KR20210071830A - Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법 - Google Patents

Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210071830A
KR20210071830A KR1020200157961A KR20200157961A KR20210071830A KR 20210071830 A KR20210071830 A KR 20210071830A KR 1020200157961 A KR1020200157961 A KR 1020200157961A KR 20200157961 A KR20200157961 A KR 20200157961A KR 20210071830 A KR20210071830 A KR 20210071830A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
sample
measuring
bcl2
level
Prior art date
Application number
KR1020200157961A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102351570B1 (ko
Inventor
윤태영
이홍원
최병산
차민권
홍샘
이윤서
전창주
고영일
윤성수
Original Assignee
주식회사 프로티나
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 프로티나 filed Critical 주식회사 프로티나
Priority to CA3164047A priority Critical patent/CA3164047A1/en
Priority to AU2020398476A priority patent/AU2020398476A1/en
Priority to US17/111,883 priority patent/US20210179683A1/en
Priority to EP20896087.2A priority patent/EP4075141A4/en
Priority to CN202080084567.5A priority patent/CN114761809A/zh
Priority to JP2021560871A priority patent/JP7449589B2/ja
Priority to PCT/KR2020/017691 priority patent/WO2021112635A2/ko
Priority to US17/349,522 priority patent/US20210309706A1/en
Publication of KR20210071830A publication Critical patent/KR20210071830A/ko
Priority to KR1020220004043A priority patent/KR20220010051A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102351570B1 publication Critical patent/KR102351570B1/ko
Priority to JP2023203884A priority patent/JP2024023501A/ja

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법, 및 BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료에 적합한 대상 선별 방법이 제공된다.

Description

BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법{Method of Response Prediction For BCL2 family Protein Targeting Drug}
BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법, 및 BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료에 적합한 대상 선별 방법이 제공된다.
BCL2 (B-cell lymphoma 2) 계통 단백질은 세포자살을 유발 (pro-apoptotic) 또는 억제 (anti-apoptotic)함으로써 세포자살(apoptosis)을 조절하는 단백질이다.
BCL2 계통 단백질은 흑색종, 유방암, 전립선암, 만성 림프구성 백혈병 및 폐암를 포함하는 다양한 암의 원인으로 알려져 있고, 암 치료에 대한 저항성을 유발하는 원인으로도 알려져 있으며, 정신분열증 및 자가면역의 원인일 가능성도 제시되고 있다. 이러한 이유로 BCL2 계통 단백질은 항암제의 좋은 표적이 되고 있으며, BCL2 계통 단백질을 표적으로 하는 다양한 억제제(inhibitor)들이 개발되고 있다.
이와 같은 BCL2 계통 단백질의 표적 약물이 암치료에 효과적으로 적용되기 위해서 BCL2 계통 단백질에 의한 세포자살 조절신호를 정량적으로 파악할 수 있는 수단의 개발이 필요하다.
신호전달의 매개가 되는 단백질의 상호작용을 정량적으로 측정하여 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 처방에 의하여 암(예컨대, 혈액암) 치료가 가능한 환자를 확인할 수 있는 개별 맞춤 치료 기술이 제공된다.
일 예에서, 개체의 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 또는 개체에서의 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 효능을 예측하는 방법 또는 상기 예측에 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
다른 예는 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성을 가지는 대상 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물이 효능을 나타내는 개체 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 적용하기에 적합한 개체를 선별(확인)하는 방법 또는 상기 선별(확인)에 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
상기 방법은, 상기 약물에 대하여 반응성을 가지는 개체, 상기 약물이 효능을 나타내는 개체, 또는 상기 약물 또는 상기 약물을 이용한 치료를 적용하기에 적합한 개체에 상기 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 포함하고, BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성을 가지는 개체, BCL2 계통 단백질 표적 약물이 효능을 나타내는 개체, 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물 또는 이를 이용한 치료를 적용하기에 적합한 개체의 암 치료용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 방법으로 확인된 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성을 가지는 개체, BCL2 계통 단백질 표적 약물이 효능을 나타내는 개체, 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물 또는 이를 이용한 치료를 적용하기에 적합한 개체에게 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 약학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법이 제공된다.
상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물은 BCL2 계통 단백질을 표적으로 하는 것(예, BCL2 단백질 저해제 또는 MCL1 단백질 저해제)일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 개체의 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 또는 개체에서의 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 효능을 예측하는 방법 또는 상기 예측에 정보를 제공하는 방법; 및/또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성을 가지는 개체 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물이 효능을 나타내는 개체 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 적용하기에 적합한 개체를 선택(확인)하는 방법 또는 상기 선택(확인)에 정보를 제공하는 방법은 시료 내의 세포자살억제(anti-apoptotic) 단백질과 세포자살유도(pro-apoptotic) 단백질 간의 상호작용을 측정하는 단계 (a1) (예컨대; 하기하는 단계 (i) 및/또는 (ii)) 및/또는 시료 내 세포자살억제 단백질 및/또는 세포자살유도 단백질 수준을 측정하는 단계 (a2) (예컨대, 하기하는 단계 (iii))를 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 다음 중에서 선택된 하나 이상(예, 1개, 2개, 또는 3개)을 포함할 수 있다:
(i) 시료 내의 제1 단백질 및 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질 간 상호작용을 측정하는 단계로서, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 외부에서 공급된 단백질인 단계 (제1 단백질-단백질 상호작용 측정 단계);
(ii) 시료 내의 제1 단백질 및 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질 간 상호작용을 측정하는 단계로서, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 시료 내에 존재하는 단백질인 단계 (제2 단백질-단백질 상호작용 측정 단계); 및
(iii) 제1 단백질, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질, 또는 이들 모두의 시료 내 수준을 측정하는 단계.
일 예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 상기 단계 (i), 단계 (ii), 또는 단계 (iii)을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 본 명세서에서 제공되는 방법은 상기 단계 (i) 및 단계 (ii)의 조합, 단계 (i) 및 단계 (iii)의 조합, 단계 (ii) 및 단계 (iii)의 조합, 또는 단계 (i), 단계 (ii), 및 단계 (iii)의 조합을 포함할 수 있다.
상기 제1 단백질 및 제1 단백질과 상호작용하는 단백질 (이하, ‘제1 단백질과 상호작용하는 단백질’을 ‘제1 단백질 상호작용 단백질’로도 기재함)은 세포 자살억제(anti-apoptotic) 서브타입 단백질과 세포 생존유도 서브타입 단백질 중에서 선택될 수 있다.
일 예로 상기 단계 (i) 내지 (iii)의 제1 단백질은 BCL2 계통 단백질 중의 "세포 생존유도 (pro-survival) 또는 세포자살억제 (anti-apoptotic) 서브타입 단백질" (이하, "세포자살억제 단백질"로 기재함) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 단계 (i) 내지 (iii)의 제1 단백질은, 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로, BCL2, BCLxL, BCLw, BFL1 및 MCL1로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예, 1종, 2종 또는 3종)일 수 있다. 상기 단계 (i) 내지 (iii)의 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은, BCL2 계통 단백질 중의 세포자살유도(pro-apoptotic) 서브타입 단백질 (이하, "세포 세포자살유도(pro-apoptotic) 서브타입 단백질"을 세포자살유도 단백질로 기재함) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 단계 (i) 내지 (iii)의 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은, 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로, 세포자살유도 단백질 중 BH3 서브타입 (BH3-only) 단백질 (제2 단백질) 및 이펙터 (effector) 서브타입 단백질 (제3 단백질)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 제2 단백질은 BAD, BIM, PUMA, BMF, BID, tBID, BIK, HRK 및 NOXA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예, 1종, 2종 또는 3종)이고, 상기 제3 단백질은 BAX, BOK 및 BAK으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예, 1종 또는 2종)일 수 있다. 일 예에서, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 BAD, BIM, PUMA, BMF, BID, tBID, BIK, HRK, NOXA, BAX. BOK 및 BAK로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 (예, 1종, 2종, 3종, 4종 또는 5종)일 수 있다. 상기 방법이 단계 (i) 내지 (iii) 중 2 이상을 포함하는 경우, 각 단계에서의 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 서로 같거나 다를 수 있다.
다른 예로, 상기 단계 (i) 내지 (iii)의 제1 단백질은 BCL2 계통 단백질 중의 세포자살유도(pro-apoptotic) 단백질 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 단계 (i) 내지 (iii)의 제1 단백질은, 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로, BCL2 계통 단백질 중의 세포 자살유도 단백질 중 BH3 서브타입 (BH3-only) 단백질 및 이펙터 (effector) 서브타입 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 BH3 서브타입 (BH3-only) 단백질은 BAD, BIM, PUMA, BMF, tBID, BIK, HRK 및 NOXA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예, 1종, 2종 또는 3종)이고, 상기 이펙터 (effector) 서브타입 단백질은 BAX. BOK 및 BAK으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예, 1종 또는 2종)일 수 있다. 상기 단계 (i) 내지 (iii)의 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 BCL2 계통 단백질 중 세포자살억제 (anti-apoptotic) 단백질 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 단계 (i) 내지 (iii)의 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은, 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로, BCL2, BCLxL, BCLw, BFL-1 및 MCL1로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상(예, 1종, 2종 또는 3종)일 수 있다.
상기 방법이 단계 (i) 내지 (iii) 중 2 이상을 포함하는 경우, 각 단계에서의 제1 단백질 및 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 서로 같거나 다를 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "시료(생물학적 시료)"는 개체(예컨대, 인간)로부터 분리된 세포 또는 세포 용해물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 개체는 질병(예컨대, 암)의 치료를 필요로 하는 개체로서, BCL2 계통 단백질 표적 약물의 투여 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 이용한 치료법의 적용 대상 개체 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 투여 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 이용한 치료법의 효능 (약물 반응성)의 확인을 필요로 하는 개체일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 개체는 암환자(예컨대, 인간)이고, 상기 세포는 상기 개체로부터 분리된 암세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 개체는 인간 혈액암 환자이고, 상기 시료는 혈액암 환자로부터 분리된 백혈구 (예, 과립백혈구, 림프구, 및/또는 단핵구 (예, 말초혈액 단핵구 (peripheral blood mononuclear cell; PBMC) 등) 등), 골수세포 (예, 조혈모세포 등), 상기 세포를 포함하는 혈액, 골수, 버피코트 (buffy coat), 및 이들의 용해물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 방법에서의 선택 또는 확인 대상 개체로부터 얻어진 시료는 비교를 위한 대조 시료 (예컨대, 후술되는 비교를 위한 기준값 선정을 위한 효과군 시료 또는 비효과군 시료)와 구별하기 위하여 "시험 시료"로 표현될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "외부에서 공급된(exogenous) 단백질 (예컨대, 제1 단백질과 상호작용하는 단백질)"은 시료 내에 존재하는 내재의 (endogenous) 단백질이 아닌 외부에서 첨가해준 단백질을 의미할 수 있다. 일 예에서, 상기 외부에서 공급된 단백질은 통상의 표지물질 (예컨대, 형광물질 등)로 표지된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 단계 (i)은 시료 내의 BCL2 계통 단백질(제1 단백질)과 외부에서 공급된(exogenous) BCL2 계통 단백질(제1 단백질과 상호작용하는 단백질) 간의 상호작용을 측정하는 단계(제1 단백질-단백질 상호작용 측정 단계)로서, 기판에 고정된 제1 단백질(시료 내 단백질)에 외부에서 공급되고 표지물질로 표지된 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질을 접촉시키고, 상기 제1 단백질(시료 내 단백질) 및 이와 상호작용하는 단백질(외부 투입 단백질) 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정(예컨대, 제1 단백질 및 제1 단백질과 상호작용 하는 단백질 사이에 형성된 복합체 수준 측정)하는 단계를 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 단계 (ii)는 시료 내(endogenous)에서의 BCL2 계통 단백질 간의 상호작용을 측정하는 단계(제2 단백질-단백질 상호작용 측정 단계)로서, 상기 제1 단백질과 결합하는 결합물질(예컨대, 제1 단백질에 대한 항체 등)을 포함하는 기판에 제1 단백질을 포함하는 시료를 접촉시키고, 상기 제1 단백질(시료 내 단백질) 및 제1 단백질과 상호작용하는 단백질(시료 내 단백질) 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정 (예컨대, 제1 단백질 및 제1 단백질과 상호작용하는 단백질 사이에 형성된 복합체 수준을 측정)하는 단계를 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 단계 (i) 및/또는 (ii)에서, 제1 단백질 및 이와 상호작용하는 단백질 간 형성된 복합체 수준은 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질 (단계 (i)) 또는 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질에 결합하는 결합물질 (단계 (ii))에 표지된 표지물질로부터 발생한 신호 강도로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 단계 (iii)은 제1 단백질, 제1 단백질과 상호작용하는 단백질, 또는 이들 모두의 시료 내 수준(Total expression level)을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 시료 내 수준은 시료 내의 단백질 발현 수준(예컨대, 단백질 농도), 활성화된 단백질의 발현 수준(예컨대, 활성화된 단백질 농도), 인산화된 단백질의 발현 수준(예컨대, 인산화된 단백질 농도), 또는 이들 중 2 이상의 조합일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단계 (i)(제1 단백질-단백질 상호작용 측정 단계)은 다음 중 선택된 하나 이상 (예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개)을 포함할 수 있다:
(i-1) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-2) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-3) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-4) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-5) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-6) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-7) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-8) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-9) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 NOXA 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-10) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(i-11) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계; 및
(i-12) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계.
일 구체예에서, 상기 단계 (i)(제1 단백질-단백질 상호작용 측정 단계)의 각각의 단백질-단백질 상호작용 측정 단계는,
(1) 제1 단백질의 결합물질이 포함된 기판에 상기 시료를 공급하여 제1 단백질을 기판에 고정시키는 단계;
(2-1) 상기 기판에 표지물질이 부착된 제1단백질 상호작용 단백질을 외부로부터 공급하여 기판 상의 제1 단백질과 반응시키는 단계; 및
(3) 기판 표면상 근접장 영역 내에서 상기 표지물질이 발생시키는 신호를 TIRF 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)을 이용하여 측정하는 단계
에 의하여 수행되거나 상기 단계를 포함할 수 있다.
제1 단백질-단백질 상호작용 측정 단계에 있어서, 상기 외부에서 공급된 단백질(제1단백질 상호작용 단백질)은 표지물질로 표지된 (표지물질이 부착된) 것일 수 있다. 제1 단백질-단백질 상호작용 측정 단계에 있어서, 상기 단백질-단백질 상호작용의 측정은 제1 단백질(시료 내 단백질) 및 이와 상호작용하는 단백질(외부 단백질) 사이에 형성된 복합체 수준을 측정하여 수행될 수 있고, 일 예에서, 상기 복합체 수준은 제1단백질 상호작용 단백질에 부착된 표지물질에서 발생하는 신호에 의하여 측정될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단계 (ii)(제2 단백질-단백질 상호작용 측정 단계)는 다음 중 선택된 하나 이상(예, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11 개)을 포함할 수 있다:
(ii-1) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용 (예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계;
(ii-2) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용 (예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계;
(ii-3) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계;
(ii-4) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계;
(ii-5) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계;
(ii-6) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계;
(ii-7) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계;
(ii-8) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 NOXA 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
(ii-9) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계;
(ii-10) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계; 및
(ii-11) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계.
일 구체예에서, 상기 단계 (ii)(제2 단백질-단백질 상호작용 측정 단계)의 각각의 단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계는,
(1) 제1 단백질의 결합물질이 포함된 기판에 시료를 공급(투입)하여 제1 단백질을 기판에 고정시키는 단계;
(2-2) 표지물질이 부착된 제1단백질 상호작용 단백질의 결합 물질을 상기 기판에 공급하여, 제1 단백질(시료 내 단백질)과 제1단백질 상호작용 단백질(시료 내 단백질) 사이에 형성된 복합체 (complex) 중의 제1단백질 상호작용 단백질과 반응시키는 단계; 및
(3) 기판 표면상 근접장 영역 내에서 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 TIRF 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)을 이용하여 측정하는 단계
에 의하여 수행되거나 상기 단계를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 상기 단계 (ii)(제2 단백질-단백질 상호작용 측정 단계)의 각각의 단백질 상호작용(예, 형성된 복합체 수준)을 측정하는 단계는,
(1) 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질이 포함된 기판에 시료를 공급(투입)하여 제1 단백질 상호작용 단백질을 기판에 고정시키는 단계;
(2-2) 표지물질이 부착된 제1 단백질의 결합 물질을 상기 기판에 공급하여, 제1 단백질(시료 내 단백질)과 제1 단백질 상호작용 단백질(시료 내 단백질) 사이에 형성된 복합체 (complex) 중의 제1단백질과 반응시키는 단계; 및
(3) 기판 표면상 근접장 영역 내에서 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 TIRF 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)을 이용하여 측정하는 단계
에 의하여 수행되거나 상기 단계를 포함할 수 있다.
제2 단백질-단백질 상호작용 측정 단계에 있어서, 상기 복합체는 시료 내 제1 단백질과 시료 내 제1 단백질 상호작용 단백질 사이에서 내재적으로 형성된 것이다. 제2 단백질 단백질 상호작용 측정 단계에 있어서, 상기 단백질-단백질 상호작용의 측정은 제1 단백질 (시료 내 단백질) 및 이와 상호작용하는 단백질 (시료 내 단백질) 사이에 형성된 복합체 수준을 측정하여 수행될 수 있고, 일 예에서, 상기 복합체 수준은 상기 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질 또는 상기 제1 단백질의 결합물질에 부착된 표지물질에서 발생하는 신호에 의하여 측정될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단계 (iii)은 다음 중 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다:
(iii-1) 시료 내 BCL2 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(iii-2) 시료 내 BCLxl 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(iii-3) 시료 내 MCL1 단백질의 수준을 측정하는 단계;
(iii-4) 시료 내 BAX 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
(iii-5) 시료 내 BAK 단백질의 수준을 측정하는 단계.
상기 단계 (iii)의 각각의 수준 측정 단계는,
- 제1 단백질의 결합물질(제1 단백질의 기판 고정을 위한 포획물질), 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질(제1 단백질 상호작용 단백질의 고정을 위한 포획물질), 또는 이들 모두가 포함된 기판에 시료를 공급하여, 상기 제1 단백질, 제1 단백질 상호작용 단백질, 또는 이들 모두를 기판에 고정화시키는 단계;
- 표지물질이 부착된 제1 단백질의 결합물질(기판에 제1 단백질이 고정화된 경우, 제1 단백질 검출을 위한 검출물질), 표지물질이 부착된 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질(기판에 제1 단백질 상호작용 단백질이 고정화된 경우, 제1 단백질 상호작용 단백질 검출을 위한 검출 물질), 또는 이들 모두(기판에 제1 단백질 및 제1 단백질 상호작용 단백질이 고정화된 경우)를 상기 기판에 공급하여 반응시키는 단계; 및
- 기판 표면상 근접장 영역 내에서 상기 표지자가 발현하는 신호를 TIRF 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)을 이용하여 측정하는 단계
에 의하여 수행되거나 상기 단계를 포함할 수 있다.
