KR20210060561A - 인트론-기반 범용 클로닝 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 방법은 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계, 및 상기 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시킴으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 제1 폴리뉴클레오티드는 인트론의 5' 부분을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론의 3' 부분을 포함한다. 본 발명에 의해 추가로 구상되는 것은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 이는 진핵 숙주 세포에서 전사될 때 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 적어도 5 개의 인트론을 포함하는 전사체로 전사된다.
Description
여러 DNA 단편을 단일 연속 DNA 스트레치로 조립할 수 있는 분자 클로닝 방법 및 재조합 DNA 분자는 분자 생물학, 생물 공학 및 의학 연구에 필수적인 도구이다. 최초의 재조합 DNA 분자는 제한 효소와 DNA 리가제의 발견 직후인 1960년대 후반에 만들어졌다. 그 이후, 재조합 DNA 분자의 생성을 빠르고 용이하게 하기 위해 다양한 방법이 개발되었다.
단백질 공학은 전형적으로, 근본적인 코딩 DNA 서열을 조작하여 수행된다. 서로 다른 단백질 도메인을 코딩하는 DNA 모듈들의 지향성 조립은 신규한 바이오 치료제 형식(biotherapeutic format)의 개발 및 최적화에 중요하다.
분자 클로닝은 단일 DNA 단편의 클로닝으로부터, 여러 DNA 구성 요소의 단일 연속 DNA 스트레치로의 조립으로 진행되었다. 그러나, 복잡한 작제물의 생성을 가능하게 하는 효율적인 기술이 여전히 필요하다(문헌[Endy, Nature 2005 Nov 24;438(7067):449-53] 참조). 특히, 유전적 구성 요소들을 더 큰 시스템으로 조립하는 동안 지루함과 뜻밖의 결과를 상당 부분 제거하기 위해 일련의 표준적이고 신뢰할 수 있는 공학 메커니즘이 요망된다(문헌[Knight, T. F. (2003). Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. DOI: 1721.1/21168] 참조).
전형적으로 DNA 모듈(예를 들어, 단백질 도메인을 코딩함)은 정의된 플랭킹 프리픽스(prefix) 및 서픽스(suffix) DNA 서열을 사용하여 컷-앤-페이스트(cut-and-paste) 메커니즘에 의해 조립된다. 전형적으로, 프리픽스 및 서픽스 서열은 회문성 타입 II 제한 부위를 코딩한다. 타입 II 효소는 동일한 부위에서 DNA를 인식하여 절단하고, 동일한 제한 효소에 의해 절단되는 다른 DNA 모듈에 융합될 수 있는 단일 가닥 오버행(overhang)을 생성한다. 그러나, 관심 DNA 모듈은 DNA 조작 기법에 의해 적절한 타입 II 제한 부위를 5' 및 3' 말단에 갖춤으로써, 변경된/돌연변이된 1차 뉴클레오티드 서열을 생성해야 한다. 또한, 선형 지향성 DNA 모듈 조립에는 몇 가지 고유한 타입 II 부위가 필요하다. 서로 다른 타입 II 제한 효소는 종종 반응 조건과 관련하여 양립 가능하지 않기 때문에 조립에는 일반적으로 여러 클로닝 단계가 필요하다.
골든 게이트(Golden Gate) 클로닝은 자주 사용되는 분자 클로닝 방법이며, 이 방법은 타입 IIs 제한 효소와 T4 DNA 리가제를 사용하여 여러 DNA 단편의 단일 조각으로의 동시적이고 지향성인 조립을 가능하게 한다. 문헌[Engler 2008, A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS ONE 3.11: e3647] 및 문헌[Engler et al. 2009, Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS ONE 4: e5553]. EcoRI 및 BamHI와 같은 표준 타입 II 제한 효소와 달리, BsaI, BsmBI 및 BbsI와 같은 타입 IIs 제한 효소는 그 인식 서열의 바깥쪽에서 DNA를 절단하므로 비-회문성 오버행을 생성할 수 있다. 절단 부위를 적절하게 설계하면, 타입 IIs 제한 효소에 의해 절단된 두 개의 단편은 원래 제한 부위를 결여한 생성물로 리게이션될 수 있다.
타입 II-기반 제한-리게이션은 단일 클로닝 단계로 많은 DNA 단편의 조립을 가능하게 한다. 조립을 위해, DNA 단편들은 정의된 거리 및 배향으로 타입 IIs 효소 인식 부위에 의해 플랭킹되는 5' (프리픽스) 및 3' (서픽스) 말단에 1 내지 6 bp 길이, 예를 들어, 3 내지 4 bp 길이의 상보적 서열 스트레치를 필요로 한다. 인식 부위에 결합하면, 타입 IIs 효소는 프리픽스 및 서픽스 뉴클레오티드 서열에서 DNA 단편들을 절단하여 실제 인식 부위를 제거하는 동시에, 리게이션 서열들로 이루어진 유리 5' 및 3' 말단을 생성한다. 이어서, 이러한 리게이션 서열들은 리게이션 반응으로 일치하는/양립 가능한 리게이션 서열과 함께 DNA 단편들을 융합하는 데 사용된다. 결과적으로, 5' 프리픽스와 3' 서픽스 서열이 두 개의 별개의 DNA 단편 사이에서 동일한 경우, 이 단편들은 타입 II-기반 제한 리게이션 반응으로 매끄럽게 리게이션될 수 있다.
일반적으로, 특정 변이 라이브러리를 생성하는 데 사용된 DNA 단편/모듈은 종종 양립 가능한 프리픽스 및 서픽스 서열을 나타내지 않기 때문에 새로운 프로젝트와 관련하여 재사용(즉, 재조립)될 수 없다. 대신, 서로 다른 클로닝 전략과 일치하도록 모듈이 다시 설계되어야 한다(즉, 프리픽스와 서픽스 서열이 리게이션을 가능하게 하도록 조정되어야 함). 이는 시간과 비용이 매우 많이 드는 양상을 보이는데, 그 이유는 특히 프리픽스- 및 서픽스-플랭킹된 코어 서열이 변경되지 않은 채로 유지되면서 DNA 단편/모듈의 4 bp 프리픽스 및 서픽스 서열이 빈번히 수정되어야 하기 때문이다.
따라서, 당업계에 설명된 클로닝 전략의 주요 제한은 지향성 조립을 가능하게 하기 위해 DNA 모듈 내에 고유하고 양립 가능한 프리픽스 및 서픽스 서열을 여전히 필요로 한다는 것이다. 이러한 프리픽스 및 서픽스 서열은 서로 다른 단백질 도메인 및/또는 형식 간에 양립 가능하지 않을 수 있으며, 이는 이러한 방법의 범용 적용 가능성을 제한한다.
현재까지, 5' 및 3' 프리픽스 및 서픽스 서열과 무관하게 타입 IIs-기반 제한-리게이션 반응에서 재사용 및 조립될 수 있는 일반적인 DNA 단편 모듈을 생성하는 효율적인 방법은 존재하지 않는다.
pre-mRNA 스플라이싱은 진핵 생물 유전자 발현에 필수적인 과정이다. 고등 척추 동물의 경우, 인식해야 하는 표적 인트론의 길이는 <50 nt 내지 >500.000 nt의 범위이다. 인간의 경우, 약 90 nt 내지 약 2000 nt 길이를 갖는 인트론이 pre-mRNA 내에서 가장 흔히 발견된다. 그러나, 짧거나 심지어 극히 짧은(ultra-short) 인트론 서열 또한 기술되었다. 예를 들어, 짧은 인트론은 시노랩디티스 엘레강스(C. Elegans)(<40 nt), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(약 20 내지 59 nt) 및 인간 조직(<65 nt)에서 발견되었다(문헌[Hong et al. 2006, Intron size, abundance, and distribution within untranslated regions of genes. Molecular biology and evolution, 23(12), 2392-2404]; 문헌[Shimada et al., 2015, Identification and validation of evolutionarily conserved unusually short pre-mRNA introns in the human genome. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 10376-10388]).
pre-mRNA에서 인트론과 엑손 사이의 경계에 위치한 인트론은 스플라이소좀 인트론(spliceosomal intron)이라고도 지칭된다. RNA 스플라이싱은 엑손들 뒤에 남겨진 비-코딩 RNA 인트론들을 제거하고, 이어서 엑손들이 스플라이싱되고 함께 결합하여 최종 mRNA("성숙 mRNA")를 형성한다.
여러 관심 유전자의 발현을 가능하게 하는 재조합 DNA 분자의 빠르고 쉬운 생성에 대한 강한 요구가 존재한다. 특히, 5' 말단 및 3' 말단, 즉, 프리픽스 및 서픽스 서열과 무관하게 타입 IIs-기반 제한-리게이션 반응에서 재사용 및 조립될 수 있는 일반 DNA 단편 모듈을 생성하는 수단 및 방법이 매우 바람직할 것이다.
본 발명의 기초가 되는 기술적 과제는 전술한 요구에 부합하는 수단 및 방법의 제공으로 볼 수 있다. 기술적 과제는 청구범위 및 이하 본 명세서에서 특징화되는 구현예에 의해 해결된다.
따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 방법은, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드를 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시킴으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 각각은, 절단 시 서로 리게이션되어 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성시킬 수 있는 상보적 말단을 생성하는, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 및 절단 부위를 포함하는 인트론 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 인트론의 5' 부분을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드는 인트론의 3' 부분을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 추가로 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의해 추가로 구상되는 것은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드이며, 이는 진핵 숙주 세포에서 전사될 때 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 적어도 5 개의 인트론을 포함하는 전사체로 전사된다.
전술한 방법의 일 구현예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 다음 요소를 포함한다:
(i) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열, 및
(iv) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((iii)의 절단 서열은 (iv)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음).
전술한 방법의 일 구현예에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 다음 요소를 포함한다:
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열로서, 상기 제2 절단 서열은 제1 절단 서열에 상보적인, 제2 절단 서열((ii)의 제2 절단 서열은 (i)의 인식 서열, 즉, 제2 폴리뉴클레오티드의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열.
따라서, 본 발명은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은,
(a1) 제1 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열, 및
(iv) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((iii)의 절단 서열은 (iv)의 인식 서열, 즉, 제1 폴리뉴클레오티드의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하는, 단계,
(a2) 제2 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열로서, 상기 제2 절단 서열은 제1 절단 서열에 상보적인, 제2 절단 서열((ii)의 제2 절단 서열은 (i)의 인식 서열, 즉, 제2 폴리뉴클레오티드의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계, 및
(b) 상기 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시킴으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함한다.
생성된 폴리뉴클레오티드는 제1 인트론을 포함한다(즉, 제1 인트론을 인코딩할 것임). 상기 제1 인트론은 기능적일 것이며, 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 것이다.
따라서, 생성된 융합 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(aa) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(bb) 제1 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제1 인트론은 기능적이고, 상기 제1 인트론은 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열, 및
(cc) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함할 것이다.
본 발명의 방법은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드의 생성을 가능하게 한다. 따라서, 방법은 클로닝 방법이다. 그러한 방법은 전형적으로 시험관내에서 수행된다. 본 발명의 방법은 앞서 명시적으로 언급된 단계들로 제한되지 않으며, 그에 따라 이러한 단계들 이외의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 단계는 본 발명의 융합 폴리뉴클레오티드로의 추가 폴리뉴클레오티드 서열의 리게이션과 관련될 수 있다. 예를 들어, 이하 본원에 설명되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 상기 제시된 바와 같은 요소 (aa), (bb) 및 (cc)를 포함하는 융합 폴리뉴클레오티드의 생성뿐만 아니라 관심 폴리펩티드의 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 부분 등을 인코딩하는 핵산 서열과 같은 추가 요소를 포함하는 융합 폴리뉴클레오티드의 생성도 가능하게 한다. 또한, 추가 폴리뉴클레오티드가 리게이션에 사용될 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 비번역 영역(5' UTR) 및 3' 비번역 영역(3' UTR)을 인코딩할 수 있다. 이러한 서열은 전사되지만 번역되지는 않기 때문에, 본원에 설명된 바와 같은 인트론-기반 클로닝 접근법을 적용하는 것이 가능하다.
더욱이, 추가 단계는 발현 벡터와 같은 벡터로의 융합 폴리뉴클레오티드의 클로닝, 포유 동물 세포와 같은 적합한 숙주 세포로의 융합 폴리뉴클레오티드 또는 상기 융합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 도입, 및/또는 숙주 세포 또는 배양 배지/상청액으로부터 폴리펩티드의 분리, 즉, 정제와 관련될 수 있다. 정제 공정은 관심 단백질 내의 적합한 태그, 예를 들어, His 태그의 존재에 의해 지원될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보핵산(RNA), 또는 특히 데스옥시리보핵산(DNA)을 지칭할 것이다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 DNA 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥, 또는 특히 이중 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 상기 이중 가닥 DNA는 본 발명의 방법의 단계 (b) 동안 말단(들)에 하나 또는 두 개의 단일 가닥 오버행을 일시적으로 포함할 것이다. 이는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 절단 서열, 즉, 절단 부위의 수에 좌우된다: 하나의 절단 부위가 존재하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 한쪽 말단에 하나의 단일 가닥 오버행을 포함하고; 두 개의 절단 서열이 존재하는 경우, 폴리뉴클레오티드는 (양쪽 끝에 하나씩) 두 개의 단일 가닥 오버행을 포함한다. 오버행은 타입 IIs 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 기인하여 생성되며, (본원의 다른 곳에 설명된 바와 같이) 사전 결정된 순서로 단편들의 리게이션을 가능하게 한다.
폴리뉴클레오티드의 길이는 염기쌍 또는 뉴클레오티드의 수로 표시된다. 달리 언급되지 않는 한, 두 용어 모두는 각각의 핵산이 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산인지 여부에 관계없이 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 폴리뉴클레오티드가 각각의 뉴클레오티드 서열에 의해 정의되기 때문에, 뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 서열/폴리뉴클레오티드 서열이라는 용어는 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명에 의해 생성될 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리뉴클레오티드이므로 다양한 폴리뉴클레오티드의 융합에 의해 생성될 것이다. 특히, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는, 본원의 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 적어도 하나의 추가 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 폴리뉴클레오티드 등)를 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드(및 존재하는 경우 적어도 하나의 추가 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 폴리뉴클레오티드 등)의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시켜 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성함으로써 생성될 것이다.
본 발명의 방법의 단계 (a1) 및 (a2)에 따라, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 제공될 것이다. 폴리뉴클레오티드를 제공하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드는 중합 효소 연쇄 반응(PCR)으로부터 유래(즉, 그에 의해 생성)된다. 다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인공 유전자 합성으로부터 유래(즉, 그에 의해 생성)된다. 동일한 내용이 본원의 다른 곳에서 언급되는 바와 같은 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9 및 제10 폴리뉴클레오티드 등에 적용된다. 일 구현예에서, 제공된 폴리뉴클레오티드는 벡터에 존재하며, 즉 벡터에 포함된다. 대안적인 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 선형 DNA 단편으로 제공된다.
본 발명의 방법의 단계 (a1)에서 언급된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 다음 요소를 포함할 것이다:
(i) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열, 및
(iv) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((iii)의 제1 절단 서열은 (iv)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음).
본 발명의 방법의 단계 (a1)에서 언급된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로 다음 요소를 포함할 것이다:
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열로서, 상기 제2 절단 서열은 제1 절단 서열에 상보적인, 제2 절단 서열((ii)의 제2 절단 서열은 (i)의 인식 서열, 즉, 제2 폴리뉴클레오티드의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열.
단계 (a1)의 항목 (i)에 제시된 바와 같은 핵산 서열은 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩할 것이고, 단계 (a2)의 항목 (iv)의 핵산 서열은 상기 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩할 것이다. 전형적으로, 본 발명에 따라 본원에서 언급된 바와 같은 관심 폴리펩티드의 일부를 인코딩할 핵산 서열은 적어도 10, 적어도 50, 또는 적어도 200 bp의 길이를 갖는다. 상기 핵산 서열은 코딩 서열의 일부를 포함할 것이다. 따라서, 폴리펩티드의 일부는 적어도 1 개 아미노산, 적어도 약 3 개 아미노산, 적어도 약 15 개 아미노산, 또는 적어도 약 50 개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 따라서, 부분은 최소 1 개 아미노산 내지 임의의 가능한 길이, 예를 들어 100 개 아미노산, 500 개 아미노산, 1000 개 아미노산 또는 그 초과의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 부분은 단백질 도메인을 포함한다. 따라서, 부분은 예를 들어 100 개 내지 150 개 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 5' 비번역 영역(5' UTR)을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 마지막 부분, 즉, C-말단을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 3' 비번역 영역(3' UTR)을 추가로 포함할 수 있다.
