KR20210060436A - 광발광 무기 나노 입자를 사용한 모세관 작용 테스트 - Google Patents

광발광 무기 나노 입자를 사용한 모세관 작용 테스트 Download PDF

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KR20210060436A
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파스칼 페레이라
맥시밀리안 리칠리
세드릭 부지그
안티고니 알렌산드로
티에리 가코인
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에꼴레 폴리테크닉
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Abstract

본 발명은 화학식 A1- xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II)의 광발광 무기 나노 입자를 프로브로 사용하는 모세관 작용 테스트에 의해 액체 샘플에서 관심있는 생물학적 또는 화학적 물질을 검출 및/또는 정량화하는 시험관내 방법에 관한 것이다, 여기서 Ln은 유로퓸(Eu), 디스프로슘(Dy), 사마륨(Sm), 네오디뮴(Nd), 에르븀(Er), 이테르븀(Yb), 툴륨(Tm), 프라세오디뮴(Pr), 홀뮴(Ho) 및 이들의 혼합물에서 선택되고; A는 이트륨(Y), 가돌리늄(Gd), 란타넘(La), 루테튬(Lu) 및 이들의 혼합물로부터 선택되고; 0 < x < 1; 및 0 ≤ y < 1이고, 상기 방법은 320nm 이하의 파장에서 매트릭스의 여기(excitation)에 의해 1-광자 흡수 후 상기 나노 입자의 방출 수명이 100ms 보다 짧은 발광 검출을 사용한다.
또한, 프로브로서 전술한 나노 입자를 포함하는 모세관 작용 테스트 장치 및 시험관내 진단을 위한 이러한 방법의 사용에 관한 것이다.

Description

광발광 무기 나노 입자를 사용한 모세관 작용 테스트
본 발명은 생체 분석 및 시험관내 진단 분야에 관한 것이다. 이는 보다 구체적으로 액체 샘플에서 관심 있는 생물학적 또는 화학적 물질, 예를 들어 단백질, 항체, 독소 및 기타 화합물을 광학 및 물리 화학적 특성이 제어된 광발광 무기 나노 입자를 프로브로 사용하는 모세관 작용 테스트에 의해 검출 및/또는 정량화하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다.
일반적으로 "스트립 테스트"라는 이름으로 알려진 측방 유동 분석(LFA)과 같은 모세관 작용 테스트(Capillary action test)는 임상, 제약, 식품 또는 화학 분석 목적으로 일반적으로 사용된다. 항체, 항원, 단백질, 바이오 마커, 화학 분자, 핵산 등과 같은 다양한 유형의 분석 물질의 존재를 감지하는데 사용할 수 있다([1]). 측방 유동 분석(lateral flow assay)에 사용되는 인식 분자(recognition molecule)가 항체인 경우 일반적으로 "면역 크로마토그래피 분석"(측방 유동 면역 분석, LFIA)이라고 한다.
모세관 작용 테스트는 사용의 간편성, 속도(15분 이하의 시간 내에 감지) 및 저렴한 비용으로 특히 중요하다.
일반적으로 모세관 작용 시험 장치는 다공성 고체 지지체(예를 들어 니트로 셀룰로스 막) 형태의 모세관 작용 수단을 사용하며, 그 안에 시험 샘플이 고체 지지체의 한쪽 끝에 증착되고 고체로 상기 장치에 통합된 시약이 모세관 작용에 의해 이동한다.
전형적으로, 모세관 작용 테스트를 위한 상기 장치의 다공성 고체 지지체는 프로브(또는 검출 종)와 접합하거나 분석할 물질(또는 "분석물")과 특이적으로 결합하는 액체 형태로, 동결 건조 또는 탈수된 시약을 포함하는 라벨링 영역(영어 용어로 "컨쥬게이트 패드") 및 상기 분석물을 특이적으로 포획하는 시약이 고정되는 검출 영역(영어 용어로"검출 패드")을 포함한다.
분석물과 특이적으로 결합하는 시약은 동결 건조된 형태로 고정되지만 젖으면 고체 지지체에서 이동한다. 따라서, 고체 지지체가 액체 샘플과 접촉할 때, 후자는 프로브에 접합된 분석물에 특이적으로 결합하는 시약을 동반하는 상기 지지체에서 모세관 작용에 의해 이동한다. 분석물과 특이적으로 결합하는 시료 및 시약은 고체 지지체에서 분석물에 특정한, 고정된 포획 시약을 포함하는 검출 영역까지 모세관 작용에 의해 이동한다.
"샌드위치" 유형의 가장 일반적인 모세관 작용 테스트에서 프로브에 접합된 결합 시약은 시료에 포함된 분석물과 결합하고 후자가 만나면 분석물은 포획 시약에 의해 고체 지지체에 고정된다. 따라서 시료 내 분석 물질의 유무는 분석 물질을 통해 탐지 영역 수준에서 고정된 프로브를 탐지하여 측정된다.
이들 장치는 또한 모세관 흐름의 방향에 대해 검출 영역의 하류에 위치한 소위 컨트롤 영역을 포함하며, 여기에서 표지된 표적화 시약에 특정한 두 번째 포획 시약이 고정된다. 검출 영역까지 이동한 후, 프로브에 과도하게 결합된 결합 시약은 분석물과 반응하지 않고 제어 영역까지 이동하여 두 번째 포획 시약에 결합한다. 따라서 사용자는 검증할 장치의 샘플 및 시약의 이동을 허용하는 긍정적인 컨트롤을 가지므로 테스트가 제대로 작동하는지 확인할 수 있다.
따라서 샘플에서 분석물의 결정은 검출 영역 수준에서 그리고 선택적으로 컨트롤 영역 수준에서 프로브의 존재 또는 부재를 검출함으로써 달성된다.
모세관 작용 테스트에서 가장 일반적으로 사용되는 프로브는 금 나노 입자이다([1], [2]). 이들은 표면 플라즈몬 주파수에 해당하는 특성 파장에서 빛을 흡수한다. 나노 입자의 표면 플라즈몬 주파수는 크기와 응집 상태에 따라 다르다. 금 나노 입자가 검출 영역 및/또는 컨트롤 영역 수준에서 고정될 때, 서로 가까이 있는 나노 입자의 표면 플라즈몬의 주파수와 관련된 흡수는 따라서 육안으로 볼 수 있는 특징적인 색, 전형적으로 청색/보라색이 상기 영역에 부여되도록 한다. 유리하게는, 이러한 테스트를 통해 ELISA 분석을 위해 일반적으로 몇 시간이 소요되는 기존의 면역 검출 기술에 필요한 시간과 비교하여 샘플 분석 결과를 일반적으로 몇 분 내에 신속하게 얻을 수 있다. 또한 준비 또는 분석을 위해 비싸고 부피가 큰 장비가 필요하지 않다.
그러나 이러한 테스트는 검출 감도가 낮고 정량 한계가 낮다는 주요 단점이 있다. 따라서 일반적으로 정성적 또는 반정량적 정보만 제공한다. 특히, 이러한 스트립 테스트는 예를 들어 ELISA 유형과 같은 기존의 면역 검출 분석으로 얻을 수 있는 것보다 검출 감도가 훨씬 낮다. 따라서 금 나노 입자를 기반으로한 스트립 테스트는 일반적으로 약 ng/mL 정도의 농도를 감지할 수 있는 반면, ELISA 분석은 일반적으로 2 ~ 3배 더 민감하게 일부 pg/mL를 감지할 수 있다. 예를 들면, 회사 Cortez Diagnostics는 감도가 1ng/ml인 트로포닌 I(심근 경색의 바이오 마커)를 검출하기 위한 스트립 테스트를 제공하며([3]), 회사 Abcam은 7pg/mL의 감도로 ELISA 분석(ab200016)을 제공한다.
스트립 테스트의 민감도를 개선하기 위해, 즉 이러한 분석의 검출 한계를 낮추기 위해, 모세관 작용 테스트에서 금 나노 입자의 대안으로서 다양한 물질, 특히 수정된 금 나노 입자, 자성 입자, 반도체 나노 결정 또는 "퀀텀 닷", 상향 변환 형광체(up-conversion phosphors), 유기 형광체(organic fluorophor) 등이 프로브로 제안되었다([1], [4]).
따라서 금 나노 입자를 기반으로 한 여러 나노 물질이, 예를 들어 금 나노 입자로 코팅된 Fe2O3 나노미터 입자([5]), 금 나노 입자를 포함하는 실리카 나노 튜브([6]) 또는 다분지형 금 나노 플라워(GNF)([7])가 모세관 작용 테스트를 위한 장치의 프로브로 탐색되었다. 우리는 또한 금 나노 입자에 은 층을 증착할 것을 제안하는 Der-Jiang et al.([8])를 인용할 수 있다. 그러나 이러한 접근 방식에는 종종 매우 복잡한 이러한 프로브의 합성을 위한 경로가 필요하다. 또한 은이 금보다 쉽게 산화되기 때문에 은과 금을 결합한 프로브는 수성 매체에서 모세관 작용 테스트에 적용하기에 덜 안정적이다.
유기 형광체 및 퀀텀닷과 같은 광발광 프로브(이하 간단히 "발광 프로브"라고도 함)를 사용함으로써 금 나노 입자를 기반으로 한 분석에 비해 모세관 작용 테스트의 감도를 높일 수 있었다. 사실, 빛의 방출(발광)의 검출은 일반적으로 흡수의 검출보다 더 민감하며(금 나노 입자의 경우), 후자는 투과된 빛의 높은 배경에 대해 수행된다(예를 들어, 유기 형광체에 관한여 [9], [10] 및 [11]; QD에 관하여 : [11]-[17], [50]).
불행히도 이러한 광발광 프로브는 몇 가지 단점이 있으므로 스트립 테스트에서 프로브로서의 잠재력을 완전히 활용할 수 없다. 이러한 단점 중, 우리는 예를 들어 조명에 의해 유도 된 비가 역적 구조적 변화를 따르는 유기 형광체의 경우 광표백 현상이 형광 소멸에 반영되거나 반도체 나노 결정 또는 "양자점"에 대한 발광 반짝임 현상을 언급할 수 있으며, 프로브는 주기적으로 방출을 중단하고 결과적으로 지속적이고 재현 가능한 신호를 생성하는데 적합하지 않다. 다른 결점은 예를 들어 발광 프로브의 방출 스펙트럼의 폭에서 발생한다. 사실, 방출 스펙트럼이 너무 넓으면 존재할 수 있는 배경 신호를 필터링하기 어렵고 이는 신호의 품질, 특히 신호 대 잡음비에 영향을 준다. 생물학적 분석에서 프로브의 효율성, 실용적인 특성 및 프로브 사용의 용이성에 기여하는 광학 요소 외에도 고려할 필요가 있다. 따라서 반도체 나노 결정의 경우와 같이 특정 입자는 동결 후 발광 특성을 잃어 바이오 공액 반도체 나노 결정의 저장에 대한 단점을 나타낸다. 원하는 분자가 표적화되도록 하는 분자 화합물에 대한 프로브의 용이한 커플링 또한 적합한 프로브를 선택할 때 고려해야 할 측면이다. 따라서 반도체 나노 결정을 포함한 일정 수의 입자가 유기 용매에서 합성된다. 생물학적 용도로 사용하려면 이러한 입자를 물에 분산시키기 위한 추가 표면 처리 단계가 필요하고, 이 과정은 구현하기 복잡하고 시간이 지남에 따라 불안정할 수 있다([18]). 사실, 반도체 나노 결정(semiconductor nanocrystal)에 사용되는 표면 기능화는 나노 결정의 표면과 공유 결합을 포함하지 않는다. 따라서 기능화 분자는 분리되고 프로브 역할을 하는 나노 결정의 분석물(항체 또는 다른 일부)과 특이적으로 결합하는 시약의 해리를 일으킬 수 있다. 따라서 분석물의 특이적 결합 시약에 이러한 나노 결정의 접합은 기능화 유형에 따라 몇 주에서 몇 달이 걸릴 수 있다. 그러나 모세관 작용 테스트를 상업적으로 사용하려면 테스트 스트립에 프로브-결합 시약 접합체를 부착한 후 2년 정도의 안정성이 필요하다.
이러한 발광 프로브의 또 다른 단점은 발광을 감지하는데 필요한 여기가 기생광(parasitic light)의 방출을 유발할 수 있으며, 이는 배경 신호를 증가시키고 결과적으로 신호 대 잡음비를 감소시키는 결과를 초래할 수 있다는 것이다. 예를 들어 발광의 지연된 검출과 결합된 킬레이트 또는 란탄족 이온 복합체를 함유하는 발광 나노 입자; 상향 변환 나노 입자; 또는 지속적인 발광을 가진 나노 입자를 사용하는 것과 같이 기생 방출로부터 이러한 신호를 제거하거나 적어도 감소시키기 위한 다양한 접근법이 제안되었다.
따라서, 킬레이트 또는 란탄족 이온 복합체가 적재된 발광 입자는 모세관 작용 테스트에서 발광 프로브로 이미 제안되었다.
예를 들어, Zhang et al([19])은 이동 스트립 테스트에서 박테리아 Pantoea stewartii subsp . stewartii ( Pss )를 검출하기 위한 프로브로 란탄족(Eu) 킬레이트가 로딩된 실리카 나노 입자의 사용을 제안한다. 이러한 프로브는 금 입자를 사용하는 기존 분석법으로 얻을 수 있는 것보다 100배 더 낮은 검출 한계에 도달할 수 있다고 한다. 또한 Xia et al([20])는 B형 간염 표면 항원(HBsAg)을 검출하기 위한 측면 흐름 분석에서 유로퓸(europium) 킬레이트가 적재된 실리카 입자를 사용한다.
혈청 샘플에서 알파 태아 단백질(AFP, alpha-fetoprotein)을 검출하거나 전립선 특이 항원(PSA, prostate-specific antigen) 및 비오틴화된 소혈청 알부민(biotin-BSA)을 검출하기 위하여, 우리는 또한 측면 유동 분석에서 유로퓸 킬레이트가 적재된 폴리스티렌 미립자를 사용하는 것을 제안한 Liang et al.([21])과 Juntunen et al.([22])의 연구를 인용할 수 있다. 문서 WO 2013/013214 및 WO 2014/146215는 또한 측면 흐름 분석 스트립에서 프로브로서 터븀(terbium) 및/또는 유로퓸 킬레이트가 로딩된 폴리스티렌 나노 구의 사용을 제안한다.
또한 문서 WO 2014/146215에서 수명이 일반적으로 1-10ns 정도인 기생 방출을 피할 수 있는 지연 검출을 구현하기 위해 킬레이트 또는 란탄족 이온 복합체를 포함하는 이러한 나노 입자의 긴 수명 방출(약 100μs)을 활용하는 것이 제안되었다.
그러나 발광 프로브로 사용되는 킬레이트 또는 란탄족 복합체가 로딩된 발광 입자는 일반적으로 킬레이트 또는 복합체 당 하나의 란탄족 이온만을 포함한다. 각 킬레이트 또는 복합체는 나노- 또는 마이크로 입자 내에서 무시할 수 없는 공간을 차지하므로 주어진 입자 크기에 따라 방출되는 이온의 수를 제한한다. 예를 들어, 45nm의 나노 입자는 약 1000개의 킬레이트를 포함하고 이온을 방출한다[47]. 더욱이, 란탄족 이온의 복합체 또는 킬레이트를 함유하는 이러한 유형의 입자의 합성은 복합체 또는 킬레이트의 합성 및 킬레이트를 함유하는 입자의 합성의 적어도 두 단계를 포함한다. 따라서 이러한 유형의 입자 합성은 복잡하고 따라서 상대적으로 비용이 많이 든다. 마지막으로, 이러한 유형의 입자의 안정성도 의문을 제기했다([23]).
최근 몇 년 동안 희토류를 기반으로 하는 또 다른 유형의 발광 나노 입자는 바이오 이미징, 특히 모세관 작용 테스트의 응용 분야에서 발광 프로브로 제안되었다:이들은 적외선 또는 근적외선 소스(예를 들어 [24]-[29])에 의해 여기 하에서 가시광을 방출하는 상향 변환 형광체의 나노 입자이다. 이러한 상향-변환 나노 입자(up-conversion nanoparticle)를 사용하는 맥락에서 2개의 광자는 발광 방출이 관찰되기 전에 나노 입자에 의해 흡수되며, 이는 감지 된 신호에 해당한다. 예를 들어, 우리는 UPT 유형의 프로브("Up-converting Phosphor Technology")를 사용하는 측면 흐름 분석 스트립을 제안하여 효소 결합 면역 흡수 분석보다 더 높은 검출 감도에 도달할 수 있도록 하는 Niedbala et al([30])의 실험을 언급할 수 있다. 이러한 종류의 상향-변환 발광 프로브는 예를 들어 문서 US 2014/0170674에서 제안된 측면 흐름 분석용 장치에 사용된다.
이러한 상향-변환 형광체(up-conversion phosphor)는 특히 앞서 언급한 발광 프로브에 비해 특히 광표백 현상에 대한 저항성을 나타내고 배경 잡음을 유발하는 기생 형광 수준이 낮다는 장점이 있다. 실제로 여기가 검출 파장보다 낮은 파장에서 발생하기 때문에 시료에 포함된 보조 물질이나 다공성 고체 지지체로 인한 방출은 거의 존재하지 않는다.
불행히도, 이러한 상향-변환 인광체는 양자 수율이 낮고 여기 소스의 낮은 광학 전력 밀도에 대해 효율이 상당히 감소한다는 주요 단점이 있으며, 발광은 여기 전력 밀도의 제곱에 비례한다. 더욱이, 테스트 대역 및 선택적으로 컨트롤 대역을 포함하는 상당히 넓은 영역은 여기되어야 하며, 이는 주어진 전력에 대한 여기의 전력 밀도를 감소시킨다. 결과적으로 이러한 종류의 발광 프로브를 사용하여 테스트를 읽으려면 여기를 위해 레이저 다이오드를 렌즈, 필터, 광전자 증배관(photomultiplier), 전치 증폭기(preamplifier) 등과 같은 다른 요소와 결합하는 복잡한 장비가 필요하다.
마지막으로, 여기(excitation)에 의해 유도되는 기생 발광을 피하기 위해 지속적인 발광을 방출하는 무기 나노 입자도 제안되었다. 이러한 무기 나노 입자는 란탄족 이온을 도펀트로 포함하는 결정질 매트릭스로 형성된다. 지속적인 발광을 갖는 나노 입자의 특별한 특징은 도펀트가 결정의 전자 구조에 트랩 상태를 도입하고 여기된 전하가 거기에 트랩된다는 것이다. 따라서 이러한 나노 입자에 의한 발광 방출은 이러한 트랩 상태에서 전하가 방출된 후에만 *?*발생할 수 있으며, 방출은 열 활성화에 의해 발생한다([31]). 전자 구조에서 이러한 트랩 상태의 에너지에 따라, 즉 트랩의 깊이에 따라, 열 활성화 및 따라서 방출의 수명에 따라 몇 시간 또는 며칠에 도달할 수 있다. 따라서 나노 입자를 여기한 다음 여기가 중지된 후 적합한 판독기에 모세관 작용 테스트 장치를 삽입하고 여기가 없는 경우, 따라서 기생 방출이없는 경우 발광을 감지하여 분석을 읽을 수 있다. 예를 들어, Paterson et al.([32])는 금 나노 입자로 얻은 것보다 현저하게 향상된 검출 감도를 얻었다(검출 한계는 금 나노 입자로 얻은 것보다 약 10 배 낮음). 이것은 또한 판독를 위해 방출 필터를 사용할 필요가 없게 한다.
그러나 이 시스템은 방출 신호의 획득 시간이 길다는 단점이 있다. 사실, 이러한 나노 입자에 의한 방출은 몇 분 동안, 특히 몇 시간 또는 심지어 며칠 동안 상황에 따라 발생하기 때문에 방출된 광자 수의 무시할 수 없는 부분을 수집하려면 이 수명에 해당하는 시간을 기다려야 한다. 따라서 단위 시간(예를 들어 초당)에서 방출되는 광자의 수가 적어 결과적으로 높은 수준의 감도에 도달하기 위해 발광 획득 시간을 늘려야 한다. 이러한 획득 시간은 신속한 진단을 제공하는 모세관 작용 테스트의 목적과 상반된다. 이 문제를 해결하기 위해 여기 전력을 증가시킬 수 있다; 그러나 이는 복잡한 장비가 필요하므로 소형이고 저렴한 분석 시스템에 대한 요구 사항을 충족하지 못한다.
