KR20210063211A - 다제내성 박테리아에서 생성되는 메탈로-베타-락타마제에 대한 신규 저해제 및 이의 제조방법 - Google Patents

다제내성 박테리아에서 생성되는 메탈로-베타-락타마제에 대한 신규 저해제 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 메탈로-베타-락타마제(MBL) 저해제 및 이를 포함하는 다제내성 항균 조성물에 관한 것으로 화학식 1의 화합물 또는 이의 유도체이다.
Figure pat00030
화학식 1
여기서 R1은 H,
Figure pat00031
또는
Figure pat00032
이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 MBL 저해제는 광범위한 스펙트럼의 MBL에 대하여 가지는 저해제 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 MBL와 베타-락탐 구조를 가지는 항생제를 함께 처리하게 되면 미생물이 생산하는 MBL에 의해 항생제가 분해되는 것을 막아 항생제의 작용 시간 및 범위를 확장시킬 수 있고, MBL의 존재로 인하여 항생제에 대해 저항성을 획득할 수 있는 박테리아도 사멸시킬 수 있어서, 다제내성 저항성 박테리아에 의한 감염을 예방 및 치료하는데 유용하다.

Description

다제내성 박테리아에서 생성되는 메탈로-베타-락타마제에 대한 신규 저해제 및 이의 제조방법{New inhibitors for the metallo-beta-lactamase produced by a multi-registant bacteria and methods of preparation thereof}
본 발명은 모든 서브클래스(B1, B2 및 B3) 메탈로-베타-락타마제 (metallo-beta-lactamase: 이하 "MBL"이라 약칭함)들의 저해할 수 있는 신규한 MBL 저해제 및 이를 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.
베타-락탐 항생제는 박테리아 감염 치료에 사용되는 가장 성공적인 약물 중 하나이며 항생제 세계 시장의 약 65%를 차지한다(Worthington et al., J. Org. Chem., 2013, 78(9), pages 4207-4213). 따라서 베타-락탐 항생제에 대한 내성은 그람 음성 박테리아 감염과 관련된 가장 심각한 문제 중 하나이다(Lee et al., Lancet Infect. Dis., 2016, 16(1), pages 17-18).
베타-락타마제는 베타-락탐(베타-락탐 항생제)을 가수 분해하여 불활성 화시키는 박테리아 효소이며, 중증 또는 고위험 세균 감염의 치료에 일반적으로 사용되는 효과적인 베타-락탐계 항생제인 페니실린(penicillins), 세팔로스포린(cephalosporins), 모노박탐(monobactams) 및 카바페넴(carbapenems)에 내성이 있는 병원성 박테리아의 주요 원인이다.
베타-락타마제는 페니실린, 세팔로스포린, 모노박탐 및 카바페넴(박테리아 감염 치료를 위한 최후의 수단 약물)과 같은 베타-락탐 항생제에 내성을 부여하는 다양한 박테리아에 의해 생성된다(McKenna, Nature, 2013, 499(7459), pages 394-396; Papp-Wallace et al, Antimicrob. Agents Chemother., 2011, 55(11), pages 4943-4960). 그람 음성 박테리아에서 항생제 내성을 부여하는 효소 그룹인 베타-락타마제의 생산은 현재 그람 음성 감염을 치료하는 데있어 주요 장벽 중 하나이다(Lee et al., Lancet Infect. Dis., 2016, 16(1), pages 17-18); Papp-Wallace et al, Antimicrob. Agents Chemother., 2011, 55(11), pages 4943-4960; Tucker et al., Cell, 2018, 172(3), pages 618-628 e613). 베타-락타마제들은 이들의 촉매적 메커니즘에 따라 세린 베타-락타마제(A, C 및 D 클래스) 및 메탈로-베타-락타마제(MBL, 클래스 B 효소들은 3 개의 서브클래스 B1-B3으로 더 나뉘어 짐)로 분류된다(Bush et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2010, 54(3), pages 969-976; Galleni et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2001, 45(3), pages 660-663).
메탈로-베타-락타마제는 촉매 작용을 위해 아연이 필요하다. 이들은 광범위한 기질 스펙트럼을 가지며 모노박탐을 제외하고 카바페넴을 포함한 사실상 모든 베타-락탐 항생제를 가수 분해 할 수 있다(Palzkill, Ann. N. Y. Acad. Sci., 2013, 1277, pages 91-104). 장내세균과(Enterobacteriaceae)에서 동정되고 가장 공통적으로 획득된 서브클래스 B1 메탈로-베타-락타마제들은 VIM-유형(Verona integron-encoded metallo-beta-lactamase) 및 IMP-유형(imipenem-resistant Pseudomonas) 그룹과 신흥 NDM-유형(New Delhi metallo-beta-lactamase)이 포함된다(Nordmann et al., Trends Microbiol., 2011, 19(12), pages 588-595; Walsh et al., Clin. Microbiol. Rev., 2005, 18(2), pages 306-325; Yong et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2009, 53(12), pages 5046-5054). 임상적으로 가장 중요한 카바페넴에이즈(carbapenemase)들 중 하나인 NDM-1은 2008년에 인도에서 스웨덴으로 돌아온 환자에서 분리된 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae)과 대장균(Escherichia coli)에서 처음 발견되었으며, 이후 전 세계 여러 국가에서 분리된 박테리아에서 존재하는 것으로 밝혀졌다(Yong et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2009, 53(12), pages 5046-5054). IMP-1은 1991년 일본의 세라티아 마르체센스 (Serratia marcescens)에서 발견되었다(Ito et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1995, 39(4), pages 824-829). VIM-1은 1997년 이탈리아에서 처음 확인되었고(Cornaglia et al., Clin. Infect. Dis., 2000, 31(5), pages 1119-1125; Lauretti et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1999, 43(7), pages 1584-1590), VIM-2는 1996년에 프랑스에서 분리된 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에서 보고되었다(Poirel et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2000, 44(4), pages 891-897). GIM-1(German imipenemase-1: subclass B1 MBL)은 2002년 독일의 임상 녹농균에서 처음 확인되었다(Castanheira et al. Antimicrob. Agents Chemother., 2004, 48(12), pages 4654-4661). 또한 독일에서 유래 한 다제내성 균주인 녹농균의 다른 클론에서 보고되었다(Rieber et al. J. Antimicrob. Chemother., 2012, 67(4), pages 1043-1045).