관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 융합 폴리뉴클레오티드의 제1 엑손이다. 따라서, 상기 핵산 서열은 생성된 전사체의 제1 엑손을 인코딩할 것이다. 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 융합 폴리뉴클레오티드의 제2 엑손이다. 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 융합 폴리뉴클레오티드의 제3 엑손이며, 그 밖의 것도 이와 같다.
생성된 융합 폴리뉴클레오티드에 포함된 엑손들은 기능적 인트론들에 의해 분리되어 있다. 예를 들어, 제1 엑손과 제2 엑손은 제1 인트론에 의해 분리되어 있다. 추가 엑손들은, 융합 폴리뉴클레오티드에 존재하는 경우, 바람직하게는 마찬가지로 기능적 인트론들에 의해 분리되어 있다. 따라서, 제3 엑손이 존재하는 경우, 제2 엑손과 제3 엑손은 제2 인트론에 의해 분리되어 있고; 제4 엑손이 존재하는 경우, 제3 엑손과 제4 엑손은 제3 인트론에 의해 분리되어 있으며, 그 밖의 것도 이와 같다. 일 구현예에서, 융합 폴리뉴클레오티드에 포함된 인트론들은 동일하며, 즉, 동일한 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, 융합 폴리뉴클레오티드에 포함된 인트론들은 서로 다른 서열을 갖는다. 이 구현예에서, 예를 들어 서로 다른 유전자 및/또는 서로 다른 유기체의 인트론이 사용될 수 있다. 인트론은 또한 인공 인트론, 즉, 자연에서 발생하지 않는 인트론일 수 있다. 예를 들어, 두 개의 서로 다른 인트론으로부터의 5' 및 3' 부분을 조합하거나 자연 발생적 인트론을 돌연변이시킴으로써 인공 인트론을 설계할 수 있다. 자연 발생적 인트론은 하나 이상의 뉴클레오티드를 추가, 대체, 또는 결실시킴으로써 돌연변이될 수 있다. 도 7은 추가 뉴클레오티드를 포함하는 인트론이 상기 인트론을 포함하는 전사체로부터 효율적으로 스플라이싱 아웃(spliced out)될 수 있음을 보여준다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 생성된 융합 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드를 생성하기 위해 진핵 숙주 세포에서 발현, 즉, 전사될 것이다. 융합 폴리뉴클레오티드의 발현으로 인해 생성된 프로세싱되지 않은 전사체, 즉, 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA)는 융합 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 모든 엑손 및 인트론 서열을 포함할 것이다. 상기 전사체는 진핵 세포에서 프로세싱되어 인트론(또는 인트론들)이 상기 전사체로부터 스플라이싱 아웃됨으로써, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 메신저 RNA(mRNA), 즉, 관심 폴리펩티드로 번역되는 mRNA를 생성한다. 인트론은 스플라이싱에 의해 전구체 mRNA로부터 제거되기 때문에, mRNA는 엑손 서열만을 포함한다.
본 발명의 기초가 되는 연구에서, 생성된 전사체로부터 시험된 모든 인트론이 스플라이싱 아웃된 것은 아님이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 방법에 의해 생성된 융합 폴리뉴클레오티드가 진핵 숙주 세포에서 발현될 때 관심 폴리펩티드의 생성을 가능하게 하는지 여부를 평가하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 이 평가는 생성된 폴리펩티드(예를 들어, 그 활성)를 평가하여 수행될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
용어 "인트론"은 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 이 용어는 프로세싱되지 않은 전사체 내에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 이 뉴클레오티드 서열은 진핵 숙주 세포에 의해 전사체로부터 스플라이싱, 즉, 절제될 수 있다. 상기 프로세싱되지 않은 전사체는 흔히 전구체 메신저 RNA(pre-mRNA)로도 지칭된다. 프로세싱되지 않은 전사체로부터의 인트론의 스플라이싱은 프로세싱된 전사체, 즉, 성숙한 메신저 RNA의 번역 전에 발생한다. 원칙적으로, 기능적인(특히, 본원에서 언급된 바와 같은 융합 폴리뉴클레오티드가 발현될 숙주 세포에서 기능적인) 임의의 인트론이 사용될 수 있다. 그러한 인트론은 자연 발생적 인트론, 또는 인공 인트론, 즉, 자연에서는 발생하지 않지만 기능적인 인트론일 수 있다. 기능적 스플라이스 부위를 포함하는 인공 인트론은 예를 들어 문헌[Gatermann et al., Mol. Cell Biol., 9:1526 (1989)]에 기술되었다.
앞서 설명된 바와 같이, 융합 폴리뉴클레오티드에 포함된 인트론(들)은 기능적일 것이다. 인트론과 관련하여 용어 "기능적"은 당업자에 의해 잘 이해되어 있다. 기능적인 인트론은 전형적으로 진핵 숙주 세포에서 발현되는 전사체(특히, pre-mRNA)로부터 스플라이싱 아웃될 수 있는 인트론이다. 인트론이 기능하는지 여부는 잘 알려진 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 인트론이 스플라이싱 아웃되었는지 여부를 평가하기 위해 발현된 단백질의 활성을 분석하는 것이 가능하다. 융합 폴리뉴클레오티드는, 진핵 숙주 세포에서 전사될 때, 상기 세포에서 프로세싱되는 전사체로 전사되어 기능적 인트론이 상기 전사체로부터 스플라이싱 아웃됨으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 생성한다. 융합 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 추가 인트론(예를 들어, 제2 인트론)을 포함하는 경우, 추가 인트론은 (관심 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 생성하기 위해) 마찬가지로 전사체로부터 스플라이싱 아웃된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 용어 "인트론"은 스플라이소좀 인트론을 지칭한다(때때로 핵 pre-mRNA 인트론으로 지칭됨). 당업계에 알려진 바와 같이, 스플라이소좀 인트론은 인트론과 엑손 사이의 경계에 위치한 특정 인트론 서열을 포함한다. 이러한 서열은 스플라이소좀 RNA 분자에 의해 인식된다(예를 들어, 문헌[Sperling (2016): WIREs RNA 2016.doi: 10.1002/wrna.1377]; 문헌[Shefer et al. (2014): Comp. Struct. Biotechnol. J. 11, 113] 참조).
본 발명의 일 구현예에서, 기능적인 인트론은 스플라이스 도너(donor) 부위, 분기점, 폴리피리미딘 트랙(polypyrimidine tract) 및 스플라이스 억셉터(acceptor) 부위를 포함한다. 상기 요소들은 당업계에 잘 알려져 있다. 스플라이스 도너 부위는 인트론의 5' 말단에 있는 GU (GT) 서열로 이루어진다. 스플라이스 억셉터 부위는 인트론의 3' 말단에 위치하므로 인트론을 종결한다. 상기 억셉터 부위는 AG 서열로 이루어진다. 분기점은 래리아트(lariat) 형성에 관여하는 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다. 폴리피리미딘 트랙은 피리미딘 뉴클레오티드가 풍부하며 전형적으로 15 내지 20 nt의 길이를 갖는다. 전형적으로, 이는 스플라이싱될 인트론의 3' 말단보다 약 5 내지 40 nt 앞에 위치한다. 트랙은 스플라이소좀의 조립을 촉진한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "인트론"은 인트론을 인코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라 상기 서열의 전사체 내의 상응하는 서열 둘 모두를 지칭한다.
융합 폴리뉴클레오티드에 포함된 인트론은 (기능적인 한) 임의의 길이를 가질 수 있다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 인트론을 인코딩하는 핵산(즉, 인트론의 리게이션된 5' 및 3' 부분을 포함하는 기능적 인트론)은 40 내지 2000 bp의 길이, 특히 50 내지 1000 bp의 길이를 갖는다. 따라서, 융합 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 인트론(들), 즉, 전사체에 포함된 인트론(예를 들어, 제1, 제2 및/또는 제3 인트론)은 40 내지 2000 nt, 특히 50 내지 1000 nt의 길이를 가질 것이다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 인트론, 즉, 융합 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 전사체에 포함된 인트론은 짧은 인트론이다. 그러한 인트론의 사용은 이것이 본 발명의 방법에 의해 생성된 융합 폴리뉴클레오티드의 크기를 감소시키고 취급을 더 쉽게 하기 때문에 유리하다. 또한, 유전자 합성에 의한 작은 인트론의 합성은 큰 인트론에 비해 적은 비용과 관련된다. 본원에서 언급되는 바와 같은 짧은 인트론은 전형적으로 500 nt 미만의 길이를 갖는다. 일 구현예에서, 짧은 인트론은 50 내지 200 nt의 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 짧은 인트론은 50 내지 150 nt의 길이를 갖는다. 추가 구현예에서, 짧은 인트론은 50 내지 100 nt의 길이를 갖는다. 예를 들어, 전사체에 존재하는 각각의 인트론은 50 내지 200 nt의 길이, 예컨대 50 내지 150 nt 또는 50 내지 100 nt의 길이를 가질 수 있다. 따라서, 인트론(즉, 기능적 인트론)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 50 내지 200 bp, 특히 50 내지 150 bp, 또는 50 내지 100 bp의 길이를 가질 것으로 예상된다.
기능적인 극히 짧은 인트론이 당업계에 기술되었다. 예를 들어, 극히 짧은 인트론은 문헌[Shimada et al., 2015 (Identification and validation of evolutionarily conserved unusually short pre-mRNA introns in the human genome. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 10376-10388)]에 기술되었다.
본 발명에 따라 수행된 연구에서 80 개 뉴클레오티드보다 긴 인트론들의 조합이 일반적으로 극히 짧은 인트론들을 포함하는 조합보다 더 높은 발현 수준을 생성하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, 실시예 섹션의 인트론 I8 및 I9에 대한 결과 참조). 바람직한 구현예에서, 생성된 폴리뉴클레오티드의 인트론(들)은 그에 따라 적어도 80 개 뉴클레오티드, 특히 적어도 90 개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 인트론(들)은 80 내지 200 nt의 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 인트론(들)은 80 내지 150 nt의 길이를 갖는다. 추가 구현예에서, 인트론, 예를 들어 전사체에 존재하는 각각의 인트론은 80 내지 120 nt의 길이를 갖는다. 또한, 인트론(들)은 90 내지 150 nt 또는 90 내지 120 nt의 길이를 가질 것으로 예상된다.
바람직하게는, 생성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인트론(들)은 n 개 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 여기서 n은 3으로 나눌 수 없는 정수이다. 따라서, 생성된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인트론(들), 특히 각각의 인트론은 n 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있으며, 여기서 n은 3으로 나누었을 때 정수가 되지 않는 정수이다. 예를 들어, 인트론(들)은 91, 92, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 103, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118 또는 119 nt의 길이를 가질 수 있다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 사용되는 인트론(들)은 본 발명의 기초가 되는 연구에 사용된 인트론으로부터 선택된다. 특히, 인트론은 인트론 I2, I3, I4, I5, 또는 I7(예를 들어, I2, I4, I5 또는 I7), 특히 실시예 섹션의 표 1에 나타낸 바와 같은 I8 또는 I9, 또는 표 2에 나타낸 바와 같은 기능적 변이체일 수 있다. 이러한 인트론의 서열을 실시예 섹션의 표 3에 나타낸다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함된 적어도 하나의 인트론(예를 들어, 제1 인트론)은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임과 인프레임(in frame) 상태로 내부 정지 코돈을 포함한다. 따라서, 적어도 하나의 인트론은 하나 이상의 인프레임 정지 코돈을 포함할 수 있다. 또한, 융합 폴리뉴클레오티드가 하나 초과의 인트론(예를 들어, 제1 및 제2 인트론)을 포함하는 경우, 모든 인트론은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임과 인프레임 상태로 내부 정지 코돈을 포함할 것으로 예상된다. 따라서, 폴리뉴클레오티드의 각 인트론은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임과 인프레임 상태로 하나 이상의 내부 정지 코돈을 포함할 수 있다. 하나 이상의 내부 정지 코돈의 존재는 불완전한 스플라이싱의 경우 절단된 폴리펩티드의 생성을 초래할 것이다. 그러한 절단된 폴리펩티드는 더 짧은 길이로 인해 관심 폴리펩티드로부터 분리될 수 있다.
RNA의 정지 코돈은 예를 들어 UAG(amber), UAA(ochre), UGA(opal)이다. 해당 DNA 서열은 TAG, TAA 및 TGA이다.
일부 구현예에서, 인트론(들)은 본원에 기재된 바와 같은 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 각 오픈 리딩 프레임에 적어도 하나의 정지 코돈을 포함한다. 따라서, 하나 이상의 인트론은 3 개의 오픈 리딩 프레임 모두에 적어도 하나의 정지 코돈을 포함할 수 있다.
본원의 다른 곳에서 이미 설명된 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 생성된 융합 폴리뉴클레오티드에 포함된 기능적 인트론은 인트론(예를 들어, 제1 인트론)의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 인트론(예를 들어, 제1 인트론)의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 융합 폴리뉴클레오티드에 포함된 기능적 인트론(들)은 기능적 인트론의 5' 말단과 기능적 인트론의 3' 말단을 조합하여 생성될 것이다. 조합은 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제1, 제2(및 존재하는 경우 제3, 제4, 제5 등) 폴리뉴클레오티드의 절단으로 인해 생성되는 양립 가능한, 즉, 상보적인 오버행을 통해 달성된다. 절단 및 리게이션은 바람직하게는 동시에 수행된다. 따라서, 폴리뉴클레오티드들은, 소위 골든 게이트 클로닝, 즉, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제(즉, 활성형 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제) 및 리가제 둘 모두의 존재하의 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 폴리뉴클레오티드들의 절단 및 절단 생성물들의 리게이션을 포함하는 반응에서 원하는 순서로 이루어지는 단편들의 융합에 의해 조합된다.
본 발명에 따르면, 본원에서 언급된 바와 같은 인트론의 5' 부분 및 3' 부분은 기능적이지 않을 것으로, 즉, 기능적 인트론이 아닐 것으로 예상된다. 바람직하게는, 인트론의 상기 부분은 전사체로부터 스플라이싱 아웃되는 데 필요한 모든 요소를 포함하지는 않는다. 본 발명에 따르면, 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 스플라이스 억셉터 부위를 포함하지 않을 것으로 예상된다. 상기 부위는 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열에 포함될 것이다. 또한, 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 스플라이스 도너 부위를 포함하지 않을 것으로 예상된다. 상기 부위는 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열에 포함될 것이다.
스플라이싱에 필요한 모든 요소가 존재하는 것은 아니기 때문에, 상기 부분은, 전사체에 단독으로, 즉, 상응하는 5' 또는 3' 부분 없이 존재할 때, 전사체로부터 스플라이싱 아웃될 수 없다. 인트론의 기능은 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이 각각 인트론의 5' 부분 및 3' 부분을 포함하는 2 개의 폴리뉴클레오티드를 리게이션함으로써 달성된다.
인트론의 5' 및 3' 부분을 인코딩하는 서열은 적합한 것으로 간주되는 임의의 길이를 가질 수 있다. 부분의 최소 길이는 본 발명의 방법에서 적용되는 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의해 생성된 오버행의 길이이다. 일 구현예에서, 인트론의 5' 부분은 적어도 스플라이스 도너 부위를 포함하고, 인트론의 3' 부분은 적어도 스플라이스 억셉터 부위를 포함한다. 전형적으로, 5' 부분 및 3' 부분은 각각 적어도 10 nt 또는 적어도 20 nt의 길이를 갖는다. 실시예 섹션에서 시험된 부분의 길이는 12 nt 내지 98 nt였다(표 4 참조).
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 인트론 상의 5' 및 3' 부분은 단일 인트론으로부터 유래된다. 본 발명의 방법의 다른 구현예에서, 인트론의 5' 및 3' 부분은 2 개의 서로 다른 인트론으로부터 유래된다. 따라서, 본원에서 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 조립함으로써 인공 인트론이 생성된다.
본 발명의 일 구현예에서, 본원에서 언급된 바와 같은 적어도 하나의 기능적 인트론(예를 들어, 제1 인트론)은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성이다. 본 발명의 일 구현예에서, 기능적 인트론(예를 들어, 제1 인트론), 기능적 인트론들, 및/또는 본원에서 언급된 바와 같은 인트론의 5' 및/또는 3' 부분은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성이다. 따라서, 융합 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드의 서열을 갖지 않을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 기능적 인트론(예를 들어, 제1 인트론), 기능적 인트론들, 및/또는 본원에서 언급된 바와 같은 인트론의 5' 및/또는 3' 부분은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성이다. 융합 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 인트론(들), 또는 이의 일부)는 바람직하게는 융합 폴리뉴클레오티드에서 자연 발생적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 인트론 또는 이의 일부)가 아닌 폴리뉴클레오티드이다. 일 구현예에서, 융합 폴리뉴클레오티드에 포함된 모든 인트론(예를 들어, 제1, 제2, 제3 인트론 등)은 융합 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성이다.
