KR20210072002A - 폴리머 기반 거대분자 프로드러그 - Google Patents

폴리머 기반 거대분자 프로드러그 Download PDF

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마이클 초르니
이반 알페리브
가렛 엠. 브로되르
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Abstract

캄프토테신 유사체가 생리적 조건 하에 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴리머에 공유 결합되는 거대분자 프로드러그가 제공된다. 또한, 거대분자 프로드러그로 암, 특히 신경모세포종을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

폴리머 기반 거대분자 프로드러그
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 9월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/732,199호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분야
캄프토테신 유사체(camptothecin analog)가 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴리머에 공유 결합된 거대분자 프로드러그(macromolecular prodrug)가 제공된다. 또한, 거대분자 프로드러그로 암, 특히 신경모세포종(neuroblastoma)을 치료하는 방법이 제공된다.
배경
신경모세포종(NB)은 모든 소아암의 8 내지 10%를 차지하고 소아암으로 인한 사망의 15%를 차지하는 소아기의 가장 흔하고 치명적인 고형 종양으로 남아 있다. 다른 소아 신생물의 치료율이 향상되었음에도 불구하고, NB 환자의 생존율은 뒤처져 있다.
현재 클리닉에서 사용되는 집중적 복합 요법은 환자의 절반 이상에서 실패하였으며(환자의 50 내지 60%는 근치적 구제 치료 옵션(curative salvage treatment options)없이 재발을 경험함), "초고" 위험 범주로 정의된, 무반응 환자 하위 그룹이 제시한 가장 어려운 치료 과제가 있다. 매우 다양한 병인 및 생물학적으로 불리한 변이체의 유병률을 갖는 고위험 NB는 현재 캄프토테신 계열의 토포이소머라 제 I 억제제(topoisomerase I inhibitor)인 토포테칸(topotecan) 및 이리노테칸(irinotecan)을 포함하는 1차 치료제로서 강력한 항암제가 접근하고 있다. 그러나, 공격적인 질병의 맥락에서 이들의 임상적 사용은 여전히 차선으로 남아 있으며, 용량 제한 부작용 및 후천적 약물 내성으로 인해 재발 또는 불응성 NB 환자에서 좋지 않은 결과를 낳는다. 중요하게는, 이러한 환자들의 치료 실패는 NB 세포 성장을 효과적으로 억제하는 데 필요한 임계 약물 수준을 1 내지 3 자릿수배 증가시키는 것과 연관되는 것으로 나타났으며, 이는 임상적으로 달성할 수 없는 값에 이른다.
따라서, 불응성 NB와 싸우기 위해, 전신 노출을 증가시키지 않으면서 종양내 전달을 현저하게 향상시키고 치료적으로 효과적인 약물 수준에서 약물 존재를 확장할 수 있는 대체 치료 접근법이 필요하다. 본원에서 기술되는 구체예는 이러한 요구를 해결한다.
개요
제1 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 적어도 두 개의 분자가 생리적 조건(예를 들어, 22℃, pH = 7.2) 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴록사머 폴리머(poloxamer polymer)에 공유 결합되는, 거대분자 프로드러그가 제공된다.
제2 구체예에서, SN22 유사체의 적어도 두 개의 분자가 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 PEG 폴리머에 공유 결합되는, 거대분자 프로드러그가 제공된다.
제3 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 적어도 두 개의 분자가 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴리머에 공유 결합되고, 적어도 하나의 캄프토테신 유사체는 적어도 하나의 NE 수송체(NET) 리간드로 기능화되는, 거대분자 프로드러그가 제공된다.
다른 구체예, 캄프토테신 유사체는 SN22(7-에틸-캄프토테신), SN38(7-에틸-10-하이드록시-캄프토테신) 또는 이들의 조합이다.
또 다른 구체예에서, 폴리머는 폴록사머 폴리머이다.
또 다른 구체예에서, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 폴리머이다.
또 다른 구체예에서, 폴리머는 멀티-암(multi-arm) PEG 폴리머이다.
또 다른 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 두 개의 분자는 폴리머에 공유 결합된다.
또 다른 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 4개의 분자는 폴리머에 공유 결합된다.
또 다른 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 2 내지 8개의 분자는 폴리머에 공유 결합된다.
또 다른 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드는 생리적 조건 하에 불안정한 에스테르 결합을 통해 캄프토테신 유사체에 공유 결합된다.
또 다른 구체예에서, 캄프토테신 유사체는 SN-38이다.
또 다른 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드는 벤질구아니딘(BG)이다.
또 다른 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드는 페네틸구아니딘 또는 티라민이다.
또 다른 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드와 캄프토테신 유사체 사이의 에스테르 결합은 옥시헥사노일 에스테르이다.
또 다른 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드와 캄프토테신 유사체 사이의 에스테르 결합은 옥시에톡시프로파노일 또는 옥시에톡시에톡시프로파노일 에스테르이다.
또 다른 구체예에서, 거대 분자 프로드러그는 [PEG-SN38-BG]8이다.
또 다른 구체예에서, 거대 분자 프로드러그는 PF108-(SN22)2이다.
다른 구체예에서, 거대 분자 프로드러그는 PEG-[SN22]4이다.
또 다른 구체예에서, 에스테르 결합은 옥시아세테이트 에스테르 결합이다.
또 다른 구체예에서, 상기 정의된 바와 같은 유효량의 거대 분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 신경모세포종을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 상기 정의된 바와 같은 유효량의 거대 분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 고형 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 상기 정의된 바와 같은 유효량의 거대 분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 뇌종양이 있는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 상기 정의된 바와 같은 유효량의 거대 분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 구체예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 인간이다.
도 1: 플루로닉 F-108(Pluronic F-108)의 유무에 따른 PF108-(SN22)2 프로드러그(100 nM SN22에 등가인 용량) 대 SN22에 의한 내화학성 NB 세포[BE(2)C]의 성장 억제. 비치료된, 또는 플레인(plain)의 화학적으로 비개질된 플루로닉 F-108로 처리된 세포가 대조군으로 포함되었다. 테스트된 노출 기간은 24시간 및 30분(각각 A 및 B)을 포함하였다. 세포 성장은 생물 발광(bioluminescence)에 의해 시간이 지남에 따라 모니터링되었다. 결과는 평균±SD로 표시된다.
도 2: 임상적으로 사용되는 수용성 전구체(4시간 내지 3일)인 이리노테칸(irinotecan)으로 투여된 SN38과 비교하여, 폴록사머 기반 프로드러그로서 전달된 SN22의 종양내 수준. 분석은 불응성 NB의 동소 이종이식 모델(orthotopic xenograft model)에서 수행되었다. 무흉선 누드(nu/nu) 마우스(n = 5)에 20% 플루로닉 F-127(50 ㎕)에 현탁시킨 BE(2)C 세포(동물 당 106 개)를 신장 위의 지방 패드에 접종하였다. 종양은 생물 발광 이미징의 제어 하에 1.0±0.4 cm3의 크기에 도달하도록 허용되었다. PF108-(SN22)2 또는 이리노테칸(120 ㎕)은 각각 10 mg/kg의 SN22 또는 SN38에 등가인 용량으로 꼬리 정맥 주사로 투여되었다. 종양을 채취하고, 무게를 재고, 4, 24 및 72시간에 종양내 약물 수준에 대해 HPLC로 분석하였다. 중량 표준화 약물 농도가 평균±SD로서 두 그룹에 대한 비교로 표시된다.
도 3: 불응성 고위험 NB의 동소 모델에서의 PF108-(SN22)2의 치료 효능. [44]에 기술된 절차에 따라 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 106개의 BE(2)C 세포를 마우스에 접종하였다. PF108-(SN22)2 치료는 4주 동안 주 1회 10 mg/kg의 SN22에 등가인 용량으로 정맥 내로 투여되었다. 10 mg/kg의 SN38로 주 2회 투여된 이리노테칸이 양성 대조군으로서 포함되었다. 염수 또는 화학적으로 비개질된 플루로닉 F-108이 음성 대조군으로서 사용되었다. 종양 관련 신호를 정량적 생물 발광으로 모니터링하였다(0-5주에 촬영된 대표 이미지가 (A)에 표시된다. (B)에 그래프로 표시된 정량 데이터는 평균±SD로 표시된다. 이 연구의 5주 기간 동안 각 동물 그룹에 대한 생존 곡선은 (C)에 표시된다.
도 4: 블랭크 플루로닉 F-108 유무에 따른 유리 SN22 대 PF108-(SN22)2 프로드러그의 증식 방지 효과 테스트. 치료에 대한 반응은 케모-나이브(
Figure pct00001
) 대 내화학성 표현형(각각 IMR32(A) 및 BE(2)C(B))을 나타내는 NB 세포들 간에 노출 기간(0.5, 4 및 24시간) 및 용량(웰당 20, 40 및 80 ng SN22에 등가임)의 함수로서 비교되었다. 반응은 치료 후 7일에 성장 억제율 %(평균±SD)로 표시된다.
도 5: PF108-(SN22)2(4시간-3일)로 전달된 SN22의 기관 분포 및 종양내 수준. 분석은 생물 발광 이미징의 제어 하에 1.0±0.4 cm3의 크기에 도달하도록 허용된 동소 BE(2)C 이종이식편에서 수행되었다. 프로드러그는 10 mg/kg의 SN22에 등가인 용량으로 꼬리 정맥 주사에 의해 투여되었다. 분석은 형광 측정법으로 수행되었다. 약물 양은 기관 당 주입된 용량%로 나타내고, 평균±SD로 표시된다.
도 6: 케모-나이브, MYCN 증폭 NB의 동소 모델에서의 PF108-(SN22)2의 치료 효능. 마우스에 106개의 루시퍼라제 발현 IMR-32 세포를 접종하였다. 이리노테칸 또는 PF108-(SN22)2(kg 당 10 mg 약물, 4주에 걸쳐 각각 주 2회 및 1회)으로의 치료는 접종 3주 후에 시작하였다(A). 대안적으로, PF108-(SN22)2는 10배 더 큰 NB 종양을 갖는 동물에게 3주에 걸쳐 주 1회 투여되었다(B). 종양 관련 신호는 정량적 생물 발광에 의해 모니터링되었다. 정량적 데이터는 평균±SD로 표시된다.