상기 포획물질과 검출물질은 동일한 표적 단백질에 결합하는 서로 다른 단백질로서, 상기 표적 단백질 상의 결합하는 부위가 서로 완전히 중복되지 않는 모든 결합물질 (예컨대, 항체)들 중에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
상기 단계 (ii) 및/또는 (iii)에서 사용된 제1 단백질의 결합물질 또는 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질은 제1 단백질 또는 제1 단백질 상호작용 단백질에 결합하는 물질 (예컨대, 항체, 항원결합단편, 항체 유사체, 압타머, 소분자 화합물 등)일 수 있으며, 표지물질로 표지된 것일 수 있다. 이 때, 상기 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질은 제1 단백질 상호작용 단백질이 제1 단백질과 상호작용 (결합)하는 부위와 상이한 부위에서 제1 단백질 상호작용 단백질에 결합하는 물질일 수 있다.
일 예에서, 단계 (i), (ii) 또는 (iii)에서 제1 단백질을 기판에 고정(pull down)하기 위한 제1 단백질의 결합물질, 단계 (ii)에서 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질 사이에 형성된 복합체 검출(detecting)을 위한 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질, 및/또는 단계 (iii)에서 제1 단백질 또는 제1 단백질 상호작용 단백질 검출(detecting)을 위한 제1 단백질의 결합물질 또는 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질은 각 결합 대상 단백질에 대하여 통상적으로 사용 가능한 모든 항체들 중에서 특별한 제한 없이 선택된 1종 이상의 것일 수 있다. 상기 단계 (i) 내지 (iii) 중에서 2 이상이 수행되고 동일한 제1 단백질 및/또는 제1 단백질 상호작용 단백질이 2 이상의 단계에서 공통적으로 사용되는 경우, 동일한 단백질의 고정(pull down) 및/또는 검출(detecting)을 위하여 각 단계에서 사용되는 결합물질은 서로 같거나 상이할 수 있다. 본 명세서에 기재된 제1 단백질 및 제1 단백질과 상호작용하는 단백질의 결합물질을 다음과 같이 예시할 수 있다:
세포자살억제 (anti-apoptotic) 단백질
BCL2: ab32124, ab182858, ab238041, ab692 (이상, Abcam), 3498S, 15071S, #4223 (이상, CST), BSM-52304R, BSM-10846M, BSM-33411M, BSM-52022M (이상, Bioss), NB100-56098 (Novus), 12789-1-AP (Proteintech), LS-C159170-400 (LSBio), 13-8800 (Thermo Fisher Scientific), 610538 (BD), sc-509, sc-23960, sc-7382 (이상, Santa cruz), TA806591, CF806589, UM800117, CF806639 (이상, OriGene) 등;
BCL-XL: 2764S, 2762S, 2870, 3498S (이상, CST), ab77571, ab59348, ab32370, ab178844 (이상, Abcam), MA5-11950, MA5-28637 (이상, Invitrogen), MA5-15142 (Thermo Fisher Scientific), BSM-51229M (Bioss), sc-56021, sc-136207, sc-271121, sc-70417, sc-23958 (이상, Santa cruz), ALX-804-660-C100 (Enzo), 66020-1-IG (Proteintech), NBP2-25240, NBP2-32810, NBP2-44416, NBP1-47665 (이상, Novus), TA506188 (OriGene), H00000598-M01A (Abnova) 등;
MCL1: ab32087 (Abcam), 5453S, 39224S, #94296 (이상, CST), MA5-32060, 14-6701-82, 14-9047-82, MA5-15236, 14-6701-82, 14-9047-82 (이상, Invitrogen), SP2170P, TA500986, TA500990 (이상, OriGene), 16225-1-AP (Proteintech), LS-C475-0.1 (LSBio), MAB8825 (Abnova), sc-12756, sc-74437, sc-74436, sc-377487, sc-69839, sc-69840, sc-53951 (이상, Santa cruz) 등;
BCLw: MA5-15076 (Invitrogen), #2724 (CST), sc-293236, sc-130701 (이상, Santa cruz), NBP2-61706 (Novus) 등;
BFL1: NBP2-67563, NBP2-46568CST (이상, Novus), #14093 (CST), MA5-11757 (Invitrogen), sc-166943 (Santa cruz) 등;
세포자살유도(pro-apoptotic) 단백질
BAX: ab32503, ab182733, ab81083 (이상, Abcam), #5023, 2774S, 2772S (이상, CST), MA5-14003, MA5-16322, 35-9700 (이상, Invitrogen), BSM-52316R, BSM-33279M (이상, Bioss), 50599-2-Ig (Proteintech), SAB4502546 (Merck), NB100-56096 (Novus), 610982, 610983 (이상, BD), sc-7480, sc-23959, sc-70408 (이상, Santa cruz), CF810335, TA810334 (이상, OriGene), #633602 (Biolegend), LS-C357719-20 (LSBio) 등;
BAK: ab238515, ab32371, ab69404, ab137646 (이상, Abcam), 6947S, 12105S (이상, CST), B5897 (Merck), 06-536, AM03-100UGCN, SAB1305656 (이상 Sigma), H00000578-M01A, MAB8753 (Abnova), sc-517390, sc-518110 (이상, Santa cruz), MA5-36225 (Invitrogen), GTX10808 (GeneTex) 등;
BAD: 9296S (CST), sc-8044 (Santa cruz), MA5-11117, MA5-15230 (이상, Invitrogen) 등;
NOXA: ab68523 (Abcam), sc-515840, sc-56169, sc-398873 (이상, Santa cruz), 등;
BIM: MA5-15763, MA5-15764 (이상, Invitrogen), sc-374358 (Santa cruz), CF812441 (OriGene) 등.
상기 열거한 항체들은 예시를 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 이들 항체를 사용하는 것으로 제한되는 것은 아니다. 특정 단백질에 대한 결합 활성이 알려진 항체라면 모두 사용 가능하고, 동등한 효과를 기대할 수 있다.
본 명세서에서, 시료 내 단백질-단백질 상호작용 측정 (단계 (ii))에서 제1 단백질 상호작용 단백질 또는 제1 단백질의 검출 (detecting)을 위하여 사용된 제1 단백질 상호작용 단백질 또는 제1 단백질의 결합물질은 표지물질로 표지된 것일 수 있으며, 상기 결합물질이 항체인 경우에, 항체에 표지물질이 부착되거나, 상기 항체에 결합하는 이차 항체에 표지물질이 부착될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법은 상기 BCL2 계통 단백질 간의 상호작용을 측정하는 단계 (a1) 및/또는 시료 내 BCL2 계통 단백질 수준을 측정하는 단계 (a2)에 더하여,
(b) 상기 단계 (a1)에서 측정된 BCL2 계통 단백질 간 상호작용 및/또는 단계 (a2)에서 측정된 시료 내 BCL2 계통 단백질 수준을 기준 값과 비교하는 단계 (b1), 및/또는 상기 시료 또는 상기 시료가 분리된 개체가 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성을 가지는 환자 및/또는 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물이 상기 시료 또는 상기 시료가 분리된 개체에서 효과를 발휘할 수 있는 것으로 확인 (또는 결정, 판단)하는 단계, 및/또는 상기 개체를 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 적용하기에 적합한 대상으로 개체로서 선택 (또는 확인, 결정, 판단)하는 단계 (b2)를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법은, 상기 단계 (b) (구체적으로, b2) 이후에, 상기 단계 (b) (구체적으로, b2)에서 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성을 가지거나 상기 약물이 효능을 나타내는 것으로 확인된 개체, 또는 상기 약물을 적용하기에 적합한 것으로 선택된 개체에게 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 또는 상기 약물의 효능은 상기 약물의 표적 단백질 (예컨대, BCL2 단백질)을 표적 (예컨대, 저해)함으로써 얻어지는 병리학적 효과를 의미하는 것으로, 예를 들어, 항암 효과 (암 (또는 암세포)의 경감, 감소, 완화, 제거, 치료, 및/또는 진행 및/또는 전이의 억제 또는 지연, 등), 보다 구체적으로, 혈액암에 대한 항암 효과일 수 있다.
상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 투여 또는 상기 약물을 이용한 치료에 적합한 개체는 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물이 질병의 치료 효과를 나타낼 수 있는 환자를 의미하는 것으로, 예컨대, 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 투여 또는 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 이용한 치료에 의하여 항암 효과 (암 또는 암세포의 경감, 감소, 완화, 제거, 치료 등)가 발휘될 수 있는 환자일 수 있다.
상기 단계 (b) (구체적으로, b1)에서, 기준 값은 본 명세서에서 제공되는 방법을 이용하여 기존의 암환자(예컨대, 혈액암 환자)로부터 얻은 정보를 기반으로 설정될 수 있다. 일 예로, 상기 기준 값은, 1) BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료가 효과를 발휘한(BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성이 있는) 환자 또는 환자군, 또는 상기 환자 또는 환자군으로부터 분리된 시료 (효과군 시료)에 대하여 본 명세서에서 제공되는 방법(상기 단계 (a1) 및/또는 (a2))을 수행하여 얻어진 측정 값, 또는 2) BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료가 효과를 발휘하지 못한(BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성이 없는) 환자 또는 환자군, 또는 상기 환자 또는 환자군으로부터 분리된 시료 (비효과군 시료)에 대하여 본 명세서에서 제공되는 방법(상기 단계 (a1) 및/또는 (a2))을 수행하여 얻어진 측정 값일 수 있다.
일 예에서, 상기 기준값이 효과군 시료로부터 얻어진 것일 때, 시험 시료 내 BCL2 계통 단백질 간의 상호작용을 측정하는 단계(a1) 및/또는 시료 내 BCL2 계통 단백질 수준을 측정하는 단계(a2)에서 얻어진 측정값이 상기 기준값과 비슷한 범주 (예컨대, 동일 또는 10% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 또는 1% 이내의 오차 범위) 또는 상기 기준값을 초과하는 경우, 상기 시료 또는 상기 시료가 얻어진 개체를 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성을 가지는 환자 (또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료(투여)를 적용하기에 적합한 환자)로 선택하거나, 상기 시료 또는 개체에 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물이 효과를 발휘하는 것으로 확인 (또는 결정, 판단)할 수 있다 (단계 b2).
다른 예에서, 상기 기준값이 비효과군 시료로부터 얻어진 것일 때, 시험 시료 내 BCL2 계통 단백질 간의 상호작용을 측정하는 단계(a1) 및/또는 시료 내 BCL2 계통 단백질 수준을 측정하는 단계(a2)에서 얻어진 측정값이 상기 기준값과 비슷한 범주 (예컨대, 동일 또는 10% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 또는 1% 이내의 오차 범위) 또는 상기 기준값 미만인 경우, 상기 시료 또는 상기 시료가 얻어진 개체를 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성이 없는 환자 (또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료(투여)가 효과를 보이지 않는 환자)로 선택하거나, 상기 시료 또는 개체에 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물이 효과를 발휘하지 않는 것으로 확인 (또는 결정, 판단)할 수 있다 (단계 b2).
또 다른 일 예로, 상기 기준값은 효과군에 대하여 시료 내 BCL2 계통 단백질 간의 상호작용을 측정하는 단계 (a1) 및/또는 시료 내 BCL2 계통 단백질 수준을 측정하는 단계 (a2)에서 얻어진 측정 값의 최소값, 또는 중간 값 또는 평균 값으로 설정될 수 있다. 환자 정보가 추가됨에 따라 기준 값은 조정될 수 있고, 여러 분석 값으로부터 도출된 수식 또는 알고리즘에 따라 기준 값이 조정될 수도 있다. 본 명세서에서 제공되는 방법의 단계 (b)에서, 단계 (a1) 및/또는 단계 (a2)의 측정값이 해당 기준 값보다 높은 (비슷한 범주 및/또는 초과) 경우, 시험 시료 또는 상기 시료가 얻어진 개체를 BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료에 효과(반응성)가 있는 환자 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료(투여)에 적합한 환자로 선정할 수 있다.
또 다른 예로, 상기 기준값은 비효과군에 대하여 시료 내 BCL2 계통 단백질 간의 상호작용을 측정하는 단계 (a1) 및/또는 시료 내 BCL2 계통 단백질 수준을 측정하는 단계(a2)에서 얻어진 측정 값의 최대 값, 또는 중간 값 또는 평균 값으로 설정될 수 있다. 환자 정보가 추가됨에 따라 기준 값은 조정될 수 있고, 여러 분석 값으로부터 도출된 수식 또는 알고리즘에 따라 기준 값이 조정될 수도 있다. 본 명세서에서 제공되는 방법의 단계 (b)에서, 단계 (a1) 및/또는 단계 (a2)의 측정값이 해당 기준 값보다 낮은(비슷한 범주 및/또는 미만) 경우, 시험 시료 또는 상기 시료가 얻어진 개체를 BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료에 효과가 없는 환자로 선정할 수 있다.
다른 예로, 시료 내 상기 기준 값은 비교 단백질 및 상기 비교 단백질과 상호작용하는 단백질 간 상호작용 및/또는 시료 내 비교단백질 및/또는 상기 비교 단백질과 상호작용하는 단백질의 수준(발현량 또는 농도)일 수 있다. 상기 비교 단백질 및 비교 단백질과 상호작용하는 단백질은 세포자살억제(anti-apoptotic)과 세포자살유도 단백질 중에서 선택될 수 있다. 상기 비교 단백질 및 비교 단백질과 상호작용하는 단백질은 앞서 설명한 제1 단백질 및 제1 단백질과 상호작용하는 단백질과 각각 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 비교 단백질은 제1 단백질과 상이한 것일 수 있고, 상기 비교 단백질과 상호작용하는 단백질은 제1 단백질 상호작용 단백질과 동일하거나 상이한 것일 수 있다.
이 경우, 본 명세서에서 제공되는 방법은, 상기 단계 (b) 이전에, 다음의 단계 (a1') 및/또는 (a2')를 추가로 포함할 수 있다:
(a1') 시료 내 비교 단백질 및 상기 비교 단백질과 상호작용하는 단백질 간 상호작용을 측정하는 단계 및/또는 (a2') 시료 내 비교 단백질 및/또는 비교 단백질 상호작용 단백질 수준을 측정하는 단계.
다른 예는, BCL2 계통 단백질 표적 약물을 다음의 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 (예, 혈액암) 치료 방법, 및 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 포함하는, 다음의 개체에 적용(투여)하기 위한 암 (예, 혈액암) 치료용 약학 조성물 또는 다음의 개체의 암(예, 혈액암)을 치료하기 위한 암 치료용 약학 조성물을 제공한다:
개체로부터 얻어진 (분리된) 시료 내 BCL2 계통 단백질 간의 상호작용 (예컨대, 단계 (a1)의 (i) 및/또는 (ii)에 의하여 측정될 수 있음) 및/또는 시료 내 BCL2 계통 단백질 수준 (예컨대, 단계(a2)에서 측정될 수 있음)이 상기 기준값 (예컨대, 효과군으로부터 얻어진 기준값)과 비슷한 범주 또는 상기 기준값을 초과하는 개체 (예컨대, 본 명세서에서 제공되는 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 및/또는 상기 약물의 효능 예측 방법에 의하여 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대하여 반응성을 가지거나 상기 약물이 효능을 발휘할 것으로 확인된 개체, 및/또는 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 투여 또는 이를 이용한 치료에 적합한 대상의 선택 방법에 의하여 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 투여 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 이용한 치료에 적합한 대상으로 선택된 개체).
상기 BCL2 계통 단백질은 BCL-2 상동성 (BCL-2 homology; BH; BH1, BH2, BH3) 도메인을 공유하는 단백질들을 총칭하는 것으로, 세포자살(apoptosis; 예컨대 미토콘드리아에서의 세포자살)을 조절한다.
본 명세서에 사용된 바로서, 제1 단백질은 BCL2 계통 단백질 중에서 세포자살을 막는 세포자살 억제 (anti-apoptotic) 단백질로서, 세포자살 단백질 및/또는 세포자살 유도 단백질과 상호작용(결합)하여 세포자살 단백질 및/또는 세포자살 유도 단백질의 기능을 저해하는 기능을 갖는 것일 수 있다. 상기 제1 단백질은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 포함되어 있거나 상기 시료에서 분리된 형태일 수 있다. 일 예에서, 상기 제1 단백질은 인간 등의 포유동물 유래의 단백질일 수 있고, 예컨대, BCL2 (예, NCBI ref seq. NM_000633.2 등), BCLxL (예, NCBI ref seq. NM_138578.1 등), MCL1 (예, NCBI ref seq. NM_021960.3 등), BCLw(예, NCBI ref seq. NM_001199839.2 등), BFL1(예, NCBI ref seq. NM_001114735.2 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 BH3 서브타입 (BH3-only) 단백질(제2 단백질); 및 세포자살 이펙터 (pro-apoptotic effector) 단백질(제3 단백질);로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 상기 제2 단백질(BH3 서브타입 단백질)은 BH3 도메인만으로 구성되어 BH3-only 단백질로도 칭해진다. 예컨대, 상기 제2 단백질은 BIM (예, NCBI ref seq. B033694), BID (예, NCBI ref seq. NM_001196.2) 또는 tBID (예, NCBI ref seq. NM_001196.2의 N-terminal truncated form 등), BAD (예, NCBI ref seq. NM_004322.2 등), NOXA(예, NCBI ref seq. NM_001382616.1 등), PUMA(예, NCBI ref seq. AAO16862.1 등), BMF(예, NCBI ref seq. NM_001003940.2 등), BIK(예, NCBI ref seq. 1.NM_001197.5), HRK(예, NCBI ref seq. 1.NM_003806.4 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 제3 단백질은 여러 개의 BH 도메인을 포함하는 세포자살 유도 (pro-apoptotic) 단백질로서, 예컨대 BAX (예, NCBI ref seq. NM_138761.3 등), BAK (예, NCBI ref seq. NP_001179.1 등), BOK(예, NCBI ref seq. NM_032515.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
다른 예에서, 상기 제1 단백질은 앞서 설명한 바와 같은 BH3 서브타입 (BH3-only) 단백질(제2 단백질); 및 세포자살 이펙터 (pro-apoptotic effector) 단백질(제3 단백질)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 앞서 설명한 바와 같은 세포자살 억제 (anti-apoptotic) 단백질 중에서 선택된 것일 수 있다.
본 명세서에서, 외부에서 공급되는 제1 단백질 상호작용 단백질은 야생형 또는 제1 단백질과의 상호작용이 가능할 것을 전제로, 야생형과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성 (identity or homology)을 가지는 변이형 단백질일 수 있다. 또한, 상기 제1 단백질 상호작용 단백질은 인간 유래의 것이거나, 인간 유래 제1 단백질과 상호작용 가능한 이종 유래의 것일 수 있다.
상기 개체는 인간 등의 포유동물일 수 있으며, 예컨대, 암환자(혈액암, 고형암), 보다 구체적으로 혈액암 환자일 수 있다. 또한, 기준값 설정을 위하여, 상기 개체는 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 투여 또는 상기 약물의 효능 확인이 필요한 개체일 수 있다.