동일한 내용이 본원에서 언급된 바와 같은 인트론의 5' 부분 및 3' 부분에 적용되며, 즉, 상기 부분은 이들이 포함된 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성일 것으로 예상된다. 특히, 인트론의 5' 부분 또는 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드의 부분을 인코딩하는 핵산 서열에 대해 이종성일 것이다. 예를 들어, 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열에 대해 이종성이거나, 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열에 대해 이종성일 것이다.
또한, 기능적 인트론(기능적 인트론들)은 자연적으로(즉, 생물학적 게놈 환경에 있을 때) 인트론을 포함하지 않는 융합 폴리뉴클레오티드의 위치(융합 폴리뉴클레오티드의 위치들)에 위치할 것으로 예상된다.
관심 폴리펩티드의 일부를 인코딩하는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 폴리뉴클레오티드 등은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 적어도 하나의 절단 서열, 및 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 적어도 하나의 인식 서열을 포함할 것이다. 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 융합 폴리뉴클레오티드의 생성을 위해 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 리가제와 함께 사용된다. 생성은 사전 결정된 순서로 다양한 폴리뉴클레오티드를 조립하여 달성된다.
용어 "타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제"는 당업자에게 잘 이해되어 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 이 용어는 인식 서열의 바깥쪽에서 DNA를 절단하는 엔도뉴클레아제(흔히 "제한 효소"로도 지칭됨)를 지칭한다. 타입 IIs 효소는 인식 서열로부터 0 내지 20 bp의 거리에서 DNA를 절단하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 바람직하게는 비대칭 이중 가닥 DNA 서열을 인식하고 이중 가닥 DNA 상의 인식 서열의 바깥쪽에서 이중 가닥 DNA를 절단한다. 단일 가닥 오버행("점착성 말단(sticky end)"은 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의해 생성된다. 본 발명의 방법에 따라 사용되는 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 오버행은 전형적으로 3, 4, 5 또는 6 개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 이는 사용된 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제의 특이성에 따라 달라진다. 그러나, 특정 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 더 긴 오버행의 생성도 가능하다. 일 구현예에서, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 절단 시 3 개 뉴클레오티드의 오버행을 생성할 것이다. 다른 구현예에서, 이는 4 개 뉴클레오티드의 오버행을 생성할 것이다. 4 bp의 오버행을 생성하는 엔도뉴클레아제의 경우, 256 개(즉, 44 개)의 잠재적인 오버행 서열이 가능하다. 따라서, 최대 256 개의 폴리뉴클레오티드는 올바른 순서로 조립될 수 있다.
타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 인식 서열(본원에서는 "인식 부위"로도 지칭됨)의 바깥쪽에 있는, 즉, 그에 포함되지 않는 절단 서열(본원에서는 "절단 부위"로도 지칭됨)에서 DNA를 절단하기 때문에, 전술한 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 제공되는 제1, 제2, 제3 폴리뉴클레오티드 등은 인식 서열 및 절단 서열 둘 모두를 포함한다. 절단 서열은 인식 서열에 작동 가능하게 연결될 것이다. 이는 엔도뉴클레아제가 폴리뉴클레오티드에서 인식 서열을 인식한 후에 폴리뉴클레오티드가 엔도뉴클레아제에 의해 절단 부위에서 절단됨을 의미한다.
절단은 절단 부위와 인식 부위 사이의 정의된 거리에서만 발생할 것으로 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, (전부는 아니지만) 대부분의 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 인식 서열과 절단 서열 사이에 스페이서(spacer)의 존재를 필요로 한다. 따라서, (엔도뉴클레아제가 스페이서를 필요로 하는 경우) 스페이서는 인식 서열과 절단 서열 사이에 존재해야 한다. 스페이서는 하나 이상의 뉴클레오티드로 이루어진다. 스페이서의 길이는 적용된 제한 엔도뉴클레아제에 따라 달라진다. 예를 들어, BsaI는 (5'에서 3' 방향으로) 하나의 뉴클레오티드 다음에 있는 하나의 가닥을 절단한다. 따라서, 이 효소에 의한 절단 부위에서의 절단을 가능하게 하기 위해 인식 서열과 절단 서열 사이에 하나의 뉴클레오티드의 스페이서가 존재해야 한다. 다른 엔도뉴클레아제는 더 긴 스페이서를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 적용된 엔도뉴클레아제가 FokI인 경우, 9 개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 스페이서가 필요할 것이다.
또한, 일부 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 메틸화에 민감할 수 있고, 그에 따라 메틸화된 시토신 잔기에서 절단을 수행할 수 없어, 메틸화된 DNA를 온전하게 남기는 것으로 당업계에 알려져 있다. 타입 IIs 효소의 활성이 각각의 인식 서열 내의 또는 그 주위의 메틸화된 서열에 의해 차단되는 것을 피하기 위해, 절단될 폴리뉴클레오티드는 잠재적인 알려진 메틸화 부위가 피해지도록 하나 또는 두 개 뉴클레오티드만큼 신장된다. 인식 부위가 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하는 경우, 추가 뉴클레오티드(들)는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 추가된다. 인식 부위가 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 위치하는 경우, 추가 뉴클레오티드(들)는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 추가된다. 따라서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 (인식 부위의 위치에 따라) 5' 말단 또는 3' 말단에 하나 또는 두 개 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
인식 서열은 타입 IIs 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 서열이다. 절단 서열은 바람직하게는 상기 엔도뉴클레아제의 존재하에 절단되는, 즉, 상기 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 서열이다. 절단 부위에서의 절단 및 후속 리게이션을 가능하게 하기 위해 인식 부위는 올바른 배향으로 존재해야 함을 이해해야 한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 인식 부위의 배향은 절단이 폴리뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에서 발생하는지에 따라 달라진다. 5' 말단에서, 절단은 5'에서 3'방향으로 발생할 것이다. 3' 말단에서, 절단은, 3'에서 5' 방향으로 발생할 것이다.
본 발명에 따르면, 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법의 단계 (a)에서 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 포함된 절단 서열(들) 및 인식 서열들은 그에 따라 엔도뉴클레아제에 의한 절단 시 인식 서열(들)은 상기 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 제1, 제2, 제3 폴리뉴클레오티드 등)로부터 제거되도록 배열될 것이다. 이는 인식 서열(들)을 절단 서열에 대해(즉, 그의 업스트림 또는 다운스트림에) 올바른 배향으로 배치함으로써 달성된다. 예를 들어, 인식 서열(들)은 상기 폴리뉴클레오티드의 말단(들)에 올바른 배향으로 배치될 수 있다. 따라서, 본원에서 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드가 5' 말단에서 절단될 경우, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열은 절단 서열이 이어지는 상기 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 위치할 것이다. 따라서, 절단 서열은 상기 인식 서열의 다운스트림에 위치한다. 본원에서 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드가 3' 말단에서 절단될 경우, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 위치할 것이다. 이 경우, 절단 서열은 상기 인식 서열의 업스트림에 위치한다. 인식 서열(들)을 상기 폴리뉴클레오티드의 말단(들)에 배치할 필요가 없는 것으로 이해해야 한다. 오히려, 추가 뉴클레오티드가 존재할 수 있다. 예를 들어, 추가 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 추가될 수 있다.
인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 경우, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 서열의 다음에는 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열이 이어질 것이다. 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 경우, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열의 다음에는 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 서열이 이어질 것이다.
일 구현예에서, 본원에서 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드, 즉, 제1, 제2, 제3 폴리뉴클레오티드 등에 포함된 절단 서열은 (리게이션될) 인트론의 5' 또는 3' 부분의 일부이다. 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드에서 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열을 포함한다. 예를 들어, 제2 폴리뉴클레오티드에서 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열을 포함한다. 리게이션 후, 생성된 인트론은 인트론의 5' 부분, 절단 부위 및 인트론의 3' 부분을 포함한다(본원에서는 기능적 인트론으로도 지칭됨). 인식 서열은 더 이상 존재하지 않는다.
절단 서열은 본원에 제시된 바와 같은 인트론에서 자연적으로 발생하는 서열일 수 있다. 대안적으로, 이는 인트론에서 자연적으로 발생하지 않을 수 있다. 이 경우, 이는 (예를 들어, 삽입에 의해) 인트론에 추가되거나, 자연 발생적 인트론의 서열에 점 돌연변이를 도입하여 생성되었을 수 있다.
다수의 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제가 상업적으로 이용 가능하다. 일 구현예에서, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 AcuI, AlwI, BaeI, BbsI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaXI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BspCNI, BspMI, BspQI, BsrDI, BsrI, BtgZI, BtsCI, BtsI, BtsIMutI, CspCI, EarI, EciI, FauI, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, NmeAIII, PleI, SapI, 및 SfaNI로부터 선택된다. 바람직하게는, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 BsaI, BbsI, FokI, BsmBI, BtgZI 및 SapI로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제2 폴리뉴클레오티드는 제1 절단 서열에 상보적인 제2 절단 서열을 포함할 것이다. 본 발명에 따르면, "다른 절단 서열에 상보적인 절단 서열"(제1 절단 서열과 상보적인 그러한 제2 절단 서열)이라는 문구는 바람직하게는 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 의해 생성된 오버행들이 서로 상보적임(즉, 양립 가능함)을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 오로지 하나의 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제가 사용된다. 상기 엔도뉴클레아제는 조립하려는 폴리뉴클레오티드(제1, 제2 폴리뉴클레오티드 등)에 포함된 모든 인식 서열을 인식한다. 본 발명의 대안적인 구현예에서, 서로 다른 인식 부위를 갖는 서로 다른 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 2 개, 3 개 또는 그 초과의 서로 다른 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제가 사용된다. 상기 서로 다른 엔도뉴클레아제는 절단된 폴리뉴클레오티드들을 리게이션할 수 있도록 이상적으로 동일한 길이(예를 들어, 4 nt) 및 상보적 서열을 갖는 오버행을 생성할 것이다.
또한, 조립하려는 폴리뉴클레오티드들은 사용되는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 추가 인식 서열을 포함하지 않는 것으로 예상된다(즉, 이들은 원하지 않는 위치에서의 절단을 피하기 위해 본원에서 언급된 바와 같은 인식 서열 이외의 인식 서열을 포함하지 않을 것임). 이는 당업자에 의해 고려된다.
전술한 본 발명의 방법의 단계 (b)에서, 단계 (a)에서 제공된 폴리뉴클레오티드들을 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시킴으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "리가제"는 폴리뉴클레오티드들을 함께 결합시키는 데 사용되는 효소와 관련될 것이다. 본 발명의 방법에 따라 적용되는 리가제는 DNA 리가제일 것이다. DNA 리가제는 당업계에 잘 알려져 있으며, 박테리오파지 리가제, 예컨대 T4 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, 세균 고세균 리가제를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 리가제는 T4 DNA 리가제이다. 이 리가제는 보조 인자로 ATP를 필요로 한다. 리가제를 사용함으로써, 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 제공되는 폴리뉴클레오티드들은 엔도뉴클레아제에 의한 절단 후에 생성된 상보적 오버행을 통해 리게이션된다. 그에 따라, 폴리뉴클레오티드들은 지향성 방식으로 조립된다.
단계 (b)에서의 절단 및 리게이션, 즉, 폴리뉴클레오티드들의 조립은 동시에 또는 본질적으로 동시에 수행된다. 따라서, 조립은 리가제 및 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제의 존재하에 수행된다. 두 효소 모두 활성 상태여야 한다. 이러한 종류의 어셈블리는 "골든 게이트(Golden Gate)" 어셈블리로 알려져 있다.
단계 (b)에서 조립에 사용되는 효소들은 최적의 온도가 서로 다르기 때문에, 조립은 전형적으로 서모사이클러(thermocycler)에서 수행된다. 전형적인 서모사이클러 프로토콜은 약 37℃(타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제의 경우 최적임)와 약 16℃(리가제의 경우 최적임) 사이를 왕복한다. 여러 사이클이 만들어질 수 있다. 마지막 단계에서, 효소는 열에 의해(예를 들어, 65℃에서) 비활성화된다. 프로그래밍 가능한 서모사이클러는 여러 상업용 공급 업체로부터 쉽게 입수할 수 있다.
절단 및 리게이션 후, 조립 생성물은 에스케리키아 콜라이(E. coli) 세포와 같은 컴피턴트(competent) 세균 세포로 형질 전환된다.
융합 폴리뉴클레오티드는 관심 폴리펩티드를 인코딩한다. 원핵 세포가 스플라이싱 기구를 갖고 있지 않기 때문에 융합 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에서 발현되어야 함을 이해해야 한다. 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해, 이는 하나 이상의 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 바람직하게는, 발현 제어 서열은 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성이다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "발현 제어 서열"은 관심 핵산 서열(본 경우에는 상기 언급된 핵산 서열)의 전사를 지배, 즉, 개시 및 제어할 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 그러한 서열은 일반적으로 프로모터 또는 프로모터와 인핸서 서열의 조합을 포함하거나 그로 이루어진다. 따라서, 발현 제어 서열은 바람직하게는 프로모터이다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 핵산 분자의 전사, 바람직하게는 번역 가능한 mRNA 로의 전사를 포함한다. 추가 조절 요소에는 전사 인핸서뿐만 아니라 번역 인핸서가 포함될 수 있다.
바람직하게는, 프로모터는 진핵 숙주 세포, 더욱 바람직하게는 포유 동물 세포 및/또는 곤충 세포에서 활성일 것이다. 일 구현예에서, 융합 폴리뉴클레오티드는 CMV-5-, SV40-, RSV-, EF1a-, MPSV- 및 SR 알파-프로모터로부터 선택된 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 곤충 세포의 경우, 폴리헤드론(polyhedron) 프로모터, p10 프로모터, 또는 ie1 프로모터가 사용될 수 있다.
발현을 가능하게 하기 위해, 융합 폴리뉴클레오티드는 벡터에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 본 발명의 방법에 의해 생성된 융합 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 재조합 DNA 작제물이다. 더욱이, 이 용어는 또한 표적화 작제물의 게놈 DNA로의 무작위 또는 부위 특이적 통합을 가능하게 하는 표적화 작제물과 관련된다. 그러한 표적 작제물은 바람직하게는 상동 또는 이종 재조합에 충분한 길이의 DNA를 포함한다. 벡터는 숙주에서의 증식 및/또는 선택을 위한 선택 가능한 마커를 포함할 수 있다.
융합 폴리뉴클레오티드가 발현될 숙주 세포는 임의의 진핵 세포, 예컨대 포유 동물(예를 들어, 인간 또는 마우스) 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 진핵 세포, 더욱 바람직하게는 포유 동물 또는 곤충 세포이다. 예를 들어, 숙주 세포는 HEK-293 세포(인간 배아 신장 세포 293), 예컨대 HEK-293E 세포, HEK-293T 세포, 또는 FreestyleTM HEK-293 세포일 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 CHO 세포(중국 햄스터 난소), 예컨대 CHO-K1 세포일 수 있다.
본 발명의 방법은 사전 정의된 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 적용될 수 있다.
그러나, 방법은 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 사용되는 제1, 제2 및 추가 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 부분들의 순서가 다른 관심 폴리펩티드들을 인코딩하는 복수의 서로 다른 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 적용될 수도 있다. 그러한 경우, 융합 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 본 발명의 방법에 따라 명시된 바와 같은 제1, 제2 및 적어도 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러나, 상기 적용에 대해, 그러한 경우 추가 폴리뉴클레오티드 및/또는 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 서열은 모두 서로 상보적이어서 제1, 제2 및 추가 폴리뉴클레오티드의 리게이션이 실질적으로 무작위 방식으로 발생할 것으로 예상된다.
용어 "폴리펩티드"는 당업자에 의해 잘 이해되어 있다. 폴리펩티드는 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 아미노산 잔기들로 구성된 분자이다. 관심 폴리펩티드는 임의의 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드는 적어도 50, 100, 300 또는 500 개 아미노산을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 작제물에 따라, 폴리펩티드는, 예를 들어 생성되는 관심 폴리펩티드가 인공 항체인 경우 심지어 더 길 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드는 적어도 2000 개 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명의 기초가 되는 연구에서, 다양한 융합 폴리펩티드가 분석되었다(루시퍼라제 및 항체, 도 1 내지 16 참조). 그러나, 본 발명은 이들 폴리펩티드로 한정되지 않는다. 원칙적으로, 관심 폴리펩티드는 임의의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 자연 발생적 폴리펩티드이다. 전형적으로, 상기 폴리펩티드는 효소, 전사 인자, 뉴클레아제, 리간드 단백질, 치료 단백질, 전사 인자, 성장 인자, 성장 인자 수용체이다. 또한, 관심 폴리펩티드는 항체 또는 이의 유도체, 예를 들어 이중 특이적 또는 다중 특이적 단백질 작제물/항체일 수 있다. 특정 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 2 개 이상의 자연 발생적 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 포함하는 융합 단백질이다. 특정 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 적어도 하나의 자연 발생적 폴리펩티드 및 적어도 하나의 비-자연 발생적 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 포함하는 융합 단백질이다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드는 치료 펩티드 또는 단백질과 치료 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 융합체일 수 있다.
