KR20210051138A

KR20210051138A - 사람 폐 조직으로부터 2형 폐포 세포 분리 및 계대배양 방법, 및 이를 이용한 폐 오가노이드 제작 방법

Info

Publication number: KR20210051138A
Application number: KR1020190136022A
Authority: KR
Inventors: 김성원; 연정민; 배현아
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2021-05-10
Also published as: KR102461222B1

Abstract

본 발명은 사람 폐 조직으로부터 2형 폐포 세포 분리 및 계대배양 방법, 및 이를 이용한 폐 오가노이드 제작 방법 등에 관한 것이다.

Description

사람 폐 조직으로부터 2형 폐포 세포 분리 및 계대배양 방법, 및 이를 이용한 폐 오가노이드 제작 방법{Alveolar type Ⅱ cell isolation from human lung tissue and subculture method, and method for producing lung organoid using thereof}

최근 성체줄기세포(adult stem cells), 배아줄기세포(embryonic stem cell), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)로부터 오가노이드를 배양하여 기존의 2D 배양법의 조직의 본연의 성질과 조직 단위의 특성 재현의 어려움 등의 한계를 극복할 수 있는 방법이 개발되고 있다. 오가노이드는 인체의 생리활성 기능을 비슷하게 재현해 낼 수 있어 사람의 조직으로부터 장기유사체인 오가노이드를 만들고 오가노이드 기반의 질환모델링, 신약개발의 플랫폼 구축 및 재생의료 등의 적용분야가 점차적으로 확대되고 있다.

최근 대기오염원인 미세먼지의 농도증가가 암을 포함한 폐질환과 관련된 위험성 및 사망률 증가와 관련성이 있다는 연구 결과가 발표되고 있다. 또한, 폐질환은 세계의 주요 사망원인 중 세 번째 요인으로 알려져 있으나, 손상된 폐를 회복시키는 원리는 알려져 있지 않다.

폐는 다른 장기에 비해 구조적으로 복잡하고 세포의 종류가 다양함에도 불구하고, 아직까지 많은 연구가 진행되지 않고 있다. 특히, 폐 조직에서 2형 폐포세포(ATII, Alveolar type II cells)는 폐포 상피세포 중 60% 정도를 구성하고 있으며 surfactant protein을 생산하여 폐의 기능과 표면장력을 유지시킴으로서 붕괴(collapse)를 막아주는 주는 역할을 한다.

그러나, 2형 폐포세포는 2D에서 배양하였을 경우 1형 폐포세포와 같은 모양의 표현형(phenotype)을 갖게 되어 배양에 어려움이 있으며, 사람 폐 조직에서 2형 폐포세포를 유지시키는 것이 어려운 실정이며. 폐 조직 세포를 이용한 오가노이드 제작 방법 또한 폐 조직의 수급의 어려움으로 인해 용이하지 아니한 상황이다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0047343호

이에 본 발명자들은 적은 양의 폐 조직을 이용하여 2형 폐포세포를 분리하고 이를 계대배양한 후, 상기 세포를 이용한 폐 오가노이드를 제작하였으며, 또한 폐 오가노이드가 가장 잘 만들어지는 적합한 배지를 개발하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 2형 폐포세포의 분리 및 증식 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 폐 조직으로부터 분리한 2형 폐포세포로부터 폐 오가노이드의 제작방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 2형 폐포세포 계대배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 폐 오가노이드 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제작된 폐 오가노이드를 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

따라서, 상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 2형 폐포세포의 분리 및 증식 방법을 제공한다.

a) 분리한 폐 조직을 지름 0.01 내지 100mm 의 크기로 절개하는 단계;

b) 상기 a) 단계의 절개된 조직을 효소와 반응시켜 2형 폐포세포를 분리하는 단계;

c) 상기 분리한 2형 폐포세포를 제1 배지에서 증식시키는 단계; 및

d) 상기 제1 배지에서 증식된 세포를 제2 배지에 계대배양하는 단계.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 2형 폐포세포는 HTII-280을 발현할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 b) 단계의 효소는 트립신 및 엘라스타제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 c) 단계의 제1 배지는 세포배양용으로 통상적으로 사용되는 공지의 기본배지일 수 있다. 상기 기본배지는 예컨대, M199/F12 혼합물, MEM-알파(alpha Minimal essential Medium) 배지, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지, MCDB 131 배지, IMEM 배지, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (Ham's)) 배지, PCM 배지 또는 MSC 확장 배지 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 c) 단계는 HBSS를 이용하여 죽은 세포를 제거하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 c) 단계의 제1 배지는 DMEM/F12일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 c) 단계는 20 내지 50℃, 25 내지 45℃, 30 내지 45℃, 35 내지 39℃, 36 내지 38℃, 약 37℃에서 배양될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 d) 단계의 제2 배지는 SAGM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 c) 단계의 혼합물은 마트리겔 코팅된 디쉬에 넣어진 상태로 제2 배지에서 계대배양되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 d) 단계의 계대배양은 1 내지 5일, 1 내지 4일, 1 내지 3일, 바람직하게는 2일마다 배지를 교환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 d) 단계의 계대배양은 세포가 콜로니를 형성하면 배지를 교환하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 100%, 90%, 80%, 75%, 70%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%. 51%, 또는 50% 이상 세포가 자란 경우 배지를 교환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 d) 단계는 20 내지 50℃, 25 내지 45℃, 30 내지 45℃, 35 내지 39℃, 36 내지 38℃, 약 37℃에서 배양될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 2형 폐포세포로부터 폐 오가노이드의 제작방법을 제공한다.

1) 폐 조직으로부터 분리한 2형 폐포세포를 폐 섬유아세포 및 마트리겔(matrigel)과 혼합하는 단계;

2) 상기 1) 단계의 혼합물에 ROCK 억제제를 첨가하는 단계; 및

3) 상기 2) 단계의 혼합물을 제3 배지에서 배양하는 단계.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 2형 폐포세포 및 폐 섬유아세포는 1 : 0.1 내지 100, 1 : 0.1 내지 50, 1 : 0.1 내지 25, 1 : 0.1 내지 20, 1 : 1 내지 20, 1 : 5 내지 15, 1 : 8 내지 12, 또는 1 : 10 의 세포수(cells) 비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 마트리겔은 폐 섬유아세포와 1 : 0.1 내지 100, 1 : 0.1 내지 10, 1 : 0.5 내지 5, 1 : 0.5 내지 1.5, 1 : 0.9 내지 1.1, 또는 1 : 1 의 부피비로 혼합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 ROCK 억제제는 상기 2) 단계의 혼합물에 대하여 0.1 내지 100 , 0.5 내지 80, 0.5 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 5 내지 15, 7 내지 13, 8 내지 12, 9 내지 11, 또는 10 μM / ml로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 제3 배지는 폐포화 배지(alveolrization media)일 수 있다. 상기 폐포화 배지는 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX, B27 보충제, BSA, HEPES, 염화칼슘, ITS 프리믹스, 8-Br-cAMP, FGF7, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 2형 폐포세포 계대배양용 배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 폐 오가노이드 배양용 배지 조성물을 제공한다.

상기 폐 오가노이드 배양용 배지 조성물은 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX, B27 보충제, BSA, HEPES, 염화칼슘, ITS 프리믹스, 8-Br-cAMP, FGF7, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제작된 폐 오가노이드를 제공한다.

본 발명에 따르면, 폐 조직으로부터 분리된 2형 폐포세포를 계대배양함으로써 많은 수의 2형 폐포세포를 저장하여 사용할 수 있으며, 이러한 세포를 이용하여 다량의 표준화된 폐 오가노이드를 형성할 수 있다. 또한, 간단한 방법을 이용하여 정확한 폐 오가노이드가 만들어지는 배지의 구성을 확인하였는 바, 본 발명에 따른 사람 2형 폐포세포를 이용하여 폐 오가노이드를 제작함으로써 질환 모델링 또는 약물 스크리닝뿐만 아니라 재생의료 등에 유용하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 (A) 2형 폐포세포를 2D culture로 계대배양하여 P0에서 P3까지의 세포 모양을 나타내며, (B) 2형 폐포세포의 marker인 lamellar body를 lysotracker 형광시약으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 2D culture P0 및 P3에서 2형 폐포세포의 marker인 lamellar body를 ATII세포에서 TEM으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 계대배양한 P1, P2 및 P3의 2형 폐포세포를 MRC5와 Alveolar media를 사용하여 공동 배양한 오가노이드의 모양을 나타낸 것이다.
도 4는 Alveolar media를 사용한 폐 오가노이드에서 ATI, ATII, club cell marker를 확인한 결과이다.
도 5는 계대배양한 P2와 P3의 2형 폐포세포를 MRC5와 공동배양한 오가노이드의 모양을 나타낸 것이다.
도 6은 Edward media를 사용한 폐 오가노이드에서 ATI, ATII, club cell marker를 확인한 결과이다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 2형 폐포세포의 분리 및 증식 방법을 제공한다.

b) 상기 a)단계의 절개된 조직을 효소와 반응시켜 2형 폐포세포를 분리하는 단계;

본 발명의 일 실시예에서는 정상 사람 폐 조직으로부터, 본 발명의 특정 배지를 사용하여 2형 폐포세포를 분리 및 계대배양을 함으로써, 폐포 세포 수를 유지할 수 있음을 확인하였으며, 계대배양된 세포를 이용하여 폐 오가노이드를 제작하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 a) 단계의 폐 조직은 0.01 내지 100 mm, 0.01 내지 50 mm, 0.01 내지 40 mm, 0.01 내지 30 mm, 0.01 내지 20 mm, 0.01 내지 10 mm, 0.01 내지 5 mm, 0.01 내지 3 mm, 0.01 내지 2 mm, 0.01 내지 1 mm 의 크기로 절개되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 c) 단계의 제1 배지는 세포배양용으로 통상적으로 사용되는 공지의 기본배지로서, 예컨대, M199/F12 혼합물, MEM-알파(alpha Minimal essential Medium) 배지, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지, MCDB 131 배지, IMEM 배지, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (Ham's)) 배지, PCM 배지 또는 MSC 확장 배지 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 이들 기본배지는 염, 비타민, 완충액, 에너지 공급원, 아미노산 및 다른 물질을 포함하며, 세포의 배양 시동물 유래 혈청을 약 10% 내지 30% 정도 포함하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 위한 범용적인 영양분을 제공하게 된다. 세포 배양에 사용되는 혈청은 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청일 수 있고, 바람직하게는, 우태아혈청(FBS)일 수 있다. 또한, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.

또한, 세포 배양 시, 항생제, 항진균제 및 오염을 야기하는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 시제를 첨가하는 것이 좋다.

항생제로는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 펀지존(fungizone) 등의 통상 세포배양에 사용되는 항생제를 사용할 수 있다. 항진균제로는 암포테리신 B, 마이코플라스마 억제제로는 타일로신을 이용하는 것이 바람직하며 젠타마이신, 시프로플록사신, 아지트로마이신등으로 마이코플라스마 오염을 방지할 수 있다.

필요에 따라 L-글루타민 등의 산화영양소와 소듐 피루베이트 등 에너지 대사물질을 더 첨가할 수 있다.

초기 배양의 일반적 배양조건은 세포배양에 가장 적합한 조건을 적용하여 습도 90 내지 95％, 온도 25 내지 40℃, 5 내지 10％ CO₂ 배양기에서 배양하고, 5 내지 10％ CO₂ 배양 시에는 최종농도가 0.17 내지 0.22 중량％가 되게 소듐 바이카보네이트 등의 탄소 조절원을 첨가해줄 수 있다.

본 발명에서, "폐 조직"은 모든 폐 조직 구조, 및 정맥, 동맥, 혈관, 모세관, 및 상기 구조의 일부이거나, 또는 그와 관련된 유형의 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 관련된 조직; 폐 및 흉막 조직; 및 혈관 평활근, 혈관주위세포, 및 혈관 내피 계통 및/또는 표현형을 포함할 수 있지만, 그에 한정되지 않는다. 상기 폐 조직은 포유동물, 예컨대 인간, 마우스, 랫트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 또는 고양이 등에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 인간일 수 있다. 이러한, 폐 조직을 수득하는 방법에 대해서는 당업계에서 잘 알려져 있다.

본 발명에서, “2형 폐포세포”는 폐 조직으로부터 분리된 것, 분리 후 계대배양된 것, 또는 상업적으로 구입된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 2형 폐포세포는 ATII-280을 발현하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, "계대배양(subculture)"은 세포증식 방법의 하나로 1 내지 7일마다 주기적으로 이전 배양으로부터 새로운(fresh) 배지에 옮겨 배양하는 방법으로, 세포주를 보존하고 세포의 대를 이어나가는 배양방식을 의미한다. 이러한 방법은 subculturing 또는 passaging이라고 한다. 이러한 계대배양을 통해 축적되는 독성 대사물질을 제거하고 고갈된 영양분을 공급하여 세포 사멸을 억제하고 성장 및 증식을 촉진할 수 있다.

본 발명에서 "증식"은 유사한 형태의, 특히, 세포의 번식 또는 증가를 의미하는 것으로 사용된다. 즉, 증식은 더 많은 개수의 세포 생성을 포함하며, 특히 단순히 세포 개수를 계수하는 것, ³H-티미딘의 세포 내로의 혼입을 측정하는 것 등에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "성장 배지"라는 용어는 세포의 성장을 촉진하는 배양 배지를 의미하는 것으로 한다. 성장 배지는 일반적으로 동물 혈청을 함유할 것이다. 일부 예에서, 성장 배지는 동물 혈청을 함유하지 않을 수도 있다. 본 발명의 제1 배지 또는 제2 배지는 성장 배지일 수 있다.

본 발명에서, "소기도 성장 배지" 또는 "SAGM"이라는 어구는 하기 성분, 히드로코르티손, 표피 성장인자, 에피네프린, 트랜스페린, 인슐린, 레티노산, 트리아이오도티로닌, 및 소 혈청 알부민-지방산 무함유 중 하나 이상의 것을 포함하는 성장 배지를 의미한다.

2) 상기 1) 단계의 혼합물에 ROCK 억제제를 첨가하는 단계; 및

3) 상기 2) 단계의 혼합물을 제3 배지에서 배양하는 단계.

본 발명에서, "오가노이드"란 용어는 조직 또는 기관의 표면적 외관 또는 실제 구조 또는 기능을 모방하는 하나 이상의 세포 유형의 3차원 집합체를 지칭한다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 3) 단계는 1 내지 60일, 1 내지 50일, 1 내지 40일, 1 내지 30일, 1 내지 25일, 또는 1 내지 20일마다 배지를 교환하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 “ROCK(Rho-associated kinase)”는 세린-쓰레오닌 카이네이즈의 AGC(PKA/PKG/PKC) 패밀리에 속하며 포유류(인간, 래트, 마우스), 제브라피쉬(zebrafish), 제노푸스(Xenopus), 무척추동물(C. 엘레강스, 모기, 초파리) 및 닭에서 발견되는 인산화 효소를 말한다. 포유류의 ROCK는 카이네이즈 도메인, 꼬인 코일 부위(coiled-coil region) 및 PH(Pleckstrin homology) 도메인으로 구성되어 있으며, PH 도메인은 분자 내 폴딩에 의한 자가억제 기작을 가지므로 RhoA-GTP가 없으면 카이네이즈의 활성이 감소된다. 인간의 ROCK은 158 kDa의 분자량을 가지고 small GTPase RhoA의 주요 다운스트림 작동자이다. 용어“ROCK 억제제 (Rho-associated kinase inhibitor)”는 Y27632(trans-4-[(1R)-1-Aminoethyl]-N-4-pyridinylcyclohexanecarboxamide, 2HCl), H-1152[(S)-(+)-(2-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonylhomopiperazine, 2HCl], HA-1077[(5 isoquinolinesulfonyl)homopiperazine, 2HCl], 및 ROCK inhibitor II [N-(4-pyridyl)-N'-(2,4,6-trichlorophenyl)urea]를 포함하나, 이제 제한되지 않고 ROCK의 활성을 억제하는 것으로 당업계에 알려진 모든 물질을 포함한다.

본 발명의 다른 실시예에서 상기 ROCK 억제제는 0.1 내지 100 , 0.5 내지 80, 0.5 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 5 내지 15, 7 내지 13, 8 내지 12, 9 내지 11, 또는 10 μM / ml로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 제3 배지는 폐포화 배지일 수 있다.

상기 폐포화 배지는, 2형 폐포세포를 폐 오가노이드로의 배양, 성장 및/또는 증식을 가능하게 하는 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폐포화 배지는 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine), B27 보충제, BSA, HEPES, 염화칼슘, ITS 프리믹스, 8-Br-cAMP, FGF7, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폐포화 배지는 Ham's F12 20 ml에 대하여, IBMX 50 내지 150 μM, B27 보충제, 덱사메타손 20 내지 70 nM, ITS 프리믹스 0.01 내지 1 %, BSA 0.1 내지 0.5%, 염화칼슘 0.5 내지 1.5 mM, HEPES 10 내지 20 mM, 8-Br-cAMP 10 내지 200 μM, FGF7 1 내지 20 ng/ml 및/또는 페니실린/스트렙토마이신 10 내지 100 U/ml을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폐포화 배지는 사용 전에 8-Br-cAMP 및 FGF7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 폐 오가노이드 배양용 배지 조성물은 상기 폐포화 배지와 동일한 조성을 가지는 것일 수 있으며, Ham's F12, 덱사메타손, IBMX, B27 보충제, BSA, HEPES, 염화칼슘, ITS 프리믹스, 8-Br-cAMP, FGF7, 페니실린/스트렙토마이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 "오가노이드 배양"은 오가노이드를 생성하거나 유지시킬 수 있는 모든 행위를 포함한다. 예를 들면 세포 또는 특정 조직으로부터 분리된 세포가 특정 기능을 갖는 조직이나 기관 세포로 분화시키는 것일 수 있으며, 및/또는 오가노이드를 생존, 성장 또는 증식시키는 것일 수 있다.

상기 2형 폐포세포 및 상기와 같은 세포를 포함하는 조작된 폐 오가노이드는 생체 내에서 피실험자의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명은 피실험자의 호흡기 질환의 치료 방법을 포함한다. 본 발명에 개시된 바와 같이, 하나의 태양에서 방법은 호흡기 질환의 증상의 개선, 치료 또는 경감이 필요한 피실험자에서 상기 증상의 개선, 치료 또는 경감을 포함한다. 상기 방법은 또한 2형 폐포 세포 또는 상기와 같은 세포를 포함하는 폐 오가노이드를 상기 피실험자의 호흡기 질환의 치료에 유효한 양으로 투여함을 포함한다.

상기 피실험자의 치료 방법은 2형 폐포 세포 또는 상기와 같은 세포를 포함하는 폐 오가노이드를 투여하거나 2형 폐포 세포 또는 상기와 같은 세포를 포함하는 폐 오가노이드를 이식함을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 투여 또는 이식 결과 상기 피실험자에서 호흡기 질환의 증상이 개선, 치료 또는 경감된다. 상기 개선, 치료 또는 경감은 자연적 감각 또는 인공 장치를 사용하여 탐지될 수 있는 상기 호흡기 질환 또는 상기 호흡기 질환의 증상의 임의의 변화일 수 있다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "피실험자" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 비-인간 포유동물은 예를 들어 가축 및 애완동물, 예를 들어 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 뮤린 포유동물을 포함한다. 바람직하게, 상기 피실험자는 인간이다.

본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 호흡기 질환은 호흡기 중에 신체적으로 나타난 질병 또는 상태, 예를 들어 비제한적으로 낭성 섬유증, 호흡곤란 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 폐결핵, 기침, 기관지 천식, 증가된 기도 과민반응에 기반한 기침(기관지염, 독감 증후군, 천식, 폐쇄성 폐질환 등), 독감 증후군, 기침억제, 기도 과민반응, 결핵 질병, 천식(기도 염증성 세포 침윤, 증가된 기도 과민반응, 기관지수축, 점액 과분비 등), 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 기침, 가역적인 기도 폐쇄, 성인 호흡기 질병 증후군, 비둘기 사육자병, 농부의 폐, 기관지폐 이형성증, 기도 질환, 폐기종, 알러지성 기관지폐 아스퍼질러스증, 알러지성 기관지염 기관지확장증, 직업성 천식, 반응성 기도 질병 증후군, 간질성 폐 질병, 기생충성 폐 질병 등이다.

본 발명의 2형 폐포 세포 또는 상기와 같은 세포를 포함하는 폐 오가노이드는 약학적 조성물에 1 pg 내지 30g w/v%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “개체”란 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 호흡기 질환을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 호흡기 질환 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 호흡기 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

본 발명에서 "희석제(diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 체액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약학적 조성물로서, 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 분해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 대용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.

본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본 발명의 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 폐 조직에서 폐포세포 분리와 계대배양

본 연구에 이용한 사람 폐 조직은 폐수술 시행과정에서 얻어진 조직으로서 수술 전 환자의 동의하에 이용하였다. 정상 폐 조직을 채취한 후 항생-항진균용액(Giboco, amphotericin B, penicillin, streptomycin)이 포함된 HBSS 용액(Gibco, Gaithersberg, MD)으로 얼음에 넣어 운반하여 세포를 분리하였다. 구체적으로, 사람 2형 폐포세포 분리를 위해 수술과정에서 절제한 정상 폐 조직을 항생-항진균용액이 포함된 HBSS 용액으로 혈액이 보이지 않을 때까지 세척하였다. 혈액이 제거된 폐 조직을 수술용 가위를 이용하여 0.5 mm³ 이하의 크기로 작게 자른 후 30 ml HBSS가 포함된 용액으로 이동시킨 뒤 100um strainer로 걸러준 후 3회 이상 세척하였다.

1.5 ml 트립신(trypsin, 10 KU/ml; sigma), 300 ul 엘라스타제(elastase, 4.45 U/ml)가 포함된 40 ml HBSS에 작게 잘린 폐 조직을 넣어서 37℃ shaking incubator에 45분간 넣어 반응시키고, 30 ml DMEM/F12, 10 ml FBS, 1 ml DNase I(10,000 U/ml)이 포함된 inhibition 용액을 넣고 25 ml 파이펫으로 5분 동안 피펫팅하였다..

반응 시킨 용액을 100 um, 75 um, 40 um strainer로 통과 시킨 후 50 ml 팔콘 튜브(falcon tube)에 모아서 300 g에서 10분 동안 실온에서 원심분리하였다. 상층액을 버리고 20 ml DMEM/F12을 넣고 500 g에서 5분 동안 실온에서 원심분리를 2회 반복하였다. 1% geltrex(DMEM/F12) 2 ml을 60 mm dish에 30분 동안 37℃ incubator에 넣은 후 DPBS로 2회 세척한 dish에 세포를 SAGM media(Lonza) 5 ml을 부유시킨 후 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

2-3일에 1회씩 SAGM media를 교환하고 ATII세포가 60% 이상 자라면 TrypLE를 이용하여 세포를 떼어서 계대배양하였다.

실시예 2. 계대배양한 2형 폐포세포 모양과 lamellar body 확인

상기 실시예 1에 따라 ATII를 계대배양한 세포를 P0에서 P3까지의 모양을 확인하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, colony 형태로 자라는 ATII 세포는 전형적인 마름모 모양의 세포 모양이 관찰되어 육안적으로 ATII 세포임을 확인하였다.

또한, P2-P4까지 배양된 ATII의 특징적인 marker인 lamellar body를 Lysotracker 형광을 30분동안 반응시킨후 형광현미경에서 관찰하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 배양된 세포가 핵 주변에서 lamellar body를 나타내는 것을 확인하였는 바, ATII임을 확인하였다.

실시예 3. 계대배양한 2형 폐포세포에서 TEM을 통한 lamellar body 확인

상기 실시예 1에 따라 ATII세포를 P0와 계대배양하여 P3에서 glutaladehyde 고정 후 세포처리 후 TEM을 통하여 lamellar body를 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, P0 및 계대배양한 P3의 세포로부터 lamellar body를 확인함으로서 ATII가 계대배양으로 유지되는 것을 확인하였다.

실시예 4. 계대배양한 2형 폐포세포를 폐포화 배지(alveolarization media)를 사용하여 오가노이드 제작

상기 실시예 1에 따라 계대배양한 ATII 세포가 디쉬의 60%이상 자랐을 때 DPBS로 2회 세척 후 TrypLE 1 ml을 넣고 37℃ CO₂ 배양기에서 5분 정도 반응시킨 후 5 ml SAGM media를 넣고 pipetting후 15 ml tube에 넣고 1300 rpm에서 3분동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 인간 섬유아세포(MRC5; ATCC)는 10 passage 이하의 세포를 이용하였다. 섬유아세포는 L-DMEM(Gibco)과 10% FBS(Gibco)와 anti-anti(1x)가 포함된 배지를 넣어서 37℃에서 배양시킨 후 세포를 분리하였다.

2형 폐포세포 1X10⁴ cells과 MRC5 1X10⁵ cells을 45 ul 폐포화 배지(alveolar media)에 넣고 부유시킨 후 마트리겔(matrigel) 45 ul을 섞어서 24 transwell 상에 삽입해 넣고 37℃ CO₂ incubator에 넣고 30분 후에 bottom에 500 ul 의 폐포화 배지에 10 uM Y27632를 넣고 2일 뒤 폐포화 배지로 교체 후 2-3일마다 배지를 교환하여 배양하였다. 14-20일 동안 배양하여, 제작된 폐 오가노이드를 분석하였다.

폐포화 배지 성분

Media component	Final concentration
8-Br-CAMP	100 uM
FGF7 (human KGF)	10 ng/ml
IBMX	100 uM
B27 supplement	1x
Dexamethasone	50 nM
ITS premix	0.10%
BSA	0.25%
CaCl₂	0.8mM
Hepes	15 mM
Penicillin / Streptomycin	100U·ml^- ¹/100νg·ml^-1
Ham's F12	20 ml

*8-Br-cAMP 와 FGF7 은 사용전에 첨가한다.

실시예 5. 계대배양한 2형 폐포세포를 폐포화 배지로 제작된 폐 오가노이드 모양 확인

상기 실시예 4에 따라 P1의 ATII 세포를 떼어서 섬유아세포와 공동배양하여 5일, 8일의 폐 오가노이드, P2의 ATII 세포를 떼어서 섬유아세포와 공동배양하여 2일, 5일, 11일 폐 오가노이드, P3의 ATII 세포를 5일, 6일 폐 오가노이드 모양을 확인하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 배양된 폐 오가노이드 모두 둥근 모양의 오가노이드가 형성되어지는 것이 확인되었다.

실시예 6. 폐 오가노이드에서 폐포세포의 marker 확인

상기 실시예 4에 따라 제작된 폐 오가노이드를 4% 파라포름알데히드로 고정 후 조직 처리후 1형 폐포세포의 마커인 HTI-56과 2형 폐포세포의 마커 HTII-280, pro-spc와 club cell의 마커인 CCSP를 면역염색하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 형광염색과 DAB 발색 모두에서 폐포의 구성성분인 1형 폐포세포인 HTI-56과 2형 폐포세포의 마커 HTII-280가 확인되었다.

비교예 1. 계대배양한 2형 폐포세포를 에드워드 배지(Edward media)에서 제작한 폐 오가노이드 모양 및 2형 폐포세포 Marker 확인

비교예 1-1. 폐 오가노이드 모양 확인

상기 실시예 1에 따라 계대배양한 ATII 세포가 디쉬의 60%이상 자랐을 때 DPBS로 2회 세척 후 TrypLE 1 ml을 넣고 37℃ CO₂ 배양기에서 5분 정도 반응시킨 후 5 ml SAGM media를 넣고 피펫팅 후 15 ml 튜브에 넣고 1300 rpm에서 3분동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 인간 섬유아세포 (MRC5; ATCC)는 10 passage 이하의 세포를 이용하였다. 섬유아세포는 L-DMEM(Gibco)과 10% FBS(Gibco)와 anti-anti(1x)가 포함된 배지를 넣어서 37℃ 배양 시킨 후 세포를 분리하였다.

2형 폐포세포 5X10³ cells과 MRC5 5X10⁴ cells을 45 ul 에드워드 배지에 넣고 부유시킨 후 마트리겔 45 ul을 섞어서 24 transwell 상에 삽입해 넣고 37℃ CO₂ 배양기에 넣고 30분 후에 bottom에 500 ul 의 에드워드 배지에 10 uM Y27632를 넣고 2일 뒤 에드워드 배지로 교체 후 2-3일마다 배지를 교환하여 배양하였다. 14-20일 동안 배양 한 후에 폐 오가노이드를 분석하였다.

에드워드 배지 성분

Media component	Final concentration
Wnt3a	200 ng/ml
FGF7	50 ng/ml
FGF10	50 ng/ml
XAV939	10 uM
CHIR99021	1 uM
Penicillin / Streptomycin	100U·ml^- ¹/100νg·ml^-1
SAGM(-epinephrine)	20 ml

P1 및 P2의 ATII 세포를 떼어서 fibroblast와 공동배양하여 4일, 11일의 폐 오가노이드의 모양을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 배양된 폐 오가노이드 일부에서 둥근 모양의 오가노이드가 잘 형성되지 않는 것이 확인되었다.

비교예 1-2. 폐 오가노이드 마커 확인

상기 비교예 1에 따라 제작된 폐 오가노이드를 4% 파라포름알데히드로 고정 후 조직 처리후 1형 폐포세포의 마커인 HTI-56과 2형 폐포세포의 마커 HTII-280, pro-spc와 club cell의 마커인 CCSP를 면역염색하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 주로 2형 폐포세포의 마커만 몇 개의 오가노이드에서 확인되었다.

따라서, 에드워드 배지를 이용한 경우 2형 폐포세포가 폐 오가노이드로의 배양이 잘 이루어지지 않음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

하기 단계를 포함하는 2형 폐포세포의 분리 및 증식 방법:
a) 개체로부터 분리한 폐 조직을 지름 0.01 내지 100mm 의 크기로 절개하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 절개된 조직을 효소와 반응시켜 2형 폐포세포를 분리하는 단계;
c) 상기 분리한 2형 폐포세포를 제1 배지에서 증식시키는 단계; 및
d) 상기 제1 배지에서 증식된 세포를 제2 배지에 계대배양하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 2형 폐포세포는 HTⅡ-280을 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 b) 단계의 효소는 트립신 및 엘라스타제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 배지는 M199/F12 혼합물, MEM-알파(alpha Minimal essential Medium) 배지, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지, MCDB 131 배지, IMEM(Improved Minimum Essential Medium) 배지, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (Ham's)) 배지, PCM 배지 및 MSC(mesenchymal stromal cell) 확장 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 배지는 소기도 성장 배지(SAGM)인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 c) 단계는 20 내지 50℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 d) 단계의 계대배양은 1 내지 5일마다 배지를 교환하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 d) 단계는 20 내지 50℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
하기 단계를 포함하는 2형 폐포세포로부터 폐 오가노이드를 제작하는 방법.
1) 제1항의 방법으로 분리 및 증식된 2형 폐포세포를 폐 섬유아세포 및 마트리겔(matrigel)과 혼합하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 혼합물에 ROCK(Rho-associated kinase) 억제제를 첨가하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계의 혼합물을 제3 배지에서 배양하는 단계.
제9항에 있어서,
상기 2형 폐포세포 및 폐 섬유아세포는 1 : 0.1 내지 100의 세포수 비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 마트리겔은 폐 섬유아세포와 1 : 0.1 내지 100의 부피비로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 ROCK 억제제는 상기 2) 단계의 혼합물에 대하여 0.1 내지 100μM/ml로 첨가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항에 있어서,
상기 제3 배지는 폐포화 배지(alveolrization media)인 것을 특징으로 하는, 방법.
제13항에 있어서,
상기 폐포화 배지는 Ham's F12, 덱사메타손, IBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine), B27 보충제, BSA(Bovine serum albumin), HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid), 염화칼슘, ITS 프리믹스, 8-Br-cAMP, FGF7(Fibroblast Growth Factor 7), 및 페니실린/스트렙토마이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제9항의 방법으로 제작된 폐 오가노이드.