본 명세서에서, 혈액암은 백혈병 (예, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 만성골수성백혈병, 만성림프구성백혈병 등), 림프종 (예, 악성 림프종, B 세포 림프종, 소림프구림프종 (small lymphocytic lymphoma; SLL) 등), 다발성골수종, 골수형성이상증후군 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 시료는 상기 환자로부터 분리된(유래한) 생물학적 시료로서, 세포, 세포 용해물, 조직, 또는 이들의 배양물, 또는 확립된 세포주를 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 상기 세포 또는 조직은 암세포 또는 암조직일 수 있고, 구체적으로 상기 암은 혈액암 또는 고형암 (예컨대, 유방암 또는 폐암(e.g., 폐선암 등) 등)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 개체는 인간 혈액암 환자이고, 상기 시료는 혈액암 또는 고형암 (예컨대, 유방암 또는 폐암(e.g., 폐선암 등) 환자로부터 분리된 백혈구 (예, 과립백혈구, 림프구, 및/또는 단핵구 등), 골수세포 (예, 조혈모세포 등), 상기 세포를 포함하는 혈액, 골수, 버피코트 (buffy coat), 암세포, 암 조직, 또는 이들의 용해물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
일 예에서, 상기 시료는 혈액암 또는 고형암 (예컨대, 유방암 또는 폐암(e.g., 폐선암 등) 환자로부터 분리된 백혈구 (예, 과립백혈구, 림프구, 및/또는 단핵구 등), 골수세포 (예, 조혈모세포 등), 상기 세포를 포함하는 혈액, 골수, 버피코트 (buffy coat), 암세포, 암 조직 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용해물일 수 있다. 상기 용해물은 Hepes, NaCl, Glycerol, 콜레스테롤계 세정제(detergent; 이하, 계면활성제로도 기재됨), phosphatase inhibitor cocktail 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 용제를 사용하여 얻어진 것일 수 있고, 이 때, 콜레스테롤계 세정제 (예컨대, glycol-diosgenin (GDN), 디기토닌(digitonin) 등), PEG계 세정제 (예컨대, Triton x-100 등) 등의 사용이 필수적일 수 있다. 본 명세서에서 사용 가능한 세정제)는 GDN, 디기토닌(Digitonin), Triton x-100 (TX-100), 또는 이들 중 2 이상의 조합 등을 포함할 수 있다. 예컨대, GDN은, 전체 용제 기준으로, 0.001~10 %, 0.005~5%, 0.008~1.2%, 0.01~10 %, 0.05~5%, 0.08~1.2%, 0.1~10 %, 0.5~5%, 0.8~1.2%, 또는 약 1%(weight for weight)의 양으로 사용될 수 있다. 상기 용해물은 상기 세정제를 이용하여 적절한 농도로 희석하여 사용될 수 있다. 상기와 같은 콜레스테롤계 세정제 및/또는 PEG계 세정제를 사용하는 경우, 다른 계열의 세정제를 사용한 경우와 대비하여, 세포 외(in vitro)에서 세포의 기능, 활성, 및/또는 단백질 3차 구조를 세포 내와 유사하게 안정적으로 유지할 수 있어, 실제 세포 내 환경에서의 단백질의 구조 및/또는 기능을 비교적 정확하게 모사할 수 있고, 세포 내에서의 단백질 고유 특성을 세포 외에서 정확히 관측할 수 있다는 이점을 가질 수 있다.
상기 단계 (i)에서 외부에서 공급되는(exogenous) 표지물질이 부착된, 제1단백질과 상호작용하는 단백질은 세포용해액 형태로 사용될 수 있다. 상기 세포 용해액은 표지물질이 부착된, 제1단백질과 상호작용하는 단백질을 재조합적으로 발현하는 세포를 적절한 용제, 예컨대 TX-100 또는 콜레스테롤계 세정제을 포함하는 용제를 사용하여 용해시켜 얻어진 것일 수 있다. 예컨대, TX-100은, 전체 용제 기준으로, 0.001%~1% 또는 0.2~5% (weight for weight)를 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.5~2%, 더 바람직하게는 0.8~1.2%, 더 바람직하게는 1%를 포함할 수 있다. 상기 제조된 세포용해액은 희석 후 기판에 공급되는데, 이 때 세포용해액은 TX-100을 0.02~0.04%를 포함하도록 설정함이 바람직하다. 상기 TX-100 농도의 임계 값을 초과하면, PEG으로 코팅되어 있는 기판에서 일어나는 비특이적인 결합 신호를 줄일 수 있지만, 제1단백질과의 특이적인 상호작용으로 관측되어지는 제1단백질과 상호작용하는 단백질의 측정값(신호값)이 낮게 형성되어 단백질 분석에 용이하지 않다. 상기 임계 값 미만이면, 용매 안 TX-100의 임계미셸농도(Critical Micell Concentration; CMC) 이하의 상태로 존재하기 때문에 제1단백질 상호작용 단백질의 용해상태가 불안정해지며, PEG으로 코팅되어 있는 기판에서 일어나는 제1단백질 상호작용 단백질의 비특이적인 결합신호가 증가하게 되어 유효하지 않은 신호가 측정되어 단백질 분석에 용이하지 않을 수 있다. 이는 콜레스테롤계 세정제를 사용함에 있어서도 해당 세정제의 임계미셸농도 이상을 사용하는 것은 동일하게 바람직하다.
상기 제1단백질 상호작용 단백질을 포함하는 세포 용해액 내의 제1단백질 상호작용 단백질의 농도는 10-2 내지 103 nM 또는 10-1 내지 102 nM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 적절히 조절할 수 있다.
본 명세서에서, 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물은 상기한 BCL2 계통 단백질(예컨대, 세포자살 억제 (anti-apoptotic) 단백질)을 인식 및/또는 저해하는 단백질 (예컨대, 항체, 또는 이의 유사체 등), 핵산 분자 (예컨대, siRNA 등), 및 소분자 화합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 세포자살 조절 약물 (Apoptosis-Controlling Drug)일 수 있으며, 일 구체예에서 항암 효과, 예컨대 혈액암에 대하여 항암 효과를 갖는 것일 수 있다. 예컨대, BCL2 표적 약물 (예, BCL2 저해제)의 예로서 항 BCL2 항체, Venetoclax, ABT737 등을 들 수 있고, BCLxL 표적 약물 (예, BCLxL 저해제)의 예로서 항 BCLxL 항체, ABT263 등을 들 수 있고, MCL-1 표적 약물 (예, MCL-1 저해제)의 예로서 항 MCL-1 항체, AMG-176, AZD5991, Maritoclax 등을 들 수 있다.
상기 베네토클락스(Venclexta® 또는 Venclyxto®)은 급성골수성백혈병(acute myeloid leukemia; AML), 만성림프구성백혈병 (chronic lymphocytic leukemia; CLL), 소림프구임파종 (small lymphocytic lymphoma; SLL) 등의 치료에 사용될 수 있다.
이하, 보다 상세히 설명한다.
일 예에서, BCL2 계통 단백질 표적 약물의 대표적인 예로 베네토클락스(Venetoclax)를 들어 설명한다:
앞서 설명한 바와 같이, 본 명세서에서 유전자적 특징으로는 관측할 수 없는 BCL2 계통 단백질들의 세포자살 억제 능력을 단분자 단백질 상호작용 측정방법을 통해 정량적으로 파악하고, 이를 혈액암 환자의 진단방법으로 활용함을 제안한다. 이를 위한 핵심적인 기술들은 다음과 같다: (1) 단백질 상호작용의 관측이 세포 내 존재하는 BCL2 계통 단백질의 다양한 상태를 반영, (2) 다각적 단백질 상호작용 관측 및 단백질 수준 관측의 정량적인 비교를 통해 BCL2 계통 단백질 표적 약물(일 예로 베네토클락스(Venetoclax), AMG 176, 또는 AZD5991 등)에 민감한 세포주 및 환자들을 선별 가능.
(1) 세포 내 상태를 유지하여 BCL2 계통 단백질을 기판에 포획
본 명세서에서는 세포 내 존재하는 BCL2 계통 단백질들의 상태가 유지된 상태로 기판에 포획되는지를 확인하였다.
일 실시예에서, 대표적인 혈액암 세포주인 HL60 (급성골수성백혈병) 또는 OCI-LY3 (B 세포 림프종) 세포주에 세포사멸 유도를 위해 베네토클락스(Venetoclax)를 세포 배양 중에 처리한다. 이 후 세포사멸 단백질인 BAX 단백질의 활성화된 형태 (conformation)를 나타내는 N-말단이 드러난(노출된) BAX를 측정하는 실험을 수행한다. 이 때, 베네토클락스(Venetoclax)를 처리함에 따라 N-말단이 드러난 BAX의 양이 증가하는 것을 볼 수 있다. 반면, 세포용해액에 TX-100 처리를 통해 인위적으로 BAX 단백질의 N-말단이 노출되게 만든 뒤 동일한 검사를 수행할 경우 BAX의 비슷한 양이 유지되는 것을 확인할 수 있다. 이는 BAX의 발현량은 변하지 않지만, 베네토클락스 처리시에 N-말단이 드러난 활성화된 형태의 BAX 단백질 비율이 증가하는 것을 의미한다 (도 17 참조).
이와 같은 결과를 통해, 본 명세서에 제안하는 방법은 BCL2 계통 단백질이 세포 내에서 이루고 있는 형태/PTM(Post-translational modifications) 등을 그대로 반영할 수 있음을 입증한다.
(2) 세포 내 BCL2 계통 단백질의 상태 변화가 반영되는 단백질 간 상호작용(PPI, Protein-Protein Interaction) 확인
본 명세서에서 세포 내 존재하는 BCL2 계통 단백질들의 상태 변화가 단백질 상호작용(PPI) 측정에 반영됨을 확인하였다.
일 실시예에서, OCI-LY3 세포주나 HL60 세포주에 각각 BCL2 저해제인 베네토클락스(Venetoclax), MCL1 저해제인 AZD5991을 처리한 뒤 BCL2 계통 단백질들의 단백질 간 상호작용(PPI) 변화를 비교하였다. 해당 저해제는 BCL2, MCL1 단백질과 다른 단백질 사이의 상호작용을 선택적으로 저해하기에 해당 약물 처리에 의한 세포 내 BCL2 계통 단백질의 상태 변화 (예를 들어 복합체 형성 정도)를 기대할 수 있다. 실제, OCI-LY3 세포주를 배양 중에 베네토클락스(Venetoclax)(BCL2 저해제)와 AZD5991(MCL-1 저해제)을 각각 24시간 처리한 후 획득된 세포용해액과 아무런 처리를 하지 않은 상태의 세포용해액(무처리군)을 각각 준비한 후 해당 세포용해액에서 추출된 BCL2, MCL1 단백질과 BAD, NOXA (표지자 GFP가 부착된) 단백질 사이의 상호작용을 측정하였을 때, 베네토클락스(Venetoclax)가 처리된 세포용해액에서 측정된 BCL2-BAD 사이의 상호작용(PPI)이 무처리군에서 측정된 BCL2-BAD 사이의 상호작용(PPI) 보다 높은 것으로 확인되었다. 또한, AZD5991이 처리된 세포용해액에서 나온 MCL1 단백질과 NOXA(표지자 부착) 단백질의 상호작용이 무처리군에서 측정된 MCL1 단백질과 NOXA(표지자 부착) 단백질의 상호작용보다 높은 것으로 확인되었다. 반면, Venetoclax 처리는 MCL1-NOXA 상호작용(PPI)에 아무런 영향을 미치지 않고, AZD5991 처리는 BCL2-BAD 상호작용(PPI)에 아무런 영향을 미치지 않았다. 또한, 본 실험에서 사용된 조건 하에서는 각 약물의 처리가 BCL2, MCL1 발현량에 현저한 변화를 일으키지는 않은 것으로 증명되었다.
즉, 특정 약물에 반응하는 특정 단백질의 상태변화를 확인 및/또는 상기 특정 단백질 이외의 다른 단백질은 상태변화가 일어나지 않은 것을 확인함으로써, 본 명세서에서 제공되는 방법이 약물 처리에 의한 정확한 상태 변화를 측정할 수 있음을 확인하였다.
종래의 많은 연구가 BCL2 단백질의 발현양을 측정해 세포안에서 BCL2가 세포자살 작용을 억제하는 정도를 가늠하였지만, 본 명세서에서는 단백질의 분자적 형질이 반영된 PPI 관측을 통해서 세포자살 작용을 억제하는 정도를 정량적으로 측정할 수 있음이 특징이다.
(3) 다각적 단백질 상호작용 관측 및 단백질 수준 관측을 통한 BCL2 계통 단백질 표적 약물 민감도 예측
본 명세서에서는 세포나 환자 검체의 세포자살유도 단백질과 세포자살억제 단백질들이 세포사멸에 미치는 영향을 시료 내 단백질과 외래 단백질 간 상호작용 측정(제1 단백질-단백질 상호작용 측정), 시료 내 단백질 간 상호작용 측정(제2 단백질-단백질 상호작용 측정), 및/또는 단백질 발현 양 측정 등을 각각 정량적으로 실시하여, 세포사멸신호를 복합적으로 분석하였으며 이를 이용하여 BCL2 계통 단백질 표적약물(일 예로 베네토클락스(Venetoclax))에 대한 민감도를 확인하였다.
상기 시료 내 단백질과 외래 단백질 간 상호작용 측정은 시료 내의 BCL2, BCLxL, MCL1 등 세포자살억제 단백질과, BIM, BAD, NOXA, BAX, BAK 등 외부(시료 외)에서 공급된 세포자살유도 단백질 간의 상호작용(제1 단백질-단백질 상호작용, 이하 제1 PPI(Protein-Protein Interaction)라 정의함)을 측정하여, BCL2 표적 저해제(일 예로 베네토클락스(Venetoclax))또는 MCL1 표적 저해제(일 예로 AMG 176) 반응성과의 상관관계를 정량적으로 분석하였다. 이 때 시료 외에서 공급된 세포자살유도 단백질은 표지자가 부착되어 있다.
상기 시료 내 단백질간 상호작용 (예를 들어, 단백질 복합체 형성) 측정은 시료 내의 BCL2, BCLxL, MCL1 등 세포자살억제 단백질과 동일 시료 내의 BAX, BAK, BIM, BAD, NOXA 등 세포자살유도 단백질 간의 상호작용(제2 단백질-단백질 상호작용, 이하 제2 PPI(Protein-Protein Interaction)라 정의함)을 측정하여, BCL2 표적 저해제(일 예로 베네토클락스(Venetoclax))또는 MCL1 표적 저해제(일 예로 AMG 176) 감수성과의 상관관계를 확인하였다.
상기 시료 내 단백질과 외래 단백질 간 상호작용(제1 PPI) 수준 및/또는 시료내 단백질 간 상호작용(제2 PPI) 수준을 비교분석 함으로써, BCL2 표적 저해제(일 예로 베네토클락스(Venetoclax))또는 MCL1 표적 저해제(일 예로 AMG 176) 감수성과의 상관관계를 분석하였다. 상기 비교분석을 통하여 시료 내 BCL2, BCLxL, MCL1 등 세포자살억제 단백질의 상태를 확인할 수 있다. 일 예로 세포자살억제 단백질의 세포자살유도 단백질과 상호작용하는 활성 자리의 노출 정도를 확인할 수 있다. 이로부터 단백질 간 결합정도, 결합세기, 잔여 결합자리, 약물 민감도 등을 간접적으로 예측할 수 있다.
본 명세서에서는, 시료 내의 BCL2, BCLxL, MCL1 등 세포자살억제 단백질 또는 BAX, BAK 등 세포자살유도 단백질의 수준을 측정하여, BCL2 표적 저해제(일 예로 베네토클락스(Venetoclax))또는 MCL1 표적 저해제(일 예로 AMG 176) 감수성과의 상관관계를 확인하였다. 상기 단백질의 수준은 단백질 발현 수준일 수 있고, 활성화된 단백질의 발현 수준일 수 있고, 인산화된 단백질의 발현 수준일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 단백질-단백질 상호작용 측정은 single-molecule pull-down 및/또는 co-immunoprecipitation (co-IP)를 기반으로 하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바로서, 용어 "단백질-단백질 상호작용 (protein-protein interaction: PPI)"은 제1 단백질과 제1단백질 상호작용 단백질 간의 물리적 및/또는 화학적 결합 또는 복합체 형성을 의미할 수 있으며, 예컨대, 결합 빈도, 결합 세기(강도), 및 결합 시간 등의 인자들 중에서 하나 이상으로 측정될 수 있다. 또한, 상기 제1 단백질과 제1단백질 상호작용 단백질 간의 상호작용 (결합)은 이들 간의 직접적인 상호작용 (결합)뿐 아니라 중간에 다른 단백질 (신호전달경로 중에서 제1 단백질 및 제1단백질 상호작용 단백질 사이에 위치하는 단백질)을 매개로 한 상호작용 (결합)도 포함할 수 있다. 본 명세서에서의 단백질-단백질 상호작용은 단분자 (single molecule) 반응 (1 분자의 제1 단백질과 1 분자의 제1단백질 상호작용 단백질 간의 반응)일 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 제1 단백질은 BCL2 계통 단백질 (Anti-apoptotic 단백질)로서, BCL-2 (예, NCBI ref seq. NM_000633.2 등), BCLxL (예, NCBI ref seq. NM_138578.1 등), 또는 MCL-1 (예, NCBI ref seq. NM_021960.3 등)일 수 있다. 상기 제1 단백질 상호작용 단백질은 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질로서, BIM (예, NCBI ref seq. B033694), BID (예, NCBI ref seq. NM_001196.2) 또는 tBID (예, NCBI ref seq. NM_001196.2의 N-terminal truncated form 등), BAD (예, NCBI ref seq. NM_004322.2 등), BAX (예, NCBI ref seq. NM_138761.3 등), NOXA(예, NCBI ref seq. NM_001382616.1), BAK(예, NCBI ref seq. NP_001179.1 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법에서 수행되는 제1 단백질 및 제1 단백질 상호작용 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계 (a1; (i) 및/또는 (ii))는 분리된 세포 또는 조직에 대하여 생체 외 또는 세포 외 (in vitro)에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 의한 측정을 단계 별로 상세히 설명한다.
단계 (1): 제1 단백질이 고정화된 기판 준비 단계 (단계 (i) 및 (ii) 공통)
상기 단계 (1)은 제1 단백질 또는 제1 단백질을 포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제1 단백질이 고정된 기판을 준비하는 단계이다.
상기 시료는 개체(환자)로부터 분리된 세포, 조직, 세포 또는 조직의 용해물, 파쇄물, 또는 추출물, 체액 (예컨대, 혈액 (전혈, 혈장, 또는 혈청), 타액 등)일 수 있다. 상기 환자는 암환자 예컨대 혈액암 환자일 수 있고, 상기 시료는 상기 암세포 (혈액암 세포)를 포함하는 것일 수 있으며, 그 구체적인 예는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 기판은 표면에 제1 단백질을 고정시킬 수 있는 모든 재질 및/또는 모든 구조를 갖는 것일 수 있다 (결정질 또는 비결정질 모두 사용 가능함). 일 예에서, 상기 기판은, 표지 신호의 검출 용이성을 고려하여, 빛의 굴절률이 생체 물질의 많은 부분을 차지하는 물의 굴절률 (약 1.3) 이상인 재질일 수 있다. 일 예에서, 상기 기판은 두께가 약 0.1 내지 약 1 mm, 약 0.1 내지 약 0.5 mm, 0.1 내지 약 0.25 mm, 또는 약 0.13 내지 약 0.21 mm 정도일 수 있으며, 굴절률이 약 1.3 내지 약 2, 약 1.3 내지 약 1.8, 약 1.3 내지 약 1.6, 또는 약 1.5 내지 약 1.54 정도인 것일 수 있다. 상기 기판은 상기 굴절률 범위를 만족시키는 모든 재질일 수 있으며, 예컨대 유리 (굴절률: 약 1.52), 석영 등으로 이루어진 군에서 선택된 재질로부터 얻어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 기판은 생물 시료 관찰에 통상적으로 사용되는 모든 형태를 갖는 것일 수 있으며, 예컨대, 웰 타입, 슬라이드 타입, 채널 타입, 어레이 형태, 미세유체칩, 미세관 (캐필러리) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 형광현미경 관찰시, 상기 시료가 적용된 기판 위에 커버글라스를 장착하여 관찰할 수 있으며, 커버글라스의 재질은 앞서 기판에서 설명한 바와 같고, 두께는 기판에서 설명한 범위 또는 이보다 얇을 수 있다 (예컨대, 굴절률 1.52, 두께 0.17mm일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아님).
