KR20210071950A

KR20210071950A - 정밀하게 조작된 잠행성 메신저 rna 및 다른 폴리뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20210071950A
Application number: KR1020217006597A
Authority: KR
Inventors: 유수프 에르쿨; 부락 일마즈
Original assignee: 커날 바이오로직스, 인크.
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2021-06-16
Also published as: JP2021533826A; EP3833360A1; CA3109222A1; WO2020033720A1; US20210317179A1; CN113286597A; AU2019319911A1; EP3833360A4

Abstract

본 기재 내용은 폴리뉴클레오티드 서열 내의 면역원성 모티프를 정밀하게 서열 조작함으로써, 긴 폴리뉴클레오티드 서열에서 면역원성을 낮추는 방법에 관한 것이다. 본 기재 내용은 추가로 개선된 기능성을 갖는, 예컨대 낮은 선천성 면역원성, 개선된 안정성 또는 높은 단백질 발현을 나타내는 정밀하게 서열 조작된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드에서, 면역원성 서열 모티프는 제거되는 반면, 서열의 나머지 부분은 보존된다. 전체 뉴클레오티드 변화에 대한 이러한 표적화된 조작 접근법은 고유의 장점을 갖는데, 이는 자연적인 또는 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열의 붕괴가 적고, 게다가 높은 발현성이 보존되나, 선천성 면역 수용체에 대한 잠행(stealthiness)이 가능하다는 점을 포함한다.

Description

정밀하게 조작된 잠행성 메신저 RNA 및 다른 폴리뉴클레오티드

서열 목록의 참고에 의한 포함

2018년 8월 9일자에 생성된 ASCII 텍스트 파일(명칭: Sequence Listing Kernal.txt, 6KB) 내의 서열 목록은, EFS-Web을 통해 미국 특허청(United States Patent and Trademark Office)에 제출되었으며, 본원에 인용되어 포함된다.

메신저 리보핵산(mRNA) 분야는 현대 의학에서 많이 응용되고 있다. mRNA를 치료 목적으로 사용하기 위해서는 이의 선천성 면역원성의 감소가 매우 중요하며, 그렇지 않는 경우 시토카인 분비부터 RNA 분해 및 번역 정지(stalled translation)에 이르는 범위까지의 일련의 원치않는 효과를 발생시킬 수 있다. 통상 시험관내 전사(IVT: in vitro transcription) 반응을 통해 제조되며 단일-가닥 및 캡핑된 mRNA 둘 다를 생성할 수 있는 외인성 mRNA, 뿐만 아니라 예컨대 이중 가닥 및/또는 캡핑되지 않은 mRNA로서의 부산물을 인식하는 몇몇 선천성 면역 수용체가 인간에서 확인되었다(문헌[Sahin 등, 2014, Nat Rev Drug Discov, 13:759-80]). 선천성 면역계의 수용체는 캡핑되지 않은 RNA, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 및 단일 가닥 RNA(ssRNA)의 센서를 포함한다(문헌[Schlee & Hartmann, 2016, Nat Rev Immunol, 16:566-580]). 이 수용체들 중에서, RIG-I는 5' 트리포스페이트(5'PPP) 또는 캡 0 구조를 갖는 무딘-말단(blunt-ended) dsRNA에 결합하는 반면(문헌[Schuberth-Wagner 등, 2015, Immunity. 43:41-52]), IFIT1은 5' 트리포스페이트(5'PPP) 또는 캡 0 구조를 갖는 ssRNA에 결합한다(문헌[Abbas 등, 2013, Nature. 494:60-64]; 문헌[Abbas 등, 2017, PNAS, 114:E2106-E2115]). 캡 Ⅰ 구조를 얻기 위한 효율적인 캡핑 및/또는 IVT mRNA의 포스파타제 처리에 의해, 이러한 캡핑되지 않은 RNA 센서들을 회피할 수 있다(문헌[Warren 등, 2010, Cell Stem Cell. 7:618-30]; 문헌[Ramanathan 등, 2016, Nucleic Acids Res. 44:7511-7526]). dsRNA를 감지하는 수용체는 TLR3, MDA5, PKR 및 OAS1을 포함하는데(문헌[Schlee & Hartmann, 2016, Nat Rev Immunol, 16:566-580]), mRNA의 정제에 의해 이들을 회피하여 IVT 반응의 이중 가닥 RNA 산물을 제거할 수 있다(문헌[Kariko 등, 2011, Nucleic Acids Res. 39:e142]; 문헌[Person 등 2014], USPTO 특허 출원: US 2014/0328825 A1).

ssRNA(단일 가닥 ORN 및 siRNA 이중체의 개별 가닥들)에 결합하는 선천성 면역 수용체는 TLR7 및 TLR8을 포함하는데, 이는 매우 상동성이 있다(highly homologous)(문헌[Wang 등, 2006, J Biol Chem, 281:37427-37434]; 문헌[Matsushima 등, 2007, BMC Genomics, 10.1186/1471-2164-8-124]; 문헌[Wei 등 2009, 단백질 Sci., 18:1684-1691]). 또한 siRNA를 포함하는 이중 가닥 RNA도, 엔도좀 내에서 이중 가닥 RNA의 두 가닥이 단일 가닥 RNA로 분리된 후, TLR7 및 TLR8에 의해 인식될 수 있다(문헌[Goodchild 등, 2009, BMC Immunology, 10:40]). 이 수용체들이 자극될 때, 세포내 NF-κB 및 IRF-3 신호전달 경로가 활성화되고, 뒤이어 이것은 IFN-알파(TLR7) 및 TNF-알파 및 IL-12p40(TLR8)의 분비를 유도한다(문헌[Gorden 등 2005; J Immunol., 174:1259-1268]; 문헌[Forsbach 등, 2008, J Immunol., 180:3729-3738]). 최근 이 단백질들의 결정 구조가 해결되었고(문헌[Tanji 등, 2015, Nat Struct Mol Biol. 22:109-115]; 문헌[Zhang 등, 2016, Immunity. 45:737-748]), 이들의 리간드 결합 부위가 확인되었다(문헌[Wei 등, 2009, Wei 등 2009, Protein Sci., 18:1684-1691]; 문헌[Ohto 등, 2014, Microbes Infect. 16:273-282]). 이들 연구에서는 2개의 별도의 리간드 결합 도메인이 발견되었는데: 하나는 단일 뉴클레오시드(TLR7에 대해서는 구아노신, TLR8 에 대해서는 우리딘)에 결합하고, 다른 하나는 짧은 올리고리보뉴클레오티드(ORN)에 결합한다. 두 도메인 모두에서, 리간드 결합은 이 수용체들을 이량체화하고 활성화하는데 필요하다. 구조 생물학 연구는 TLR7/8 리간드에 대한 이전의 연구와 동일 선상에 이는데, 이는 TLR7/8의 활성자가 될 U- 및 GU-풍부 ORN 서열을 일관되게 보여주었다(문헌[Judge 등 2005, Nat Biotechnol, 23,457-462]; 문헌[Heil 등, 2004, Science,(80)303:1526-1529]; 문헌[Hornung 등, 2005, Nat Med., 10.1038/nm1191]). 몇몇 그룹은 TLR7 및/또는 TLR8에 대해 높은 촉진 활성을 갖는 특이적인 ssRNA 서열들을 식별하였다(문헌[Diebold 등, 2006, Eur J Immunol. 10.1002/eji.200636617]; 문헌[Forsbach 등, 2008, J Immunol., 180:3729-3738]; 문헌[Jurk 등, 2011, Nucleic acid Ther. 21:201-214, Green 등, 2012, J Biol Chem. 287:39789-39799]). Jurk 등(2011)은 이들 ssRNA의 다양한 유도체들을 시험하여, TLR7/8 결합을 위한 ssRNA 서열 모티프를 식별하였다. 이들은 (IFN-a 분비에 기초하여) 인간 TLR7에 대해서는 UCW 모티프(여기에서, W는 U 또는 A임)를 나타내고, (IL12p40 분비에 기초하여) 인간 TLR8 자극에 대해서는 KNUNDK 모티프(여기에서, N은 임의의 뉴클레오티드이고, K는 G 또는 U이고, D는 C를 제외한 임의의 뉴클레오티드임)를 나타낸다.

정제되고 캡핑된 IVT mRNA는 RIG-I, IFIT, PKR, MDA5, OAS 및 TLR3를 회피할 수 있으나, 인간 세포에서는 TLR7 및 TLR8에 의해 인식되지 않는다. 이러한 인식은 비-표준 뉴클레오티드, 예컨대 슈도우리딘(pseudouridine), N1-메틸-슈도우리딘, 메톡시-우리딘 및 2-티오우리딘을 mRNA에 포함시키거나(문헌[Kariko, 2005, Immunity. 23:165-75]; 문헌[Kariko, 2008, Mol Ther. 16:1833-40]; 문헌[Kormann 등, 2011, Nat Biotechnol. 29:154-157]; 및 문헌[Andries 등, 2015, J Control Release. 217:337-344]), 또는 mRNA의 전체 뉴클레오티드 함량의 변화를 통해 mRNA 서열을 거칠고/비정확하게(unrefined/crude) 조작함으로써 회피할 수 있다. 후자의 접근법은 mRNA의 GC 함량을 증가시키거나(문헌[Thess 등, 2015, Mol Ther. 23:1456-64]; 문헌[Schlake 및 Thess, 2015]), A를 증가시키거나, U 또는 GU 함량을 감소시킴으로써 이루어질 수 있다(문헌[Kariko & Sahin, 2017], WIPO 특허 출원 번호: WO 2017/036889 A1). 암호화 영역에 대해서는, 이러한 서열 조작은 주로 mRNA 상의 코돈의 3번째 뉴클레오티드를 변화시킴으로서 이루어진다. 유전적 코드의 중복성(redundancy) 때문에, 서열 조작으로 인해 암호화된 단백질의 아미노산 서열이 변화하지는 않는다. 이 방법은 전달 유전자(transgene)의 단백질 발현 수율을 개선시키기 위해 분자 및 합성 생물학에서 통상 사용되는 기술인 코돈 최적화와 유사하다(문헌[Quax 등, 2015, Mol Cell. 59:149-161]) 그러나, IVT mRNA 서열 조작의 경우, 주요 목표는 IVT mRNA가 신체 내에서 RNA 센서에 대해 잠행성(stealthy)이거나, 상기 센서가 이를 감지하지 못하게(invisible) 하는 것이다.