CphA-유형(Carbapenemase hydrolyzing Aeromonas: subclass B2 MBL)은 에로모나스 하이드로필라 (Aeromonas hydrophila)로부터 동정되었다(Massidda et al., J. Bacteriol., 1991, 173(15), pages 4611-4617). 서브클래스 B3 GOB-타입 메탈로-베타-락타마제는 다양한 대립 유전자 변이체를 포함하며, 이들 모두는 면역 저하 환자의 신생아 수막염 및 기회 감염 병원체인 Elizabethkingia meningoseptica에서 발견되었다(Bloch et al., Medicine (Baltimore), 1997, 76(1), pages 30-41; Lee et al, J. Chin. Med. Assoc., 2008, 71(9), pages 473-476); Shinha et al, IDCases, 2015, 2(1), pages 13-15). GOB-1[크리세오박테리움균(Chryseobacterium meningosepticum)의 클래스 B 베타-락타마제로 명명됨]은 임상적으로 가장 중요한 인간 병원체인 크리세오박테리움균에서 발견되었다(Bellais et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2000, 44(7), 1878-1886).
Avibactam(이전의 NXL104)은 diazabicyclooctane(DBO, non-lactam class) 유도체 항생제이며 ceftazidime-avibactam은 2015년 FDA에 의해 승인되었다. Avibactam은 Ambler 클래스 A를 포함한 세린 베타-락타마제 효소[주로 extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) 및 Klebsiella pneumonia carbapenemases (KPCs)], 클래스 C 및 일부 클래스 D(OXA-1, OXA-10 및 OXA-48 하위군 포함)를 저해한다(Lomovskaya et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2017, 61(11), pii: e01443-17). 또한, relebactam(이전 MK-7655A)은 다른 DBO 클래스 약물에 의해 개발되었으며, FDA는 최근 2019년 항생제 imipenem-cilastatin/relebactam의 승인을 발표하였다. Vaborbactam(이전 RPX7009)은, 고리 모양의 boronate non-beta-lactam agent(avibactam 및 relebactam과 구조적으로 구별됨), 베타-락타마제 저해제이며 meropenem-vaborbactam은 2017년 FDA에 의해 승인되었다. 두 저해제(relebactam 및 vaborbacta)는 Ambler 클래스 A(ESBL 및 KPC 포함)와 클래스 C 베타-락타마제에(AmpC) 대하여 활성을 나타내었다. 그러나, 이들은 클래스 B MBL(예를 들어, NDM-, IMP- 및 VIM-타입)를 저해하는 것이 입증되지 않았다(Zhanel et al., Drugs, 2018, 78(1), pages 65-98). 또한,MBL는 클라불산(clavulanate), 설박탐(sulbactam) 및 테이조박탐(tazobactam)과 같은 저해제에 의해 저해되지 않는다.
따라서, 모든 서브클래스(B1, B2 및 B3) MBL를 저해하기 위해 넓은 스펙트럼 기능성을 갖는 신규 MBL 저해제 개발이 반드시 필요하다. 본 발명자는 메탈로-베타-락타마제의 모든 클래스를 저해할 수 있는 신규한 저해제를 합성하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 MBL 저해제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 신규한 MBL 저해제 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 MBL 저해제를 포함한 박테리아의 감염 치료 및 예방 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 MBL 저해제를 이용한 박테리아의 감염 치료 및 예방 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 위하여, 본 발명의 제 1 의 형태는 하기 화학식 1의 MBL 저해제이다.
Figure pat00001
여기에서, R1은 H,
Figure pat00002
또는
Figure pat00003
이다.
보다 구체적으로는 상기 MBL 저해제는 하기 화학식 2 내지 4중 어느 하나 이다.
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
본 발명의 제 2 의 형태는 상기 화학식 1의 MBL 저해제 및 세균 활성을 억제하는 항생제를 포함하는 항생제 조성물이다. 상기 화학식 1의 MBL 저해제는 MBL를 억제하여, 항생제의 분해를 막아 항생제의 항균 활성 유지를 도와준다. 상기 항생제는 베타-락탐 구조를 가지는 항생제이면 모두 포함되고, 보다 구체적으로는 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신(cephamycins), 모노박탐, 카바페넴 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 항생제이다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 제 3 의 형태는 대상체에게 유효량의 상기 화학식 1의 MBL 저해제 및 세균 활성을 억제하는 항생제 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 세균 감염을 치료하는 방법이다. 상기 방법은 조성물을 대상체에게 투여하기 전, 동시에 또는 다음에 대상체에게 베타-락탐 항생제를 투여할 수 있다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함 할 수 있다. 상기 세균은 이에 제한되는 것은 아니라 그람 음성 세균이다.
본 발명의 제 4 의 형태는 하기 반응식 1 내지 3 중 어느 하나의 반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하기 화학식 1의 MBL 저해제 합성 방법이다;
[화학식 1]
Figure pat00007
여기에서, R1은 H,
Figure pat00008
또는
Figure pat00009
이다;
반응식 1:
Figure pat00010
;
반응식 2:
Figure pat00011
; 및
반응식 3:
Figure pat00012
. 보다 구체적으로는 상기 화학식 1에서, R1이 H인 경우, 상기 반응식 1에 따라 화학식 2의 3,5-디클로로페닐보론산(3,5-Dichlorophenylboronic acid)을 제조하는 방법이고; 상기 화학식 1에서 R1이
Figure pat00013
인 경우, 상기 반응식 2에 따라 화학식 3의 (4-(4-아미노-3-클로로페녹시)-3,5-디클로로페닐)보론산의 합성: (4-(4-amino-3-chlorophenoxy)-3,5-dichlorophenyl)boronic acid을 제조하는 방법이고; 상기 화학식 1에서 R1이
Figure pat00014
인 경우, 상기 반응식 3에 따라서 화학식 4의 (3,5-디클로로-4-(2-하이드록시에톡시)페닐)보론산((3,5-dichloro-4-(2-hydroxyethoxy)phenyl)boronic acid)을 제조하는 방법이다.
본 발명에 따른 화학식 1의 MBL 저해제는 MBL의 모든 서브클래스에 효과를 가져 광범위한 스펙트럼의 MBL 저해제이다. 본 발명에 따른 MBL와 베타-락탐 구조를 가지는 항생제를 함께 처리하게 되면 미생물이 생산하는 MBL에 의해 항생제가 분해되는 것을 막아 항생제의 작용 시간 및 범위를 확장시킬 수 있고, MBL의 존재로 인하여 항생제에 대해 저항성을 획득할 수 있는 세균도 사멸시킬 수 있어서, 항생제 저항성 세균에 의한 감염을 예방 및 치료하는데 유용하다.
도 1은 3,5-디클로로페닐보론산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 3,5-디클로로페닐보론산의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 3는(4-(4-아미노-3-클로로페녹시)-3,5-디클로로페닐)보론산 화합물의 예시적인 합성을 나타내는 플로우 시트의 반응식 및 시약이다.
도 4는 (4-(4-아미노-3-클로로페녹시)-3,5-디클로로페닐)보론산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 (4-(4-아미노-3-클로로페녹시)-3,5-디클로로페닐)보론산의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 (3,5-디클로로-4-(2-하이드록시에톡시)페닐)보론산 화합물의 예시적인 합성을 나타내는 플로우 시트의 반응식 및 시약이다.
도 7은 (3,5-디클로로-4-(2-하이드록시에톡시)페닐)보론산의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 (3,5-디클로로-4-(2-하이드록시에톡시)페닐)보론산의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 하나 이상의 구체예에 따르면, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 유도체는 MBL들을 저해 할 수 있다(하기 실시예 3 참조). 상기 화합물들은 모든 서브클래스(B1, B2 및 B3) MBL들을 저해하는 광범위한 스펙트럼 기능성을 나타낸다. 그러나, 이전에 보고된 화합물(FAD 승인) 모두가 임상적으로-중요한 서브클래스 B1 MBL(NDM, IMP, VIM 및 GIM-타입), 서브클래스 B2 MBL(CphA) 및 서브클래스 B3 MBL(GOB-유형)을 억제하는 것은 입증되지 않았다(아래 실시예 참조).
ICM-VLS 소프트웨어를 사용한 구조 기반 가상 스크리닝은 MBL들을 저해하는 신규 화합물을 찾는데 사용하였다(아래 실시예 1 참조). 박테리아 균주에서 정제된 MBL들은 이러한 스크리닝에 사용하였다. MBL들의 활성을 저해하는 스크리닝된 화합물의 능력(IC50값)은 표준 효소 저해 방법을 사용하여 측정 하였다(하기 실시예 5 참조; Page, Biochem. J., 1993, 295, pages 295-304). 세포-기반 분석 방법을 사용하여, bla NDM-1을 보유한 폐렴간균에 대해 6,600 개의 본 연구실의 화합물 라이브러리(Our chemical library, OCL)의 스크리닝을 수행하였다(하기 실시예 2 참조). OCL-4(본 연구실의 화합물 라이브러리로부터 스크리닝 되었고, A 및 B 부분으로 구성)와 이미페넴의 조합은 bla NDM-1을 보유한 폐렴간균에 대해 부분적인 시너지 효과를 나타냈다. 신규 저해제들을 개발하기 위해서, 이들은 화학식 I(R1 = H를 갖는 화학식 2의 DCPBA) 및 OCL-4의 부분(A 및 B)에 기초하여 설계되었다. 화학식 3의 ACP-DCPBA는 DCPBA 및 OCL-4의 부분 A(반응식 2)에 기초하여 합성되었다. 화학식 4의 CHP-DCPBA는 DCPBA 및 OCL-4의 부분 B(반응식 3)에 기초하여 합성되었다. 본 발명의 하나의 바람직한 구체예에서, 화학식 2의 DCPBA 및 이의 유도체 화합물(화학식 3의 CHP-DCPBA 및 화학식 4의 CHP-DCPBA)들은 MBL들의 활성을 효과적으로 저해하는데 이용 될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 구체 예에 따르면, 화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 MBL들의 저해제로 사용될 수 있다. 기존의 화합물들 중에서는 모든 서브클래스(B1, B2 및 B3) MBL들을 저해하는 것이 보고되지 않았지만, 화학식 1의 화합물은 모든 서브클래스(B1, B2 및 B3) MBL들을 저해하는 광범위한 스펙트럼 기능성을 나타낸다.
따라서, 통상적인 저해제들과 비교하여, 화학식 1의 화합물은 MBL들을 저해하는데 보다 효과적이므로 화학식 1의 화합물은 박테리아 감염의 치료에 더욱 유용 할 수 있다.
베타-락탐 항생제에 내성인 병원성 박테리아의 베타-락타마제들은 화학식 1의 화합물을 투여함으로써 불활성화되기 때문에, 항생제와 함께 처리하면 보다 효과적으로 수행 될 수 있다.
베타-락탐 항생제들은 분자 구조에 베타-락탐 고리를 포함하는 항생제이다. 베타-락탐 항생제에는 페니실린, 세팜, 카바페넴, 페넴 및 모노박탐이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 본 출원의 구현예에 따르면, 베타-락탐 항생제는 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신, 모노박탐 및/또는 카바페넴이다.
화학식 1의 화합물을 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구로 투여 될 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부, 정맥내 주사, 피하 주사, 근육 주사, 복강내 주사 또는 경피 투여에 대한 국소 적용에 의해 투여 될 수 있다.
조성물은 약제학적 유효량으로 투여된다. 본원에 기재된 바와 같이, "약학적 유효량"이라는 표현은 의학적 치료에 적용될 수 있는 박테리아 감염을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 투여량 수준은 감염의 유형 또는 중증도, 약제의 활성, 약제에 대한 감수성, 투여 기간, 투여 경로, 배설 비율, 치료 기간, 조합에 사용되는 약제를 포함하는 요소 및 의료 분야에서 잘 알려진 다른 요소들에 기초하여 결정 될 수 있다. 조성물은 베타-락탐 항생제를 투여하기 전, 동시에 또는 후에 대상체에게 투여 될 수 있다. 조성물은 별도의 치료제로서 투여 될 수 있거나, 다른 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 통상적인 치료제와 함께 또는 동시에 투여 될 수 있다. 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여 할 수도 있다. 부작용 없이 상기 언급된 모든 성분을 고려하여 최소 용량으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 용량은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함 할 수 있다. 담체에는 락토오스, 덱스트로스, 슈크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘이 포함되고 미네랄오일이 일반적으로 제제를 제조하는데 사용되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 실시예에 따른 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제를 추가로 포함 할 수 있다.
본 발명의 구체예의 조성물은 경구 제형 및 비경구 제형을 포함하는 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 제제를 제조하는 경우, 제제를 제조하는데 일반적으로 사용되는 희석제 또는 매개물, 예컨대 충전제, 증량제, 결합제, 보습제, 붕해제 또는 계면 활성제를 사용하여 제조한다. 경구 투여용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물을 전분과 같은 하나 이상의 매개물(전분, 탄산 칼슘, 자당, 유당 또는 젤라틴)과 혼합함으로써 제조된다. 또한, 단순한 매개물 이외에, 스테아르산마그네슘 또는 활석과 같은 윤활제가 사용된다. 경구 투여용 액체제로는 현탁액, 내부용 용액제제, 유제, 시럽 제제 등을 들 수 있다. 통상적으로 사용되는 단순 희석제로서 물 또는 액체 파라핀 이외에, 보습제, 감미제, 방향족제 또는 방부제와 같은 다양한 종류의 매개물이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제의 예는 멸균된 수용액, 불용성제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제를 포함한다. 수불용성 용매 또는 현탁제로서, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜 또는 올리브오일과 같은 식물성 오일 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈 61, 카카오 지방, 라우린 지방, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시 예는 본 발명의 특정 설명을 위해서만 제공되며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는 것은 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 자명하다.
실시예 1 가상의 라이브러리 스크리닝(Virtual library screening)
NDM-1(가장 임상적으로 중요한 MBL)을 저해하는 신규 화합물을 찾기 위해, ICM-VLS 소프트웨어를 사용하여 구조 기반 가상 스크리닝을 수행 하였다. NDM-1의 결정학적 구조(PDB ID, 3SPU) (King, et al., Protein Sci., 2011, 20(9), pages 1484-1491)는 ICM (Internal Coordinate Mechanics) 소프트웨어 프로그램(Molsoft, LLC)에서 사용 가능한 PocketFinder 알고리즘을 사용하여 분석하였다.
단백질 구조는 0.1 Å의 RMS(root mean square) 구배를 갖는 ICM 역장 및 거리 의존 유전 전위를 사용하여 3 차원(3D) 양성자화, 물 분자의 결실 및 에너지 최소화에 의해 준비되었다.
리간드-결합 부위는 활성 부위 틈새 주위에서 13.0 Å의 서브 세트 영역으로 정의되었고, ICM-VLS 소프트웨어(Molsoft, LLC)를 사용하여 VLS(virtual library screening)를 위한 표적 부위로 선택하였다. ICM-VLS는 편향된 확률로 Monte Carlo 입체 구조 검색을 사용하여 전체적인 최적화를 사용하여 리간드의 완전 유연한 전체-원자 모델을 단백질 수용체의 원자 좌표로부터 계산된 그리드 전위 맵 세트에 신속하게 도킹하였다. 이어서, 각각의 리간드-도킹 입체 형태는 스코어링 기능으로 평가하였다. ICM-점수 기능은 반데르발스 에너지, 정전기, 수소 결합, 구조적 엔트로피 손실 및 용매화 정전기 에너지 변화를 통합한다(Abagyan et al., J. Mol. Biol., 1994, 235(3), pages 983-1002). ICM-VLS를 사용하여 3개의 3.0 GHz Intel Xeon 프로세서에서 기본 ICM-도킹 매개 변수를 사용하여 MolCart 화합물 및 빌딩 블록 데이터베이스(Molsoft, LLC)에서 전체 10,658,063 화합물 세트를 도킹하였다. 세 번의 도킹 실행 후, 도킹 점수 <-45 인 결과 화합물은 광범위한 수소 결합 및 반데르발스 접촉을 갖는 화합물을 선택하여 추가로 여과 한 후, 다양한 스캐폴드에 대한 계층적 군집화에 의해 표적 NDM-1의 리간드-결합 부위와 구조적으로 그리고 화학적으로 양립 가능한 50개의 화합물을 확인하였다. 분자 도킹 점수가 가장 좋은 7개의 화합물을 선택하였고 Enamine(http://www.enamine.net/)에서 구입하였다.
7개 화합물의 IC50값은 하기 기재된 바와 같이 결정하였다. 스크리닝된 7개의 화합물(10 mM)을 100% DMSO에 용해시켰다. 필요에 따라 더 희석된 스톡을 제조하였다. NDM-1 활성은 Shimazu UV-1650PC 분광 측정기에 의해 니트로세핀(nitrocefin) (Oxoid, Hampshire, UK)의 특징적인 분자 흡광 계수(De482 = 15,900 M-1 cm-1)를 사용하여 482 nm에서의 흡광도 변화를 모니터링함으로써 결정되었다. 최대 5% DMSO는 MBL들의 효소 활성에 영향을 미치지 않았다. 분석은 효소(263 nM), 100 μM ZnCl2 및 100 μg/mL 소혈청알부민을 함유하는 50 mM MES (pH 7.0)에서 수행되었다. 30°C에서 정제된 효소 및 저해제의 예비 배양 5분 후, 니트로세핀(100 μM)을 첨가하여 효소 반응을 시작하였다. 잔류 속도는 5분 후에 측정되었다. 각 반응의 처음 120초를 사용하여 초기 속도를 측정하였다. 데이터는 마이크로 소프트 엑셀을 사용하여 평가하였다. NDM-1의 농도-의존적 저해는 2배 희석 시리즈로부터 생성된 상이한 농도로 7개의 화합물을 대상으로 측정하였다. 7개의 화합물의 모든 농도에서 반응 진행을 3회 측정하였다. IC50값은 다음 방정식을 사용하여 엑셀용 XL Fit curve fitting software(www.idbs.com)를 사용하여 4-매개 변수 로그 피팅을 사용하여 계산하였다:
Figure pat00015
여기서 y는 잔류 효소 활성(%)이고 x 는 해당 농도이다. 적합 IC50 매개 변수는 곡선의 적합 상단(B)과 하단(A) 사이의 반값을 제공하는 농도로 정의된다. 7개의 화합물 중에서, 화합물 1(화학식 2: DCPBA)만이 IC50 값(79.89 μM)을 나타내었다(표 1).
표 1. 선별된 화합물의 NDM-1에 대한 IC50값.
Figure pat00016
실시예 2 In vivo 스크리닝
이미페넴(고정 8 μg/mL)과 화학물질 조합의 향상된 활성을 찾기 위해, 초기 스크리닝은 본 실험실의 화학 라이브러리(OCL) 6,600개의 화합물을 대상으로 bla NDM-1을 보유한 폐렴간균에 대해 96-웰 플레이트를 사용하여 200 μM의 농도로 수행하였다. 본 발명자들은 Mueller-Hinton II broth (MHB; Difco Laboratories, Detroit, Mich.)에서 배양된 1Х107 cells/mL로 접종 용액을 준비하였고, 다채널 피펫을 사용하여 96-웰 플레이트에 10 μL씩 접종하였다. 96-웰 플레이트는 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 그런다음, OD600에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 결정하였고, 처리되지 않은 대조군에 비해 배양물의 탁도가 60%이상 감소된 화합물을 선택하였다. bla NDM-1을 보유한 폐렴간균에 대한 6,600개의 화합물의 예비 스크리닝은 세포 생존을 60%미만으로 감소시킨 4 개의 "히트"를 선별하였다.
4개의 화합물(OCL-1, OCL-2, OCL-3 및 OCL-4)을 체커보드 분석(checkerboard assays)으로 시험하여 이들의 개별 및 조합 효능을 측정 하였다(표 2). 이중-용량 반응 실험에서 선택된 화합물 조합은 bla NDM-1을 보유한 폐렴간균에 대한 상호 작용의 특성을 사용하여 결정하였다. 먼저, 선택한 각 화합물의 연속 희석액(10% DMSO 중 20-1280 μg/mL)을 준비하고, 이미페넴의 연속 희석액(멸균수에서 10-2560 μg/mL)과 혼합하였다. 다음으로, Mueller-Hinton II 배지에서 1Х107 cells/mL의 밀도로 세포 용액을 준비하였다. 마지막으로, 200 μL의 96-웰 플레이트에는 최종 세포(5Х105 cells/mL), 이미페넴(0.5-128 μg/mL) 및 화합물(1-64 μg/mL)의 최종 농도로 포함되었다. 대조군의 경우, 이에 따라 미처리 및 사멸 세포 대조군 웰뿐만 아니라 이미페넴은 가로줄에 화합물은 세로줄에 처리하였다. 마지막으로, 96-웰 플레이트는 37°C에서 24시간 동안 배양하였고, OD600에서 흡광도 측정하여 세포 생존을 결정하였다. FIC index (FICi)=FICA+FICB=[A]/MICA+[B]/MICB, 여기서 [A]는 약물 A의 농도이고, MICA 는 MIC 및 FICA는 유기체에 대한 약물 A의 FIC이고, [B], MICB 및 FICB는 약물 B에 대해 동일한 방식으로 정의된다. 이렇게 얻어진 FICi는 다음과 같이 해석된다: <0.5, synergy; 0.5 to 0.75, partial synergy; 0.76 to 1.0, additive effect; >1.0 to 4.0, indifference; and >4.0, antagonism (Timurkaynak et al., Int. J. Antimicrob. Agents, 2006, 27(3), 224-228).
상기 결과에서 이미페넴과 병용 될 때 다양한 정도의 항균 활성을 보여주었다. 특히, OCL-4는 이미페넴의 조합에 대해 가장 낮은 FICi 값(0.562)을 나타냈다(표 2). 이러한 결과는 OCL-4가 NDM-1에 저해 효과를 갖는다는 것을 의미한다. bla NDM-1을 보유한 폐렴간균에 대해 보다 효과적인 저해제를 개발하기 위해, 화합물 2(DCPBA)과 OCL-4 화합물의 부분(A 및 B)을 기반으로 신규 저해제들을 설계하였다.
표 2. 이미페넘과 화합물 간의 in vitro 상호 작용.
Figure pat00017
실시예 3 신규 화합물의 합성 및 특성
유기 금속 반응은 오븐-건조된 유리 제품에서 그리고 무수 용매를 사용하여 아르곤 상에서 수행되었다. 무수 테트라히드로푸란(THF) 및 디에틸에테르를 표준 방법으로 수득하였고, 사용 전에 나트륨벤조페논케틸로부터 아르곤 하에 새로 증류시켰다. 모든 시작 화학 물질 및 시약은 시판되고 있다. 화합물의 크로마토그래피 정제는 실리카겔(입자 크기 0.05-0.20 mm)을 사용하여 수행하였다. 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼은 메탄올(CD3OD) 용액에서 Bruker Avance 400(1H의 경우 400MHz, 13C의 경우 125MHz) 또는 Bruker Avance 500(1H의 경우 500MHz, 13C의 경우 125MHz) 분광계를 사용하여 기록되었다. 화학적 이동(δ)은 내부 표준으로서 단일 테트라메틸실란(TMS)으로부터 다운필드로 ppm으로 측정되었다(s singlet, d doublet, t triplet, m multiplet, br s broad signal). 커플링 상수(J)는 Hz로 표시된다. 얻어진 화합물의 순도는 Agilent 1260 기기에서 LC/MS로 확인하였다. 모든 시험된 화합물의 순도는 95%이상이었다.
실시예 3-1. 3,5-디클로로페닐보론산(3,5-Dichlorophenylboronic acid)의 합성(화학식 2의 DCPBA)
화학식 1의 화합물의 예시적인 합성은 다음과 같다:
Figure pat00018
반응식 1: 화학식 2의 DCPBA의 합성.
1 단계:
3,5-디클로로아닐린(0.042 mol)에 염산(300 mL)을 첨가하여 잘 섞은 후 -5°C까지 냉각시킨다. 반응 온도150 ml의 무수 테트라히드로푸란에 1,3-디클로로-5-요오도 벤젠(0.026 mol)이 포함된 용액은 -80°C까지 냉각시킨 후 n-부틸 리튬(0.029 mol)이 포함된 헥산(2.5 M) 용액을 첨가, 첨가하는 동안 반응 혼합물 온도를 -70°C 이하로 유지시킨다. 첨가가 완료되면, 반응 혼합물을 -80°C에서 15분 동안 교반한 다음, 트리이소프로필보레이트(0.076 mol)를 동시에 첨가하였다. 반응 혼합물은 주위 온도로 서서히 가온시키고, 추가로 1시간 동안 교반하였다. 이 시간 후, 반응 혼합물을 감압하에 약 50 mL의 부피로 농축시켰고, 500 mL의 얼음물에 부었다. 혼합물은 26 mL의 염산 수용액(2 N)으로 산성화시키고 형성된 침전물을 여과하고 건조시켜 백색 분말(final product)을 얻었다. Mp 323 °C. LC/MS: MH+ 192. 1H-NMR (500 MHz, DMSO): d 7.62 (d, 1H, 4-H), 7.76 (s, 2H, 2,6-H), 8.44 (br s, 2H, OH) (도 1). 13C-NMR (125 MHz, DMSO): d 129.3 (4-C), 131.9 (2,6-C), 132.8 (1-C), 134.2 (3,5-C) (도 2).
실시예 3-2. (4-(4-아미노-3-클로로페녹시)-3,5-디클로로페닐)보론산의 합성: (4-(4-amino-3-chlorophenoxy)-3,5-dichlorophenyl)boronic acid (ACP-DCPBA)
본 발명의 ACP-DCPBA 화합물의 예시적인 합성은 도 3에 보여준 바와 같이 플로우 시트의 반응식 및 시약에 따라 합성되었다.
반응식 2: ACP-DCPBA의 합성
1 단계:
N,N-디메틸포름아미드(200 mL)에 4-브로모-2,6-디클로로페놀(30.2 g, 124.8 mmol, 1.05 당량)의 용액에 2-클로로-4-플루오로-1-니트로벤젠(20.9 g, 121.5 mmol, 1.0)과 탄산칼륨(32.8 g, 237.7 mmol, 2.0 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 16시간 동안 120°C에서 교반하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고, 여과된 반응물은 물(1,000 mL)로 희석하였고, 에틸아세테이트(300 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(400 mL x 3)로 세척하였고, 무수 황산나트륨으로 건조하고 진공에서 농축하였다. 잔류물은 폴리에틸렌/에틸아세테이트 = 100/1로 용리하는 실리카겔 칼럼으로 정제하여 5-브로모-1,3-디클로로-2-(3-클로로-4-니트로페녹시)벤젠을 백색 고체(6.6 g, 수율: 14%)와 황색 고체(18.5 g, 순도: 약 70%, 수율: 39%)로서 수득하였다.
2 단계:
무수 테트라히드로푸란(230 mL), 에탄올(115 mL) 및 물(58 mL)의 혼합 용매에 5-브로모-1,3-디클로로-2-(3-클로로-4-니트로페녹시)벤젠(18.5 g, 46.6 mmol, 1.0 당량)의 용액에 염화암모늄(25.2g, 466.0 mol, 10 당량) 및 철(13.0 g, 233.0 mmol, 5 당량)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80°C에서 6시간 동안 교반하였다. LC-MS에의해 반응을 모니터링 하였다. 이어서, 혼합물을 여과하고 여과액을 농축시켰다. 잔류물은 물(150 mL)로 희석하였고 에틸아세테이트(200 mL x 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(100 mL)로 세척하였고 무수 황산나트륨상에서 건조시켰다. 용액을 진공에서 농축시켰고 잔류물은 실리카 플래쉬 컬럼(폴리에틸렌 중 0 ~ 10% 에틸아세테이트)으로 정제하여 4-(4-브로모-2,6-디클로로페녹시)-2-클로로아닐린을 백색 고체(8.3 g, 수율: 48%)로서 수득하였다.
3 단계:
질소 하의 디옥산(170 mL)에 4-(4-브로모-2,6-디클로로페녹시)-2- 클로로아닐린(8.3 g, 22.6 mmol, 1.0 당량), 비스(피나콜라토)디보론(6.9 g, 27.1 mmol, 1.2 당량) 및 포타슘아세테이트(4.4 g, 45.2, 2.0 당량)이 포함된 혼합물에 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(1.7 g, 2.3 mmol, 0.1 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물은 100°C에서 16시간 동안 교반하였다. LC-MS에 의해 반응을 모니터링 하였다. 이어서, 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물은 폴리에틸렌/에틸 아세테이트 = 30/1로 용리하는 실리카겔 칼럼으로 정제하여 2-클로로-4-(2,6-디클로로-4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페녹시)아닐린을 백색 고체(6.8 g, 수율: 73%)로서 수득하였다.
4 단계:
아세톤(200 mL)에 포함되어 있는 2-클로로-4-(2,6-디클로로-4-(4,4,5,5- 테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페녹시)아닐린 용액(6.8 g, 16.5 mmol)에 물(50 mL), 과아이오딘산나트륨(28.2 g, 131.7 mmol) 및 아세트산암모늄(10.1 g, 131.7 mmol)을 첨가하였다. 45°C에서 4시간 동안 교반한 후, 혼합물을 농축시켰고, 메탄올(50 mL)로 희석하고 여과하여 불용성 고체를 제거 하였다. 여과액을 역상 컬럼(물 중 10% ~ 100% 아세토니트릴)으로 정제하여 (4-(4-아미노-3-클로로페녹시)-3,5-디클로로페닐)보론산을 갈색 빨간 고체(3.5 g, 수율: 64%)로서 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CD3OD): d = 6.58 (dd, J = 8.8, 2.8 Hz, 1H), 6.67 (d , J = 2.8 Hz, 1H), 6.80 (d , J = 8.8 Hz, 1H), 7.76 (brs , 2H) (도 4). 13C-NMR (400 MHz, CD3OD): d = 115.18, 116.13, 117.15, 119.77, 129.60, 134.84, 139.80, 149.00, 149.79. MS: m/z 331.9 [M+H]+ (도 5).
실시예 3-3. (3,5-디클로로-4-(2-하이드록시에톡시)페닐)보론산의 합성: (3,5-dichloro-4-(2-hydroxyethoxy)phenyl)boronic acid (CHP-DCPBA)
본 발명의 CHP-DCPBA 화합물의 예시적인 합성은 도 6에 보여준 바와 같이 플로우 시트의 반응식 및 시약에 따라 합성되었다:
반응식 3: CHP-DCPBA의 합성.
1 단계:
N,N-디메틸포름아미드(100 mL)에 녹아있는 1,2,3-트리클로로-5-니트로벤젠 (7.0 g, 31.0 mmol)의 용액에 4-클로로-2-메톡시페놀(4.9 g, 31.0 mmol)과 탄산칼륨(8.6 g, 62.0 mmol)을 첨가하였다. 100°C에서 1시간 동안 교반 한 후, 혼합물은 물(400 mL)로 희석하였고 에틸아세테이트(200 mL x 3)로 추출하였다. 합한 에틸아세테이트는 염수(300 mL x 3)로 세척하였고, 황산나트륨상에서 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 잔류물은 폴리에틸렌/에틸 아세테이트 = 20/1(120 mL)로 연화 처리하여 1,3-디클로로-2-(4- 클로로-2-메톡시페녹시)-5-니트로 벤젠을 황색 고체(9.2 g, 수율: 86%)로서 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): d = 3.91 (s, 3H), 6.45 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.81 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.28 (s, 2H).
2 단계:
무수테트라히드로푸란/에탄올/물(50 mL/100 mL/20 mL)에 녹아있는 1,3-디클로로-2-(4-클로로-2-메톡시페녹시)-5-니트로벤젠(9.2 g, 26.6 mmol)의 용액에 철과(7.5 g, 133.3 mmol) 및 염화암노늄(14.4 g, 266.6 mmol)을 첨가하였다. 75°C에서 1시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물은 약 50 mL로 농축하고 에틸아세테이트/물(100 mL/100 mL)로 희석하고 여과하였다. 수상을 분리하고 에틸 아세테이트(100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층은 염수(50 mL)로 세척하였고, 황산 나트륨상에서 건조시키고 농축시켜 3,5-디클로로-4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)아닐린을 황색 고체(8.2 g, 수율: 97%)로서 수득하였다.
3 단계:
아세토니트릴(180 mL)에 녹아있는 3,5-디클로로-4-(4-클로로-2-메톡시 페녹시)아닐린(8.0 g, 25.2 mmol)의 용액을 40%의 수성 브롬화수소산(15.1 mL, 75.7 mmol)로 처리하였다. 생성된 혼합물에 물(30 mL)에 녹아있는 아질산나트륨(2.1 g, 30.3 mmol)의 용액을 -5°C에서 적가하였다. 첨가 한 후, 혼합물은 -5°C에서 25분 동안 교반하였다. 브롬화 구리(7.2 g, 50.5 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 혼합물은 실온으로 가온하고 추가로 1시간 동안 교반 하였다. 이어서, 혼합물은 약 30 mL로 농축시켰고, 물(100 mL)로 희석한 후 에틸 아세테이트(100 mL x 2)로 추출하였다. 합한 에틸 아세테이트는 염수(100 mL)로 세척하였고, 황산 나트륨상에서 건조시키고 농축시켰다. 잔류물은 실리카 겔 칼럼(폴리에틸렌/에틸아세테이트= 80/1)으로 정제하여 5-브로모-1,3-디클로로-2-(4-클로로-2-메톡시페녹시)벤젠을 백색 고체(7.5 g, 수율 : 78%)로서 수득하였다. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): d = 3.95 (s, 3H), 6.34 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.77 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.54 (s, 2H).
4 단계:
디옥산(115 mL)에 5-브로모-1,3-디클로로-2-(4-클로로-2-메톡시페녹시)벤젠 (7.5 g, 19.7 mmol), 비스(피나콜라토)디보론(7.5 g, 29.6 mmol), [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐(II)(720 mg, 1.0 mmol)과 및 포타슘아세테이트(3.9 g, 39.5 mmol)를 첨가한 후 질소 조건하에서 100°C에서 16시간 동안 교반mL), 과아이오딘산나트륨(16.0 g, 74.8 mmol)과 아세트산암모늄(5.8 g, 74.8 mmol)을 첨가하였다. 45°C에서 4시간 동안 교반한 후, 혼합물은 농축시키고, 메탄올(50 mL)로 희석하고 여과하여 불용성 고체를 제거하였다. 여과액을 약 30 mL로 농축하였고 역상 컬럼(물 중 30% ~ 100% 아세토니트릴)으로 정제하여 (3,5-디클로로-4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)보론산을 백색 고체(2.6 g, 수율: 80%)로서 수득하였다.
6 단계:
다이클로로메테인(17%, 30 mL, 30.0 mmol)에 녹아있는 삼브롬화붕소 용액을 (3,5-디클로로-4-(4-클로로-2-메톡시페녹시)페닐)보론산(2.5 g, 7.5 mmol)에 첨가하여 질소 조건하에서 -78°C에서 교반하였다. 반응물은 1시간 내에 실온으로 가온하고 추가로 3시간 동안 교반하였다. 반응은 -78°C에서 메탄올(20 mL)로 ◎칭하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 생성된 용액은 진공에서 농축시켰다. 잔류물은 역상 컬럼(물 중 5% ~ 95% 아세토니트릴)으로 정제하여(3,5-디클로로-4-(4-클로로-2-하이드록시페녹시)페닐)보론산을 백색 고체(2.0 g, 수율: 83%)로서 수득하였다. 1H -NMR (400 MHz, CD3OD): d = 6.28 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.65 (dd, J = 8.8, 2.4 국의 한 대학 병원에서 분양 받았다. 대장균에 대해 코돈 최적화된 bla GIM-1 유전자(GenBank ID: AJ620678), bla CphA 유전자(GenBank ID: X57102) 및 bla GOB-1 유전자(GenBank ID: AF090141)를 인코딩하는 3개의 DNA 템플릿을 IDT(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, USA)로부터 합성하였다. DNA 주형은 적합한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다(표 3). 증폭된 DNA와 pET-30a(+) 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)를 NdeI 및 XhoI로 이중 절개 한 다음, 처리된 DNA를 이용하여 이중 절개된 벡터에 결합시켰다. DNA 서열을 확인한 후, 플라스미드들은(pET-30a(+)/His6-bla NDM-1, pET-30a(+)/His6-bla IMP-1, pET-30a(+)/His6-bla VIM-2, pET-30a(+)/His6-bla GIM-1, pET-30a(+)/His6-bla CphA 및 pET-30a(+)/His6-bla GOB-1)은 개별적으로 대장균 BL21(DE3) 세포로 형질 전환시켰다. 히스티딘-태깅된 단백질들(NDM-1, IMP-1, VIM-2, GIM-1, CphA 및 GOB-1) 각각은 이전에 보고된 바와 같이 준비되었다(Park et al., J. Glob. Antimicrob. Resist., 2018, 14, 302-305).
표 3. MBLs을 인코딩하는 6개의 유전자를 발현시키기 위해 PCR 증폭에 사용된 올리고 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열들.
Figure pat00019
aF, sense (forward) primer; R, antisense (reverse) primer.Restriction sites appear in bold. The underlined and bolded bases indicate the hexahistidine tag, and italic bases indicate the enterokinase recognition site.
실시예 5 MBLs에 대한 신규 화합물(DCPBA, ACP-DCPBA 및 CHP-DCPBA)의 IC 50 값의 결정
4종의 임상적으로 중요한 서브클래스 B1 MBL들(NDM-1, IMP-1, VIM-2 및 GIM-1), 서브클래스 B2 MBL(CphA) 및 서브클래스 B3 MBL(GOB-1)에 대한 신규 화합물들(DCPBA, ACP-DCPBA 및 CHP-DCPBA)의 저해 효과를 조사하기 위해 대한 IC50값을 측정하였다(표 4). 화합물들(DCPBA, ACP-DCPBA 및 CHP-DCPBA)은 10 mM농도로 100% DMSO에 용해시켰다. MBL의 활성은 482nm에서 흡광도의 변화를 모니터링함으로써 결정하였다. 최대 5% DMSO는 MBL의 효소 활성에 영향을 미치지 않았다. 각각의 효소(NDM-1, 263 nM; IMP-1, 891 nM; VIM-2, 81 nM; GIM-1, 662 nM; CphA, 157 nM; GOB-1, 2.69 μM)들은 화합물(DCPBA, ACP-DCPBA 및 CHP-DCPBA)과 5분간 반응시킨 후 니트로세핀(100 μM)과 혼합하였다. 각 반응의 처음 120초를 사용하여 초기 속도를 측정하였다. 데이터는 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 평가하였다. 모든 농도의 DCPBA(ACP-DCPBA 또는 CHP-DCPBA)에서 반응 진행은 3회 측정하였다. DCPBA, ACP-DCPBA 및 CHP-DCPBA에 의한 MBL 저해 결과는 표 4에 제시하였다. DCPBA는 모든 서브클래스 MBL에 대하여 27.33 ± 0.01 μM ~ 798.90 ± 0.02 μM범위에서 IC50값을 나타내었다. ACP-DCPBA는 모든 서브클래스 MBL에 대하여 22.78 ± 0.01 μM ~ 790.24 ± 0.02 μM 범위에서 IC50값을 나타내냈다. CHP-DCPBA는 모든 서브클래스 MBL에 대하여 15.15 ± 0.01 μM ~ 468.50 ± 0.01 μM 범위에서 IC50값을 나타내었다. 따라서, 모든 신규 화합물들(DCPBA, ACP-DCPBA 및 CHP-DCPBA)은 모든 서브클래스 MBL에 대한 저해 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, ACP-DCPBA 및 CHP-DCPBA에 대한 Cph의 IC50값은 DCPBA에 대한 CphA의 IC50값에 비해 6배 낮았다. 표 4는 CHP-DCPBA가 모든 서브클래스(B1, B2 및 B3) MBL의 최상의 저해제임을 입증하는 결과이다.
표 4. 기질로서 니트로세핀을 사용하여 모든 서브클래스(B1, B2 및 B3) MBL에 대하여 신규 저해제들(DCPBA, ACP-DCPBA 및 CHP-DCPBA)에 대한 IC50값 측정.
Figure pat00020
aMBLs, metallo-beta-lactamases
화학식 1의 화합물은 모든 임상적으로 중요한 MBL 서브그룹을 저해하는 광범위한 스펙트럼 기능성을 나타낸다는 것이 입증되었다.
따라서 상기 화합물은 베타-락탐 항생제(베타-락탐)의 효과를 강화시키는 데 유용하며 박테리아 감염의 예방 및 치료에 베타-락탐 항생제와 함께 사용될 수 있다.
<110> MYONGJI UNIVERSITY INDUSTRY AND ACADEMIA COOPERATION FOUNDATION <120> New inhibitors for the metallo-beta-lactamase produced by a multi-registant bacteria and methods of preparation thereof <130> PN200032 <150> US 16/690,298 <151> 2019-11-21 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca aggaaatccg cccgacgatt 60 ggccagcaa 69 <210> 2 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gagctcgagt cagcgcagct tgtcggccat gcgggccgta tga 43 <210> 3 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agtctttgcc agatttaaaa 60 attgaaaagc ttg 73 <210> 4 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gagctcgagt tagttgcttg gttttgatgg ttttttac 38 <210> 5 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca aggagtatcc gacagtcagc 60 gaaattc 67 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gagctcgagc tactcaacga ctgagcgatt tgtg 34 <210> 7 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agcagggtca taaaccgcta 60 gaagtta 67 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gagctcgagt taatcagccg acgcttcagc g 31 <210> 9 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca aggcggggat gtcgctgacg 60 ca 62 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gagctcgagt tatgactggg gtgcggcctt gatcag 36 <210> 11 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atacatatgc accatcatca tcatcatgac gacgacgaca agcaggtggt taaggaaccg 60 gag 63 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gagctcgagt tatttgtctt gcgagtcctt ttttattttg tc 42

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염;
    [화학식 1]
    Figure pat00021

    여기에서, R1은 H,
    Figure pat00022
    또는
    Figure pat00023
    이다.
  2. 메탈로-베타 락타마제를 억제하는 제 1 항에 따른 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제 1 항에 따른 화합물을 포함하는 박테리아 감염 치료용 조성물.
  4. 제 1 항에 따른 화합물 및 항생제를 포함하는 박테리아의 감염 치료 및 예방용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 항생제는 베타-락탐 구조를 가지는 항생제인 것을 특징으로 하는 박테리아의 감염 치료 및 예방용 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 항생제는 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신(cephamycins), 모노박탐, 카바페넴 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 항생제인 것을 특징으로 하는 박테리아의 감염 치료 및 예방용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 박테리아의 감염 치료 및 예방용 조성물.
  8. 대상체에게 유효량의 제 1 항에 따른 화합물 및 항생제 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 상기 항생제 조성물은 상기 제 1 항에 따른 화합물과 동시 또는 이시에 투여되는 것을 특징으로 하는 박테리아의 감염 치료 및 예방 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 항생제는 베타-락탐 구조를 가지는 항생제인 것을 특징으로 하는 박테리아의 감염 치료 및 예방 방법.
  10. 제 9 항에 있어서 상기 항생제는 페니실린, 세팔로스포린, 세파마이신(cephamycins), 모노박탐, 카바페넴 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 항생제인 것을 특징으로 하는 박테리아의 감염 치료 및 예방 방법.
  11. 하기 반응식 1 내지 3 중 어느 하나의 반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하기 화학식 1의 메탈로-베타-락타마제 저해제 합성 방법:
    [화학식 1]
    Figure pat00024

    여기에서, R1은 H,
    Figure pat00025
    또는
    Figure pat00026
    이다;

    반응식 1:
    Figure pat00027
    ;
    반응식 2:
    Figure pat00028
    ; 및
    반응식 3:
    Figure pat00029
    .
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