상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 제1 단백질, 즉, BCL2, BCLxL, MCL1 또는 이들 모두와 특이적으로 결합할 수 있는 모든 물질로부터 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, BCL2, BCLxL, MCL1, 또는 이들 모두에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편 (예컨대, 항체의 scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2 등), 압타머 (단백질 또는 핵산분자), 소분자 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 때, 상기 제1 단백질(BCL2, BCLxL, MCL1, 또는 이들 모두)에 특이적으로 결합하는 물질은 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질과의 상호작용을 방해하지 않는 부위, 즉, 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질이 상호작용(결합)하는 부위가 아닌 부위에서 제1 단백질과 결합하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 기판은 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 물질 (예컨대, 항체 등)을 표면에 포함(고정)하기 위하여 적절히 표면개질되거나, 표면에 직접 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질이 고정된 것일 수 있다. 상기 기판이 표면개질된 경우, 상기 기판은 일면에 상기 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 물질 (예컨대, 항체 등)을 고정화시킬 수 있는 작용기를 갖는 모든 화합물로 처리(예컨대, 도포)될 수 있으며, 예컨대, 알데히드기, 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 화합물로 처리될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 알데히드기, 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 화합물은 바이오틴(biotin), 소혈청알부민 (Bovine serum albumin; BSA), 바이오틴이 결합된 소혈청알부민, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG), 바이오틴이 결합된 PEG (폴리에틸렌글리콜-바이오틴; PEG-biotin), 폴리소베이트 (e.g., Tween20) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표면 처리된 기판은 뉴트라비딘(neutravidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 처리(예컨대, 도포)될 수 있다.
단계 (2): 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질을 반응시키는 단계
상기 단계 (2)는 하기 단계 (2-1) 및/또는 (2-2)를 실시할 수 있다.
단계 (2-1): 시료 내 단백질 및 시료 외 단백질 간 단백질-단백질 상호작용 (단계 (i)의 제1 단백질-단백질 상호작용)
상기 단계 (2-1)은, 상기 제1 단백질(시료 내 단백질)이 고정된 기판 (예컨대, 상기 단계 (1)에서 준비될 수 있음)에, 표지물질로 표지된(부착된) 제1 단백질 상호작용 단백질(시료 외 단백질)을 첨가하여 상기 제1 단백질과 반응시키는 단계이다. 상기 표지물질로부터 생성된 신호를 측정함으로써, 시료 내 단백질과 시료 외 단백질 간의 복합체 형성 수준을 확인할 수 있고, 이를 통하여 시료 내 단백질과 시료 외 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용 수준을 측정할 수 있다.
상기 표지된 제1 단백질 상호작용 단백질은 제1 단백질 상호작용 단백질이 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되거나 (표지 물질이, 예컨대, 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적), 재조합적, 또는 물리적으로, 결합되거나), 표지물질이 결합될 수 있는 tag이 부착된 형태를 의미할 수 있다. 상기 검출 가능한 신호는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광, 및/또는 방사선 검출을 통하여 측정될 수 있는 모든 신호 (예컨대, 빛, 방사선 등)들 중에서 선택될 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 표지 신호를 발생시킬 수 있는 모든 소분자 화합물, 단백질, 펩타이드, 핵산분자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 형광 염료 (소분자 화합물; Cyanine, Alex, Dylight, Fluoprobes 등), 형광 단백질 (예컨대, 녹색형광단백질 (GFP, enhanced GFP), 황색형광단백질 (YFP), 청록색형광단백질(CFP), 청색형광단백질(BPF), 적색형광단백질(RPF), mcherry 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 tag은 His-tag / Ni-NTA 등과 같이 통상적으로 사용되는 모든 종류에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 표지 물질의 사용 농도는, 노이즈를 발생시키지 않고 정확하고 용이한 검출이 가능하도록 하기 위하여, 약 1uM 이하의 범위에서 적절하게 정할 수 있으며, 예컨대, 1nM 내지 1000nM, 1nM 내지 500nM, 1nM 내지 100nM, 10nM 내지 1000nM, 10nM 내지 500nM, 또는 10nM 내지 100nM 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 표지물질로부터 발생하는 신호는 이를 검출 또는 측정하는데 통상적으로 사용되는 모든 신호 검출 수단 (예컨대, 통상의 형광 현미경, 형광 카메라, 형광세기 측정 (정량) 장치 등)에 의하여 측정될 수 있다.
단계 (2-2): 시료 내 단백질 간 단백질-단백질 상호작용 (단계 (ii)의 제2 단백질-단백질 상호작용)
상기 단계 (2-2)는, 상기 제1 단백질이 고정된 기판 (예컨대, 상기 단계 (1)에서 준비될 수 있음)에, 제1단백질 상호작용 단백질의 결합물질(상기 결합물질은 표지물질이 부착됨)을 공급하여, 제1 단백질(시료 내)과 제1 단백질 상호작용 단백질 (시료 내) 간 형성된 복합체 (complex) 중의 제1 단백질 상호작용 단백질과 반응시키는 단계이다. 상기 표지물질로부터 생성된 신호를 측정함으로써 시료 내 단백질 복합체 형성 수준을 확인할 수 있고, 이를 통하여 시료 내 단백질-단백질 상호작용 수준을 측정할 수 있다.
상기 제1 단백질 상호작용 단백질 결합물질은 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되거나 (표지 물질이, 예컨대, 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적), 재조합적, 또는 물리적으로, 결합되거나), 표지물질이 결합될 수 있는 tag이 부착된 형태를 의미할 수 있다. 상기 검출 가능한 신호는 통상적인 효소 반응, 형광, 발광, 및/또는 방사선 검출을 통하여 측정될 수 있는 모든 신호 (예컨대, 빛, 방사선 등)들 중에서 선택될 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 표지 신호를 발생시킬 수 있는 모든 소분자 화합물, 단백질, 펩타이드, 핵산분자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 형광 염료 (소분자 화합물, 유기형광염료(organic fluorescent dye); Cyanine, Alex, Dylight, Fluoprobes 등), 형광 단백질 (예컨대, 녹색형광단백질 (GFP, enhanced GFP), 황색형광단백질 (YFP), 청록색형광단백질(CFP), 청색형광단백질(BPF), 적색형광단백질(RPF), mcherry 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 tag은 His-tag / Ni-NTA 등과 같이 통상적으로 사용되는 모든 종류에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 표지 물질의 사용 농도는, 노이즈를 발생시키지 않고 정확하고 용이한 검출이 가능하도록 하기 위하여, 약 1uM 이하의 범위에서 적절하게 정할 수 있으며, 예컨대, 1nM 내지 1000nM, 1nM 내지 500nM, 1nM 내지 100nM, 10nM 내지 1000nM, 10nM 내지 500nM, 또는 10nM 내지 100nM 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 표지물질로부터 발생하는 신호는 이를 검출 또는 측정하는데 통상적으로 사용되는 모든 신호 검출 수단 (예컨대, 통상의 형광 현미경, 형광 카메라, 형광세기 측정 (정량) 장치 등)에 의하여 측정될 수 있다.
단백질의 상호작용을 보다 정확하게 측정하기 위하여, 반응시키는 단계 (단계 (2))와 후속하는 단백질-단백질 상호작용 측정 단계 (단계 (3)) 사이에, 상기 반응이 일어난 기판을 통상적인 방법으로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단계 (3): 단백질-단백질 상호작용 측정 단계
상기 단계 (3)은 상기 단계 (2) (즉, (2-1) 및/또는 (2-2))에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계이다. 상기 신호 측정은 단계 (2)에서 사용된 표지 신호(예컨대, 효소 반응, 형광, 발광, 또는 방사선 검출 등의 통상적인 방법을 통하여 측정 가능한 신호)를 검출 (또는 측정 또는 확인)할 수 있는 모든 수단을 사용하여 수행될 수 있다.
일 예에서, 단계 (3)에서의 단백질-단백질 상호작용 측정은 실시간 분석에 의한 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 표지 신호가 형광 신호인 경우, 상기 신호 검출은 상기 형광 신호를 발생시키는 표지 물질이 흡수하는 광원을 공급하여 발생하는 형광 신호를, 예컨대, 형광 현미경, 형광 (측정) 카메라, 및/또는 형광 세기 측정 (정량) 장치 등을 사용하여, 영상화하거나 및/또는 정량할 수 있다.
상기 신호가 형광 신호인 경우, 단계 (3) (단백질-단백질 상호작용 측정 단계)은
(i) 상기 단계 (2)의 반응물에 광원을 공급하는 단계; 및
(ii) 상기 공급된 광원에 의하여 발생한 형광 신호를 검출하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 단계 (i)의 광원을 공급하는 단계는 상기 단계 (2)에서 얻어진 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질의 반응물에 광원을 공급하는 단계로서, 이와 같은 목적을 달성할 수 있다면, 광원의 공급 시기는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 광원은 단계 (1) 이전, 동시, 또는 이후부터 단계 (2) 이후까지 지속적으로 공급되거나, 단계 (2) 직전, 동시, 또는 직후에 소정의 시간 동안 공급될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 광원은 형광 신호에 해당하는 파장을 갖는 모든 광원일 수 있으며, 예컨대, 레이저, 할로겐 램프 등일 수 있다.
일 구체예에서, 단계 (3)의 단백질-단백질 상호작용 측정 단계는 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscope) 또는 공초점 현미경 등을 사용하여 광원을 공급하고, 통상적인 방법으로 형광 신호를 관찰하여 수행될 수 있다. 다른 예에서, 상기 전반사 형광 현미경에 신호 영상화를 위한 형광 (측정) 카메라, 예컨대 EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device) 또는 CMOS (Complementary metal oxide semiconductor)를 장착하여 사용함으로써, 광원 공급 및 형광 신호의 영상화 및/또는 정량을 수행할 수 있다.
다음에서는 단계 (3)의 단백질-단백질 상호작용 측정 단계를 전반사 현미경 및 형광 (측정) 카메라를 사용하여 수행하는 경우를 예를 들어 보다 상세히 설명한다:
가) 상기 단계 (1) 또는 단계 (2)의 기판을 전반사 현미경에 장착시킨다. 전반사 현미경에서 광원의 공급 위치는 통상적으로 관측하고자 하는 기판 쪽이며, 렌즈의 위치는 광원공급 위치와 무관하다.
나) 광원은 레이저일 수 있으며, 광원의 세기는 약 0.5 mW 내지 약 5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 4.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 4 mW, 약 0.5 mW 내지 약 3.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 3 mW, 약 0.5 mW 내지 약 2.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 2 mW, 약 1 mW 내지 약 5 mW, 약 1 mW 내지 약 4.5 mW, 약 1 mW 내지 약 4 mW, 약 1 mW 내지 약 3.5 mW, 약 1 mW 내지 약 3 mW, 약 1 mW 내지 약 2.5 mW, 약 1 mW 내지 약 2 mW, 약 1.5 mW 내지 약 5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 4.5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 4 mW, 약 1.5 mW 내지 약 3.5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 3 mW, 약 1.5 mW 내지 약 2.5 mW, 또는 약 1.5 mW 내지 약 2 mW, 예컨대, 약 2 mW일 수 있으며, 광원의 파장은 앞서 설명한 바와 같이 형광 신호 또는 사용된 표지 물질, 및/또는 장비의 구성 (예컨대 감쇄필터를 사용하는 경우 세기가 센 광원을 사용할 수 있음)에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.
다) 상기 광원 공급에 의하여 발생한 형광 신호를 형광 (측정) 카메라로 촬영하여 영상화 및/또는 정량할 수 있다.
상기 형광신호의 촬영 (또는 영상화)은, 표지 물질의 형광 신호 발생 유지 시간 (발광시간, lifetime)을 고려하여, 광원 공급과 동시 또는 상기 신호 발생 유지 시간 이내에 수행할 수 있다.
형광 (측정) 카메라 (예컨대, EMCCD 카메라)로 형광 신호를 촬영(또는 영상화)함에 있어서, 1 프레임당 노출시간, 레이저 파워, 카메라 gain 값, 총 촬영 프레임 등을 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대, 1 프레임 당 노출시간이 짧을수록 1 프레임에 누적되는 신호가 줄어들게 되며, 이를 상쇄하기 위하여 레이저 파워를 높이거나, 형광 카메라의 감도를 높일 수 있다. 일 예에서, 1 프레임 당 노출시간을 약 0.001초 내지 약 5초, 약 0.001초 내지 약 3초, 약 0.001초 내지 약 2초, 약 0.001초 내지 약 1초, 약 0.001초 내지 약 0.5초, 약 0.001초 내지 약 0.3초, 약 0.001초 내지 약 0.1초, 약 0.01초 내지 약 5초, 약 0.01초 내지 약 3초, 약 0.01초 내지 약 2초, 약 0.01초 내지 약 1초, 약 0.01초 내지 약 0.5초, 약 0.01초 내지 약 0.3초, 약 0.01초 내지 약 0.1초, 약 0.05초 내지 약 5초, 약 0.05초 내지 약 3초, 약 0.05초 내지 약 2초, 약 0.05초 내지 약 1초, 약 0.05초 내지 약 0.5초, 약 0.05초 내지 약 0.3초, 약 0.05초 내지 약 0.1초, 약 0.07초 내지 약 5초, 약 0. 07초 내지 약 3초, 약 0. 07초 내지 약 2초, 약 0. 07초 내지 약 1초, 약 0. 07초 내지 약 0.5초, 약 0. 07초 내지 약 0.3초, 약 0.07초 내지 약 0.1초, 약 0.1초 내지 약 5초, 약 0.1초 내지 약 3초, 약 0.1초 내지 약 2초, 약 0.1초 내지 약 1초, 약 0.1초 내지 약 0.5초, 또는 약 0.1초 내지 약 0.3초, 예컨대 약 0.1초로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
예컨대, EMCCD 카메라를 사용하는 경우, 표지 물질 (예컨대, eGFP)로부터 생성된 광자(photon)는 EMCCD의 소자를 통해 전자로 바뀌어 계측된다 (광전효과, photoelectric effect). 이 때, 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수를 gain 값을 통해 변경할 수 있다. 설정된 gain 값이 높을수록 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수가 늘어나서, EMCCD 카메라의 감도가 높아지는 동시에 background noise도 함께 증가하므로 signal-to-noise 비율이 중요하다. 일 구체예에서, 우수한 signal-to-noise 비율을 얻기 위하여, gain값을 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 80, 약 10 내지 약 60, 약 10 내지 약 50, 약 20 내지 약 100, 약 20 내지 약 80, 약 20 내지 약 60, 약 20 내지 약 50, 약 30 내지 약 100, 약 30 내지 약 80, 약 30 내지 약 60, 또는 약 30 내지 약 50, 예컨대, 약 40 정도로 정할 수 있지만, 이에 한정되지 않고 카메라의 감도, 수명, 장비 구축 현황, 노이즈, 시험 조건 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다.
총 촬영 프레임 개수와 노출 시간을 곱하면 총 촬영 시간이 얻어진다 (노출시간 * 총 촬영 프레임 개수 = 촬영 시간). 형광 물질의 발광 시간 (lifetime) 이후에는 형광 신호가 사라지므로, 상기 촬영 시간이 발광시간 내에 진행되도록 총 촬영 프레임 개수 및/또는 노출 시간을 조절할 수 있다.
단백질-단백질 상호작용 측정 결과의 정확도를 높이기 위하여, 상기 영상화를 하나 이상, 예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 7개 이상, 또는 10개 이상 (상한값은 기판의 크기 및 영상화 가능한 면적에 따라서 결정됨)의 기판 또는 이를 포함하는 하나 이상의 채널 (각 채널은 2개 이상의 기판을 포함함)에서 수행하고, 신호가 나타난 영역(spot), 구체적으로 이미지 중 밝은 영역 (PPI complex라고도 함)의 개수(PPI count)를 구하여, 상기 얻어진 형광 신호를 정량화할 수 있으며, 이는 단백질-단백질 상호작용을 정량화한 것으로 볼 수 있다.
다른 예에서, 단계 (3)에서 측정된 형광 세기를 통상적인 장치를 이용하여 수치화함으로써 단백질-단백질 상호작용을 정량할 수도 있다. 이 때, 결과의 정확성을 위하여, 상기 결과를 시료 양 또는 시료 내 단백질 양을 기준으로 표준화 (normalization)시킬 수 있다.
제1 단백질 및/또는 제1 단백질 상호작용 단백질을 2종 이상 사용하는 경우, 단계 (1) 내지 (3)은 각각의 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질 조합에 대하여 각각 수행될 수 있다 (즉, 단계 (1) 내지 (3)은 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질 조합의 수만큼 반복 수행될 수 있다).
본 명세서에서 제공되는 방법은, 다음의 단계 (4)를 추가로 포함할 수 있다:
단계 (4): 비교하는 단계 (단계 (b), 구체적으로 (b1))
단계 (4)는 상기 단계 (3)에서 얻어진 결과(단백질-단백질 상호작용 수준)을 제1 비교 단백질과 제1 비교 단백질 상호작용 단백질 간 단백질-단백질 상호작용 수준과 비교하거나 기준값과 비교하는 단계이다. 상기 제1 비교 단백질과 제1 비교 단백질 상호작용 단백질, 및 기준값은 앞서 설명한 바와 같다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "BCL2 계통 단백질을 표적으로 한다" 함은 BCL2 계통 단백질을 인식(특이적 결합)하거나 및/또는 활성을 저해하는 것을 의미할 수 있다. BCL2 계통 단백질의 활성의 저해는 BCL2 계통 단백질과 결합하거나, 및/또는 BCL2 계통 단백질을 분해 및/또는 구조적 변형시켜 고유의 기능, 예컨대 세포 자살 억제 기능을 감소시키거나 제거하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "약물"은 약리적 효과를 나타내는 모든 물질, 예컨대, 소분자 화합물, 단백질 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대, DNA, RNA (예컨대, siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머, 등), 식물 추출물, 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 제1 단백질과 상호작용하는 단백질, 표지물질로서 형광 단백질, 결합 물질로서 항체 등의 모든 외부에서 공급되는 단백질은 재조합적 합성 또는 화학적 합성으로 생산된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 상기 재조합적 생산은 상기 단백질을 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터를 HEK293 세포와 같은 포유류 세포 (mammalian cell)에 형질주입 (transfection) 통해 발현하거나, SF9과 같은 곤충세포 (insect cell)에 형질주입을 통해 발현하거나, E. coli와 같은 세균에 형질주입을 통해 발현시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 발현된 단백질은 추가적인 정제 (purification)과정을 거칠 수 있으나, 필수적인 것은 아니고, 정제된 단백질 또는 단백질을 발현한 세포용해액을 그대로 사용하여 단백질-단백질 측정을 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "BCL2 계통 단백질을 표적으로 하는 치료 또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물을 사용하는 치료"는 서로 등가적 의미로 호환 가능하며, 제1 단백질의 활성을 저해하는 모든 의학적 및/또는 약학적 행위를 의미할 수 있으며, 예컨대, 앞서 설명한 바와 같은 BCL2 계통 단백질의 활성을 저해하는 약물을 BCL2 계통 단백질의 활성을 저해하는 것을 필요로 하는 대상에게 처방 및/또는 투여하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, "BCL2 계통 단백질을 표적으로 하는 치료"는 BCL2 계통 단백질과 결합하거나, 및/또는 BCL2 계통 단백질을 분해 및/또는 구조적 변형시켜 고유의 기능, 예컨대, 세포 자살 억제 기능을 감소시키거나 제거하는 약물을 이를 필요로 하는 대상에게 처방 및/또는 투여하는 것일 수 있다.