화학적 변형체, 예컨대 슈도우리딘은 특히 반복된 형질감염시, 선천성 면역원성을 감소시키기는 하나 완전히 없애지는 않는다(문헌[Liang 등, 2017, Mol Ther. 25(12):2635-2647]). 추가로, 일부 RNA 센서의 자극은 바람직할 수 있지만, 다른 것들의 자극은 원치않는 mRNA의 가능한 치료 용도들이 있다. 예를 들어, 단지 TLR7 결합 활성만을 갖는 mRNA는, IFN-알파 분비가 항종양 면역을 유도하거나 부스팅시킬 수 있는 일부 면역-항암제(immuno-oncology) 응용에서 바람직할 수 있다. 화학적 변형체는 일부 센서의 회피 및 다른 것들의 자극을 허용하지 않는다.

인간 게놈 내에서 암호화 영역의 GC 함량은 52%이고(문헌[Merchant 등, 2007, Science. 318(5848):245-50]), 이의 뉴클레오티드의 1% 미만은 비-표준적인 것이다(문헌[Li et al, 2015, Nat Chem Biol, 11(8):592-7]). mRNA 화학 또는 서열이 자연적인(세포내) 인간 mRNA로부터 더 많이 변형되어 (IVT mRNA의 선천성 면역원성을 감소시킴에 따라), 의도치 않은 결과를 가질 위험성이 증가한다. 전체 뉴클레오티드 함량 변화 접근법을 통한 화학적 변형 및 서열 조작은 둘 다 거칠고/비정확한 방법인데, 이는 파괴적일 수 있고, 예컨대 (5-메틸-시티딘, 6-메틸아데노신, 및 2-티오-우리딘 변형체에 대해서는) 번역 감소(문헌[Kariko 등, 2015, Mol Ther, 16(11):1833-40]) 또는 잠재성(cryptic) 펩티드 형성(문헌[Mauro & Chappell, 2014, Trends Mol Med. 2014 Nov;20(11):604-13]; 문헌[Mauro 등, 2018, BioDrugs, 32:69-81])과 같은 문제점을 갖는다. 추가로, 인간 mRNA "후성전사체(epitranscriptome)" 내에서는, 화학적으로 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 m6A 및 슈도우리딘이 균일하게 분포하지 않는다(문헌[Carlile 등, 2014, Nature. 515:143-6]; 문헌[Dominissini 등, 2016, Nature. 530:441-446]). 예를 들어, 포유류 정지 코돈에 위치한 우리딘은 슈도우리딜화(pseudouridylation) 모티프를 포함하지 않고(문헌[Schwartz et al, 2014, Cell. 159:148-162]), IVT mRNA에 슈도우리딘을 포함시키면 정지 코돈 번역초과(readthrough)를 유발하는 것으로 나타났다(문헌[Karijolich & Yu, 2011, Nature. 474:395-398]; 문헌[Fernandez et al, 2013, Nature. 500:107-110]). 추가로, 변형된 뉴클레오티드는 RNA 전사 효소(T7 RNA 중합효소) 뿐만 아니라 번역 기구의 정확성(fidelity)을 감소시킬 수 있고, 또한 단백질의 번역-후 변형을 변화시킬 수도 있다. 또한, 변형된 뉴클레오티드는 인간에서 mRNA가 RNase에 대해 내성을 갖게 하며, 혈청 내 RNA 축적은 과다응고 상태를 유발할 수 있다. 이러한 생물학적 위험들 외에도, 비-표준 뉴클레오티드의 사용은 또한 제조 비용의 상승으로 이어질 수도 있다(문헌[Hadas 등, 2017, Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 9:e1367]).

본 발명의 개요

본 발명은 인간 TLR8에 대한 결합과 관련된 면역원성 서열 모티프를 제거하기 위해 서열 조작된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 메신저 RNA)를 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)의 정밀한 서열 조작을 위한 방법을 제공하는데, 여기에서는 단지 면역원성 모티프만이 제거되나, 서열의 나머지 부분은 손상되지 않은 채로 남아있다.

일 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, mRNA)로부터 면역원성 RNA 서열 모티프인 KNUNDK를 제거하여, 인간 TLR8을 통한 선천성 면역원성을 유의하게 감소시키는 방법을 제공한다.

일 구현예에서, 본 발명은 GFP를 암호화하는 메신저 RNA를 제공하는데, 여기에서는 mRNA의 암호화 영역 내의 KNUNDK 서열 모티프에 매치되는 하나 이상의 면역원성 서열은, 그 서열을 위한 DNA 주형을 코돈 조작함으로써 제거되고, HEK 세포에 형질감염되어, 인간 TLR8을 통한 면역원성의 감소 및 높은 단백질 발현을 나타낸다.

본 발명의 일 양태는 인간 배아 신장 세포주(HEK293-TLR8 SEAP)를 KNUNDK 서열 모티프가 제거된 mRNA와 반복적으로 접촉시켜, 높은 수준의 단백질 발현을 가능하게 하나, mRNA의 선천성 면역원성을 감소시키는 단계를 포함하는 방법이다.

본 발명의 일 양태는 인간 1차 단핵구 유래 수지상 세포(MDDC)를 KNUNDK 모티프가 제거된 mRNA와 접촉시켜, 높은 수준의 단백질 발현을 가능하게 하면서도, mRNA의 본래의 TLR8 면역원성은 감소시키는 단계를 포함하는 방법이다.

본 발명의 다른 양태는 mRNA에 의한 인간 TLR8 활성화는 방지하나, 다른 RNA 센서, 예컨대 인간 TLR7 및 인간 RIG-I의 활성화는 허용하는, 신규하고 정밀한 잠행성 mRNA 조작 방법이다.

본원에 개시된 모티프 제거를 통한 정밀한 mRNA 조작 방법은, 면역원성 서열들은 제거하면서도, mRNA 내의 비-면역원성 서열들은 남겨둔다. 이러한 최소 침투성 접근법(minimally invasive approach)은 mRNA의 면역원성을 낮추면서도, 이의 번역 활성은 높은 수준으로 유지시킬 수 있다. 비정확한 서열 조작 접근법(crude sequence engineering approach)(예컨대 GC 증가, GU 감소, 또는 U 감소-기반 mRNA 조작)과는 달리, 이 접근법은 효율적인 번역을 저해하지 않으므로, 높은 수준의 단백질 발현을 보유 또는 유지하기 위해 많은 버전의 서열 조작된 mRNA들을 시험할 필요가 없다. 이 접근법은 비-표준 뉴클레오티드의 사용과는 관계가 없으므로, 번역 효율 감소, 번역-후 변화 또는 정지 코돈 번역초과와 같은 문제는 예측되지 않는다. 최종적으로, 상기 정밀한 조작은 또한 mRNA 치료제의 제조 비용도 감소시킬 수 있다.

도 1a-1b. a. 서열 조작된 eGFP mRNA 디자인. 원래의("야생형") mRNA 서열을 암호화 영역 내에서 변형하여, TLR8 모티프를 제거하거나("모티프 감소(Low Motif)"), 전체 G 및 U 함량을 감소시키거나("비정확(Crude)"), 모티프의 제거와 G 및 U의 감소("모티프 감소 + 비정확")를 둘 다 한다. 도 1. b. 뉴클레오티드 및 모티프 변화의 개요. 각각의 mRNA 디자인 접근법을 위한, 제시된 TLR8 모티프의 총 수 및 변화된 뉴클레오티드의 총 수는 표에 나타나 있다. 정밀한 (모티프 감소) 접근법은 TLR8 결합 부위는 효율적으로 제거하는 반면, 변화된 뉴클레오티드의 총 수를 최소화하였다(UTR: 비번역 영역).
도 2. 리포펙타민(Lipofectamine)을 통해, TLR8을 과다발현하는 인간 세포에 형질감염된, 조작된 eGFP mRNA의 선천성 면역원성. 야생형(WT) 및 서열 조작된 mRNA는 HPLC를 통해 정제되었고, 리포펙타민 2000(Life Technologies)을 통해 TLR8을 과다 발현하는 HEK293 세포에 형질감염되었으며, 리포터 플라스미드의 함유로 인해 (NF-KB 및 AP-1 결합 부위에 융합된 IFN-B 프로모터를 통한) TLR8 자극시 분비성 배아 알칼라인 포스파타제(SEAP)가 분비되었다. 분비된 SEAP 활성은 mRNA 형질감염 48시간 후에 측정되었다. 모티프 감소, 비정확(GU 감소), 및 모티프 감소 + 비정확한 mRNA는, 야생형(WT) mRNA에 비해 유의하게 감소된 TLR8 자극을 나타내었다(3개의 비교 모두에 대해 p<0.05). 형질감염은 정량적으로 수행되었고, 데이터는 평균 +/- 표준 편차(SD)로 나타나있다.
도 3. Trans-IT를 통해 TLR8을 과다발현하는 인간 세포에 형질감염된, 조작된 eGFP mRNA의 선천성 면역원성. 야생형(WT) 및 서열 조작된 mRNA는 HPLC를 통해 정제되었고, TransIT-mRNA 시약(Mirus Bio)을 통해 HEK293-null 세포(TLR8 발현 없음) 및 TLR8를 과다 발현하는 HEK293-TLR8 세포에 형질감염되었다. 두 세포주는 모두 리포터 플라스미드를 함유하여, (NF-KB 및 AP-1 결합 부위에 융합된 IFN-B 프로모터를 통한) TLR8 자극 시 알칼라인 포스파타제(SEAP)를 분비한다. 분비된 AP 활성은 mRNA 형질감염 24시간 후에 측정되었고, 사전-실험 SEAP 수준에 의해 정량화된 세포 수에 맞게 정규화되었다. 화학적으로 변형된("chem. mod.") mRNA 대조군은 100% 슈도-U 및 100% 5mC를 함유하였다. (HEK-Null 세포에서의 AP 활성은 기저 TLR3 발현을 통해 유발된 배경 면역 신호를 결정하기 위해 측정되었다). 모티프 감소 mRNA는, 화학적으로 변형된 mRNA와 유사하게, 야생형(WT) 및 GU 감소("비정밀") mRNA보다 유의하게 더 낮은 TLR8 자극을 나타내었다. 형질감염은 5회 실시되었고, 데이터는 평균+/-SD로 나타나있다.
도 4a-4b. a. 리포펙타민 2000을 통해 TLR8을 과다발현하는 인간 세포에 의해 형질감염된 조작된 eGFP mRNA에 의해 유발된 단백질 발현. 야생형(WT) 및 서열 조작된 mRNA는 HPLC를 통해 정제되었고, 리포펙타민 2000을 통해 TLR8을 과다 발현하는 HEK293 세포에 형질감염되었다. eGFP 발현 세포의 이미지는 형질감염 2일 후 Envision 플레이트 판독기를 통해 얻었다. b. 도 4a에 나타난, TLR8을 과다발현하는 인간 세포에서의 eGFP 발현의 정량화. 정밀하게 조작된 mRNA("모티프 감소")는, GU 감소("비정밀") 및 화학적으로 변형된("Chem. mod.") mRNA보다 유의하게 더 높은 단백질 발현을 나타내었다. 형질감염은 5회 실시되었고, 데이터는 평균+/- SD으로 나타나있다.
도 5a-5d. 인간 단핵구-유래 수지상 세포(MDDC)로 형질전환된 조작된 eGFP mRNA에 의해 유발된 단백질 발현. 야생형(WT) 및 서열 조작된 mRNA는 HPLC를 통해 정제되었고, 리포펙타민 2000을 통해 MDDC에 형질감염되었다. eGFP 발현은 4일차에 정량화되었다. MDDC에 단일 형질감염된 후, 모티프 감소 mRNA(c)는 비정확 mRNA(b)보다 유의하게 더 높은 단백질 발현 및 WT mRNA(A)와 유사한 발현을 나타내었다. (d) 실험 결과는 3회 실시되었다. 데이터는 평균 +/- SD로 나타나있다.
도 6. 리포펙타민 2000을 통해 TLR8을 과다발현하는 인간 세포에 반복적으로 형질감염된 조작된 eGFP mRNA에 의해 유발된 단백질 발현. 야생형(WT) 및 서열 조작된 mRNA는 스핀 컬럼을 통해 수집되거나("WT - 비정제된" 및 "모티프 감소 - 비정제된"), 또는 HPLC를 통해 정제되었다("WT - HPLC" 및 "모티프 감소 - HPLC"). 이후, 이들은 2 일차, 3 일차 및 4 일차에 연속하여 리포펙타민 2000을 통해 TLR8를 과다발현하는 HEK293 세포(0 일차에 분주됨)에 형질감염되었다. eGFP 발현은 4 일차, 7 일차 및 11 일차에 정량화되었다. 반복된 형질감염 세팅에서, 정제된 모티프 감소 mRNA는 정제된 WT mRNA보다 유의하게 더 높은 단백질 발현을 나타내었다. 형질감염은 5회 실시되었고, 데이터는 평균 +/- SD로 나타나있다.