상기 제시된 바와 같이, 상기 관심 폴리펩티드는 또한 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 항체는 또한 이중 특이적 항체 또는 다중 특이적 항체일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "이중 특이적 항체"는 2 개의 서로 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 다중 특이적 항체는 둘 이상의 서로 다른 에피토프에 결합하는 항체이다. 상기 이중 특이적 및 다중 특이적 항체의 다양한 에피토프는 전형적으로 비-중첩 에피토프들이다. 또한, 항체는 2가 또는 다가 항체일 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 다중 특이적 다가 항체이다. 일 구현예에서, 항체는 이중 특이적 2가 항체이다.
일 구현예에서, 관심 폴리펩티드는 비-자연 발생적 폴리펩티드이다.
본 발명의 방법은 2 개의 폴리뉴클레오티드의 조립뿐만 아니라 3 개 이상의 폴리뉴클레오티드의 조립도 가능하게 한다. 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 폴리뉴클레오티드가 사전 결정된 순서로 조립, 즉, 리게이션되어 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있다. 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 2 개 초과의 폴리뉴클레오티드가 조립되는 경우, 융합 폴리뉴클레오티드의 중심 위치에 위치할 조립하려는 폴리뉴클레오티드(본원에서는 중심 폴리뉴클레오티드로도 지칭됨)는 양 말단, 즉, 5' 말단 및 3' 말단에 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 및 인식 부위를 포함한다. 융합 폴리뉴클레오티드의 말단에 있게 될 조립하려는 폴리뉴클레오티드(본원에서는 말단 폴리뉴클레오티드로도 지칭됨)는 한쪽 말단에만 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 및 인식 부위를 포함할 수 있다. 그러나, 상기 말단 폴리뉴클레오티드는 양 말단에 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 및 인식 부위를 포함할 것으로 또한 예상된다. 이는 예를 들어 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)로의 클로닝을 가능하게 할 것이다. 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 절단 부위와 인식 부위는 서로 작동 가능하게 연결될 것이다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 방법은 3 개의 폴리뉴클레오티드(상기 제시된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드, 상기 제시된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드, 및 제3 폴리뉴클레오티드)의 조립, 즉, 리게이션을 포함한다. 단계 (a1), (a2) 및 (a3)에서 각각 제공되는 폴리뉴클레오티드는 (5'에서 3'로) 다음 순서로 리게이션될 것이다:
제1 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드) - 제2 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제3 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드).
제2 폴리뉴클레오티드가 중심 폴리뉴클레오티드가 되기 때문에, 이는 본 발명의 방법의 단계 (a2)에서 제시된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드의 요소 (i) 내지 (iv)에 더하여 (다시 5'에서 3' 방향으로) 다음 서열을 포함한다:
(v) 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열과 상이한, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제3 절단 서열, 및
(vii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 제3 절단 서열은 상기 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음).
방법은 단계 (a3)를 추가로 포함한다. 상기 단계는 단계 (b) 전에 수행된다. 본 발명의 방법의 단계 (a3)에서, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제4 절단 서열로서, 상기 제4 절단 서열은 제3 절단 서열에 상보적인, 제4 절단 서열((ii)의 제4 절단 서열은 상기 인식 서열, 즉, (i)의 제3 폴리뉴클레오티드의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 방법은 4 개의 폴리뉴클레오티드(상기 제시된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드, 3 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드, 및 상기 제시된 바와 같은 제3 폴리뉴클레오티드, 및 제4 폴리뉴클레오티드)의 조립, 즉, 리게이션을 포함한다. 단계 (a1), (a2), (a3) 및 (a4)에서 각각 제공되는 폴리뉴클레오티드는 (5'에서 3'로) 다음 순서로 리게이션될 것이다:
제1 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드) - 제2 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제3 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제4 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드)
제3 폴리뉴클레오티드가 중심 폴리뉴클레오티드가 되기 때문에, 이는 상기 단계 (a3)에서 제시된 바와 같은 제3 폴리뉴클레오티드의 요소 (i) 내지 (iv)에 더하여 (다시 5'에서 3' 방향으로) 다음 서열을 포함한다:
(v) 제3 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열 및 제2 폴리뉴클레오티드의 제3 절단 서열과 상이한, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제5 절단 서열, 및
(vii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 제5 절단 서열은 상기 인식 서열(즉, (vii)의 인식 서열)에 작동 가능하게 연결되어 있음).
방법은 단계 (a4)를 추가로 포함한다. 상기 단계는 단계 (b) 전에 수행된다. 본 발명의 방법의 단계 (a4)에서, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제6 절단 서열로서, 상기 제6 절단 서열은 제5 절단 서열에 상보적인, 제6 절단 서열((ii)의 제6 절단 서열은 (i)의 상기 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제3 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제4 부분을 인코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 방법은 5 개의 폴리뉴클레오티드(상기 제시된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드, 3 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드, 4 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련된 제3 폴리뉴클레오티드, 상기 제시된 바와 같은 제4 폴리뉴클레오티드, 및 제5 폴리뉴클레오티드)의 조립, 즉, 리게이션을 포함한다. 단계 (a1), (a2), (a3), (a4) 및 (a5)에서 각각 제공되는 폴리뉴클레오티드는 (5'에서 3'로) 다음 순서로 리게이션될 것이다:
제1 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드) - 제2 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제3 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제4 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제5 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드)
제4 폴리뉴클레오티드가 중심 폴리뉴클레오티드가 되기 때문에, 이는 상기 단계 (a4)에서 제시된 바와 같은 제4 폴리뉴클레오티드의 요소 (i) 내지 (iv)에 더하여 (다시 5'에서 3' 방향으로) 다음 서열을 포함한다:
(v) 제4 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열, 제2 폴리뉴클레오티드의 제3 절단 서열, 및 제3 폴리뉴클레오티드의 제5 절단 서열과 상이한, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제7 절단 서열, 및
(vii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 상기 제7 절단 서열은 (vii)의 상기 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음).
방법은 단계 (a5)를 추가로 포함한다. 상기 단계는 단계 (b) 전에 수행된다. 방법의 단계 (a5)에서, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제8 절단 서열로서, 상기 제8 절단 서열은 제7 절단 서열에 상보적인, 제8 절단 서열((ii)의 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제4 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제5 부분을 인코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 방법은 6 개의 폴리뉴클레오티드(상기 제시된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드, 3 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드, 4 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와 같은 제3 폴리뉴클레오티드, 5 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와 같은 제4 폴리뉴클레오티드, 상기 제시된 바와 같은 제5 폴리뉴클레오티드, 및 제6 폴리뉴클레오티드)의 조립, 즉, 리게이션을 포함한다. 단계 (a1), (a2), (a3), (a4), (a5) 및 (a6)에서 각각 제공되는 폴리뉴클레오티드는 (5'에서 3'로) 다음 순서로 리게이션될 것이다:
제1 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드) - 제2 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제3 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제4 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제5 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제6 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드)
제5 폴리뉴클레오티드가 중심 폴리뉴클레오티드가 되기 때문에, 이는 상기 단계 (a5)에서 제시된 바와 같은 제5 폴리뉴클레오티드의 요소 (i) 내지 (iv)에 더하여 (다시 5'에서 3' 방향으로) 다음 서열을 포함한다:
(v) 제5 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열, 제2 폴리뉴클레오티드의 제3 절단 서열, 제3 폴리뉴클레오티드의 제5 절단 서열, 및 제4 폴리뉴클레오티드의 제7 절단 서열과 상이한, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제9 절단 서열, 및
(vii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 제9 절단 서열은 (vii)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음).
방법은 단계 (a6)을 추가로 포함한다. 상기 단계는 단계 (b) 전에 수행된다. 방법의 단계 (a6)에서, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제10 절단 서열로서, 상기 제10 절단 서열은 제9 절단 서열에 상보적인, 제10 절단 서열((ii)의 제10 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제5 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제6 부분을 인코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 제6 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 방법은 7 개의 폴리뉴클레오티드(상기 제시된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드, 3 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드, 3 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와같은 제3 폴리뉴클레오티드, 5 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와 같은 제4 폴리뉴클레오티드, 6 개의 폴리뉴클레오티드의 조립과 관련하여 제시된 바와 같은 제5 폴리뉴클레오티드, 상기 제시된 바와 같은 제6 폴리뉴클레오티드, 및 제7 폴리뉴클레오티드)의 조립, 즉, 리게이션을 포함한다. 단계 (a1), (a2), (a3), (a4), (a5), (a6) 및 (a7)에서 각각 제공되는 폴리뉴클레오티드는 (5'에서 3) 다음 순서로 리게이션될 것이다:
제1 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드) - 제2 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제3 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제4 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제5 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제6 폴리뉴클레오티드(중심 폴리뉴클레오티드) - 제7 폴리뉴클레오티드(말단 폴리뉴클레오티드)
제6 폴리뉴클레오티드가 중심 폴리뉴클레오티드가 되기 때문에, 이는 단계 (a6)에서 제시된 바와 같은 제6 폴리뉴클레오티드의 요소 (i) 내지 (iv)에 더하여 (다시 5'에서 3' 방향으로) 다음 서열을 포함한다:
(v) 제6 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열, 제2 폴리뉴클레오티드의 제3 절단 서열, 제3 폴리뉴클레오티드의 제5 절단 서열, 제4 폴리뉴클레오티드의 제7 절단 서열, 및 제5 폴리뉴클레오티드의 제9 절단 서열과 상이한, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제11 절단 서열, 및
(vii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 제11 절단 서열은 (vii)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음).
방법은 단계 (a7)을 추가로 포함한다. 상기 단계는 단계 (b) 전에 수행된다. 방법의 단계 (a7)에서, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제12 절단 서열로서, 상기 절단 서열은 제11 절단 서열에 상보적인, 제12 절단 서열((ii)의 제12 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제6 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제7 부분을 인코딩하는 핵산 서열
을 포함하는 제7 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
상기 정의된 바와 같은 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개 폴리뉴클레오티드 등의 조립 및 그에 따른 리게이션은 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 일어난다.
이 단계 (b)에서, 상기 정의된 바와 같은 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 또는 7 개 폴리뉴클레오티드 등을 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 상기 폴리뉴클레오티드들의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 조건 하에서, 접촉시킴으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성한다.
3 개의 폴리뉴클레오티드가 제공되고 리게이션되는 경우, 융합 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(aa) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(bb) 제1 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제1 인트론은 기능적이고, 상기 제1 인트론은 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열,
(cc) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(dd) 제2 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제2 인트론은 기능적이고, 상기 제2 인트론은 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열, 및
(ee) 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
4 개의 폴리뉴클레오티드가 제공되고 리게이션되는 경우, 융합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로,
(ff) 제3 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제3 인트론은 기능적이고, 상기 제3 인트론은 제3 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제3 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열, 및
(gg) 관심 폴리펩티드의 제4 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
5 개의 폴리뉴클레오티드가 제공되는 경우, 융합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로,
(hh) 제4 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제4 인트론은 기능적이고, 상기 제4 인트론은 제4 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제4 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열,
(ii) 관심 폴리펩티드의 제5 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
6 개의 폴리뉴클레오티드가 제공되는 경우, 융합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로,
(jj) 제5 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제5 인트론은 기능적이고, 상기 제4 인트론은 제5 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제5 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열,
(kk) 관심 폴리펩티드의 제6 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
7 개의 폴리뉴클레오티드가 제공되는 경우, 융합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3' 방향으로,
(ll) 제6 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제6 인트론은 기능적이고, 상기 제6 인트론은 제6 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제6 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열,
(mm) 관심 폴리펩티드의 제7 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
상기 제시된 바와 같이 생성된 융합 폴리뉴클레오티드는, 진핵 숙주 세포에서 전사될 때, 상기 세포에서 프로세싱되는 전사체로 전사되어 기능적 인트론이 상기 전사체로부터 스플라이싱 아웃됨으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 생성한다.
제1 구현예에서, 전사체에 의해 전사된 모든 인트론은 동일하거나 본질적으로 동일하다. 따라서, 제1 인트론, 제2 인트론, 및 제3 인트론 등은 동일하거나 본질적으로 동일하다. 놀랍게도, 본 발명의 기초가 되는 연구에서 동일한 인트론이 많은 경우에 관심 단백질의 발현을 방해하지 않고 작제물 내의 여러 위치에서 사용될 수 있는 것으로 나타났다(실시예 참조). 동일하거나 본질적으로 동일한 인트론을 갖는 폴리뉴클레오티드는 인트론 내의 절단 부위를 이동시킴으로써, 즉, 길이가 다른 동일한 인트론의 5' 및 3' 부분을 사용함으로써 생성될 수 있다. 따라서, 제1 인트론에 대한 5' 및 3' 부분은 제2 인트론에 대한 5' 및 3' 부분과 길이가 다르다. 서로 다른 부분의 리게이션은 두 개의 동일하거나 본질적으로 동일한 인트론을 생성시킬 것이다.
제2 구현예에서, 모든 인트론은 서로 다르다. 따라서, 서로 다른 인트론이 사용된다. 이 경우, 고유한 절단 부위가 각 인트론의 조립에 사용된다. 또한, 다양한 절단 부위를 갖는 단일 인트론을 사용하여 다양한 인트론을 갖는 작제물을 생성하는 것이 가능하다. 그러한 절단 부위는 인트론에 도입되었을 수 있다.
제3 구현예에서, 전사체는 전사체 내의 다른 인트론과 동일한 인트론을 포함하고, 나머지 인트론과 다른 적어도 하나의 인트론을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 전사체는 1회 초과로 나타나는 인트론 및 이러한 인트론과 다른 하나 이상의 다른 인트론을 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 다른 인트론은 서로 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
본 발명은 추가로 7 개 초과의 폴리뉴클레오티드의 조립을 가능하게 한다. 일반적으로, 본 발명의 방법의 단계 (a) 및 (b)는 다음과 같다:
(a) n 개의 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, n은 적어도 3의 정수이며,
여기서 1로 번호가 매겨지는 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 관심 폴리펩티드의 1로 번호가 매겨지는 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 1로 번호가 매겨지는 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한, 1로 번호가 매겨지는 절단 서열, 및
(iv) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((iii)의 절단 서열은 (iv)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하고,
2 내지 (n-1)로 번호가 매겨지는 폴리뉴클레오티드(들)는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 서열로서, 상기 절단 서열은 1 내지 (n-2)로 번호가 매겨지는 절단 서열에 상보적인, 절단 서열((ii)의 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 1 내지 (n-2)로 번호가 매겨지는 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 2 내지 (n-1)로 번호가 매겨지는 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(v) 2 내지 (n-1)로 번호가 매겨지는 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 다른 번호를 갖는 절단 서열(들)과 상이한, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한, 2 내지 (n-1)로 번호가 매겨진 절단 서열, 및
(vii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 절단 서열은 (vii)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하고,
n으로 번호가 매겨지는 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 절단 서열로서, 상기 절단 서열은 n-1로 번호가 매겨지는 절단 서열에 상보적인, 절단 서열((ii)의 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) (n-1)로 번호가 매겨지는 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 n으로 번호가 매겨지는 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계, 및
(b) 상기 n 개의 폴리뉴클레오티드를 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 n 개의 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시킴으로서 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계.
유리하게는, 본 발명의 기초가 되는 연구에서, 2 개의 비기능적 모이어티(기능적 인트론의 5' 말단 및 기능적 인트론의 3' 말단)로 분할되는 기능적 인트론의 3' 또는 5' 말단에서 적합한 타입 IIs 절단 서열의 사용은 달리 양립 가능하지 않은 DNA 단편들의 타입 IIs 제한-리게이션에 의한 조립을 가능하게 하는 것으로 나타났다. 양립 가능하지 않은 DNA 단편은 5' 및 3' 말단에 그러한 타입 IIs-스플릿(split) 인트론 어댑터 모듈을 나타내는 핵산 서열이 갖추어져 있다. 골든 게이트 클로닝, 즉, 타입 IIs 엔도뉴클레아제를 사용한 절단 및 리게이션을 포함하는 반응에서 원하는 순서로 이루어지는 단편들의 융합은 동일한/양립 가능한 타입 IIs 프리픽스 및 서픽스 서열을 포함하는 스플릿 인트론 어댑터의 매끄러운 리게이션에 의해 기능적 인트론들의 재구성을 초래한다.