상기 투여는 경구 또는 비경구 경로로 수행될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 병변 부위 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 또는 직장내 투여 등의 경로로 수행될 수 있다.
상기 개체, 환자 또는 대상은 모든 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등일 수 있고, 예컨대 제1 단백질과 관련된 질병을 갖는 환자일 수 있다. 상기 제1 단백질과 관련된 질병은 제1 단백질의 과발현 또는 제1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화와 관련된 질병일 수 있으며, 예컨대, 암, 보다 구체적으로 혈액암일 수 있다. 구체적 예에서, 상기 개체, 환자 또는 대상은 암환자, 구체적으로 혈액암 환자일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "약물에 대한 반응성"은 약물을 투여 받은 개체에서 상기 약물이 효과를 발휘하는 정도를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "효능 또는 효과"는 약물 또는 치료가 처치 대상에서 달성하고자 하는 의학적 및/또는 약학적 효과를 의미하는 것으로, 처치 대상이 갖는 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 증상의 완화 및/또는 개선 등을 의미하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 약물이 항암제이고 치료가 항암 치료이고, 상기 처치 대상이 암환자인 경우, 상기 효과는 항암 효과(암의 예방 및/또는 치료 효과)일 수 있고, 상기 항암 효과는 암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 및/또는 전이(metastasis) 등을 억제, 및/또는 암의 악화를 억제, 및/또는 저항성을 감소 또는 제거하는 효과 등을 포함하는 것일 수 있다.
다른 예에서, 앞서 설명한 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 효과 예측 및/또는 BCL2 계통 단백질 표적 약물 치료에 사용하기 위한 분석 장치를 제공한다.
상기 분석 장치는,
제1 단백질에 특이적으로 결합하는 제1 단백질의 포획용 물질 또는 제1 단백질을 포함하는 반응부를 포함하거나,
여기에 더하여, 제1 단백질 상호작용 단백질 검출용 제제 및/또는 신호검출 수단을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 제1 단백질 상호작용 단백질 검출용 제제 제1 단백질 상호작용 단백질에 (특이적으로) 결합하는 결합물질을 포함하는 것으로서, 상기 결합물질은 제1 단백질 상호작용 단백질이 제1 단백질과 상호작용 (결합)하는 부위와 상이한 부위에 결합하는 물질 (예컨대, 항체, 항원결합단편, 항체 유사체, 압타머, 소분자 화합물 등)일 수 있으며, 표지물질로 표지된 것일 수 있다.
상기 제1 단백질은 앞서 설명한 바와 같고, 정제된 단백질 또는 이를 포함하는 세포 또는 상기 세포의 용해물 형태로 사용될 수 있으며, 상기 반응부는 상기 제1 단백질, 이를 포함하는 세포, 또는 상기 세포의 용해물, 또는 이들이 고정화된 기판을 포함하는 것일 수 있다.
상기 분석 장치는 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질 간의 상호작용 (결합) 여부 및/또는 정도를 측정하기 위한 것일 수 있다.
상기 반응부는 표면에 제1 단백질 포획용 물질이 고정화되거나, 상기 제1 단백질이 포획용 물질을 통하거나 통하지 않고(직접적으로) 고정화된 기판을 포함할 수 있다. 상기 제1 단백질 포획용 물질은 제1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질, 예컨대, 항체 또는 이의 항원결합단편일 수 있다. 상기 반응부는 웰 (예컨대, 멀티웰) 타입, 슬라이드 타입, 채널 타입, 어레이 형태, 미세유체칩, 미세관 (캐필러리) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분석 장치는 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 장치일 수 있으며, 이를 위하여, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 상기 제1 단백질 상호작용 단백질은 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되거나 (표지 물질이, 예컨대, 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적), 재조합적, 또는 물리적으로, 결합되거나), 표지물질이 결합될 수 있는 tag이 부착된 형태일 수 있다.
또한, 상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 신호 검출 수단에서 측정된 신호값을 제1 단백질의 수준으로 정상화 (normalization)시키기 위하여, 제1 단백질에 결합하는 탐지용 물질 및 상기 탐지용 물질에 결합하는 표지용 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제1 단백질에 결합하는 탐지용 물질은 앞서 설명한 멀티 웰에 포함된 제1 단백질의 포획용 물질과 상이한 부위에서 제1 단백질과 결합하는 생물 분자 (예컨대, 항체)일 수 있으며, 상기 표지용 물질은 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되고 (표지 물질이, 예컨대, 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적으로 결합)) 상기 제1 단백질에 결합하는 탐지용 물질에 결합 가능한 생물 분자 (예컨대, 항체)일 수 있다.
상기 신호검출 수단은 사용된 표지 물질에서 발생시키는 신호에 따라서 통상적으로 사용되는 모든 신호 검출 수단일 수 있다. 예컨대, 상기 신호 검출 수단은 신호 자극부 및 신호 검출부를 포함할 수 있으며, 여기에 더하여 측정된 신호를 분석 (예컨대, 정량 또는 영상화)하는 신호 분석부를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 신호 자극, 신호 검출, 및 신호 분석은 각각 다른 부위에서 수행되거나, 이들 중 적어도 두 가지 이상이 하나의 부위에서 동시에 또는 연속하여 수행될 수 있다. 일 예에서, 상기 표지가 형광물질인 경우, 상기 신호 검출 수단은 형광 신호를 발생 및 검출할 수 있는 모든 수단들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 형광 신호 자극부 (예컨대, 광원), 및 형광 신호 검출부, 및/또는 형광 신호 분석부를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 신호 검출 수단은 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscope) 또는 공초점 현미경 (광원 및 형광신호 검출용)을 포함하거나, 여기에 더하여, 형광 카메라, 예컨대 EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device) 또는 CMOS (Complementary metal oxide semiconductor)를 추가로 포함하여, 광원 공급 및 형광 신호의 영상화 및/또는 정량을 수행할 수 있다. 상기 광원의 파장, 세기, 형광 카메라 측정 조건 (예컨대, 1 프레임당 노출시간, 레이저 파워, 카메라 gain값, 총 촬영 프레임 등)은 앞서 설명한 바와 같다.
본 명세서에 제공된 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 소량의 시료에서의 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질 간 상호 작용 및/또는 제1 단백질과 제1 단백질 발현 수준을 정확하고 효율적으로 관찰, 분석, 검출, 및/또는 측정할 수 있다는 이점을 갖는다. 따라서, 상기 멀티 웰 또는 이를 이용하는 분석 방법은 생검 (예컨대, needle biopsy), 혈중 암세포 시료와 같이 매우 소량의 시료에 대해서도 유용하고 효과적으로 적용될 수 있다.
베네토클락스(Venetoclax) 등의 BCL2 계통 단백질 표적 약물은 여러 혈액암 환자들의 치료에 사용될 수 있다. 예컨대, 베네토클락스(Venetoclax)는 만성 백혈병 이외에도 약물로 인한 빠른 호전이 필요한 급성백혈병 및 골수암의 치료에 적용될 수 있는데, 환자들의 부담을 최소한으로 줄여주기 위해 빠르게 약물의 효능을 예상할 수 있는 진단기법이 필요하다. BCL2 단일 단백질의 발현양 및 돌연변이 유전자의 유무를 확인하는 종래의 방법으로는 베네토클락스(Venetoclax) 등의 BCL2 계통 단백질 표적 약물의 효능을 성공적으로 예측할 수 없는 반면, 본 명세서에서 제공되는 단백질-단백질 상호작용 및/또는 단백질 발현 측정 기반 진단 방법은 개별 환자의 다양한 종류의 혈액암에 베네토클락스(Venetoclax) 등의 BCL2 계통 단백질 표적 약물이 잘 작용할지 여부를 빠르고 특정적으로 예측할 수 있어서, 보다 신속하고 효과적으로 개별맞춤 혈액암 치료를 수행할 수 있도록 한다.　　
도 1은 기판에 부착된 개별 항체와 표적 단백질간의 결합을 측정한 도면으로, 도 1a는 BCL2, BCLxL, MCL1에 관한 것이고, 도 1b는 BCL-W, Bfl-1에 관한 것이다.
도 2a는 시료 내 BCL2, MCL1, BCLxL와 외부에서 투입한 BIM, NOXA, BAD의 상호작용을 측정(PPI count)한 것이고, 도 2b는 시료 내 BCL2, BCL-XL와 외부에서 투입한 tBID의 상호작용을 측정(PPI count)한 것이고, 도 2c는 시료 내 BCL2, MCL1, BCL-XL과 외부에서 투입한 BAX, BAK의 상호작용을 측정(PPI count)한 것이고, 도 2d는 시료 내 BCL2, BCL-XL, MCL1과 외부에서 투입한 BIM 단백질의 BH3 도메인만을 검사단백질로 사용하여 상호작용을 측정한 것이다.
도 3은 제1단백질 상호작용 단백질의 농도에 따른 상호작용 측정 값의 변화를 시료 내 BCL2와 외부에서 투입한 BAD의 상호작용을 측정하여 나타낸 도면이다.
도 4는 외부에서 투입되는 용액에 포함되는 계면활성제의 종류 및 농도에 따른 상호작용 측정 값의 변화를 시료 내 BCL2와 외부에서 투입한 BAD의 상호작용을 측정하여 나타낸 도면이다.
도 5는 외부에서 투입되는 용액에 포함되는 계면활성제 Triton X-100의 농도에 따른 상호작용 측정 값의 변화를 시료 내 BCL2와 외부에서 투입한 BAD의 상호작용을 측정하여 나타낸 도면이다.
도 6은 외부에서 투입되는 검사단백질 BIM에 대해서 종 (species) 간의 보존성이 뛰어난 아미노산 (highly conserved amino acids)에 변이가 발생할 경우 BCL-XL 또는 BCL2와의 상호작용 측정 값이 차이남을 확인한 도면이다.
도 7은 시료(HL60, OCI-LY3) 내 BCL2, MCL1, BCL-XL과 BIM의 복합체 수준을 측정한 도면이다.
도 8은 시료(OCI-LY3) 내 BCL2와 BAX의 복합체 수준을 측정한 도면이다.
도 9는 시료(OCI-LY3) 내 BCL2, BCL-XL, MCL1과 BAK의 복합체 수준을 측정한 도면이다.
도 10은 시료(HL60, OCI-LY3, SUDHL8) 내 BCL-XL과 BAD의 복합체 수준, MCL1과 NOXA의 복합체 수준을 측정한 도면이다.
도 11은 단백질 복합체 수준을 측정함에 있어서, 제1단백질과 제1단백질 상호작용 단백질이 서로 호환될 수 있음을 확인한 도면이다.
도 12는 도 12a는 두 종의 BAK 항체가 모두 BAK에 결합될 수 있음을 나타낸 결과이다. 도 12b는 각각 [MCL1, BAK], [BCL-XL, BAK], [BCL2, BAK]를 공동발현시킨 세포 (HEK293)에 대해서 명시된 침강항체 (pull down Ab)를 이용하여 신호를 측정한 결과이다. 이를 통해 BAK에 결합되던 D4E4 클론의 BAK 항체는 BCL2 계통 단백질이 공동발현된 경우 결합되지 않음을 검증한 도면이다. 도 12c는 도 12a에서 사용된 항체 중 하나인 AT38E2를 이용하여 앞서 사용한 공동발현된 BAK가 검출됨을 검증한 도면이다.
도 13은 시료 내 MCL1, BCL-XL, BCL2의 발현량을 측정한 도면이다.
도 14는 시료 내 BAX, BAK의 발현량을 측정한 도면이다.
도 15는 a는 GDN을 처리한 시료에 치료제(Staurosporine, Venetoclax)를 투입한 후 BAX의 발현량을 검출항체로 측정한 것이고, b는 Triton X-100을 처리한 시료에 치료제(Staurosporine, Venetoclax)를 투입한 후 BAX의 발현량을 검출항체로 측정한 것이다. c는 GDN을 처리한 시료에 치료제(Staurosporine, Venetoclax)를 투입한 후 BAX의 발현량을 검출항체로 측정한 것이고, b는 Triton X-100을 처리한 시료에 치료제(Staurosporine, Venetoclax)를 투입한 후 BAX의 발현량을 검출항체로 측정한 것이다.
도 16은 검체 내 BAX 발현량을 측정한 것으로 도 17a, c는 특정 접힘 형태의 BAX의 발현량을 venetoclax 처리 시간에 따라 측정한 도면이고, 도 17b, d는 동일 검체에서 Triton X-100을 처리한 후 측정한 결과이다.
도 17은 a는 시료(HL60)의 BCL2와 외부에서 투입한 BAD의 상호작용을 venetoclax, AMG176을 처리한 후 측정한 도면이고, b는 시료(OCI-LY3)의 BCL2와 외부에서 투입한 BAD의 상호작용을 venetoclax, AMG176을 처리한 후 측정한 도면이다.
도 18은 a는 시료(HL60)의 MCL1과 외부에서 투입한 NOXA의 상호작용을 venetoclax, AMG176을 처리한 후 측정한 도면이고, b는 시료(OCI-LY3)의 MCL1과 외부에서 투입한 NOXA의 상호작용을 venetoclax, AMG176을 처리한 후 측정한 도면이다.
도 19는 a는 시료(HL60)의 BCL-XL과 외부에서 투입한 BAD의 상호작용을 venetoclax, AMG176을 처리한 후 측정한 도면이고, b는 시료(OCI-LY3)의 BCL-XL과 외부에서 투입한 BAD의 상호작용을 venetoclax, AMG176을 처리한 후 측정한 도면이다.
도 20은 a는 시료(HL60) 내 BCL2, MCL1, BCL-XL 발현량을 venetoclax, AMG176 처리 후 측정한 도면이고, b는 시료(OCI-LY3) 내 BCL2, MCL1, BCL-XL 발현량을 venetoclax, AMG176 처리 후 측정한 도면이다.
도 21은 a는 시료(HL60) 내 BCL2, MCL1, BCL-XL과 BIM의 복합체 수준을 venetoclax, AMG176 처리 후 측정한 도면이고, b는 시료(OCI-LY3) 내 BCL2, MCL1, BCL-XL과 BIM의 복합체 수준을 venetoclax, AMG176 처리 후 측정한 도면이다.
도 22는 a는 시료(HL60) 내 MCL1과 NOXA의 복합체 수준을 venetoclax, AMG176 처리 후 측정한 도면이고, b는 시료(OCI-LY3) 내 MCL1과 NOXA의 복합체 수준을 venetoclax, AMG176 처리 후 측정한 도면이다.
도 23은 a는 시료(HL60) 내 BCL-XL과 BAD의 복합체 수준을 venetoclax, AMG176 처리 후 측정한 도면이고, b는 시료(OCI-LY3) 내 BCL-XL과 BAD의 복합체 수준을 venetoclax, AMG176 처리 후 측정한 도면이다.
도 24는 a는 시료(HL60) 내 BCL2와 BAX의 복합체 수준을 Venetoclax 처리 시간에 따라 측정한 것이고, b는 시료(OCI-LY3) 내 BCL2와 BAX의 복합체 수준을 Venetoclax 처리 시간에 따라 측정한 도면이다.
도 25는 a는 시료(HL60) 내 BAX 발현량을 Venetoclax 처리 시간에 따라 측정한 것이고, b는 시료(OCI-LY3) 내 BAX 발현량을 Venetoclax 처리 시간에 따라 측정한 도면이다.
도 26은 a는 시료(HL60) 내 BAK 발현량을 Venetoclax 처리 시간에 따라 측정한 것이고, b는 시료(OCI-LY3) 내 BAK 발현량을 Venetoclax 처리 시간에 따라 측정한 도면이다.
도 27은 시료(HL60) 내 BCL2와 외부에서 투입한 BIM의 상호작용을 Venetoclax, AZD5991이 각각 공존하는 상태에서 처리 농도에 따라 측정한 도면이다.
도 28은 시료(HL60) 내 MCL1과 외부에서 투입한 BIM의 상호작용을 Venetoclax, AZD5991이 각각 공존하는 상태에서 처리 농도에 따라 측정한 도면이다.
도 29는 AML 환자(n=32) 검체에 대하여 모든 파라미터(상호작용(제1 PPI), 복합체(제2 PPI), 발현량)를 측정한 후 Z-core 히트맵으로 나타낸 도면이다.
도 30은 유방암 환자(n=302) 검체의 BCL2 발현량을 정량적으로 측정한 도면이다.
도 31은 폐선암 환자(n=15) 검체의 BCL2 발현량을 정량적으로 측정한 도면이다.
도 32는 시료(OCI-LY3)에 venetoclax를 처리한 후 처리시간에 따라 시료 내 BCL2와 외부에서 투입한 BIM의 상호작용 수준변화, 및 시료내 BCL2와 BIM의 복합체 수준 변화를 측정한 도면이다.
도 33은 시료(OCI-LY3)에 AZD5991을 처리시간에 따라 시료 내 MCL1과 외부에서 투입한 NOXA의 상호작용 수준 변화, 및 시료 내 MCL1과 NOXA의 복합체 수준 변화를 측정한 도면이다.
도 34는 환자 1의 시료내 BCL2, MCL1, BCL-XL과 외부에서 투입한 BIM 간의 상호작용 수준을 i) 진단 당시 추출된 골수 ii) FLT3 표적항암제(quizartinib) 처방 후 재추출된 골수 iii) venetoclax와 LDAC 처방 후 획득한 전혈검체로 부터 측정한 도면이다.
도 35는 환자 2의 시료내 BCL2, MCL1, BCL-XL과 외부에서 투입한 BIM 간의 상호작용 수준을 i) 진단 당시 추출된 골수 ii) FLT3 표적항암제(quizartinib) 처방 후 재추출된 골수 iii) venetoclax와 LDAC 처방 후 획득한 전혈검체로 부터 측정한 도면이다.
도 36a 내지 36c는 AML 환자 검체 (n=32)로부터 venetoclax 반응성 (세로축)과 PPI(제1 PPI), 복합체(제2 PPI), 발현량 등 21가지 측정값 사이의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 37은 AML 환자검체로부터 venetoclax 반응성과 BCL2-BIM PPI(제1 PPI) 및 BCL2-BIM 복합체(제2 PPI) 측정값 사이의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 38은 지표를 결합하여 venetoclax 반응성을 예측하는 결과에 대한 것으로, 도 38a는 지표를 1에서 10개까지 늘려갈 때 상관관계 계수값을 나타낸 결과이고, 도 38b는 2가지 지표의 결합시의 상관관계 분석결과를 단독 지표시의 결과와 비교하여 보여주는 그래프이고, 도 38c는 다섯 가지 주요 지표가 결합되었을 때의 상관관계 분석결과이다.