정의

본원에 사용된 용어 "약(about)"은, 주어진 값으로부터의 대략 ±10%의 편차를 지칭한다.

용어 "클로닝 부위(cloning site)"는, DNA 절편(들)을 발현 벡터에 클로닝하는데 유용한 하나 이상의 제한 효소 인식 서열을 포함하되, 통상적으로 발현 벡터 내에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 뉴클레오티드 서열이 다수의 제한 효소 인식 서열들을 포함하는 경우, 그 뉴클레오티드 서열은 또한 "다중 클로닝 부위(multiple cloning site)" 또는 "폴리링커(polylinker)"로도 지칭된다.

용어 "발현 벡터(expression vector)"는, 원하는 분자의 발현에 영향을 미치는 서열, 예를 들어, 프로모터, 암호화 영역 및 전사 종결 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. 발현 벡터는 통합성 벡터(즉, 숙주 게놈에 통합될 수 있는 벡터), 또는 통합되지는 않으나 자가-복제하는 벡터(이 경우, 벡터는 일단 숙주 세포 내에 들어오면 전체 벡터를 복제할 수 있는 "복제의 기원(origin of replication)"을 포함함)일 수 있다.

용어 "유전자 발현(gene expression)"은, 핵산 서열이 성공적인 전사 및 대부분의 경우 번역을 거쳐, 단백질 또는 펩티드를 생성하는 과정을 지칭한다. 명확성을 위해, "유전자 발현"의 측정에 대해 언급될 때, 이것은 그 측정이 전사의 핵산 산물, 예를 들어, RNA 또는 mRNA, 또는 번역의 아미노산 산물, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 펩티드에 대한 것일 수 있다는 의미로 이해되어야 할 것이다. RNA, mRNA, 폴리펩티드 및 펩티드의 양 또는 수준을 측정하는 방법은, 당업계에 잘 알려져 있다.

본원에서 어구 "면역원성 모티프(immunogenic motif)"는, 세포 내에 위치한 선천성 면역 수용체, 예컨대 TLR7 또는 TLR8에 대한 RNA의 결합과 관련되며, 세포내 세포 신호 전달 경로의 활성화를 유발하여, 유전자 발현을 변화시키고/시키거나, 세포로부터 시토카인을 방출시키는 임의의 RNA 서열에 대한 언급을 포함하는데 사용된다.

용어 "플라스미드(plasmid)"는, 박테리아 내의 자연 발생적인 플라스미드, 및 인공적으로 제조된 원형 DNA 절편을 둘 다 포함한다.

본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는, 13개 초과의 뉴클레오티드인 임의의 RNA 또는 DNA 서열을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 천연 또는 합성(화학적으로 변형된) 포스페이트 골격, 당, 및 리보스 당을 갖는, 자연적 또는 합성 기원의 핵산을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "메신저 RNA(messenger RNA)" 및 "mRNA"는, 세포 내에서 또는 세포-불포함 단백질 번역 시스템에서 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있는 임의의 RNA 서열을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "시험관내 전사"는, 플라스미드 기반, 또는 PCR 산물 기반일 수 있는 DNA 주형으로부터 mRNA를 제조하기 위한 효소적 반응을 지칭한다. 전자의 경우에, 제한 효소에 의해 선형화된 플라스미드 DNA 및 제한 부위들 사이의 IVT 주형 영역은, 정제되어 더욱 고품질의 DNA 주형을 얻는다. 후자의 경우에, 말단 영역 또는 측접 영역에 상보적인 프라이머는, 플라스미드로부터 주형 DNA를 증폭 및 정제하기 위해 고안된다. 이 PCR 프라이머들 중 하나가 폴리-T 서열을 포함할 때, 이는 또한 전사 도중 폴리-A 꼬리를 mRNA 서열에 포함시킬 수 있다. 통상, 시험관내 전사(IVT) 반응은 표준 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 기질과 함께, T7, T3 또는 SP6 RNA 중합효소 효소를 사용한다.

본원에 사용된 용어 "암호화 영역(coding region)"는, 일반적으로 5' 비번역 영역와 3' 비번역 영역의 사이에 위치하며, 리보솜에 의해 단백질로 활발하게 번역되는 메신저 RNA의 일부를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "5'UTR"은, mRNA의 5' 말단에 위치하며, 일반적으로 리보솜에 대한 결합 및 mRNA 암호화 영역의 발현 향상에 관여하는 메신저 RNA의 일부를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "3'UTR"은, mRNA의 3' 말단에 위치하며, 일반적으로 mRNA의 발현 및 반감기의 향상에 관여하는 메신저 RNA의 일부를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "서열 조작(sequence engineering)"은, 특정한 이유로 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 이루어진 임의의 변화를 지칭한다. 이러한 변화는 면역원성을 감소시키고, 발현을 향상시키고/시키거나, 반감기를 향상시킬 수 있다. 이들은 RNA 서열 전체, 또는 RNA 서열의 특정 섹션 내에서 이루어질 수 있다. 메신저 RNA에 대하여, 서열 조작은 암호화 서열, 5'UTR 및/또는 3'UTR 영역을 변형시키는 것과 관련될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "정밀한 서열 조작(precise sequence engineering)"은, 면역원성 모티프를 제거함으로써 올리고뉴클레오티드의 면역원성을 감소시키나, 상기 올리고뉴클레오티드 서열의 나머지에서의 불필요한 변형은 피하기 위해 올리고뉴클레오티드 서열에 이루어진 변화를 지칭한다. 일부 구현예에서, "정밀한 서열 조작"은 폴리뉴클레오티드에서 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개의 면역원성 모티프, 또는 모든 면역원성 모티프를 제거하는 것과 관련된다. 일부 구현예에서, "정밀한 서열 조작"은 폴리뉴클레오티드 서열에서 발견되는 면역원성 모티프의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 99% 또는 100%의 제거와 관계된다.

어구 "면역원성 모티프의 제거(removal of an immunogenic motif)"는, 면역원성 모티프 내의 단일 뉴클레오티드, 또는 면역원성 모티프 내의 다수의 뉴클레오티드들(예를 들어, 주어진 면역원성 모티프의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 모든 뉴클레오티드)을 변화시킴으로써 폴리뉴클레오티드 내의 면역원성 모티프를 변형시켜서, 상기 모티프가 더이상 존재하지 것(즉, 면역원성 모티프가 "파괴됨(destroyed)")을 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "변화(change)"는, 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및 화학적 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나의 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레오티드들에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, "KNUNDK" 면역원성 모티프는 표 1에 나타난 바와 같은 192개의 가능한 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. "KNUNDK" 모티프에 따르지 않는(즉, 표 1에 나열된 192개의 서열들에서 벗어난) 서열을 생성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 임의의 돌연변이, 변화 또는 치환은, 모티프를 "파괴" 또는 "제거(remove)"할 것이다. 예를 들어, 개시 폴리뉴클레오티드 내의 면역원성 모티프가 "GAUAAG"인데, 이것이 "GAAAAG"로 돌연변이화된 경우, KNUNDK 모티프는 "제거되었다"고 할 수 있다.

일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA이다. 특정 구현예에서, RNA는 메신저 RNA(mRNA)이다. mRNA의 암호화 영역 내에, 정밀한 서열 조작은 유전적 코드의 중복성을 이용하여, 각각의 표적 코돈을 원래의 코돈과 동일한 아미노산을 암호화하는 대안적인 코돈으로 대체함으로써, 암호화된 단백질의 최종 서열을 보존한다. 달리 말해, mRNA의 아미노산-암호화 영역 내에(즉, "오픈 리딩 프레임(open reading frame)" 또는 "ORF" 내에) 적어도 하나의 면역원성 모티프가 있는 경우, mRNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 변화시키지 않고도 변화(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모든 뉴클레오티드의 변화)가 일어난다.