도 7: ABCG2 발현, 및 NLF 및 트랜스펙션된 클론의 성장. (A) 액틴(actin) 대조군과 비교하여 NLF 및 ABCG2 항체(Santa Cruz)가 있는 3개의 단일 세포 클론에 대해 웨스턴 분석(Western analysis)을 수행하였다. 클론 1, 2 및 3은 각각 미량, 낮은 및 중간 수준의 ABCG2 발현을 가졌다. (B) SN38 또는 SN22(50 ng/ml)의 존재 하에 NLF 및 ABCG2-발현 클론의 성장. 성장은 4일째에 나타났다.
도 8: 동소 NB 모델의 치료. 내화학성의, 루시퍼라제 트랜스펙션된 SKNBE(2)C 세포(107)를 누드 마우스의 신장 주위 지방 패드에 주입하였다. 마우스를 5개 그룹으로 나누었다: 비치료 또는 블랭크 PEG, CPT-11, PEG-[SN38]4 또는 PEG-[SN22]4(그룹 당 10 마리 동물)로 치료. 종양이 약 0.2 cm3에 도달하였을 때 치료를 시작하였다. PEG-[SN38]4 또는 PEG-[SN22]4를 사용한 치료는 종양 퇴행(tumor regression)을 일으켰으나, PEG-[SN22]4 치료 만은 완전한 종양 소멸을 유발하였다.
도 9: TH-MYCN 형질전환(transgenic) 마우스 모델에서의 PEG-[SN22]4 및 PEG-[SN38]4의 효능. 마우스는 염수(N = 8), CPT-11(15 mg/kg/용량; N = 7), PEG-[SN38]4(10 mg/kg/용량; N = 6) 또는 PEG-[SN22]4(10 mg/kg/용량; N = 6)로 4주 동안 주 1회 꼬리 정맥 주사로 치료되었다. 치료는 마우스가 약 1-2 cm3의 종양 크기를 갖고 약 5주령이었을 때 시작하였다. 마우스는 종양 부담으로 인한 고통의 징후를 보였을 때 연구에서 제외되었다. PEG-[SN22]4는 빠른 종양 퇴행을 보였으며 180-200일에 부검시 종양이 발견되지 않았다.
도 10: PEG [SN22]4로 치료된 EWS 및 RMS 이종이식편의 생존. 마우스는 염수, CPT-11(15 mg/kg/용량) 또는 PEG-[SN22]4(10 mg/kg/용량)(모두 N = 10)로 4주 동안 주 1회 꼬리 정맥 주사로 치료되었다. (좌). 치료 4주 후, EWS 세포주 TC-71(내화학성)의 옆구리 이종이식편을 갖는 동물의 생존. PEG-[SN22]4 동물은 어느 것도 재발하지 않았다. (우). 치료 4주 후 폐포(융합 양성) RMS 세포주 Rh30의 옆구리 이종이식편을 갖는 동물의 생존. PEG-[SN22]4로 치료한 동물 중 2 마리는 늦게 재발하였고 1 마리는 작고 성장이 느린 종양이 있었지만, 나머지 7 마리는 180-200일에 종양이 없었다.
도 11: 8-암(8-arm)(40kDa) PEG를 담체로 사용하고, BG를 표적 리간드([PEG-SN38-BG]8)로 사용하여 설계된 NET-표적 거대 분자 프로드러그로 전달된 SN-38의 종양내 수준. 분석은 불응성 NB의 동소 이종이식 모델에서 수행되었다. 무흉선 누드(nu/nu) 마우스(n = 5)에 20% 플루로닉 F-127(50 ㎕)에 현탁시킨 BE(2)C 세포(동물당 106 개)를 신장 상의 지방 패드에 접종하였다. 종양은 생물 발광 이미징의 제어 하에 1.0±0.4 cm3의 크기에 도달하도록 허용되었다. [PEG-SN38-BG]8은 SN-38 10 mg/kg에 등가인 용량으로 꼬리 정맥 주사로 투여되었다. 종양을 채취하고 무게를 재고, HPLC로 분석하였다. 중량 표준화 약물 농도는 평균±SD로 표시된다.
도 12: 불응성 고위험 NB의 동소 모델에서의 [PEG-SN38-BG]8의 치료 효능. 무흉선 누드(nu/nu) 마우스에 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 BE(2)C 세포(106)를 접종하였다. [PEG-SN38-BG]8 치료는 4주 동안 주 2회 10 mg/kg의 SN-38에 등가인 용량으로 정맥 내 투여되었다. 주 2회 15 mg/kg으로 투여된 이리노테칸은 양성 대조군으로서 포함되었다. 염수(비치료)를 투여한 마우스 그룹은 음성 대조군으로서 사용되었다. 추가 그룹에서, 10배 더 큰 종양 크기(2.0 cm3, '큰 종양')에 도달하도록 허용된 동물에게 동일한 요법을 사용하여 프로드러그를 투여하였다. 종양 관련 신호는 정량적 생물 발광에 의해 모니터링되었다. (A)에 그래프로 표시된 데이터는 평균±SD로 표시된다. 190일 기간 동안 각 동물 그룹의 생존 곡선은 (B)에 표시된다.
도 13: 내화학성 NB 세포 BE(2)C에서의 [PEG-SN38-BG]8 및 SN-38(각각 (A) 및 (B))의 항증식 활성에 대한 보리노스타트(vorinostat)의 강화 효과 평가. 6시간에 피크로 보고된 보리노스타트-유도 NET 발현에 따라, 6시간의 노출 기간이 본 실험을 위해 선택되었다. BE(2)C 세포를, 보리노스타트(1.25-5.0 μM) 유무에 따라, 25-100 nM의 SN-38에 등가인 농도에서 [PEG-SN38-BG]8 또는 SN-38과 함께 인큐베이션하였다. 세포 성장은 생물 발광에 의해 측정되었다. 치료 6일 후 BE(2)C 세포 생존 데이터는 모델 z = z 0 + A·x + B·y + C·[x·y]를 적용하고 상호작용 항 C의 중요성을 결정함으로써 고가산성(hyperadditivity)에 대해 분석되었다.
도 14: NET-발현, 내화학성 NB 세포, BE(2)C에 대한 [PEG-SN38-BG]8 프로드러그의 항증식 효과. 세포 성장 동력학에 대한 효과가 BG(A)와의 기능화가 결여된 유리 SN-38 또는 이분(bipartite)[PEG-SN38]8과 비교하여 연구되었다. 세포는 125 nM의 SN-38에 상응하는, 화합물에 등가인 농도에서 4시간 동안 노출되었다. 추가 실험(B)에서, [PEG-SN38-BG]8 치료에 대한 반응은 HDAC1 특이적 억제제인 엔티노스타트(entinostat)(0-5 μM)의 유무에 따라 조사되었다. 프로드러그의 용량은 0-100 nM SN-38에 등가인 범위 내에서 다양하였고, 노출 기간은 6시간으로 고정되었다. 세포 성장은 생물 발광에 의해 모니터링되었다. 반응은 치료 6일 후 세포 생존율 %(평균±SD)로 표시된다. 실험 데이터는 모델 z = z0 + A·x + B·y + C·[x·y]를 사용하고 상호작용 항 C의 중요성을 결정하는 고가산성에 대해 분석되었다.
도 15: 케모-나이브 MYCN 증폭 NB의 동소 이종이식 모델에서의 [PEG-SN38-BG]8의 치료 효능. 마우스에 106개의 루시퍼라제 발현 IMR-32 세포를 접종하였다. kg 당 10 mg SN-38에 등가인 용량으로 4주에 걸쳐 주 2회 SN-38의 수용성 전구체(이리노테칸) 또는 [PEG-SN38-BG]8으로의 치료가 접종 후 21일에 시작되었다. 종양 관련 신호는 정량적 생물 발광에 의해 모니터링되었다. (A)의 데이터는 평균±SD로 표시된다. 각 그룹에 대한 대표적인 생물 발광 이미지는 (B)에 포함된다.
도 16: 불응성 고위험 NB의 동소 모델에서의 [PEG-SN38-BG]8의 치료 효능. 무흉선 누드(nu/nu) 마우스에 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 BE(2)C 세포(106)를 접종하였다. [PEG-SN38-BG]8 치료는 4주 동안 주 2회 10 mg/kg의 SN-38에 등가인 용량으로 정맥 내 투여되었다. 비교를 위해 주 2회 투여되는 이리노테칸(15 mg/kg) 및 등가 용량의 이분[PEG-SN38]4이 포함되었다. 블랭크 PEG 또는 염수(비치료)로 투여된 마우스 그룹은 음성 대조군으로서 사용되었다(A). "_구조" 실험에서, 2주에 종양이 2.0 cm3에 도달한, 초기에 이리노테칸(15 mg/kg, 2회/주)으로 치료받은 동물에게 동일한 요법을 사용하여 프로드러그가 투여되었다(B). 종양 관련 신호는 정량적 생물 발광에 의해 모니터링되었다. 데이터는 평균±SD로 표시된다.
도 17: 케모-나이브 MYCN 증폭 NB의 동소 이종이식 모델에서의 [PEG-SN38-BG]8의 치료 효능. 마우스에 106개의 루시퍼라제 발현 IMR-32 세포를 접종하였다. kg 당 10 mg SN-38에 등가인 용량으로 4주에 걸쳐 주 2회 SN-38의 수용성 전구체(이리노테칸) 또는 [PEG-SN38-BG]8으로의 치료가 접종 후 21일에 시작되었다. 종양 관련 신호는 정량적 생물 발광에 의해 모니터링되었다. (A)의 데이터는 평균±SD로 표시된다. 대표 이미지가 (B)에 포함된다.