도 39a 내지 39c는 AML 환자 검체 (n=26)로부터 AZD5991 반응성과 PPI(제1 PPI), 복합체(제2 PPI), 발현량 등 21가지 측정값 사이의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 40은 네 가지 주요 지표를 결합하여 AZD5991 반응성을 예측한 결과이다.
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
실시예 1. 시료 내 단백질 및 시료 외 단백질 간 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 측정
1.1. 분석용해액(시료) 준비
만성 림프구성 백혈병(CLL)및 급성 골수성 백혈병 등 다양한 혈액암 환자에게서 얻어진 골수 샘플로부터 Ficolle gradient의 protocol(GE healthcare Ficoll-paque plus 17-1440-03)을 이용해 Buffy coat 만을 선별적으로 수집하였다.
분리한 Buffy coat의 펠렛을 dPBS로 Washing 한 뒤, dPBS 500g로 5min 동안 분리하였다. 해당과정을 두 번 반복하여, 세포에 남아있는 적혈구와 혈소판을 최대한 제거할 수 있도록 하였다. 이와 같이 분리된 Buffy coat로부터 유래된 혈액암 세포를 107개씩 소분하여, 이후의 실험에 사용할 수 있도록 질소에 Snap-freeze 후, -80℃에서 보관하였다.
혈액암 세포주 (세포주 은행 및 ATCC; HL-60 (CVCL_0002), OCI-LY3 (CVCL_8800)), Ramos (CVCL_0597), U937, THP1, SUDHL8) 및 환자의 Buffy coat에서 유래된 암세포의 펠렛은 lysis buffer (Hepes 50mM Nacl 150mM Glycerol 10%(w/v) GDN(Digitonin) 1%(w/v) with 2%(w/v) phosphatase inhibitor cocktail2,3 (P5726, P0044))을 이용해 서스팬션 해주고, 10분에 한 번씩 총 세 번에 걸쳐 vortexing하였다. 30분 이후, 펠렛을 녹인 lysis buffer을 15000g로 10분동안 원심분리하여 상층액을 분리하고 이를 이후 실험에서 기판에 적용하기 위한 분석용해액으로 사용하였다.
1.2. 표지물질로 표지된 제1단백질 상호작용 단백질 준비
표지물질 표지된 제1 단백질 상호작용 단백질(표지자(probe) 단백질)은 일시적 형질 감염을 통해 생산하였다. 보다 구체적으로, pEGFP-C1 (Addgene: PT3028-5)에 제한효소 처리 후 각 단백질 유전자 BIM (Sino biological: HG13819-G), NOXA (Sino biological: HG16548-U), BAD (Sino biological: HG10020-M)을 삽입하여 GFP 발현 단백질 벡터를 제조하였다. 제조된 발현 벡터를 Polyethylenimine을 이용하여 HEK293T 세포(ATCC; CRL-3216)에 일시적 형질 감염하여 과발현된 GFP-표지(GFP-labeled) 단백질을 획득하였다.
GFP-표지 단백질이 발현된 HEK293T 세포를 1% TX100 lysis buffer로 용해시켜, 세포용해액 샘플을 준비하였다. 상기 준비된 세포용해액을 1% TX100 lysis buffer를 사용하여 165nM으로 dilution 한 뒤, 소분하여 Snap-freeze하고, 실험 전에 녹여 사용하였다. 최종적으로 표지된 제1단백질 상호작용 단백질을 포함하는 세포용해액은 0.03%의 TX-100을 포함하도록 준비하였다.
본 발명의 방법으로 BID, 또는 BIM, BAX, BAK 중 BH3 부위 (domain)만을 선별적으로 사용하여 표지된 제1단백질 상호작용 단백질을 준비하였다. 다음의 표 1은 하기하는 실시예에서 사용된 제1단백질 상호작용 단백질(인간 유래) 및 이들의 Uniprot ID와 사용된 아미노산 부위를 예시한다.
제1 단백질 상호작용 단백질 Uniprot ID
BAD Q92934
NOXA Q13794
BIM Q43521
BID P55957
BIM_BH3 Q43521 (AA 134-166)
BAX_BH3 Q07812 (AA 59-73)
BAK_BH3 Q16611 (AA 74-88)
상기 제1단백질 상호작용 단백질의 표지자(probe)로는 녹색형광단백질 (green fluorescent protein, 이하 GFP; pEGFP-C1 vector (clontech) 사용하여 표지)을 사용하여, 상기 제1 단백질 상호작용 단백질의 C-말단에 eGFP가 연결된 형태를 준비하였다.
1.3. 기판의 준비
45mm*60mm Glass cover slip을 biotin PEG:mPEG의 비율을 3:100(w:w)으로 하여 코팅하였다.
상기 기판의 PEG 코팅된 면으로 BCL2 family 단백질(제1 단백질)을 침강시키기 위해서 NTV(Neutravidin; Thermo, A2666)과 Biotin이 표지된 Goat anti-rabbit secondary (111-065-046 Jackson immunoresearch) 항체를 사용하였다.
NTV 및 secondary항체를 PEG 코팅된 기판위에 결합시킨 뒤, 각 BCL2 family 단백질(제1 단백질)을 침강(puul down)시키기 위한 항체(primary antibody)로서, 다음의 표 2에 예시된 항체를 사용하였다.
환자세포 및 세포주(한국 세포주 은행 및 ATCC; HL-60, U937, THP1, OCI-LY3, SUDHL8)의 lysate을 각각 관측하고자 하는 단백질을 침강시킬 수 있는 항체(표 2 참조)가 코팅된 well에 10ul씩 넣고 실온에서 1시간 동안 반응 후, Washing buffer(Hepes 50mM Nacl 150mM Glycerol 1% GDN 0.03%)로 잔여 lysate를 씻어내었다.
제1 단백질 (인간) Uniprot ID 제1 단백질 결합물질(항체) 정보
BCL2 P10415 #4223 (CST)
BCL-XL Q07817 MA5-15142 (Thermo Fisher Scientific)
MCL1 Q07820 #94296 (CST)
BCLw Q92843 MA5-15076 (Invitrogen)
BFL1 Q16548 NBP2-67563 (Novus)
상기 표 2에 예시된 항체의 성능을 GFP와 융합된 제1단백질을 이용하여 기판에 고정되는 정도로서 측정하였다. 구체적으로, GFP와 융합된 BCL2 단백질 1nM를 상기 제시된 항체가 구비된 기판에 주입한 후 반응시킨 후, 세척과정을 거쳐 남아 있는 GFP의 양을 측정하였다. BCL-XL, MCL1, BCLw, 및 BFL1에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 1a 및 1b에 나타내었다. 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이, 상기 표 2에 제시된 개별 항체는 표적이 되는 단백질을 기판에 성공적으로 고정시킬 수 있음을 확인하였다.
1.4. 시료 내 단백질과 시료 외 단백질 간 상호작용 측정
상기 실시예 1.2에서 준비된 표지물질이 부착된 제1단백질 상호작용 단백질을 포함하는 세포용해물을 실시예 1.3에서 준비된 기판에 공급하였다. 보다 구체적으로, 상기 실시예 1.2의 세포용해물을 Well에 10ul씩 넣고 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 Washing buffer (Hepes 50mM Nacl 150mM Glycerol 1% GDN 0.03%)로 잔여물을 씻어내었다. 그 후, 다음과 같이 단백질 상호작용(PPI)을 측정하였다:
전반사 형광현미경에 기판을 고정시키고 이미징하여, 단백질 간 상호작용(결합)에 대한 데이터를 얻었다. 결과의 정확성을 높이기 위하여, 동일 조건에서 총 10개의 다른 위치에서 이미지를 획득하고, 이를 평균하여 대표 값으로 사용하였다.
형광 이미지는 16bit unsigned integer 형식으로 저장하였다. 형광 신호에 맞게 신호 관측을 위한 레이저의 파장을 조절하고 (GFP의 경우 488nm), 발광시간을 11초 정도 유지시키기 위하여 레이저 파워를 2mW로 조절하여 사용하였다.
전체 프레임 (10 프레임) 중, 초반 프레임을 버리고, 3개 프레임(7-9 번째 프레임)의 이미지를 평균하여 하나의 이미지를 생성하였으며, 이와 같은 과정을 well 안에서 위치를 옮겨가며 반복 수행하여 총 10개의 이미지를 획득하여 아래 과정을 수행하였다. EMCCD (Electron-multiplying charge-coupled device; Andor iXon Ultra 897 EX2 (DU-897U-CS0-EXF)) 카메라를 사용하여 1프레임당 노출시간을 0.1초로 하고, EMCCD gain 값은 40으로 하여 형광 이미지를 얻었다.
형광단백질로부터 나오는 신호는 특정 위치에 모여있는 형태 (localized point spread function (PSF))로 발생하는데, 이 PSF 개수(물리적인 값)가 측정하고자 하는 BCL2 family 단백질과 이와 상호작용(결합)하는 단백질 간의 PPI 숫자 (생물학적인 값)이다. 상기 PSF 값은 아래와 같은 과정을 거쳐서 생물학적인 값인 PPI 값으로 전환시켰다:
(a) Local maximum의 위치를 구하였다 (예를 들어, i번째 row, j번째 column pixel). 앞서 기술한 바와 같이, 단분자 형광신호는 512x512 픽셀 중에서 특정 위치(현재 관측장비 하에서 대략 5x5 픽셀 사이즈, 1 pixel = 0.167 마이크로미터)에 모여 형성되므로, local maximum을 찾으면 개별 PSF를 선별할 수 있다. 이는 Matlab에서 제공되는 toolkit을 이용하여 구할 수 있다.
(b) 상기 (a)에서 구한 local maximum이 실제 PSF로부터 발생한 것인지에 대한 판별과정을 거친다. 우선 local maximum의 최소값(minimum intensity value)을 정의하고, 상기 얻어진 local maximum 중에서 이 최소값보다 큰 경우만 분석에 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 최소값은 75이고, 이 값은 레이저 파워/노출시간/장비구축 상황에 따라서 달라질 수 있다. 최종적으로 얻어진 local maximum 좌표를 중심으로 5x5 픽셀의 정보를 불러온 후, 이 5x5 픽셀에서 밝기에 대한 중심을 구하였다 (centroid of intensity). 이 때, 구해진 밝기 중심이 기존 local maximum 좌표에 대하여 0.5 pixel 이상 벗어나게 되면 (PSF 모양에 대한 2D 대칭이 사라지면), 정상적이지 않은 형광신호라고 판단하고 분석에서 제외시켰다.
(c) 모든 조건을 통과한 PSF 만 최종적으로 선별하여 좌표와 전체 개수를 구하였다. 이 때 얻어진 PSF 전체 개수가 PPI의 개수(PPI count)가 된다.
같은 조건하에서 촬영된 모든 파일에 대하여 상기 과정을 수행하여 PSF 개수를 구한 후, 이를 취합하여 평균과 표준편차를 구하였다. 이 값이 최종적으로 특정 조건에서 PPI의 개수를 나타내는 값이 된다. 본 실시에서 PPI의 개수를 통하여 시료 내 제1 단백질과 시료 외 제1 단백질 상호작용 단백질 간 형성된 복합체를 측정할 수 있다.
상기 얻어진 PPI의 개수(PPI count) 측정 결과를 도 2a (제1 단백질 및 제1 단백질 상호작용 단백질 종류에 따른 결과), 2b (세포주 종류에 따른 결과), 2c (제1 단백질 및 세포주 종류에 따른 결과), 및 2d (제1 단백질 및 세포주 종류에 따른 결과)에 나타내었다.
또한, 본 실시예의 시료 내 단백질 및 시료 외 단백질 간 상호작용 측정 결과에 영향을 미치는 요소를 확인하기 위하여, (i) 분석용해액(시료) 농도 및 표지물질이 부착된 제1단백질 상호작용 단백질의 농도에 따른 PPI 세기 (측정된 형광 신호 세기) (도 3), (ii) 분석용해액(시료) 농도 및 표지물질이 부착된 제1 단백질 상호작용 단백질을 포함하는 세포 용해액에 포함되는 계면활성제의 종류에 따른 PPI count (도 4) 및 농도에 따른 PPI count (도 5)를 측정하였다. 대체적으로 분석용해액(시료) 농도 및 제1 단백질 상호작용 단백질의 농도가 증가함에 따라 PPI count도 증가하는 경향을 보였다.
또한, 제1 단백질 상호작용 단백질의 변이에 따른 PPI count를 측정하여 도 6에 나타내었다.
실시예 2. 시료 내 단백질 간 상호작용 측정 (복합체(Complex) 측정)
본 실시예에서는 동일한 시료 내의 제1 단백질과 제1 상호작용 단백질 간 상호작용 측정을 수행하였다. 구체적으로, 상기 상호작용은 분석용해액 내에서 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질이 결합된 상태로 존재하는 제1 단백질-제1 단백질 상호작용 단백질 복합체를 검출하여 측정하였다. 본 실시예에서 측정된 제1 단백질-제1 단백질 상호작용 단백질 간 복합체를 아래의 표 3에 예시하였다:
제1단백질 제1단백질 상호작용(결합) 단백질 관련 도면
BCL2 BIM 도 7
BAX 도 8
BAK 도 9
BCL-XL BIM 도 7
BAD 도 10
BAK 도 9
MCL1 BIM 도 7
NOXA 도 10
BAK 도 9
상기 표 3에 표시된 도면의 결과는 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질 중, 제1 단백질이 기판에 고정되고, 표지된 제1 단백질 상호작용 단백질 결합물질을 이용하여 이들 간 형성된 복합체를 측정한 결과이다. 반대로 제1 단백질 상호작용 단백질이 기판에 고정되고, 표지된 제1 단백질 결합물질을 이용하여 이들 간 형성된 복합체(complex count, PPI count)를 측정할 수도 있다 (이 경우, 제1 단백질 상호작용 단백질에 대한 항체를 pull down 항체로, 제1 단백질에 대한 항체를 detecting 항체로 사용함)(도 11). 도 7 내지 도 11에서 확인되는 바와 같이, 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질 중 어느 것을 기판에 고정시키는지에 무관하게 동등한 검출 효과를 얻을 수 있다.
상기와 같은 결과는 다음과 같이 시료 내 제1 단백질-제1 단백질 상호작용 단백질 간 상호작용을 측정하여 얻어진 것이다:
우선, 상기 실시예 1.1과 동일하게 준비된 분석용해액을 실시예 1.3를 참조하여 준비된 기판에 공급하였다.
시료 내 단백질 복합체 검출을 위한 결합물질로서 제1 단백질 상호작용 단백질에 대한 항체를 검출 항체(detecting antibody)로서 사용하였으며, 상기 검출 항체를 표지하기 위해서, 형광이 표지된 Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (jackson ImmunoReserach: 715-165-151) 항체(secondary antibody)를 희석하여 준비하였다.
상기 준비된 검출항체를 상기 준비된 기판에 공급하였다. 검출항체는 Well에 10ul씩 넣고 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 Washing buffer (Hepes 50mM Nacl 150mM Glycerol 1% GDN 0.03%)로 잔여 항체를 씻어내었다. 그 후, 형광이 표지된 Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (jackson ImmunoReserach: 715-165-151) 항체를 2000배 희석하여 well 당 10ul씩 10분간 반응시킨 뒤 Washing buffer (Hepes 50mM Nacl 150mM Glycerol 1% GDN 0.03%)로 잔여 항체를 씻어내었다. 그 다음 단백질 상호작용(complex)을 측정하였다. 측정 방법은 상기 실시예 1-4와 동일하게 실시하였다.
본 실시예에 사용된 결합물질(항체) 정보를 아래의 표 4에 예시하였다:
제 1단백질 항체정보(pull down) 제1단백질 상호작용 단백질 항체정보 (detecting)
BCL2 #4223 (CST) BIM MA5-15763(Invitrogen)
BCL2 BAX ab32503(Abcam)
BCL2 BAK Abnova MAB8753
BCL-XL MA5-15142 (Thermo Fisher Scientific) BIM MA5-15763(Invitrogen)
BCL-XL BAD 9296S (CST)
BCL-XL BAK Abnova MAB8753
MCL1 #94296 (CST) BIM MA5-15763(Invitrogen)
MCL1 NOXA ab68523(Abcam)
MCL1 BAK Abnova MAB8753
상기 서술한 바와 같이, 제1 단백질과 제1 단백질 상호작용 단백질은 서로 상호 교환이 가능하다. 또한, 사용된 항체가 단일 클론일 경우 동등한 클론이라면 다른 제조사의 제품도 사용 가능하다.
상기 항체 목록은 본 실시예를 설명하기 위하여 예시적으로 기재한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명에서 복합체를 형성하는 제1 단백질 또는 제1 단백질 상호작용 단백질에 대한 항체 또는 단백질 특이적 결합물질의 사용에 대한 특별한 제한은 존재하지 않는다. 다만, 두 단백질의 복합체 형성에 주요하게 알려진 부위를 항원 혹은 결합물질의 인식부위로 사용하게 되는 경우에는 복합체 검출이 불가능하다. 일 구현예에서 BAK와 복합체를 형성하는 BCL2, BCL-XL, MCL1을 검출하기 위해서는 BAK의 BH3 부위를 제외한 다른 부위(예컨대, 지질막을 투과하지 않는 (transmembrane domain이 아닌), helix 1번부터 helix 4번까지의 부위 등)를 인식하는 항체를 사용하는 것이 좋다 (도 12).
실시예 3. 시료 내 단백질 발현 수준 측정
본 실시예에서 분석용해액 내 존재하는 특정 단백질의 양을 정량적으로 측정하였다. 상기 특정 단백질은 BCL2, BCL-XL, MCL1, BAX, 및 BAK이다.
이를 위하여, 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 분석용해액을 준비하고, 실시예 1-3과 동일하게 준비된 기판에 공급하였다. 그 후, 상기 기판에 실시예 2에서와 같이 준비된 표지된 검출 항체 (형광이 표지된 Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (jackson ImmunoReserach: 715-165-151) 항체로 표지됨)를 첨가하였다. 그 후, 실시예 1-4와 동일한 방법을 수행하여, 형광신호 측정을 통하여 분석용해액 내 분석대상 단백질과 이의 검출항체 간 결합을 측정하였다.
본 실시예에서, 분석 대상 단백질을 기판에 고정하기 위한 포획(pull down) 항체와 검출하기 위한 검출(detecting) 항체는 서로 항원이 동일하지만, 항원의 서로 다른 부위에 결합하는 것으로 선정되어야 한다.