본원에 사용된 용어 "코돈 최적화(codon optimization)"는, 폴리펩티드 또는 단백질 발현 수준을 증가시키려는 목적으로 실시된 서열 조작을 지칭한다. 폴리펩티드 및 단백질의 양 또는 수준을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본원에 사용된 용어 "GU 감소 mRNA(Low GU mRNA)"는, 동일한 mRNA의 야생형 버전에 비해 구아닌(G) 및 우라실(U) 함량이 감소된, 서열 조작된 mRNA를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "U 감소 mRNA(Low U mRNA)"는, 동일한 mRNA의 야생형 버전에 비해 U 함량이 감소된, 서열 조작된 mRNA를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "GC 증가 mRNA(High GC mRNA)"는, 동일한 mRNA의 야생형 버전에 비해 G 및 C 함량이 증가한, 서열 조작된 mRNA를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "효소적 캡핑(enzymatic capping)"은, 효소, 통상적으로 배시니아 캡핑 시스템(Vaccinia capping system)(5'-5' 포스포디에스테르 결합을 갖는 7-메틸-구아노신 캡(캡 0)을 첨가함)과 2-O-메틸트랜스퍼라제(mRNA의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드를 2-O-메틸화시켜, 캡 I 구조를 형성함)의 조합에 의해 7-메틸 구아노신-기반 캡 구조, 예컨대 캡 0, 캡 I, 캡 II을 첨가하는 것을 지칭하는데, 이들은 전사 반응 이후에 첨가되어, mRNA가 더욱 번역이 잘 되도록 개선시킨다. 효소적 캡핑의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본원에 사용된 용어 "공동-전사성 캡핑(co-transcriptional capping)"은, 7-메틸 구아노신 캡 또는 캡 유사체, 예컨대 ARCA 또는 CleanCap를 mRNA 전사 반응에 포함시킴으로서 이러한 캡 유사체를 첨가시켜, mRNA가 더욱 번역이 잘 되도록 개선시키는 것을 지칭한다. 공동-전사성 캡핑의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본원에 사용된 용어 "화학적 변형(chemical modification)"은, mRNA의 질소 염기에 실시된 화학적 변화를 지칭한다. 이러한 변형은 mRNA 전사 반응에서 T7 RNA 중합효소에 대한 기질로서 비-표준(화학적으로 변형된) 뉴클레오티드 유사체를 포함함으로써 통상 실시된다. 이러한 화학적 변형체들은 슈도우리딘(Ψ), 5-메틸시티딘(m5C), N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ), 5-메톡시우리딘(5moU), N6-메틸아데노신(m6A), 5-메틸우리딘(m5U), 또는 2-티오우리딘(s2U)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "부분적인 화학적 변형(partial chemical modification)"은, mRNA 내의 특정 뉴클레오티드, 통상적으로 우리딘 또는 시티딘의 일부(모두는 아님)의 화학적 변형을 지칭한다. 예를 들어, 2-티오우리딘(s2U)은 IVT 기질로서 이를 1 대 3의 몰 비율로 부분적으로 포함함으로써 대략 25% 비율로 사용될 수 있으며, 여기에서 모든 3개의 표준 우리딘에 대해, 하나의 2-티오우리딘이 mRNA에 포함된다.

본원에 사용된 용어 "캡슐화(encapsulation)"는, 고체, 라멜라 또는 소낭(vesicle)-유사, 지질- 또는 중합체-기반 나노입자 내에 mRNA를 포장하는 것을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "전달 비히클(delivery vehicle)"은, mRNA의 캡슐화에 사용되어 mRNA 페이로드(payload)를 효과적으로 안정화시키고, 이동시키고, 표적 세포 또는 조직으로 전달할 수 있도록 하는 임의의 천연 또는 합성 물질을 지칭한다.

어구 "연구-용도 조성물(research-use composition)"은, 과학 지식을 증진시킬 목적으로 실험실에서 사용되며, 임상적 또는 수의학적 용도로는 의도되지 않은 임의의 연구 물질을 지칭한다. 어구 "수의학적 조성물(veterinary composition)"은, 동물에 사용되어 동물의 건강과 웰빙을 개선시키는 임의의 물질을 지칭한다.

전반적인 설명

본 기재 내용은 폴리뉴클레오티드 서열 내의 면역원성 모티프를 제거하기 위한 정밀한 서열 조작에 의해, 폴리뉴클레오티드 서열에서 면역원성을 낮추는 방법에 관한 것이다. 본 기재 내용은 또한 이러한 폴리뉴클레오티드 내에서 하나 이상의 또는 모든 면역원성 서열 모티프가 제거된 조작된 폴리뉴클레오티드의 조성물에 관한 것이다.

기존의 mRNA 변형 및 조작 방법을 제한하려는 관점에서, 선천성 면역 센서에 비해 단지 관련 서열들을 변화시키기만 하는 신규한 mRNA 조작 접근법이 계속 필요하였다.

현재 이용가능한 mRNA의 선천성 면역원성을 감소시키는 mRNA 화학적 변형 및 서열 조작 접근법은, 너무 비정확하며, 모든 서열들을 균등하게 변화 및 변형시킨다.

TLR7 및 TLR8은 특정한 U 함유 서열 또는 서열 모티프에 기초하여 mRNA를 포함한 ssRNA 종을 탐지한다. 이들 면역원성 모티프의 표적화 제거는 더욱 정밀한 서열 조작 접근법이 가능하도록 할 수 있다. 유전적 코드의 중복성(이 경우, 거의 모든 코돈의 3번째 위치는 초기(nascent) 폴리펩티드 사슬에서와 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 대안적인 뉴클레오티드를 갖는다)에 기인하여, mRNA 서열은 서열 모티프를 특이적으로 제거하도록 변형될 수 있으나, 암호화된 단백질 서열은 동일하게 유지한다.

비정확한 조작 접근법, 예컨대 GC 증가 mRNA(상기 mRNA 서열은 전체 G 및 C 함량을 증가시키도록 인공적으로 변화됨) 또는 GU 감소 mRNA(상기 mRNA 서열은 전체 G 및 U 함량을 감소시키도록 인공적으로 변화됨)에 비해, 이러한 정밀 접근법(모티프 감소 접근법)은 최소 침투성이며, 즉 이는 TLR7/8 결합에 관여하지 않는 임의의 서열들은 변형시키지 않는다. 그 결과, 이 신규한 접근법은 상기 mRNA의 구조적이고 기능적인 특징들을 대부분 유지시킨다. 많은 장점들 중에서도, 이 접근법은 확고한 번역 효율을 가능하게 한다. 처음으로, 본 발명은 정밀한 mRNA 조작이 실현가능함은 물론 유리하기도 하다는 것을 나타낸다.

따라서, 일 구현예에서, 본원에 기재된 모티프는 연구 목적, 뿐만 아니라 수의학적 및 임상적 응용, 예컨대 백신화 또는 유전자 교환(gene replacement)을 위해, 단백질을 발현하는데 사용된 다른 메신저 RNA들로부터 제거될 수 있다. 상기 mRNA는 하나 이상의 다양한 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화할 수 있는데, 이는 유전자 편집 효소(예를 들어, Cas9, ZFN 및 TALEN), 유도만능줄기세포(IPSC) 재프로그램화 인자(Oct4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc, nanog, Lin28, Glis1), 트랜스-분화 인자, 대사 효소[예를 들어, 표면활성물질(Surfactant) 단백질 B, 우리딘 5'-디포스포-글루쿠로노실트랜스퍼라제(Uridine 5'-diphospho-glucuronosyltransferase), 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제(Ornithine transcarbamylase)], 세포막 단백질(예를 들어, CFTR, OX40L, TLR4, CD40L, CD70, B-세포 수용체 서브유닛, T-세포 수용체 서브유닛, 키메라 항원 수용체), 호르몬 및 시토카인(EPO, VEGF, IL12, IL36감마), 전-어팝토시스, 괴사 및 괴사유발(necroptotic) 단백질, 바이러스 항원(예를 들어, HIV gp120 및 gp41 항원, 인플루엔자 HA 및 NA 항원), 박테리아 항원 및 독소, 암 항원 및 신생-항원, 예방 또는 치료 항체 및 항체 절편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

다른 구현예에서, 서열 조작될 mRNA는 키메라 구조(융합 단백질 생성)로서, 또는 IRES 영역에 흩어져 있는 개별적인 암호화 영역들 또는 자가-분할 펩티드를 암호화하는 서열에 의해 암호화되는 개별적인 폴리펩티드들로서, 하나 초과의 단백질을 암호화할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 인간 TLR8 및 마우스 TLR7 모티프로서 KNUNDK를 이용하고, 상기 KNUNDK 모티프와 매치되는 서열을 제거하는데, 여기에서 N은 임의의 뉴클레오티드이고, K는 구아노신(G) 또는 우리딘(U)이고, D는 시티딘(C)을 제외한 임의의 뉴클레오티드이다. KNUNDK 모티프를 포함하는 6량체 서열들은, 표 1에 제공되어 있다.

다른 구현예에서, 모티프 제거를 통한 정밀한 서열 조작은, UCW, UNU, UWN, USU, KWUNDK, KNUWDK, UNUNDK, KNUNUK(문헌[Forsbach 등, 2008]; 문헌[Jurk 등 2011]; 문헌[Green 등 2012]) 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 TLR7 및 TLR8 서열 모티프에 기초할 수 있으며, 여기에서 W는 아데노신(A) 또는 U이고, S는 G 또는 C이다.

표 1: KNUNDK 모티프와 매치하는 서열들의 목록

다른 구현예에서, 본 발명의 모티프 제거 접근법은 54개 초과의 뉴클레오티드인 다른 긴 폴리뉴클레오티드에서 실시되어, 이러한 폴리뉴클레오티드의 선천성 면역원성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 긴 폴리뉴클레오티드는 적어도 54개, 적어도 55개, 적어도 56개, 적어도 57개, 적어도 60개, 적어도 65개, 적어도 70 개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개, 적어도 95개, 적어도 100개, 적어도 110개, 적어도 120개, 적어도 130개, 적어도 140개, 또는 적어도 150개의 뉴클레오티드를 포함한다. 이들 긴 폴리뉴클레오티드는 Crispr-Cas9에 대한 가이드 RNA(gRNA), 긴 비-암호화 RNA(lncRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 및 원형 RNA(circRNA) 를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 미조작된 개시 폴리뉴클레오티드는 다수의 면역원성 모티프들을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 내의 다수의 면역원성 모티프들은 단일 타입의 모티프이다(예를 들어, 폴리뉴클레오티드의 모든 면역원성 모티프는, UCW, UWN, USU, UNU, KWUNDK, KNUWDK, UNUNDK, KNUNDK 및 KNUNUK로 이루어지는 군으로부터 선택된 모티프이되, 여기에서 W는 아데노신 모노포스페이트 또는 우리딘 모노포스페이트를 나타내고, S는 구아노신 모노포스페이트 또는 시티딘 모노포스페이트를 나타낸다). 일부 구현예에서, 폴리펩티드 내의 다수의 면역원성 모티프들은 상이한 타입들을 포함한다(예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열 내에는 UCW, UWN, USU, UNU, KWUNDK, KNUWDK, UNUNDK, KNUNDK 및 KNUNUK로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 모티프 타입들이 있는데, 여기에서 W는 아데노신 모노포스페이트 또는 우리딘 모노포스페이트를 나타내고, S는 구아노신 모노포스페이트 또는 시티딘 모노포스페이트를 나타낸다).

일부 구현예에서, 정밀하게 서열 조작된 폴리뉴클레오티드는, 조작(면역원성 모티프의 표적화 제거)되지 않은 폴리뉴클레오티드, 또는 다른 종래의 방법으로 변화된 폴리뉴클레오티드에 비해, 개선된 기능성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 어구 "개선된 기능성(improved functionality)"이란 더 낮은 면역원성을 보이고, TLR 7 및 TLR8)을 포함하나 이에 제한되지 않는 선천성 면역계 수용체에 대해 잠행성(stealth)인 것을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 단백질을 암호화하는 구현예에서, 어구 "개선된 기능성"은 암호화된 단백질의 생산을 개선시키고, 그 양을 증가시키는 개선된 번역 효율에 대한 언급을 포함한다. 일부 구현예에서, 어구 "개선된 기능성"은, 조작된 폴리뉴클레오티드의 안정성 향상에 대한 언급을 포함한다. 특정 구현예에서, 정밀 서열-조작된 폴리뉴클레오티드의 안정성 향상은, 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제에 대한 개선되거나 향상된 내성에 기인한다.

다른 구현예에서, 상기 모티프 제거 접근법은 슈도우리딘(Ψ), 5-메틸시티딘(m5C), N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ), 메톡시우리딘(5

moU), N6-메틸아데노신(m6A), 5-메틸우리딘(m5U), 또는 2-티오우리딘(s2U)을 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 통상 사용된 mRNA 화학적 변형체와 조합하여 사용될 수 있는데, 이 경우 상기 변형체는 mRNA 내에서 표준 뉴클레오티드의 0.1-1%, 1-10% 또는 10-25% 또는 25-50% 또는 50-100%를 대체한다.

다른 구현예에서, 상기 모티프 제거 접근법은 하나 이상의 다른 자연적으로 발견된 RNA 화학적 변형체와 조합하여 사용될 수 있는데, 이는 1,2'-O-디메틸아데노신, 1,2'-O-디메틸구아노신, 1,2'-O-디메틸이노신, 1-메틸-3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘, 1-메틸아데노신, 1-메틸구아노신 1-메틸이노신, 1-메틸슈도우리딘, 2,8-디메틸아데노신, 2- 메틸티오메틸렌티오-N6-이소펜테닐-아데노신, 2-게라닐티오우리딘, 2-리시딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸티오 사이클릭 N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-히드록시이소펜테닐) 아데노신, 2-메틸티오-N6-히드록시노르발릴카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신 2-메틸티오-N6-메틸아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-셀레노우리딘, 2-티오-2'-O-메틸우리딘, 2-티오시티딘 2-티오우리딘, 2'-O-메틸아데노신, 2'-O-메틸시티딘, 2'-O-메틸구아노신, 2'-O-메틸이노신, 2'-O-메틸슈도우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 2'-O-리보실아데노신 (포스페이트), 2'-O-리보실구아노신 (포스페이트), 3,2'-O-디메틸우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)-5,6-디히드로우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)슈도우리딘, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우리딘, 3-메틸시티딘, 3-메틸슈도우리딘, 3-메틸우리딘, 4-데메틸와이오신(demethylwyosine), 4-티오우리딘, 5,2'-O-디메틸시티딘, 5,2'-O-디메틸우리딘, 5-(카르복시히드록시메틸)-2'-O-메틸우리딘 메틸 에스테르, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘 메틸 에스테르, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2-티오우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)-2'-O-메틸우리딘, 5-(이소펜테닐아미노메틸)우리딘, 5-아미노메틸-2-게라닐티오우리딘, 5-아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-아미노메틸-2-티오우리딘, 5-아미노메틸우리딘, 5-카바모일히드록시메틸우리딘, 5-카바모일메틸-2-티오우리딘, 5-카바모일메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카바모일메틸우리딘, 5-카르복시히드록시메틸우리딘, 5-카르복시메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-게라닐티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 5-카르복시메틸우리딘, 5-시아노메틸우리딘, 5-포르밀-2'-O-메틸시티딘, 5-포르밀시티딘, 5-히드록시시티딘, 5-히드록시메틸시티딘, 5-히드록시우리딘, 5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘, 5-메톡시카보닐메틸-2'-O-메틸우리딘, 5-메톡시카보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-게라닐티오우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘, 5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-메틸디히드로우리딘, 5-메틸우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 7-아미노카르복시프로필-데메틸와이오신, 7-아미노카르복시프로필와이오신, 7-아미노카르복시프로필와이오신 메틸 에스테르, 7-아미노메틸-7-데아자구아노신, 7-시아노-7-데아자구아노신, 7-메틸구아노신, 8-메틸아데노신, N2,2'-O-디메틸구아노신, N2,7,2'-O-트리메틸구아노신, N2,7-디메틸구아노신, N2,N2,2'-O-트리메틸구아노신, N2,N2,7-트리메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N4,2'-O-디메틸시티딘, N4,N4,2'-O-트리메틸시티딘, N4,N4-디메틸시티딘, N4-아세틸-2'-O-메틸시티딘, N4-아세틸시티딘, N4-메틸시티딘, N6,2'-O-디메틸아데노신, N6,N6,2'-O-트리메틸아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, N6-(시스-히드록시이소펜테닐)아데노신, N6-아세틸아데노신, N6-포르밀아데노신, N6-글리시닐카바모일아데노신, N6-히드록시메틸아데노신, N6-히드록시노르발릴카바모일아데노신, N6-이소펜테닐아데노신, N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신, N6-메틸아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 큐베이스(Qbase), 아그마디틴(agmatidine), 아캐오신(archaeosine), 사이클릭 N6-트레오닐카바모일아데노신, 디히드로우리딘 에폭시퀘오신(epoxyqueuosine), 갈락토실-퀘오신, 글루타밀-퀘오신, 히드록시-N6-트레오닐카바모일아데노신, 히드록시와이부토신(hydroxywybutosine), 이노신, 이소와이오신(isowyosine), 만노실-퀘오신, 메틸화 저변형된(undermodified) 히드록시와이부토신, 메틸와이오신, 퍼록시와이부토신, 슈도우리딘, 퀘오신, 저변형된 히드록시와이부토신, 우리딘 5-옥시아세트산, 우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 와이부토신, 및 와이오신을 포함하나 이에 제한되지 않고, 여기에서 상기 자연적 변형체는 mRNA 내에서 표준 뉴클레오티드의 0.1-1%, 1-10% 또는 10-25% 또는 25-50% 또는 50-100%를 대체한다.

메신저 RNA 면역원성 및 번역 활성은, 또한 캡핑, 폴리아데닐화 및 불순물(IVT 반응에서 생긴 dsRNA 오염물)에 의해서도 영향을 받는다. 본 발명에서, mRNA는 배시니아 캡핑 시스템을 사용하여 효소에 의해 캡핑되었다(여기에서, 5' 말단을 7mG로 캡핑하여 캡 0 구조를 얻고, N1-뉴클레오티드를 2-O-메틸화시켜 mRNA의 5' 말단에서 캡 I 구조를 얻는다). 다른 구현예에서, 서열 조작된 mRNA는 예컨대 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA) 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA/G)pG(CleanCap)를 포함하나 이에 제한되지 않는 합성 또는 자연적인 캡 유사체를 사용하여 공동-전사로 캡핑될 수 있다. 다른 구현예에서, mRNA는 5' 말단(5'ppp)의 탈인산화가 있거나 없이 캡핑되지 않은 채로 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, mRNA는 주형-기반 접근법을 사용하여 폴리아데닐화된다. 이 접근법에서, 주형 DNA 서열은 고정 길이의 폴리A 꼬리를 암호화하는 말단 폴리A/T 서열을 mRNA에 포함한다. 대안적인 구현예에서, 서열 조작된 mRNA는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 효소에 의해 폴리아데닐화될 수 있다. 다른 구현예에서, mRNA는 비-폴리아데닐화될 수 있다.

일부 구현예에서, mRNA는 역상 HPLC 및 이후 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제된다. 다른 구현예에서, mRNA는 이온-교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 또는 RNAse III에 의한 dsRNA의 효소적 소화, 또는 다이서(dicer) 처리를 통해 정제된다. 다른 구현예에서, 효소적 소화와 크로마토그래피 방법들 중 하나 이상의 조합이 사용될 수 있다.

본 발명에서, mRNA의 모티프 제거는 추가적인 서열 조작 방법 없이 사용되었다. 그러나, 이러한 정밀한 mRNA 조작 접근법을 다른 서열 조작 접근법들과 조합하는 것이 가능하다. 일부 구현예에서, 모티프 제거를 위한 서열 조작은, 코돈 최적화를 위해 서열 조작과 조합하여 사용된다. 일부 구현예에서, 코돈 최적화는 코돈 사용(코돈 바이어스), 코돈 주변 맥락(codon neighbor context), mRNA 2차 구조, mRNA 3차 구조, 또는 이 변수들의 조합에 기초한다. mRNA의 단백질 발현 수율은 코돈 최적화를 통해 유의하게 개선될 수 있다. 이 서열 조작 접근법은 TLR7 및/또는 TLR8 서열 모티프의 제거와 함께 사용될 수 있다.

다른 구현예에서, 정밀한 서열 조작 접근법(모티프 제거)은 비정확한 서열 조작 접근법, 예컨대 GC 증가 mRNA와 조합될 수 있는데, 상기 서열 조작은 상기 mRNA, GU 감소의 GC 함량을 최대화하기 위해 mRNA에 실시되며, 상기 서열 조작은 mRNA 또는 U 감소 mRNA의 G 및 U 함량을 최소화하기 위해 실시되고, 상기 서열 조작은 mRNA의 U 함량을 최소화하기 위해 실시된다. 이러한 비정확 접근법들은 통상 면역원성을 완전히 없애기에는 부족하므로, 이들은 정밀한 조작과 조합됨으로써 추가로 개선되어 나머지 모티프를 제거할 수 있다. 본 발명에서, 서열 조작은 mRNA의 암호화 영역 내에서 실시되었다. 다른 구현예에서, 5' 및 3' 비번역 영역도 또한 면역원성 모티프를 제거하기 위해 조작될 수 있다. 다른 구현예에서, 5' 및 3' 비번역 영역은 이들 영역 내의 모티프를 회피하거나 그 수를 최소화하기 위해 (자연적 또는 합성 UTR 서열의 라이브러리로부터) 선택될 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, 서열 조작된 mRNA는 선형 mRNA였다. 다른 구현예에서, 서열 조작된 mRNA는 화학적, 효소적, 리보자임-매개, 또는 자가-원형화를 통해 만들어진 원형 mRNA일 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명은 양이온성 지질-기반 전달제를 이용한다. 다른 구현예에서, mRNA는 폴리락티드, 폴리락티드-폴리글리콜리드 공중합체, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 젤라틴, 알기네이트, 프로타민, 콜라겐, 알부민, 키토산, 시클로덱스트린, PEG화 프로타민, 폴리(L-리신)(PLL), PEG화 PLL, 폴리에틸렌이민(PEI), 지질 나노입자, 리포좀, 나노리포좀, 프로테오리포좀, 자연적 및 합성적으로-유래된 엑소좀 둘 다, 자연적, 합성 및 반-합성 라멜라체(lamellar bodies), 나노미립자, 칼슘 포스포르(calcium phosphor)-실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화실리콘 나노미립자, 나노결정성 미립자, 반도체 나노미립자, 건조 분말, 나노덴드리머, 전분-기반 전달 시스템, 마이셀, 에멀전, 솔-겔, 니오솜(niosome), 플라스미드, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 인산칼슘 뉴클레오티드, 압타머 및 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 전달제에 의해 전달될 수 있다. 다른 구현예에서, 이들 전달제는 소분자 리간드, DNA 또는 RNA 압타머, 올리고펩티드, 또는 단백질, 예컨대 항체, 항체 절편, 및 리간드, 예컨대 트랜스페린에 접합됨으로써, 표면 관능화된다.

본 발명에서, mRNA는 시험관내에서 세포로 전달되었다. 다른 구현예에서, mRNA는 생체외 또는 생체내에서 세포, 조직 또는 유기체에 전달될 수 있다. 생체내 투여를 위한 전달 경로는 경구성 또는 비경구성(정맥내, 근육내, 피내, 또는 피하)이다.

일부 구현예에서, 단일 단백질을 암호화하는 mRNA가 단독으로 전달된다. 다른 구현예에서는, 상이한 단백질들을 암호화하는 다수의 mRNA들이 칵테일 제제로서 전달된다. 이 제제 중의 개별 mRNA는 네이키드(naked) mRNA일 수 있거나, mRNA의 합리적인 흡수 및 번역을 가능하게 하는 지질 나노입자 또는 중합성 담체 내에 캡슐화될 수 있거나, 또는 네이키드 mRNA와 캡슐화 mRNA의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 칵테일 mRNA는 특정 응용에서는 활성을 위해 mRNA 서열 및/또는 전달제 구성요소, 크기, 전하, 전하 비율, 표면 화학을 변화시킴으로서 추가로 최적화된다. 특정 구현예에서, 칵테일 제제 중의 mRNA의 일부는 TLR7/8 결합이 최소화되도록 조작되나, 다른 것들은 비-조작되거나 부분 조작된 상태로 남아있어서, 선천성 면역계를 선택적으로 또는 부분적으로 자극시킬 수 있다.

실시예

이하의 비-제한적인 실시예는 본 명세서의 일부를 형성하며, 본 기재 내용의 특정 양태들을 추가로 나타내기 위해 포함된다.

실시예 1. 재료 및 방법

주형 DNA 생성( IDT )

본 기재 내용에 사용된 모든 DNA 주형은, T7 프로모터, 5'UTR(비번역 영역) 서열, 암호화 영역 및 3'UTR 서열을 포함한다. 암호화 영역은 야생형 eGFP 주형 DNA 서열을 변화시킴으로써 조작하였는데, 여기에서는 야생형 코돈과 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 대안적인 코돈을 사용하여, G 및 U 함량을 감소시키거나, 아니면 오픈 리딩 프레임 내의 면역원성 서열 모티프를 제거하였다. 고안된 서열들은 상업적인 벤더(IDT)에서 합성하였고, TA 클로닝을 통해 pMini-T 벡터(PCR 클로닝 키트, NEB)에 클로닝하였고, 생거(Sanger) 시퀀싱을 통해 서열을 검증하였다. 메신저 RNA는 정방향 프라이머

(서열번호: 5)와 역방향 프라이머

(서열번호: 6)와 함께 Q5 고-수율 DNA 중합효소(NEB)를 사용하여 PCR 증폭함으로써, 벡터로부터 얻었다. 역방향 프라이머는 120개 뉴클레오티드-길이의 폴리A 꼬리의 주형 서열을 포함하였다. PCR 반응 산물을 아가로스 겔 상에서 전개하고, NucleoSpin Gel 및 PCR 클린-업 키트(Macherey-Nagel)로 정제하였다.

mRNA의 시험관내 전사(IVT). 비변형된 mRNA는 HiScribe ™ T7 고수율 RNA 합성 키트에 의해 제조사의 프로토콜을 사용하여 DNA 주형으로부터 전사되었다. IVT 반응은 37℃에서 2시간 동안 실시되었다(변형된 mRNA). 37℃에서 10분 동안 반응 산물에 TURBO DNase(Thermo Fisher)를 처리하고, MEGAclear 전사 클린-업 키트(Thermo Fisher)에 의해 mRNA를 분리하였다. 캡핑은 배시니아 캡핑 시스템(NEB) 및 mRNA 캡 2'-O-메틸트랜스퍼라제(methyltransferase)(NEB)를 사용하여 전사-후에 실시되었다. 앤타크틱(Antarctic) 포스파타제 효소(NEB)로 포스파타제 처리를 한 후, MEGAclear 전사 클린-업 키트로 분리하였다. 슈도우리딘 및 5-메틸시티딘(L-6101)을 갖는 변형된 eGFP mRNA는, TriLink Biotechnologies로부터 입수하였다.

mRNA 정제:

캡핑되고 탈인산화된 mRNA는 문헌[Kariko 등, 2013]에 따라 HPLC에 의해 정제하였다. 간략히, 메신저 RNA는 0.1 M TEAA(이동상 A) 및 25% 아세토니트릴 완충액을 포함하는 TEAA(이동상 B)를 사용하는 역상 PDVB HPLC 컬럼(RNASep 컬럼, Concise Seperations)이 장착된 Varian Prostar HPLC 장비에서 전개되었다. 주요한 mRNA 분획은 Amicon Ultra-15 원심분리 필터 유닛(Millipore)으로 농축하였고, RNAse-불포함 물에 희석하였다. RNA는 소듐 아세테이트(3M, pH 5.5; Thermo Fisher), 이소프로판올(Thermo Fisher) 및 글리코겐(Roche) 중에서 밤새 침전시킴으로서 수집하였다. RNA 농도는 NanoDrop 2000 UV-Vis 분광광도계로 측정하였다(Thermo Fisher).

세포:

HEK293 TLR8 및 이의 모세포주(HEK293 Null)는 Invivogen에서 입수하였다. 세포를 DMEM(Corning) 및 10% FBS(Seradigm)와 함께 계대하였다. 실험 시점에서의 세포 계대 수는 15 미만이었다. 인간 1차 단핵구-유래 수지상 세포(MDDC)는 Astarte Biologics에서 입수하였다(공여자 #345). 100 ug/ml GM-CSF 및 IL-4(R&D Systems)가 보충된 AIM V 배지(Thermo Fisher)를 사용하여, MDDC를 유지하였다.

mRNA 형질감염:

형질감염 48시간 전에, 20,000~40,000개의 HEK293 세포를 폴리-L-리신(Sigma) 사전-코팅된 96-웰 플레이트 상에 분주하였다. 리포펙타민 2000(Thermo Fisher) 기반 형질감염을 위해, 형질감염일에, 배지를 50㎕의 Opti-MEM I 무혈청 배지(Thermo Fisher)로 교체하였다. 각각의 웰에 대해, 400ng의 mRNA를 25㎕의 최종 부피로 Opti-MEM과 혼합하고, 0.4㎕의 리포펙타민 2000을 24.6㎕의 Opti-MEM과 혼합하였다. 용액을 실온에서 5분 동안 사전-항온처리하였다. 이후, 이들을 합치고, 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 50㎕의 mRNA-리포펙타민 복합체를 각각의 웰에 첨가함으로써, 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 4시간 후, 배지를 DMEM 및 10% FBS로 교체하였다. 리포펙타민 2000에 의한 반복된(연속적인) 형질감염을 위하여, 분주되는 세포수를 웰당 12,000개로 감소시켰다. 세포를 0 일차에 분주하고, 2 일차, 3 일차 및 4 일차에 형질감염시켰다.

HEK293 세포의 TransIT mRNA(Mirus Bio) 기반 형질감염을 위해, 세포를 폴리-L-리신 사전처리된 96-웰 플레이트 상에 웰당 25,000개 세포로 분주하였다. 72시간 후, 웰당 400ng의 mRNA, 0.22㎕의 TransIT mRNA 시약, 0.14㎕의 TransIT 부스트 시약 및 OptiMEM I 무혈청 배지를 17.5㎕의 최종 부피로 사용하였다. 형질감염 24시간 후, 배지를 성장 배지로 교체하였다. MDDC 형질감염을 위해, 동결된 세포를 해동하고, 세척하고, 웰당 50,000개 세포를 96-웰 플레이트 상에 분주하였다. 세포는 0.11㎕의 TransIT mRNA 및 0.07㎕의 부스트 시약을 사용하여, 24시간 후에 형질감염시켰다. 배지는 형질감염 4시간 후에 교체하였다.

SEAP 및 eGFP 정량화

eGFP 정량화를 위해, 플레이트를 EnVision 2105 다중모드 플레이트 판독기로 판독하였다. 선천성 면역원성 측정을 위해, 형질감염 22~24 시간 후에, SEAP 활성을 QUANTI-Blue 분비성 알칼라인 포스파타제 검정(InvivoGen)에 의해 측정하였다. 포스파타제 검정을 위한 항온 처리는, 37℃에서 2시간 동안 실시하였다.

실시예 2.

일부 구현예에서, 서열 조작은 eGFP mRNA를 암호화하는 주형 DNA의 ORF(암호화 영역)에서 실시하였다. 담배 식각 바이러스(Tobacco etch virus)(5'UTR) 및 생쥐(mus musculus) 알파-글로빈(3'UTR)으로부터의 측접 UTR 서열들 및 폴리-A[120개의 A] 꼬리를 갖는, 미조작되거나 원래의(야생-형) eGFP mRNA.

(서열번호: 1)은 TLR8 결합과 관련된 11개의 면역원성 모티프를 갖는데, 이들 중 7개는 mRNA의 암호화 영역에서 발견되나, 나머지 4개는 5'- 및 3' UTR 영역 내에 위치하였다(도 1a). 비정확한 조작 접근법은 GU 감소 mRNA(서열번호: 2)를 생성하는데, 이는 78개의 총 서열 변화를 갖고, 암호화 영역 내의 7개의 면역원성 모티프 중 5개가 제거되었다. 반대로, 정밀한 서열 조작 접근법은 모티프 감소 mRNA(서열번호: 3)를 생성하는데, 이는 매우 적은 서열 변형(총 7개)을 갖고, 암호화 영역 내의 7개의 면역원성 모티프 모두가 제거되었다(도 1b).

실시예 3.

일부 구현예에서, 서열 조작된 mRNA를, 리포펙타민 2000에 의해 TLR8를 과다발현하는 HEK293 세포에 형질감염시켰다(도 2). 27,000개 세포/웰을 폴리-L-리신 사전처리된 96-웰 플레이트에 분주하였다. 48시간 후, 리포펙타민 2000을 사용하여 각각의 웰을 400ng/웰 mRNA로 형질감염시켰다. 배지는 4시간 후에 교체하였다. 형질감염 24시간 후, 세포 배양 상청액 중의 SEAP 활성을 정량화함으로써, 선천성 면역원성을 측정하였다(도 2). TLR8 자극의 감소는 GU 감소 mRNA(비정확) 및 모티프 감소 mRNA 둘 다에서 나타났다. 비정확 및 정밀 접근법(비정확 + 모티프 감소 mRNA)을 조합하여 사용하면, TLR8 활성화에서 추가적인 감소를 나타내지 않았다.

실시예 4.

일부 구현예에서, 서열 조작된 mRNA을 TransIT-mRNA 시약에 의해 TLR8를 과다발현하는 HEK293 세포, 또는 TLR8의 과다발현이 없는 HEK293 Null 모세포에 형질감염시켰다(도 3). 35,000개 세포/웰을 폴리-L-리신 사전처리된 96-웰 플레이트에 분주하였다. 48시간 후, 세포를 400ng/웰의 mRNA로 형질감염시켰다. 배지는 4시간 후에 교체하였다. 선천성 면역원성은 형질감염 24시간 전후에 세포 배양 상청액 중의 SEAP 활성을 정량화함으로서 결정하였다. 사전-형질감염 SEAP 판독분을 사용하여, 면역 신호를 분주된 세포 양에 맞게 정규화하였다. TransIT-기반 전달 시스템에서는, 리포펙타민 2000 기반 형질감염과 유사하게, 정밀한 조작이 감소된 TLR8 자극을 나타내었다. 화학적으로 변형된 mRNA은, 유사하게 낮은 TLR8 자극을 나타내었다. 비정확한 접근법도 또한 감소된 TLR8 활성을 나타낸 반면, GU 감소 mRNA의 SEAP 신호는 모티프 감소 mRNA 및 화학적으로 변형된 mRNA에 비해 더 높았다.

실시예 5.

일부 구현예에서, 서열 조작된 mRNA를 리포펙타민 2000에 의해 TLR8를 과다발현하는 HEK293 세포에 형질감염시켰다(도 4). 27,000개 세포/웰을 폴리-L-리신 사전처리된 96-웰 플레이트에 분주하였다. 48시간 후, 각각의 웰을 400ng/웰 mRNA로 형질감염시켰다. 배지는 4시간 후에 교체하였다. eGFP의 단백질 발현 수준은 형질감염 6일 후 플레이트를 이미지화하고(도 4a), 각각의 웰에서 eGFP 신호를 정량화함으로써 결정하였다(도 4b). eGFP 발현을 기초로 할 때, 비정확 접근법 및 화학적 변형은 mRNA 번역을 감소시키는 반면, 정밀한 서열 조작(모티프 감소 mRNA)은 보존된 번역을 나타내었다.

실시예 6.

일부 구현예에서, 서열 조작된 mRNA를 TransIT mRNA 시약에 의해 MDDC에 형질감염시켰다(도 5). 50,000개 세포/웰을 96-웰 플레이트에 분주하였다. 24시간 후에, 각각의 웰을 400ng/웰 mRNA로 형질감염시켰다. 4시간 후에, 배지를 교체하였다. eGFP의 단백질 발현 수준은 형질감염 4일 후 플레이트를 이미지화하고(도 5a), 각각의 웰에서 eGFP 신호를 정량화함으로서 결정하였다(도 5b). 리포펙타민 형질감염된 mRNA와 유사하게, TransIT 형질감염된 mRNA는 GU 감소 mRNA에 비해, 모티프 감소 mRNA에서 개선된 번역 활성을 나타내었다.

실시예 7.

다른 명세에서, 서열 조작된 mRNA를 리포펙타민 2000 시약에 의해 TLR8를 과다발현하는 HEK293 세포에 반복적으로 형질감염시켰다(도 6). 0 일차에, 12,000개 세포/웰을 폴리-L-리신 사전처리된 96-웰 플레이트에 분주하였다. 2 일차, 3 일차 및 4 일차에, 각각의 웰을 400ng/웰 mRNA로 형질감염시켰다. 배지는 각각의 형질감염 4시간 후에 교체하였다. 4 일차, 7 일차 및 11 일차에, 각각의 웰 내의 eGFP 신호를 정량화함으로써 eGFP의 단백질 발현 수준을 결정하였다(도 5b). 반복된 형질감염 세팅에서, 모티프 감소 mRNA는 GU 감소 mRNA 및 야생-형(미조작된) mRNA 둘 다보다 더 높은 번역을 나타내었다.

서열

서열번호: 1. 야생형 eGFP mRNA의 시험관내 전사를 위한 합성 주형 DNA 서열. T7 파지 RNA 중합효소 프로모터 부위, 담배 식각 바이러스 5' 비번역 영역(UTR), 자연적(야생형) 버전의 수정 해파리( Aequorea Victoria) 녹색 형광 단백질(eGFP) 증가 암호화 서열, 생쥐 알파-글로빈 3'UTR, 및 폴리-A[120개 A] 꼬리를 포함하는 합성 DNA 서열.

서열번호: 2. 비정확하게 조작된(GU 감소) eGFP mRNA, 암호화 서열: G- 및 U-감소된 수정 해파리 eGFP 암호화 서열의 시험관내 전사를 위한 합성 주형 DNA 서열.

서열번호: 3. 모티프 감소 eGFP mRNA의 시험관내 전사를 위한 합성 주형 DNA 서열. 암호화 서열: KNUNDK 모티프가 제거된 수정 해파리 eGFP 암호화 서열.

서열번호: 4. 비정확(GU 감소) 및 모티프 감소 eGFP mRNA의 시험관내 전사를 위한, 합성 주형 DNA 서열. 암호화 서열: KNUNDK 모티프 제거된, 및 GU 감소된 수정 해파리 eGFP.

서열번호: 5. DNA - 인공 서열 - 올리고뉴클레오티드

서열번호: 6. DNA - 인공 서열 - 올리고뉴클레오티드

SEQUENCE LISTING <110> Kernal Biologics, Inc. <120> PRECISELY ENGINEERED STEALTHY MESSENGER RNAS AND OTHER POLYNUCLEOTIDES <130> 2013065-0003 <150> 62/716451 <151> 2018-08-09 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 1 ttggaccctc gtacagaagc taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga 60 gtaagaagaa atataagagc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 120 gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 180 gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 240 aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 300 agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 360 tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 420 gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 480 gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 540 atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 600 gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 660 cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 720 aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 780 ggcatggacg agctgtacaa gtaagctgcc ttctgcgggg cttgccttct ggccatgccc 840 ttcttctctc ccttgcacct gtacctcttg gtctttgaat aaagcctgag taggaagaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1017 <210> 2 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 2 atggtcagca aaggcgaaga actcttcacc ggcgtcgtcc ccatcctcgt cgaactcgac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtc tccggcgaag gcgaaggcga cgccacctac 120 ggcaaactca ccctcaaatt catctgcacc accggcaaac tccccgtccc ctggcccacc 180 ctcgtcacca ccttcaccta cggcgtccaa tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaaa 240 caacacgact tcttcaaaag cgccatgccc gaaggctacg tccaagaacg caccatcttc 300 ttcaaagacg acggcaacta caaaacccgc gccgaagtca aattcgaagg cgacaccctc 360 gtcaaccgca tcgaactcaa aggcatcgac ttcaaagaag acggcaacat cctaggccac 420 aaactcgaat acaactacaa cagccacaac gtctacatca tggccgacaa acaaaaaaac 480 ggcatcaaag tcaacttcaa aatccgccac aacatcgaag acggcagcgt ccaactcgcc 540 gaccactacc aacaaaacac ccccatcggc gacggccccg tcctcctccc cgacaaccac 600 tacctcagca cccaatccgc cctaagcaaa gaccccaacg aaaaacgcga ccacatggtc 660 ctcctcgaat tcgtcaccgc cgccggcatc acccacggca tggacgaact ctacaaataa 720 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 3 atggtcagca aaggcgaaga actcttcacc ggcgtcgtcc ccatcctcgt cgaactcgac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtc tccggcgaag gcgaaggcga cgccacctac 120 ggcaaactca ccctcaaatt catctgcacc accggcaaac tccccgtccc ctggcccacc 180 ctcgtcacca ccttcaccta cggcgtccaa tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaaa 240 caacacgact tcttcaaaag cgccatgccc gaaggctacg tccaagaacg caccatcttc 300 ttcaaagacg acggcaacta caaaacccgc gccgaagtca aattcgaagg cgacaccctc 360 gtcaaccgca tcgaactcaa aggcatcgac ttcaaagaag acggcaacat cctaggccac 420 aaactcgaat acaactacaa cagccacaac gtctacatca tggccgacaa acaaaaaaac 480 ggcatcaaag tcaacttcaa aatccgccac aacatcgaag acggcagcgt ccaactcgcc 540 gaccactacc aacaaaacac ccccatcggc gacggccccg tcctcctccc cgacaaccac 600 tacctcagca cccaatccgc cctaagcaaa gaccccaacg aaaaacgcga ccacatggtc 660 ctcctcgaat tcgtcaccgc cgccggcatc acccacggca tggacgaact ctacaaataa 720 <210> 4 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 4 atggtcagca aaggcgaaga actcttcacc ggcgtcgtcc ccatcctcgt cgaactcgac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtc tccggcgaag gcgaaggcga cgccacctac 120 ggcaaactca ccctcaaatt catctgcacc accggcaaac tccccgtccc ctggcccacc 180 ctcgtcacca ccttcaccta cggcgtccaa tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaaa 240 caacacgact tcttcaaaag cgccatgccc gaaggctacg tccaagaacg caccatcttc 300 ttcaaagacg acggcaacta caaaacccgc gccgaagtca aattcgaagg cgacaccctc 360 gtcaaccgca tcgaactcaa aggcatcgac ttcaaagaag acggcaacat cctaggccac 420 aaactcgaat acaactacaa cagccacaac gtctacatca tggccgacaa acaaaaaaac 480 ggcatcaaag tcaacttcaa aatccgccac aacatcgaag acggcagcgt ccaactcgcc 540 gaccactacc aacaaaacac ccccatcggc gacggccccg tcctcctccc cgacaaccac 600 tacctcagca cccaatccgc cctaagcaaa gaccccaacg aaaaacgcga ccacatggtc 660 ctcctcgaat tcgtcaccgc cgccggcatc acccacggca tggacgaact ctacaaataa 720 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 5 ttggaccctc gtacagaagc t 21 <210> 6 <211> 138 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 6 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120 atggccagaa ggcaagcc 138

Claims

조작된 폴리뉴클레오티드로서, 이의 서열은 폴리펩티드를 암호화하고 이의 폴리펩티드-암호화 서열 내에 복수의 TLR7 모티프 또는 TLR8 모티프를 포함하는 참고 올리고뉴클레오티드의 서열과 일치하되, 상기 조작된 폴리뉴클레오티드는 상기 복수의 모티프 각각을 갖지 않으나 여전히 폴리펩티드를 암호화하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 모티프 각각은 KNUNDK, 모티프 UCW 모티프, UNU 모티프, UWN 모티프, USU 모티프, KWUNDK 모티프, KNUWDK 모티프, UNUNDK 모티프, KNUNUK 모티프 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, DNA이거나, DNA를 포함하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, RNA이거나, RNA를 포함하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제1항의 조작된 폴리뉴클레오티드를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 조작된 폴리뉴클레오티드는 RNA이거나, RNA를 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 RNA는 또한 제1항의 조작된 폴리뉴클레오티드이기도 한 DNA로부터 발현되었던, 방법.
조작된 DNA로부터 치료용 mRNA를 발현시킴으로써 이를 생성하는 방법으로서, 상기 조작된 DNA의 서열은, 폴리펩티드를 암호화하고 이의 폴리펩티드-암호화 서열 내에 복수의 TLR7 모티프 또는 TLR8 모티프를 포함하는 참고 DNA의 서열과 일치하되, 상기 조작된 DNA는 상기 복수의 모티프 각각을 갖지는 않으나 여전히 폴리펩티드를 암호화하는, 방법.
적어도 54개의 뉴클레오티드를 포함하는 조작된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 조작된 폴리뉴클레오티드는 개시 폴리뉴클레오티드에 기초하여 정밀하게 서열 조작되어, 상기 개시 폴리뉴클레오티드 내의 적어도 하나의 면역원성 서열 모티프를 제거하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 개시 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드인, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 합성 폴리뉴클레오티드인, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개시 폴리뉴클레오티드는 메신저 RNA(mRNA)인, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역원성 서열 모티프는 암호화 영역, 3' 비번역 영역(3'UTR), 또는 5' 비번역 영역(5'UTR)로부터 선택된 mRNA의 적어도 하나의 영역으로부터 제거되는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제12항에 있어서, 상기 mRNA는 포유류 단백질, 병원체 항원, 암 항원 및 신생항원, 키메라 단백질, 돌연변이된 단백질, 및 합성 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제13항에 있어서, 상기 조작된 mRNA에 의해 암호화된 단백질은 개시 mRNA 서열에 의해 암호화된 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 조작된 폴리뉴클레오티드는 Crispr-Cas9에 대한 가이드 RNA(gRNA), 긴 비-암호화 RNA(lncRNA), tRNA, 리보솜 RNA(rRNA), 원형 RNA, 압타머 RNA, 합성 RNA인, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 면역원성 서열 모티프는 인간 TLR7에 결합할 수 있는 서열 또는 복수의 서열들을 포함하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 적어도 하나의 면역원성 서열 모티프는 인간 TLR8에 결합할 수 있는 서열 또는 복수의 서열들을 포함하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제18항에 있어서, 상기 면역원성 모티프는 KNUNDK이되, 여기에서 K는 구아노신 모노포스페이트 또는 우리딘 모노포스페이트를 나타내고, N은 임의의 뉴클레오티드를 나타내고, U는 우리딘 모노포스페이트를 나타내고, D는 아데노신 모노포스페이트, 구아노신 모노포스페이트 또는 우리딘 모노포스페이트를 나타내는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 면역원성 모티프는 UCW, UWN, USU, UNU, KWUNDK, KNUWDK, UNUNDK 및 KNUNUK로 이루어진 군으로부터 선택되는 모티프이되, 여기에서 W는 아데노신 모노포스페이트 또는 우리딘 모노포스페이트를 나타내고, S는 구아노신 모노포스페이트 또는 시티딘 모노포스페이트를 나타내는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 개시 폴리뉴클레오티드 서열에서 발견되는 상기 면역원성 모티프 서열의 적어도 1%, 적어도 50%, 또는 적어도 90%가 제거되는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 면역원성 모티프 제거를 통한 상기 정밀한 서열 조작은 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화와 조합하여 사용되는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 정밀한 서열 조작은 GU 함량 감소, U 함량 감소, 및 GC 함량 증가-기반 mRNA의 서열 조작으로 이루어지는 군으로부터 선택된 비정확 서열(crude sequence) 조작 방법들 중 적어도 하나와 조합하여 사용되는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 정밀한 서열 조작은 슈도우리딘(Ψ), 5-메틸시티딘(m5C), N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ), 5-메톡시우리딘(5moU), N6-메틸아데노신(m6A), 5-메틸우리딘(m5U) 또는 2-티오우리딘(s2U)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 비-표준 뉴클레오티드를 사용하는 폴리뉴클레오티드의 적어도 부분적인 화학적 변형과 조합하여 사용되는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 조작된 폴리뉴클레오티드는 효소적 캡핑, 또는 캡 유사체를 사용하는 공동-전사성 캡핑을 통해 추가된 5' 캡 구조를 추가로 포함하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 조작된 폴리뉴클레오티드는 폴리-A 꼬리를 추가로 포함하는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제9항에 있어서, 상기 조작된 폴리뉴클레오티드는 정제되는, 조작된 폴리뉴클레오티드.
제1항의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 약학적 조성물.
제9항의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 수의학적 조성물 또는 연구-용도 조성물.
제9항의 조작된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 전달 비히클로서, 상기 전달 비히클은 이온성 또는 양이온성 지질 나노입자, 리포좀, 지질-유전자 결합체(lipoplex) 및 중합성 담체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전달 비히클.
정밀한 서열 조작 방법으로서:
a) 적어도 54개의 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계;
b) 상기 폴리뉴클레오티드 서열 내에서 적어도 하나의 면역원성 모티프를 식별하는 단계;
c) 상기 식별된 적어도 하나의 면역원성 모티프 서열을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적인 폴리뉴클레오티드인, 방법.
제31항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 합성 폴리뉴클레오티드인, 방법.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 메신저 RNA(mRNA) 폴리뉴클레오티드인, 방법.
제34항에 있어서, 상기 변형은 상기 mRNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 변화시키지 않는, 방법.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 식별된 상기 적어도 하나의 면역원성 모티프는 복수의 면역원성 모티프들을 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 단계 (c)는 다수의 식별된 면역원성 모티프들을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 식별된 면역원성 모티프의 적어도 10%를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 식별된 면역원성 모티프의 적어도 50%를 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, 상기 단계 (c)는 상기 식별된 면역원성 모티프를 모두 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 Crispr-Cas9에 대한 가이드 RNA(gRNA), 긴 비-암호화 RNA(lncRNA), tRNA, 리보솜 RNA(rRNA), 원형 RNA, 압타머 RNA 및 합성 RNA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제31항에 있어서, d) 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 코돈 최적화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제31항에 있어서,
d) 슈도우리딘(Ψ), 5-메틸시티딘(m5C), N1-메틸-슈도우리딘(N1mΨ), 5-메톡시우리딘(5moU), N6-메틸아데노신(m6A), 5-메틸우리딘(m5U) 또는 2-티오우리딘(s2U)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 비-표준 뉴클레오티드를 사용하여, 폴리뉴클레오티드의 부분적인 화학적 변형을 실시하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 효소적 캡핑 또는 캡 유사체를 사용하는 공동-전사성 캡핑을 통해, 상기 폴리뉴클레오티드에 5' 캡 구조를 추가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드에 폴리-A 꼬리를 추가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제31항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.