도 18: 전이성 불응성 NB 모델에서의 [PEG-SN38-BG]8의 치료 효능. 106개의 루시퍼라제 발현 BE(2)C 세포를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입하였다. 이리노테칸(15 mg/kg) 또는 [PEG-SN38-BG]8을 kg 당 10 mg SN-38에 등가인 용량으로 25일에 치료가 시작되었다(4주, 2회/주). 종양 관련 신호는 정량적 생물 발광((A), 평균±SD로 표시된 데이터)에 의해 모니터링되었다. 대표 이미지가 (B)에 포함된다.
도 19: PF68-SN38-BG 프로드러그 대 대조군으로서 이분(비표적) PF68-SN38 및 유리 SN-38의 항증식 효과. 15분 노출 후 획득된 MDR[BE(2)C]을 나타내는 NB 세포의 반응은 SN-38 등가 용량(0-25 nM)의 함수로서 치료 후 6일에 성장 곡선(A) 및 성장 억제율 %(B)로 표시된다. 세포 성장은 생물 발광에 의해 모니터링되었다. 결과는 평균±SD로 표시된다.
도 20: 내화학성 NB 세포, BE(2)C에 대한 PF68-SN38-BG의 항증식 작용의 NET-선택성. BG로의 기능화가 결여된 이분 PF68-SN38과 비교하여 니속세틴(1 μM)을 사용하여 NET 억제 유무에 따른 세포 성장을 조사하였다(A). 세포를 동일한 농도의 화합물에 15분 동안 노출시켰다. 치료 후 6일에 실험 데이터를 Tukey 사후 테스트(Tukey post-hoc test)를 통한 ANOVA로 분석하였다.
도 21: 불응성 NB 모델에서의 NET-유도 전달의 치료 효능. 마우스에 106개의 루시퍼라제 발현 BE(2)C 세포를 신장 위 지방 패드에 접종하였다. 치료는 이리노테칸(15 mg/kg) 또는 kg 당 10 mg SN-38에 등가인 용량으로 이분 및 삼분(tripartite) 구성물로 시작되었다(4주, 2회/주, (A)). 대안적으로, 종양은 치료를 시작하기 전에 2 cm3에 도달하도록 허용되었다(B). 질병 진행은 정량적 생물 발광에 의해 모니터링되었다. 종양 성장 데이터는 평균±SD로 표시된다.
도 22: 내화학성의 루시퍼라제-트랜스펙션된 SKNBE(2)C 세포(107)를 누드 마우스의 신장 주위 지방 패드에 주입하고 종양 발생을 추적하였다. 마우스를 5개의 그룹으로 나누었다: 비치료 또는 블랭크 PEG, CPT-11, PEG-[SN22]4 또는 PEG- [SN38]4 치료(그룹 당 10 마리의 동물). 종양이 약 0.2 cm3에 도달했을 때 치료가 시작되었다. 종양 크기는 두 대조군에서 2주에 걸쳐 빠르게 증가하였으며 성장은 CPT-11에 의해 약간만 지연되었다. PEG-[SN22]4 또는 PEG-[SN38]4 치료는 성장을 늦춘 후, 종양을 퇴행시켰다. PEG-[SN22]4 치료 만이 완전한 종양 소멸을 유발하였다((A) = 이미징; (B) = 정량화).
상세한 설명
제1 구체예
상기 기술된 프로드러그의 제1 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 적어도 두 개의 분자는 생리적 조건(예를 들어, 22℃, pH = 7.2) 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴록사머 폴리머에 공유 결합된다.
캄프토테신 유사체는 토포이소머라제 억제제로서 당업계에 잘 알려져 있다. 캄프토테신 자체는 (S)-4-에틸-4-하이드록시-1H-피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]-퀴놀린-3,14-(4H,12H)-디온이다. 용어 "캄프토테신 유사체"는 캄프토테신을 포함한다. 바람직한 캄프토테신 유사체는 SN22(7-에틸-캄프토테신), SN38(7-에틸-10-하이드록시-캄프토테신), 또는 이들의 조합을 포함한다.
폴록사머는 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 두 개의 친수성 사슬이 측면에 있는 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 사슬을 포함하는 비이온성 트리블록 코폴리머이다. 폴리옥시에틸렌의 총 사슬 수는 2 내지 130의 범위일 수 있다. 옥시프로필렌 단위의 수는 15 내지 67의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 폴록사머의 분자량은 사구체 여과의 임계치 미만이다(30-50 kDa). 이러한 폴리머는 인간에게 안전한 사용 이력이 있으며 제약 등급 재료(Kolliphor® P)로 입수 가능하다. 많은 폴록사머가 FDA에 의해 부형제로서 승인되었으며, 현재 다양한 용도로 임상적으로 사용되고 있다. 이러한 모든 폴록사머는 본원에 기술된 구체예에 적합하다.
분자 크기 및 친수성/친유성 균형과 같은 폴록사머의 생물학적 관련 성질은 친수성(A) 및 소수성(B) 블록[A = 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO) 및 B = 폴리(프로필렌 옥사이드)(PPO)]의 길이 조정 및 몰비를 통해 조절된다. 화학적으로 균질한 폴리(에틸렌 옥사이드)와 달리, 중간 PPO 블록의 중간 길이와 비교적 높은 친수성/친 유성 균형 값을 결합한 ABA 트리블록 폴록사머는 세포막과 안정적으로 결합할 수 있고, 이는 종양 침투 및 종양내 존재 확장을 위한 효과적인 메커니즘을 제공한다. 폴록사머의 예는 Kolliphor® P188, P338 및 P407를 포함한다.
캄프토테신 유사체는 생리적 조건(예를 들어, 22℃, pH = 7.2)에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴록사머 폴리머에 공유 결합된다. 일 구체예에서, 에스테르 결합은 옥시아세테이트 에스테르 결합이다. 캄프토테신 유사체는 바람직하게는 캄프토테신의 위치 20에 상응하는 위치의 하이드록실 기를 통해 폴록사머 폴리머에 결합된다.
다른 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 두 분자는 폴록사머 폴리머에 공유 결합된다. 바람직한 구체예에서, 거대 분자 프로드러그는 PF108-(SN22)2이며, 이는 하기 구조식으로 표현된다:
Figure pct00002
제2 구체예
상기 기술된 프로드러그의 제2 구체예에서, SN22 유사체의 적어도 두 개의 분자는 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 PEG 폴리머에 공유 결합된다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 폴리머는 당업계에 잘 알려져 있다. PEG 폴리머는 선형이고, 화학식 H-(O-CH2-CH2)n-OH로 표현될 수 있다. 다른 구체예에서, PEG 폴리머는 멀티-암 폴리머이다. 멀티-암 PEG 폴리머는 중심 코어 기에서 나오는 3 내지 10개의 PEG 사슬을 갖는다. 4개의 PEG 사슬이 특히 바람직하다. 바람직한 중심 코어 기는 펜타에리트리톨 기 및 트리펜타에리트리톨 기를 포함한다. PEG 폴리머는 2,000, 5,000, 10,000, 25,000, 35,000, 50,000, 75,000 및 85,000 달톤을 포함하는 그 사이의 모든 값 및 하위 범위를 포함하여 1,000 내지 100,000 달톤의 분자량을 가질 수 있다.
또 다른 구체예, SN22의 두 개의 분자는 선형 PEG 폴리머에 공유 결합된다. 또 다른 구체예에서, SN22의 4개의 분자는 4개의 PEG 사슬을 갖는 멀티-암 PEG 폴리머에 공유 결합된다. 또 다른 구체예에서, SN22의 4개 초과 및 8개 이하의 분자가 멀티-암 PEG 폴리머에 공유 결합된다. 바람직하게는, SN22의 분자는 이들 구체예에서 각각의 PEG 사슬에 공유 결합된다.
SN22 모이어티는 생리적 조건(예를 들어, 22℃, pH = 7.2) 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 PEG 폴리머에 공유 결합된다. 일 구체예에서, 에스테르 결합은 옥시아세테이트 에스테르 결합이다. 캄프토테신 유사체는 바람직하게는 캄프로테신의 위치 20에 상응하는 위치에 하이드록실 기를 통해 PEG 폴리머에 결합된다.
바람직한 구체예에서, 거대분자 프로드러그는 하기 구조식으로 표현되는 PEG-[SN22]4이다:
Figure pct00003
또 다른 구체예에서, 환자는 경구 화학요법 약물인 테모졸로마이드(Temozolomide)(TMZ)로 사전 치료될 수 있다. 이러한 사전 치료는 부가적인 효능을 제공할 수 있지만 프로드러그의 종양 침투를 향상시킬 수 있다. 테모졸로마이드는 20 내지 250 mg/kg/일 PO의 용량으로 수일 동안, 예를 들어 5일 동안 투여될 수 있고, 이어서 프로드러그 치료가 예를 들어 7일에 시작하여 이어질 수 있다. 100 mg/kg/일 PO의 용량이 바람직하다.
제3 구체예
상기 기술된 프로드러그의 제3 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 두 개 이상의 분자는 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴리머에 공유 결합되고, 여기서 적어도 하나의 캄프토테신 유사체는 적어도 하나의 NE 수송체(NET) 리간드로 기능화된다.
캄프토테신 유사체는 SN22(7-에틸-캄프토테신), SN38(7-에틸-10-하이드록시-캄프토테신) 또는 이들의 조합일 수 있다. SN38이 특히 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 캄프토테신 유사체의 2개 내지 8개의 분자가 폴리머에 공유 결합된다. 이 범위는 캄프토테신 유사체의 2, 3, 4, 5, 6 및 7개의 분자와 같은 모든 특정 값 및 그 사이의 하위 범위를 포함한다. 폴리머에 공유 결합되는 8개의 분자의 캄프토테신 유사체가 특히 바람직하다.
폴리머는 상기 기술된 바와 같은 폴록사머 폴리머 또는 PEG 폴리머일 수 있다. 멀티-암 PEG 폴리머가 바람직하다. 이 구체예에서, 멀티-암 PEG 폴리머는 중심 코어 기로부터 나오는 3개 내지 10개의 PEG 사슬을 갖는다. 4개 내지 8개의 PEG 사슬이 특히 바람직하고, 8개의 PEG 사슬이 특히 바람직하다. 바람직한 중심 코어 기는 펜타에리트리톨 기 및 트리펜타에리트리톨 기를 포함한다. 트리펜타에리트리톨 기가 중심 코어 기로서 특히 바람직하다.
캄프토테신 유사체는 생리적 조건(예를 들어, 22℃, pH = 7.2)에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴록사머 폴리머에 공유 결합된다. 일 구체예에서, 에스테르 결합은 옥시아세테이트 에스테르 결합이다. 캄프토테신 유사체는 바람직하게는 캄프토테신의 위치 20에 상응하는 위치에서 하이드록실 기를 통해 폴록사머 폴리머에 결합된다.
이 구체예에서, 적어도 하나의 캄프토테신 유사체는 노르에피네프린(NE) 수송체에 대해 적어도 하나의 리간드, 즉, NE 수송체(NET) 리간드로 기능화된다. 일 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드는 페네틸구아니딘, 벤질구아니딘(BG) 또는 티라민이다. 벤질구아니딘이 특히 바람직하다.
또 다른 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드는 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 캄프토테신 유사체에 공유 결합된다. 바람직한 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드와 캄프토테신 유사체 사이의 에스테르 결합은 옥시헥사노일 에스테르이다. 또 다른 구체예에서, NE 수송체(NET) 리간드와 캄프토테신 유사체 사이의 에스테르 결합은 옥시에톡시프로파노일 또는 옥시에톡시에톡시프로파노일 에스테르이다.
바람직한 구체예에서, 거대분자 프로드러그는 하기 구조식으로 표현되는, [PEG-SN38-BG]8이다:
Figure pct00004
치료 방법
상기 기술된 바와 같이, 거대분자 프로드러그는 유효량의 거대분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 신경모세포종을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 거대분자 프로드러그는 또한 유효량의 거대분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 고형 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 거대분자 프로드러그는 또한 유효량의 거대분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 뇌 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 거대분자 프로드러그는 또한 유효량의 상기 정의된 바와 같은 거대분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여함으로써 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
이들 구체예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 바람직하게는 포유 동물, 특히 바람직하게는 인간이다.
거대분자 프로드러그는 당업계에 일반적으로 사용되는 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 방법은 비경구(정맥내, 근육내 및 피하), 경구, 비강, 안구, 경점막(구강, 질 및 직장) 및 경피 투여 경로를 포함한다.
거대분자 프로드러그는 상기 기술된 병태를 치료하기에 효과적인 임의의 용량으로 투여될 수 있다. 거대분자 프로드러그의 투여량은 용량당 0.5 내지 200 mg/kg일 수 있다.
실시예
실시예 1: PF108-(SN22)2
1. 2-단계 프로드러그 합성.
22 - 25℃에서 THF 중의 Jones 시약(CrO3/H2SO4)을 사용하는 폴록사머의 산화는 폴리머의 말단 CH2OH를 말단 알콕시아세테이트 카르복실 기로 변환시키고, 이는 이후 가수 분해 가능한 에스테르 결합을 통해 여러 하이드록실 함유 약물의 가역적 공유 결합에 사용될 수 있다. 상기 언급된 조건에서 플루로닉 F-108(Kolliphor P338)의 산화는 OCH2CO 양성자의 신호에 의해 1H NMR을 사용하여 나타난 바와 같이 0.18 mmol/g의 카르복실 기를 함유하는 폴리머를 생성하였다. 유사하게, 플루로닉 F-68의 산화는 0.23 mmol/g의 말단 카르복실 기를 함유하는 폴리머를 생성하였다. 1,3-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)를 카르복실 기에 대한 활성화제로, 4-디메틸아미노피리딘 토실레이트(DPTS)를 촉매로, 그리고 CH2Cl2를 용매로 사용하여 SN22와 카르복실화된 플루로닉 F-108을 추가로 컨쥬게이션시켜 0.13 mmol/g 또는 4.8 % wt.의 약물을 함유하는 폴리머 컨쥬게이트를 형성시켰다. 1H NMR은 SN-22가 카르복실화된 플루로닉의 카르복실 기와 SN22 분자의 20-OH 사이의 에스테르 결합을 통해 폴리머에 공유 결합되었음을 입증하였다. Kolliphor-등급 플루로닉(표 1) 및 SN22(순도: ≥97%, HPLC)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO) 및 AK Scientific(Union City, CA)에서 각각 구매될 것이다.
카르복실화된 플루로닉으로 SN38의 프로드러그를 제조하기 위해, SN38의 페놀성 10-OH(순도: ≥97 %, AstaTech, Bristol, PA)를 먼저 N-메틸피롤리돈 중의 이미다졸의 존재 하에 3차-부틸(클로로)디페닐실란(TBDPS-Cl)의 작용에 의해 10-3차-부틸디페닐실릴(TBDPS) 기로 보호하였다. 타당성 실험에서, 생성된 10-TBDPS-보호된 SN38(97% 수율로 얻어짐)을 상기와 같이 카르복실화된 플루로닉 F-68과 반응시켜 후속 탈보호(CH2Cl2 중의 피리디늄 플루오라이드 사용) 후 목적 컨쥬게이트를 얻었으며, 이는 1H NMR에 따르면 0.17 mmol/g 또는 6.6 %wt의, 20-OH에 의한 에스테르 결합을 통해 공유 결합된 SN38를 함유하였다.
표 1: 본원에 기재된 프로드러그 컨쥬게이트를 제조하는 데 사용되는 제약 등급 폴록사머 폴리머
Figure pct00005
2. 폴록사머-SN22 프로드러그는 내화학성 NB 세포의 성장을 억제한다.
불응성 NB는 NB 세포 성장을 억제하는 데 필요한 임계 약물 수준의 변화에 의해 특징된다. 치료 전 진단시 대비 유도 요법 중 진행성 질환이 있는 동일한 환자로부터 유래된 모든 테스트된 세포주 쌍에서 나타난 이러한 변화는 동시에 다른 화학적 및 약리학적 계열의 화학 요법제에 대한 반응에 영향을 미친다. 제약 등급 플루로닉 F-108(Kolliphor P338) 및 SN22로 구성된 프로드러그인 PF108-(SN22)2를 코돈 135에 대한 TP53 돌연변이 획득 및 p53 기능 상실과 관련된 약물 내성 표현형을 나타내는 BE(2)C 세포주에 대하여 테스트하였다.
24시간 노출 후, PF108-(SN22)2는 7일 동안 BE(2)C 세포의 성장을 효과적으로 억제하였으며, 효능이 SN22 단독 또는 화학적으로 비개질된 플루로닉 F-108과 조합한 경우(PF108 + SN22)와 유사한 반면, 약물 없이 플루로닉 F-108을 적용한 경우에는 세포 성장 억제가 관찰되지 않았다(도 1A). PF108-(SN22)2의 효과는 노출이 30분으로 제한된 경우 현저히 덜 두드러졌고(도 1B), 이는 프로드러그가 이 시간 척도에서 대부분 손상되지 않았음을 시사한다.
이에 비해, 케모-나이브 NB 세포(IMR-32)에 대하여 테스트한 경우, 프로드러그는 SN22의 20 내지 80 nM에 상응하는 용량 범위 및 30분 내지 24시간의 노출 기간 내에서 균일하게 효과적이어서, 강력한 IMR-32 세포 성장 억제를 야기하였다(도 4A 참조). 이것은 이전에 치료되지 않은 환자로부터 유래된 이 세포주에서 내재적 내성이 부족한 것과 일치하여 실질적으로 보다 낮은 수준으로 존재하는 활성 SN22의 항증식 효과에 반응성이게 한다. 중요하게는, 유리 SN22가 세포 배양 실험에서 양성 대조군으로서 포함되었지만, 약학적으로 허용되는 비히클과 비상용성이라는 것이다.
3. 폴록사머 프로드러그로서 SN22 전달은 동소 BE(2)C 종양에서의 노출을 연장시킨다.
화학 방사선 요법 후 재발시 유래된 BE(2)C 세포와 진단시 동일한 환자에서 유래된 BE(1) 세포를 비교한 결과, 90% 세포 성장 억제를 달성하는 데 필요한 캄프토테신 유사체 SN38의 농도가 엄청나게 증가한 것으로 나타났다: 각각 25 대 2 ng/ml. 중요하게는, SN38의 상응하는 종양 내 수준이 그것의 전구체인 이리노테칸(CPT-11)에 의한 통상적인 치료를 사용하여 유지될 수 없다는 것이 밝혀졌다. 최대 허용 용량을 초과하지 않으면서 효과적인 국소 약물 수준을 유지할 수 없는 것은 재발성 및 불응성 고위험 NB 환경에서 임상적으로 사용되는 캄프토테신 및 다른 화학 요법제의 주요 실패 원인이다. 이들 보고서와 일치하여, 이러한 결과는 이리노테칸(10 mg/kg) 투여 후 각각 24시간 및 72시간에 큰(≥ 1 cm3) BE(2)C 동소 이종이식편에서 SN38가 25 ng/g 및 2 ng/g 미만임을 보여준다. 이에 비해, PF108-(SN22)2와 등가인 용량으로 전달된 SN22는 종양에서 4, 24 및 72시간에서 각각 다수 배 더 높은 수준: 2180±850 ng/g, 2140±520 ng/g 및 1570±580 ng/g으로 안정적으로 존재하였고(도 2), 이는 폴록사머 프로드러그 기반 전달이 SN22의 안정된 치료 유효 수준을 유지할 수 있고, 이에 따라 지속적인 NB 종양 성장 억제에 대한 전제 조건을 해결한다는 것을 시사한다.
4. 폴록사머-SN22 프로드러그는 약물 내성 NB에서 생존을 연장하는 종양 성장을 강력하게 억제한다.
1.5 ㎍/g 초과의 종양 내 수준에서 지속적으로 존재하는 것과 일치하여, 종양 퇴행을 유발하는 폴록사머 기반 전구 약물로서 SN22를 제형화하고, 주 1회 투여하자 동소 BE(2)C 이종이식편의 재성장을 강력하게 억제하였다(도 3A 및 B). 이것은 또한 이 연구에서 두 번 더 자주 투여된 이리노테칸의 한계 항종양 효과와 대조적으로 현저하게 연장된 동물 생존율로 해석되었다(도 3C). 이 NB 모델에서 이리노테칸의 한계 효과(도 3)는 공격적이고 불응성인 인간 NB 환경에서 지속적인 치료 반응을 달성하는 데 중요한 과제를 개괄하는 전임상 평가 접근법의 적절성을 보여준다. 특히, 이리노테칸과 달리 PF108-(SN22)2는 종양 수축을 유발하고 질병을 안정화시킬 수 있었으며, 단지 4회의 약한 용량(21일에 투여된 PF108-(SN22)2의 마지막 투여, 도 3B에 표시됨)으로 이루어진 치료 기간 동안 및 그 이후에는 진행이 관찰되지 않았다. 폴록사머-SN22 프로드러그의 현저한 항암 작용은 설사, 피부 텐팅(tenting)(탈수로 인한), 피부 궤양, 거식증, 악액질 또는 체중 증가 지연과 같은 전신 독성의 징후를 동반하지 않았다.
5. 폴록사머-SN22 프로드러그: MYCN 증폭 NB 세포에 대한 항증식 효과의 정량적 연구.
뚜렷한(케모-나이브 대 내화학성) 표현형을 갖는 NB 세포에 대한 폴리머 프로드러그의 항증식 효과 비교 연구 타당성을 입증하기 위해, 치료 시작 전 및 집중 화학 방사선 요법 후 재발시 공격적인 MYCN-증폭 질환을 나타내는 두 세포주(각각 IMR-32 및 BE(2)C)에 대한 PF108-(SN22)2의 효과를 비교하였다.
케모-나이브 및 내화학성 세포 간에 반응 패턴의 큰 차이가 관찰되었다: IMR-32의 성장이 연구된 전체 용량 및 노출 기간 범위 내에서 높은 효능으로 균일하게 억제되었지만(도 4A), BE(2)C 세포는 웰당 ≤ 40 ng 약물 용량 또는 ≤ 4시간 노출 기간에서 PF108-(SN22)2에 의해 단지 제한된 성장 억제를 나타냈다. 특히, 화학적으로 비개질된 플루로닉 F-108의 존재 유무에 따른 유리 SN22에 대한 이들 세포의 반응성은 또한 이전 연구에서 볼 수 있듯이 p53 기능 상실 및 다른 화학 요법 계열에 대한 민감도 감소를 나타내는 BE(2)C의 내화학성 표현형과 일치하여, IMR-32에 비해 더 높은 용량 및 더 긴 노출 기간 쪽으로 강하게 이동되었다.
6. 폴록사머 프로드러그로서 제형화된 SN22의 비교 종양 흡수 및 체류.
폴록사머 기반 프로드러그를 사용한 전달 접근법의 효과는 PF108-(SN22)2 컨쥬게이트로서 투여된 SN22의 빠른 종양 흡수 및 지속적인 종양 내 체류를 보여주는 데이터에 의해 입증된다(도 2 및 5). PF108-(SN22)2는 내화학성 NB 세포의 성장을 억제하는 데 필요한 보고된 유효 국소 농도보다 약 두자릿수 배 더 큰 수준에서 동소 NB 종양에서의 약물 존재를 연장시킨다.
기관 분포 분석은 망상 내피 시스템, 간 및 비장의 기관에 의해 흡수되는 상대적으로 낮은 약물 양과 함께, 프로드러그로서 전달된 SN22의 빠른 축적 및 장기적인 체류를 확인하였다. PF108-(SN22)2로서 투여된 상당한 양의 SN22는 투여 후 4시간 및 24시간에 혈액에서 측정되었으며, 이는 이 기간 동안 종양에서 진행 중인 약물 축적과 일치한다(도 5). 이것은 말초 기관, 비장, 폐 및 신장에서 관찰되는 빠른 약물 제거와는 대조적이다. 중요하게는, 토포이소머라제 I 억제제는 활성 복제가 없는 경우에도 세포 독성이 높을 수 있는 다른 화학 요법과 달리, 순환 세포에 매우 특이적이라는 것이다(S 단계-의존성).
폴록사머 프로드러그 기반 전달로 관찰되는 말초 기관으로부터의 제한된 분포 및 빠른 약물 제거와 함께, 약리학적 선택적 작용 방식은 잠재적으로 상당한 전신 독성의 위험을 추가로 감소시키며, 이는 급성 전신 독성 증상(설사, 궤양, 거식증, 악액질 또는 체중 감소)의 결여와 일치한다.
7. 폴록사머-SN22 프로드러그는 수축을 일으키고 이리노테칸에 일시적인 반응을 보이는 크고 작은 NB 종양의 재성장을 억제한다.
작고 큰 NB 종양에 대한 지속적인 항암 효과를 제공하는 폴록사머 기반 프로 드러그 전략의 효과는 PF108-(SN22)2(동소 IMR-32 이종이식 모델, 도 6)의 주 1회 투여 요법으로 실험적으로 나타났다. 특히, 그것들의 케모-나이브 표현형에도 불구하고, MYCN 증폭 IMR-32 세포로 확립된 동소 NB 종양은 이리노테칸(주어진 주 2회)에 대해 일시적인 반응만을 보여주었다. 불응성 질환의 BE(2)C 이종이식 모델(도 3)에서 프로드러그 접근법의 효과를 입증하는 결과와 함께, 이는 기존의 화학 요법에 대해 제한된 또는 반응이 없음을 보여주는 고위험 NB의 맥락에서 폴록사머 프로드러그 기반 전달을 지지하는 강력한 증거를 제공한다.
실시예 2: PEG-[SN22]4
1. PEG-[SN22]4의 합성
카르복실 기에 대한 활성화제로서 1,3-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC), 촉매로서 4-디메틸아미노피리딘토실레이트(DPTS), 및 용매로서 CH2Cl2를 사용하여 카르복실화 4-암-PEG(JenKem Technology, Mn = 20,553 Da)를 SN22와 컨쥬게이션시켜 0.17 mmol/g 또는 6.4 중량%의 약물을 함유하는 폴리머 컨쥬게이트를 형성시켰다. 1H NMR은 SN-22가 카르복실화 폴리머의 카르복실 기와 SN22의 20-OH 사이의 에스테르 결합에 의해 폴리머에 공유 결합되었음을 보여주었다.
2. 실험 결과.
ABCG2 유출에 대한 SN38 및 SN22의 감수성을 평가하기 위해, ABCG2-null NB 세포주인 NLF가 확인되었다. NLF를 ABCG2 발현 벡터로 트랜스펙션시킨 후, ABCG2 발현의 미량, 낮은 및 중간 수준을 갖는 단일 세포 클론을 선택하였다(도 7A). 다음으로, 다양한 농도의 SN38 또는 SN22에 대한 NLF 및 ABCG2 발현 클론의 민감도와 IncuCyte® S3 Live-Cell 분석 시스템을 사용하여 지속적으로 모니터링된 성장을 평가하였다. 더 높은 수준의 ABCG2를 가진 클론은 SN38에 대해 점점 더 내성을 갖는, 반면 SN22에는 완전히 민감하게 유지되었다(도 7B). 이는 공격적인 NB 및 NB 줄기 세포를 특징화하는 내인성 ABCG2 발현이 이리노테칸/SN38 및 가능하게는 ABCG2 유출에 취약한 다른 화학 요법제에 대한 약물 내성에 기여함을 시사한다.
생체 내 NB에서 SN22의 다른 스케줄을 조사하기 위해, NB 옆구리 이종이식 마우스 모델을 사용하여 테스트하고, 면역 결핍 nu/nu 마우스의 케모-나이브 SH-SY5Y NB 라인의 서브클론이 수행되었다. 예비 실험에서 4주 동안 주 2회 CPT-11(25 mg/kg/용량) IV와 비교하여 PEG-[SN22]4(10 mg/kg/용량)의 두 가지 상이한 치료 스케줄을 평가하였다. PEG-[SN22]4는 2주 동안 주 2회 또는 4주 동안 주 1회(각 4회 용량) 투여되었다. 두 배의 CPT-11 용량이 2.5배 더 높은 용량으로 투여되었지만, PEG-[SN22]4가 관해 유도 및 생존 연장에 훨씬 더 효과적이었다.
다음으로, 내화학성 NB 라인 SKNBE(2)C를 갖는 NB 동소 이종이식 마우스 모델에서의 PEG-[SN22]4, PEG-[SN38]4 및 CPT-11. BE(2)C 세포를 생물 발광 이미징이 가능하도록 루시퍼라제 발현 벡터로 트랜스펙션시켰다. 마우스를 PEG-[SN22]4(10 mg/kg/용량), PEG-[SN38]4(10 mg/kg/용량) 또는 CPT-11(15 mg/kg/용량)으로 4주 동안 주 1회 치료하였다. 이 내화학성 모델에서 CPT-11은 효과가 없었던 반면, PEG-[SN22]4 및 PEG-[SN38]4는 둘 모두 종양 축소에 매우 효과적이었다(도 8). 종양은 PEG-[SN38]4 치료된 마우스에서 치료 중단 후 빠르게 재성장하는 반면, PEG-[SN22]4 치료는 종양이 완전히 사라지고 치료 기간이 지난 후에도 종양의 성장을 지속적으로 억제하였으며, 이는 PEG-[SN22]4가 후천적 약물 내성을 극복하는 능력으로 인해 불응성 질환에 대한 우수한 효능을 가짐을 시사한다.
PEG-[SN22]4는 또한 TH-MYCN 형질전환 마우스 모델에서 드 노보(de novo) NB를 치료하는 데 사용되었다. 두 개의 트랜스유전자 복사체를 갖는 거의 모든 마우스에서 4 내지 5주까지 척추 주위 신경절 또는 부신에서 자발적 종양이 발생하였다. 종양이 만져지면(4 내지 5주), 마우스를 4개의 그룹으로 나누었다. 대조군-비치료; CPT-11 치료(15 mg/kg/용량), PEG-[SN38]4(10 mg/kg/용량) 또는 PEG-[SN22]4(10 mg/kg/용량). 마우스는 4주 동안 주 1회 치료받았다. 종양은 치료되지 않은 동물에서 빠르게 진행되었으며, 종양 성장은 CPT-11 치료에 의해 단지 약간 지연되었다. 종양 부담으로 인한 증상이 나타난 경우에 마우스를 희생시켰다. 그러나, 모든 종양은 PEG-[SN22]4 치료로 퇴행하여 치료 후 1 내지 2주 이내에 만져지지 않게 되었다(도 9). 종양은 SN22 치료 개시 후 180일 이상 모든 마우스에서 만져지지 않았다. 이 마우스 중 몇 마리를 희생시켰고 종양 부위를 육안으로, 그리고 현미경으로 조사하였으나, 어떠한 마우스에서도 종양의 증거가 발견되지 않았다. 이러한 데이터는 PEG-[SN22]4가 면역적격 마우스에서 발생하는 자발적 종양에 대해 매우 효과적이며, 모든 동물에서 장기적인 완화 및 치료를 생성하는 데 4회 매주 용량으로도 충분하였음을 시사한다.
PEG-[SN22]4를 사용하여 유사한 방식으로 이종이식편으로서 성장하는 두 개의 대표적인 육종을 치료하였다. 내화학성 유잉 육종(EWS) 계통 TC-71 및 폐포(융합 양성) 횡문근 육종(RMS) 계통 Rh30을 치료하였다. 180일 후, 모든 EWS 마우스는 만져질 수 있는 종양이 없었지만, RMS 이종이식편을 갖는 두 마리의 마우스는 약 150일에 종양이 재성장하여 희생되어야 했다(도 10). 이들 마우스는 단일 약물의 4회 매주 용량으로만 치료되었으므로, 이러한 재발은 더 긴 치료 또는 다른 약물과의 조합으로 피할 수 있었다. 그럼에도 불구하고, EWS 및 RMS의 이러한 결과는 PEG-[SN22]4의 효능이 NB에 제한되거나 특이적이지 않고, 다른 고형 종양에 적용된다는 것을 보여준다.
상기 제시된 결과는 면역적격 형질 전환 동물에서 발생하는 자발적 NB 뿐만 아니라 NB 이종이식편으로부터 종양을 없애는 데 PEG-[SN22]4가 상당한 효능이 있음을 보여준다. 대부분의 동물은 치료 시작 후 180-200일 동안 무사고 생존(event-free survival)(EFS)에 정의된 바와 같이 "치료"되었다. 단일 내화학성 EWS 계통 및 단일 융합 양성 RMS 계통을 옆구리 이종이식편으로서 치료하였을 때 유사한 결과가 얻어졌다. 따라서, PEG-[SN22]4는 공격적인 소아 고형 종양의 이러한 동물 모델 및 본원에 기술된 다른 조건에서 장기 EFS를 얻는 데 단일 제제로서 효과적이다.
세포주. 고위험 NB의 주요 유전자형(MYCN 증폭, 1p36 결실, ALK 돌연변이)뿐만 아니라 케모-나이브 및 내화학성 종양(SY5Y, IMR5, NLF, SKNBE2C) 모두를 나타내는 4개의 NB 세포주 패널을 모든 시험관내 및 생체내 연구에 사용할 수 있다. 세포는 10% 우태아 혈청(Cellgro)이 있는 RPMI-1640(Gibco)에서 성장하고 95% 공기 및 5% CO2의 가습 대기에서 유지된다. 세포는 포스페이트 완충 염수(PBS) 중 0.02% Na4 EDTA를 사용하여 수집된다. 사용되는 RMS 계통은 RH18 및 RH30(배아, 폐포)이고; EWS 계통은 TC32 및 TC71(진단, 재발)이고; OS 계통은 U2OS 및 SAOS2이다.
마우스. Jackson Laboratories의 6주령 Foxn1nu/Foxn1nu(JAX stock # 007850) 마우스가 사용된다. 마우스는 12시간 간격으로 설정된 명암 주기로 습도 및 온도 제어 조건에서 유지된다. 이 마우스는 129-SvJ 배경에 있다. 트랜스유전자에 대해 동형 접합인 마우스는 일반적으로 4 내지 5주 이내에 종양이 발생한다.
옆구리 이종이식 . 마우스에 0.1 ml의 Matrigel(Corning, Tewksbury, MA)에 현탁된 1 x 107개의 NB 세포를 오른쪽 옆구리에 SQ 주사한다. 종양은 캘리퍼(caliper)를 사용하여 2차원(mm)으로 수동으로 2회/주 측정된다. 체적(cm3)은 다음과 같이 계산된다: [(0.523 x L x W2)/1000)], 여기서 L> W. 체중을 2회/주 얻고, 체중이 >10% 변화하면 치료 용량을 조정한다. 마우스(암당 n = 10)는 종양 부피가 0.2 cm3(2)에 도달하면 4주 동안 1회/주 꼬리 정맥 주사로 PEG-[SN22]4에 의해 치료받는다. PEG-[SN22]4는 10 mg/kg/용량으로 제공되고; CPT-11(CPT-11; 15 mg/kg) 또는 비히클 단독은 양성 및 음성 대조군으로 사용된다.
동소 이종이식 . 루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 NB 세포를 동물 당 106개 세포로 무흉선 누드(nu/nu) 마우스의 신장 위의 지방 패드에 이식한다. 종양을 확인하고, 이후 Living Image Software(Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA)과 결합된 생체 발광 이미징 시스템(Perkin Elmer, Santa Clara, CA)을 사용하여 주 2회 종양 부담을 모니터링한다. 종양 크기가 1 cm3 도달한 후(접종 후 ~28일), 종양이 있는 마우스를 10 마리의 동물 그룹으로 무작위로 분류하고, 상기와 같이 단일 120 ㎕ 용량의 PEG-(SN22)4, CPT-11 또는 비히클을 IV 투여한다.
PEG-[SN22]4 및 CPT-11의 약동학 분석 . 옆구리 이종이식편을 갖는 마우스(암당 n = 3, 시점 당)는 꼬리 정맥을 통해 10 mg/kg로 PEG-[SN22]4 또는 15 mg/kg IV로 CPT-11의 단일 용량을 제공받는다. CPT-11은 간에서 활성 SN38로 전환해야 하는 프로드러그이기 때문에 용량이 더 낮다. 혈액은 안와 및 말단 출혈로 채취하고 나트륨 헤파린(BD)을 함유하는 2 ml 수집 튜브에 수집된다. 조직(종양, 폐, 간, 비장, 신장)은 냉염수로 심장 관류 후 4, 12, 24, 48 및 72시간에 희생 후 수집되고, CHOP 약리학 코어에 의해 분석된다. 총 SN38, SN22 및 CPT-11 수준은 마우스 혈액(물로 1 : 1 희석) 및 조직 균질액에서 UPLC-MS/MS로 분석된다.
실시예 3: [PEG-SN38-BG]8
1. 삼분 폴리머 기반 프로드러그 합성
본원에 기술된 프로드러그는 인 시츄(in situ) 절단 가능한 에스테르 결합을 통해 멀티암 또는 선형 PEG 담체에 각각 연결된 8개 또는 2개의 약물-리간드 하이브리드 분자를 지닌다. 알콕시아세틸 기의 강력한 전자 치환 효과로 인해 일반(아실) 에스테르에 비해 가수 분해 불안정성 및 활성화 속도가 증가한다.
먼저, N-Boc로 보호된 아미노메틸페녹시헥산산을 4-N,N-디메틸아미노피리딘 토실레이트(DPTS)를 촉매로서, 1,3-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC))를 카르복실 기에 대한 활성화제로서, 그리고 디클로로메탄을 용매로서 사용하여 85% 수율로 SN-38(AstaTech, Bristol, PA)에 컨쥬게이션시켰다. 보호기를 트리플루오로아세트산으로 제거하고, 컨쥬게이트를, 구아니디닐화제로서 1,3-디-Boc-2-(트리플루오로메틸설포닐)구아니딘을 사용하여 테트라하이드로푸란 및 디클로로메탄의 1:1 혼합물 중에서 반응시켰다(수율: 75%). 이후, 가수 분해 절단 가능한 6-헥사노일 스페이서를 통해 연결된 Boc-보호된 BG 및 SN-38의 소분자 컨쥬게이트를, 또한 DPTS, DCC 및 디클로로메탄을 각각 촉매, 활성화제 및 용매로서 사용하여 카르복실화된 8-암 PEG(JenKem Technology, Mn = 37390 Da, PDI = 1.06)에 부착시켰다
정제를 위해, 폴리머를 벤젠 용액에서 디에틸 에테르로 침전시키고, 황산나트륨 수용액(21 % w/w)으로 세척하여 잔류 DPTS를 제거하였다. 이동성 화합물의 부재가 이 단계에서 TLC 분석(실리카 겔, 클로로포름-아세토니트릴, 7:3)에 의해 확인되었다. 끝으로, 보호기를 트리플루오로 아세트산으로 처리하여 구아니딘 모이어 티로부터 제거하였다. 얻어진 [PEG-SN38-BG]8 폴리머를 디에틸 에테르로 세척하고 진공에서 건조시켰다. 생성물의 구조 및 기능화 효율을 1H NMR로 분석하였으며, 0.18 mmol/g(7.1 중량%)의 SN-38 및 등가량의 이 폴리머와 관련된 BG를 나타냈다. 순도는 TLC 및 1H NMR 분석 둘 모두로 확인되었다.
2. 표적 종양 치료를 위한 흡수.
8-암 PEG 기반 및 BG 기능화된 프로드러그로서 전달된 SN-38인, [PEG-SN38-BG]8는 kg 당 10 mg SN-38에 상응하는 등가 용량에서, 1시간, 4시간 및 24시간에 각각 여러 배 더 높은 농도: 2.82±0.53 ㎍/g, 4.46±1.59 ㎍/g 및 2.63±0.85 ㎍/g로 종양에서 안정적으로 존재하였으며(도 11), 이는 폴리머 프로드러그 기반 전달이 표준 치료에 반응하지 않는 불응성 종양의 성장을 억제하는 데 필요한, 안정한 치료 효과적인 약물 수준을 제공할 수 있음을 시사한다.
약물 내성 NB 세포주 BE(2)C에 대해 보고된 25 ng/ml의 치료 역치보다 두 자릿수배 더 큰 수준에서 SN-38의 지속적인 종양내 존재와 일치하여 [PEG-SN38-BG]8로서 제형화되고 투여된 약물은 빠른 종양 퇴행을 일으켜, 크고 작은 동소 BE(2)C 이종이식편의 재성장을 강력하게 억제하였다(도 12A). 프로드러그의 오래 지속되는 항암 효과는 이 연구에서 등가 용량으로 투여된 이리노테칸에 의한 한계 치료 효과 및 생존 연장(20일의 t50% 생존율)과 대조적으로 무사고 동물 생존율을 현저하게 연장시켰다(각각 130일 및 88일의 t50% 생존율 대 비치료 동물의 경우 12일, 도 12B).
중요하게는, 이 모델에서 이리노테칸의 한계 효과는 공격적이고 불응성인 인간 NB 환경에서 지속적이고 임상적으로 의미있는 반응을 달성하는 데 있어 치료적 과제를 개괄하는 전임상 평가 접근법의 적절성을 입증한다. 동시에, [PEG-SN38-BG]8은 8회 용량(24일에 투여된 마지막 용량)으로 이루어진 치료 기간 동안 및 그 이후에 진행이 관찰되지 않고 빠른 종양 수축을 유발하고 질병을 안정화시킬 수 있었다. 놀랍게도, 설사, 피부 텐팅(탈수로 인한), 피부 궤양, 식욕 부진, 악액질 또는 체중 증가 지연과 같은 전신 독성의 징후가 [PEG-SN38-BG]8 프로드러그로 치료하는 동안 관찰되지 않았다.
3. NET 발현 증진제는 흡수-1 표적 프로드러그의 성능을 더욱 향상시킬 수 있다.
토포이소머라제 I 억제제와 대체로 중복되지 않는 독성 프로파일을 갖는 강력한 pan-HDAC 억제제인 보리노스타트(vorinostat)는 DNA 파손 복구 효소의 발현을 억제하고, DAN 손상 유도 아폽토시스를 촉진함으로써 NB 종양에서 NET 발현을 실질적으로 증가시키고, 캄프토테신 약물에 대해 종양 세포를 민감화시키는 것으로 나타났으며[44], 두 효과는 SN-38의 BG-기능화된 프로드러그를 사용하여 신경 내분비 종양의 표적 치료를 강화하는 것과 관련된다. [PEG-SN38-BG]8 대 SN-38에 의한 BE(2)C 세포 성장 억제에 대한 보리노스타트의 강화 효과를 조사하였다.
보리노스타는 [PEG-SN38-BG]8의 항증식 효과를 현저하게 강화시켰지만(z = z 0 + A·x + B·y + C·[x·y]에서 상호작용 항 C에 대해 p< 0.0001, 도 13A), 또한 화학적으로 비개질된 SN-38와는 적당히 상승작용하였다(C에 대해 P = 0.087, 도 13B). 이것은 BG 기능화된 프로드러그에 의한 NB 세포 성장 억제의 보다 큰 향상을 추가하는, 보리노스타트에 의해 나타난 조합된 NET 발현 관련 및 비관련 약물 강화 메커니즘과 일치한다. 특히, 보리노스타트가 프로드러그의 작용을 강하게 강화시킨 낮은 마이크로몰 농도 범위(1-5 μM)에서, 자체 BE(2)C 세포 성장 억제 효과는 NB의 전임상 모델에서 보리노스타트의 중간 정도의 단일 제제 활성과 일치하여 단지 중간 정도였다(도 13A).
4. 내화학성 NB 세포의 프로드러그 매개 성장 억제 및 약리학적 강화.
프로드러그 구조에 포함된 표적 리간드의 특이적인 기여도를 평가하기 위해, NET-발현, 내화학성 NB 세포에 대한 [PEG-SN38-BG]8의 세포 성장 억제 활성을, 유사하게 구성되지만 BG 모이어티가 없는 대조군 분자인, [PEG-SN38]8의 세포 성장 억제 활성과 비교하였다. 추가로, NB 세포 및 종양 이종이식편에서 NET 발현을 상향 조절하고, 흡수-1을 향상시키는 것으로 나타난 pan-HDAC 억제제가 NET-발현 NB 세포에 대한 [PEG-SN38-BG]8의 항증식 효과를 강력하게 강화한다는 사실을 확인하여(도 13), HD 1형 하위계열(엔티노스타트(entinostat))에 대해 특이성을 갖는 선택적 HDAC 억제제가 [PEG-SN38-BG]8과도 상승 작용할 것이라는 가설이 해결되었다.
내화학성 NB 세포의 증식을 억제하는 능력의 큰 차이는 BG 리간드 없이 어셈블링된 이분 대조군 구성물과 삼분 프로드러그 사이에서 관찰되었다. NET-발현 BE(2)C 세포의 성장은 직접 약물-세포 접촉의 시험관 내 조건에서 유리 SN-38의 효능에 필적하는 높은 효능으로 [PEG-SN38-BG]8에 의해 억제된 반면, 이분 구성물인, [PEG-SN38]8은 현저하게 덜 효과적이었으며(도 14A), 이는 삼분 설계의 중요성 및 항증식 반응을 향상시키는 데 있어 BG의 역할을 시사한다. 별도의 연구에서, 프로드러그 매개 NB 세포 성장 억제에 대한 강력한 강화 효과가 HDAC1 특이적 차단제인 엔티노스타트에 대해 나타났다(도 14B, 상호작용 항 C에 대해 p <0.001). 흥미롭게도, 이 발견은 후생적 작용 방식을 갖는 매우 선택적인 비화학 요법제인 엔티노스타트가 화학적으로 구별되는 pan-HDAC 억제제인 보리노스타트와 유사하게 흡수를 향상시킴으로써 BG 기능화된 치료제와 상승작용할 수 있음을 시사한다.
5. NET-표적 프로드러그로 제형화된 SN-38의 비교 종양 흡수 및 체류.
프로드러그 기반 치료 전략의 효과는 빠른 종양 흡수 및 [PEG-SN38-BG]8 삼분 프로드러그로 전달된 SN-38의 지속적인 종양내 체류를 보여주는 연구에서 입증되었다(도 11 및 표 2). 임상적으로 사용되는 약리학적 비활성 전구체(이리노테칸)의 형태로 투여된 SN-38과 달리, 프로드러그 기반 전달은 내화학성 NB 세포, BE(2)C의 성장을 억제하는 데 요구되는 보고된 SN-38 농도보다 약 두자릿수배 더 높은 수준에서 SN-38의 국소화 및 지속적인 종양내 존재를 달성한다. HPLC 분석을 사용하여 큰 동소 BE(2)C 이종이식편(1.0±0.4 cm3, n = 5)에서 분석이 수행되었다.
표 2. 종양 그램 당 용량%로 표시되는 종양내 약물 수준(평균±SD로 표시)
Figure pct00006
6. [PEG-SN38-BG]8 프로드러그는 종양 퇴행을 유발하고, 기존 요법에 대한 일시적인 반응 만을 보여주는 공격적인 NB 모델에서 "치료"를 달성한다.
공격적인 NB 종양에 대한 지속적인 항암 효과를 제공하는 삼분 프로드러그 전략의 효과는 동소 IMR-32 이종이식 모델에서 실험적으로 보여졌다(도 15). 4주에 걸쳐 주 2회 투여된 [PEG-SN38-BG]8은 케모-나이브 MYCN 증폭 질환 모델에서 후속 재성장없이 빠른 종양 수축을 일으켰다. 이것은 SN-38 전구체인 이리노테칸으로 치료된 동물 그룹에서 치료 중단 직후에 종양이 재성장하기 시작하는 것과 대조적이다(도 15A, B). 불응성 질환의 BE(2)C 이종이식 모델(도 12)에서 프로드러그 접근법의 효과를 입증하는 결과와 함께, 이것은 기존의 화학 요법에 대해 제한되거나 반응이 없음을 보여주는 고위험 NB의 맥락에서 삼분 프로드러그 기반 전달을 뒷받침하는 강력한 증거를 제공한다.
7. 삼분 구성물은 다중약물 내성, 고위험 신경모세포종에 대한 치료제로서의 가능성을 보여준다.
노르에피네프린 수송체(NET) 표적 폴리머-결합 프로드러그로서 제형화되고 4주에 걸쳐(2회/주) 투여된 SN-38은, 빠른 종양 퇴행을 야기하고, 내화학성 동소 BE(2)C 이종이식편의 재성장을 완전히 억제하고 무사고 생존을 현저하게 연장시켰다(>14 주, 도 16A). 이는 이 모델에서 항종양 효과가 없는 이리노테칸과 대조적이며, 또한 치료 기간 동안에만 종양 성장을 억제한 이분 대조군[PEG-SN38]4에 비해 극적인 개선이다(도 16A). 더욱이, 이리노테칸으로 치료받는 동안 빠르게 큰 종양(2 cm3)이 발생한 동물을 [PEG-SN38-BG]8로 전환하면 종양이 줄어들고 > 12주에 대해 검출할 수 없는 상태로 유지된다("구조" 연구, 도 16B).
중요하게는, 이리노테칸에 의해 나타난 항종양 효과의 결여는 초고위험 NB 환자에서 나타나는 반응의 결여와 유사하게 전임상 모델이 불응성 NB의 임상적 거동을 충실하게 개괄함을 보여준다. 놀랍게도, [PEG-SN38-BG]8에서 나타난 지속적이고 깊은 치료 효과는 전신 독성(설사, 피부 텐팅 또는 궤양, 식욕 부진, 악액질 또는 체중 증가 지연)의 징후를 동반하지 않았다.
치료적으로 덜 어려운 케모-나이브 질환을 모델링한 실험 환경에서 테스트한 경우, 이리노테칸은 치료 기간(4주) 동안 종양 성장을 억제할 수 있었지만, 같은 기간에 걸쳐 투여된 [PEG-SN38-BG]8은 NB 종양을 완전히 제거하였다(30주 후 검출 가능한 재성장 없음, 도 17). 이러한 결과는 폴리머 담체 연결 프로드러그를 사용한 NET-표적 전달이 공격적인 MYCN 증폭 NB의 여러 단계(새로 진단되거나 재발된)를 성공적으로 치료하도록 최적화될 수 있다는 증거를 제공한다.
8. [PEG-SN38-BG]8 프로드러그는 전이성 약물 내성 NB 모델에서 퇴행을 일으키고 파종성 종양 침착물의 재성장을 억제한다.
전이성 불응성 질환의 마우스 모델에서 파종성 내화학성 NB에 대한 지속적인 치료 효과를 달성하는 데 있어 삼분 프로드러그 기반의 NET-표적 약물 전달의 효과를 평가하였다(도 18). 4주에 걸쳐 투여된 [PEG-SN38-BG]8은 확립된 다초점 종양 침착물의 빠른 제거를 야기하였으며, >15주 동안 검출 가능한 재성장이 없었다. 대조적으로, 15 mg/kg의 용량으로 주 2회 주어진 이리노테칸은 질병 진행에 큰 영향을 미치지 않았다(도 18A, B). 동소 불응성 종양에 대한 NET-표적 삼분 프로드러그의 실험적으로 입증된 효과와 함께(도 16), 이러한 결과는 프로드러그 설계 전략에 대한 이론적 근거 및 기존 요법에 반응하지 않는, 국소 및 파종성의, 고위험 질환 둘 모두에 대한 치료 잠재력을 강력하게 뒷받침한다.
9. MYCN 증폭된 다중 약물 내성 NB 세포의 프로드러그 매개 성장 억제.
내화학성 NB 세포[BE(2)C]를, NET-표적 삼분 프로드러그(PF68-SN38-BG) 대 비표적 이분 대조군(PF68-SN38) 및 유리 SN-38로 치료한 경우, 반응 패턴에서 큰 차이가 관찰되었다. p53 기능 상실을 보여주는 BE(2)C의 내화학성 표현형과 일치 하여, BE(2)C 세포 성장은 유리 SN-38에 의해 약간 억제되었다. 또한, PF68-SN38에 대해 제한적이고 일시적인 반응을 나타냈다. 블랭크 플루로닉 F-68은 세포 성장에 영향을 미치지 않았다. 그러나, ≥ 5 nM 용량의 SN-38에서 PF68-SN38-BG에 15분 노출되면 강력하고 지속적인 항증식 효과가 나타났다(도 19).
프로드러그 설계에 들어 있는 NET 친화성의 특정 기여도를 평가하기 위해, PF68-SN38-BG의 BE(2)C 성장 억제 활성을 특정 NET 차단제(니속세틴, 1 μM) 유무에 따라 테스트하였다. 대조군으로서 포함된 이분 PF68-SN38은 ≤ 20 nM 용량의 SN-38에서 가장 낮은 성장 억제 활성을 나타냈다. 삼분 PF68-SN38-BG의 효과는 현저히 더 강했지만(P = 0.020), NET 차단에 의해 부분적으로 가역적이었으며(도 20), 이는 NET 표적화의 역할을 확인시켜 준다.
이러한 결과와 일치하여, 플루로닉 F-108을 사용하여 유사하게 합성되고, 4 주(2회/주)에 걸쳐 투여된 삼분 NET-표적 프로드러그는 이 불응성 NB 모델에서 이리노테칸의 한계 효과와 대조적으로 동소 BE(2)C 이종이식 종양의 빠른 퇴행을 일으켰다(도 21A, 20A). 또한, 이분 PF108-SN38과 대조적으로, 삼분 프로드러그는 전체 치료 기간 동안 진행되지 않고 질병을 안정화시켰다. 더욱이, 종말점에 빠르게 접근하는 동물은 프로드러그로 치료한 경우 현저한 종양 수축을 나타냈다("구조" 연구, 도 21B)
10. 동소 NB 이종이식편에서 PEG-[SN38]4에 대한 PEG-[SN22]4의 비교
PEG-[SN22]4를 내화학성 NB 계통 SKNBE(2)C를 갖는 동소 NB 이종이식편에서 PEG-[SN38]4와 비교하였다. BE(2)C 세포를 루시퍼라제 발현 벡터로 트랜스펙션시켜 생물 발광 이미징을 가능하게 하였다. 마우스는 PEG-[SN22]4(10 mg/kg/용량), PEG-[SN38]4(10 mg/kg/용량) 또는 CPT-11(15 mg/kg/용량)으로 4주 동안 주 1회 치료되었다. 이 내화학성 모델에서 CPT-11은 거의 효과가 없었던 반면, PEG-[SN22]4 및 PEG-[SN38]4는 둘 모두 종양 수축에 매우 효과적이었다(도 22). PEG-[SN22]4 치료는 2-3 주까지 종양이 완전히 사라졌지만, 작은 종양이 PEG-[SN38]4 치료된 마우스에서 계속 보였다. 이것은 PEG-[SN22]4가 이 인간 NB 이종이식 마우스 모델에서 우수한 효능을 갖고 있음을 시사한다.
본 발명이 특정 구체예를 참조하여 본원에서 예시되고 설명되었지만, 본 발명은 상기 기술된 세부 사항으로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명에서 벗어나지 않고 청구 범위의 등가물의 범위 및 범위 내에서 세부 사항에서 다양한 수정이 이루어질 수 있다.

Claims (25)

  1. 캄프토테신 유사체(camptothecin analog)의 적어도 두 개의 분자가 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴록사머 폴리머에 공유 결합되는, 거대분자 프로드러그(macromolecular prodrug).
  2. SN22 유사체의 적어도 두 개의 분자가 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 PEG 폴리머에 공유 결합되는, 거대분자 프로드러그.
  3. 캄프토테신 유사체의 적어도 두 개의 분자가 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 폴록사머 폴리머에 공유 결합되고, 적어도 하나의 캄프토테신 유사체는 적어도 하나의 NE 수송체(NET) 리간드로 기능화되는, 거대분자 프로드러그.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 캄프토테신 유사체가 SN22(7-에틸-캄프토테신), SN38(7-에틸-10-하이드록시-캄프토테신) 또는 이들의 조합인, 거대분자 프로드러그.
  5. 제3항에 있어서, 폴리머가 폴록사머(poloxamer) 폴리머인, 거대분자 프로드러그.
  6. 제3항에 있어서, 폴리머가 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 폴리머인, 거대분자 프로드러그.
  7. 제2항 또는 제3항에 있어서, 폴리머가 멀티-암(multi-arm) PEG 폴리머인, 거대분자 프로드러그.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 캄프토테신 유사체의 두 개의 분자가 폴리머에 공유 결합되는, 거대분자 프로드러그.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 캄프토테신 유사체의 4개의 분자가 폴리머에 공유 결합되는, 거대분자 프로드러그.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 캄프토테신 유사체의 2 내지 4개의 분자가 폴리머에 공유 결합되는, 거대분자 프로드러그.
  11. 제3항에 있어서, NE 수송체(NET) 리간드가 생리적 조건 하에서 불안정한 에스테르 결합을 통해 캄프토테신 유사체에 공유 결합되는, 거대분자 프로드러그.
  12. 제3항에 있어서, 캄프토테신 유사체가 SN-38인, 거대분자 프로드러그.
  13. 제3항에 있어서, NE 수송체(NET) 리간드가 벤질구아니딘(BG)인, 거대분자 프로드러그.
  14. 제3항에 있어서, NE 수송체(NET) 리간드가 페네틸구아니딘 또는 티라민인, 거대분자 프로드러그.
  15. 제3항에 있어서, NE 수송체(NET) 리간드와 캄프토테신 유사체 사이의 에스테르 결합이 옥시헥사노일 에스테르인, 거대분자 프로드러그.
  16. 제3항에 있어서, NE 수송체(NET) 리간드와 캄프토테신 유사체 사이의 에스테르 결합이 옥시에톡시프로파노일 또는 옥시에톡시에톡시프로파노일 에스테르인, 거대분자 프로드러그.
  17. 제1항에 있어서, PF108-(SN22)2인, 거대분자 프로드러그.
  18. 제2항에 있어서, PEG-[SN22]4인, 거대분자 프로드러그.
  19. 제3항에 있어서, [PEG-SN38-BG]8인, 거대분자 프로드러그.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 에스테르 결합이 옥시아세테이트 에스테르 결합인, 거대분자 프로드러그.
  21. 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 거대분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 신경모세포종을 치료하는 방법.
  22. 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 거대분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 고형 종양이 있는 대상체를 치료하는 방법.
  23. 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 거대분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 뇌종양이 있는 대상체를 치료하는 방법.
  24. 유효량의 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 거대분자 프로드러그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
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