본 실시예에 사용된 항체 정보를 다음의 표 5에 예시하였다:
표적단백질 제1 결합물질(pull down) 제2 결합물질(detecting) 관련 도면
BCL2 #4223 (CST) ab692 (Abcam) 도 13
BCL-XL MA5-15142 (Thermo Fisher Scientific) Ab77571 (Abcam) 도 13
MCL1 #94296 (CST) 14-6701-82 (Thermo) 도 13
BAX sc 23959 (Santa Cruz) Ab32503 (Abcam) 도 14
BAK ab238515 (Abcam)) AM03 (Sigma) 도 14
상기 제1 결합물질은 기판에 고정되는 항체이고, 제2 결합물질은 분석용해액이 주입된 후 표적 단백질 검출을 위하여 공급되는 항체이다. 이 때, 상기 제1 결합물질과 제2 결합물질은 서로 바꾸어 사용 가능하다. 이를 테면, 제2 결합물질을 기판에 고정하고 분석용해액, 제1 결합물질 순서로 기판에 공급해도 동일하게 표적단백질의 정량분석이 가능하다. 상기 제시된 항체가 본 발명의 범위를 국한하지 않는다. 다만, 제1 결합물질과 제2 결합물질의 항원인식부위 (epitope)는 서로 완전히 중복되지 않아야 한다.
실시예 4. 특정 접힘 형태 (Conformation-specific) 단백질 측정
본 실시예는 단백질 접힘 형태에 따라 특이적으로 인지할 수 있는 항체 또는 결합물질을 이용하여 검체 내 존재하는 특정 접힘 형태 (conformation)의 단백질을 검출하는 방법에 적용될 수 있다. 일 구현예에서 단백질 접힘 형태 특이적 검출은 BAX, BAK를 포함한다.
종래의 발견에 따르면 BAX 단백질은 세포 내에서 다양한 접힘 형태를 유지할 수 있다. 그 중 N-말단에 속한 약 20개 정도의 아미노산의 노출 (exposure)은 BAX 단백질이 세포사멸을 일으킬 수 있는 형태로의 접힘 형태 시에 발생하는 것으로 알려져 있다 (Yi-Te Hsu et al., J. Bio. Chem. 272, (1997), Michael A. Dengler et al., Cell Rep. 27 (2019)). 또는, BAK 단백질은 미토콘드리아 지질막으로 이동 시 다양한 접힘 형태 변화를 일으키며 세포사멸을 유도한다 (Mark Xiang Li et al., PNAS 114 (2017)). 이렇게 특정 접힘 형태에서만 노출되는 부위를 인식할 수 있는 항체 또는 결합물질을 이용한다면 상기 발명을 구현할 수 있다.
일 예로, BAX 단백질의 N-말단을 인지하도록 알려진 항체와 어느 접힘 형태에서도 노출되는 부위를 인지하는 항체를 이용한다면 검체 내 세포사멸을 유도하도록 활성화된 상태의 BAX 단백질을 검출할 수 있을 것이다. 또 다른 예로, BAK 단백질의 BH3 부위를 선택적으로 인식하는 항체와 어떤 상태에서도 노출되는 BAK 부위를 인식하는 항체 쌍을 이용한다면 BH3가 드러난 접힘 형태의 BAK 단백질을 검체로부터 검출할 수 있다. 하기 표 6은 이러한 발명을 구현하기 위해 사용된 항체쌍을 제시한다. 하기 항체가 본 발명의 한계를 제한하는 것은 아니다. 또한, 단일 클론 항체일 경우 제조사에 무관하다.
표적단백질 접힘 형태 항체 1 항체 2
BAX N-말단 노출 Ab 32503 Sc-23959
BAK BH3 노출 SC-517390 SAB1305656
상기 표에서 항체 1은 기판의 표면에, 항체 2는 검출을 위해 주입되는 항체를 의미한다. 두 항체의 역할이 바뀌어도 결과는 동등할 수 있다. 예를 들어, 항체 2를 기판 표면에 고정하고, 항체 1을 검출 항체로 주입하여도 동등한 효과를 기대할 수 있다.
상기 발명의 구현을 위해서는 실시예 1에서 구현한 것과 같이 분석용해액을 준비할 수 있다.
본 실시예에서 단백질량 정량분석을 위한 측정방법은 실시예 2 또는 실시예 3에서 제시한 방법과 동일한 방법일 수 있다. 이를 테면, 사용되는 항체 또는 단백질 특이적 결합물질이 모두 동일한 항원 또는 표적단백질에 결합되도록 이루어져 있다. 다만, 두 항체 혹은 단백질 특이적 결합물질의 표적단백질 결합부위는 서로 달라야 한다. 또한, 항체를 사용할 경우 두 항체의 숙주 (host)는 해당 항체에 직접적으로 표지자가 구비되어 있지 않는 한 다르도록 권고한다.
본 실시예는 실시예 2 또는 3에서 제안한 방법을 참조로 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체 1, 검체, 항체 2의 순서로 주입하여 특정 접힘 형태의 표적단백질을 검출할 수 있다.
본 실시예의 구현을 위해, 인위적으로 세포사멸을 유도하여 검체를 준비할 수 있다. 예를 들어 세포에 Staurosporine을 1시간 처리하여 세포사멸을 유도하거나 venetoclax를 24시간 처리하여 세포사멸을 유도한 상태의 검체를 준비한다. 이 검체를 GDN이 포함된 용해액으로 용해하여 분석용해액을 만든 뒤 N-말단이 노출된 BAX를 검출하면 신호가 증가하는 것을 확인할 수 있다 (도 14). 동일한 검체를 Triton X-100이 포함된 용해액으로 분석용해액을 준비할 경우 Non-ionic 계열의 계면활성제인 Triton X-100에 의해 강제적으로 N-말단을 유도할 수 있다. 이 분석용해액으로부터 N-말단이 노출된 BAX를 검출한다 (도 15). 세포사멸이 유도된 검체에서 GDN을 이용하여 분석용해액을 준비한 뒤 검출항체를 이용해서 N-말단이 노출된 BAX를 측정할 경우 증가하는 것을 볼 수 있다. 반면, Triton X-100을 이용하여 인위적으로 N-말단이 노출되도록 할 경우, 세포사멸 유도 여부에 관계없이 일정한 값으로 나타나는 것을 볼 수 있다.
또 다른 예로, AML 세포인 HL60이나 DLBCL 세포인 OCI-LY3에 베네토클락스(Venetoclax)를 처리하며 세포사멸을 유도하면서 BAX N-말단이 노출되는 비율을 측정할 수 있다. 100 nM 농도의 베네토클락스(Venetoclax)를 2, 4, 8, 24시간 처리한 뒤 획득된 검체를 GDN이 포함된 용해액으로 분석용해액을 준비한다. 이 후 BAX를 검출하면, 베네토클락스(Venetoclax) 처리 시간에 따라 BAX 검출 신호가 바뀌는 것을 확인할 수 있다 (도 16). 반면, 동일한 분석용해액에 최종적으로 1% 농도의 Triton X-100이 되도록 추가로 섞어 N-말단 노출을 유도한 뒤 동일한 분석을 수행할 경우 시간에 따라 BAX 양의 변화가 거의 없는 것을 볼 수 있다.
이를 통해 본 발명에서 제시하는 접힘 형태 특이적 단백질 검출방법은 세포의 상태, 이를 테면 세포사멸 정도를 분석하는데 도움이 되는 지표를 제공할 수 있다.
실시예 5. BCL2 계통 단백질 표적저해제 처리에 따른 세포 내 BCL2 계통 신호전달경로 변화 측정
본 실시예는 BCL2 family 단백질의 표적저해제 처리에 따른 세포 내 신호전달 변화를 측정할 수 있는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로 BCL2 표적저해제인 베네토클락스(Venetoclax), 또는 MCL1 표적저해제인 AZD5991을 처리하면서 세포 내 존재하는 다양한 BCL2 family 단백질 (이를테면, BCL2, BCL-XL, MCL1)의 시료 간 단백질 상호작용 세기, 시료 내 단백질 상호작용 세기(복합체 측정), 단백질 발현양 변화를 포괄적으로 분석할 수 있는 방법을 제공한다.
본 실시예의 구현을 위해 시료 간 단백질 상호작용 측정은 실시예 1, 시료 내 단백질 복합체 측정은 실시예 2, 발현량 변화 측정은 실시예 3, 4와 동일할 수 있다.
일 예로, 세포에 처리하는 표적저해제 베네토클락스(venetoclax) 또는 AZD5991의 농도는 100 nM이며 시간은 24시간일 수 있다. 대조군으로 DMSO를 동일한 조건으로 처리하여 준비할 수 있다.
본 실시예에서 분석한 내용은 아래 표 7 및 표 8에 정리하였다:
시료 간 단백질 상호작용 분석
제 1단백질 제 1단백질 상호작용 단백질
BCL2 BAD-GFP
BIM*-GFP
BCL-XL BAD-GFP
BIM*-GFP
MCL1 GFP-NOXA
BIM*-GFP
(상기 표 7에서,BIM*는 BIM 중 BH3 도메인만을 잘라낸 단백질에 GFP 표지자가 구비된 형태이고,
제 1단백질은 분석용해액에 포함된 단백질이며 기판 표면에 결합되는 단백질임)
시료 내 단백질 복합체 측정
제 1단백질 제 1단백질 상호작용(결합) 단백질
BCL2 BIM
BAX
BAK
BCL-XL BIM
BAD
BAK
MCL1 BIM
NOXA
BAK
상기 표에서 복합체를 형성하는 제 1단백질 및 제 1단백질 상호작용(결합) 단백질은 모두 분석용해액에 포함된 단백질이다. 두 단백질 중 어느 단백질이 기판 표면에 고정되어도 결과는 동등할 수 있다. 이를테면, 기판의 표면에 고정되는 항체가 제 1단백질의 항체일 수도 제 1단백질 상호작용(결합) 단백질의 항체일 수도 있다.
일 예로, 본 실시예에서 제안하는 방법을 통해 BCL2 표적저해제가 처리되기 전/후의 BCL2 family 단백질의 PPI 세기 변화 및 복합체 형성정도 변화를 정량적으로 측정할 수 있다. 이를 구현하기 위해 HL60 또는 OCI-LY3 세포주에 DMSO, Venetoclax 100 nM (BCL2 표적저해제), AMG176 100 nM (MCL1 표적저해제)를 24시간 처리한 후, 각각의 검체로부터 분석용해액을 생성하여 상기 제시된 지표를 측정한다. Venetoclax를 처리한 경우 HL60이나 OCI-LY3 모두에서 BCL2-BAD PPI 세기가 증가하는 것을 확인할 수 있다 (도 17). 반면, MCL1 표적저해제인 AMG176을 처리한 경우 BCL2-BAD PPI의 변화는 거의 없었다. 이는 venetoclax-BCL2에만 국한되는 것은 아니다. MCL1-NOXA PPI의 경우 AMG176을 처리하였을 때 선별적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다 (도 18). BCL-XL의 경우 venetoclax/AMG176 모두에 반응하지 않고, BCL-XL 발현량에 따라 PPI 세기가 달라지는 것을 통해 BCL2, MCL1 표적저해제에 의한 해당 단백질의 PPI 세기가 선별적으로 발생하는 것을 확인할 수 있다 (도 19, 20).
또다른 예로, BCL2 표적저해제 처리에 따른 복합체 형성 변화 측정을 들 수 있다. 상기 PPI 측정과 동일 조건 하에서 수집된 검체를 분석하여 BCL2 family와 BIM 복합체 형성정도 변화 (도 21), MCL1-NOXA 복합체 변화 (도 22), BCLXL-BAD 복합체 변화 (도 23)를 측정하는데 사용될 수 있다. 나아가, BCL2-BAX 복합체 변화 (도 24), BAX 및 BAK 발현량 변화 (도 25, 도 26)를 측정하는데도 적용될 수 있다.
본 실시예는 사용되는 표적저해제와 BCL2 family 단백질 및 관련된 신호전달 단백질 사이의 직접적인 관계를 측정하는데도 사용될 수 있다. 이를 구현하기 위해 제1단백질은 BCL2 또는 MCL1 단백질로 이용하고, 제 1단백질 상호작용 단백질로는 BIM-GFP 단백질을 이용한다. 기판의 표면에 제 1단백질이 고정된 상태에서 제 1단백질 상호작용 단백질과 함께 다양한 농도의 표적저해제, venetoclax 또는 AZD5991 (MCL1 표적저해제), 을 주입하여 PPI 세기 변화를 측정하는데에도 사용될 수 있다. BCL2-BIM PPI 세기는 BCL2 표적저해제인 venetoclax가 있을 때에만 감소하며, AZD5991은 거의 영향을 미치지 않는다 (도 27). 반면, MCL1이 제 1단백질인 경우 AZD5991에 의해서만 MCL1-BIM PPI 세기가 감소하는 것을 볼 수 있다 (도 28).
이를 종합하면, 본 발명에서 제안하는 방법을 통해 검체에 BCL2 family 표적저해제가 처리되었을 때 나타나는 BCL2 family 단백질의 특성 (PPI 세기, 복합체 형성, 발현량 등)을 정량적으로 분석할 수 있다. 또한, PPI 세기 변화는 약물에 의해 직접적으로 조절되는 현상임을 확인할 수 있다. 결론적으로, 본 발명을 통해 제안되는 방법은 BCL2 표적저해제 처리에 의한 BCL2 family 단백질의 변화를 측정할 수 있는 방법으로 검체의 분자진단기법으로 사용될 수 있다.
실시예 6. 실제 환자검체 분석 방법
본 실시예에서 예시하는 방법은 환자 (예를 들어 급성골수성백혈병 (Acute Myeloid Leukemia, AML) 또는 유방암)로부터 유래된 검체에서 BCL2 family 단백질의 특성을 측정하는 것이다.
환자 검체 간의 동등한 비교를 위해, 준비된 환자 검체 분석용해액의 전체 단백질 농도를 Bradford 기법, lowry 기법, 적외선 흡광도 등에서 선택된 하나 이상의 방법으로 결정할 수 있다. 기판에 주입되는 검체의 농도를 일정하게 유지하여, 검체 간의 정량적인 비교를 가능케한다. AML 환자 검체는 환자의 혈액 또는 골수로부터 추출된 검체를 사용할 수 있다. 고형암 조직의 경우 수술, 바늘생검 (needle biopsy) 등으로부터 획득된 검체를 사용할 수 있다.
환자검체는 실시예 1, 2, 3에 제시된 모든 분석이 가능하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이는 혈액암, 고형암에 구애받지 않고 모두 적용가능하다.
일 예로, AML 혈액암 환자 32명에서 획득된 검체를 분석하여 BCL2 family의 PPI(실시예 1 참조), 복합체(실시예 2 참조), 발현량(실시예 3 참조)을 종합적으로 분석하는 방법을 제공할 수 있다 (도 29).
또 다른 예로 유방암 환자 302명으로부터 획득된 검체를 분석하여 검체 내 존재하는 BCL2 단백질의 발현량을 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있다 (도 30).
또 다른 예로 폐선암 (lung adenocarcinoma) 환자 검체 15개로부터, 검체 내 존재하는 BCL2 단백질의 발현량을 측정하는데 적용될 수 있다 (도 31).
실시예 7. 실시예 1의 상호작용 측정과 실시예 2의 복합체 측정의 비교
본 실시예에서 제안하는 두 방법, 제1단백질 상호작용 단백질을 이용한 PPI 세기 측정 (실시예 1)과 제1단백질 결합단백질과의 복합체 형성 측정 (실시예 2) 은 서로 다른 정보를 제공할 수 있다.
보다 구체적으로, OCI-LY3 세포 배양 중 Venetoclax 100 nM 또는 AZD5991 100 nM를 처리하는 방법을 통해 약물 처리 전/후 BCL2 family 단백질의 PPI 세기 및 복합체 형성정도의 달라짐을 본 발명의 방법을 통해 측정할 수 있다. 일례로, BCL2-BIM PPI의 경우 venetoclax가 처리된 검체에서 높아지는 경향을 보이나, BCL2-BIM 복합체는 감소하는 것으로 확인된다 (도 32). 또 다른 예로, MCL1-NOXA PPI의 경우 AZD5991이 처리된 검체에서 높아졌으나, MCL1-NOXA 복합체는 감소하였다 (도 33). 이러한 예를 통해, 실시예 1을 통해 구현되는 PPI 세기 측정과 실시예 2를 통해 구현되는 복합체 형성 측정은 근본적으로 다른 측정값임을 알 수 있다.
실시예 8. 약물 투여를 결정하기 위해 BCL2 계열 단백질의 상호작용 변화 관측을 통한 환자 상태 추적 방법
본 실시예에서 제안하는 방법을 통해 환자의 분자적 상태를 시계열로 추적하는 방법을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로, 혈액암 환자의 골수 또는 혈액검체를 시간에 따라 채집하여 상호작용 분석을 통해 BCL2 계통 단백질의 의존정도 및 해당 표적항암제 처방 여부를 결정하는데 도움이 되는 정보를 제공할 수 있다. 이를 구현하기 위해 환자 1에서 i) 진단 당시 골수를 추출하여 BCL2, MCL1, BCL-XL과 BIM-GFP 사이의 상호작용(PPI) 분석, ii) FLT3 표적항암제인 quizartinib 처방 후 골수를 재추출하여 동일한 분석, iii) 상기 ii)단계에서 획득된 상호작용(PPI) 정보를 바탕으로 venetoclax와 Low-dose cytarabine (LDAC)를 처방한 후 획득한 전혈검체에서 동일한 분석을 수행하였다 (도 34). 진단 당시 환자의 BCL2-BIM PPI는 낮아서 venetoclax 처방 근거가 부족하였으나, FLT3 표적저해제인 quizartinib 처방 이후 BCL2-BIM PPI가 급격히 높아지는 신호전달경로 재설정 (signal rewiring)이 발생하였으며, 이를 바탕으로 venetoclax와 LDAC 병용처방하여 BCL2-BIM PPI가 다시 낮아지는 것을 확인하였다. 또한, 임상적 소견으로는 quizartinib 처방 이후 급격한 백혈구 수치 상승이 발생하였으나, venetoclax와 LDAC 병용 처방 이후 다시 안정적인 백혈구 수치를 보여 venetoclax의 약효를 임상적 수준에서도 확인할 수 있었다. 이후 제대혈 추출 줄기세포이식 (Cord blood stem cell transplantation)을 통해 해당 환자는 완전관해 (complete remission)를 달성할 수 있었다.
또다른 예로, 환자 2번에 대해서도 환자 1과 동일한 방법으로 시계열 진단을 수행하였다 (도 35). 해당 환자 역시 FLT3 표적저해제 처방에서는 BCL2 계열 단백질의 신호전달경로를 조절할 수 없었지만, venetoclax와 LDAC 병용처방 이후에는 BCL2-BIM PPI가 급격히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이는 백혈구 수치 검사에서도 동일하게 quizartinib 처방 이후 약 3배가량 백혈구 수치가 증가하였음을 통해 quizartinib 처방은 임상적 효과를 보지 못한 것으로 판단된다.
실시예 9. BCL2 표적저해제 반응성 예측 방법 개발
본 실시예에서 제안되는 방법을 통해 급성 골수성백혈병 (Acute myeloid leukemia) 환자의 BCL2 표적저해제 베네토클락스(venetoclax)의 감수성을 예측할 수 있다.
구체적으로 실시예 6을 통해 AML 환자로부터 추출한 검체 (골수 또는 혈액)에서 BCL2 계통 단백질 중 6종에 대하여 PPI 측정 (실시예 1), 6종에 대하여 발현량 측정 (실시예 3) 및 9종에 대하여 복합체 측정 (실시예2)을 수행하였다 (하기 표 9 참조).