마지막으로, 유로퓸과 비스무트와 함께 도핑된 YVO4 나노 입자는 모세관 작용 시험의 또 다른 변형에 사용되었다([33]). 비스무트의 존재는 바나 데이트 이온 VO4 3 - 내부의 전하 이동 전이 O2--V5+로 인해, 가시적으로, 전하 이동 전이 Bi3 +-V5+의 출현으로 인해, 280 nm에서 흡수 피크를 갖는 YVO4 매트릭스의 흡수 이동을 생성할 수 있게 하고, 따라서 약 350nm의 더 일반적인 여기 소스를 사용할 수 있다. 그런 다음 여기가 Eu3 + 이온으로 전달된다. 그러나 이 접근법은 이러한 나노 입자의 복잡한 합성의 결점을 가지고 있다. 특히 결정 구조가 다른 YVO4와 BiVO4의 균일한 고용체를 생산하는 것은 어렵다([34]). 이를 위해서는 더 복잡한 장비(오토 클레이브)([33]) 또는 숙성 과정([34])이 필요한 고온에서 열수 합성에 의존해야 한다.
따라서 현재까지 모세관 작용 테스트를 위해 제안된 프로브 중 어느 것도 완전히 만족스럽지 않다. 특히, 육안으로 또는 콤팩트하고 저렴한 판독기로 읽을 수 있는 시스템과 함께, 매우 밝고 복잡하지 않으며 합성 비용이 저렴한 프로브의 장점을 결합할 수 있는, 모세관 작용 테스트 장치에 사용할 수 있는, 프로브가 여전히 필요하며, 이는 금 나노 입자를 기반으로 한 모세관 작용 시스템보다 훨씬 더 민감한 감지 기능을 제공한다.
본 발명은 모세관 작용 테스트에 사용될 수 있고 이러한 요구를 충족시키는 새로운 발광 프로브를 제안하는 것을 정확하게 목표로 한다.
보다 구체적으로, 모세관 작용 테스트에 의한 분석 방법의 프로브로서, 그것은 제어된 광학적 및 물리 화학적 특성을 갖는 희토류 이온으로 도핑된 발광 나노 입자의 사용을 제안한다.
따라서, 본 발명은 프로브로서 하기 화학식 (I)의 광발광 무기 나노 입자(photoluminescent inorganic nanoparticle)를 사용하여 모세관 작용 테스트에 의해 액체 샘플에서 관심 있는 생물학적 또는 화학적 물질을 검출 및/또는 정량화하는 시험관내 방법을 설명한다:
(A1-xLnx)a(MpOq) (I)
여기서:
- M은 결정질 화합물(crystalline compound)을 형성하기 위하여, 산소(O)와 결합할 수 있는 하나 이상의 원소를 나타내고;
- Ln은 하나 이상의 발광 란탄족 이온(lanthanide ion)에 해당하고;
- A는 전자 레벨이 발광 공정에 관여하지 않는 결정질 매트릭스의 일부를 형성하는 하나 이상의 이온에 해당하고;
- 0 < x < 1; 및
- p, q 및 a의 값은 (A1- xLnx)a(MpOq)의 전기적 중립성(electrical neutrality)이 존중(respect)되도록 하고,
상기 방법은 1-광자 흡수 후, 상기 나노 입자의 방출 수명(emission lifetime)이 100ms보다 짧은 발광 검출을 사용한다(employing).
보다 구체적으로, 본 발명의 제1양태에 따르면, 본 발명은 프로브로서 하기 화학식 (II)의 광발광 무기 나노 입자를 사용하여 모세관 작용 테스트에 의해 액체 샘플에서 관심 있는 생물학적 또는 화학적 물질을 검출 및/또는 정량화하는 시험관내 방법에 관한 것이다　:
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II)
여기서:
- A는 이트륨(Y), 가돌리늄(Gd), 란타넘(La), 루테튬(Lu) 및 이들의 혼합물로부터 선택되고;
- Ln은 유로퓸(Eu), 디스프로슘(Dy), 사마륨(Sm), 네오디뮴(Nd), 에르븀(Er), 이테르븀(Yb), 툴륨(Tm), 프라세오디뮴(Pr), 홀뮴(Ho) 및 이들의 혼합물에서 선택되고;
- 0 < x < 1, 특히 0.2 ≤ x ≤ 0.6, 더욱 특히 x는 0.4의 값을 가지며; 및
- 0 < y < 1, 특히 y의 값은 0이고;
상기 방법은 320nm 이하의 파장에서 매트릭스의 여기(excitation)에 의해 1-광자 흡수 후 나노 입자의 방출 수명이 100ms 보다 짧은 발광 검출을 사용한다.
특히, 상기 발광 검출은 유리하게는 300nm 이하, 특히 250 내지 300nm의 파장에서 매트릭스 AVO4(1-y)(PO4)y, 예를 들어 YVO4의 여기에 의해 수행된다(effected).
본 발명의 방법에 따르면, 검출된 신호는 단일 광자(single photon)의 흡수 후 광발광 나노 입자에 의한 발광 방출, 즉 여기 파장보다 더 큰 파장에서의 방출에 해당한다. 단일 광자의 흡수 후 발광 방출은 특히 위에서 언급한 "상향 변환" 입자의 경우와 같이 2-광자 흡수를 위한 입자에 의한 발광 방출의 검출의 경우와 다르다.
이러한 나노 입자는 아래에 설명된 바와 같이 분석할 물질을 인식할 수 있는 인식 분자(항체, 핵산, 펩티드, 압타머 등)로 기능화된다.
본 발명의 의미에서, 샘플 내 물질의 "분석"은 상기 물질의 존재 또는 부재의 검출 또는 정성적 특성화 측면뿐만 아니라 상기 물질의 정량적 특성화 또는 결정(determination) 측면을 포함한다.
액체 샘플은 특히 생물학적 샘플, 특히 임의의 생물학적 유체 또는 체액일 수 있다. 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 비강 도말(nasal smear), 소변, 희석된 대변, 질도말 또는 뇌척수액 중에서 선택된 사람으로부터 채취한 샘플일 수 있다.
또한 예를 들어 환경 샘플 또는 농산물 및 식품의 샘플과 같은 생물학적 분자, 화학 분자 또는 병원성 바이러스 또는 박테리아를 포함하는 용액일 수 있다.
본 발명의 방법은 특히 샘플, 특히 생물학적 샘플에서 분자, 단백질, 핵산, 독소, 바이러스, 박테리아 또는 기생충을 검출 및/또는 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어 바이오 마커, 항체, DNA 및/또는 RNA, 면역 글로불린(IgG, IgM 등), 항원의 존재를 검출하는데 사용할 수 있고, 상기 항원은 생물학적 샘플에서 바이러스, 박테리아 또는 기생충을 구성하는 생체 분자일 수도 있다.
예를 들어 과학 경찰 조사를 위한 관심 분자, 예를 들어 마약과 같은 불법 화학 물질 또는 방어를 위한 관심 물질(생물 테러 행위자)일 수도 있다.
또한 식품 안전(Salmonella, Listeria , 또는 Escherichia coli와 같은 병원성 박테리아 또는 노로바이러스 또는 알레르겐과 같은 바이러스) 또는 환경, 예를 들어 오염 물질(살충제)에 관심이 있는 물질일 수 있다.
본 발명에 따른 모세관 작용 시험에 의해 분석하고자 하는 관심 생물학적 또는 화학적 물질은 이하에서 "분석할 물질" 또는 "분석물"이라는 표현으로보다 간단하게 표시된다.
예를 들어, 검사 스트립에서와 같은 모세관 작용 테스트 장치에서 프로브로서 본 발명에 따른 발광 무기 나노 입자의 사용은 여러 측면에서 특히 유리한 것으로 입증된다.
첫째, 본 발명에 따라 사용되는, 이하에서 정확하게 기재된 화학식 (A1-xLnx)a(MpOq) (I), 예를 들어, YVO4:Eu 또는 GdVO4:Eu, YAG:Ce 유형의 나노 입자, 특히 화학식 A1- xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II)의 나노입자의 희토류 이온으로 도핑된 나노 입자는 특히 우수한 광 안정성과 관련하여 특히 유리한 특성을 가지며, 이것은 장기간의 일정한 신호를 획득하고 방출의 반짝임 현상이 없는 것을 허용한다.
또한, 이러한 나노 입자는 동결 후에도 발광을 잃지 않는다.
희토류로 도핑된 이트륨 바나데이트 기반 나노 입자는 예를 들어 Riwotzki 등([45]) 및 Huignard 등([46])에 의해 자세히 설명되었다. 문서 EP 1 282 824에서, 생물학적 물질 또는 다른 유기 물질을 검출하기 위한 프로브로서 표면 개질된 무기 발광 나노 입자의 사용을 설명한다.
그러나 본 발명자들이 아는 한, 모세관 작용 테스트에서 발광 프로브로 사용하기 위해, 지속적인 발광을 갖는 입자와는 다른 희토류 이온으로 도핑되고 단일 광자의 흡수 후 방출되는 위에서 정의된 바와 같이 광발광 무기 나노 입자를 활용하는 것이 제안된 적이 없다.
란탄족 이온을 기반으로 한 이러한 나노 입자가 특히 모세관 작용 테스트에서 화학적 또는 생물학적 물질을 검출하고 정량화하는 데 사용될 수 있다는 것은 예측할 수 없었으며 또한 테스트 감도 측면에서 성능을 향상시킬 수 있다.
사실, 반짝임이 없다는 점을 제외하고는, 희토류를 기반으로 한 나노 입자의 발광 특성은 양자점(quantum dot)보다 열등한 것으로 간주된다. 희토류 이온, 특히 금속 산화물 매트릭스로 구성된 나노 입자에서, 발광의 여기는 매트릭스의 직접 여기(direct excitation)에 의해 수행되거나, 덜 자주는 발광 희토류 이온의 가시광에서 직접 여기에 의해 수행될 수 있다. 희토류 이온의 직접 흡수에 대한 흡광 계수(extinction coefficient)는 일반적으로 매우 낮지만 결정질 매트릭스의 여기에 대한 흡광 계수는 훨씬 높다([35]).
그러나 결정질 매트릭스의 흡수 대역은 일반적으로 UV에 위치하므로 다음과 같은 주요 단점이 있다: 모세관 작용 장치(예를 들어 모세관 확산 멤브레인)의 다양한 구성 요소뿐만 아니라 생체 분자도 UV를 강하게 흡수한다. 예를 들어, 바나데이트 이온 VO4 3- 기반 매트릭스의 경우 280nm에서의 흡수 피크는 단백질, 특히 트립토판 아미노산의 흡수와 일치한다. 결과적으로, 특히 UV에서 희토류 이온으로 도핑된 결정질 매트릭스에 기반한 나노 입자의 발광의 여기는 큰 보조 방출 신호를 생성하기 쉽다. 이와 같은 기생 방출(Parasitic emission)은 복잡한 분자 혼합물에서 낮은 강도의 신호를 정확하게 식별하는 것을 목표로 하는 모세관 흐름 스트립 테스트와 같은 체외 진단 테스트의 목적과 호환되지 않는다.
모든 기대에 반하여, 본 발명자들은 본 발명에 따른 희토류에 기초한 이러한 광발광 나노 입자를 UV의 여기 조건, 특히 350 nm 미만, 유리하게는 320 nm 미만, 더 유리하게는 250 내지 320 nm, 특히 250 내지 300 nm의 여기 조건에서도 모세관 작용 테스트 유형의 시험관내 진단 기술에서 프로브로 사용할 수 있음을 발견했다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 모세관 테스트 시험에서 UV에서 여기된 나노 입자의 발광을 검출하는 것이 사용된 나노 입자에 특유한 세 가지 광학적 특성으로 인해 기생 방출로부터 강한 신호가 있음에도 불구하고 가능하다는 것을 증명했다: i) 매우 큰 크기의 나노 입자에 의존할 필요 없이 본 발명의 나노 입자에 포함된 많은 수의 발광 란탄족 이온, ii) 희토류 이온의 좁은 방출 스펙트럼으로, 일반적으로 스펙트럼이 매우 넓고 기생 방출을 효과적으로 제거할 수 있음, iii) 일반적으로 Eu로 도핑된 YVO4 또는 GdVO4 나노 입자의 경우 350nm 정도의 큰 스톡스 이동(Stokes shift)(흡수 피크와 방출 피크 사이의 이동) (바나데이트 매트릭스의 경우 280 nm에서 흡수 피크 및 617 nm에서 Eu의 방출 피크), 이는 이동 지원 또는 일반적으로 Stokes 이동이 작은 분석할 물질을 포함하는 샘플로 인한 여기 파장 및 기생 방출을 효과적으로 거부할 수 있다. 특히, 이 큰 스톡스 시프트는 검출을 위해 간섭 필터보다 저렴한 간단한 고역 통과 필터를 사용할 수 있음을 의미한다.
따라서 기생 방출을 효과적으로 제거하고 원하는 감지 감도를 얻기에 충분한 신호 대 잡음비로 신호를 획득할 수 있다.
더욱이, 모든 예상과 달리, 320nm 이하, 특히 바나데이트 매트릭스의 흡수 피크가 위치하는(도 11(A) 참조) 약 280nm 또는 300nm에서 여기는 380nm에서 여기보다 훨씬 낮은 측면 흐름 분석에 일반적으로 사용되는 니트로 셀룰로오스 막에 연결된 기생 방출을 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 11(B) 참조). 란탄족 이온을 킬레이트화하거나 복합화하는 분자가 일반적으로 320nm([47])에서 400nm([48]) 사이를 흡수한다는 것을 알고, 250 ~ 300nm, 특히 260 ~ 300nm를 흡수하는 매트릭스의 사용은 추가적인 이점을 제공한다.
특히, 뿐만 아니라 280nm를 중심으로 하는 YVO4 또는 GdVO4의 결정 또는 약 300nm([40])의 중심에 있는 LaVO4의 결정에서 바나데이트 이온 VO4 3- 내의 O2--V5+ 전하 이동 흡수가 가능하고 Eu를 포함하는 나노 입자의 경우, O2--Eu3 + 전하 이동에 연결된 또 다른 흡수는 약 260nm 주위의 흡수를 유도한다. 후자는 예를 들어 La2Hf2O7:Eu, A2Hf2O7 (A = Y, Gd, Lu) 및 La2Zr2O7:Eu 나노 입자에서 관찰되었다([41]).
더욱이, 이하에 주어진 실시 예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 검출 민감도 측면에서 모세관 작용 시험의 성능에 도달할 수 있게 하는데, 이는 적어도 10배(one order of magnitude) 또는 훨씬 더 향상된다.
특히, 정성 분석(샘플에 분석 물질의 유무)뿐만 아니라 반정량 및 정량 분석도 가능하다.
따라서, 본 발명은 또한 모세관 작용 테스트 장치의 검출 감도를 증가시키기 위해 상기 정의된 바와 같은 나노 입자의 모세관 작용 시험 장치에서 프로브로서의 용도에 관한 것이다.
상기 광발광 나노 입자는 임의의 공지된 유형의 모세관 작용 테스트, 예를 들어 측방 유동 분석, 예를 들어, 도 2에 개략적으로 도시된 바와 같이 소위 "샌드위치" 분석 또는 소위 도 3에 도시된 바와 같은 "경쟁" 분석에서 프로브로서 사용될 수 있다. 특히, 금 나노 입자를 발광 프로브로 사용하여 현재까지 제안된 모세관 작용 시험 장치에 사용하기에 적합하며, 모세관 작용 시험 장치의 지지체 특성을 수정할 필요가 없다.
특히, 이하에 제시된 실시 예에서 예시된 바와 같이, 본 발명에 따른 광발광 나노 입자는 예를 들어 금 나노 입자와 유사한 평균 크기, 약 30 내지 50nm를 가질 수 있고, 결과적으로 이 크기의 입자의 이동에 적합한 모세관 작용 수단, 전형적으로 니트로셀룰로스 멤브레인과 양립할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 광발광 나노 입자는 더 클 수 있으며, 따라서 발광 신호를 최적화할 수 있다. 사실, 란탄족 이온의 수는 나노 입자의 부피에 따라 증가하므로 방출되는 발광 신호는 구형 입자 반경의 입방체에 따라 증가한다. 이 경우, 측면 유동 분석의 이동 지지체는 선택한 나노 입자의 크기에 맞게 조정된 기공을 포함할 수 있다. 가변 기공 크기를 갖는 막은 예를 들어 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, MerckMillipore 사에 의해서 참조번호 HF075, HF090, HF120, HF135, HF180로 시판되는 가변 기공 크기를 갖는 막).
더 큰 나노 입자는 예를 들어 예시된 바와 같이 입자를 원심 분리하여 크기를 분류하여 얻을 수 있으며, 크기 분포에서 가장 큰 크기의 입자만 유지하거나 벌크 물질을 분쇄하여 얻을 수 있다. 당업자에게 알려진 임의의 다른 기술이 또한 사용될 수 있다.
더욱이, 실시 예에서 예시된 바와 같이, 금 입자의 입자 크기와 유사한 입자 크기를 유지하면서, 본 발명의 나노 입자는 특히 킬레이트 또는 란탄족의 복합체 에 기초한 입자의 경우보다 훨씬 더 큰 발광을 일으키는 많은 수의 이온을 가지며, 따라서 고강도의 방출 신호를 생성할 수 있어 결과적으로 향상된 감도를 얻을 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 검출 방법은 금 나노 입자를 프로브로 사용하는 동일한 분석의 검출 한계보다 최대 10배, 특히 최대 100배 또는 최대 1000배까지 정성 측정을 가능하게 한다.
마지막으로, 모세관 작용 테스트에서 프로브로서 본 발명에 따른 나노 입자를 사용하면 란탄족 킬레이트가 로딩된 입자로 얻은 결과와 비교하여 감도 측면에서 성능이 향상된다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 액체 샘플에서 관심있는 생물학적 또는 화학적 물질을 검출 및/또는 정량화하는데 유용한 모세관 작용 테스트 장치에 관한 것으로, 상기 장치는 프로브로서 상기 정의된 바와 같은 광발광 무기 나노 입자를 포함한다.
보다 정확하게는, 따라서 본 발명은 액체 샘플에서 관심있는 생물학적 또는 화학적 물질을 검출 및/또는 정량하는데 유용한 모세관 작용 테스트 장치에 관한 것으로, 상기 장치는 프로브로서 화학식 A1- xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II)의 광발광 무기 나노 입자를 포함하고, 여기서 A, Ln, x 및 y는 위에 정의된 바와 동일하고, 상기 나노 입자는 320nm 이하, 특히 300nm 이하 그리고 더 특히 250 ~ 300nm 사이의 파장에서 매트릭스의 여기에 의해 1-광자 흡수 후 100ms 미만의 방출 수명으로 발광을 방출할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 모세관 작용 시험 장치는 화학식 (II)의 광발광 무기 나노 입자를 포함하며, 그 발광은 320nm 이하, 특히 300nm 이하 그리고 더 특히 250 ~ 300nm 사이의 파장에서 매트릭스의 여기에 의해 1-광자 흡수 후 100ms 미만의 방출 수명으로 검출된다.
좀 더 정확하게 말하자면, 횡 방향 유동 분석을 위해 알려진 장치에서 일반적으로 사용되는 금 나노 입자와 같은 프로브처럼, 본 발명에 따른 광발광 나노 입자는 특히 "표지 영역"(더 일반적으로 영어 용어로 "접합 패드"라고 함)이라고하는 분석 장치의 영역 수준에서 항체와 같이 분석할 물질에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 시약에 결합된 형태로 존재한다.
본 발명은 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이 이동 스트립 유형의 종래의 모세관 작용 시험 장치(영어 명칭 "측류 스트립"으로 알려짐)를 참조하여보다 구체적으로 설명된다. 물론, 본 발명의 방법은 프로브로서 본 발명의 광발광 나노 입자를 사용하기에 적합하다면, 모세관 작용 시험 장치의 임의의 다른 변형을 사용할 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 모세관 작용 테스트 장치는 기준 방향(reference direction)으로 모세관 작용을 위한 수단, 특히 다음을 포함하는 니트로 셀룰로스 막과 같은 다공성 고체 지지체를 포함할 수 있다:
- 액체 샘플의 증착을 위한 영역;
- 시료 침착을 위해 상기 영역의 하류에 배치되고, 적어도 하나의 "결합 시약"(인식 분자), 예를 들어 분석될 물질에 특이적인 항체에 결합하는, 본 발명에 따른 광발광 무기 나노 입자(프로브)로 로딩된, 라벨링 영역 또는 커플링 영역이라고 불리는, 영역,
- 상기 라벨링 영역의 하류에 배치된된 "검출 영역"이라고도 하는 반응 영역, 여기서 분석 대상 물질에 특이적인 항체와 같은 적어도 하나의 "포획 시약"(인식 분자)이 고정되어 있음,
- 검출 영역의 하류에 위치한 시약의 이동 제어 영역(migration control zone); 및
선택적으로, 제어 영역의 하류에 배열된 흡수 패드.
모세관 작용 테스트를 위한 장치의 예는 아래에서 자세히 설명한다.
액체 샘플은 본 발명에 따른 모세관 작용 테스트 장치를 사용하여 직접 분석될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 액체 샘플의 분석은 일반적으로 다음을 포함한다:
(i) 분석할 액체 샘플 및 선택적으로 희석제를 모세관 작용 테스트 장치의 증착(deposition) 영역 수준에 적용하는 단계;
(ii) 광발광 나노 입자에 의해 생성된 발광이 반응 영역에서 검출될 때까지 및/또는 발광이 이동 제어 영역에서 검출될 때까지 장치를 인큐베이션하는 단계; 및
(iii) 결과를 판독하고 및 해석하는 단계.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 액체 샘플, 특히 생물학적 샘플에서 관심있는 생물학적 또는 화학적 물질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 본 발명에 따른 모세관 작용 테스트 장치의 용도에 관한 것이다.
상기 모세관 작용 테스트 장치는 테스트 결과를 제공하는 판독기에 연결될 수 있다.
이하에 상세히 설명된 바와 같이, 결과의 판독은 검출 영역 수준에서 고정된 나노 입자에 의해 생성된 발광을 검출하고, 적용 가능한 경우 모세관 작용 테스트 장치의 제어 영역 수준에서 발광을 감지하는 것을 포함한다.
특히 다음과 같은 방법으로 수행된다.
- 고정화된 광발광 나노 입자의 여기; 및
- 발광 방출 감지.
특히 유리하게는, 적절한 필터만을 사용하여 육안으로 모세관 작용 시험 장치를 판독하는 것이 가능하다.
대안적으로, 상기 발광은 예를 들어 방출 필터 및 카메라와 같은 검출기를 사용하는 간단한 검출 장비를 사용하여 판독될 수 있다.
방출 필터는 간섭 필터일 수 있지만 단순한 고역 통과 필터일 수도 있다. 사실, 이러한 입자의 방출과 관련된 큰 스톡스 이동(Stokes shift)으로 인해, 일반적으로 작은 스톡스 이동을 갖는 모든 기생 방출은 이러한 나노 입자의 방출보다 짧은 파장에 위치할 것다.
마지막으로, 본 발명에 따른 모세관 작용 시험 장치는 하나의 동일한 샘플에서 여러 물질의 다중 검출, 즉 동일한 모세관 작용 시험에 의한 동시 검출에 적합하다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 시험관내 진단을 위한 상기 정의된 바와 같은 검출 방법 또는 상기 정의된 바와 같은 모세관 작용 시험 장치의 사용에 관한 것이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 모세관 작용 시험으로 생물학적 샘플에서 특정 물질의 낮은 함량을 검출할 수 있는 가능성은 예를 들어 질병의 조기 발견 또는 질병의 진행 또는 치료 효과의 진단을 위해 본 발명의 방법을 사용하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 모세관 작용 검사에 의해 진단될 수 있는 질병은 제한되지 않으며, 하나 이상의 특이적 결합 파트너(리간드, 항체, 항원, 상보적 핵산, 압타머 등)가 있는 생물학적 관심 유형(단백질, 핵산, 항체 등)의 질병의 특정 마커의 존재에 의해 밝혀진 모든 질병을 포함한다.
예를 들어, 감염성 질환(세균, 기생충 또는 AIDS와 같은 바이러스), 염증 및 자가 면역 질환, 심장 질환, 신경 질환 또는 종양 질환(예를 들어 유방암 또는 전립선 암과 같은 고형암)을 언급할 수 있다.
감도에서 가장 큰 이득(100 또는 1000배)으로 ELISA 분석 또는 ELISA의 변형 중 하나에 가까운 성능을 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 ELISA 유형의 민감한 검출이 필요하지만 이용할 수 없는 경우에 특히 적합하다.
따라서 진료 시점(POC)에서 신속한 진단이 가능하다.
따라서, 본 발명의 방법은 감염성 질병 또는 다른 일반적인 질병의 진단을 위해 예를 들어 개발 도상국, 시골 및/또는 외딴 지역에서 감염성 질병 또는 다른 일반적인 질병의 진단에 유용할 수 있다.
특히 환자의 생존이 위험할 수 있는 경우(심부전, 정맥 혈전증, 염증 증후군, 전신 세균 감염(패혈증), 급성 췌장염) 긴급 진단을 가능하게 하는 응급 치료(SAMU, SMUR 응급 의료 서비스)의 맥락에서 특히 유용할 수 있다. 이러한 상황에서 병원에 도착하기 전에 ELISA 분석에 필적하는 감도로 신속한 분석을 수행하여 환자의 진단 및 관리 시간을 절약하여 환자의 생존 가능성을 높일 수 있다.
더욱이, 프로브로서 본 발명에 따른 입자를 사용하는 모세관 작용 테스트에 의한 진단은 투여되는 의약품(예를 들어 면역 조절제 또는 면역 억제제의 경우)의 용량을 조정하기 위해 정기적인 진단 테스트를 필요로하는 환자에게 특히 유용할 수 있다. 실제로 혈액 샘플을 채취하거나 다른 침습적 검사를 통해 진단하는 대신 스트립 테스트를 수행하면 환자의 편안함을 개선하고 진단 비용을 절감하며 적시에 검출/정량을 수행할 수있는 이점이 있고, 따라서 투여되는 의약품의 용량을 더 잘 조정할 수 있다.
물론, 본 발명의 방법은 위에서 언급한 응용에 제한되지 않는다. 따라서, 핵산(예를 들어 종자에서 GMO)을 검출하거나, 환경, 예를 들어 물, 사람 또는 동물 소비용 식품에서 오염 물질 또는 병원체를 검출하는데 사용할 수 있다.
따라서 본 발명의 방법의 적용은 면역학에서 분자 유전학 또는 DNA 및 RNA의 검출로 확장될 수 있다. 부분적으로 상보적인 단편이 나노 입자에 결합된 생물학적 시료의 RNA 가닥 하나 이상을 표지하는데 사용할 수 있으며, 그런 다음 Affymetrix 유형의 DNA 칩과 유사한 접근 방식에 따라 스트립의 기질에 이식된 다른 영역의 상보적 단편에 대한 혼성화를 통해 이들을 검출한다. 본 발명의 한 가지 장점은 이러한 접근법에 일반적으로 필요한 증폭 단계가 없다는 것이다.
본 발명의 방법은 또한 불법 화학 물질, 예를 들어 마약 또는 경찰 또는 방어를위한 기타 관심 물질을 탐지하는데 사용될 수 있다.
또한 농산물이나 식품 또는 환경에서 관심 물질, 특히 병원균을 검출 및/또는 정량화하는 데 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 모세관 작용 시험 장치의 다른 특징, 변형 및 장점은 본 발명을 제한하지 않고 예시의 목적으로 이하에 제공된 설명, 실시 예 및 도면을 읽으면 더 명확해질 것이다.
이하, "...와...사이", "...에서...까지의 범위" 및 "...에서...까지의 변화"는 동등하며, 달리 명시되지 않는 한 범위의 한계가 포함됨을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 표현 "하나를 포함하는"은 "적어도 하나를 포함하는"으로 이해되어야 한다.
광발광 무기 나노 입자
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 모세관 작용 시험 장치에서 프로브로서 특정 광학 및 물리 화학적 특성을 갖는 광발광 무기 나노 입자를 사용한다.
본 발명의 축광성(photoluminescent) 나노 입자는 희토류 이온으로 도핑된 결정질 매트릭스로부터 형성된다. 상기 "결정질 매트릭스"는 특정 원자가 "치환된 이온"이라고 하는 다른 원자로 대체되는 결정질 고체의 전형이다. 상기 치환된 이온은 결정질 매트릭스의 화학적 또는 물리적 특성을 개질하는 것을 가능하게 하며, 특히 나노 입자에 광학 방출 품질을 부여한다.
본 발명의 나노 입자에서 희토류 이온은 희토류 이온의 복합체 또는 킬레이트 형태가 아니며, 후자는 적합한 유기 리간드와 조합된 희토류 이온으로부터 형성된다(예를 들어 Yuan et al([36])의 실험에 설명되어 있음).
본 발명의 나노 입자는 동일한 성질 또는 상이한 성질의 희토류 이온으로 도핑될 수 있다.
특히 이들은 유로퓸(Eu), 디스프로슘(Dy), 사마륨(Sm), 프라세오디뮴(Pr), 네오디뮴(Nd), 에르븀(Er), 이테르븀(Yb), 세륨(Ce), 홀뮴(Ho ), 테르븀(Tb), 툴륨(Tm) 및 이들의 혼합물로부터 선택된 란탄족 이온(lanthanide ion)일 수 있다.
특히, 상기 란탄족 이온은 Eu, Dy, Sm, Pr, Nd, Er, Yb, Ho, Tm 및 이들의 혼합물, 특히 Eu, Dy, Sm, Yb, Er, Nd 및 이들의 혼합물, 특히 Eu, Dy, Sm 및 이들의 혼합물, 특히 Eu로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 모세관 작용 시험에서 프로브로 사용되는 발광(luminescent) 무기 나노 입자는보다 구체적으로 하기 화학식 (I)이다:
(A1-xLnx)a(MpOq) (I)
여기서:
- 결정질 화합물(crystalline compound)을 형성하기 위하여, M은 산소(O)와 결합할 수 있는 하나 이상의 원소를 나타내고;
- Ln은 하나 이상의 발광 란탄족 이온(lanthanide ion)에 해당하고;
- A는 전자 레벨이 발광 공정에 관여하지 않는 결정질 매트릭스의 일부를 형성하는 하나 이상의 이온에 해당하고;
- 0 < x < 1, 특히 0.1 ≤ x ≤ 0.9, 특히 0.2 ≤ x ≤ 0.6, 특히 0.2 ≤ x ≤ 0.4, 더욱 특히 x는 0.4의 값을 가지며; 및
- p, q 및 a의 값은 (A1- xLnx)a(MpOq)의 전기적 중립성(electrical neutrality)이 존중(respect)되도록 하고,
상기 방법은 1-광자 흡수 후, 상기 나노 입자의 방출 수명(emission lifetime)이 100ms보다 짧은 발광 검출, 즉 여기 파장(excitation wavelength)보다 더 큰 파장에서 발광 검출을 사용한다(employing).
보다 구체적으로 A는 이트륨(Y), 가돌리늄(Gd), 란타넘(La), 루테튬(Lu) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있으며; 특히 A는 Y, Gd 또는 La, 특히 Y 또는 Gd를 나타내고; 바람직하게 A는 Y를 나타낸다.
특히, 상기 화학식 (Ⅰ)에서 M은 V, P, W, Mo, As, Al, Hf, Zr, Ge, Ti, Sn 및 Mn에서 선택된 하나 이상의 원소를 나타낼 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 나노 입자의 결정질 매트릭스는 하나 이상의 유형의 음이온 MpOq를 포함할 수 있다.
바람직하게는, M은 V, P, Al, Hf, Zr, Ge, Ti, Sn 및 Mn으로부터 선택된 하나 이상의 원소를 나타낸다.
특히 M은 V1- yPy를 나타낼 수 있으며 y는 0에서 1까지이다. 보다 구체적으로 M은 V를 나타낼 수 있다.
특정 실시 예에 따르면, 전술한 화학식 (Ⅰ)의 p는 0과 다르다.
예를 들어, 본 발명의 나노 입자는 M이 V 및/또는 P를 나타내는 화학식 (Ⅰ)일 수 있고, p는 1의 값을 가지며, 따라서 상기 나노 입자의 매트릭스 Aa(MpOq)는 VO4 3- 및/또는 PO4 3- 음이온을 포함한다.
또 다른 특정 실시 예에 따르면, 본 발명의 나노 입자는 M이 Hf 또는 Zr, Ge, Ti, Sn, Mn을 나타내는 화학식 (Ⅰ)일 수 있고, p는 2의 값을 갖고 q는 7의 값을 갖으며, 따라서 상기 입자의 매트릭스는 AaHf2O7, AaZr2O7, AaGe2O7, AaTi2O7, AaSn2O7 or AaMn2O7이다. 특히, A는 La, Y, Gd 또는 Lu를 나타낼 수 있으며, 이 경우 a=2이다.
다른 실시 예에서, M은 Al을 나타내고, A는 Y 또는 Lu를 나타내고, p는 5의 값을 갖고 q는 12의 값을 가지며, 따라서 상기 나노 입자의 매트릭스 Aa(MpOq)는 가넷 Y3Al5O12(YAG) 또는 Lu3Al5O12(LuAG)이다.
다른 실시 예에서, p는 0의 값을 갖고 A는 Y 또는 Gd를 나타내고, 따라서 상기 나노 입자의 매트릭스 Aa(MpOq)는 Y2O3 또는 Gd2O3 유형이다.
따라서, 변형 실시 예에 따르면, 모세관 작용 시험에 사용되는 발광 무기 나노 입자는 화학식 Gd2O3 : Ln이고, 여기서 상기 정의된 바와 같이, Ln은 하나 이상의 발광 란탄족 이온을 나타내고, Ln 이온으로 나노 입자의 도핑 수준은 10 내지 90%, 특히 20 내지 60%, 특히 20 내지 40%, 더욱 특히 40%이다.
이 변형 실시 예의 맥락에서, 상기 발광은 250 nm 이하의 파장에서 상기 매트릭스의 여기에 의해 검출될 수 있다[51].
본 발명에 따른 나노 입자의 결정질 매트릭스, 특히 금속 산화물 매트릭스의 이온이 희토류 이온으로 치환되는 정도는 보다 구체적으로 10% 내지 90%, 특히 20 내지 60%일 수 있으며, 특히 20 ~ 40%, 특히 40%이다.
그러한 높은 수준의 도핑을 선택하는 것은 직관적이지 않았다. 사실, 일반적으로 희토류 이온으로 도핑된 발광 나노 입자의 일반적인 도핑 수준은 더 높은 농도에서 발생하는 "??칭(quenching)" 효과를 피하기 위해 10% 미만의 값으로 유지다([42]-[44]).
유리하게는, 본 발명에 따른 나노 입자의 불완전한 결정성(imperfect crystallinity)은 이하에서 더 상세히 설명되는 바와 같이 "??칭" 효과를 피할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 축광 나노 입자의 또 다른 특징에 따르면, 그들은 감지된 신호에 대응하는 단일 광자의 흡수 후에 발광을 할 수 있다.
더욱이, 본 발명의 나노 입자에 의한 발광 방출은 소위 지속적인 발광을 갖는 나노 입자([32])와는 대조적으로 "트랩" 상태를 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명의 나노 입자는 발광 방출 수명이 100ms 보다 짧고, 즉 100ms 이하이다([35], [39], [49]).
방출 수명은 방출 나노 입자의 여기 상태, 보다 구체적으로는 방출 희토류 이온의 수명으로 이해되어야 하며, 그리고 실제로 여기 중단 후 발광 방출 광자(luminescence emission photon)의 지속 시간 또는 여기 중단 후 발광 지수 붕괴의 특징적인 시간에 의해 결정된다.
발광 나노 입자의 방출 수명은 나노 입자의 광분해(photodegradation) 또는 광표백(photobleaching) 이전의 발광 방출 시간과 다르다.
본 발명에 따라 사용되는 나노 입자는보다 구체적으로 100ms 이하, 또는 심지어 10ms 이하, 또는 심지어 1ms 이하의 방출 수명을 갖는다.
유리하게는, 본 발명에 따라 사용되는 나노 입자는 5 μs 이상, 특히 10 μs 이상, 특히 20 μs 이상, 또는 50 μs 이상의 방출 수명을 갖는다. .
본 발명의 입자의 방출 수명(나노초 정도(the order of a nanosecond)의 일반적인 형광체 수명과 비교하여, Y1- xEuxVO4 입자의 경우 수백 μs)을 이용하는 것이 가능하고, 정교하지 않고 저렴한 재료를 사용하여 충분한 시간 분해능(10 μs 또는 100 μs 정도)으로 시간 분해 감지, 특히 방출 지연 감지를 수행할 수 있다. 예를 들어 여기에 사용할 수 있는 LED(Light Emitting Diode)의 전류를 변조하고 하나가 아닌 스트립의 일련의 이미지를 기록한 다음 신호를 시간 함수로 분석하여 짧은 수명(약 10ns 이하)의 잔류 기생 방출을 제거한다.
변형 실시 예에 따르면, 본 발명에 따라 사용되는 광발광 나노 입자는 하기 화학식 (Ⅱ)의 것일 수 있다:
A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II)
여기서:
- A는 이트륨(Y), 가돌리늄(Gd), 란타넘(La), 루테튬(Lu) 및 이들의 혼합물로부터 선택되고, 특히 A는 Y를 나타내고;
- Ln은 유로퓸(Eu), 디스프로슘(Dy), 사마륨(Sm), 네오디뮴(Nd), 에르븀(Er), 이테르븀(Yb), 툴륨(Tm), 프라세오디뮴(Pr), 홀뮴(Ho) 및 이들의 혼합물에서 선택되고, 바람직하게는 Ln은 Eu를 나타내고;
- 0 < x <1, 특히 0.2 ≤ x ≤ 0.6, 더욱 특히 x는 0.4의 값을 가지며; 및
- 0 ≤ y <1, 특히 y의 값은 0이고;
상기 방법은 1-광자 흡수 후 나노 입자의 방출 수명이 100ms 보다 짧은 발광 검출을 사용한다.
특정 실시 예에 따르면, 본 발명에 따라 사용되는 나노 입자는 y가 0의 값을 갖는 전술한 화학식(Ⅱ)에 해당한다. 즉, 나노 입자는 화학식 A1- xLnxVO4(III)일 수 있으며, 여기서 A, Ln 및 x는 위에서 정의한 바와 같다.
상기 화학식 (Ⅱ) 또는 (Ⅲ)에서 A는 보다 구체적으로 이트륨(Y), 가돌리늄(Gd), 란타늄(La) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 특히 A는 Y 또는 Gd를 나타낸다. 특정 실시 예에 따르면, 상기 화학식 (Ⅱ) 또는 (Ⅲ)에서 A는 이트륨(Y)을 나타낸다.
상기 화학식 (Ⅱ) 또는 (Ⅲ)에서 Ln은 특히 유로퓸(Eu), 디스프로슘(Dy), 사마륨(Sm), 이테르븀(Yb), 에르븀(Er), 네오디뮴(Nd) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 특히, Ln은 Eu, Dy, Sm 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 또 다른 특정 실시 예에 따르면, 전술 한 화학식 (Ⅱ) 또는 (Ⅲ)에서 Ln은 Eu를 나타낸다.
따라서, 변형 실시 예에 따르면, 본 발명에 따른 발광 프로브로 사용되는 나노 입자는 화학식 Y1- xEuxVO4 (IV)이고, 여기서 0 < x <1, 특히 0.2 ≤ x ≤ 0.6, 더욱 특히 x는 0.4의 값을 갖는다.
변형 실시 예에 따르면, 상응하는 전자 전이(electronic transition)가 허용되는 경우 희토류 이온의 직접 흡수(direct absorption)를 이용할 수 있다. 이러한 경우, 상기 직접 흡수는 일반적으로 산화물 매트릭스의 흡수보다 약하게 유지되더라도 해당 전자 전이가 금지된 경우보다 더 강하다. 이 경우에 적용되는 희토류 이온의 두 가지 예는 Eu2 + 및 Ce3 + 이온이다. 이러한 이온은 예를 들어 다음 무기 나노 입자의 구성 요소로 존재할 수 있다: Ce3 +의 경우 LaPO4 또는 YAG, Eu2 +의 경우 Sr2O4.
본 발명에 따라 사용되는 축광 나노 입자는 평균 크기가 5 nm 이상 1 μm 이하, 특히 10 nm 내지 500 nm, 바람직하게는 20 nm 내지 200 nm, 특히 20 nm 내지 100 nm일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라 사용되는 광발광 나노 입자는 많은 수의 희토류 이온을 함유하기에 충분한 부피를 가지며, 따라서 낮은 농도의 분석물을 검출할 수 있도록 충분한 발광 신호를 방출한다.
바람직하게는, 본 발명의 나노 입자는 103개 이상의 희토류 이온, 특히 1000 내지 6,000,000 희토류 이온, 특히 5000 내지 500,000, 더욱 특히 20,000 내지 1,000,000 희토류 이온을 포함한다.
예를 들어 직경이 30nm인 Y0. 6Eu0 . 4VO4 구형 나노 입자는 70,000 개의 Eu3 + 이온을 포함한다(Casanova et al. [37]에 따른 이온 수 계산 참조).
평균 크기는 투과 전자 현미경으로 측정할 수 있다. 투과 전자 현미경의 이미지를 통해 나노 입자의 모양(구형, 타원)을 결정하고 나노 입자의 평균 치수를 추론할 수 있다. 전체적으로 구형인 입자의 경우 평균 크기는 입자의 평균 직경을 의미한다. 타원형 입자의 경우 평균 크기는 타원체와 부피가 같은 구형의 평균 크기를 의미한다. 일반적으로 2D 투영인 투과 이미지에서 보이지 않는 타원체의 세 번째 축은 가장 작은 크기의 축과 길이가 같다고 가정한다.
특정 실시 예에 따르면, 본 발명의 나노 입자는 전체적으로 길쭉한(확장된) 타원형이다.
그들은 보다 구체적으로 20 내지 60 nm 사이의 a로 지정된 장축의 길이　; 및 10 내지 30 nm 사이의 b로 표시된 단축의 길이를 가질 수 있다. 특히, 본 발명의 나노 입자는 장축 길이의 평균값 a가 40 nm이고 단축 길이의 평균값 b가 20 nm일 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따라 사용되는 나노 입자는 낮은 다분산성(polydispersity)을 갖는다. 동적 광산란의 측정 값에서 추론할 수 있는 다분산 지수는 0.2 미만인 것이 바람직하다. 이것이 입자의 합성 또는 기능화의 마지막에 해당되지 않는 경우, 원심 분리 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 기술에 의해 크기를 분류함으로써 더 낮은 다 분산도를 얻을 수 있다.
특정 실시 예에 따르면, 희토류 이온, 예를 들어 유로퓸(Eu)으로 도핑의 수준 및 나노 입자에 의한 방출의 양자 효율의 곱의 생성물은 최대화된다.(the product of the level of doping with rare earth ions, for example with europium (Eu), times the quantum efficiency of the emission by the nanoparticle is maximized.)
Ln 이온을 사용한 도핑 x의 수준과 양자 효율의 곱의 생성물은 Ln 이온을 사용한 강력한 도핑(예를 들어 0.2 ~ 0.6, 특히 0.4)을 사용하여, 양자 효율을 감소시키지 않고, 특히 농도의 소멸로 이어지는(leading to an extinction of concentration) 도핑 이온 사이의 전달 과정(transfer processes)을 제한함으로써 최대화할 수 있다. 특히 높은 양자 효율을 유지하기 위해 나노 입자는 결정성이 불완전하다. 사실, 우수한 결정성은 특히 높은 수준의 도핑의 경우와 같이 토핑 이온들이 서로 가까이 있을 때, 도핑 이온 사이의 전달 과정을 촉진하며, 그리고 결과적으로 용매의 존재와 표면에 연결된 비복사 과정(nonradiative processes)에 의한 이온의 탈여기(deexcitation) 과정을 촉진한다. 특히, 실온 또는 적어도 600℃를 초과하지 않는 온도에서 합성하는 방법은 이러한 나노 입자에 요구되는 불완전한 결정도에 유리하다.
나노 입자의 결정성은 투과 전자 현미경 이미지에서 측정했을 때 적어도 하나의 주어진 결정학적 방향에서 X-선 회절 패턴에 의해 결정되는 간섭성 길이(coherence length)가 입자 크기의 80% 미만인 경우 "불완전"한 것으로 간주된다. 다결정성, 결함, 다공성 등(polycrystallinity, defects, porosity, etc) 다양한 유형의 불완전한 결정성을 고려할 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따라 사용되는 나노 입자는 각각 방출이 중단되기 전에 108개 이상의 광자, 특히 109개 이상의 광자, 또는 심지어 1010개 이상의 광자를 방출할 수 있다. 많은 경우, 특히 Eu로 도핑된 YVO4 또는 GdVO4 입자의 경우 연속 조명 하에서 방출의 중단(소멸)이 관찰되지 않는다. 즉, 유리하게는, 본 발명에 따른 나노 입자는 비가역적인 광분해 또는 광표백 현상을 나타내지 않는다.
유리하게는, 본 발명에 따라 사용된 나노 입자는 용액에서 우수한 콜로이드 안정성을 나타낸다.
용액 내 나노 입자의 안정성은 모세관 작용 테스트 장치에서 이러한 입자를 프로브로 사용하여 검출 결과의 재현성 측면에서 요구 사항을 충족하는 데 특히 중요하다.
특히, 나노 입자의 우수한 콜로이드 안정성은 모세관 작용 테스트의 다공성 지지체에서 액체 샘플의 이동 중에 감지 영역 및 선택적으로 장치의 제어 영역(control zone)까지, 해당되는 경우 분석할 물질에 결합된, 발광 나노 입자의 이동을 보장할 수 있게 한다.
"제타 전위"는 현탁액(suspension)의 안정성을 나타내는 요소 중 하나이다. 예를 들어 Malvern사의 Zetasizer Nano ZS 유형 장비를 사용하여 직접 측정할 수 있다. 이 장비는 광학 장치를 사용하여 입자에 적용된 전기장의 함수로서 입자의 변위 속도를 측정한다.
특히, 본 발명의 나노 입자는 유리하게는 합성 말기에 pH ≥ 5의 수성 매질에서 ξ로 지정된 제타 전위(-28 mV 이하)를 갖는다. 특히, 나노 입자는 pH ≥ 6.5, 특히 pH ≥ 7, 특히 pH ≥ 8의 수성 매질에서, -30 mV 이하의 수성 매질에서 제타 전위 ξ를 갖는다.
ξ로 표시된 "제타 전위"는 용액의 벌크와 입자의 전단면(shear plane) 사이에 존재하는 전위차로 정의할 수 있다. 이것은 서스펜션의 안정성을 나타낸다. 전 단면(또는 유체 역학적 반경)은 입자가 용액에서 이동할 때 용매가 입자와 함께 이동하는 입자 주위의 가상 구(imaginary sphere)에 해당한다. 제타 전위는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 전기장에서 가용화 층을 갖는 입자의 변위에 의해 결정될 수 있다.
pH ≥ 5에서 -28mV 이하인 나노 입자의 음의 제타 전위는 수용액에서 나노 입자의 정전 기적 반발 현상을 서로에 대해 증가시켜 응집 현상을 억제할 수 있다. 실제로, 높은 절대 값의 제타 전위, 특히 28mV 이상의 제타 전위는 일반적으로 낮은 이온 강도(low ionic strength)를 갖는 매질에서 응집 효과를 억제할 수 있다는 사실은 당업자에게 경험적으로 알려져 있다.
제타 전위의 측정은 입자의 수성 현탁액을 정제한 후에 수행되므로 이온 전도도가 100 μS.cm-1 미만인 수성 현탁액에 대해 수행됨을 이해해야 한다. 상기 현탁액에 존재하는 이온의 수준을 추정할 수 있는 현탁액의 이온 전도도는 알려진 전도도 측정기로 실온(25℃)에서 측정할 수 있다.
특정 실시 예에 따르면, 본 발명에 따라 사용되는 발광 나노 입자는 하나 이상의 표면 분자를 가질 수 있으며, 높은 제타 전위로 인해 이들을 현탁 상태로 유지하는 것을 촉진한다.
특정 실시 예에 따르면, 본 발명에 따라 사용되는 나노 입자는 표면에 테트라 알킬암모늄(tetraalkylammonium) 양이온을 포함할 수 있다.
이러한 종류의 나노 입자 및 이들의 합성 방법은 예를 들어 No. FR1754416에 출원된 출원에 설명되어 있다.
예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 축광 나노 입자는 화학식 Y0. 6Eu0 . 4VO4일 수 있으며, 그 표면에 테트라메틸암모늄 양이온이 선택적으로 고정된다.
본 발명에 따라 사용되는 나노 입자, 특히 전술한 화학식 (Ⅱ)의 나노 입자는 주로 결정질 및 다결정질(polycrystalline) 특성을 가지며, 특히 X- 선 회절에 의해 추론된 평균 크기가 3 내지 40nm이다.
나노 입자의 제조
본 발명에 따라 사용되는 희토류 이온으로 도핑된 결정질 매트릭스를 포함하는 광발광 나노 입자는 당업자에게 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해 제조될 수있다.
특히, 이들은 콜로이드 합성 경로에 의해 제조될 수 있다. 상기 수성 콜로이드 합성 방법은 당업자에게 친숙하다(Bouzigues et al., ACS Nano 5, 8488-8505 (2011) [49]). 수성 매질에서 이러한 합성은 후속 용매 이동 단계가 필요하지 않다는 장점이 있다.
예를 들어, 화학식 A1- xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II)의 나노 입자는 상기 원소 A 및 Ln의 전구체로부터 시작하여 그리고 오르토바나데이트 이온(VO4 3-) 및 선택적으로 포스페이트 이온(PO4 3-)의 전구체로부터 시작하여 수성 매질에서 공침 반응에 의해 형성될 수 있다.
원소 A 및 Ln의 전구체는 통상적으로 상기 원소의 염, 예를 들어 질산염, 염화물, 과염소산염 또는 아세테이트(nitrates, chlorides, perchlorates 또는 acetates), 특히 질산염의 형태일 수 있다. 원소 A 및 Ln의 전구체 및 이의 양은 물론 원하는 나노 입자의 성질을 고려하여 적합한 방식으로 선택된다.
예를 들어, 화학식 Y1- xEuxVO4 (IV) 의 나노 입자 합성은 이트륨 및 유로퓸의 전구체 화합물로서 질산 이트륨(Y(NO3)3) 및 질산 유로퓸(Eu(NO3)3)을 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 광발광 나노 입자에 대한 이러한 종류의 콜로이드 경로에 의한 합성 방법은 예를 들어 No. FR1754416에 출원된 출원에 기술되어 있다. 유리하게는, 출원 번호 FR1754416에 기재된 바와 같이, 공침 반응은 유효량의 테트라알킬암모늄 양이온의 존재하에 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 발광 나노 입자, 특히 수십 나노 미터보다 큰 더 큰 크기의 합성은 예를 들어 분쇄에 의해 당업자에게 공지된 임의의 다른 접근법에 의해 달성 될 수 있다.
발광 나노 입자의 표면 기능화
나노 입자를 결합 시약에 커플링
측면 유동 분석 장치에서 통상적으로 사용되는 프로브와 같이, 본 발명에 따라 사용되는 발광 나노 입자는 분석할 물질에 특이적인 적어도 하나의 결합 시약에 결합된다.
발광 프로브에 결합된 결합 시약의 기능 및 그에 따른 특성은 모세관 작용 테스트의 특성, 특히 아래에 설명된대로 사용되는 측면 흐름 분석의 특성, 특히 소위 "샌드위치"분석인지 "경쟁" 분석인지에 따라 달라진다.
따라서, "결합 시약"은 "샌드위치"유형의 분석과 관련하여 확인해야 하는 관심있는 생물학적 또는 화학적 물질 또는 "경쟁" 분석의 맥락에서 식별이 필요한 관심있는 생물학적 또는 화학적 물질과 경쟁하는 검출 영역의 포획 시약에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 화학적, 생화학 적 또는 생물학적 화합물을 의미한다. 이하에 설명된 바와 같이, 상기 결합 시약은 또한 측방 유동 분석을 위한 장치의 제어 영역에 고정된 제2포획 시약(capturing reagent)에 특이적으로 결합할 수 있다.
"결합하다" 또는 "결합"은 공유 결합과 같은 임의의 강한 결합 또는 바람직하게는 예를 들어 항원/항체 유형의 약한 결합의 집합을 의미한다.
본 발명에 따른 프로브로서 사용되는 발광 나노 입자에 결합된 결합 시약의 특성은 물론 샘플에서 분석될 물질을 고려하여 선택된다.
유리하게는, 본 발명에 따라 사용되는 광발광 나노 입자는 매우 다양한 생물학적 표적화에 완벽하게 적합하며, 특정 결과는 나노 입자 표면에 접목된 결합 시약 또는 시약의 특성에 따라 달라진다.
결합 시약은 보다 구체적으로 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 항체 단편, 나노 바디, 항원, 올리고 뉴클레오티드, 펩티드, 호르몬, 리간드, 사이토 카인, 펩티드 모방제(peptidomimetic), 단백질, 탄수화물, 알려진 세포 표면 단백질을 표적으로하는 화학적으로 변형된 단백질, 화학적으로 변형된 핵산, 화학적으로 변형된 탄수화물, 압타머, 단백질 및 DNA/RNA의 어셈블리 또는 HaloTag 유형의 라벨링에 사용되는 클로로알칸으로부터 선택될 수 있다. SNAP-Tag 또는 CLIP-Tag 유형의 접근 방식도 사용할 수 있다.
특정 실시 예에 따르면, 이것은 항체 또는 항체 단편, 펩티드, 화학적으로 변형된 핵산 또는 압타머, 특히 항체이다.
적합한 항체 단편은 면역 글로불린의 하나 이상의 가변 도메인, 예컨대 단순 가변 도메인 Fv, scFv, Fab, (Fab')2 및 기타 단백질 분해 단편 또는 "나노 바디"(낙타과의 항체에서 얻은 VHH 단편 또는 연골 어류의 항체에서 얻은 VNAR과 같은 단일 도메인을 가진 항체)를 포함한다.
본 발명에 따른 용어 "항체"는 키메라 항체, 인간 또는 인간화 항체, 재조합 및 변형 항체, 접합 항체 및 이의 단편을 포함한다.
결합 시약은 또한 세포 표면 수용체에 결합하는 것으로 알려진 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 표적화 단편은 저밀도 지질단백질, 트랜스페린, EGF, 인슐린, PDGF, 섬유소 용해 효소(fibrinolytic enzymes), 항-HER2, 항-HER3, 항-HER4, 아넥신, 인터루킨, 인터페론, 에리트로포이에틴 또는 콜로니 자극 인자로부터 유래될 수 있다.
입자를 결합 시약에 커플링
하나 이상의 결합 시약에 결합된 입자를 적절하게 제조하기 위해 커플링/그 래프팅의 적절한 방법을 사용하는 것은 당업자에게 달려있다. 발광 나노 입자의 표면 기능화에 사용되는 결합 시약(들)의 양은 입자의 양을 고려하여 조정된다.
일반적으로, 각 나노 입자가 여러 결합 시약, 바람직하게는 적어도 5개의 결합 시약, 더 바람직하게는 적어도 10개의 결합 시약에 결합되는 것이 바람직하다.
결합 시약은 직접 또는 스페이서("링커"라고도 함)를 통해 나노 입자에 이식될 수 있다.
입자를 생체 분자에 결합(이식이라고도 함)하는 방법은 당업자에게 친숙하다. 일반적으로 공유 결합, 표면 복합화, 정전기 상호 작용, 캡슐화 또는 흡착에 의해 결합된다.
공유 결합에 의한 커플링의 경우를 포함하여 특정 경우에, 입자는 공유 결합을 형성하기 위해 결합 시약에 의해 운반되는 다른 화학기와 반응할 수 있는 화학 기로 미리 기능화될 수 있다.
나노 입자의 표면에 존재할 수 있는 화학기의 예로 카르복실기, 아미노기, 티올 기, 알데히드기 및 에폭시기를 언급할 수 있다.
아미노기는 아미노트리에톡시실란(APTES)과 같은 아미노 유기 실란과 같은 분자에 의해 공급될 수 있다. APTES의 장점은 공유 결합을 통해 나노 입자 주위에 캡슐을 형성한다는 것이다. 따라서 APTES에 의해 공급되는 아민은 시간이 지남에 따라 매우 안정적이다. 아미노기는 숙신산 무수물과의 반응에 의해 카르복실기로 변형될 수 있다.
카르복실기는 구연산 또는 폴리아크릴산(PAA)과 같은 분자에 의해 공급될 수 있다.
카르복실기는 당업자에게 알려진 임의의 기술, 특히 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시숙신이미드(NHS)와의 반응에 의해 활성화될 수 있으며, 아민은 결합 시약이 단백질 또는 항체일 때 폴리펩티드의 표면에서 기능하고 공유 아미드 결합을 형성한다.
APTES를 사용한 나노 입자의 기능화는 나노 입자를 실리카 층으로 코팅한 후에 유리하게 수행될 수 있다.
다른 경우에, 입자는 결합 시약에 대한 후속 결합을 허용할 수 있는 분자에 미리 결합될 수 있다.
예를 들어, 상기 입자는 스트렙타비딘에 결합될 수 있으며, 이는 비오틴화된 표적 화제에 결합을 허용한다.
예를 들어, 출원 번호 FR1754416은 스트렙타비딘에 결합된 나노 입자를 비오틴화된 항체에 결합함으로써 비오티닐화된 항체에 대한 나노 입자의 결합을 설명한다. 또한 상기 언급된 바와 같이 APTES로 기능화된 나노 입자에 항체를 직접 결합하여 수행할 수 있다(아미노 그룹을 카르복실 그룹으로 변환, 카르복실 그룹의 활성화 및 항체 표면의 아미노 그룹과 직접 반응).
나노 입자 표면상의 결합 시약의 커플링은 또한 당업자에게 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
이는 또한 나노 입자를 실리카 층으로 코팅한 다음 APTES로 코팅하는 반응에 의해 유리하게 영향을 받을 수 있으며, 그 후 아민 기능은 2개의 NHS 기능을 포함하는 이작용성 스페이서 제제와 반응하는 역할을 한다. 다음으로, 이작용성 스페이서 에이전트(bifunctional spacer agent)에 결합된 나노 입자는 단백질(항체, 스트렙타비딘 등) 표면의 아민 기능과 반응할 수 있다. 이러한 유형의 결합 방법은 특히 Casanova et al([38])과 Giaume et al([39])의 논문에 설명되어 있다.
이동 에이전트(Migration agent)
전하와 표면의 특성, 모양과 크기에 따라, 본 발명의 발광 나노 입자는 이하 "이동제(migration agent)"라 불리는 제제로 코팅될 수 있으며, 이는 예를 들어 니트로셀룰로스 막 내에서 모세관 작용 테스트 장치 내에서의 이동을 용이하게 한다.
당업자는 하나 이상의 이동제를 사용하여 적절하게 나노 입자를 기능화할 수 있다. 특히, 이 이동제는 상기 기술된 결합 시약에 대한 나노 입자의 커플링을 방해해서는 안되며, 특히 분석물 또는 분석물과 경쟁하는 포획 시약에 특이적으로 결합하는 후자의 능력을 방해하지 않아야 함을 이해해야 한다.
이동제는 특히 스텔스제(stealth agent) 또는 부동태화제(passivating agent)로부터 선택될 수 있다.
이러한 제제는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO) 사슬, 특히 실란화된; PEO-폴리(프로필렌 옥사이드)-PEO; 폴리(L-라이신) 사슬로 접목된(grafted) 폴리(에틸렌 옥사이드) 사슬("poly(L-lysine)-grafted-Poly(Ethylene Glycol)" (PLL-g-PEG)); 폴리(L-라이신)으로 접목된 덱스트란 사슬; 폴리(p-자일릴렌)(파릴렌); 폴록 사머(중앙 부분이 프로필렌 옥사이드 블록이고 끝이 폴리에틸렌 옥사이드 블록인 트리블록 공중합체, 예를 들어, 회사 BASF에서 Pluronic®이라는 이름으로 판매하는 것); 폴록사민; 폴리소르베이트 및 다당류(예를 들어 키토산, 덱스트란, 히알루론산 및 헤파린), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리락트산(PLA), 폴리글루탐산(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴레이트(HPMA) 공중합체 및 폴리아미노산; 음이온 계면 활성제; 양이온 계면 활성제; 비이온성 계면 활성제 및 양쪽성 계면 활성제(zwitterionic detergents)일 수 있다.
바람직하게는, 이동제는 실란화된 PEG 사슬, 폴록사머 및 폴리락트산(PLA)에서 선택된다. 이들 제제는 당업자에게 공지된 임의의 접근법에 의해 나노 입자의 표면 상에 증착될 수 있다. 예를 들어, 이들은 그 위에 흡착되거나 공유 결합될 수 있다.
나노 입자와 하나 이상의 이동제를 결합하는 것은 예를 들어, 결합 시약의 아미노기에 대한 반응에 의해 나노 입자에 결합 시약이 결합될 때 아미노기를 함유하는 이동제를 선택함으로써 결합 시약 또는 시약의 결합과 동시에 영향을 받을 수 있다. 이 경우, 이동제의 양은 결합 시약의 양에 비례하여 조정되어야 하므로 나노 입자는 표면에 충분한 수의 이동제와 결합 시약을 모두 포함한다.
모세관 작용 테스트 장치(CAPILLARY ACTION TEST DEVICE)
전술한 바와 같이, 상기 정의된 바와 같은 광발광 나노 입자는 본 발명에 따라 모세관 작용 시험, 예를 들어 "측방 유동" 분석에서 프로브로서 사용된다.
용어 "측방 유동"은 모든 용해되거나 분산된 화합물이 확산 수단을 통해 측 방향으로, 바람직하게는 등가 속도 및 규칙적인 유량으로 모세관에 의해 수송되는 액체 유동을 지칭한다.
본 발명의 방법은 예를 들어 금 나노 입자 유형의 프로브에 대해 알려진 임의의 통상적인 모세관 작용 테스트 장치로 구현될 수 있다. 모세관 작용 테스트 장치는 특히 모든 구성을 가정할 수 있다. 따라서 선형, 방사형, T-형, L-형, 십자형 구성 등을 가질 수 있다.
이하, 이동 스트립 유형의 측면 유동 분석을위한 장치에 관한 첨부된 도 1 내지 3 및 5를 보다 구체적으로 참조한다.
더욱이, 본 발명에 따라 사용되는 장치는 "샌드위치" 유형의 분석 또는 대안적으로 이하에 상세히 설명되는 "경쟁" 분석에 적합할 수 있다.
전형적으로, 도 1에 도시된 바와 같이, 모세관 작용 테스트 장치, 특히 본 발명에 따른 측면 유동 분석을 위한 장치는 기준 방향(X)에서 모세관 작용을 위한 수단, 특히 다공성 고체 지지체(10)를 포함하고　: 이는
- 액체 샘플 및 선택적으로 희석제(diluent)의 증착을 위한 영역(1);
- 분석될 물질과 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 시약에 결합된 본 발명에 따른 광발광 무기 나노 입자(프로브)가 로딩된 "라벨링 영역"이라고 불리는 증착 영역의 하류에 배치된 영역(2);
- 분석될 물질에 특정한 하나 이상의 포획 시약이 고정되는, 라벨링 영역(2)의 하류에 배치된 "검출 영역"이라고도 하는 반응 영역(3)　;
- 상기 검출 영역(3)의 하류에 위치하고, 분석물과 특이적으로 결합하는 시약에 특이적인 하나 이상의 제2포획 시약이 고정되는 제어 영역(4)을 포함한다.
"샌드위치" 분석에서, 검출 영역으로부터 분석물을 특이적으로 포획하는 시약 및 프로브에 결합된 결합 시약은 예를 들어 분석물의 2개의 상이한 에피토프 부위에서 분석물에 각각 그리고 특이적으로 결합하기 위해 선택된다.
"경쟁" 분석에서, 상기 프로브에 결합된 결합 시약은 분석 물질과 동일하거나 유사하며, 검출 영역의 포획 시약에 결합하기 위해 분석 물질과 경쟁한다.
이동 제어 영역(4)은 시료의 적어도 일부가 분석 장치의 다공성 고체 지지체를 제대로 통과했음을 사용자에게 나타낸다.
측면 유동 분석을 위한 장치는 일반적으로 흡수 패드(5)를 추가로 포함하고, 반응 영역 및 제어 영역의 하류에 배치되며, 한쪽 끝이 다공성 지지체와 유체 접촉한다. 상기 흡수 패드는 모세관에 의한 이동을 유지하고 과도한 액체 샘플을 수용한다.
용어 "상류" 및 "하류"는 분석에서 모세관 흐름의 방향(X)을 나타내며, 이 이동은 증착 영역(1)(상류 기능 말단)에서 검출 영역(3)으로 발행하고 그리고 흡수 패드(5)의 수준(하류 기능 말달)에서 후자가 존재할 때 끝난다.
측면 유동 분석을 위한 장치의 다공성 고체 지지체의 각 다른 영역은 인접한 영역 또는 영역과 유체 연통한다.
두 구성 요소 사이의 "유체 접촉"은 모세관 작용 시험을 위한 장치의 일반적인 경우와 같이 두 구성 요소가 물리적으로 접촉하여 첫 번째 요소에서 두 번째 요소로 액체가 이동할 수 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 이 접촉은 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이 하나의 구성 요소가 다른 구성 요소와 겹침으로써 제공된다.
"모세관 작용을 위한 수단"은 보다 구체적으로 간단한 모세관 작용에 의해 액체의 이동을 허용하는 다공성 고체 지지체(10)를 의미한다. 이 지지체의 다공성은 액체 또는 습식 상태에서 샘플 및/또는 시약의 모세관 흐름(또는 측면 이동)을 허용한다. 다공성 지지체는 알려진 측면 유동 분석 장치에서 이미 사용된 지지체에서 선택 될 수 있다. 예를 들어, 니트로셀룰로오스, 폴리에스테르, 유리 섬유, 셀룰로오스 섬유, 폴리에테르설폰(PES), 셀룰로오스 에스테르, PVDF 등으로 구성될 수 있다.
모세관 작용을 위한 수단은 하나 이상의 개별 부품으로 구성될 수 있으며 지지체의 다른 부분은 다른 재료로 구성될 수 있다. 모세관 작용 수단이 다른 부분이나 다른 재료로 구성될 때, 이러한 요소는 모세관 작용 수단에서 모세관 흐름의 연속성을 허용하도록 배치된다.
일반적으로 모세관 작용을 위한 수단은 모세관 작용 방향(X)으로 길쭉한 다공성 고체 지지체로 구성된다.
유리하게는, 밴드 또는 스트립 형태의 다공성 지지체(10)이다. 특히, 여러 개의 중첩되거나 겹치는 막으로 구성된 면역 크로마토 그래피 스트립일 수 있다.
특정 실시 예에 따르면, 다공성 지지체는 니트로셀룰로스 멤브레인이다.
니트로셀룰로오스 멤브레인의 예로서 멤ㅂ레인 MilliporeTM HF240, MilliporeTM HF180, MilliporeTM HF135, MilliporeTM HF120, MilliporeTM HF090, MilliporeTM HF075, SartoriusTM CN140, SartoriusTM CN150, FF120 HP membranes(GE), FF80HP membranes(GE), AE membranes(GE), Immunopore membranes(GE)이 있다.
측면 유동 분석을 위한 장치의 다공성 고체 지지체의 크기는 다를 수 있다. 예를 들어, 길이가 30 ~ 200mm, 바람직하게는 60 ~ 100mm, 폭이 2 ~ 10mm, 바람직하게는 4 ~ 5mm인 밴드일 수 있다.
본 발명에 따른 측방 유동 분석용 장치는 예를 들어 강성 지지체(6)에 고정된 크로마토 그래피 스트립으로 구성될 수 있다.
상기 강성 지지체(6)는 보드, 플라스틱 코팅된 보드 또는 더 바람직하게는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 단단한 지지체는 폴리스티렌으로 만들어진다.
유리하게는, 특정 물질은 모세관 작용 수단의 각 영역에 대응한다.
샘플의 증착 영역(1)(영어 용어로 "샘플 패드"라고도 함)은 유리하게는 흡수성 다공성 재료로 형성될 수 있다. 사실, 모세관 작용 수단의 침착 영역은 액체 샘플을 수용하기 위한 것으로, 예를 들어 소변 또는 혈액 샘플 스트림과 접촉하게 된다. 이 물질은 당업자에게 공지된 적합한 흡수제로부터 선택되고 이미 통상적인 측면 흐름 분석에 사용된다.
전술한 바와 같은 무기 광발광 나노 입자(7)는 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이 모세관 작용 수단의 라벨링 영역(2)(영어 용어로 "접합 패드(Conjugate Pad)"라고도 함) 수준에서 사용된다.
위에서 언급한 바와 같이, 이러한 나노 입자(7)는 분석할 물질과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 시약과 결합된다.
"샌드위치" 분석의 맥락에서, 결합 시약은 측방 유동 분석 동안 분석물에 특이 적으로 결합할 수 있다. 예를 들어 분석물의 특정 항체일 수 있다.
통상적인 "경쟁" 분석의 맥락에서, 결합 시약은 분석 물질과 경쟁하면서 검출 영역(3)의 포획 시약에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서 결합 시약은 예를 들어 분석물 자체 또는 적합한 유사체일 수 있다. "적합한 아날로그(Suitable analog)"는 분석물을 특이적으로 포획하는 시약에 특이 적으로 결합하는 아날로그를 의미한다.
발광 프로브에 결합된 결합 시약은 또한 제어 영역에 고정된 제2포획 시약(9)에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직하게는, 상기 언급된 바와 같이, 발광 나노 입자는 추가적으로, 스텔스 제 또는 부동태화제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 측면 유동 분석을 위한 장치에서의 이동을 촉진하도록 의도된 적어도 하나의 제제를 표면에 포함한다. 따라서 이러한 제제는 적용 가능한 경우 결합 시약을 통해 결합된 나노 입자의 분석물, 예를 들어 니트로셀룰로스 막의 다공성 지지체에서 검출 영역(3)까지의 이동을 촉진한다.
분석물과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 시약에 결합 된 무기 광발광 나노 입자는 모세관 작용 수단에서 건조 상태로 고정되지만 젖었을 때 모세관 작용에 의해 자유롭게 이동한다.
따라서, 분석 중에 모세관 작용 수단을 통해 모세관 작용에 의해 이동하는 샘플은 분석할 물질을 특이적으로 결합하는 시약에 결합된 나노 입자를 동반한다.
분석할 물질에 특정한 제1포획 시약은 본 발명에 따른 측방 유동 분석을위한 장치의 모세관 작용 수단의 감지 영역(3) (영어 용어로 "검출 패드"라고도 함) 수준에서 고정된다. 그것은 상기 분석물에 특이적으로 결합하는 능력에 적합한 방식으로 선택된다.
"샌드위치" 분석(도 2)의 맥락에서, 검출 영역의 포획 시약은 광발광 나노 입자에 대한 커플링을 위해 전술한 결합 시약과 동일한 성질을 가질 수 있다. 예를 들어 분석할 물질에 대해 강한 친화성을 갖는 항체(8)일 수 있다.
"경쟁" 분석의 맥락에서, 포획 시약은 (예를 들어, 분석물과 동일하거나 유사한) 발광 프로브에 결합된 결합 시약에도 결합 할 수 있다.
상기 분석물(11) 및 포획 시약(8)은 일반적으로 리간드/수용체, 항원/항체, DNA/RNA, DNA/DNA 또는 DNA/단백질 쌍을 형성한다.
따라서 분석물이 항원 또는 합텐인 경우 포획 시약은 예를 들어 분석물의 특정 항체이거나 분석물이 항체인 경우 포획 시약은 항체가 인식하는 항원이거나 분석물을 특이적으로 인식하는 항체이다. 분석물이 핵산인 경우 포획 시약은 예를 들어 상보적 DNA 프로브이다.
상기 포획 시약은 젖었을 때 이동하지 않는 방식으로 감지 영역 수준에 침착 및 고정된다. 이러한 고정화는 당업자에게 공지된 기술에 의해, 예를 들어 니트로 셀룰로스 또는 전하 개질 나일론의 경우 정전기 상호 작용에 의해 또는 폴리(비닐리덴 플루오라이드)(PVDF) 또는 폴리에테르설폰(PES)의 막의 경우 소수성 상호 작용에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시 예에 따르면, 상기 검출 영역(3)은 예를 들어, 하나 이상의 포획 시약으로 기능화된 밴드(하나 이상의 테스트 라인 "T") 형태로 모세관 작용을 위한 수단상에서 공간적으로 분리된 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다. 여러 개의 "테스트 라인"을 사용하는 것은 다중 검출을 위한 분석, 즉 하나의 동일한 샘플에서 여러 물질을 동시에 검출하는 경우 특히 흥미롭다.
모세관 작용 테스트 장치는 일반적으로 분석의 유효성을 확인하는데 사용되는 검출 영역(3)의 하류에 위치한 제어 영역(4)을 포함하며, 여기서 프로브에 결합된 결합 시약에 특이적인 하나 이상의 제2포획제(9)가 고정된다.
이 제2포획제는 프로브에 접합된 결합 시약에 특이적으로 결합하는 능력에 대해 적절하게 선택된다. 예를 들어 "샌드위치" 유형의 분석과 관련하여 분석물과 특이적으로 결합하는 시약으로 사용되는 항체의 2차 항체 또는 항체의 특정 항원일 수 있다.
검출 영역(3)의 제1포획 시약과 마찬가지로, 이 제2포획 시약은 젖었을 때 이동하지 않는 방식으로 제어 영역(4)의 수준에서 고정된다.
모세관 작용을 위한 수단은 일반적으로 플라스틱으로 만들어진 플레이트 또는 카세트와 같은 고체 지지체(6)에 선택적으로 고정될 수 있다.
본 발명에 따른 모세관 작용 시험 장치는 특히 시험 스트립이 배치된 케이스(12)를 포함할 수 있으며, 상기 케이스는 도 8에 개략적으로 도시된 바와 같이 제공된 특정 개구부(opening)의 수준을 제외하고는 바람직하게는 폐쇄된다. 특히, 개구부(14)는 샘플 증착을 위해 영역 위에 제공된다. 판독 창(reading window)(13)을 구성하는 또 다른 개구부는 예를 들어 검출 영역(3) 및 선택적 제어 영역(4)의 레벨에 제공될 수 있다. 대안적으로, 검출 영역 및 제어 영역을 각각 관찰하기 위해 두 개의 창이 제공될 수 있다.
대안적으로, 이러한 영역을 보이게 하기 위해 케이스는 투명하거나 하나 이상의 투명 부품이 제공될 수 있다.
물론, 종래의 모세관 작용 시험 장치로 알려진 장치의 다양한 구성이 사용될 수 있다. 예를 들어, 검사 스트립을 포함하는 케이스는 윗면 수준에서 하나 이상의 중공 릴리프를 포함할 수 있으며, 그 베이스는 스트립의 표면에 놓여 액체 샘플을 증착하기 위한 웰 또는 공간을 형성한다.
본 발명의 방법에 따른 모세관 작용 테스트 절차는 보다 구체적으로 다음을 포함한다:
(i) 분석할 액체 샘플 및 선택적으로 희석제(diluent)를 모세관 작용 테스트 장치의 증착 영역(1) 수준에 적용하는 단계;
(ii) 광발광 나노 입자에 의해 생성된 발광이 반응 영역(3)에서 검출될 때까지 및/또는 발광이 이동 제어 영역(4)에서 검출될 때까지 장치를 인큐베이션하는 단계; 및
(iii) 결과를 판독하고 및 해석하는 단계.
분석할 액체 샘플은 장치의 모세관 작용을 위한 수단의 증착 영역(1)에 직접 증착될 수 있다.
"액체 샘플"은 분석할 물질이 용액 또는 현탁액에 포함된 모든 샘플을 의미한다.
이 액체 샘플은 특히 생물학적 유체 또는 체액일 수 있다. 액체 샘플은 또한 생물학적 유체 또는 체액에서 확보했을 수 있다. 또한 고체 시료에서 추출한 액체일 수도 있다.
일반적으로 액체 샘플은 소변, 전혈, 혈장, 혈청, 희석된 대변이다.
특정 실시 양태에 따르면, 특히 액체 샘플이 예를 들어 혈장, 혈청, 전혈, 비강 또는 질 도말 또는 객담인 경우, 분석할 샘플과 함께 희석제가 사용된다. 상기 희석제는 장치의 증착 영역 수준에서 증착된다.
샘플을 증착하기 전에 분석할 샘플과 혼합될 수 있다. 대안으로, 희석제는 샘플 전 또는 후에 증착될 수 있다. 이 희석제는 다공성 지지체에서 이동하여 샘플과 결합 시약에 연결된 프로브를 동반한다. 일반적으로이 희석제는 완충 식염수를 포함한다. 또한 반응에 필요한 계면활성제 또는 기타 성분을 포함할 수 있다.
그 다음 모세관 작용 시험 장치는 증착 영역(deposition zone)에서 제어 영역(control zone)으로 모세관 작용에 의해 액체 샘플이 이동하기에 충분한 시간 동안 배양된다.
보다 구체적으로, 도 2에 개략적으로 표시된 "샌드위치" 유형의 측면 유동 분석은 다음과 같이 진행된다.
다공성 지지체가 분석 물(11)을 포함하는 액체 샘플과 접촉하면, 후자는 프로브(7)에 결합된 분석물에 특이적으로 결합하는 시약이 있는 라벨링 영역까지 이 지지체에서 모세관 작용에 의해 이동한다. 따라서 분석물(11)은 결합 시약에 의해 발광 프로브(7)에 결합한다.
분석할 물질이 존재하는 경우 후자는 감지 영역 수준에 고정된 제1포획 시약(8)에 의해 모세관 작용 테스트 장치의 감지 영역(3) 수준에서 고정된다. 따라서 이것은 감지 영역 수준에서 발광 프로브(3)의 고정화로 이어질 것이다.
따라서 샘플에서 분석할 물질의 유무는 검출 영역 수준에서 발광 프로브(3)를 검출하여 측정된다. 보다 구체적으로, 검출 영역 수준에서 검출된 발광은 특히 시료 내 분석 물질의 농도에 비례하여 증가한다.
초과 프로브, 즉 분석물과 반응하지 않은 결합 시약에 결합된 나노 입자는 제어 영역으로 이동한다. 이 제어 영역에서 결합 시약은 제2포획제(9)에 결합하여 제어 영역(4) 수준에서 과도하게 프로브를 고정시킨다. 따라서 사용자는 자신의 처분에 따라 샘플 및 장치의 시약 이동을 확인하고 테스트의 적절한 작동을 확인할 수 있는 포지티브 컨트롤을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법의 또 다른 변형에 따르면, 사용되는 분석은 "경쟁 분석" 유형이다. 경쟁 분석의 맥락에서, 도 3-a에 개략적으로 표시된 것처럼 샘플에 분석 물질이 없는 경우 발광 프로브는 검출 영역의 포획 시약에 결합 시약을 결합하여 검출 영역 수준에서 고정된다. 그러나 분석물이 존재하는 경우 후자는 발광 프로브의 결합 시약과 경쟁하여 검출 영역의 포획 시약에 고정된다.
따라서 경쟁 분석의 맥락에서 검출 영역 수준에서 검출된 발광은 특히 시료의 분석 물질 농도에 반비례한다.
도 3-b에 표시된 "경쟁" 유형의 분석의 또 다른 변형에 따르면, 분석물은 이미 검출 영역의 포획 부위 수준에 고정되어 있고, 반면 라벨링 영역의 발광 나노 입자에 결합된 결합 시약은 "샌드위치" 분석에서와 같이 분석 물에 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 샘플에 분석물이 포함되어 있는 경우 후자는 샌드위치 분석에서와 같이 결합 시약을 통해 발광 나노 입자에 고정되므로 검출 영역 수준에서 결합할 수 없다. 그러나 분석물과 반응하지 않은 결합 시약에 결합된 프로브는 검출 영역의 포획 시약 수준에서 고정된 분석물을 통해 검출 영역에 결합할 수 있다. 다시 한 번, 검출 영역 수준에서 검출된 발광 신호는 특히 샘플의 분석 물질 농도에 반비례하여 감소할 것이다.
앞서 언급한 모세관 작용 시험의 변형 중 하나 또는 다른 것에 따르면, 결과는 분석이 끝날 때 모세관 작용 테스트 장치 수준에서 고정된, 특히 검출 영역(3) 수준 및 선택적으로 제어 영역(4) 수준에서 시료의 이동이 끝날 때 고정된 나노 입자에 의해 생성된 발광을 감지하여 판독된다.
물론, 본 발명은 첨부된 도면에 개략적으로 도시된 바와 같이 모세관 작용 시험 장치의 구현에 어떤식으로든 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 방법을 구현하기 위한 모세관 작용 시험 장치의 다른 변형은 본 발명의 광발광 나노 입자를 검출 프로브로서 사용하기에 적합하다면 고려될 수 있다. 예를 들어, "Dipstick Lateral Flow" 유형 또는 "Vertical Lateral Flow"유형 등의 모세관 작용 테스트를 위한 장치일 수 있다.
변형 실시 예에 따르면, 단일 분석(소위 "다중" 검출)으로 샘플의 여러 물질을 검출할 수 있다.
예를 들어, "샌드위치" 분석의 맥락에서, 반응 영역 (3) 수준에서, 개별 영역 수준 (예를 들어 여러 테스트 라인 "T")에서 분석할 각 물질에 특정한 여러 포획 시약을 고정할 수 있다. 이 경우, 검출 프로브 역할을 하는 나노 입자는 분석하고자 하는 각 물질에 특유한 2종 이상의 포획 시약과 결합될 수 있다. 다른 분석물이 있는 경우 프로브는 각 분석물에 특정한 포획 시약을 포함하는 개별 영역 각각에 고정된다. 각 반응 영역에서 발광 신호의 존재 및 값은 해당 분석 물의 존재 및 농도에 해당한다. 이 경우 공간 다중화이다.
대안적으로, 라벨링 영역(2)의 수준에서 다른 방출 파장에서 방출하는 다른 란탄족 이온으로 도핑된 다양한 프로브를 사용할 수도 있으며, 각각의 프로브는 분석할 각 물질에 특정한 결합 시약과 결합되고 단일 반응 영역(3) 수준에서 분석할 각 물질에 특정한 여러 포획 시약에 결합된다. 이 경우 여러 방출 색상을 사용하여 다중화된다. 이 경우, UV에서 결정질 매트릭스의 여기는 동일한 여기 파장으로 다른 파장에서 방출되는 다른 란탄족 이온을 여기할 수 있기 때문에 특히 유리하다.
공간 멀티플렉싱과 여러 방출 색상을 사용한 멀티플렉싱, 두가지 접근 방식을 결합하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 2개의 다른 방출 색상을 가진 2개의 프로브로 4개의 분석물 검출 방법으로, 각각은 분석할 4개의 물질 중 2개에 특이적인 2개 유형의 시약 및 2개의 반응 영역에 결합하고, 각각은 분석할 4가지 물질 중 2개의 특이적 결합 시약을 포함한다. 따라서 제1반응 영역에서 두 가지 다른 색상의 신호는 처음 두 분석물의 존재와 농도를 나타낸다　; 제2반응 영역에서 두 가지 다른 색상의 신호는 다른 두 분석 물의 존재와 농도를 나타낸다.
광도의 검출(DETECTION OF THE LUMINESCENCE)
통상적인 모세관 작용 시험과 마찬가지로, 본 발명의 방법에 따라 수행되는 시험(검출 및/또는 정량화)의 평가는 검출 영역 및 선택적으로 제어 영역을 관찰함으로써 수행된다.
보다 정확하게는, 검출 영역 및/또는 제어 영역, 바람직하게는 검출 영역 및 제어 영역 레벨에서 고정된 프로브에 의해 생성된 발광을 검출함으로써 분석 결과를 판독한다.
검출 장치
본 발명에 따른 모세관 작용 시험 장치의 검출 및 제어 영역의 관찰은 특히 광발광 나노 입자의 여기 단계 (i) 및 발광 방출 검출 단계 (ii)를 사용한다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 다음을 포함하는 시험관내 진단 키트에 관한 것이다:
- 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 모세관 작용 시험 장치; 및
- 검출 영역 수준 및 선택적으로 장치의 제어 영역 수준에서 고정된 프로브에 의해 생성된 발광을 검출하기 위한 장치.
여기 소스를 포함하는 조명 장치를 포함하는 간단한 검출 설정은 발광 프로브의 존재를 관찰할 수 있도록 한다.
여기는 나노 입자의 흡광도 특성과 호환되어야 한다. 상기 여기는 UV, 가시 광선 또는 근적외선에서 발생할 수 있다.
램프, 발광 다이오드 또는 레이저와 같은 비간섭 여기 소스를 사용하여 수행할 수 있다.
여기 소스는 희토류 이온 및/또는 희토류 이온이 혼입된 나노 입자의 매트릭스를 직접 여기시킬 수 있다. 바람직하게는, 희토류 이온은 검출 영역 수준 및 선택적으로, 제어 영역에서 고정된 축광 나노 입자의 매트릭스(예를 들어 AVO4 또는 다른 금속 산화물 매트릭스)의 여기, 그리고 이어서 상기 나노 입자에서 희토류 이온으로의 에너지 전달에 의해 여기된다. 대부분의 경우 매트릭스의 여기는 UV에서 수행된다.
특히, 상기 기재된 바와 같은 화학식 A1- xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II) 의 나노 입자, 특히 y가 0의 값을 갖는 경우, 발광은 350 nm 이하, 특히 320 nm 이하, 더욱 특히 300 nm 이하의 파장에서 매트릭스의 여기에 의해 검출될 수 있다.
AVO4 매트릭스, 특히 화학식 Y1- xEuxVO4, (IV)의 나노 입자의 YVO4 매트릭스의 경우, 여기는 230 내지 320nm, 특히 250 내지 310nm, 보다 특히 265 내지 295 nm의 파장에서 영향을 받을 수 있다. 나노 입자 매트릭스의 여기는 매트릭스의 흡수 계수(또는 용액 내 나노 입자의 흡광 계수)가 발광 이온의 직접 여기에 해당하는 것보다 훨씬 더 크기 때문에 특히 유리하다. 더욱이, 모든 예상과는 달리 UV의 여기에 의해 생성된 기생 배경 신호는 분석 물질이 낮은 농도로 존재하더라도 나노 입자의 방출로 인한 신호의 탐지를 방지하는 특성이 아니다, 아래 제공된 예에 설명되어 있다.
Eu를 함유하는 산화물 매트릭스의 경우, 여기는 210 ~ 310nm, 특히 230 ~ 290nm, 더욱 특히 245 ~ 275nm의 파장에서 영향을 받을 수 있다.
이 경우 여기는 UV 램프, UV LED (발광 다이오드) 또는 UV 레이저를 사용하여 영향을 받을 수 있다. 프로브를 감지하는데 필요한 여기의 힘과 강도는 UV 램프 또는 UV LED를 사용하여 쉽게 얻을 수 있다. 바람직하게는, 여기는 LED를 사용하여 수행되며, 후자는 에너지 손실이 적고 따라서 제거할 열이 거의 없다.
더욱이, 유리하게는, 여기는 스트립의 표면, 특히 검출 및 제어 영역 수준에서 균일하게 수행된다. 이러한 균일성은 UV 램프뿐만 아니라 검출 및 제어 영역 주변에 배치된 저전력의 여러 LED로도 달성할 수 있다. 예를 들어, 도 7에 도시된 바와 같이 4개의 LED로 이루어진 4개의 그룹이 사용될 수 있다. 도 7의 계획은 스트립의 감지 및 제어 영역 주변에 여러 개의 LED를 배치할 수 있는 계획 중 하나를 나타낸다.
여기 전력 밀도는 0.5 ~ 20mW/cm2, 특히 1 ~ 10mW/cm2일 수 있다.
본 발명에 따른 모세관 작용 시험의 상업적 적용의 맥락에서, 여기 동안 생성된 열을 효과적으로 제거할 수 있으며, 주어진 여기 전력으로 얻은 검출 감도와 문제의 여기 전력을 얻는데 필요한 여기 소스 비용의 비율을 고려하여 성능 계수를 정의할 수 있다. 유리하게는, 본 발명에 따른 진단 키트는 이러한 성능 계수(factor of merit)를 최적화하는 것을 가능하게 한다.
특히 유리한 실시 양태에 따르면, 특히 분석물의 정성적 특성화와 관련하여 결과의 판독은 특히 방출 필터를 사용하여 모세관 작용 시험 장치, 특히 검출 영역 및 선택적으로 제어 영역의 육안 관찰에 의해 수행될 수 있다.
방출 필터를 사용하면 발광 이온의 특성 방출 대역을 선택하여 비특이적 신호를 배제할 수 있다. 예를 들어, Y1- xEuxVO4 나노 입자를 사용하면 YVO4 매트릭스에서 Eu3 +의 발광 파장, 즉 617nm에서 방출되는 광도를 감지할 수 있다. 방출 필터는 간섭 필터 또는 고역 통과 필터일 수 있다.
또는 간단한 감지 장비를 사용하여 결과를 읽을 수 있다. 후자는 방출 필터 및 검출기를 포함할 수 있다.
검출기는 광자 검출기이다.
이는 특히 CCD 또는 EM-CCD 카메라 또는 CMOS 카메라와 같은 2D 감지 픽셀 표면으로 구성되는 특히 광전자 증배기(photomultiplier), 광 다이오드 또는 애벌랜치(avalanche) 광 다이오드 유형의 단일 검출기이거나 감광 장치 어레이 유형의 검출기일 수 있다.
바람직하게는 카메라와 같은 2D라고 하는 감지 장치이다. 따라서 측면 흐름 분석에 사용되는 스트립의 2D 이미지를 얻을 수 있다.
예를 들어 스마트 폰의 CCD 또는 CMOS 센서일 수 있다.
유리하게는, 본 발명에 따른 모세관 작용 시험은 방출 신호의 낮은 획득 시간을 갖는다. 특히, 발광은 몇 초, 특히 1초 이하, 특히 100ms 이하에서 측정될 수 있다. 바람직하게는 방출 신호의 획득 시간은 스마트 폰 카메라로 이미지 획득 시간과 호환되어야 한다.
측면 유동 분석 결과 분석(Analysis of the results of the lateral flow assay)
그런 다음 발광 결과를 해석할 수 있다.
측면 유동 분석의 결과 분석은 검출 영역 및/또는 제어 영역 수준에서, 예를 들어, 육안으로 간단한 시각적 관찰 또는 예를 들어 CCD 카메라로 얻은 스트립의 2D 이미지(예를 들어 스마트 폰으로 기록된 사진)의 시각적 판독에 의해 프로브의 존재를 간단하게 결정(정성적 측정)하는 것으로 구성될 수 있다.
그것은 분석된 시료에 분석 대상 물질이 존재하는지 여부를 결론을 내릴 수 있다.
예를 들어, "샌드위치"유형의 측면 흐름 분석의 맥락에서 결과의 정성적 해석은 다음과 같을 수 있다.
- 두 개의 밴드가 있는 경우 : 테스트가 양성이다.
- 단일 제어 밴드가 있는 경우 : 테스트가 음성이다.
- 단일 테스트 밴드가 있는 경우 : 테스트가 유효하지 않다.
- 밴드가 없는 경우 : 테스트가 유효하지 않다.
유리하게는, 본 발명에 따른 검출 방법은 프로브로 금 나노 입자를 사용한 동일한 모세관 작용 테스트의 검출 한계보다 최대 10배, 특히 최대 100배 또는 심지어 최대 1000배까지 정성적 측정을 가능하게 한다.
모세관 작용 시험 결과의 분석은 또한 분석할 물질의 정량적 특성화, 즉 발광 결과를 해석하여 시료 내 물질의 농도를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 검출 시스템은 발광 방출을 분석하기 위한 임의의 수단, 예를 들어 예를 들어 발광 신호를 기록하고 이용할 수있는 변환기를 추가로 포함할 수 있다.
발광 측정은 미리 설정된 표준 또는 보정을 참조하여 해석할 수 있다.
위에서 볼 수 있듯이 샌드위치 유형의 분석의 맥락에서 검출 영역의 발광 신호는 증가하며, 특히 분석 물질의 농도에 비례하는 반면 경쟁 분석의 맥락에서는 반비례할 수 있다.
예를 들어, 분석할 물질의 다른 농도를 포함하는 교정 밴드라고하는 여러 제어 밴드를 사용하여 교정을 참조하여 정량화할 수 있다.
발광 측정의 해석은 특히 검출 영역으로부터의 발광 신호 대 제어 영역으로부터의 발광 신호의 비율(the ratio of the luminescence signal from the detection zone to that from the control zone)을 이용할 수 있다.
발광을 해석하기 위한 이러한 수단은 예를 들어 스마트폰 애플리케이션 내에서 결합되어 획득한 이미지를 분석하고 획득한 결과의 정량적 가치를 제공할 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따라 사용되는 검출 시스템은 2D 검출기, 이미지 기록 시스템 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용할 수 있다.
대안으로, 2D 검출기가 판독기에 통합될 수 있으며, 기록된 이미지는 스마트폰 또는 이미지 분석을 허용하는 다른 시스템으로 전송될 수 있다.
특히 분석물의 정량적 특성화를 위한 (예를 들어 분석 소프트웨어에 의한) 결과의 분석은 예를 들어 검출 영역, 제어 영역 및 배경 신호의 신호에 대응하는 신호의 결정을 포함할 수 있다. 배경 신호의 발광 값은 다른 두 영역의 값에서 뺀다. 그런 다음 감지 영역의 신호와 제어 영역의 신호의 비율이 계산된다.
보다 정확하게는 (예를 들어 분석 소프트웨어를 통해 또는 유리하게는 검출 장치(스마트폰 또는 기타)에 로드된 애플리케이션을 통한) 결과 분석, 특히 분석물의 정량적 특성화를 위해 예를 들어 다음을 포함할 수 있다. (i) 검출 영역의 발광 수준 LD, 제어 영역의 발광 수준 LC 및 사용자가 식별한 마커 LB(배경 신호)가 없는 영역에서 발광 수준 결정, (ii) SD/C=(LD/C-LB) 식에서 원시 신호(raw signal) SD 및 SC 계산, (iii) SD/C 최대화를 위한 알고리즘을 사용하여 검출 및 제어 영역의 최적 위치 파악, (iv) 비율 계량 신호 R=SD/SC or R= SD/(SD+SC) 계산 및 (v) 분석물의 절대 농도를 결정하기 위해 R 값을 보정표와 비교. 검출 영역의 자동 위치 지정(단계 iii)을 통해 사용자가 도입한 편향을 피하고 재현 가능한 정량 측정을 얻을 수 있다. 또는 검출 및 제어 밴드의 위치는 사용자의 개입없이 완전히 자동으로 선택될 수 있다. 후자의 경우 스트립에서 감지 및 제어 밴드의 위치와 판독기에서 스트립의 위치가 항상 동일해야 한다.
"샌드위치" 유형의 분석과 관련하여, 결과 분석은 바람직하게는 R=SD/SD+SC 비율의 계산을 포함한다. 실제로 "샌드위치" 유형의 분석과 관련하여 분석 물질의 농도가 높을수록 신호 SD가 커지고 신호 SC가 작아진다 (제어 영역으로 이동하는데 사용할 수 있는 프로브가 더 적다).
여기, 발광 검출 및 결과 분석을 위한 모든 구성 요소는 예를 들어 스트립 판독기와 같은 모세관 작용 테스트 장치의 판독기라고 하는 케이스 내에서 결합될 수 있다.
예를 들어 테스트 결과를 읽을 목적으로 하나 이상의 스트립을 삽입하기 위해 스트립 판독기에 개구부를 만들 수 있다.
기록된 이미지를 데이터 분석 장비로 전송할 수 있도록 USB 연결 또는 이와 동등한 장치가 포함된 개구부가 제공될 수도 있다.
본 발명에 따른 방법은 유리하게는 5 ng/mL 이하, 특히 0.5 ng/mL 이하, 또는 심지어 0.05 ng/mL 이하의 함량으로 샘플에서 관심 물질을 검출하는 것을 가능하게 한다. 이 성능은 물론 분석물과 사용된 특정 결합 시약의 효율성에 따라 달라진다.
유리하게는, 본 발명에 따른 검출 방법은 프로브로 금 나노 입자를 사용한 동일한 모세관 작용 시험의 정량 한계보다 최대 10배, 특히 최대 100배, 또는 최대 1000배까지 정량 측정을 가능하게 한다.
아래 제시된 실시 예 및 도면은 예시의 목적으로만 제공되며 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1: 측면 흐름 분석을 위한 스트립의 단면 보기의 개략도;
도 2: 분석물(11)을 포함하는 분석할 액체 샘플을 증착 영역(1)의 수준(상단 그림)과 분석의 말단(하단 그림)에 적용하기 전, "샌드위치" 유형의 분석에 대한 개략도;
도 3: 분석물(11)을 포함하는 분석할 액체 샘플을 증착 영역(1)의 수준(상단 그림)과 분석의 말단(하단 그림)에 적용하기 전, 두 가지 변형에 따른 "경쟁" 분석 절차의 개략도;
도 4: 실시 예 1.1에 따라 수득된 나노 입자의 투과 전자 현미경(TEM)에 의해 수득된 이미지(스케일 바: 각각 60nm (도 4a) 및 5nm (도 4b));
도 5 : 실시 예 1.1.a에 따라 약 300개의 나노 입자 세트에 대한 TEM 이미지로부터 결정된 나노 입자 크기의 히스토그램　;
도 6: 5, 0.5, 0.05 ng/mL의 h-FABP 항원을 포함하는 용액의 이동 후 UV 램프로 조명된, 실시 예 3의 분석에 따른 스트립 사진, 검출 대역은 왼쪽에서, 제어 대역은 오른쪽에서 볼 수 있다. 흡수 패드는 이미지의 오른쪽 가장자리에서 볼 수 있다. 사진에 표시된 발광 신호는 ImageJ로 분석되었다. 결과는 도 7에 나와 있다;
도 7: 실시 예 3에 따른 테스트 스트립으로 테스트된 5, 0.5, 0.05 및 0 ng/mL의 h-FABP를 포함하는 액체 샘플에 대해 ImageJ에 의해 측정된 R= SD/SD+SC 비율에 대한 결과. 상기 점은 R의 평균값을 나타내고 오차 막대는 각각 3개 및 2개 스트립에 대한 관련 표준 편차를 나타낸다;
도 8: 측면 유동 분석을 위한 스트립을 포함하는 케이스의 평면도의 개략도;
도 9 : 나노 입자의 여기를 위해 4개의 UV LED 그룹("LED #1"~ "LED #4")을 사용하는 스트립 판독기의 구조. 상기 스트립은 삽입 레일(20) 수준에서 판독기에 삽입될 수 있다. 판독은 커버의 개구부를 통해 이루어지며, 나노 입자의 방출(예의 경우 617nm 중심)을 선택하고 여기 파장(예의 경우 280nm 중심)을 차단 할 수 있는 필터가 배치된다. 간섭 필터 또는 고역 통과 필터일 수 있다. 예를 들어 휴대폰의 CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 카메라는 이미지를 기록하기 위해 이 개구부 앞에 배치된다;
도 10: Android(Samsung)에서 작동하는 전용 애플리케이션을 사용하여 스트립에 대한 결과 분석 그림. 왼쪽 : 감지 영역, 배경 신호 영역 및 제어 영역에 대해 위에서 아래로 누적 발광 레벨이 계산되는 직사각형이 있는 스트립의 흑백 이미지. 오른쪽 : Android 분석 애플리케이션이 실행중인 휴대폰의 스크린 샷. 누적 발광 레벨 계산이 수행되는 직사각형과 내부에 발광 누적 레벨 계산이 수행되고 "캡처(Capture)", "측정(Measure)", "조절(Adjust)"및 "저장(Save)" 기능이 있는 스트립의 흑백 이미지를 볼 수 있다;
도 11: (A) 실시 예에 따라 합성된 Y0. 6Eu0 . 4VO4 나노 입자 용액의 흡광도 스펙트럼. (B) 280, 300 및 380 nm (여기 슬릿의 폭 : 5 nm)에서 여기된 석영 큐벳에 삽입된 예의 측면 흐름 분석에 사용된 백킹 카드(backing card)에 접착된 니트로셀룰로오스 막의 방출 스펙트럼. 상기 방출은 전체 스펙트럼에 걸쳐 380 nm, 특히 Y0.6Eu0.4VO4 나노 입자를 기반으로 하는 프로브의 신호가 감지되는 파장인 617 nm에서 여기 후 훨씬 더 강렬하다;
도 12: 방출 파장이 617nm로 고정된 Y0. 6Eu0 . 4VO4 나노 입자의 여기 스펙트럼 (도면의 왼쪽 부분)과 여기 파장이 278nm로 고정된 방출 스펙트럼(도면의 오른쪽 부분);
도 13: 방출 파장이 572 nm로 고정된 YVO4:Dy 5% 나노 입자의 여기 스펙트럼 (도 13-a) 및 여기 파장이 278 nm로 고정된 방출 스펙트럼(도 13-b);
도 14: 방출 파장이 600nm로 고정된 YVO4:Sm 3% 나노 입자의 여기 스펙트럼 (도 14-a)과 여기 파장이 278nm로 고정된 방출 스펙트럼(도 14-b);
도 15: Eu3 + 이온을 포함하는 나노 입자의 경우 617nm로 고정되고 Dy3 + 이온을 포함하는 나노 입자의 경우 573nm로 고정된 방출 파장에 대한 Y0. 6Eu0 . 4VO4, Lu0.6Eu0.4VO4, LuVO4:Dy 10%, La0 . 6Eu0 . 4VO4 and GdVO4:Dy 20% 나노 입자의 여기 스펙트럼;
도 16: 278 nm의 여기 파장(LuVO4 매트릭스의 여기)에 대한 Lu0 . 6Eu0 . 4VO4 나노 입자의 방출 스펙트럼. 상기 방출은 617 nm에서 주요 피크를 가지며 593 및 700 nm에서 두 개의 다른 피크를 갖는다;
도 17: 278 nm의 여기 파장(LuVO4 매트릭스의 여기)에 대한 LuVO4:Dy 10% 나노 입자의 방출 스펙트럼. 상기 방출에는 483 및 573 nm에서 두 개의 주요 피크가 있다;
도 18: 278 nm의 여기 파장(LuVO4 매트릭스의 여기)에 대한 La0 . 6Eu0 . 4VO4 나노 입자의 방출 스펙트럼. 방출은 617에서 주요 피크를 가지며 593 및 700 nm에서 다른 두 개의 피크를 갖는다;
도 19: 278 nm의 여기 파장(LuVO4 매트릭스의 여기)에 대한 GdVO4:Dy 20% 나노 입자의 방출 스펙트럼. 상기 방출에는 483 및 573 nm에서 두 개의 주요 피크가 있다;
도 20: y=0, y=0.05, y=0.2, y=0.5 및 y=1에 대한 Y(VO4)1- y(PO4)y:Eu 20% 나노 입자의 흡광도 스펙트럼. 희석 전 초기 농도는 약 50mM의 바나데이트 이온이다;
도 21: 278nm에서 고정된 여기 파장에서 y=0, y=0.05, y=0.2, y=0.5 및 y=1에 대한 Y(VO4)1- y(PO4)y:Eu 20% 나노 입자의 방출 스펙트럼. 희석 전 초기 농도는 약 50mM의 바나데이트 이온이다;
도 22: 항원 부재하에 컨트롤 라인에 고정된 BSA-비오틴을 함유하는 "딥 스틱" 스트립상의 Lu0 . 6Eu0 . 4VO4-SA 및 Lu0 . 9Dy0 . 1VO4-SA 나노 입자의 이동. 스트립은 312 nm에서 UV 램프로 조명 하에서 관찰된다. 간섭 필터를 통해 검출된 방출(Eu3 + 및 Dy3+ 이온 방출에 대해 각각 Semrock FF01-620/14-25 및 FF03-575/25); 아이폰 6 스마트 폰으로 찍은 이미지. 컨트롤 선에서 두 개의 명확한 밴드가 관찰된다. 흡수 패드까지 이동한 나노 입자의 방출은 이미지의 오른쪽에서 볼 수 있다.
1. 광발광 프로브의 준비
1.1. 광발광 무기 나노 입자의 합성
1.1.a Y 0. 6 Eu 0 . 4 VO 4 나노 입자의 합성
암모늄 메타바나데이트(Ammonium metavanadate) NH4VO3는 메타바나데이트 이온 VO3-의 공급원으로 사용되며, 오르토바나데이트(orthovanadate) VO4 3-은 염기, 이 경우 테트라메틸암모늄 하이드록사이드, N(CH3)4OH와의 반응 후 현장에서 수득된다. 이트륨 나이트레이트(Yttrium nitrate) 및 유로퓸 나이트레이트(europium nitrate)는 Y3+ 및 Eu3 + 이온의 공급원으로 사용되었다.
0.1M에서 10 mL의 NH4VO3 및 0.2M의 N(CH3)4OH (용액 1)의 수용액이 새로 준비된다.
0.1 M 이온(Y3+ + Eu3 +)에서 Y(NO3)3 및 Eu(NO3)3의 다른 용액(용액 2) 10 mL의 부피를 주사기 펌프에 의해 용액 1에 1 mL/min의 유속으로 적가한다.
Y(NO3)3 대 Eu(NO3)3의 몰 농도비는 나노 입자에서 Y3+ 및 Eu3 + 이온의 원하는 비율의 함수로 선택되며, 일반적으로 몰비 Y3+ : Eu3 +는 0.6:0.4이다.
Y(NO3)3/Eu(NO3)3 용액이 첨가되면 용액이 확산되고 침전물 형성없이 흰색/유백색으로 나타난다. 상기 합성은 모든 Y(NO3)3/Eu(NO3)3 용액이 추가될 때까지 계속된다.
이제 20 mL의 최종 용액을 정제하여 과도한 반대 이온을 제거해야 한다. 이를 위해 100μS.cm-1 미만의 전도도에 도달할 때까지, 11000g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific)에서 80분 동안 원심 분리 (일반적으로 3회)한 다음 초음파 처리(Bioblock Scientific, 초음파 프로세서, 40초 동안 50%에서 작동하는 최대 130W의 전력)를 통해 재분산한다. 상기 전도도는 화학적 전도도 측정기를 사용하여 측정된다.
테트라 메틸암모늄 양이온이 고정된 표면에 Y0. 6Eu0 . 4VO4 나노 입자의 합성은 다음과 같이 설명할 수 있다:
Figure pct00001
병에 16시간 동안 방치한 후 나노 입자 용액을 육안으로 관찰하면 용액이 균일하게 확산되는 것으로 나타났다.
최종 용액은 합성의 최종 pH (약 pH 5)에서 몇 달 후에도 물에서 매우 안정적이다. 상기 용액은 높은 이온 강도 (>0.1M)이지만 합성 배지를 포함하여 (과도한 반대 이온을 제거하기 전) 안정적으로 유지된다.
반대 이온을 제거한 후 DLS-Zeta Potential 장치(Zetasizer Nano ZS90, Malvern)로 측정한 나노 입자의 제타 전위는 pH 7에서 -38.4mV이다.
TEM에 의한 나노 입자 관찰(도 4)은 나노 입자가 긴 타원 모양임을 보여준다. 나노 입자의 크기는 약 300개의 나노 입자 세트에 대한 TEM 이미지에서 결정된다(도 5). 본 발명의 나노 입자는 약 40 nm의 평균값을 갖는 20 내지 60 nm의 a로 표시된 장축의 길이 및 약 20 nm의 평균값을 갖는 10 내지 30 nm의 b로 지정된 단축의 길이를 갖는다.
Y0. 6Eu0 . 4VO4 나노 입자의 여기 및 방출 스펙트럼은 도 12에 나와 있다. 여기 스펙트럼은 278 nm에서 피크를 가지며 방출 스펙트럼은 617 nm에서 주 피크를 가지며 593 및 700 nm에서 두 개의 피크를 가진다.
YVO4 매트릭스의 Eu3 + 이온은 다른 발광 란탄족 이온으로 대체될 수 있다. 이 경우 V-O 전하 전이와 관련된 VO4 3- 바나데이트 이온의 흡수 피크 주변의 여기 및 흡수 스펙트럼은 변하지 않는다. 방출 스펙트럼은 각 란탄족 이온의 방출 스펙트럼의 전형이다.
1.1.b Y 0. 95 Dy 0 .05 VO 4 ( YVO 4 :Dy 5%) 나노 입자의 합성
합성은 0.1M 이온(Y3+ + Dy3 +)에서 Y(NO3)3 및 Dy(NO3)3으로 구성된 용액 2를 제외하고는 실시 예 1.1.a의 합성과 동일하다. 용액 2는 주사기 펌프에 의해 1 mL/min의 유속으로 용액 1에 적가된다.
Y(NO3)3 대 Dy(NO3)3의 몰 농도 비율은 나노 입자에서 원하는 Y3+ 및 Dy3 + 이온 비율의 함수로 선택되며,이 경우 Y3+:Dy3 + 몰 비율은 0.95:0.05이다.
이러한 나노 입자의 여기 및 방출 스펙트럼은 도 13에 나와 있다. Dy3 + 이온의 방출은 483 및 573 nm에서 두 개의 주요 피크를 가지고 있다.
1.1.c Y 0. 97 Sm 0 . 03 VO 4 ( YVO 4 :Sm 3%) 나노 입자의 합성
합성은 0.1M 이온(Y3+ + Sm3 +)에서 Y(NO3)3 및 Sm(NO3)3으로 구성된 용액 2를 제외하고는 실시 예 1.1.a의 합성과 동일하다. 용액 2는 주사기 펌프에 의해 1 mL/min의 유속으로 용액 1에 적가된다.
Y(NO3)3 대 Sm(NO3)3의 몰 농도 비율은 나노 입자에서 원하는 Y3+ 및 Sm3 + 이온 비율의 함수로 선택되며,이 경우 Y3+:Sm3 + 몰 비율은 0.97:0.03이다.
이러한 나노 입자의 여기 및 방출 스펙트럼은 도 14에 나와 있다.
또한 YVO4 매트릭스의 Y3+ 이온은 Gd3 +, Lu3 + 및 La3 +와 같은 다른 이온으로 대체될 수 있다(다음 예 참조). 이러한 모든 매트릭스 GdVO4, LuVO4 및 LaVO4의 경우 V5+-O2- 전하 이동 전이와 관련된 VO4 3- 바나데이트 이온의 흡수 피크 주변의 여기 및 흡수 스펙트럼은 YVO4 매트릭스에 비해 변하지 않는다. 또한 이러한 매트릭스 GdVO4, LuVO4 및 LaVO4에서 Eu3 + 이온은 다른 발광 란탄족 이온으로 대체될 수 있다. 방출 스펙트럼은 각 란탄족 이온의 방출 스펙트럼의 전형이다. 매트릭스와 발광 란탄족 이온의 다른 대표적인 조합이 아래에 제시된다.
1.1.d Lu 0 . 6 Eu 0 . 4 VO 4 나노 입자의 합성
합성은 0.1M 이온(Lu3 + + Eu3 +)에서 Lu(NO3)3 및 Eu(NO3)3으로 구성된 용액 2를 제외하고는 실시 예 1.1.a의 합성과 동일하다. 용액 2는 주사기 펌프에 의해 1 mL/min의 유속으로 용액 1에 적가된다.
Lu(NO3)3 대 Eu(NO3)3의 몰 농도 비율은 나노 입자에서 원하는 Lu3 + 및 Eu3 + 이온 비율의 함수로 선택되며,이 경우 Lu3 +:Eu3 + 몰 비율은 0.6:0.4이다.
Lu0 . 6Eu0 . 4VO4 나노 입자의 여기 스펙트럼은 도 15에 표시되고 방출 스펙트럼은 도 16에 표시된다. LuVO4 매트릭스에서 Eu3 + 이온의 방출 스펙트럼은 YVO4 매트릭스(도 12)와 비교하여 거의 변하지 않았으며 617nm에서 주 피크를, 593 및 700nm에서 두 개의 피크를 가지고 있다.
1.1.e LuVO 4 :Dy 10% 나노입자의 합성
합성은 0.1M 이온(Lu3 + + Dy3 +)에서 Lu(NO3)3 및 Dy(NO3)3으로 구성된 용액 2를 제외하고는 실시 예 1.1.a의 합성과 동일하다. 용액 2는 주사기 펌프에 의해 1 mL/min의 유속으로 용액 1에 적가된다.
Lu(NO3)3 대 Dy(NO3)3의 몰 농도 비율은 나노 입자에서 원하는 Lu3 + 및 Dy3 + 이온 비율의 함수로 선택되며,이 경우 Lu3 +:Dy3 + 몰 비율은 0.9:0.1이다.
LuVO4:Dy 10% 나노 입자의 여기 스펙트럼은 도 16에 표시되고 방출 스펙트럼은 도 17에 표시된다. LuVO4 매트릭스에서 Dy3 + 이온의 방출 스펙트럼은 YVO4 매트릭스(도 13)와 비교하여 거의 변하지 않았으며 483 및 573 nm에서 두 개의 방출 피크를 가지고 있다.
1.1.f La 0 . 6 Eu 0 . 4 VO 4 나노 입자의 합성
합성은 0.1M 이온(La3 + + Eu3 +)에서 La(NO3)3 및 Eu(NO3)3으로 구성된 용액 2를 제외하고는 실시 예 1.1.a의 합성과 동일하다. 용액 2는 주사기 펌프에 의해 1 mL/min의 유속으로 용액 1에 적가된다.
La(NO3)3 대 Eu(NO3)3의 몰 농도 비율은 나노 입자에서 원하는 La3 + 및 Eu3 + 이온 비율의 함수로 선택되며,이 경우 La3 +:Eu3 + 몰 비율은 0.6:0.4이다.
La0 . 6Eu0 . 4VO4 나노 입자의 여기 스펙트럼은 도 15에 표시되고 방출 스펙트럼은 도 18에 표시된다. LaVO4 매트릭스에서 Eu3 + 이온의 방출 스펙트럼은 YVO4 매트릭스(도 12)와 비교하여 거의 변하지 않았으며 617nm에서 주 피크를, 593 및 700nm에서 두 개의 피크를 가지고 있다.
1.1.g GdVO 4 :Dy 20% 나노 입자의 합성
이들 나노 입자의 합성은 다음과 같이 오르토바나데이트(orthovanadate) 전구체로부터 시작하여 수행된다. 0.1M에서 10mL의 NaVO4 수용액 (용액 1)을 새로 준비하고 1M NaOH 용액을 사용하여 pH를 12.6에서 13 사이로 조정한다.
0.1 M의 이온(Gd3 + + Dy3 +)에서 Gd(NO3)3 및 Dy(NO3)3의 다른 용액(용액 2) 10 mL의 부피를 주사기 펌프에 의해 1 mL/min의 유속으로 교반하면서 용액 1에 적가한다.
Gd(NO3)3 대 Dy(NO3)3의 몰 농도 비율은 나노 입자에서 원하는 Gd3 + 및 Dy3 + 이온 비율의 함수로 선택되며, 이 경우 Gd3 + : Dy3 +몰 비율은 0.8 : 0.2이다.
Gd(NO3)3/Dy(NO3)3 용액이 첨가되면 유백색 침전물이 형성된다. 합성은 모든 Gd(NO3)3/Dy(NO3)3 용액이 추가될 때까지 계속된다. pH가 8-9에서 안정화될 때까지 용액을 30분 동안 교반한다.
20 mL의 최종 용액은 과잉 반대 이온을 제거하기 위해 실시예 1.1.a에서와 같이 정제되어야 한다. 이를 위해 100μS.cm-1 미만의 전도도에 도달할 때까지, 11000g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific)에서 15분 동안 원심 분리(일반적으로 3회)한 다음 초음파 처리(Bioblock Scientific, 초음파 프로세서, 40초 동안 50 %에서 작동하는 최대 130W의 전력)를 통해 재분산한다.
GdVO4:Dy 20% 나노 입자의 여기 스펙트럼은 도 15에 나타나 있으며 방출 스펙트럼은 도 19에 나타나 있다. GdVO4 매트릭스에서 Dy3 + 이온의 방출 스펙트럼은 YVO4 매트릭스(도 13)의 방출 스펙트럼에 비해 거의 변하지 않으며 483 및 573 nm에서 두 개의 방출 피크를 가지고 있다.
1.1.h Y(VO 4)1- y (PO 4 ) y :Eu 20% 나노 입자의 합성
매트릭스에 다른 VO4 3- : PO4 3- 비율로 VO4 3- 및 PO4 3- 이온의 혼합물을 포함하는 나노 입자도 합성되었다.
합성은 0.1M의 이온 농도(VO3- + PO4 3-)에서 0.1·y M의 Na3PO4, 0.1·(1-y) M NH4VO3 및 0.2·(1-y) M의 N(CH3)4OH로 구성된 용액 1을 제외하고 실시 예 1.1.a의 합성과 동일하다. 상기 농도의 10mL 수용액(용액 1)이 새로 준비준다. y=0, y=0.05, y=0.2, y=0.5 및 y=1인 NP를 준비했다.
PO4 3- 이온은 278 nm에서 흡수를 나타내지 않는다. 따라서 100%의 PO4 3- 이온을 포함하는 나노 입자는 278 nm에서 흡수 피크를 갖지 않다(도 20 참조). 이러한 나노 입자의 방출 스펙트럼은 도 21에 제시되어 있으며 1과는 다른 y의 모든 값에 대해 동일하다(y=1에 대해 방출이 관찰되지 않음). 그들은 617에서 메인 피크를 가지며 593 및 700 nm에서 두 개의 추가 피크를 가지고 있다. 이러한 방출 스펙트럼은 거의 동일하다.
1.2. 나노 입자와 단백질 (항-h- FABP 항체)의 공유 결합
1.1.a 지점에서 설명한 대로 얻은 Y0. 6Eu0 . 4VO4 나노 입자는 다음 프로토콜에 따라 항체에 결합된다.
1.2.1. 나노 입자를 실리카 층으로 코팅
나노 입자 합성이 끝나면 나노 입자 용액을 17,000g에서 3분 동안 원심 분리하여 나노 입자 응집체를 침전시키고 상층 액을 회수한다. 크기별 선택이 수행된다. 이를 위해 1900g에서 3분 동안 여러 차례 원심 분리를 수행한다. 각 원심 분리 후 초음파 처리기를 사용하여 나노 입자를 재분산한 다음 DLS-Zeta Potential 장치(Zetasizer Nano ZS90, Malvern)를 사용하여 나노 입자의 크기를 결정한다.
20mM의 바나데이트 이온 농도를 갖는 25mL의 Y0. 6Eu0 . 4VO4 입자 부피가 준비된다. 입자의 표면을 코팅하기 위해 2.5 mL의 순수한 규산 나트륨 용액(Merck Millipore 1.05621.2500)을 피펫으로 적가한다. 이 용액은 최소 5시간 동안 저어주면서 작용한다.
그런 다음 과량의 규산염과 나트륨 반대 이온을 제거하기 위해 용액을 정제한다. 용액을 11000g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific)에서 60분 동안 원심 분리한 다음 초음파 처리(Bioblock Scientific, 초음파 프로세서, 400W 전력에서 50%로 작동)로 재분산한다. 용액의 전도도가 100 μS/cm 미만이 될 때까지 이 단계를 반복한다.
1.2.2. 나노 입자 표면에 아민 접목
3구 유형의 500mL 플라스크에 225mL의 무수 에탄올을 넣고 최종 농도 1.125mM에 해당하는 APTES(3-aminopropyltriethoxysilane) (Mw 221.37 g/mol Sigma Aldrich) 265μL를 추가한다. 이 양은 도입된 바나데이트 5당량에 해당한다. 그런 다음 응축기가 플라스크에 부착된다. 전체를 플라스크 히터에 놓고 후드 아래에 놓는다. 혼합물을 90℃에서 환류하에 가열한다. 3구 플라스크의 입구 중 하나에 pH 9의 75 mL 물에 용해된 나노 입자 콜로이드 용액(바나데이트 이온 농도 [V]=3mM)을 유속 1mL/분의 연동 펌프를 사용하여 적가한다. 전체를 24시간 동안 교반하면서 가열한다.
48시간 후 회전 증발기(rotavapor R-100, BUCHI)를 사용하여 나노 입자를 부분적으로 농축한다. 용액을 적절한 플라스크에서 회전시키고 50℃의 수조에서 가열한다.
회수된 용액은 에탄올:물(3:1) 용매에서 여러 번 원심 분리하여 정제한다. 정제 후, 크기별 분류는 위에서 설명한 프로토콜에 따라 수행된다.
1.2.3. 아민화 나노 입자 표면에 카르 복실을 접목
접목(grafting)을 시작하기 전에 용매 이동이 수행된다.
접목 프로토콜은 다음과 같다.
아민화 NP를 EtOH:H2O 버퍼에서 DMF 또는 DMSO로 옮기고 여러번 원심 분리를 수행한다(13000g, 90분). 펠릿은 각 원심 분리 사이에 초음파 처리에 의해 재분산된다(75%에서 20초). NP의 농도를 측정하고 결정한다.
5 mL의 DMF에서 NPS를 회수한 다음 유리 비커에 10%의 숙신산 무수물을 추가한다(즉, 5 mL에서 0.5g). 교반하면서 불활성 분위기에서 밤새 반응하도록 놔둔다.
DMF와 과량의 숙신산 무수물을 제거하기 위해 원심 분리(60분 동안 13000g, Legend Micro 17r, Thermo Scientific)로 카르복실화된 NP를 최소 두 번 세척한다.
초음파 처리(Bioblock Scientific, 초음파 프로세서)에 의해 pH6에서 물 또는 MES 버퍼에 카르복실화된 입자를 다시 재현탁한다.
1.2.4. 나노 입자를 항-h- FABP 항체에 결합
COOH로 표면 이식된 나노 입자의 결합은 다음 프로토콜에 따라 수행된다.
1. MES 버퍼(pH 5-6)에 EDC/Sulfo-NHS 혼합 용액(각각 농도 500 및 500 mg/mL)을 새로 준비한다.
2. 90 nM의 NPs (이 경우 Casanova et al [37] 참조에 따라 바나데이트 이온의 농도에서 계산된 나노 입자의 농도)를 미리 준비한 용액 3mL에 추가하고 교반하면서 실온에서25분 동안 반응하도록 놔둔다.
3. MilliQ 물로 최소 2회의 원심 분리(60분 동안 13000g, Legend Micro 17R, Thermo Scientific)를 통해 NP를 빠르게 세척하여 초과한 시약을 제거한다.
4. pH 7.3에서 인산나트륨 완충액으로 초음파 처리한 후 마지막 펠릿을 회수한다.
필요한 비율(단백질:Nps)의 함수로 필요한 양, 일반적으로 20 : 1의 비율에 대해 2μM의 단백질(anti h-FABP Antibody, Ref 4F29, 10 E1, Hytest) 및 mPEG-silane (MW: 10 kD, Laysan Bio 256-586-9004)을 추가한다.
5. 이 용액을 교반하면서 실온에서 2 ~ 4 시간 동안 반응하도록 놔둔다.
6. 차단제(1% glycine)를 첨가하여 유리 COOH와 반응하여 NP 표면의 잔류 반응 부위를 차단한다. 30분 동안 반응하도록 놔둔다.
7. PBS pH 7.2와 함께 원심 분리 필터(Amicon Ultra 0.5 mL, Ref UFC501096, Millipore)를 사용하여 원심 분리하여 단백질에 결합된 NP를 여러 번 세척한다. NP를 저장 배지(인산염 완충액 + Tween 20(0.05%) + 0.1% 글리신 + 10% 글리세롤)로 옮긴다. BCA 분석을 위해 100 μL을 취한다. 나머지 용액은 분취 액으로 나누어 -80℃에서 냉동된다.
더욱이, 실시 예 1.1.b 내지 1.1.h에 따라 합성된 모든 나노 입자는 Y0.6Eu0.4VO4 나노 입자와 동일한 방식으로 항체에 결합될 수 있다.
1.3. 나노 입자와 단백질(항-h- FABP 항체)의 수동 결합(Passive coupling)
실시예 1.2의 공유 결합 대신에 나노 입자를 항체에 수동 결합하는 것도 다음과 같이 수행될 수 있다.
- 나노 입자 1mL 용액 (5mM 바나데이트 이온 농도)을 15분 동안 15,000g에서 원심 분리한다.
- 800 μL의 MilliQ 물에 펠릿을 채운 다음 초음파 처리(Bioblock Scientific, Ultrasonic Processor, 40초 동안 50%에서 작동하는 최대 전력 130W)로 재분산한다.
- 포타슘 포스페이트 완충액 2mM pH 7.4에 250μg/mL의 항체 용액 100μL를 추가한다.
- 1시간 동안 회전시키면서 배양한다.
- 100 μL의 포타슘 포스페이트 버퍼 20mM pH 7.4 / 1% BSA를 추가한다.
- 15,000g에서 15분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거한다.
- 1 mL의 포타슘 포스페이트 완충액 2mM pH 7.4 / 0.1% BSA에 펠릿을 채운다. 초음파 처리(Bioblock Scientific, 초음파 프로세서, 40초 동안 50%에서 작동하는 최대 전력 130W)를 통해 재분산한다.
- 15,000g에서 15분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거한다.
- 250 μL의 포타슘 포스페이트 완충액 2mM pH 7.4 / 0.1% BSA에 펠릿을 채운다. 초음파 처리(Bioblock Scientific, Ultrasonic Processor, 40초 동안 50%에서 작동하는 최대 전력 130W)로 재분산한다.
2. "샌드위치" 타입의 스트립에 대한 테스트 준비
단백질의 존재를 정성적 또는 정량적으로 결정하기 위한 신속한 테스트를 개발하려면 다양한 매개 변수를 최적화하고 반응 시간과 테스트 감도 사이의 절충안을 찾아야 한다.
도 1에 표시된 대로 분석 스트립(assay strip)의 제조는 다음 네 가지 필수 부분을 결합하여 수행된다.
- 본질적으로 불활성인 유리 섬유가 라벨링 영역(2)으로 사용된다 (영어 용어로 "컨쥬게이션 패드")(GFDX 103000, Millipore).
- 증착 영역(영어 용어로 "샘플 패드")(1)(Ref CFSP173000, Millipore)으로 표면 개질된 폴리에스터가 사용된다. 그들은 단백질과의 약한 비특이적 상호 작용, 우수한 견인력 및 우수한 취급 특성을 가지고 있다는 장점이 있다.
- 니트로셀룰로오스 멤브레인(NC)(HF180MC100, Millipore)은 모세관 작용(10)을 위한 수단으로 사용된다. 이는 액체 이동 및 단백질 고정에 최적의 특성을 가지고 있다. NC 멤브레인은 비다공성 접착 플라스틱("백킹 카드")의 지지대(6)에 접착된다.
- 셀룰로오스(CFSP173000, Millipore)는 높은 흡수 능력을 위해 흡수 패드(5)로 사용된다.
심장 바이오 마커인 h-FABP(인간 지방산 결합 단백질) 검출:
다양한 구성 요소를 조립하기 전에 NC 멤브레인에 항체를 증착해야 한다.
1. h-FABP(red. 4F29, 9F3, Hytest)에 대한 마우스 단클론 항체 용액을 PBS (pH 7.4)에 1 mg/mL 농도로 희석된다. 이 솔루션은 테스트 밴드(3)에 사용된다. 마우스 항체에 대한 염소 폴리클로날 IgG 항체(Ref ab6708, Abcam)의 또 다른 용액은 PBS (pH7.4)에 1mg/mL의 농도로 희석된다. 후자는 제어 밴드(4)에 사용된다.
2. 항체 용액은 "디스펜서"(Claremont Bio Automated Lateral Flow Reagent Dispenser (ALFRD))를 사용하여 NC 멤브레인에 증착된다. 주사기 펌프를 사용하여 0.7 μL/2 mm의 부피가 NC 멤브레인을 따라 각 밴드에 대해 증착된다(약 30cm 길이, 여러 스트립이 만들어 짐). 37℃에서 1시간 동안 건조시킨다.
3. 항체를 증착한 후, NC 멤브레인을 PBS (pH 7.4)에 희석 된 1% BSA + 0.04 %에서 Tween 20으로 37℃에서 30분 동안 배양하여 항체가 차지하지 않는 고정 부위를 부동 태화한다.
4. 디스펜서를 사용하여 라벨링 영역("접합 패드")에 NP에 결합된 Ab를 증착한다. 3 μL/4 mm의 부피가 유리 섬유 막을 따라 끝까지 도포된다. PBS(pH7.4)에 희석된 BSA 1%로 차단하기 전에 실온에서 1시간 동안 건조되도록 놔둔다. 실온에서 말린다.
스트립의 조립
1. Abs가 이미 고정된 NC의 접착 부위에 다양한 구조(흡수 패드 및 증착 영역 역할을 하는 셀룰로오스, Ab + NP가 증착된 라벨링 영역)를 조립한다. 상기 구성 요소는 라벨링 영역("컨쥬게이션 패드"), 증착 영역("샘플 패드"), 마지막으로 흡수 패드의 순서로 NC의 플라스틱 지지대에 고정된다. 모세관 현상에 의한 유체의 더 나은 이동을 위해 다양한 구성 요소가 도면(도 1)과 같이 서로 겹치도록 장착된다.
2. 종이 커터를 사용하여 조립된 멤브레인을 4mm 너비로 분리한다.
3. 스트립은 습도가 30% 미만인 대기에서 수분 흡수제(건조제)가 있는 상태에서 알루미늄 백에 보관된다.
3. 스트립 테스트 절차
스트립은 실시 예 1.2에서 제조된 항체에 결합된 Y0. 6Eu0 . 4VO4 나노 입자를 사용하여 제조된다.
h-FABP(ref. 8F65, Hytest)의 여러 농도가 5ng/mL에서 0.05ng/mL까지 측정되었다. 재조합 h-FABP는 완충액 또는 혈청으로 원하는 농도로 희석된다.
1. 위의 2번 항목에서 설명한대로 준비된 스트립과 분석할 샘플을 테스트를 수행하기 전에 실온으로 되돌린다.
2. 400 μL의 샘플을 병에 수직 위치로 보관한다.
3. 증착 영역("샘플 패드")이 아래쪽으로 향하도록 스트립을 병에 담근다. 마이그레이션을 시작하기 위하여 하단의 스트립을 탭(Tap)한다. 스트립을 튜브의 수직 위치에 10분 동안 유지한다.
4. UV 램프(Vilber Lourmat, 312nm에서 VL-8.MC 8W, 254nm에서 8W) (ImageJ에 의한 디지털 사진 및 분석, 도 6 및 7 참조)를 사용하여 도 8과 9에 제시된 판독기를 사용하여 스트립의 결과를 판독한다. 도 10은 Android에서 작동하는 휴대폰의 전용 애플리케이션을 사용하여 스트립에 대한 결과를 분석한 것이다. 판독기는 278 nm에서 4개의 LED 그룹 4개와 감지를 위해 간섭 필터(620/15, Semrock)를 사용한다. RG605 필터(Schott)와 같은 고역 통과 필터도 검출에 사용할 수 있다.
나노 입자의 흡수 스펙트럼은 도 11(A)에 나와 있다. 약 50nm의 최대 절반에서 전체 폭(a full width at half maximum)과 함께 흡수 피크는 280nm에 위치한다. 약 40nm의 최대 절반에서 전체 폭과 함께 UV 램프의 방출 스펙트럼은 310nm의 중심에 있다. 약 10nm의 최대 절반에서 전체 폭과 함께 UV LED의 방출 스펙트럼은 278nm의 중심에 있다.
결과의 질적인 해석
결과의 질적 해석은 다음과 같다.
- 두 개의 밴드가 있는 경우 : 테스트가 양성이다.
- 단일 제어 밴드가 있는 경우 : 테스트가 음성이다.
- 단일 테스트 밴드가 있는 경우 : 테스트가 유효하지 않다.
- 밴드가 없는 경우 : 테스트가 유효하지 않다.
결과의 정량적 해석
도 10은 전용 애플리케이션을 사용하여 휴대폰으로 찍은 디지털 사진에서 시작하는 정량 분석의 예를 보여준다. 휴대폰 화면의 "캡처(Capture)"에 놓이면 흑백 이미지 녹화가 트리거된다. 그런 다음 "측정(Measure)"에 놓인 후 응용 프로그램은 사용자에게 휴대폰 화면에서 손가락으로 검출 영역(detection zone)을 가리킨 다음 제어 영역(control zone)을 가리 키도록 요청하고, 따라서 응용 프로그램이 감지 영역(LD)을 포함하는 사각형 내부의 누적 발광 수준과 제어 영역(LC)을 포함하는 동일한 크기의 사각형 내부의 누적 발광 수준을 계산하도록 한다. "조정(Adjust)"에 놓이면 측정된 신호를 최대화하기 위해 검출 영역과 제어 영역에 해당하는 두 직사각형의 위치 최적화가 트리거된다. 검출 영역과 제어 영역 사이의 공간 중간에 위치한 동일한 크기의 직사각형 내부의 누적 방출 수준(cumulative emission level)은 배경 신호(LB)를 결정하고 신호 SD/C = LD/C-LB를 계산하는 역할을 한다. 응용 프로그램은 R = SD/SC 또는 R = SD/(SD + SC) 비율을 계산한 다음 표시한다. R의 값은 ng/mL의 농도 값을 제공하기 위해 교정 표와 비교할 수 있다. 결과는 나중에 다음 결과와 비교하기 위해 "저장(Save)" 기능으로 저장할 수 있다.
h-FABP 항원을 포함하는 각 샘플의 스트립 테스트를 위해 3개의 스트립을 준비 하였다. 항원을 포함하지 않는 샘플의 경우 2개의 스트립만 준비하였다.
도 7의 그래프는 5, 0.5, 0.05 및 0 ng/mL의 h-FABP를 포함하는 다른 액체 샘플에 대해 ImageJ로 측정한 R = SD/(SD + SC) 비율에 대해 얻은 결과를 보여준다. 도 7의 점은 R의 평균값을 나타내고 오류 막대는 테스트된 여러 스트립에 대한 관련 표준 편차를 나타낸다(h-FABP를 포함하는 샘플의 경우 3개의 스트립, 이를 포함하지 않는 샘플의 경우 2개의 스트립).
따라서, 본 발명에 따른 방법은 유리하게는 h-FABP가 샘플에서 5ng/mL 이하, 특히 0.5ng/mL 이하 또는 심지어는 0.05ng/mL의 낮은 값까지의 함량으로 샘플에서 검출되도록 허용한다. 즉, h-FABP는 330pM 이하, 특히 33pM 이하 또는 3.3pM까지 낮은 함량에서 검출될 수 있다.
4. "샌드위치" 유형의 " 딥스틱 " 스트립에서 Lu 0 . 6 Eu 0 . 4 VO 4 -SA 및 Lu 0 . 9 Dy 0 . 1 VO 4 -SA 나노 입자 마이그레이션
각각 실시예 1.1.d 및 1.1.e에 따라 합성된 Lu0 . 6Eu0 . 4VO4 및 Lu0 . 9Dy0 . 1VO4 나노 입자는 실시예 1.3에 따라 스트렙타비딘(SA)에 커플링 되었다(패시브 커플링). "딥스틱"스트립은 스트렙타비딘에 결합된 NP를 인식하기 위해 니트로 셀룰로스 막 상에 BSA-비오틴을 고정함으로써 실시예 2에 따라 제조되었다. 항원 부재하에 실시예 3에 따른 Lu0 . 6Eu0 . 4VO4-SA 및 Lu0 . 9Dy0 . 1VO4-SA 나노 입자로 시험 스트립을 제조하였다. 스트립은 UV 램프 여기(312 nm) 하에서 시각화되었다. 제어 라인 레벨에 두 개의 명확하고 강렬한 밴드가 형성되었다(도 22).
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Claims (25)

  1. 다음 화학식 (II)의 광발광 무기 나노 입자를 프로브로 사용하는 모세관 작용 테스트에 의해 액체 샘플에서 관심있는 생물학적 또는 화학적 물질을 검출 및/또는 정량화하는 시험관내 방법:
    A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II)
    여기서:
    - A는 이트륨(Y), 가돌리늄(Gd), 란타넘(La), 루테튬(Lu) 및 이들의 혼합물로부터 선택되고;
    - Ln은 유로퓸(Eu), 디스프로슘(Dy), 사마륨(Sm), 네오디뮴(Nd), 에르븀(Er), 이테르븀(Yb), 툴륨(Tm), 프라세오디뮴(Pr), 홀뮴(Ho) 및 이들의 혼합물에서 선택되고;
    - 0 < x < 1, 특히 0.2 ≤ x ≤ 0.6, 더욱 특히 x는 0.4의 값을 가지며; 및
    - 0 < y < 1, 특히 y의 값은 0이고;
    상기 방법은 320nm 이하의 파장에서 매트릭스의 여기(excitation)에 의해 1-광자 흡수 후 상기 나노 입자의 방출 수명이 100ms 보다 짧은 발광 검출을 사용한다.
  2. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 발광의 검출은 300 nm 이하, 특히 250 nm 내지 300 nm를 포함하는 파장에서 상기 매트릭스의 여기에 의해 수행되는(effected) 방법.
  3. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 액체 샘플은 생물학적 샘플, 특히 인간으로부터 채취한 샘플이며, 더욱 특별하게 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 비강 도말(nasal smear), 소변, 희석된 대변, 질도말 또는 뇌척수액으로부터 선택된 샘플인 방법.
  4. 선행하는 청구항에 있어서,
    샘플, 특히 생물학적 샘플에서 분자, 단백질, 핵산, 독소, 바이러스, 박테리아 또는 기생충을 검출 및/또는 정량화하기 위한 방법.
  5. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 광발광 나노 입자는 평균 크기가 5 nm 이상이고 엄격하게(strictly) 1 μm 이하, 특히 10 nm 내지 500 nm, 바람직하게는 20 nm 내지 200 nm인 방법.
  6. 선행하는 청구항에 있어서,
    Ln은 Eu, Dy, Sm, Yb, Er, Nd 및 이들의 혼합물, 특히 Eu, Dy, Sm 및 이들의 혼합물로부터 선택되며, 보다 구체적으로는 Eu인 방법.
  7. 선행하는 청구항에 있어서,
    A는 Y, Gd, La 및 이들의 혼합물로부터 선택되며, 특히 A는 Y 또는 Gd를 나타내고, 특히 A는 Y를 나타내는 방법.
  8. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 나노 입자가 pH ≥ 5의 수성 매질에서 - 28 mV 이하의, ξ로 지정된 제타 전위를 가지며 이온 전도도는 엄격히 100 μS.cm-1 미만이 될 수 있는 양으로 상기 나노 입자는 표면에 테트라알킬암모늄(tetraalkylammonium) 양이온을 포함하는 방법.
  9. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 나노 입자는 화학식 A1- xLnxVO4(III)이고, 여기서 A, Ln 및 x는 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같고, 특히 화학식 Y1- xEuxVO4(IV), 여기서 0 < x < 1, 특히 0.2 ≤ x ≤ 0.6, 보다 특히 x는 0.4의 값을 갖는 방법.
  10. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 방법은 모세관 작용 시험 장치를 사용하고, 여기서 상기 광발광 무기 나노 입자는 분석될 물질, 특히 항체 또는 항체 단편, 펩티드, 화학적으로 변형된 핵산 또는 압타머와 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 시약에 결합하는 방법.
  11. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 방법은 모세관 작용 시험 장치를 사용하고, 상기 광발광 무기 나노 입자는 모세관 작용 시험 장치 내에서의 이동을 용이하게 하도록 의도된, 특히 스텔스제(stealth agent) 또는 부동태화제(passivating agent)로부터 선택되고, 더욱 특히 실란화된 PEG 사슬, 폴록사머 및 폴리락트산(PLA)으로부터 선택되는 하나 이상의 제제로 표면에서 기능화 되는 방법.
  12. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 방법은
    - 액체 샘플 및 선택적으로 희석제의 증착을 위한 영역(1);
    - 분석될 물질과 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 시약에 결합된 상기 광발광 무기 나노 입자(프로브)가 로딩된 "라벨링 영역"이라고 불리는 증착 영역의 하류에 배치된 영역(2);
    - 분석될 물질에 특정한 하나 이상의 포획 시약이 고정되는, 라벨링 영역(2)의 하류에 배치된 "검출 영역"이라고도 하는 반응 영역(3);
    - 상기 검출 영역(3)의 하류에 위치하고, 분석할 물질과 특이적으로 결합하는 시약에 특이적인 하나 이상의 제2포획 시약이 고정되는 제어 영역(4);및
    선택적으로 반응 영역 및 제어 영역의 하류에 배열된 흡수 패드(5)를 포함하는 모세관 작용 시험 장치를 사용하는 방법.
  13. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 방법은 적어도 다음 단계를 포함하는 방법:
    (i) 분석할 액체 샘플 및 선택적으로 희석제(diluent)를 모세관 작용 테스트 장치의 증착 영역(1) 수준에 적용하는 단계;
    (ii) 광발광 나노 입자에 의해 생성된 발광이 반응 영역(3)에서 검출될 때까지 및/또는 발광이 이동 제어 영역(4)에서 검출될 때까지 장치를 인큐베이션하는 단계; 및
    (iii) 결과를 판독하고 및 해석하는 단계.
  14. 선행하는 청구항에 있어서,
    모세관 작용 시험 결과의 판독은 분석이 끝날 때 모세관 작용 시험 장치의 수준에서 고정된, 특히 검출 영역(3)의 수준에서, 그리고 선택적으로 제12항에 정의된 장치의 제어 영역(4)의 수준에서 고정된 프로브에 의해 생성된 발광을 검출함으로써 수행되는 방법.
  15. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 나노 입자는 화학식 Y1- xEuxVO4 (IV)이고, 상기 발광의 검출은 230 ~ 320nm, 특히 250 ~ 310nm, 더욱 특히 265 ~ 295nm의 파장에서 YVO4 매트릭스의 여기에 의해 수행되는 방법.
  16. 선행하는 청구항에 있어서,
    모세관 작용 시험 결과의 판독은 모세관 작용 시험 장치, 특히 방출 필터를 사용하는, 제12항에 정의된 바와 같은 모세관 작용 시험 장치의 검출 영역 및 선택적으로 제어 영역을 육안으로 직접 관찰함으로써 이루어지는 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    모세관 작용 시험의 결과 판독은 방출 필터 및 광자 검출기, 특히 CCD 또는 CMOS 카메라를 포함하는 검출 장비를 사용하여 수행되는 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항 및 제17항에 있어서,
    특히 상기 관심있는 물질의 정량적 특성을 얻기 위한 결과의 해석은 청구항 제12항에 정의된 모세관 작용 테스트 장치의 검출 영역, 제어 영역 및 배경 신호에 해당하는 신호의 결정, 배경 신호의 발광 값을 빼는 단계 그 다음 감지 영역의 신호와 제어 영역의 신호 비율을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 액체 샘플에서 관심있는 생물학적 또는 화학적 물질을 검출 및/또는 정량화하는 데 유용한 모세관 작용 테스트 장치로, 상기 장치는 다음 화학식 (II)의 광발광 무기 나노 입자를 프로브로 포함하는 장치:
    A1-xLnxVO4(1-y)(PO4)y (II)
    여기서:
    - A는 이트륨(Y), 가돌리늄(Gd), 란타넘(La), 루테튬(Lu) 및 이들의 혼합물로부터 선택되고;
    - Ln은 유로퓸(Eu), 디스프로슘(Dy), 사마륨(Sm), 네오디뮴(Nd), 에르븀(Er), 이테르븀(Yb), 툴륨(Tm), 프라세오디뮴(Pr), 홀뮴(Ho) 및 이들의 혼합물에서 선택되고;
    - 0 < x < 1, 특히 0.2 ≤ x ≤ 0.6, 더욱 특히 x는 0.4의 값을 가지며; 및
    - 0 < y < 1, 특히 y의 값은 0이고;
    상기 방법은 320nm 이하, 특히 300nm 이하, 더욱 특히 250 ~ 300nm의 파장에서 매트릭스의 여기(excitation)에 의해 1-광자 흡수 후 상기 나노 입자의 방출 수명이 100ms 보다 짧은 발광 검출을 사용한다.
  20. 선행하는 청구항에 있어서,
    상기 나노 입자는 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 장치.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서,
    상기 장치는 제12항에 정의된 바와 같은 장치.
  22. 다음 중 적어도 하나는 포함하는, 체외 진단 키트:
    - 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 모세관 작용 시험 장치; 및
    - 분석 종료시, 상기 장치 수준에서, 특히 제21항에 정의된 바와 같은 모세관 작용 시험 장치의 검출 영역 및/또는 제어 영역의 수준에서 고정된 프로브에 의해 생성된 발광을 검출하기 위한 장치.
  23. 체외 진단의 목적을 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 방법 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 청구된 모세관 작용 시험 장치의 용도.
  24. 관심있는 물질, 특히 농산물 또는 식품 또는 환경 중의 병원체를 검출 및/또는 정량화하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 방법 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 청구된 모세관 작용 시험 장치의 용도.
  25. 불법 화학 물질, 특히 약물 또는 경찰이나 방어를 위한 기타 관심 물질을 탐지 및/또는 정량화하기 위한, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 청구된 방법 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 청구된 모세관 작용 시험 장치의 용도.
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