본 발명의 방법은, 적용되는 경우, 조립될 폴리뉴클레오티드들의 서열의 일부가 된다는 양립 가능한 서열들의 전제 조건 없이 폴리뉴클레오티드들의 일반적인 조립을 가능하게 한다. 따라서, 1차 폴리뉴클레오티드 서열의 변경은 필요하지 않다. 본 발명 덕택에, 절단 서열은 (코딩 서열에 의해서가 아닌) 인트론 서열에 의해 제공되기 때문에, 각각 관심 폴리펩티드의 일부를 인코딩하는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드의 재조합 융합이 이제 가능하다. 동시에, 달리 양립 가능하지 않은 DNA 단편이 선형이지만 인트론-산재된(intron-interspersed) 방식으로 조립될 것이다. 재구성된 인트론 "스페이서"는 스플라이싱에 의해 전사 후 진핵 발현 숙주로의 트랜스펙션 시 제거되어 의도된 조립된 핵산 작제물을 생성한다. 본 발명의 방법, 즉, 타입 IIs-기반 클로닝과 스플릿 인트론 접근법의 조합은 그에 따라 서열 경계와 무관하게 코딩 DNA 단편들을 조립하는 보편적인 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 다양한 단백질 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들의 용이한 조립을 가능하게 한다. 적용되는 경우, 이는 더 쉬운 단백질 생성을 가능하게 할 것이다. 그러한 단백질은, 예를 들어, 스크리닝 방법에 적용될 수 있고, 개선된 치료 특성을 갖는 단백질의 확인을 가능하게 할 수 있다. 적용되는 경우, 본 발명의 방법은 생물제제 약물 발견에 있어 귀중한 도구가 될 것이다. 본원에 기술된 모듈 클로닝은 다중 특이적 단백질 공학을 가능하게 할 것이다. 예를 들어, 다중 특이적이고 그에 따라 다수의 표적을 갖는 항체가 생성될 수 있다. 그러한 항체는 단일 표적만을 갖는 단일 특이적 항체에 비해 더 넓은 범위의 활성을 가질 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 앞서 본원에 제시된 정의 및 설명은 다음에 준용된다.
더욱이, 본 발명은
(i) 본 발명의 방법에 의해 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계, 및
(ii) 진핵 숙주 세포에서 상기 융합 폴리뉴클레오티드를 발현하여 상기 관심 폴리펩티드를 생성하는 단계
를 포함하는 관심 폴리펩티드의 생성에 관한 것이다.
일 구현예에서, 방법은 상기 진핵 숙주 세포로부터 생성된 관심 폴리펩티드를 분리하는 단계 (iii)를 추가로 포함한다. 용어 "상기 진핵 숙주 세포로부터 생성된 관심 폴리펩티드를 분리"한다는 것은 또한 배양 배지의 상청액으로부터의 생성된 폴리펩티드의 분리를 포함한다.
단계 (i)에서, 융합 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 방법, 즉, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법에 의해 생성될 것이다. 따라서, 상기 방법의 단계들이 수행된다.
단계 (ii)에서, 융합 폴리뉴클레오티드가 진핵 숙주 세포에서 발현되어 상기 관심 폴리펩티드를 생성할 것이다. 폴리뉴클레오티드를 발현하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 앞서 설명되었다. 상기 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해, 이는 바람직하게는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 상기 프로모터는 숙주 세포에서 활성일 것이다. 바람직한 숙주 세포는 앞에 설명되어 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 상기 정의된 바와 같은 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드에 더하여, 상기 조성물은 상기 정의된 바와 같은 제4, 또는 제4 및 제5, 또는 제4, 제5, 및 제6, 또는 제4, 제5, 제6, 및 제7 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 인트론의 일부는 포함하지 않지만 적합한 절단 및 인식 부위를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 절단 부위에 작동 가능하게 연결된 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하여, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단 시, 조성물에 존재하는 추가 폴리뉴클레오티드에 대한 폴리뉴클레오티드의 리게이션을 가능하게 할 것이다. 상기 추가 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드의 절단 부위에 적합한 절단 부위를 가질 것이다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 본원의 다른 곳에서 정의되어 있다. 따라서 그 정의가 적용된다.
상기 폴리뉴클레오티드들은 별개의 폴리뉴클레오티드들일 것이다. 그러나, 절단 및 리게이션에 의한 조립 시, 단일 폴리뉴클레오티드(즉, 본원에서 언급된 바와 같은 융합 폴리뉴클레오티드)가 생성될 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
상기 제1 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열, 및
(iv) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((iii)의 제1 절단 서열은 (iv)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하고,
상기 제2 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열로서, 상기 제2 절단 서열은 제1 절단 서열에 상보적인, 제2 절단 서열((ii)의 제2 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iv) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(v) 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열과 상이한, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제3 절단 서열, 및
(vii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 제3 절단 서열은 (vii)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하고,
상기 제3 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제4 절단 서열로서, 상기 제4 절단 서열은 제3 절단 서열에 상보적인, 제4 절단 서열((ii)의 제4 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
상기 언급된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 더하여, 조성물은 리가제, 특히 T4 DNA 리가제와 같은 DNA 리가제, 및 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 절단 서열에서, 즉, 모든 절단 서열에서 폴리뉴클레오티드를 절단할 수 있을 것이다. 따라서, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 인식 서열을 인식할 것이다.
본 발명의 조성물의 바람직한 구현예에서, 조성물에 포함된 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제는 조성물에 포함된 폴리뉴클레오티드들(예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드)의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하여, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성할 것이다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 절단을 가능하게 하는(즉, 이를 절단할 수 있는) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제, 및 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단으로 인해 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 리가제를 포함하는 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 상기 정의된 바와 같은 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드에 더하여, 상기 키트는 상기 정의된 바와 같이 제4, 또는 제4 및 제5, 또는 제4, 제5, 및 제6, 또는 제4, 제5, 제6, 및 제7 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 진핵 숙주 세포에서 전사될 때 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 적어도 3 개의 인트론을 포함하는 전사체로 전사되는, 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
용어 "적어도 3 개의 인트론"은 3 개, 또는 3 개 초과, 특히 적어도 4 개, 적어도 5 개, 적어도 6 개, 적어도 7 개, 적어도 8 개, 적어도 9 개, 적어도 10 개 또는 적어도 15 개의 인트론을 의미한다. 바람직하게는, 전사체에 포함된 모든 인트론은 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성이다. 용어 "이종성"은 앞에 설명되어 있다.
용어 "인트론"은 앞에 정의되어 있다. 따라서 그 정의가 적용된다.
일 구현예에서, 전사체에 의해 전사되는 모든 인트론은 동일하거나 본질적으로 동일하다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 인트론은 다른 모든 인트론과 상이하다. 또 다른 구현예에서, 모든 인트론은 서로 상이하다.
전사체에 포함된 인트론의 길이는 본 발명의 방법과 관련하여 본원에 앞서 명시된 바와 같은 길이일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드(또는 방법)의 일 구현예에서, 전사체에 포함된 상기 인트론 각각은 50 내지 200 nt, 특히 50 내지 150 nt의 길이를 갖는다. 예를 들어, 상기 인트론 각각은 50 내지 100 nt의 길이를 갖는다. 또한, 상기 인트론 각각은 80 내지 110 nt의 길이를 가질 수 있다.
본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 생성된 폴리뉴클레오티드의 인트론(들)은 또한 적어도 80 개 뉴클레오티드, 특히 적어도 90 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 인트론(들)은 80 내지 200 nt의 길이를 갖는다. 다른 구현예에서, 인트론(들)은 80 내지 150 nt의 길이, 예컨대 80 내지 120 nt의 길이를 갖는다. 또한, 인트론(들)은 90 내지 150 nt의 길이, 예컨대 90 내지 120 nt의 길이를 가질 것으로 예상된다.
또한, 본 발명에서는 전사체에 포함된 각 인트론이 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임과 인프레임 상태로 내부 정지 코돈을 포함할 것으로 예상된다.
마지막으로, 본 발명은 리가제 및 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 엔도뉴클레아제에 의한
(a1) 상기 정의된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드, 및
(a2) 상기 정의된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로
(a3) 상기 정의된 제3 폴리뉴클레오티드
의 절단, 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션에 의해 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는, 용도에 관한 것이다.
전술한 용도에 따르면, 적어도 하나의 추가 폴리뉴클레오티드가 절단될 수 있으며, 상기 추가 폴리뉴클레오티드는
(a4) 상기 정의된 바와 같은 제4 폴리뉴클레오티드,
(a5) 상기 정의된 바와 같은 제5 폴리뉴클레오티드,
(a6) 상기 정의된 바와 같은 제6 폴리뉴클레오티드, 및
(a7) 상기 정의된 바와 같은 제7 폴리뉴클레오티드
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구현예가 본원의 아래에 요약된다. 앞서 본원에 제공된 설명 및 정의는 다음의 바람직한 구현예에 준용된다:
1. 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a1) 제1 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열, 및
(iv) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((iii)의 제1 절단 서열은 (iv)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하는, 단계,
(a2) 제2 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열로서, 상기 제2 절단 서열은 제1 절단 서열에 상보적인, 제2 절단 서열((ii)의 제2 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계, 및
(b) 상기 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시킴으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
2. 구현예 1에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(aa) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(bb) 제1 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제1 인트론은 기능적이고, 상기 제1 인트론은 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열,
(cc) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
3. 구현예 1 및 2에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는, 진핵 숙주 세포에서 전사될 때, 상기 세포에서 프로세싱되는 전사체로 전사되어 인트론이 상기 전사체로부터 스플라이싱 아웃됨으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 생성하는, 방법.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 제1 인트론은 융합 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인, 방법.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 제1 인트론을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 40 내지 2000 bp의 길이를 갖는, 방법.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 인트론을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 50 내지 200 bp, 특히 50 내지 150 bp의 길이를 갖는, 방법.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 인트론은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임과 인프레임 상태로 내부 정지 코돈을 포함하는, 방법.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는,
(v) 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 제1 폴리뉴클레오티드의 제3 절단 서열과 상이한 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제3 절단 서열, 및
(viii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 제3 절단 서열은 (vii)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 추가로 포함하는, 방법.
9. 구현예 8에 있어서, 상기 방법은,
(a3) 제3 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제4 절단 서열로서, 상기 제4 절단 서열은 제3 절단 서열에 상보적인, 제4 절단 서열((ii)의 제4 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계를 추가로 포함하고,
단계 (b)에서 상기 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드를 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시킴으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하고,
상기 융합 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(aa) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(bb) 제1 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제1 인트론은 기능적이고, 상기 제1 인트론은 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열,
(cc) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(dd) 제2 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제2 인트론은 기능적이고, 상기 제2 인트론은 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열, 및
(ee) 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
10. 관심 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서,
(i) 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계, 및
(ii) 진핵 숙주 세포에서 상기 융합 폴리뉴클레오티드를 발현하여 상기 관심 폴리펩티드를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
11. 구현예 10에 있어서, 방법은 상기 진핵 숙주 세포로부터 생성된 관심 폴리펩티드를 분리하는 단계 (iii)를 추가로 포함하는, 방법.
12. 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서,
상기 제1 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열, 및
(iv) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((iii)의 제1 절단 서열은 (iv)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하고,
상기 제2 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열로서, 상기 제2 절단 서열은 제1 절단 서열에 상보적인, 제2 절단 서열((ii)의 제2 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iv) 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(v) 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열과 상이한, 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제3 절단 서열, 및
(vii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((vi)의 제3 절단 서열은 (vii)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하고,
상기 제3 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제4 절단 서열로서, 상기 절단 서열은 제3 절단 서열에 상보적인, 제4 절단 서열((ii)의 제4 절단 서열은 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물.
13. 구현예 12에 있어서, 상기 조성물은 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 추가로 포함하는, 조성물.
14. 구현예 13에 있어서, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 상기 리가제는 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 함으로써 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는, 조성물.
15. 구현예 12에서 정의된 바와 같은 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드의 절단을 가능하게 하는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제, 및 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단으로 인해 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 리가제를 포함하는, 키트.
16. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나, 구현예 11 내지 14 중 어느 하나, 또는 구현예 15에 있어서, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 AcuI, AlwI, BaeI, BbsI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaXI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BspCNI, BspMI, BspQI, BsrDI, BsrI, BtgZI, BtsCI, BtsI, BtsIMutI, CspCI, EarI, EciI, FauI, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, NmeAIII, PleI, SapI, 및 SfaNI로부터 선택되는, 방법, 조성물, 또는 키트.
17. 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 진핵 숙주 세포에서 전사될 때 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 적어도 5 개의 인트론을 포함하는 전사체로 전사되는, 폴리뉴클레오티드.
18. 구현예 17에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 적어도 7 개의 인트론을 포함하는 전사체로 전사되는, 폴리뉴클레오티드.
19. 구현예 17 및 18에 있어서, 상기 인트론 각각은 50 내지 200 nt, 특히 50 내지 150 nt의 길이를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
20. 구현예 17 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 인트론 각각은 80 내지 200 nt의 길이, 예컨대 90 내지 150 nt 또는 90 내지 120 nt의 길이를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
21. 구현예 19에 있어서, 상기 인트론 각각은 50 내지 100 nt의 길이를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
22. 구현예 17 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 모든 인트론은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임과 인프레임 상태로 내부 정지 코돈을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
23. 리가제 및 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물의 용도로서, 상기 엔도뉴클레아제에 의한
(a1) 구현예 1에 정의된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드, 및
(a2) 구현예 1 또는 3에 정의된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로
(a3) 구현예 3에 정의된 바와 같은 제3 폴리뉴클레오티드
의 절단, 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션에 의해 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는, 용도.
본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 전체 개시 내용 및 본 명세서에서 구체적으로 언급된 개시 내용과 관련하여 본원에 참고로 포함된다.
도면은 다음과 같다:
도 1: 발현 작제물에 사용된 바이-시스트론(bi-cistronic) 벡터(pcDNA5-FRT-TO_DEST[Invitrogen/ThermoFisher Scientific]에 기반한 pcDNA5dual-FRT-TO_DEST.
도 2: 1 개 또는 2 개의 인트론을 사용한 루시퍼라제 실험: 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 유전자 내의 인트론 위치. 박스는 "엑손"을 나타내고, 검정색 가로 막대는 인위적으로 삽입된 인트론을 나타낸다.
도 3: hRluc 발현 - 인트론 #2 및 #3에서 캐노니컬(canonical) 스플라이스 부위의 돌연변이는 C-말단 서열의 일부의 결실과 마찬가지로, 레닐라 루시퍼라제의 발현을 파괴한다. x-축은 hRluc 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 제시된 작제물은 인트론 위치 #1(도 2 참조)에 (비)기능적 인트론이 있는 작제물 및 hRluc의 C-말단 결실 작제물을 포함한다. 오차 막대: 표준 편차.
도 4: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #1에 단일 인트론이 있는 작제물은 인트론이 없는 대조 작제물의 발현 수준을 유지한다. 인트론 #1만이 단백질의 기능적 발현을 야기하지 않는다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 5: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #1 및 #2에 두 개의 동일한 인트론이 있는 작제물은 인트론이 없는 대조 작제물의 발현 수준의 적어도 80%를 유지한다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 6: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #1 및 #2에 두 개의 서로 다른 인트론이 있는 작제물은 어떤 조합을 사용하든지 간에 인트론이 없는 대조 작제물의 발현 수준의 적어도 70%를 유지한다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 7: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #1에 인트론 I3의 다양한 변형이 있는 작제물은 그 길이보다는 삽입된 서열의 유형에 따라, 인트론이 없는 대조 작제물의 60% 내지 90%를 나타낸다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다. 도면 내의 서열: caagtgggctgag는 SEQ ID NO: 41이고, cagctgggctgctt는 SEQ ID NO: 42이다.
도 8: 3 개 내지 7 개의 인트론을 사용한 루시퍼라제 실험: 레닐라 루시퍼라제 유전자 내의 인트론 위치. 박스는 "엑손"을 나타내고, 검정색 가로 막대는 인트론을 나타낸다. 3 개 초과의 인트론이 있는 작제물은 모두 위치 #3, #4, 및 #5에 인트론을 포함한다.
도 9: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #3 내지 #7(도 8 참조)에 3 개 내지 7 개의 동일한 인트론이 있는 작제물은 인트론이 없는 대조 작제물에 비해 감소된 수준의 발현을 나타낸다. 작제물당 사용되는 인트론의 수는 모든 작제물에서 동일한 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 인트론 #2는 동일한 작제물에서 2 개 초과의 카피가 사용되는 경우 작동하는 것으로 보이지 않는다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 10: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #3 내지 #7에 3 개 내지 7 개의 서로 다른 인트론이 있는 작제물은 인트론이 없는 대조 작제물과 비교할 때 감소된 수준의 발현을 나타낸다. 이때, 더 많은 인트론이 발현 수준을 높이는 경향이 있는 것처럼 보인다. 발현은 사용된 인트론들의 조합, 및 이들이 사용되는 순서에 따라 달라지는 것으로 보인다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 11a 및 도 11b: 가변 도메인과 불변 도메인 사이(1 개 인트론, 도 11a 참조)), 또는 리더(leader) 서열과 가변 도메인 및 가변 도메인과 불변 도메인 사이 둘 모두(2 개의 인트론, 도 11b 참조))에 1 개 또는 2 개의 인트론이 있는 항체 작제물(경쇄 및 중쇄).
도 12: 항체 발현 - 인트론이 있거나 없는 서열로부터 생성된 항체의 발현 수준은 비슷하다. x-축은 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 제시된 작제물은 약간 다른 발현 벡터들(EV1 및 EV2) 또는 발현 벡터 EV2(I8/I8, I9/I9)에 인트론을 포함하지 않거나 사슬당 하나의 인트론을 포함하는 항체를 포함한다(인트론 위치에 대해서는 도 11a 및 도 11b를 참조). 오차 막대: 12회의 독립적인 실험으로부터의 표준 편차.
도 13: 항체 발현 - 중쇄(검정색 막대) 또는 경쇄(체크 무늬 막대)에 하나의 인트론을 포함하는 작제물의 비교는 종종 인트론 #3 또는 인트론 #3의 변형된 형태(mI3)를 포함하는 작제물에 대한 낮은 발현을 나타낸다. 경쇄는 더 강한 영향을 받는 것으로 보인다. 대조적으로, 인트론 #8 또는 #9는 대조군과 동일한 수준으로 발현되거나 심지어 상승된 발현 수준을 나타낸다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 작제물 명칭은 경쇄/중쇄 순서로 인트론 참조 번호를 포함한다: "---"는 인트론이 없는 경쇄 또는 중쇄를 나타내고, 다른 모든 것은 원래 인트론(I3, I8, I9) 또는 하이브리드 인트론(I3_I8, I8_I3)을 포함한다. x-축은 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 오차 막대: 3회의 독립적인 실험, 모의(mock) 및 인트론이 없는 대조군에 대한 12회의 실험으로부터의 표준 편차.
도 14: 항체 발현 - 리더 서열의 3' 말단에서 서로 다른 말단 코돈의 사용: AGC(검정색 막대) 또는 TCG(체크 무늬 막대)의 사용은 중쇄 서열에 두 개의 인트론을 포함하는 다양한 작제물의 발현 수준에 영향을 주지 않는다. 따라서, 인트론 개시점에 대한 -1 위치에서 가장 덜 자주 사용되는 뉴클레오티드 "C"는 엑손에서 가장 자주 사용되는 마지막 뉴클레오티드를 나타내는 "G"와 비교할 때 발현을 감소시키지 않는다. 야생형 인트론 #3 또는 그의 변형된 버전(mI3)을 포함하지 않는 인트론 조합의 사용은 대조 작제물과 비교할 때 더 안정적인 발현 수준을 보여준다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 작제물 명칭은 경쇄("---" = 무 인트론(no intron))/중쇄 순서로 인트론 참조 번호를 포함한다. x-축은 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 오차 막대: 3회의 독립적인 실험, 모의 및 인트론이 없는 대조군에 대한 12회의 실험으로부터의 표준 편차.
도 15: 항체 발현 - 리더 서열의 3' 말단에서 서로 다른 말단 코돈의 사용: AGC(검정색 막대) 또는 TCG(체크 무늬 막대)의 사용은 경쇄 서열에 두 개의 인트론을 포함하는 다양한 작제물의 발현 수준에 영향을 주지 않는다. 따라서, 인트론 개시점에 대한 -1 위치에서 가장 덜 자주 사용되는 뉴클레오티드 "C"는 엑손에서 가장 자주 사용되는 마지막 뉴클레오티드를 나타내는 "G"와 비교할 때 발현을 감소시키지 않는다. 야생형 인트론 #3 또는 그의 변형된 버전(mI3)을 포함하지 않는 인트론 조합의 사용은 대조 작제물과 비교할 때 더 안정적인 발현 수준을 보여준다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 작제물 명칭은 경쇄/중쇄("---" = 무 인트론) 순서로 인트론 참조 번호를 포함한다. x-축은 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 오차 막대: 3회의 독립적인 실험, 모의 및 인트론이 없는 대조군에 대한 12회의 실험으로부터의 표준 편차.
도 16: 항체 발현 - 경쇄 및 중쇄 둘 모두에서의 다양한 인트론 조합은 동일한 사슬에 다른 인트론이 존재하지 않을 때 발현 수준에 대한 인트론 #3의 부정적인 영향을 거의 항상 나타낸다. 인트론 #3이 동일한 사슬에서 인트론 #8 또는 #9와 조합될 때 발현 수준이 다시 증가할 수 있다. 검정색 막대: 각 사슬에 인트론 1 개, 줄무늬 막대: 경쇄에 인트론 1 개, 중쇄에 인트론 2 개, 회색 막대: 경쇄에 인트론 2 개, 중쇄에 인트론 1 개, 체크 무늬 막대: 각 사슬에 인트론 2 개). 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 작제물 명칭은 경쇄/중쇄 순서로 인트론 참조 번호를 포함한다. x-축은 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자에 다양한 인트론 또는 인트론 조합이 있는 작제물을 나타낸다("mI3"= 인트론 #3의 변형된 버전). y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 오차 막대: 3회의 독립적인 실험, 모의 및 인트론이 없는 대조군에 대한 12회의 실험으로부터의 표준 편차.
도 1: 발현 작제물에 사용된 바이-시스트론(bi-cistronic) 벡터(pcDNA5-FRT-TO_DEST[Invitrogen/ThermoFisher Scientific]에 기반한 pcDNA5dual-FRT-TO_DEST.
도 2: 1 개 또는 2 개의 인트론을 사용한 루시퍼라제 실험: 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 유전자 내의 인트론 위치. 박스는 "엑손"을 나타내고, 검정색 가로 막대는 인위적으로 삽입된 인트론을 나타낸다.
도 3: hRluc 발현 - 인트론 #2 및 #3에서 캐노니컬(canonical) 스플라이스 부위의 돌연변이는 C-말단 서열의 일부의 결실과 마찬가지로, 레닐라 루시퍼라제의 발현을 파괴한다. x-축은 hRluc 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 제시된 작제물은 인트론 위치 #1(도 2 참조)에 (비)기능적 인트론이 있는 작제물 및 hRluc의 C-말단 결실 작제물을 포함한다. 오차 막대: 표준 편차.
도 4: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #1에 단일 인트론이 있는 작제물은 인트론이 없는 대조 작제물의 발현 수준을 유지한다. 인트론 #1만이 단백질의 기능적 발현을 야기하지 않는다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 5: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #1 및 #2에 두 개의 동일한 인트론이 있는 작제물은 인트론이 없는 대조 작제물의 발현 수준의 적어도 80%를 유지한다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 6: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #1 및 #2에 두 개의 서로 다른 인트론이 있는 작제물은 어떤 조합을 사용하든지 간에 인트론이 없는 대조 작제물의 발현 수준의 적어도 70%를 유지한다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 7: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #1에 인트론 I3의 다양한 변형이 있는 작제물은 그 길이보다는 삽입된 서열의 유형에 따라, 인트론이 없는 대조 작제물의 60% 내지 90%를 나타낸다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다. 도면 내의 서열: caagtgggctgag는 SEQ ID NO: 41이고, cagctgggctgctt는 SEQ ID NO: 42이다.
도 8: 3 개 내지 7 개의 인트론을 사용한 루시퍼라제 실험: 레닐라 루시퍼라제 유전자 내의 인트론 위치. 박스는 "엑손"을 나타내고, 검정색 가로 막대는 인트론을 나타낸다. 3 개 초과의 인트론이 있는 작제물은 모두 위치 #3, #4, 및 #5에 인트론을 포함한다.
도 9: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #3 내지 #7(도 8 참조)에 3 개 내지 7 개의 동일한 인트론이 있는 작제물은 인트론이 없는 대조 작제물에 비해 감소된 수준의 발현을 나타낸다. 작제물당 사용되는 인트론의 수는 모든 작제물에서 동일한 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 인트론 #2는 동일한 작제물에서 2 개 초과의 카피가 사용되는 경우 작동하는 것으로 보이지 않는다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 10: hRluc 발현 - hRluc의 인트론 위치 #3 내지 #7에 3 개 내지 7 개의 서로 다른 인트론이 있는 작제물은 인트론이 없는 대조 작제물과 비교할 때 감소된 수준의 발현을 나타낸다. 이때, 더 많은 인트론이 발현 수준을 높이는 경향이 있는 것처럼 보인다. 발현은 사용된 인트론들의 조합, 및 이들이 사용되는 순서에 따라 달라지는 것으로 보인다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 오차 막대: 표준 편차. x-축 및 y-축의 사용에 대해서는 도 3을 참조한다.
도 11a 및 도 11b: 가변 도메인과 불변 도메인 사이(1 개 인트론, 도 11a 참조)), 또는 리더(leader) 서열과 가변 도메인 및 가변 도메인과 불변 도메인 사이 둘 모두(2 개의 인트론, 도 11b 참조))에 1 개 또는 2 개의 인트론이 있는 항체 작제물(경쇄 및 중쇄).
도 12: 항체 발현 - 인트론이 있거나 없는 서열로부터 생성된 항체의 발현 수준은 비슷하다. x-축은 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 제시된 작제물은 약간 다른 발현 벡터들(EV1 및 EV2) 또는 발현 벡터 EV2(I8/I8, I9/I9)에 인트론을 포함하지 않거나 사슬당 하나의 인트론을 포함하는 항체를 포함한다(인트론 위치에 대해서는 도 11a 및 도 11b를 참조). 오차 막대: 12회의 독립적인 실험으로부터의 표준 편차.
도 13: 항체 발현 - 중쇄(검정색 막대) 또는 경쇄(체크 무늬 막대)에 하나의 인트론을 포함하는 작제물의 비교는 종종 인트론 #3 또는 인트론 #3의 변형된 형태(mI3)를 포함하는 작제물에 대한 낮은 발현을 나타낸다. 경쇄는 더 강한 영향을 받는 것으로 보인다. 대조적으로, 인트론 #8 또는 #9는 대조군과 동일한 수준으로 발현되거나 심지어 상승된 발현 수준을 나타낸다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 작제물 명칭은 경쇄/중쇄 순서로 인트론 참조 번호를 포함한다: "---"는 인트론이 없는 경쇄 또는 중쇄를 나타내고, 다른 모든 것은 원래 인트론(I3, I8, I9) 또는 하이브리드 인트론(I3_I8, I8_I3)을 포함한다. x-축은 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 오차 막대: 3회의 독립적인 실험, 모의(mock) 및 인트론이 없는 대조군에 대한 12회의 실험으로부터의 표준 편차.
도 14: 항체 발현 - 리더 서열의 3' 말단에서 서로 다른 말단 코돈의 사용: AGC(검정색 막대) 또는 TCG(체크 무늬 막대)의 사용은 중쇄 서열에 두 개의 인트론을 포함하는 다양한 작제물의 발현 수준에 영향을 주지 않는다. 따라서, 인트론 개시점에 대한 -1 위치에서 가장 덜 자주 사용되는 뉴클레오티드 "C"는 엑손에서 가장 자주 사용되는 마지막 뉴클레오티드를 나타내는 "G"와 비교할 때 발현을 감소시키지 않는다. 야생형 인트론 #3 또는 그의 변형된 버전(mI3)을 포함하지 않는 인트론 조합의 사용은 대조 작제물과 비교할 때 더 안정적인 발현 수준을 보여준다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 작제물 명칭은 경쇄("---" = 무 인트론(no intron))/중쇄 순서로 인트론 참조 번호를 포함한다. x-축은 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 오차 막대: 3회의 독립적인 실험, 모의 및 인트론이 없는 대조군에 대한 12회의 실험으로부터의 표준 편차.
도 15: 항체 발현 - 리더 서열의 3' 말단에서 서로 다른 말단 코돈의 사용: AGC(검정색 막대) 또는 TCG(체크 무늬 막대)의 사용은 경쇄 서열에 두 개의 인트론을 포함하는 다양한 작제물의 발현 수준에 영향을 주지 않는다. 따라서, 인트론 개시점에 대한 -1 위치에서 가장 덜 자주 사용되는 뉴클레오티드 "C"는 엑손에서 가장 자주 사용되는 마지막 뉴클레오티드를 나타내는 "G"와 비교할 때 발현을 감소시키지 않는다. 야생형 인트론 #3 또는 그의 변형된 버전(mI3)을 포함하지 않는 인트론 조합의 사용은 대조 작제물과 비교할 때 더 안정적인 발현 수준을 보여준다. 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 작제물 명칭은 경쇄/중쇄("---" = 무 인트론) 순서로 인트론 참조 번호를 포함한다. x-축은 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자에 인트론이 있거나 없는 작제물을 나타낸다. y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 오차 막대: 3회의 독립적인 실험, 모의 및 인트론이 없는 대조군에 대한 12회의 실험으로부터의 표준 편차.
도 16: 항체 발현 - 경쇄 및 중쇄 둘 모두에서의 다양한 인트론 조합은 동일한 사슬에 다른 인트론이 존재하지 않을 때 발현 수준에 대한 인트론 #3의 부정적인 영향을 거의 항상 나타낸다. 인트론 #3이 동일한 사슬에서 인트론 #8 또는 #9와 조합될 때 발현 수준이 다시 증가할 수 있다. 검정색 막대: 각 사슬에 인트론 1 개, 줄무늬 막대: 경쇄에 인트론 1 개, 중쇄에 인트론 2 개, 회색 막대: 경쇄에 인트론 2 개, 중쇄에 인트론 1 개, 체크 무늬 막대: 각 사슬에 인트론 2 개). 기준 작제물: 빗금이 쳐진 막대. 작제물 명칭은 경쇄/중쇄 순서로 인트론 참조 번호를 포함한다. x-축은 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자에 다양한 인트론 또는 인트론 조합이 있는 작제물을 나타낸다("mI3"= 인트론 #3의 변형된 버전). y-축은 인트론이 없는 기준 작제물(빗금이 쳐진 막대)에 대한 각 작제물의 발현 수준을 보여준다. 오차 막대: 3회의 독립적인 실험, 모의 및 인트론이 없는 대조군에 대한 12회의 실험으로부터의 표준 편차.
실시예
본 발명은 오로지 하기 실시예에 의해 예시될 것이다. 상기 실시예는 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하는 방식으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 재료 및 방법
플라스미드
(a) 루시퍼라제(들)를 포함하는 작제물의 클로닝
플라스미드 pcDNA5-FRT-TO_DEST(Invitrogen/ThermoFisher Scientific의 pcDNA5/FRT/TO를 기반으로 하고 CMV 프로모터와 BGHpA 부위 사이에 attR1/2 부위를 삽입하여 게이트웨이(Gateway) 클로닝을 가능하게 하도록 변형됨)를, 다음과 같이 레닐라 및 반딧불이 루시퍼라제(각각 hRluc 및 luc2 - 도 1 참조)의 동시 발현을 가능하게 하도록 조정하였다: (i) 진핵 세포 신장 인자 1α(EF1α)의 프로모터를 pcDNA5-FRT-TO_DEST의 PmlI 부위에 평활(blunt) 리게이션에 의해 도입하여 5' PmeI 부위를 파괴하지만 3' 부위는 유지함으로써 pcDNA5dual-FRT-TO_DEST를 생성하였다. (ii) 반딧불이 루시퍼라제 뉴클레오티드 서열(pGL4.10[Promega]로부터 취한 아미노산 서열, 인간 세포주에서의 발현을 위한 코돈 최적화를 사용한 유전자 합성을 GeneArt/Thermo Fisher Scientific(독일 레겐스부르크 소재)에 의해 수행하였음). 5' 말단에 있는 5' 컨센서스 Kozak 서열(CACGTGAGCGCCACC, SEQ ID NO: 43) 및 3' 말단에 있는 이중 정지 코돈(TAATGA)을 pcDNA5dual-FRT-TO_DEST의 PmlI 부위에 삽입하여 luc2-pcDNA5dual-FRT-TO_DEST를 생성하였다. (iii) 인트론 서열이 있는 모든 레닐라 루시퍼라제 뉴클레오티드 서열(레닐라 루시퍼라제의 아미노산 서열은 pGL4.75[Promega]로부터 취하였음)을 5' Kozak 컨센서스 서열 및 3' 이중 정지 코돈(각각 ACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO: 44) 및 TGATAAGCTTACCCAGCTTTCTTGTACAAAG(SEQ ID NO: 45))을 포함하는 플랭킹 attB1 및 attB2 서열을 사용하여 GeneArt/Thermo Fisher Scientific(독일 레겐스부르크 소재)(상기와 같이 최적화된 코돈)에 의해 합성하여, luc2-pcDNA5dual-FRT-TO_DEST로의 게이트웨이 클로닝을 가능하게 하였다(정확한 인트론 위치에 대해서는 도 2 및 도 8 참조). (iv) 유사하게, 인트론이 없는 레닐라 루시퍼라제를 pcDNA5dual-FRT-TO_DEST(반딧불이 루시퍼라제 유전자가 없음)에 클로닝했고, 이를 모든 레닐라 루시퍼라제 분석에서 주요 양성 대조군으로 사용하였다.
(b) 항체 작제물의 클로닝(표준 제한 및 골든 게이트-기반 클로닝)
진핵 세포에서 일시적인 발현을 위한 기존의 CMV-기반 벡터를 사용하여, 제한 클로닝(삽입체(insert)는 Kozak 컨센서스 서열을 포함함) 또는 골든 게이트 클로닝을 사용하여 항체 발현 작제물(경쇄 및 중쇄 작제물)을 생성했다. 후자의 경우, BsaI 제한 부위를 벡터 백본으로부터 제거하고, 발현 벡터로의 항체 서열의 통합에 사용된 BsaI 부위(5': cgccagGAGACC(SEQ ID NO: 46), 3: GGTCTCtataat(SEQ ID NO: 47); BsaI 인식 서열은 볼드체로 표시됨)에 의해 플랭킹된 스터퍼(stuffer) 서열을 도입했다. 항체 작제물들(모든 항-huIL4)을 서로 다른 인트론을 포함하는 모듈의 다양한 조합을 사용하여 조립하고, 이어서 문헌[Weber et al (PLoS ONE. 2011 Feb 18;6(2):e16765)] 및 문헌[Engler et al (ACS Synth Biol. 2014 Nov 21;3(11):839-43)]에 설명된 바와 같이 발현 벡터에 클로닝했다. 항체 작제물의 코딩 서열의 뉴클레오티드 서열은, (i) (골든 게이트-기반 클로닝을 사용하여 생성된 작제물의 경우) BsaI 부위가 파괴되어야 하는 중쇄의 불변 영역에 있는 하나의 뉴클레오티드, 및 (ii) 리더 서열의 마지막 코돈을 제외하고는, 인트론이 없는 항체와 인트론을 포함하는 항체 모두에서 동일했다.
골든 게이트 모듈
인트론을 포함하는 항체 경쇄 및 중쇄를 생성하는 골든 게이트 모듈은 세 부분을 포함하도록 설계되었다: 인트론의 3' 부분은 모듈의 5' 말단에 배치되었고, 도메인의 코딩 서열, 즉, 항체 사슬의 가변 또는 불변 부분이 뒤따랐다. 코딩 서열에 이어 다음 인트론의 5' 부분이 뒤따랐다. 양쪽 말단에서, BsaI 부위는, BsaI에 의한 분해 시 이들 부위가 제거되어 각 인트론 위치에 특이적인 4 개 뉴클레오티드 오버행을 남김으로써 최종 작제물의 특정 리게이션 및 조립을 가능하게 하는 방식으로 배치되었다.
인트론
본 발명의 기초가 되는 연구에서 일련의 인트론을 사용하였다: 원래 인트론, 변형된 인트론 및 부분 인트론:
인트론에 대한 개요는 표 1 내지 표 4에서 찾을 수 있다.
변형된 인트론 또는 부분 인트론은 다음을 포함하였다:
(a) 음성 대조군으로 사용될 인트론의 5' 또는 3' 말단에 캐노니컬 스플라이스 부위의 결실이 있는 인트론(인트론 #10 내지 #13)
(b) 4 개 뉴클레오티드 삽입이 있는 인트론(골든 게이트 클로닝 반응을 위한 삽입된 중첩 서열의 예, 인트론 #14 내지 #16 및 #19 내지 #20)
(c) 삽입체의 양쪽에 두 개의 잠재적인 중첩 서열을 포함하는 더 큰 뉴클레오티드 삽입체가 있는 인트론(엑손의 스킵핑(skipping)에 사용될 수 있음; 인트론 #17 및 #18)
(d) 서로 다른 인트론의 두 반쪽으로 이루어진 하이브리드 인트론(인트론 #21 내지 #24)
(e) 골든 게이트 클로닝 반응에 사용하기 위한 원래 인트론의 5' 부분 또는 3' 부분으로 이루어진 부분 인트론(부분 인트론 #1 내지 #16)
세포 배양 및 트랜스펙션
현탁액-적응 HEK293-F 세포(Invitrogen Cat. No. 51-002)를 6 mM 글루타민을 함유하는 프리스타일 F17 발현 배지(Freestyle F17 Expression medium)(Gibco Cat. No. A1383502)에서 배양하였다. 트랜스펙션 전날, 1 리터의 세포를 벤트 캡(vent cap)이 있는 3 L 페른바흐 에를렌마이어(Fernbach Erlenmeyer) 플라스크(Corning 431252)에 1.2e6 세포/ml의 밀도로 시딩하고, 110 rpm 및 8% CO2에서 교반하면서 37℃에서 밤새 인큐베이션했다.
트랜스펙션 당일, 세포를 F17 발현 배지로 1.9e6 세포/ml로 조정하였다. 각 트랜스펙션에 대해, 50 ng의 pXL4617_EBNA(EBNA1 발현 플라스미드)를 1 μg의 관심 발현 작제물의 DNA 및 2.8 μg의 PEI(Polysciences, Cat. No. 23966-2)와 혼합하고, F17 발현 배지를 사용하여 230 μl의 부피로 조정했다. 15 분 배양 후, 870 μl의 세포(1.65e6)를 DNA/PEI 복합체에 첨가했다. 모든 트랜스펙션 실험은 1100 μl의 최종 작업 부피로 96-딥(deep) 웰 플레이트(Nunc Cat. No. 10447181)에서 수행하였다. 플레이트를 DUETZ 시스템 덮개(Kuehner Technology)로 덮고, 37℃, 8% CO2 및 1,000 rpm에서 3 mm 오빗(orbit)으로 진탕하면서(Infors HT Multitron Pro) 2 일 동안 인큐베이션했다. 모든 트랜스펙션은 적어도 2중으로 수행하였고, 2회 내지 5회 반복하였다.
루시퍼라제 리포터 어세이(루시퍼라제 작제물)를 이용한 발현 분석
(a) 실험 절차
트랜스펙션된 세포의 루시퍼라제 활성은 Dual-Glo® 루시퍼라제 어세이 시스템(Luciferase Assay System)(Promega, Cat. No. E2940)으로 트랜스펙션 2 일 후에 측정하였다. 50 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 이소플레이트(Perkin Elmer Cat. No. 6005040)로 옮기고, 실온에서 10 분 동안 평형화시켰다. 50 μl의 Dual-Glo® 시약을 첨가하고, 10 분 동안 인큐베이션하여 세포를 용해시켰다. 반딧불이 루시퍼라제 발광은 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Gemini XP; 설정: 30회 판독, 높은 PMT)로 측정하였다. 50 μl의 Dual-Glo® Stop & Glo® 시약을 첨가하여 반딧불이 반응으로부터의 발광을 켄칭시켰다. 10 분 인큐베이션 후, 레닐라 루시퍼라제 발광을 반딧불이 루시퍼라제에 대해 설명된 것과 동일한 조건하에서 측정하였다.
(b) 데이터 분석
하나의 트랜스펙션(이중 또는 삼중)으로부터의 여러 데이터 포인트를 사용하여 평균값을 생성했다. 이어서, 이들을 반딧불이 루시퍼라제[luc2])와 함께 레닐라 루시퍼라제[hRLuc, 인트론이 없음]를 포함하는 바이시스트론 작제물의 평균 신호에 대해 정규화하여, 상대 발현 수준을 생성했다. 이어서, 시험된 작제물당 2회 내지 9회 실험의 상대 발현 수준의 평균값을 (표준 편차와 함께) 계산했다.
반딧불이 루시퍼라제의 측정으로부터의 신호를 성공적인 트랜스펙션을 나타내는 대조군으로 사용하였다(데이터는 제시되지 않음).
Octet® QK
e
(항체 작제물)를 사용한 발현 분석
(a) 정량화
트랜스펙션 7 일 후에, 발현된 항체 작제물을 포함하는 세포 상청액을 원심 분리(3220 rcf, 2 분)에 의해 수거하였다. 이들 상청액은 단백질 A 바이오센서(Pall Fort
Bio, #18-5013)를 사용하는 Octet® QKe 시스템(Pall Fort
Bio, #30-5046)을 사용하는 생물층 간섭계(bio-layer interferometry: BLI)에 의해 정량화하였다. 바이오센서의 재생에 의한 정량화를 다음과 같이 수행하였다: 세포 상청액을 D-PBS(Gibco, #14190-094)에 1:10으로 희석하고, 어세이 플레이트(Greiner 마이크로 플레이트 96 웰, PP, 검정색, #655209)로 옮겼다. 정량화 시간을 120 초로 설정하고, 바이오센서의 재생/중화는, 제1 측정 전과 이어지는 모든 측정들 사이에 3 회 사이클을 사용하여, 10 mM 글리신/HCl, pH 1.5 및 D-PBS를 사용하여 5 초까지 수행하였다. 어세이를 30℃에서 1000 rpm으로 진탕하면서 수행하였다. 센서 오프셋은 3 mm로 설정하였다. 실험은 10 분 동안 플레이트를 평형화하기 위해(30℃ 및 진탕) 600 초의 지연 후 시작하였다.
(b) 데이터 분석
데이터 분석은 사전 검증된 인간 IgG 표준 곡선(결합 속도 대 농도)과 함께 Fort
Bio Data Analysis 9.0을 사용하여 수행하였다. 여러 트랜스펙션(각각 이중으로 수행됨)으로부터의 여러 데이터 포인트를 사용하여 3회의 독립적인 실험으로부터 평균값과 표준 편차를 생성했다.
Octet® QK
e
를 사용한 결합 어세이
(a) 인간 IL4에 결합하는 항체
또한 Octet® QKe 시스템을 사용하여 인간 IL4로부터 발현된 항-IL4 항체의 해리 속도(kd)를 시험하였다. 이를 위해, His6 태그가 있는 2.5 μg/mL의 재조합 인간 IL4(novoprotein, #CD88)를 120 초 동안 항-펜타(penta)-His 항체(Qiagen)로 사전 코팅된 바이오센서(HIS1K, Pall Fort
Bio, #18-5122)에서 포획했다. 모의 트랜스펙션으로부터의 상청액("기준선 웰", D-PBS 중에 1:10으로 희석됨, 로딩 시간 30 초)을 사용한 기준선 기록 후, 바이오센서를 샘플 상청액(또한 D-PBS 중에 1:10으로 희석됨)이 함유된 샘플 웰에 침지시켰다. 120 초의 인큐베이션 후, 바이오센서를 기준선 웰의 상청액으로 다시 이동시켜, 고정된 IL4로부터 600 초 동안, 결합된 항-IL4 항체가 해리되도록 하였다. 제1 측정 전과 이어지는 모든 측정들 사이에 3회 사이클을 사용하여, 바이오센서를 10 mM 글리신/HCl, pH 1.7 및 D-PBS로 각각 5 초 동안 재생시키고 중화시켰다. 각 어세이를 30℃ 및 1000 rpm 진탕에서 센서 오프셋을 3 mm로 설정하여 수행하였고, 10 분 동안 플레이트를 평형화하기 위해(30℃ 및 진탕) 600 초 지연 후 시작했다. 모든 샘플을 (Octet® QKe 매뉴얼에 설명된 바와 같이) 이중-참조 방식으로 측정하였으며, 두 참조는 (i) 결합된 리간드가 없는 모의 트랜스펙션의 상청액(D-PBS 중의 1:10), 및 (ii) 결합된 IL4 리간드가 있는 모의 트랜스펙션의 상청액(D-PBS 중의 1:10)이었다.
(b) 항체 결합 실험의 데이터 분석
모든 샘플 데이터 포인트는 (Octet® QKe 매뉴얼에 설명된 바와 같이) (i) 비특이적 결합 및 리간드 해리를 보정하기 위한 이중 참조(상기 참조), 및 (ii) 두 측정 단계 사이의 오정렬을 피하기 위한 단계간 보정(interstep correction)을 이용하여 계산했다. 생성된 결합 곡선을 로컬 풀(local full) 1:1 모델로 피팅하고, 해리 상수 kdis를 계산했다. 여러 트랜스펙션(각각 이중으로 수행됨)으로부터의 여러 데이터 포인트를 사용하여 3회의 독립적인 실험으로부터 평균값과 표준 편차를 생성했다.
실시예 2: 결과/결론
루시퍼라제 실험의 결과는 도 3 내지 도 10에 제시되어 있고, 항체 실험의 결과는 도 12 내지 도 16에 제시되어 있다.
세포 내에서 발현된 1-사슬 루시퍼라제 작제물 및 분비된 2-사슬 항체 작제물 둘 모두를 사용하여, 다음과 같은 것이 밝혀졌다:
(a) 다양한 단백질의 코딩 서열에 다양한 짧은 및 극히 짧은 인트론을 도입하면 (진핵) HEK293FS 세포에서 발현될 때 인트론이 없는 대조 단백질과 유사한 발현 수준으로 기능적 단백질(세포질 또는 분비됨)을 생성하였음.
(b) 캐노니컬 스플라이스 부위를 돌연변이시키면, 예상대로 모의 트랜스펙션의 수준으로 관심 단백질의 발현 수준이 감소하며, 이로써 기능적 인트론(그에 따른 pre-mRNA로부터의 이의 제거)이 관심 단백질의 적절한 발현에 가장 중요함을 보여주었음.
(c) 두 개의 동일하거나 동일하지 않은 인트론의 도입은 단 하나의 인트론을 포함하는 서열과 필적하는 발현 수준을 야기했음.
(d) 인트론으로의 "외래" 서열의 삽입은 일부 단백질의 발현 수준이 대조군 수준과 비교할 때 약간 감소했더라도 우수한 발현을 야기했음.
(e) 3 개 내지 7 개의 (동일하거나 동일하지 않은) 인트론의 삽입은 일부 인트론의 경우 발현을 나타내지 않았음. 다른 모든 것들은 감소된 수준의 발현을 보였음.
(f) 인트론은, 스플라이싱되지 않은 작제물이 (스플라이싱 후에) 예상된 단백질의 특성을 여전히 보유할 수 있는(그러나 반드시 보유해야 하는 것은 아님) 연장된 단백질을 생성하지 않도록 하기 위해 적어도 하나의 내부 인프레임 정지 코돈을 포함할 수 있음(예를 들어 인트론의 길이가 3의 배수인 경우).
(g) 다양한 인트론 조합을 포함하는 모듈식 골든 게이트-기반 클로닝에 의해 생성된 항체 작제물은, 작제물에 사용된 인트론 조합에 따라 다양한 발현 수준으로 존재하기는 하였지만, 예상대로 생성되어 배양 배지로 분비되었음. 인트론 I8 및 I9와 같은 더 긴 인트론들의 조합은 일반적으로 극히 짧은 인트론을 포함하는 것보다 높은 발현 수준을 생성했음. 항체 작제물의 기능 시험은, 모든 경우가 아닌 일부 경우에 인트론 I3 또는 그의 변형된 형태인 mI3가 약간 감소된 결합을 나타내기는 하였지만, 예상 범위에서 표적에 대한 결합을 보여주었음.
인트론은 기능적 mRNA를 생성하기 위해 세포 스플라이싱 장치를 사용하여 올바르게 폴딩된 관심 단백질을 생성하기 위해 골든 게이트 클로닝 접근법과 함께 사용될 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명의 클로닝 방법은, DNA 모듈-특이적 프리픽스 및 서픽스 서열의 필요성을 제거하고 그에 따라 달리 양립 가능하지 않은 DNA 모듈들의 조합을 가능하게 하여 완전히 일반적이고 보편적인 단백질 공학 방법론을 낳기 때문에 유리하다. 대조적으로, 당업계에 설명된 클로닝 기술에서, 관심 DNA 모듈들은 고유하고 양립 가능한 프리픽스-서픽스 쌍을 포함하는 경우에만 선형으로 융합될 수 있고, 결과적으로 양립 가능하지 않은 프리픽스-서픽스 쌍을 가진 1차 모듈 서열들은 지향성 조립을 가능하게 하기 위하여 1차 DNA 서열 조작에 의해(예를 들어, 양립 가능한 서열들을 도입함으로써) 수정되어야 한다. 양립 가능한 프리픽스 및 서픽스 서열은 타입 IIs 제한 효소(예를 들어, BsaI)에 의해 생성된 상보적인 4 개 염기쌍 오버행(프리픽스-서픽스 쌍)으로 구성된다. 결과적으로, 단백질 모듈은 공유 말단 4 bp 표적 부위(전형적으로 공통 아미노산 코돈 + 1 개의 추가 뉴클레오티드)에서 골든 게이트 클로닝에 의해 결합될 수 있다.
그러나, 본 발명의 방법은 비-회문성 타입 IIs 제한 부위를 코딩하는 정의된 플랭킹 프리픽스 및 서픽스 서열을 사용하여 컷-앤-페이스트 메커니즘에 의해 DNA 모듈(예를 들어, 단백질 도메인을 코딩함)이 조립되는 것을 가능하게 한다. 이때, DNA 모듈 조립을 위한 프리픽스 및 서픽스 서열은 DNA 모듈의 말단 부분으로부터 이동하게 되고, 관심 DNA 모듈로 융합되는 스플릿 인트론 서열(예를 들어, 두 개의 비기능적 모이어티로 분할되는 기능적 인트론)의 3' 또는 5' 말단에 대신 위치한다. 따라서, 프리픽스 및 서픽스 서열은 인트론 서열에 의해 제공된다. 양립 가능한 말단 프리픽스 및 서픽스 서열이 1차 DNA 서열의 일부가 된다는 전제 조건 없이 DNA 모듈의 일반적인 조립. 1차 DNA 서열의 변경은 필요하지 않다. 따라서, 양립 가능한 말단 프리픽스 및 서픽스 서열이 1차 DNA 서열의 일부가 된다는 전제 조건 없이 DNA 모듈의 일반적인 조립이 가능하다. 1차 DNA 서열의 변경은 필요하지 않다. 프리픽스 및 서픽스 서열이 더 이상 1차 DNA 모듈의 일부가 아니므로, 다중-도메인 어셈블리에 대한 유연성/가변성은 i) 인트론 서열 내에서 타입 IIs 표적 부위의 위치를 이동시키거나 ii) 대안적인 인트론 서열을 사용하거나 iii) 이들을 조합함으로써 달성된다.
본 발명의 방법은, 중첩 위치에서, 즉, 절단 후 생성된 오버행 내에서 적어도 하나의 동일한 3 개 뉴클레오티드의 스트레치를 공유하는 서열들(예를 들어, 단백질 도메인을 인코딩함)의 리게이션을 가능하게 하기 때문에 유리하다. 이는 DNA 서열들의 유연하고 코딩 서열-비의존성인 리게이션을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은, 코딩 서열과, 코딩 서열과 무관하게 리게이션에 사용되고/이를 가능하게 하는 플랭킹 핵산 서열 서열의 리게이션 및 그에 따른 콘카테머형성(concatenation)을 가능하게 한다.
방법에 의해 조립된 작제물은 인공 인트론을 포함할 수 있다. 여기서 시험된 인트론이 임의로 조합될 수 없다는 것이 명백해졌지만, 스플라이싱에 의해 진핵 발현 숙주에서 인트론이 제거되어 의도한 관심 폴리펩티드를 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이는 예상치 못한 일은 아니었다. 당업계에 얄려져 있는 바와 같이, 스플라이싱은 엑손 및 인트론 둘 모두 내의 활성화 및 억제 뉴클레오티드 서열에 의해 조절된다(예를 들어, 문헌[Lee and Rio, Annu. Rev. Biochem. 2015. 84:291-323] 또는 문헌[Yeo GW, Van Nostrand EL, Liang TY (2007) Discovery and analysis of evolutionarily conserved intronic splicing regulatory elements. PLoS Genet 3(5): e85. doi:10.1371/journal.pgen.0030085] 참조). 스플라이싱 효율에 대한 다양한 짧은 뉴클레오티드 서열의 영향을 보여주는 많은 실험 데이터가 있지만, 모든 조절 서열이 알려져 있는 것은 아니다. 주어진 서열 환경에서의 그러한 서열의 영향도 항상 알려져 있는 것은 아니다. 또한, 스플라이싱의 조절은 긴 인트론보다 극히 짧은 인트론에 대해 다르게 작동할 수 있다. 앞서 설명된 실험에서, 극히 짧은 인트론의 스플라이싱은 여기에 사용된 긴 인트론보다 잠재적인 조절 요소에 더 감수성이 있는 것처럼 보였다.
놀랍게도, 많은 경우, 동일한 인트론이 관심 단백질의 발현을 방해하지 않으면서, 작제물 내의 여러 위치에서 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Sanofi
<120> INTRON-BASED UNIVERSAL CLONING METHODS AND COMPOSITIONS
<130> SAN14152PC
<160> 47
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I1
<400> 1
gtaaggtaag aattgaattt ctcagttgaa ggatgcttac actcttgtcc atctag 56
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I2
<400> 2
gtgagtgggc caggggagag gtgccgtggg gctgggccga gctgaccctc atgtctccat 60
ag 62
<210> 3
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3
<400> 3
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggccc gagctgaccg cacccctccc 60
cacag 65
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I4
<400> 4
gtaagggagg gaaggggggg tggggagggg ccggctgtgc ccccctcacc tgcccctccc 60
cacag 65
<210> 5
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I5
<400> 5
gtaaggggtt aacagtagca ggcttgaggt ctggacatat atatgggtga caatgacatc 60
cactttgcct ttctctccac ag 82
<210> 6
<211> 375
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I6
<400> 6
gtaagtcagg tgtcagccgc agatgcgttc aggtgagggc ggaggctagc ggggcgctgt 60
gcagcactga gctcgcggaa gaccaggacc aggagatcac cgagggcgac cgccaggccc 120
cgggccctcc gctcccgagg ggcggcctct cagcaccagc ccgggggccg gcctgatcgc 180
cacgcaggca cctgccgccg ccaccgccac cgccatctca accgtacggg tgggagaggc 240
tgtgcgccgc tccaggggag atccggctcc catccggccc cacccgccct gccttgccct 300
gcccgcagct tctgggctgc caggctccat tctgaagctt ctactaactc tcgagtcttc 360
tttttttttt cacag 375
<210> 7
<211> 72
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I7
<400> 7
gtaagtcaac gcaattaatc tatgaaatcc ctaatgccta cggcagccgc tggattgtta 60
cttcttcttc ag 72
<210> 8
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I8
<400> 8
gtaagaacca aaccctccca gcaggggtgc ccaggcccag gcatggccca gagggagcag 60
cgggtggggc ttaggccaag ctgagctcac accttgacct ttcattccag 110
<210> 9
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I9
<400> 9
gtgagtacag gaggtggaga gtggccagcc cttctcatgt tcagagaaca tggttaactg 60
gttaagtcat gtcgtcccac ag 82
<210> 10
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I2(del5ss)
<400> 10
tggagtgggc caggggagag gtgccgtggg gctgggccga gctgaccctc atgtctccat 60
ag 62
<210> 11
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I2(del3ss)
<400> 11
gtgagtgggc caggggagag gtgccgtggg gctgggccga gctgaccctc atgtctccat 60
ga 62
<210> 12
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(del5ss)
<400> 12
tggagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggccc gagctgaccg cacccctccc 60
cacag 65
<210> 13
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(del3ss)
<400> 13
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggccc gagctgaccg cacccctccc 60
cacga 65
<210> 14
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(ins38)-1
<400> 14
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggcaa gcccgagctg accgcacccc 60
tccccacag 69
<210> 15
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(ins38)-2
<400> 15
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggcag ccccgagctg accgcacccc 60
tccccacag 69
<210> 16
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(ins38)-3
<400> 16
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggttc ccccgagctg accgcacccc 60
tccccacag 69
<210> 17
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(ins38)-4
<400> 17
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggcaa gtgggctgag gcccgagctg 60
accgcacccc tccccacag 79
<210> 18
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(ins38)-5
<400> 18
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggcag ctgggctgct tcccgagctg 60
accgcacccc tccccacag 79
<210> 19
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(ins37)-1
<400> 19
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcggcaag gcccgagctg accgcacccc 60
tccccacag 69
<210> 20
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(ins37)-2
<400> 20
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcggcagc gcccgagctg accgcacccc 60
tccccacag 69
<210> 21
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(1-29)_I8(25-110)
<400> 21
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagg ggtgcccagg cccaggcatg gcccagaggg 60
agcagcgggt ggggcttagg ccaagctgag ctcacacctt gacctttcat tccag 115
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I3(1-48)_I8(99-110)
<400> 22
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggccc gagctgacct ttcattccag 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I8(1-24)_I3(30-65)
<400> 23
gtaagaacca aaccctccca gcagtgggcg ggcccgagct gaccgcaccc ctccccacag 60
<210> 24
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Intron I8(1-98)_I3(49-65)
<400> 24
gtaagaacca aaccctccca gcaggggtgc ccaggcccag gcatggccca gagggagcag 60
cgggtggggc ttaggccaag ctgagctcac accttgaccg cacccctccc cacag 115
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I3N1(1-29)
<400> 25
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcag 29
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I3C1(30-65)
<400> 26
tgggcgggcc cgagctgacc gcacccctcc ccacag 36
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I3N2(1-48)
<400> 27
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcgggccc gagctgac 48
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I3C2(49-65)
<400> 28
cgcacccctc cccacag 17
<210> 29
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mI3N1(1-36_insCAAG)
<400> 29
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcggcaag 40
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mI3C1(insCAAG_37-65)
<400> 30
gcccgagctg accgcacccc tccccacag 29
<210> 31
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mI3N2(1-36_insCAGC)
<400> 31
gtgagtgggc gccccggcgg ggtgggcagt gggcggcagc 40
<210> 32
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mI3C2(insCAGC_37-65)
<400> 32
gcccgagctg accgcacccc tccccacag 29
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I8N1(1-24)
<400> 33
gtaagaacca aaccctccca gcag 24
<210> 34
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I8C1(25-110)
<400> 34
gggtgcccag gcccaggcat ggcccagagg gagcagcggg tggggcttag gccaagctga 60
gctcacacct tgacctttca ttccag 86
<210> 35
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I8N2(1-98)
<400> 35
gtaagaacca aaccctccca gcaggggtgc ccaggcccag gcatggccca gagggagcag 60
cgggtggggc ttaggccaag ctgagctcac accttgac 98
<210> 36
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I8C2(99-110)
<400> 36
ctttcattcc ag 12
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I9N1(1-22)
<400> 37
gtgagtacag gaggtggaga gt 22
<210> 38
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I9C1(23-82)
<400> 38
ggccagccct tctcatgttc agagaacatg gttaactggt taagtcatgt cgtcccaca 59
<210> 39
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I9N2(1-60)
<400> 39
gtgagtacag gaggtggaga gtggccagcc cttctcatgt tcagagaaca tggttaactg 60
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> I9C2(61-82)
<400> 40
gttaagtcat gtcgtcccac ag 22
<210> 41
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hRluc - I3 modified 1
<400> 41
caagtgggct gagg 14
<210> 42
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Claims (17)
- 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은,
(a1) 제1 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 상기 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열, 및
(iv) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열((iii)의 제1 절단 서열은 상기 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하는, 단계,
(a2) 제2 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열로서, 상기 제2 절단 서열은 상기 제1 절단 서열에 상보적인, 제2 절단 서열(상기 제2 절단 서열은 (a2)의 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 상기 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iv) 상기 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(v) 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열과 상이한, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제3 절단 서열, 및
(vii) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열(상기 제3 절단 서열은 (a2)의 (vii)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하는, 단계, 및
(a3) 제3 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제4 절단 서열로서, 상기 제4 절단 서열은 상기 제3 절단 서열에 상보적인, 제4 절단 서열(상기 제4 절단 서열은 (a3)의 (i)의 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 상기 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 상기 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 단계, 및
(b) 상기 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드를 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제와, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 상기 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 조건하에서, 접촉시킴으로써 상기 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(aa) 상기 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(bb) 상기 제1 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제1 인트론은 기능적이고, 상기 제1 인트론은 상기 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 상기 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열,
(cc) 상기 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(dd) 상기 제2 인트론을 인코딩하는 핵산 서열로서, 상기 제2 인트론은 기능적이고, 상기 제2 인트론은 상기 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열 및 상기 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 서열, 및
(ee) 상기 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는, 진핵 숙주 세포에서 전사될 때, 상기 세포에서 프로세싱되는 전사체로 전사되어 각 인트론이 상기 전사체로부터 스플라이싱 아웃(spliced out)됨으로써 상기 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 생성하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 인트론 및/또는 상기 제2 인트론은 상기 융합 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 인트론을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 제2 인트론을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 40 내지 2000 bp의 길이를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 인트론을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 50 내지 200 bp, 특히 50 내지 150 bp의 길이를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 인트론은 상기 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임과 인프레임(in frame) 상태로 내부 정지 코돈을 포함하는, 방법.
- 관심 폴리펩티드를 생성하는 방법으로서,
(i) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 상기 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는 단계, 및
(ii) 진핵 숙주 세포에서 상기 융합 폴리뉴클레오티드를 발현하여 상기 관심 폴리펩티드를 생성하는 단계, 및 선택적으로
(iii) 상기 진핵 숙주 세포로부터 상기 생성된 관심 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물로서,
상기 제1 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 관심 폴리펩티드의 제1 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(ii) 제1 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iii) 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제1 절단 서열, 및
(iv) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열(상기 제1 절단 서열은 상기 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하고,
상기 제2 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제2 절단 서열로서, 상기 제2 절단 서열은 제1 절단 서열에 상보적인, 제2 절단 서열(상기 제2 절단 서열은 상기 제2 폴리뉴클레오티드의 상기 인식 서열 (i)에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 상기 제1 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(iv) 상기 관심 폴리펩티드의 제2 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(v) 제2 인트론의 5' 부분을 인코딩하는 핵산 서열,
(vi) 상기 제1 폴리뉴클레오티드의 제1 절단 서열과 상이한, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제3 절단 서열, 및
(vii) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열(상기 제3 절단 서열은 상기 인식 서열에 작동 가능하게 연결되어 있음)을 포함하고,
상기 제3 폴리뉴클레오티드는, 5'에서 3' 방향으로,
(i) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열,
(ii) 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 대한 제4 절단 서열로서, 상기 절단 서열은 상기 제3 절단 서열에 상보적인, 제4 절단 서열((ii)의 제4 절단 서열은 상기 제3 폴리뉴클레오티드의 인식 서열 (i)에 작동 가능하게 연결되어 있음),
(iii) 상기 제2 인트론의 3' 부분을 인코딩하는 핵산 서열, 및
(iv) 상기 관심 폴리펩티드의 제3 부분을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 조성물. - 제9항에 있어서, 상기 조성물은 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 추가로 포함하며, 특히 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제 및 상기 리가제는 상기 제1 폴리뉴클레오티드, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 및 상기 제3 폴리뉴클레오티드의 절단 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 함으로써 상기 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는, 조성물.
- 제9항에 정의된 바와 같은 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오티드, 상기 제1 폴리뉴클레오티드, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 및 상기 제3 폴리뉴클레오티드의 절단을 가능하게 하는 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제, 및 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단으로 인해 생성된 절단 생성물들의 리게이션을 가능하게 하는 리가제를 포함하는, 키트.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항, 제9항 또는 제10항, 또는 제11항에 있어서, 상기 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제는 AcuI, AlwI, BaeI, BbsI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BsaXI, BseRI, BsgI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BsmI, BspCNI, BspMI, BspQI, BsrDI, BsrI, BtgZI, BtsCI, BtsI, BtsIMutI, CspCI, EarI, EciI, FauI, FokI, HgaI, HphI, HpyAV, MboII, MlyI, MmeI, MnlI, NmeAIII, PleI, SapI, 및 SfaNI로부터 선택되는, 방법, 조성물, 또는 키트.
- 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 진핵 숙주 세포에서 전사될 때 상기 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성인 적어도 5 개의 인트론을 포함하는 전사체로 전사되는, 폴리뉴클레오티드.
- 제13항에 있어서, 상기 인트론 각각은 바람직하게는 50 내지 200 nt의 길이, 더욱 바람직하게는 50 내지 150 nt의 길이, 가장 바람직하게는 50 내지 100 nt의 길이를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
- 제13항에 있어서, 상기 인트론 각각은 바람직하게는 80 내지 200 nt의 길이, 예컨대 90 내지 150 nt 또는 90 내지 120 nt의 길이를 갖는, 폴리뉴클레오티드.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 인트론은 상기 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임과 인프레임 상태로 내부 정지 코돈을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 리가제 및 타입 IIs 제한 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물의 용도로서,
상기 엔도뉴클레아제에 의한
(a1) 제1항에 정의된 바와 같은 제1 폴리뉴클레오티드,
(a2) 제1항에 정의된 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드, 및
(a3) 제1항에 정의된 바와 같은 제3 폴리뉴클레오티드
의 절단, 및 생성된 절단 생성물들의 리게이션에 의해 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 융합 폴리뉴클레오티드를 생성하는, 용도.
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