분류 측정값 분류 측정값
PPI (실시예 1 참조) BCLXL-BAD PPI 복합체 (실시예 2 참조) BCLXL-BIM CPX
MCL1-NOXA PPI MCL1-BIM CPX
BCL2-BAD PPI BCL2-BIM CPX
BCLXL-BIM (BH3) PPI BCL2-BAX CPX
MCL1-BIM (BH3) PPI BAK-BCLXL CPX
BCL2-BIM (BH3) PPI BAK-MCL1 CPX
발현량 (실시예 3 참조) BCL-XL Lv BAK-BCL2 CPX
MCL1 Lv BCLXL-BAD CPX
BCL2 Lv MCL1-NOXA CPX
BAX LV (-TX100) 　 　
BAX LV (+TX100) 　 　
BAK LV (Y164) 　 　
Venetoclax 반응성 측정을 위해, 환자로부터 분리된 검체에 venetoclax를 각각 0, 30, 100, 300, 1000 nM를 24시간 처리한 후 살아있는 세포의 양을 유세포분석기를 이용하여 측정한다. 잔여 생존세포량에 대한 용량반응곡선을 그린 후 그래프 아랫면적 (AUC, Area under the curve)의 역수값을 이용하여 개별 환자의 venetoclax 반응성을 정량한다. 개별 측정값에 대한 venetoclax 반응성과의 선형상관관계 분석을 통해 가장 예측력이 높은 지표를 획득할 수 있다 (도 36a-c). 정량적 비교를 위하 선형상관관계계수 (R, pearson correlation coefficient)를 획득한다. 총 21개의 지표 중 R값이 0.65 이상으로 측정되는 값은 BCL2-BAD PPI, BCL2-BIM PPI, BCL2 발현량 및 BCL2-BAX 복합체 형성이 포함된다 (도 36a-c 중 네모로 표시된 네 가지 지표). 상기 선정된 지표가 venetoclax 반응성 측정 모델 수립에 있어 발명의 범위 (예를 들어 예측 모델에 포함되는 지표 종류)를 제한하는 것은 아니다.
PPI와 형성된 복합체가 서로 다른 지표임을 확인하기 위해 BCL2-BIM PPI와 BCL2-BIM 복합체 형성 정도를 각각 venetoclax 반응성과 비교할 수 있다 (도 37). BCL2-BIM PPI의 경우 venetoclax 반응성과 R=0.74로 높은 상관관계를 나타내나, BCL2-BIM 복합체 형성은 R=0.41로 낮은 상관계수를 보인다. 이를 통해 PPI 측정과 복합체 형성 측정은 서로 다른 지표임을 추론할 수 있으며, PPI 측정을 통해 venetoclax 반응성 예측이 높은 정확도로 가능할 수 있음을 나타낸다.
측정값의 결합을 통해 보다 venetoclax 반응성 예측의 정확도를 향상시킬 수 있다. 측정값을 결합시키는 방법은 다변수선형회귀 (multiple linear regression), 로지스틱회귀 (logistic regression), 서포트벡터머신 (support vector machine) 등 다양한 방법이 있으며, 본 발명의 실시예에서는 다변수회귀 방식을 이용하였으나 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 단일 변수(지표)를 이용할 경우 R=0.75 정도가 가장 높은 값이었으나, 결합되는 변수의 개수가 많아질수록 이는 증가하게 된다 (도 38a).
21개의 변수(지표)를 결합할 경우 최대 2,097,151개의 변수 결합이 생성될 수 있다. 최적의 모델 탐색에는 생물학적 타당성, 수학적 타당성 등 다양한 변수가 고려될 수 있다.
일 예로, 단독 지표보다 2 이상의 지표를 조합하는 경우 보다 상승된 분석 결과를 얻을 수 있음을 보이기 위하여, BCL2-BAX 또는 BCL2-BIM 복합체 형성 정도와 venetoclax 반응성과의 상관관계를 도 38b의 상단에 나타내고, BCL2-BAX 또는 BCL2-BIM 복합체 형성 정도와 BCL2-BAD PPI를 결합한 결과와 venetoclax 반응성과의 상관관계를 도 38b의 하단에 각각 나타내었다. 도 38b에 나타난 바와 같이, BCL2-BAX 또는 BCL2-BIM 복합체 형성 정도를 측정한 경우 R값이 각각 0.67 및 0.41로 나타난 것과 비교하여, BCL2-BAD PPI를 결합한 경우의 R값은 각각 0.76 및 0.75로 나타나서, 2 가지 지표를 조합한 경우 보다 개선된 약물 반응성 예측 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
다른 예로 총 5개의 변수가 결합된 모델을 이용할 경우 선형상관관계계수가 0.85로 증가하는 것을 확인할 수 있다 (도 38c). 이 때 포함되는 변수는 하기 표 10과 같고, 이는 다양한 변수의 조합 중 가장 유의미한 결과를 나타낸다.
분류 측정값
PPI BCLXL-BAD PPI
발현량 BAX LV (+TX100)
복합체 BCL2-BAX CPX
BAK-BCLXL CPX
BAK-MCL1 CPX
실시예 10. MCL1 표적저해제 반응성 예측방법의 구현
실시예 9에서 수행한 것과 동일하게 MCL1 표적저해제에 대한 반응성 예측 방법이 제공될 수 있다. 일례로 MCL1 표적저해제는 AZD5991을 이용하였으나, 유사한 약물작동기전 (mechanism of action)을 지닌 표적저해제라면 동등할 수 있다. 사용된 약물의 종류가 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 9와 같이 단일 지표에 대한 선형상관관계 분석을 수행할 수 있으며 이를 통해 MCL1-BIM PPI, BCLXL-BIM PPI, BAX 발현량, BAK 발현량 등이 AZD5991 반응성과 상관관계가 있음을 확인할 수 있다 (도 39a-c).
반응성 예측의 정확도를 상승시키기 위해, 실시예 9에서와 같이 다양한 변수 결합을 이용할 수 있다. 일례로 하기 표 11에 표시된 변수를 결합하여 AZD5991 반응성과의 상관관계 분석을 수행하면 R=0.78이라는 값을 획득할 수 있고(도 40), 이는 다양한 변수의 조합 중 가장 유의미한 결과를 나타낸다.
분류 측정값
PPI BCLXL-BIM PPI
MCL1-BIM PPI
발현량 BAX (+TX100) level
복합체 BAK-BCLXL CPX
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 어떠한 경우에도 한정적인 것으로 해석되지 않는다.

Claims (16)

  1. 다음 중 선택된 하나 이상을 포함하는, 개체의 BCL2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측에 정보를 제공하는 방법:
    (i) 시료 내의 제1 단백질 및 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질 간 상호작용을 측정하는 단계로서, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 외부에서 공급된 단백질인, 단계;
    (ii) 시료 내의 제1 단백질 및 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질 간 상호작용을 측정하는 단계로서, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 시료 내에 존재하는 단백질인, 단계; 및
    (iii) 제1 단백질, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질, 또는 이들 모두의 시료 내 수준을 측정하는 단계,
    이 때, 상기 제1 단백질은 BCL2 계통 단백질 중 세포자살억제 (anti-apoptotic) 단백질에서 선택된 1종 이상이고, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 BCL2 계통 단백질 중 세포자살유도(pro-apoptotic) 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이거나, 상기 제1 단백질은 BCL2 계통 단백질 중 세포자살유도 단백질에서 선택된 1종 이상이고, 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질은 BCL2 계통 단백질 중 세포자살억제 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이며,
    상기 시료는 상기 개체로부터 분리된 세포 또는 세포 용해물을 포함함.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단백질은 BCL2, BCLxL, BCLw, BFL1 및 MCL1로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 제1단백질과 상호작용하는 단백질은 BAD, BIM, NOXA, PUMA, BMF, tBID, BIK, HRK, BAX, BAK 및 BOK으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이거나,
    상기 제1 단백질은 BAD, BIM, NOXA, PUMA, BMF, tBID, BIK, HRK, BAX, BAK 및 BOK으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 제1단백질과 상호작용하는 단백질은 BCL2, BCLxL, BCLw, BFL1 및 MCL1로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (i)은 기판에 고정된 제1 단백질에 외부에서 공급되고 표지물질로 표지된 상기 제1 단백질과 상호작용하는 단백질(제1 단백질 상호작용 단백질)을 접촉시키고, 상기 시료 내 제1 단백질 및 외부 공급된 제1 단백질 상호작용 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고;
    상기 단계 (ii)는 표면에 상기 제1 단백질과 결합하는 결합물질을 포함하는 기판에 시료를 접촉시키고, 시료 내 제1 단백질 및 시료 내 제1 단백질 상호작용 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계를 포함하고;
    상기 단계 (iii)은 시료 내 제1 단백질, 시료 내 제1 단백질 상호작용 단백질, 또는 이들 모두의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것인,
    방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단계 (i)의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계는,
    (1) 제1 단백질의 결합물질이 포함된 기판에 시료를 공급하여 제1 단백질을 기판에 고정시키는 단계;
    (2-1) 상기 기판에 표지물질이 부착된 제1단백질 상호작용 단백질을 외부로부터 공급하여 기판 상의 제1 단백질과 반응시키는 단계; 및
    (3) 기판 표면상 근접장 영역 내에서 상기 표지물질이 발생시키는 신호를 TIRF 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)을 이용하여 측정하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 단계 (i)은 다음 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법:
    (i-1) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-2) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-3) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-4) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-5) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-6) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-7) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-8) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-9) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 NOXA 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-10) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-11) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계; 및
    (i-12) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계.
  6. 제3항에 있어서, 상기 단계 (ii)의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계는,
    (1) 제1 단백질의 결합물질이 포함된 기판에 시료를 공급하여 제1 단백질을 기판에 고정시키는 단계;
    (2-2) 표지물질이 부착된 제1단백질 상호작용 단백질의 결합 물질을 상기 기판에 공급하여, 시료 내 제1 단백질과 시료 내 제1단백질 상호작용 단백질 사이에 형성된 복합체 중의 제1단백질 상호작용 단백질과 반응시키는 단계; 및
    (3) 기판 표면상 근접장 영역 내에서 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 TIRF 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)을 이용하여 측정하는 단계를 포함하거나,
    (1') 제1 단백질 상호작용 단백질의 결합물질이 포함된 기판에 시료를 공급하여 제1 단백질 상호작용 단백질을 기판에 고정시키는 단계;
    (2'-2) 표지물질이 부착된 제1단백질 결합 물질을 상기 기판에 공급하여, 시료 내 제1 단백질과 시료 내 제1단백질 상호작용 단백질 사이에 형성된 복합체 중의 제1단백질과 반응시키는 단계; 및
    (3') 기판 표면상 근접장 영역 내에서 상기 표지물질로부터 발생하는 신호를 TIRF 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)을 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것인,
    방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기 단계 (ii)는 다음 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법:
    (ii-1) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-2) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-3) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-4) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAD 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-5) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-6) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-7) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-8) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 NOXA 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-9) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 된 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-10) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 된 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계; 및
    (ii-11) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계.
  8. 제3항에 있어서, 상기 단계 (iii)의 단백질의 수준을 측정하는 단계는,
    제1 단백질의 포획물질, 제1 단백질 상호작용 단백질의 포획물질, 또는 이들 모두가 포함된 기판에 시료를 공급하여, 상기 제1 단백질, 제1 단백질 상호작용 단백질, 또는 이들 모두를 기판에 고정화시키는 단계;
    표지물질이 부착된 제1 단백질의 검출물질, 표지물질이 부착된 제1 단백질 상호작용 단백질의 검출물질, 또는 이들 모두를 상기 기판에 공급하여 반응시키는 단계; 및
    기판 표면상 근접장 영역 내에서 상기 표지자가 발현하는 신호를 TIRF 현미경(total internal reflection fluorescence microscope)을 이용하여 측정하는 단계
    를 포함하는 것인, 방법.
  9. 제2항에 있어서, 상기 단계 (iii)은 다음 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 방법:
    (iii-1) 시료 내 BCL2 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-2) 시료 내 BCLxl 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-3) 시료 내 MCL1 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-4) 시료 내 BAX 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (iii-5) 시료 내 BAK 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  10. 제2항에 있어서, 다음 중 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법:
    (i-1) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-2) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-3) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-4) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-5) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-6) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-7) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-8) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-9) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 NOXA 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-10) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-11) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-12) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (ii-1) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-2) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-3) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-4) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAD 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-5) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-6) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-7) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-8) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 NOXA 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-9) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 된 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-10) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 된 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-11) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (iii-1) 시료 내 BCL2 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-2) 시료 내 BCLxl 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-3) 시료 내 MCL1 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-4) 시료 내 BAX 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
    (iii-5) 시료 내 BAK 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 다음의 단계 (i-1) 내지 (i-12) 중 선택된 하나 이상 및 단계 (ii-1) 내지 (ii-11) 중에서 선택된 하나 이상을 포함하거나, 단계 (i-1) 내지 (i-12) 중 선택된 하나 이상 및 단계 (iii-1) 내지 (iii-5) 중에서 선택된 하나 이상을 포함하거나, 단계 (ii-1) 내지 (ii-11) 중에서 선택된 하나 이상 및 단계 (iii-1) 내지 (iii-5) 중에서 선택된 하나 이상을 포함하거나, 단계 (i-1) 내지 (i-12) 중 선택된 하나 이상, 단계 (ii-1) 내지 (ii-11) 중에서 선택된 하나 이상, 및 단계 (iii-1) 내지 (iii-5) 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법:
    (i-1) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-2) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-3) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-4) 시료 내의 BCL2 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-5) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAD 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-6) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-7) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-8) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-9) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 NOXA 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-10) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BIM 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-11) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BAX 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (i-12) 시료 내의 MCL1 단백질 및 외부에서 공급된 BAK 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계;
    (ii-1) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-2) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-3) 시료 내의 BCL2 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-4) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAD 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-5) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-6) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-7) 시료 내의 BCLxl 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-8) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 NOXA 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-9) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 된 BIM 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-10) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 된 BAX 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (ii-11) 시료 내의 MCL1 단백질 및 시료 내의 BAK 단백질 간 형성된 복합체 수준을 측정하는 단계;
    (iii-1) 시료 내 BCL2 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-2) 시료 내 BCLxl 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-3) 시료 내 MCL1 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-4) 시료 내 BAX 단백질의 수준을 측정하는 단계;
    (iii-5) 시료 내 BAK 단백질의 수준을 측정하는 단계.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물은 베네토클락스(Venetoclax), ABT737, 및 항 BCL2 항체로 이루어진 군에서 선택된 BCL2 저해제인, 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물은 항 MCL-1 항체, AMG-176, AZD5991, 및 마리토클락스(Maritoclax)로 이루어진 군에서 선택된 MCL1 저해제인, 방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BCL2 계통 단백질 표적 약물은 항 BCLxL 항체 및 ABT263로 이루어진 군에서 선택된 BCLxL 저해제인, 방법.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 암환자이고, 상기 세포는 상기 개체로부터 분리된 암세포인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 혈액암인, 방법.
KR1020200157961A 2019-12-06 2020-11-23 Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법 KR102351570B1 (ko)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2020398476A AU2020398476A1 (en) 2019-12-06 2020-12-04 Method for predicting reactivity to drug targeting BCL2 family protein
US17/111,883 US20210179683A1 (en) 2019-12-06 2020-12-04 Method of response prediction for bcl2 family protein targeting drug
EP20896087.2A EP4075141A4 (en) 2019-12-06 2020-12-04 METHOD FOR PREDICTING REACTIVITY TO A DRUG TARGETING A PROTEIN OF THE BCL2 FAMILY
CN202080084567.5A CN114761809A (zh) 2019-12-06 2020-12-04 预测bcl2家族蛋白靶向药物的反应性的方法
CA3164047A CA3164047A1 (en) 2019-12-06 2020-12-04 Method for predicting reactivity to drug targeting bcl2 family protein
JP2021560871A JP7449589B2 (ja) 2019-12-06 2020-12-04 Ｂｃｌ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測方法
PCT/KR2020/017691 WO2021112635A2 (ko) 2019-12-06 2020-12-04 Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법
US17/349,522 US20210309706A1 (en) 2019-12-06 2021-06-16 Method of response prediction for bcl2 family protein targeting drug
KR1020220004043A KR20220010051A (ko) 2019-12-06 2022-01-11 Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법
JP2023203884A JP2024023501A (ja) 2019-12-06 2023-12-01 Ｂｃｌ２ファミリータンパク質標的薬物に対する反応性予測方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190162071 2019-12-06
KR20190162071 2019-12-06

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220004043A Division KR20220010051A (ko) 2019-12-06 2022-01-11 Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210071830A true KR20210071830A (ko) 2021-06-16
KR102351570B1 KR102351570B1 (ko) 2022-01-14

Family

ID=76603327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200157961A KR102351570B1 (ko) 2019-12-06 2020-11-23 Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102351570B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160178634A1 (en) * 2013-08-01 2016-06-23 Eutropics Pharmaceuticals, Inc. Method for predicting cancer sensitivity
KR20190053979A (ko) * 2017-04-19 2019-05-20 주식회사 프로티나 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 장치

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160178634A1 (en) * 2013-08-01 2016-06-23 Eutropics Pharmaceuticals, Inc. Method for predicting cancer sensitivity
KR20190053979A (ko) * 2017-04-19 2019-05-20 주식회사 프로티나 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 장치

Also Published As

Publication number Publication date
KR102351570B1 (ko) 2022-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Moreno-Layseca et al. Cargo-specific recruitment in clathrin-and dynamin-independent endocytosis
Yim et al. A pulse-chasable reporter processing assay for mammalian autophagic flux with HaloTag
Dutta et al. EphrinA2 regulates clathrin mediated KSHV endocytosis in fibroblast cells by coordinating integrin-associated signaling and c-Cbl directed polyubiquitination
RU2566064C2 (ru) Идентификация низкомолекулярных соединений, распознаваемых антителами у индивидуумов с нейродегенеративными заболеваниями
KR102189141B1 (ko) 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 장치
JP6610728B2 (ja) センサーチップおよびこれを用いたｓｐｆｓ免疫蛍光測定システム
Woolley et al. Prognostic association of YB-1 expression in breast cancers: a matter of antibody
KR102317202B1 (ko) 유방암 재발 예측 방법
CN113366317A (zh) 用于囊泡货物标记和检测的系统和方法
Deng et al. A fluorogenic probe for predicting treatment response in non-small cell lung cancer with EGFR-activating mutations
KR102351570B1 (ko) Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법
KR20220010051A (ko) Bcl2 계통 단백질 표적 약물에 대한 반응성 예측 방법
US11045548B2 (en) Methods for inhibiting cancer cell migration with gold nanomaterials and photothermal therapy
JP7286627B2 (ja) 試料における細胞間相互作用を検出するためのキット、方法、およびそれらの使用
JP2021522478A (ja) 選択された患者の心血管疾患を治療するための組成物および方法
US7354709B2 (en) Collapsin response mediator protein-1
JP4560314B2 (ja) 中性アミノ酸トランスポーターによる癌の検出法、及びそのためのキット
KR20210001095A (ko) Pd-l1과 pd-1 간 상호작용 저해제 및 스크리닝 방법
US20120296067A1 (en) Compound capable of binding to naturally occurring denatured protein, and method for screening for the compound

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant