolide) 항생물질, 구체적으로 임상에서 승인된 약물인 아지트로마이신(azithromycin)과 록시스로마이신(roxithromycin)이 세놀리틱 활성 약물로서 효능이 있음을 확인하였다. 이러한 복잡한 상호 작용의 높은 특이성을 직접적으로 뒷받침하기 위해, 모(parent) 마클로라이드 화합물-에리트로마이신 자체-는 본 발명에 개시된 스크리닝 분석에서 세놀리틱 활성을 나타내지 않는다. 그러나, 텔리스로마이신(Telithromycin)(또 다른 마클로라이드)과 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신의 화학적 유사체(analogs) 또는 유도체(derivatives)는 세놀리틱 활성을 나타내었다. 본 명세서에서 상기 '유도체'와 '유사체'라는 용어는 상호 교환적으로 사용되었다. 본 발명에서 개시한 것과 같이, 세놀리틱 제제(agents)를 확인하는 데 스크리닝 방법론이 사용되었다. 또한, 세놀리틱 제제는 세놀리틱 활성을 개선하기 위해 하나 이상의 표적화 신호(targeting signals)로 변형될 수 있으며, 노화 세포를 보다 강력하게 없애기 위해 미토콘드리아 생성(biogenesis) 억제제와 같은 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 접근법은 다양한 형태를 취할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체로부터 선택된 적어도 하나의 세놀리틱 제제의 치료학적 양을 가지는 세놀리틱 조성물의 형태를 취할 수 있다. 본 발명에서 상기 '유도체'와 '유사체'라는 용어는 일반적인 사용법이 다를 수 있더라도, 같은 의미로 사용되었다. 예를 들어, 실시양태에서 하기 중 하나로부터 선택된 화학식의 약학적 유효량의 형태일 수 있다:

,

, 및

. 이러한 실시양태에서, R1 및 R2는 작용기를 나타내며, 상기 작용기는 동일하거나 상이할 수 있으며, R1 및 R2의 적어도 하나가 막-표적화 신호(membrane-targeting signal) 및 미토콘드리아-표적화 신호(mitochondria-targeting signal) 중 하나이다. 그 밖으로는, R1 및 R2는 수소(hydrogen), 카복실(carboxyl), 알케인(alkane), 사이클릭 알케인(cyclic alkane), 알케인계 유도체(alkane-based derivative), 알켄(alkene), 사이클릭 알켄(cyclic alkene), 알켄계 유도체(alkene-based derivative), 알카인(alkyne), 알카인계 유도체(alkyne-based derivative), 케톤(ketone), 케톤계 유도체(ketone-based derivative), 알데하이드(aldehyde), 알데하이드계 유도체(aldehyde-based derivative), 카복실산(carboxylic acid), 카복실산계 유도체(carboxylic acid-based derivative), 에테르(ether), 에테르계 유도체(ether-based derivative), 에스테르(ester), 에스테르계 유도체(ester-based derivative), 아민(amine), 아민계 유도체(amine-based derivative), 아마이드(amide), 아마이드계 유도체(amide-based derivative), 모노사이클릭 아렌(monocyclic arene), 폴리사이클릭 아렌(polycyclic arene), 헤테로아렌(heteroarene), 아렌계 유도체(arene-based derivative), 헤테로아렌계 유도체(heteroarene-based derivative), 페놀(phenol), 페놀계 유도체(phenol-based derivative), 벤조산(benzoic acid), 및 벤조산계 유도체(benzoic acid-based derivative)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 미리스트산(myristic acid), 올레산(oleic acid), 단쇄 지방산(short-chain fatty acid), 및 중쇄 지방산(medium-chain fatty acid)으로부터 선택된 막-표적화 신호이다. 청구항 1의 세놀리틱 조성물에 있어서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 트리-페닐-포스포늄(tri-phenyl-phosphonium; TPP), TPP-유도체, 구아니디늄(guanidinium), 구아니디늄 유도체(guanidinium derivative), 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지(10-N-nonyl acridine orange)로부터 선택된 미토콘드리아-표적화 신호이다. 세놀리틱 조성물의 일부 실시양태에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 2-부텐-1,4-비스-TPP(2-butene-1,4-bis-TPP); 2-클로로벤질-TPP(2-chlorobenzyl-TPP); 3-메틸벤질-TPP(3-methylbenzyl-TPP); 2,4-디클로로벤질-TPP(2,4-dichlorobenzyl-TPP); 1-나프틸메틸-TPP(1-naphthylmethyl-TPP); p-자일릴렌비스-TPP(p-xylylenebis-TPP); 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체로부터 선택된 TPP-유도체이다.

일부 실시양태에서, 상기 세놀리틱 화합물은 아지트로마이신 유도체 또는 유사체일 수 있다. 예를 들어, 상기 세놀리틱 조성물은 하기 화학식을 갖는 화합물일 수 있다

, 상기 R1은 메틸 및 R2는 막-표적화 신호와 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이거나, R1은 막-표적 신호와 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나 및 NH-R2는 N(CH₃)₂이다. 물론, 상기 작용기는 본 발명의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 상이할 수 있다. 용어의 일반적인 사용법에 따라, 염기 화합물(예를 들어, 아지트로마이신)로부터 단일 치환은 유사체로 지칭되며, 염기 화합물에 하나 이상의 변형은 유도체로 간주될 수 있다. 단순함을 위해, 본 명세서에서 상기 '유도체'와 '유사체'라는 용어를 상호 교환적으로 사용하였다.

일부 실시양태에서, 상기 세놀리틱 화합물은 록시스로마이신 유도체 또는 유사체일 수 있다. 예를 들어, 상기 세놀리틱 조성물은 하기 화학식을 갖는 화합물일 수 있다

, 상기 R1은 O-CH₂-O-(CH₂)₂-OCH₃ 및 R2는 막-표적화 신호와 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이거나, R1은 막-표적화 신호와 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나 및 NH-R2는 N(CH₃)₂이다. 물론, 상기 작용기는 본 발명의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 상이할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 세놀리틱 화합물은 텔리스로마이신 유도체 또는 유사체일 수 있다. 예를 들어, 상기 세놀리틱 조성물은 하기 화학식을 갖는 화합물일 수 있다

, 상기 R1은

및 R2는 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이거나, R1은 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나 및 NH-R2는 N(CH₃)₂이다.

본 발명 접근법의 바람직한 실시양태에서, 상기 세놀리틱 조성물은 미토콘드리아 흡수를 개선하고 결과적으로, 화합물의 세놀리틱 활성을 개선하기 위한 신호를 표적화하는 적어도 하나의 작용기를 갖는다. 상기 개시한 일반식의 사용에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택된 막-표적화 신호, 또는 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-자일릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체로부터 선택된 미토콘드리아-표적화 신호이다.

일부 실시양태에서, 상기 세놀리틱 조성물은 또한 하나 이상의 추가적인 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태는 테트라사이클린(tetracycline), 클로르테트라사이클린(chlortetracycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 데메클로사이클린(demeclocycline), 메타사이클린(methacycline), 독시사이클린(doxycycline), 미노사이클린(minocycline), 및 티게사이클린(tigecycline) 중 적어도 하나의 치료학적 양을 포함할 수 있다. 일부 실시양태는 피르비늄(pyrvinium), 아토바쿠온(atovaquone), 베다퀼린(bedaquiline), 이리노테칸(irinotecan), 소라페닙(sorafenib), 니클로사마이드(niclosamide), 스티리펜톨(stirpentol), 클로로퀸(chloroquine), 및 라파마이신(rapamycin) 중 적어도 하나의 치료학적 양을 포함할 수 있다. 아울러, 일부 실시양태는 미토리보신(mitoriboscin), 미토케토신(mitoketoscin), 미토플라보신(mitoflavoscin), 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체 중 적어도 하나의 치료학적 양을 포함할 수 있다. TPP-유도체는 세놀리틱 화합물의 유도체 또는 유사체와 접합될 수 있고, 표적화 신호로서 기능할 수 있으며, 별도의 치료 화합물로도 존재할 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 일부 실시양태는 비타민 C(Vitamin C), 베르베린(berberine), 카페인산 페닐 에스테르(caffeic acid phenyl ester), 실리비닌(silibinin), 브루티에리딘(brutieridin), 및 멜리티딘(melitidin) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

상기 세놀리틱 조성물의 형태(form)를 나타내는 실시양태는 다양한 형태로 만들어질 수 있고, 예를 들어 화장품, 알약, 로션, 샴푸, 크림, 비누, 피부 세정제, 면도제, 애프터 쉐이브, 젤, 스틱, 페이스트, 스프레이, 에어로졸, 분말, 액체, 수성 현탁액, 수용액, 폼, 경피 패치, 팅크(tincture), 및 증기를 포함한다. 다만 상기 형태는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다.

본 발명의 접근법의 실시양태는 노화 치료용 조성물의 형태를 취할 수 있다. 이러한 조성물은 상기 개시한 바와 같이 세놀리틱 제제의 치료학적 양을 포함한다. 예를 들어, 상기 세놀리틱 제제는 (i) 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택된 막-표적화 신호; 및 (ii) 트리-페닐-포스포늄(TPP), TPP-유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체, 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지로부터 선택된 미토콘드리아-표적화 신호 중 적어도 하나를 갖는, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 하나일 수 있다.

일부 실시양태에서, 노화 치료용 조성물은 또한 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 및 티게사이클린 중 적어도 하나의 치료학적 양을 포함할 수 있다. 일부 실시양태는 피르비늄, 아토바쿠온, 베다퀼린, 이리노테칸, 소라페닙, 니클로사마이드, 스티리펜톨, 클로로퀸, 및 라파마이신 중 적어도 하나의 치료학적 양을 포함할 수 있다. 아울러, 일부 실시양태는 미토리보신, 미토케토신, 미토플라보신, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체 중 적어도 하나의 치료학적 양을 포함할 수 있다. 추가적으로, 일부 실시양태는 비타민 C, 베르베린, 카페인산 페닐 에스테르, 실리비닌, 브루티에리딘, 및 멜리티딘 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

본 발명의 접근법은 개체에서 노화 세포의 사멸을 유도하는 방법의 형태를 취할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 세놀리틱 제제의 치료학적 양이 개체에 투여된다. 상기 세놀리틱 제제는 상기 개시한 바와 같이, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 적어도 하나일 수 있다. 유도체 또는 유사체는 막-표적화 및 미토콘드리아-표적화 신호와 같은, 하나 이상의 표적화 신호를 포함할 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 및 티게사이클린 중 적어도 하나의 치료학적 양이 세놀리틱 제제와 함께 투여될 수 있다. 또 다른 예로, 피르비늄, 아토바쿠온, 베다퀼린, 이리노테칸, 소라페닙, 니클로사마이드, 스티리펜톨, 클로로퀸, 및 라파마이신 중 적어도 하나의 치료학적 양이 투여될 수 있다. 또한 추가적인 예로, 미토리보신, 미토케토신, 미토플라보신, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체 중 적어도 하나의 치료학적 양이 투여될 수 있다. 또 다른 예로, 비타민 C, 베르베린, 카페인산 페닐 에스테르, 실리비닌, 브루티에리딘, 및 멜리티딘 중 적어도 하나의 치료학적 양이 투여될 수 있다. 상기 치료학적 제제는 세놀리틱 제제와 공동-투여되거나, 일부 실시양태에서는 세놀리틱 제제 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다.

본 발명의 접근법의 일부 실시양태는 개체에서 연령-관련 질환의 발병을 지연시키는 방법의 형태를 취할 수 있다. 상기 연령-관련 질환은 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 관절염(arthritis), 암(cancer), 심혈관 질환(cardiovascular disease), 백내장(cataract), 치매(dementia), 당뇨병(diabetes), 탈모(hair loss), 고혈압(hypertension), 염증성 질환(inflammatory disease), 신장 질환(kidney disease), 근위축(muscular atrophy), 신경질환(neurological disease), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 폐질환(pulmonary disease), 척추 디스크 변성(vertebral disc degeneration), 및 탈모증(alopecia) 중 적어도 하나일 수 있다. 예를 들어, 연령-관련 질환은 경도 인지 장애(mild cognitive impairment), 운동 신경 기능 장애(motor neuron dysfunction), 알츠하이머 병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 및 황반 변성(macular degeneration)과 같은 신경질환일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본 발명에 개시된 바와 같이, 세놀리틱 제제의 치료학적 양이 개체에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세놀리틱 제제는 본 발명에서 개시된 바와 같이 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 상기 세놀리틱 제제는 발병 시점, 즉 연령-관련 질환의 진단 시점 또는 진단 직후에 투여될 수 있다. 대안적으로, 상기 세놀리틱 제제는 진단 후에 일상적으로 투여될 수 있고, 빈도 및 투여량은 본 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세놀리틱 제제는 발병 전에 투여될 수 있으며, 특히 연령-관련 질환이 개체에서 예상되거나 발생할 가능성이 있는 경우(예를 들어, 유전적 마커 또는 다른 생물학적 마커로 인해) 투여될 수 있다.

본 발명의 접근법은 또한 연령-관련 질환의 발병 지연용 조성물의 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 접근법은 죽상동맥경화증, 관절염, 암, 심혈관 질환, 백내장, 치매, 당뇨병, 탈모, 고혈압, 염증성 질환, 신장 질환, 근위축, 신경질환, 골관절염, 골다공증, 폐질환, 척추 디스크 변성, 및 탈모증의 발병을 지연시키는 데 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 적어도 하나를 포함하는 세놀리틱 제제의 치료학적 양이, 본 발명에 개시된 바와 같이, 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세놀리틱 제제는 본 발명에 개시된 바와 같이 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 접근법은 또한 세놀리틱 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법의 형태를 취할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 세포 집단은 노화 세포 집단을 생성하기 위해 첫 번째 기간 동안 DNA 손상제에 노출된다. DNA 손상제의 예는 브로모디옥시우리딘(bromodeoxyuridine; BrdU)이지만, 다른 DNA 손상제도 본 발명의 접근법에 벗어나지 않고 사용될 수 있다. 노화 세포 집단의 적어도 일부를 두 번째 기간 동안 후보 화합물로 처리하여 처리된 세포 집단을 형성한다. 후보 화합물은 세놀리틱 활성에 대해 스크리닝되는 화합물이다. 상기 처리된 세포 집단은 적어도 하나의 세놀리틱 활성 마커에 대해 분석된다. 세놀리틱 활성 마커의 예로는 세포 생존력(cell viability), 호기성 해당 작용(aerobic glycolysis), 자가 포식(autophagy), 억제 활성(inhibitory activity), 및 세포 증식 감소(cell proliferation reduction)를 포함한다. 예를 들어, 자가포식성 LC3 단백질은 본 발명에 개시된 바와 같이 정량적으로 측정될 수 있다. 설포로다민 B(Sulphorhodamine B) 분석 및 세포-유도 전기 임피던스(cell-induced electrical impedance) 측정은 세놀리틱 활성에 대한 세포 집단을 분석하는 데 사용할 수 있는 분석의 예이다. 상기 첫 번째 기간은 다양할 수 있으며, 하기 서술되는 실시양태에서는 약 8 일이다. 상기 두 번째 기간도 다양할 수 있고, 하기 논의되는 실시양태에서는 약 3 일 내지 약 5 일이다. 일부 실시양태에서, BrdU는 두 번째 기간 전에 세척될 수 있다.

본 발명의 접근법의 추가적인 실시양태는 하기 상세한 설명을 검토한 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 수 있다.

도 1은 본 발명의 접근법의 하나의 실시양태에 따른 세놀리틱 약물을 스크리닝 및 확인하는 방법을 나타낸다.
도 2는 MRC-5 섬유아세포에서 DNA 합성 감소 결과를 보여준다.
도 3a는 MRC-5 섬유아세포에서 아지트로마이신에 대한 SRB 분석 결과를 보여준다. 도 3b 및 3c는 각각 BrdU 전처리 및 전처리없이 100 μM 아지트로마이신으로 처리된 MRC-5 섬유아세포의 이미지를 보여준다.
도 4는 MRC-5 섬유아세포에서 록시스로마이신에 대한 SRB 분석 결과를 보여준다.
도 5는 MRC-5 섬유아세포에서 50 μM 아지트로마이신에 대한 자가포식 유도 결과를 보여준다.
도 6a 및 6b는 MRC-5 세포에 아지트로마이신 처리 72 시간 후 대사 흐름 분석(metabolic flux analysis)을 통한 세포외 산성화 속도(extracellular acidification rate) 결과를 보여준다.
도 7a 및 7b는 MRC-5 세포에 아지트로마이신 처리 72 시간 후 대사 흐름 분석을 통한 산소 소비 속도(oxygen consumption rate) 결과를 보여준다.
도 8은 노화를 유도하기 위해 8 일 동안 BrdU로 전처리한 후, 5 일 동안 아지트로마이신에 노출시킨 노화 인간 피부 세포에서 세놀리틱 활성을 보여준다.
도 9a는 BrdU 전처리, BrdU 전처리 후 아지트로마이신 처리, 아지트로마이신 단독, 및 대조군을 비교하는 MRC-5 세포주에 대한 xCELLigence 실시간 세포 상태 모니터링을 통한 대표 세포 추적도를 보여준다. 도 9b는 동일한 세포주에 대한 최종 세포 지수 결과를 나타낸다.
도 10a 및 10b는 각각 BrdU 전처리, BrdU 전처리 후 록시스로마이신 처리, 록시스로마이신 단독, 및 대조군을 비교하는 MRC-5 세포주에 대한 xCELLigence 실시간 세포 상태 모니터링을 통한 최종 세포 지수 결과 및 대표 세포 추적도를 보여준다.
도 11a 및 11b는 각각 BrdU 전처리, BrdU 전처리 후 텔리스로마이신 처리, 텔리스로마이신 단독, 및 대조군을 비교하는 MRC-5 세포주에 대한 xCELLigence 실시간 세포 상태 모니터링을 통한 최종 세포 지수 결과 및 대표 세포 추적도를 보여준다.

다음의 기재는 본 발명의 접근법의 구현예가 실행될 수 있도록 현재 의도된 실시예를 포함한다. 다음의 기재는 본 발명의 일반적인 원리를 설명하기 위한 목적일 뿐, 이의 의미를 제한하기 위한 것이 아니다.

본 발명에서 개시된 바와 같이, 본 발명의 접근법은 노화를 유도하기 위한 스크리닝 분석법의 개발, 및 이를 세놀리틱 활성을 갖는 화합물, 즉 노화 세포의 선택적 억제 및 노화 세포 사멸을 유도하는 화합물을 확인하기 위한 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 접근법은 일부 실시양태에서, 노화 및 연령-관련 장애의 치료를 위한 세놀리틱 활성을 갖는 임상적으로 승인된 치료제를 확인하고 용도를 변경하는 데 사용될 수 있다. 도 1은 본 발명의 접근법에 따른 스크리닝 방법을 나타낸다. 단계 S101에서, 정상 섬유아세포를 선택한다. 다음으로, 단계 S102에서 상기 세포에 DNA 손상제를 노출시켜 노화를 유도한다. 예를 들어, 브로모디옥시우리딘은 상기 손상제로 사용될 수 있다. 단계 S103에서 상기 노화 세포에 후보 치료 화합물을 처리한다. 또한, 여러 후보 치료 화합물이 노화 세포의 일부를 사용하여 스크리닝 될 수 있으며, 화합물 농도 및 처리 기간의 변화는 상기 단계에 포함될 수 있다. 마지막으로, 단계 S104에서, 처리된 세포는 세놀리틱 활성 마커를 분석한다. 정상 세포 및/또는 비처리 노화 세포도 대조군으로서 분석될 수 있다. 세놀리틱 활성 마커는 다양할 수 있으며, 예를 들어 세포 생존력, 호기성 해당 작용, 자가 포식, 억제 활성, 및 세포 증식 감소를 포함할 수 있다.

BrdU로도 알려진 브로모디옥시우리딘(5-브로모-2'-디옥시우리딘)은 노화 유도에 사용될 수 있다. BrdU는 증식하는 세포를 식별하는 데 일반적으로 사용되는 뉴클레오사이드 티미딘(nucleoside thymidine)의 유사체이다. BrdU는 제어된 DNA 손상을 유도하고, 고효율로 세포 노화를 유발한다. 본 발명의 접근법의 BrdU 분석은 제어된 DNA 손상 및 노화를 유도하기 위해 100 μM의 BrdU의 존재하에 정상적인 섬유아세포를 장기간 배양(8 일)한다. 구체적인 실시양태에서, 본 발명자들은 BrdU-기반 분석에서 2 개의 독립적인 정상, 비-불멸화된 인간 섬유아세포 세포주인 MRC-5 폐 세포(스크리닝용) 및 BJ 피부 세포(검증용)를 사용하였다. 그런 다음, 정상 및 노화 섬유아세포의 동종 매치된(isogenically-matched) 배양은 세놀리틱 활성을 갖는 약물을 확인하기 위한 약물 스크리닝용으로 사용될 수 있다. 세놀리틱 활성은 본 기술분야에서 SRB 분석으로도 알려진, 설포로다민 B 분석을 사용하여 검출될 수 있다. 이 분석법은 세포 생존력에 대한 대리 마커이고, 조직 배양 접시에 부착된 남아있는 단백질의 양을 측정한다. 이러한 접근법은 예를 들어 항생제와 같은 임상적으로 승인된 약물을 포함한 화합물을 신속하게 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 개시된 실시양태에서, 본 발명의 접근법은 다양한 화합물 중 아지트로마이신 및 록시스로마이신을 포함하는 에리트로마이신 계열 멤버들을 스크리닝하는 데 사용되었다. 본 발명의 접근법은 다른 화합물을 스크리닝하는 데에도 사용될 수 있음이 인식되어야 한다.

실험적으로, 본 발명의 접근법은 "정상" 섬유아세포와 "노화" 섬유아세포의 반응을 나란히 직접 비교한다. 정상 섬유아세포가 아닌, 노화 섬유아세포를 우선적으로 죽이는 약물은 세놀리틱 활성에 대해 양성으로 간주될 수 있다. 본 발명에 개시된 실시양태에서 본 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 노화 섬유아세포를 우선적으로 표적화하는 2 개의 에리트로마이신 계열 멤버, 아지트로마이신 및 록시스로마이신을 확인하였다. 하기 [표 1]은 에리트로마이신, 아지트로마이신, 및 록시스로마이신의 두 가지 농도의 결과를 나타내며, 아지트로마이신과 록시스로마이신은 100 μM에서 세놀리틱 활성을 가짐을 나타낸다. 또한, 다른 마클로라이드인 텔리스로마이신 뿐만 아니라 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신의 화학적 유사체도 유익한 세놀리틱 활성을 나타내었다. 그러나, 에리트로마이신 자체는 어떠한 세놀리틱 활성을 나타내지 않았다.

본 발명의 실시양태에서 스크리닝된 에리트로마이신 계열 멤버의 일부의 정확한 화학 구조는 하기 화합물 I-IV로 나타낸다. 에리트로마이신 계열의 화합물 구조는 상당한 유사성을 갖지만, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신에서 세놀리틱 활성이 나타남에 유의한다.

또한, 본 발명자들은 세포 노화를 충분히 유도할 수 있는 BrdU-유도 DNA 손상을 이용하여 검증하였다. 도 2는 MRC-5 섬유아세포에서 DNA 합성 감소 결과를 보여준다. BrdU의 2일 처리는, Muse 세포 주기 키트로 측정했을 때 MRC-5 섬유아세포에서 DNA 합성을 ~ 70%까지 유의적으로 감소시켰다. BrdU 처리 8 일 후, MRC-5 세포는 세포 노화의 바이오 마커인 베타-갈락토시다아제에 대해 양성 염색되었다. 이 데이터의 경우 n=3; *는 p<0.05를 나타낸다. 도 2의 인레이(inlay)는 BrdU로 처리된 세포에서 베타-갈락토시다아제 양성을 보여준다. 상기 결과는 BrdU로 처리된 세포는 세포주기 정지를 겪었다는 증거로, S-기에서 세포 수의 ~ 70% 감소, 및 베타-갈락토시다아제 활성 유도에 의해 입증된다. 이러한 결과를 통해 MRC-5 세포의 BrdU-처리가 노화의 두 가지 특징인 DNA 합성을 효과적으로 억제하고 베타-갈락토시다아제를 유도한다는 것을 확인한다.

하나의 실시양태에서, 아지트로마이신은 노화 MRC-5 인간 폐 섬유아세포에서 세놀리틱 활성을 나타냈다. MRC-5 세포를 BrdU로 8 일 동안(노화를 유도하기 위해) 전처리한 후, BrdU를 세척하고, 또 다른 5 일 동안 아지트로마이신에 노출시켰다. 그런 다음, SRB 분석을 수행하여 약물이 세포 생존력에 미치는 영향을 결정하였다. 도 3a는 대조군(BrdU 단독)에 비해, BrdU-처리된 MRC-5 섬유아세포에 100 μM 및 50 μM 농도의 아지트로마이신을 처리한 경우에 대한 SRB 분석 결과를 보여준다. 100 μM에서 아지트로마이신은 정상 MRC-5 폐 섬유아세포의 생존력에 영향을 미치지 않았지만, 노화 MRC-5 섬유아세포는 선택적으로 사멸시켰다. 상기 농도의 아지트로마이신은 5 일 동안 처리 후 대조군 세포에는 영향을 주지 않고 노화 세포 약 50%를 강력하고 선택적으로 제거하였다. 그러나 아지트로마이신은 50 μM에서 효과가 없었다. 상기 실험은 매우 유사한 결과를 나타내고, 독립적으로 최소 3 회 반복되었다. 상기 데이터의 경우 **는 p<0.01을 나타낸다. 도 3b 및 3c는 각각 BrdU 전처리 또는 전처리없이, 100 μM 아지트로마이신으로 처리된 MRC-5 섬유아세포의 이미지이다. 이 이미지는 아지트로마이신이 정상 세포에는 거의 영향을 미치지 않았지만, 노화 세포에서는 세포 사멸을 유도했음을 보여준다. 3b 및 3c의 오른쪽 상단에 있는 눈금 막대는 20 ㎛를 나타낸다.

이에 비해, 동일한 농도의 록시스로마이신은 노화 MRC-5 섬유아세포를 보다 효과적으로 사멸시켰지만(~ 70%), 정상 MRC-5 섬유아세포의 생존력에 약간의 영향을 미쳤다. 일 실시양태에서, MRC-5 세포를 BrdU로 8 일 동안(노화를 유도하기 위해) 전처리한 후, BrdU를 세척하고 또 다른 5 일 동안 록시스로마이신에 노출시켰다. 5 일 동안 노출 후, SRB 분석을 수행하여 약물이 세포 생존력에 미치는 영향을 결정하였다. 도 4는 록시스로마이신으로 처리된 MRC-5 섬유아세포에 대한 SRB 분석 결과를 보여준다. 상기 데이터는 100 μM 농도의 록시스로마이신이 MRC-5 세포에 강력하고 선택적인 영향을 미쳤음을 보여주며, 이는 5 일 후 50% 이상의 노화 세포를 제거했기 때문이다. 그러나, 록시스로마이신은 50 μM 농도에서 효과가 없었다. 상기 실험은 매우 유사한 결과 나타내고, 독립적으로 최소 3 회 반복되었다. *는 도 4에서 p<0.05를 나타낸다.

도 3a 및 도 4는 아지트로마이신 및 록시스로마이신이 50 μM에서 노화 세포 생존력에 유의한 영향을 미치지 않음을 보여준다. 이는 세놀리틱 효과가 농도에 따라 다르다는 것을 나타낸다. 이에, 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 기술분야에 공지되고 이용 가능한 방법을 사용하여 세놀리틱 활성을 갖는 약물에 대한 적절한 농도를 결정할 수 있음이 인식되어야 한다. 상기 실험에 이용된 농도에 근거하여, 아지트로마이신 독성은 노화 세포 표현형을 선택적으로 표적화하는 데 가장 높은 특이성을 나타냈다.

아지트로마이신의 표현형적 및 대사적 효과를 실험적으로 보다 잘 이해하기 위해, MRC-5 섬유아세포를 사용하여 추가 실험을 수행하였다. MRC-5 세포에 72 시간 동안 50 μM로 아지트로마이신을 처리하였다. 그런 다음 Muse 자가포식 LC3-항체 기반 키트를 사용하여 자가포식성 LC3 단백질을 검출하여 자가포식을 모니터링하였다. 도 5는 아지트로마이신이 자가 포식 표현형의 강력한 유도제임을 보여주는 결과이다. 도 5의 **는 상기 데이터에 대해 p<0.01을 나타낸다. 상기 결과에서, 아지트로마이신 처리는 MRC-5 세포에서 자가 포식이 3 배 이상 증가됨을 나타낸다.

다음으로, 본 발명자들은 시호스 XFe96 대사 흐름 분석기를 이용하여, 호기성 해당 작용 및 미토콘드리아 대사에 대한 아지트로마이신의 효과를 측정하였다. MRC-5 세포에 25 μM 내지 100 μM 범위 농도의 아지트로마이신을 72 시간 처리한 후, 시호스 XFe96으로 대사 흐름 분석을 수행하여 세포외 산성화 속도(ECAR)를 측정하였다. 도 6a 및 6b는 이러한 대사 흐름 분석을 통한 ECAR 데이터를 보여주며, 아지트로마이신은 시험된 모든 농도에서 호기성 해당 과정을 증가시키는 것을 알 수 있다. 도 6a의 데이터는 40 분의 위에서 아래로 각각 100 μM, 50 μM, 25 μM 및 대조군(즉, 비히클 단독)의 아지트로마이신 농도를 나타낸다. 도 6b에서, 막대 데이터는 왼쪽에서 오른쪽으로 대조군, 100 μM, 50 μM 및 25 μM을 나타낸다. 상기 데이터의 경우 n=3; **는 p<0.01, ***는 p<0.001을 나타낸다.

본 발명자들은 또한 산소 소비 속도(OCR)에 대한 아지트로마이신의 효과를 평가하기 위해 대사 흐름 분석을 수행했다. 그 결과 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 아지트로마이신이 MRC-5 세포에서 OCR에 대해 이상성(biphasic)의 효과를 가짐을 보여준다. 상기 데이터는 MRC-5 세포에 25 ~ 100 μM 농도 범위의 아지트로마이신을 72 시간 처리한 후, 시호스 XFe96으로 대사 흐름 분석을 실시하여 확인하였다. 도 7a 데이터에서 선은 41 분에 위에서 아래로, 대조군(즉, 비히클 단독)과 25 μM, 50 μM 및 100 μM 농도에 대한 것이다. 가장 높은 아지트로마이신 농도인 100 μM은 미토콘드리아 호흡을 54 분까지 증가시켰고, 낮은 농도(50 μM)는 유의적으로 감소시켰음에 유의한다. 그러나 25 μM은 OCR에 큰 영향을 미치지 않았다. 상기 데이터의 경우 n=3이고 *는 p<0.05를 나타낸다.

도 7b는 기초 호흡(basal respiration), 양성자 누출(proton leak), ATP-연결 호흡, 최대 호흡 및 예비 호흡 능력에 대한 OCR을 보여준다. 왼쪽에서 오른쪽으로 막대 데이터는 대조군과 100 μM, 50 μM 및 25 μM의 농도를 나타낸다. 아지트로마이신의 미토콘드리아 효과는 농도 의존적이며 이상성임에 유의한다. 25 μM에서 아지트로마이신은 OCR에 유의적인 영향을 미치지 않았다. 그러나, 50 μM에서 아지트로마이신은 미토콘드리아 대사를 명확하게 억제하여 특히 최대 호흡과 예비 호흡 능력에 영향을 미쳤다. 대조적으로, 100 μM에서 아지트로마이신은 최대 호흡을 자극하고 예비 호흡 능력을 두 배 이상 늘렸다. 이는 미토콘드리아 억제 효과를 극복하기 위한 아지트로마이신 처리로 인한 세포 보상 반응을 나타낸다.

아지트로마이신의 선택성과 효능은 정상, 비-불멸화 BJ 인간 섬유아세포를 이용하여 검증하였다. BJ 세포를 BrdU로 8 일 동안 전처리하여 노화를 유도하고, BrdU를 세척하고 5 일 동안 아지트로마이신에 노출시켰다. 그런 다음, 세포 생존력에 대한 아지트로마이신의 효과를 확인하기 위해 SRB 분석을 수행하였다. 아지트로마이신은 BJ 세포에 대해 강력하고 선택적인 효과를 보였는데, 이는 5 일 동안 50 μM 처리 후, 대조군 세포의 생존력을 감소시키지 않고 50% 이상의 노화 세포를 제거했기 때문이다. 상기 실험은 매우 유사한 결과를 나타내었고 독립적으로 최소 3 회 반복되었다. 상기 결과는 도 8에 나타낸다. 도 8에서 **는 p<0.01을 나타낸다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 아지트로마이신은 BJ 피부 섬유아세포에서 더 강력하고, 50 μM에서만 유의적인 세놀리틱 활성을 나타냈다. 아지트로마이신은 또한 정상적인 BJ 피부 섬유아세포의 생존력을 25% 이상 증가시켰다. 따라서 아지트로마이신은 두 개의 다른 해부학적 부위(폐 조직 및 피부)에서 파생된 인간 섬유아세포에서 유사한 선택성과 세놀리틱 활성을 나타낸다.

본 발명의 접근법에 따라 세놀리틱 활성을 테스트한 다른 화합물

스크리닝된 화합물	테스트 세포	테스트 농도
독시사이클린	BJ	25 - 200 μM
디페닐렌요오도늄 클로라이드 (Diphenyleneiodonium chloiride)	BJ	0.5 - 10 μM
멜라토닌 (Melatonin)	BJ	200 - 400 μM
아스파탐 (Aspartame)	BJ	200 - 400 μM
글루코사민 (Glucosamine)	BJ	10 - 15 μM
케르세틴 (Quercetin)	BJ	10 - 100 μM
다사티닙 (Dasatinib)	BJ	0.1 - 1 μM
클로로퀸	BJ, MRC-5	100 - 200 μM
에리트로마이신	BJ, MRC-5	100 - 200 μM
클래리스로마이신 (Clarithromycin)	BJ, MRC-5	100 - 200 μM
라파마이신	MRC-5	50 - 500 μM
라이코펜 (Lycopene)	MRC-5	25 - 50 μM
알파-리포산 (Alpha-lipoic acid)	MRC-5	25 - 50 μM

본 발명의 접근법은 MRC-5 또는 BJ 섬유아세포를 이용한 세놀리틱 분석 시스템을 사용하여 다른 여러 후보 약물을 테스트하는 데 사용되었다. 이러한 화합물은 상기 [표 2]에 나열하였으며, 사용된 세포주와 테스트에 사용된 화합물 농도 범위도 개시하였다. 불행히도, 다른 후보 약물 어느 것도 정상적인 섬유아세포 대응물에 할애할 동안, 어떠한 특이적 세놀리틱 활성을 나타내지 않았다.

비록 에리트로마이신 계열 전체가 세놀리틱 활성을 나타내지는 않지만, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신은 특이적이고 선택적인 세놀리틱 활성을 나타낸다. 또한, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신의 많은 화학적 유사체 및 유도체도 세놀리틱 활성을 보유하고 있음이 인식되어야 한다. 전통적으로 '유사체'는 모 화합물과 하나의 요소만 차이가 있는 반면, '유도체'는 다른 화합물에서 파생되거나 합성된 화합물이다. 본 명세서에서, 용어는 상호교환적으로 사용되지만, 유도체 중 다수는 그 용어의 일반적인 사용 하에서 유사체로 지칭될 수도 있다. 예를 들어, 표적 신호 모이어티에 부착되기 위해 하나의 치환이 이루어진 유도체는 유사체로 간주될 수 있다. 지방산 막-표적화 신호 또는 TPP-유도체 미토콘드리아-표적화 신호와 같은 표적화 신호를 갖는 유도체는 미토콘드리아 흡수를 증가시키고, 결과적으로 효능을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다. 이러한 효과는 암 줄기세포 및 노화 세포와 같은 미토콘드리아 생물 발생에 크게 의존하는 세포에서 두드러진다. 하기 화합물 V 내지 VII는 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신의 유사체 각각에 대한 작용기의 위치를 보여주는 일반적인 구조식이다.

각각의 일반식 V 내지 VII는 번호가 매겨진 "R"로 표시되고 R-기로 지칭되며 잠재적인 접합 또는 치환을 위한 위치를 갖는다. 각각의 R-기는 수소(hydrogen), 탄소(carbon), 질소(nitrogen), 황(sulfur), 산소(oxygen), 플루오린(fluorine), 염소(chlorine), 브로민(bromine), 아이오딘(iodine), 카복실, 알케인, 사이클릭 알케인, 알케인계 유도체, 알켄, 사이클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알카인, 알카인계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데하이드, 알데하이드계 유도체, 카복실산, 카복실산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르 및 에스테르계 유도체, 아민, 아민계 유도체, 아마이드, 아마이드계 유도체, 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 벤조산계 유도체, 막-표적화 신호, 및 미토콘드리아-표적화 신호로부터 선택될 수 있다. 상기 언급한 탄소나 질소와 같은 단일 원자는 만족스러운 원자가(valence)가 여전히 필요할 수 있음이 인식되어야 한다(예를들어, 하나 이상의 추가 결합 또는 수소 원자가 필요할 수 있음). 본 발명에서 사용된 용어 "유도체"는 화학 반응에 의해 유사한 화합물로부터 유도되는 화합물을 지칭한다. 세놀리틱 화합물 유도체의 하나 이상의 R-기는 노화 세포에 대한 화합물의 선택성과 유효성을 향상시키기 위해, 막-표적화 신호 및/또는 미토콘드리아-표적화 신호로 치환될 수 있다. 막-표적화 신호는 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산을 포함한다. 상기 생성된 접합체는 지방산의 화학적 변형을 달성하기 위해 지질화 반응(예를 들어, 미리스토일화(myristoylation), 팔미토일화(palmitoylation) 등)과 같은 본 기술분야에 공지된 기술에 따라 합성될 수 있다. 미토콘드리아-표적화 신호는 예를 들어, 트리-페닐-포스포늄(TPP), TPP-유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체, 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지와 같은 친유성 양이온을 포함한다. TPP-유도체의 비-포괄적인 예로는 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-자일릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체를 포함한다. 유도체는 본 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 이들은 일 예로서 제공된 비-포괄적인 리스트임이 인식되어야 한다.

본 발명의 접근법의 추가 적용에서, 노화 세포에 대한 아지트로마이신의 선택성은 xCELLigence 시스템을 사용하여 검증되었다. 노화 세포는 단백질 합성 및 분비의 극적인 증가를 수반하는 소위 노화 관련 분비 표현형(SASP)을 겪기 때문에, 본 발명자들은 상기 단백질 측정 분석 시스템이 테스트된 화합물의 세놀리틱 활성을 과소 평가하였는지 여부를 확인하였다. xCELLigence 분석 시스템은 단백질에 의존하지 않고, 대신 전기 임피던스를 사용하여 실시간으로 세포 증식을 지속적으로 측정한다.

도 9a 및 9b는 아지트로마이신에 대한 xCELLigence 분석의 대표적인 데이터를 보여준다. 도 9a의 대표적인 세포 추적은 노화 세포(BrdU 처리/MRC-5 섬유아세포)가 효과적으로 사멸되었음을 보여준다. 308.44 시간 표시에서, 위에서 아래로, 곡선은 BrdU 단독, 아지트로마이신 단독, 대조군, 및 BrdU를 아지트로마이신과 함께 처리한 세포를 나타낸다. 대조군에 대한 정규화된 세포 지수는 처리 직후 눈에 띄게 높았으며, 약 235 시간까지 BrdU 단독 곡선과 일치했다. 도 9b는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 최종 세포 지수를 나타내는 막대 그래프를 보여준다. 이를 통해 알 수 있듯이, 아지트로마이신은 약 97% 노화 MRC-5 세포를 표적화하였다. 이와 반대로, 정상 대조군 MRC-5 세포는 아지트로마이신에 의해 일시적으로만 영향을 받았으며, 세포 증식을 통해 빠르게 회복되었다. 아지트로마이신을 처리한 세포주에서 나타난 회복은 비히클 단독 대조군의 세포 수준을 30% 이상 초과했다. 상기 데이터는 아지트로마이신은 노화 세포를 우선적으로 표적으로 하여 노화 세포를 거의 25 배 감소시키는 효율성을 통해 노화세포의 약 97%를 제거하는 것을 확인하였다. 도 9a 및 9b에서 ****는 p<0.001을 나타낸다. 따라서 실시간 xCELLigence 분석 시스템은 고정된 SRB 분석을 보완하고, 약물 스크리닝 동안 화합물의 잠재적인 세놀리틱 효과를 보다 직접적으로 시각화하는 것을 제공한다.

상기 xCELLigence 분석은 또한 록시스로마이신 및 텔리스로마이신에 대한 세놀리틱 활성을 확인하는 데 사용되었다. 도 10a는 각각 대조군, 록시스로마이신을 처리한 대조군, BrdU 처리 대조군, 및 BrdU 처리한 섬유아세포에 90 μM의 록시스로마이신 처리군에 대한 평균 ± 평균의 표준 오차로서 최종 세포 지수를 보여준다. MRC-5 섬유아세포는 상기 분석에 사용되었다. 대조군에 비해, 록시스로마이신 처리는 정상 섬유아세포의 생존력에 약간의 영향을 미쳤지만, 노화를 유도하기 위해 BrdU로 처리된 섬유아세포의 82%를 표적화하였다. BrdU로 8 일 동안 전처리하여 노화를 유도한 노화 MRC-5 세포는 BrdU를 세척하고, 또 다른 5 일 동안 록시스로마이신에 노출시켰다. 상기 실험은 매우 유사한 결과를 나타내었고, 독립적으로 최소 3 회 반복되었다. 도 10a에서 *는 p<0.01을 나타냄에 유의한다. 록시스로마이신에 대한 xCELLigence 분석의 대표적인 데이터는 도 10b에 나타낸다. 249 시간에서 위에서 아래로, 선은 대조군, BrdU 단독, 록시스로마이신 대조군(90 μM), 및 BrdU과 록시스로마이신 처리군을 나타낸다. 록시스로마이신은 노화 섬유아세포의 세포 지수를 지속적으로 감소시키는 것을 알 수 있다. 상기 데이터를 통해 록시스로마이신이 강한 세놀리틱 활성을 가지고 있음을 확인하였다.

동일한 접근법을 사용하여 텔리스로마이신에 대한 세놀리틱 활성을 확인하였다. 도 11a는 평균 ± 평균의 표준 오차로서 최종 세포 지수를 나타내고, 도 11b는 대표적인 xCELLigence 데이터를 보여준다. 텔리스로마이신은 90 μM 농도로 처리하였다. 도 11a는 텔리스로마이신이 노화 세포를 100% 표적하고, 정상 MRC-5 세포에 거의 영향을 미치지 않음을 보여준다. 도 11b는 243.5 시간에서 위에서 아래로, 대조군, 텔리스로마이신 처리 대조군, BrdU 처리 대조군, 및 BrdU 및 텔리스로마이신 처리군을 나타낸다. 상기 데이터는 텔리스로마이신이 강한 세놀리틱 활성을 가지고 있음을 나타낸다.

따라서 본 발명의 접근법은 인간 섬유아세포의 노화 표현형을 표적으로 하는 화합물을 체계적으로 식별하기 위한 세놀리틱 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 데이터 및 도면에 개시된 바와 같이, 본 발명의 접근법은 임상적으로 승인된 약물을 스크리닝하는 데 사용될 수 있으며, 사용 범위가 제한되지 않고 다른 화합물을 스크리닝하기 위해서도 사용될 수 있음이 인식되어야 한다. 상기 결과는, 두 개의 잘 확립된 비-불멸화 인간 섬유아세포 세포주인 MRC-5 및/또는 BJ 세포를 사용하여 확인하였다. 노화 유도가 확인된다면, 다른 인간 세포도 사용될 수 있음이 인식되어야 한다. 세포주기 정지 및 노화를 유도하기 위해, 섬유아세포를 8 일 동안 100 μM 농도의 BrdU(DNA 손상제)에 노출시켰다. 본 발명의 접근법에서 벗어나지 않는다면 다른 DNA 손상제도 사용될 수 있음이 인식되어야 한다. 상기 농도와 노출 기간은 다양할 수 있지만, 노화 유도는 확인해야 하는 것이 인식되어야 한다. BrdU 처리 및 세척 후, 섬유아세포는 시험 약물 또는 화합물에 노출시켰다. 상기 결과에서, 시험 화합물 노출은 5 일 동안 하였다. 그러나, 시험 화합물의 처리 시간과 농도는 달라질 수 있다. 약물 처리 후, 고속 대량분석(high-throughput analysis)이 가능한 플레이트 판독기를 이용하여 SRB 분석 시스템을 통해 세포 부착을 평가할 수 있다. 또한, 상기 개시한 xCELLigence 분석이 사용될 수 있다.

본 발명의 접근법의 스크리닝 방법을 이용하여, 본 발명자들은 3 개의 임상적으로 승인된 마클로라이드 항생물질인 아지트로마이신, 록시스로마이신 및 텔리스로마이신이 노화 세포에 대해 매우 선택적인 세놀리틱 활성이 있음을 확인하였다. 이와 반대로, 상기 화학 구조와 유사한 것으로 간주되는 모 화합물인 에리트로마이신은 노화 섬유아세포에 대한 독성을 나타내지 않았다. 아지트로마이신의 화학적 효과에 대한 대사 분석은 아지트로마이신이 자가 포식과 해당 과정 모두의 시작을 유도하는 것을 나타낸다. 또한, 아지트로마이신은 고용량(100 μM)에서 미토콘드리아 활성을 증가시켰지만, 저용량(50 μM)에서는 반대 효과를 나타내어 명확한 이상성 효과를 보여준다. 이러한 대사 효과는 아지트로마이신의 매우 특이적인 세놀리틱 활성을 뒷받침할 수 있다.

요약하면, 본 발명의 접근법은 세놀리틱 활성을 갖는, 기존의 임상적으로 승인된 항생제 및 다른 약물과 같은 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 접근법은, 예를 들어 노화 섬유아세포를 표적으로 하는 데 사용할 수 있는 항-노화 약물로 약물의 용도를 변경하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 접근법은 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신의 선택적 세놀리틱 활성을 입증하는 데 사용되었다. 상기 개시한 일반 화학식을 사용하여 형성될 수 있는 화합물들의 화학적 유사체도 또한 세놀리틱 활성을 갖는다. 특히, 막-표적화 신호 및/또는 미토콘드리아-표적화 신호의 추가를 포함하는 유도체는 보다 유의적인 세놀리틱 효과를 갖는다.

따라서, 본 발명의 접근법은 세놀리틱 활성을 갖는 화합물을 스크리닝하는 방법의 형태를 취할 수 있다. 세포 집단에 노화를 생성하거나 유도하기 위해 세포 집단은 브로모디옥시우리딘(BrdU)에 노출될 수 있다. 상기 노출은 상기 개시한 일부 실시양태에서, 약 8 일 동안 100 μM의 BrdU 농도일 수 있지만, 본 기술분야의 통상의 기술자는 세포 집단의 노출시간 및 BrdU 농도를 적절하게 결정할 수 있다. 처리된 세포 집단을 생성하기 위해 노화 세포 집단은 후보 화합물로 처리될 수 있다. 처리 기간은 일부 실시양태에서, 약 3-5 일이지만, 처리 기간을 다르게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 노화 세포 집단 일부에 처리될 수 있으며, 비처리 대조군 부분과 원하는 부분이 상이한 처리 기간 동안, 및/또는 상이한 화합물 농도로, 상이한 처리 화합물로 처리될 수 있다. BrdU는 치료제 처리 전에 세척될 수 있다. 처리 화합물, 농도 및 처리 기간이 다양할 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 처리 후, 세포 집단은 세놀리틱 활성 지표 또는 마커에 대해 분석될 수 있다. 예를 들어, 세포 집단은 본 발명에 개시되거나 및/또는 본 기술분야에 공지된 분석법을 이용하여 세포 생존력, 호기성 해당 작용, 자가 포식, 억제 활성, 자가포식성 LC3 단백질의 정량적 측정, 및 세포 증식 감소에 대해 분석될 수 있다. 추가적인 예로, 설포로다민 B 분석 및 세포-유도 전기 임피던스 측정 중 하나 또는 둘 모두를 세놀리틱 활성을 분석하는 데 사용할 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 처리 화합물의 세놀리틱 활성을 평가하기 위해 본 발명에 개시한 분석과 상이한 분석을 사용할 수 있다는 점도 인식되어야 한다.

본 발명의 접근법은 또한 적어도 하나의 세놀리틱 제제의 치료학적 양을 갖는 세놀리틱 조성물의 형태를 취할 수 있다. 세놀리틱 제제는 아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체일 수 있다. 상기 치료학적 양은 본 발명 및 본 기술분야에 공지되고 이용 가능한 방법을 사용하여 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다는 점이 인식되어야 한다. 일부 실시양태에서, 세놀리틱 제제는 (i) 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택된 막-표적화 신호; 또는 (ii) 트리-페닐-포스포늄(TPP), TPP-유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체, 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지로부터 선택된 미토콘드리아-표적화 신호 중 어느 하나일 수 있는, 적어도 하나의 표적화 신호로 치환될 수 있다. 상기 표적화 신호 치환은 세놀리틱 제제의 미토콘드리아 흡수를 증가시켜 세놀리틱 활성을 향상시킨다. 예를 들어, 상기 화합물 IV-VI 중 어느 하나에 개시된 R-기는 표적화 신호를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 신호는 세놀리틱 화합물의 치환 위치 중 하나에 부착된 TPP-유도체일 수 있다. TPP-유도체는 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-자일릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. TPP-유도체로의 치환은 공유 결합이 필요로 할 수 있다는 점이 인식되어야 한다.

일부 실시양태에서, 세놀리틱 제제는 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 및 티게사이클린을 포함하는 테트라사이클린 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 미토콘드리아 생성 억제제는 산화 대사를 억제하고, 세놀리틱 활성을 더욱 증폭하는 데 사용할 수 있다. 데이터 및 추가적인 실시예는 2018 년 4 월 20 일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2018/028587에 개시되어 있으며, 전체가 참조로 본 발명에 통합된다. 일부 실시양태에서, 세놀리틱 제제는 해당 작용(glycolysis) 억제제, 예를 들어 피르비늄, 아토바쿠온, 베다퀼린, 이리노테칸, 소라페닙, 니클로사마이드, 스티리펜톨, 클로로퀸, 및 라파마이신을 포함할 수 있다. 상기 개시된 바와 같이, 세놀리틱 제제로 처리된 노화 세포는 해당 표현형(glycolytic phenotype)으로 전환된다. 해당 작용 억제제의 도입은 이러한 세포의 기능적 대사 경로를 박탈하여 노화 세포 집단에서 세포 사멸 유도를 향상시킨다.

본 발명의 접근법 하에서, 다수의 미토콘드리아 생성 억제제가 세놀리틱 제제와 연관하여 사용될 수 있다. 미토콘드리아 억제제의 추가예는 다음을 포함한다: 미토리보신, 산화 대사 억제제 및 해당 대사 억제제, 레푸르포신(repurposcins), 안티미토신(antimitoscins), 미토케토신, 미토플라보신, 미토플라빈(mitoflavin), TPP-유도체, MDIVI-1 유도체, 클로람페니콜(chloramphenicol), 퓨로마이신(puromycin) 및 기타 단백질 합성 억제제(예를 들어, 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 및 라파마이신 유사체를 포함), 항-기생충 약물(예를 들어, 피르비늄 파모에이트(pyrvinium pamoate) 및 니클로사마이드), 클로로퀸, 스티리펜톨, 카페인산 페닐 에스테르(CAPE), 비타민 C, 2-디옥시-글루코스(2-DG), MCT1 억제제(AZD3965 및 AR-C155858), D-글루코사민, 케르세틴 및 카베딜롤(carvedilol). 하기 단락은 특정 범주의 미토콘드리아 생성 억제제 치료제를 설명한다. 간결함을 위해, 관련된 현재 진행중인 출원 발명은 본 발명에 완전히 설명된 것처럼 참조로 통합된다.

미토콘드리아 생성 억제제의 첫 번째 범주는 미토리보신으로, 2018 년 3 월 14 일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2018/022403에 개시되어 있고, 그 전체가 참조로 본 발명에 통합된다. 상기 본 발명에 통합되는 참고 문헌은 선택된 미토리보신 화합물에 대한 데이터를 포함한다. 일반적으로 미토리보신은 항암 및 종종 항미생물 활성, 화학 요법 민감성, 방사선 민감성, 및 광과민성 효과뿐만 아니라 노화 방지 효과가 있는 미토콘드리아 억제제 화합물이다. 이러한 화합물은 미토콘드리아 리보솜의 큰 하위 단위 또는 작은 하위 단위(또는 일부, 둘 다)에 결합하여 미토콘드리아 생성을 억제한다. 일반적인 화학 구조 및 특정 화합물과 함께 미토리보신 그룹의 예는 통합된 상기 출원에 설명되어 있으며, 미토리보사이클린(mitoribocyclines), 미토리보마이신(mitoribomycins), 미토리보스포린(mitoribosporins), 및 미토리보플록신(mitoribofloxins)을 포함한다. 예시적인 미토리보신은 하기 화합물 VIII-XVII로 나타낸다.

미토케토신은 세놀리틱 활성을 향상시키는 데 사용할 수 있는 또 다른 범주의 미토콘드리아 생성 억제제이다. 이들은 ACAT1/2 및 OXCT1/2 중 적어도 하나에 결합하고 미토콘드리아 ATP 생성을 억제하는 비-발암성 화합물이다. 상기 화합물은 2018 년 6 월 25 일에 출원된 국제출원 PCT/US2018/039354에 상세하게 설명되어 있으며, 그 전체가 참조로 본 발명에 통합된다. 일반적으로 미토케토신은 케톤 재이용을 담당하고 항암 및 항생제 특성을 가진 미토콘드리아 효소를 표적으로 한다. 이러한 화합물은 OXCT1/2 및 ACAT1/2의 활성 촉매 부위 중 하나 또는 둘 모두에 결합하여 미토콘드리아 기능을 억제한다.

레푸르포신 및 안티미토신는 본 발명의 접근법과 관련하여 사용될 수 있는 미토콘드리아 생성 억제제의 세 번째 범주이다. 2018 년 11 월 29 일에 출원되고 그 전체가 본 발명에 참조로 통합된 국제 특허 출원 PCT/US2018/062956은 레푸르포신을 보다 상세히 설명한다. 일반적으로, "레푸르포신"은 미토콘드리아를 표적으로 하도록 화학적으로 변형된 내재적 항-미토콘드리아 특성을 갖는 화합물이다. 레푸르포신의 범주 내에 있는 안티미토신은 2018 년 5 월 18 일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/033466에 보다 구체적으로 설명되어 있으며, 그 전체가 본 발명에 참조로 통합된다. 내재적 항-미토콘드리아 특성을 가진 기존 항생제는 미토콘드리아를 표적하고, 미토콘드리아 생성을 억제하도록 화학적으로 변형될 수 있다. 본 발명의 용어 "안티미토신"은 항미토콘드리아를 표적화하도록 화학적으로 변형된 내재적으로 항-미토콘드리아 특성을 갖는 항생제를 광범위하게 지칭한다. 이전에는, 항생제의 내재적 항-미토콘드리아 활성은 원하지 않는 부작용으로 간주하였다. 실제로, 일부 잠재적 항생제는 과도한 항-미토콘드리아 특성으로 인해 시험에서 제외되었으며, 연구자들은 항-미토콘드리아 활성을 잠재적인 결함으로 간주하였다. 그러나, 본 발명의 접근법에서는 항생제의 내재적 항-미토콘드리아 활성이 완전히 새로운 치료제의 기초가 될 수 있다. 안티미토신은 미토콘드리아 표적 신호(예를 들어, 화학적 모이어티)로 화학적으로 변형된 내재적 항-미토콘드리아 특성을 갖는 항생제일 수 있다. 화학적 변형은, 예를 들어 공유 또는 비공유 결합을 통해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항생제는 테트라사이클린계, 에리트로마이신계, 클로람페니콜, 피르비늄 파모에이트, 아토바쿠온, 및 베다퀼린의 멤버 중 하나이다. 미토콘드리아-표적화 신호는 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-리보솜 표적화 신호를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물 또는 모이어티일 수 있다. 막-표적화 신호의 예에는 단쇄(예를 들어, 사슬이 6 개 미만의 탄소 원자) 지방산 및 중쇄(예를 들어 사슬이 6 ~ 12 개 탄소 원자) 지방산, 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 및 올레산을 포함한다. 미토콘드리아-리보솜 표적화 신호의 예에는 트리-페닐-포스포늄(TPP), 및 구이니다늄계 모이어티가 포함된다. TPP와 구아니디늄은 살아있는 세포에서 미토콘드리아 표적 신호(MTS)로서 기능적으로 작동하는 무독성 화학 모이어티이다. 탄소 스페이서-암 또는 연결 사슬, 둘 중 하나를 사용하여 항생제에 결합될 수 있다.

미토플라보신 및 미토플라빈은 본 발명의 접근법하에서 사용될 수 있는 미토콘드리아 생성 억제제의 네 번째 범주이다. 이들 화합물은 2018 년 10 월 23 일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/057093에 보다 상세히 설명되어 있으며, 그 전체가 본 발명에 참고로 통합된다. 미토플라보신은 플라빈-함유 효소에 결합하여 미토콘드리아 ATP 생성을 억제하는 화합물이다. 디페닐렌요오도늄 클로라이드(Diphenyleneiodonium chloride; DPI)는 미토플라보신의 하나의 예이다. 미토플라보신은 안티미토신과 관련하여 상기 개시한 바와 같이 미토콘드리아-표적화 신호로 변형될 수 있음이 인식되어야 한다. 미토콘드리아 기능을 억제하는 리보플라빈의 유도체인 미토플라빈은 미토콘드리아-표적화 신호로 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 로제오플라빈(roseoflavin)[8-디메틸-8-(디메틸아미노)-리보플라빈 또는 8-디메틸아미노리보플라빈]은 리보플라빈의 유도체인 자연 발생적 항균 화합물이고, 이는 CSC 표적화 및 미토콘드리아 생성 억제의 잠재력을 최적화하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 루미크롬(Lumichrome)(7,8-디메틸알록사진)은 리보플라빈 분해의 형광 광생성물이고, 이 또한 CSC를 표적화하는 잠재력을 최적화하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 리보플라빈의 다른 통상의 유도체는: 알록사진(Alloxazine), 루미플라빈(Lumiflavine), 1,5-디하이드로리보플라빈(1,5-dihydroriboflavin) 및 1,5-디하이드로플라빈(1,5-dihydroflavin)을 포함한다. 이러한 리보플라빈의 유도체는 미토콘드리아-표적화 신호로 화학적으로 변형되어 미토플라빈을 형성할 수 있으며, 본 발명의 접근법에 따라 미토콘드리아 생성 억제제로 사용될 수 있다.

미토콘드리아 생성 억제제의 여섯 번째 범주는 암세포 흡수의 강한 선호도(대량 암세포, 암 줄기 세포 및 에너지성 암 줄기 세포)를 보여줄 뿐 아니라, 상기 세포에서 미토콘드리아 생성을 방해하는 TPP-유도체 화합물이다. 이러한 TPP-유도체 화합물은 2018 년 11 월 21 일에 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/062174에 보다 상세히 설명되어 있으며 그 전체가 본 발명에 참조로 통합된다. TPP-유도체와 관련하여 사용되는, 본 기술분야에 공지된 유도체는 원자를 다른 원자 또는 원자 그룹으로 대체함으로써 모 화합물로부터 합성될 수 있는 화합물이다. 예를 들어, TPP의 유도체는 2-부텐-1,4-비스-TPP이며, 부텐에 의해 연결된 두 개의 포스포늄 기를 포함한다. 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체는 하나 이상의 페닐기를 할로겐 또는 유기 화합물과 같은 다른 화합물로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 간결함을 위해, 상기 개시를 통해 본 기술분야의 통상의 기술자가 충분히 알 수 있기 때문에, 본 명세서는 잠재적인 모든 유도체는 개시하지는 않는다. 본 발명의 접근법에 따라 미토콘드리아 생성 억제제로 사용될 수 있는 TPP-유도체 화합물의 다른 예로는 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체를 포함한다. 당연히, 상기 개시한 목록이 TPP-유도체 리스트의 완전한 리스트가 아닌 점이 인식되어야 한다.

본 발명의 접근법에서 사용될 수 있는 미토콘드리아 생성 억제제의 또 다른 범주는 2018 년 12 월 18 일에 출원되고 그 전체가 본 발명에 참고로 통합된, 국제 특허 출원 PCT/US2018/066247에 개시된 MDIVI-1 유도체이다. 미토콘드리아 분열 억제제-1(Mitochondrial division inhibitor-1; mDIVI-1)은 DRP1을 선택적이고 가역적으로 억제하는 작은 분자이다. MDIVI-1은 GTP 가수분해를 촉매하는 능력과 DRP1이 미토콘드리아 주변의 고리 모양 구조로 DRP1 자가-조립을 억제 및 결합함으로써 DRP1을 표적으로 함이 알려져 있다. 본 발명의 접근법은 하기 나타낸 일반식 XVIII을 갖는 미토콘드리아 분열 억제제 1(mDIVI-1) 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태를 취할 수 있다:

상기 R1 내지 R8은 각각 수소, 탄소, 질소, 황, 산소, 플루오린, 염소, 브로민, 아이오딘, 카복실, 알케인, 사이클릭 알케인, 알케인계 유도체, 알켄, 사이클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알카인, 알카인계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데하이드, 알데하이드계 유도체, 카복실산, 카복실산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르 및 에스테르계 유도체, 아민, 아민계 유도체, 아마이드, 아마이드계 유도체, 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 벤조산계 유도체, 및 미토콘드리아-표적화 신호로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 R-기는 상기 개시한 바와 같이 표적화 신호이다.

세놀리틱 제제의 활성을 향상시키기 위해 본 발명의 접근법 하에서 사용될 수 있는 다른 미토콘드리아 생성 억제제의 예로는 비타민 C, 베르베린, 카페인산 페닐 에스테르, 실리비닌, 브루티에리딘, 및 멜리티딘을 포함한다.

세놀리틱 조성물은 광범위한 유익한 용도를 가질 수 있음이 인식되어야 한다. 예를 들어, 세놀리틱 조성물은 노화 세포의 사멸 유도 및/또는 노화 세포의 증식 억제를 통한 노화 세포의 치료를 구성하는 노화 치료제로 사용될 수 있다. 세놀리틱 조성물은 죽상동맥경화증, 관절염, 암, 심혈관 질환, 백내장, 치매, 당뇨병, 탈모, 고혈압, 염증성 질환, 신장 질환, 근위축, 골관절염, 골다공증, 폐질환, 척추 디스크 변성, 및 탈모증과 같은 연령-관련 질환의 개시 및/또는 진행을 지연시키는 데 사용될 수 있다. 경도 인지 장애, 운동 신경 기능 장애, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 및 황반 변성과 같은 신경질환도, 세놀리틱 조성물의 사용을 통해 지연 또는 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세놀리틱 조성물은 연령-관련 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

세놀리틱 제제는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 세놀리틱 제제는 화장품, 알약, 로션, 샴푸, 크림, 비누, 피부 세정제, 면도제, 애프터 쉐이브, 젤, 스틱, 페이스트, 스프레이, 에어로졸, 분말, 액체, 수성 현탁액, 수용액, 폼, 경피 패치, 팅크, 및 증기 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 탈모 치료용 세놀리틱 조성물은 모발, 두피 및/또는 피부를 위한 국소 적용의 형태를 취할 수 있다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 명세서에서 반복될 필요 없이, 본 기술분야에 공지되고 이용 가능한 방법을 사용하여 세놀리틱 제제의 형태를 선택할 수 있음이 인식되어야 한다.

상기 개시된 바와 같이, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 및 텔리스로마이신의 유도체는 본 발명의 접근법에서 벗어나지 않는 한, 세놀리틱으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 유도체는 하나 이상의 치환된 표적화 신호를 포함할 수 있다. 막-표적화 신호 또는 미토콘드리아-표적화 신호를 아지트로마이신, 록시스로마이신 또는 텔리스로마이신에 추가하면, 생성된 접합체의 미토콘드리아 흡수가 크게 증가하고 결과적으로 세놀리틱 활성이 향상된다. 예를 들어, 하기 개시된 화합물 XIX-XXI는 하나 이상의 기능적 R-기가 표적화 신호인 유도체를 나타낸다.

첫째로, 화합물 XIX는 일부 실시양태에 따른 아지트로마이신 유도체에 대한 일반식을 나타내며, 작용기 R1 또는 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, 하나 또는 둘 모두가 표적화 신호이다. 예를 들어, R1 및/또는 R2는 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택된 막-표적화 신호일 수 있다. (당연히, 접합체는 팔미테이트 염과 같은 결합을 위해 말단 수소가 제거되는 모이어티를 포함할 수 있다). R1 및/또는 R2는 트리-페닐-포스포늄(TPP), TPP-유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체, 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지로부터 선택된 미토콘드리아-표적화 신호일 수 있다. TPP-유도체의 비-포괄적인 예로, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-자일릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, R1 및 R2 중 하나만이 모 화합물에서 벗어나므로, 따라서 상기 유도체는 유사체이다. 예를 들어, R1은 메틸이고 R2는 표적화 신호일 수 있다. 다른 예로서, R1은 표적화 신호이고 NH-R2는 -N(CH₃)₂ 일 수 있다. 일부 실시양태에서, R1 또는 R2는 표적화 신호일 수 있고, R1 및 R2 중 다른 것은 수소, 카복실, 알케인, 사이클릭 알케인, 알케인계 유도체, 알켄, 사이클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알카인, 알카인계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데하이드, 알데하이드계 유도체, 카복실산, 카복실산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르 및 에스테르계 유도체, 아민, 아민계 유도체, 아마이드, 아마이드계 유도체, 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 및 벤조산계 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

화합물 XX는 일부 실시양태에 따른 록시스로마이신 유도체에 대한 일반식을 나타내며, 작용기 R1 또는 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, 하나 또는 둘 모두가 표적화 신호일 수 있다. 예를 들어, R1 및/또는 R2는 상기 개시된 바와 같이 막-표적화 신호 또는 미토콘드리아-표적화 신호일 수 있다. 일부 실시양태에서, R1 및 R2 중 하나만이 모 화합물에서 벗어나므로, 상기 유도체는 유사체이다. 예를 들어, R1은 록시스로마이신에 존재하는 O-CH₂-O-(CH₂)₂-OCH₃와 같은 메톡시일 수 있고, R2는 표적화 신호일 수 있다. 다른 실시양태로서, R1은 표적화 신호일 수 있고 NH-R2는 N(CH₃)₂ 일 수 있다. 일부 실시양태에서, R1 또는 R2는 표적화 신호일 수 있고, R1 및 R2 중 다른 것은 수소, 카복실, 알케인, 사이클릭 알케인, 알케인계 유도체, 알켄, 사이클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알카인, 알카인계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데하이드, 알데하이드계 유도체, 카복실산, 카복실산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르 및 에스테르계 유도체, 아민, 아민계 유도체, 아마이드, 아마이드계 유도체, 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 및 벤조산계 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

화합물 XXI는 텔리스로마이신 유도체에 대한 일반식을 나타내고, 작용기 R1 또는 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 하나 또는 둘 모두가 표적화 신호일 수 있다. 예를 들어, R1 및/또는 R2는 상기 개시된 바와 같이 막-표적화 신호 또는 미토콘드리아-표적화 신호일 수 있다. 일부 실시양태에서, R1 및 R2 중 하나만이 모 화합물에서 벗어나므로, 상기 유도체는 유사체이다. 예를 들어, R1은 텔리스로마이신 카르밤산염(carbamate) 고리에 존재하는

와 같은 알킬-아릴 기일 수 있고, R2는 표적화 신호일 수 있다. 다른 예로서, R1은 표적화 신호일 수 있고 -NH-R2는 -N(CH₃)₂ 일 수 있다. 일부 실시양태에서, R1 또는 R2는 표적화 신호일 수 있고, R1 및 R2 중 다른 것은 수소, 카복실, 알케인, 사이클릭 알케인, 알케인계 유도체, 알켄, 사이클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알카인, 알카인계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데하이드, 알데하이드계 유도체, 카복실산, 카복실산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르 및 에스테르계 유도체, 아민, 아민계 유도체, 아마이드, 아마이드계 유도체, 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 및 벤조산계 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

하기의 예로 나타낸, 화합물 XXII는 R1이 메틸이고 R2가 지방산 막-표적화 신호인 아지트로마이신 유도체를 나타낸다. 본 예에서, R2는 막-표적화 신호 미리스트산의 지방산 모이어티이다. 화합물 XXII는 예를 들어, 본 기술분야에 공지된 지질화 기술인 미리스토일화(myristoylation)를 통해 형성될 수 있음이 인식되어야 한다. 세놀리틱 화합물의 상기 예는 아지트로마이신에 비해 미토콘드리아 흡수를 증가시켰고 결과적으로 세놀리틱 활성이 증가되었다. 화합물 XXII는 세놀리틱 활성을 갖는 본 발명의 접근법 하의 아지트로마이신 유도체의 한 예이다. 세놀리틱 활성을 갖는 수많은 다른 유도체가 본 발명의 접근법 하에서 만들어질 수 있음이 인식되어야 한다.

다음 단락은 본 발명에 개시된 실험 및 데이터와 관련하여 사용되는 재료 및 방법을 나타낸다. 이러한 재료 및 방법은 예시적이며, 본 기술분야의 통상의 기술자는 본 발명의 접근법에서 벗어나지 않은 한, 다른 방법을 사용할 수 있음이 인식되어야 한다. MRC-5(ATCC®CCL-171) 인간 폐 섬유아세포 세포 및 BJ(ATCC®CRL2522) 인간 피부 섬유아세포는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다. Gibco-브랜드 세포 배양 배지(MEM)는 Life Technologies에서 구입하였다. 브로모디옥시우리딘, 아지트로마이신, 록시스로마이신 및 에리트로마이신은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 아지트로마이신(Pfizer)은 FDA 승인을 받았다. 록시스로마이신(GSK 및 Sandoz)은 미국에서는 사용할 수 없지만, 뉴질랜드, 호주 및 이스라엘에서는 임상적으로 승인되었다.

MRC-5 또는 BJ 세포를 24 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음 날, 플레이트의 절반을 100 μM의 BrdU로 처리하고, 대조군 웰은 비히클 단독(DMSO)으로 처리하고 5% CO₂ 가습 조건에서 37℃에서 8 일 동안 배양하였다. BrdU 처리 8 일 후, 세포를 또 다른 3 ~ 5 일 동안 다양한 테스트 화합물 또는 약물(예를들어, 아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 에리트로마이신 등)으로 처리하였다. BrdU는 약물 처리 전에 세척하였다.

설포로다민 B 분석: 플레이트를 배양한 후, 설포로다민 B 분석(SRB)으로 세포 생존력을 측정하였다. 상기 분석은 세포 단백질 함량의 측정을 통해 수행하였다. 세포를 10% 트리클로로아세트산(Trichloroacetic acid; TCA)으로 1 시간 동안 4℃에서 고정하고 밤새 실온에서 건조시켰다. 그 다음, 플레이트를 SRB와 함께 30 분 동안 배양하고, 1% 아세트산으로 2 회 세척하고 적어도 1 시간 동안 공기에서 건조시켰다. 마지막으로, 단백질 결합 염료를 10 mM Tris, pH 8.8, 용액에 용해시키고, 540 nm에서 플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.

자가포식 및 세포주기 분석: 자가포식(Muse™ 자가포식 LC3-항체 기반 키트, Merck Millipore 사용) 및 세포주기 (Muse® 세포 주기 키트, Merck Millipore) 실험은 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.

베타-갈(Beta-Gal) 염색: BrdU-처리된 MRC-5 세포의 베타-갈락토시다아제 염색은 노화 베타-갈락토시다아제 염색 키트(#9860, Cell Signaling Technology Inc.)에 의해 수행되었으며, 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.

시호스 XFe96 대사 흐름 분석: MCF7 세포에 대한 세포외 산성화 속도(ECAR) 및 실시간 산소 소비 속도(OCR)는 시호스 세포 외 흐름(XF96) 분석기(Seahorse Bioscience, MA, USA)를 사용하여 확인하였다. MRC-5 세포는 10% FBS(fetal bovine serum; 소태아혈청), 2 mM 글루타막스(GlutaMAX) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)이 보충된 MEM에서 유지시켰다. 웰당 40,000 개의 세포를 XF96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하고, 5% CO₂ 가습 대기에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 72 시간 동안 아지트로마이신으로 처리하였다. 실험 전에 플레이트를 예열된 XF 분석 배지로 세척하였다(OCR 측정을 위해 XF 분석 배지에 10mM 포도당, 1 mM 피루베이트를 보충하고 pH 7.4로 조정하였다). 그런 다음, 세포를 비-CO₂ 인큐베이터에서 1 시간 동안 37℃에서 175 ㎕/웰의 XF 분석 배지에 유지시켰다. 배양하는 동안, XF 분석 배지 내에 80 mM 포도당 25 ㎕, 9 μM 올리고마이신(Oligomycin), 1M 2-디옥시글루코스(deoxyglucose)(ECAR 측정 용) 및 10 μM 올리고마이신 25 ㎕, 9 μM FCCP, 10 μM 로테논(Rotenone), 10 μM 안티마이신(Antimycin) A(OCR 측정 용)를 XFe-96 센서 카트리지의 주입 포트에 로딩하였다. 실험 동안에, 상기 기기는 해당 시점에서 웰 내로 상기 억제제를 주입하면서, ECAR/OCR을 연속해서 측정하였다. ECAR 및 OCR 측정은 단백질 함량 (Sulphorhodamine B 분석)에 의해 정규화되었다. 데이터 세트는 일원(one-way) ANOVA 및 스튜던트 t-테스트 계산을 이용하여 XFe-96 소프트웨어에 의해 분석하였다. 모든 실험은 적어도 3중으로 수행하였고, 결과를 본 명세서에 개시하였다.

xCELLigence 분석 시스템: xCELLigence RTCA 시스템(ACEA Biosciences Inc.). 간략하게, MRC-5 폐 섬유아세포(비히클 단독 및/또는 100 μM BrdU로 처리)를 각 웰에 접종하고 세포 유도 전기 임피던스 측정을 통해 RTCA(실시간 세포 분석)를 사용하여 아지트로마이신의 효능을 평가하였다. 본 접근법은 세포 반응의 시작 및 역학을 정량화할 수 있다. 실험은 각 조건에 대해 4 중 샘플을 사용하여 독립적으로 여러 번 반복하였다.

통계 분석: 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. 0.05 미만의 값은 유의성으로 간주하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다.

본 발명의 상세한 설명에서 개시된 용어는 특정 실시양태를 개시하기 위한 목적일 뿐이며, 본 발명을 제한하기 위한 의도는 아니다. 본 명세서에 개시된 단수 형태인 "한", "하나", 및 "상기"는, 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수 형태도 역시 포함하기 위한 의도이다. "포함하다" 및/또는 "포함하는"이라는 용어는 본 명세서에서 사용될 때 명시된 특징, 정수, 단계, 연산, 요소 및/또는 구성 요소의 존재를 지정하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 연산, 요소, 구성 요소, 및/또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

본 발명은 그 목적 또는 본질적인 특성에서 벗어나지 않고 다른 특정 형태로 구체화될 수있다. 따라서, 본 발명의 실시예는 모든 측면에서 제한적이지 않고 예시적인 것으로 간주하여야 하며, 본 발명의 범위는 상기 개시한 설명보다는 출원의 청구 범위에 의해 표시되며, 청구범위의 동등성의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변경은 본 발명에 포함되도록 의도된다.

Claims

하기로부터 선택되는 화학식을 갖는 화합물의 약학적으로 유효량을 포함하는 세놀리틱 조성물:

상기에서, R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있고, 막-표적화 신호, 미토콘드리아-표적화 신호, 수소, 카복실, 알케인, 사이클릭 알케인, 알케인계 유도체, 알켄, 사이클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알카인, 알카인계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데하이드, 알데하이드계 유도체, 카복실산, 카복실산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르, 에스테르계 유도체, 아민, 아민계 유도체, 아마이드, 아마이드계 유도체, 모노사이클릭 아렌, 폴리사이클릭 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 및 벤조산계 유도체로부터 선택되고; 및
R1 및 R2 중 적어도 하나는 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이다.
청구항 1에 있어서,
R1 및 R2 중 적어도 하나는 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택되는 막-표적화 신호인 세놀리틱 조성물.
청구항 1에 있어서,
R1 및 R2 중 적어도 하나는 트리-페닐-포스포늄(TPP), TPP-유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체, 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지로부터 선택된 미토콘드리아-표적화 신호인 세놀리틱 조성물.
청구항 3에 있어서,
R1 및 R2 중 적어도 하나는 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-자일릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체로부터 선택되는 TPP-유도체인 세놀리틱 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식을 갖는 세놀리틱 조성물:

,
상기에서, R1은 메틸이고 R2는 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이거나, 또는 R1은 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이고 NH-R2는 N(CH₃)₂이다.
청구항 1에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식을 갖는 세놀리틱 조성물:

,
상기에서, R1은 O-CH₂-O-(CH₂)₂-OCH₃이고 R2는 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이거나, 또는 R1은 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이고 NH-R2는 N(CH₃)₂이다.
청구항 1에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식을 갖는 세놀리틱 조성물:

,
상기에서, R1은
이고 R2는 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이거나, 또는 R1은 막-표적화 신호 및 미토콘드리아-표적화 신호 중 하나이고 NH-R2는 N(CH₃)₂이다.
청구항 5 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
R1 및 R2 중 적어도 하나는 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택되는 막-표적화 신호이거나, 또는 R1 및 R2 중 적어도 하나는 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-자일릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체로부터 선택되는 미토콘드리아-표적화 신호인 세놀리틱 조성물.
아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체로부터 선택되는 적어도 하나의 세놀리틱 제제의 치료학적 양을 포함하는 세놀리틱 조성물.
청구항 9에 있어서,
상기 세놀리틱 제제는 (i) 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택되는 막-표적화 신호; 및 (ii) 트리-페닐-포스포늄(TPP), TPP-유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체, 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지로부터 선택되는 미토콘드리아-표적화 신호 중 적어도 하나를 포함하는 표적화 신호를 갖는, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 하나를 포함하는 세놀리틱 조성물.
청구항 10에 있어서,
상기 표적화 신호는 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-클로로벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP; 1-나프틸메틸-TPP; p-자일릴렌비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체로부터 선택되는 TPP-유도체인 세놀리틱 조성물.
청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 및 티게사이클린 중 적어도 하나의 치료학적 양을 추가적으로 포함하는 세놀리틱 조성물.
청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
피르비늄, 아토바쿠온, 베다퀼린, 이리노테칸, 소라페닙, 니클로사마이드, 스티리펜톨, 클로로퀸, 및 라파마이신 중 적어도 하나의 치료학적 양을 추가적으로 포함하는 세놀리틱 조성물.
청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
미토리보신, 미토케토신, 미토플라보신, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체 중 적어도 하나의 치료학적 양을 추가적으로 포함하는 세놀리틱 조성물.
청구항 9 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
비타민 C, 베르베린, 카페인산 페닐 에스테르, 실리비닌, 브루티에리딘, 및 멜리티딘 중 적어도 하나를 추가적으로 포함하는 세놀리틱 조성물.
청구항 9에 있어서,
상기 세놀리틱 조성물은 화장품, 알약, 로션, 샴푸, 크림, 비누, 피부 세정제, 면도제, 애프터 쉐이브, 젤, 스틱, 페이스트, 스프레이, 에어로졸, 분말, 액체, 수성 현탁액, 수용액, 폼, 경피 패치, 팅크, 및 증기 중 적어도 하나의 형태인 세놀리틱 조성물.
아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 적어도 하나를 포함하는 세놀리틱 제제의 치료학적 양을 포함하는 노화 치료용 조성물.
청구항 17에 있어서,
상기 세놀리틱 제제는 (i) 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택되는 막-표적화 신호; 및 (ii) 트리-페닐-포스포늄(TPP), TPP-유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체, 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지로부터 선택되는 미토콘드리아-표적화 신호 중 적어도 하나를 갖는, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 하나를 포함하는 조성물.
청구항 17 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 및 티게사이클린 중 적어도 하나의 치료학적 양을 추가적으로 포함하는 조성물.
청구항 17 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
피르비늄, 아토바쿠온, 베다퀼린, 이리노테칸, 소라페닙, 니클로사마이드, 스티리펜톨, 클로로퀸, 및 라파마이신 중 적어도 하나의 치료학적 양을 추가적으로 포함하는 조성물.
청구항 17 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
미토리보신, 미토케토신, 미토플라보신, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체 중 적어도 하나의 치료학적 양을 추가적으로 포함하는 조성물.
청구항 17 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
비타민 C, 베르베린, 카페인산 페닐 에스테르, 실리비닌, 브루티에리딘, 및 멜리티딘 중 적어도 하나를 추가적으로 포함하는 조성물.
아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 적어도 하나를 포함하는 세놀리틱 제제의 치료학적 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 노화 세포의 사멸을 유도하는 방법.
청구항 23에 있어서,
상기 세놀리틱 제제는 (i) 팔미트산, 스테아르산, 미리스트산, 올레산, 단쇄 지방산, 및 중쇄 지방산으로부터 선택되는 막-표적화 신호; 및 (ii) 트리-페닐-포스포늄(TPP), TPP-유도체, 구아니디늄, 구아니디늄 유도체, 및 10-N-노닐 아크리딘 오렌지로부터 선택되는 미토콘드리아-표적화 신호 중 적어도 하나, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 하나를 포함하는 방법.
청구항 23에 있어서,
테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 및 티게사이클린 중 적어도 하나의 치료학적 양을 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
청구항 23에 있어서,
피르비늄, 아토바쿠온, 베다퀼린, 이리노테칸, 소라페닙, 니클로사마이드, 스티리펜톨, 클로로퀸, 및 라파마이신 중 적어도 하나의 치료학적 양을 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
청구항 23에 있어서,
미토리보신, 미토케토신, 미토플라보신, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체 중 적어도 하나의 치료학적 양을 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
청구항 23에 있어서,
비타민 C, 베르베린, 카페인산 페닐 에스테르, 실리비닌, 브루티에리딘, 및 멜리티딘 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 적어도 하나를 포함하는 세놀리틱 제제의 치료학적 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 연령-관련 질환의 발병을 지연시키는 방법.
청구항 29에 있어서,
상기 연령-관련 질환은 죽상동맥경화증, 관절염, 암, 심혈관 질환, 백내장, 치매, 당뇨병, 탈모, 고혈압, 염증성 질환, 신장 질환, 근위축, 신경질환, 골관절염, 골다공증, 폐질환, 척추 디스크 변성, 및 탈모증 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
청구항 30에 있어서,
상기 신경질환은 경도 인지 장애, 운동 신경 기능 장애, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 및 황반 변성 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
청구항 29에 있어서,
상기 세놀리틱 조성물은 경구용 조성물, 국소용 조성물, 및 정맥 내 조성물 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
청구항 29 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세놀리틱 제제는 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 방법.
청구항 29 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 및 티게사이클린 중 적어도 하나의 치료학적 양을 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
청구항 29 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
피르비늄, 아토바쿠온, 베다퀼린, 이리노테칸, 소라페닙, 니클로사마이드, 스티리펜톨, 클로로퀸, 및 라파마이신 중 적어도 하나의 치료학적 양을 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
청구항 29 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 있어서,
미토리보신, 미토케토신, 미토플라보신, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; 및 p-자일릴렌비스-TPP의 유도체 중 적어도 하나의 치료학적 양을 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
청구항 29 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서,
비타민 C, 베르베린, 카페인산 페닐 에스테르, 실리비닌, 브루티에리딘, 및 멜리티딘 중 적어도 하나를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
아지트로마이신, 록시스로마이신, 텔리스로마이신, 아지트로마이신 유사체, 록시스로마이신 유사체, 및 텔리스로마이신 유사체 중 적어도 하나를 포함하는 세놀리틱 제제의 치료학적 양을 포함하는, 연령-관련 질환의 발병 지연용 조성물.
청구항 38에 있어서,
상기 연령-관련 질환은 죽상동맥경화증, 관절염, 암, 심혈관 질환, 백내장, 치매, 당뇨병, 탈모, 고혈압, 염증성 질환, 신장 질환, 근위축, 신경질환, 골관절염, 골다공증, 폐질환, 척추 디스크 변성, 및 탈모증 중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
청구항 38 및 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세놀리틱 제제는 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 옥시테트라사이클린, 데메클로사이클린, 메타사이클린, 독시사이클린, 미노사이클린, 티게사이클린, 피르비늄, 아토바쿠온, 베다퀼린, 이리노테칸, 소라페닙, 니클로사마이드, 스티리펜톨, 클로로퀸, 라파마이신, 미토리보신, 미토케토신, 미토플라보신, 2-부텐-1,4-비스-TPP; 2-부텐-1,4-비스-TPP의 유도체; 2-클로로벤질-TPP; 2-클로로벤질-TPP의 유도체; 3-메틸벤질-TPP; 3-메틸벤질-TPP의 유도체; 2,4-디클로로벤질-TPP; 2,4-디클로로벤질-TPP의 유도체; 1-나프틸메틸-TPP; 1-나프틸메틸-TPP의 유도체; p-자일릴렌비스-TPP; p-자일릴렌비스-TPP의 유도체; 비타민 C, 베르베린, 카페인산 페닐 에스테르, 실리비닌, 브루티에리딘, 및 멜리티딘 중 적어도 하나의 치료학적 양을 추가적으로 포함하는 조성물.
청구항 28에 있어서,
상기 세놀리틱 제제는 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 조성물.
첫 번째 기간 동안 DNA 손상제를 세포 집단에 노출시켜 노화 세포 집단을 생성하는 단계;
상기 노화 세포 집단의 적어도 일부를 두 번째 기간 동안 후보 화합물로 처리하여 처리된 세포 집단을 형성하는 단계;
상기 처리된 세포 집단에서 적어도 하나의 세놀리틱 활성 마커를 분석하는 단계;를 포함하는 세놀리틱 활성 화합물을 스크리닝하는 방법.
청구항 42에 있어서,
상기 DNA 손상제는 브로모디옥시우리딘(BrdU)을 포함하는 방법.
청구항 42에 있어서,
상기 적어도 하나의 세놀리틱 활성 마커는 세포 생존력, 호기성 해당 작용, 자가 포식, 억제 활성, 및 세포 증식 감소 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
청구항 42에 있어서,
상기 적어도 하나의 세놀리틱 활성 마커는 자가포식성 LC3 단백질의 정량적 측정을 포함하는 방법.
청구항 42에 있어서,
상기 첫 번째 기간은 약 8 일인 방법.
청구항 42에 있어서,
상기 두 번째 기간은 약 3 일 내지 약 5 일인 방법.
청구항 42에 있어서,
상기 BrdU는 상기 두 번째 기간 전에 노화 세포 집단에서 세척되는 것인 방법.
청구항 42에 있어서,
적어도 하나의 세놀리틱 활성 마커를 상기 노화 세포 집단의 적어도 일부에서 분석하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
청구항 42에 있어서,
상기 처리된 세포 집단에서 적어도 하나의 세놀리틱 활성 마커를 분석하는 단계는 설포로다민 B 분석 수행 및 세포-유도 전기 임피던스 측정 중 적어도 하나를 포함하는 방법.